CN1351614A - 结合人il－12的人抗体及其生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了特异性结合人白细胞介素－12(hIL－12)的人抗体,优选重组人抗体。优选抗体对hIL－12具有高度亲和力,而且在体外和体内中和hIL－12活性。本发明的抗体可以是全长抗体或其抗原结合部分。本发明的抗体或抗体部分可用于检测hIL－12以及抑制例如患有其中hIL－12活性有害的疾病的病人体内的hIL－12活性。本发明还包括用于表达本发明重组人抗体的核酸、载体和宿主细胞以及合成所述重组人抗体的方法。

Description

结合人IL-12的人抗体及其生产方法
相关申请
本申请是要求1999年3月25日提交的美国临时申请序号60/126,603的优先权的非临时申请，所述临时申请的内容通过引用结合到本文中。发明背景
人白细胞介素12(IL-12)最近鉴定为一种细胞因子，它具有独特的结构和多效作用(Kobayashi等(1989)J.Exp Med.170：827-845；Seder等(1993)Pro.Natl.Acad.Sci.90：10188-10192；Ling等(1995)J.Exp Med.154：116-127；Podlaski等(1992)Arch.Biochem.Biophys.294：230-237)。IL-12在与若干涉及免疫和炎症反应的疾病有关的病理学中起着重要的作用。一篇关于IL-12、其生物活性和在疾病中的作用的综述可见Gately等(1998)Ann Rev.Immunol.16：495-521。
在结构上IL-12是一种异源二聚体蛋白(称为“p70亚单位”)，它包含通过二硫桥将二者连接在一起的35kDa亚单位(p35)和40kDa亚单位(p40)。所述异源二聚体蛋白主要由诸如单核细胞、巨噬细胞和树突细胞的抗原提呈细胞产生。这些细胞类型还分泌相对于p70亚单位过量的p40亚单位。p40和p35亚单位在遗传学上是不相关的，而且也没有关于它们具有生物活性的报道，尽管p40同源二聚体可能具有IL-12拮抗剂的作用。
在功能上，IL-12在调节抗原特异性1型T辅助(Th1)淋巴细胞和2型T辅助(Th2)淋巴细胞之间的平衡中起重要作用。Th1和Th2细胞控制自身免疫性疾病的发生和发展，IL-12在调节Th1淋巴细胞的分化和成熟中起重要的作用。Th1细胞释放的细胞因子是炎症性细胞因子，包括γ干扰素(IFNγ)、IL-2和淋巴毒素(LT)。Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13促进体液免疫、过敏反应和免疫抑制。
与Th1反应在自身免疫性疾病中占优势以及IFNγ的促炎活性一致的是，IL-12可能在与许多诸如类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)和节段性回肠炎的自身免疫性疾病和炎症疾病有关的病理学中起主要作用。
已经证实MS病人的IL-12的表达增加，因为文献证实急性MS斑中存在不同水平的p40 mRNA。(Windhagen等，(1995)J.Exp.Med.182：1985-1996)。另外，用MS患者表达CD40L的T细胞体外刺激抗原提呈细胞使IL-12产生增加(与对照T细胞相比)，这与CD40/CD40L相互作用是IL-12的有效诱导剂的观测结果一致。
与健康对照相比，在RA患者滑液中观测到IL-12 p70水平升高(Morita等(1998)Arthritis and Rheumatism.41：306-314)。在RA滑液中细胞因子信使核酸(mRNA)表达类型鉴定主要为Th1细胞因子。(Bucht等，(1996)Clin.Exp.Immunol.103：347-367)。IL-12似乎还在与节段性回肠炎(CD)有关的病理学中起重要作用。在节段性回肠炎患者的肠粘膜中观测到IFNγ和IL-12表达增加(Fais等(1994)J.Interferon Res.14：235-238；Parronchi等，(1997)Am.J.Path.150：823-832；Monteleone等，(1997)Gastroenterology.112：1169-1178和Berrebi等，(1998)Am.J.Path.152：667-672)。CD患者的粘膜固有层的T细胞的细胞因子分泌类型的特征是主要为Th1反应，包括IFNγ水平明显升高(Fuss等，(1996)J.Immunol.157：1261-1270)。而且，CD患者的结肠组织切片显示丰富的表达IL-12的巨噬细胞和表达IFNγ的T细胞(Parronchi等(1997)Am.J.Path.150：823-832)。
因为人IL-12在各种人类疾病中的作用，因此设计了各种治疗策略来抑制或中和IL-12活性。尤其是寻找结合并中和IL-12的抗体用作抑制IL-12活性的手段。某些最早期的抗体为小鼠单克隆抗体(mAb)，它由IL-12免疫小鼠的淋巴细胞制备的杂交瘤分泌(参见例如Strober等的世界专利申请公布号WO 97/15327；Neurath等(1995)J.Exp.Med.182：1281-1290；Duchmann等(1996)J.Immunol.26：934-938)。这些小鼠IL-12抗体的体内应用受到限制，因为存在将小鼠抗体给予人类的有关问题，例如血清半衰期短、不能激发某些人类效应物功能以及在人体内诱发抗小鼠抗体的不需要的免疫反应(“human anti-mouseantibody”(HAMA)反应)。
一般来说，试图解决在人类使用完全小鼠抗体有关问题的措施包括通过遗传工程改进所述抗体使其成为更接近人类的抗体。例如制备了嵌合抗体，嵌合抗体中所述抗体链的可变区是鼠源性的，而所述抗体链的恒定区是人源性的(Junghans等(1990)Cancer Res.50：1495-1502；Brown等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：2663-2667；Kettleborough等(1991)Protein Engineering.4：773-783)。但是因为这些嵌合抗体和人源化抗体仍然保留部分鼠序列，所以它们仍然可能激发不需要的免疫反应、人抗嵌合抗体(HACA)反应，当长时间给予所述抗体时尤其如此。
鼠抗体或其衍生物(例如嵌合抗体或人源化抗体)的优选IL-12抑制剂应该为完全人抗IL-12抗体，因为这样的抑制剂不会激发HAMA反应，即使长期使用也不会激发HAMA。然而，本领域没有关于这类抗体的介绍，因此仍然需要这样的抗体。发明概述
本发明提供结合人IL-12的人抗体。本发明还涉及应用本发明的人抗IL-12抗体治疗或预防其病理学涉及IL-12的急性或慢性疾病或病症。
一方面，本发明提供结合人IL-12的分离人抗体或其抗原结合部分。
在一个实施方案中，本发明提供选择性突变的人IL-12抗体，包括：
使人抗体或其抗原结合部分在优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点进行选择性突变，因为突变产生的增强活性的氨基酸残基而使得它结合人IL-12。
在一个优选实施方案中，本发明提供选择性突变的人IL-12抗体，包括：
使人抗体或其抗原结合部分在优选选择性诱变位点进行选择性突变，因为突变产生的增强活性的氨基酸残基而使得它结合人IL-12。
在另一个优选实施方案中，使所述选择性突变的人IL-12抗体或其抗原结合部分在一个以上优选选择性诱变位点、接触或超突变位点进行选择性突变，从而使得它具有增强活性的氨基酸残基。在另一个优选实施方案中，在3个以下优选选择性诱变位点、接触或超突变位点选择性突变选择性突变的人IL-12抗体或其抗原结合部分。在另一个优选实施方案中，在2个以下的优选选择性诱变位点、接触或超突变位点选择性突变所述选择性诱变的人IL-12抗体或其抗原结合部分。在再一优选实施方案中，选择性突变所述选择性突变的人IL-12抗体或其抗原结合部分，以便获得目标特异性亲和水平，相对于当用噬菌体展示技术对相同抗原选择抗体时获得的水平，所述目标水平提高。在另一个优选实施方案中，所述选择性突变的人IL-12抗体还保留了至少一个需要特性，例如保留与其他蛋白或人组织的非交叉反应性、保留表位识别、产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分：它结合人IL-12，并且根据表面胞质团共振测定，它以0.1s-1或0.1s-1以下的Koff速率常数(rate constant)与人IL-12解离，或者它以1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖。更优选所述分离的人抗体或其抗原结合部分以1×10-2s-1或1×10-2s-1以下的Koff速率常数与人IL-12解离，或者以1×10-7M或1×10-7M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖。更优选所述分离的人抗体或其抗原结合部分以1×10-3s-1或1×10-3s-1以下的Koff速率常数与人IL-12解离，或者以1×10-8M或1×10-8M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖。更优选所述分离的人抗体或其抗原结合部分以1×10-4s-1或1×10-4s-1以下的Koff速率常数与人IL-12解离，或者以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖。更优选所述分离的人抗体或其抗原结合部分以1×10-5s-1或1×10-5s-1以下的Koff速率常数与人IL-12解离，或者以1×10-10M或1×10-10M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖。甚至更优选所述分离的人抗体或其抗原结合部分以1×10-5s-1或1×10-5s-1以下的Koff速率常数与人IL-12解离，或者以1×10-11M或1×10-11M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以下特性：
a)以1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)具有包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的重链CDR3；以及
c)具有包含SEQ ID NO：2氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO：3氨基酸序列的重链CDR2；以及具有包含SEQ IDNO：4氨基酸序列的轻链CDR2。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO：5氨基酸序列的重链CDR1；以及具有包含SEQ ID NO：6氨基酸序列的轻链CDR1。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO：7氨基酸序列的重链可变区；以及具有包含SEQ ID NO：8氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以下特性：
a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)具有包含SEQ ID NO：9氨基酸序列的重链CDR3；以及
c)具有包含SEQ ID NO：10氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO：11氨基酸序列的重链CDR2；以及具有包含SEQID NO：12氨基酸序列的轻链CDR2。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO：13氨基酸序列的重链CDR1；以及具有包含SEQ ID NO：14氨基酸序列的轻链CDR1。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体具有包含SEQ ID NO：15氨基酸序列的重链可变区；以及具有包含SEQ ID NO：16氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它：
a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)具有包含SEQ ID NO：17氨基酸序列的重链CDR3；以及
c)具有包含SEQ ID NO：18氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO：19氨基酸序列的重链CDR2；以及具有包含SEQID NO：20氨基酸序列的轻链CDR2。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO：21氨基酸序列的重链CDR1；以及具有包含SEQ ID NO：22氨基酸序列的轻链CDR1。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO：23氨基酸序列的重链可变区；以及具有包含SEQ ID NO：24氨基酸序列的轻链可变区。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体包含选自Kabat等论述的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定区或者它们的任何等位基因变异体的重链恒定区(Kabat，E.A.，等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国人类健康服务部(U.S.Department of Heath and HumanServices)，NIH公告第91-3242号)，通过引用包括在本文中。在一个更优选的实施方案中，所述抗体重链恒定区是IgG1。在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体是Fab片段或F(ab’)2片段或单链Fv片段。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它：
a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)具有包含选自SEQ ID NO：404-SEQ ID NO：469的氨基酸序列的重链CDR3；以及
c)具有包含选自SEQ ID NO：534-SEQ ID NO：579的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含选自SEQ ID NO：335-SEQ ID NO：403的氨基酸序列的重链CDR2；以及具有包含选自SEQ ID NO：506-SEQ ID NO：533的氨基酸序列的轻链CDR2。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含选自SEQ ID NO：288-SEQ ID NO：334的氨基酸序列的重链CDR1；以及具有包含选自SEQ ID NO：470-SEQ ID NO：505的氨基酸序列的轻链CDR1。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分包括含SEQ ID NO：23氨基酸序列的重链可变区；以及包括含SEQ ID NO：24氨基酸序列的轻链可变区。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体包含如上所述的重链恒定区或Fab片段或F(ab’)2片段或单链Fv片段。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它：
a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)具有包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链CDR3；以及
c)具有包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链CDR2；以及具有包含SEQID NO：28的氨基酸序列的轻链CDR2。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链CDR1；以及具有包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的轻链CDR1。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO：31氨基酸序列的重链可变区；以及具有包含SEQ ID NO：32氨基酸序列的轻链可变区。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体包含如上所述的重链恒定区或Fab片段或F(ab’)2片段或单链Fv片段。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它：
a)以1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)包括含SEQ ID NO：1氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO：3氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO：5氨基酸序列的重链CDR1，或者为其在接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO：1氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO：3氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO：5氨基酸序列的重链CDR1的抗体高10倍以下；以及
c)包括含SEQ ID NO：2氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ ID NO：4氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO：6氨基酸序列的轻链CDR1，或者为其在接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO：2氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ ID NO：4氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO：6氨基酸序列的轻链CDR1的抗体高10倍以下。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它：
a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)包括含SEQ ID NO：9氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO：11氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO：13氨基酸序列的重链CDR1，或者为其在接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO：9氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO：11氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO：13氨基酸序列的重链CDR1的抗体高10倍以下；以及
c)包括含SEQ ID NO：10氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ IDNO：12氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO：14氨基酸序列的轻链CDR1，或者为其在接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO：10氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ ID NO：12氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO：14氨基酸序列的轻链CDR1的抗体高10倍以下。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它：
a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)包括含SEQ ID NO：17氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ IDNO：19氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO：21氨基酸序列的重链CDR1，或者为其在优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO：17氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO：19氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO：21氨基酸序列的重链CDR1的抗体高10倍以下；以及
c)包括含SEQ ID NO：18氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ IDNO：20氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO：22氨基酸序列的轻链CDR1，或者为其在优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO：18氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ ID NO：20氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO：22氨基酸序列的轻链CDR1的抗体高10倍以下。
本发明还提供编码本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸分子。一种优选的分离核酸编码包含SEQ ID NO：17氨基酸序列的重链CDR3。所述分离的核酸编码抗体重链可变区。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO：19氨基酸序列的抗体重链可变区的CDR2。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ IDNO：21氨基酸序列的抗体重链可变区的CDR1。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO：23氨基酸序列的抗体重链可变区。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO：18氨基酸序列的轻链CDR3。所述分离的核酸编码抗体轻链可变区。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO：20氨基酸序列的抗体轻链可变区的CDR2。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO：22氨基酸序列的抗体轻链可变区的CDR1。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO：24氨基酸序列的抗体轻链可变区。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它：
a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)包括含SEQ ID NO：25氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ IDNO：27氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO：29氨基酸序列的重链CDR1，或者为其在优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO：25氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO：27氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO：29氨基酸序列的重链CDR1的抗体高10倍以下；以及
c)包括含SEQ ID NO：26氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ IDNO：28氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO：30氨基酸序列的轻链CDR1，或者为其在优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO：26氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ ID NO：28氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO：30氨基酸序列的轻链CDR1的抗体高10倍以下。
一种优选的分离核酸编码包含SEQ ID NO：25氨基酸序列的重链CDR3。所述分离的核酸编码抗体重链可变区。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO：27氨基酸序列的抗体重链可变区的CDR2。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ IDNO：29氨基酸序列的抗体重链可变区的CDR1。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO：31氨基酸序列的抗体重链可变区。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO：26氨基酸序列的轻链CDR3。所述分离的核酸编码抗体轻链可变区。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO：28氨基酸序列的抗体轻链可变区的CDR2。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO：30氨基酸序列的抗体轻链可变区的CDR1。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO：32氨基酸序列的抗体轻链可变区。
另一方面，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以下特性：
a)它结合人IL-12，并且根据表面胞质团共振测定，它以0.1s-1或0.1s-1以下的koff速率常数与人IL-12解离，或者它以1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖。
b)具有包含选自VH3种系家族成员的氨基酸序列的重链可变区，其中所述重链可变区因为优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基。
c)具有包含选自Vλ1种系家族成员的氨基酸序列的轻链可变区，其中所述轻链可变区因为优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以下特性：
a)它结合人IL-12，并且根据表面胞质团共振测定，它以0.1s-1或0.1s-1以下的koff速率常数与人IL-12解离，或者它以1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖。
b)具有包含选自SEQ ID NO：595-667的氨基酸序列的重链可变区，其中所述重链可变区因为优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基。
c)具有包含选自SEQ ID NO：669-675的氨基酸序列的轻链可变区，其中所述轻链可变区因为优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以下特性：
a)它结合人IL-12，并且根据表面胞质团共振测定，它以0.1s-1或0.1s-1以下的koff速率常数与人IL-12解离，或者它以1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖。
b)具有包含COS-3种系氨基酸序列的重链可变区，其中所述重链可变区因为优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基。
c)具有包含DPL8种系氨基酸序列的轻链可变区，其中所述轻链可变区因为优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以下特性：
a)它结合人IL-12，并且根据表面胞质团共振测定，它以0.1s-1或0.1s-1以下的koff速率常数与人IL-12解离，或者它以1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖。
b)具有包含选自VH3种系家族成员的氨基酸序列的重链可变区，其中所述重链可变区包含结构类似于其他VH3种系家族成员CDR2的CDR2和结构类似于其他VH3种系家族成员CDR1的CDR1，而且其中所述重链可变区因为优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基。
c)具有包含选自Vλ1种系家族成员的氨基酸序列的轻链可变区，其中所述轻链可变区包含结构类似于其他Vλ1种系家族成员CDR2的CDR2和结构类似于其他Vλ1种系家族成员CDR1的CDR1，而且其中所述轻链可变区因为优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基。
在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分的重链CDR3存在突变。在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分的轻链CDR3存在突变。在另一个实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分的重链CDR2存在突变。在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分的轻链CDR2存在突变。在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分的重链CDR1存在突变。在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分的轻链CDR1存在突变。
另一方面，本发明提供带有本发明抗体编码核酸的重组表达载体以及这种载体导入其中的宿主细胞，本发明还包括通过培养本发明的宿主细胞制备本发明的抗体的方法。
再一方面，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它中和人IL-12的活性和至少一种选自狒狒IL-12、狨IL-12、黑猩猩IL-12、弥猴(cynomolgus)IL-12和恒河猴IL-12的其他灵长类IL-12的活性，但是它不中和小鼠IL-12的活性。
再一方面，本发明提供包含本发明抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体的药用组合物。
再一方面，本发明提供包含所述抗体或其抗原结合部分和其他药物如治疗药物的组合物。
再一方面，本发明提供抑制人IL-12活性的方法，包括使人IL-12与本发明的抗体如J695接触，从而抑制人IL-12活性。
再一方面，本发明提供抑制罹患其中IL-12活性有害的疾病的病人的人IL-12活性的方法，包括给予所述病人本发明的抗体如J695，从而抑制所述病人的人IL-12活性。所述疾病可为例如节段性回肠炎、多发性硬化或类风湿性关节炎。
再一方面，本发明的特征为改善抗体或其抗原结合部分的活性以获得预定目标活性的方法，包括
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；
b)从H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94选择优选选择性诱变位点。
c)分别使选定的优选选择性诱变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得第一组突变抗体或其抗原结合部分；
d)评价第一组突变抗体或其抗原结合部分的活性，以确定单一选择性诱变位点的突变是否产生具有预定目标活性或部分目标活性的抗体或其抗原结合部分；
e)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中逐步组合显示具有改进活性的各个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分。
f)评价所述组合抗体或其抗原结合部分的活性，以确定组合抗体或其抗原结合部分是否具有预定目标活性或部分目标活性。
g)如果步骤d)或f)没有获得具有预定目标活性的抗体或其抗原结合部分，或者获得只具有部分活性的抗体，则使选自H35、H50、H53、H54、H95、H96、H97、H98、L30A和L96的其他氨基酸残基突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得第二组突变抗体或其抗原结合部分；
h)评价第二组突变抗体或其抗原结合部分的活性，以确定选自H35、H50、H53、H54、H95、H96、H97、H98、L30A和L96的单个氨基酸残基的突变是否产生具有预定目标活性或部分活性的抗体或其抗原结合部分；
i)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中逐步组合显示具有改进活性的步骤g)的各个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分；
j)评价所述组合抗体或其抗原结合部分的活性，以确定组合抗体或其抗原结合部分是否具有预定目标活性或部分目标活性；
k)如果步骤h)或j)没有获得具有预定目标活性的抗体或其抗原结合部分，或者获得只具有部分活性的抗体，则使选自H33B、H52B和L31A的其他氨基酸残基突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得第三组突变抗体或其抗原结合部分；
l)评价第三组突变抗体或其抗原结合部分的活性，以确定选自H33B、H52B和L31A的单一氨基酸残基的突变是否产生具有预定目标活性或部分活性的抗体或其抗原结合部分；
m)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中逐步组合显示具有改进活性的步骤k)的各个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分；
n)评价所述组合抗体或其抗原结合部分的活性，以确定组合抗体或其抗原结合部分是否具有预定目标活性，由此获得具有预定目标活性的抗体或其抗原结合部分。
另一方面，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；
b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点；
c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；
e)对至少一个其他接触位点或超突变位点重复步骤b)至d)；
f)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合显示具有改进活性的各个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及
g)评价所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
在一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；
b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的接触位点或超突变位点；
c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；
e)对至少一个其他接触位点或超突变位点重复步骤b)至d)；
f)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合显示具有改进活性的各个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及
g)评价所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96。在另一个优选实施方案中，所述超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93。在一个更优选的实施方案中，选择性诱变的残基选自优选选择性诱变位点，它们选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94。在一个更优选的实施方案中，所述接触位点选自L50和L94。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；
b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的接触位点或超突变位点；
c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，而且以合适表达系统表达所述抗体系列；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性，其中所述特性为所述抗体需要保留的特性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。
在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个优选实施方案中，所述超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，选择性诱变的残基选自优选选择性诱变位点，它们选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，所述接触位点选自L50和L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；
b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点；
c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性，其中所述特性为需要保留的特性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分；
f)对至少一个其他优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点重复步骤a)至e)；
g)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合至少2个单独显示具有改进活性和至少一种保留特性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及
h)评价所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。
在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个优选实施方案中，所述超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，选择性诱变的残基选自优选选择性诱变位点，它们选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，所述接触位点选自L50和L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；
b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的接触位点或超突变位点；
c)分别使所述选定的接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性，其中所述特性为所述抗体需要保留的特性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。
在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个优选实施方案中，所述超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，选择性诱变的残基选自优选选择性诱变位点，它们选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，所述接触位点选自L50和L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；
b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点；
c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性，其中所述特性为需要保留的特性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分；
f)对至少一个其他优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点重复步骤a)至e)；
g)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合至少2个单独显示具有改进活性和至少一种保留特性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及
h)评价所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。
在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个优选实施方案中，所述超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，选择性诱变的残基选自优选选择性诱变位点，它们选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，所述接触位点选自L50和L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；
b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；
c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性变化；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；
b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；
c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)对至少一个其他CDR位点重复步骤b)至d)，所述CDR位点既不是b)项选定的位点，也不是H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96位点；
f)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合至少2个单独显示具有改进活性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及
g)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；
b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；
c)分别使所述选定接触或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性变化；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分，所述抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；
b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；
c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)对至少一个其他CDR位点重复步骤b)至d)，所述CDR位点既不是b)项选定的位点，也不是H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94位点；
f)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合至少2个单独显示具有改进活性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及
g)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和其他特性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；
b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；
c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性变化；
f)对至少一个其他CDR位点重复步骤b)至e)，所述CDR位点既不是b)项选定的位点，也不是H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96位点；
g)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合至少2个单独显示具有改进活性但不影响至少一种其他特性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及
h)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种其他特性的保留情况；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的亲和力的方法，包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分，所述抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；
b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；
c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性变化；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；
b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；
c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性的变化；
f)对至少一个其他CDR位点重复步骤b)至e)，所述CDR位点既不是b)项选定的位点，也不是H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96位点；
g)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合至少2个单独显示具有改进活性但是不影响至少一种其他特性的增强活性的氨基酸残基，形成具有至少一种保留特性的组合抗体或其抗原结合部分；以及
h)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种特性的保留情况；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。
所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性而不影响其他特性的方法，包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；
b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；
c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性变化；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性并保留其他特性的抗体或其抗原结合部分。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分，所述抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；
b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；
c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种其他特性的保留情况，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)对至少一个其他CDR位点重复步骤b)至d)，所述CDR位点既不是b)项选定的位点，也不是H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96位点；
f)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合至少2个单独显示改进活性而且不影响至少一种其他特性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及
g)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种其他特性的保留情况，直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种其他保留特性的抗体或其抗原结合部分。
所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。附图简述
图1A-1B显示一系列结合人IL-12的人抗体的重链可变区的氨基酸序列与种系序列Cos-3/JH3和Dp118 Lv1042的排列对比。Kabat编码用来指示氨基酸位置。显示了Joe 9野生型的全长序列。而其他抗体，只显示了与Joe 9野生型不同的氨基酸位点。
图1C-1D显示一系列结合人IL-12的人抗体的轻链可变区的氨基酸序列的对比。Kabat编码用来指示氨基酸位置。显示了Joe 9野生型的全长序列。而其他抗体，只显示了与Joe 9野生型不同的氨基酸位点。
图2A-2E显示通过定点诱变突变的Y61抗体的重链CDR位点和各位点的相应氨基酸取代。图右侧的条形图显示取代抗体解离速率(实心条)与非突变Y61解离速率(空心条)的比较。
图2F-2H显示通过定点诱变突变的Y61抗体的轻链CDR位点和各位点的相应氨基酸取代。图右侧的条形图显示取代抗体解离速率(实心条)与非突变Y61解离速率(空心条)的比较。
图3证实人抗IL-12抗体J695对弥猴血浆新蝶呤水平的体内效力。
图4显示用胶原免疫小鼠后不同天数的关节炎平均评分的曲线图，证实与用大鼠IgG治疗相比，用C17.15治疗显著减轻关节炎相关症状。发明详述
为了更容易理解本发明，首先定义某些术语。
术语“增强活性的氨基酸残基”包括增强所述抗体活性的氨基酸残基。当然增强活性的氨基酸残基可取代接触位点、超突变位点或优选选择性诱变位点的氨基酸残基，进而在一个或多个CDR中可能存在一个以上的增强活性的氨基酸残基。增强活性的氨基酸残基包括增强抗体的结合特异性/亲和性例如增强抗人IL-12抗体与人IL-12的结合的氨基酸残基。增强活性的氨基酸残基还包括增强抗体例如抑制人IL-12的人IL-12抗体的中和效价的氨基酸残基。
术语“抗体”包括4个多肽链组成的免疫球蛋白分子，4个多肽链是通过二硫键内部连接的2个重链(H)和2个轻链(H)。重链由1个重链可变区(本文简称为HCVR或VH)和1个重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。轻链由1个轻链可变区(本文简称为LCVR或VL)和1个轻链恒定区组成。轻链恒定区由1个结构域CL组成。VH和VL区可进一步分为超变区(称为互补决定区(CDR))和更保守区(称为构架区(FR))，超变区位于构架区之间。各VH和VL由3个CDR和4个FR组成，从氨基末端至羧基末端的排列顺序如下：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
