CN1795010A - 针对α干扰素受体－1(IFNAR－1)的人源化抗体 - Google Patents

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Abstract

公开了结合IFNAR－1的人源化单克隆抗体，和基于相关抗体的组合物和分子。还公开了含有人源化抗体的药物组合物和使用所述人源化抗体的治疗和诊断方法。

Description

针对α干扰素受体-1(IFNAR-1)的人源化抗体
相关申请的交叉参考
本申请要求于2003年4月23日提交的美国Serial No.60/465,058的利益，该申请的内容完整并入本文作为参考。
发明背景
I型干扰素(IFN)(IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-τ)是结构上相关的细胞因子家族，它们具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用(Hardy等，Blood.97：473，2001；Cutrone和Langer，J.Biol.Chem.276：17140，2001)。人IFNα基因座包括两个亚家族。第一个亚家族由14个非等位基因和具有至少80％同源性的4个假基因组成。第二个亚家族(αII或者ω)含有5个假基因和一个功能基因，其与IFNα基因表显出70％同源性(Weissmann和Weber，Prog.Nucl.Acid Res.Mol.Biol.，33：251-300，1986)。IFNα的亚型具有不同的比活，但是它们具有相同的生物景带(Streuli等，PNAS-USA 78：2848，1981)并且具有相同的细胞受体(Agnet M.等，《Interferon 5》，第一版。Gresser 1-22页，Academic Press，London 1983)。
β干扰素(IFNβ)由与IFNα具有约50％同源性的单个基因编码。
γ干扰素由活化的淋巴细胞产生，不与α/β干扰素具有同源性并且不与它们的受体反应。
所有人I型干扰素都结合由两个跨膜蛋白质IFNAR-1和IFNAR-2组成的细胞表面受体(IFNα受体，IFNAR)。IFNAR-1是高亲和力结合和IFNAR复合体的差别特异性所必需的(Cutrone，2001，前文)。尽管还没有鉴定每种I型IFN亚型的功能差异，但是认为每一种可以显示出与IFNAR受体组分的不同相互作用，导致潜在不同的信号转导结果(Cook等，(1996)J.Biol.Chem.，271：13448)。具体而言，使用IFNAR-1和IFNAR-2突变形式的研究表明α和β干扰素通过与各条链的不同相互作用经由受体发出不同信号(Lewerenz等，(1998)J.Mol.Biol.282：585)。
对I型IFN的早期功能研究集中在针对病毒感染的内在防御(Haller等，(1981)J.Exp.Med.154：199；Lindenmann等，(1981)Methods Enzymol.78：181)。然而，最近的研究暗示I型IFN为适应性免疫应答中的有效免疫调节性细胞因子。特别地，已经表明I型IFN促进幼稚I细胞沿着Th1途径的分化(Brinkmann等，(1993)J.Exp.Med.178：1655)，以增强抗体产生(Finkelman等，(1991)J.Exp.Med.174：1179)和支持记忆T细胞的功能活性和存活(Santini，等，(2000)J.Exp.Med.191：1777；Tough等，(1996)Science 272：1947)。
许多研究小组的最近工作表明IFN-α可以增强树突细胞(DCs)的成熟或活性(Santini等，(2000)J.Exp.Med.，191：1777；Luft等，(1998)J.Immunol.，161：1947；Luft等，(2002)Int.Immunol.14：367；Radvanyi等，(1999)Scand.J.Immunol.50：499)。此外，已经描述了在许多自身免疫疾病中I型干扰素的表达增加(Foulis等(1987)Lancet，2：1423；Hooks等，(1982)Arthritis Rheum 25：396；Hertzog等，(1988)Clin.Immunol.immunopathol.48：192；Hopkins和Meager(1988)Clin.Exp.Immunol.73：88；Arvin和Miller(1984)Arthritis Rheum.27：582)。这其中研究最多的实例是胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)(Foulis(1987)，前文)和系统性红斑狼疮(SLE)(Hooks(1982)，前文)，它们与IFN-α水平升高有关，以及类风湿性关节炎(RA)(Hertzog(1988)，Hopkins和Meager(1988)，Arvin和Miller(1984)，前文)，其中，IFN-β可能起更重要的作用。
此外，已经报导施用α干扰素加剧银屑病和多发性硬化患者中潜在的疾病和在以前没有自身免疫疾病病史的患者中诱导SLE样综合征。还表明α干扰素在正常小鼠中诱导肾小球性肾炎和加速NZB/W小鼠中自发性自身免疫疾病的发作。此外，已经在一些病例中表明IFN-α导致不希望的副作用，包括发热和神经紊乱。因此，存在某些病理状况，其中抑制I型IFN的活性对于患者是有益的，并且需要有效抑制I型IFN活性的试剂。
发明概述
本发明提供了人I型IFN生物活性的拮抗剂。这些拮抗剂可用于治疗(包括预防)目的，例如，用于I型IFN(IFNα/β/ω/τ)的产生或表达与病理症状有关的情况中。此类拮抗剂还可以用于诊断多种疾病或者研究此类疾病的演进。本发明提供了针对IFNAR-1受体的人源化抗体，该抗体中已经将鼠CDR序列直接嫁接到未经修饰的人构架序列中，产生高亲和力功能抗体。此外，本发明提供了人源化抗体，其含有额外的抗体修饰以便减小该抗体自身的抗原性。本发明还提供了上面抗体的抗体片段。
在一个实施方案中，本发明提供了特异结合IFNα受体1的人源化抗体或人源化抗体片段，其含有：
包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：3的互补决定区氨基酸序列的重链可变区；和
包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6的互补决定区氨基酸序列的轻链可变区；和
来自人抗体或者人抗体共有构架的重链和轻链的可变结构域构架区，其中没有改变来自人抗体或者人抗体共有构架的其中可变结构域构架区。
在另一实施方案中，本发明提供了特异结合IFNα受体-1的人源化抗体或人源化抗体片段，其具有的重链可变区含有：
鼠抗体64G12的CDR1(SEQID NO：1)、CDR2(SEQ ID NO：2)和CDR3(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列，其中已经在CDR3(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列中进行了至少一个氨基酸替换，且
可变结构域构架区来源于人抗体或者人抗体共有构架。
优选地，人抗体或者人源化抗体片段保留鼠抗体64G12的α干扰素受体-1结合亲和力的至少50％。在该实施方案中，可以不改变来自人抗体或者人抗体共有构架的可变结构域构架区，或者可以含有构架残基中的特定替换。在优选的实施方案中，所述抗体或抗体片段含有CDR3的4位上的氨基酸替换。优选地，该替换是将脯氨酸替换为选自L、N、E、V、A、C、G、S、I、R、D、M、H、T、W和K的氨基酸，更优选替换为选自L、E、V、A、C、G、S、I、R、D、M、T、W和K的氨基酸。在另一优选的实施方案中，抗体或者抗体片段含有CDR3 11位上的氨基酸替换。该替换是将酪氨酸替换为选自L、E、Q、R、V、A、F、G、C、I、T、W、H、K、D和S的氨基酸，更优选替换为选自E、R、V、A、F和H的氨基酸。在另一优选的实施方案中，所述抗体或抗体片段还含有包含鼠抗体64G12的CDR1(SEQ ID NO：4)、CDR2(SEQ ID NO：5)和CDR3(SEQ ID NO：6)氨基酸序列的轻链可变区。
在另一实施方案中，本发明提供了特异结合IFNα受体-1的人源化抗体或人源化抗体片段，其含有：
包含鼠抗体64G12的CDR1(SEQID NO：1)、CDR2(SEQ ID NO：2)和CDR3(SEQ ID NO：3)氨基酸序列的重链可变区；和
包含有鼠抗体64G12的CDR1(SEQID NO：4)、CDR2(SEQ ID NO：5)和CDR3(SEQ ID NO：6)氨基酸序列的轻链可变区；并且
其中人源化抗体或人源化抗体片段含有选自24H、29H、37H、40H、71H、78H、19L、37L、46L、58L、70L和83L的氨基酸位置的至少一个氨基酸替换。
其中每组成员的氨基酸位置用Kabat中提出的编号系统表示。
在优选实施方案中，氨基酸替换是用丙氨酸替换Kabat中提出的编号系统表示的残基24H上的苯丙氨酸，用甲硫氨酸替换Kabat中提出的编号系统表示的残基29H上的亮氨酸，用丙氨酸替换Kabat中提出的编号系统表示的残基29H上的亮氨酸，分别用异亮氨酸和苏氨酸替换Kabat中提出的编号系统表示的残基37H上的缬氨酸和残基40H上的丙氨酸，用脯氨酸替换Kabat中提出的编号系统表示的残基40H上的丙氨酸，用赖氨酸替换Kabat中提出的编号系统表示的残基71H上的精氨酸，用亮氨酸替换Kabat中提出的编号系统表示的残基78H上的缬氨酸，用丙氨酸替换Kabat中提出的编号系统表示的残基19L上的缬氨酸，用亮氨酸替换Kabat中提出的编号系统表示的残基37L上的谷氨酰胺，用丙氨酸替换Kabat中提出的编号系统表示的残基46L上的亮氨酸，用异亮氨酸替换Kabat中提出的编号系统表示的残基58L上的缬氨酸，用天冬氨酸替换Kabat中提出的编号系统表示的残基70L上的丝氨酸，用苏氨酸替换Kabat中提出的编号系统表示的残基83L上的苯丙氨酸。
本发明其他优选的人源化抗体或人源化抗体片段为含有选自图1B(H2)的SEQ ID NO：8、图1D(H3)的SEQ ID NO：10、图1 E(M3)的SEQID NO：11、图1H(M3-A)的SEQ ID NO：14、图1I(M3-B)的SEQ ID NO：15、图1J(M3-A/B)的SEQ ID NO：16、图1K(DI M3)的SEQ ID NO：17和图1L(DI M3-B)的SEQ ID NO：18的重链可变区氨基酸序列；和选自图2B(K6)的SEQ ID NO：20、图2C(K1)的SEQ ID NO：21、图2D(K1-C)的SEQ ID NO：22、图2D(K1-D)的SEQ ID NO：23、图2D(K1-E)的SEQID NO：24、图2D(K1-C/D)的SEQ ID NO：25、图2H(K1-C/E)的SEQ IDNO：26、图2I(K1-D/E)的SEQ ID NO：27、图2J(K1-D/E)的SEQ ID NO：28、图2K(DI K1)的SEQ ID NO：29、图2L(DI K1-C)的SEQ ID NO：30的轻链可变区氨基酸序列的人源化抗体或人源化抗体片段。优选的重链和轻链可变区对包括：具有图1B(H2)的SEQ ID NO：8中给出的氨基酸序列的可变重链氨基酸序列，和具有图2B(K6)的SEQ ID NO：20中给出的氨基酸序列的可变轻链氨基酸序列；具有图1B(H2)的SEQ ID NO：8中给出的氨基酸序列的可变重链氨基酸序列，和具有图2C(K1)的SEQ ID NO：21中给出的氨基酸序列的可变轻链氨基酸序列；具有图1D(H3)的SEQ IDNO：10中给出的氨基酸序列的可变重链氨基酸序列，和具有图2B(K6)的SEQ ID NO：20中给出的氨基酸序列的可变轻链氨基酸序列；具有图1D(H3)的SEQ ID NO：10中给出的氨基酸序列的可变重链氨基酸序列，和具有图2C(K1)的SEQ ID NO：21中给出的氨基酸序列的可变轻链氨基酸序列；具有图1E(M3)的SEQ ID NO：11中给出的氨基酸序列的可变重链氨基酸序列，和具有图2C(K1)的SEQ ID NO：21中给出的氨基酸序列的可变轻链氨基酸序列；具有图1K(DI M3)的SEQ ID NO：17中给出的氨基酸序列的可变重链氨基酸序列，和具有图2C(K1)的SEQ ID NO：21中给出的氨基酸序列的可变轻链氨基酸序列；具有图1I(M3-B)的SEQ ID NO：15中给出的氨基酸序列的可变重链氨基酸序列，和具有图2C(K1)的SEQ IDNO：21中给出的氨基酸序列的可变轻链氨基酸序列；具有图1L(DI M3-B)的SEQ ID NO：18中给出的氨基酸序列的可变重链氨基酸序列，和具有图2C(K1)的SEQ ID NO：21中给出的氨基酸序列的可变轻链氨基酸序列；具有图1E(M3)的SEQ ID NO：11中出的氨基酸序列的可变重链氨基酸序列，和具有图2D(K1-C)的SEQ ID NO：22中给出的氨基酸序列的可变轻链氨基酸序列；具有图1I(M3-B)的SEQ ID NO：15中给出的氨基酸序列的可变重链氨基酸序列，和具有图2D(K1-C)的SEQ ID NO：22中给出的氨基酸序列的可变轻链氨基酸序列；具有图1K(DI M3)的SEQ ID NO：17中给出的氨基酸序列的可变重链氨基酸序列，和具有图2D(K1-C)的SEQ ID NO：22中给出的氨基酸序列的可变轻链氨基酸序列；或者具有图1L(DI M3-B)的SEQ ID NO：18中给出的氨基酸序列的可变重链氨基酸序列，和具有图2D(K1-C)的SEQ ID NO：22中给出的氨基酸序列的可变轻链氨基酸序列。
在其他实施方案中，本发明人源化抗体还含有人重和轻恒定结构域。在优选的实施方案中，人重恒定区选自人γ1、γ2、γ3和γ4。更优选地，人重恒定区为γ1。在其他实施方案中，本发明的人源化抗体具有KD为1×10-7M或更小的IFNα受体结合亲和力，更优选KD为1×10-8M或更小的结合亲和力。“KD为1×10-7M或更小的结合亲和力”指1×10-7M的结合亲和力或者更大的总结合亲和力。在其他实施方案中，结合亲和力处于1×10-7到5×10-10M，或者1×10-8到5×10-10M，或者1×10-9到5×10-10M的范围。还在其他实施方案中，本发明的人源化抗IFNAR-1抗体或者抗体片段在体外和体内具有生物活性并且抑制多种I型干扰素诱导的生物应答。
本发明的另一方面涉及抑制I型干扰素与表达INFα受体-1的细胞上INFα受体-1的结合的方法。该方法包括将细胞与本发明的人源化抗体或人源化抗体片段接触，从而I型干扰素与INFα受体-1的结合受到抑制。在另一方面，本发明涉及抑制受试者中免疫应答的方法。该方法包括对受试者施用本发明的人源化抗体或人源化抗体片段从而使免疫应答受到抑制。所要抑制的免疫应答可以是，例如其中细胞上I类MHC或者II类MHC的表达受到调节，或者其中诱导树突细胞的发育或者特征是混合型淋巴细胞反应的免疫应答。免疫应答的抑制可以包括抑制同种免疫刺激(allostimulatory)细胞，如GMCSF/IFN诱导的树突细胞。
