CN108473549A - 单链gitr受体激动剂蛋白 - Google Patents

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Abstract

本文提供特异性GITR受体激动剂蛋白，编码该蛋白的核酸，以及治疗患有GITRL相关疾病或疾患的受试者的方法。本文提供的GITR受体激动剂蛋白包括三个可溶性GITRL结构域和Fc片段。GITR受体激动剂蛋白基本上是非聚集的并且适用于治疗、诊断和/或研究应用。

Description

单链GITR受体激动剂蛋白
技术领域
本发明提供了包含三个可溶性GITRL结构域和Fc片段的特异性GITR受体激动剂蛋白，编码GITR受体激动剂蛋白的核酸分子及其用途。GITR受体激动剂蛋白基本上是非聚集的并且适用于治疗、诊断和/或研究应用。
背景技术
已知TNF超家族(TNFSF)细胞因子的三聚化对于有效的受体结合和活化是必需的。然而，TNF超家族细胞因子的三聚体复合物难以从重组单体单元制备。
WO 01/49866和WO 02/09055公开了包括TNF细胞因子和多聚化组分的重组融合蛋白，特别是来自C1q蛋白家族的蛋白质或胶原凝集素。然而，这些融合蛋白的缺点是三聚化结构域通常具有较大的分子量和/或三聚化效率相当低。
Schneider等人(J Exp Med 187(1989),1205-1213)描述了TNF细胞因子的三聚体通过N末端定位的稳定基序来稳定。在CD95L中，受体结合结构域三聚体的稳定化可能是由位于细胞质膜附近的N末端氨基酸结构域引起的。
Shiraishi等人(Biochem Biophys Res Commun 322(2004),197-202)描述了CD95L的受体结合结构域可以通过N-末端定位的人工α螺旋卷曲螺旋(亮氨酸拉链)基序稳定。然而，发现多肽链彼此的取向，例如平行或反平行取向，很难预测的。此外，卷曲螺旋拉链基序中七价重复序列的最佳数目很难确定。另外，卷曲螺旋结构具有在改变pH和/或离子强度后形成大分子聚集体的倾向。
WO 01/25277涉及结合细胞受体的细胞外配体结合结构域的单链寡聚多肽，其中所述多肽包括至少三个受体结合位点，其中至少一个受体结合位点能够结合到细胞受体的配体结合结构域，并且至少一个受体结合位点不能有效结合到细胞受体的配体结合结构域，由此单链寡聚多肽能够结合到受体，但不能激活受体。例如，单体来源于TNF家族的细胞因子配体，特别是来自TNF-α。
WO 2005/103077公开了单链融合多肽，其包括TNF家族配体成员中的至少三个单体和将TNF配体家族成员的单体彼此连接的至少两个肽接头。然而，最近的实验已经表明，这些单链融合多肽表现出不想要的聚集。
WO 2010/010051公开了包括三个可溶性TNF家族细胞因子结构域和至少两个肽接头的单链融合多肽。所描述的融合多肽基本上是非聚集的。
最近的研究已经显示，抗GITR-mAb的体内抗肿瘤活性取决于Fc-γ-R驱动的机制，并且不仅仅依赖于激动性活性。Bulliard,Y.,R.Jolicoeur,M.Windman,S.M.Rue,S.Ettenberg,D.A.Knee,N.S.Wilson,G.Dranoff和J.L.Brogdon(2013)。"Activating Fcgamma receptors contribute to the antitumor activities of immunoregulatoryreceptor-targeting antibodies."J Exp Med 210(9):1685-1693。
本领域需要展现出独立于基于Fc-γ-R的体内交联的高生物学活性、高稳定性和允许有效重组制造的新型的GITR受体激动剂。
发明内容
本发明提供了模拟体内GITR：GITRL相互作用的特异性GITR受体激动剂蛋白，与激动性单克隆抗体相比，其展现了低的蛋白水解降解和更短的体内半衰期。
本发明的GITR受体激动剂蛋白通常包括：(i)第一可溶性GITRL细胞因子结构域；(ii)第一肽接头；(iii)第二可溶性GITRL结构域；(iv)第二肽接头；(v)第三可溶性GITRL结构域；(vi)第三肽接头(例如，铰链接头)和(vii)抗体Fc片段。
在一种实施方式中，抗体Fc片段(vii)位于第一GITRL结构域(i)的N末端，和/或第三GITRL结构域(v)的C末端。在另一种实施方式中，抗体Fc片段在C末端上位于第三GITRL结构域(v)。在一种实施方式中，该多肽基本上是非聚集的。在另一种实施方式中，第二和/或第三可溶性GITRL结构域是任选地包括氨基酸序列突变的N末端缩短结构域。在另一种实施方式中，可溶性GITRL结构域(i)、(ii)和(iii)是C末端缩短的结构域，其任选地包括氨基酸序列突变。
在一种实施方式中，该可溶性GITRL结构域中的至少一个，特别是可溶性GITRL结构域(iii)和(v)中的至少一个是具有开始于人GITRL的氨基酸E52或A54或K55或E56或P57的N末端序列的可溶性GITRL结构域，并且其中E52或A54或K55或E56可被中性氨基酸例如Ser或Gly替换。在另一种实施方式中，该可溶性GITRL结构域中的至少一个，特别是可溶性GITRL结构域(iii)和(v)中的至少一个是具有选自以下的N末端序列的可溶性GITRL结构域：(a)E52–P57和(b)(Gly/Ser)56–P57。在一种实施方式中，可溶性GITRL结构域以人GITRL的氨基酸S177结束和/或任选地包括在位置E52、A54、K55、L65A、P66A、K68A、P77、N80、V82、E88、L90、Q91、N106、N120、N129、K121、D122、V144、L159、N161、N172、P173、Q174处的一种或多种突变。在一种实施方式中，可溶性GITRL结构域(i)、(iii)和(v)包括根据SEQ ID NO：1的人GITRL的氨基酸E52-S177。
在一种实施方式中，该可溶性GITRL结构域中的至少一个，特别是至少可溶性GITRL结构域(i)是具有N末端序列的可溶性GITRL结构域，其起始于氨基酸E56并且其中E56可以被Gln、Ser或Gly替换。在一种实施方式中，该可溶性GITRL结构域中的至少一个，特别是至少可溶性GITRL结构域(iii)是以A170结束的可溶性C末端缩短的GITRL结构域。在另一种实施方式中，该可溶性GITRL结构域中的至少一个，特别是至少可溶性GITRL结构域(iii)是以P171结束的可溶性C末端缩短的GITRL结构域。在又一种实施方式中，该可溶性GITRL结构域中的至少一个，特别是至少可溶性GITRL结构域(iii)是以Q174结束的可溶性C末端缩短的GITRL结构域。
在一种实施方式中，第一和第二肽接头(ii)和(iv)独立地具有3-8个氨基酸的长度，特别是3、4、5、6、7或8个氨基酸的长度，并且优选为甘氨酸/丝氨酸接头，任选地包括可被糖基化的天冬酰胺残基。在一种实施方式中，第一和第二肽接头(ii)和(iv)由根据SEQID NO：2的氨基酸序列组成。在另一种实施方式中，该多肽另外包括例如SEQ ID NO：17的N末端信号肽结构域，其可以包括蛋白酶切割位点，和/或N该端信号肽结构域包括C末端元件，该C末端元件可以包括和/或连接至识别/纯化结构域，例如连接至根据SEQ ID NO：18的丝氨酸接头的Strep标签。
在一种实施方式中，抗体Fc片段(vii)通过铰链接头，优选地通过SEQ ID NO：16的铰链接头，融合至可溶性GITRL结构域(i)和/或(v)。在另一实施方式中，抗体Fc片段(vii)由如SEQ ID NO：13或14中所示的氨基酸序列组成。
在一种实施方式中，本发明的单链融合多肽包括选自SEQ ID NO：15和25-35组成的组的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本发明提供了包括两种单链融合多肽的二聚体的GITR受体激动剂蛋白，每种融合多肽具有SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列。在一种实施方式中，两种多肽通过在每种多肽的半胱氨酸残基406、412和415之间形成的三个链间二硫键来共价连接。类似的半胱氨酸残基是SEQ ID NO:28、29或30的位置406、412和415，SEQ ID NO:31的位置392、398和401，SEQ ID NO:32的位置391、397和400，SEQ ID NO:33的位置374、380和383，SEQ ID NO:34的位置397、403和406以及SEQ ID NO:35的位置382、388和391。
在一种实施方式中，一种或多种成熟多肽SEQ ID NO:27、28、29或30的位置132和266处的天冬酰胺残基中的一个或多个是N-糖基化的。在另一种实施方式中，在一种或多种多肽的位置132和266处的天冬酰胺残基都是N-糖基化的。类似的天冬酰胺残基是SEQ IDNO:31的位置128和257，SEQ ID NO:32的位置128和258，SEQ ID NO:33的位置122和245，SEQID NO:34的位置129和260以及SEQ ID NO:35的位置125和250。
在另一种实施方式中，该一种或多种多肽进一步经翻译后修饰。在另一种实施方式中，翻译后修饰包括将第一可溶性结构域(i)的E52Q突变蛋白的N末端谷氨酰胺修饰为焦谷氨酸。在又一种实施方式中，翻译后修饰包括将第一可溶性结构域(i)的E56Q突变蛋白的N末端谷氨酰胺修饰为焦谷氨酸。
附图说明
图1包括三个GITRL结构域的单链融合多肽的结构域结构。I.、II.、III.可溶性GITRL结构域。
图2表示GITRL一般结构的示意图。
■■■细胞膜，位于细胞内的N末端，
1.受体结合结构域(RBD)的反平行β折叠，
2.RBD与细胞膜的界面，
3.蛋白酶切割位点。
图3包括另外的Fab抗体片段的单链融合多肽。
图4通过三个二硫桥将两个C末端融合的单链Fc融合多肽二聚化。
图5表示本发明的六价单链CD27受体激动剂融合蛋白的示意图。存在于内表面区域上的CH2碳水化合物(5)通常在“开放的Fc构象转变”期间通常在空间位阻上保护CH2亚结构域(2)免受蛋白酶影响，其中铰链-链间二硫键(4)被还原并且共价的链间连接被破坏。这使得CH2解离并使内表面区域和上铰链赖氨酸K223(6)暴露于蛋白酶。由于CH3结构域(3)彼此之间的高的亲和力，因此“开放阶段”中的二聚体缔合(association)仍然完整。
(1)scCD27L-RBD；(2)CH2结构域；(3)CH3结构域；(4)铰链半胱氨酸(左侧：氧化成二硫桥；具有游离巯基的右侧还原阶段)；(5)连接至位置N297(EU编号)的CH2碳水化合物；(6)上铰链赖氨酸(K223)
图6ELISA评估三种不同的GITR受体激动剂蛋白，蛋白A、蛋白B和蛋白C(每种蛋白都包括strep标签)至它们的受体的结合。
图7描述了strep标签的蛋白A、蛋白B和蛋白C的分析性尺寸排阻层析。使用TosohTSK凝胶G3000SWxl柱在1260无限HPLC系统上进行实验。该柱载有浓度为1mg/ml总体积为20μl的相应蛋白质。流速设定为0.5ml/min。
(A)观测到蛋白A在14.86min处有单个主峰。(B)观测到蛋白B在15.09min处有单个主峰。(C)观测到蛋白C在15.56min处有单个峰
图8描述了蛋白A、蛋白B和蛋白C在非还原和还原条件下的SDS-PAGE结果。在含有作为还原剂的DTT的非还原(泳道2-4)和还原(泳道5-7)条件下，将240ng相应的蛋白加载到SDS-PAGE 4-12％的Bis-Tris凝胶上。凝胶在110V下运行20分钟，然后在190V下运行60分钟，随后使用银染色方案染色。人们观察到泳道2-4和泳道5-7中主要条带之间的分子量差异约为70-80kDa。由于这是泳道2-4中主要条带观察到的分子量的约一半，这表明泳道2-4中的同二聚体通过二硫桥共价地连接。在泳道5-7中，该键在还原条件下丢失。
具体实施方式
本发明提供了包括由两个肽接头连接的至少三个可溶性GITRL结构域和在N末端和/或C末端上的抗体来源的二聚化结构域的单链融合多肽。本发明人已经发现通过二聚化结构域的两个单链融合多肽的二聚化产生了六价GITR受体激动剂，其提供了高生物学活性和良好的稳定性。
优选地，单链融合多肽是非聚集的。术语“非聚集的”是指制剂中单体含量≥50％，优选≥70％，并且更优选≥90％。单体含量与聚集体含量的比率可以通过使用尺寸排阻层析法(SEC)检查聚集体形成的量来确定。关于聚集的稳定性可以通过SEC在不同的储存条件下(例如4℃或25℃)限定的时间段(例如从数天到若干天直至数周和数月)之后确定。对于融合蛋白，为了分类为基本上的非聚集的，优选的是，在4℃或25℃储存若干天(例如10天)的时间段之后，更优选若干周(例如2、3或4周)的时间段之后，并且最优选在若干月(例如2或3个月)的时间段之后，“单体”含量如上文所限定。关于在FC融合蛋白的情况下“单体”的限定，两条多肽链的组装由FC部分驱动，并且所得组装蛋白的功能单元由两条链组成。该单元在Fc融合蛋白的情况下被限定为“单体”，这与二聚化单链融合多肽无关。
单链融合多肽可以包括可以位于其N末端和/或C末端的另外的结构域。另外的融合结构域的实例是，例如可以包括蛋白酶切割位点的N末端信号肽结构域，或可以包含和/或连接识别/纯化结构域的C末端元件。根据优选的实施方式，融合多肽在其C末端包括经由接头融合的Strep标签。包括短的丝氨酸接头的示例性Strep标签在SEQ ID NO:18中示出。
本发明的GITR受体激动剂蛋白包含来源于GITRL的三个可溶性结构域。优选地，这些可溶性结构域来源于哺乳动物，特别是来源于包括等位基因变体的人GITR和/或其衍生物。可溶性结构域包含包括受体结合结构域而无膜定位结构域的GITRL的细胞外部分。像TNF超家族的其他蛋白质一样，GITRL经由15-30个氨基酸的N末端部分(即所谓的茎区)锚定到膜。茎区有助于三聚化，并提供了到细胞膜一定的距离。然而，茎区不是具有位于原体界面处受体结合位点的三聚体受体结合结构域(RBD)的一部分。
重要的是，RBD的特征在于其N末端氨基酸和C末端氨基酸的特定位置。所述氨基酸是紧邻的，并且位于三聚体的轴的附近。RBD(在人GITRL的情况下以Pro57开始)的第一N末端氨基酸形成具有在人GITRL的情况下以Ala171结束的RBD的C末端区域的反平行β链。人GITRL含有可能参与突出到原体间的界面中的弱原体接触的C末端延伸(N172-S177)。C末端Ser177仍然靠近邻近原体的Pro57。
因此，RBD的上述反平行β链和C末端延伸与细胞膜形成界面，其经由茎区的氨基酸连接并锚定在细胞膜内。特别优选的是，GITR受体激动剂蛋白的可溶性GITRL结构域包括缺少来自茎区域的任何氨基酸的GITRL的受体结合结构域。否则，需要将可溶性结构域中的一个的C末端与下一个可溶性结构域的N末端连接的长接头来补偿该下一个可溶性结构域的N末端茎区，这可能导致不稳定性和/或聚集体的形成。
这种可溶性结构域的另一个优点是RBD的N-端氨基酸不可用于任何抗药物抗体。优选地，该单链融合多肽由以下组成：(i)第一可溶性GITRL结构域；(ii)第一肽接头：(iii)第二可溶性GITRL结构域；(iv)第二肽接头；(v)第三可溶性GITRL结构域，该单链融合多肽能够形成模拟其天然配对物(counterpart)的三聚体组织的有序结构，从而包括至少一个用于相对GITRL受体的功能结合位点。因此，包括组分(i)-(v)的单链融合多肽也称为单链GITRL受体结合域(scGITRL-RBD)。重要的是，与同源三聚体野生型GITRL-RBD相比，scGITRL-RBD包括增强的稳定性，因为可溶性GITRL结构域(i)、(iii)和(v)通过接头(ii)和(iv)提供的彼此共价连接实现三聚化。
GITR受体激动剂蛋白包括三个功能性GITR受体结合位点，即能够与GITR受体形成复合物的氨基酸序列。因此，可溶性结构域能够结合到相应的GITR受体。在一种实施方式中，可溶性结构域中的至少一个能够受体激活，由此可能影响凋亡和/或增殖活性。在另一种实施方式中，可溶性结构域中的一个或多个被选作为不能受体激活。
可溶性GITRL结构域可以源自人GITRL，如SEQ ID NO：1中所示的。优选地，可溶性GITRL结构域来源于人GITRL，特别是从氨基酸52、56或57开始，特别包括SEQ ID NO：1的氨基酸52-177或56-177或57-177。任选地，SEQ ID NO:1的氨基酸Glu56可以被不带电荷的氨基酸例如Ser或Gly替换，或者被谷氨酰胺替换。
表1：野生型人GITRL蛋白的序列
如上所示，可溶性GITRL结构域可以包括如SEQ ID NO：1中所示的野生型序列。然而，应该注意的是，可能在这些可溶性结构域中的一个或多个中引入突变，例如改变(例如增加或减少)可溶性结构域的结合性质的突变。在一种实施方式中，可以选择不能与相应的细胞因子受体结合的可溶性结构域。
在本发明的另一种实施方式中，可溶性GITRL结构域(i)包括导致GITR受体亲和力降低和/或GITR受体活化降低的GITRL的突变体或其受体结合结构域。
影响受体结合和/或活性的GITRL突变蛋白
该突变体可以通过技术人员已知的任何技术生成。取代可影响GITRL的至少一个氨基酸，例如如本文所述的人GITRL(例如，SEQ ID NO：1)或其受体结合结构域。在这方面优选的取代影响SEQ ID NO:1的人GITRL的以下氨基酸中的至少一种：L65A、P66A、K68A、P77、N80、V82、E88、L90、Q91、N106、N120、N129、K121、D122、V144、L159、N161、N172、P173和Q174。在优选的实施方式中，N106突变为A、S、R、D、E、Q或N和/或D122突变为A、S、D、E或R。
在另一个优选的实施方式中，C末端区域Q174-S177从可溶性结构域(i)、(Ⅲ)或(v)中的至少一个中删除。
一种或多种氨基酸取代可对于或在GITR结合或GITR诱导的信号转导方面影响GITRL(例如，人GITRL)的结合和/或活性。GITR的结合和/或活性可以被积极地影响，即更强、更具选择性或更特异性的受体结合和/或更多的受体活化。可替换地，GITR的结合和/或活性可以被消极地影响，即较弱、较少选择性或较少特异性的受体结合和/或受体较少或没有活化。
因此，一种实施方式是如本文所述的GITR受体激动剂蛋白，其中该可溶性结构域中的至少一个包括GITRL的突变体或其受体结合结构域，其与野生型-GITRL相比更小程度的结合和/或激活GITR。
具有增强的稳定性/溶解度的GITRL突变蛋白
在本发明的另一种实施方式中，可溶性GITRL结构域(i)、(iii)和(v)中的一个或多个可包括GITRL突变体或其受体结合结构域，其导致自身聚集的降低和/或体内稳定性的延长。
在这方面优选的取代是V82[S，T]、E88D和N129[S，D]。每个GITRL结构域的一种或多种突变可以相同或不同。
本发明的单链融合分子包括三个可溶性GITRL结构域，即组分(i)、(iii)和(v)。如果第二和/或第三可溶性GITRL结构域是任选地包括氨基酸序列突变的N末端缩短的结构域，则单链GITRL融合多肽针对聚集的稳定性得到增强。因此，优选地，第二和第三可溶性GITRL结构域都是N末端缩短的结构域，其任选地包括N末端区域中优选地在可溶性GITRL结构域的N末端的前五个氨基酸内的氨基酸序列突变。这些突变可以包括用中性氨基酸，特别是丝氨酸或甘氨酸替换碱性氨基酸。
与此相反，第一个可溶性GITRL结构域的选择并不重要。在此，可以使用具有全长N末端序列的可溶性结构域。然而，应该注意的是，第一可溶性GITRL结构域也可以具有N末端缩短的且任选突变的序列。
在本发明另一优选的实施方式中，可溶性GITRL结构域(i)、(iii)和(v)是可溶性人GITRL结构域。第一可溶性GITRL结构域(i)可以选自天然的、缩短的和/或突变的序列。因此，第一可溶性GITRL域(i)具有N端序列，其可起始于人GITRL的氨基酸Glu56或Pro57，并且其中Glu56可以由中性氨基酸替换，例如由Ser或Gly或由Gln替换，以在表达期间能够形成焦谷氨酸。第二和第三可溶性GITRL结构域(iii)和(v)具有缩短的N末端序列，其优选起始于人GITRL(SEQ ID NO：1)的氨基酸Glu56或Pro57，并且其中Glu56可以被另一个氨基酸，例如Ser或Gly替换。
优选地，可溶性GITRL结构域(iii)和(v)的N末端序列选自：
(a)Glu56或Pro57
(b)(Gly/Ser)56
可溶性GITRL结构域优选以人GITRL的氨基酸S177结束。在某些实施方式中，GITRL结构域可以包括如上所述的内部突变。
GITR受体激动剂蛋白的组分(ii)和(iv)是分别位于组分(i)和(iii)之间或(iii)和(v)之间的肽接头元件。柔性接头元件具有3-8个氨基酸的长度，特别是3、4、5、6、7或8个氨基酸的长度。接头元件优选为甘氨酸/丝氨酸接头，即基本上由氨基酸甘氨酸和丝氨酸组成的肽接头。在其中可溶性细胞因子结构域以S或G(N-末端)开始的情况下，接头在该S或G之前结束。
应该注意的是，接头(ii)和接头(iv)不需要具有相同的长度。为了减少潜在的免疫原性，其可以优选使用较短的接头。另外，结果表明较短的接头导致单链分子具有降低形成聚集体的趋势。然而，比本文公开的接头长得多的接头可以表现出不利的聚集特性。
如果需要，接头可包括可形成糖基化位点Asn-Xaa-Ser的天冬酰胺残基。在某些实施方式中，接头之一，例如接头(ii)或接头(iv)包括糖基化位点。在其他实施方式中，接头(iv)二者都包含糖基化位点。为了增加GITRL激动剂蛋白的溶解度和/或为了降低潜在的免疫原性，优选接头(ii)或接头(iv)或两者都包括糖基化位点。
表2中示出了优选的接头序列。优选的接头是GSGSGNGS(SEQ ID NO：2)。
表2：接头序列实例
SEQ ID NO 序列
2 GSGSGNGS
3 GSGSGSGS
4 GGSGSGSG
5 GGSGSG
6 GGSG
7 GGSGNGSG
8 GGNGSGSG
9 GGNGSG
10 GSGSGS
11 GSGS
12 GSG
GITR受体激动剂蛋白另外包括抗体Fc片段结构域，其可位于第一GITRL结构域(i)的N末端和/或第三GITRL结构域(v)的C末端。优选地，抗体Fc片段结构域包括降低的与Fc-γ-R受体体内相互作用的能力。优选地，抗体Fc片段结构域包括SEQ ID NO：13或14中所示的氨基酸序列或由其组成(见表3)。与野生型人IGG1-Fc相比，序列ID NO:13具有N297S突变。序列ID NO:14是具有降低的Fc-γ-R结合能力的糖基化的(N297野生型)人IGG1Fc突变蛋白。
表3：Fc片段结构域的实例
糖基化位点的数量和体内稳定性
糖基化位点的总数和三维碳水化合物的单个位置影响GITR受体激动剂蛋白质的体内稳定性。此外，碳水化合物识别取决于末端糖的局部密度，碳水化合物树(tree)的分支，以及碳水化合物与其他物质彼此的相对位置。
此外，部分降解的碳水化合物通过凝集素驱动机制降低GITR受体激动剂蛋白的体内半衰期。通过减少分子上糖基化位点的总数，所得到的化合物不易适于这些机制，从而增加半衰期。
为了避免基于Fc-γ受体的结合减少Fc结构域的CH2结构域碳水化合物是必需的。细胞上的FcR-γ受体可导致融合蛋白体内潜在的高度交联，其导致基于GITR受体超簇的毒性。另外，不需要的Fc驱动的机制如ADCC可能导致有毒事件。因此，在一种实施方式中，本发明的GITR受体激动剂蛋白上的糖基化位点的总数通过CH2糖基化位点，特别是N糖基化位点的减少而减少，导致包括产生无糖基CH2结构域的SEQ ID NO:15(蛋白A)(根据EU编号系统)的N297S等效突变的GITR受体激动剂蛋白。在本发明的另一种实施方式中，可溶性GITRL结构域(i)，(iii)和(v)中的一个或多个可以包括交换成天冬氨酸、丝氨酸或甘氨酸的N129，从而产生具有糖基化位点数量减少的GITR受体激动性融合蛋白。在优选的实施方式中，N129[D，S，G]和N114[D，S，G]突变限于本发明的激动性GITR受体激动性融合蛋白的可溶性GITRL结构域(iii)和(v)。
CH2结构域去稳定化通过另外的铰链半胱氨酸来补偿
存在于内表面区域上的CH2糖基化通常在“开放的Fc构象转变”期间保护亚结构域免受蛋白酶影响，其中铰链-链间二硫键被还原并且共价的链间连接被破坏。这使得CH2解离并使内表面区域暴露于蛋白酶。包括具有SEQ ID NO:15(蛋白A)(根据EU编号系统)的N297S等效突变的GITR受体激动剂蛋白产生无糖基化CH2，并且因此可能经受蛋白酶消化，并且与具有野生型CH2糖基化的等效结构比更不稳定。在宿主细胞蛋白酶存在并且长期作用该结构的情况下，这会影响化合物在USP/DSP/存储期间的稳定性。因此，在某些实施方式中，GITR受体激动剂缺乏CH2糖基化位点，但在每条多肽链的接头序列(例如GSGSGNGS，SEQID NO：2)中包括糖基化位点。
根据本发明的优选实施方式，抗体Fc片段结构域经由铰链接头元件融合。铰链接头元件具有10-30个氨基酸的长度，特别是15-25个氨基酸的长度，例如22个氨基酸。术语“铰链接头”包括足够长以允许铰链接头元件连接的结构域获得生物学活性确认的任何接头。铰链接头元件优选包括免疫球蛋白的铰链区序列，在本文中指的是“Ig铰链区”。术语“Ig铰链区”是指包括与包含一个或多个半胱氨酸残基(例如，两个半胱氨酸残基)的天然存在的Ig铰链区序列的一部分具有序列同一性或相似性氨基酸序列的任何多肽，在该Ig铰链区序列处二硫键连接免疫球蛋白的两个重链。
铰链区的衍生物和类似物可通过突变获得。本文所指的衍生物或类似物是包括与野生型(或天然存在的蛋白质)的全长序列具有序列同一性或相似性的氨基酸序列的多肽，除了其具有可归因于删除，插入和/或取代的一个或多个氨基酸序列差异。
单个GITR受体激动剂蛋白中具有开放Fc构象的分子的数目取决于存在于铰链区中的链间二硫键的数目。因此，在一种实施方式中，将第三个半胱氨酸(根据EU编号系统的C225)引入本发明的GITR受体激动剂蛋白的铰链区，以改善减少CH2糖基化位点的作用。
在铰链区中将赖氨酸交换成甘氨酸导致蛋白水解稳定性的增强
在一种实施方式中，本发明的GITR受体激动剂蛋白另外包括上铰链赖氨酸(根据EU编号系统的K223)至甘氨酸的突变，以降低在该位点的蛋白水解加工，从而增强该融合蛋白的整体稳定性。将上述第三半胱氨酸(根据EU编号系统的C225)的引入与上述在铰链区内的赖氨酸至甘氨酸突变(根据EU编号系统的K223G)组合导致本发明的整体稳定化的GITR受体激动剂蛋白质。
包括上述半胱氨酸(C225)和赖氨酸至甘氨酸突变(K223G)的特别优选的铰链接头元件包括SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列或由其组成(表4)。
内源性半胱氨酸干扰铰链二硫化物的形成
稳定六价GITR受体激动剂蛋白的同二聚体的铰链区的链间二硫化物连接性也受GITRL子序列的游离巯基的影响。游离巯基基团可以通过还原表面暴露的二硫桥，例如通过GITRL的C58-C78二硫化物的还原来产生。这还导致上述开放的FC构象，这是由于通过在高蛋白质浓度下制剂的内源性游离巯基自还原该结构的铰链二硫桥。因此，当长时间暴露于氧气和蛋白酶时，包括游离巯基的单链GITRL-FC融合蛋白在制造和储存期间预期不太稳定。
因此，为了可能能够在技术规模上制造六价GITR受体激动剂，C58和C78残基优选同时突变成不同的氨基酸(例如L、S、A或G)。
GITR受体激动剂蛋白可另外包括N末端信号肽结构域，其允许在合适的宿主细胞中进行处理，例如细胞外分泌。优选地，N末端信号肽结构域包括蛋白酶切割位点，例如信号肽酶切割位点，因此可以在表达后或表达期间被去除以获得成熟蛋白质。特别优选的N末端信号肽结构域包括如SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列(表4)。
此外，GITR受体激动剂蛋白可另外包括具有例如1-50个，优选10-30个氨基酸长度的C末端元件，其可包括或连接至识别/纯化结构域，例如FLAG结构域、Strep标签或Strep标签Il结构域和/或聚His结构域。根据优选的实施方式，融合多肽包括经由如SEQ ID NO:18中所示的短的丝氨酸接头融合至C末端的Strep标签(表4)。
优选的铰链接头元件(SEQ ID NO:16、19-24)、优选的N-末端信号肽结构域(SEQID NO:17)和优选的丝氨酸接头strep标签(SEQ ID NO:18)在表4中示出。
表4：示例性结构域和接头
SEQ ID NO 序列
16 GSSSSSSSSGSCDKTHTCPPC
17 METDTLLVFVLLVWVPAGNG
18 SSSSSSAWSHPQFEK
19 GSSSSSSSGSCDKTHTCPPC
20 GSSSSSSGSCDKTHTCPPC
21 GSSSSSGSCDKTHTCPPC
22 GSSSGSCDKTHTCPPC
23 GSSSGSCDKTHTCPPCGS
24 GSSSGSCDKTHTCPPCGSGS
在本发明的一种实施方式中，融合多肽包括由SEQ ID NO:2的肽接头元件融合的三个可溶性GITRL结构域。所有三个可溶性GITRL结构域(i)、(iii)、(v)由根据SEQ ID NO:1的人GITRL的氨基酸52-177组成。得到的scGITRL-RBD序列模块在表5b SEQ ID NO:36中示出。
在本发明进一步优选的实施方式中，融合多肽包括由SEQ ID NO:2的肽接头元件融合的三个可溶性GITRL结构域。所有三个可溶性GITRL结构域(i)、(iii)、(v)由根据SEQID NO:1的人GITRL的氨基酸52-177组成，其中在第一结构域(i)中具有E52Q突变。得到的scGITRL-RBD序列模块在表5b SEQ ID NO:39中示出。
在本发明的另一种实施方式中，融合多肽包括由SEQ ID NO:2的肽接头元件融合的三个可溶性GITRL结构域。所有三个可溶性GITRL结构域(i)、(iii)、(v)由根据SEQ IDNO:1的人GITRL的氨基酸56-177组成。得到的scGITRL-RBD序列模块在表5b SEQ ID NO:40中示出。
在本发明又一优选的实施方式中，融合多肽包括由SEQ ID NO:2的肽接头元件融合的三个可溶性GITRL结构域。所有三个可溶性GITRL结构域(i)、(iii)、(v)由根据SEQ IDNO:1的人GITRL的氨基酸56-177组成，其中在第一结构域(i)中具有E56Q突变。得到的scGITRL-RBD序列模块在表5b SEQ ID NO:41中示出。