术语抗体的“抗原结合部分”(或“抗体部分”)包括保持特异性结合抗原(例如hIL-12)能力的抗体片段。曾经证实抗体的抗原结合功能可由全长抗体片段完成。属于术语抗体的“抗原结合部分”的结合片段实例包括(i)Fab片段，它是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的一价片段；(ii)F(ab’)2片段，它是包括通过铰链区的二硫键连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)抗体单臂VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)VH结构域构成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由独立的基因编码，但是它们可利用重组方法以合成接头连接在一起，合成接头使它们能够制成其中VL和VH区成对形成一价分子的单一蛋白链(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等(1988)Science 242：423-426和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这种单链抗体也包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。也包括其他形式的单链抗体例如双体分子(diabodies)。双体分子是双价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域表达在单一多肽链上，但是采用短到允许同一链上的这2个结构域成对的接头，由此驱使所述结构域与另一条链的互补结构域成对，而产生2个抗原结合位点(参见例如Holliger，P.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.等(1994)Structure 2：1121-1123)。进而抗体或其抗原结合部分可以成为所述抗体或其抗原结合部分与一个或多个其他蛋白或肽通过共价或非共价结合形成的更大免疫粘附分子的组成部分。这样的免疫粘附分子的实例包括利用链霉抗生物素蛋白核心区制成四聚scFv分子(Kipriyanov，S.M.等(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6：93-101)以及利用半胱氨酸残基、标记肽和C-末端多组氨酸标记制成双价生物素化scFv分子(Kipriyanov，S.M.等(1994)Mol.Immunol.31：1047-1058)。可采用常规技术例如分别用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗体，由完整抗体制备诸如Fab和F(ab’)2片段的抗体部分。而且如本文所述，可采用标准重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫粘附分子。优选的抗原结合部分是完整结构域或成对的完整结构域。
术语“回复突变”是指人抗体的部分或全部体细胞突变的氨基酸被同源种系抗体序列的相应种系残基取代的过程。本发明的人抗体的重链序列和轻链序列分别与VBASE数据库中的种系序列对比，鉴定具有最高同源性的序列。使本发明的人抗体的差异通过突变编码该不同氨基酸的确定核苷酸位置而恢复为种系序列。研究由此鉴定为回复突变的候选对象的各氨基酸的作用是直接还是间接影响抗原结合，而突变后发现影响所述人抗体任何需要特性的任何氨基酸不纳入最终的人抗体；例如选择性诱变方法鉴定的增强活性的氨基酸不进行回复突变。为了使回复突变的氨基酸数目最少，可保留与最接近种系序列不同、但是与第二种种系序列相应氨基酸相同的氨基酸位置，前提是对于所述氨基酸两侧至少10个、优选12个氨基酸，第二种种系序列与本发明人抗体的序列相同而且共线性。可在优化抗体的任何阶段进行回复突变；但是优选正好在选择性诱变方法之前或之后进行回复突变。更优选正好在选择性诱变方法之前进行回复突变。
本文使用的术语“人白细胞介素IL-12”(本文简称为hIL-12或IL-12)包括主要由巨噬细胞和树突细胞分泌的人细胞因子。该术语包括一种异源二聚体蛋白，该蛋白包含通过二硫键将二者结合在一起的35kD亚单位(p35)和40kD亚单位(p40)。所述异源二聚体蛋白称为“p70亚单位”。例如以下文献进一步介绍了人IL-12的结构：Kobayashi等(1989)J.Exp Med.170：827-845；Seder等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90：10188-10192；Ling等(1995)J.Exp Med.154：116-127；Podlaski等(1992)Arch.Biochem.Biophys.294：230-237。术语人IL-12包括重组人IL-12(rh IL-12)，它可利用标准重组表达方法制得。
术语“Kabat编码”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文中交互使用。本领域公知的这些术语是指编码比抗体或其抗原结合部分的重链可变区和轻链可变区的其他氨基酸残基更易变(即超变)的氨基酸残基的系统(Kabat等(1971)Ann.NY Acad.Sci.190：382-391和Kabat，E.A.等(1991)Sequence of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国人类健康服务部，NIH公告第91-3242号)。对于重链可变区而言，超变区为CDR1的第31-35位氨基酸、CDR2的第50-65位氨基酸和CDR3的第95-102位氨基酸。对于轻链可变区而言，超变区为CDR1的第24-34位氨基酸、CDR2的第50-56位氨基酸和CDR3的第89-97位氨基酸。
Kabat编码在本文中用来指示对本发明抗体进行修饰的氨基酸位置。例如可使Y61抗IL-12抗体重链CDR1位置31的丝氨酸(S)突变为谷氨酸(E)(H31S→E)，或者可使轻链CDR3位置94的甘氨酸(G)突变为酪氨酸(Y)(L94G→Y)。
术语“人抗体”包括具有相当于Kabat等介绍的人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体(参见Kabat等(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，第五版，美国人类健康服务部，NIH公告第91-3242号)。本发明的人抗体可包含例如不是由CDR(尤其是CDR3)的人种系免疫球蛋白序列(例如体外随机诱变或定点诱变或体内体细胞突变导入的突变)编码的氨基酸残基。优选用本文介绍的“选择性诱变方法”导入所述突变。所述人抗体可具有至少一个被氨基酸残基例如由非人种系免疫球蛋白序列编码的增强活性的氨基酸残基取代的位点。所述人抗体可具有高达20个被不是人种系免疫球蛋白序列组成部分的氨基酸残基取代的位点。在其他实施方案中，取代最高达10个、最高达5个、最高达3个或最多2个位点。在一个优选实施方案中，这些取代位于以下更详细介绍的CDR区。然而，本文使用的术语“人抗体”不包括其中另一种哺乳动物(例如小鼠)种系来源的CDR序列移植到人构架序列上的抗体。
术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的人抗体，例如利用转染入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体(在以下部分II中进一步介绍)、从重组组合人抗体文库分离的抗体(在以下部分III中进一步介绍)、从人免疫球蛋白基因转基因动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如(Taylor，L.D.等(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)或者涉及人免疫球蛋白基因序列剪接为其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有人种系免疫球蛋白序列来源的可变区和恒定区(参见Kabat，E.A.等(1991)Sequence of Protein of Immunological Interest，第五版，美国人类健康服务部，NIH公告第91-3242号)。然而，在某些实施方案中，使这样的重组人抗体进行体外诱变(或者当使用人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列可能不是体内人抗体种系所有组成成分中天然存在的序列，尽管所述序列得自人种系VH和VL序列并与人种系VH和VL序列有关。但是，在某些实施方案中，这样的重组抗体得自选择性诱变方法或回复突变或这两种方法。
“分离抗体”包括基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如基本不含特异性结合非hIL-12抗原的抗体、特异性结合hIL-12的分离抗体)。特异性结合hIL-12的分离抗体可结合其他物种的IL-12分子(下文更详细讨论)。此外，分离抗体可基本不含其他细胞物质和/或化学物质。
“中和抗体”(或“中和hIL-12活性的抗体”)包括其与hIL-12的结合抑制hIL-12的生物活性的抗体。这种对hIL-12生物活性的抑制作用可通过检测hIL-12生物活性的一个或多个指标评价，所述指标例如为对植物凝集素母细胞增殖测定(PHA)中的人植物凝集素母细胞增殖的抑制作用，或对人IL-12受体结合测定中的受体结合的抑制作用(参见实施例3-γ干扰素诱导测定)。这些hIL-12生物活性指标可通过本领域已知的若干标准体外或体内测定中的一个或多个测定评价(参见实施例3)。
术语“活性”包括各种活性，例如抗体对抗原的结合特异性/亲和性如结合IL-12抗原的抗hIL-12抗体；和/或抗体的中和效价如其与hIL-12的结合抑制hIL-12的生物活性的抗hIL-12抗体，例如对PHA母细胞增殖的抑制作用或对人IL-12受体结合测定中的受体结合的抑制作用(参见实施例3)。
术语“表面胞质团共振”包括例如采用BIAcore系统(PharmaciaBiosensor AB，Uppsala，Sweden and Piscataway，NJ)通过检测生物传感器基体(matrix)中的蛋白浓度改变而可分析实时生物特异性作用的光学现象。关于其进一步的介绍参见实施例5和Jonsson，U.等(1993)Ann.Biol.Clin.51：19-26；Jonsson，U.等(1991)Biotechniques 11：620-627；Johnsson，B.等(1995)J.Mol.Recognit.8：125-131和Johnnson，B.等(1991)Anal.Biochem.198：268-277。
本文使用的术语“Koff”是用以指抗体与抗体/抗原复合物解离的解离速率常数(off rate constant)。
本文使用的术语“Kd”是指一种具体抗体抗原相互作用的解离常数(dissociation constant)。
术语“核酸分子”包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链核酸或双链核酸，但是优选为双链DNA。
关于编码结合IL-12的抗体(包括“分离抗体”)或抗体部分(例如VH、VL、CDR3)的核酸，本文使用的术语“分离核酸分子”包括其中编码所述抗体或抗体部分的核苷酸序列不含其他编码结合非hIL-12抗原的抗体或抗体部分的核苷酸序列的核酸分子，所述其他序列可能天然邻接人类基因组DNA中的所述核酸。因此，例如编码抗IL-12抗体的VH区的本发明分离核酸不含其他编码结合非IL-12抗原的其他VH区的序列。术语“分离核酸分子”还包括编码双价、双特异性抗体的序列，所述双价双特异性抗体例如为双体分子，其中VH和VL区不含其他非所述双体分子序列。
术语“载体”包括能够转运与其连接的另一个核酸分子的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，质粒是额外DNA节段可连接入其中的环形双链DNA环。另一类载体是病毒载体，在病毒载体中额外DNA节段可连接入病毒基因组中。某些载体能够在其导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞时整合入宿主细胞的基因组中，因此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够控制与其有效连接的基因的表达。这样的载体在本文中称为“重组表达载体”(或者简称为“表达载体”)。一般来说，重组DNA技术中应用的表达载体通常为质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可交互使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明包括同类的其他形式表达载体，例如具有同等功能的病毒载体(例如复制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)包括重组表达载体已经导入其中的细胞。当然这类术语不仅指具体对象的细胞，而且也指这种细胞的子代细胞。因为突变或环境的影响连续传代时可能发生某些改变，所以这样的子代细胞可能事实上与亲代细胞不完全相同，但是仍然包括在本文使用的术语“宿主细胞”范畴内。
本文使用的术语“改变”是指抗体或其抗原结合部分中的一个或多个氨基酸的改变。可通过在一个或多个位点添加、取代或缺失氨基酸而产生这样的改变。应用已知技术如PCR诱变可引起所述变化。
术语“接触位点”包括抗体重链可变区或轻链可变区的CDR1、CDR2或CDR3中的氨基酸位点，这些位点被以26种已知抗体抗原结构之一接触抗原的氨基酸占据。如果CDR氨基酸以26种已知抗体抗原复合物结构中的任一种接触所述抗原，则可认为该氨基酸占据了接触位点。与非接触位点相比，接触位点被接触抗原的氨基酸占据的可能性更高。接触位点最好为含有以26种结构中的3种以上结构(＞11.5％)接触抗原的氨基酸的CDR位点。接触位点最优选为含有以25种结构中的8种以上结构(＞32％)接触抗原的氨基酸的CDR位点。
术语“超突变位点”包含占据抗体重链可变区或轻链可变区的CDR1、CDR2或CDR3区中的位点的氨基酸残基，这些残基被认为在所述抗体的体内亲和力成熟过程中体细胞超突变的频率或概率高。“体细胞超突变的高频率或高概率”包括所述残基在所述抗体的体内亲和力成熟过程中发生体细胞超突变的5-约40％机会的频率或概率。当然在该规定范围的所有范围值也是本发明的一部分，例如5-约30％、5-约15％、15-30约％。
术语“优选选择性诱变位点”包括占据重链可变区或轻链可变区的CDR1、CDR2或CDR3区的位点的氨基酸残基，可认为优选选择性诱变位点既可是接触位点又可是超突变位点。
术语“选择性诱变方法”包括通过选择和单独突变在至少一个优选选择性诱变位点、超突变位点和/或接触位点的CDR氨基酸而改进抗体活性的方法。“选择性诱变的”人抗体为含有应用选择性诱变方法在所选定位点产生的突变的抗体。在另一个实施方案中，所述选择性诱变方法用来提供优选突变抗体重链可变区的CDR1、CDR2或CDR3(此后分别称为H1、H2和H3)或轻链可变区的CDR1、CDR2或CDR3 (此后分别称为L1、L2和L3)的各选定氨基酸残基的方法。氨基酸残基可选自优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点。根据各个氨基酸在轻链可变区或重链可变区的位置选择各个氨基酸。当然超突变位点也可以是接触位点。在一个实施方案中，选择性诱变方法是“靶向方法”。表述“靶向方法”包括以靶向方式优选突变抗体重链可变区的CDR1、CDR2或CDR3或者轻链可变区的CDR1、CDR2或CDR3的各个选定氨基酸残基的方法，例如“逐组靶向方法(Group-wise targeted approach)”或“逐个CDR靶向方法(CDR-wisetargeted approach)”。在“逐组靶向方法”中，针对具体各组的各氨基酸残基进行选择性突变，包括组I(包括L3和H3)、组II(包括H2和L1)和组III(包括L2和H1)，所列各组的顺序为优选靶向顺序。在“逐个CDR靶向方法”中，以以下优选靶向顺序针对各CDR的各个氨基酸残基进行选择性突变：H3、L3、H2、L1、H1和L2。使选定的氨基酸残基突变为例如至少2个其他氨基酸残基，并测定突变对抗体活性的影响。以抗体的结合特异性/亲和性和/或抗体的中和效价的变化检测活性。当然，选择性诱变方法可用来优化任何来源的任何抗体，包括噬菌体展示、人IgG种系基因的转基因动物、从人B细胞分离的人抗体。选择性诱变方法优选用于不能用噬菌体展示技术进一步优化的抗体。应该指出的是，任何来源包括噬菌体展示、人IgG种系基因的转基因动物、从人B细胞分离的人抗体的各种抗体可在选择性诱变方法之前或之后进行回复突变。
术语“增强活性的氨基酸残基”包括增强抗体活性的氨基酸残基。当然增强活性的氨基酸残基可取代优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点的氨基酸残基，进而在一个或多个CDR中可能存在1个以上的增强活性的氨基酸残基。增强活性的氨基酸残基包括增强抗体(例如结合人IL-12的抗人IL-12抗体)的结合特异性/亲和性的氨基酸残基。增强活性的氨基酸残基还包括增强抗体中和效价的氨基酸残基，所述抗体例如为抑制人IL-12的人IL-12抗体。
本发明各方面在以下各小节中更详细地介绍。I.结合人IL-12的人抗体
本发明提供结合人IL-12的分离人抗体或其抗原结合部分。本发明的人抗体优选为重组中和性人抗hIL-12抗体。例如通过用实施例1所述的噬菌体展示技术筛选hIL-12的一个或多个人VL和VHcDNA文库，从而可选择结合人IL-12的本发明抗体。最初筛选人VL和VHcDNA文库鉴定了一系列的抗IL-12抗体，其中一种本文称为“Joe 9”(或“Joe 9野生型”)，选定其用于进一步研制。Joe 9是一种亲和力较低的人IL-12抗体(例如Koff约0.1sec-1)，但它仍可用于特异性结合和检测hIL-12。可如下提高Joe 9抗体的亲和力：对重链CDR和轻链CDR进行诱变，产生一组“混合及匹配”而且可进一步突变的轻链可变区和重链可变区序列，最终获得对hIL-12的亲和力增强的无数其他抗hIL-12抗体(参见实施例1、表2(见附件A)和图1A-D的序列对比)。
在这些抗体中，在本文中称为Y61的人抗hIL-12抗体证实，结合亲和力显著改善(例如Koff约2×10-4sec-1)。选择Y61抗hIL-12抗体通过分别突变重链CDR和轻链CDR中的具体氨基酸残基进一步成熟亲和力。根据占据优选选择性诱变位点、接触位点和/或超突变位点的氨基酸残基选择用于位点特异性突变(选择性诱变方法)的Y61的氨基酸残基。关于重链CDR和轻链CDR选定位点的取代的总结见图2A-2H。本文称为J695的本发明优选重组中和抗体产生于Y61轻链CDR2位置50的Gly取代为Tyr以及Y61轻链CDR3位置94的Gly取代为Tyr。
关于Joe 9野生型至J695谱系(lineage)的一组本发明抗IL-12抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列对比示于图1A-1D。关于Joe 9至J695谱系，这些序列的对比可鉴定结合hIL-12的本发明抗体的优选重链可变区和轻链可变区的共有序列以及CDR3、CDR2和CDR1的共有序列。此外，总结于图2A-2H的Y61诱变分析对于包含修饰Y61但仍然保持良好hIL-12结合特性的序列的Y61至J695谱系，可鉴定结合hIL-12的重链可变区和轻链可变区的共有序列以及结合hIL-12的CDR3、CDR2和CDR1共有序列。在后附的序列表中以鉴定序列鉴定的本发明优选CDR、VH和VL序列(包括共有序列)总结如下。
 SEQIDNO：     抗体链   区段                   序列
   1  Joe 9至J695共有序列  CDR H3        (H/S)-G-S-(H/Y)-D-(N/T/Y)
   2  Joe 9至J695  CDR L3      Q-(S/T)-Y-(D/E)-(S/R/K)-(S/G/Y)-
   共有序列        (L/F/T/S)-(R/S/T/W/H)-(G/P)-(S/T/A/L)-(R/S/M/T/L)-(V/I/T/M/L)
   3  Joe 9至J695共有序列 CDR H2           F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V-K-G
   4  Joe 9至J695共有序列 CDR L2                (G/Y)-N-(D/S)-(Q/N)-R-P-S
   5  Joe 9至J695共有序列 CDR H1                 F-T-F-S-(S/E)-Y-G-M-H
   6  Joe 9至J695共有序列 CDR L1        (S/T)-G-(G/S)-(R/S)-S-N-I-(G/V)-(S/A)-(N/G/Y)-(T/D)-V-(K/H)
   7  Joe 9至J695共有序列   VH               (完整VH序列：参见序列表)
   8  Joe 9至J695共有序列   VL               (完整VL序列：参见序列表)
   9   Y61至J695共有序列 CDR H3        H-(G/V/C/H)-(S/T)-(H/T/V/R/I)-(D/S)-(N/K/A/T/S/F/W/H)
   10   Y61至J695共有序列 CDR L3                  Q-S-Y-(D/S)-(Xaa)-(G/D/Q/L/F/R/H/N/Y)-T-H-P-A-L-L
   11   Y61至J695共有序列 CDR H2         (F/T/Y)-I-(R/A)-Y-(D/S/E/A)-(G/R)-S-(Xaa)-K-(Y/E)-Y-A-D-S-V-K-G
   12   Y61至J695共有序列 CDR L2             (G/Y/S/T/N/Q)-N-D-Q-R-P-S
   13   Y61至J695共有序列 CDR H1        F-T-F-(Xaa)-(Xaa)-(Y/H)-(G/M/A/N/S)-M-H
   14   Y61至J695共有序列 CDR L1          S-G-G-R-S-N-I-G-(S/C/R/N/D/T)-(N/M/I)-(T/Y/D/H/K/P)-V-K
   15   Y61至J695共有序列   VH               (完整VH序列：参见序列表)
   16  Y61至J695共有序列    VL              (完整VL序列：参见序列表)
   17     Y61  CDR H3                    H-G-S-H-D-N
   18     Y61  CDR L3              Q-S-Y-D-R-G-T-H-P-A-L-L
   19     Y61  CDR H2        F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V-K-G
   20     Y61  CDR L2                  G-N-D-Q-R-P-S
   21     Y61  CDR H1                F-T-F-S-S-Y-G-M-H
   22     Y61  CDR L1             S-G-G-R-S-N-I-G-S-N-T-V-K
   23     Y61    VH              (完整VH序列：参见序列表)
   24     Y61    VL              (完整VL序列：参见序列表)
   25    J695  CDR H3                     H-G-S-H-D-N
   26    J695  CDR L3               Q-S-Y-D-R-Y-T-H-P-A-L-L
   27    J695  CDR H2           F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V-K-G
   28    J695  CDR L2                     Y-N-D-Q-R-P-S
   29    J695  CDR H1                   F-T-F-S-S-Y-G-M-H
   30    J695  CDR L1                S-G-S-R-S-N-I-G-S-N-T-V-K
   31    J695    VH               (完整VH序列：参见序列表)
   32    J695    VL               (完整VL序列：参见序列表)
以测定Kd速率和Koff速率的表面胞质团共振分析功能性表征Joe9野生型亲和力成熟产生的抗体。获得了一系列Koff速率在以下范围内的抗体：约0.1s-1至约1×10-5s-1，更优选Koff约1×10-4s-1至约1×10-5s-1或1×10-5s-1以下。如实施例3所述，还体外表征了抗体抑制植物凝集素(PHA)母细胞增殖的能力。获得了一系列IC50值在以下范围内的抗体：约1×10-6M至约1×10-11M、更优选约1×10-10M至1×10-11M或更低。
因此，在一个方面，本发明提供这样的分离人抗体或其抗原结合部分：结合人IL-12并以0.1s-1或以0.1s-1以下的表面胞质团共振测定的Koff速率常数与人IL-12解离，或者它以1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定)的植物凝集素母细胞增殖。在优选的实施方案中，分离的人IL-12抗体或其抗原结合部分以1×10-2s-1或1×10-2s-1以下的Koff速率常数与人IL-12解离，或者以1×10-7M或1×10-7M以下的IC50抑制体外PHA测定的植物凝集素母细胞增殖。在更优选的实施方案中，分离的人IL-12抗体或其抗原结合部分以1×10-3s-1或1×10-3s-1以下的Koff速率常数与人IL-12解离，或者以1×10-8M或1×10-8M以下的IC50抑制体外PHA测定的植物凝集素母细胞增殖。在更优选的实施方案中，分离的人IL-12抗体或其抗原结合部分以1×10-4s-1或1×10-4s-1以下的Koff速率常数与人IL-12解离，或者以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定的植物凝集素母细胞增殖。在更优选的实施方案中，分离的人IL-12抗体或其抗原结合部分以1×10-5s-1或1×10-5s-1以下的Koff速率常数与人IL-12解离，或者以1×10-10M或1×10-10M以下的IC50抑制体外PHA测定的植物凝集素母细胞增殖。在甚至更优选的实施方案中，分离的人IL-12抗体或其抗原结合部分以1×10-5s-1或1×10-5s-1以下的Koff速率常数与人IL-12解离，或者以1×10-11M或1×10-11M以下的IC50抑制体外PHA测定的植物凝集素母细胞增殖。
可用表面胞质团共振测定IL-12抗体的解离速率常数(Koff)(参见实施例5)。一般来说，表面胞质团共振分析应用BIAcore系统(PharmaciaBiosensor，Piscataway，NJ)通过表面胞质团共振(SPR)检测配体(固定在生物传感器基体上的重组人IL-12)和分析物(抗体溶液)之间的实时结合作用。也可以通过固定分析物(生物传感器基体上的抗体)而提供配体(重组IL-12溶液)进行表面胞质团共振。可用若干合适体外测定中的一种或多种测定评价IL-12抗体或其抗原结合部分的中和活性(参见实施例3)。
本领域众所周知，抗体重链CDR和抗体轻链CDR在抗体与抗原的结合特异性/亲和性中起重要作用。因此本发明包括具有Joe 9的轻链CDR和重链CDR的人抗体以及具有经修饰增强抗体的结合特异性/亲和性的CDR的其他抗体。如实施例1所证实，对所述轻链CDR和重链CDR的一系列修饰可使人抗hIL-12抗体的亲和力成熟。结合人IL-12的Joe 9野生型至J695的人抗体系列的重链和轻链可变区的氨基酸序列对比见图1A-1D。根据序列对比(见上表的总结)确定抗体CDR的共有序列基序。例如Joe 9至J695谱系的VHCDR3的共有基序包含氨基酸序列：(H/S)-G-S-(H/Y)-D-(N/T/Y)(SEQ ID NO：1)，该氨基酸序列包含SEQ ID NO：7所示共有HCVR的位置95-102的氨基酸。VLCDR3的共有基序包含氨基酸序列：Q-(S/T)-Y-(D/E)-(S/R/K)-(S/G/Y)-(L/F/T/S)-(R/S/T/W/H)-(G/P)-(S/T/A/L)-(R/S/M/T/L-V/I/T/M/L)(SEQ ID NO：2)，该氨基酸序列包含SEQ ID NO：8所示共有LCVR的位置89-97的氨基酸。
因此，另一方面，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以下特性：
a)以1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)具有包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的重链CDR3；以及
c)具有包含SEQ ID NO：2氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个优选实施方案中，所述抗体还包括含氨基酸序列：F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V-K-G(SEQ ID NO：3)(它包括含氨基酸序列SEQ ID NO：7的共有HCVR的位置50-65的氨基酸)的VHCDR2以及还包括含氨基酸序列：(G/Y)-N-(D/S)-(Q/N)-R-P-S(SEQ ID NO：4)(它包括含氨基酸序列SEQ ID NO：8的共有LCVR的位置50-56的氨基酸)的VL CDR2。
在另一个优选实施方案中，所述抗体还包括含氨基酸序列：F-T-F-S-(S/E)-Y-G-M-H(SEQ ID NO：5)(它包括含氨基酸序列SEQ IDNO：7的共有HCVR的位置27-35的氨基酸)的VH CDR1以及还包括含氨基酸序列：(S/T)-G-(G/S)-(R/S)-S-N-I-(G/V)-(S/A)-(N/G/Y)-(T/D)-V-(K/H)(SEQ ID NO：6)(它包括含氨基酸序列SEQ ID NO：8的共有LCVR的位置24-34的氨基酸)的VL CDR1。
在再一优选实施方案中，所述本发明抗体包括含SEQ ID NO：7氨基酸序列的HCVR和含SEQ ID NO：8氨基酸序列的LCVR。
根据对产生J695抗体的Y61进行的突变分析可确定其他共有基序(总结于图2A-2H)。如图2A-2H所示的条形图所证实，Y61的重链和轻链CDR的某些残基可取代而不会显著减弱所述抗体的hIL-12结合特性。例如以12个不同氨基酸残基对CDR H1的位置30的各个取代不会显著降低所述抗体的Koff速率，说明该位置可用各种不同氨基酸残基取代。因此根据突变分析(即可用其他氨基酸残基取代的Y61中的位置)，确定共有基序。重链和轻链CDR3的共有基序分别示于SEQ ID NO：9和10，重链和轻链CDR2的共有基序分别示于SEQ IDNO：11和12，而重链和轻链CDR1的共有基序分别示于SEQ ID NO：13和14。VH和VL区的共有基序分别示于SEQ ID NO：15和16。
因此，在一个方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以下特性：
a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)具有包含SEQ ID NO：9氨基酸序列的重链CDR3；以及
c)具有包含SEQ ID NO：10氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个优选实施方案中，所述抗体还包括含SEQ ID NO：11氨基酸序列的VH CDR2以及还包括含SEQ ID NO：12氨基酸序列的VLCDR2。
在另一个优选实施方案中，所述抗体还包括含SEQ ID NO：13氨基酸序列的VH CDR1以及还包括含SEQ ID NO：14氨基酸序列的VLCDR1。
在再一优选实施方案中，所述本发明抗体包括含SEQ ID NO：15氨基酸序列的HCVR和含SEQ ID NO：16氨基酸序列的LCVR。
本发明的一种优选抗体是人抗hIL-12抗体Y61，它是通过PCR诱变CDR3使Joe 9野生型的亲和力成熟而制得(如实施例1所述)。根据表面胞质团共振和体外中和测定，Y61的特异性/结合亲和性改善。Y61的重链和轻链CDR3分别示于SEQ ID NO：17和18，Y61的重链和轻链CDR2分别示于SEQ ID NO：19和20，而Y61的重链和轻链CDR1分别示于SEQ ID NO：21和22。Y61的VH具有SEQ IDNO：23的氨基酸序列，而Y61的VL具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列(这些序列也示于图1A-1D，与Joe9对比)。
因此，另一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它：
a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)具有包含SEQ ID NO：17氨基酸序列的重链CDR3；以及
c)具有包含SEQ ID NO：18氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO：19氨基酸序列的重链CDR2，以及具有包含SEQID NO：20氨基酸序列的轻链CDR2。
在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO：21氨基酸序列的重链CDR1，以及具有包含SEQID NO：22氨基酸序列的轻链CDR1。
在再一优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO：23氨基酸序列的重链可变区，以及具有包含SEQID NO：24氨基酸序列的轻链可变区。
在某些实施方案中，所述全长抗体包含重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定区，以及它们的任何同种异型变异体，正如Katbat所论述(Kabat，E.A.，等(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，第五版，美国人类健康服务部，NIH公告第91-3242号)。所述抗体重链恒定区最好是IgG1重链恒定区。或者，所述抗体部分可是Fab片段或F(ab’2)片段或单链Fv片段。
对Y61各个残基的修饰产生一批图2A-2H所示的抗体。以表面胞质团共振和/或体外中和测定测定各抗体的特异性/结合亲和性。
因此，另一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它：
a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)具有包含选自SEQ ID NO：404-SEQ ID NO：469的氨基酸序列的重链CDR3；以及
c)具有包含选自SEQ ID NO：534-SEQ ID NO：579的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含选自SEQ ID NO：335-SEQ ID NO：403的氨基酸序列的重链CDR2；以及具有包含选自SEQ ID NO：506-SEQ ID NO：533的氨基酸序列的轻链CDR2。
在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含选自SEQ ID NO：288-SEQ ID NO：334的氨基酸序列的重链CDR1；以及具有包含选自SEQ ID NO：470-SEQ ID NO：505的氨基酸序列的轻链CDR1。
在再一优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分包括含SEQ ID NO：23氨基酸序列的重链可变区以及含SEQ ID NO：24氨基酸序列的轻链可变区。
在某些实施方案中，所述全长抗体包含重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定区，以及它们的任何同种异型变异体，正如Katbat所论述(Kabat，E.A.，等(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，第五版，美国人类健康服务部，NIH公告第91-3242号)。所述抗体重链恒定区最好是IgG1重链恒定区。或者，所述抗体部分可是Fab片段或F(ab’2)片段或单链Fv片段。
本发明的一种特别优选的重组中和抗体J695是通过对抗体Y61的接触和超突变氨基酸残基进行定点诱变而制得(参见实施例2和以下部分III)。J695与Y61的不同之处在于：Y61轻链CDR2位置50的Gly取代为Tyr以及Y61轻链CDR3位置94的Gly取代为Tyr。J695的重链和轻链CDR3分别示于SEQ ID NO：25和26，J695的重链和轻链CDR2分别示于SEQ ID NO：27和28，而J695的重链和轻链CDR1分别示于SEQ ID NO：29和30。J695的VH具有SEQ ID NO：31的氨基酸序列，而J695的VL具有SEQ ID NO：32的氨基酸序列(这些序列也示于图1A-1D，与Joe9对比)。
因此，另一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它：
a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)具有包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链CDR3；以及
c)具有包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链CDR2，以及具有包含SEQID NO：28的氨基酸序列的轻链CDR2。
在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链CDR1，以及具有包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的轻链CDR1。
在再一优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO：31氨基酸序列的重链可变区，以及具有包含SEQID NO：32氨基酸序列的轻链可变区。
在某些实施方案中，所述全长抗体包含重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定区，以及它们的任何同种异型变异体，正如Katbat所论述(Kabat，E.A.，等(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，第五版，美国人类健康服务部，NIH公告第91-3242号)。所述抗体重链恒定区最好是IgG1重链恒定区。或者，所述抗体部分可是Fab片段或F(ab’2)片段或单链Fv片段。
可使Joe 9至J695的谱系抗体或Y61至J695的谱系抗体的CDR3、CDR2和CDR1的优选共有序列产生其他突变，以获得本发明的其他抗IL-12抗体。可应用标准分子生物学技术，例如PCR诱变，针对轻链和/或重链CDR的各个接触氨基酸残基或超突变氨基酸残基进行这样的修饰方法，然后如本文所述对修饰抗体进行动力学和功能分析(例如实施例3所述的中和测定和实施例5所述的BIAcore分析)。
因此，另一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它：
a)以1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)包括含SEQ ID NO：1氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO：3氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO：5氨基酸序列的重链CDR1，或者为其在优选选择性诱变位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQID NO：1氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO：3氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO：5氨基酸序列的重链CDR1的抗体高10倍以下；以及
c)包括含SEQ ID NO：2氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ ID NO：4氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO：6氨基酸序列的轻链CDR1，或者为其在优选选择性诱变位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQID NO：2氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ ID NO：4氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO：6氨基酸序列的轻链CDR1的抗体高10倍以下。
另一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它：
a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)包括含SEQ ID NO：9氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO：11氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO：13氨基酸序列的重链CDR1，或者为其在优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO：9氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO：11氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO：13氨基酸序列的重链CDR1的抗体高10倍以下；以及
c)包括含SEQ ID NO：10氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ IDNO：12氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO：14氨基酸序列的轻链CDR1，或者为其在优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO：10氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ ID NO：12氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO：14氨基酸序列的轻链CDR1的抗体高10倍以下。
一般技术人员还知道，可对本发明抗体例如Y61或J695的CDR区进行其他突变，以获得本发明的其他抗IL-12抗体。如上所述，可用标准分子生物学技术进行这样的修饰方法。分别如实施例3和5所述，可对修饰抗体进行功能和动力学分析。对Y61各个残基进行达到与J695相同的修饰示于图2A-2H，见实施例2介绍。
因此，另一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它：
a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)包括含SEQ ID NO：17氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ IDNO：19氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO：21氨基酸序列的重链CDR1，或者为其在优选选择性诱变位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO：17氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO：19氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO：21氨基酸序列的重链CDR1的抗体高10倍以下；以及
c)包括含SEQ ID NO：18氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ IDNO：20氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO：22氨基酸序列的轻链CDR1，或者为其在优选选择性诱变位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO：18氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ ID NO：20氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO：22氨基酸序列的轻链CDR1的抗体高10倍以下。
另一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它：
a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)包括含SEQ ID NO：25氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ IDNO：27氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO：29氨基酸序列的重链CDR1，或者为其在优选选择性诱变位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO：25氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO：27氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO：29氨基酸序列的重链CDR1的抗体高10倍以下；以及
c)包括含SEQ ID NO：26氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ IDNO：28氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO：30氨基酸序列的轻链CDR1，或者为其在优选选择性诱变位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO：26氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ ID NO：28氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO：30氨基酸序列的轻链CDR1的抗体高10倍以下。
在再一实施方案中，本发明提供分离的人抗体或其抗原结合部分，它中和人IL-12活性以及中和至少一种选自以下的其他灵长类IL-12活性：狒狒IL-12、狨IL-12、黑猩猩IL-12、弥猴IL-12和恒河猴IL-12，但其不中和小鼠IL-12活性。II.选择重组人抗体
可通过筛选重组组合抗体文库、优选scFv噬菌体展示文库分离获得本发明的重组人抗体，所述文库用从得自人淋巴细胞的mRNA制备的人VL和VH cDNA制得。制备和筛选这样的文库的方法学是本领域已知的。除了市售用于制备噬菌体展示文库的试剂盒(例如PharmaciaRecombinat Phage Antibody System，目录号27-9400-01；以及StratageneSurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)之外，具体适用于制备和筛选抗体展示文库的方法和试剂实例可参见例如Kang等的PCT公布号WO 92/18619；Winter等的PCT公布号WO 92/20791；Breitling等的PCT公布号WO 93/01288；McCafferty等的PCT公布号WO92/01047；Garrard等的PCT公布号WO 92/09690；Fuchs等(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay等(1992)Hum Antibody Hybridomas3：81-85；Huse等(1989)Science 246：1275-1281；McCafferty等，Nature(1990)348：552-554；Griffiths等(1993)EMBO J 12：725-734；Hawkins等(1992)J Mol Biol 226：889-896；Clackson等(1991)Nature352：624-628；Gram等(1992)PNAS 89：3576-3580；Garrad等(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom等(1991)Nuc Acid Res 19：4133-4137和Barbas等(1991)PNAS 88：7978-7982。
用于该方法的抗体文库优选为用人VL和VH cDNA制备的scFv文库。优选用重组人IL-12作为抗原筛选scFv抗体文库，以选择具有对IL-12的结合活性的人重链和轻链序列。为了选择对IL-12的p35亚单位或p70异源二聚体特异性的抗体，在存在过量游离p40亚单位情况下进行筛选测定。例如应用实施例1所述的micro-Friguet滴定法可确定亚单位优选抗体。
在选定初始的人VL和VH节段后，进行其中筛选不同成对的选定VL和VH节段的IL-12结合的“混合和匹配”实验以选择优选VL/VH对组合(参见实施例1)。另外，为了进一步提高hIL-12结合的亲和力和/或降低解离速率常数，可用类似于天然免疫反应过程中与抗体亲和力成熟有关的体内体细胞突变过程的方法，优选在VH和/或VL的CDR3区中随机突变所述优选VL/VH对的VL和VH节段。这种体外亲和力成熟可通过应用分别与VH CDR3或VL CDR3互补的PCR引物扩增VH和VL区而完成，所述引物在某些位置已经“掺入了”(“spiked”)4种核苷酸碱基的随机混合物，使得获得的PCR产物编码随机突变已经导入VH和/或VL CDR3区的VH和VL节段。可再选择和再筛选这些随机突变VH和VL节段对hIL-12的结合，可选定对IL-12结合具有高亲和力和低解离速率的序列。表2(参见附件A)显示了因为体外亲和力成熟而产生的结合特异性/亲和力改变的抗体。
在从重组免疫球蛋白展示文库选择、分离和筛选了本发明的抗hIL-12抗体后，可从噬菌体颗粒(例如噬菌体基因组)回收编码选定抗体的核酸，并将其用标准重组DNA技术亚克隆入其他表达载体。必要时，可进一步操作所述核酸以产生本发明的其他抗体形式(例如与编码额外免疫球蛋白结构域(例如额外恒定区)的核酸连接)。为了表达通过筛选组合文库分离的重组人抗体，使编码所述抗体的DNA克隆入重组表达载体中，并将其导入哺乳动物宿主细胞中，见以下部分IV的更详细介绍。
在实施例1更详细地介绍了应用噬菌体展示技术选择人IL-12结合抗体的方法以及通过随机诱变或定点诱变CDR区使选定抗体亲和力成熟。
如实施例1所述，筛选人VL和VH cDNA文库鉴定一系列抗IL-12抗体，其中选定Joe 9抗体用于进一步研制。比较Joe 9的重链可变区与从VBASE数据库选择的重链种系序列，显示Joe 9与COS-3种系序列相似。COS-3属于种系序列的VH3家族。
VH3家族是人VH种系所有组成成分的一部分，VH种系所有组成成分可根据核苷酸序列同源性分为7个家族，即VH1-VH7(Tomlinson等(1992)J.Mol.Biol.，227，776-798和Cook等(1995)Immunology Today，16，237-242)。VH3家族的成员最多，在种系所有组成成分中占的比例最大。对于任何给定的人VH3种系抗体序列，在整个VH3家族中的氨基酸序列同一性是最高的(参见例如Tomlinson等(1992)J.Mol.Biol.，227，776-798和Cook等(1995)Immunology Today，16，237-242)。任何2个VH3家族种系VH序列之间的氨基酸序列同一性变化范围为约100个VH残基中的69-98个残基(即任何2个种系VH序列之间的氨基酸序列同源性为69-98％)。对于大多数种系序列对，具有至少80个或80个以上的相同氨基酸残基(即至少80％氨基酸序列同源性)。VH3家族成员间的高度氨基酸序列同源性使某些氨基酸残基位于VH链CDR和构架区的关键位点。这些氨基酸残基赋予CDR以结构特征。
抗体结构研究表明，根据占据CDR和构架区某些位置的关键氨基酸残基，可将CDR构象分为各种家族的正则CDR结构。因此，在具有正则结构和相同关键氨基酸残基的不同抗体中存在相似的局部CDR构象(Chothia等(1987)J.Mol.Biol.，196，901-917和Chothia等(1989)Nature，342，877-883)。在VH3家族中，在CDR1和CDR2正则结构的关键位点存在保守的氨基酸残基同一性(Chothia等(1992)J.Mol.Biol.，227，799-817)。
COS-3种系VH基因是VH3家族成员之一，而且是3-30(DP-49)种系VH等位基因的一种变异体。COS-3只在位置5与Joe 9 VH氨基酸序列不同。Joe9 VH和COS-3之间以及Joe 9 VH和其他VH3家族成员之间的高度氨基酸序列同源性赋予高度CDR结构同源性(Chothia等(1992)J.Mol.Biol.，227，799-817；Chothia等(1987)J.Mol.Biol.，196，901-917和Chothia等(1989)Nature，342，877-883)。