本发明还提供了治疗受试者中自身免疫紊乱、移植排斥、或者移植物抗宿主病(GVHD)的方法。所述方法包括对受试者施用本发明的人源化抗体或者抗体片段从而治疗该受试者的自身免疫紊乱、移植排斥、或者GVHD。在一个实施方案中，自身免疫紊乱是炎性肠病(IBD)。在另一实施方案中，自身免疫紊乱是系统性红斑狼疮(SLE)。还在另一个实施方案中，自身免疫紊乱是胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)。在另一实施方案中，自身免疫紊乱是类风湿性关节炎(RA)。
本发明还提供了改变受试者中血清C反应蛋白(CRP)水平的方法、改变受试者中血清新蝶呤水平的方法，和改变受试者中B-细胞增殖的方法，所述方法包括对受试者施用本发明的人源化抗体或者蛋白质片段。
另一方面，本发明还提供了嵌合的抗IFNAR-1抗体或者抗体片段。优选地，所示嵌合抗体含有鼠抗IFNAR-1抗体64G12的重链可变结构域和轻链可变结构域(分别为图1A的SEQ ID NO：7和图2A的SEQ ID NO：19)，其与人重链和轻链恒定区有效连接。优选的人重链恒定区包括人γ1、人γ2、人γ3和人γ4，更优选人γ1。
附图简述
图1A-1L是显示本发明抗IFNAR-1抗体的鼠重链可变区和重链可变区的氨基酸序列的示意图。CDR1、CDR2和CDR3区加下划线表示。对CDR或者构架残基进行的替换用斜体表示。
图1A是最初的鼠64G12重链可变区。其通过组合5’引物(atgggcagacttacattctcattcctg)(SEQ ID NO：43)和与鼠IgG1结构域互补的3’引物(cagtggatagacagatggggg)(SEQ ID NO：44)从cDNA文库扩增克隆，所述cDNA文库合成自从64G12杂交瘤提取的mRNA。64G12重链的CDR序列用下划线标出。
图1B是通过将来自鼠序列的CDR和其他氨基酸与人免疫球蛋白重链生殖系DP-28构架序列组合而设计的重链可变区。
图1C是通过将来自鼠序列的CDR-3与人免疫球蛋白重链生殖系DP-28构架序列组合而设计的重链可变区。
图1D是通过将来自鼠序列的CDR和其他氨基酸与人免疫球蛋白重链构架序列组合而设计的重链可变区。
图1E是通过将来自鼠序列的CDR和其他氨基酸与人免疫球蛋白重链生殖系DP-47构架序列组合而设计的重链可变区。
图1F是具有用L、N、E、V、A、C、G、S、R、D、M、H、T、W、K、或I替换的氨基酸X的重链M3。
图1G是具有用L、E、Q、R、V、A、F、G、C、T、W、H、K、D、S、或I替换的氨基酸X重链M3。
图1H是通过替换CDR-1区中的氨基酸(斜体)除去T-细胞表位的重链M3。
图1I是通过替换CDR-2区中的氨基酸(斜体)除去T-细胞表位的重链M3。
图1J是通过替换CDR-1和2区中的氨基酸(斜体)除去两个T-细胞表位的重链M3。
图1K是通过改变构架区中斜体氨基酸除去所有潜在T细胞表位的重链M3。
图1L是通过改变构架和CDR-2区中斜体氨基酸除去所有潜在T细胞表位的重链M3。
图2A-2S是显示本发明抗IFNAR-1抗体的鼠轻链可变区和轻链可变区的氨基酸序列的示意图。CDR1、CDR2和CDR3区加下划线表示。对CDR或者构架残基进行的替换用斜体表示。
图2A是最初的鼠64G12轻链可变区。其通过基于抗体的N-末端肽序列的5’引物(ctcacccagtctccaaccaccatggctgcatc)(SEQ ID NO：46)和与鼠κ恒定区结构域互补的3’引物(actggatggtgggaagatgg)(SEQ ID NO：45)从cDNA文库扩增克隆，所述cDNA文库合成自从64G12杂交瘤提取的mRNA。64G12重链的CDR序列用下划线标出。
图2B是通过将来自鼠序列的CDR和其他氨基酸与人免疫球蛋白轻链生殖系DPk-26构架序列组合而设计的轻链可变区。
图2C是通过将来自鼠序列的CDR和其他氨基酸与人免疫球蛋白κ链构架序列组合而设计的轻链可变区。
图2D是通过改变CDR-1中斜体氨基酸而除去其潜在T-细胞表位之一的轻链K1。
图2E是通过改变CDR-1中斜体氨基酸而除去其潜在T-细胞表位之一的轻链K1。
图2F是通过改变CDR-3中斜体氨基酸而除去其潜在T-细胞表位之一的轻链K1。
图2G是通过改变CDR-1中斜体氨基酸而除去两个其潜在T-细胞表位的轻链K1。
图2H是通过改变CDR-1和3中斜体氨基酸而除去两个其潜在T-细胞表位的轻链K1。
图2I是通过改变CDR-1和3中斜体氨基酸而除去两个其潜在T-细胞表位的轻链K1。
图2J是通过改变CDR-1和3中斜体氨基酸而除去三个其潜在T-细胞表位的轻链K1。
图2K是通过改变构架区中斜体氨基酸而除去其所有潜在T细胞表位的轻链K1。
图2L是通过改变构架区和CDR-1中而斜体氨基酸除去其所有潜在T细胞表位的轻链K1。
图2M是通过改变构架区中斜体氨基酸而除去其六个潜在T细胞表位中5个的轻链K1。
图2N是通过改变构架区和CDR-1中而斜体氨基酸除去其六个潜在T细胞表位中5个的轻链K1。
图2O是通过改变构架区中斜体氨基酸而除去其六个潜在T细胞表位中5个的轻链K1。
图2P是通过改变构架区中斜体氨基酸而除去其六个潜在T细胞表位中5个的轻链K1。
图2Q是通过改变构架区中斜体氨基酸而除去其六个潜在T细胞表位中5个的轻链K1。
图2R是通过改变构架区中斜体氨基酸而除去其六个潜在T细胞表位中5个的轻链K1。
图2S是通过改变构架区中斜体氨基酸而除去其六个潜在T细胞表位中5个的轻链K1。
图3A-3D显示了重链可变区M3(图3A)和DI M3-B(图3C)以及轻链可变区K1(图3B)和K1-C(图3D)的核酸序列。
图4A-4B是显示如在干扰素反应性报道基因测定中测量的抗IFNAR-1人源化抗体对IFN-α(图4A)和INF-β(图4B)活性的抑制的图。
图5为条形图，其显示了人源化抗IFNAR-1抗体对多种IFNα亚型的生物活性的逆转。
发明详述
本发明提供了针对α干扰素受体1(IFNAR-1)的新的人源化和嵌合抗体。一方面，本发明人源化抗体含有来自人生殖系序列的未改变的构架(FR)区。在其他方面，与供体鼠抗体相比，人源化抗体含有CDR区(优选CDR3区)中的突变，用以例如提高该抗体的结合。在其他方面，与人生殖系序列相比，人源化抗体含有构架区内的突变，用以例如减小该抗体的免疫原性(例如除去T细胞表位)。本发明的抗体可用于治疗目的，例如，用于其中I型干扰素(IFN)的产生或表达与病理症状有关的病例。
已经发现鼠抗人IFNAR-1单克隆抗体64G12的CDR可以嫁接到人抗体序列的FR以提供人源化抗体和抗体来源的试剂，所述人源化抗体和抗体来源的试剂具有64G12抗IFNAR-1 mAb的结合特性和高抗原亲和力，而且还显示出降低的HAMA的诱导和增加的效应器活性。优选地，选择人构架氨基酸序列使得所得抗体可适于体内施用于人。这可以通过例如基于含有此类人FR的抗体的先前用法确定。优选地，人FR自身不是显著免疫原性的。
在一个实施方案中，本发明涉及特异结合IFNAR-1并且能够阻断I型干扰素作用的人源化抗体。优选地，此类人源化抗体来源于对IFNAR-1具有良好结合亲和力和针对所有I型干扰素的良好阻断活性的抗体，如64G12。优选地，此类人源化抗体来源于64G12—一种IgG同种型鼠抗体，已经报导其以高亲和力结合IFNAR-1(KD＝1.2×10-9M)。
优选地，本发明的人源化抗体与64G12结合相同的表位。可以基于与64G12竞争结合IFNAR-1或表达IFNAR-1的细胞的能力鉴定此类抗体。已经发现64G12结合的表位包括肽CNFSSLKLNVYE(SEQID NO：42)。该肽在IFNAR1的细胞外部分的亚结构域1中。该肽中的特定替换显著抑制抗体结合，并且还抑制I型IFNs的结合和活性。
鼠抗IFNAR-1单克隆抗体64G12和其产生以前已经描述(美国专利No.5,919,453)并且已经在1992年2月26日保藏在ECACC(欧洲动物细胞保藏中心，Porton Down Salisbury，Wiltshire SP4 056，英国)。
如上面讨论的，人源化抗体提供了优于鼠和嵌合抗体的潜在优点，例如在人中更小的免疫原性。这是有利的，因为当此类人源化抗体体内施用，例如，用于治疗自身免疫疾病(如SLE、IDDM、RA等)或者用于防止移植物排斥或GVHD时，所述抗体将减小和潜在消除引起的HAMA应答。而且，此类抗体可以显示出改良的药物动力学性质。
本发明的人源化抗体可以包括，具有全长重链和轻链的完整抗体分子；其片段，如Fab、Fab’、(Fab’)2或者Fv片段；单链抗体片段，例如单链Fv、轻链和重链单体或二体；多价单特异性抗原结合蛋白，其含有通过连接结构相互连接的两个、三个、四个或更多抗体或者其片段；或者这些分子的片段或者类似物或者具有与MAb 64G12相同特异性的任何其他分子。在优选实施方案中，所述抗体包括具有全长重链和轻链的完整抗体分子。
为了更容易理解本发明，首先定义某些术语。额外定义的给出惯穿于详细的说明书。
术语“α干扰素受体1”、“IFNAR-1”和“IFNAR-1抗原”在本文中可以互换使用，并且包括人INFAR-1的变体、同种型和种间同系物。因此，本发明的人抗体可以在某些情况中与来自不同于人的其它物种的INFAR-1，或者结构上与人IFNAR-1相关的其他蛋白质(例如人INFAR-1同系物)交叉反应。在其他情况中，所述抗体可以对人IFNAR-1完全特异并且不显示出种间或其他类型的交叉反应性。
文中的术语“抗体”包括完整抗体，包括IgG、IgM和IgA同种型的那些完整抗体，和其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”指含有通过二硫键互相连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白或者其抗原结合部分。每条重链含有重链可变区(文中简写为VH)和重链恒定区。IgG重链恒定区由四个结构域(CH1、交链、CH2和CH3)组成。每条轻链由轻链可变区(文中简写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区含有一个结构域CL。VH和VL区还可以细分成超变区，其称作互补决定区(CDR)，其中散布更保守的区域，所述区域称作构架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基末端到羧基末端以下面的顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或者因子的结合，所述组织或者因子包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
文中所用术语抗体的“抗原结合部分”(或者简称为“抗体部分”)指保留特异结合抗原(例如IFNAR-1)的能力的一个和多个抗体片段。已经表明全长抗体的片段可以执行抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合部分”所包括的结合片段的实例包括(i)Fab片段，其是VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，其是含有通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但是可以使用重组方法，通过合成的接头将VL和VH连接，所述接头使得它们可以一条蛋白质链生产，其中VL和VL链配对形成单价分子(称作单链Fv(scFv)；见例如Bird等，(1988)Science 242：423-426；和Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)，或者通过其他方法，如使用二硫键或者通过二聚化基序连接VL和VH。此类单链抗体也包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。使用本领域技术人员公知的常规技术可以得到这些抗体片段，并且筛选与完整抗体以相同方式使用的片段。
术语“表位”指能够特异结合抗体的蛋白质决定簇。表位通常由化学活性表面分子组(如氨基酸或糖侧链)组成，并且通常具有特定三维结构特征，以及特定电荷特征。构象和非构象表位的区别在于存在变性剂时与前者而不是后者的结合丧失。
文中所用术语“单克隆抗体”或者“单克隆抗体组合物”指单一分子组合物的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。因此，术语“人单克隆抗体”指具有来源于人生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区、显示出单一结合特异性的抗体。在一个实施方案中，通过与永生细胞融合的杂交瘤产生人单克隆抗体，所述杂交瘤包括从转基因非人动物(例如转基因鼠)得到的B细胞，所述转基因非人动物的基因组包含人重链转基因和轻链转基因。
文中所用“分离的抗体”意在指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如特异结合IFNAR-1的分离抗体基本上无特异结合不同于IFNAR-1的抗原的抗体)。然而，特异结合人IFNAR-1的表位、同种型或者变体的分离抗体可能具有对其他相关抗原的交叉反应性，所述相关抗原例如来自其他物种的抗原(例如IFNAR-1物种同系物)。此外，分离的抗体可以基本上无其他细胞物质和/或化学物品。在本发明的一个实施方案中，具有不同特异性的“分离的”单克隆抗体的组合存在于明确的组合物中。
文中所用“特异结合”指抗体结合预定抗原。通常，抗体以10-7M或更小的解离常数(KD)结合，并且结合预定抗原的KD为其结合该预定抗原或密切相关抗原之外的非特异抗原(例如BSA、酪蛋白)的KD的至多1/2。短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”在本文中可以与术语“特异结合抗原的抗体”互换使用。
文中所用术语对IgG抗体的“高亲和力”指抗体具有10-8M或更小，更优选10-9M或更小，甚至更优选10-10M或更小的KD。然而，对于其他抗体同种型“高亲和力”结合可能不同。例如，IgM同种型的“高亲和力”结合指抗体具有10-7M或更小，更优选10-8M或更小的亲和力。
文中所用术语“Kassoc”或者“Ka”意在指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，其中文中所用术语“Kdis”或者“Kd”意在指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。文中所用术语“KD”意在指解离常数，其得自Kd与Ka之比(即Kd/Ka)并且表达为摩尔浓度(M)。
文中所用“同种型”指重链恒定区基因编码的抗体类型(例如IgM、IgA或者IgG1)。
文中所用“同种型转换”指抗体的类型或者同种型从一种Ig类型转变成其他Ig类型之一的现象。
文中所用术语“天然存在的”应用于物体时指该物体可以在自然界中找到。例如，存在于生物体(包括病毒)、可以从天然来源分离并且没有被实验人员有意修饰的多肽或者多核苷酸序列是天然存在的。
文中所用术语“未重排的”或者“生殖系构型”用于V片段时指这样的构型，其中V片段没有重组来与D或者J片段直接相邻。
