CN102250250A - 一种人鼠嵌合型抗人CD19抗体Hm2E8b及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供抗一种人鼠嵌合型抗人CD19抗体Hm2E8b，是鼠源性单克隆抗体ZCH-4-2E8的单链抗体和人IgG的Fc片段结合的嵌合抗体。本发明提供的单抗具有良好的识别B淋巴细胞肿瘤细胞膜CD19抗原而不识别其他组织、细胞成分的特性，体外实验表明，该抗体对CD19阳性的细胞具有良好的选择性杀伤作用，因此，可在制备治疗B淋巴细胞性恶性肿瘤包括白血病、淋巴瘤药物中的应用。

Description

一种人鼠嵌合型抗人CD19抗体Hm2E8b及用途

技术领域

本发明属生物技术，主要涉及抗CD19人鼠嵌合抗体Hm2E8b的研制及在制备B淋巴细胞恶性肿瘤靶向治疗药物中的用途。

背景技术

自1975年，Milstein和Kohler成功建立了制备单克隆抗体的方法以来,随着抗体工程技术的发展,单克隆抗体已经广泛用于基础研究和临床诊断及治疗。单克隆抗体分子量小，毒性小，特异性高，但是目前大多数高亲和力的单抗是鼠源性的，在临床导向治疗中可能发生血清病或产生人抗鼠免疫球蛋白抗体(human anti-mouse antibody，HAMA)，只有将其进行人源化的改造，将抗体分子中部分鼠源片段替换为人源片段，以大大降低或基本消除抗体的免疫原性。抗体与抗原的结合位点位于可变区Fv段，而免疫原性主要位于恒定区Fc段。最简单的改造就是弃Fc段，保留Fv段，但是由于天然走向的Fv抗体片段，VH和VL容易发生自由解离，结构不稳定，故现在较为多见的就是构建单链抗体（single chain Fv antibody fragments，scFv）。

ScFv是由一个携带了完整抗原结合位点的单基因编码而成，由抗体重链（VH）和轻链（VL）的可变区通过一段弹性短肽（Linker）相连而成，是最小的功能性抗体片段，仅有一个抗原结合位点，拥有与原代抗体相似的抗原结合力，分子量约27-30 kDa。与天然走向的Fv抗体片段相比，由于减少了VH和VL的自由解离，更为稳定，局部浓度更高。Linker约10-25个氨基酸，大多是由甘氨酸和丝氨酸组成，最常用的是（Gly₄Ser）₃，可以提供足够的弹性和抑制蛋白酶的作用。

scFv分子量小，仅为完整抗体的1/6，与后者相比，它最大的优势就是对肿瘤的穿透率高，静脉给药分布更广泛，加速了与靶位的结合，可以携带药物和某些毒性物质快速到达组织和肿瘤部位。因为缺少恒定区和某些抗体的结合部位，单链抗体具有较低的免疫原性，能够较少非特异性的结合。另外单链抗体半衰期短，体内可以快速清除，因此可广泛应用于药物解毒实验和反射免疫治疗等。

但与典型的抗体不同，scFv分子的最大缺陷就是与靶抗原的单价结合，即使其单价结合具有较高的亲和力，解离也总是很快发生，这使得在体内这样的非平衡环境中不能在靶位长时间停留。近年来许多设计通过交联的方法或者重组融合的方法将scFv改造成二聚体或其它多聚分子， 这些多聚体可以与单一的靶抗原结合或同时和多种靶抗原结合，分子量在60-120kDa，亲和力强，从细胞表面和多价抗原上解离的速度慢，半衰期长，并且保持了较强的肿瘤穿透力。