在本发明的另一种实施方式中，融合多肽包括由SEQ ID NO:2的肽接头元件融合的三个可溶性GITRL结构域。所有三个可溶性GITRL结构域(i)、(iii)、(v)由根据SEQ IDNO:1的人GITRL的氨基酸55-177组成。得到的scGITRL-RBD序列模块在表5b SEQ ID NO:42中示出。
在本发明再一优选的实施方式中，融合多肽包括由SEQ ID NO:2的肽接头元件融合的三个可溶性GITRL结构域。所有三个可溶性GITRL结构域(i)、(iii)、(v)由根据SEQ IDNO:1的人GITRL的氨基酸55-177组成，其中在第一结构域(i)中具有K55Q突变。得到的scGITRL-RBD序列模块在表5b SEQ ID NO:43中示出。
在本发明的另一种实施方式中，融合多肽包括由SEQ ID NO:2的肽接头元件融合的三个可溶性GITRL结构域。第一可溶性GITRL结构域(i)由根据SEQ ID NO:1的人GITRL的氨基酸56-177组成，以及可溶性GITRL结构域(iii)和(v)由根据SEQ ID NO:1的人GITRL的氨基酸57-177组成。得到的scGITRL-RBD序列模块在表5b SEQ ID NO:44中示出。
在本发明的另一种实施方式中，融合多肽包括由SEQ ID NO:2的肽接头元件融合的三个可溶性GITRL结构域。第一可溶性GITRL结构域(i)由根据SEQ ID NO:1的人GITRL的氨基酸56-177组成，可溶性GITRL结构域(iii)和(v)由根据SEQ ID NO:1的人GITRL的氨基酸57-177组成，其中在第一结构域(i)中具有E56Q突变。得到的scGITRL-RBD序列模块在表5b SEQ ID NO:45中示出。
在本发明的另一种实施方式中，融合多肽包括由SEQ ID NO:2的肽接头元件融合的三个可溶性GITRL结构域。第一可溶性GITRL结构域(i)由根据SEQ ID NO:1的人GITRL的氨基酸56-171组成，可溶性GITRL结构域(iii)和(v)由根据SEQ ID NO:1的人GITRL的氨基酸57-171组成，其中在第一结构域(i)中具有E56Q突变。得到的scGITRL-RBD序列模块在表5b SEQ ID NO:46中示出。
在本发明的另一种实施方式中，融合多肽包括由SEQ ID NO:2的肽接头元件融合的三个可溶性GITRL结构域。第一可溶性GITRL结构域(i)由根据SEQ ID NO:1的人GITRL的氨基酸56-173组成，可溶性GITRL结构域(iii)和(v)由根据SEQ ID NO:1的人GITRL的氨基酸57-173组成，其中在第一结构域(i)中具有E56Q突变。得到的scGITRL-RBD序列模块在表5b SEQ ID NO:47中示出。
在本发明的另一种实施方式中，融合多肽包括由两种不同肽接头元件融合的三个可溶性GITRL结构域。第一接头元件(ii)由SEQ ID NO:2组成。第二接头元件(iv)由SEQ IDNO:11组成。第一可溶性GITRL结构域(i)由根据SEQ ID NO:1的人GITRL的氨基酸56-171组成，可溶性GITRL结构域(iii)和(v)由根据SEQ ID NO:1的人GITRL的氨基酸57-171组成，其中在第一结构域(i)中具有E56Q突变。得到的scGITRL-RBD序列模块在表5b SEQ ID NO:48中示出。
上述scGITRL-RBD模块(SEQ ID:36、39-48)非常适合于使用表2(SEQ ID NO:2-12)中所述的接头生成具有融合到N末端或C末端端部的另外结构域的融合蛋白。
优选的构象GITRL-Fc
此外，该融合多肽包括根据SEQ ID NO:13的抗体Fc片段结构域，所述抗体Fc片段结构域通过根据SEQ ID NO:16的铰链接头在C末端上融合至可溶性GITRL结构域(v)。发明人惊奇地发现，与二价激动性抗GITR-mAB相比，该特定融合多肽提供了改善的生物活性，并且与包含位置223中的赖氨酸和CH2结构域N297S突变(根据EU编号)的融合蛋白相比具有延长的稳定性。本发明的GITR受体激动剂蛋白的示例性实施方式的氨基酸序列在SEQ ID NO:27中所示。
此外，融合多肽可包括N末端信号肽结构域，例如根据SEQ ID NO:17的N末端信号肽结构域。本发明的GITR受体激动剂蛋白的具体实例在SEQ ID NO:25中示出。
根据另一个优选实施方式，该融合多肽可另外包括C末端Strep标签，所述C末端Strep标签经由SEQ ID NO:18中所示的短的丝氨酸接头而被融合至本发明的多肽。根据本发明的这一方面，Fc片段优选由SEQ ID NO:13或14中所示的氨基酸序列组成。进一步地，Fc片段可以由较短的Fc片段组成，例如包括SEQ ID NO:13的氨基酸1-217的Fc片段。包括C末端Strep标签的融合多肽的特别优选的实例示于SEQ ID NO:15(蛋白A)。
如SEQ ID NO:15、25和26所示的示例性GITR受体激动剂蛋白，各自在每个序列的氨基酸1-20处包括N末端信号肽结构域。在每种情况下，成熟蛋白以氨基酸21开始。本发明成熟的示例性GITR受体激动剂蛋白(没有信号肽)在SEQ ID NO:27-35、49和50中所示。上文所述的示例性GITR受体激动剂蛋白示于表5中。
如在SEQ ID NO:27中所示的GITR受体激动剂的糖基化位点的总数减少(根据EU编号系统，N297S突变在CH2区中提供了无糖基化的CH2结构域)、铰链区中链间二硫键的数目增加，以及上铰链赖氨酸至甘氨酸的突变(根据EU编号系统，K223G)。这些改变提供了减少潜在的降解和GITR受体超簇(伴随有伴随的毒性)。
如在SEQ ID NO:30中所示的GITR受体激动剂包括与SEQ ID NO:27相同的布局，但在使用SEQ ID NO:39所示的scGITRL-RBD模块的可溶性GITRL结构域(i)中具有E52Q突变。成熟蛋白质包括N末端E52Q突变，由此能够形成焦谷氨酸，导致保护了N末端免受氨肽酶影响，并随后增强了制造和储存期间蛋白质的整体稳定性。
如SEQ ID NO:31所示的GITR受体激动剂包括具有SEQ ID NO:45的scGITRL-RBD模块、具有SEQ ID NO:16的第三肽接头和(vii)具有SEQ ID NO:13的抗体Fc片段。
如SEQ ID NO:32所示的GITR受体激动剂包括具有SEQ ID NO:41的scGITRL-RBD模块、具有SEQ ID NO:21的第三肽接头和(vii)具有SEQ ID NO:13的抗体Fc片段。
如SEQ ID NO:33所示的GITR受体激动剂包括具有SEQ ID NO:46的scGITRL-RBD模块、具有SEQ ID NO:16的第三肽接头和(vii)具有SEQ ID NO:13的抗体Fc片段。
如SEQ ID NO:34所示的GITR受体激动剂包括具有SEQ ID NO:43的scGITRL-RBD模块、具有SEQ ID NO:16的第三肽接头和(vii)具有SEQ ID NO:13的抗体Fc片段。
如SEQ ID NO:35所示的GITR受体激动剂包括具有SEQ ID NO:47的scGITRL-RBD模块、具有SEQ ID NO:16的第三肽接头和(vii)具有SEQ ID NO:13的抗体Fc片段。
另外的示例性GITR受体激动剂包括具有SEQ ID NO:45的scGITRL-RBD模块、具有SEQ ID NO:16的第三肽接头和(vii)具有SEQ ID NO:13的抗体Fc片段。
如SEQ ID NO:49所示的GITR受体激动剂(蛋白B)包括具有SEQ ID NO:41的scGITRL-RBD模块、具有SEQ ID NO:16的第三肽接头和(vii)具有SEQ ID NO:13的抗体Fc片段。
如SEQ ID NO:50所示的GITR受体激动剂(蛋白C)包括具有SEQ ID NO:48的scGITRL-RBD模块、具有SEQ ID NO:16的第三肽接头和(vii)具有SEQ ID NO:13的抗体Fc片段。
表5：示例性GITR受体激动剂蛋白
表5B：示例性scGITRL-RBD模块
此外，已注意到，scGITRL-RBD模块(SEQ ID NO:36)非常适合于生成具有其他结构域的融合蛋白，该其他结构域使用表2中所述的接头(SEQ ID NO:2-12)融合到N末端或C末端端部。
本发明的另一方面涉及编码本文所述的GITR受体激动剂蛋白的核酸分子。核酸分子可以是DNA分子，例如双链或单链DNA分子，或RNA分子。核酸分子可编码GITR受体激动剂蛋白或其前体，例如GITR受体激动剂蛋白的原形式或前形式，其可包括用于分泌或纯化的信号序列或其他异源氨基酸部分，其优选位于GITR受体激动剂蛋白的N末端和/或C末端。异源氨基酸部分可以通过蛋白酶切割位点，例如因子X3、凝血酶或IgA蛋白酶切割位点连接至第一和/或第二结构域。本发明的核酸序列的具体实例示于表6中为SEQ ID NO:37。该核酸分子包括编码SEQ ID NO:25的融合多肽的开放阅读框。
表6：示例性GITR受体激动剂蛋白的核酸序列
核酸分子可操作性地连接到表达控制序列，例如允许核酸分子在所需宿主细胞中表达的表达控制序列。核酸分子可以位于载体上，例如质粒、细菌噬菌体、病毒载体、染色体整合载体等。合适的表达控制序列和载体的实例描述于例如由Sambrook等人(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,and Ausubel等人(1989),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons或其更新的版本。
各种表达载体/宿主细胞系统可用于表达编码本发明的GITR受体激动剂蛋白的核酸序列。合适的宿主细胞包括但不限于原核细胞，诸如细菌，例如大肠杆菌(E.coli)，真核宿主细胞，诸如酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或动物细胞，优选哺乳动物细胞，更优选人细胞。此外，本发明涉及用如上所述的核酸分子转化或转染的非人生物。这种转基因生物可以通过已知的遗传转移方法产生，包括同源重组。
本发明的另一方面涉及药物或诊断组合物，其包括作为活性剂的至少一种GITR受体激动剂蛋白、编码它们的相应核酸或转化或转染的细胞，全部如本文所述的。
另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包括本文公开的GITR受体激动剂蛋白和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。
另一方面，本发明提供编码GITR受体激动剂蛋白的核酸分子。在另一种实施方式中，本发明提供了包括核酸分子的表达载体。在另一种实施方式中，本发明提供了包括该核酸分子的细胞。在进一步的实施方式中，该细胞是真核细胞。在另一种实施方式中，该细胞是哺乳动物细胞。在另一种实施方式中，该细胞是中国仓鼠卵巢(CHO-1)细胞。在其他实施方式中，细胞选自由CHO-DBX11、CHO-DG44、CHO-S和CHO-K1细胞组成的组。在其他实施方式中，该细胞选自由Vero、BHK、HeLa、COS、MDCK、HEK-293、NIH-3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、T47D、NS0、CRL7030、HsS78Bst、PER.C6、SP2/0-Agl4和杂交瘤细胞。
在另一方面，本发明提供了治疗患有GITRL相关疾病或疾患的受试者的方法，该方法包括向受试者施用有效量的GITR受体激动剂蛋白。在一种实施方式中，单独施用GITR受体激动剂蛋白。在另一种实施方式中，GITR受体激动剂蛋白在施用第二种药剂之前、同时或之后施用。在另一种实施方式中，所述疾病或疾患选自有如下组成的组：肿瘤、传染病、炎性疾病、代谢性疾病、自身免疫性疾病、退行性疾病、凋亡相关疾病和移植排斥。在一种实施方式中，肿瘤是实体肿瘤。在一种实施方式中，肿瘤来源于由肉瘤、食管癌和胃癌组成的癌症组。在另一种实施方式中，肿瘤源自尤氏文肉瘤(Ewing’s sarcoma)或纤维肉瘤。在另一种实施方式中，肿瘤来源于由非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈癌和小细胞肺癌(SCLC)组成的癌症组。在一种实施方式中，肿瘤是淋巴肿瘤。在一种实施方式中，肿瘤是血液肿瘤。在另一种实施方式中，肿瘤源自非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’slymphoma)、白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、慢性髓细胞白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)或毛细胞白血病。在另一种实施方式中，自身免疫疾患是类风湿性疾病、关节炎疾病或类风湿性和关节炎疾病。在另一种实施方式中，疾病或疾患是类风湿性关节炎。在另一种实施方式中，退行性疾病是神经退行性疾病。在另一实施方式中，神经退行性疾病是多发性硬化。
在一种实施方式中，第二剂是化疗剂、放射治疗剂或生物剂。在一种实施方式中，第二药剂选自由度维利塞(Duvelisib)、伊布替尼(Ibrutinib)、纳维妥拉(Navitoclax)和维奈妥拉(Venetoclax)组成的组，在另一种实施方式中，第二种剂是凋亡剂。在一种实施方式中，凋亡的第二剂选自由硼替佐米(Bortezomib)、氮杂胞苷(Azacitidine)、达沙替尼(Dasatinib)和吉非替尼(Gefitinib)组成的组。在一种具体实施方式中，通过静脉内或皮下施用将本文公开的药物组合物施用于患者。在其他实施方式中，通过口内、胃肠外、肌内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、椎内、滑膜内、胸腔内、子宫内、膀胱内、团注(bolus)、阴道内、直肠、口腔的、舌下的、鼻内或透皮施用将所公开的药物组合物施用于患者。
在一种实施方式中，GITR受体激动剂蛋白作为单次团注施用。在另一种实施方式中，GITR受体激动剂蛋白可以分若干次的剂量施用。GITR受体激动剂蛋白可以约0.1-100mg/kg施用。在一种实施方式中，GITR受体激动剂蛋白可以选自以下项组成的组的剂量施用：约0.1-0.5、0.1-1、0.1-10、0.1-20、0.1-50、0.1-75、1-10、1-15、1-7.5、1.25-15、1.25-7.5、2.5-7.5、2.5-15、5-15、5-7.5、1-20、1-50、7-75、1-100、5-10、5-15、5-20、5-25、5-50、5-75、10-20、10-50、10-75和10-100mg/kg。在其他实施方式中，GITR受体激动剂蛋白以约0.1-100mg/ml存在于药物组合物中。在一种实施方式中，所述GITR受体激动剂蛋白以选自以下项组成的组的量存在于药物组合物中：约0.1-0.5、0.1-1、0.1-10、0.1-20、0.1-50、0.1-75、1-10、1-20、1-50、1-75、1-100、5-10、5-15、5-20、5-25、5-50、5-75、10-20、10-50、10-75或10-100mg/ml。在其他实施方式中，将治疗有效量的GITR受体激动剂蛋白施用于受试者。在另一种实施方式中，将预防有效量的GITR受体激动剂蛋白施用于受试者。
本文所用术语“GITRL相关疾病或疾患”是可通过向需要其的受试者施用有效量的GITR受体激动剂而可以改善的任何疾病或疾患。至少一种GITR受体激动剂蛋白、相应的编码其的核酸或转化或转染的细胞，全部如本文所述的可用于治疗，例如预防和/或治疗由GITRL功能障碍引起的、与GITRL功能障碍相关的和/或伴随GITRL功能障碍的疾患，特别是增殖性疾病，诸如肿瘤，例如实体肿瘤或淋巴肿瘤；传染病；炎性疾病；代谢性疾病；自身免疫性疾病，例如类风湿性和/或关节炎疾病；退行性疾病，例如神经退行性疾病，诸如多发性硬化；凋亡相关疾病或移植排斥。
本文所用的术语“GITRL功能障碍”应理解为GITRL的任何功能或表达偏离GITRL的正常功能或表达，例如GITRL基因或蛋白的过度表达、与GITRL的正常生理表达水平相比GITRL基因或蛋白的表达减少或消除、与GITRL正常的生理活性或结合相比，GITRL活性增加、GITRL活性降低或消除、GITRL与任何结合配偶体(例如，受体，特别是GITRL受体或另一细胞因子分子)的结合增强、与任何结合配偶体(例如受体，特别是GITRL受体或另一细胞因子分子)的结合减弱或消除。
在各种实施方式中，提供了一种用于诊断和/或治疗患有可通过靶向GITRL受体诊断和/或治疗的疾患的人受试者的方法，所述方法包括向人受试者施用本文公开的GITR受体激动剂蛋白，使得对人受试者中的一种或多种靶标的活性的影响是激动性的，使得一种或多种症状减轻和/或使得治疗实现。本文提供的GITR受体激动剂蛋白可用于诊断和/或治疗患有原发性和转移性癌症的人，包括乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌(例如小细胞肺癌“SCLC”和非小细胞肺癌“NSCLC”)、口咽癌、下咽癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、胆囊和胆管癌、小肠癌、尿道癌(包括肾癌、膀胱癌和尿路上皮癌)、女性生殖道癌(包括宫颈癌、子宫癌和卵巢癌以及绒毛膜癌和妊娠滋养细胞疾病)、男性生殖道癌(包括前列腺癌、精囊癌、睾丸癌和生殖细胞肿瘤)、内分泌腺癌(包括甲状腺癌、肾上腺癌和垂体癌)和皮肤癌，以及血管瘤、黑色素瘤、肉瘤(包括源自骨和软组织的肉瘤以及卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma))、脑肿瘤、神经肿瘤、眼睛肿瘤和脑膜肿瘤(包括星形细胞瘤、胶质瘤、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、神经母细胞瘤、许旺氏细胞瘤(Schwannomas)和脑膜瘤)、源自造血系统恶性肿瘤、急性白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)、B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、慢性粒细胞白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s and non-Hodgkin’slymphomas)、DLBCL、滤泡性淋巴瘤、造血系统恶性肿瘤、卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增生症、恶性黑色素瘤、多发性骨髓瘤、副肿瘤综合征/恶性高钙血症或实体肿瘤。
提供了包括本文公开的GITR受体激动剂蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方式中，药物组合物包括至少一种用于治疗疾患的另外的治疗剂。例如，另外的剂可以是治疗剂、化疗剂；成像剂、细胞毒性剂、血管生成抑制剂、激酶抑制剂(包括但不限于KDR和TIE-2抑制剂)、共刺激分子调节剂或免疫检查点抑制剂(包括但不限于抗B7.1、抗B7.2、抗B7.3、抗B7.4、抗CD28、抗B7RP1、CTLA4-Ig、抗CTLA-4、抗PD-1、抗PD-L1、抗PD-L2、抗ICOS、抗LAG-3、抗Tim3、抗VISTA、抗HVEM、抗BTLA、LIGHT融合蛋白、抗CD137、抗CD137L、抗OX40、抗OX40L、抗CD70、抗CD27、抗CD27L、抗GAL9、抗A2AR、抗KIR、抗IDO-1、抗CD20)、树突状细胞/抗原呈递细胞调节剂(包括但不限于抗CD40抗体、抗CD40L、抗DC-SIGN、抗Dectin-1、抗CD301、抗CD303、抗CD123、抗CD207、抗DNGR1、抗CD205、抗DCIR、抗CD206和抗ILT7)、Toll样受体调节剂(包括但不限于抗TLR-1、抗TLR-2、抗TLR-3、抗TLR-4、抗TLR-4、抗TLR-5、抗TLR-6、抗TLR-7、抗TLR-8、抗TLR-9)、粘附分子阻滞剂(包括但不限于抗LFA-1抗体、抗E/L选择素抗体、小分子抑制剂)、抗细胞因子抗体或其功能片段(包括但不限于抗IL-18、抗TNF或抗IL-6/细胞因子受体抗体)、双特异性重定向T细胞或NK细胞细胞毒性(包括但不限于)、基于嵌合T细胞受体(CAR-T)治疗、基于T细胞受体(TCR)治疗、治疗性癌症疫苗、甲氨蝶呤(methotrexate)、环孢菌素(methotrexate)、雷帕霉素(methotrexate)、FK506、可检测标记物或报告物、TNF拮抗剂、抗风湿剂、肌肉松弛剂、麻醉剂、非甾体抗炎药(NSAID)、镇痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻滞剂、抗菌剂、抗银屑病剂、皮质类固醇、合成代谢类固醇、促红细胞生成素、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁药、抗精神病药、兴奋剂、哮喘药物、β激动剂、吸入类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
在一种实施方式中，治疗癌症或预防或抑制本文所述肿瘤转移的方法中，一种或多种GITR受体激动剂蛋白可单独使用或与一种或多种另外的剂例如化疗剂、放疗剂或生物剂组合使用。在一些实施方式中，该剂可以包括如下：13-顺式视黄酸(13-cis-RetinoicAcid)；2-CdA；2-氯脱氧腺苷(2-Chlorodeoxyadenosine)；5-氮杂胞苷(5-Azacitidine)；5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)；5-FU；6-巯基嘌呤(6-Mercaptopurine)；6-MP；6-TG；6-硫鸟嘌呤(6-Thioguanine)；白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)； 放线菌素-D(Actinomycin-D)； 阿地白介素(Aldesleukin)：阿仑单抗(Alemtuzumab)；ALIMTA；阿里维A酸(Alitretinoin)； 全反式维甲酸(All-transretinoicAcid)；α干扰素(Alpha Interferon)；六甲蜜胺(Altretamine)；氨甲蝶呤(Amethopterin)；氨磷汀(Amifostine)；氨鲁米特(Aminoglutethimide)；阿那格雷(Anagrelide)；阿那曲唑(Anastrozole)；阿拉伯糖基胞嘧啶(Arabinosylcytosine)；Ara-C 三氧化二砷(Arsenic Trioxide)；阿泽拉TM(ArzerraTM)；天冬酰胺酶(Asparaginase)；ATRA； 阿扎胞苷(Azacitidine)；BCG；BCNU；苯达莫司汀(Bendamustine)；贝伐单抗(Bevacizumab)；贝沙罗汀(Bexarotene)；必卡他胺(Bicalutamide)；BiCNU；博来霉素(Bleomycin)；硼替佐米(Bortezomib)；白消安(Busulfan)； C225；甲酰四氢叶酸钙(Calcium Leucovorin)； 喜树碱11(Camptothecin-11)；卡培他滨(Capecitabine)喀拉克TM(CaracTM)；卡铂(Carboplatin)；卡莫司汀(Carmustine)；卡莫司汀膜晶片(Carmustine Wafer)； CC-5013；CCI-779；CCNU；CDDP；CeeNU； 西妥昔单抗(Cetuximab)；苯丁酸氮芥(Chlorambucil)；顺铂(Cisplatin)；嗜橙菌因子(Citrovorum Factor)；克拉屈滨(Cladribine)；可的松(Cortisone)；CPT-11；环磷酰胺(Cyclophosphamide)；阿糖孢苷(Cytarabine)；阿糖孢苷脂质体(Cytarabine Liposomal)； 达卡巴嗪(Dacarbazine)；达克金(Dacogen)；更生霉素(Dactinomycin)；阿法达贝泊汀(Darbepoetin Alfa)；达沙替尼(Dasatinib)；道诺霉素(Daunomycin)；道诺红菌素(Daunorubicin)；道诺红菌素盐酸盐(Daunorubicin Hydrochloride)；道诺红菌素脂质体(Daunorubicin Liposomal)；地卡特隆(Decadron)；地西他滨(Decitabine)； 地尼白介素-毒素连接物(Denileukin Diftitox)；戴破赛TM(DepoCytTM)；地塞米松(Dexamethasone)；地塞米松乙酸盐(Dexamethasone Acetate)；地塞米松钠磷酸盐(Dexamethasone Sodium Phosphate)；戴克赛松(Dexasone)；右雷佐生(Dexrazoxane)；DHAD；DIC；笛奥戴克(Diodex)；多西他赛(Docetaxel)；阿霉素(Doxorubicin)；阿霉素脂质体(Doxorubicin Liposomal)；得罗希亚TM(DroxiaTM)；DTIC；度维里斯(Duvelisib)；艾里咖TM(EligardTM)；意林司TM(EllenceTM)；乐沙定TM(EloxatinTM)； 表柔比星(Epirubicin)；阿法依泊汀(Epoetin Alfa)；爱必妥(Erbitux)；埃罗替尼(Erlotinib)；欧文氏菌左旋天冬酰胺酶(Erwinia L-asparaginase)；雌莫司汀(Estramustine)；阿米福汀(Ethyol) 依托泊苷(Etoposide)；磷酸依托泊苷(EtoposidePhosphate)；依维莫司(Everolimus)； 依西美坦(Exemestane)； 弗隆非格司亭(Filgrastim)；氟尿苷(Floxuridine)；氟达拉滨(Fludarabine)； 氟尿嘧啶(Fluorouracil)；氟尿嘧啶乳(膏)(Fluorouracil(cream))；氟甲睾酮(Fluoxymesterone)；氟他胺(Flutamide)；亚叶酸(Folinic Acid)；氟维司群(Fulvestrant)；吉非替尼(Gefitinib)；吉西他滨(Gemcitabine)；吉妥珠单抗奥唑米星(Gemtuzumab ozogamicin)；健择(Gemzar)；格列卫TM(GleevecTM)；植入膜剂( Wafer)；GM-CSF；戈舍瑞林(Goserelin)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(Granulocyte-Colony Stimulating Factor)；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(G-MCSF)(Granulocyte Macrophage ColonyStimulating Factor)； 海赛卓尔(Hexadrol)； 六甲嘧胺(Hexamethylmelamine)；HMM； 氢化可的松(Hydrocortisone)；氢化可的松磷酸钠(Hydrocortisone Sodium Phosphate)；氢化可的松琥珀酸钠(Hydrocortisone Sodium Succinate)；磷酸氢化可的松(HydrocortonePhosphate)；羟基脲(Hydroxyurea)；依鲁替尼(Ibrutinib)；替伊莫单抗(Ibritumomab)；替坦异贝莫单抗(Ibritumomab Tiuxetan)；伊达比星(Idarubicin)干扰素α(Interferon-alpha)；干扰素α-2b(PEG缀合物)(Interferon-alpha-2b(PEG Conjugate))；异环磷酰胺(Ifosfamide)；白介素11(IL-11)(Interleukin-11)；白介素2(IL-2)(Interleukin-2)；甲磺酸伊马替尼(Imatinibmesylate)；咪唑甲酰胺(Imidazole Carboxamide)；伊匹单抗(ipilimumab)、伊立替康(Irinotecan)；异维甲酸(Isotretinoin)；伊沙匹隆(Ixabepilone)；伊赛普拉TM(IxempraTM)；凯卓酶(t)(Kidrolase(t))拉帕替尼(Lapatinib)；L-天冬酰胺酶(L-asparaginase)；LCR；来那度胺(Lenalidomide)；来曲唑(Letrozole)；甲酰四氢叶酸(Leucovorin)；留可然(Leukeran)；瘤肯TM(LeukineTM)；亮丙瑞林(Leuprolide)；长春新碱(Leurocristine)；禄斯得停TM(LeustatinTM)；利丽单抗(Lirilumab)；阿糖胞苷脂质体(Liposomal Ara-C)；罗氮芥(Lomustine)；L-PAM；左旋苯丙氨氮芥(L-Sarcolysin)； (Lupron)；马希得克(Maxidex)；双氯乙基甲胺(Mechlorethamine)；盐酸双氯乙基甲胺(Mechlorethamine Hydrochloride)； 甲地孕酮(Megestrol)；醋酸甲地孕酮(Megestrol Acetate)；MEK抑制剂(MEK inhibitor)；美法仑(Melphalan)；巯基嘌呤(Mercaptopurine)；美司钠(Mesna)；美司那TM(MesnexTM)；甲氨蝶呤(Methotrexate)；甲氨蝶呤钠(Methotrexate Sodium)；甲基强的松龙(Methylprednisolone)；丝裂霉素(Mitomycin)；丝裂霉素C(Mitomycin-C)；米托蒽醌；(Mitoxantrone)；M MTC；MTX；盐酸氮芥氮芥(Mustine)；麦乐赛尔TM(MylocelTM)；生根粉263(Navitoclax)；奈拉滨(Nelarabine)；倍血添TM(NeulastaTM)； 尼罗替尼(Nilotinib)；尼鲁米特(Nilutamide)； 氮芥(Nitrogen Mustard)；纳武单抗(Nivolumab)；尼普累特(Nplate)；奥曲肽(Octreotide)；醋酸奥曲肽(Octreotide acetate)；奥法木单抗(Ofatumumab)； 昂克赛尔TM(OnxalTM)；奥普瑞白介素(Oprelvekin)； 奥沙利铂(Oxaliplatin)；紫杉醇(Paclitaxel)；紫杉醇蛋白质结合物(Paclitaxel Protein-bound)；帕米膦酸钠(Pamidronate)；帕尼单抗(Panitumumab)； 帕唑帕尼(Pazopanib)；PEG干扰素(PEG Interferon)；培加帕加司(Pegaspargase)；培非格司亭(Pegfilgrastim)；PEG-INTRONTM；PEG左旋天冬酰胺酶(PEG-L-asparaginase)；PEMETREXED；派姆单抗(Pembrolizumab)；喷司他丁(Pentostatin)；帕妥珠单抗(Pertuzumab)；苯丙氨酸氮芥(Phenylalanine Mustard)；皮地利珠单抗(Pidilizumab)；普拉汀诺泼尼松龙(Prednisolone)；泼尼松(Prednisone)；甲基苄肼(Procarbazine)； 聚苯丙生20载卡莫司汀植入剂(Prolifeprospan 20withCarmustine Implant)；BRAF抑制剂(BRAFinhibitor)；雷洛昔芬(Raloxifene)； 利妥昔单抗(Rituximab)；罗扰素罗米司亭(Romiplostim)；盐酸红比霉素(Rubidomycin hydrochloride)；善得定(Sandostatin )；沙格司亭(Sargramostim)； 索拉非尼(Sorafenib)；SPRYCELTM；STI-571；STIVAGRATM；链脲菌素(Streptozocin)；SU11248；舒尼替尼(Sunitinib)；它莫西芬(Tamoxifen) 替莫唑胺(Temozolomide)替西罗莫司(Temsirolimus)；替尼泊苷(Teniposide)；TESPA；萨力多胺(Thalidomide)；硫鸟嘌呤(Thioguanine)；(Thioguanine )；三胺硫磷(Thiophosphoamide)；硫替哌(Thiotepa)； 拓扑替康(Topotecan)；托瑞米芬(Toremifene)；托西莫单抗(Tositumomab)；曲妥珠单抗(Trastuzumab)；曲美木单抗(Tremelimumab)；维甲酸(Tretinoin)；曲克傲TM(TrexallTM)；TSPA；乌瑞鲁单抗(Urelumab)；VCR；维克替比TM(VectibixTM)；万耐托克(Venetoclax)； 微尔度TM(ViadurTM)； 长春花碱(Vinblastine)；硫酸长春花碱(Vinblastine Sulfate)；万卡赛(Vincasar )；长春新碱(Vincristine)；长春瑞滨(Vinorelbine)；酒石酸长春瑞滨(Vinorelbine tartrate)；VLB；VM-26；伏立诺他(Vorinostat)；福退癌(Votrient)；VP-16； 泽娃灵TM(ZevalinTM)； 唑来膦酸(Zoledronic acid)；佐林扎(Zolinza)；和/或本文未具体列出的靶向相似途径的任何其他剂。