文中所用术语“核酸分子”意在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但是优选双链DNA。
如文中公开和要求保护的，所提出的序列包括“保守序列修饰”，即核苷酸和氨基酸序列修饰，其不显著影响或改变该核苷酸编码或者含有该氨基酸序列的抗体的结合特征。此类保守序列修饰包括核苷酸和氨基酸替换、加入和缺失。可以通过本领域公知的标准技术(如位点定向诱变和PCR介导的诱变)导入修饰。保守氨基酸替换包括其中将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸替换。具有相似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分枝侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。从而，优选用来自相同侧链家族的另一氨基酸残基替换人抗IFNAR-1抗体中预测的非必需氨基酸残基。
对于核酸，术语“基本上同源”指两个核酸或者它们所指定的序列在具有适当核苷酸插入或者缺失的优化排列和比较中至少约80％核苷酸，通常至少约90％到95％，更优选至少约98％到99.5％的核苷酸是相同的。备选地，当片段在选择性杂交条件下与所述链的互补序列杂交时存在基本上同源。
两条序列之间的同一性百分数是序列所共有的相同位置数目的函数(即％同源性＝相同位置数/总位置数×100)，改函数考虑了为进行两条序列的优化比对而引入的缺口数、各个缺口的长度。可以使用如下面的非限制性实施例中描述的数学算法完成两条序列之间的序列比较和同一性百分数测定。
可以使用GCG软件包(可以在 http：//www.gcg.com得到)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的缺口权重和1、2、3、4、5、或6的长度权重确定两条核苷酸序列之间的同一性百分数。也可以使用已经整合到ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))，使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分12和缺口罚分4来测定两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分数。此外，可以使用整合到GCG软件包(可以在 http：//www.gcg.com得到)的GAP程序的Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))，使用Blossum 62矩阵或者PAM250矩阵，缺口权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6测定两条氨基酸序列之间的同一性百分数。
本发明的核酸和蛋白质序列还可以用作“查询序列”对公共数据库进行检索，以例如鉴定相关序列。此类检索可以用Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)进行。可以使用NBLAST程序，得分＝100、字长＝12进行BLAST核苷酸检索，以得到与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序，得分＝50，字长＝3进行BLAST蛋白质检索，以得到与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的带缺口的比对，可以如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402描述的利用带缺口的BLAST。当使用BLAST和带缺口的BLAST程序时，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。见 http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。
核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物中，或者以部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过标准技术，包括碱/SDS处理、CsCl分层法(CsClbanding)、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和其他本领域众所周知的方法从其他细胞组分或者其他污染物(例如其他细胞核酸或者蛋白质)纯化时，核酸是“分离的”或者“使得基本上纯”的。见例如F.Ausubel，等编著，《CurrentProtocols in Molecular Biology》，Greene Publishing和Wiley Interscience，New York(1987)。
本发明的核酸组分，当通常为来自于cDNA、基因组或者混合物的天然序列(除了修饰的限制性位点等之外)时，可以通过标准技术突变以提供基因序列。对于编码序列，这些突变可以如希望的影响氨基酸序列。具体地，考虑了与文中描述的天然V、D、J、恒定、转换和其他此类序列基本上同源或从其衍生的DNA序列(其中“衍生”指序列与另一序列相同或从该序列修饰而来)。
核酸当与另一核酸序列处于功能关系时是“有效连接的”。例如，启动子或者增强子如果影响编码序列的转录，那么该启动子或者增强子有效连接所述编码序列。对于转录调节序列，有效连接的指所连接的DNA序列是毗邻的，必要时连接两个蛋白质编码区，毗邻并且处于读框内。对于转换序列，有效连接指序列能够影响转换重组。
文中所用术语“载体”意指能够运输其所连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指环状双链DNA环，该环中可以连接额外的DNA片段。另一种类型载体是病毒载体，其中额外的DNA片段可以连接入病毒基因组。某些载体能够在它们所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)当导入宿主细胞时能够整合到宿主细胞的基因组，从而随宿主基因组复制。此外，某些载体能够指导它们有效连接的基因的表达。此类载体在本文中称作“重组表达载体”(或者简称为“表达载体”)。通常，用于重组DNA技术的表达载体通常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。然而，本发明意在包括表达载体的其他形式，如病毒载体(例如复制缺陷的逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们具有等价功能。
文中所用术语“重组宿主细胞”(或者简称“宿主细胞”)意指已经导入重组表达载体的细胞。应当理解该术语不仅指具体受试细胞，而且指该细胞的后代。因为由于突变或者环境影响，连续世代中可能发生某些修饰，此类后代实际上可能不与亲代细胞相同，但是仍然包括在文中所用的“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞包括，例如CHO细胞和淋巴细胞。
文中所用术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非人哺乳动物，如非人灵长类、绵羊、狗、奶牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
在下面的小节中详细描述了本发明的多个方面。
产生针对IFNAR-1的人源化抗体
通过得到编码结合IFNAR-1的抗体(优选64G12)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的核酸序列，鉴定所述VH和VL序列中的CDR和将所述编码CDR核酸序列嫁接到所选的编码人构架核酸序列产生目的人源化抗体。克隆编码免疫球蛋白的核酸序列的方法是本领域众所周知的。此类方法将通常包括使用适宜的引物通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所要克隆的免疫球蛋白编码序列。适于扩增免疫球蛋白核酸序列(特别是鼠可变重链和轻链序列)的引物已经在文献中报导。克隆了此类免疫球蛋白编码序列后，通过本领域众所周知的方法对它们测序。这是为了鉴定VH和VL编码序列，更具体地，它们的编码CDR和FR的部分。这可以通过众所周知的方法实现，所述方法包括Boss等的美国专利No.4,816,397和Winter的美国专利No.5,225,539中所描述的。
一旦鉴定了编码将要人源化的抗体的CDR和FR的DNA序列后，即鉴定编码CDR的氨基酸序列(基于核酸序列和遗传密码并通过与以前的抗体序列比较进行推导)并将编码CDR的核酸序列嫁接到所选人FR编码序列。这可以通过适宜的引物和接头实现。选择适宜的引物和接头以提供目的核酸序列的连接的方法在技术人员的知识范围内。
如上文所讨论，用于人源化的所选人FR将优选为可能适于体内施用的FR，即它们自身在人体中不是免疫原性的。
CDR编码序列嫁接到所选的人FR-编码序列后，表达编码“人源化”可变重和可变轻序列的所得DNA序列以产生人源化Fv或者连接到人恒定区序列以产生结合IFNAR-1的人源化抗体。通常，人源化VH和VL序列将表达为完整αIFNAR-1抗体分子的一部分，即作为具有人恒定结构域序列的融合蛋白，其编码DNA序列从通过商业途径可获得的文库得到或者使用例如上述得到DNA序列的方法之一得到。适宜时，人源化抗体分子的轻或重链可变结构域可以融合人轻链或重链恒定结构域(除非另外指出，文中所用术语重链恒定结构域应理解为包括铰链区)。人源化抗体分子的人恒定结构域(存在时)可以就抗体的目的功能进行选择，尤其可能需要缺乏效应器功能。例如，与重链可变区融合的重链恒定区可以是人IgA、IgG或者IgM结构域。优选使用人IgG结构域。可以与轻链可变区融合的轻链人恒定结构域包括人λ或人κ链。优选使用人κ链结构域。
备选地，可以有利地使用人恒定结构域的类似物。这些类似物包括比相应的人结构域含有一个或多个额外氨基酸的那些恒定结构域或者其中相应人结构域的一个或多个存在的氨基酸已经被缺失或改变的那些恒定结构域。此类结构域可以通过例如寡核苷酸定向诱变来产生。然而，也可以在不存在恒定序列时表达VH和VL序列以产生人源化αIFNAR-1 Fv。然而，人恒定序列的融合是潜在需要的，因为所得人源化αIFNAR-1抗体可以具有基本上改良的药物动力学图谱。合成编码公知序列的蛋白质的DNA的方法是本领域熟知的。使用此类方法，合成编码目的人源化VL和VH序列(有或没有恒定区)的DNA，然后将其在适于表达重组抗体的载体系统中表达。这可以在任何提供以融合蛋白表达目的人源化VL和VH序列的载体系统中实现，所述融合蛋白具有人恒定结构域序列并且将合作产生功能(抗原结合)抗体或抗体片段。可用的方法在Boss等的美国专利No.4,816,397和Winter的美国专利No.5,225,539中有所描述。
适于表达重组抗体，尤其是人源化抗体的表达载体和宿主细胞是本领域众所周知的。下面的文献是可用于实施本发明的适于表达重组免疫球蛋白的代表性方法和载体：Weidle等，Gene，51：21-29(1987)；Dorai等，，J.Immunol.，13(12)：4232-4241(1987)；De Waele等，Eur.J.Biochem.，176：287-295(1988)；Colcher等，Cancer Res.，49：1738-1745(1989)；Wood等，，J.Immunol.，145(9)：3011-3016(1990)；Bulens等，Eur.J.Biochem.，195：235-242(1991)；Beldsington等，，Biol.Technology，10：169(1992)；King等，，Biochem.J.，281：317-323(1992)；Page等，Biol.Technology，9：64(1991)；King等，Biochem.J.，290：723-729(1993)；Chaudhary等，Nature，339：394-397(1989)；Jones等，，Nature，321：522-525(1986)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65-92(1989)；Benhar等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：12051-12055(1994)；Singer等，，J.Immunol.，150：2844-2857(1993)；Couto等，Hybridoma，13(3)：215-219(1994)；Queen等，，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：10029-10033(1989)；Caron等，Cancer Res.，52：6761-6767(1992)；Coloura等，J.Immunol.Meth.，152：89-109(1992)。此外，适于表达重组抗体的载体可通过商业途径得到。所述载体可以是例如裸露的核酸片段、载体结合的核酸片段、核蛋白、质粒、病毒、类病毒或者转座元件。
公知能够表达功能免疫球蛋白的宿主细胞包括，例如：哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞；COS细胞；骨髓瘤细胞，如NS0和SP2/0细胞；细菌，如大肠杆菌；酵母细胞，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；和其他宿主细胞。其中，CHO由于它们能够有效表达和分泌免疫球蛋白而被许多研究人员使用。NS0细胞是可用于本发明的优选宿主细胞类型之一。
基本上通过两种基本方法之一得到人源化抗体的重组表达。在第一种方法中，提供任选融合所选恒定区的VH和VL可变序列表达的单一载体转染宿主细胞。在第二种方法中，将宿主细胞用两种载体转染，每种载体提供VH或VL序列的表达，各VH或VL序列任选融合所选的恒定区。
人恒定结构域序列是本领域众所周知的，并且已经在文献中报导。优选的人恒定轻链序列(CL)包括κ和λ恒定轻序列。优选的人恒定重链序列包括人γ1、人γ2、人γ3、人γ4和其提供改变的效应或功能的突变版本，例如增加的体内半寿期、减弱的Fc受体结合等。
表达后，将通过公知方法(例如Scatchard分析)测定所得人源化抗体的抗原结合亲和力。理想地，人源化抗体的抗原结合亲和力将接近亲本抗体(例如64G12)的抗原结合亲和力，或者保持至少50％亲本抗体(即供应CDR的抗体)的结合亲和力。
可以通过任一方法人源化抗体，所述方法能够用来源于非人抗体的CDR替换人抗体的CDR的至少一部分。Winter描述了可用于制备本发明的人源化抗体的方法(英国专利申请GB2188638A，于1987年3月26日提交)，将其内容特别并入作为参考。例如，使用国际申请WO 94/10332(标题为Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G onHuman Mononuclear Phagocytes)中描述的寡核苷酸位点定向诱变可以用非人CDR替换人CDR。