技术人员知道，鉴于与Joe 9的高度氨基酸序列相似性和正则结构相似性，其他VH3家族成员也可用来获得结合人IL-12的抗体。例如可如下达到此目的：通过链改组技术选择合适的VL(Winter等(1994)Annual Rev.Immunol.，12，433-55)或者将啮齿动物抗体或其他人抗体的CDR(包括本发明抗体的CDR)移植到VH3家族构架上。
根据核苷酸序列同源性，人Vλ种系所有组成成分可分为10个家族(Williams等(1996)J.Mol.Biol.，264，220-232)。比较Joe 9的轻链可变区与从VBASE数据库选择的轻链种系序列，显示Joe 9与DPL8λ种系相似。Joe 9 VL与DPL8序列仅在4个构架位置上不同，而且与其他Vλ1家族成员的构架序列高度同源。鉴于与Joe 9的高度氨基酸序列同源性和正则结构相似性，其他Vλ1家族成员也可用来获得结合人IL-12的抗体。例如可如下达到此目的：通过链改组技术选择合适的VL(Winter等同上)或者将啮齿动物抗体或其他人抗体的CDR(包括本发明抗体的CDR)移植到Vλ1家族构架上。
本发明方法包括结合hIL-12的重组抗体，它包含得自种系序列的VH3家族成员之一的重链可变区和得自种系序列的Vλ1家族成员之一的轻链可变区。此外，技术人员知道，任何VH3家族重链序列成员可与任何Vλ1家族轻链序列成员组合。
本领域技术人员还知道，在一个群体(例如人类群体)中存在导致种系氨基酸序列变化的DNA序列多态性。这样的种系序列遗传多态性可因为天然等位基因变异而存在于群体中的个体之间。这样的天然等位基因变异通常可导致1-5％的基因核苷酸序列变异。天然等位基因变异所致的任何以及全部这样的核苷酸变异以及由此产生的种系序列氨基酸多态性均属于本发明范畴。
因此，一个方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以下特性：
a)结合人IL-12，并根据表面胞质团共振测定，以0.1s-1或0.1s-1以下koff速率常数与人IL-12解离，或者以1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖。
b)具有包含选自VH3种系家族成员之一的氨基酸序列的重链可变区，其中所述重链可变区在具有增强活性的氨基酸残基的接触位点或超突变位点存在突变。
c)具有包含选自Vλ1种系家族成员之一的氨基酸序列的轻链可变区，其中所述轻链可变区在具有增强活性的氨基酸残基的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点存在突变。
在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分在重链CDR3中存在突变。
在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分在轻链CDR3中存在突变。
在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分在重链CDR2中存在突变。
在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分在轻链CDR2中存在突变。
在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分在重链CDR1中存在突变。
在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分在轻链CDR1中存在突变。
一般技术人员知道，鉴于VH3种系家族成员之间或轻链Vλ1种系家族成员之间的高度氨基酸序列相似性，所以种系序列突变可获得结合人IL-12的其他抗体。表1(参见附件A)显示了VH3家族成员的种系序列，而且证实了家族成员中的显著序列同源性。表1还显示了Vλ1家族成员的种系序列。提供Joe 9的重链序列和轻链序列作为比较。例如可在本发明抗体发生突变的相同氨基酸位置(例如Joe 9中的突变)，使VH3或Vλ1家族成员的种系序列发生突变。可用标准分子生物学技术，例如PCR诱变，针对种系序列中的各个氨基酸残基进行修饰，然后如本文所述对修饰抗体进行动力学和功能分析(例如实施例3所述的中和测定和实施例5所述的BIAcore分析)。
因此，一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以下特性：
a)具有包含选自SEQ ID NO：595-667的氨基酸序列的重链可变区，其中所述重链可变区因为优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基。
b)具有包含选自SEQ ID NO：669-675的氨基酸序列的轻链可变区，其中所述轻链可变区因为优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基。
一般技术人员知道，鉴于Joe 9和COS-3重链种系序列之间以及Joe 9和DPL8λ种系序列之间的高度氨基酸序列相似性，所以这些种系序列CDR区的其他突变可获得结合人IL-12的其他抗体。可用如上所述的标准分子生物学技术进行这样的修饰方法。
因此，在一个方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以下特性：
a)结合人IL-12，并根据表面胞质团共振测定，以0.1s-1或0.1s-1以下koff速率常数与人IL-12解离，或者以1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖。
b)具有包含COS-3种系氨基酸序列的重链可变区，其中所述重链可变区因为优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基。
c)具有包含DPL8种系氨基酸序列的轻链可变区，其中所述轻链可变区因为优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基。
由于某些氨基酸残基占据轻链可变区和重链可变区的CDR和构架区的关键位点，所以结构特征存在于这些区中。具体来说，CDR2和CDR1区是正则结构分类的依据。因为家族成员之间存在高度氨基酸序列同源性，所以这些正则特性存在于家族成员之间。技术人员知道，在赋予这些正则结构的氨基酸残基的修饰可产生结合IL-12的其他抗体。可采用如上所述的标准分子生物学技术进行所述修饰。
因此，另一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以下特性：
a)结合人IL-12，并根据表面胞质团共振测定，以0.1s-1或0.1s-1以下koff速率常数与人IL-12解离，或者以1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖。
b)具有包含选自VH3种系家族成员之一的氨基酸序列的重链可变区，其中所述重链可变区包括与其他VH3种系家族成员的CDR2结构相似的CDR2以及与其他VH3种系家族成员的CDR1结构相似的CDR1，而且其中所述重链可变区因为优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基；
c)具有包含选自Vλ1种系家族成员之一的氨基酸序列的轻链可变区，其中所述轻链可变区包括与其他Vλ1种系家族成员的CDR2结构相似的CDR2以及与其他Vλ1种系家族成员的CDR1结构相似的CDR1，而且其中所述轻链可变区因为优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基。
本发明重组人抗体具有与选自VBASE数据库的人种系免疫球蛋白序列同源的可变区和恒定区。重组人抗体的突变(例如随机诱变或PCR诱变)产生不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸。此外，得自人类提供者的重组抗体文库将包括由于发生于B细胞发育期间的正常体细胞突变过程而不同于其相应种系序列的抗体序列。值得注意的是，如果PCR扩增获得的“种系”序列编码不同于真正种系构型的构架区的氨基酸(即与真正种系序列相比扩增序列发生改变)，则最好使这些氨基酸不同变回真正种系序列(即构架残基“回复突变”为种系构型)。因此本发明可任选包括回复突变步骤。为此，首先比较所述种系编码的重链和轻链氨基酸序列与突变免疫球蛋白重链和轻链构架氨基酸序列，鉴定与最接近种系序列不同的突变免疫球蛋白构架序列的氨基酸残基。然后，利用遗传密码确定应该使哪个核苷酸改变，从而使突变免疫球蛋白序列的合适核苷酸回复突变为相应的种系序列。应用标准方法如PCR介导的诱变(其中突变核苷酸掺入PCR引物，使得PCR产物存在所述突变)或定点诱变对突变免疫球蛋白构架序列进行诱变。研究鉴定为回复突变侯选对象的各氨基酸的作用，以了解在抗原结合中的作用是直接作用还是间接作用，而最终的人抗体不应有突变后发现影响人抗体任何需要特性的任何氨基酸；举例来说，使用选择性诱变方法鉴定的增强活性的氨基酸不易发生回复突变。测定诱变获得的抗体特性的测定可包括ELISA、竞争性ELISA、体外和体内中和测定和/或(参见例如实施例3)各种来源(包括人、灵长类和/或其他物种)的组织切片的组织化学。
为了使回复突变的氨基酸数目最少，可保留与最接近种系序列不同、但是与第二种种系序列相应氨基酸相同的氨基酸位置，前提是第二种种系序列的所述氨基酸两侧至少10个、优选12个氨基酸与本发明人抗体的序列相同而且共线性。这保证用本发明的人抗体治疗个体的专化抗原提呈细胞提呈给免疫系统的任何肽表位都不是外源性的，而是与自身抗原相同，即所述第二种种系序列编码的免疫球蛋白。可在优化抗体的任何阶段进行回复突变；但是优选正好在选择性诱变方法之前或之后进行回复突变。更优选正好在选择性诱变方法之前进行回复突变。III.对优选选择性诱变位点、接触位点和/或超突变位点的修饰
通常可用以上部分II所述的噬菌体展示方法选择亲和力提高的抗体。可以通过CDR残基的随机突变组合以及产生包含不同序列抗体的大文库达到此目的。然而，对于有效选择方法，抗体抗原反应必须处于平衡，以便高亲和力抗体在不同时间优选结合所述抗原。在达到某一水平的亲和力(即抗体Y61的亲和力)后，当噬菌体展示方法用来提高选定抗IL-12抗体的亲和力时，不能确定建立平衡的选择条件(推测由于抗原和噬菌体颗粒之间的额外非特异性作用所致)。因此，不能用噬菌体展示方法选择更高亲和力的抗体。因此，对于至少部分抗体或抗原，噬菌体展示方法受限于其选择具有高度改善的结合特异性/亲和性的抗体的能力。所以，建立了克服了这些限制的称为选择性诱变方法(Selective Mutagenesis Approach)的方法，它不需要抗体的噬菌体展示的亲和力成熟，该方法由本发明提供。尽管研制了该选择性诱变方法，用以克服使用噬菌体展示系统的缺陷，但是应该指出的是，该方法也可用于噬菌体展示系统。而且，选择性诱变方法可用来增强任何抗体的活性。
为了增强抗体的活性(例如亲和力活性或中和活性)，人们最好使重链和轻链的各CDR位点突变为相应的其他可能氨基酸残基。但是，因为抗体内平均存在70个CDR位点，所以这种方法是非常费时的而且操作繁复。因此，本发明方法使人们可通过只突变重链和/或轻链CDR中的某些选定残基而增强抗体的活性。此外，本发明方法可增强抗体活性，而不影响其他需要抗体特性。
根据一级序列或其在可变区中的位置，不能精确预测确定抗体可变区的什么氨基酸残基接触抗原。尽管如此，Kabat等通过对不同特异性抗体进行序列对比，已经鉴定了为抗体之间显著不同的可变区局部区域的CDR(Kabat等(1971)Ann.NY Acad.Sci.190：382-393，Kabat，E.A.等(1991)Sequence of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国人类健康服务部，NIH公告第91-3242号)。结构研究表明，抗原结合表面由CDR中存在的氨基酸残基形成。还知道CDR外面的其他氨基酸残基在抗原结合中起结构性作用或直接参与抗原结合。所以，对于各抗原抗体对，CDR内以及CDR外面的氨基酸残基可能是重要的。
Tomlison等进行了序列对比研究，在重链和轻链CDR1和CDR2中以及在为体细胞突变高频位点的部分κ链CDR3中鉴定了许多位点。(Tomlison等(1996)J.Mol.Biol.256：813-817)。具体来说，位置H31、H31B、H33、H33B、H52B、H56、H58、L30、L31、L31A、L50、L53、L91、L92、L93和L94鉴定为体细胞突变高频位点。然而，该分析不包括重要重链CDR3区以及已知位于抗体结合位点中心而且潜在与抗原产生重要作用的轻链CDR3部分。此外，Tomlison等提出单独的体细胞多样性不一定能预测特定氨基酸在抗原结合中的作用，而且他们认为保守氨基酸残基接触抗原，而非保守氨基酸残基不接触抗原。该结论进一步得到关于体细胞突变对抗体亲和力的影响的突变研究的支持(Sharon，(1990)，PNAS，87：4814-7)。高亲和力抗对苯偶氮基胂酸盐(Ars)抗体的19个体细胞突变同时被其相应的种系残基取代，产生种系形式的活性丧失200倍的抗Ars抗体。只恢复19个体细胞突变中的3个突变就可恢复抗Ars抗体的全部亲和力，证实允许发生许多体细胞突变而不影响抗原结合活性。
该结果的部分原因在于抗体多样性特性本身。未成熟B细胞最初可产生识别许多自我抗原或非自我抗原的低亲和力抗体。而且，抗体可能发生引起自身反应的亲和力成熟序列变化过程。所述低亲和力抗体的超突变可用来消除自身反应性(“负性选择”)并增加对外源抗原的亲和力。所以，分析无数抗体的一级和结构数据不能提供以下目的的预测方法：(1)体细胞超突变位点在亲和力成熟过程与降低对不需要抗原的亲和力的过程中的作用；或者(2)特定氨基酸如何影响特定抗原抗体对的特性。
通过分析许多抗原抗体复合物的晶体结构进行了阐明特定氨基酸残基在抗原识别中的作用的其他努力(MacCallum等(1996)J.Mol.Biol.262：732-745)。指出位于CDR中和CDR外的位点的潜在作用。在26个分析的结构中的10个以上结构中参与抗原结合的CDR位点包括重链H31、H33、H50、H52、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98和H100以及轻链L30A、L32、L91、L92、L93、L94、L96。但是，所述作者指出，应用这些数据和其他结构数据预测抗原接触可或多或少预测接触位点，因此推测不同策略可能适用于不同抗原。
Pini等介绍了在大噬菌体展示文库的抗体CDR序列中随机化多个残基，以快速增加抗体亲和力(Pini等(1998)J.Biol.Chem.273：21769-21776)。然而，Pini等所论述的高亲和力抗体在总共8个位置具有突变，而对增强抗体亲和力必须哪些变化进行简化分析(reductionaryanalysis)不可行，因为需要测试无数可能组合所需要的最小数目的氨基酸。
此外，随机化多个残基不一定能够保留抗体的其他需要特性。需要的抗体特性是本领域已知的，包括例如保留非交叉反应性，例如与其他蛋白或人组织的非交叉反应性，以及保留与改善中和效价的人种系免疫球蛋白序列密切相关的抗体序列。其他需要特性包括保留物种交叉反应性的能力、保留表位特异性的能力和保留在哺乳动物细胞中高水平表达蛋白的能力。可用本领域已知的技术观测或测量所述需要特性，所述技术包括但不限于ELISA、竞争性ELISA、体外和体内中和测定(参见例如实施例3)、根据需要对包括人、灵长类或其他来源的不同来源的组织切片的免疫组织化学分析以及利用瞬时表达或稳定表达研究在哺乳动物细胞中的表达。
另外，Pini等的方法可导入比增强亲和力实际需要的最小数目更多的变化，而且可产生在人体内引发抗人抗体(HAMA)形成的抗体。此外，如其他地方所论述，本文证实的噬菌体展示或其他相关方法，包括核糖体展示，在抗体和抗原之间亲和力达到一定水平后，这些方法不适用，而且因为其他作用，包括与其他噬菌体或核糖体组分以及抗原的其他作用，不能在合理的时间范围内建立达到平衡所需的条件。
一般技术人员可以从上述参考文献内容收集关于抗体多样性原因的有趣科学信息。然而，本发明提供增强特定抗原抗体对的抗体亲和力的方法，同时保留抗体的其他相关特性或需要特性。这在考虑需要赋予特定抗体各种不同特性包括抗原结合时特别重要。
如果起始抗体具有需要保留的需要特性时，选择性诱变方法是保留这些需要特性而同时增强抗体活性的最佳策略。例如诱变Y61时，目的是增强抗体对hIL-1的亲和力而且提高抗体的中和效价，同时保留所需要的特性。需要的Y61特性包括(1)保留与其他蛋白或人组织的非交叉反应性，(2)保留精确的表位特异性，即优选识别p70(p40/p35)异源二聚体中的p40表位，因此防止游离可溶性p40的结合干扰；以及(3)产生具有尽可能接近其相应种系免疫球蛋白序列的重链和轻链氨基酸序列的抗体。
在一个实施方案中，本发明方法提供选择性诱变方法作为保留抗体需要特性同时增强亲和力和/或中和效价的策略。术语“选择性诱变方法”定义同上，包括分别使选定氨基酸残基突变的方法。可首先从优选选择性诱变位点选择需要突变的氨基酸残基，然后从接触位点、再后从超突变位点选择需要突变的氨基酸残基。可使各个选定的位置突变为至少2个其他氨基酸残基，确定所述突变对抗体需要特性以及抗体活性改善的影响。
选择性诱变方法包括以下步骤：
按照顺序1)优选选择性诱变位点；2)接触位点；3)超突变位点，选择候选位置，然后根据在抗体重链可变区和轻链可变区中的位置对位置排序(优选顺序为：CDR3＞CDR2＞CDR1)；
按照排列的顺序分别使候选的优选选择性诱变位点、超突变位点和/或接触位点突变为所有可能的其他氨基酸残基，分析各个突变对抗体活性的影响，以确定增强活性的氨基酸残基；
必要时，逐步组合各个增强活性的氨基酸残基，分析各种组合对抗体活性的影响；选择具有增强活性的氨基酸残基的突变抗体，就其免疫原性潜能根据氨基酸取代的部位和同一性对所述突变抗体进行排序。最高位次为包含几乎与种系数据库描述的可变区序列相同的氨基酸序列的突变抗体，或者具有与其他人抗体相似的氨基酸序列的突变抗体。第二位次为包含种系序列或其他人抗体序列罕见的氨基酸取代的突变抗体。最低位次为种系序列或另一种人抗体序列未曾有的氨基酸取代的突变抗体。如上所述，突变抗体包含的至少一个增强活性的氨基酸残基位于CDR3优于位于CDR2，位于CDR2优于位于CDR1。重链可变区CDR优于轻链可变区CDR。
还可以研究突变抗体例如与其相应的亲代抗体相比的活性增强情况。例如应用中和测定或利用表面胞质团共振分析的结合特异性/亲和性(参见实施例3)可测定突变抗体的活性改善。优选活性改善较亲代抗体增高至少2-20倍。活性改善较亲代抗体增高可至少为“x1”至“x2”倍，其中“x1”和“x2”为2-20之间而且包括2和20的整数，包括所述范围中的范围，例如2-15(例如5-10)。
还可以研究具有增强活性的氨基酸残基的突变抗体，以确定突变后是否保留至少一种其他需要特性。例如以抗hIL-12抗体测试：(1)保留与其他蛋白或人组织的非交叉反应性，(2)保留表位识别，即优选识别p70(p40/p35)异源二聚体中的p40表位，因此防止游离可溶性p40的结合干扰，以及(3)产生具有尽可能接近其相应种系免疫球蛋白序列的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列的抗体；以及根据不同于种系序列的数目确定哪些抗体至少可能引发人免疫反应。对具有1个以上(例如至少2个或至少3个)增强活性的氨基酸残基的抗体进行相同的观测，以确定是否保留了需要特性。
在诱变Y61中应用“选择性诱变方法”的一个实例如下所述。各突变H31S→E、L50→Y或L94G→Y分别增强抗体的中和活性。然而当测试组合克隆时，组合克隆H31S→E+L50→Y+L94G→Y的活性不比L50→Y+L94G→Y(J695)更好。所以，CDR1的位置31由种系氨基酸残基Ser变为Glu对于J695的活性比Y61有提高是非必须的。因此，选择性诱变方法鉴定与最终活性有关的最小数目的变化，由此降低最终抗体的免疫原性潜力而且保留抗体的其他需要特性。
选择性诱变方法制备的编码VH和VL的分离DNA可转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFV基因，如IV部分所述。为了表达选择性诱变方法制备的VH和VL区，可将编码重链和轻链的表达载体转染入各种宿主细胞，见IV部分的详细介绍。优选宿主细胞包括原核生物宿主细胞，例如大肠杆菌，或者真核生物宿主细胞，例如酵母细胞，如酿酒酵母。最优选的真核生物宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，见IV部分的详细介绍。
选择性诱变方法提供了制备活性增强的抗体的方法而不需要用其他方法预先进行抗体亲和力成熟。选择性诱变方法提供制备经过回复突变、亲和力增强的抗体的方法。选择性诱变方法还提供增强亲和力成熟抗体的活性的方法。
技术人员知道，选择性诱变方法可用于本领域已知的标准抗体操作技术。实例包括但不限于CDR移植抗体、嵌合抗体、scFV片段、全长抗体的Fab片段和其他来源例如转基因小鼠的人抗体。
对抗体进行快速大规模的突变分析包括利用核糖体展示技术的体外转录和翻译(参见例如Hanes等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94：4937-4942；Dall Acqua等，(1998)Curr.Opin.Struc.Biol.8：443-450；He等，(1997)Nucleic Acid Res.25：5132-5134)和授予Kawasaki的美国专利第5,643,768和5,658,754号。选择性诱变方法还提供制备可用核糖体展示技术选择的活性增强抗体的方法。
在本发明方法中，通过改变HCVR和/或LCVR的各个CDR位点而进一步修饰抗体或其抗原结合部分。尽管可以用噬菌体展示抗体制备这些修饰，但是优选所述方法，因为可用在其他类型宿主系统如细菌、酵母或哺乳动物细胞表达系统中表达的抗体实施该方法。选择用于修饰的CDR中的各个位点基于为接触位点和/或超突变位点的位点。
本文定义的优选接触位点和超突变位点示于表3(参见附件A)，其按照本发明方法的修饰详细介绍于实施例2。优选接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96。优选超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93。更优选的氨基酸残基(称为“优选选择性诱变位点”)既是接触位点又是超突变位点，它们选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94。特别优选的接触位点选自L50和L94。优选增强活性的氨基酸残基取代位于选自以下位点的氨基酸残基：H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96。更优选增强活性的氨基酸残基取代位于以下位点的氨基酸残基：H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94。特别优选增强活性的氨基酸残基取代位于选自L50和L94的位点的氨基酸残基。
一般来说，本发明方法包括：选择目的亲代抗体或其抗原结合部分的重链或轻链CDR中特别优选的选择性诱变位点、接触位点和/或超突变位点，随机突变所述各位点(例如利用突变寡核苷酸的遗传方法制备修饰抗体的“微小文库(mini-library)”)或者使一个位点突变为特定需要氨基酸，以鉴定显示增强活性的氨基酸残基，纯化修饰抗体(例如用非噬菌体展示宿主系统)，检测修饰抗体对抗原的活性(例如利用BIAcore分析测定koff速率)，必要时，对其他CDR位点重复所述步骤，组合证实活性增强的各个突变，以及测试各种组合是否产生较亲代抗体更高活性(例如亲和性或中和效价)的抗体或其抗原结合部分。
因此，在一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；
b)依次选择用于突变的互补决定区(CDR)中的1)优选选择性诱变位点，2)接触位点或3)超突变位点，由此鉴定选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点；
c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；
e)任选对至少一个其他优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点重复步骤a)-d)；
f)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合显示具有改进活性的各个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及
g)评价所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。最好所述选定抗体的活性提高而如上所述不丧失或保留亲代抗体的至少一种需要特性。一般技术人员应用本领域已知的技术可检测或观测所述需要特性。
优选的接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96。优选超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93。更优选的优选选择性诱变位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93和L94。特别优选的接触位点选自L50和L94。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；
b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点；
c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)任选对至少一个其他优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点重复步骤a)-d)；
f)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合2个单独显示具有改进活性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及
g)评价具有两个增强活性氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
优选的接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96。优选超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93。更优选的优选选择性诱变位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93和L94。特别优选的接触位点选自L50和L94。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；
b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点；
c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)任选对至少一个其他优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点重复步骤a)-d)；
f)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合3个单独显示具有改进活性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及
g)评价具有两个增强活性氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
优选增强活性的氨基酸残基取代位于选自以下位点的氨基酸残基：H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96。
在诱变各个选定位点后，可对突变克隆测序，以鉴定在各克隆的选定位点中导入了什么氨基酸残基。可选择少数克隆(例如约24个)进行测序，在统计学上来说应获得10-15种独特抗体，但可对大多数克隆(例如60个以上)进行测序，保证鉴定在选定位点具有每种可能取代的抗体。
在一个实施方案中，首先选择用于诱变的重链和/或轻链CDR3区的接触位点和/或超突变位点。然而，对于已经通过噬菌体展示选择随机诱变CDR3区而体外使亲和力成熟的抗体，最好首先选择重链和/或轻链CDR1或CDR2中的接触位点和/或超突变位点。
在一个更优选的实施方案中，首先选择用于诱变的重链和/或轻链CDR3区的优选选择性诱变位点。然而，对于已经通过噬菌体展示选择随机诱变CDR3区而体外使亲和力成熟的抗体，最好首先选择重链和/或轻链CDR1或CDR2中的优选选择性诱变位点。
在另一个优选实施方案中，如下依次通过选择性诱变方法优化选定抗体：首先使选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94的优选选择性诱变位点各自突变为至少2个其他氨基酸残基(优选为5-14个其他氨基酸)，所获得抗体的特征为亲和力、中和效价提高(而另外可能的特征为保留至少一种其他地方论述的其他特性)。如果一个优选选择性诱变位点的突变根本不能或不能足够增强亲和力或中和效价，甚至如果组合多个增强活性的氨基酸取代优选选择性诱变位点的氨基酸残基也不能获得具有目标活性(包括亲和力和/或中和效价)的组合抗体，则从H35、H50、H53、H54、H95、H96、H97、H98、L30A和L96选择其他氨基酸残基用于选择性诱变，并使其各自突变为至少2个其他氨基酸残基(优选为5-14个其他氨基酸残基)，获得抗体的特征为亲和力、中和效价提高(而另外可能的特征为保留至少一种其他地方论述的其他特性)。
如果选自H35、H50、H53、H54、H95、H96、H97、H98、L30A和L96的氨基酸残基的单一突变根本不能或不能足够增强活性(包括亲和力和/或中和效价)，甚至如果组合多个增强活性的氨基酸取代这些位点的氨基酸也不能获得具有目标活性(包括亲和力和/或目标中和效价)的组合抗体，则从H33B、H52B、L31A选择其他氨基酸残基用于选择性诱变，并使其各自突变为至少2个其他氨基酸残基(优选为5-14个其他氨基酸残基)，获得抗体的特征为亲和力、中和效价提高(而另外可能的特征为保留至少一种其他地方论述的其他特性)。
当然，连续选择性诱变方法可在以上概述的任何步骤终止，只要鉴定出具有需要活性(包括亲和力和中和效价)的抗体。如果预先选定位点的诱变鉴定出了增强活性的氨基酸残基，但是组合抗体仍然未达到活性的目标组合(包括亲和力和中和效价)，和/或如果所鉴定的增强活性的氨基酸还影响其他需要特性而因此不可接受时，则可对其他CDR残基进行诱变(参见IV部分)。
本发明方法可用来改善抗体或其抗原结合部分的活性，以获得预定的目标活性(例如预定的亲和力和/或中和效价，和/或需要特性)。
因此，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分活性以获得预定目标活性的方法，包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；
b)从H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94选择优选选择性诱变位点。
c)分别使选定的优选选择性诱变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得第一组突变抗体或其抗原结合部分；
d)评价第一组突变抗体或其抗原结合部分的活性，以确定单一选择性诱变位点的突变是否产生具有预定目标活性或部分目标活性的抗体或其抗原结合部分；
e)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中逐步组合显示具有改进活性的各个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分。
f)评价所述组合抗体或其抗原结合部分的活性，以确定组合抗体或其抗原结合部分是否具有预定目标活性或部分目标活性。
g)如果步骤d)或f)没有获得具有预定目标活性的抗体或其抗原结合部分，或者获得只具有部分活性的抗体，则使选自H35、H50、H53、H54、H95、H96、H97、H98、L30A和L96的其他氨基酸残基突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得第二组突变抗体或其抗原结合部分；
h)评价第二组突变抗体或其抗原结合部分的活性，以确定选自H35、H50、H53、H54、H95、H96、H97、H98、L30A和L96的单个氨基酸残基的突变是否产生具有预定目标活性或部分活性的抗体或其抗原结合部分；
i)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中逐步组合显示具有改进活性的步骤g)的各个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分；
j)评价所述组合抗体或其抗原结合部分的活性，以确定组合抗体或其抗原结合部分是否具有预定目标活性或部分目标活性；
k)如果步骤h)或j)没有获得具有预定目标活性的抗体或其抗原结合部分，或者获得只具有部分活性的抗体，则使选自H33B、H52B和L31A的其他氨基酸残基突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得第三组突变抗体或其抗原结合部分；
l)评价第三组突变抗体或其抗原结合部分的活性，以确定选自H33B、H52B和L31A的单一氨基酸残基的突变是否产生具有预定目标活性或部分活性的抗体或其抗原结合部分；
m)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中逐步组合显示具有改进活性的步骤k)的各个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分；
n)评价所述组合抗体或其抗原结合部分的活性，以确定组合抗体或其抗原结合部分是否具有预定目标活性，由此获得具有预定目标活性的抗体或其抗原结合部分。
可应用许多诱变方法，包括PCR装配、Kunkel(dut-ung-)和硫代磷酸(Amersham Sculptor试剂盒)寡核苷酸定向诱变。
各种各样的宿主表达系统可用来表达突变抗体，包括细菌、酵母、杆状病毒和哺乳动物表达系统(以及噬菌体展示表达系统)。合适细菌表达载体的实例为pUC119(Sfi)。其他抗体表达系统是本领域已知的和/或在以下IV部分中介绍。
可鉴定用本发明方法生产的修饰抗体或其抗原结合部分，而不依赖于噬菌体展示方法进行选择。因此，对于改善通过噬菌体展示系统选择获得但是其活性不能进一步通过噬菌体展示系统诱变增强的重组亲代抗体或其抗原结合部分的活性，特别优选本发明方法。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；
b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的接触位点或超突变位点；
c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；
e)任选对至少一个其他优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点重复步骤b)至d)；
f)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合显示具有改进活性的各个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及
g)评价所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
优选接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96。优选超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93。更优选的优选选择性诱变位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93和L94。特别优选的接触位点选自L50和L94。
利用现有的方法制备结合亲和力和中和效价提高同时保留如上所述的其他抗体特性是不可能的或者极其费时。但是，本发明方法可非常容易地鉴定这类抗体。本发明方法处理的抗体可以是任何来源的抗体。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；
b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点；
c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，而且以合适表达系统表达所述抗体系列；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性，其中所述特性为所述抗体需要保留的特性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。
在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个优选实施方案中，所述超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在一个更优选的实施方案中，选择性诱变的残基选自优选选择性诱变位点，它们选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在一个更优选的实施方案中，所述接触位点选自L50和L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
如果抗体针对特定抗原的亲和力会因此增强，而此时噬菌体展示方法(或相关系统，包括核糖体展示)不再适用，且要保留其他需要特性，则可应用本发明方法。因此，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；
b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点；
c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性，其中所述特性为需要保留的特性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分；
f)任选对至少一个其他优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点重复步骤a)至e)；
g)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合至少2个单独显示具有改进活性和至少一种保留特性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及
h)评价所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。
在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个优选实施方案中，所述超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在一个更优选的实施方案中，选择性诱变的残基选自优选选择性诱变位点，它们选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在一个更优选的实施方案中，所述接触位点选自L50和L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；
b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的接触位点或超突变位点；
c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性，其中所述特性为所述抗体需要保留的特性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。
在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个优选实施方案中，所述超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在一个更优选的实施方案中，选择性诱变的残基选自优选选择性诱变位点，它们选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在一个更优选的实施方案中，所述接触位点选自L50和L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；
b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的接触位点或超突变位点；
c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性，其中所述特性为所述抗体需要保留的特性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。
在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个优选实施方案中，所述超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在一个更优选的实施方案中，选择性诱变的残基选自优选选择性诱变位点，它们选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在一个更优选的实施方案中，所述接触位点选自L50和L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。IV.修饰其他CDR残基
最后，可用增强活性的氨基酸残基需要、和/或结合抗原和/或保留所述抗体其他需要特性直接或间接需要的任何方法鉴定特定抗体抗原对中的所有CDR残基。这类CDR残基称为“优选选择性诱变位点”。应该注意的是，在特定的条件下也可以用其他方法鉴定所述优选选择性诱变残基，包括抗体和抗原的共结晶以及分子建模。
如果完成了优选鉴定集中于上述优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点的增强活性的氨基酸的所有努力，或者如果需要其他改进，可如下所述修饰其余CDR残基。应该知道，按照上述实施方案已经可以在任何一个或多个接触位点或超突变位点修饰所述抗体，但是可能需要进一步改进。所以，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；
b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；
c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；
d)评价所述突变抗体或所述突变抗体系列或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价所述突变抗体或所述突变抗体系列或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性的变化，直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
如果一个残基的诱变不能满足要求，则可诱变其他残基；因此，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；
b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、 L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；
c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)对至少一个其他CDR位点重复步骤b)至d)，所述CDR位点既不是b)项选定的位点，也不是H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96位点；
f)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合至少2个单独显示具有改进活性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及
g)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
如果完成了优选鉴定集中于上述接触位点或超突变位点的增强活性的氨基酸的所有努力，或者如果需要其他改进，而且所述抗体不能通过诱变和噬菌体展示(或相关的核糖体展示)方法进一步优化，则可如下所述修饰其余CDR残基。应该知道，按照上述实施方案已经可以在任何一个或多个优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点修饰所述抗体，但是可能需要进一步改进。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；
b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94以外的氨基酸残基和；
c)分别使所述选定接触或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性变化，直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
如果单一诱变不足以提高所述抗体的亲和力，则可诱变其他残基。因此，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分，所述抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；
b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；
c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)对至少一个其他位点重复步骤b)至d)，所述位点既不是b)项选定的位点，也不是H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94位点；
f)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合至少2个单独显示具有改进活性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及
g)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和其他特性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
可能完成了优选鉴定集中于所述优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点的增强活性的氨基酸的所有努力，或者可能需要其他改进，而且重要的是保留所述抗体的其他特性。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性而不影响其他特性的方法，包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；
b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；
c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性变化，直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性并保留其他特性的抗体或其抗原结合部分。
所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
如果单一残基的诱变不能满足要求，则可诱变其他残基；所以，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；
b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；
c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性变化；
f)对至少一个其他CDR位点重复步骤b)至e)，所述CDR位点既不是b)项选定的位点，也不是H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96位点；
g)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合至少2个分别显示改进活性而不影响至少一种其他特性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及
h)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种其他特性的保留情况；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留的其他特性的抗体或其抗原结合部分。
对优选选择性诱变位点、接触和超突变残基的诱变可能并没有足够增强所述抗体的亲和力，而诱变和噬菌体展示方法(或相关核糖体展示方法)可能不再有用，而且应该保留至少一种其他特性。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的亲和力的方法，包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分，所述抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；
b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；
c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分并以非噬菌体展示系统表达；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性的变化，直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
如果单一残基的诱变不能满足要求，则可诱变其他残基；所以，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分，所述抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；
b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；
c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分并以非噬菌体展示系统表达；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种其他特性的保留情况，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)对至少一个其他CDR位点重复步骤b)至d)，所述CDR位点既不是b)项选定的位点，也不是H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96位点；
f)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合至少2个分别显示改进活性而不影响至少一种其他特性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及
g)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种其他特性的保留情况，直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种其他保留特性的抗体或其抗原结合部分。V.表达抗体
可通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链基因和重链基因，制备本发明的抗体或抗体部分。为了重组表达抗体，用一个或多个携带编码所述抗体的免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞，使得所述轻链和重链在宿主细胞中表达，而且优选分泌入培养所述宿主细胞的培养基中，从该培养基中可回收所述抗体。标准重组DNA方法学用来获得抗体重链基因和抗体轻链基因，使这些基因导入重组表达载体中，然后使所述载体导入宿主细胞中，所述标准方法例如为以下文献介绍的方法：Sambrook，Fritsch和Maniatis(编辑)，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，Ausubel，F.M.等(编辑)CurrentProtocols in Molecuar Biology，Greene Publishing Associates，(1989)和Boss等的美国专利第4,816,397号。
为了获得编码Joe 9 wt或Joe 9 wt-相关抗体的重链可变区的DNA片段，如II部分所述，从人文库筛选人IL-12特异性抗体并使其突变。获得编码Joe 9 wt或Joe 9 wt-相关VH和VL节段的DNA片段后，应用标准方法例如PCR定点诱变(PCR介导的诱变，其中突变核苷酸掺入PCR引物中，使得PCR产物存在所述突变)或其他定点诱变方法，对这些序列进行诱变。应用标准重组DNA技术进一步操作具有需要水平的活性和结合特异性/亲和性的人IL-12抗体如J695，例如使可变区基因转变为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，VL或VH编码DNA片段与编码另一种蛋白的另一DNA片段如抗体恒定区或柔性接头有效连接。本文使用的术语“有效连接”是指两种DNA片段连接在一起，使得两种DNA片段编码的氨基酸序列保持在读框中。
编码VH区的分离DNA可通过使VH编码DNA与另一种编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的DNA分子有效连接而转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat，E.A.等(1991)Sequence of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国人类健康服务部，NIH公告第91-3242号)，通过标准PCR扩增可获得包含这些区段的DNA片段。所述重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区及Kabat介绍的其任何同种异型变异体(Kabat，E.A.等(1991)Sequence of Proteins ofImmunological Interest，第五版，美国人类健康服务部，NIH公告第91-3242号)，但是最优选为IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，VH编码DNA可以与另一种只编码重链CH1恒定区的DNA分子有效连接。
编码VL区的分离DNA可通过使VL编码DNA与另一种编码轻链恒定区CL的DNA分子有效连接而转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat，E.A.等(1991)Sequence of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国人类健康服务部，NIH公告第91-3242号)，通过标准PCR扩增可获得包含这些区段的DNA片段。所述轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但是最优选λ恒定区。
为了获得scFv基因，使VH和VL编码DNA片段与另一种编码柔性接头的片段如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的片段有效连接，使得VH和VL序列可表达为邻接的单链蛋白，VL和VH区通过柔性接头连接在一起(参见例如Bird等(1988)Science 242：423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等，Nature(1990)348：552-554)。
为了表达本发明抗体或抗体部分，使如上所述获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入表达载体中，使得所述基因与转录控制序列和翻译控制序列有效连接。在这种情况下，术语“有效连接”是指抗体基因连接入载体，使得所述载体中的转录控制序列和翻译控制序列发挥其预定的调节所述抗体基因的转录和翻译的作用。选择与所用的表达宿主细胞匹配的表达载体和表达控制序列。抗体轻链基因和抗体重链基因可插入独立的载体，而更常见的是，将这两种基因插入同一表达载体。应用标准方法(例如连接在抗体基因片段和载体中的互补限制性位点，或者如果没有限制性位点则平端连接)使抗体基因插入表达载体中。在插入J695或J695相关的轻链序列或重链序列之前，所述表达载体已经带有抗体恒定区序列。例如一种使J695或J695相关的VH和VL序列转化为全长抗体基因的方法是将其分别插入编码重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得VH节段与所述载体中的CH节段有效连接，而VL节段与所述载体中的CL节段有效连接。另外或者二者择一，重组表达载体可编码有助于抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可克隆入载体，以便信号肽按读框与抗体链基因的氨基末端连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即非免疫球蛋白信号肽)。
除了抗体链基因之外，本发明重组表达载体携带有控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”是指包括控制抗体链基因转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。例如以下文献介绍了这类调节序列：Goeddel；GeneExpression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990)。本领域技术人员知道，表达载体的设计，包括调节序列的选择，可能取决于诸如用于转化的宿主细胞的选择、需要蛋白的表达水平等的因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括控制蛋白在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，例如得自以下病毒的启动子和/或增强子：巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒。关于病毒调节元件及其序列的进一步介绍，参见例如Stinski的美国专利第5,168,062号、Bell等的美国专利第4,510,245号和Schaffner等的美国专利第4,968,615号，Bujard等的美国专利第5,464,758号和Bujard等的美国专利第5,654,168号。
除了抗体链基因和调节序列之外，本发明重组表达载体可携带其他序列，例如调节所述载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因有助于选择所述载体已经导入其中的宿主细胞(参见例如均为Axel等的美国专利第4,399,216、4,634,665和5,179,017号)。例如，选择标记基因通常赋予载体导入其中的宿主细胞对药物如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于甲氨蝶呤选择/扩增dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。
为了表达轻链和重链，编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染入宿主细胞中。各种形式的术语“转染”包括通常用于将外源DNA导入原核生物宿主细胞或真核生物宿主细胞的各种各样的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染等。尽管理论上可在原核生物宿主细胞或真核生物宿主细胞中表达本发明抗体，但是优选在真核生物宿主细胞中表达抗体，而最优选哺乳动物宿主细胞，因为真核生物细胞、尤其是哺乳动物细胞较原核生物细胞更可能装配和分泌适当折叠的免疫活性抗体。用于表达本发明重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国苍鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220介绍的dhfr-CHO细胞，和DHFR选择标记一起使用，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中所介绍)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，如下制备抗体：培养宿主细胞足够长时间，使抗体在宿主细胞中表达，更优选所述抗体分泌入宿主细胞在其中生长的培养基中。应用标准蛋白纯化方法可从培养基中回收抗体。
宿主细胞也可以用来产生完整抗体的一部分，例如Fab片段或scFv分子。应该知道，关于上述方法的各种改变也属于本发明范畴。例如最好用编码本发明抗体的轻链或重链(而不是同时的二者)的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可用来去除结合hIL-12非必需的编码轻链或重链或二者的DNA的一部分或全部。本发明的抗体也包括这样的截短DNA分子表达的分子。另外，可以应用标准化学交联方法交联本发明抗体与第二种抗体制备双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本发明的抗体，而另一条重链和轻链是非hIL-12抗原特异性的。
在一个用于重组表达本发明抗体或其抗原结合部分的优选系统中，编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体通过磷酸钙介导的转染导入dhfr-CHO细胞。在重组表达载体中，抗体重链基因和抗体轻链基因独立与增强子/启动子调节元件(例如得自SV40、CMV、腺病毒等，如CMV增强子/AdMLP启动子调节元件或SV40增强子/AdMLP启动子调节元件)有效连接，以驱动高水平的基因转录。重组表达载体还携带有DHFR基因，它使得可应用甲氨蝶呤选择/扩增选择以载体转染的CHO细胞。培养选定的转化体宿主细胞，以便表达抗体重链和抗体轻链，从培养基中回收完整抗体。标准分子生物学技术用来制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞以及从培养基中回收抗体。可用人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)表达本发明的抗体或其抗原结合部分(参见例如Taylor，L.D.等(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)。也可以修饰植物细胞，以产生表达本发明抗体或其抗原结合部分的转基因植物。
鉴于以上所述，本发明的另一个方面涉及可用于重组表达本发明抗体和各种抗体部分的核酸、载体和宿主细胞组分。本发明的特征优选在于编码J695的CDR或J695的完整重链可变区和/或轻链可变区的分离核酸。因此，在一个实施方案中，本发明的特征在于一种编码抗体重链可变区的分离核酸，所述分离核酸编码包含SEQ ID NO：25氨基酸序列的J695重链CDR3。优选编码抗体重链可变区的核酸还编码包含SEQ ID NO：27氨基酸序列的J695重链CDR2。更优选编码抗体重链可变区的核酸还编码包含SEQ ID NO：29氨基酸序列的J695重链CDR1。甚至更优选所述分离核酸编码包含SEQ ID NO：31氨基酸序列的抗体重链可变区(J695的全长VH区)。
在其他实施方案中，本发明的特征在于一种编码抗体轻链可变区的分离核酸，所述分离核酸编码包含SEQ ID NO：26氨基酸序列的J695轻链CDR3。优选编码抗体轻链可变区的核酸还编码包含SEQ ID NO：28氨基酸序列的J695轻链CDR2。更优选编码抗体轻链可变区的核酸还编码包含SEQ ID NO：30氨基酸序列的J695轻链CDR1。甚至更优选所述分离核酸编码包含SEQ ID NO：32氨基酸序列的抗体轻链可变区(J695的全长VL区)。
本发明还提供编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体。例如在一个实施方案中，本发明提供编码以下抗体链的重组表达载体：
a)具有包含SEQ ID NO：31氨基酸序列的可变区的抗体重链；以及
b)具有包含SEQ ID NO：32氨基酸序列的可变区的抗体轻链。
本发明还提供一种或多种本发明重组表达载体导入其中的宿主细胞。优选所述宿主细胞为哺乳动物宿主细胞，更优选宿主细胞为CHO细胞、NS0细胞或COS细胞。本发明甚至还提供如下合成本发明重组人抗体的方法：在合适培养基中培养本发明的宿主细胞，直到合成本发明的重组人抗体。所述方法还可包括从培养基中分离所述重组人抗体。VI.药用组合物和药物的给药
本发明抗体和各种抗体部分可掺入适合给予患者的药用组合物中。通常所述药用组合物包括本发明抗体或抗体部分以及药学上可接受的载体。本文使用的“药学上可接受的载体”包括生理学上匹配的任何溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等。药学上可接受的载体的实例包括一种或多种水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及它们的组合物。在大多数情况下，最好所述组合物包含等渗剂，例如糖类、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。药学上可接受的载体还可包括微量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，它们延长抗体或抗体部分的保藏期或有效性。
本发明的抗体和各种抗体部分可掺入适用于胃肠外给药的药用组合物中。优选抗体或抗体部分制备为含0.1-250mg/ml抗体的注射溶液。注射溶液可由装于燧石小瓶或琥珀小瓶、安瓿或预填充的注射器的液体剂型或冻干剂型构成。缓冲剂可为pH 5.0-7.0(最好pH 6.0)的L-组氨酸(1-50mM)，最好5-10mM。其他合适的缓冲剂包括但不限于琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。氯化钠可用来以0-300mM浓度(液体剂型最好为150mM)改善溶液的等渗性(toxicity)。冻干剂型可包含低温防护剂，主要为0-10％蔗糖(最好0.5-1.0％)。其他合适低温防护剂包括海藻糖和乳糖。冻干剂型可包含增量剂，主要为1-10％甘露醇(最好2-4％)。液体和冻干剂型可应用稳定剂，主要为1-50mM L-蛋氨酸(最好5-10mM)。其他合适的增量剂包括甘氨酸、精氨酸，也可包含0-0.05％吐温80(最好0.005-0.01％)。其他表面活性剂包括但不限于吐温20和BRIJ表面活性剂。
在一个优选实施方案中，药用组合物包含约0.01mg/kg-10mg/kg剂量的所述抗体。更优选所述抗体剂量包括每隔1周给予1mg/kg，或每周给予0.3mg/kg。
本发明的组合物可以为各种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如注射溶液和输注溶液)、分散剂或悬浮剂、片剂、丸剂、散剂、脂质体和栓剂。优选形式取决于预定的给药模式和治疗用途。常见的优选组合物为注射溶液或输注溶液形式，例如类似于用于其他抗体被动免疫接种人类的组合物。优选的给药模式为胃肠外给药(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉给药)。在一个优选实施方案中，所述抗体通过静脉输注或注射给药。在另一个优选实施方案中，所述抗体通过肌肉或皮下注射给药。
通常治疗组合物在生产及储藏条件下必须是无菌稳定的。所述组合物可配制为溶液、微乳剂、分散剂、脂质体或其他适合高浓度药物的有序结构。可如下制备无菌注射溶液：将需要量的所述活性化合物(即抗体或抗体部分)以合适溶剂根据需要与以上列举的一种成分或组合物混合，然后过滤除菌。一般如下制备分散剂：将所述活性化合物掺入含有基本分散介质和以上列举的需要的其他成分的无菌溶媒中。在用于制备无菌注射溶液的无菌冻干粉的情况下，制备的优选方法是：真空干燥和喷雾干燥，由所述活性成分和任何其他需要成分的预先过滤除菌溶液制得冻干粉。例如利用如卵磷脂包衣、在分散剂的情况下维持需要的颗粒大小，以及利用表面活性剂可维持溶液的合适流体性。通过使组合物中含有延迟吸收的物质例如单硬脂酸盐和明胶可延长注射组合物的吸收。
尽管对于许多治疗应用来说，优选的给药途径/给药模式为皮下注射、静脉内注射或输注，但是可用本领域已知的各种方法给予本发明的抗体和各种抗体部分。技术人员知道，给药途径和/或给药模式取决于需要的效果。在某些实施方案中，可应用避免所述化合物快速释放的载体制备所述活性化合物，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴片和微包囊传递系统。可应用可生物降解、生物匹配的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这类制剂的大多数方法是专利方法或本领域技术人员公知的方法。参见例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson编著，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
在某些实施方案中，本发明的抗体或抗体部分可利用例如惰性稀释剂或可食同化载体口服给药。所述化合物(和其他成分，如果需要的话)可装入硬壳或软壳明胶胶囊、压制成片或直接掺入患者的食物中。对于口服治疗性给药，所述化合物可掺混于赋形剂，而且以摄食片剂、口颊片、锭剂、胶囊剂、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等形式使用。为了通过非胃肠外给药给予本发明化合物，可能必须用防止其失活的物质对本发明化合物进行包衣或者本发明化合物与所述物质同时给予。
其他活性化合物也可以掺入所述组合物中。在某些实施方案中，本发明抗体或抗体部分可与一种或多种其他治疗药物配制在一起和/或共同给予，所述药物可用于治疗IL-12活性起有害作用的疾病。例如本发明的抗hIL-12抗体或抗体部分可与一种或多种结合其他靶的其他抗体(例如结合其他细胞因子或结合细胞表面分子的抗体)配制在一起和/或共同给予。而且，本发明的一种或多种抗体可与两种或两种以上的前述药物联合使用。这样的联合治疗可有利地使用较低剂量的所给予的治疗药物，因此避免与各种单一治疗相关的可能毒性或并发症。熟练医师知道，当本发明抗体用作联合治疗的一部分时，最好比只给予患者所述抗体的剂量更低的剂量的抗体(例如通过应用联合治疗可达到协同治疗效果，它又使得可应用较低剂量的所述抗体而达到需要的治疗效果)。
白细胞介素12在与涉及免疫和炎症因素的各种疾病有关的病理学中起重要作用。这些疾病包括但不限于类风湿性关节炎、骨关节炎、少年慢性关节炎、Lyme关节炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、脊柱关节病、系统性红斑狼疮、节段性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎症性肠病、胰岛素依赖型糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变应性疾病、牛皮癣、皮炎性硬皮病、特应性皮炎、移植物抗宿主病、器官移植排斥反应、与器官移植有关的急性或慢性免疫病、肉样瘤病、动脉硬化、弥散性血管内凝血、Kawasaki病、Grave病、肾病综合征、慢性疲劳综合征、Wegener肉芽肿病、Henoch-Schoenlein紫癜、肾脏显微镜下血管炎、慢性活动性肝炎、眼色素层炎、脓毒性休克、毒素性休克综合征、脓毒病综合征、恶病质、感染性疾病、寄生虫病、获得性免疫缺陷综合征、急性横贯性脊髓炎、慢性舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬化、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭、心肌梗死、Addison病、I型散发性多腺体缺陷和II型多腺体缺陷、Schmidt综合征、成人(急性)呼吸窘迫综合征、脱发、斑形脱发、血清反应阴性关节病、关节病、Reiter病、牛皮癣性关节病、溃疡性结肠炎关节病、肠病性滑膜炎、衣原体、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关性关节病、脊柱关节病、动脉硬化性疾病/动脉硬化、特应性变态反应、自身免疫性大疱病、寻常天疱疮、落叶状天疱疮、类天疱疮、线性IgA病、自身免疫性溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、少年恶性贫血、肌痛性脑炎/Royal Free Disease、慢性粘膜皮肤念珠菌病、巨细胞性关节炎、原发性硬化性肝炎、隐原性自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷病综合征、获得性免疫缺陷相关性疾病、丙型肝炎、普通可变性免疫缺陷(普通可变性低丙种球蛋白血症)、扩张性心肌病、女性不育、卵巢功能衰竭、成熟前卵巢功能衰竭、纤维性肺病、隐原性纤维性肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、结缔组织病相关性间质性肺病、混合型结缔组织病相关性肺病、全身性硬化相关性间质性肺病、类风湿性关节炎相关性间质性肺病、系统性红斑狼疮相关性肺病、皮肌炎/多肌炎相关性肺病、Sjogren病相关性肺病、关节僵硬性脊椎炎相关性肺病、脉管炎性弥散性肺病、含铁血黄素沉着病相关性肺病、药物引起的间质性肺病、辐射性纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、淋巴细胞侵润性肺病、感染后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎(典型自身免疫性肝炎或狼疮样肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗-LKM抗体肝炎)、自身免疫介导的低血糖、具有黑色棘皮症的B型胰岛素抵抗、甲状旁腺功能低下、与器官移植有关的急性免疫病、与器官移植有关的慢性免疫病、骨关节病、原发性硬化性胆管炎、特发性白细胞减少、自身免疫性嗜中性白细胞减少、肾病NOS、肾小球肾炎、显微镜下的肾脏脉管炎、莱姆病、盘状狼疮红斑、特发性男性不育或NOS、精子的自身免疫、多发性硬化(全部亚型)、胰岛素依赖型糖尿病、交感性眼炎、继发于结缔组织病的肺动脉高压、Goodpasture综合征、结节性多动脉炎在肺部的表现、急性风湿热、类风湿性脊椎炎、Still病、全身性硬化、Takayasu病/动脉炎、自身免疫性血小板减少、特发性血小板减少、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿自身免疫性甲状腺机能低下(Hashimoto病)、萎缩性自身免疫性甲状腺机能低下、原发性粘液性水肿、晶状体性眼色素层炎、原发性脉管炎和白癜风。本发明的人抗体和各种抗体部分可用来治疗自身免疫性疾病、尤其是与炎症有关的疾病，包括类风湿性脊椎炎、变态反应、自身免疫性糖尿病、自身免疫性眼色素层炎。
优选本发明抗体或其抗原结合部分用来治疗类风湿性关节炎、节段性回肠炎、多发性硬化、胰岛素依赖型糖尿病和牛皮癣，见VII部分更详细的介绍。
本发明的人抗体或抗体部分也可以与用于治疗自身免疫性疾病和炎症性疾病的一种或多种其他治疗药物一起使用。
本发明抗体或其抗原结合部分可单独或联合使用以治疗所述疾病。应该知道，本发明抗体或其抗原结合部分可单独使用或与其他物质例如治疗药物联合使用，所述其他药物由技术人员选定以达到预定目的。例如所述其他物质可以是本领域已知的用于治疗本发明抗体所治疗疾病或病症的治疗药物。所述其他物质也可以是赋予所述治疗组合物有益特性的物质，例如影响所述组合物粘度的物质。
还应该知道，本发明范围内的组合是用于其预定目的的组合。以下列举的物质是为了说明本发明而不是为了限制本发明。为本发明组成部分的组合可以是本发明抗体和至少一种选自以下所列的其他物质。所述组合也可以包括一种以上其他物质，例如两种或三种其他物质，只要这样的组合形成的组合物能够实现其预定作用。
优选的组合为非类固醇抗炎药物(也称为NSAIDS)，非类固醇抗炎药物包括诸如布洛芬的药物。其他优选组合有包括强的松龙的皮质类固醇；当联合本发明抗IL-12抗体治疗患者时，通过逐渐减少所需要的类固醇剂量可减少甚至消除应用类固醇的周知副作用。可与本发明抗体或抗体部分联合用于治疗类风湿性关节炎的治疗药物的非限制性实例包括以下药物：抑制细胞因子的抗炎药物(CSAID)；其他的人细胞因子或生长因子(例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF)的抗体或拮抗剂。本发明抗体或其抗原结合部分可与针对细胞表面分子(例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90)或其配体(包括CD154(gp39或CD40L))的抗体联合使用。
优选的治疗药物组合可在不同位点干扰自身免疫和随后的炎症级联反应；优选的实例包括TNF拮抗剂，例如嵌合人源化或人TNF抗体、D2E7(1996年2月9日申请的美国申请序号08/599,226)、cA2(RemicadeTM)、CDP 571、抗TNF抗体片段(例如CDP870)和可溶性p55或p75 TNF受体以及它们的衍生物、(p75TNFRIgG(EnbrelTM)或p55TNFRIgG(Lenercept)、可溶性IL-13受体(sIL-13)，此外还有TNFα转化酶(TACE)抑制剂；同样IL-1抑制剂(例如白细胞介素1转化酶抑制剂，例如Vx740或IL-1RA等)因为同样的原因可能也是有效的。其他优选的组合包括白细胞介素11、抗P7s和p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)。再一优选组合为自身免疫反应中的其他重要作用物，它们可与IL-12作用平行发挥作用、依赖于IL-12作用或与IL-12作用协同作用；特别优选IL-18拮抗剂，包括IL-18抗体或可溶性IL-18受体或IL-18结合蛋白。已经证实，IL-12和IL-18相互重叠但是具有不同的作用，二者的拮抗剂组合可能是最有效的。又一优选组合是非消耗性抗-CD4抑制剂。另外的其他优选组合包括协同刺激途径CD80(B7.1)或CD86(B7.2)的拮抗剂，包括抗体、可溶性受体或拮抗性配体。
本发明抗体或其抗原结合部分也可以与药物联合使用，所述药物例如甲氨蝶呤、6-MP、硫唑嘌呤、柳氮磺吡啶、美沙拉嗪、奥沙拉嗪氯喹啉/羟氯喹啉、青霉胺、金硫苹果酸盐(肌肉注射和口服)、硫唑嘌呤、秋水仙碱、皮质类固醇类(口服、吸入和局部注射)、β-2肾上腺素受体激动剂(沙丁胺醇、特布他林、沙美特罗)、黄嘌呤类(茶碱、氨茶碱)、色甘酸盐、萘多罗米、酮替芬、异丙托铵和氧托铵、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸莫非替克、来氟米特、NSAID如布洛芬、皮质类固醇类如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗血栓形成剂、补体抑制剂、肾上腺素能药物、干扰促炎细胞因子如TNFα或IL-1信号转导的药物(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转化酶抑制剂(例如Vx740)、抗P7s、p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)、TNFα转化酶(TACE)抑制剂、T细胞信号转导抑制剂如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转化酶抑制剂、可溶性细胞因子受体以及它们的衍生物(例如可溶性p55或p75 TNF受体和衍生物p75TNFRIgG(EnbrelTM)和p55TNFRIgG(Lenercept)、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R、可溶性IL-13受体(sIL-13))和抗炎细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)。优选组合包括甲氨蝶呤或来氟米特，在中度或重度类风湿性关节炎的情况下优选环孢菌素。
与本发明抗体或其抗体部分联合用于炎症性肠病的治疗药物的非限制性实例包括以下药物：布地奈德；表皮生长因子；皮质类固醇类；环孢菌素、柳氮磺吡啶；氨基水杨酸盐；6-巯基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂氧合酶抑制剂；美沙拉秦；奥沙拉秦；巴柳氮；抗氧化剂；血栓烷抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗IL-1β单克隆抗体；抗IL-6单克隆抗体；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基咪唑化合物；其他人细胞因子或生长因子(例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDFG)的抗体或拮抗剂。本发明抗体或其抗原结合部分可与针对细胞表面分子(例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90)或其配体的抗体联合使用。本发明抗体或其抗原结合部分也可以与各种药物联合使用，所述药物例如为甲氨蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸莫非替克、来氟米特、NSAID如布洛芬、皮质类固醇类如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗血栓形成剂、补体抑制剂、肾上腺素能药物、干扰促炎细胞因子如TNFα或IL-1信号转导的药物(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转化酶抑制剂(例如Vx740)、抗P7s、p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)、TNFα转化酶抑制剂、T细胞信号转导抑制剂如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转化酶抑制剂、可溶性细胞因子受体以及它们的衍生物(例如可溶性p55或p75 TNF受体、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R、可溶性IL-13受体(sIL-13))和抗炎细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)。
可联合抗体或抗原结合部分治疗节段性回肠炎的治疗药物的优选实例包括以下药物：TNF拮抗剂，例如抗TNF抗体、D2E7(1996年2月9日申请的美国申请序号08/599,226)、cA2(RemicadeTM)、CDP571、抗TNF抗体片段(例如CDP870)、TNFR-Ig构建物(p75TNFRIgG(EnbrelTM)和p55TNFRIgG(Lenercept)、抗P7s、p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)、可溶性IL-13受体(sIL-13)和PDE4抑制剂。本发明的抗体或其抗原结合部分可与诸如布地奈德和地塞米松的皮质类固醇类联合使用。本发明抗体或其抗原结合部分也可以与以下药物联合使用：例如柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸和奥沙拉秦，而且也可以与干扰促炎因子(例如IL-1)的合成或作用的药物联用，例如IL-1β转化酶抑制剂(例如Vx740)和IL-1ra。本发明抗体或其抗原结合部分还可以与T细胞信号转导抑制剂联用，例如酪氨酸激酶抑制剂6-巯基嘌呤。本发明抗体或其抗原结合部分可与IL-11组合使用。
可与本发明抗体或抗体部分联合治疗多发性硬化的治疗药物的非限制性实例包括以下药物：皮质类固醇类；强的松龙；甲基强的松龙；硫唑嘌呤；环磷酰胺；环孢菌素；甲氨蝶呤；4-氨基吡啶；替扎尼定；干扰素-β1a(Avonex；Biogen)；干扰素-β1b(Betaseron；Chiron/Berlex)；Copolymer 1(Cop-1；Copaxone；Teva PharmaceuticalIndustries，Inc.)；高压氧；静脉免疫球蛋白；克拉立平(clabribine)；其他人细胞因子或生长因子(例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDFG)的抗体或拮抗剂。本发明抗体或其抗原结合部分可与针对细胞表面分子(例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90)或其配体的抗体联合使用。本发明抗体或其抗原结合部分也可以与各种药物联合使用，所述药物例如为甲氨蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸莫非替克、来氟米特、NSAID如布洛芬、皮质类固醇类如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗血栓形成剂、补体抑制剂、肾上腺素能药物、干扰促炎细胞因子如TNFα或IL-1信号转导的药物(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转化酶抑制剂(例如Vx740)、抗P7s、p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)、TACE抑制剂、T细胞信号转导抑制剂如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转化酶抑制剂、可溶性细胞因子受体以及它们的衍生物(例如可溶性p55或p75 TNF受体、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R、可溶性IL-13受体(sIL-13))和抗炎细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-13和TGFβ)。
可与本发明抗体或其抗原结合部分联合治疗多发性硬化的治疗药物的优选实例包括干扰素-β如干扰素β1a和干扰素β1b；copaxone，皮质类固醇类、IL-1抑制剂、TNF抑制剂和抗CD40配体和CD80的抗体。
本发明的药用组合物可包含“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明抗体或抗体部分。“治疗有效量”是指以必要的给药剂量和时间周期达到需要的治疗效果的有效量。抗体或抗体部分的治疗有效量可随各种因素(例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重)以及抗体或抗体部分在个体激发需要反应的能力而变化。抗体或抗体部分的治疗有效量也可以为抗体或抗体部分的治疗有益作用超过其任何毒性或有害作用的剂量。“预防有效量”是指以必要的给药剂量和时间周期达到需要的预防效果的有效量。一般来说，因为预防有效量是在患者患病前或疾病早期阶段使用，所以预防有效量低于治疗有效量。
可调整给药方案以获得最佳需要反应(例如治疗反应或预防反应)。例如单次大剂量给药，可随时间给予数个分剂量，或者可根据治疗情况的要求相应减少或增加剂量。特别优选配制为剂量单位形式的胃肠外组合物，以便于给药而且剂量均匀。本文使用的剂量单位形式是指根据待治疗的哺乳动物对象的单位剂量调制的物理独立单位；每个单位含有预计产生需要治疗效果的预定量活性化合物和需要的药用载体。本发明的剂量单位形式的规格取决于或直接取决于(a)活性化合物的独特特性和需要达到的具体治疗效果或预防效果，以及(b)配制技术固有的限制，例如活性化合物在各个个体的治疗敏感性。
本发明抗体或抗体部分治疗或预防有效量的典型非限制性范围为0.01-20mg/kg，更优选1-10mg/kg，甚至更优选0.3-1mg/kg。需要注意的是，剂量值可随需要缓解的病症类型和程度而变化。进一步需要指出的是，对于任何具体对象，具体给药方案应该在不同时间根据个体需要和管理或监控所述组合物使用的人员的专业判断而进行调整，本文给出的剂量范围仅仅是举例说明，而不是限制要求保护的组合物的范围或实施。VII.本发明抗体的使用
因为本发明抗hIL-12抗体或其部分能够结合hIL-12，所以可应用常规免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或组织的免疫组织化学，将其用来检测hIL-12(倒如生物样品，例如血清或血浆)。本发明提供检测生物样品中的hIL-12的方法，包括使生物样品与本发明抗体或抗体部分接触，以及检测与hIL-12结合的抗体(或抗体部分)或非结合的抗体(或抗体部分)，由此检测生物样品中的hIL-12。应用有助于检测结合抗体或非结合抗体的可检测物质直接标记或间接标记抗体。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质和放射性物质。合适的酶实例包括辣根过氧物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；合适放射性物质的实例包括125I、131I、35S或3H。
作为标记抗体的替代方法，可应用以可检测物质标记的rhIL-12标准品和非标记抗hIL-12抗体通过竞争性免疫测定检测生物体液中的hIL-12。在该测定中，混合生物样品、标记的rhIL-12标准品和抗hIL-12抗体，测定标记的rhIL-12标准品结合非标记抗体的量。生物样品中的hIL-12量与结合抗hIL-12抗体的标记rhIL-12标准品量成反比。
本发明的Y61和J695抗体也可以用来检测非人类物种来源的IL-12、尤其是灵长类来源的IL-12。例如Y61可用来检测弥猴和恒河猴的IL-12。J695可用来检测弥猴、恒河猴和狒狒的IL-12。然而，抗体既不与小鼠IL-12交叉反应也不与大鼠IL-12交叉反应(参见实施例3，F小节)。
本发明的抗体和抗体部分能够在体外(参见实施例3)和体内(参见实施例4)中和hIL-12活性。因此，本发明的抗体和抗体部分可用来抑制IL-12活性，例如抑制含有hIL-12的细胞培养物、人类对象或其他具有本发明抗体与之交叉反应的IL-12的哺乳动物对象(例如灵长类，诸如狒狒、弥猴和恒河猴)的IL-12活性。在一个优选实施方案中，本发明提供中和人IL-12活性和至少一种其他灵长类IL-12、但是不中和小鼠IL-12活性的分离的人抗体或其抗原结合部分，所述灵长类IL-12选自狒狒IL-12、狨IL-12、黑猩猩IL-12、弥猴IL-12和恒河猴IL-12。所述IL-12优选为人IL-12。例如对于含有或怀疑含有hIL-12的细胞培养物，可在所述培养基中加入本发明抗体或抗体部分，抑制培养物中的hIL-12活性。
在另一个实施方案中，本发明提供在患有其中IL-12活性有害的疾病的患者抑制IL-12活性的方法。IL-12参与了各种各样的疾病的病理生理学(Windhagen等，(1995)J.Exp.Med.182：1985-1996；Morita等(1998)Arthritis and Rheumatism.41：306-314；Bucht等，(1996)Clin.Exp.Immunol.103：347-367；Fais等(1994)J.Inteferon Res.14：235-238；Parronchi等，(1997)Am.J.Path.150：823-832；Monteleone等，(1997)Gastroenterology.112：1169-1178和Berrebi等，(1998)Am.J.Path.152：667-672；Parronchi等(1997)Am.J.Path.150：823-832)。本发明提供在患有这种疾病的患者抑制IL-12活性的方法，该方法包括给予所述患者本发明抗体或抗体部分，使得所述患者体内的IL-12活性受到抑制。最好是所述IL-12为人IL-12，所述患者为人类患者。或者，所述患者可以是表达本发明抗体与之交叉反应的IL-12的哺乳动物。甚至所述患者可以是导入了hIL-12的哺乳动物(例如通过给予hIL-12或表达hIL-12转基因)。本发明抗体可以因为治疗目的而给予人类患者(下文进一步讨论)。此外，本发明抗体可给予表达所述抗体与之交叉反应的IL-12的非人类哺乳动物，其目的是兽医学目的或作为人类疾病动物模型。关于后者，这样的动物模型可用于评价本发明抗体的治疗效能(例如试验给药剂量和给药疗程)。
本文使用的术语“其中IL-12活性有害的疾病”包括其中已经证实所述病症患者体内存在的IL-12是或怀疑是与所述病症的病理生理学有关或者为引起所述病症恶化的因素的疾病和其他病症。因此，其中IL-12活性有害的病症是预期抑制IL-12活性可缓解所述病症的症状和/或发展的病症。这类病症的证据是例如所述病症患者的生物体液中的IL-12浓度升高(例如所述患者的血清、血浆、滑液等中的IL-12浓度升高)，所述IL-12浓度可用例如如上所述的抗IL-12抗体检测。关于其中IL-12活性有害的病症有许多实例。在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分可用于治疗本文所述疾病或病症的疗法。在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分可用于生产治疗本文所述疾病或病症的药物。下面进一步讨论本发明抗体和抗体部分在治疗几个非限制性的具体病症中的应用；A.类风湿性关节炎
白细胞介素12在诸如类风湿性关节炎的炎症性疾病中具有作用。在类风湿性关节炎患者的滑液中已经检测到诱导型IL-12p40信使，而且证实IL-12存在于类风湿性关节炎患者的滑液中(参见例如Morita等，(1998)Arthritis and Rheumatism 41：306-314)。发现IL-12阳性细胞存在于类风湿性关节炎滑膜的内层下。本发明人抗体和抗体部分可用来治疗例如类风湿性关节炎、少年类风湿性关节炎、Lyme关节炎、类风湿性脊椎炎、骨关节炎和痛风性关节炎。一般来说，所述抗体或抗体部分系统性给药，尽管对于某些病症来说，局部给予所述抗体或抗体部分可能是有益的。本发明抗体或抗体部分也可以与一种或多种其他用于治疗自身免疫性疾病的治疗药物一起给予。
在用于类风湿性关节炎的胶原诱导型关节炎(CIA)小鼠模型中，在关节炎之前用抗IL-12 mAb(大鼠抗小鼠IL-12单克隆抗体，C17.15)处理小鼠非常明显地抑制疾病的发生以及降低疾病的发生率和严重程度。发生关节炎后早期给予抗IL-12 mAb治疗降低关节炎严重程度，但是发生疾病后晚期用抗IL-12 mAb治疗小鼠对疾病严重程度的影响最小。B.节段性回肠炎
白细胞介素-12也在炎症性肠病节段性回肠炎具有作用。节段性回肠炎患者的肠粘膜的IFN-γ和IL-12表达增高(参见例如Fais等，(1994)J.Interferon Res.14：235-238；Parronchi等，(1997)Amer.J.Pathol.150：823-832；Monteleone等，(1997)Gastroenterology 112：1169-1178；Berrebi等，(1998)Amer.J.Pathol.152：667-672)。已经证实抗IL-12抗体抑制小鼠结肠炎模型疾病，所述模型例如为TNBS诱导的结肠炎IL-12失效小鼠，以及抑制最近的IL-10失效小鼠疾病。因此，本发明抗体和抗体部分可用于治疗炎症性肠病。C.多发性硬化
白细胞介素-12在多发性硬化的病理生理学中为关键介导物。在多发性硬化患者的病变部位证实了诱导型IL-12 p40信使或IL-12本身的表达(Windhagen等，(1995)J.Exp.Med.182：1985-1996，Drulovic等，(1997)J.Neurol.Sci.147：145-150)。慢性进行性多发性硬化患者的IL-12循环水平升高。研究多发性硬化患者的T细胞和抗原提呈细胞(APC)揭示，自我保持的各个系列的免疫性相互作用为进行性多发性硬化发生Th1型免疫反应的基础。T细胞分泌的IFN-γ增加导致APC产生的IL-12增加，这可长时间维持产生慢性状态的Th1型免疫活化和疾病的循环(Balashov等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94：599-603)。采用多发性硬化的小鼠和大鼠实验性变应性脑脊髓炎(EAE)模型研究了IL-12在多发性硬化患者中的作用。在多发性硬化的小鼠复发缓解型EAE模型中，用抗IL-12 mAb预先处理延迟麻痹以及降低临床评分。在麻痹高峰或随后的复发期用抗IL-12 mAb治疗降低临床评分。因此，本发明抗体或其抗原结合部分可用来缓解人类患者多发性硬化的相关症状。D.胰岛素依赖型糖尿病
白细胞介素-12为胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)的重要介导物。通过给予IL-12在NOD小鼠诱导IDDM，而抗IL-12抗体对IDDM过继转移模型具有保护作用。发病早的IDDM患者常常出现所谓的“蜜月期”，在“蜜月期”中保有部分残留胰岛细胞功能。这些残留胰岛细胞产生胰岛素，而且调节血糖水平比给予胰岛素更好。用抗IL-12抗体治疗这些早期发病的患者可进一步防止破坏胰岛细胞，由此维持内源性来源的胰岛素。E.牛皮癣
白细胞介素-12为牛皮癣的关键介导物。牛皮癣包括与TH1型细胞因子表达类型有关的急性和慢性皮肤病变。(Hamid等(1996)J.Allergy Clin.Immunol.1：225-231；Turka等(1995)Mol.Med.1：690-699)。在患病的人体皮肤样品中检测到IL-12 p35和p40 mRNA。由此，本发明的抗体或其抗原结合部分可用来缓解诸如牛皮癣的慢性皮肤病。
通过以下实施例进一步阐明本发明，而不能将其解释为以任何方式限制本发明。在整个本说明书中引用的所有引用文献，包括参考文献、授予的专利和公开的专利申请，其内容均通过引用特别结合到本文中。进而应该知道，在此所附的所有表格(参见附件A)内容均引用性纳入本发明。
                     附件A
  表1按照Kabat编号的VH3家族种系氨基酸序列(所包括的Joe VH用于比较)
Figure A0080778301421
表1按照Kabat编号的VH3家族种系氨基酸序列(所包括的Joe VH用于比较)
Figure A0080778301431
表1按照Kabat编号的Vλ1家族种系氨基酸序列(所包括的Joe VL用于比较)
   * Williams，JMB，1996，264，220-232
                                                                表2
克隆    H3 SEQID NO： H3    L3 SEQID ND： L3 koff      RB测定IC50(M)      PHA测定IC50(M) IFNγIC50(M)
    Joe9 wt      77     SGSYDY     110       QSYDSSLRGSRV      1.00E-01     1.50E-06      1.00E-06
   Joe9 wt IgG1      77     SGSYDY     110       QSYDSSLRGSRV      5.00E-07
       70-1      78     HGSHDN     110          Joe9 wt      1.34 e-2      2.00E-07
    70-1  IgG1      78     HGSHDN     110          Joe9 wt      2.00E-07
       70-2      79     HGSYDY     110          Joe9 wt      3.30E-02      3-5.0E-7
       70-7      80     RRRSNY     110          Joe9 wt      1.29E-01      3-5.0E-7
      70-13      81     SGSIDY     110          Joe9 wt      7.20E-02      3-5.0E-7
      78-34      77       wt     111       OSYDRGFTGSRV      1.64 e-2     2.00E-07      6.00E-07
      78-25      77       wt     112       QSYDSSLRGSRV      5.00E-02
      78-28      77       wt     112       QSYDSSLRGSRV      4.66E-02
      78-35      77       wt     113       QSYDSSLTGSRV      4.99E-02     4.00E-07
       79-1      77       wt     114       QSYDSSLWGSRV     2.00E-07      6.00E-07
     101-14      79      70-2     111           78-34      7.52E-03
      101-9      79      70-2     113           78-35      8.54E-03
     101-19      81      70-13     111           78-34      4.56E-02
      101-8      81      70-13     111           78-34      1.01E-02
      101-4      81      70-13     113           78-35      9.76E-03
      101-5      81      70-13     113           78-35      4.45E-02
   101-11 (12)      78      70-1     111           78-34       4.5 e-3      3.00E-08
   101-11 IgG1      78      70-1     111           78-34     1.60E-09
   26-1 (2，3)      78      70-1     114            79-1       7.4 e-3      6.00E-08
      136-9      82     HGSHDD     115       QTYDISESGSRV      3.20E-03
     136-10      82     HGSHDD     116       QSYDRGFTGSRV      1.40E-03     2.00E-09
     136-14      83     HGSHDN     117       QTYDRGFTGSRV      1.10E-03     3.00E-10      1.00E-07
     136-15      83     HGSHDN     118       QTYDKGFTGSSV       7.4 e-4     1.00E-10      2.00E-09
  136-15种系      83     HGSHDN     118       QTYDKGFTGSSV      4.60E-04      6.00E-09
     136-16      83     HGSHDN     119       QSYDRRFTGSRV      6.10E-04     3.00E-10      5.00E-09
     136-17      83     HGSHDN     120       QSYDWNFTGSRV      2.90E-05     2.00E-09      7.00E-09
     136-18      83     HGSHDN     121       QSYDRGFTGSRV      1.10E-03     8.00E-10
     136-21      83     HGSHDN     122       QSYDNGFTGSRV      4.20E-04     2.00E-09
     136-24      83     HGSHDN     123       QSYDNAVTASKV      8.90E-04     1.00E-09
                                                                        表2
      克隆   H3 SEQID NO： H3   L3 SEQID NO： L3 koff     RB测定IC50(M)      PHA测定IC50(M) IFNγIC50(M)
     101-11     84      TT HGSHDN HGQG     124      QSYDRGFTGSRV     4.5×10-3     2×10-9      2.00E-08
    136-15M1     85      AK ...... ....     124      QSYDRGFTGSRV    4.00E-10
     149-4     86      .. ...... .S..     124      ............    1.37×10-3    8×10-11      3.00E-09
     149-5     87      .. .....T ....     125      QSYDSSLWGTRV    1.02×10-3   1.2×10-10      3.00E-09
     149-6     84      .. ...... ....     124      ............    2.73×10-3    6×10-10      2.00E-09
     149-7     84      .. ...... ....     126      .....D......    1.13×10-3    9×10-10      3.00E-09
     149-8     86      K. ...... ....    2.33×10-3     3×10-9
     149-9     89      K. ...... ..H.     127      ...E......M.    3.54×10-3   1.8×10-10
    149-11     90      .. ...... .S..     128      ....N....A..    1.43×10-2    2×10-10.      4.00E-09
    149-12     84      .. ...... ....    3.73×10-3    中和
    149-13     84      .. ...... ....    2.22×10-3    5×10-10
    149-14     91      .. .R..N. ....   1.5×10-10      6.00E-09
    92         TT HGSHDN     124      QSYDRGFTGSRY
     156-1     93         .. .....T     126      .....D......     5.00E-03
     156-2     93         .. .....T     129      .....R......
     156-3     93         .. .....T     128      ....N....A..     9.00E-03
     156-4     93         .. .....T     127      ...E.....SM.
     156-5     93         .. .....T     130      .T..K.....S.
     156-6     92         .. ......     126      .....D......     3.00E-03
     156-7     92         .. ......     129      .....R......
     156-8     92         .. ......     128      ....N....A..
     156-9     92         .. ......     127      ...E.....SM.
    156-10     92         .. ......     130      .T..K.....S.
    156-11     94         .K ......     126      .....D......
    156-12     94         .K ......     129      .....R......
    156-13     94         .K ......     128      ....N....A..
    156-14     94         .K .....     127      ...E.....SM.
    156-15     94         .K ......     130      .T..K.....S.
    156-16     93         .. .....T     124      ............
    156-17     92         .. ......     125      ....SSLW.T..     6.00E-03
    156-18     93         .. .....T     125      ....SSLW.T..
                                                                   表2
克隆   H3 SEQID NO： H3    L3 SEQID NO： L3 koff     RB测定IC50(M)       PHA测定IC50(M) IFNγIC50(M)
    92       TT HGSHDN      124          QSYDRGFTGSRV
    103-1     95       .. Q.R...      124          ............    2.9×10-3
    103-2     96       K. R.R...      130          .T..K.....S.    7.3×10-4    7.00E-11      1.00E-09
    103-3     97       .. .....K      124          ............    2.5×10-3
    103-6      131          .....D...T..    4.5×10-4
    103-7     98       .. .....D      131          .....D...T..    3.7×10-4    1.40E-10      1.00E-09
    103-8     99       K. ......      130          .T..K.....S.    3.3×10-4    6.00E-11      1.50E-09
   103-14 & 9    100       KT HGSHDN      132          QSYDRGFTGSMV     6.7 e-4    4.00E-11      1.20E-09
   103-8 & 2    100       KT HGSHDN      133          QTYDKGFTGSSV     5.3 e-4      1.50E-09
    103-4    101       TT HGSHDN      134          QSYDRGFTGARV     1.6 e-4    8.60E-11      9.00E-10
   103-152    101       TT HGSHDN      135          QSYERGFTGARV    8.60E-11
   102       TT SGSTDY      136          QSYDRGFTGSRVF
     170-1    102       .. ......      137          .........FK..    2.35E-03
     170-2    102       .. ......      138          .......VSAY..    8.80E-04
     170-3    102       .. ......      139          ......L.VTK..    1.11E-03
     170-4    102       .. ......      140          ......Y.A....    8.11E-04
     170-7    102       .. ......      141          ..........K..    5.30E-04
    170-11    102       .. ......      142          ......L..F...    4.40E-04
    170-13    102       .. ......      143          ..........YK..    1.59E-03
    170-15    102       .. ......      144          ......L..Y.L.    4.43E-03
    170-19    103       .. H..H.N      145          ........DYK..    1.00E-03
    170-21    104       .. H..Q.N      146          .........P.L.    3.89E-03
    170-22    102       .. ......      147          ......L......    5.60E-04
    170-23    103       .. H..H.N      148          .........A..W    1.00E-03    2.00E-10
    170-24    104       .. H..Q.N      149          .........Y...    2.80E-04    5.00E-10
    170-35    105       A. H..Q.N      136          .............    1.00E-05
    170-38      150          .........P...    2.10E-04
    170-39      151          ......M.S....    2.79E-03
    170-36     83         HGSHDN      152          QSYDRDSTGSRVF    4.00E-04    2.00E-10
    170-25    106         HGSQDT      153          QSYDSSLRGSRVF    5.00E-04    5.00E-11
                                                     表2
克隆   H3 SEQID NO： H3   L3 SEQID NO： L3 koff     RB测定IC50(M)   PHA测定IC50(M) IFNγIC50(M)
   106    SGSYDY    136      QSYDRGFTGSRYF
   73-B1    107    SGSYDY    154      H...SD.......     3.25E-03      ＞1E-8
   73-B2    107    SGSYDY    155      H.SES........     2.07E-03
   73-B6    107    SGSYDY    156      H...NR.......     2.51E-03      ＞1E-8
   73-C1    107    SGSYDY    157      H...SR.......     2.71E-03      ＞1E-8
   73-C2    107    SGSYDY    158      ....SE.......     3.79E-03
   73-C6    107    SGSYDY    159      ....T........     3.96E-03
   73-D1    107    SGSYDY    160      H...S........     3.99E-03
   73-D2    107    SGSYDY    161      ....T........     3.56E-03
   73-D4    107    SGSYDY    162      H...TK.......     5.36E-03
   73-D5    107    SGSYDY    163      H.S.S........     3.57E-03
   73-E3    107    SGSYDY    164      ....SD.......     4.98E-03
   73-E6    107    SGSYDY    165      H..ES........     4.17E-03
   73-F3    107    SGSYDY    166      ....APWS.....     7.08E-03
   73-F5    107    SGSYDY    167      ...DSD....K..     3.74E-03
   73-G2    107    SGSYDY    168      HTN.S........     3.98E-03
   73-G3    107    SGSYDY    169      H...TR.......     3.50E-03
   73-G4    107    SGSYDY    170      ....MR.......     6.58E-03
   73-G5    107    SGSYDY    171      H.S.SDS......     6.01E-03
   73-G6    107    SGSYDY    172      ...NTD.......     6.30E-03
   73-H2    107    SGSYDY    173      ....S........     5.93E-03
   73-F6    107    SGSYDY    174      H...M........     5.87E-03
   73-H3    107    SGSYDY    175      H...N........     6.85E-03
   73-C5    107    SGSYDY    176      H.H..D.......     4.84E-03
   73-B7    108    HGSQDN    177      QSYDSSLRGSRV     2.50E-03    7.00E-09
                                                       表2
克隆    H3 SEQID NO： H3   L3 SEQID NO： L3 koff     RB测定IC50(M)   PHA测定IC50(M) IFNγIC50(M)
   136    QSYDRGFTGSRYF
   M2 A2      83     HGSHDN    178    ......IH.....     4.00E-02
   M2 A4      83     HGSHDN    179    ....S..P.....     8.49E-03
   M2 A5      83     HGSHDN    180    ....I.S......     4.01E-02
   M2 B1      83     HGSHDN    181    ....S.L......     7.97E-03
   M2 B3      83     HGSHDN    182    ....I.M......     4.60E-02
   M2 B4      83     HGSHDN    183    ....I.L......     4.42E-02
   M2 B5      83     HGSHDN    184    ....S.V......     8.38E-03
   M2 B6      83     HGSHDN    185    ......L.A....     2.81E-02
   M2 C2      83     HGSHDN    181    ....S.L......     4.85E-02
   M2 C3      83     HGSHDN    186    ....T.L......     4.62E-02
   M2 C4      83     HGSHDN    181    ....S.L......     8.16E-03
   M2 C5      83     HGSHDN    187    ....TAL......     4.71E-02
   M2 D1      83     HGSHDN    188    .....IR.......     3.71E-02
   M2 D2      83     HGSHDN    189    ....IRS......     3.85E-02
   M2 D3      83     HGSHDN    190    ....NRL......     3.33E-02
   M2 D4      83     HGSHDN    191    ...ETS.......     5.81E-02
   M2 D5      83     HGSHDN    192    ....SSS......     5.18E-02
   M2 D6      83     HGSHDN    193    ....S...A....     5.01E-02
   M2 E1      83     HGSHDN    194    .T..K.....S..     5.32E-02
   M2 E2      83     HGSHDN    195    ....N........     4.77E-02
   M2 E6      83     HGSHDN    196    ....T...K....     9.77E-03
   M2 F1      83     HGSHDN    197    ....SDV......     6.16E-02
   M2 H5      83     HGSHDN    198    ....A........     9.90E-03
                                                             表2
   克隆   H3 SEQID NO： H3   L3 SEQID NO： L3 koff    RB测定IC50(M)    PHA测定IC50(M) IFNγIC50(M)
    124       QSYDRGFTGSRV
    A5     83     HGSHDN     199       ......THPSML     1.12E-03
   A12     83     HGSHDN     200       ......TTPRPM     1.43E-03
    A4     83     HGSHDN     201       ......RNPALT     1.47E-03
    A6     83     HGSHDN     202       ......THPWLH     1.87E-03
   A10     83     HGSHDN     203       ......NSPATV     1.87E-03
   A11     83     HGSHDN     204       ......TFPSPQ     2.07E-03
    C2     83     HGSHDN     205       ......LNPSAT     2.23E-03
    A8     83     HGSHDN     206       ......KSNKML     2.37E-03
    B8     83     HGSHDN     207       ......HTAHLY     2.40E-03
    C6     83     HGSHDN     208       ......QTPSIT     2.42E-03
    A3     83     HGSHDN     209       ......YPRNIL     2.51E-03
   B11     83     HGSHDN     210       ......ITPGLA     2.95E-03
    B5     83     HGSHDN     211       ......QPHAVL     3.04E-03
   C10     83     HGSHDN     212       ......NSPIPT     3.10E-03
    C4     83     HGSHDN     213       ......TPNNSF     3.23E-03
    C3     83     HGSHDN     214       ....S.VDPGPY     3.34E-03
    B2     83     HGSHDN     215       ......RPRHAL     3.61E-03
    A2     83     HGSHDN     216       ......PYHPIR     3.80E-03
    C5     83     HGSHDN     217       ......PHTQPT     3.91E-03
    A7     83     HGSHDN     218       ......HNNFSP     3.95E-03
    C9     83     HGSHDN     219       ......PTHLPH     3.97E-03
    B3     83     HGSHDN     220       ......TPSYPT     4.12E-03
    C8     83     HGSHDN     221       ....S.TSNLLP     5.36E-03
    B7     83     HGSHDN     222       ......DSNHDL     5.45E-03
    A1     83     HGSHDN     223       ......LPRLTH     5.66E-03
    C7     83     HGSHDN     224       ......IPTSYL     5.83E-03
   C12     83     HGSHDN     225       ......LRVQAP     5.85E-03
   B10     83     HGSHDN     226       ......LSDSPL     6.04E-03
    B6     83     HGSHDN     227       ....S.SLRRIL     7.58E-03
    A9     83     HGSHDN     228       ......PARTSP     7.98E-03
    B9     83     HGSHDN     229       ......RAAHPQ     8.66E-03
                                                         表2
克隆   H3 SEQID NO： H3   L3 SEQID NO： L3 koff      RB测定IC50(M)     PHA测定IC50(M) IFNγIC50(M)
    124      QSYDRGFTGSRV
    177-D7     83     HGSHDN     230      ......TQPABI       4.07E-04
    177-G6     83     HGSHDN     231      ......THPTMI       5.50E-04
    177-D9     83     HGSHDN     232      ......RIPABT       6.32E-04
    177-C6     83     HGSHDN     233      ......THPVPA       7.94E-04
    177-H5     83     HGSHDN     234      ......SBPIPA       1.32E-03
    177-H9     83     HGSHDN     235      ......THPVPA       1.58E-03
    177-H10     83     HGSHDN     236      ......THPTMY       3.44E-03
    144-F1     83     HGSHDN     237      ......HHYTTF       5.80E-04
    43-E3     83     HGSHDN     238      ......SHPAAE       8.00E-04
    43-E9     83     HGSHDN     239      ......TIPSIE       8.00E-04
    43-G2     83     HGSHDN     240      ......SSPAIM       7.00E-04
    43-G3     83     HGSHDN     241      ......IWPNLN       9.00E-04
    31-A6     83     HGSHDN     242      ......THPNLN       5.00E-04
    31-B5     83     HGSHDN     243      ......THPSIS       5.00E-04
    124      QSYDRGFTGSRV
     Y17     83     HGSHDN     244      QSYDRGSAPMIN       8.90E-05     4.50E-10     ＞1E-8
     Y19     83     HGSHDN     245      QSYDRGHHPAMS       2.26E-04     3.00E-11     ＞1E-8
     Y38     83     HGSHDN     246      ......THPSIT       5.08E-04     5.50E-11     2.60E-09
     Y45     83     HGSHDN     247      ......TDPAIV       6.17E-04     4.00E-11     4.30E-09
     Y61     83     HGSHDN     248      ......THPALL       2.75 e-4       4E-11     1.40E-10
   Y61 IgG     83     HGSHDN     248      ......THPALL       1.50E-04     1.60E-11     1.30E-10
 Y61 IgG种系     83     HGSHDN     248      ......THPALL       1.50E-04     1.60E-11     1.30E-10      1.60E-10
    Y139     83     HGSHDN     249      ......SHPALT       5.92E-04       3E-11     4.50E-10
  Y139 IgG1     83     HGSHDN     249      ......SHPALT     1.00E-09
     Y174     83     HGSHDN     250      ......TTPAPE       7.55E-04       6E-11     2.00E-09
     Y177     83     HGSHDN     251      ......SHPTLI       6.61E-04       5E-11     1.00E-09
      A5     83     HGSHDN     252      ......THPSML       4.50E-04     6.60E-11
     A12     83     HGSHDN     253      ......TTPRPM       5.57E-04     2.50E-10
      D9     83     HGSHDN     254      ......RLPAQT       8.21E-04     3.5E-09       ＞＞
      G6     83     HGSHDN     255      ......THPLTI       5.08E-04       1E-10     1.00E-09
   G6 IgG1     83     HGSHDN     255      ......THPLTI     1.00E-09
      C6     83     HGSHDN     256      QSYDRGQTPSIT       1.07E-03     3.5E-10     1.00E-08
     Y55     83     HGSHDN     257      QSYDRGTHFQMY       1.06E-03     1.40E-10      ＞1E-8
                                                                   表2
克隆   H3 SEQID NO： H3   L3 SEQID NO： L3 koff     RB测定IC50(M)     PHA测定IC50(M) IFNγIC50(M)
        A4     83      HGSHDN     258       QSYDRGRNPALT     6.30E-04    2.50E-10
       AO3     83      HGSHDN     259       QSYDRGTHPLTM     3.04E-04    3.00E-11    4.00E-10
     AO3 IgG1     83      HGSHDN     260       QSYDRGTHPLTM     3.04 e-4    2.90E-11    3.80E-10
    AO3 IgG种系     83      HGSHDN     260       QSYDRGTHPLTM     2.50E-04    3.50E-11    1.75E-10
      99-B11     83      HGSHDN     261       QSYDSGYTGSRV     5.40E-03
      99-C11     83      HGSHDN     262       QSYDSGFTGSRV     5.70E-03
       99-H4     83      HGSHDN     263       QSYDSRFTGSRV     4.80E-03
       99-E9     83      HGSHDN     262       QSYDSGFTGSRV     5.40E-03
       99-H7     83      HGSHDN     264       QSYPDGTPASRV     3.30E-03
      99-H11     83      HGSHDN     265       QSYSTHMPISRV     4.90E-03
       99-F6     83      HGSHDN     266       QSYDSGSTGSRV     4.90E-03
       99-F7     83      HGSHDN     267       QSYPNSYPISRV     4.80E-03
       99-F8     83      HGSHDN     268        QSYIRAPQQV     3.70E-03
      99-F11     83      HGSHDN     262       QSYDSGFTGSRV     5.40E-03
       99-G7     83      HGSHDN     269       QSYLKSRAFSRV     4.80E-03
      99-G11     83      HGSHDN     270       QSYDSRFTGSRV     4.30E-03
    124       QSYDRGFTGSRV
    L3.3R3M-B1     83      HGSHDN     271       ......FTGSMV     5.46E+00
    L3.3R3M-B3     83      HGSHDN     272       ......FTGSMV     5.51E+00
    L3.3R3M-C6     83      HGSHDN     273       ......FTGFDG     6.17E+00
    L3.3R3M-F9     83      HGSHDN     274       ......TAPALS     4.99E+00
    L3.3R3M-G8     83      HGSHDN     275       ......SYPALR     5.55E+00
    L3.3R3M-H6     83      HGSHDN     276       ......NWPNSN     5.69E+00
   L3.3R3M-H10     83      HGSHDN     277       ......TAPSLL     5.35E+00
    L3.3R3M-A3     83      HGSHDN     278       ......FTGSMV     5.37E+00
    L3.3R3M-F8     83      HGSHDN     279       ......TTPRIR     4.99E+00
    L3.3R3M-G1     83      HGSHDN     280       ......FTGSMV     4.21E+00
    L3.3R3M-G7     83      HGSHDN     281       ......FTGSMV     4.24E+00
   L3.3R3M-H11     83      HGSHDN     282       ......MIPALT     3.95E+00
                                                                          表2
         克隆   H3 SEQID NO： H3    L3 SEQID NO： L3 koff     RB测定IC50(M)      PHA测定IC50(M) IFNγIC50(M)
       Y61-L94N     109      CKT HGSHDN      283      QSYDRNTHPALL     8.00E-11
       Y61-L94F     109      CKT HGSHDN      284      QSYDRFTHPALL     6.00E-11
       Y61-L94Y     109      CKT HGSHDN      285      QSYDRYTHPALL    2.00E-11     2.00E-11
     Y61-L94Y IgG     109      CKT HGSHDN      285      QSYDRYTHPALL     1.27E-04    6.00E-11     5.00E-11       4.00E-11
       Y61-L50Y     109      CKT HGSHDN      286      QSYDRGTHPALL    2.00E-11 2.00E-11
     Y61-L50Y* IgG     109      CKT HGSHDN      286      QSYDRGTHPALL     6.98E-05     2.00E-11       3.00E-11
    Y61-L50Y-H31E**IgG     109      CKT HGSHDN      286      QSYDRGTHPALL     2.99E-05 6.00E-11 2.00E-11
     Y61-L50Y-H31E-L94Y** IgG     109      CKT HGSHDN      287      QSYDRYTHPALL     4.64E-05 1.00E-11 1.00E-11
     J695(Y61-L94Y-L50Y IgG*)     109      CKT HGSHDN      287      QSYDRYTHRALL     5.14E-05    5.00E-11     1.00E-11       5.00E-12
                         *CDR L2：L50G→Y**CDR L2：L50G→Y；CDR H1：H31S→E
Figure A0080778301541
                   表4.在过量游离IL-12 p40存在下的中和活性
 SEQ ID NO：    克隆  PHA测定IC50(M)p70∶p40 1∶0  PHA测定IC50(M)p70∶p40 1∶20  PHA测定IC50(M)p70∶p40 1∶50
  VH：47  136-15     2.00E-09      5.00E-09      4.00E-09
  VL：48
  VH：51   149-5     6.50E-09      7.00E-09      4.00E-09
  VL：52
  VH：53   149-6     9.00E-10      1.00E-09      1.00E-09
  VL：54
  VH：84   149-7     3.50E-09      2.50E-09      4.00E-09
 VL：126
  VH：23  Y61 IgG     1.80E-10      1.80E-10
  VL：24
  VH：65  AO3 IgG1     2.50E-10      2.20E-10
  VL：66
  VH：31    J695     1.00E-11      3.50E-11
  VL：32
实施例实施例1：分离抗IL-12抗体A.筛选IL-12结合抗体
通过筛选3个不同的scFv噬菌体展示文库分离抗hIL-12的抗体，所述噬菌体展示文库利用从人扁桃体(称为scFv 1)、扁桃体和外周血淋巴细胞(PBL)(称为svFv 2)、以及骨髓来源的淋巴细胞(称为BMDL)获得的mRNA的人VL和VH cDNA制得。Vaughan等(1996)NatureBiotech.14：309-314中介绍了文库的构建以及筛选方法。
应用所述各种抗原即人IL-12 p70亚单位、人IL-12 p40亚单位、嵌合IL-12(小鼠p40/人p35)、小鼠IL-12、生物素化人IL-12和生物素化嵌合IL-12筛选所述文库。应用标准方法使所述抗原包被在免疫试管中，从而选择IL-12特异性抗体(Marks等，(1991)J.Mol.Biol.222：581-597)。用IL-12或生物素化IL-12筛选scFv文库2，产生大量IL-12特异性结合物。根据BstN1酶性消化类型确定而且经DNA测序证实，选择5个不同的克隆类型。主要克隆类型有VHDP58/VLDPL11、VHDP77/VLDPK31、VHDP47/VL和VHDP77/VLDPK31，它们均能够识别IL-12的p40亚单位。
以IL-12 p70筛选BMDL文库获得3个不同克隆类型。发现其中2个克隆为交叉反应克隆。对主要克隆测序，而且该克隆由VHDP35/VLDP组成。该克隆识别IL-12的p40亚单位。用IL-12 p70筛选svFv文库1没有获得特异性IL-12抗体。
为了鉴定优选结合p70异源二聚体或IL-12的p53亚单位而不是p40亚单位的IL-12抗体，使用联合的scFv 1+2文库以及BMDL文库。为了选择识别p70异源二聚体或p35亚单位的IL-12抗体，使噬菌体文库预温育，并在游离p40存在下进行选择。对分离克隆的测序显示9个不同抗体谱系。通过“micro-Friguet”滴定法进一步分析亚单位优选性。以ELISA中捕获生物素的IL-12滴定含有scFv的上清液并测定ED50。产生50％ED的scFv浓度与浓度逐渐增加的游离p70或p40(抑制剂)预温育。检测生物素IL-12包被板的ELISA信号的减少，并对游离p70或p40浓度作图。这为p70和p40的各克隆提供IC50。如果两种亚单位的滴定过程一致，则svFv既结合p40又结合p70。滴定过程的任何变化说明p70优选于p40的程度。B.对IL-12的抗体谱系特异性的亲和力成熟(Joe 9)
测试各克隆抑制IL-12在IL-12受体结合测定(称为RBA)中结合其受体的能力，以及测试其抑制IL-12诱导的PHA刺激的人体母细胞增殖(PHA测定)的能力，如实施例3所述。克隆Joe 9在RBA和PHA测定中的IC50值均最低，两种测定的IC50值均为1×10-6M。另外，Joe9重链可变区(VH)的变化数与从VBASE数据库鉴定的最接近的种系序列COS-3相比最小。表1(见附件A)显示VH3家族种系序列，其中COS-3为成员之一，以及Vλ1家族种系序列各成员。所以，选择亲和力成熟的Joe 9。Joe9野生型(Joe9 wt)抗体的VH和VL的氨基酸序列示于图1A-1D。
为了提高Joe 9的亲和力，制备各种突变的重链和轻链二者的互补决定区3(CDR3)。应用重链CDR3(称为“H3”)或轻链CDR3(称为“L3”)特异性简并寡核苷酸通过定点PCR诱变产生CDR3变异体，在各CDR3中平均存在3种碱基取代(称为“掺入(spike)”)。应用含有全部4种核苷酸的随机混合物的简并重链寡核苷酸：5’TGTCCCTTGGCCCCA(G)(T)(A)(G)(T)(C)(A)(T)(A)(G)(C)(T)(C)(C)(C)(A)(C)(T)GGTCGTACAGTAATA3’(SEQ ID NO：580)和寡核苷酸pUC反向Tag：GAC ACC TCG ATC AGC GGA TAA CAA TTTCACACA GG(SEQ ID NO：581)对重链CDR3进行PCR诱变，产生所有组成成分的重链CDR3突变体。应用Joe 9反向寡核苷酸(5’TGG GGCCAA GGG ACA3’(SEQ ID NO：582)和fdteteseq 24+21寡核苷酸(5’-ATT CGT CCT ATA CCG TTC TAC TTT GTC GTC TTT CCA GACGTT AGT-3’(SEQ ID NO：583)扩增亲代轻链。
两种PCR产物之间的互补性用来驱使两种片段在PCR装配反应退火，用pUC反向Tag(SEQ ID NO：581)和fdTag 5’-ATT CGT CCTATA CCG TTC-3’(SEQ ID NO：584)扩增全长重组svFv文库。用含有全部4种核苷酸的混合物的轻链寡核苷酸：5’GGTCCCAGTTCCGAAGACCCTCGAACC(C)(C)(T)(C)(A)(G)(G)(C)(T)(G)(C)(T)(G)(T)(C)ATATGACTGGCAGTAATAGTCAGC3’(SEQ IDNO：585)和Joe 9反向寡核苷酸：5’TGG GGC CAA GGG ACA3’(SEQID NO：586)对轻链进行PCR诱变，产生所有组成成分的轻链CDR3突变体。应用pUC反向Tag(SEQ ID NO：581)和HuJH3FOR寡核苷酸5’TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC3’(SEQ ID NO：587)扩增亲代重链。两种PCR产物之间的互补性用来驱使两种片段在PCR装配反应退火，用反向Tag GAC ACC TCG ATC AGC G(SEQ ID NO：588)和HuJλ2-3 FOR NOT寡核苷酸5’GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGCCGC ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC3’(SEQ ID NO：589)扩增全长重组svFv文库。
用1nM生物素化IL-12选择重链CDR3突变体，用含7nM浓度的游离IL-12或p40的PBS于室温下洗涤1小时。利用噬菌体ELISA分析克隆，并应用低密度IL-12芯片以BIAcore动力学结合研究测试结合IL-12的克隆(参见实施例5中的BIAcore分析方法)。一般来说，BIAcore分析利用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor，Piscataway，NJ)通过表面胞质团共振(SPR)测量配体(固定在生物传感器基体上的重组人IL-12)和分析物(抗体溶液)之间的实时结合作用。该系统利用SPR的光学特性检测葡聚糖生物传感器基体中蛋白浓度变化。蛋白质与已知浓度的葡聚糖基体共价结合。通过葡聚糖基体注射抗体，注射抗体和固定配体之间的特异性结合使基体蛋白浓度增加，结果是SPR信号改变。SPR信号变化记录为共振单位(RU)，而且沿传感图的y轴随着时间而显示。为了测定解离速率(off rate，koff)、结合速率(on rate，kon)、结合速率常数(Ka)(association rate constant)和解离速率常数(Kd)(dissociation rate contstant)，应用BIAcore动力学评价软件(2.1版本)。以中和测定分析证实koff速率改善的克隆，中和测定包括抗体对IL-12结合其受体的抑制作用(RBA测定)、对IL-12诱导的PHA刺激的人母细胞增殖的抑制作用(PHA测定)和对IL-12诱导的人母细胞产生γ干扰素的抑制作用(IFNγ测定)。关于重链CDR3掺入克隆70-1至70-13的中和测定的解离速率和/或IC50值的总结见表2(参见附件A)。克隆70-1的koff速率比亲代Joe 9克隆更佳，而且具有2.0×10-7M的最低IC50值。因此，选择克隆70-1转化为完整IgG1。
应用1nM生物素IL-12选择轻链CDR3突变体，用含7nM浓度的游离p40的PBS洗涤。利用噬菌体ELISA分析克隆，并应用低密度IL-12芯片以BIAcore结合分析测试结合IL-12的克隆。以中和测定测试解离速率优于亲代Joe 9克隆的克隆，所述中和测定测定对IL-12受体结合的抑制作用或对PHA母细胞增殖的抑制作用。关于轻链CDR3突变克隆78-34至79-1中和测定的解离速率和/或IC50值的总结见表2(参见附件A)。
根据koff速率，与亲代Joe 9相比，克隆78-34和78-35的koff速率提高。选择其中2个克隆对重链突变体进行组合分析。C.组合克隆
具有最佳结合特性的突变轻链和重链克隆用于组装scFv。通过PCR重叠延伸并连接(pull-throug)如上所述的突变VH和VL区段而组合效价特性改善的突变克隆组合。组合重链突变体(70-2、70-13和70-1)和轻链突变体(78-34、78-35和79-1)产生克隆101-14至26-1，如表2所示(参见附件A)。这些克隆中和测定的koff速率和/或IC50值见表2。
BIAcore结合分析鉴定了克隆101-11，它由重链CDR3突变克隆70-1和轻链CDR3突变克隆78-34组合产生，其解离速率为0.0045s-1。此koff速率分别与重链CDR3突变体克隆70-1(0.0134s-1)或轻链CDR3突变克隆78-34(0.0164s-1)相比显著改善。此外，克隆101-11的中和测定显示显著改善。因此，选择克隆101-11进行如下所述的亲和力成熟。D.克隆101-11的亲和力成熟
克隆101-11的进一步亲和力成熟包括应用掺入寡核苷酸引物对101-11的重链和轻链CDR3二者进行重复循环的PCR诱变。以降低浓度的生物素化IL-12(bio-IL-12)选择克隆。应用BIAcore结合分析和RBA、PHA中和测定评价所述突变克隆的结合特性。克隆136-9至170-25的koff速率和/或IC50值见表2(参见附件A)。克隆103-14证实受体结合测定和PHA母细胞测定二者的IC50值均提高。克隆103-14还证实koff速率低，因此选择它进行进一步的亲和力成熟。E.制备和选择克隆103-14轻链CDR3的随机文库
应用如下概述的3个不同文库于3个节段系统性随机化克隆103-14的轻链CDR3(QSYDRGFTGSMV(SEQ ID NO：590))，其中X由序列NNS的随机密码子编码，N为任何核苷酸，而S为脱氧胞嘧啶或脱氧胍。L3.1＝XXXXXXFTGSMV(SEQ ID NO：591)L3.2＝QSYXXXXXXSMV(SEQ ID NO：592)L3.3＝QSYDRGXXXXXX(SEQ ID NO：593)
对克隆103-14的全部3个轻链CDR(称为L3.1、L3.2和L3.3)进行随机诱变。不突变克隆103-14的重链CDR3(称为H3)。构建基于克隆103-14的4个随机文库(H3和L3.1、L3.2 & L3.3)，使其接受各种各样的选择条件，包括应用有限的抗原浓度和存在或缺乏过量游离抗原(p40和p70)。主要用BIAcore从选择物(克隆73-B1至99-G11)筛选产品，间或应用RBA进行筛选，结果示于表2(参见附件A)。
对克隆103-14的轻链CDR进行随机诱变获得克隆Y61，与亲代克隆103-14相比，其IC50值明显改善。选择Y61转化为完整IgG1。按照PHA测定，完整Y61-IgG1的IC50值约130pM。IC50值不受游离p40过量50倍摩尔的影响，证实游离p40不与Y61抗IL-12抗体交叉反应，因而未减少抗体结合异源二聚体。Y61重链可变区和轻链可变区的全长序列如下所示。
                Y61重链可变区肽序列
                           CDR H1QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASFTFS SYGMH WVRQAPGKGLEWVA
  CDR H2FIRYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCKTCDR H3HGSHDN WGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：23)
                Y61轻链可变区肽序列
                       CDR L1QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISC SGGRSNIGSNTVK WYQQLPGTAPKLLIYCDR L2GNDQRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCCDR L3QSYDRGTHPALL FGTGTKVTVLG(SEQ ID NO：24)
按照Kabat定义指示CDR残基。实施例2：Y61超突变位点和接触位点的突变
通常采用噬菌体展示方法对亲和力改善的重组抗体进行选择。可如下达到此目的：通过随机突变组合的CDR残基，获得包含不同序列的单链抗体的大文库。一般根据其抗体抗原反应达到平衡的能力选择亲和力改善的抗体。但是，当Y61 scFV在噬菌体表面表达并与IL-12温育时，未能找到允许系统达到正常抗体抗原平衡的选择条件。scFV-噬菌体保持与IL-12结合，推测是由于非特异性作用所致，因为纯化Y61 scFv显示正常解离动力学。因为Y61不能应用噬菌体展示亲和力成熟的常规方法(即制备文库以及通过诱变多CDR残基进行选择)，所以开发了新的策略，其中使各个CDR位点突变。
该策略涉及选择用于突变的合适CDR位点，而且基于鉴定和选择为优选选择性诱变位点、接触位点和/或超突变位点的氨基酸。接触位点定义为当抗原与抗体反应时与抗原接触的概率高的残基，而超突变位点定义为认为在抗体体内亲和力成熟过程中发生体细胞超突变的概率高的残基。优选选择性诱变位点为既是接触位点又是超突变位点的CDR位点。应用实施例1所述的方法已经优化Y61抗体的CDR3区，因此，难以应用噬菌体展示选择方法进一步改进位于抗体结合位点中心的区域。通过去除不利的抗原抗体接触或工程构建新的接触使CDR3区外面的潜在接触位点突变，可进一步改善活性。
认为是抗原接触点的Y61的氨基酸残基和体内亲和力成熟过程中的体细胞超突变部位的CDR位点示于表3(参见附件A)。对于Y61的亲和力成熟，选择CDR3外面的15个残基、L3环中的3个残基和H3环中的5个残基进行PCR诱变。
使Y61 scFv基因克隆入pUC119(Sfi)质粒载体中，以用于诱变。以随机密码子设计合成寡核苷酸，以使各个选定位点突变。经PCR诱变后，对少数克隆(约24个)测序，并用宿主细胞例如细菌、酵母或哺乳动物宿主细胞表达。纯化表达抗体，用BIAcore系统测定koff。然后用中和测定测试解离速率改善的克隆(与Y61相比)。对其他CDR位点重复该过程。将证实中和活性改善的各个突变组合，以获得中和效价更高的抗体。
为了提高中和效价突变的Y61 CDR位点和各位点的相应氨基酸取代示于图2A-2H。给出了BIAcore分析测得的解离速率。这些解离速率示于每个表右侧的直方图中。
位点H30、H32、H33、H50、H53、H54、H58、H95、H97、H101、L50、L92、L93的取代结果证实，所检测的所有氨基酸取代均产生解离速率比Y61低的抗体。发现位点H52、L32和L50中只有一个氨基酸取代改善了Y61的解离速率，所有其他改变均对活性产生不利影响。对于L50，Gly→Tyr这个单一的改变明显提高(5-10倍)Y61的中和效价。结果证实，这些位点对Y61的活性是重要的，说明大多数情况下噬菌体展示能够选择最佳残基。但是，在位点H31、H56、L30和L94发现数个取代改善Y61的解离速率，说明这些位点对抗原结合也是重要的，尽管噬菌体展示方法不能选择这几个最佳残基。
对Y61的接触位点和超突变位点进行选择性突变鉴定了轻链CDR2中的氨基酸残基L50和轻链CDR3中的残基L94，它们均提高Y61的中和能力。这些突变的组合产生累加效应，获得抗体J695，其中和能力明显增强。J695重链可变区序列和轻链可变区序列的全长序列如下所示。
              J695重链可变区肽序列
                          CDR H1QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFS SYGMH WVRQAPGKGLEWVA
CDR H2FIRYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCKTCDR H3HGSHDN WGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：31)
             J695轻链可变区肽序列
                   CDR L1QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISC SGSRSNIGSNTVK WYQQLPGTAPKLLIYCDR L2YNDQRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCCDR L3QSYDRYTHPALL FGTGTKVTVLG(SEQ ID NO：32)
按照Kabat定义指示CDR残基。
关于重链和轻链可变区序列对比的总体情况示于图1A-1D，说明从Joe9至J695的克隆的谱系发展。CDR和残基按照Kabat编号。实施例3：抗hIL-12抗体的功能活性
为了检测本发明的人抗人IL-12抗体的功能活性，所述抗体用于数个检测抗体抑制IL-12活性的能力的检测法中。A.制备PHA活化的人淋巴母细胞
按照Current Protocols in Immunology，Unit 7.1所述，通过Ficoll-Hypaque梯度离心(1500rpm，45分钟)从健康供者收集白细胞(leukopac)，从白细胞再分离人外周血单核细胞(PBMC)。收集位于血液水溶液和淋巴细胞分离液交界面的PBMC，用磷酸缓冲盐水(PBS)以1500rpm离心15分钟洗涤3次，以去除Ficoll-Paque颗粒。
然后按照Current Protocols in Immunology，Unit 6.16所述，活化PBMC形成淋巴母细胞。将洗涤后的PBMC以0.5-1×106细胞/ml重悬浮于添加0.2％(v/v)PHA-P(Difco，Detroit，MI)的RPMI完全培养基(RMPI 1640培养基，10％胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素)中，在5％二氧化碳大气中于37℃培养4天。4天后，用加有0.2％(v/v)PHA-P和50U/ml重组人IL-12的RPMI完全培养基以1∶1体积将细胞培养物一分为二。通过使携带人IL-12 cDNA的表达载体转染入COS细胞(参见Kaufman等，(1991)Nucleic Acids Res.19，4484-4490)产生重组人IL-12，按照PCT/US96/01382所述纯化重组人IL-12。然后使细胞培养物再培养1-3天。收获PHA母细胞，用RPMI完全培养基洗涤2次，用95％FBS、5％DMSO以10×106细胞/ml冻存细胞。
在存在IL-2下培养1天后收集用于IL-12受体结合测定(参见B部分)的PHA母细胞，而在存在IL-2下培养3天后收集用于PHA母细胞增殖测定(参见C部分)和γ干扰素诱导测定(参见D部分)的PHA母细胞。B.IL-12受体结合测定
如下分析抗IL-12抗体抑制放射性标记的IL-12结合PHA母细胞上的IL-12受体的能力。使各种浓度的抗IL-12抗体与50-100pM125I-hIL-12(应用Bolton-Hunter标记方法制备碘化hIL-12，比活20-40mCi/mg，NEN-Dupont)在结合缓冲液(RPMI 1640，5％FBS，25mMHepes pH 7.4)中于37℃预温育1小时。如上所述分离PHA母细胞，洗涤一次，再用结合缓冲液重悬浮为2×107细胞/ml细胞密度。在抗体125I-hIL-12混合物中加入PHA母细胞(1×106细胞)，室温下温育2小时。如下分离细胞结合放射性与游离125I-hIL-12：室温下离心检测混合物30秒，吸出液体，用0.1ml结合缓冲液洗涤，然后于4℃以10,000×g离心4分钟。利用γ计数器检测细胞沉淀物的细胞结合放射性。在缺乏抗体的情况下测定总结合，而通过在所述测定中含有25nM非标记IL-12测定非特异性结合。一式二份进行温育。
在采用Y61和J695人抗IL-12抗体的IL-12受体结合测定中，两种抗体对IL-12受体结合具有相似的抑制作用。Y61抑制IL-12受体结合的IC50值约1.6×10-11M，而J695的IC50值约1.1×10-11M。C.人PHA母细胞增殖测定
评价抗IL-12抗体抑制PHA母细胞增殖的能力(IL-12刺激PHA母细胞增殖)。在微量滴定板(U形底，96孔，Costar，Cambridge，MA)的100ml RPMI完全培养基中使连续稀释的抗IL-12抗体与230pg/ml hIL-12于37℃、5％二氧化碳预温育1小时。洗涤如上所述分离的PHA母细胞一次，将其用RPMI完全培养基重悬浮为3×105细胞/ml细胞密度。在抗体/hIL-12混合物中加入PHA母细胞(100ml，3×104细胞)，于37℃、5％二氧化碳温育3天，用0.5mCi/孔(3H)-胸苷(Amersham，Arlington Heights，IL)标记4-6小时。将培养内容物通过细胞收集器(Tomtec，Orange，CT)收获在玻璃纤维滤膜上，利用液闪计数检测掺入细胞DNA中的(3H)-胸苷。一式二份检测所有试样。
存在各种浓度p70∶p40(即IL-12异源二聚体与游离p40亚单位的比率)的中和结果示于表4(参见附件A)。
分析在PHA母细胞增殖测定中的Y61人抗IL-12抗体证实，在只有IL-12 p70而没有任何过量的p40(p70∶p40比率为1∶0)的情况下，所述抗体抑制PHA母细胞增殖的IC50值约1.8×10-10M。在存在50倍过量游离p40(p70∶p40比率为1∶50)的情况下，Y61抗体抑制PHA母细胞增殖的IC50值约1.8×10-10M。该结果证实，Y61抑制母细胞增殖的能力不受存在的过量p40的影响。
在p70∶p40比率1∶0的情况下，人抗IL-12抗体J695抑制PHA母细胞增殖的IC50值约1.0×10-11M。在p70∶p40比率1∶50的情况下，该抗体抑制PHA母细胞增殖的IC50值约5.8±2.8×10-12M(n＝2)，说明过量p40对J695抗体只有轻微的抑制作用。总体结果证实，因为在L50和94的突变，J695比Y61的中和活性有改善。D.γ干扰素诱导测定
如下分析抗IL-12抗体抑制PHA母细胞产生IFNγ(IL-12刺激产生IFNγ)的能力。在微量滴定板(U形底，96孔，Costar)的100ml RPMI完全培养基中使各种浓度的抗IL-12抗体与200-400pg/ml hIL-12于37℃、5％二氧化碳预温育1小时。洗涤如上所述分离的PHA母细胞一次，将其用RPMI完全培养基重悬浮为1×107细胞/ml细胞密度。在抗体/hIL-12混合物中加入PHA母细胞(100μl，1×106细胞)，于37℃和5％二氧化碳温育18小时。温育后从各孔取出150μl无细胞上清液，应用ELISA(Endogen Interferon gamma ELISA，Endogen，Cambridge，MA)检测所产生的人IFNγ水平。一式二份检测各上清液。
人抗IL-12抗体Y61在该测定中的分析证实，Y61抑制人IFNγ产生的IC50值约1.6×10-10M，而人抗IL-12抗体J695抑制人IFNγ产生的IC50值约5.0±2,3×10-12M(n＝3)。结果证实，因为L50和L94的修饰而显著改善J695的亲和力。E.用分离的PBMC诱导产生非人IL-12
为了检测人抗hIL-12抗体与其他物种IL-12的交叉反应性，如下制备非人IL-12。对弥猴、狒狒和犬PBMC使用lymphoprep(Nycomed，Oslo，Norway)，对犬PBMC使用Accu-paque(Accurate Chemical & Sci.Corp.，Westbury，NY)，或者对大鼠PBMC使用Lympholyte-rat(AccurateChemical & Sci.Corp.，Westbury，NY)，如上所述通过密度梯度离心从新鲜的肝素化血液分离PBMC。
然后按照文献所述(D’Andrea等，(1992)J.Exp.Med.176，1387-1398，Villinger等，(1995)J.Immunol.155，3946-3954，Buettner等，(1998)Cytokine 10，241-248)，诱导PBMC产生IL-12。洗涤后的PBMC以1×106细胞/ml重悬浮于加有0.0075％(重量/体积)SAC(Pansorbin；Calbiochem-Behring Co.，La Jolla，CA)或1-5mg/ml ConA(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)和0.0075％SAC的RPMI完全培养基中，在5％二氧化碳大气下于37℃培养18小时。离心收集无细胞和无SAC培养基并通过0.2mm滤膜过滤。
从Emory University School of Medicine，Atlanta，GA获得的恒河猴IL-12为重组恒河猴IL-12。F.小鼠2D6细胞增殖测定
小鼠T细胞克隆2D6在小鼠IL-2、IL-4、IL-7和IL-12作用下增殖(Maruo等，(1997)J.Leukocyte Biol.61，346-352)。还检测到其在含有大鼠IL-12的大鼠PBMC上清液作用下的明显增殖。犬、弥猴、狒狒或人IL-12对2D6细胞没有作用。以加有50mMβ-巯基乙醇(βME)和30ng/ml小鼠IL-12的RPMI完全培养基培养小鼠2D6细胞。检测前1天，洗除小鼠IL-12，用加有βME的RPMI完全培养基温育所述细胞过夜。
在微量滴定板(U形底，96孔，Costar)的100ml RPMI完全培养基中使连续稀释的抗IL-12抗体与40pg/ml小鼠IL-12于37℃、5％二氧化碳下预温育1小时。洗涤2D6细胞一次，将其用含βME的RPMI完全培养基重悬浮为1×105细胞/ml细胞密度。在抗体/hIL-12混合物中加入2D6细胞(100μl，1×104细胞)，于37℃、5％二氧化碳温育3天，以0.5mCi/孔(3H)-胸苷标记4-6小时。收获培养内容物，利用液闪计数进行计数。一式二份检测所有样品。G.J695与非人IL-12的种间交叉反应性
应用从数个非人类物种分离的PBMC分析J695与非人IL-12的种间交叉反应性。应用如上所述的几个生物测定证实大鼠、犬、弥猴和狒狒PBMC上清液中存在非人IL-12活性，所述测定例如小鼠2D6细胞增殖测定、人PHA母细胞增殖测定和通过用针对小鼠IL-12和/或人IL-12的兔和/或羊多克隆抗体阻断非人PBMC诱导的反应的γ干扰素诱导测定。然后通过测定观测到50％抑制反应的J695抗体浓度，以相同生物测定评价人抗hIL-12抗体Y61和J695与PBMC上清液中的非人IL-12或纯化的小鼠IL-12和恒河猴IL-12的交叉反应性。种间交叉反应性结果总结于表5。结果证实，Y61和J695分别能够识别各种猴的IL-12(例如Y61能够识别弥猴IL-12和恒河猴IL-12，J695能够识别弥猴IL-12、恒河猴IL-12和狒狒IL-12)，而且J695对犬IL-12的活性约低35倍；Y61和J695均与小鼠或大鼠IL-12没有交叉反应性。H.J695的人细胞因子特异性
以竞争性ELISA测试J695的特异性，其中测试一组人细胞因子干扰可溶性J695结合固定的人IL-12的能力。该组人细胞因子包括IL-1α和IL-1β(Genzyme，Boston，MA)、IL-2(Endogen)、IL-4、IL-10、IL-17、IFNγ和TGF-β1(R & D，Minneapolis，MN)、IL-8(Calbiochem)、PDGF、IGF-I和IGF-II(Boehringer Mannheim Corp.，Indianapolis，IN)、TNFα和淋巴毒素、IL-6、可溶性IL-6受体、IL-11、IL-12 p70、IL-12 p40、M-CSF和LIF。EBI-3为非洲淋巴瘤病毒感染B淋巴细胞诱导产生的IL-12 p40相关蛋白(Devergne等，(1996)J.Virol.70：1143-1153)，它表达为人IgG-Fc嵌合体(EBI-3/Fc)。还测试了单链鲑精DNA(Sigma)。
                                                      表5种间交叉反应性数据
                                                                 IC50(M)
           抗体       小鼠IL-12      大鼠IL-12       犬IL-12     弥猴IL-12    恒河猴IL-12    狒狒IL-12     人IL-12
   名称      特异性       纯化品      PBMC上清液      PBMC上清液      PBMC上清液      纯化品     PBMC上清液   纯化品
 C17.15  大鼠-αmuIL12    3.0×10-11
 R03B03    兔-αmuIL2    1.5×10-10   6.0×10-10
 C8.6.2   小鼠-αhuIL2   1.2×10-10    1.0×10-10   2.0×10-10  5.0×10-11
   Y61    人-αhuIL2    无中和作用   2.2×10-10    1.0×10-10  1.7×10-10
  J695    人-αhuIL2    无中和作用   无中和作用   3.5×10-10   1.0×10-11    1.0×10-11   1.5×10-11  5.0×10-12
用0.1ml人IL-12(2μg/ml的0.1M碳酸盐包被缓冲液(4体积0.1M碳酸氢钠和8.5体积0.1M碳酸氢钠))于4℃包被平底ELISA免疫测定微量滴定板(96孔，高度结合，Costar)过夜。用含0.05％吐温20的PBS(PBS-T)洗涤板2次，用200μl的1mg/ml牛血清白蛋白(BSA，Sigma)的PBS-T于室温下封闭1小时，再用PBS-T洗涤2次。加入含IL-12抗体J695(100ng/ml)的样品(100μl)和各细胞因子(2nM)的含50μg/mlBSA的PBS-T(PBS-T/BSA)并于室温下温育2小时。洗涤板4次，然后与100μl小鼠抗人λ-HRP(1∶500的PBS-T/BSA，Southern Biotech.Ass.Inc.，Birmingham，AL)于室温下温育1小时。洗涤板4次，然后用ABTS(Kirkegaard & Perry Lab.，Gaithersburg，MD)在黑暗中显色20-30分钟。用微量板读数器(Molecular Devices，Menlo Park，CA)读取OD450nm。确定相对于缺乏任何可溶性细胞因子时J695结合IL-12包被板的百分结合率。
结果证实，J695结合固定的人IL-12只被人IL-12 p70阻断，在较低程度上被人IL-12 p40阻断，不被所测试的任何其他细胞因子阻断。I.对新型IL-12分子的结合
已经介绍了一种替代IL-12异源二聚体，其中p35亚单位被新型p19分子代替。应用3D同源性检索IL-6/IL-12家族成员鉴定了p19，而且以活化树突细胞合成p19。p19结合p40形成p19/p40二聚体，它具有IL-12样活性，但是其IFNγ诱导作用不如p35/p40异源二聚体有效。预测识别单独的p40、但是优选识别p70分子中的p40(例如J695和Y61，参见实施例3H)的抗体也会既中和p35/p40分子又中和p19/p40分子。实施例4：抗hIL-12抗体的体内活性
用改进的Bree等使用的模型检测IL-12抗体对IL-12诱导反应的体内作用，以研究人IL-12对弥猴外周血液学的影响(Bree等，(1994)Biochem Biophys Res.Comm.204：1150-1157)。在以前的研究中，以1μg/kg/天连续5天给予人IL-12，在24小时后使白细胞(WBC)数降低、尤其是淋巴细胞和单核细胞亚组降低。在72小时时观察到血小板数降低。在IFN-γ作用下单核细胞活化标志血浆新蝶呤水平在24小时时开始升高，在72小时时达到最高。
在人抗hIL-12抗体的第一个研究中，使平均体重5kg的15只健康弥猴镇静，并分为5组(n＝3)。第1组接受静脉内(IV)给予10mg/kg人静脉免疫球蛋白(IVIG，Miles，Eckhart，IN，用A蛋白琼脂糖凝胶纯化)。第2组接受静脉内给予1mg/kg C8.6.2(中和小鼠抗人IL-12单克隆抗体)。第3组接受静脉内给予10mg/kg C8.6.2。第4组接受静脉内给予1mg/kg Y61(人抗人IL-12抗体，从CHO细胞条件培养基纯化)。第5组接受静脉内给予10mg/kg Y61。
给予所述抗体后1小时，所有弥猴接受单次皮下(SC)注射人IL-12(1μg/kg)。在以下时间点取血试样：基线、8、24、48、96和216小时，分析全血细胞分类计数和血清化学。还检测血清人IL-12、C8.6.2抗体、Y61抗体、猴IFN-γ、猴IL-10、猴IL-6和血浆新蝶呤水平。
用IL-12和IVIG对照抗体(第1组)处理的弥猴呈现大多数预期的血液学变化，包括WBC、血小板、淋巴细胞计数和单核细胞计数降低。这样的降低在用1或10mg/kg C8.6.2或Y61抗体处理的弥猴(第2-5组)没有观测到或不明显。
通过猴IFN-γ和猴IL-10(Biosource International，Camarillo，CA)、猴IL-6(Endogen)和血浆新蝶呤(ICN Pharmaceuticals，Orangeburg，NY)特异性的ELISA分析血清或血浆样品。在任何IL-12治疗的动物，包括用IL-12和IVIG治疗的对照动物，均没有检测到IFN-γ、IL-10或IL-6。这可能是因为IL-12剂量低(仅1剂的1μg/kg)。尽管如此，IL-12和IVIG处理动物的血浆新蝶呤水平增加约3倍，但是所有C8.6.2或Y61处理动物均没有变化，包括较低剂量(1mg/kg)Y61处理的动物，说明Y61在体内有效阻断这种对IL-12的敏感反应。
在第二个研究中，通过给予外源性rhIL-12和检测J695是否能够阻断或降低通常与给予rhIL-12有关的反应，从而研究J695在弥猴体内的活性和药效学(PD)。对雄性弥猴(每组n＝3)如下给药：经隐静脉以单剂快速静脉浓注(IV)注射或背部皮肤皮下(SC)注射0.05、0.2或1.0mg/kg J695或1mg/kg静脉免疫球蛋白(IVIG)。给予J695或IVIG后1小时，所有动物接受单剂背侧皮肤皮下注射1μg/kg rhIL-12。给予J695后直到28天通过股静脉收集血样。从每个血样获得血清，并用ELISA检测IL-12、J695、IFN-γ和抗J695抗体。应用反相高效液相层析检测新蝶呤。
相对于给予J695或rhIL-12之前检测的新蝶呤水平归一化的新蝶呤水平示于图3。为了比较各组间的新蝶呤抑制作用，计算各动物新蝶呤水平归一化的曲线下面积(AUC)(表6)。新蝶呤暴露(AUC)受到剂量依赖性的抑制，相对于IVIG对照组各IV组抑制约71-93％，SC组抑制约71-100％这些结果说明，当通过IV或SC途径给药时，抑制新蝶呤作用50％需要的J695剂量(ED50)低于0.05mg/kg。
 表6：J695在弥猴体内对IL-12诱导的新蝶呤的剂量依赖性抑制
 给予IVIG或J695和rhIL-12的途径   J695剂量(mg/kg)   IVIG剂量(mg/kg)  归一化新蝶呤水平的AUC  与对照相比新蝶呤AUC下降的％
   单次IV注射后1小时SC注射       -      1.0   1745±845        0
    0.05       -    502±135       71.3
 剂量为1μg/kg的人IL-12     0.2       -    199±316       88.6
    1.0       -    128±292       92.7
  单次SC注射后1小时SC注射剂量为1μg/kg的人IL-12      -      1.0   1480±604         0
    0.05       -    426±108       71.2
    0.2       -   395±45.9       73.3
    1.0       -     0±109        100
用J695处理还防止或减少通常与给予rhIL-12有关的血液学变化(白细胞减少和血小板减少)。给予rhIL-12后24小时，淋巴细胞计数相对于对照IV和SC IVIG处理组的基线值下降约50％。所有3个剂量水平的SC或IV给予J695均防止这种降低，使得24小时时的淋巴细胞计数与基线值大致相同。给予IL-12后48小时，用IV和SC IVIG处理组的血小板计数相对于基线值下降约25％。
目标为维持高于90％效应水平的血清水平的典型剂量方案为大致每隔一周IV和SC给予1mg/kg或大致每周给予0.3mg/kg，假设重复给药有轻微累积作用。该研究证实，能够对各种猴安全给予这样剂量的抗体。在独立的毒性研究中，还发现能够安全给予各种猴高至100mg/kg的所述抗体。
J695还有效防止用嵌合IL-12处理的小鼠产生IFN-γ，所述嵌合IL-12是组合小鼠p35亚单位和人IL-12 p40亚单位的分子。与在小鼠无生物活性的人IL-12相反，这种嵌合IL-12在小鼠保持生物功能，包括诱导IFN-γ。此外，人p40亚单位允许所述嵌合分子被J695结合并中和。腹膜内注射给予雌性C3H/HeJ小鼠(10只/实验组)嵌合IL-12，每次剂量为0.05mg/kg，在第0、1、2、3和4天每天给药5次。在注射IL-12之前30秒，在第0、2和4天腹膜内注射给予剂量为0.05、0.01、0.002、0.0004、0.00008和0.000016mg/kg的J695。在第0、2和4天腹膜内注射给予剂量为0.05mg/kg的对照hulgG1γ。在第5天从小鼠取血，并用ELISA测定血清IFN-γ水平。结果证实，J695对IFN-γ产生量产生剂量依赖性抑制，ED50约0.001mg/kg。总而言之，这些结果证实，J695是体内IL-12活性的有效抑制剂。实施例5：人抗体与重组人IL-12(rhIL-12)结合的动力学分析
应用BIAcore系统(Biacore AB，Uppsala，Sweden)通过表面胞质团共振(SPR)检测捕获配体(人抗rhIL-12抗体J695，捕获在生物传感器基体上)和分析物(rhIL-12溶液)之间的实时结合作用。所述系统利用SPR的光学特性检测葡聚糖生物传感器基体中的蛋白浓度变化。蛋白质共价结合到已知浓度的葡聚糖基体上。通过葡聚糖基体注射抗体，注射抗体和固定配体之间的特异性结合使基体蛋白浓度增加，结果SPR信号发生改变。SPR信号变化记录为共振单位(RU)，而且随时间沿传感器图的y轴显示。
为了有助于山羊抗人IgG(Southern Biotechnology Associates，Cat.No.2040-01，Birmingham，AL)固定在生物传感器基体上，首先用100mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和400mM盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)活化基体上的羧基，使山羊抗人IgG通过游离胺基共价连接到葡聚糖基体上。接着，经活化的基体注射山羊抗人IgG通过活化的生物传感器注射用醋酸钠，pH 4.5稀释的35μl山羊抗人IgG(25μg/ml)，蛋白上的游离胺直接结合到活化的羧基上。注射1M乙醇胺失活未反应的基体EDC-酯。标准胺偶联试剂盒可市售获得(Biacore AB，Cat.No.BR-1000-50，Uppsala，Sweden)。
用HBS流动缓冲液(running buffer)(Biacore AB，Cat.No.BR-1001-88，Uppsala，Sweden)稀释J695，以便J695通过山羊抗人IgG捕获在基体上。为了测定rhIL-12特异性抗体结合固定的山羊抗人IgG的能力，如下进行生物测定。以流速5μl/min通过山羊抗人IgG多克隆抗体偶联的葡聚糖基体注射等份J695(25μg/ml；25μl等份)。在注射所述蛋白之前和在注射后立即使HBS缓冲液单独流经各流动池(flowcell)。基线和相当于J695注射结束后约30秒时间点之间的信号净差用来代表IgG1 J695结合量(约1200 RU)。检测直接结合可溶性rhIL-12的rhIL-12特异性抗体。用HBS流动缓冲液稀释细胞因子，以5μl/min流速通过固定蛋白基体注射50μl等份。所用rhIL-12的浓度为10、20、25、40、50、80、100、150和200nM。注射rhIL-12之前和注射后立即使单独的HBS缓冲液流经各流动池。基线信号和细胞因子注射结束后的信号的净差用来表示具体样品的结合值。在注射下一个样品之前用100mM盐酸再生生物传感器基体。为了测定解离常数(off-rate)、结合常数(on-rate)，应用BIAcore动力学评价软件(2.1版)。
与COS产生的J695相比，CHO产生的J695结合rhIL-12的典型结果示于表7。
        表7：CHO或COS产生的J695与rhIL-12的结合
来源 rhIL-12，nM 结合rhIL-12，RU 结合抗体，RU rhIL-12/AB
CHO 200 1112 1613 1.48
CHO 150 1033 1525 1.45
CHO 100 994 1490 1.43
CHO 80 955 1457 1.40
CHO 50 912 1434 1.36
CHO 40 877 1413 1.33
CHO 25 818 1398 1.25
CHO 20 773 1382 1.20
CHO 10 627 1371 0.98
来源 rhIL-12，nM 结合rhIL-12，RU 结合抗体，RU rhIL-12/AB
COS 200 1172 1690 1.49
COS 150 1084 1586 1.46
COS 100 1024 1524 1.44
COS 80 985 1489 1.42
COS 50 932 1457 1.37
COS 40 894 1431 1.34
COS 25 833 1409 1.27
COS 20 783 1394 1.20
COS 10 624 1377 1.00
应用BIAcore技术定量分析捕获J695和可溶性rhIL-12之间的分子动力学作用。进行数个独立的实验，并用商业性BIAcore数学分析软件分析结果，获得动力学速率常数，如表8所示。
表8：J695对rhIL-12的表观动力学速率常数和亲和力常数
抗体 来源 平均结合速率(M-1S-1) 平均解离速率(S-1)   平均Kd(M)
J695 CHO      3.52E+05      4.72E-05    1.34E-10
J695 COS      3.40E+05      2.61E-05    9.74E-11
CHO产生的J695(Kd＝1.34×10-10M-1)抗体和COS产生的J695(Kd＝9.74×10-11M-1)抗体作用的计算表观常数(Kd)存在微小不同。用以下公式由观测到的速率常数计算J695和rhIL-12之间的表观解离常数(Kd)∶Kd＝解离速率/结合速率。
为了测定J695和rhIL-12作用的表观解离速率常数和表观结合速率常数，应用固定量J695(2μg/ml)和不同浓度的rhIL-12进行数个结合反应。捕获J695和可溶性rhIL-12之间的实时结合作用传感器图表明，两种形式的抗体的结合相和解离相非常相似。
为了进一步评价捕获IgG1 J695 mAb结合可溶性重组细胞因子的能力，应用直接BIAcore方法。在该方法中，用IgG1 J695(2μg/ml)包被山羊抗人IgG(25μg/ml)偶联的羧甲基葡聚糖传感器表面，然后加入重组细胞因子。当可溶性rhIL-12注射通过捕获CHO或COS产生的IgG1 J695的生物传感器表面时，信号量随细胞因子溶液浓度增加而增加。所测试的任何浓度(高至1000nM)的rmIL-12(R & D Systems，Cat.No.419-ML，Minneapolis，MN)或rhIL-12均没有观测到结合。这些结果支持以下结论：IgG1 J695抗体识别rhIL-12上的不同决定簇。
表9显示了应用BIAcore的实验结果，证实人IgG1 J695 mAb只结合可溶性rhIL-12，而不结合任何一种其他重组细胞因子。
        表9：利用BIAcore技术的J695表位作图
 捕获配体COS J695  捕获配体CHO J695
  可溶性分析物
  重组人IL-12        阳性        阳性
  重组小鼠IL-12        阴性        阴性
实施例6：J695与IL-12的亲和力的进一步研究
利用BIAcore胞质团共振技术定量分析J695抗体和人IL-12之间的分子动力学作用，获得表观动力学速率常数。
BIAcore技术用来检测可溶性rhIL-12对固相捕获J695的结合。使山羊抗人IgG抗体固定在生物传感器芯片上，然后注射固定量的J695并捕获在所述表面上。加样不同浓度的rhIL-12，随时间检测不同浓度IL-12对J695的结合。假定为零级解离动力学和一级结合动力学以及J695和IL-12为简单的一对一分子作用，计算表观解离速率常数和表观结合速率常数。进行了3个独立实验，所示值为3个实验的平均值。根据这些测量结果获得表观解离速率常数(kd)和表观结合速率常数(ka)，并用其计算所述作用的Kd值(见表10)。结果表明J695对rhIL-12具有高度亲和力。
       表10：J695和人IL-12作用的动力学参数
   动力学参数             数值
       kd     3.71±0.40×10-5s-1
       ka     3.81±0.48×105M-1s-1
       Kd     9.74×10-11M(14ng/mL)
实施例7：大鼠抗小鼠白细胞介素-12的单克隆抗体C17.15的特性和中和活性
为了评价应用小鼠IL-12特异性的单克隆抗体在炎症和自身免疫小鼠模型的IL-12治疗研究与类似的人类疾病方法的相关性，研究了大鼠抗小鼠IL-12单克隆抗体C17.15与小鼠IL-12的作用。评价C17.15中和PHA母细胞增殖测定中的小鼠IL-12活性以及阻断小鼠IL-12结合细胞表面受体的能力，也评价C17.15-小鼠IL-12结合作用的动力学。
在人PHA母细胞增殖测定(参见实施例3)中，连续稀释的C17.15或大鼠IgG2a(对照抗体)与230pg/mL小鼠IL-12于37℃预温育1小时。使PHA刺激的母细胞加入到所述抗体IL-12混合物中，于37℃温育3天。然后用1μCi/孔[3H]-胸苷标记细胞6小时。收获培养物，检测掺入的[3H]-胸苷。在没有加入小鼠IL-12情况下检测背景非特异性增殖。一式二份检测所有样品。发现在该测定中C17.15对重组小鼠IL-12的IC50(M)为1.4×10-11，相比之下，观测到在相同条件下J695对重组人IL-12的IC50值为5.8×10-12(见表11)。表11：比较抗人IL-12单克隆抗体J695和大鼠抗小鼠IL-12单克隆
               抗体C17.15的特性
   抗体   表位            生物分子作用测定  受体结合测定  PHA母细胞测定
 ka，结合速率(M-1s-1)     kd，解离速率(s-1)     Kd(M)     IC50(M)      IC50(M)
   J695  Hu p40   3.81×105     3.71×10-5  9.47×10-11    1.1×10-11     5.8×10-12
  C17.15  Mu p40   3.80×105     1.84×10-4  4.80×10-10    1.5×10-10     1.4×10-11
还测定了C17.15抑制小鼠IL-12结合细胞受体的能力。连续稀释的C17.15与100pM[125I]-小鼠IL-12在结合缓冲液中于37℃预温育1小时。2D6细胞(2×106)加入到抗体/[125I]-小鼠IL-12混合物中，于室温下温育2小时。分离细胞结合放射性与游离[125I]-IL-12，测定保留的细胞结合放射性。缺乏抗体时测定标记小鼠IL-12与2D6细胞上的受体的总结合，通过在测定中包含25nM未标记的小鼠IL-12而测定非特异性结合。总结合减去非特异性结合计算得特异性结合。一式二份进行温育。结果表明，C17.15抑制小鼠IL-12结合细胞受体的IC50(M)为1.5×10-10。
通过生物分子作用分析评价C17.15对重组小鼠IL-12的亲和力。使山羊抗大鼠IgG抗体固定在生物传感器芯片上，然后注射固定量的C17.15抗体，使C17.15捕获在芯片表面上。将不同浓度的重组小鼠IL-12加样在C17.15表面上，随时间检测小鼠IL-12对固定C17.15的结合。假定为零级解离动力学和一级结合动力学以及固定C17.15和小鼠IL-12为简单的一对一分子作用，计算表观解离速率常数和表观结合速率常数。根据这些测量结果计算表观解离速率常数(kd，解离速率常数)和表观结合速率常数(ka，结合速率常数)。这些结果用来计算所述作用的Kd值。观测到重组小鼠IL-12-C17.15作用的结合速率为3.8×105M-1s-1，解离速率为1.84×10-4s-1，而Kd为4.8×10-10。
在中和小鼠IL-12活性和结合细胞表面受体中观测到的C17.15活性以及C17.15结合小鼠IL-12的动力学与相似的J695-rhIL-12作用测量结果有关。说明根据结合速率、解离速率、Kd、IC50和PHA母细胞测定，大鼠抗小鼠IL-12抗体C17.15和抗人IL-12抗体J695的作用模式几乎相同。因此，C17.15在炎症和自身免疫疾病的小鼠模型中用作J695的同源抗体，研究IL-12阻断对这些模型动物疾病的发生或发展的影响(参见实施例8)。实施例8：给予α-小鼠IL-12抗体对小鼠自身免疫性疾病或基于炎症的疾病的治疗A.α-Il-12抗体C17.15对胶原诱导型小鼠关节炎的抑制作用
已经证实了IL-12水平和类风湿性关节炎(RA)有关。例如，与健康对照相比，在RA患者的滑液中检测到IL-12 p70水平升高(Morita等(1998)Arthritis and Rheumatism.41：306-314)。因此，评价大鼠抗小鼠IL-12抗体C17.15抑制胶原诱导型小鼠关节炎的能力。
第0天用II型胶原免疫雄性DAB/1小鼠(10/组)，从第-1天(胶原免疫前1天)至第12天隔天用C17.15或对照大鼠IgG以10mg/kg腹膜内注射处理所述小鼠。临床监测所述小鼠足爪发生关节炎的情况直到第90天为止。关节炎分级为：0-正常；1-炎症局限于一个关节；2-涉及一个以上的关节、但是不是整个足爪；3-涉及整个足爪；4-足爪变形；5-所涉及关节僵硬。一个小鼠的关节炎评分为该小鼠各单独足爪的关节炎级别的总和(最大＝20)。结果表示为每组的均数±SEM。
如图4所示，结果表明C17.15处理小鼠仅在处理后第50天以后才有可检测到的关节炎评分，C17.15处理小鼠获得的最大关节炎平均评分低于IgG处理小鼠检测到的最大评分至少5倍。证实大鼠抗小鼠IL-12抗体C17.15可防止小鼠发生胶原诱导型关节炎。B.大鼠α-小鼠IL-12抗体C17.15对小鼠结肠炎的抑制作用
还证实IL-12在结肠炎的发生/病理学中具有作用。例如已经证实抗IL-12抗体抑制小鼠结肠炎模型(例如TNBS诱导型结肠炎IL-12失效小鼠(Simpson等(1998)J.Exp.Med.187(8)：1225-34)的疾病。同样证实了抗IL-12抗体抑制IL-10失效小鼠的结肠炎发生。以2个研究评价了大鼠抗小鼠IL-12抗体C17.15抑制小鼠TNBS结肠炎的能力(Davidson等(1998)J.Immunol.161(6)：3143-9)。
在第一个研究中，通过插入直肠的儿科脐动脉插管给予含2.0mgTNBS的150μL 50％乙醇溶液，在无病原体的SJL小鼠诱导结肠炎。对照小鼠只用150μL 50％乙醇溶液处理。在第11天通过尾静脉静脉内给予单剂0.75、0.5、0.25或0.1mg C17.15或0.75mg对照大鼠IgG2a，在第11和17天对小鼠称重，并在第17天进行组织学评分，从而评价所述治疗的治疗作用。用C17.15治疗小鼠的体重在抗体治疗的48小时内增加，而在治疗后第6天正常。组织学证实了C17.15的治疗作用。进一步还评价了所述治疗小鼠脾脏和结肠的CD4+T细胞的IFN-γ分泌以及所述治疗小鼠脾脏或结肠来源的巨噬细胞的IL-12水平(见表12)。
在第二个研究中，优化给药方案，在第12至14天分别用总剂量为0.1mg或0.5mgC17.15或0.1mg对照IgG2a的一半剂量治疗小鼠。发现与未治疗的对照相比，以0.1mg/小鼠或0.25mg/小鼠的剂量单剂给予C17.15仅部分改善TNBS诱导型结肠炎，而且不会显著降低CD4+T细胞体外产生IFN-γ，但是显著降低IL-12分泌。在0.5mg/小鼠或0.5mg/小鼠以上的单剂给药时观测到反应。采用所测试的最低抗体剂量并以2次分剂量注射给予(第12和14天)改进给药方案，表明多次低剂量比一次性大剂量更有效。所获得数据示于表12。
  表12：抗小鼠IL-12 mAb C17.15抑制在小鼠建立的结肠炎
  第0天诱导疾病   第11天治疗         体重(g)   脾CD4+细胞IFN-γ(U/mL)  脾巨噬细胞IL-12(pg/ml)
   第11天   第17天
  TNBS+乙醇   对照IgG2a0.75mg     16.0    15.26      3326       300
  TNBS+乙醇     C17.150.75mg     16.0    20.21      1732        0
  TNBS+乙醇     C17.150.5mg    16.36    19.94      1723        0
  TNBS+乙醇     C17.150.25mg    16.28     17.7      3618        7
  TNBS+乙醇     C17.150.1mg     16.2    17.98      3489        22
  乙醇对照       -    20.76    21.16      1135         0
按照结肠的排泄和肉眼外观评价，相隔1天以2个分剂量给予总剂量为0.1mg/小鼠或0.05mg/小鼠的C17.15单克隆抗IL-12完全逆转结肠炎。此外，该剂量方案显著下调固有层(lamina propria)T细胞产生IFN-γ和巨噬细胞产生IL-12，使得后一水平与没有TNBS结肠炎的对照乙醇处理小鼠观测到的水平相似。因此，给予TNBS结肠炎小鼠模型C17.15以剂量依赖方式逆转结肠炎的发展。C.α-IL-12抗体对小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的抑制作用
人们普遍认为IL-12在多发性硬化(MS)的发病机理中起作用。已经证实诱导的IL-12 p40信使在MS患者的急性斑中表达而在炎症性脑梗塞病变没有表达(Windhange，A.等(1995)J.Exp.Med.182：1985-1996)。得自MS患者的T细胞(而非对照T细胞)通过上调CD40L表达刺激抗原提呈细胞产生IL-12(Balashov，K.E.等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：599-603)。MS患者的IFN-γ分泌增加，体外用α-IL-12抗体可阻断IFN-γ分泌(Balashov，K.E.等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：599-603)。在MS患者检测到血清IL-12水平升高，但是其他神经疾病血清IL-12水平没有升高(Nicoletti，F.等(1996)J.Neuroimmunol.70：87-90)。已经证实IL-12产生增加与MS患者疾病活动有关(Cormabella，M.等(1998)J.Clin.Invest.102：671-678)。研究了IL-12在小鼠多发性硬化模型、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的发病机理中的作用(Leonard，J.P.等(1995)J.Exp.Med.181：281-386；Banerjee，S.等(1998)Arthritis Rheum.(1998)41：S33；以及Segal，B.M.等(1998)J.Exp.Med.187：537-546)。已知该模型疾病由TH1亚群T细胞诱导产生。所以，评价α-IL-12抗体预防急性EAE发生的能力。
发现α-IL-12抗体能够抑制急性EAE发生、抑制发生后的疾病，并减轻用自身抗原髓鞘碱性蛋白免疫小鼠的复发的严重程度(Banerjee，S.等(1998)Arthritis Rheum.(1998)41：S33)。α-IL-12抗体在小鼠的治疗的有益作用在停止治疗后持续2个月以上。还证实抗IL-12抗体抑制过继转移致脑炎T细胞接受小鼠的疾病(Leonard，J.P.等(19950 J.Exp.Med.181：281-386)。实施例9：J695的临床药理学
在双盲交叉研究中，对64名健康男性对象给予剂量逐渐递增的J695或安慰剂。在给药前和给药后0.25h检测补体片段C3a证实补体系统没有活化。只有观测到伴随感染症状的对象的CRP和纤维蛋白原水平升高。
所有对象均存活，而且J695的总体耐受性非常好。没有1例因为副作用事件(AE)而停止治疗。观测到的最常见AE是头痛和普通感冒/气管炎，这两种副作用均不是严重病症。
1名研究对象为33岁单身男性，在研究开始就患有滴状牛皮癣。按照随机研究设计，该患者随机接受经SC给予的5mg/kg J695。给予所述抗体之前10天，所述患者仅在手臂和腿上有散在小丘疹病变。给予所述抗体时，该患者出现红斑变红、增厚而且角化过度。给予J695后1周，所述患者述说皮肤症状改善，包括病变变平和脱皮减轻。第二次给予J695(5mg/kg IV)不久，在没有任何局部治疗的情况下患者的皮肤完全没有牛皮癣病变。在第二次给予抗体后随着预期的J695清除再次出现覆盖有白色鳞屑的红斑。实施例10：比较2个CHO细胞系产生的J695
为了重组表达J695，通过磷酸钙介导的转染将编码所述抗体重链和所述抗体轻链的重组表达载体导入dhfr-CHO细胞中(Urlaub，G.和Chasin，L.A.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220)。在所述重组表达载体中的抗体重链基因和轻链基因各自与增强子/启动子调节元件(例如产生自SV40、CMV、腺病毒等的调节元件，例如CMV增强子/AdMLP启动子调节元件或SV40增强子/AdMLP启动子调节元件)有效连接，以驱动高水平转录所述基因。所述重组表达载体还携带有DHFR基因，DHFR基因允许用甲氨蝶呤选择/扩增选择所述载体转染的CHO细胞。
使150个编码人抗体J695肽序列的表达载体的微生物溶解于50ml圆锥形管的2.7ml水中。加入300μL 2.5M氯化钙，将该DNA混合物滴加到50ml圆锥形管的3ml 2×HEPES缓冲盐水中。涡旋5秒并室温下温育20分钟后，使1mL溶液均匀分散在各板中(仍然为F12培养基)，使该板于37℃温育4小时。吸去液体，在每个板中加入2ml10％DMSO的F12。DMSO震荡持续1分钟，然后在各板中加入5mlPBS稀释DMSO。用PBS洗板2次，然后加入10ml加有H/T和5％FBS(选择表达DHFR的细胞)的αMEM，37℃温育过夜。以每孔100个细胞密度将细胞接种入96孔板，各板于37℃、5％二氧化碳温育2周，每周更换培养基1次。
最后一次更换培养基后5天，1∶50稀释培养上清液，并用人IgGγ链特异性ELISA进行测试。使产生最高ELISA信号的克隆从96孔板转移到1.5ml/孔αMEM+5％透析血清的12孔板中。3天后进行另一个人IgGγ链特异性ELISA，12个具有最高活性的克隆分入αMEM+5％透析血清和20nM MTX中。细胞系031898218在存在20nM MTX下生长，而没有任何明显细胞死亡或生长率降低，在3日测定中产生1.8μg/ml hIgG。031898218在含MTX的培养基中生长的T-25培养物平均产生J695为11.9μg/ml。称为ALP903的细胞系适应在无血清条件下悬浮生长，产生7.5pg J695/细胞/24h。
ALP903细胞最初用αMEM/5％FBS/20nM MTX培养基选择后，再用20nM MTX传代。所述细胞在100nM MTX选择下培养，然后在随后的30天中用500nM MTX传代2次。此时所述培养物产生32μgJ695/mL/24h。通过有限稀释亚克隆培养物。亚克隆218-22在96孔板中2天产生16.5μg/mL J695，在12孔板中2天产生50.3μg/mL J695。用αMEM/5％透析FBS/500nM MTX培养克隆218-22 38天，然后使其如上所述进行无血清旋转培养。称为ALP 905的无血清悬浮培养的平均细胞特异性产量为58pg/细胞/24h。
第一种用来产生J695的细胞系(ALP 903)由培养物产生J695抗体的产量低于第二种细胞系ALP 905。为了保证ALP 905产生的J695在功能上与ALP 903产生的J695相同，评价了两批抗体的IL-12亲和力、阻断IL-12结合细胞受体的能力、抑制IL-12诱导IFN-γ的能力以及抑制IL-12介导的PHA母细胞增殖的能力。
通过表面胞质团共振研究(BIAcore分析)检测结合IL-12的动力学速率常数，从而确定ALP 903和ALP 905批J695对IL-12的亲和力。以3个实验(如实施例3所述)测定ALP 903和ALP 905批J695抗体结合rhIL-12的解离速率常数(kd)和结合速率常数(ka)。通过解离速率常数除以结合速率常数计算获得结合IL-12的亲和力Kd。计算各个实验的Kd，然后平均。结果表明ALP 903和ALP 905批J695测得的动力学参数和结合rhIL-12的亲和力非常类似：ALP 903批的计算Kd为1.19±0.22×10-10M，而ALP 905批的Kd为1.49±0.47×10-10M(见表13)。
评价ALP 903和ALP 905产生的J695阻断rhIL-12结合PHA活化的人T淋巴母细胞上的IL-12受体的能力(参见实施例3)。测试以10倍连续稀释的起始浓度为1×10-8的各J695样品。使所述抗体与50pM[125I]-人IL-12在结合缓冲液中于37℃预温育1小时。PHA母细胞加入抗体/[125I]-人IL-12混合物中，室温下温育2小时。通过离心和洗涤步骤分离细胞结合放射性和游离[125I]-IL-12，计算抑制百分率。利用4参数曲线拟合由抑制曲线确定J695的IC50值，并通过2个独立实验证实。一式二份进行温育。两批J695的结果非常相似(见表13)。
评价ALP 903和ALP 905细胞产生的J695抑制rhIL-12诱导体外PHA活化的人淋巴母细胞产生IFN-γ的能力。连续稀释的J695与200pg/mL rhIL-12于37℃预温育1小时。加入PHA淋巴母细胞，37℃温育18小时。温育后取出无细胞上清液，用ELISA测定人IFN-γ水平。利用4参数曲线拟合用抑制曲线的IC50值对抗体浓度作图。结果证实两批J695抑制IFN-γ产生的能力非常相似。
体外PHA母细胞增殖测定用于测定ALP 903和ALP 905 J695对rhIL-12的中和能力。连续稀释的每种类型的J695与230pg/mL人IL-12于37℃预温育1小时。然后加入PHA母细胞，37℃温育3天。然后用1γCi/孔[3H]-胸苷标记细胞6小时。收获培养物，测量掺入的[3H]-胸苷。在缺乏rhIL-12的情况下测定非特异性增殖(背景)。发现ALP 903和ALP 905 J695的IC50值非常相似，见表13。
ALP 903批和ALP 905批J695抗体的中和rhIL-12活性、阻断IL-12结合细胞表面受体和结合rhIL-12中的活性没有明显不同，所以这两种不同细胞类型产生的抗体是等同物。
            表13：比较ALP 903和ALP 905批的J695的特性
  抗体   ka，结合速率(M-1，s-1)   kd，解离速率(s-1)      Kd(M)  RB测定IC50(M) PHA母细胞测定IC50(M) IFN-γ测定IC50(M)
ALP 903J695 3.75×105 4.46×10-5 1.19×10-10 3.4×10-11 5.5×10-12 5.8×10-12
ALP 905J695 3.91×105 5.59×10-5 1.49×10-10 3.0×10-11 4.4×10-12 4.3×10-12
等同实施方案
本领域技术人员知道或者最多用常规实验就能够确定本文所述本发明具体实施方案的许多等同实施方案。这样的等同实施方案包括在以下权利要求书内。说明书的核苷酸和氨基酸序列表
    序列表<110>Jochen，Salfeld等<120>结合人IL-2的人抗体及其生产方法<130>BBI-093CPPC<140><141><150>60/126,603<151>1999年3月25日<160>675<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>6<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><223>位置1的Xaa可为His或Ser<220><223>位置4的Xaa可为Tyr或His<220><223>位置6的Xaa可为Tyr，Asn或Thr<400>1Xaa Gly Ser Xaa Asp Xaa1               5<210>2<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><223>位置2的Xaa可为Ser或Thr<220><223>位置4的Xaa可为Asp或Glu<220><223>位置5的Xaa可为Ser，Arg或Lys<220><223>位置6的Xaa可为Ser，Gly或Tyr<220><223>位置7的Xaa可为Leu，Phe，Thr或Ser<220><223>位置8的Xaa可为Arg，Ser，Thr，Trp或His<220><223>位置9的Xaa可为Gly或Pro<220><223>位置10的Xaa可为Ser，Thr，Ala或Leu<220><223>位置11的Xaa可为Arg，Ser，Met，Thr或Leu<220><223>位置12的Xaa可为Val，Ile，Thr，Met或Leu<400>2Gln Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1               5                  10<210>3<211>17<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>3Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1               5                  10                  15Gly<210>4<211>7<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><223>位置1的Xaa可为Gly或Tyr<220><223>位置3的Xaa可为Asp或Ser<220><223>位置4的Xaa可为Gln或Asn<400>4Xaa Asn Xaa Xaa Arg Pro Ser1               5<210>5<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><223>Xaa为Ser或Glu<400>5Phe Thr Phe Ser Xaa Tyr Gly Met His1               5<210>6<211>13<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><223>位置1的Xaa可为Ser或Thr<220><223>位置3的Xaa可为Ser或Gly<220><223>位置4的Xaa可为Arg或Ser<220><223>位置8的Xaa可为Gly或Val<220><223>位置9的Xaa可为Ser或Ala<220><223>位置10的Xaa可为Asn，Gly或Tyr<220><223>位置11的Xaa可为Thr或Asp<220><223>位置13的Xaa可为Lys或His<400>6Xaa Gly Xaa Xaa Ser Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa1               5                  10<210>7<211>115<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><223>位置6的Xaa可为Gln或Glu<220><223>位置16的Xaa可为Arg或Gly<220><223>位置31的Xaa可为Ser或Glu<220><223>位置84的Xaa可为Lys或Asn<220><223>位置97的Xaa可为Thr，Ala或Lys<220><223>位置98的Xaa可为Thr或Lys<220><223>位置99的Xaa可为Ser或His<220><223>位置102的Xaa可为Tyr或His<220><223>位置104的Xaa可为Tyr，Asn或Thr<400>7Gln Val Gln Leu Val Xaa Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Xaa1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Asx
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Xaa Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Xaa Xaa Xaa Gly Ser Xaa Asp Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
        100                 105                 110Val Ser Ser
    115<210>8<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><223>位置1的Xaa可为Ser或Gln<220><223>位置2的Xaa可为Tyr或Ser<220><223>位置13的Xaa可为Thr或Ala<220><223>位置23和91的Xaa可为Ser或Thr<220><223>位置25的Xaa可为Gly或Ser<220><223>位置26的Xaa可为Arg或Ser<220><223>位置30的Xaa可为Gly或Val<220><223>位置31的Xaa可为Ser或Ala<220><223>位置35的Xaa可为Lys或His<220><223>位置51的Xaa可为Gly或Lys<220><223>位置54的Xaa可为Gln或Asn<220><223>位置79的Xaa可为Val或Leu<220><223>位置93的Xaa可为Asp或Glu<220><223>位置94的Xaa可为Ser，Arg或Lys<220><223>位置95的Xaa可为Ser，Gly或Tyr<220><223>位置96的Xaa可为Leu，Phe，Thr或Ser<220><223>位置97的Xaa可为Arg，Ser，Thr，Trp或His<220><223>位置98的Xaa可为Gly或Pro<220><223>位置99的Xaa可为Ser，Thr，Ala或Leu<220><223>位置100的Xaa可为Arg，Ser，Met，Thr或Leu<220><223>位置101的Xaa可为Val，Ile，Thr，Met或Leu<220><223>位置32的Xaa可为Asn，Gly或Tyr<220><223>位置33的Xaa可为Thr或Asp<220><223>位置53的Xaa可为Asp或Ser<400>8Xaa Xaa Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Xaa Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Xaa Gly Xaa Xaa Ser Asn Ile Xaa Xaa Xaa
         20                  25                  30Xaa Val Xaa Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Xaa Asn Xaa Xaa Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Xaa Gln65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa
             85                  90                  95Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
        100                 105                 110<210>9<211>6<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><223>位置2的Xaa可为Gly，Val，Cys或His<220><223>位置3的Xaa可为Ser或Thr<220><223>位置4的Xaa可为His，Thr，Val，Arg，或Ile<220><223>位置5的Xaa可为Asp或Ser<220><223>位置6的Xaa可为Asn，Lys，Ala，Thr，Ser，Phe，Trp，或His<400>9His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1               5<210>10<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><223>位置4的Xaa可为Asp或Ser<220><223>位置5的Xaa为任何氨基酸<220><223>位置6的Xaa可为Gly，Asp，Gln，Leu，Phe，Arg，His，Asn或Tyr<400>10Gln Ser Tyr Xaa Xaa Xaa Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>11<211>17<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><223>位置1的Xaa可为Phe，Thr或Tyr<220><223>位置3的Xaa可为Arg或Ala<220><223>位置5的Xaa可为Asp，Ser，Glu或Ala<220><223>位置6的Xaa可为Gly或Arg<220><223>位置8的Xaa为任何氨基酸<220><223>位置10的Xaa可为Tyr或Glu<400>11Xaa Ile Xaa Tyr Xaa Xaa Ser Xaa Lys Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys1               5                  10                  15Gly<210>12<211>7<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><223>位置1的Xaa可为Gly，Tyr，Ser，Thr，Asn或Gln<400>12Xaa Asn Asp Gln Arg Pro Ser1               5<210>13<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><223>位置4和5的Xaa为任何氨基酸<220><223>位置6的Xaa可为Tyr或His<220><223>位置7的Xaa可为Gly，Met，Ala，Asn或Ser<400>13Phe Thr Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Met His1               5<210>14<211>13<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><223>位置9的Xaa可为Ser，Cys，Arg，Asn，Asp或Thr<220><223>位置10的Xaa可为Asn，Met或Ile<220><223>位置11的Xaa可为Thr，Tyr，Asp，His，Lys或Pro<400>14Ser Gly Gly Arg Ser Asn Ile Gly Xaa Xaa Xaa Val Lys1               5                  10<210>15<211>114<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><223>位置30的Xaa可为Ser或Glu<220><223>位置83的Xaa可为Lys或Asn<220><223>位置5的Xaa可为Gln或Glu<400>15Gln Val Gln Val Xaa Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser1               5                  10                  15Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Tyr Gly
         20                  25                  30Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
     35                  40                  45Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
 50                  55                  60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu65                  70                  75                  80Gln Met Xaa Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys
             85                  90                  95Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
        100           105           110Ser Ser<210>16<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><223>位置1的Xaa可为Ser或Gln<220><223>位置2的Xaa可为Tyr或Ser<220><223>位置13的Xaa可为Thr或Ala<220><223>位置25的Xaa可为Gly或Ser<220><223>位置51和95的Xaa可为Gly或Tyr<220><223>位置79的Xaa可为Val或Leu<400>16Xaa Xaa Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Xaa Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Xaa Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn
         20                  25                  30Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Xaa Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Xaa Gln65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Arg Xaa Thr
             85                  90                  95His Pro Ala Leu Leu Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
        100                 105                 110<210>17<211>6<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>17His Gly Ser His Asp Asn1               5<210>18<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>18Gln Ser Tyr Asp Arg Gly Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>19<211>17<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>19Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1               5                  10                  15Gly<210>20<211>7<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>20Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser1               5<210>21<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>21Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His1               5<210>22<211>13<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>22Ser Gly Gly Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Lys1               5                  10<210>23<211>115<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>23Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Lys Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
        100                 105                 110Val Ser Ser
    115<210>24<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>24Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Arg Ser Trp Ile Gly Ser Asn
         20              25                      30Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Val Gln65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Arg Gly Thr
             85                  90                  95His Pro Ala Leu Leu Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
        100                 105                 110<210>25<211>6<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>25His Gly Ser His Asp Asn1               5<210>26<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>26Gln Ser Tyr Asp Arg Tyr Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>27<211>17<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>27Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1               5                  10                  15Gly<210>28<211>7<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>28Tyr Asn Asp Gln Arg Pro Ser1               5<210>29<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>29Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His1               5<210>30<211>13<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>30Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Lys  1               5                   10<210>31<211>115<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>31Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55              60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Lys Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
        100                 105                 110Val Ser Ser
    115<210>32<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>32Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn
         20                  25                  30Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Tyr Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Arg Tyr Thr
             85                  90                  95His Pro Ala Leu Leu Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
        100                 105                 110<210>33<211>115<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>33Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Thr Thr Ser Gly Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
        100                 105                 110Val Ser Ser
    115<210>34<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>34Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn
         20                  25                  30Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Val Gln65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu
             85                  90                  95Arg Gly Ser Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
        100                 105                 110<210>35<211>115<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>35Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Glyl               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Lys Ser Gly Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
        100                 105                 110Val Ser Ser
    115<210>36<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><223>位置32的Xaa为Gly或Tyr<400>36Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Xaa
         20                  25                  30Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu
             85                  90                  95Ser Gly Ser Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
        100                 105                 110<210>37<211>115<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>37Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Thr Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
        100                 105                 110Val Ser Ser
    115<210>38<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>38Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn
         20                  25                  30Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Val Gln65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu
             85                  90                  95Arg Gly Ser Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
        100                 105                 110<210>39<211>115<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>39Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Thr Thr Ser Gly Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
        100                 105                 110Val Ser Ser
    115<210>40<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>40Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn
         20                  25                  30Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Val Gln65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Arg Gly Phe
             85                  90                  95Thr Gly Ser Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
        100                 105                 110<210>41<211>115<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>41Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Thr Thr Ser Gly Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
        100                 105                 110Val Ser Ser
    115<210>42<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>42Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn
         20                  25                  30Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Val Gln65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu
             85                  90                  95Trp Gly Ser Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
        100                 105                 110<210>43<211>115<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>43Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Thr Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
        100                 105                 110Val Ser Ser
    115<210>44<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>44Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn
         20                  25                  30Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Val Gln65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Arg Gly Phe
             85                  90                  95Thr Gly Ser Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
        100                 105                 110<210>45<211>115<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>45Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Thr Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
        100                 105                 110Val Ser Ser
    115<210>46<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>46Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn
         20                  25                  30Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Val Gln65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu
             85                  90                  95Trp Gly Ser Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
        100                 105                 110<210>47<211>115<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>47Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Lys Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
        100                 105                 110Val Ser Ser
    115<210>48<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>48Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn
         20                  25                  30Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Val Gln65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Asp Lys Gly Phe
             85                  90                  95Thr Gly Ser Ser Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
        100                 105                 110<210>49<211>115<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>49Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Lys Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
        100                 105                 110Val Ser Ser
    115<210>50<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>50Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn
         20                  25                  30Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Asp Lys Gly Phe
             85                  90                  95Thr Gly Ser Ser Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
        100                 105                 110<210>51<211>115<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>51Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Thr Thr His Gly Ser His Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
        100                 105                 110Val Ser Ser
    115<210>52<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>52Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn
         20                  25                  30Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Val Gln65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu
             85                  90                  95Trp Gly Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
        100                 105                 110<210>53<211>115<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>53Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Thr Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
        100                 105                 110Val Ser Ser
    115<210>54<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>54Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Arg Ser Asn Ile Val Ser Asn
         20                  25                  30Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Val Gln65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Arg Gly Phe
             85                  90                  95Thr Gly Ser Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
        100                 105                 110<210>55<211>115<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>55Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Thr Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
        100                 105                 110Val Ser Ser
    115<210>56<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>56Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Arg Ser Asn Ile Val Ser Asn
         20                  25                  30Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Val Gln65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Arg Gly Phe
             85                  90                  95Thr Gly Ala Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
        100                 105                 110<210>57<211>115<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>57Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Lys Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
        100                 105                 110Val Ser Ser
    115<210>58<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>58Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn
         20                  25                  30Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Val Gln65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Asp Lys Gly Phe
             85                  90                  95Thr Gly Ser Ser Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
        100                 105                 110<210>59<211>115<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>59Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Lys Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
        100                 105                 110Val Ser Ser
    115<210>60<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>60Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln  1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn
         20                  25                  30Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Val Gln65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Glu Arg Gly Phe
             85                  90                  95Thr Gly Ser Met Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
        100                 105                 110<210>61<211>115<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>61Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Lys Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
        100                 105                 110Val Ser Ser
    115<210>62<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>62Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn
         20                  25                  30Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Val Gln65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Arg Gly Thr
             85                  90                  95His Pro Leu Thr Ile Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
        100                 105                 110<210>63<211>115<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>63Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Lys Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
        100                 105                 110Val Ser Ser
    115<210>64<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>64Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn
         20                  25                  30Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Val Gln65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Arg Gly Ser
             85                  90                  95His Pro Ala Leu Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
        100                 105                 110<210>65<211>115<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>65Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Lys Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
        100                 105                 110Val Ser Ser
    115<210>66<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>66Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn
         20                  25                  30Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Val Gln65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Arg Gly Thr
             85                  90                  95His Pro Leu Thr Met Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
        100                 105                 110<210>67<211>115<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>67Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly GlyVal Val Gln Pro Gly Arg1               5              10                     15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Lys Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
        100                 105                 110Val Ser Ser
    115<210>68<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>68Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Glnl               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn
         20                  25                  30Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Arg Gly Thr
             85                  90                  95His Pro Leu Thr Met Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
        100                 105                 110<210>69<211>115<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>69Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90              95Lys Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
        100                 105                 110Val Ser Ser
    115<210>70<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>70Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn
         20                  25                  30Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Arg Gly Thr
             85                  90                  95His Pro Ala Leu Leu Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
        100                 105                 110<210>71<211>115<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>71Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Glu Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Lys Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
        100                 105                 110Val Ser Ser
    115<210>72<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>72Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn
         20                  25                  30Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln 65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Arg Gly Thr
             85                  90                  95His Pro Ala Leu Leu Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
        100                 105                 110<210>73<211>115<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>73Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Lys Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
        100                 105                 110Val Ser Ser
    115<210>74<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>74Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn
         20                  25                  30Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Tyr Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Arg Gly Thr
             85                  90                  95His Pro Ala Leu Leu Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
        100                 105                 110<210>75<211>115<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>75Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Lys Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
        100                 105                 110Val Ser Ser
    115<210>76<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>76Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn
         20                  25                  30Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Arg Tyr Thr
             85                  90                  95His Pro Ala Leu Leu Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
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               10<210>548<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>548Gln Ser Tyr Asp Cys Gly Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>549<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>549Gln Ser Tyr Asp Ser Gly Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>550<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>550Gln Ser Tyr Asp Tyr Gly Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>551<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>551Gln Ser Tyr Asp Arg Gly Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>552<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>552Gln Ser Tyr Asp Asn Gly Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>553<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>553Gln Ser Tyr Asp Gln Gly Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>554<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>554Gln Ser Tyr Asp Thr Gly Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>555<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>555Gln Ser Tyr Asp Gly Gly Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>556<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>556Gln Ser Tyr Asp Ala Gly Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>557<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>557Gln Ser Tyr Asp Val Gly Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>558<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>558Gln Ser Tyr Asp Met Gly Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>559<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>559Gln Ser Tyr Asp Leu Gly Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>560<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>560Gln Ser Tyr Asp Ile Gly Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>561<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>561Gln Ser Tyr Asp Pro Gly Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>562<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>562Gln Ser Tyr Asp Trp Gly Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>563<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>563Gln Ser Tyr Asp Arg Asp Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>564<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>564Gln Ser Tyr Asp Arg Cys Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>565<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>565Gln Ser Tyr Asp Arg Ser Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>566<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>566Gln Ser Tyr Asp Arg Tyr Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>567<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>567Gln Ser Tyr Asp Arg His Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>568<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>568Gln Ser Tyr Asp Arg Arg Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>569<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>569Gln Ser Tyr Asp Arg Asn Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>570<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>570Gln Ser Tyr Asp Arg Gln Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>571<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>571Gln Ser Tyr Asp Arg Thr Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>572<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>572Gln Ser Tyr Asp Arg Gly Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>573<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>573Gln Ser Tyr Asp Arg Ala Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>574<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>574Gln Ser Tyr Asp Arg Val Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>575<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>575Gln Ser Tyr Asp Arg Leu Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>576<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>576Gln Ser Tyr Asp Arg Ile Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>577<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>577Gln Ser Tyr Asp Arg Pro Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>578<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>578Gln Ser Tyr Asp Arg Trp Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>579<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>579Gln Ser Tyr Asp Arg Phe Thr His Pro Ala Leu Leu1               5                  10<210>580<211>48<212>DNA<213>合成构建物<223>位置16-34的核苷酸可被任何核苷酸取代，使得随机核苷酸占所述序列的12％<400>580tgtcccttgg ccccagtagt catagctccc actggtcgta cagtaata             48<210>581<211>35<212>DNA<213>合成构建物<400>581gacacctcga tcagcggata acaatttcac acagg                           35<210>582<211>15<212>DNA<213>合成构建物<400>582tggggccaag ggaca                                                 15<210>583<211>45<212>DNA<213>合成构建物<400>583attcgtccta taccgttcta ctttgtcgtc tttccagacg ttagt                45<210>584<211>18<212>DNA<213>合成构建物<400>584attcgtccta taccgttc                                              18<210>585<211>66<212>DNA<213>合成构建物<223>位置28-42的核苷酸可被任何核苷酸取代，使得随机核苷酸占所述序列的12％<400>585ggtcccagtt ccgaagaccc tcgaacccct caggctgctg tcatatgact ggcagtaata 60gtcagc                                                            66<210>586<211>15<212>DNA<213>合成构建物<400>586tggggccaag ggaca                                                  15<210>587<211>24<212>DNA<213>合成构建物<400>587tgaagagacg gtgaccattg tccc                                        24<210>588<211>16<212>DNA<213>合成构建物<400>588gacacctcga tcagcg                                                 16<210>589<211>48<212>DNA<213>合成构建物<400>589gagtcattct cgacttgcgg ccgcacctag gacggtcagc ttggtccc              48<210>590<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>590Gln Ser Tyr Asp Arg Gly Phe Thr Gly Ser Met Val1               5                  10<210>591<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><223>N为任何核苷酸而S为脱氧胞嘧啶或脱氧胍的NNS序列的随机密码子编码Xaa<400>591Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Thr Gly Ser Met Val1               5                  10<210>592<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><223>N为任何核苷酸而S为脱氧胞嘧啶或脱氧胍的NNS序列的随机密码子编码Xaa<400>592Gln Ser Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Met Val1               5                  10<210>593<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><223>N为任何核苷酸而S为脱氧胞嘧啶或脱氧胍的NNS序列的随机密码子编码Xaa<400>593Gln Ser Tyr Asp Arg Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1               5                  10<210>594<211>100<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>594Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His
 20                          25                  30Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Gly Arg Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
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        100<210>595<211>100<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>595Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His
         20                  25                  30Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
     35                  40                  45Gly Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
 50                  55                  60Ser Val Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Lys Asn Thr65                  70                  75                  80Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr
             85                  90                  95Tyr Cys Ala Arg
        100<210>596<211>100<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>596Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His
         20                  25                  30Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
     35                  40                  45Gly Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
 50                  55                  60Ser Val Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Lys Asn Thr65                  70                  75                  80Met Tyr Leu Gln Met Ser Asn Leu Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr
             85                  90                  95Tyr Cys Ala Arg
        100<210>597<211>100<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>597Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His
         20                  25                  30Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
     35                  40                  45Gly Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
 50                  55                  60Ser Val Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Lys Asn Thr65                  70                  75                  80Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr
             85                  90                  95Tyr Cys Ala Arg
        100<210>598<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>598Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
         20                  25                  30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Lys<210>599<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>599Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
         20                  25                  30Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>600<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>600G1u Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Val Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
         20                  25                  30Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ser Leu Ile Ser Trp Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
             85                  90              95Ala Lys<210>601<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>601Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
         20                  25                  30Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>602<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>602Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
         20                  25                  30Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>603<211>100<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>603Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser
         20                  25                  30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ala Asn Ser Tyr Ala Thr Ala Tyr Ala Ala
 50                  55                  60Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr65                  70                  75                  80Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
             85                  90                  95Tyr Cys Thr Arg
        100<210>604<211>100<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>604Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
         20                  25                  30Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
 50                  55                  60Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr65                  70                  75                  80Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
             85                  90                    95Tyr Cys Thr Thr
        100<210>605<211>100<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>605Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
         20                  25                  30Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Gly Arg Ile Glu Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
 50                  55                  60Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr65                  70                  75                  80Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
             85                  90                  95Tyr Cys Thr Thr
        100<210>606<211>100<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>606Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
         20                  25                  30Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
 50                  55                  60Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr65                  70                  75                  80Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
             85                  90                  95Tyr Cys Thr Thr
        100<210>607<211>100<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>607Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
         20                  25                  30Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Ala
 50                  55                  60Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr65                  70                  75                  80Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
             85                  90                  95Tyr Cys Thr Thr
        100<210>608<211>100<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>608Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
         20                  25                  30Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
 50                  55                  60Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr65                  70                  75                  80Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
             85                  90                  95Tyr Cys Thr Thr
        100<210>609<211>100<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>609Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Lys Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
         20                  25                  30Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
 50                  55                  60Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr65                  70                  75                  80Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
             85                  90                  95Tyr Cys Thr Thr
        100<210>610<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>610Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Pro Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn His
         20                  25                  30Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ser Tyr Ile Ser Gly Asp Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Ser Pro Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90              95Val Lys<210>611<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>611Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn His
         20                  25                  30Tyr Thr Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ser Tyr Ser Ser Gly Asn Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Val Lys<210>612<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>612Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser
         20                  25                  30Asp Met Asn Trp Val His Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ser Arg Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Thr Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Val Arg<210>613<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>613Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser
         20                  25                  30Asp Met Asn Trp Ala Arg Lys Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ser Arg Thr His Tyr Val Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Arg Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Ser Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Lys Asn Arg Arg Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Val Arg<210>614<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>614Thr Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Glu Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser
         20                  25                  30Asp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ser Arg Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Phe Leu Tyr65                  70                  75                  80Gln Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Val Arg<210>615<211>97<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>615Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
         20                  25                  30Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ser Ala Asn Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys
 50                  55                  60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65                  70                  75                  80Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
             85                  90                  95Arg<210>616<211>97<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>616Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
         20                  25                  30Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
 50                  55                  60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu65                  70                  75                  80Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
           85                   90                  95Arg<210>617<211>97<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>617Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
 50                  55                  60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65                  70                  75                  80Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
             85                  90                  95Arg<210>618<211>97<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>618Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
 50                  55                  60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65                  70                  75                  80Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
             85                  90                  95Arg<210>619<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>619Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Lys<210>620<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>620Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val
     35                  40                  45Ser Ala Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Val Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Val Lys<210>621<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>621Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val
     35                  40                  45Ser Ala Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Val Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Val Lys<210>622<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>622Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val
     35                  40                  45Ser Ala Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Gly Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>623<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>623Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Lys<210>624<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>624Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>625<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>625Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                   30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>626<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>626Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>627<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>627Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>628<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>628Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
         85                  90                  95Ala Arg<210>629<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>629Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>630<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>630Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>631<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>631Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>632<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>632Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>633<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>633Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val
     35                  40                  45Ser Ala Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Val Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Val Lys<210>634<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>634Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val
     35                  40                  45Ser Ala Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>635<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>635Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>636<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>636Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95A1a Arg<210>637<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>637Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Lys<210>638<211>97<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>638Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ser Ala Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys
 50                  55                  60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65                  70                  75                  80Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
             85                  90                  95Arg<210>639<211>98<212>PRT<2l3>人(Homo sapiens)<400>639Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>640<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>640Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Leu Arg Ala Arg Leu Cys Ile Thr Val
           85                  90                  95Arg Glu<210>641<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>641Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>642<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>642Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>643<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>643Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>644<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>644Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>645<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>645Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Arg Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>646<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>646Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>647<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>647Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>648<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>648Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Gly Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>649<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>649Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                   30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Lys<210>650<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>650Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Lys<210>651<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>651Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>652<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>652Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
         85                 90                  95Ala Lys<210>653<211>95<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>653Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Arg Lys
             85                  90                  95<210>654<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>654Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>655<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>655Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Ala
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Thr Asn Thr Leu Phe65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>656<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>656Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>657<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>657Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>658<211>97<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>658Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
 50                  55                  60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65                  70                  75                  80Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
             85                  90                  95Arg<210>659<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>659Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>660<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>660Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>661<211>97<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>661Glu Asp Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Pro Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Val Leu His Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
     35                  40                  45Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Met
 50                  55                  60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr Leu65                  70                  75                  80Gln Met Asn Ser Leu Ile Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
             85                  90                  95Arg<210>662<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>662Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
     35                  40                  45Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>663<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>663Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
     35                  40                  45Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>664<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>664Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>665<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>665Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
     35                  40                  45Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Met
 50                  55                  60Lys Gly Gln Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Thr Arg<210>666<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>666Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Ala Arg<210>667<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>667Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
         20                  25                  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35                  40                  45Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
 50                  55                  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
             85                  90                  95Thr Thr<210>668<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>668Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln1               5                  10                  15Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
         20                  25                  30Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln65                  70                  75                  80Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu
             85                  90                  95Ser Ala<210>669<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>669Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln1               5                  10                  15Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asp Met Gly Asn Tyr
         20                  25                  30Ala Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Glu Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Trp65                  70                  75                  80Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Ala Trp Asp Thr Ser Pro
             85                  90                  95Arg Ala<210>670<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>670Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
         20                  25                  30Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln65                  70                  75                  80Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
             85                  90                  95Asn Gly<210>671<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>671Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
         20                  25                  30Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg65                  70                  75                  80Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
             85                  90                  95Ser Gly<210>672<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>672Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Glu Ala Pro Arg Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
         20                  25                  30Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln65                  70                  75                  80Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
             85                  90                  95Asn Gly<210>673<211>99<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>673Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
         20                  25                  30Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
     35                  40                  45Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Gln Phe
 50                  55                  60Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu65                  70                  75                  80Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ala Trp Asp Asn Ser
             85                  90                  95Leu Asn Ala<210>674<211>99<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>674Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
         20                  25                  30Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
     35                  40                  45Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
 50                  55                  60Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu65                  70                  75                  80Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
             85                  90                  95Leu Ser Gly<210>675<211>98<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>675Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln1               5                  10                  15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn
         20                  25                  30Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
     35                  40                  45Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
 50                  55                  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Val Gln65                  70                  75                  80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu
             85                  90                  95Arg Gly

Claims (147)

1.一种结合人IL-12的分离的人抗体或其抗原结合部分，其中所述人抗体为中和抗体。
2.一种选择性突变的人IL-12抗体，该抗体包括：
使人抗体或其抗原结合部分在优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点进行选择性突变，因为突变产生的增强活性的氨基酸残基而使其结合人IL-12。
3.一种选择性突变的人IL-12抗体，该抗体包括：
使人抗体或其抗原结合部分在优选选择性诱变位点进行选择性突变，因为突变产生的增强活性的氨基酸残基而使其结合人IL-12。
4.权利要求2的选择性突变的人IL-12抗体，其中使所述人抗体或其抗原结合部分在1个以上优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点进行选择性突变，从而具有增强活性的氨基酸残基。
5.权利要求4的选择性突变的人IL-12抗体，其中使所述人抗体或其抗原结合部分在3个以下的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点发生选择性突变。
6.权利要求4的选择性突变的人IL-12抗体，其中所述人抗体或其抗原结合部分在2个以下的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点发生选择性突变。
7.权利要求2的选择性突变的人IL-12抗体，其中使所述人抗体或其抗原结合部分选择性突变，以便获得目标特异性亲和力水平，所述目标水平优于用噬菌体展示技术选择抗相同抗原的抗体可获得的水平。
8.权利要求7的选择性突变的人IL-12抗体，其中所述选择性突变的人抗体还保持至少一种需要特性。
9.一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它结合人IL-12，并且根据表面胞质团共振测定，它以0.1s-1或0.1s-1以下的koff速率常数与人IL-12解离，或者它以1×10-6M或1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖。
10.权利要求9的分离的人抗体或其抗原结合部分，根据表面胞质团共振测定，它以1×10-2s-1或1×10-2s-1以下的koff速率常数与人IL-12解离，或者以1×10-7M或1×10-7M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖。
11.权利要求9的分离的人抗体或其抗原结合部分，根据表面胞质团共振测定，它以1×10-3s-1或1×10-3s-1以下的koff速率常数与人IL-12解离，或者以1×10-8M或1×10-8M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖。
12.权利要求9的分离的人抗体或其抗原结合部分，根据表面胞质团共振测定，它以1×10-4s-1或1×10-4s-1以下的koff速率常数与人IL-12解离，或者以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖。
13.权利要求9的分离的人抗体或其抗原结合部分，根据表面胞质团共振测定，它以1×10-5s-1或1×10-5s-1以下的koff速率常数与人IL-12解离，或者以1×10-10M或1×10-10M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖。
14.权利要求9的分离的人抗体或其抗原结合部分，根据表面胞质团共振测定，它以1×10-5s-1或1×10-5s-1以下的koff速率常数与人IL-12解离，或者以1×10-11M或1×10-11M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖。
15.一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以下特性：
a)以1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)具有包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的重链CDR3；以及
c)具有包含SEQ ID NO：2氨基酸序列的轻链CDR3。
16.权利要求15的分离的人抗体或其抗原结合部分，它还具有包含SEQ ID NO：3氨基酸序列的重链CDR2；以及具有包含SEQ ID NO：4氨基酸序列的轻链CDR2。
17.权利要求15的分离的人抗体或其抗原结合部分，它还具有包含SEQ ID NO：5氨基酸序列的重链CDR1；以及具有包含SEQ ID NO：6氨基酸序列的轻链CDR1。
18.权利要求16的分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有包含SEQ ID NO：7氨基酸序列的重链可变区；以及具有包含SEQ ID NO：8氨基酸序列的轻链可变区。
19.一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以下特性：
a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)具有包含SEQ ID NO：9氨基酸序列的重链CDR3；以及
c)具有包含SEQ ID NO：10氨基酸序列的轻链CDR3。
20.权利要求19的分离的人抗体或其抗原结合部分，它还具有包含SEQ ID NO：11氨基酸序列的重链CDR2；以及具有包含SEQ ID NO：12氨基酸序列的轻链CDR2。
21.权利要求19的分离的人抗体或其抗原结合部分，它还具有包含SEQ ID NO：13氨基酸序列的重链CDR1；以及具有包含SEQ ID NO：14氨基酸序列的轻链CDR1。
22.权利要求19的分离的人抗体，它具有包含SEQ ID NO：15氨基酸序列的重链可变区；以及具有包含SEQ ID NO：16氨基酸序列的轻链可变区。
23.一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它
a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)具有包含SEQ ID NO：17氨基酸序列的重链CDR3；以及
c)具有包含SEQ ID NO：18氨基酸序列的轻链CDR3。
24.权利要求23的分离的人抗体或其抗原结合部分，它还具有包含SEQ ID NO：19氨基酸序列的重链CDR2；以及包含SEQ ID NO：20氨基酸序列的轻链CDR2。
25.权利要求23的分离的人抗体或其抗原结合部分，它还具有包含SEQ ID NO：21氨基酸序列的重链CDR1；以及包含SEQ ID NO：22氨基酸序列的轻链CDR1。
26.一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有包含SEQ IDNO：23氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO：24氨基酸序列的轻链可变区。
27.权利要求26的分离的人抗体，它包含选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定区的重链恒定区。
28.权利要求27的分离的人抗体，其中所述抗体重链恒定区是IgG1。
29.权利要求26的分离的人抗体，它为Fab片段。
30.权利要求26的分离的人抗体，它为F(ab’)2片段。
31.权利要求26的分离的人抗体，它为单链Fv片段。
32.一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它：
a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)具有包含选自SEQ ID NO：404-SEQ ID NO：469的氨基酸序列的重链CDR3；或
c)具有包含选自SEQ ID NO：534-SEQ ID NO：579的氨基酸序列的轻链CDR3。
33.权利要求32的分离的人抗体或其抗原结合部分，它还具有包含选自SEQ ID NO：335-SEQ ID NO：403的氨基酸序列的重链CDR2；或包含选自SEQ ID NO：506-SEQ ID NO：533的氨基酸序列的轻链CDR2。
34.权利要求32的分离的人抗体或其抗原结合部分，它还具有包含选自SEQ ID NO：288-SEQ ID NO：334的氨基酸序列的重链CDR1；或包含选自SEQ ID NO：470-SEQ ID NO：505的氨基酸序列的轻链CDR1。
35.一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有包含SEQ IDNO：23氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO：24氨基酸序列的轻链可变区。
36.权利要求35的分离的人抗体，它包含选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定区的重链恒定区。
37.权利要求36的分离的人抗体，其中所述抗体重链恒定区是IgG1。
38.权利要求35的分离的人抗体，它为Fab片段。
39.权利要求35的分离的人抗体，它为F(ab’)2片段。
40.权利要求35的分离的人抗体，它为单链Fv片段。
41.一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它：
a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)具有包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链CDR3；以及
c)具有包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的轻链CDR3。
42.权利要求41的分离的人抗体或其抗原结合部分，它还具有包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链CDR2；以及包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的轻链CDR2。
43.权利要求41的分离的人抗体或其抗原结合部分，它还具有包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链CDR1；以及包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的轻链CDR1。
44.一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有包含SEQ IDNO：31氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO：32氨基酸序列的轻链可变区。
45.权利要求44的分离的人抗体，它包含选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定区的重链恒定区。
46.权利要求45的分离的人抗体，其中所述抗体重链恒定区是IgG1。
47.权利要求44的分离的人抗体，它为Fab片段。
48.权利要求44的分离的人抗体，它为F(ab’)2片段。
49.权利要求44的分离的人抗体，它为单链Fv片段。
50.一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它：
a)以1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)包括含SEQ ID NO：1氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO：3氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO：5氨基酸序列的重链CDR1，或者为其在接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO：1氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO：3氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO：5氨基酸序列的重链CDR1的抗体高10倍以下；以及
c)包括含SEQ ID NO：2氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ ID NO：4氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO：6氨基酸序列的轻链CDR1，或者为其在接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO：2氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ ID NO：4氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO：6氨基酸序列的轻链CDR1的抗体高10倍以下。
51.一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它：
a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)包括含SEQ ID NO：9氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO：11氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO：13氨基酸序列的重链CDR1，或者为其在接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO：9氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO：11氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO：13氨基酸序列的重链CDR1的抗体高10倍以下；以及
c)包括含SEQ ID NO：10氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ IDNO：12氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO：14氨基酸序列的轻链CDR1，或者为其在接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO：10氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ ID NO：12氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO：14氨基酸序列的轻链CDR1的抗体高10倍以下。
52.一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它：
a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)包括含SEQ ID NO：17氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ IDNO：19氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO：21氨基酸序列的重链CDR1，或者为其在接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO：17氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO：19氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO：21氨基酸序列的重链CDR1的抗体高10倍以下；以及
c)包括含SEQ ID NO：18氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ IDNO：20氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO：22氨基酸序列的轻链CDR1，或者为其在接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO：18氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ ID NO：20氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO：22氨基酸序列的轻链CDR1的抗体高10倍以下。
53.一种分离的核酸，它编码包含SEQ ID NO：17氨基酸序列的重链CDR3。
54.权利要求53的分离的核酸，它编码抗体重链可变区。
55.权利要求54的分离的核酸，其中所述抗体重链可变区的CDR2包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列。
56.权利要求54的分离的核酸，其中所述抗体重链可变区的CDR1包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列。
57.权利要求56的分离的核酸，它编码包含SEQ ID NO：23氨基酸序列的抗体重链可变区。
58.一种分离的核酸，它编码包含SEQ ID NO：18氨基酸序列的轻链CDR3。
59.权利要求58的分离的核酸，它编码抗体轻链可变区。
60.权利要求59的分离的核酸，其中所述抗体轻链可变区的CDR2包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。
61.权利要求59的分离的核酸，其中所述抗体轻链可变区的CDR1包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列。
62.权利要求61的分离的核酸，它编码包含SEQ ID NO：24氨基酸序列的抗体轻链可变区。
63.一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它：
a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；
b)包括含SEQ ID NO：25氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ IDNO：27氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO：29氨基酸序列的重链CDR1，或者为其在接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO：25氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO：27氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO：29氨基酸序列的重链CDR1的抗体高10倍以下；以及
c)包括含SEQ ID NO：26氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ IDNO：28氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO：30氨基酸序列的轻链CDR1，或者为其在接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO：26氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ ID NO：28氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO：30氨基酸序列的轻链CDR1的抗体高10倍以下。
64.一种分离的核酸，它编码包含SEQ ID NO：25氨基酸序列的重链CDR3。
65.权利要求64的分离的核酸，它编码抗体重链可变区。
66.权利要求65的分离的核酸，其中所述抗体重链可变区的CDR2包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列。
67.权利要求65的分离的核酸，其中所述抗体重链可变区的CDR1包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列。
68.权利要求67的分离的核酸，它编码包含SEQ ID NO：31氨基酸序列的抗体重链可变区。
69.一种分离的核酸，它编码包含SEQ ID NO：26氨基酸序列的轻链CDR3。
70.权利要求69的分离的核酸，它编码抗体轻链可变区。
71.权利要求70的分离的核酸，其中所述抗体轻链可变区的CDR2包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列。
72.权利要求70的分离的核酸，其中所述抗体轻链可变区的CDR1包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列。
73.权利要求72的分离的核酸，它编码包含SEQ ID NO：32氨基酸序列的抗体重链可变区。
74.一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以下特性：
a)它结合人IL-12，并且根据表面胞质团共振测定，它以0.1s-1或0.1s-1以下的koff速率常数与人IL-12解离，或者它以1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖；
b)具有包含选自VH3种系家族成员的氨基酸序列的重链可变区，其中所述重链可变区因为接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基；
c)具有包含选自Vλ1种系家族成员的氨基酸序列的轻链可变区，其中所述轻链可变区因为接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基。
75.一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以下特性：
a)它结合人IL-12，并且根据表面胞质团共振测定，它以0.1s-1或0.1s-1以下的koff速率常数与人IL-12解离，或者它以1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖；
b)具有包含选自SEQ ID NO：595-667的氨基酸序列的重链可变区，其中所述重链可变区因为接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基；
c)具有包含选自SEQ ID NO：669-675的氨基酸序列的轻链可变区，其中所述轻链可变区因为接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基。
76.一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以下特性：
a)它结合人IL-12，并且根据表面胞质团共振测定，它以0.1s-1或0.1s-1以下的koff速率常数与人IL-12解离，或者它以1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖；
b)具有包含COS-3种系氨基酸序列的重链可变区，其中所述重链可变区因为接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基；
c)具有包含DPL8种系氨基酸序列的轻链可变区，其中所述轻链可变区因为接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基。
77.一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以下特性：
a)它结合人IL-12，并且根据表面胞质团共振测定，它以0.1s-1或0.1s-1以下的koff速率常数与人IL-12解离，或者它以1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖；
b)具有包含选自VH3种系家族成员的氨基酸序列的重链可变区，其中所述重链可变区包含结构类似于其他VH3种系家族成员CDR2的CDR2和结构类似于其他VH3种系家族成员CDR1的CDR1，而且其中所述重链可变区因为接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基；
c)具有包含选自Vλ1种系家族成员的氨基酸序列的轻链可变区，其中所述轻链可变区包含结构类似于其他Vλ1种系家族成员CDR2的CDR2和结构类似于其他Vλ1种系家族成员CDR1的CDR1，而且其中所述轻链可变区因为接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基。
78.权利要求74、75、76或77的分离的人抗体或其抗原结合部分，其中所述突变位于重链CDR3。
79.权利要求74、75、76或77的分离的人抗体或其抗原结合部分，其中所述突变位于轻链CDR3。
80.权利要求74、75、76或77的分离的人抗体或其抗原结合部分，其中所述突变位于重链CDR2。
81.权利要求74、75、76或77的分离的人抗体或其抗原结合部分，其中所述突变位于轻链CDR2。
82.权利要求74、75、76或77的分离的人抗体或其抗原结合部分，其中所述突变位于重链CDR1。
83.权利要求74、75、76或77的分离的人抗体或其抗原结合部分，其中所述突变位于轻链CDR1。
84.一种重组表达载体，它编码：
a)具有包含SEQ ID NO：31氨基酸序列的可变区的抗体重链；以及
b)具有包含SEQ ID NO：32氨基酸序列的可变区的抗体轻链。
85.一种宿主细胞，该宿主细胞中导入了权利要求84的重组表达载体。
86.一种合成结合人IL-12的人抗体的方法，该方法包括在培养基中培养权利要求85的宿主细胞，直到所述细胞合成结合人IL-12的人抗体为止。
87.一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它中和人IL-12以及至少一种选自狒狒IL-12、狨IL-12、黑猩猩IL-12、弥猴IL-12和恒河猴IL-12的其他灵长类IL-12的活性，但是它不中和小鼠IL-12的活性。
88.一种药用组合物，它包含权利要求1-52、74-83和87任一项的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。
89.一种组合物，它包含权利要求1-52、74-83和87任一项的抗体或其抗原结合部分和另一种物质。
90.权利要求89的组合物，其中所述另一种物质是治疗药物。
91.权利要求90的组合物，其中所述治疗药物选自布地奈德，表皮生长因子，皮质类固醇类，环孢菌素、柳氮磺吡啶，氨基水杨酸盐，6-巯基嘌呤，硫唑嘌呤，甲硝唑，脂氧合酶抑制剂，美沙拉秦，奥沙拉秦，巴柳氮，抗氧化剂，血栓烷抑制剂，IL-1受体拮抗剂，抗IL-1β单克隆抗体，抗IL-6单克隆抗体，生长因子，弹性蛋白酶抑制剂，吡啶基咪唑化合物，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDFG的抗体或激动剂，CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或它们的配体的抗体，甲氨蝶呤，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，霉酚酸莫非替克，来氟米特，NSAID类，布洛芬，皮质类固醇类，强的松龙，磷酸二酯酶抑制剂，腺苷激动剂，抗血栓形成剂，补体抑制剂，肾上腺素能药物，IRAK，NIK，IKK，p38，MAP激酶抑制剂，IL-1β转化酶抑制剂，TNFα转化酶抑制剂，T细胞信号转导抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，柳氮磺吡啶，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，血管紧张素转化酶抑制剂，可溶性细胞因子受体，可溶性p55 TNF受体，可溶性p75 TNF受体，sIL-1RL，sIL-1RII，sIL-6R，抗炎细胞因子，IL-4，IL-10，IL-11，IL-13和TGFβ。
92.权利要求90的治疗组合物，其中所述治疗药物选自抗TNF抗体及其抗体片段、TNFR-Ig构建物、TACE抑制剂、PDE4抑制剂、皮质类固醇类、布地奈德、地塞米松、柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸、奥沙拉秦、IL-1β转化酶抑制剂、IL-1ra、酪氨酸激酶抑制剂、6-巯基嘌呤和IL-11。
93.权利要求90的治疗组合物，其中所述治疗药物选自皮质类固醇类，强的松龙，甲基强的松龙，硫唑嘌呤，环磷酰胺，环孢菌素，甲氨蝶呤，4-氨基吡啶，替扎尼定，干扰素-β1a，干扰素-β1b，Copolymer 1，高压氧，静脉免疫球蛋白，clabribine，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、GF和PDFG的抗体或激动剂，CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或它们的配体的抗体，甲氨蝶呤，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，霉酚酸莫非替克，来氟米特，NSAID类，布洛芬，皮质类固醇类，强的松龙，磷酸二酯酶抑制剂，腺苷激动剂，抗血栓形成剂，补体抑制剂，肾上腺素能药物，IRAK，NIK，IKK，p38或MAP激酶抑制剂，IL-1β转化酶抑制剂，TACE抑制剂，T细胞信号转导抑制剂，激酶抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，柳氮磺吡啶，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，血管紧张素转化酶抑制剂，可溶性细胞因子受体，可溶性p55TNF受体，可溶性p75 TNF受体，sIL-1RI，sIL-1RII，sIL-6R，sIL-13R，抗-P7s，p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)，抗炎细胞因子，IL-4，IL-10，IL-13和TGFβ。
94.一种抑制人IL-12活性的方法，该方法包括使人IL-12与权利要求44的抗体接触，从而抑制人IL-12活性。
95.一种抑制患有其中IL-12活性有害的疾病的病人的人IL-12活性的方法，该方法包括给予所述病人权利要求44的抗体，从而抑制所述病人的人IL-12活性。
96.权利要求95的方法，其中所述病症选自类风湿性关节炎、骨关节炎、少年慢性关节炎、Lyme关节炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、脊柱关节病、关节僵硬性脊椎炎、系统性狼疮红斑、节段性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎症性肠病、多发性硬化、胰岛素依赖型糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变应性疾病、牛皮癣、皮炎性硬皮病、甲状腺炎、移植物抗宿主病、器官移植排斥反应、与器官移植有关的急性或慢性免疫病、肉样瘤病、动脉硬化、弥散性血管内凝血、Kawasaki病、Grave病、肾病综合征、慢性疲劳综合征、结节性多动脉炎、Wegener肉芽肿病、Henoch-Schoenlein紫癜、肾脏显微镜下血管炎、慢性活动性肝炎、Sjogren综合征、眼色素层炎、脓毒病、脓毒性休克、脓毒病综合征、成人呼吸窘迫综合征、恶病质、感染性疾病、寄生虫病、获得性免疫缺陷综合征、急性横贯性脊髓炎、重症肌无力、慢性舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬化、纤维性肺病、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭和心肌梗死。
97.权利要求95的方法，其中所述病症为节段性回肠炎。
98.权利要求95的方法，其中所述病症为多发性硬化。
99.权利要求95的方法，其中所述病症为类风湿性关节炎。
100.一种改善抗体或其抗原结合部分的活性以达到预定目标活性的方法，该方法包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；
b)从H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94选择优选选择性诱变位点；
c)分别使选定的优选选择性诱变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得第一组突变抗体或其抗原结合部分；
d)评价第一组突变抗体或其抗原结合部分的活性，以确定单一选择性诱变位点的突变是否产生具有预定目标活性或部分目标活性的抗体或其抗原结合部分；
e)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中逐步组合显示具有改进活性的各个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分；
f)评价所述组合抗体或其抗原结合部分的活性，以确定组合抗体或其抗原结合部分是否具有预定目标活性或部分目标活性；
g)如果步骤d)或f)没有获得具有预定目标活性的抗体或其抗原结合部分，或者获得只具有部分活性的抗体，则所述方法还包括使选自H35、H50、H53、H54、H95、H96、H97、H98、L30A和L96的其他氨基酸残基突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得第二组突变抗体或其抗原结合部分；
h)评价第二组突变抗体或其抗原结合部分的活性，以确定选自H35、H50、H53、H54、H95、H96、H97、H98、L30A和L96的单个氨基酸残基的突变是否产生具有预定目标活性或部分活性的抗体或其抗原结合部分；
i)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中逐步组合显示具有改进活性的步骤g)的各个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分；
j)评价所述组合抗体或其抗原结合部分的活性，以确定组合抗体或其抗原结合部分是否具有预定目标活性或部分目标活性；
k)如果步骤h)或j)没有获得具有预定目标活性的抗体或其抗原结合部分，或者获得只具有部分活性的抗体，则所述方法还包括使选自H33B、H52B和L31A的其他氨基酸残基突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得第三组突变抗体或其抗原结合部分；
l)评价第三组突变抗体或其抗原结合部分的活性，以确定选自H33B、H52B和L31A的单一氨基酸残基的突变是否产生具有预定目标活性或部分活性的抗体或其抗原结合部分；
m)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中逐步组合显示具有改进活性的步骤k)的各个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分；
n)评价所述组合抗体或其抗原结合部分的活性，以确定组合抗体或其抗原结合部分是否具有预定目标活性，由此获得具有预定目标活性的抗体或其抗原结合部分。
101.一种改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，该方法包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；
b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点；
c)分别使所述优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；
e)如果没有获得所需要的抗体活性，则对至少一个其他优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点重复步骤b)至d)；
f)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中逐步组合显示具有改进活性的各个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及
g)评价所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
102.权利要求101的方法，其中接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96。
103.权利要求101的方法，其中超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93。
104.权利要求101的方法，其中所述优选位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94。
105.权利要求101的方法，其中所述接触位点选自L50和L94。
106.一种改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，该方法包括；
a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；
b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点；
c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；
e)如果没有获得所需要的抗体活性，则对至少一个其他优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点重复步骤b)至d)；
f)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合显示具有改进活性的各个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及
g)评价所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
107.权利要求106的方法，其中接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96。
108.权利要求106的方法，其中超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93。
109.权利要求106的方法，其中优选选择性诱变位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94。
110.权利要求106的方法，其中所述接触位点选自L50和L94。
111.一种改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，该方法包括：
a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；
b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点；
c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，而且以合适表达系统表达所述抗体系列；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性，其中所述特性为所述抗体需要保留的特性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。
112.权利要求111的方法，其中接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96，而其中所述其他特性选自保留与其他蛋白的非交叉反应性、保留与其他人体组织的非交叉反应性、保留表位识别和接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
113.权利要求111的方法，其中所述超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93，而其中所述其他特性选自保留与其他蛋白的非交叉反应性、保留与其他人体组织的非交叉反应性、保留表位识别和接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
114.权利要求111的方法，其中所述优选选择性诱变位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94，而其中所述其他特性选自保留与其他蛋白的非交叉反应性、保留与其他人体组织的非交叉反应性、保留表位识别和接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
115.权利要求111的方法，其中所述接触位点选自L50和L94，而其中所述其他特性选自保留与其他蛋白的非交叉反应性、保留与其他人体组织的非交叉反应性、保留表位识别和接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
116.一种改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，该方法包括：
a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；
b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点；
c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性，其中所述特性为需要保留的特性，直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分；
f)对至少一个其他优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点重复步骤a)至e)；
g)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合至少2个单独显示具有改进活性和至少一种保留特性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及
h)评价所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。
117.权利要求116的方法，其中接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96，而其中所述其他特性选自保留与其他蛋白的非交叉反应性、保留与其他人体组织的非交叉反应性、保留表位识别和接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
118.权利要求116的方法，其中所述超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93，而其中所述其他特性选自保留与其他蛋白的非交叉反应性、保留与其他人体组织的非交叉反应性、保留表位识别和接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
119.权利要求116的方法，其中所述优选选择性诱变位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93和L94，而其中所述其他特性选自保留与其他蛋白的非交叉反应性、保留与其他人体组织的非交叉反应性、保留表位识别和接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
120.权利要求116的方法，其中所述接触位点选自L50和L94，而其中所述其他特性选自保留与其他蛋白的非交叉反应性、保留与其他人体组织的非交叉反应性、保留表位识别和接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
121.一种改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，该方法包括：
a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；
b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的接触位点或超突变位点；
c)分别使所述选定的接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性，其中所述特性为所述抗体需要保留的特性，直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。
122.权利要求121的方法，其中接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96，而其中所述其他特性选自保留与其他蛋白的非交叉反应性、保留与其他人体组织的非交叉反应性、保留表位识别和接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
123.权利要求121的方法，其中所述超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93，而其中所述其他特性选自保留与其他蛋白的非交叉反应性、保留与其他人体组织的非交叉反应性、保留表位识别和接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
124.权利要求121的方法，其中所述接触位点选自L50和L94，而其中所述其他特性选自保留与其他蛋白的非交叉反应性、保留与其他人体组织的非交叉反应性、保留表位识别和接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
125.一种改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，该方法包括：
a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；
b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点；
c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性，其中所述特性为需要保留的特性，直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分；
f)对至少一个其他优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点重复步骤a)至e)；
g)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合至少2个单独显示具有改进活性和至少一种保留特性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及
h)评价所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。
126.权利要求125的方法，其中接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96，而其中所述其他特性选自保留与其他蛋白的非交叉反应性、保留与其他人体组织的非交叉反应性、保留表位识别和接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
127.权利要求125的方法，其中所述超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93，而其中所述其他特性选自保留与其他蛋白的非交叉反应性、保留与其他人体组织的非交叉反应性、保留表位识别和接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
128.权利要求125的方法，其中所述优选选择性诱变位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93和L94，而其中所述其他特性选自保留与其他蛋白的非交叉反应性、保留与其他人体组织的非交叉反应性、保留表位识别和接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
129.权利要求125的方法，其中所述接触位点选自L50和L94，而其中所述其他特性选自保留与其他蛋白的非交叉反应性、保留与其他人体组织的非交叉反应性、保留表位识别和接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
130.一种改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，该方法包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；
b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；
c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性变化；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
131.一种改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，该方法包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；
b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；
c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)对至少一个其他CDR位点重复步骤b)至d)，所述CDR位点既不是b)项选定的位点，也不是H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96位点；
f)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合至少2个单独显示具有改进活性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及
g)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
132.一种改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，该方法包括：
a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；
b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；
c)分别使所述选定接触或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性变化，直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
133.一种改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，该方法包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分，所述抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；
b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；
c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分并以非噬菌体展示系统表达；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)对至少一个其他CDR位点重复步骤b)至d)，所述CDR位点既不是b)项选定的位点，也不是H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94位点；
f)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合至少2个单独显示具有改进活性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及
g)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和其他特性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
134.一种改善抗体或其抗原结合部分的活性而不影响其他特性的方法，该方法包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；
b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；
c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性变化，其中需要保留所述特性，直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和保留特性的抗体或其抗原结合部分。
135.一种改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，该方法包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；
b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；
c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性变化；
f)对至少一个其他CDR位点重复步骤b)至e)，所述CDR位点既不是b)项选定的位点，也不是H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96位点；
g)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合至少2个单独显示具有改进活性但是不影响至少一种其他特性的增强活性的氨基酸残基，形成具有至少一种保留特性的组合抗体或其抗原结合部分；以及
h)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种特性的保留情况，直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。
136.改善抗体或其抗原结合部分的亲和力的方法，该方法包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分，所述抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；
b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；
c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分并以非噬菌体展示系统表达；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性的变化；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
137.一种改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，该方法包括：
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分，所述抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；
b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；
c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分并以非噬菌体展示系统表达；
d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种其他特性的保留情况，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)对至少一个其他CDR位点重复步骤b)至d)，所述CDR位点既不是b)项选定的位点，也不是H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96位点；
f)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合至少2个单独显示具有改进活性而不影响至少一种其他特性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及
g)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种其他特性的保留情况，直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种其他保留特性的抗体或其抗原结合部分。
138.权利要求130、131、132、133、134、135、136或137的方法，其中所述其他特性选自保留与其他蛋白的非交叉反应性、保留与其他人体组织的非交叉反应性、保留表位识别和接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
139.一种检测人IL-12的方法，该方法包括使人IL-12与权利要求1-52、74-83和87中任一项的抗体或其抗原结合部分接触，以便检测人IL-12。
140.权利要求139的方法，其中在体外检测人IL-12。
141.权利要求139的方法，其中为诊断目的检测生物样品中的人IL-12。
142.权利要求1-52、74-83和87中任一项的抗体或其抗原结合部分用于治疗的用途。
143.权利要求1-52、74-83和87中任一项的抗体或其抗原结合部分用于生产治疗其中IL-12活性有害的病症的药物的用途。
144.权利要求143的用途，其中所述病症选自类风湿性关节炎、骨关节炎、少年慢性关节炎、Lyme关节炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、脊柱关节病、关节僵硬性脊椎炎、系统性狼疮红斑、节段性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎症性肠病、多发性硬化、胰岛素依赖型糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变应性疾病、牛皮癣、皮炎性硬皮病、甲状腺炎、移植物抗宿主病、器官移植排斥反应、与器官移植有关的急性或慢性免疫病、肉样瘤病、动脉硬化、弥散性血管内凝血、Kawasaki病、Grave病、肾病综合征、慢性疲劳综合征、结节性多动脉炎、Wegener肉芽肿病、Henoch-Schoenlein紫癜、肾脏显微镜下血管炎、慢性活动性肝炎、Sjogren综合征、眼色素层炎、脓毒病、脓毒性休克、脓毒病综合征、成人呼吸窘迫综合征、恶病质、感染性疾病、寄生虫病、获得性免疫缺陷综合征、急性横贯性脊髓炎、重症肌无力、慢性舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬化、纤维性肺病、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭和心肌梗死。
145.权利要求143的用途，其中所述病症为节段性回肠炎。
146.权利要求143的用途，其中所述病症为多发性硬化。
147.权利要求143的用途，其中所述病症为类风湿性关节炎。
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