其中一个有效的办法就是将scFv与Ig的Fc段结合，与免疫球蛋白超家族成员相比，scFv-Fc在肿瘤中的浓度较高，而且通过Fc受体的交联作用，可以延长scFv-Fc在体内的半衰期。γ链的Fc段包含IgG的铰链区，CH₂和CH₃片段，其中铰链区包含了树木不等的半胱氨酸，参与重链间二硫键的形成，有助于二聚体的形成，而CH₂片段可以和各种各样的效应细胞的C1q和Fc受体结合，与C1q发生反应后可以激活补体依赖细胞毒反应（CDC），与Fc受体结合可以激活抗体依赖细胞毒反应（ADCC）和抗体依赖细胞介导的吞噬作用（ADCP）以及通过与Fc新生受体结合控制IgG的分解代谢，通过ADCC和CDC效应，吞噬免疫复合物介导抗原递呈，释放细胞因子和促炎症因子。

CD19是一种跨膜糖蛋白，约95kDa大小，属于免疫球蛋白超家族，存在于B细胞成熟的各个阶段，在大多数的非何杰金氏淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphomas, NHL）和许多白血病包括急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia， ALL）和慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia， CLL）中高表达，而且CD19在造血干细胞以及其它非B系的正常组织中不表达，因此CD19是淋巴细胞起源肿瘤的一个重要的靶位。

在过去的20年中，通过CD20嵌合抗体美罗华（rituximab）的联合化疗，许多B-NHL和B淋巴细胞白血病成功得到了治疗。在美罗华的治疗过程中，部分B细胞肿瘤的病人会出现CD20抗原丢失，部分病人会出现耐药。而且相对于CD20来说，CD19在细胞表面出现较早且存在于整个B细胞的成熟期，在淋巴细胞恶性肿瘤中的表达谱也更广，因此对许多早期B细胞肿瘤来如ALL以及部分CD20^-对美罗华不敏感的肿瘤来说，CD19抗体可作为理想的靶向治疗的药物。

ZCH（Zhejiang Children’s Hospital）-4-2E8（简称2E8），为抗CD19单抗，属鼠IgM亚类，要应用于临床，需要对其进行人源化的改造。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗CD19的人鼠嵌合型的抗体Hm2E8b，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所述，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。

本发明的另一个目的是提供所述的一种抗CD19的人鼠嵌合型的抗体Hm2E8b在制备治疗B淋巴细胞恶性肿瘤药物中的应用。

CD19分子是B淋巴细胞特异性的信号转导表面受体，存在于B细胞成熟的各个阶段，在大多数的非何杰金氏淋巴瘤（NHL）和许多白血病包括急性淋巴细胞白血病（ALL）和慢性淋巴细胞白血病（CLL）中高表达，目前已成为免疫治疗的一个重要靶位。目前针对B系恶性肿瘤的治疗，已经有一些CD19特异性抗体治疗，包括非结合抗体，药物共轭抗体以及双特异性的抗体（CD19-CD3），在体外实验、动物模型、以及早期的临床实验中取得较为理想的成果。但是也存在不少的问题，因此有必要对更多的CD19抗体进行优化。 ZCH-4-2E8单抗具有良好的识别B淋巴细胞肿瘤细胞膜CD19抗原而不识别其他组织、细胞成分的特性，体外实验表明，2E8免疫毒素对2E8阳性的急性B细胞性白血病细胞具有良好的选择性杀伤作用，而对2E8阴性的细胞却无作用，因此，该抗体具有潜在治疗B细胞性恶性肿瘤包括白血病、淋巴瘤的应用前景。但2E8是鼠源性的抗体，应用于人体会产生免疫反应其根本原因是鼠源性免疫球蛋白（抗体）的Fc段对人体具有免疫原性，因此，有必要对鼠源性抗体进行人源化改造。

本发明研制的嵌合抗体Hm2E8b，是通过一系列繁琐而复杂的分子生物学技术构建带有scFv2E8-Fc基因的分泌型真核表达载体，然后转染哺乳动物细胞CHO获得的。该抗体对2E8阳性的急性B细胞性白血病细胞具有良好的选择性杀伤作用，对临床B淋巴细胞性白血病及其它B淋巴细胞恶性肿瘤靶向治疗产生十分重要的应用价值。