本发明范围还包括嵌合和人源化抗体，其中特定氨基酸已经被替换、缺失或者加入。具体地，优选的人源化抗体在构架区中具有氨基酸替换，以便如提高对抗原的结合。例如，在具有小鼠CDR的人源化抗体中，位于人构架区中的氨基酸可以用位于小鼠抗体中相应位置的氨基酸替换。公知在某些情况中此类替换提高人源化抗体对抗原的结合。其中氨基酸已经被加入、缺失或替换的抗体在本文中称作经修饰抗体或经改变的抗体。
本发明还包括与本文中提出的人源化抗体和抗体片段基本上同源的变体和等价物。它们可用包含例如保守替换，即将一个或多个氨基酸用相似氨基酸替换。例如，保守替换指将氨基酸用相同的一般类别中的另一氨基酸替换，例如将一个酸性氨基酸用另一酸性氨基酸替换，一个碱性氨基酸用另一碱性氨基酸替换，或者一个中性氨基酸用另一中性氨基酸替换。保守氨基酸替换是本领域众所周知的。
短语“基本上同源的”涉及(寡肽或多肽或蛋白质的)目的氨基酸序列与相关的参考氨基酸序列的相似性。该短语定义为“比对”的目的和参考序列之间至少约75％“对应”——即平行位置上相同氨基酸残基的状态，所谓比对即目的和/或参考序列中已经插入最小数目的“空”碱基以便最大化序列之间存在的对应碱基数。“空”碱基不是目的和参考序列的部分；插入目的序列中的“空”碱基的最小数目可以与插入参考序列的最小数目不同。在该定义中，当参考序列与目的序列的氨基酸序列组成的蛋白质或者蛋白质部分是具有αIFNAR-1结合亲和力的αIFNAR-1抗体或抗体片段时，认为参考序列与目的序列“相关”。含有αIFNAR-1抗体或抗体片段的蛋白质的每一种可以独立地为抗体或者抗体片段或双功能或多功能蛋白质，例如融合蛋白、双特异性和多特异性抗体、单链抗体等。
本领域技术人员将能够(通过常规实验)确定对于治疗自身免疫疾病和预防移植排斥而言多少量的抗体是有效和无毒的。然而，通常，有效剂量处于约0.05到100毫克/kg体重/天的范围。
本发明的人源化抗体或人源化抗体片段可以根据前面的治疗方法以足以产生治疗或者预防效果的量施用于受试者。本发明的目的抗体可以以常规剂型施用于人或者其他动物，所述剂型可以根据公知技术通过将本发明的抗体与常规的可药用载体、稀释剂和/或赋形剂组合来制备。本领域普通技术人员将理解可药用载体、稀释剂和/或赋形剂的形式和特征由组合的活性成分的量、施用途径和其他众所周知的变量决定。
本发明抗体(或其片段)的施用途径可用是经口、肠胃外、通过吸入或者局部施用。文中所用术语“肠胃外的”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道或者腹膜内施用。通常优选肠胃外施用的皮下、静脉内和肌内形式。制备产生针对IFNAR-1的人源化单克隆抗体的转染瘤
例如，联合使用本领域众所周知的重组DNA技术和基因转染方法(例如Morrison，S.(1985)Science 229：1202)，可以在宿主细胞转染瘤中产生本发明的人源化抗体。
例如，为了表达抗体，或者其抗体片段，编码部分或者全长轻和重链的DNA可用通过标准分子生物学技术(例如PCR扩增、位点定向诱变)得到并且可以插入到表达载体中使基因与转录和翻译控制序列有效连接。在该上下文中，术语“有效连接”指以使载体中的转录和翻译控制序列发挥它们意图的功能(即调节抗体基因的转录和翻译)的方式将抗体基因连接到载体。选择与所用表达宿主细胞相容的表达载体和表达控制序列。抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到分开的载体或者，更常见地，两个基因可以插入到同一表达载体。通过标准方法(例如连接抗体基因片段和载体上的互补限制性位点，或者如果不存在限制性位点，进行平未端连接)将抗体基因插入表达载体。本文所描述的抗体的重链和轻链可变区可以用于产生任一抗体同种型的全长抗体基因，这可用通过以VH片段有效连接载体中的CH片段并且VL片段有效连接载体中的CL片段的方式将它们插入已经编码目的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体来实现。额外或备选地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆到载体中，以便信号肽连接在框内抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或者异源信号肽(即来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。
除了抗体链基因，本发明的重组表达载体携带控制宿主细胞中抗体链基因表达的调节序列。术语“调节序列”意在包括控制抗体链基因的转录和翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。此类调节序列在例如Goeddel；Gene Expression Technology.《Methods inEnzymology 185》，Academic Press，San Diego，CA(1990)中有所描述。本领域技术人员将明白表达载体的设计，包括调节序列的选择，取决于诸如所要转化的宿主细胞的选择、所希望的蛋白质的表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选的调节序列包括指导哺乳动物细胞中蛋白质高水平表达的病毒元件，如来源于巨细胞病毒(CMV)、猿病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多形瘤的启动子和/或增强子)。备选地，可以使用非病毒调节序列，如泛蛋白启动子或者β-珠蛋白启动子。
除了抗体链基因和调节序列，本发明的重组表达序列还可以携带额外的序列，如调节宿主细胞中载体复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因方便载体所导入的宿主细胞的选择(见例如Axel等的美国专利No.4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，通常，选择标记基因赋予载体所导入的宿主细胞对药物(如G418、潮霉素、或氨甲蝶呤)的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于用氨甲蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。
为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码轻链和重链的表达载体转染到宿主细胞。术语“转染”的多种形式意在包括用于将外来DNA导入原核或真核宿主细胞的多种常规技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。
用于表达本发明的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，使用DHFR选择标记，例如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中所描述的)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。具体地，对于用于NS0骨髓瘤细胞，另一种优选的表达系统是在WO 87/04462、WO 89/01036和EP33841中公开的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞足够的时间以允许在宿主细胞中表达抗体，或者更优选地，允许抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中来产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基回收抗体。
药物组合物
本发明的另一方面提供了含有与可药用载体一起配制的本发明的人源化单克隆抗体或者其抗原结合片段的组合物，例如药物组合物。此类组合物可以包括本发明的一种人源化抗体的或者(两种或多种不同的)本发明人源化抗体的组合。
在一个实施方案中，本发明提供了含有人源化抗IFNAR-1抗体的组合的治疗组合物，例如作为药物组合物，所述抗体结合人IFNAR-1上的不同表位并且具有互补活性。此外，本发明的人源化抗体可以缀合治疗剂(如毒素或者放射标记)以形成免疫缀合物或者可以连接一种或多种额外的抗体以形成双特异性(或者多特异性)分子。在另一实施方案中，治疗组合物含有一种本发明的免疫缀合物或者双特异性(或者多特异性)分子或其组合。
本发明的药物组合物可以以联合治疗施用，即与其他试剂联合施用。例如，联合治疗可以包括具有至少一种其他治疗的本发明组合物。
文中所用“可药用载体”包括生理上相容的任一和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。优选地，载体适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊椎或表皮施用(例如通过注射或输注)。取决于施用途径，活性化合物(即抗体、双特异性和多特异性分子)可以包裹在材料中，以保护该化合物免于可以使该化合物失活的酸和其他天然条件的作用。
“可药用盐”指保持亲本化合物的所需生物活性并且不给予任何不希望的毒理学效果的盐(见例如Berge，S.M等，(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括从无毒无机酸(如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等)衍生的盐，以及从无毒有机酸(如脂肪族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸等)衍生的盐。碱加成盐包括从碱土金属(如钠、钾、镁、钙等)，以及从无毒有机胺类(如N，N’-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)衍生的盐。
可以通过本领域公知的多种方法施用本发明的组合物。如本领域技术人员将理解的，施用途径和/或方式将取决于所希望的结果。活性化合物可以保护该化合物不会快速释放的载体制备，例如控制释放制剂，包括植入物、透皮贴剂，和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、原酸酯，和聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法已经申请专利或者是本领域技术人员公知的。见例如《Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems》，J.R.Robinson编，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
为了通过某些施用途径施用本发明的化合物，可能必须将化合物用防止其失活的材料包被或者与所述材料共同施用。例如，本发明化合物可以在适宜的载体(例如脂质体或者稀释剂)中施用于受试者。可药用稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。脂质体包括水包油包水CGF乳剂以及常规脂质体(Streian等，(1984)J Neuroimmunol.7：27)。
可药用载体包括无菌水性溶液或者分散剂或者用于临时制备无菌注射液或者分散剂的无菌粉末剂。此类介质和试剂在药物活性物质的中的用途是本领域公知的。除了迄今与所述活性化合物不相容的任何常规介质和试剂之外，设想将常规介质和试剂用于本发明的药物组合物中。补充活性化合物也可以掺入组合物中。
治疗组合物在生产和保存条件下通常必须是无菌和稳定的。组合物可以配制成溶液剂、微乳剂、脂质体或者适于高药物浓度的其他有序结构。载体可以是溶剂或者分散剂介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)和它们的适宜混合物。例如，通过使用包衣(如卵磷脂)，通过保持所需的颗粒大小(对于分散剂)和使用表面活性剂，可以保持适当流动性。在许多情况中，组合物中将优选包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或者氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)可以延长可注射组合物的吸收。
如果需要，可以通过将适宜溶剂中的所需量活性化合物掺入上面列举的成分之一和组合，然后无菌微滤来制备无菌注射液。通常，可以将活性化合物掺入含有基础分散介质的无菌载体和所需的其他成分中来制备分散剂。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末剂，优选的制备方法是真空干扰和冷冻干燥(冻干)，其从前面无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何额外的所需成分的粉末剂。
调节剂量方案以提供最优目的应答(例如治疗应答)。例如，可以施用单次快速浓注，可以随时间施用数个分开的剂量或者根据治疗条件的紧急情况按比例减小或者增加剂量。尤其有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物，以便于施用和剂量的统一。文中所用剂量单位形式指适宜作为所治疗的受试者的统一剂量的物理不连续(discrete)的单位；每个单位含有预定量的活性化合物，该预定量经计算联合所需的药物载体结合产生所希望的治疗效果。本发明的剂量单位形式的说明书由如下条件规定并且直接取决于如下条件：(a)活性化合物的独特特征和所要实现的具体治疗效果的内在限制，和(b)复合领域的内在限制，如用于治疗个体敏感性的活性化合物。
可药用抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
对于治疗组合物，本发明的制剂包括适于经口、鼻、局部(包括口含和舌下)、直肠、阴道和/或肠胃外施用的制剂。制剂可以方便地以单位剂形存在或者可以通过药学领域中任何公知的方法制备。可以与载体物质组合以产生单次剂型的活性成分的量将随着所治疗的受试者和具体施用方式而变。可以与载体物质组合以产生单次剂型的活性成分的量通常是产生治疗效果的组合物的量。通常，以百分比计，该量将为约0.01％到约99％的活性成分，优选约0.1％到约70％，最优选约1％到约30％。
短语“肠胃外施用”指不同于经肠和局部施用的施用方式，通常通过注射，并且包括(但不限于)静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
本发明抗体组合物的优选施用途径为静脉内、肌内和腹膜内。优选的递送方式为通过注射和输注。
可用于本发明的药物组合物的适宜的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，和它们适宜的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。例如，通过使用包衣材料(如卵磷脂)，通过保持所需的颗粒大小(对于分散剂)和使用表面活性剂，可以保持适当流动性。