当两种或更多种物质或原理用作组合治疗方案的一部分时，它们可以通过相同的施用途径或通过不同的施用途径、在基本上相同的时间或在不同的时间(例如基本上同时、连续或根据替换方案)施用。当物质或原理通过相同的施用途径同时施用时，它们可以作为不同的药物制剂或组合物或组合药物制剂或组合物的一部分施用，这对于本领域技术人员来说是清楚的。
此外，当两种或更多种活性物质或原理用作组合治疗方案的一部分时，每种物质或原理可以以与化合物或原理单独使用时相同的量和根据相同的方案施用，并且这种组合使用可以产生或可以不产生协同效应。然而，当两种或更多种活性物质或原理的组合使用导致协同效应时，也可以减少一种、多于一种或所有待施用的物质或原理的量，而仍然实现期望的治疗作用。当它们以通常的量使用时，这可以例如用于避免、限制或减少与一种或多种物质或原理的使用相关的任何不希望的副作用，同时仍然获得期望的药物或治疗效果。
根据本发明使用的治疗方案的有效性可以以对于所涉及的疾病或疾患本身已知的任何方式来确定和/或遵循，如对于临床医生来说将是清楚的。临床医生还能够在适当的情况下并在个案的基础上改变或修改特定的治疗方案，以便实现期望的治疗效果，避免、限制或减少不期望的副作用，和/或在一方面实现期望的治疗效果与另一方面避免、限制或减少不期望的副作用之间实现适当的平衡。
通常，将遵循治疗方案直到获得期望的治疗效果和/或只要维持期望的治疗效果。同样，这可以由临床医生确定。
在各种实施方式中，本文提供了包含一种或多种GITR受体激动剂蛋白的药物组合物，其是单独的或与预防剂、治疗剂和/或药学上可接受的载体组合的。在各种实施方式中，本文公开的药物组合物的用途的非限制性实例包括诊断、检测和/或监测疾患，预防、治疗、管理和/或改善疾患或其一种或多种症状和/或用于研究。单独的或与预防剂、治疗剂和/或药学上可接受的载体组合的药物组合物的制剂，是本领域技术人员已知的(美国专利公开No.20090311253A1)。
如本文所用，短语“有效量”是指导致与GITRL功能障碍相关的或与GITRL相关的疾病或疾患相关的一个或多个参数的可检测的改善(例如，高于基线至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或更多)的GITRL激动剂蛋白的量。
施用本文提供的治疗剂的方法包括但不限于口服施用、胃肠外施用(例如皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬膜外施用、瘤内施用、粘膜施用(例如鼻内和口服途径)和肺部施用(例如，用吸入器或喷雾器施用的雾化化合物)。用于特定施用途径的药物组合物的制剂以及各种施用方法所必需的材料和技术对于本领域技术人员是可获得的和已知的(美国专利公开No.20090311253A1)。
在各种实施方式中，可以调节剂量方案以提供最佳所需应答(例如，治疗或预防应答)。例如，可以单次团注施用，可以随时间施用若干个分开的剂量，或者剂量可以按治疗情况的紧急指示成比例地减少或增加。在一些实施方式中，胃肠外组合物以剂量单位形式配制，以便于施用和剂量的均匀性。术语“剂量单位形式”是指适于作为待治疗的哺乳动物受试者的单一剂量的物理上离散的单位；每个单元含有预定量的活性化合物，所述预定量的活性化合物经计算以产生与所需药物载体相关的所需治疗效果。
本文提供的治疗或预防有效量的GITR受体激动剂蛋白的示例性非限制性范围为约0.1-100mg/kg(例如，约0.1-0.5、0.1-1、0.1-10、0.1-20、0.1-50、0.1-75、1-10、1-15、1-7.5、1.25-15、1.25-7.5、2.5-7.5、2.5-15、5-15、5-7.5、1-20、1-50、7-75、1-100、5-10、5-15、5-20、5-25、5-50、5-75、10-20、10-50、10-75或10-100mg/kg，或中间的任何浓度)。在一些实施方式中，所述GITR受体激动剂蛋白以治疗有效浓度存在于药物组合物中，例如约0.1-100mg/ml的浓度(例如，0.1-0.5、0.1-1、0.1-10、0.1-20、0.1-50、0.1-75、1-10、1-20、1-50、1-75、1-100、5-10、5-15、5-20、5-25、5-50、5-75、10-20、10-50、10-75或10-100mg/ml，或中间的任何浓度)。注意，剂量值可随待缓解病症的类型和/或严重程度而变化。还应当理解，对于任何特定的受试者，可以根据个体需要和/或进行组合物施用或监督组合物施用的人的专业判断随时间调节具体的剂量方案，并且本文所示的剂量范围仅是示例性的，而不旨在限制所要求保护的组合物的范围或实践。
实施例
实施例1.GITR受体激动剂蛋白制备
1.1多肽结构
A)氨基酸Met1–Gly20
Ig-κ-信号肽，在氨基酸Gly20之后假定的信号肽酶切割位点。
B)氨基酸Glu21–Ser146
人GITRL配体的第一可溶性细胞因子结构域(GITRL，SEQ ID NO:1的氨基酸52-177)。
C)氨基酸Gly147–Ser154
SEQ ID NO:2的第一肽接头元件。
D)氨基酸Glu155–Ser280
人GITRL配体的第二可溶性细胞因子结构域(GITRL，SEQ ID NO:1的氨基酸52-177)。
E)氨基酸Gly281–Ser288。
SEQ ID NO:2的第二肽接头元件。
F)氨基酸Glu289–Ser414
人GITRL配体的第三可溶性细胞因子结构域(GITRL，SEQ ID NO:1的氨基酸55-133)。
G)氨基酸Gly415–Cys435
SEQ ID NO:16的铰链接头元件。
H)氨基酸Pro436–Lys653
SEQ ID NO:13的抗体Fc片段结构域。
上述GITR受体激动剂蛋白如SEQ ID NO:25所示。
所示的接头可由其他优选的接头代替，例如如SEQ ID NO:3-12所示。
所示的铰链连接元件可由其他优选的铰链连接元件替换，例如如SEQ ID NO:19-24中所示。
应当注意，第一和第二肽接头不需要相同。
信号肽序列(A)可以被任何其他合适的例如哺乳动物信号肽序列替换。
1.2编码该多肽的基因盒
合成基因可以根据用于在合适的宿主细胞例如昆虫细胞或哺乳动物细胞中表达的其密码子使用而优化。优选的核酸序列如SEQ ID NO:37所示。
实施例2.表达和纯化
2.1融合多肽的克隆、表达和纯化
上述融合蛋白使用下述方法在不同真核宿主细胞中重组表达：
小规模表达GITR受体激动剂融合蛋白的方法：
为了小规模分析前述GITR受体激动剂融合蛋白，Hek293细胞在补充有10％的FBS，100单位/ml青霉素和100[mu]g/ml链霉素的DMEM+GlutaMAX(GibCo)中生长，并且用含有融合多肽和适当选择标志物的表达盒的质粒瞬时转染，例如包含杀稻瘟菌素、嘌呤霉素或潮霉素抗性基因的功能表达盒。在需要多个多肽链以获得最终产物的那些情况下，表达盒在转染过程中结合在一种质粒上或定位在不同质粒上。转染后3天收获含有重组融合多肽的细胞培养物上清液，并通过300×g离心澄清，随后通过0.22μm无菌过滤器过滤。
大规模表达和纯化GITR受体激动剂融合蛋白的方法
为了更大规模地表达GITR受体激动剂融合蛋白，将编码上述蛋白质的合成DNA盒插入真核表达载体中，该真核表达载体包括适当的选择标志物(例如，包括杀稻瘟菌素、嘌呤霉素或潮霉素抗性基因的功能表达盒)和适于增加宿主细胞基因组内转录活性插入位点数目的遗传元件。通过电穿孔将序列验证的表达载体导入适合中国仓鼠卵巢细胞(CHO-S，Invitrogen)的悬浮液中。转染后三天将对转染细胞施加合适的选择压力。通过随后在选择压力下培养来回收携带源自于载体的抗性基因的存活细胞。当选择的细胞群在化学限定培养基(PowerCHO2-CD,Lonza)中在37℃和7％CO2气氛中在轨道震荡培养箱(100rpm,50mm震甩)中生长稳定时，通过ELISA测定法检测上述蛋白质来分析单个上清液，并且在蛋白质产生之前在摇动瓶中扩增具有最高比生产率的细胞群(轨道震荡器，100rpm，震甩50mm)。
对于实验室规模的蛋白质生产，单个细胞群在化学限定的培养基(PowerCHO2-CD,Lonza)中在37℃和7％CO2气氛中在Wave生物反应器20/50EHT(GE-Healthcare)中培养7-12天。基础培养基为补充有4mM GlutaMAX的PowerCHO2-CD。Wave培养始于活细胞浓度为0.3×10e6至0.4×10e6个细胞/ml，且采用如下设定(对于五升或十升袋)：震荡频率18rpm、震荡角度7°、气流0.2-0.3L/min、7％CO2、36.5℃。在Wave运行期间，向细胞培养物中补料PowerFeed A(Lonza)两次，通常在第2天(20％补料)和第5天(30％补料)。第二次补料后，震荡频率增加至22rpm，震荡角度增加到8°。
当细胞活力下降到80％以下时，生物反应器通常在第7天至第12天之间收获。首先，使用手动深度过滤系统(Millipore Millistak Pod，MC0HC 0.054m2)澄清培养物上清液。对于带Strep标签的蛋白，添加亲和素至终浓度为0.5mg/L。最后，使用瓶顶过滤器(0.22μm，PES，Corning)将含有GITR受体激动剂融合蛋白的培养物上清液无菌过滤，并储存在2-8℃直至进一步处理。
为了亲和纯化，将链霉素琼脂糖(Streptactin Sepharose)填充至柱(凝胶床2ml)，用15ml缓冲液W(100mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0)或pH 7.4的PBS平衡，并将细胞培养物上清液施于色谱柱，流速约为4ml/min。随后，用15ml缓冲液W洗柱，通过加入7×1ml缓冲液E(100mM Tris HCl，150mM NaCl，2.5mM脱硫生物素，pH8.0)逐步洗脱结合的多肽。替换地，包含2.5mM脱硫生物素的pH 7.4PBS可以用于该步骤。
可替换基于链霉素琼脂糖的方法，使用具有固定化蛋白A作为亲和配体的柱和Akta层析系统(GE-Healthcare)进行亲和纯化。选择对融合蛋白的FC结构域具有高亲和力的固相材料：MABSelect SureTM(GE Healthcare)。简而言之，将澄清的细胞培养物上清液加载到在洗涤缓冲液-1(20mM Pi，95mM NaCl，pH 7.2)中平衡的HiTrap MabSelectSure柱(CV＝5ml)上，其不超过10mg融合蛋白/ml柱-床的加载。用10倍柱体积(10CV)的上述平衡缓冲液洗涤柱子，接着用四倍柱体积(4CV)的洗涤缓冲液-2(20mM Pi，95mM NaCl，pH 8.0)洗涤以去除宿主细胞蛋白和宿主-细胞DNA。然后用洗脱缓冲液(20mM Pi，95mM NaCl，pH 3.5)洗脱柱子，洗脱液以多至10个级分收集，每个级分的体积等于柱床体积(5ml)。用等体积的上述洗涤缓冲液-2中和每个级分。在上述亲和层析法过程中，线速度设定为150cm/h并保持恒定。
定量洗脱液级分的蛋白量，并通过超滤浓缩峰级分，并通过尺寸排阻层析法(SEC)进一步纯化。
使用Akta层析系统(GE-Healthcare)在葡聚糖(Superdex)200 10/300 GL或HiLoad 26/60柱上进行SEC。柱用磷酸盐缓冲盐水平衡，将浓缩的、亲和纯化的多肽加载到SEC柱上，样品体积不超过柱体积的2％(v/v)。在葡聚糖200 10/300 GL柱(GE Healthcare)中，流速为每分钟0.5ml。在HiLoad 26/60葡聚糖200柱中，流速为每分钟2.5ml。通过280nm处的吸光度监测多肽的洗脱曲线。
为了测定天然条件下纯化的融合多肽的表观分子量，向葡聚糖200柱加载有已知分子量的标准蛋白质。基于标准蛋白质的洗脱体积绘制校准曲线并确定纯化的融合多肽的分子量。包括FC结构域的GITR受体激动剂融合蛋白从葡聚糖200柱洗脱，表观分子量约为140-180kDa，这将证实Fc结构域对成熟GITR受体激动剂融合多肽的同源二聚化。
实施例3：三价对照蛋白
为了比较六价GITR受体激动剂融合蛋白和用噬菌体RB69-FOLDON稳定的同源三聚体三价GITR受体激动剂融合蛋白之间的相对结合，如前一部分所述在CHO-S细胞中表达并进行纯化。该序列在下表中示出：
实施例4：通过限制性蛋白酶消化测定GITR受体激动剂蛋白质的体外稳定性
如实施例1中所述的六价Fc融合蛋白一样，将表达并纯化待研究的所有GITR受体激动剂蛋白。该组将包括在CH2结构域中包含N297S突变[根据EU编号系统]和铰链区的GITR受体激动剂蛋白，该铰链区能够形成三个二硫桥并且另外缺少上铰链赖氨酸[K223，根据EU编号系统]，其突变为甘氨酸[K223G]。在有限的蛋白酶消化测定中，将在三个二硫化物发挥铰链功能的情况下同时包括N297S突变和K223G突变的前述GITR受体激动剂蛋白与呈现在两个二硫化物或三个二硫化物实现铰链区的情况下包括N297S突变但具有K223野生型的GITR受体激动剂蛋白进行比较。
此外，具有减少至4个氨基酸的第二接头元件(iv)，并且具有缩短的铰链元件(vi)的GITR受体激动剂蛋白将被研究(例如SEQ ID NO：32和34)。工程化策略(三个二硫化物实现铰链区情况下的N297S与K223G突变结合)和缩短接头元件(iv和vi)二者都对相应分子的稳定性具有潜在影响。
本发明的不同GITR激动性蛋白的稳定性可以通过体外限制的蛋白酶消化解决。对于该分析，将上述GITR受体激动剂蛋白与低浓度蛋白酶(例如胰蛋白酶、V8蛋白酶)在不同温度(例如4℃、25℃、37℃)下一起孵育不同时间。随后可以通过不同的方法，如SDS-PAGE，分析型SEC或本领域已知的分析质谱法(例如Nano-RP-HPLC-ESI-MSMS)来测量特定蛋白水解片段随时间的定量及其出现。由于被研究的蛋白质具有大部分共同的序列，随着时间的推移，来自单个蛋白质的特定蛋白水解片段的更快的出现和数量增加可用于判断它们的相对稳定性并将它们相互排序。关于所研究的上述GITR受体激动剂蛋白的基于蛋白酶的诱饵动力学，关于其蛋白水解稳定性顺序预期如下：
与在铰链区中包括N297S和野生型K223的GITR受体激动剂蛋白相比，包含N297S和K223G以及实现铰链区的三个二硫化物的GITR受体激动剂蛋白同时具有延长的稳定性。与包括SEQ ID NO:16作为铰链接头元件的GITR受体激动剂蛋白相比，包含SEQ ID NO:21作为铰链接头元件的GITR受体激动剂蛋白具有延长的稳定性。
实施例5：稳定性/聚集测试
单体和聚集体的含量通过实施例2中所述的分析性SEC测定。对于特定目的，在生理pH的含有生理盐浓缩物的缓冲液(例如，pH 7.4 0.9％NaCl；pH 7.4PBS)中进行该分析。典型的聚集分析在葡聚糖200柱(GE Healthcare)上进行。该柱分离10至800kDa范围内的蛋白。
为了测定天然条件下纯化的融合多肽的表观分子量，向葡聚糖200柱加载已知分子量的标准蛋白。基于标准蛋白的洗脱体积绘制校准曲线，并基于洗脱体积计算未知分子量的纯化融合蛋白的表观分子量。
对可溶性非聚集蛋白的SEC分析通常在限定的洗脱体积显示出明显的单个蛋白峰(在280nm或214nm处的OD处测量)。该洗脱体积对应于特定蛋白的表观天然分子量。关于在FC融合蛋白的情况下“单体”的定义，两条多肽链的组装由该蛋白质的FC部分驱动，并且功能单位是由两条链组成的蛋白质。含有两条FC连接的多肽链的该单元在Fc融合蛋白的情况下被定义为“单体”，这与二聚化单链融合多肽无关。
如果发生蛋白质聚集，SEC分析显示出具有较低保留体积的额外蛋白质峰。蛋白寡聚物可能用作聚集种子，并且高含量的寡聚物可能导致蛋白质聚集。大分子量的寡聚物和聚集体在葡聚糖200柱的空隙体积中洗脱，并且不能通过SEC对它们的天然分子量进行分析。
GITR受体激动剂融合蛋白的纯化制剂应优选仅含有限定的单体蛋白和非常少量的寡聚蛋白。特定GITR受体激动剂融合蛋白制剂的聚集/寡聚程度基于SEC分析通过分别计算所限定单体和寡聚物/聚集体级分的OD280图的峰面积来测定。基于总峰面积，限定的单体蛋白的百分比计算如下：
单体含量[％]＝[单体蛋白的峰面积]/[总峰面积]×100)
实施例6：通过QCM分析测定三价和六价GITR受体配体构建体的平衡结合常数
基于用自动生物传感器系统(Attana A100)测定的动力学结合数据(k结合和k解离)，计算GITR受体配体的三价和六价构建体的平衡结合常数(KD)。A100允许基于石英晶体微天平(QCM)技术来实时研究分子间的相互作用。
为此目的，将人GITR受体固定化至羧基活化的QCM芯片的表面。随后，三价或六价GITR受体配体分别以不同浓度(例如0.5、1、2、5和10μg/ml)用作分析物，用于分析配体-受体结合(k结合)和解离(k解离)的动力学结合数据。分析是实时进行的，并且可以计算相应的KD：KD＝k解离/k结合。
QCM分析表明，三价GITR受体配体与相应的固定化GITR受体结合，KD在低nM范围内，预期KD为1-500nM。然而，GITR受体配体的六价构建体显示出与相应的固定化GITR受体的在pM范围内的较高的结合亲和力，预期KD为1pM–500nM。动力学结合数据(k结合和k解离)的共同特征是与三价构建体相比，六价构建体显示更快的k结合。此外，如果与三价配体相比，六价配体通常观察到较慢的解离(k解离)。
实施例7：T细胞增殖测定
为了评估GITR受体激动剂的T细胞活化能力，通过使用磁珠的阴性选择从人血沉棕黄层制剂中纯化T细胞。用CFSE标记细胞与或不与不同量的GITR受体激动剂一起孵育，并与抗人CD3抗体在37℃下结合2-5天。在流式细胞仪上获取CFSE稀释作为测量细胞分裂的手段的数据。通过使用细胞培养物上清液和用于捕获的抗人IFNγ抗体的ELISA测量IFNγ产生。
当GITR受体激动剂与抗人CD3抗体一起存在于T细胞培养物中时，人们期望通过CD4+和CD8+T细胞二者观察到IFNγ分泌的清楚的增加。除了更高的IFNγ产生之外，人们期望通过使用流式细胞术测量CFSE稀释来看到更多的T细胞被驱动进入细胞周期。这将证明GITR受体激动剂在T细胞活化情况中的共刺激作用。
实施例8：GITR激动剂结合测定
使用阴性选择和磁珠从新鲜血沉棕黄层制剂中分离原代人T细胞。将细胞以每孔2×10e6个细胞接种到24孔板中。将T细胞与抗人CD3抗体(克隆HIT3a，1μg/ml)、抗人CD28抗体(克隆CD28.2，5μg/ml)和不同量的蛋白A(GITRL，10-1000ng/ml)一起孵育，或简单地留在培养基中作为对照。在37℃下3天后，用抗人GITR和抗人CD4或抗人CD8抗体荧光标记细胞。在guava easyCyte流式细胞仪上在CD4+和CD8+T细胞群内评估GITR荧光。
当将与抗CD3和抗CD28抗体一起孵育的T细胞群与单独留在培养基中的对照细胞进行比较时，人们期望观察到GITR的较低荧光信号，指示受体的活化诱导的下调。当细胞与GITR激动剂(蛋白A)共孵育时，这种作用可以更强且是剂量依赖性的，这表明由GITR激动剂(蛋白A)引起的补充作用。这些结果提示GITR激动剂(蛋白A)与其受体在体外结合。
实施例9：人体外T细胞增殖测定
通过阴性选择和磁珠(pan T细胞分离试剂盒，Miltenyi Biotec)从健康供体的外周血纯化总T细胞(人)，并用CFSE(CellTraceTMCFSE细胞增殖试剂盒，用于流式细胞术，ThermoFisher)染色，并以每孔2×10e6个细胞接种到24孔板中。将细胞单独与培养基，单独与可溶性抗CD3抗体(1μg/ml的克隆OKT3)，与抗CD3抗体加抗CD28抗体(1μg/ml的克隆28.2)或与抗CD3抗体加10、100或1000ng/ml的蛋白A分别在37℃孵育5天。
在第5天，洗涤细胞并用DAPI(排除死细胞)和特异性抗体染色。用Guava EasyCyte12流式细胞仪(EMD Millipore)通过流式细胞术测量前向散射(FSC或大小)和CFSE稀释(增殖的测定)的表达。使用FlowJo 10.1软件(FlowJo，LLC)对每个样品至少一万个记录的事件进行数据分析。响应细胞的百分比通过使用培养基对照基于前向散射和CFSE确定合适的门限位置来测定。细胞尺寸增大或CFSE水平降低的细胞被标记为响应细胞。下表中示出了来自一个供体的两个生物复制的个体数据。这些结果与来自其他供体的结果一致，并且清楚地表明，与单独的抗体刺激相比，用蛋白A体外处理人T细胞增强了T细胞的活化和增殖。
增强的人T细胞活化的定量：
实施例10：受体结合测定
对于评估OX40L与其相应受体的功能性结合的ELISA测定，用1μg/ml OX40-Fc(Bio-Techne GmbH,Wiesbaden-Nordenstadt，德国)包被微量滴定板。在用StartingBlock(Life Technologies GmbH,Darmstadt,Germany)封闭后，将孔与指定浓度的不同构型的GITRL化合物(蛋白A、蛋白B和蛋白C)一起孵育。经由GITRL的Strep标签II使用抗Strep标签-过氧化物酶StrepTactin-HRP(1:5000,IBA GmbH,Goettingen，德国)，以及随后在ELISA读取器中检测450nm波长处的转化的氧化物酶-底物TMB一(one)(Kem-En-TecDiagnostics,Taastrup，丹麦)检测结合到其相应受体的GITRL。图6清楚地显示了本发明所有检验蛋白质构型的功能性结合。N末端和C末端缩短的变体的结合能力与蛋白A相当。
序列表
<110> 阿珀吉科吉尼科斯股份公司（Apogenix AG）
<120> 单链GITR受体激动剂蛋白
<130> PN18016356P
<160> 50
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 177
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> GITR配体WT
<400> 1
Met Cys Leu Ser His Leu Glu Asn Met Pro Leu Ser His Ser Arg Thr
1 5 10 15
Gln Gly Ala Gln Arg Ser Ser Trp Lys Leu Trp Leu Phe Cys Ser Ile
20 25 30
Val Met Leu Leu Phe Leu Cys Ser Phe Ser Trp Leu Ile Phe Ile Phe
35 40 45
Leu Gln Leu Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro
50 55 60
Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn
65 70 75 80
Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu
85 90 95
Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro
100 105 110
Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr
115 120 125
Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val
130 135 140
Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys
145 150 155 160
Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile
165 170 175
Ser
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 接头
<400> 2
Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 接头
<400> 3
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 接头
<400> 4
Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 接头
<400> 5
Gly Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 6
<211> 4
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 接头
<400> 6
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 接头
<400> 7
Gly Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 接头
<400> 8
Gly Gly Asn Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 接头
<400> 9
Gly Gly Asn Gly Ser Gly
1 5
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 接头
<400> 10
Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 11
<211> 4
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 接头
<400> 11
Gly Ser Gly Ser
1
<210> 12
<211> 3
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 接头
<400> 12
Gly Ser Gly
1
<210> 13
<211> 218
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> IGG1-Fc N297S
<400> 13
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
115 120 125
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
180 185 190
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 14
<211> 217
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> IGG1-Fc WT
<400> 14
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 15
<211> 667
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 蛋白A (GITRL去糖基化（deglyco）Fc)
<400> 15
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Val Phe Val Leu Leu Val Trp Val Pro
1 5 10 15