附图说明

图1是 2E8 1细胞的总RNA电泳图。

图2是PCR产物Leader-VH2E8和VL2E8电泳图。

图3是PCR产物Leader-scFv2E8电泳图。

图4是TA- Leader-scFv2E8酶切鉴定图。

图5是TA- Leader-scFv2E8测序结果。

图6是TA- Leader-scFv2E8和pHMCH3双酶切电泳图。

图7是pHMCH3-Hm2E8b双酶切鉴定电泳图。

图8是转染级纯pHMCH3-Hm2E8b质粒电泳。

图9是筛选第14天未转染组CHO细胞（A）和转染组细胞(B)。

图10是CHO-Hm2E8b RT-PCR 产物电泳图。

图11是CHO（A）和CHO-Hm2E8b (B)细胞免疫荧光图。

图12是Hm2E8b-CHO亚克隆流式筛选图。

图13是Hm2E8b SDS-PAGE图。

图14是Hm2E8b Western-Blot图。

图15是流式间标法CHO-Hm2E8b细胞培养上清Hm2E8b嵌合抗体活性检测结果。

图16是CHO-Hm2E8b细胞培养上清Hm2E8b嵌合抗体对直标单抗2E8-FITC的流式细胞阻滞结果。

图17是Hm2E8b对Nalm6的CDC作用。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例一 真核表达载体 pHMCH3-Hm2E8b 的构建

抽提2E8杂交瘤细胞RNA，以此为模板，通过SOE的方法扩增Leader-scFv2E8片段，建立TA克隆，测序正确后插入pHMCH3载体（带有人IgG1的Fc片段），构建真核表达载体pHMCH3-Hm2E8b。

1. 2E8杂交瘤细胞RNA的抽提和处理

1.1总RNA的抽提

（1） 计数细胞，共5×10⁶个活细胞；

（2） 常温下1000rpm离心15分钟，弃去上清；

（3） 沉淀中加入无菌生理盐水1000rpm离心15分钟，洗涤2次；

（4） 向沉淀中加入1ml TRIZOL（1ml/5×10⁶细胞），立即用1ml移液枪反复吹吸数分钟，将溶液转入1.5ml eppendorf管中，室温下静置5分钟；

（5） 加入0.2ml氯仿，剧烈摇动15秒，室温下静置5分钟；

（6） 4°C下12000g离心15分钟，将水相转入新的1.5ml的eppendorf管中，加入0.5ml异丙醇，立即摇匀，室温下静置5分钟；

（7） 4°C下，12000g离心10分钟；

（8） 弃去上清，加入1.5ml 75% 乙醇，混匀，4°C下，7500g离心5分钟，弃去上清；

（9） 无菌操作台晾干，加入25μl无RNA酶的DEPC水溶解沉淀，-80°C冰箱保存。

1.2 总RNA凝胶电泳及浓度的测定

抽提2组2E8 细胞总 RNA，分别1％ 琼脂糖凝胶电泳，结果显示明显的 28S、18S及5S 3条条带(参见图1，M为分子标志物，泳道1和泳道2均为抽提后的总RNA，其中泳道1加样品过多，泳道2加样品量适中，用于进一步实验。泳道1有杂带，泳道2条带清晰，纯度高，选用泳道2的RNA作为逆转录模板)。取出2μl新抽提的总RNA，加入98μl DEPC水混匀，紫外分光光度计测定A260=0.273，A280=0.150，计算其浓度为0.569（μg/μl）。

1.3 RT合成cDNA（按照逆转录酶说明书进行）

。

2. PCR 反应扩增Leader-scFv2E8片段

2.1 设计引物通过PCR，扩增出2E8的Leader-VH和VL片段，通过重叠延伸PCR的方法将Leader-VH和VL片段通过Linker（Gly₄Ser）₃连接起来，构建Leader-scFv2E8，同时在两端引入酶切位点BamH I和EcoR I。（下划线部分为酶切位点）