这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过前文的消毒步骤，并通过包含多种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，可以确保防止微生物的存在。组合物中包含等渗剂(如糖、氯化钠等)也可能是必要的。此外，通过包含延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝和明胶)可以延长可注射药物形式的吸收。
当本发明的化合物作为药物施用于例如人或动物时，它们可以单独给药或者作为药物组合物给药，药物组合物含有例如0.01％到99.5％(更优选0.1到90％)与可药用载体组合的活性成分。
无论所选的施用途径如何，可以以适当的水合形式使用的本发明化合物，和/或本发明的药物组合物可以通过本领域技术人员公知的常规方法配制成可药用剂型。
本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以改变以得到一定量的活性成分，所述量可以有效实现对于具体患者、组合物和施用方式的所希望的治疗应答，而对该患者无毒性。所选的剂量水平将取决于多种药物动力学因素，包括所用的本发明的具体组合物、或者其酯、盐或者酰胺的活性，施用途径、施用时间和所用的具体化合物的排泄速度、治疗的持续时间、与所用的具体组合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和既往病史，以及医学领域众所周知的因素。
具有本领域普通技术的医生或者兽医可以容易地确定和规定所需药物组合物的有效量。例如，医生或者兽医可以将药物组合物中所用的本发明化合物以低于实现所希望的治疗效果所需的剂量水平开始并逐渐增加剂量直到实现所希望的效果。通常，本发明组合物的适宜日剂量将为有效产生治疗效果的最低剂量的化合物量。此中有效剂量将通常取决于上面描述的因素。优选施用为静脉内、肌内、腹膜内、或者皮下，优选接近靶部位施用。如果需要，治疗组合物的有效日剂量可以以全天中适当间隔分开的2、3、4、5、6或更多的亚剂量施用，所述亚计量任选为单位剂型。尽管本发明的化合物可以单独施用，优选将该化合物作为药物制剂(组合物)施用。
可以用本领域公知的医学装置施用治疗组合物。例如，在优选实施方案中，本发明的治疗组合物可以以无针头的皮下注射装置，如美国专利No.5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公开的装置施用。可用于本发明的众所周知的植入物和模块包括：美国专利No.4,487,603，其公开了以受控的速率分散药物的可植入的微输注泵；美国专利No.4,486,194，其公开了用于通过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利No.4,447,233，其公开了用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利No.4,447,224，其公开了用于连续递送药物的可变流速的可植入输注装置；美国专利No.4,439,196，其公开了具有多室隔室的渗透药物递送系统；和美国专利No.4,475,196，其公开了渗透药物递送系统。本文引入这些专利作为参考。许多其他此类植入物、递送系统和模块是本领域技术人员公知的。
在某些实施方案中，可以配制本发明的人源化单克隆抗体以确保体内的适当分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水的化合物。为了确保本发明的治疗化合物穿过BBB(如果需要)，可以将它们配制在例如脂质体中。对于生产脂质体的方法，见例如美国专利No.4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体可以含有选择性转运到特定细胞或器官的一个或多个部分，从而增强靶向药物递送(见例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。代表性靶向部分包括叶酸或生物素(见例如Low等的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等，(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性剂蛋白质A受体(Briscoe等(1995)Am.J Physiol.1233：134)，它们的不同种类可以包含本发明的制剂，以及本发明分子的组分；p120(Schreier等(1994)J：Biol.Chem.269：9090)；也见K.Keinanen；M.L Lauklcanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。在本发明的一个实施方案中，本发明的治疗化合物配制在脂质体中；在更优选的实施方案中，脂质体包含靶向部分。在最优选的实施方案中，通过快速浓注到目的部分递送脂质体中的治疗化合物。组合物必须是具有一定程度的流动性以易于注射。组合物必须在生产和贮存条件下是稳定的并且必须免于微生物(如细菌和真菌)的污染作用。
相对于未受治疗的受试者，“治疗有效剂量”优选将I型干扰素的生物活性抑制至少约20％，更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，更优选至少约80％。化合物抑制I型干扰素的生物活性的能力可以在动物模型中评估，所述动物模型为诸如实施例中描述的或者本领域中公知的其他模型系统，其能够预测在与I型干扰素活性异常相关的人症状中的功效。备选地，通过检查化合物抑制I型干扰素的生物活性的能力可以评估组合物的该性质。此类抑制可以使用技术人员公知的体外测定法测定，所述测定法包括(但不限于)实施例中描述的体外测定法。治疗化合物的治疗有效量可以抑制I型干扰素活性，从而至少可以部分减轻异常I型干扰素表达或活性介导的疾病或紊乱的症状。此类疾病和紊乱包括自身免疫疾病、移植排斥和GVHD。本领域技术人员将能够基于诸如受试者的大小、受试者的症状的严重性，和所选施用的具体组合物和途径之类的因素确定此类量。
组合物必须是无菌且具有一定程度的流动性从而可以通过注射器递送。载体除了水还可以是等渗缓冲盐溶液、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，和它们的适宜混合物。例如，通过使用包衣(如卵磷脂)，通过保持所需的颗粒大小(对于分散剂)和使用表面活性剂，可以保持适当流动性。在许多情况中，组合物中将优选包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或者氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)，可以产生可注射组合物的长期吸收。
如上述，当活性化合物受到适当保护时，该化合物可以经口施用，例如用惰性稀释剂或者可同化的食用载体保护时。
本发明的用途和方法
本发明的人源化单克隆抗IFNAR-1抗体和相关衍生物/缀合物和组合物具有多种体外和体内诊断和治疗用途。例如，这些分子可以体外或离体施用于培养的细胞。备选地，它们可以例如体内施用于受试者以治疗、预防或诊断其中I型干扰素起作用的多种紊乱。文中所用“受试者”意在包括人和非人动物。本发明的术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类、绵羊、狗、奶牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
本发明的抗体组合物可用于治疗自身免疫疾病，如系统性红斑狼疮(SLE)、炎性肠病(IBD，包括克罗恩病、溃疡性结肠炎和Celiac病)、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)和类风湿性关节炎(RA)。此外，本发明的抗体组合物可以用于抑制或预防移植排斥或者治疗移植物抗宿主病(GVHD)。
本发明的抗体组合物用于治疗炎性肠病的用途在2003年4月23日提交的具有US Serial No.60/465,155，标题为″Compositions and Methods forthe Therapy of Inflammatory Bowel Disease″的共有的美国专利申请中详细描述，将该专利申请的完整内容特别并入本文作为参考。
可以最初测试本发明的人抗体与体外治疗使用相关的结合活性。例如，使用下面实施例中描述的Baicore和流式细胞术测定法可以测试本发明的组合物。施用本发明的抗体和组合物的适宜方法是本领域熟知的。适宜的剂量也可以在本领域技术内确定并且将取决于受试者的年龄和体重和所用的具体药物。
本发明的人抗IFNAR-1抗体也可以与上文描述的其他治疗剂共同施用。
优选用于肠胃外施用的药物制剂，《如Remington′s PharmaceuticalSciences》，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1989中所描述的制剂。最终制剂含有0.01到50％的活性成分。产生此类缀合物的方法和它们在诊断剂和治疗剂中的用途在例如Shih等，美国专利No.5,057,313；Shih等，Int.J.Cancer 41：832(1988)；共同待决的共有美国Ser.No.08/162,912和McKearn等，美国专利No.5,156,840中提供，将它们的内容完整并入本文作为参考。
如上文提到的，对于治疗，将人源化载体组合物和可药用载体以治疗有效量施用于患者。如果所施用的量是生理学上显著的，那么说施用的抗体组合物和可药用载体的组合是“治疗有效的”。如果试剂的存在导致接受患者生理上的可检测改变，那么该试剂是“生理学上显著的”。与在全身性施用时相等非靶向治疗剂在靶标的聚集相比，如果靶向治疗剂递送更高比例的施用剂量到达意图的靶标，那么该靶向治疗剂是“治疗有效的”。
还通过下面的实施例阐明本发明，不应将这些实施例误解为限制性的。本申请中引用的所有附图和所有参考文献、专利和公开专利申请的内容在此明确并入本文作为参考。
实施例1：产生对IFNAR-1特异的人源化抗体
用于制备人源化抗体的供体CDR的来源是鼠单克隆抗体64G12，其对IFNAR-1特异(美国专利No.5,919,453)。之前已经建立了64G12杂交瘤细胞系。
64G12可变区的克隆
使用Qiagen的Oligotex mRNA Miniprep试剂盒从64G12杂交瘤提取mRNA并随后使用Clontech的Marathon cDNA扩增试剂盒合成cDNA。用Qiagen的HotStarTaq使用针对鼠IgG1基因的引物(正向：ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCTG(SEQ ID NO：43)和反向：CAGTGGATAGACAGATGGGG(SEQ ID NO：44))扩增64G12的重链可变区，而使用针对鼠κ基因的引物(ACTGGATGGTGGGAAGATGG)(SEQ ID NO：45)和N-末端氨基酸序列的引物(CTCACCCAGTCTCCAACCACCATGGCTGCATC)(SEQ ID NO：46)扩增轻链。通过比较64G12抗体的N-末端肽序列与来自cDNA克隆的经翻译的蛋白质序列证实链的身份。
可变区的构建
参考Kabat等(″Sequences of Proteins of Immunological Interes″USDepartment of Health and Human Services，US Government PrintingOffice)的数据库并利用计算机辅助的与其他VH和VL序列的比对，从64G12 VH和VL结构域的序列确定了CDR序列，特别引入该数据库的内容作为参考。VH序列在SEQ ID NO：7中显示。VL序列在SEQ ID NO：19中显示。VH和VL结构域的CDR区的氨基酸序列在下表1中显示。
表1
    SEQ ID NO：     序列     说明
    1  TSGMGIG  64G12 VHCDR1
    2  HIWWDDDKYYNPSLKS  64G12 VHCDR2
    3  NYYPYDAWFDY  64G12 VHCDR3
    4  SASSSINSNHLH  64G12 VLCDR1
    5  RTSILAS  64G12 VLCDR2
    6  QQGSNIPFT  64G12 VLCDR3
使用引物从上述模板扩增鼠可变区，所述引物具有允许框内亚克隆到我们的哺乳动物表达载体阅读框内的限制性位点。
通过Operon合成第一系列的人可变区cDNA。用Stratagene的QuikChange定向诱变试剂盒随后产生去免疫的抗体。
全长抗体的表达
将所有重和轻可变区序列(鼠和人)都分别亚克隆到Invitrogen的哺乳动物表达载体pcdna3.1/neo和pcdna3.1/hygro中具有人IgG恒定区的框内。人骨粘连蛋白信号序列用于代替内源IgG序列以分泌重组抗体。此外，将4.2 kb RNP UCOE′s(Benton等，Cytotechnology，38：43-46，2002)插入到CMV启动子的上游以保持开放的染色质和允许快速产生高水平抗体表达的细胞。
对于瞬时转染，用Roche的FuGENE 6，用携带重链和轻链的质粒共转染人293细胞。转染后3-4天收集上清液并通过A蛋白-sepharose层析纯化抗体。
为了稳定表达，使用Invitrogen的DMRIE-C，用携带重链和轻链的线性化质粒共同转染CHO-S细胞。通过向培养基加入500μg/mL遗传霉素和潮霉素B选择稳定转染的细胞。扩增分泌抗体的细胞，并如Harlow和Lane(《Antibodies：A Laboratory Manual》，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)所描述的通过A蛋白亲和层析从培养基纯化抗体，将该文献的内容特别并入作为参考。
通过如Nakamye等(Nucleic Acids Res14，9679-9687(1986))(将其内容特别并入作为参考)所描绘的寡核苷酸位点定向诱变实现鼠64G12 CDR向人构架的转移。用于诱变VH的DNA模板含有如下来自人生殖系序列DP-26、DP-47和DPk26的人构架区：(DP-26) (Genbank：HSIGDP26)QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSNARMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYY(SEQ ID NO：47)，(DP-47) (Genbank：HSIGDP47)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK(SEQ IDNO：48)，和(DPk26) (Genbank：HSIGDPK26)EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGSSLHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCHQSSSLP(SEQ ID NO：49).