Ala Gly Asn Gly Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly
20 25 30
Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val
35 40 45
Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr
50 55 60
Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala
65 70 75 80
Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu
85 90 95
Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His
100 105 110
Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu
115 120 125
Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe
130 135 140
Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Thr Ala Lys Glu Pro
145 150 155 160
Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser
165 170 175
Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile
180 185 190
Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala
195 200 205
Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys
210 215 220
Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly
225 230 235 240
Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn
245 250 255
Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu
260 265 270
Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser
275 280 285
Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser
290 295 300
Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser
305 310 315 320
Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly
325 330 335
Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val
340 345 350
Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser
355 360 365
Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr
370 375 380
Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr
385 390 395 400
Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser
405 410 415
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
420 425 430
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
435 440 445
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
450 455 460
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
465 470 475 480
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
485 490 495
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
500 505 510
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
515 520 525
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
530 535 540
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
545 550 555 560
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
565 570 575
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
580 585 590
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
595 600 605
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
610 615 620
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
625 630 635 640
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ser Ser Ser Ser
645 650 655
Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
660 665
<210> 16
<211> 21
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 16
Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His
1 5 10 15
Thr Cys Pro Pro Cys
20
<210> 17
<211> 20
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 通用信号肽
<400> 17
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Val Phe Val Leu Leu Val Trp Val Pro
1 5 10 15
Ala Gly Asn Gly
20
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 带有strep标签的丝氨酸接头
<400> 18
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5 10 15
<210> 19
<211> 20
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 19
Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Cys
20
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 20
Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
1 5 10 15
Pro Pro Cys
<210> 21
<211> 18
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 21
Gly Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 22
Gly Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
<210> 23
<211> 18
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 23
Gly Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 24
<211> 20
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 24
Gly Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ser
20
<210> 25
<211> 653
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 蛋白A - 无strep标签
<400> 25
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Val Phe Val Leu Leu Val Trp Val Pro
1 5 10 15
Ala Gly Asn Gly Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly
20 25 30
Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val
35 40 45
Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr
50 55 60
Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala
65 70 75 80
Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu
85 90 95
Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His
100 105 110
Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu
115 120 125
Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe
130 135 140
Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Thr Ala Lys Glu Pro
145 150 155 160
Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser
165 170 175
Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile
180 185 190
Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala
195 200 205
Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys
210 215 220
Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly
225 230 235 240
Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn
245 250 255
Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu
260 265 270
Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser
275 280 285
Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser
290 295 300
Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser
305 310 315 320
Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly
325 330 335
Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val
340 345 350
Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser
355 360 365
Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr
370 375 380
Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr
385 390 395 400
Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser
405 410 415
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
420 425 430
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
435 440 445
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
450 455 460
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
465 470 475 480
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
485 490 495
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
500 505 510
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
515 520 525
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
530 535 540
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
545 550 555 560
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
565 570 575
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
580 585 590
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
595 600 605
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
610 615 620
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
625 630 635 640
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
645 650
<210> 26
<211> 652
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 融合至Seq_14的GITRL-wt
<400> 26
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Val Phe Val Leu Leu Val Trp Val Pro
1 5 10 15
Ala Gly Asn Gly Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly
20 25 30
Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val
35 40 45
Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr
50 55 60
Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala
65 70 75 80
Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu
85 90 95
Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His
100 105 110
Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu
115 120 125
Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe
130 135 140
Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Thr Ala Lys Glu Pro
145 150 155 160
Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser
165 170 175
Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile
180 185 190
Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala
195 200 205
Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys
210 215 220
Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly
225 230 235 240
Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn
245 250 255
Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu
260 265 270
Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser
275 280 285
Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser
290 295 300
Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser
305 310 315 320
Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly
325 330 335
Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val
340 345 350
Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser
355 360 365
Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr
370 375 380
Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr
385 390 395 400
Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser
405 410 415
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
420 425 430
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
435 440 445
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
450 455 460
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
465 470 475 480
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
485 490 495
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
500 505 510
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
515 520 525
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
530 535 540
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
545 550 555 560
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
565 570 575
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
580 585 590
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
595 600 605
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
610 615 620
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
625 630 635 640
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
645 650
<210> 27
<211> 633
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 融合至Seq_13的GITRL-wt(无信号（sig）、无strep标签、 无糖基化（glyco）)
<400> 27
Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser
1 5 10 15
Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser
20 25 30
Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly
35 40 45
Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val
50 55 60
Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser
65 70 75 80
Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr
85 90 95
Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr
100 105 110
Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser
115 120 125
Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys
130 135 140
Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro
145 150 155 160
Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly
165 170 175
Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp
180 185 190
Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln
195 200 205
Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu
210 215 220
Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln
225 230 235 240
Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro
245 250 255
Gln Phe Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Thr Ala Lys
260 265 270
Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met
275 280 285
Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu
290 295 300
Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro
305 310 315 320
Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys
325 330 335
Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn
340 345 350
Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile
355 360 365
Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile
370 375 380
Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser
385 390 395 400
Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
405 410 415
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
420 425 430
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
435 440 445
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
450 455 460
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
465 470 475 480
Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
485 490 495
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
500 505 510
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
515 520 525
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
530 535 540
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
545 550 555 560
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
565 570 575
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
580 585 590
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
595 600 605
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
610 615 620
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
625 630
<210> 28
<211> 647
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 融合至Seq_13的GITRL-wt(无信号、 无糖基化)
<400> 28
Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser
1 5 10 15
Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser
20 25 30
Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly
35 40 45
Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val
50 55 60
Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser
65 70 75 80
Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr
85 90 95
Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr
100 105 110
Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser
115 120 125
Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys
130 135 140
Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro
145 150 155 160
Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly
165 170 175
Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp
180 185 190
Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln
195 200 205
Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu
210 215 220
Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln
225 230 235 240
Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro
245 250 255
Gln Phe Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Thr Ala Lys
260 265 270
Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met
275 280 285
Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu
290 295 300
Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro
305 310 315 320
Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys
325 330 335
Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn
340 345 350
Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile
355 360 365
Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile
370 375 380
Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser
385 390 395 400
Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
405 410 415
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
420 425 430
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
435 440 445
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
450 455 460
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
465 470 475 480
Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
485 490 495
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
500 505 510
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
515 520 525
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
530 535 540
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
545 550 555 560
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
565 570 575
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
580 585 590
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
595 600 605
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
610 615 620
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Trp
625 630 635 640
Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
645
<210> 29
<211> 632
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 融合至Seq14的GITRL-wt (无信号、无strep标签)
<400> 29
Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser
1 5 10 15
Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser
20 25 30
Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly
35 40 45
Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val
50 55 60
Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser
65 70 75 80
Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr
85 90 95
Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr
100 105 110
Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser
115 120 125
Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys
130 135 140
Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro
145 150 155 160
Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly
165 170 175
Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp
180 185 190
Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln
195 200 205
Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu
210 215 220
Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln
225 230 235 240
Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro
245 250 255
Gln Phe Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Thr Ala Lys
260 265 270
Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met
275 280 285
Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu
290 295 300
Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro
305 310 315 320
Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys
325 330 335
Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn
340 345 350
Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile
355 360 365
Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile
370 375 380
Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser
385 390 395 400
Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
405 410 415
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
420 425 430
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
435 440 445
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
450 455 460
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
465 470 475 480
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
485 490 495
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
500 505 510
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
515 520 525
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
530 535 540
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
545 550 555 560
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
565 570 575
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
580 585 590
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
595 600 605
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
610 615 620
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
625 630
<210> 30
<211> 633
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 实例
<400> 30
Gln Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser
1 5 10 15
Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser
20 25 30
Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly
35 40 45
Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val
50 55 60
Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser
65 70 75 80
Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr
85 90 95
Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr
100 105 110
Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser
115 120 125
Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys
130 135 140
Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro
145 150 155 160
Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly
165 170 175
Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp
180 185 190
Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln
195 200 205
Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu
210 215 220
Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln
225 230 235 240
Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro
245 250 255
Gln Phe Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Thr Ala Lys
260 265 270
Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met
275 280 285
Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu
290 295 300
Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro
305 310 315 320
Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys
325 330 335
Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn
340 345 350
Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile
355 360 365
Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile
370 375 380
Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser
385 390 395 400
Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
405 410 415
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
420 425 430
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
435 440 445
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
450 455 460
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
465 470 475 480
Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
485 490 495
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
500 505 510
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
515 520 525
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
530 535 540
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
545 550 555 560
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
565 570 575
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
580 585 590
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
595 600 605
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
610 615 620
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
625 630
<210> 31
<211> 619
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 实例
<400> 31
Gln Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met
1 5 10 15
Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu
20 25 30
Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro
35 40 45
Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys
50 55 60
Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn
65 70 75 80
Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile
85 90 95
Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile
100 105 110
Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn
115 120 125
Gly Ser Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln
130 135 140
Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys
145 150 155 160
Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala
165 170 175
Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr
180 185 190
Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln
195 200 205
Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu
210 215 220
Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly
225 230 235 240
Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly
245 250 255
Asn Gly Ser Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp
260 265 270
Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp
275 280 285
Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val
290 295 300
Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu
305 310 315 320
Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile
325 330 335
Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp
340 345 350
Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp
355 360 365
Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser Ser Ser
370 375 380
Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
385 390 395 400
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
405 410 415
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420 425 430
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
435 440 445
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450 455 460
Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
465 470 475 480
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
485 490 495
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
545 550 555 560
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
565 570 575
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
580 585 590
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
595 600 605
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
610 615
<210> 32
<211> 618
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 实例
<400> 32
Gln Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met
1 5 10 15
Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu
20 25 30
Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro
35 40 45
Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys
50 55 60
Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn
65 70 75 80
Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile
85 90 95
Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile
100 105 110
Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn
115 120 125
Gly Ser Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp
130 135 140
Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp
145 150 155 160
Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val
165 170 175
Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu
180 185 190
Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser Gly Ser
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Gly Asn Gly Ser Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser
260 265 270
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275 280 285
Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly
290 295 300
Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val
305 310 315 320
Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser
325 330 335
Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr
340 345 350
Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr
355 360 365
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370 375 380
Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
385 390 395 400
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
405 410 415
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
420 425 430
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
435 440 445
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
450 455 460
Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
465 470 475 480
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
485 490 495
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
500 505 510
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
515 520 525
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
530 535 540
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
545 550 555 560
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
565 570 575
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
580 585 590
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
595 600 605
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