重链5’端引物（P1）（SEQ ID NO 3）：

CGCGGATCCATGGATTGGCTGTGG

轻链3’端引物（P2）（SEQ ID NO 4）：

ATACAGACAAGTAGGATGAAGATTGTGTCATCTGGATGTC

重链5’端引物（P3）（SEQ ID NO 5）：

GACATCCAGATGACACAATCTTCATCCTACTTGTCTGTAT

轻链3’端引物（P4）（SEQ ID NO 6）：

CCGGAATTCTTTGATTTCCAGCTTGG 。

2.2 PCR反应体系：

。

2.3 反应条件（表1）：

。

2.4 以2E8杂交瘤细胞cDNA为模板，以P1、P2为引物，用上述PCR反应体系和条件，扩增到产物Leader-VH2E8，约514bp（图2泳道2，为Leader-VH2E8 PCR扩增产物，M为分子量标志物）。

2.5以2E8杂交瘤细胞cDNA为模板，以P3、P4为引物，用上述PCR反应体系和条件，扩增到产物VL2E8，约327bp（图2泳道1，为VL2E8 PCR扩增产物）。

2.6将上述PCR产物Leader-VH2E8和VL2E8在1％的琼脂糖凝胶中电泳，将目的回收纯化，并互为模板互为引物，产物再以P1、P4为引物，SOE扩增到Leader-scFv2E8，约801bp(图3，M为分子标志物，泳道1为Leader-scFv2E8 PCR扩增产物)，PCR产物1％的琼脂糖凝胶中电泳，将目的回收纯化。

反应体系：

反应条件（表2、表3）：

加入P1和P4各1µl，

。

3. TA- Leader-scFv2E8克隆的构建

3.1 PCR产物Leader-scFv2E81%琼脂糖电泳切胶纯化，克隆到pGEM^®-T easy vector中，建立TA- Leader-scFv2E8克隆，挑选3个克隆，命名为TA- Leader-scFv2E8-1、2、3，分别以EcoR I 酶切鉴定，均可见801bp左右目的条带（参见图4，M为分子标志物，泳道1、2、3均为TA-Leader-scFv2E8酶切鉴定图）。

3.2 选取TA- Leader-scFv2E8-1克隆送Invitrogen测序，与理论序列一致（测序结果参见图5，M为分子量标志物，泳道1、2 为TA-Leader-scFv2E8双酶切电泳图；泳道3、4为pHMCH3双酶切电泳图）。

4. pHMCH3-Hm2E8b质粒的构建

将扩增的Leader-scFv2E8插入到已经构建好的pHMCH3载体（带有人IgG1的Fc片段），构建真核表达载体pHMCH3-Hm2E8b。

4.1 TA- Leader-scFv2E8和pHMCH3分别用 BamH I和EcoR I双酶切

酶切体系：

37℃ 水浴 2小时。

4.2 酶切产物1%1%琼脂糖凝胶电泳，100V电泳30min（参见图6，其中M为分子量标志物，泳道1、2 为TA-Leader-scFv2E8双酶切电泳图；泳道3、4为pHMCH3双酶切电泳图），1、2泳道可见TA- Leader-scFv2E8酶切得到801bp左右条带，3、4泳道可见pHMCH3酶切得到6000bp左右条带，回收上述琼脂糖凝胶中目的基因片段，将目的片段连接。

连接体系：

16℃过夜反应。

4.3 连接产物转化DH5α，铺板挑4个克隆进行扩增，抽提质粒，分别进行BamH I 和EcoRI 双酶切鉴定，酶切产物电泳，1、3、4泳道均可见清晰的801bp左右的目的条带，泳道2未见清晰的目的条带（参见图7，其中M为分子标志物。泳道1、2、3、4均为pHMCH3-Hm2E8b双酶切鉴定电泳图）。

