具体实施方式
本发明结合实施例,作进一步的说明。
实施例一
本发明2个基因的核苷酸序列及氨基酸序列:
1、抗人CD19鼠免疫球蛋白重链可变区基因(单抗ZCH-4-2E8VH2E8)的核苷酸序列(SEQ ID NO 1)及氨基酸序列(SEQ ID NO 3)。
2、抗人CD19鼠免疫球蛋白轻链可变区基因(抗原单抗ZCH-4-2E8VL2E8)的核苷酸(SEQ ID NO 2)及氨基酸序列(SEQ ID NO 4)。
实施例二
本发明提供的2个抗人CD19鼠免疫球蛋白可变区基因通过下列步骤获得:
1、ZCH-4-2E8单抗的研制:基本按Koller&Milstein报告的鼠-鼠杂交瘤经典方法进行,以小儿急性未分化型淋巴细胞性白血病(uALL)细胞(其免疫表型为HLA-DR+,CD19+,CD10-,CD33-,TdT+,CD7-,CD41a-)作为免疫原,将107白血病细胞给8周龄雌性Balb/C小鼠作腹腔注射,每周一次,共4次,于第4次注射后第3天,脱臼杀死小鼠,无菌取脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株NS-1细胞按6∶1混合,以50%聚乙二醇(PEG,美国Sigma公司,分子量3350道尔顿)溶液作为融合媒介进行细胞融合,于96孔板(美国Falcon公司)中进行选择性培养。于融合后第9~20天,隔日用免疫原细胞对培养上清进行间接免疫荧光法(IIF)筛选。阳性孔细胞经3次克隆化并连续2次100%孔达到阳性,即建立了能持续分泌2E8单抗的杂交瘤细胞系。经8个多月的连续传代培养和反复冻融,其分泌2E8单抗的能力稳定。以其腹水(荧光法效价1∶3200)或培养上清(荧光法效价1∶16)作为2E8单抗的来源。
2、最佳克隆的筛选将冻存于液氮(-196℃)中的2E8细胞复苏后进行亚克隆培养,获得6孔单克隆细胞群,分别命名为67A10,67B8,67B11,67D2,67F9,67G10,通过异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠免疫球蛋白(GAMIg-FITC)间接标记法比较各单克隆细胞群培养上清在Nalm-6细胞上的平均荧光强度,参见图1。根据两者平均荧光强度的对比,从中筛选出1个最佳亚单克隆细胞株67B11,再次克隆化得到亚克隆83C5,选用83C5作进一步的实验。
3、2E8重、轻链基因(VH2E8、VL2E8)的扩增
3.1总RNA的抽提和处理:
收集最佳克隆(83C5)的2E8杂交瘤细胞及鼠骨髓瘤细胞系NS-1细胞分别约8×106,以核糖核酸(RNA)抽提试剂盒(TRIZOL液)按说明书步骤抽提总RNA。最后溶于25μl DEPC(diethyl-pyrocarbonate,焦碳酸二乙酯)水中,并加入RNasin (核糖核苷酸酶抑制剂)至终浓度为1U/μl(单位/微升)。紫外分光光度计测定A260、A280及其比值,1%琼脂糖电泳观察总RNA。进行逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)前,各取2μl 2E8及NS-1总RNA,按照RQ1(无RNA酶的DNA酶试剂盒)说明的方法,消化总RNA中污染的基因组DNA。
3.2总RNA的抽提:
(1)计数细胞,共8×106个活细胞;
(2)常温下1000转/分钟(rpm)离心15分钟,弃上清;
(3)沉淀中加入无菌生理盐水后在1000rpm条件下离心15分钟,重复洗涤2次;
(4)向沉淀中加入8ml TRIZOL(1ml/106细胞),立即用5ml无菌针筒反复抽打剪切数分钟;
(5)将上述TRIZOL溶液按1ml/管转入1.5ml带盖小塑料(eppendorf)管中,室温下静置5分钟;
(6)每管加入0.2ml氯仿,剧烈摇动15秒,室温下静置10分钟;
(7)4℃下12000g离心15分钟,将水相转入新的1.5ml的eppendorf管中,每管加入0.5ml异丙醇,立即摇匀,室温下静置10分钟;
(8)4℃下,12000g离心10分钟;
(9)弃上清,每管加入1.5ml 75%乙醇,混匀,4℃下,7500g离心5分钟,弃上清;
(10)真空干燥机中晾干,每管加入25μl无RNA酶的DEPC水溶解沉淀,-80℃冰箱保存。
3.3总RNA浓度的测定:
取出2μl新抽提的总RNA,加入98μl DEPC水混匀,紫外分光光度计(GeneQuant II)测定260吸光值(A260)及280吸光值(A280),RNA实际浓度用如下公式计算:
3.4总RNA凝胶电泳:
取新抽提的总RNA 3μl加入电泳上样缓冲液5μl,1%琼脂糖凝胶内含溴乙啶(EB)浓度0.5μg/ml,经100V直流电压下电泳5分钟,凝胶成像系统观测结果并摄像保存。
3.5总RNA的处理:取总RNA 1μl+无RNA酶的DNA酶(RNase-freeDnase)(1U/μl)10μl+RNasin(40U/μl)1μl+氯化镁(25mM)1μl,总量达13μl,经37℃×1小时,90℃×5分钟孵浴后立即置冰上待用。
3.6RT-PCR:
按照说明书,将RQ1无RNA酶的DNA酶处理过的总RNA进行逆转录(25μl体系),并用DNA纯化试剂盒(QIAquick)纯化mRNA/cDNA杂交双链。取纯化的cDNA2.5μl进行PCR。