610 615
<210> 33
<211> 601
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 实例
<400> 33
Gln Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met
1 5 10 15
Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu
20 25 30
Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro
35 40 45
Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys
50 55 60
Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn
65 70 75 80
Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile
85 90 95
Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile
100 105 110
Ile Leu Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Pro Cys Met Ala
115 120 125
Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro
130 135 140
Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn
145 150 155 160
Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn
165 170 175
Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile
180 185 190
Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr
195 200 205
Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His
210 215 220
Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Gly
225 230 235 240
Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu
245 250 255
Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys
260 265 270
Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile
275 280 285
Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe
290 295 300
Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn
305 310 315 320
Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly
325 330 335
Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn
340 345 350
Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Gly Ser Ser Ser Ser Ser
355 360 365
Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
370 375 380
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
385 390 395 400
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
405 410 415
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
420 425 430
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
435 440 445
Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
450 455 460
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
465 470 475 480
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
485 490 495
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
500 505 510
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
515 520 525
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
530 535 540
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
545 550 555 560
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
565 570 575
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
580 585 590
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
595 600
<210> 34
<211> 624
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 实例
<400> 34
Gln Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln
1 5 10 15
Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys
20 25 30
Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala
35 40 45
Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr
50 55 60
Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln
65 70 75 80
Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu
85 90 95
Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly
100 105 110
Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly
115 120 125
Asn Gly Ser Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser
130 135 140
Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser
145 150 155 160
Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly
165 170 175
Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val
180 185 190
Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser
195 200 205
Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr
210 215 220
Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr
225 230 235 240
Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser
245 250 255
Gly Ser Gly Asn Gly Ser Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro
260 265 270
Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn
275 280 285
Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu
290 295 300
Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro
305 310 315 320
Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr
325 330 335
Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val
340 345 350
Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys
355 360 365
Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile
370 375 380
Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr
385 390 395 400
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
405 410 415
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
420 425 430
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
435 440 445
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
450 455 460
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val
465 470 475 480
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
485 490 495
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
500 505 510
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
515 520 525
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
530 535 540
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
545 550 555 560
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
565 570 575
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
580 585 590
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
595 600 605
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
610 615 620
<210> 35
<211> 609
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 实例
<400> 35
Gln Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met
1 5 10 15
Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu
20 25 30
Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro
35 40 45
Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys
50 55 60
Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn
65 70 75 80
Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile
85 90 95
Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile
100 105 110
Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Pro
115 120 125
Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser
130 135 140
Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile
145 150 155 160
Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala
165 170 175
Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys
180 185 190
Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly
195 200 205
Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn
210 215 220
Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu
225 230 235 240
Leu Ala Asn Pro Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Pro Cys Met Ala
245 250 255
Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro
260 265 270
Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn
275 280 285
Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn
290 295 300
Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile
305 310 315 320
Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr
325 330 335
Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His
340 345 350
Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn
355 360 365
Pro Gln Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys
370 375 380
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
385 390 395 400
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
405 410 415
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
420 425 430
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
435 440 445
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val
450 455 460
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
465 470 475 480
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
485 490 495
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
500 505 510
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
515 520 525
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
530 535 540
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
545 550 555 560
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
565 570 575
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
580 585 590
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
595 600 605
Lys
<210> 36
<211> 394
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> scGITRL-RBD的实例
<400> 36
Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser
1 5 10 15
Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser
20 25 30
Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly
35 40 45
Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val
50 55 60
Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser
65 70 75 80
Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr
85 90 95
Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr
100 105 110
Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser
115 120 125
Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys
130 135 140
Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro
145 150 155 160
Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly
165 170 175
Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp
180 185 190
Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln
195 200 205
Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu
210 215 220
Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln
225 230 235 240
Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro
245 250 255
Gln Phe Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Thr Ala Lys
260 265 270
Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met
275 280 285
Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu
290 295 300
Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro
305 310 315 320
Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys
325 330 335
Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn
340 345 350
Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile
355 360 365
Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile
370 375 380
Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser
385 390
<210> 37
<211> 2006
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> GITR受体激动剂融合蛋白的核酸序列
<400> 37
aagctttagg gataacaggg taatagccgc caccatggag actgacaccc tgctggtgtt 60
cgtgctgctg gtctgggtgc ctgcaggaaa tggagaaact gccaaagagc cctgtatggc 120
caagtttggc cctcttccct ctaagtggca gatggcttcc tctgaaccac catgcgtgaa 180
caaagtgagc gactggaaac tggagatctt gcagaacggg ctgtatttga tctacggcca 240
ggtggcccct aatgctaact ataacgatgt agccccattt gaggtcagac tgtataagaa 300
taaggacatg attcagactc tgaccaataa gtccaagatc cagaatgtgg gaggcactta 360
cgaattgcac gtgggtgata ccatcgattt gatcttcaac agcgaacatc aggtgctcaa 420
gaacaataca tactggggaa ttatactgct ggcaaaccca cagttcattt ccgggtccgg 480
ttctggtaac ggctctgaga cagcaaaaga gccctgcatg gcaaaattcg gtcctctgcc 540
cagtaagtgg caaatggcat catccgaacc tccctgtgtg aataaggtgt cagactggaa 600
acttgagatc cttcagaatg gactctacct catctatgga caggttgctc ctaacgctaa 660
ttacaatgat gtggctccct tcgaagttcg gctgtacaag aataaggata tgatacagac 720
ccttactaac aaaagcaaaa ttcagaacgt gggcggaaca tacgagctgc atgtcggtga 780
cacgattgat ctgatcttca actcagagca tcaggtcctg aagaataaca cctactgggg 840
cattattctg ctcgccaatc cccaatttat atccgggagc gggtcaggca acggcagtga 900
gacagccaag gaaccatgta tggctaaatt tgggcccctg ccatctaaat ggcagatggc 960
atctagcgaa cctccctgcg ttaacaaggt atccgactgg aaattggaga tcctccagaa 1020
cggactgtac ctgatctatg gccaagtcgc cccaaatgcc aattacaatg acgtagctcc 1080
ctttgaggtc aggctctata agaacaaaga catgattcaa acacttacca acaagagtaa 1140
gatacagaat gtgggcggaa cctatgaact gcacgttggg gataccattg acctgatctt 1200
caacagtgag caccaagtcc tcaagaataa cacttattgg ggtatcatcc tgctggccaa 1260
ccctcagttt atcagcggat cctcgagttc atcgtcctca tccggctcat gtgataagac 1320
ccacacctgc cctccctgtc ctgcccctga gctgctgggc ggaccttctg tgttcctgtt 1380
cccccccaag cctaaggaca ccctgatgat ctccaggacc cctgaggtga cctgtgtggt 1440
ggtggacgtg tctcacgaag atcccgaggt gaagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga 1500
ggtccacaac gccaagacca agcctaggga ggagcagtac agctccacct accgggtggt 1560
gtctgtgctg accgtgctgc accaggattg gctgaacgga aaggagtata agtgtaaggt 1620
ctccaacaag gccctgcctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaggcca agggccagcc 1680
tcgggagcct caggtgtaca ccctgcctcc tagcagggag gagatgacca agaaccaggt 1740
gtccctgacc tgtctggtga agggcttcta cccttccgat atcgccgtgg agtgggagtc 1800
taatggccag cccgagaaca actacaagac cacccctcct gtgctggact ctgacggctc 1860
cttcttcctg tactccaagc tgaccgtgga caagtccaga tggcagcagg gcaacgtgtt 1920
ctcctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caatcactac acccagaagt ccctgtctct 1980
gagtccgggc aagtaatagg cgcgcc 2006
<210> 38
<211> 203
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 融合至RB69 FOLDON的GITRL
<400> 38
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Val Phe Val Leu Leu Val Trp Val Pro
1 5 10 15
Ala Gly Asn Gly Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly
20 25 30
Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val
35 40 45
Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr
50 55 60
Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala
65 70 75 80
Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu
85 90 95
Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His
100 105 110
Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu
115 120 125
Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe
130 135 140
Ile Ser Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly
145 150 155 160
Tyr Ile Glu Asp Ala Pro Ser Asp Gly Lys Phe Tyr Val Arg Lys Asp
165 170 175
Gly Ala Trp Val Glu Leu Pro Thr Ala Ser Gly Pro Ser Ser Ser Ser
180 185 190
Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
195 200
<210> 39
<211> 394
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> scGITRL-RBD的实例
<400> 39
Gln Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser
1 5 10 15
Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser
20 25 30
Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly
35 40 45
Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val
50 55 60
Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser
65 70 75 80
Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr
85 90 95
Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr
100 105 110
Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser
115 120 125
Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys
130 135 140
Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro
145 150 155 160
Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly
165 170 175
Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp
180 185 190
Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln
195 200 205
Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu
210 215 220
Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln
225 230 235 240
Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro
245 250 255
Gln Phe Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Thr Ala Lys
260 265 270
Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met
275 280 285
Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu
290 295 300
Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro
305 310 315 320
Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys
325 330 335
Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn
340 345 350
Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile
355 360 365
Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile
370 375 380
Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser
385 390
<210> 40
<211> 382
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> scGITRL-RBD的实例
<400> 40
Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met
1 5 10 15
Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu
20 25 30
Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro
35 40 45
Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys
50 55 60
Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn
65 70 75 80
Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile
85 90 95
Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile
100 105 110
Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn
115 120 125
Gly Ser Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp
130 135 140
Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp
145 150 155 160
Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val
165 170 175
Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu
180 185 190
Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile
195 200 205
Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp
210 215 220
Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp
225 230 235 240
Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser Gly Ser
245 250 255
Gly Asn Gly Ser Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser
260 265 270
Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser
275 280 285
Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly
290 295 300
Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val
305 310 315 320
Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser
325 330 335
Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr
340 345 350
Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr
355 360 365
Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser
370 375 380
<210> 41
<211> 382
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> scGITRL-RBD的实例
<400> 41
Gln Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met
1 5 10 15
Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu
20 25 30
Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro
35 40 45
Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys
50 55 60
Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn
65 70 75 80
Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile
85 90 95
Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile
100 105 110
Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn
115 120 125
Gly Ser Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp
130 135 140
Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp
145 150 155 160
Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val
165 170 175
Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu
180 185 190
Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile
195 200 205
Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp
210 215 220
Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp
225 230 235 240
Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser Gly Ser
245 250 255
Gly Asn Gly Ser Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser
260 265 270
Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser
275 280 285
Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly
290 295 300
Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val
305 310 315 320
Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser
325 330 335
Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr
340 345 350
Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr
355 360 365
Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser
370 375 380
<210> 42
<211> 385
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> scGITRL-RBD的实例
<400> 42
Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln
1 5 10 15
Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys
20 25 30
Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala
35 40 45
Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr
50 55 60
Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln
65 70 75 80
Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu
85 90 95
Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly
100 105 110
Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly
115 120 125
Asn Gly Ser Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser
130 135 140
Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser
145 150 155 160
Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly
165 170 175
Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val
180 185 190
Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser
195 200 205
Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr
210 215 220
Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr
225 230 235 240
Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser
245 250 255
Gly Ser Gly Asn Gly Ser Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro
260 265 270
Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn
275 280 285
Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu
290 295 300
Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro
305 310 315 320
Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr
325 330 335
Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val
340 345 350
Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys
355 360 365
Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile
370 375 380
Ser
385
<210> 43
<211> 385
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> scGITRL-RBD的实例
<400> 43
Gln Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln
1 5 10 15
Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys
20 25 30
Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala
35 40 45
Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr
50 55 60
Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln
65 70 75 80
Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu
85 90 95
Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly
100 105 110
Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly
115 120 125
Asn Gly Ser Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser
130 135 140
Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser
145 150 155 160
Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly
165 170 175
Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val
180 185 190
Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser
195 200 205
Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr
210 215 220
Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr
225 230 235 240
Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser
245 250 255
Gly Ser Gly Asn Gly Ser Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro
260 265 270
Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn
275 280 285
Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu
290 295 300
Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro
305 310 315 320
Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr
325 330 335
Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val
340 345 350
Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys
355 360 365
Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile
370 375 380
Ser
385
<210> 44
<211> 380
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> scGITRL-RBD的实例
<400> 44
Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met
1 5 10 15
Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu
20 25 30
Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro
35 40 45
Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys
50 55 60
Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn
65 70 75 80
Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile
85 90 95
Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile
100 105 110
Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn
115 120 125
Gly Ser Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln
130 135 140
Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys
145 150 155 160
Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala
165 170 175
Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr
180 185 190
Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln
195 200 205
Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu
210 215 220
Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly
225 230 235 240
Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly
245 250 255
Asn Gly Ser Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp
260 265 270
Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp
275 280 285
Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val
290 295 300
Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu
305 310 315 320
Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile
325 330 335
Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp
340 345 350
Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp
355 360 365
Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser
370 375 380
<210> 45
<211> 380
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> scGITRL-RBD的实例
<400> 45
Gln Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met
1 5 10 15
Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu
20 25 30
Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro
35 40 45
Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys
50 55 60
Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn
65 70 75 80
Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile
85 90 95
Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile
100 105 110
Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn
115 120 125
Gly Ser Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln
130 135 140
Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys
145 150 155 160
Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala
165 170 175
Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr
180 185 190
Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln
195 200 205
Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu
210 215 220
Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly
225 230 235 240
Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly
245 250 255
Asn Gly Ser Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp
260 265 270
Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp
275 280 285
Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val
290 295 300
Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu
305 310 315 320
Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile
325 330 335
Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp
340 345 350
Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp
355 360 365
Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser
370 375 380
<210> 46
<211> 362
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> scGITRL-RBD的实例
<400> 46
Gln Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met
1 5 10 15
Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu
20 25 30
Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro
35 40 45
Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys
50 55 60
Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn
65 70 75 80
Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile
85 90 95
Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile
100 105 110
Ile Leu Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Pro Cys Met Ala
115 120 125
Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro
130 135 140
Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn
145 150 155 160
Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn
165 170 175
Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile
180 185 190
Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr
195 200 205
Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His
210 215 220
Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Gly
225 230 235 240
Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu
245 250 255
Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys
260 265 270
Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile
275 280 285
Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe
290 295 300
Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn
305 310 315 320
Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly
325 330 335
Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn
340 345 350
Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala
355 360
<210> 47
<211> 370
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> scGITRL-RBD的实例
<400> 47
Gln Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met
1 5 10 15
Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu
20 25 30
Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro
35 40 45
Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys
50 55 60
Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn
65 70 75 80
Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile
85 90 95
Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile
100 105 110
Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Pro
115 120 125
Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser
130 135 140
Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile
145 150 155 160
Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala
165 170 175
Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys
180 185 190
Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly
195 200 205
Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn
210 215 220
Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu
225 230 235 240
Leu Ala Asn Pro Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Pro Cys Met Ala
245 250 255
Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro
260 265 270
Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn
275 280 285
Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn
290 295 300
Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile
305 310 315 320
Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr
325 330 335
Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His
340 345 350
Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn
355 360 365
Pro Gln
370
<210> 48
<211> 358
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> scGITRL-RBD的实例
<400> 48
Gln Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met
1 5 10 15
Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu
20 25 30
Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro
35 40 45
Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys
50 55 60
Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn
65 70 75 80
Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile
85 90 95
Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile
100 105 110
Ile Leu Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Pro Cys Met Ala
115 120 125
Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro
130 135 140
Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn
145 150 155 160
Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn
165 170 175
Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile
180 185 190
Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr
195 200 205
Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His
210 215 220
Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Gly
225 230 235 240
Ser Gly Ser Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp
245 250 255
Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp
260 265 270
Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val
275 280 285
Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu
290 295 300
Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile
305 310 315 320
Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp
325 330 335
Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp
340 345 350
Gly Ile Ile Leu Leu Ala
355
<210> 49
<211> 621
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 实例
<400> 49
Gln Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met
1 5 10 15
Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu
20 25 30
Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro
35 40 45
Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys
50 55 60
Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn
65 70 75 80
Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile
85 90 95
Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile
100 105 110
Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn
115 120 125
Gly Ser Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp
130 135 140
Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp
145 150 155 160
Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val
165 170 175
Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu
180 185 190
Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile
195 200 205
Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp
210 215 220
Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp
225 230 235 240
Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser Gly Ser
245 250 255
Gly Asn Gly Ser Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser
260 265 270
Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser
275 280 285
Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly
290 295 300
Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val
305 310 315 320
Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser
325 330 335
Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr
340 345 350
Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr
355 360 365
Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Ser
370 375 380
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
385 390 395 400
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
405 410 415
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
420 425 430
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
435 440 445
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
450 455 460
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
465 470 475 480
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
485 490 495
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
500 505 510
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
515 520 525
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
530 535 540
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
545 550 555 560
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
565 570 575
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
580 585 590
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
595 600 605
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
610 615 620
<210> 50
<211> 597
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 实例
<400> 50
Gln Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met
1 5 10 15
Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu
20 25 30
Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro
35 40 45
Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys
50 55 60
Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn
65 70 75 80
Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile
85 90 95
Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile
100 105 110
Ile Leu Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Pro Cys Met Ala
115 120 125
Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro
130 135 140
Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn
145 150 155 160
Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn
165 170 175
Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile
180 185 190
Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr
195 200 205
Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His
210 215 220
Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Gly
225 230 235 240
Ser Gly Ser Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp
245 250 255
Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp
260 265 270
Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val
275 280 285
Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu
290 295 300
Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile
305 310 315 320
Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp
325 330 335
Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp
340 345 350
Gly Ile Ile Leu Leu Ala Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly
355 360 365
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
370 375 380
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
385 390 395 400
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
405 410 415
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
420 425 430
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser
435 440 445
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
450 455 460
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
465 470 475 480
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
485 490 495
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
500 505 510
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
515 520 525
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
530 535 540
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
545 550 555 560
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
565 570 575
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
580 585 590
Leu Ser Pro Gly Lys
595

Claims (24)

1.一种包含单链融合多肽的GITR受体激动剂蛋白，包括：
(i)第一可溶性GITRL结构域，
(ii)第一肽接头，
(iii)第二可溶性GITRL结构域，
(iv)第二肽接头，和
(v)第三可溶性GITRL结构域，以及
(vi)铰链接头，选自包括SEQ ID NO:16和19-24的组，以及
(vii)抗体Fc片段，其中所述抗体Fc片段(vii)由SEQ ID NO:13或14中所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:13或14的氨基酸1-217组成。
2.根据权利要求1所述的GITR受体激动剂蛋白，其中，所述抗体Fc片段(vii)通过铰链接头(vi)融合至第三GITRL结构域(v)的C末端端部。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的GITR受体激动剂蛋白，其基本上是非聚集的。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的GITR受体激动剂蛋白，其中，所述第二和/或第三可溶性GITRL结构域是任选地包括氨基酸序列突变的N末端缩短的结构域。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的GITR受体激动剂蛋白，其中，所述可溶性GITRL结构域中的至少一个，特别是所述可溶性GITRL结构域(iii)和(v)中的至少一个，是具有起始于根据SEQ ID NO:1的人GITRL的氨基酸E52或A54或K55或E56或P57的N末端序列的可溶性GITRL结构域，以及其中E52或A54或K55或E56可以由中性氨基酸例如Ser或Gly替换。
6.根据权利要求5所述的GITR受体激动剂蛋白，其中，所述可溶性GITRL结构域中的至少一个，特别是所述可溶性GITRL结构域(iii)和(v)中的至少一个，是具有N末端序列的可溶性GITRL结构域，所述N末端序列选自
(a)E52–P57以及
(b)(Gly/Ser)56–P57。
7.根据权利要求5或6所述的GITR受体激动剂蛋白，其中，可溶性GITRL结构域以SEQ IDNO:1的氨基酸S177结束和/或任选地包括在位置E52、A54、K55、L65A、P66A、K68A、P77、N80、V82、E88、L90、Q91、N106、N120、N129、K121、D122、V144、L159、N161、N172、P173、Q174处或在所述位置中的两个或更多个处的突变。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的GITR受体激动剂蛋白，其中，至少所述可溶性GITRL结构域(iii)是以根据SEQ ID NO:1的A170、P171或Q174结束的C末端缩短的GITRL结构域。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的GITR受体激动剂蛋白，其中，所述可溶性GITRL结构域(i)、(iii)和(v)由根据SEQ ID NO:1的人GITRL的氨基酸E52-S177组成。
10.根据前述权利要求中任一项所述的GITR受体激动剂蛋白，其中，所述第一和第二肽接头(ii)和(iv)独立地具有3-8个氨基酸的长度，特别是3、4、5、6、7或8个氨基酸的长度，并且优选地是甘氨酸/丝氨酸接头，任选地包括可以糖基化的天冬酰胺残基。
11.根据权利要求10所述的GITR受体激动剂蛋白，其中，所述第一和所述第二肽接头(ii)和(iv)由根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
12.根据前述权利要求中任一项所述的GITR受体激动剂蛋白，其另外包含N末端信号肽结构域，例如SEQ ID NO:17的N末端信号肽结构域，其可以包括蛋白酶切割位点，和/或其另外包括C末端元件，所述C末端元件可以包含和/或连接至识别/纯化结构域，例如根据SEQID NO:18的Strep标签。
13.根据前述权利要求中任一项所述的GITR受体激动剂蛋白，包括SEQ ID NO:15、SEQID NO:25-35和SEQ ID NO:49-50中任一者的氨基酸序列。
14.根据前述权利要求中任一项所述的GITR受体激动剂蛋白，包括两种多肽，每种多肽具有如SEQ ID NO:27、29、30、31、32、33、34、35、49或50中所示的氨基酸序列。
15.根据权利要求14所述的GITR受体激动剂蛋白，其中，所述两种多肽通过在以下位置处形成的三个链间二硫键而共价连接：
a)SEQ ID No:27、29、30的位置406、412和415，或
b)SEQ ID NO:31的位置392、398和401，或
c)SEQ ID NO:32的位置391、397和400，或
d)SEQ ID NO:33的位置374、380和383，或
e)SEQ ID NO:34的位置397、403和406，或
f)SEQ ID NO:35的位置382、388和391，或
g)SEQ ID NO:49的位置394、400和403，或
h)SEQ ID NO:50的位置370、376和379。
16.根据权利要求14或15所述的GITR受体激动剂蛋白，包含选自SEQ ID NO:27、29、30的N132和N266，或SEQ ID NO:31的N128和N257，或SEQ ID NO:32的N128和N258，或SEQ IDNO:33的N122和N245，或SEQ ID NO:34的N129和N260，或SEQ ID NO:35的N125和N250，或SEQID NO:49的N128和N258，或SEQ ID NO:50的N122的列表的一种或多种N糖基化的天冬酰胺残基。
17.根据前述权利要求中任一项所述的GITR受体激动剂蛋白，其中，所述一种或多种多肽进一步翻译后修饰。
18.根据权利要求17所述的GITR受体激动剂蛋白，其中，所述翻译后修饰包括N-末端谷氨酰胺至焦谷氨酸的修饰。
19.一种核酸分子，编码权利要求1-18中任一项所述的GITR受体激动剂蛋白，优选地与表达控制序列可操作性连接。
20.一种表达载体，包括权利要求19所述的核酸分子。
21.一种细胞或非人类生物，用权利要求19所述的核酸分子或权利要求20所述的载体转化或转染，其中，所述细胞是例如原核细胞或真核细胞，优选哺乳动物细胞，或更优选人细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
22.一种药物或诊断组合物，包括作为活性剂的权利要求1-18中任一项所述的GITR受体激动剂蛋白、权利要求19所述的核酸分子或权利要求20所述的载体。
23.根据权利要求22所述的药物或诊断组合物，还包括一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。
24.根据权利要求22或23所述的药物组合物用于治疗，更具体地用于预防和/或治疗由GITRL功能障碍引起的、与GITRL功能障碍相关的和/或伴随GITRL功能障碍的疾患，特别是增殖性疾患，诸如肿瘤，例如实体肿瘤或淋巴肿瘤；传染病；炎性疾病；代谢性疾病；自身免疫性疾病，例如类风湿性和/或关节炎疾病；退行性疾病，例如神经退行性疾病，诸如多发性硬化；凋亡相关疾病或移植排斥。
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