4.4 酶切鉴定有目的条带的阳性质粒取10µl委托Invitrogen公司测序。测序结果与理论序列比对，结果一致，质粒命名为pHMCH3-Hm2E8b。

实施例二人鼠嵌合型 Hm2E8b 抗体的表达和活性检测

1. 瞬时转染

用Lipofectamine™ 2000并按其操作说明，将pHMCH3-Hm2E8b转染中华仓鼠卵巢细胞CHO。

1.1 CHO细胞的准备

转染前一天，将细胞分瓶培养，当天，用PBS将细胞洗涤2次后，用RPMI-1640 (不含抗生素) 将细胞悬液配成2×10⁵ 细胞/m l 浓度, 以500µ l/孔的量加于24孔细胞培养板中，复种3孔，分别为阴性对照、PcDNA3.1⁺和pHMCH3-Hm2E8b，转染当天细胞达到80-90%融合。

1.2 质粒的准备

通过QIAGEN plasmid purification mini kit纯化2组pHMCH3-Hm2E8b质粒，溶于pH8.0的TE中，分别1%琼脂糖电泳，均可见清晰条带（参见图8，其中M为分子标志物。泳道1、2均为pHMCH3-Hm2E8b质粒电泳图），选第2组pHMCH3-Hm2E8b质粒，紫外分光光度计测浓度为0.286µg/µl，纯度为1.776，可以用于下一步转染，4℃保存。

1.3 转染

(1). 取800ng质粒DNA（2.5μl）加入Opti-MEM I培养基50ul,轻柔混匀，

(2). 取Lipofectamine™ 2000与50ulOpti-MEM I培养基轻柔混匀,室温孵育5分钟，

(3). 将质粒DNA与Lipofectamine™ 2000轻柔混合（共100ul），室温孵育20分钟，

(4). 将100ul混合物加入前一天铺满CHO细胞的24孔板中，轻轻晃动培养板加以混匀，

(5). 在37℃、5％CO₂饱和湿度孵箱中培养24hs。

2. 稳定转染

转染后24小时，收集细胞以1：10传代，继续培养，24小时加入选择性培养基G418，根据实验确定最佳筛选浓度为600µg/ml，根据细胞生长情况及培养基颜色，每3-5天更换一次筛选培养基，筛选10-14天后，CHO板中细胞全部死亡（参见图9A），PcDNA3.1和pHMCH3-Hm2E8b转染CHO细胞板中有抗性克隆出现（参见图9B），停药培养，待其增大。

3. RT-PCR 检测CHO-Hm2E8b细胞中的目的基因

细胞大量扩增以后，挑取5个阳性克隆提取总RNA，逆转录，以转染的CHO-Hm2E8b的 cDNA为模板，以Leader- scFv2E8的上下游引物P1和P4为引物，扩增Leader- scFv2E8基因。分别1%琼脂糖电泳，均可见801bp大小的目的条带，与理论序列大小相符合（参见图10泳道1-5，图中M为分子标志物，泳道1-5均为CHO-Hm2E8b 的RT-PCR产物的电泳图）。

4. 细胞免疫荧光鉴定CHO-Hm2E8b中的重组蛋白的表达

以Goat anti human Fc-FITC检测CHO-Hm2E8b细胞内Hm2E8b融合蛋白的表达，CHO 细胞作为阴性对照。荧光显微镜下CHO-Hm2E8b细胞胞浆内可见清晰的绿色荧光，阳性细胞数约为20%左右（参见图11B箭头所指细胞核外围灰色光圈，B图中有部分细胞浆中存在明显的HmE8b抗体），而CHO组未见绿色荧光(参见图11A未见明显灰色光圈)。

5. CHO- Hm2E8b细胞单克隆化

有限稀释法对转染的CHO-Hm2E8b细胞进行单克隆化，制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10 ul，在96孔板中加入150 ul/孔，再加入细胞悬液10 ul/孔，约7-10天后，逐渐增大转入6孔板中增殖。共获得10株单克隆细胞，扩大培养后取1ml细胞培养上清进行流式检测，发现第7、9细胞株表达较强，阳性细胞数约为64%，平均荧光强度为13%左右（参见图12）。取第7细胞株扩大培养，继续G418加压筛选。

6. Hm2E8b抗体的纯化

收集CHO-Hm2E8b细胞培养上清共150ml，超滤浓缩后得到5ml（30：1）浓缩上清，SPA Sepharose亲和层析法纯化，共收集5ml纯化抗体，Millipore超滤管5：1超滤浓缩共得到1ml浓缩纯化抗体，BCA测浓度为2mg/ml，估计CHO-Hm2E8b细胞培养上清内Hm2E8b的分泌量约为14-15µg/ml。

7. SDS-PAGE和Western-Blot检测细胞培养上清中重组蛋白Hm2E8b的表达

纯化抗体进行SDS-PAGE（参见图13）和Western Blot检测（参见图14）（图13和图14中，泳道1是非还原，泳道2是还原），均发现非还原条件（不加DTT）有200KDa 、130KDa和50KDa左右三个条带（参见图13泳道1、参见图14泳道1），还原条件（加DTT）有 50KDa左右单一条带（参见图13泳道2、参见图14泳道2），提示Hm2E8b单体的分子量大小约为50KDa，与理论值基本接近，单体可聚合为同源二聚体和多聚体，分子量约130KDa和200KDa左右。

8. 流式细胞仪检测细胞培养上清中重组蛋白Hm2E8b的表达

（1）流式细胞仪以简标法检测细胞培养上清中重组蛋白Hm2E8b的表达：

CHO-Hm2E8b细胞的浓缩培养上清与Nalm-6细胞共孵育，以GAH-Fc-FITC标记，流式检测可见（参见图15）：CHO-Hm2E8b组阳性细胞百分数为93.32％，平均荧光强度（MFI）为20.14％，而阴性对照组阳性细胞百分数为1.84％，平均荧光强度（MFI）为3.59％，因此间标法在CHO-Hm2E8b细胞培养上清中可检测到有活性的Hm2E8b嵌合抗体。

（2）流式细胞仪检测细胞培养上清中重组蛋白Hm2E8b对亲本直标抗体2E8的阻滞作用：

CHO-Hm2E8b细胞培养上清与Nalm-6细胞共孵育，流式检测其对亲本抗体2E8-FITC的阻滞作用(参见图16)：亲本抗体2E8-FITC识别Nalm-6，阳性细胞数为96.99%，Hm2E8b阻滞1次后下降为76.67%，阻滞2次后为61.35%，分别下降了20.95%、36.74%；平均荧光强度（MFI）分别为24.87、15.18、9.08，分别下降了38.96%、63.49%，提示Hm2E8b嵌合抗体对其亲本抗体2E8-FITC有明显的阻滞作用。

9. 嵌合抗体Hm2E8b的CDC 作用

Hm2E8b可以通过CDC作用有效的杀伤CD19阳性的Nalm6 细胞，其对 Nalm6 的 CDC 作用随浓度增高而增强，3-4µl左右的浓缩上清可以杀伤50%左右靶细胞（参见图17）。

无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。

本发明涉及的序列

<110> 浙江大学

<120> 一种人鼠嵌合型抗人CD19抗体Hm2E8b及用途

<160> 6

<210> 1

<211> 1410

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 373 a 381 c 378 g 278 t

<400> 1

CAGATCCAGT TGGTGCAGTC GGGACCTGAG CTGAAGAAGC CTGGAGAGAC AGTCAAGATC 60

TCCTGCAAGG CTTCCGGGTA TTCCTTCAGA AACTATGGAA TGAACTGGGT GAAGCAGGCT 120

CCAGGAAAGG GTTTAAAGTG GATGGGCTGG ATAAACACCT ACAGTGGAGA GCCAACACAT 180

GCTGATGACT TCAAGGGACG GTTTGCCTTC TCTTTGGAAA CCTCAGCTAG TACTGCCTAT 240

TTGCAGATCA ACAACCTCAA AAATGAGGAC ATGGCTACAT ATTTCTGTGC AAGACGGGAT 300

TTCGACGGAT ATTACTATGC TATGGACTAC TGGGGTCAAG GAACCTCAGT CACCGTCTCC 360

TCAGAGGGCG GAGGCGGAAG CGGAGGCGGA GGAAGCGGCG GTGGCGGCAG CGACATCCAG 420

ATGACACAAT CTTCATCCTA CTTGTCTGTA TCTCTAGGAG GCAGAGTCAC CATTACTTGC 480

AAGGCAAGTG ACCACATTAA TAATTGGCTA GCCTGGTATC AGCAGAAACC AGGAAATGCT 540

CCTAGGCTCT TAATATCTGG TGCAACCAGT TTGGCAACTG GGATTCCTTC AAGATTCAGT 600

GGCAGTGGAT CTGGAAAGGA TTACACTCTC AGCATTACCA GTCTTCAGAC TGAAGATGAT 660

GCTACTTATT ACTGTCAACA GTATTGGAGT ACTCCGTGGA CGTTCGGTGG AGGCACCAAG 720

CTGGAAATCA AAGAATTCGA GCCCAAATCT TGTGACAAAA CTCACACATG CCCACCGTGC 780

CCAGCACCTG AACTCCTGGG GGGACCGTCA GTCTTCCTCT TCCCCCCAAA ACCCAAGGAC 840

ACCCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACATGCGTGG TGGTGGACGT GAGCCACGAA 900

GACCCTGAGG TCAAGTTCAA CTGGTACGTG GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA 960

AAGCCGCGGG AGGAGCAGTA CAACAGCACG TACCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCCTG 1020

CACCAGGACT GGCTGAATGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGCCCTCCCA 1080

GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC AAAGGGCAGC CCCGAGAACC ACAGGTGTAC 1140

ACCCTGCCCC CATCCCGGGA GGAGGTGACC AAGAACCAGG TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC 1200

AAAGGCTTCT ATCCCAGCGA CATCGCCGTG GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC 1260

AACTACAAGA CCACGCCTCC CGTGCTGGAC TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTATAGCAAG 1320

CTCACCGTGG ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG GGGAACGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT 1380

GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGTAG 1410

<210> 2

<211> 470

<212>

<213> 人工序列

<400>2

QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYSFR NYGMNWVKQA PGKGLKWMGW INTYSGEPTH 60

ADDFKGRFAF SLETSASTAY LQINNLKNED MATYFCARRD FDGYYYAMDY WGQGTSVTVS 120

SEGGGGSGGG GSGGGGSDIQ MTQSSSYLSV SLGGRVTITC KASDHINNWL AWYQQKPGNA 180

PRLLISGATS LATGIPSRFS GSGSGKDYTL SITSLQTEDD ATYYCQQYWS TPWTFGGGTK 240

LEIKEFEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE 300

DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP 360

APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEVT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN 420

NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQ* 470

<210> 3

<211> 24

<212>

<213> 人工序列

<223> 重链5'引物序列

<400> 3

CGCGGATCCATGGATTGGCTGTGG

<210> 4

<211> 40

<212>

<213> 人工序列

<223> 重链3'引物序列

<400> 4

ATACAGACAAGTAGGATGAAGATTGTGTCATCTGGATGTC

<210> 5

<211> 40

<212>

<213> 人工序列

<223> 轻链5'引物序列

<400> 5

GACATCCAGATGACACAATCTTCATCCTACTTGTCTGTAT

<210> 6

<211> 26

<212>

<213> 人工序列

<223> 轻链3'引物序列

<400> 6

CCGGAATTCTTTGATTTCCAGCTTGG

Claims (2)

1.一种人鼠嵌合型抗人CD19抗体Hm2E8b，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所述，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。

2.根据权利要求1所述的一种人鼠嵌合型抗人CD19抗体Hm2E8b在制备治疗B淋巴细胞恶性肿瘤药物中的应用。

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