此外，在某些构建体中，在CDR和/或FR残基中进行了额外的替换以增加结合亲和力或减小抗体免疫原性(下文中进一步讨论)。
总之，产生了一系列含有如下序列的人源化抗体重链和轻链可变区。图1B-IL和2B-2S中显示了这些抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列，以及供体鼠64G12可变区的氨基酸序列(64G12 VH序列为图1A的SEQ IDNO：7，64G12 VL序列为图2A的SEQ ID NO：19)。
通过将64G12 VH的CDR与人免疫球蛋白重链生殖系DP-28构架序列组合设计重链序列H2(图1B的SEQ ID NO：8)。
通过组合仅64G12 VH的CDR3与人免疫球蛋白重链生殖系DP-28构架序列设计重链序列H2-C3(图1C的SEQ ID NO：9)。
通过将64G12 VH的CDR与人免疫球蛋白共有的重链构架序列组合设计重链序列H3(图1D的SEQ ID NO：10)。
通过将64G12 VH的CDR与人免疫球蛋白重链生殖系DP-47构架序列组合设计重链序列M3(图1E的SEQ ID NO：11)。
从M3序列设计重链序列M3-4，其中CDR3的4位用下面氨基酸之一替换：L、N、E、V、A、C、G、S、R、D、M、H、T、W、K或I(图1F的SEQ ID NO：12)。
从M3序列设计重链序列M3-11，其中CDR3的11位用下面氨基酸之一替换：L、E、Q、R、V、A、F、G、C、T、W、H、K、D、S或I(图1G的SEQ ID NO：13)。
从M3序列设计重链序列M3-A，其中通过将CDR1的4位氨基酸(甲硫氨酸)用丙氨酸替换除去T细胞表位(图1H的SEQ ID NO：14)。
从M3序列设计重链序列M3-B，其中通过将CDR2的16位氨基酸(丝氨酸)用丙氨酸替换除去T细胞表位(图1I的SEQ ID NO：15)。
从M3序列设计重链序列M3-A/B，其中将来自M3-A和M3-B的替换掺入M3序列(图1J的SEQ ID NO：16)。
从M3序列设计重链序列DI M3，其中通过在6个构架残基处进行替换除去所有其潜在T细胞表位(图1K的SEQ ID NO：17)。
从M3序列设计重链序列DI M3-B，其中将DI M3序列的构架替换和M3-B序列的CDR2替换组合(图1L的SEQ ID NO：18)。
通过组合64G12 VL的CDR与人免疫球蛋白轻链生殖系DPk-26构架序列设计轻链序列K6(图2B的SEQ ID NO：20)。
通过组合64G12 VH的CDR与人免疫球蛋白共有的轻链构架序列设计轻链序列K1(图2C的SEQ ID NO：21)。
从K1序列设计轻链序列K1-C，其中通过用苏氨酸替换CDR1的4位(丝氨酸)除去其潜在T细胞表位之一(图2D的SEQ ID NO：22)。
从K1序列设计轻链序列K1-D，其中通过用天冬酰胺替换CDR1的4位(组氨酸)除去其潜在T细胞表位之一(图2E的SEQ ID NO：23)。
从K1序列设计轻链序列K1-E，其中通过用苏氨酸替换CDR3的3位(甘氨酸)除去其潜在T细胞表位之一(图2F的SEQ ID NO：24)。
从K1序列设计轻链序列K1-C/D、K1-C/E、K1-D/E和K1-C/D/E，其中分别组合来自K1-C和K1-D的替换、来自K1-C和K1-E的替换、来自K1-D和K1-E的替换和来自K1-C、K1-D和K1-E的替换(分别为图2G、2H、2I和2J的SEQ ID NO：25、SEQID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28)。
从K1序列设计轻链序列DI K1，其中通过在六个构架残基进行替换而除去其所有潜在T细胞表位(图2K的SEQ ID NO：29)。
从K1序列设计轻链序列DI K1-C，其中将来自D1 K1的构架替换与K1-C中CDR1的替换组合(图2L的SEQ ID NO：30)。
从K1序列设计轻链序列DI K1-DS，其中通过在五个构架残基进行替换除去六个潜在T细胞表位的5个(图2M的SEQ ID NO：31)。
从K1序列设计轻链序列DI K1-C-DS，其中组合来自D1 K1-DS的替换与来自K1-C的替换合并(图2N的SEQ ID NO：32)。
从K1序列设计轻链序列DI K1-A19V、DI K1-L37Q、DI K-1-A46L、DI K1-I58V和DI K1-T83F，其中通过改变构架区中高亮的(highlighted)氨基酸除去六个潜在T细胞表位的5个，分别如图2O、2P、2Q、2R和2R中的SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37所示。
图3A-3D显示了重链可变区M3(图3A)和DI M3-B(图3C)和轻链可变区K1(图3B)和K1-C(图3D)的核酸序列。
实施例2：某些人源化VH和VL对的Biacore分析
产生了一系列人源化抗体VH和VL对并将它们与原始鼠抗体以及小鼠-人嵌合抗体比较，所述嵌合抗体含有64G12的鼠可变区和人IgG4κ恒定区。人重链H2和H3与人轻链K1和K6组合表达得到抗体H2K6、H2K1、H3K6和H3Kl。这些可变区的氨基酸序列在图1B、1D、2B和2C中显示。
通过Biacore分析(Biacore AB，Uppsala，瑞典)分析来自克隆64G12、H2K6、H2K1、H3K6和H3K1的抗体以测定结合动力学。纯化的重组IFNAR-1细胞外片段偶联到CM5传感器芯片@600RU。通过以1.75-80nM的浓度和20μl/分钟的流速加入抗体测量结合。使用BIAevaluation软件(Biacore AB，Uppsala，瑞典)将抗体结合曲线拟合朗缪尔(Langmuir)结合模型。所测定的KD值在表2中显示。
表2
 抗体   KD(M)
 64G12(小鼠IgG1)   1.2×10-9
 嵌合IgG4   3.6×10-9
 H2K6   1.3×10-9
 H2K1   0.8×10-9
 H3K6   1.8×10-9
 H3K1   3.4×10-9
使用该测定法测定鼠标准抗体和人IgG4嵌合抗体的结合亲和力为1.2-3.6nM。所有人源化抗体组合导致对IFNAR-1与嵌合抗体和鼠杂交瘤来源的最初抗体64G12不可区分的高结合亲和力。
还与K6轻链抗体联合表达了称作H2-C3的备选的重链(图1C的SEQID NO：9)，其中仅CD3保留自鼠抗体，但是所产生的抗体不能结合IFNAR-1。
另一种称作M3(图1E的SEQ ID NO：11，其含有人免疫球蛋白重链生殖系DP-47构架序列)的人源化重链与K1轻链共表达并导致能够以高亲和力结合IFNAR-1的抗体。使用捕获测定法测定结合亲和力，在该测定法中将抗人IgG Fc固定在Biacore芯片上，通过将抗人IFNAR-1抗体穿过抗人IgG Fc表面使它们被捕获，然后在25-400nM的浓度下测量可溶的IFNAR-1的结合以使得能够计算结合亲和力。将M3K1的结合亲和力与H3K1的比较。结果在表3中显示。
表3
  ka(1/Ms)   kd(1/s)   KD(M)
  H3K1   8.06E+03   5.04E-05   6.26E-09
  M3K1   5.34E+03   3.79E-05   7.09E-09
流式细胞2-1，低密度捕获
  ka(1/Ms)   kd(1/s)   KD(M)
  H3K1   7.48E+03   4.81E-05   6.43E-09
  M3K1   5.49E+03   4.39E-05   7.99E-09
流式细胞4-3，较高密度捕获
实施例3：所选抗体细胞的去免疫
使用Peptide Threading程序(Biovation，Inc.)分析H3K1 VH和VK序列。简言之，将氨基酸序列分成所有可能的13聚体。将13聚体肽顺序呈递给HLA-DR同种异型的结合沟模块并为每个等位基因的每种肽指定结合得分。为肽的每个口袋结合侧链计算构象得分。该得分基于立体重叠、结合沟中肽和残基之间的潜在氢键、肽和口袋残基之间静电相互作用和有利的接触。然后改变每个侧链的构象并再次计算得分。
通过在构成表位的特定肽中进行氨基酸替换除去潜在T细胞表位。如果可能，通过插入具有相似理化性质的氨基酸进行替换。然而，为了除去某些潜在表位，可能需要替换不同大小、电荷或疏水性的氨基酸。用于替换的氨基酸残基的编号按照Kabat(Kabat等，1991)。氨基酸替换在图1H-1L和2D-2S中总结和阐明。
构建了潜在T细胞表位数减少的一系列抗体。这些抗体包括重链变体M3-A和M3-B，其中改变CDR区域中的残基，还包括DI M3，其中改变构架残基。还构建了去免疫的轻链，它们称作K1-C、K1-D、K1-E和DI KI。这些去免疫的V区以如表4中显示的多种组合表达为人IgG4抗体。在通过Biacore分析前表达和纯化抗体。所用的Biacore芯片中，IFNAR-1以690RU包被在的流式细胞2上，抗人IgG Fc以5000RU包被在流式细胞4上。通过流式细胞2除以流式细胞4的反应比值(Fc2/Fc4)测定相对于抗人IgG Fc的抗体与IFNAR-1的结合。如表4中所示，与H3K1标准相比，一些变体保持高IFNAR-1结合活性。
表4
  重链   轻链   Fc2/Fc4   相对于H3K1的％应答
  名称  SEQ ID NO：   名称  SEQIDNO：
  H3   10   K1   21   0.30   100
  M3   11   K1   21   0.42   140
  DI M3   17   K1   21   0.41   137
  M3   11   DI K1   29   0.17   57
  DI M3   17   DI K1   29   0.06   20
  M3-A   14   K1   21   0.05   17
  M3-B   15   K1   21   0.31   103
  M3-AB   16   K1   21   0.13   43
  M3   11   K1-C   22   0.29   97
  M3   11   K1-D   23   0.09   30
  M3   11   K1-E   24   -0.05   -
  M3   11   K1-CD   25   0.17   57
  M3   11   K1-CDE   28   -0.10   -
  M3   11   K1-DE   27   -0.10   -
  M3-AB   16   K1-CD   25   0.07   23
还产生了重链DI M3-B和轻链DI K1-C的额外组合抗体。也测试了这些组合变体对IFNAR-1的结合。结果表明尽管用DI M3-B重链保留了高结合亲和力，但是DI K1-C轻链的使用导致降低的结合活性，类似于用DI K1轻链所看到的。结果在表5中显示。通过Biacore进行结合分析，抗体结合固定的可溶性IFNAR-1。在两种浓度下测定最大应答并且所显示的值是四次测定的平均值。
表5
  重链   轻链   相对干H3K1的％应答
  名称 SEQ IDNO：   名称 SEQ ID NO：
  H3   10   K1   21   100
  M3   11   K1   21   97
  M3-B   15   K1   21   117
  DI M3   17   K1   21   149
  DIM3-B   18   K1   21   122
  M3   11   K1-C   22   100
  M3-B   15   K1-C   22   156
  DI M3   17   K1-C   22   96
  DIM3-B   18   K1-C   22   100
  M3   11   DI K1   29   25
  M3-B   15   DI K1   29   17
  DI M3   17   DI K1   29   8
  DIM3-B   18   DI K1   29   11
  M3   11   DIK1-C   30   17
  M3-B   15   DIK1-C   30   14
  DI M3   17   DIK1-C   30   4
  DIM3-B   18   DIK1-C   30   9
为了进一步表征所选变体，使用抗体捕获测定法(其中抗人IgG Fc结合Biacore芯片并且可溶IFNAR-1以25-400nM使用)测定它们的亲和力。结果在表6中显示并且表明用这些变体看到对IFNAR的高结合亲和力。
表6
  ka(1/Ms)   kd(1/s)   KD(M)   AbR最大
  M3 K1   5.34E+03   3.79E-05   7.09E-09   528
  M3-B K1-C   5.49E+03   4.10E-05   7.47E-09   520
  DIM3-B K1-C   5.61E+03   2.82E-06   5.02E-10   479
流式细胞2-1，低密度捕获
  ka(1/Ms)   kd(1/s)   KD(M)   AbR最大
  M3K1   5.49E+03   4.39E-05   7.99E-09   924
  M3-B K1-C   5.46E+03   4.06E-05   7.45E-09   908
  DIM3-B K1-C   4.64E+03   1.64E-05   3.53E-09   848
流式细胞4-3，较高密度捕获
通过抗人IgG Fc、可溶性IFNAR(25-400nm)捕获
实施例4：所选抗体序列中CDR残基的改变
用改变的CDR3序列产生了一系列备选重链。一系列库中每个库都含有CDR3中11个位置之一的多个氨基酸替换，这些库与K1轻链共表达，从每个库纯化抗体用于测试。实施Biacore实验以测定对固定的可溶IFNAR-1的结合活性。通过抗IFNAR-1抗体的CDR3变体文库与固定的可溶性IFNAR-1的结合测定该抗体库。从200nM样品产生应答单位(A：最大结合的RU，D：800秒解离后的RU)。如表7中所示，测定了每个库不同的活性水平。
表7
  抗体重链   重链CDR3   A：最大结合的RU   D：800秒解离后的RU   相对于H3K1的最大应答(％)
  H3(序列10)  如SEQ ID NO：10中   194   190   100
  M3-1  CDR3aa1随机的   74   61   38
  M3-2  CDR3aa2随机的   147   140   76
  M3-3  CDR3aa3随机的   98   88   51
  M3-4  CDR3aa4随机的   102   89   53
  M3-5  CDR3aa5随机的   60   41   31
  M3-6  CDR3aa6随机的   21   12   11
  M3-7  CDR3aa7随机的   104   99   54
  M3-8  CDR3aa8随机的   26   19   14
  M3-9  CDR3aa9随机的   87   83   45
  M3-10  CDR3aa10随机的   45   38   23
  M3-11  CDR3aa11随机的   149   146   77
选择库4和11用于进一步研究并单独产生和表达每个库中的不同抗体。这些不同抗体的序列如图1F的SEQ ID NO：12和图1G的SEQ ID NO：13所示。表8中显示了库4中不同抗体与IFNAR-1结合的Biacore分析。数据表示为相对于M3K1的最大结合。库11中不同抗体与IFNAR-1的结合的Biacore分析在表9中显示。数据表示为相对于M3K1的最大结合。
表8
  重链  X氨基酸残基   轻链   相对于M3K1的％活性
  名称  SEQIDNO：   名称  SEQIDNO：
  H3   10   -   K1   21   115
  M3   11   -   K1   21   100
  M3-4   12   L   K1   21   126
  M3-4   12   N   K1   21   49
  M3-4   12   E   K1   21   128
  M3-4   12   V   K1   21   122
  M3-4   12   A   K1   21   107
  M3-4   12   C   K1   21   123
  M3-4   12   G   K1   21   114
  M3-4   12   S   K1   21   110
  M3-4   12   I   K1   21   106
  M3-4   12   R   K1   21   106
  M3-4   12   D   K1   21   100
  M3-4   12   M   K1   21   101
  M3-4   12   H   K1   21   79
  M3-4   12   T   K1   21   103
  M3-4   12   W   K1   21   93
  M3-4   12   K   K1   21   86
表9
  重链   X氨基酸残基   轻链   相对于M3K1的％活性
  名称  SEQIDNO：   名称  SEQIDNO：
  H3   10   -   K1   21   138
  M3   11   -   K1   21   100
  M3-11   13   L   K1   21   75
  M3-11   13   E   K1   21   105
  M3-11   13   Q   K1   21   73
  M3-11   13   R   K1   21   220
  M3-11   13   V   K1   21   108
  M3-11   13   A   K1   21   93
  M3-11   13   F   K1   21   93
  M3-11   13   G   K1   21   63
  M3-11   13   C   K1   21   64
  M3-11   13   I   K1   21   81
  M3-11   13   T   K1   21   82
  M3-11   13   W   K1   21   70
  M3-11   13   H   K1   21   104
  M3-11   13   K   K1   21   82
  M3-11   13   D   K1   21   67
  M3-11   13   S   K1   21   39
所有产生的变体都保持对IFNAR-1的结合，它们具有不同的抗原结合活性，如表8和9中所示。
实施例5：抗IFNAR-1人源化抗体对细胞的斯卡查德结合分析
将表达IFNAR-1和IFNAR-2的BALL-1细胞用于通过斯卡查德分析评估抗IFNAR-1人源化抗体对细胞的结合。细胞生长于含有10％FCS的RPMI中并用4℃Hanks平衡盐溶液(HBSS)洗涤两次。将细胞用Tris结合缓冲液(24mM Tris、137mM NaCl、2.7mM KCl、0.1％HAS、2mM葡萄糖、1mM MgCl2、1mM CaCl2，pH 7.4)调节到4×107个细胞/ml。将Millipore板(MAFB NOB)用溶于水的1％无脂干奶包被并在4℃保存过夜。用结合缓冲液洗涤板两次并将TBS结合缓冲液中的25μl未标记的抗体(1000倍过量)加入Millipore 96孔玻璃纤维过滤板(非特异结合NBS)中的对照孔中。将25微升缓冲液单独加入最大结合对照孔(总结合)。加入溶于TBS结合缓冲液中的25微升125I-抗IFNAR-1抗体和25μl BALL-1细胞悬浮液(4×107个细胞/ml)。将板在振荡器上4℃下以200转/分钟孵育2小时。孵育完成时，用含有终浓度0.5M NaCl的0.2ml冷TBS结合缓冲液洗涤Millipore板两次。除去滤器并在γ计数器中计数。用Prism软件(San Diego，CA)用单位点结合参数评估平衡结合。
使用上面的斯卡查德结合测定法，人源化抗体H3K1(IgG4同种型)对BALL-1细胞的亲和力为4nM，这与鼠64G12非常相似。用完整细胞结合测定法得到的低纳摩尔亲和力值与Biacore数据相当，该Biacore数据中测定了抗体对纯化的重组配体的亲和力(表10)。因此，在基于蛋白质或者基于细胞的测定中，抗体的结合亲和力都在低nM范围。
表10
  同种型   受体结合(Biacore)KD(nM)   细胞结合亲和力(BALL-1)KD(nM)
 64G12   m IgG1   1.2   3.9
  H3K1   h IgG4   3.4   4.0
实施例6：抗IFNAR-1人源化抗体抑制细胞增殖中I型IFN的生物活性IFN-应答报告子测定
来源于人B-淋巴母细胞Burkitt淋巴瘤的细胞系Daudi表达高水平IFNAR，这些细胞的生长受到I型干扰素的抑制。为了测量人源化抗IFNAR-1抗体的功能阻断能力，进行了两种不同的测定。在第一种测定中，在存在和不存在抗体时将Daudi细胞与干扰素α2b培养，并通过3[H]胸苷的摄入测量增殖。Daudi细胞从ATCC得到并且生长在含有10％FCS和2mM β巯基乙醇的RPMI(培养基)中。将细胞离心，并以1×106个细胞/孔的浓度重悬浮在加入1％人血清白蛋白的培养基(培养基&HS)中。向96孔板的每个孔加入含有适宜浓度抗体的100μl 200U/ml干扰素α2b(Schering corporation)。向孔中加入100μl培养基&HS中的Daudi细胞并将板在37℃下孵育48小时。用1μCi 3[H]-胸苷脉冲板并将板再孵育24小时。收获板，并收集到96孔纤维过滤板上，使用TopCount闪烁计数器(Packard)计数。每分钟的计数作为抗体浓度的函数作图，并使用Prism软件(San Diego，CA)，通过非线性回归、S形剂量反应(可变斜率)分析数据。
在第二种测定中，用构建体转染U937细胞，所述构建体中干扰素刺激的应答元件与报告基因连接(ISRE-RG)并且测量人源化抗INFAR-1抗体阻断IFN-诱导报告基因表达的能力。细胞生长在含有10％FCS和2mMβ巯基乙醇的RPMI(培养基)中。将细胞重悬浮(1×106个细胞/ml)在加入2％人血清的培养基中。向96孔板加入100μl细胞。将抗体在含有200U/ml干扰素α2b(Schering corporation)的培养基中连续稀释并向每孔加入100μl。将板在37℃孵育过夜。孵育后，通过流式细胞术评估报道基因的表达。将几何平均荧光密度作为抗体浓度的函数作图并使用Prism软件(San Diego、CA)通过非线性回归、S型剂量反应(可变斜率)分析数据。
使用上述两种测定法，在Daudi增殖测定中得到2-10nM的效力，在ISRE-RG报告子测定中为2-22nM。鼠64G12的效力与人源化IgG1抗体的相当。结果在表11中总结。
表11
  同种型   细胞增殖(Daudi)IC50(nM)   ISRE-RG报告子(U937)IC50(nM)
  64G12   m IgG1   2.1   5.8
  H3K1   h IgG4   9.1   21.5
  H3K1(IgG1)   h IgG1   3.9   2.7
  DI M3-B K1C   h IgG1   10   4.6
为数据清楚地表明人源化抗IFNAR-1抗体对INFα2b具有强烈活性，所以我们测试了抗体阈值INF β应答的能力。所测试的两种人源化抗体H3K1(IgG1)和H3K1(IgG4)使IFN β诱导的细胞信号转导的强烈抑制剂，如通过报告子测定所测量。H3K1(IgG1)比H3K1(IgG4)强约10倍，而鼠64G12为H3K1(IgG1)的1/3。IFNα和IFNβ的报告子测定结果在图4A-4B中显示。
为了评估人源化抗IFNAR-1抗体抑制多种I型IFN的生物活性的能力，在Daudi增殖测定中测试了不同的IFNα亚型。在10μg/ml人源化抗体DIM3-B K1C或者同种型对照的存在下，将Daudi细胞与下面的IFNα亚型之一孵育：2a、2b、4b、8、10、1、21、5、14、17、7、6或16或者与白细胞IFN或者通用IFN孵育。如上述测定Daudi增殖。结果以图5中的条形图显示。该结果表明抗IFNAR-1抗体诱导了多种I型IFN引起的应答的逆转，所述IFN包括(但不限于)白细胞IFN、通用IFN、IFNα2a、α2b、α4b、α8、α10、α1、α21、α5、α14、α17、α7、α6和α16。
实施例7：抗IFNAR-1抗体对树突细胞成熟的影响
IFNα在SLE患者中诱导树突细胞成熟和活化。建立了体外系统以检查抗IFNAR-1抗体抑制IFN-α介导的树突细胞成熟的能力。在这些实验中，通过将外周血细胞在GM-CSF和IL-4或者GM-CSF和INFα中培养驱动它们形成树突细胞表型。在仅有GM-CSF中生长培养物作为对照，因为这些细胞保持巨噬细胞样表型。如通过树突细胞摄入抗原的能力和细胞表面标记物表达的改变所测量的，INFα驱动树突细胞培养物的成熟。
为了进行该测定法，用PBS将25ml暗黄覆盖层稀释4倍。将样品分装到4×50ml锥形管中，其下是一层15ml淋巴细胞分离培养基(ICNBiomedicals)。以500Xg离以30分钟后，除去含有PBMC的暗黄层并用PBS洗涤。将细胞以4×106个细胞/ml重悬浮在培养基中。通过于37℃在培养基中孵育PBMC(2.0×107个细胞/5ml/25cm2培养瓶)并两次洗除未贴壁的细胞，分离单核细胞。最后洗涤后，细胞培养于含有加入的1％热失活的人血清(Gemini Bio Products)的培养基中。将GM-CSF(500U/ml)、IL-4(1000U/ml)、IFNα(Intron A；1000U/ml)、IFN β(1000U/ml)和/或抗IFNAR-1抗体或者同种型对照抗体(30μg/ml)加入适宜的培养瓶，并且细胞生长3到7天。为了DC成熟，在第3天和第5天加入TNFα(10ng/ml)，将DC用PBS洗涤并用1∶5000Versene在37℃处理10分钟。当通过温和细胞刮除使必要的DC脱离时，将它们洗涤并分析。
每种DC培养物重悬在染色培养基含有0.2％碳酸氢钠、0.01％叠氮钠、0.1mM EDTA、20mM HEPES和2％FCS的Hanks平衡盐溶液(HBSS)中，并相等地分装到V形底96孔板的6个孔中。每个孔在Sorvall RTH-750转子上以2100转/分钟脉冲旋转，并重悬浮在25μl染色培养基中。向每孔加入1微克特定荧光染料缀合的抗体并在冰上孵育45分钟。将DC洗涤3次，重悬浮在200μl含2％多聚甲醛的PBS中，并使用Becton DickinsonFACScalibur，通过流式细胞术分析。在Forward对Side Scatter图中引入开口(gate)，以从分析中除去污染的细胞。
来源于存在IL-4或者IFNα的GM-CSF的DC表型不同。尽管IL-4来源的DC表达CD1并且缺少CD14和CD123，但是IFNα来源的DC表达较高水平CD123和CD14和较低水平CD1a。此外，IFNα来源的DC比IL-4来源的DC表达更高水平的共刺激分子II类MHC和CD86。用人源化抗IFNAR1抗体、H3K1共处理IFN培养物导致类似巨噬细胞(仅GM-CSF)的表达模式。此外，IFN和H3K1处理的培养物的形态看起来像巨噬细胞，具有典型的薄烤饼样外观。从而，该实验表明人源化抗IFNAR-1抗体能够抑制IFNAR诱导的树突细胞成熟。流式细胞术分析的结果在表12中概述(显示了四次实验的几何平均值的中值)。
表12
  处理   CD1a   CD123   CD14   CD86   CD58   II类
  GM-CSF   42   135   427   172   208   123
  GM-CSF&IL-4   395   0.5   0   45   73   287
  GM-CSF&IFN   20   161   207   288   89   413
  GM-CSF，IFN&H3K1(IgG4)   50   86   130   125   197   141
  GM-CSF，IFN&hIgG4(对照)   4   86   263   266   88   348
实施例8：人源化抗IFNAR-1抗体在恒河猴中的药物动力学和免疫原性
通过流式细胞术分析评估人源化抗IFNAR-1抗体H3K1结合来自恒河猴的外周血细胞的能力。H3K1抗体对恒河猴细胞的反应性与和在人细胞中所见的反应性相似，表明该物种可用于预临床动物试验。使用131I标记的H3K1在恒河猴中进行药物动力学研究。与非人灵长类动物中对CDR嫁接的抗体所预期的一样，H3K1的半衰期(t1/2β)为～5.5天(两只动物)。
在第10天看到清除速率增加，表明可能存在免疫原性。为了评估这一点，将研究中的动物用H3K1给药3次，然后用标记抗体再次攻击。观察到快速清除，估计的t1/2b为14-19小时。该结果表明H3K1在猴子中产生了明确的抗体应答。在前面实施例中描述的本发明去免疫的人源化抗体可用于减小人源化抗IFNAR-1抗体在体内的免疫原性。
实施例9：在恒河猴中通过人源化抗IFNAR-1抗体中和IFNAR/IFNα活性
用药物动力学模型研究抗IFNAR抗体体内抑制干扰素活性的能力。在该模型中，将外源IFN-α2b通过肌内施用，并测量外周血细胞的活性和血清活化标记物的存在。对恒河猴静脉内输注10mg/kg鼠抗IFNAR-1mAb 64G12、人源化抗IFNAR-1mAb H3K1或者载体对照。然后肌内施用人IFN-α2b(3×106U/Kg)。在24小时内监视细胞表面标记物CD86、II类MHC、I类MHC和IFNAR1的表达。此外，监视血浆标记物新蝶呤、β2微球蛋白和C-反应蛋白。主要的发现为：a)IFN-α2b处理增加了外周血细胞上I类MHC表达并通过抗体处理阻断了该增加的表达，b)通过IFN-α2b处理升高了所有三种测量的血浆标记物并且H3K1诱导阻断50％的新蝶呤水平和CRP 25％的降低，而没有看到β2微球蛋白改变。因此，观察到对IFN-αt2b的可测量的体内应答，其受到抗体处理的部分阻断。
等价方案
本领域技术人员将认识到或者仅仅使用常规实验就可以确定本文描述的本发明特定实施方案的许多等价方案。此类等价方案意在被所附权利要求包括。
引用作为参考文献
此处完整引用本文公开的所有专利、待决专利申请和其他公开作为参考。

Claims (83)

1.特异结合IFNα受体-1的人源化抗体或人源化抗体片段，其含有：
重链可变区，该重链可变区含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQID NO：3的互补决定区氨基酸序列；和
轻链可变区，该轻链可变区含有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQID NO：6的互补决定区氨基酸序列；和
来源于人抗体重链和轻链或者人抗体共有构架的可变结构域构架区，其中所述来自人抗体或者人抗体共有构架的可变结构域构架区未被改变。
2.权利要求1的人源化抗体或人源化抗体片段，其还含有人重和轻恒定结构域。
3.权利要求2的人源化抗体或人源化抗体片段，其中人重恒定区选自人γ1、γ2、γ3和γ4。
4.权利要求2的人源化抗体或人源化抗体片段，其中人重恒定区为γ1。
5.权利要求1的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段具有KD为1×10-7M或更小的IFNα受体-1结合亲和力。
6.权利要求1的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段具有KD为1×10-8M或更小的IFNα受体-1结合亲和力。
7.权利要求1的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段具有1×10-7到5×10-10M的IFNα受体-1结合亲和力。
8.权利要求1的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段具有1×10-8到5×10-10M的IFNα受体-1结合亲和力。
9.权利要求1的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段具有1×10-9到5×10-10M的IFNα受体-1结合亲和力。
10.特异结合IFNα受体-1的人源化抗体或人源化抗体片段，其具有重链可变区，该重链可变区含有：
鼠抗体64G12的CDR1(SEQ ID NO：1)、CDR2(SEQ ID NO：2)和CDR3(SEQ ID NO：3)氨基酸序列，其中在CDR3(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列中已经进行了至少一个氨基酸替换，所述人源化抗体或人源化抗体片段还含有来源于人抗体或者人抗体共有构架的可变结构域构架区。
11.权利要求10的人源化抗体或人源化抗体片段，其中该人源化抗体或人源化抗体片段保留鼠抗体64G12的IFNα受体-1结合亲和力的至少50％。
12.权利要求10的人源化抗体或人源化抗体片段，其中来自人抗体或者人抗体共有构架的可变结构域构架区未被改变。
13.权利要求10的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述氨基酸替换在CDR3的4位。
14.权利要求13的人源化抗体或人源化抗体片段，其中CDR3的4位的所述氨基酸替换是脯氨酸替换为选自L、N、E、V、A、C、G、S、I、R、D、M、H、T、W和K的氨基酸。
15.权利要求13的人源化抗体或人源化抗体片段，其中CDR3的4位的所述氨基酸替换是脯氨酸替换为选自L、E、V、A、C、G、S、I、R、D、M、T、W和K的氨基酸。
16.权利要求10的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述氨基酸替换在CDR3的11位。
17.权利要求16的人源化抗体或人源化抗体片段，其中CDR3的11位的所述氨基酸替换是酪氨酸替换为选自L、E、Q、R、V、A、F、G、C、I、T、W、H、K、D和S的氨基酸。
18.权利要求16的人源化抗体或人源化抗体片段，其中CDR3的11位的所述氨基酸替换是酪氨酸替换为选自E、R、V、A、F和H的氨基酸。
19.权利要求10-18中任一项的人源化抗体或人源化抗体片段，其还含有轻链可变区，该轻链可变区含有鼠抗体64G12的CDR1(SEQ ID NO：4)、CDR2(SEQ ID NO：5)和CDR3(SEQ ID NO：6)的氨基酸序列。
20.权利要求19的人源化抗体或人源化抗体片段，其还含有人重和轻恒定结构域。
21.权利要求20的人源化抗体或人源化抗体片段，其中人重恒定区选自人γ1、γ2、γ3和γ4。
22.权利要求20的人源化抗体或人源化抗体片段，其中人重恒定区是人γ1。
23.权利要求10的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段具有KD为1×10-7M或更小的IFNα受体-1结合亲和力。
24.权利要求10的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段具有KD为1×10-8M或更小的IFNα受体-1结合亲和力。
25.权利要求10的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段具有1×10-7到5×10-10M的IFNα受体-1结合亲和力。
26.权利要求10的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段具有1×10-8到5×10-10M的IFNα受体-1结合亲和力。
27.权利要求10的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段具有1×10-9到5×10-10M的IFNα受体-1结合亲和力。
28.特异结合IFNα受体-1的人源化抗体或人源化抗体片段，其含有：
重链可变区，该重链可变区含有鼠抗体64G12的CDR1(SEQ ID NO：1)、CDR2(SEQ ID NO：2)和CDR3(SEQ ID NO：3)的互补决定区氨基酸序列；和
轻链可变区，该轻链可变区含有鼠抗体64G12的CDR1(SEQ ID NO：4)、CDR2(SEQ ID NO：5)和CDR3(SEQ ID NO：6)的互补决定区氨基酸序列；且
其中所述人源化抗体或人源化抗体片段在选自24H、29H、37H、40H、71H、78H、19L、37L、46L、58L、70L和83L的氨基酸位置含有至少一个氨基酸替换，
其中每组成员的氨基酸位置使用Kabat中提出的编号系统表示。
29.权利要求28的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述氨基酸替换是用丙氨酸替换利用Kabat中提出的编号系统表示的残基24H处的苯丙氨酸。
30.权利要求28的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述氨基酸替换是用甲硫氨酸替换利用Kabat中提出的编号系统表示的残基29H处的亮氨酸。
31.权利要求28的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述氨基酸替换是用丙氨酸替换利用Kabat中提出的编号系统表示的残基29H处的亮氨酸。
32.权利要求28的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述氨基酸替换是分别用异亮氨酸和苏氨酸替换利用Kabat中提出的编号系统表示的残基37H处的缬氨酸和40H处的丙氨酸。
33.权利要求28的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述氨基酸替换是用脯氨酸替换利用Kabat中提出的编号系统表示的残基40H处的丙氨酸。
34.权利要求28的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述氨基酸替换是用赖氨酸替换利用Kabat中提出的编号系统表示的残基71H处的精氨酸。
35.权利要求28的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述氨基酸替换是用亮氨酸替换利用Kabat中提出的编号系统表示的残基78H处的缬氨酸。
36.权利要求28的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述氨基酸替换是用丙氨酸替换利用Kabat中提出的编号系统表示的残基19L处的缬氨酸。
37.权利要求28的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述氨基酸替换是用亮氨酸替换利用Kabat中提出的编号系统表示的残基37L处的谷氨酰胺。
38.权利要求28的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述氨基酸替换是用丙氨酸替换利用Kabat中提出的编号系统表示的残基46L处的亮氨酸。
39.权利要求28的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述氨基酸替换是用异亮氨酸替换利用Kabat中提出的编号系统表示的残基58L处的缬氨酸。
40.权利要求28的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述氨基酸替换是用天冬氨酸替换利用Kabat中提出的编号系统表示的残基70L处的丝氨酸。
41.权利要求28的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述氨基酸替换是用苏氨酸替换利用Kabat中提出的编号系统表示的残基83L处的苯丙氨酸。
42.权利要求28的人源化抗体或人源化抗体片段，其还含有人重和轻恒定结构域。
43.权利要求42的人源化抗体或人源化抗体片段，其中人重恒定区选自人γ1、γ2、γ3和γ4。
44.权利要求43的人源化抗体或人源化抗体片段，其中人重恒定区是人γ1。
45.权利要求28的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段具有KD为1×10-7M或更小的IFNα受体-1结合亲和力。
46.权利要求28的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段具有KD为1×10-8M或更小的IFNα受体-1结合亲和力。
47.权利要求28的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段具有1×10-7到5×10-10M的IFNα受体-1结合亲和力。
48.权利要求28的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段具有1×10-8到5×10-10M的IFNα受体-1结合亲和力。
49.权利要求28的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段具有1×10-9到5×10-10M的IFNα受体-1结合亲和力。
50.其特异结合IFNα受体-1的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段含有：
重链可变区氨基酸序列，所述序列选自图1B(H2)的SEQ ID NO：8、图ID(H3)的SEQ ID NO：10、图1E(M3)的SEQ ID NO：11、图1H(M3-A)的SEQ ID NO：14、图1I(M3-B)的SEQ ID NO：15、图1J(M3-A/B)的SEQID NO：16、图1K(DI M3)的SEQ ID NO：17和图1L(DI M3-B)的SEQ IDNO：18；和
轻链可变区氨基酸序列，所选序列选自图2B(K6)的SEQ ID NO：20、图2C(K1)的SEQ ID NO：21、图2D(K1-C)的SEQ ID NO：22、图2E(K1-D)的SEQ ID NO：23、图2F(K1-E)的SEQ ID NO：24、图2G(K1-C/D)的SEQID NO：25、图2H(K1-C/E)的SEQ ID NO：26、图2I(K1-D/E)的SEQ IDNO：27、图2J(K1-C/D/E)的SEQ ID NO：28、图2K(DI K1)的SEQ ID NO：29和图2L(DI K1-C)的SEQ ID NO：30。
51.权利要求50的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段含有具有图1B(H2)的SEQ ID NO：8中给出的氨基酸序列的可变重链氨基酸序列和具有图2B(K6)的SEQ ID NO：20中给出的氨基酸序列的可变轻链氨基酸序列。
52.权利要求50的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段含有具有图1B(H2)的SEQ ID NO：8中给出的氨基酸序列的可变重链氨基酸序列和具有图2C(K1)的SEQ ID NO：21中给出的氨基酸序列的可变轻链氨基酸序列。
53.权利要求50的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段含有具有图1D(H3)的SEQ ID NO：10中给出的氨基酸序列的可变重链氨基酸序列和具有图2B(K6)的SEQ ID NO：20中给出的氨基酸序列的可变轻链氨基酸序列。
54.权利要求50的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段含有具有图1D(H3)的SEQ ID NO：10中给出的氨基酸序列的可变重链氨基酸序列和具有图2C(K1)的SEQ ID NO：21中给出的氨基酸序列的可变轻链氨基酸序列。
55.权利要求50的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段含有具有图1E(M3)的SEQ ID NO：11中给出的氨基酸序列的可变重链氨基酸序列和具有图2C(K1)的SEQ ID NO：21中给出的氨基酸序列的可变轻链氨基酸序列。
56.权利要求50的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段含有具有图1K(DI M3)的SEQ ID NO：17中给出的氨基酸序列的可变重链氨基酸序列和具有图2C(K1)的SEQ ID NO：21中给出的氨基酸序列的可变轻链氨基酸序列。
57.权利要求50的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段含有具有图1I(M3-B)的SEQ ID NO：15中给出的氨基酸序列的可变重链氨基酸序列和具有图2C(K1)的SEQ ID NO：21中给出的氨基酸序列的可变轻链氨基酸序列。
58.权利要求50的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段含有具有图1L(DI M3-B)的SEQ ID NO：18中给出的氨基酸序列的可变重链氨基酸序列和具有图2C(K1)的SEQ ID NO：21中给出的氨基酸序列的可变轻链氨基酸序列。
59.权利要求50的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段含有具有图1E(M3)的SEQ ID NO：11中给出的氨基酸序列的可变重链氨基酸序列和具有图2D(K1-C)的SEQ ID NO：22中给出的氨基酸序列的可变轻链氨基酸序列。
60.权利要求50的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段含有具有图1I(M3-B)的SEQ ID NO：15中给出的氨基酸序列的可变重链氨基酸序列和具有图2D(K1-C)的SEQ ID NO：22中给出的氨基酸序列的可变轻链氨基酸序列。
61.权利要求50的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段含有具有图1K(DI M3)的SEQ ID NO：17中给出的氨基酸序列的可变重链氨基酸序列和具有图2D(K1-C)的SEQ ID NO：22中给出的氨基酸序列的可变轻链氨基酸序列。
62.权利要求50的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述人源化抗体或人源化抗体片段含有具有图1L(DI M3-B)的SEQ ID NO：18中给出的氨基酸序列的可变重链氨基酸序列和具有图2D(K1-C)的SEQ ID NO：22中给出的氨基酸序列的可变轻链氨基酸序列。
63.抑制I型干扰素与表达IFNα受体-1的细胞上IFNα受体-1结合的方法，该方法包括将所述细胞与权利要求1-62中任一项的人源化抗体或人源化抗体片段接触，从而抑制IFN与IFNα受体-1的结合。
64.权利要求63的方法，其中人源化抗体或人源化抗体片段以KD为1×10-7M或更小的结合亲和力结合IFNα受体-1。
65.权利要求63的方法，其中人源化抗体或人源化抗体片段以KD为1×10-8M或更小的结合亲和力结合IFNα受体-1。
66.权利要求63的方法，其中人源化抗体或人源化抗体片段以KD为1×10-7M到5×10-10M的结合亲和力结合IFNα受体-1。
67.抑制受试者中免疫应答的方法，该方法包括对该受试者施用权利要求1-62中任一项的人源化抗体或人源化抗体片段，从而抑制免疫应答。
68.权利要求67的方法，其中所述免疫应答调节细胞上I类MHC或者II类MHC的表达。
69.权利要求67的方法，其中所述免疫应答诱导树突细胞发育。
70.权利要求67的方法，其中所述免疫应答的特征是混合的淋巴细胞反应。
71.权利要求67的方法，其中抑制的免疫应答包括同种免疫刺激细胞的抑制。
72.权利要求71的方法，其中所述同种免疫刺激细胞是GMCSF/IFN诱导的树突细胞。
73.治疗受试者中自身免疫紊乱、移植排斥或者移植物抗宿主病(GVHD)的方法，该方法包括对该受试者施用权利要求1-62中任一项的人源化抗体或人源化抗体片段，从而治疗受试者的自身免疫紊乱、移植排斥或者GVHD。
74.权利要求73的方法，其中所述方法用于治疗为炎性肠病(IBD)的自身免疫紊乱。
75.权利要求73的方法，其中所述方法用于治疗为系统性红斑狼疮(SLE)的自身免疫紊乱。
76.权利要求73的方法，其中所述方法用于治疗为胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)的自身免疫紊乱。
77.权利要求73的方法，其中所述方法用于治疗移植排斥。
78.权利要求73的方法，其中所述方法用于治疗GVHD。
79.改变受试者中血清CRP水平的方法，该方法包括对该受试者施用权利要求中1-62任一项的人源化抗体或人源化抗体片段，从而改变受试者中血清CRP水平。
80.改变受试者中血清新蝶呤水平的方法，该方法包括对该受试者施用权利要求1-62中任一项的人源化抗体或人源化抗体片段，从而改变受试者中血清新蝶呤水平。
81.修饰受试者中B细胞增殖的方法，该方法包括对该受试者施用权利要求1-62中任一项的人源化抗体或人源化抗体片段，从而修饰受试者中B细胞增殖。
82.权利要求1-62中任一项的人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述抗体或抗体片段抑制多种I型干扰素诱导的生物应答。
83.嵌合抗体或者抗体片段，其含有鼠抗IFNAR-1抗体64G12的重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域与人重链和轻链恒定区有效连接。
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