3.6.1RT反应体系:取RQ1处理过的总RNA 13μl+寡聚脱氧胸苷[Oligo(dT)]1.5μl,总量达14.5μl,经65℃预变性5分钟,立即置冰上,加入以下试剂:DEPC水2.5μl+5倍缓冲液5μl+25mM dNTP(脱氧核苷混合物)0.5μl+RNA酶抑制剂1.5μl+逆转录酶(200U/μL)1μl至总体积25μl,经37℃,30分钟孵浴以合成互补脱氧核糖核苷酸(cDNA),置95℃5分钟,然后移至4℃冰浴备用。
3.6.2PCR体系
(1)50μl的PCR反应体系:2.5μl纯化的2E8或NS-1cDNA,10pmol的轻链或重链可变区上下游引物各1μl,0.5μl 25mM的dNTP,5μl 10×高保真PCR缓冲液,2μl 50mM×MgSO4(硫酸镁)溶液,0.2μl高保真Taq聚合酶(Platinum TaqHigh Fidelity);引物序列如下:
重链可变区5’引物序列(SEQ ID NO 5):
GAGGTGAAGCTGGTGGAGTC
重链可变区3’引物序列(SEQ ID NO 6):
GGAGACGAGGGGGAAAAGCTTTGGGAAGGACTGACTCTC
轻链可变区5’引物序列(SEQ ID NO 7):
GATATCCAGATGACACAGACT
轻链可变区3’引物序列(SEQ ID NO 8):
GGATACAGTTGGTGCAGCATC
(2)反应条件:94℃预变性2分钟,94℃变性30秒,57℃退火30秒,72℃延伸30秒,共38个循环;
(3)最后一个循环完成后,加入1μl Taq DNA Polymerase(Taq DNA聚合酶)72℃延伸7分钟;
(4)取5μl PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,同时加标准分子量标志物DL2000,鉴定PCR产物片断大小,分别命名为VL2E8和VH2E8基因。结果可观察到350碱基对(bp)左右的VL2E8条带和400bp左右的VH2E8条带。将前述阳性条带切胶回收纯化得到VL2E8和VH2E8基因。以作为该杂交瘤融合对象的NS-1细胞cDNA为模板的PCR产物电泳结果未见扩增条带(参见图2,图3)。
4.VH2E8、VL2E8基因扩增产物的克隆和鉴定将VH2E8和VL2E8基因片段通过连接酶分别与克隆载体pGEM-T Easy连接,获得的连接产物pGEM-TEasy/VH和pGEM-T Easy/VL,通过转化DH5α感受态细菌,得到数十个白色菌落和数个蓝色菌落,分别挑取4个白色菌落进行质粒扩增,抽提后进行核酸限制性内切酶EcoRI酶切处理,1%琼脂糖电泳结果均可见350bp和400bp左右的目的片段(图4),其中M:低核糖核苷酸(DNA)标准分子量标志物;1:VH2E8基因;2:NS-1重链可变区基因(VHNS-1);3:VL2E8基因;4:NS-1轻链可变区基因(VLVS-1);5~8:重组质粒pGEM-T Easy/VL的EcoRI酶切;9~12:重组质粒pGEM-T Easy/VH的EcoRI酶切。
5.VH2E8、VL2E8基因序列测定和分析
对阳性重组质粒纯化后进行测序,VH2E8(图5)和VL2E8(图6)基因均符合小鼠Ig可变区框架结构。VH2E8基因全长366bp(见序列SEQ ID NO 1),编码122个氨基酸(见序列SEQ ID NO 3),在美国国家生物技术信息中心(NCBI)上进行检索,发现此重链可变区基因与小鼠免疫球蛋白重链的同源性达98%,氨基酸序列与小鼠Ig重链的同源性达86%,归属于小鼠Ig的VH基因。氨基酸序列分析结果显示,重链可变区含有明确的4个框架区(FR)和3个抗原决定簇互补区(CDR),在第22位和第96位为特征性Cys(半胱氨酸)。VH2E8氨基酸序列结构框架如下:
1~25 FR1
26~33 CDR1
34~50 FR2
51~58 CDR2
59~96 FR3
97~110 CDR3
111~122 FR4
VL2E8基因全长321bp(见序列SEQ ID NO 2),编码107个氨基酸(见序列SEQ ID NO 4),在NCBI上进行检索,发现此轻链可变区基因与小鼠Igκ链的同源性达97%,氨基酸序列与小鼠Igκ链的同源性达95%,归属于小鼠Ig的Vκ基因。氨基酸序列分析结果显示,轻链可变区含有明确的4个框架区(FR)和3个抗原决定簇互补区(CDR),在第23位和第88位为特征性半胱氨酸(Cys)。VL2E8氨基酸序列框架如下:
1~26 FR1
27~32 CDR1
33~49 FR2
50~52 CDR2
53~88 FR3
89~97 CDR3
98~107 FR4
实施例三
为证实2E8抗体的潜在临床治疗应用前景,我们将纯化的2E8鼠源性完整抗体与三羟基异黄酮(Genistein,简称Gen)偶合制成2E8抗体的免疫毒素(2E8-Gen),观察其对2E8阳性(急性B淋巴细胞性白血病,Nalm-6)和阴性(急性T细胞白血病细胞系Mplt-3和髓性白血病细胞系)细胞进行靶向杀伤研究,结果发现,2E8-Gen对Nalm-6细胞(B细胞系白血病/淋巴瘤细胞株)具有很强的选择性杀伤作用,经37℃48小时孵浴培养后,2E8-Gen组的细胞存活率仅5%,明显高于对照组,且2E8-Gen对2E8阴性的Molt-3和K562细胞却无杀伤作用,说明2E8-Gen具有良好的靶向杀伤B细胞白血病细胞的作用(参见图7),其中PBS为磷酸盐缓冲液,Gen为游离三羟基异黄酮,纯化2E8为纯化的2E8鼠免疫球蛋白IgMκ。
无需进一步详细阐述,相信采用前面所公开的内容,本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此,前面的实施方案应理解为仅是举例说明,而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明涉及的序列
<120>抗人CD19鼠免疫球蛋白可变区基因及用途
<160>6
<170>Patent In Version 2.1
<210>1
<211>366
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>101a 79c 102g 84t
<400>1
GAGGTGAAGC TGGTGGAGTC GGGACCTGAG CTGAAGAAGC CTGGAGAGAC AGTCAAGATC 60
TCCTGCAAGG CTTCCGGGTA TTCCTTCAGA AACTATGGAA TGAACTGGGT GAAGCAGGCT 120
CCAGGAAAGG GTTTAAAGTG GATGGGCTGG ATAAACACCT ACAGTGGAGA GCCAACACAT 180
GCTGATGACT TCAAGGGACG GTTTGCCTTC TCTTTGGAAA CCTCAGCTAG TACTGCCTAT 240
TTGCAGATCA ACAACCTCAA AAATGAGGAC ATGGCTACAT ATTTCTGTGC AAGACGGGAT 300
TTCGACGGAT ATTACTATGC TATGGACTAC TGGGGTCAAG GAACCTCAGT CACCGTCTCC 360
TCAGAG 366
<210>2
<211>321
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>92a 71c 74g 84t
<400>2
GATATCCAGA TGACACAGAC TTCATCCTAC TTGTCTGTAT CTCTAGGAGG CAGAGTCACC 60
ATTACTTGCA AGGCAAGTGA CCACATTAAT AATTGGCTAG CCTGGTATCA GCAGAAACCA 120
GGAAATGCTC CTAGGCTCTT AATATCTGGT GCAACCAGTT TGGCAACTGG GATTCCTTCA 180
AGATTCAGTG GCAGTGGATC TGGAAAGGAT TACACTCTCA GCATTACCAG TCTTCAGACT 240
GAAGATGATG CTACTTATTA CTGTCAACAG TATTGGAGTA CTCCGTGGAC GTTCGGTGGA 300
GGCACCAAGC TGGAAATCAA A 321
<210>3
<211>122
<212>
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>按照大肠杆菌偏爱的密码子,设计了酶切位点和接头肽的编码hPTH(1-34)的合成基因
<400>3
EVKLVESGPE LKKPGETVKI SCKASGYSFR NYGMNWVKQA PGKGLKWMGW INTYSGEPTH 60
ADAFKGRFAF SLETSASTAY LQINNLKNED MATYFCARRD FDGYYYAMDY WGQGTSVTVS 120
SE 122
<210>4
<211>107
<212>
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>4
DIQMTQTSSY LSVSLGGRVT ITCKASDHIN NWLAWYQQKP GNAPRLLISG ATSLATGIPS 60
RFSGSGSGKD YTLSITSLQT EDDATYYCQQ YWSTPWTFGG GTKLEIK 107
<210>5
<211>20
<212>
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>重链可变区5’引物序列
<400>5
GAG GTG AAG CTG GTG GAG TC
<210>6
<211>39
<212>
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>重链可变区3’引物序列
<400>6
GGA GAC GAG GGG GAA AAG CTT TGG GAA GGA CTG ACT CTC
<210>7
<211>21
<212>
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>轻链可变区5’引物序列
<400>7
GAT ATC CAG ATG ACA CAG ACT
<210>8
<211>21
<212>
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>轻链可变区3’引物序列
<400>8
GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC