CZ20013434A3 - Lidské protilátky, které se váľí na lidský IL-12, a způsoby jejich produkce - Google Patents

Lidské protilátky, které se váľí na lidský IL-12, a způsoby jejich produkce Download PDF

Info

Publication number
CZ20013434A3
CZ20013434A3 CZ20013434A CZ20013434A CZ20013434A3 CZ 20013434 A3 CZ20013434 A3 CZ 20013434A3 CZ 20013434 A CZ20013434 A CZ 20013434A CZ 20013434 A CZ20013434 A CZ 20013434A CZ 20013434 A3 CZ20013434 A3 CZ 20013434A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
antigen
antibody
amino acid
activity
binding portion
Prior art date
Application number
CZ20013434A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ303725B6 (cs
Inventor
Jochen G. Salfeld
Michael Roguska
Michael Paskind
Subhashis Banerjee
Daniel E. Tracey
Michael White
Zehra Kaymakcalan
Boris Labkovsky
Paul Sakorafas
Stuart Friedrich
Angela Myles
Geertruida M. Veldman
Amy Venturini
Nicholas W. Warne
Angela Widom
John G. Elvin
Alexander R. Duncan
Elaine J. Derbyshire
Sara Carmen
Stephen Smith
Thor Las Holtet
Fou Sarah L. Du
Original Assignee
Knoll Gmbh
Genetics Institute Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22425740&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ20013434(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Knoll Gmbh, Genetics Institute Inc. filed Critical Knoll Gmbh
Publication of CZ20013434A3 publication Critical patent/CZ20013434A3/cs
Publication of CZ303725B6 publication Critical patent/CZ303725B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/16—Central respiratory analeptics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A61P5/16—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4 for decreasing, blocking or antagonising the activity of the thyroid hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)

Description

Lidské protilátky, které se váží na lidský IL-12j a způsoby jejich produkce
Oblast techniky
Vynález se týká lidských protilátek neutralizujících aktivitu lidského imunoglobulinu 12.
Dosavadní stav techniky
Lidský interleukin 12 (IL-12) byl v poslední době charakterizován jako cytokin s výjimečnou strukturou a pleiotropickými účinky (popisuje se v publikaci Kobayashi, et al., (1989) J. Exp. Med. 170: 827-845, Seder, et al./ (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. 90: 10188-10192, Ling, et al., (1995)
J. Exp. Med. 154: 116-127, Podlaski, et al., (1992) Arch.
Biochem. Biophys. 294: 230-237). IL-12 má důležitou úlohu v patologii vážných onemocnění, které zahrnují imunitní a zánětlivé odezvy. Shrnutí skutečností o IL-12, o jeho biologických aktivitách a o jeho úloze při onemocněni se nachází v publikaci Gately et al., (1998), Ann. Rev. Immunol. 16: 495-521.
Strukturou je IL-12 heterodimerový protein obsahující podjednotku o molekulové hmotnosti 35 000 (p35) a podjednotku o molekulové hmotnosti 40 000 (p40), které jsou spojeny dohromady disulfidovým můstkem (označeno jako „podjednotka p70) . Heterodimerový protein se primárně produkoval buňkami prezentujícími antigen, jako jsou monocyty, makrofágy a dendritické buňky. Tyto typy buněk také vylučují ve vztahu k podjednotce p70 nadbytek podjednotky p40. Podjednotky p40 a p35 nejsou geneticky příbuzné a ani nevykazují biologickou aktivitu, ačkoli homodimer p40 může fungovat jako antagonista IL-12.
Funkčně IL-12 hraje centrální roli při regulaci rovnováhy mezi antigenem specifickým pro pomocné buňky T typ 1 (Thl) a typ 2 (Th2). Buňky Thl a Th2 řídí iniciaci a progresi • * · · • · i
• ·
autoimunnich poruch a IL-12 má kritickou úlohu při regulaci diferenciace a maturace lymfocytů Thi. Cytokiny uvolněné buňkami Thl jsou zánětlivé a zahrnují interferon y(IFNy), IL-2 a lymfotoxin (LT). Buňky Th2 vylučují IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 a IL-13, aby napomáhaly humorální imunitě, alergickým reakcím a imunosupresi.
V souladu s převahou odezev Thl u autoimunnich onemocnění a prozánětlivých aktivit IFNy, IL-12 může hrát důležitou úlohu při patologii spojené s řadou autoimunnich a zánětlivých onemocnění, jako je revmatická artritida (RA), roztroušená skleróza (MS) a Crohnova nemoc.
Lidští pacienti trpící MS vykazovali zvýšenou expresi IL12, což se dokumentovalo množstvím mRNA podjednotky p40 v plakách při akutní MS (popisuje se v publikaci Windhagen et al,, (1995), J. Exp. Med. 182: 1985-1996). Navíc stimulace ex vivo buněk prezentujících antigen buňkami T, které exprimují CD40-L a které se získaly od pacientů s MS, vede ke zvýšení produkce IL-12 ve srovnáni s kontrolními buňkami T, což je v souladu s pozorováním, že interakce CD40/CD40L je silné indukční činidlo IL-12.
V kloubním mazu pacientů s RA ve srovnání se zdravými kontrolními pacienty bylo detekováno zvýšené množství IL-12p70 (popisuje se v publikaci Morita et al., (1998) Arthritis and Rheumatism. 41: 306-314). Profil exprese informační ribonukleové kyseliny (mRNA) cytokinů v kloubním mazu při onemocnění RA identifikoval převážně cytokiny Thl (popisuje se v publikaci Bucht et al., (1996) Clin. Exp. Immunol. 103: 347367) . Také se zdá, že IL-12 hraje rozhodující úlohu v patologii Crohnovy nemoci (CD). Ve střevní sliznici pacientů s tímto onemocněním byla pozorována zvýšená exprese INFy a IL12 (popisuje se v publikaci Fais et al., (1994) J. Interferon Res. 14: 235-238, Parronchi et al., (1997) Am. J. Path. 150: 823-832, Monteleone et al., (1997) Gastroenterology. 112: 1169-1178 a Berrebi et al., (1998) Am. J. Path 152: 667-672).
Profil vylučování cytokinů buňkami T slizničního vaziva pacientů s CD je charakteristický převládající odezvou Thl, což zahrnuje značně zvýšené množství IFNy (popisuje se v publikaci Fuss, et al., (1996) J. Immunol. 157: 1261-1270). Avšak sekce tkáně tlustého střeva u pacientů s CD vykazuje velké množství makrofágů exprimujících IL-12 a buněk T exprimujících IFNy (popisuje se v publikaci Parronchi et al., (1997) Am. J. Path. 150: 823-832).
Na základě úlohy lidského IL-12 při různých lidských poruchách, byly navrženy terapeutické strategie tak, aby se inhibovala a neutralizovala aktivita IL-12. Zvláště protilátky, které se váží na IL-12, a tak ho neutralizují, se považují za prostředek inhibující aktivitu IL-12. Některé z nejčasnějších protilátek byly myší monoklonální protilátky (mAb) vylučované hybridomy připravenými z lymfocytů myši imunizovaných IL-12 (popisuje se například v přihlášce patentu č. WO 97/15327 (Strober et al., v publikaci Neurath et al., (1995) J. Exp. Med. 182: 1281-1290, Duchmann et al., (1996) J. Immunol. 26: 934- 938). Použiti těchto myších protilátek proti IL-12 in vivo je omezeno problémy spojenými s aplikací myších protilátek lidem. Tyto problémy zahrnují krátký poločas rozpadu séra, neschopnost spustit jisté lidské efektorové funkce a vyvolání nežádoucí imunitní odezvy proti myším protilátkám u lidí (reakce „lidských anti-myších protilátek (HAMA)).
V obecném případě úsilí o překonáni uvedených problémů spojených s použitím zcela myších protilátek u lidí zahrnuje genetickou manipulaci protilátek, aby byly pro člověka lépe přijatelné. Například se připravily chimerové protilátky, kde se variabilní oblasti řetězců protilátek získaly z myší a konstantní oblasti řetězců protilátek se získaly z lidí (Junghans et al., (1990) Cancer Res. 50: 1495-1502, Brown et al., (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. 88: 2663-667, Kettleborough et al., (1991) Protein Engineering 4: 773-783). Avšak protože tyto chimérické a humanizované protilátky si stále ponechávají některé myší sekvence, mohou stále vyvolat nežádoucí imunní reakci, což je reakce člověka proti chimérickým protilátkám (HACA), zvláště, když se protilátky aplikují dlouhodobě.
Výhodným činidlem inhibujícím IL-12 v případě myších protilátek nebo jejich derivátů (například chimérické a humanizované protilátky) budou zcela lidské anti-IL-12 protilátky, protože takové činidlo by nemělo vyvolat reakci HAMA, dokonce, když se používá dlouhodobě. Takové protilátky však nebyly zatím v dosavadním stavu techniky popsány a proto je stále potřeba je vytvořit.
Podstata vynálezu
Vynález poskytuje lidské protilátky, které vážou lidský IL-12. Vynález dále popisuje léčbu nebo prevenci akutních nebo chronických onemocnění nebo stavů, jejichž patologie zahrnuje IL-12, použitím lidských protilátek proti IL-12 podle vynálezu.
Podle jednoho aspektu vynález poskytuje izolovanou lidskou protilátku nebo jej i část vázající se na antigen, která se váže na lidský IL-12.
V jednom provedení vynález poskytuje selektivně mutovanou lidskou protilátku proti IL-12, která obsahuje:
lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen, selektivně mutovanou ve výhodné poloze selektivní mutageneze, v kontaktní nebo hypermutační poloze aminokyselinovým zbytkem, který zvyšuje aktivitu tak, že se protilátka váže na lidský IL-12 .
V preferovaném provedení vynález poskytuje selektivně mutovanou lidskou protilátku proti IL-12 obsahující:
lidské protilátky nebo jejich část vázající se na antigen, selektivně mutovanou ve výhodné poloze selektivní mutageneze aminokyselinovým zbytkem, který zvyšuje aktivitu tak, že se váže na lidský IL-12.
• · · ·
V dalším výhodném provedeni vynálezu selektivně mutovaná lidská protilátka proti IL-12 nebo její část vázající se na antigen je selektivně mutována ve více než jedné preferované poloze selektivní mutageneze, kontaktních nebo hypermutačních polohách aminokyselinovým zbytkem, který zesiluje aktivitu. V jiném výhodném provedení vynálezu je selektivně mutovaná lidská protilátka proti IL-12 nebo její část vázající se na antigen selektivně mutována v ne více než třech preferovaných polohách selektivní mutageneze, kontaktních nebo hypermutačních polohách. V jiném preferovaném provedení vynálezu selektivně mutovaná lidská protilátka proti IL-12 nebo její část vázající se na antigen je selektivně mutována v ne více než dvou preferovaných polohách selektivní mutageneze, kontaktních nebo hypermutačních polohách. V ještě dalším < preferovaném provedení podle vynálezu je selektivně mutovaná ! lidská protilátka proti IL-12 nebo její část vázající se na antigen selektivně mutována tak, že se dosáhlo úrovně cílové specifické afinity. Uvedená cílová úroveň se zlepšila ve srovnání s dosaženou, když se při selekci protilátek proti | stejnému antigenu použila technologie fágového zobrazení.
| V jiném preferovaném provedení vynálezu si selektivně mutovaná | lidská proti-látka proti IL-12 dále ponechává alespoň jednu % požadovanou vlastnost nebo charakteristiku, například zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo s | lidskými tkáněmi, zachování rozeznání epitopu, produkci • protilátek se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
V dalším provedení vynález poskytuje izolovanou lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen, která se váže na lidský IL-12 a disociuje z lidského IL-12 s rychlostní konstantou KOff 0,1 s_1 nebo nižší, jak se stanovilo povrchovou plazmonovou rezonancí, nebo která inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu proliferace fytohemaglutininových blastů (test PHA) , přičemž hodnota IC50 ♦ · • · · ·
··· · · · ··· «· · ·· ··· ·* ···· je 1 χ ΙΟ6 Μ nebo nižší. Výhodněji izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen disociuje z lidského IL12 s rychlostní konstantou Koff 1 χ 10-2 s’1 nebo nižší nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA, přičemž hodnota IC50 je 1 χ 107 M nebo nižší. Výhodnější je, když izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen disociuje z lidského IL-12 s rychlostní konstantou Koff 1 x 10-3 s1 nebo nižší nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA s hodnotou IC50 1 x ΙΟ8 M nebo nižší. Výhodněji izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen disociuje z lidského IL-12 s rychlostní konstantou Koff 1 x 10~4 s'1 nebo nižší nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA s hodnotou IC50 1 x 10~9 M nebo nižší. Výhodněji izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen disociuje z lidského IL-12 s rychlostní konstantou KOff 1 x 10“5 s'1 nebo nižší nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA s hodnotou IC50 1 x ΙΟ-10 M nebo nižší. Ještě výhodněji izolovaná lidská protilátka nebo .její část vázající se na antigen disociuje z lidského IL-12 s rychlostní konstantou KOff 1 χ 10“5 s_1 nebo nižší nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA s hodnotou IC50 1 x ΙΟ“11 M nebo nižší.
V dalším provedení vynález poskytuje izolovanou lidskou protilátku nebo jej i část vázající se na antigen, která má následující charakteristiky:
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA, přičemž hodnota IC50 je 1 χ ΙΟ“6 M nebo nižší,
b) vykazuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1 a
c) vykazuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2.
V preferovaném provedeni vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 3 a vykazuje CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 4. V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 5 a vykazuje CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 6. V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 7a vykazuje variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 8.
V jiném provedení vynález poskytuje izolovanou lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen, která má následující charakteristiky:
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA, přičemž hodnota IC50 je 1 χ ΙΟ-9 M nebo nižší,
b) vykazuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 9a
c) vykazuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 10.
V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 11 a vykazuje CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 12. V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 13 a vykazuje CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID
NO: 14. V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská • · · · · · ·· · ·· · ·
9 · φ··· 9 9 9 9 _ 999 999 9·· ······♦···· ·· ·····« φ 9« ··· ·· ···· protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 15 a vykazuje variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 16.
V jiném provedení vynálezu se popisuje izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která má následující charakteristiky:
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA, přičemž hodnota IC5o je 1 χ 109 M nebo nižší,
b) vykazuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 17 a
c) vykazuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 18.
V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 19 a vykazuje CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 20. V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 21 a vykazuje CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 22. V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 23 a vykazuje variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 24.
V preferovaném provedení izolovaná lidská protilátka obsahuje konstantní oblast těžkého řetězce vybranou ze skupiny zahrnující konstantní oblasti IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA a IgE nebo jejich libovolné alelové varianty, jak se popisuje v publikaci Kabat, E. A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of φ · Φ Φ φ Φ » · · · · • · · «··« φ«φ
ΦΦΦ φφφ ΦΦΦ <9 Φ φ Φ Φ ΦΦΦ ·· ΦΦΦΦ
Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Ve výhodnějším provedení vynálezu konstantní oblast těžkého řetězce protilátek je IgGl. V jiném preferovaném provedení vynálezu izolovanou lidskou protilátkou je fragment Fab nebo fragment F(ab')2 nebo fragment jediného řetězce Fv.
V jiném provedení vynálezu se popisuje izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA, přičemž hodnota IC50 je 1 x 109 M nebo nižší,
b) vykazuje CDR3 těžkého řetězce obsahuj ící
aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny
zahrnující SEQ ID NO: 404 až 469 a
c) vykazuje CDR3 lehkého řetězce obsahuj ící
aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny
zahrnující SEQ ID NO: 534 až 579.
V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 335 až 403 a vykazuje CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 506 až 533. V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 288 až 334 a vykazuje CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 470 až 505. V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 23 a vykazuje variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 24. V preferovaném provedení izolovaná lidská protilátka obsahuje konstantní oblast těžkého řetězce nebo fragment Fab nebo fragment F(ab')2 • · * · · ♦ · · · · · · · • · · « · · · · · · · • · · · · · ··· • · « ·· · · · ·· · · 4 · nebo fragment jediného řetězce Fv, jak se popisuje shora v textu.
V jiném provedení vynálezu se popisuje izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA, přičemž hodnota IC50 je 1 x 109 M nebo nižší,
b) vykazuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 25 a
c) vykazuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 26.
V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 27 a vykazuje CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 28. V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 29 a vykazuje CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 30. V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 31 a vykazuje variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 32.
V preferovaném provedení izolovaná lidská protilátka obsahuje konstantní oblast těžkého řetězce nebo fragment Fab nebo fragment F(ab'>2 nebo fragment jediného řetězce Fv, jak se popisuje shora v textu.
V dalším provedení vynález poskytuje izolovanou lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen, která
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA, přičemž hodnota IC50 je 1 x 106 M nebo nižší, φ φ Φ φφ φ ·· · ···· • 0 0 0 · Φ ·0000
ΦΦΦ · · · ·0 Φ φ Φ · Φ· ·ΦΦ Φ· Φ Φ · Φ
b) obsahuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 3 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 5 nebo jejich mutant, který obsahuje jednu nebo více substituci aminokyselin v kontaktní poloze nebo v hypermutační poloze, kde hodnota rychlostní konstanty koff uvedeného mutantu není vyšší než je desetinásobek hodnoty pro protilátku obsahující CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 3 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 5a
c) obsahuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 4 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 6 nebo jejich mutant, který obsahuje jednu nebo více substitucí aminokyselin v kontaktní poloze nebo v hypermutační poloze, kde hodnota rychlostní konstanty koff uvedeného mutantu není vyšší než je desetinásobek hodnoty pro protilátku obsahující CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 4 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 6.
V jiném provedení vynález poskytuje izolovanou lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen, která
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA, přičemž hodnota IC50 je 1 x 10’9 M nebo nižší,
b) obsahuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 9, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 11 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 13 nebo jejich mutant, který obsahuje jednu nebo více substitucí aminokyselin v kontaktní poloze nebo v hypermutační poloze, kde hodnota rychlostní konstanty koff uvedeného mutantu není vyšší než je desetinásobek hodnoty pro protilátku obsahující CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 9, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 11 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 13 a
c) obsahuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 10, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 12 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 14 nebo jejich mutant, který obsahuje jednu nebo více substitucí aminokyselin v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní poloze nebo v hypermutační poloze, kde hodnota rychlostní konstanty kOff uvedeného mutantu není vyšší než je desetinásobek hodnoty pro protilátku obsahující CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 10, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 12 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 14.
V jiném provedení vynálezu se popisuje izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA, přičemž hodnota IC50 je 1 x 10’9 M nebo nižší,
Φ Φ φ φφ · »· · φ φ φφ • · · « φ · φ φφφφ φφφ φφφ φφφ φφφ φφ φφφ ·« φφφφ
b) obsahuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 17, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 19 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 21 nebo jejich mutant, který obsahuje jednu nebo více substitucí aminokyselin v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní poloze nebo v hypermutační poloze, kde hodnota rychlostní konstanty kOff uvedeného mutantu není vyšší než je desetinásobek hodnoty pro protilátku obsahující CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 17, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 19 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 21 a
c) obsahuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 18, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 20 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 22 nebo jejich mutant, který obsahuje jednu nebo více substitucí aminokyselin v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní poloze nebo v hypermutační poloze, kde hodnota rychlostní konstanty kOff uvedeného mutantu není vyšší než je desetinásobek hodnoty pro protilátku obsahující CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 18, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 20 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 22.
Vynález také popisuje molekuly nukleových kyselin kódující protilátky nebo jejich části vázající se na antigen.
Výhodná izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 17.
• · · ·· · ·· · ·· ·· • · · · · · · · · « · e · · · · · · * · ·· · ·· ··· *· ··♦·
Izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilní oblast těžkého řetězce protilátky. V jiném provedeni vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR2 variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID
NO: 19.
V jiném provedení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduj e
CDR1 variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky obsahuj ící aminokyselinovou sekvenci SEQ
ID NO: 21. V jiném provedení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilní oblast těžkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:
23. V jiném provedení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID
NO: 18.
Izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilní oblast lehkého řetězce protilátky. V jiném provedení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR2 variabilní oblasti lehkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID
NO: 20. V jiném provedení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR1 variabilní oblasti lehkého řetězce protilátky obsahuj ící aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:
22. V jiném provedení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilní oblast lehkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 24.
V jiném provedení vynálezu se popisuje izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA, přičemž hodnota IC5o je 1 x 109 M nebo nižší,
b) obsahuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 25, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 27 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 29 nebo jejich mutant, který obsahuje jednu nebo více substitucí aminokyselin v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní poloze nebo v hypermutační poloze, kde hodnota rychlostní konstanty koff uvedeného mutantu není vyšší než je desetinásobek hodnoty pro protilátku obsahující CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 25, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 27 a CDR1 těžkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 29 a
c) obsahuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 26, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 28 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 30 nebo jejich mutant, který obsahuje jednu nebo více substitucí aminokyselin v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní poloze nebo v hypermutační poloze, kde hodnota rychlostní konstanty kOff uvedeného mutantu není vyšší než je desetinásobek hodnoty pro protilátku obsahující CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 26, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 28 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 30.
Výhodná izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 25. Izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilní oblast těžkého řetězce protilátky. V jiném provedení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR2 variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 27. V jiném provedení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR1 variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky obsahuj ící provedení aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 29. V jiném vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilní oblast těžkého řetězce protilátky obsahující •ΦΦΦΦ* · · φ φφ · φ • · · · 9 ·· · Φ Φ Φ • · · ΦΦΦ φ φ Φ
Φ Φ · ΦΦ ΦΦΦ ΦΦ ΦΦΦΦ aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 31. V jiném provedení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 26. Izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilní oblast lehkého řetězce protilátky. V jiném provedení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR2 variabilní oblasti lehkého řetězce
NO: 28.
protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID
V jiném provedení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduj e
CDR1 variabilní oblasti lehkého řetězce protilátky obsahuj ící aminokyselinovou sekvenci SEQ
ID NO: 30. V jiném provedení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilní oblast lehkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 32.
V jiném aspektu vynález poskytuje izolovanou lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen, která má následující charakteristiky:
a) váže se na lidský IL-12 a disociuje z lidského IL-12, přičemž rychlostní konstanta má hodnotu 0,1 s_1 nebo nižší, jak se stanovilo povrchovou plazmonovou rezonancí, nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu proliferace fytohemaglutininových blastů (test PHA) , přičemž hodnota IC5o je 1 x 10“6 M nebo nižší,
b) vykazuje variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou z člena embryonální rodiny Vh3, kde variabilní oblast těžkého řetězce vykazuje v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní nebo hypermutační poloze mutaci aminokyselinovým zbytkem, který zvyšuje aktivitu.
c) vykazuje variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou z člena embryonální rodiny V\l, kde variabilní oblast lehkého řetězce vykazuje v preferované poloze selektivní mutageneze, ·· ΦΦΦΦ ·· · ·· φφ φ φ · φφφφ φφφφ
ΦΦΦ ΦΦΦ · · φ v kontaktní nebo hypermutačni poloze mutaci aminokyselinovým zbytkem, který zvyšuje aktivitu.
V dalším provedení vynález poskytuje izolovanou lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen, která má následující charakteristiky:
ΦΦΦ ΦΦΦ ΦΦΦ •Φ φ φφ ΦΦΦ ·· φφφφ
a) váže se na lidský IL-12 a disociuje z lidského IL-12, přičemž rychlostní konstanta má hodnotu
0,1 s 1 nebo nižší, jak se stanovilo povrchovou plazmonovou rezonancí, nebo inhibuje proliteraci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu proliferace fytohemaglutininových blastů (test PHA), přičemž hodnota IC50 je 1 x ΙΟ-6 M nebo nižší,
b) vykazuje variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 595 až 667, kde variabilní oblast těžkého řetězce vykazuje v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní nebo hypermutačni poloze mutaci aminokyselinovým zbytkem, který zvyšuje aktivitu.
c) vykazuje variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 669 až 675, kde variabilní oblast lehkého řetězce vykazuje v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní nebo hypermutačni poloze mutaci aminokyselinovým zbytkem, který zvyšuje aktivitu.
Dále vynález popisuje izolovanou lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen, která má následující charakteristiky:
a) váže se na lidský IL-12 a disociuje z lidského IL-12, přičemž rychlostní konstanta má hodnotu 0,1 s-1 nebo nižší, jak se stanovilo povrchovou plazmonovou rezonancí, nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu
♦ · ···· • a a ·· • a w • a a# a· • a · ·
• · · a a • • a a
4 · a • a • »a • a · a · «
proliferace fytohemaglutininových blastů (test PHA), přičemž hodnota IC5o je 1 x 10“6 M nebo nižší,
b) vykazuje variabilní oblast těžkého řetězce obsahující embryonální aminokyselinovou sekvenci COS-3, kde variabilní oblast těžkého řetězce vykazuje v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní nebo hypermutační poloze mutaci aminokyselinovým zbytkem, který zvyšuje aktivitu,
c) vykazuje variabilní oblast lehkého řetězce obsahující embryonální aminokyselinovou sekvenci DPL8, kde variabilní oblast lehkého řetězce vykazuje v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní nebo hypermutační poloze mutaci aminokyselinovým zbytkem, který zvyšuje aktivitu.
Dále vynález poskytuje izolovanou lidskou její část vázající se na antigen, která protilátku nebo má následující charakteristiky:
přičemž nižší, na lidský rychlostní j ak rezonancí, se nebo tininových blastů
IL-12 a disociuje z má hodnotu konstanta stanovilo inhibuj e v in lidského IL-12,
0,1 s 1 nebo povrchovou proliferaci vitro testu plazmonovou fytohemagluproliferace fytohemaglutininových blastů (test PHA), přičemž hodnota IC50 je 1 x 10“6 M nebo nižší,
b) vykazuje variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou z člena embryonální rodiny VH3, kde variabilní oblast těžkého řetězce obsahuje CDR2, která je strukturou podobná CDR2 z jiných členů embryonální rodiny VH3, a CDR1, která je strukturou podobná CDR1 z jiných členů embryonální rodiny VH3, a kde variabilní oblast těžkého řetězce vykazuje v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní nebo hypermutační poloze mutaci aminokyselinovým zbytkem, který zvyšuje aktivitu.
·· *· • e·
• • · • 9 ·· « • • 4
• • · • Λ • • • •
• • · Φ · • • • •
• ··
c) vykazuje variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou z člena embryonální rodiny V^l, kde variabilní oblast lehkého řetězce obsahuje CDR2, která je strukturou podobná CDR2 z jiných členů embryonální rodiny V^l, a CDR1, která je strukturou podobná CDR1 z jiných členů embryonální rodiny V\l, a kde variabilní oblast lehkého řetězce vykazuje v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní nebo hypermutační poloze mutaci aminokyselinovým zbytkem, který zvyšuje aktivitu.
Ve výhodném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen vykazuje mutaci v CDR3 těžkého řetězce. V jiném výhodném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen vykazuje mutaci v CDR3 lehkého řetězce. V jiném výhodném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen vykazuje mutaci v CDR2 těžkého řetězce. V jiném výhodném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen vykazuje mutaci v CDR2 lehkého řetězce. V jiném výhodném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen vykazuje mutaci v CDR1 těžkého řetězce. V jiném výhodném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen vykazuje mutaci v CDR1 lehkého řetězce.
V dalším aspektu vynález poskytuje rekombinantní expresívní vektory nesoucí nukleové kyseliny kódující protilátku podle vynálezu a dále zahrnuje hostitelské buňky, do kterých byly takové vektory zavedeny, a způsoby přípravy protilátek podle vynálezu kultivací hostitelských buněk podle vynálezu.
V dalším aspektu vynález poskytuje izolovanou lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen, která neutralizuje aktivitu lidského IL-12 a alespoň jednoho dalšího • φ • · · · • · • φ ··· ·
IL-12 primátů vybraného ze skupiny zahrnující IL-12 paviána, IL-12 kosmana, IL-12 šimpanze, IL-12 cynomolga a IL-12 makaka, ale která neneutralizuje aktivitu myšího IL-12.
V dalším aspektu vynález poskytuje farmaceutický prostředek obsahující protilátku nebo její část vázající se na antigen podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič.
V dalším aspektu vynález poskytuje prostředek obsahující protilátku nebo její část vázající se na antigen a další činidlo, například terapeutické činidlo.
V dalším aspektu vynález poskytuje způsob inhibující aktivitu lidského IL-12, který zahrnuje kontakt lidského IL-12 s protilátkou podle vynálezu, například J695, tak, že je inhibována aktivita IL-12.
Dále vynález poskytuje způsob inhibující aktivitu lidského IL-12 v lidském subjektu, který trpí poruchou, při které je aktivita IL-12 škodlivá, a zahrnuje aplikaci protilátky podle
vynálezu, například J695, lidskému subjektu tak, že se
v lidském subjektu inhibuje aktivita IL-12. Poruchou může
například být Crohnova choroba, roztroušená skleróza nebo
reumatoidní artritida.
Dále vynález popisuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající antigen, aby se dosáhlo předem stanovené cílové aktivity, který zahrnuje:
a) poskytnutí výchozí protilátky nebo její části vázající se na antigen
b) výběr preferované polohy selektivní mutageneze vybrané ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H33, H52,
H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94,
c) individuální mutace vybrané preferované polohy selektivní mutageneze na alespoň dva odlišné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká první skupina mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
d) hodnoceni aktivity první skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, aby se stanovilo, zda mutace jednotlivé polohy selektivní mutageneze produkuje protilátku nebo její část vázající se na antigen s předem stanovenou cílovou aktivitou nebo částečnou cílovou aktivitou,
e) postupné kombinování jednotlivých mutací, které demonstrovaly, že máji zlepšenou aktivitu, ve výchozí protilátce nebo v její části vázající se na antigen, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejích částí vázajících se na antigen,
f) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich části vázající se na antigen, aby se stanovilo, zda kombinační protilátky nebo jejich části vázající se na antigen mají předem stanovenou cílovou aktivitu nebo částečnou cílovou aktivitu,
g) jestliže výsledkem kroku popsaného v odstavci d) nebo f) není protilátka nebo její část vázající se na antigen s předem stanovenou cílovou aktivitou nebo protilátka pouze s částečnou cílovou aktivitou, další aminokyselinové zbytky vybrané ze skupiny zahrnující H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A a L96 se mutují alespoň ve dvou odlišných aminokyselinových zbytcích, čímž vzniká druhá skupina mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
h) hodnocení aktivity druhé skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, aby se stanovilo, zda mutace jediného aminokyselinového zbytku vybraného ze skupiny zahrnující H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A a L96 vede ke vzniku protilátky nebo její části vázající se na antigen s předem stanovenou cílovou aktivitou nebo částečnou cílovou aktivitou, ·· ···· ·· · ·· ·· ·· · ···· ···· • A · ♦·· · ·· ♦·· ··· · 9 · ·« • · · ··«··· ·· · ·· ··· 9·····
i) postupné kombinováni jednotlivých mutací popsaných v odstavci g), které demonstrovaly zlepšenou aktivitu, ve výchozí protilátce nebo v její části vázající se na antigen, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
j) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázající se na antigen, aby se stanovilo, zda kombinační protilátky nebo jejich části vázající se na antigen mají předem stanovenou cílovou aktivitu nebo částečnou cílovou aktivitu,
k) jestliže výsledkem kroku popsaného v odstavci h) nebo j) není protilátka nebo její část vázající se na antigen s předem stanovenou cílovou aktivitou nebo protilátka pouze s částečnou cílovou aktivitou, další aminokyselinové zbytky vybrané ze skupiny zahrnující H33B, H52B a L31A se mutují alespoň ve dvou odlišných aminokyselinových zbytcích, čímž vzniká třetí skupina mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
l) hodnocení aktivity třetí skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, aby se stanovilo, zda mutace jediného aminokyselinového zbytku vybraného ze skupiny zahrnující H33B, H52B a L31A vedla ke vzniku protilátky nebo její části vázající se na antigen s předem stanovenou cílovou aktivitou nebo částečnou cílovou aktivitou,
m) postupné kombinování jednotlivých mutací popsaných v kroku k), které demonstrovaly zlepšenou aktivitu, ve výchozí protilátce nebo v její části vázající se na antigen, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejích částí vázajících se na antigen,
n) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázající se na antigen, aby se stanovilo, zda kombinační protilátky nebo jejich části vázající se na antigen mají předem stanovenou cílovou aktivitu, čímž se produkuje protilátka nebo její část vázající se na antigen s předem stanovenou cílovou aktivitou.
V dalším aspektu vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen, který zahrnuje:
a) poskytnutí výchozí protilátky nebo její části vázající antigen,
b) výběr preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy v oblasti určující komplementaritu (CDR) mutace, čímž se identifikuje vybraná preferovaná poloha selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační poloha,
c) individuální mutace uvedené vybrané preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy na alespoň dva odlišné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká skupina mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
d) hodnocení aktivity skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen,
e) opakování kroků b) až d) v případě alespoň jedné další kontaktní a hypermutační polohy,
f) postupné kombinování jednotlivých mutací, které demonstrovaly, že mají zlepšenou aktivitu, ve výchozí protilátce nebo v její části vázající se na antigen, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a
g) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich části vázající se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo k její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se • · · · ·· ?
• · e
• · · · • · · • · ··· · na antigen se zlepšenou aktivitou vzhledem k výchozí protilátce.
V jednom provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo části vázající se na antigen, který zahrnuj e:
a) poskytnutí rekombinantní výchozí protilátky nebo její části vázající se na antigen, která se získala selekcí v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita není dále zlepšována mutagenezí v uvedeném systému fágového zobrazení,
b) výběr preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci, čímž se identifikuje vybraná kontaktní nebo hypermutační poloha,
c) individuální mutace uvedené vybrané preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy na alespoň dva odlišné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká skupina mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese uvedené skupiny v systému nefágového zobrazení,
d) hodnocení aktivity skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen,
e) opakování kroků b) až d) v případě alespoň jedné další kontaktní a hypermutační polohy,
f) postupné kombinování jednotlivých mutací, které demonstrovaly, že mají zlepšenou aktivitu, ve výchozí protilátce nebo v její části vázající se na antigen, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a
g) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich části vázající se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo k její části vázající se na antigen, • · · ·
dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou.
V preferovaném provedení jsou kontaktní polohy vybrány ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96.
V jiném výhodném provedeni vynálezu se hypermutační polohy vybraly ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93. Ve výhodnějším provedení vynálezu jsou zbytky pro selektivní mutagenezi vybrány z výhodných poloh selektivní mutageneze ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50,
L91, L92, L93, L94. Ve více preferovaném provedením vynálezu jsou kontaktní polohy vybrány ze skupiny zahrnující L50 a L94.
V jednom provedení vynálezu se popisuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen, který zahrnuje:
a) poskytnuti rekombinantní výchozí protilátky nebo její části vázající se na antigen,
b) výběr preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy v oblasti určující komplementaritu (CDR) v případě mutace, čímž se identifikuje vybraná kontaktní nebo hypermutační poloha,
c) individuální mutace uvedené vybrané preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy na alespoň dva odlišné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká skupina mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese uvedené skupiny ve vhodném expresívním systému,
d) hodnocení aktivity skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na • · · · · ·
antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) hodnocení alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky u skupiny mutovaných protilátek nebo jejích částí vázajících se na antigen, kde vlastnost nebo charakteristika je ta, kterou je nutné u protilátky zachovat, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou a alespoň jednou zachovanou vlastností nebo charakteristikou ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen.
V preferovaném provedení vynálezu jsou kontaktní polohy
vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H35,
H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101,
L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a
L96 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování
| nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi,
2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu i podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem
i] p70p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné | podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí §
blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu. V jiném ‘5 provedení vynálezu jsou hypermutační polohy vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93 a další charakteristika se vybrala z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu. Ve výhodnějším provedení vynálezu jsou zbytky pro selektivní mutagenezi vybrány z výhodných poloh selektivní mutageneze ze skupiny
zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31,
L32, L50, L91, L92, L93, L94 a další charakteristika se vybrala z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu. Ve výhodnějším provedení vynálezu jsou kontaktní polohy vybrány ze skupiny L50 a L94 a další charakteristika se vybrala z 1) ochrana proti zkřížené reaktivitě s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
V jiném provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo části vázající se na antigen, který zahrnuje:
a) poskytnutí rekombinantní výchozí protilátky nebo její části vázající se na antigen, která se získala selekcí v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita nemůže být dále zlepšována mutagenezí v uvedeném systému fágového zobrazení,
b) výběr preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci, čímž se identifikuje vybraná výhodná poloha selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační poloha,
c) individuální mutace uvedené vybrané preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy na alespoň dva odlišné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká skupina mutovaných protilátek nebo jejich ♦· φφφφ
Φ φφ φφ ·· φφφφ • φ φ Φ • ΦΦΦ · • φ φ ·
ΦΦΦ φφ ΦΦΦ· exprese uvedené
protilátek nebo částí vázajících se na antigen, a skupiny v systému nefágového zobrazení,
d) hodnocení aktivity skupiny mutovaných jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) hodnocení alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky u skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen, kde vlastnost nebo charakteristika je ta, kterou je nutné zachovat, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou a alespoň jednou zachovanou vlastností nebo charakteristikou ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen,
f) opakování kroků a) až e) v případě alespoň jedné další výhodné polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutačni polohy,
g) kombinování ve výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen alespoň dvou aminokyselinových zbytků, které individuálně zvyšují aktivitu a které ukázaly, že mají zlepšenou aktivitu a alespoň jednu Zachovalou vlastnost nebo, charakteristiku, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a
h) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo k její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou vztaženo k výchozí protilátce.
·« ·««·
V preferovaném provedeni vynálezu jsou kontaktní polohy vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
V jiném provedení vynálezu jsou hypermutační polohy vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93 a další charakteristika se vybrala z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu. Ve výhodnějším provedení vynálezu jsou zbytky pro selektivní mutagenezi vybrány z výhodných poloh selektivní mutageneze ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 a další charakteristika se vybrala z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu. Ve výhodnějším provedení vynálezu jsou kontaktní polohy vybrány ze skupiny obsahující L50 a L94 a další charakteristika se vybrala z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) ·· ·«·· zachováni rozpoznáni epitopu, to je rozpoznáni epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinů.
V jiném provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo části vázající se na antigen, který zahrnuj e:
a) poskytnutí rekombinantní výchozí protilátky nebo její části vázající se na antigen, která se získala selekcí v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita nemůže být dále zlepšována mutagenezí v uvedeném systému fágového zobrazení,
b) výběr kontaktní nebo hypermutační polohy v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci, čímž se identifikuje vybraná kontaktní nebo hypermutační
c) poloha, individuální mutace uvedené vybrané kontaktní nebo polohy hypermutační aminokyselinové zbytky, protilátek nebo jejich a exprese uvedené na čímž částí alespoň dva odlišné vzniká skupina mutovaných vázajících se na antigen, skupiny v systému nefágového zobrazení,
d) hodnocení aktivity skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) hodnocení alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky u skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen, kde vlastnost nebo charakteristika je ta, kterou je nutné zachovat, ·· ···· dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se antigen se zlepšenou aktivitou a alespoň s zachovanou vlastností nebo charakteristikou ve na j ednou vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající antigen.
se na
V preferovaném provedení vynálezu jsou kontaktní polohy
vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H35,
H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101,
L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a
L96 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování
nezkřížené reaktivity s jinými
2) zachování rozpoznání epitopu, proteiny nebo lidskými tkáněmi, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo . 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu. V dalším výhodném provedení jsou hypermutační polohy vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93 a další charakteristika se vybrala z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu. Ve výhodnějším provedení vynálezu jsou zbytky pro selektivní mutagenezi vybrány z výhodných poloh selektivní mutageneze ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky ·· » 4 « • · · ♦9 • · · ·9 • · · · ·9 • · · » « ·♦ · »· ·· *· * * t 1 « ♦9 * «· « • ·· »· ··»♦ se sekvenci blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu. Ve výhodnějším provedení vynálezu jsou kontaktní polohy vybrány ze skupiny obsahující L50 a L94 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
V jiném provedení vynálezu se popisuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo části vázající se na antigen, který zahrnuj e:
a) poskytnutí rekombinantní výchozí protilátky nebo její části vázající se na antigen, která se získala selekcí v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita nemůže být dále zlepšována mutagenezí v uvedeném systému fágového zobrazení,
b) výběr preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy v oblasti určující :komplementaritu (CDR) pro mutaci, čímž se, identifikuje vybraná výhodná poloha selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační poloha,
c) individuální mutace uvedené vybrané preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká skupina mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese uvedené skupiny v systému nefágového zobrazení,
d) hodnocení aktivity skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) hodnoceni alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky u skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen, kde vlastnost nebo charakteristika je ta, kterou je nutné zachovat, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou a alespoň jednou zachovanou vlastností nebo charakteristikou ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen,
f) opakování kroků a) až e) v případě alespoň jedné další výhodné polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy, | g) kombinování ve výchozí protilátce nebo její části | vázající se na antigen alespoň dvou aminokyselinových á zbytků, které individuálně zvyšují aktivitu a které j ukázaly, že mají zlepšenou aktivitu a alespoň jednu
I Zachovalou jinou charakteristiku, za vzniku | kombinačních protilátek.nebo jejich částí vázajících se | na antigen a | h) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich
I částí vázajících se na antigen ve vztahu k Výchozí protilátce nebo k její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se $ na antigen, která vykazuje zlepšenou aktivitu ve vztahu k výchozí protilátce.
V preferovaném provedení vynálezu jsou kontaktní polohy
vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H35,
H50, H52 , H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101,
L30, L31 , L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a
L96 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování
nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi,
2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem
0 · 0 0 · 0 · 0 0 0 00 · 0 0000 000·
0 0 0 0 0 0 0 0
0 00 000 00 0000 ρ70ρ40/ρ35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu. V jiném výhodném provedení vynálezu jsou hypermutační polohy vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93 a další charakteristika se vybrala z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachováni rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu. Ve výhodnějším provedení vynálezu jsou zbytky pro selektivní mutagenezi vybrány z výhodných poloh selektivní mutageneze ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu. Ve výhodnějším provedení vynálezu jsou kontaktní polohy vybrány ze skupiny další charakteristika obsahující L50 a L94 a reaktivity s j inými j e vybrána z proteiny nebo zachování rozpoznání
1) zachování nezkřížené lidskými tkáněmi, 2) podj ednotky p70p40/p35, podj ednotky epitopu, p40 výhodně který předchází p40 a/nebo 3) je rozpoznání epitopu souvislosti s heterodimerem to ovlivnění navázání volné produkce protilátky se rozpustné sekvencí zlepšení blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
V jiném provedení vynález poskytuje způsob aktivity protilátky nebo části vázající se na antigen, který zahrnuj e:
• · · · ·· 1 • 9 9
a) poskytnutí výchozí protilátky nebo její části vázající se na antigen,
b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci, v poloze jiné než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, Η52Ά, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) individuální mutace uvedené vybrané polohy na alespoň dva odlišné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká skupina mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
d) hodnocení aktivity skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) hodnocení změn alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky u skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která vykazuje zlepšenou aktivitu a alespoň jednu zachovanou vlastnost nebo charakteristiku ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen.
Další vlastnost nebo charakteristika je výhodně vybrána z
1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
······ ·· · ·· ·· • · · ·«·· · · · · • · · · · · · · · ·· · * · ··· ·· ····
V jiném provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo části vázající se na antigen, který zahrnuje:
a) poskytnuti výchozí protilátky nebo její části vázající se na antigen,
b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci, v poloze jiné než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) individuální mutace uvedené vybrané polohy na alespoň dva odlišné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká skupina mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
d) hodnocení aktivity skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) opakování kroků b) až d) pro alespoň jednu jinou polohu CDR, kterou není ani poloha vybraná v odstavci b) ani poloha H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
f) kombinování ve výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen alespoň dvou aminokyselinových zbytků, které individuálně zvyšují aktivitu a které ukázaly, že mají zlepšenou aktivitu, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a
g) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen s dvěma aminokyselinovými zbytky zesilujícími aktivitu ve vztahu k výchozí protilátce nebo k její části vázající ♦ · se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která vykazuje zlepšenou aktivitu ve vztahu k výchozí protilátce.
V jiném provedení vynálezu se popisuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo části vázající se na antigen, který zahrnuj e:
a) poskytnutí rekombinantní výchozí protilátky nebo její části vázající se na antigen, která se získala selekcí v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita nemůže být dále zlepšována mutagenezí v uvedeném systému fágového zobrazení,
b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci, v poloze jiné než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a
c) individuální mutace uvedené vybrané kontaktní nebo hypermutační polohy na alespoň dva odlišné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese uvedené skupiny v systému nefágového zobrazení,
d) hodnocení aktivity skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) hodnocení změn alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky u skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen vykazující zlepšenou aktivitu ve
Φ · φ φ φ φ · φ φ φφ φφ • · φ ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen.
• ΦΦ ΦΦΦ ΦΦΦ • φ · φφ ΦΦΦ φ · ΦΦΦΦ
Další vlastnost nebo charakteristika je s výhodou vybrána ze 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
V jiném provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen, který zahrnuje:
poskytnutí výchozí protilátky nebo její části vázající
b)
c) se na antigen, která fágového zobrazení, ale zlepšována mutagenezí zobrazení, se získala selekcí jejíž aktivita nemůže výběr aminokyselinového komplementaritu (CDR) pro
H30,
H54,
L34,
H31,
H56,
L50, uvedeném zbytku mutaci, systému v oblasti
H31B, H32, H33,
H58, H95,
L52, L53, individuální mutace v systému být dále fágového určuj ící j iné
H35, H50, H52, Η52Ά, v poloze než
H53,
H96, H97, H98, H101, L30, L31,
L55, L91, L92, L93, L94 a L96, uvedené odlišných aminokyselinových mutovaných protilátek nebo na antigen, a exprese vybrané zbytků, jejich uvedené
L32, polohy alespoň čímž vzniká skupina částí vázajících se skupiny v systému dvou
d) nefágového zobrazení, hodnocení aktivity skupiny mutovaných protilátek nebo v CDR, kterou není jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) opakování kroků b) až d) pro alespoň jednu jinou polohu ani poloha vybraná v odstavci b) ani φ φ φ φ · · • · * φφ · · • · φ φ ♦ φ φ φ φ · φ φ · · ΦβΦ»·· ·· φ ·· ··· ·Φ ···· poloha Η30, Η31, Η31Β, Η32, Η33, Η35, Η50, Η52, Η52Α,
Η53, Η54, Η56, Η58, Η95, Η96, Η97, Η98, Η101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94,
f) kombinování ve výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen alespoň dvou aminokyselinových zbytků, které individuálně zvyšují aktivitu a které ukázaly, že mají zlepšenou aktivitu, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a
g) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen se dvěma aminokyselinovými zbytky zesilujícími aktivitu ve vztahu k výchozí protilátce nebo k její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která vykazuje zlepšenou aktivitu ve vztahu k výchozí protilátce.
Další vlastnost nebo charakteristika je s výhodou vybrána ze 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
V jiném provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo části vázající se na antigen, který zahrnuje:
a) poskytnutí výchozí protilátky nebo její části vázající se na antigen,
b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci, v poloze jiné než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31., L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) individuální mutace uvedené vybrané polohy na alespoň dva odlišné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká skupina mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
d) hodnocení aktivity skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) hodnocení změn alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky u skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen,
f) opakování kroků b) až d) pro alespoň jednu jinou polohu CDR, kterou není ani poloha vybraná v odstavci b) ani poloha H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
g) kombinování ve výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen alespoň dvou aminokyselinových zbytků, které individuálně zvyšují aktivitu a které ukázaly, že mají zlepšenou aktivitu, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a
h) hodnocení aktivity a zachování alespoň jedné jiné charakteristiky nebo vlastnosti kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen se dvěma aminokyselinovými zbytky zesilujícími aktivitu ve vztahu k výchozí protilátce nebo k její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která vykazuje zlepšenou aktivitu a alespoň jednu zachovanou vlastnost nebo charakteristiku ve vztahu k výchozí její části vázající se na antigen.
V jiném provedení vynález poskytuje afinity protilátky nebo části vázající se na antigen, který zahrnuj e:
• 9
9 protilátce nebo způsob zlepšení
a) poskytnutí výchozí protilátky nebo její části vázající se na antigen, která byla získána výběrem v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita se nemůže dále zlepšovat mutagenezí v uvedeném systému fágového
b)
c)
d) zobrazeni, výběr aminokyselinového komplementaritu (CDR) pro zbytku mutaci, v oblasti v poloze určuj ící j iné než
H30,
H54,
L34,
H31,
H56,
L50,
H31B, H32, H33,
H35, H50, H52, H52A,
H53,
H58, H95,
L52, L53, individuální mutace
H96, H97, H98, H101, L30, L31,
L55, L91, L92, L93, L94 a L96, uvedené dva odlišné aminokyselinové mutovaných protilátek nebo na antigen, hodnocení aktivity skupiny jejich částí vázajících k výchozí
L32, vybrané polohy na alespoň zbytky, čímž vzniká skupina jejich částí vázajících se a exprese v systému nefágového zobrazení, mutovaných protilátek nebo se na antigen ve části vázající aminokyselinový protilátce nebo vztahu antigen, její čímž se identifikuje se na zbytek zvyšuj ící hodnocení aktivitu, změn alespoň jedné mutovaných protilátek nebo jiné vlastnosti nebo charakteristiky u skupiny jejích částí vázajících k výchozí antigen, aktivitou se na antigen ve vztahu její části vázající se na dokud se nezíská protilátka se zlepšenou ve vztahu k výchozí protilátce nebo její protilátce nebo části vázající se dalším provedení aktivity protilátky nebo zahrnuj e:
na antigen.
vynález poskytuje způsob zlepšení části vázající se na antigen, který
a) poskytnutí výchozí protilátky nebo její části vázající se na antigen,
b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci, v poloze jiné než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, Η52Ά, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) individuální mutace uvedené vybrané polohy alespoň dvou odlišných aminokyselinových zbytků, čímž vzniká skupina mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
d) hodnocení aktivity skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se· na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) hodnocení změn alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky u skupiny mutovaných protilátek nebo jejích částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen,
f) opakování kroků b) až e) pro alespoň jednu jinou polohu CDR, kterou není ani poloha vybraná v odstavci b) ani poloha H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
g) kombinování ve výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen alespoň dvou aminokyselinových zbytků, které individuálně zvyšují aktivitu a které ukázaly, že mají zlepšenou aktivitu, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen s alespoň jednou zachovanou vlastností nebo charakteristikou a • ti···· · · · · · · · • · · · · ·· ··«· • ♦ · · · · ··· ♦· · ·· ··· 99 ····
h) hodnoceni aktivity a zachováni alespoň jedné vlastnosti nebo charakteristiky kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen se dvěma aminokyselinovými zbytky zesilujícími aktivitu ve vztahu k výchozí protilátce nebo k její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která vykazuje zlepšenou aktivitu a alespoň jednu zachovanou vlastnost nebo charakteristiku ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen.
Další vlastnost nebo charakteristika je s výhodou vybrána ze 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
V jiném provedeni vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen, bez ovlivnění jiných charakteristik,· který zahrnuje:
a) poskytnuti výchozí protilátky nebo její části vázající se na antigen,
b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci, v poloze jiné než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) individuální mutace uvedené vybrané polohy na alespoň dva odlišné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká skupina mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
d) hodnocení aktivity skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) hodnocení změn alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky u skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen vykazující zlepšenou aktivitu a zachovanou jinou charakteristiku nebo vlastnost ve vztahu k výchozí protilátce.
V jiném provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo části vázající se na antigen, který zahrnuj e:
a) poskytnutí výchozí protilátky nebo její části vázající se na antigen, která byla získána výběrem v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita se nemůže dále zlepšovat mutagenezí v uvedeném systému fágového zobrazení,
b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určuj ící komplementaritu (CDR) pro mutaci, v poloze jiné než
H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, Η52Ά, H53,
H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32,
L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) individuální mutace uvedené vybrané polohy na alespoň dva odlišné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká skupina mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a exprese v systému nefágového zobrazení,
d) hodnocení aktivity a zachování alespoň jedné jiné charakteristiky nebo vlastnosti skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu, ······ ·· · · · to · •9 · · to · · to · to # ··· · · · · · >
to · to ··· to · · to · • · · to · to ··· ·· · ·· ··· toto ····
e) opakováni kroků b) až d) pro alespoň jednu jinou polohu CDR, kterou není ani poloha vybraná v odstavci b) ani poloha H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
f) kombinování ve výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen alespoň dvou aminokyselinových zbytků, které individuálně zvyšují aktivitu a které ukázaly, že mají zlepšenou aktivitu a neovlivňují alespoň jednu jinou charakteristiku nebo vlastnost, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a
g) hodnocení aktivity a zachování alespoň jedné jiné charakteristiky nebo vlastnosti kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen se dvěma aminokyselinovými zbytky zesilujícími aktivitu ve vztahu k výchozí protilátce nebo k její části vázající se na antigen, dokud je získávána protilátka nebo její část vázající se na antigen, která vykazuje zlepšenou aktivitu a alespoň jednu zachovanou vlastnost nebo charakteristiku ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen.
Další vlastnost nebo charakteristika je s výhodou vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinů.
aktivitu
Aby vynález byl srozumitelnější, jsou nejprve definovány určité termíny.
Termín „aminokyselinový zbytek zvyšující (zesilující) zahrnuje aminokyselinový zbytek, který zlepšuje aktivitu protilátky. Rozumí se, že aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu může nahradit aminokyselinový zbytek v kontaktní, hypermutační poloze nebo ve výhodné poloze selektivní mutageneze a dále v jedné nebo více CDR může být přítomen více než jeden aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu. Aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu zahrnuje aminokyselinový zbytek, který zlepšuje vazebnou specifitu/afinitu protilátky, například anti-lidské IL-12 protilátky vázající se na lidský IL-12. Aminokyselinový zbytek zesilující aktivitu také zahrnuje aminokyselinový zbytek, který zlepšuje neutralizační sílu protilátky, například protilátky proti lidskému IL-12, která inhibuje lidský IL-12.
Termín „protilátka zahrnuje molekulu imunoglobulinu, která' obsahuje čtyři polypeptidové řetězce, z toho dva těžké řetězce (H) a dva lehké řetězce (L), které jsou vnitřně spojeny disulfidovými můstky. Každý těžký řetězec obsahuje variabilní oblast těžkého řetězce (zde je označena zkratkou HCVR nebo VH) a konstantní oblast těžkého řetězce. Konstantní oblast těžkého řetězce zahrnuje tři domény CH1, CH2 a CH3. Každý lehký řetězec obsahuje variabilní oblast lehkého řetězce (zde je označena zkratkou LCVR nebo VL) a konstantní oblast lehkého řetězce. Konstantní oblast lehkého řetězce obsahuje jednu doménu CL. Oblasti VH a VL se mohou dále dělit na hypervariabilní oblasti, které se nazývají oblasti determinující komplementaritu (CDR) a mezi nimi se nachází více konzervativní oblasti, jež se nazývají úseky základní struktury (FR) . Každá VH a VL obsahuje tři CDR a čtyři FR uspořádané od N-konce k C-konci v následujícím pořadí: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
Termín „část protilátky vázající se na antigen (nebo „část protilátky) zahrnuje fragmenty protilátky, které si uchovávají schopnost specificky se vázat na antigen (například hIL-12). Ukázalo se, že funkce protilátky vázat se na antigen může být uskutečněna fragmenty protilátky plné délky. Příklady »9 v*·· ♦ · · · · · > •· · · * ·«· « vazebných fragmentů zahrnutých v terminu „část protilátky vázající se na antigen obsahují (i) fragment Fab, což je monovalentní fragment obsahující domény VL, VH, CL a CH1, (ii) fragment F(ab')2, což je bivalentní fragment obsahující dva fragmenty Fab spojené v pantové oblasti disulfidovým můstkem, (iii) fragment Fd obsahující oblasti VH a CH1, (iv) fragment Fv obsahující domény VL a VH jednoho ramene protilátky, (v) fragment dAb (popisuje se v publikaci Ward et al., (1989) Nátuře 341: 544-546), který obsahuje oblast VH a (vi) izolovaná oblast určující komplementaritu (CDR).
Navíc, ačkoli dvě oblasti fragmentu Fv, VL a VH, jsou kódovány oddělenými geny, mohou být spojeny za použití metod rekombinace syntetickým linkerem, který jim umožňuje, aby se připravily jako jediný proteinový řetězec, ve kterém se oblasti VL a VH párují za vzniku monovalentních molekul (jsou známy jako jediný řetězec Fv (scFv), popisuje se v publikaci Bird et al., (1988) Science 242: 423-426 a Huston et al., (1988) Proč. Nati. Acad. Sci USA 85: 5879-5883). Takové jednořetězcové protilátky jsou zahrnuty v pojmu „oblast protilátky vázající se na antigen. Tento termín zahrnuje také jiné formy jednořetězcových protilátek, jako jsou bivalentní protilátky („diabody). Jde o bivalentní, bispecifickou protilátku, ve které jsou exprimovány oblasti VH a VL na jednom polypeptidovém řetězci, ale použití linkeru, který je příliš krátký, aby umožnil párování dvou domén na stejném řetězci, nutí domény tvořit páry s komplementárními oblastmi jiného řetězce a vznikají dvě vazebná místa pro antigen (popisuje se například v publikaci Holliger, P., et al., (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, Poljak, R.J., et al., (1994) Structure 2: 1121-1123). Dále protilátka nebo její část vázající se na antigen může být součástí větších imunoadhesivních molekul vytvořených kovalentním nebo nekovalentním spojením protilátky nebo části protilátky s jedním nebo více odlišných proteinů nebo peptidů. Příklady
• Φ » · • ·· • · • V· ·· 4 tt ·
48 • · • » ♦ • · ♦ • • • • • * · • • • •
• · * • • • • • •
• · 9 ··· ··
molekul· zahrnuj i použiti takových imunoadhesivních streptavidinové jaderné oblasti za vzniku tetramerové molekuly scFv (popisuje se v publikaci Kupriyanov,
Human Antibodies and
S.
Hybridomas
6:
93-101) a použití cysteinového zbytku, markerového peptidů a
C-terminálni polyhistidinové značky za vzniku bivalentnich a biotinem označených molekul scFv (popisuje se v publikaci
S. M. et
Mol. Immunol. 31: 1047-1056).
Kipriyanov,
Části protilátek, j ako j sou fragmenty Fab a F(ab')2, se mohou připravit z celých protilátek za použití běžných metod, j ako je štěpení celých protilátek papainem nebo pepsinem.
Navíc, protilátky, části protilátek a imunoadhezívni molekuly mohou být získány použitím zde rekombinace DNA. Preferované popsaných standardních metod oblasti vázající se na antigen jsou celé oblasti nebo páry celých oblastí.
Termín „zpětná mutace znamená způsob, ve kterém jsou některé nebo všechny somaticky mutované aminokyseliny protilátky nahrazeny odpovídajícími embryonálními lidské z homologní zbytky těžkého a lehkého embryonální sekvence protilátek. Sekvence řetězce lidské protilátky podle vynálezu jsou uspořádány v databázi VBASE odděleně od embryonálních sekvencí, aby se identifikovaly sekvence s nejvyšší homologií. Rozdíly v lidské protilátce podle vynálezu je možné vrátit mutací definovaných poloh odlišnou aminokyselinu, na zkoumána úloha každé nukleotidů, které kódují embryonální sekvenci. Měla aminokyseliny, která se takovou by být takto identifikovala jako kandidát zpětné mutace, při přímé nebo nepřímé úloze při navázání na antigen.
Libovolná aminokyselina, o které se zjistilo, že po mutaci ovlivňuje libovolnou požadovanou charakteristiku, by neměla být zahrnuta do konečné zesiluj ící lidské protilátky, jako například aminokyseliny aktivitu identifikované přístupem selektivní nebudou předmětem zpětné mutace.
mutageneze minimalizoval počet aminokyselin vystavených zpětné
Aby se mutaci, ty • · • · « · • · polohy aminokyselin, o kterých se zjistilo, že se liší od nejbližši embryonální sekvence, ale jsou shodné s odpovídající aminokyselinou v druhé embryonální sekvenci, se mohou zachovat za předpokladu, že druhá embryonální sekvence je shodná a kolineární se sekvencí lidské protilátky podle vynálezu v případě alespoň deseti, s výhodou dvanácti aminokyselin na obou stranách diskutované aminokyseliny. Ke zpětné mutaci může dojít v libovolném stádiu optimalizace protilátky. Je výhodné, aby ke zpětné mutaci došlo přímo před nebo po použití přístupu selektivní mutageneze. Výhodnější je, když ke zpětné mutaci dojde přímo před použitím přístupu selektivní mutageneze.
Slovní spojení „lidský interleukin 12 (zde se zkracuje jako hIL-12 nebo IL-12) zahrnuje lidský cytokin, který je primárně vylučován makrofágy a dendritickými buňkami. Termín zahrnuje heterodimerový protein obsahující podjednotku o molekulové hmotnosti 35 000 (p35) a podjednotku o molekulové hmotnosti 40 000 (p40), které jsou navzájem spojeny sulfidovým můstkem. Heterodimerový protein se označil jako „podjednotka p70. Struktura lidského IL-12je popisována dále například v publikaci Kobayashi, et al., (1989) J. Exp. Med. 170: 827845, Seder, et al., (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. 90: 1018810192, Ling, et al., (1995) J. Exp. Med.154: 116-127, Podlaski, et al., (1992) Arch. Biochem. Biophys. 294: 230-237. Termín lidský IL-12 zahrnuje rekombinantní lidský IL-12 (rh IL-12), který může být připraven metodami standardní rekombinantní exprese.
Termíny „číslování podle Kabata, „Kabatovy definice a „Kabatovo značení se zde mohou zaměňovat. Tyto termíny, které j sou v oboru aminokyselinových známy, zbytků, znamenaj i systém číslování které jsou více variabilní (to znamená hypervariabilní) než jiné aminokyselinové zbytky variabilních oblastí těžkého a lehkého řetězce protilátky nebo její části vázající se na antigen (popisuje se v publikaci
Ann. NY Acad, Sci. 190: 382-391 a Kabat,
E. A., et al·., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91 - 3242). V případě variabilní oblasti těžkého řetězce hypervariabilní oblast je v rozmezí od polohy aminokyseliny 31 do 35 v případě CDR1, polohy aminokyseliny 50 až 65 v případě CDR2 a polohy aminokyseliny 95 až 102 v případě CDR3. V případě variabilní oblasti lehkého řetězce hypervariabilní oblast je v rozmezí od polohy aminokyseliny 24 do 34 v případě CDR1, polohy aminokyseliny 50 až 56 v případě CDR2 a polohy aminokyseliny 89 až 97 v případě CDR3.
Číslování podle Kabata se zde používá za účelem označení poloh modifikací aminokyselin provedených v protilátkách podle vynálezu. Například protilátka proti IL-12 Y61 může být mutována v poloze 31 CDR1 těžkého řetězce ze šeřinu (S) na kyselinu glutamovou (E) (H31S —> E) nebo glycin (G) v poloze 94 CDR3 lehkého řetězce může být mutován na tyrozin (Y) (L94G -> Y) .
Termín „lidská protilátka zahrnuje protilátku, která má variabilní a konstantní oblast odpovídající embryonálním sekvencím lidského imunoglobulinu, jak se popisuje v publikaci Kabat et. al., (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Lidské protilátky podle vynálezu mohou zahrnovat aminokyselinové zbytky, které nejsou kódovány embryonálními sekvencemi lidského imunoglobulinu (například zavedené náhodnou nebo místně řízenou mutagenezí in vitro nebo somatickou mutací in vivo) například v CDR a zvláště v CDR3. Mutace jsou s výhodou zavedeny použitím popsaného „přístupu selektivní mutageneze. Lidská protilátka může mít alespoň jednu polohu nahrazenou aminokyselinovým zbytkem, například aminokyselinovým zbytkem zesilujícím aktivitu, který není kódován embryonální sekvencí lidského imunoglobulinu. Lidská protilátka muže mít až dvacet poloh nahrazených aminokyselinovými zbytky, které nejsou částí embryonální sekvence lidského imunoglobulinu. V jiném provedení vynálezu je nahrazeno až deset, až pět, až tři nebo až dvě polohy. V preferovaném provedení vynálezu tato nahrazení jsou v oblastech CDR, jak se popisuje v detailech dále v textu. Avšak zde používaný termín „lidská protilátka nezahrnuje protilátky, ve kterých sekvence CDR získané z embrya jiných savčích druhů, jako je myš, byly transplantovány do sekvencí základní lidské struktury.
Termín „rekombinantní lidská protilátka zahrnuje lidské protilátky, které jsou připraveny, exprimovány, vytvořeny nebo izolovány způsoby rekombinace. Jsou to například protilátky exprimované použitím rekombinantního expresívního vektoru transfekovaného do hostitelské buňky (popisuje se dále v textu v sekci II), protilátky izolované z knihovny lidských rekombinantních, kombinačních protilátek (popisuje se dále v textu v sekci II), protilátky izolované ze zvířete (například myš), které je transgenní v případě genů lidského imunoglobulinu (popisuje se například v publikaci Taylor, L. D. et al., (1992), Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295) nebo protilátky připravené, exprimované, vytvořené nebo izolované libovolnými jinými způsoby, které zahrnují sestřih sekvencí genu lidského imunoglobulinu s jinými sekvencemi DNA. Takové rekombinantní lidské protilátky mají variabilní a konstantní oblasti získané ze embryonálních sekvencí lidského imunoglobulinu (popisuje se například v publikaci Kabat, E. A.
et al., (1991), Sequences of Proteins of Immunological
Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). V jiných provedeních vynálezu však takové rekombinantní lidské protilátky jsou předmětem mutageneze in vitro (nebo v případě, že je použito zvíře transgenní pro sekvence lidského Ig, jde o somatickou mutagenezi in vivo) a tak aminokyselinové sekvence oblastí VH a VL rekombinantních protilátek jsou sekvence, které, zatímco • · · · « · • · • I * · • · · e
• r ι· •
• .· se získaly z lidských embryonálních sekvencí VH a VL a jsou s nimi příbuzné, nemohou přirozeně existovat in vivo v souboru lidských embryonálních protilátek. V jistých provedeních vynálezu jsou však takové rekombinantní protilátky výsledkem přístupu selektivní mutageneze nebo zpětné mutace nebo obou přístupů.
Termín „izolovaná protilátka zahrnuje protilátku, která v podstatě neobsahuje jinou protilátku s odlišnými antigenními specifitami (například izolovaná protilátka, která se specificky váže na hIL-12 v podstatě neobsahuje protilátky, které se specificky váží na antigeny jiné než je hIL-12) .
Izolovaná protilátka, která se specificky váže na hIL-12, se může vázat na molekuly IL-12 z jiných druhů (diskutuje se detailněji dále v textu). Izolovaná protilátka může v podstatě být bez jiného buněčného materiálu a/nebo chemikálií.
Termín „neutralizační protilátka (nebo „protilátka, která neutralizovala aktivitu hIL-12) zahrnuje protilátku, jejíž navázání na hIL-12 vede k inhibici biologické aktivity hIL-12. Tato inhibice biologické aktivity hIL-12 může být hodnocena měřením jednoho nebo více indikátorů biologické aktivity hlL12, jako je _ inhibice proliferace lidských fytohemaglutininových blastů v testu proliferace fytohemaglutininových blastů (PHA) nebo inhibice navázání receptoru v testu navázání receptoru lidského IL-12 (popisuje se v příkladu 3, test indukce interferonu gama). Tyto indikátory biologické aktivity hIL-12 se mohou hodnotit jedním nebo více standardními testy in vivo nebo in vitro, které jsou známy v oboru (popisuje se v přikladu 3).
Termín „aktivita zahrnuje aktivity, jako je specifita/afinita navázání protilátky na antigen, například protilátky proti hIL-12, která se váže na antigen IL-12, a/nebo neutralizační síla protilátky, například protilátky proti hIL-12, jejíž navázání na hIL-12 inhibuje biologickou aktivitu hIL-12, například inhibice proliferace blastů PHA • · e «·· · * · · 0 • · · 000 000 ** · 00 000 00 0000 nebo inhibice navázání receptorů v testu navázání receptorů lidského IL-12 (popisuje se v příkladu 3).
Termín „povrchová plazmonová rezonance zahrnuje optický jev, který umožňuje analýzu biospecifických interakcí v reálném čase, detekcí změn koncentrací proteinů v biosensorové matrici, například použitím systému BIAcore (firma Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ) . Dále se popisuje v Příkladu 5 a v publikaci Jonsson, U., et al., (1993), Ann. Biol. Clin. 51: 19-26, Jonsson, U., et al., (1991) Biotechniques, 11: 620-627, Johnsson, B., et al., (1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131 a Johnnson, B., et al., (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277.
Termín „Koff znamená rychlostní konstantu pro disociaci protilátky z komplexu protilátka/antigen..
Termín „Kd zde znamená disociační konstantu určité interakce protilátka-antigen.
Termín „molekula nukleové kyseliny zahrnuje molekuly DNA a RNA. Molekula nukleové kyseliny může být jednořetězcové nebo dvouřetězcová, ale výhodná je dvouřetězcová DNA.
Termín „molekula izolované nukleové kyseliny zde znamená nukleové kyseliny kódující protilátky nebo části protilátek (například VH, VL, CDR3), které se vážou na hIL-12 (zahrnuty jsou „izolované protilátky) a zahrnuje molekulu nukleové kyseliny, ve které nukleotidové sekvence kódující protilátku nebo její část neobsahují jiné nukleotidové sekvence kódující protilátku nebo její část, která se váže na antigen jiný než je hIL-12 a kterou mohou jiné sekvence přirozeně lemovat v lidské genomové DNA. Tak například izolovaná nukleové kyselina podle vynálezu kódující oblast VH protilátky anti-IL12 neobsahuje jiné sekvence kódující jinou oblast VH, která se váže na jiné antigeny než je IL-12. Termín „molekula izolované protilátky také zahrnuje sekvence kódující bivalentní, bispecifické protilátky, jako je „diabody, ve kterých oblasti ······ · · · ·· ·· *0 · ··♦« « « « *
VH a VL neobsahuji jiné sekvence než sekvence bivalentní bispecifické protilátky.
Termín „vektor zahrnuje molekulu nukleové kyseliny schopnou přenášet jinou nukleovou kyselinu, na kterou byl navázán. Jedním typem vektoru je plazmid, který představuje smyčku kruhové dvouřetězcové DNA, do které mohly být ligovány segmenty DNA. Jiným typem vektoru je virový vektor, kde se do virového genomu mohly ligovat další segmenty DNA. Jisté vektory jsou schopny autonomní replikace v hostitelské buňce, do které jsou zavedeny (například bakteriální vektory, které mají bakteriální původ replikace a epizomální savčí vektory). Jiné vektory (například neepizomální savčí vektory) se mohou po zavedení do hostitelské buňky začlenit do genomu hostitelské buňky a tím se replikují spolu s hostitelským genomem. Navíc jisté vektory jsou schopny řídit expresi genů, které do nich jsou operativně navázány. Takové vektory se nazývají „rekombinantní expresívní vektory (nebo jednoduše „expresívní vektory). V obecném případě expresívní vektory, které se využívají v metodách rekombinace DNA jsou často ve formě plazmidů. V tomto dokumentu se termíny „vektor a „plazmid mohou vzájemně zaměňovat, protože plazmid je nejběžněji používaná forma vektoru. Vynález však také zahrnuje jiné formy expresivních vektorů, jako jsou virové vektory (například retroviry s defektní replikací, adenoviry a adenoasociované viry), které vykazuji ekvivalentní funkce.
Výraz „rekombinantní hostitelská buňka (nebo jednoduše „hostitelská buňka) zahrnuje buňku, do které byl zaveden rekombinantní expresívní vektor. Rozumí se, že takový termín neznamená pouze určitou buňku, ale také potomstvo takové buňky. Vzhledem k tomu, že se mohou v následujících generacích objevit určité modifikace způsobené buď mutacemi nebo vlivem prostředí, takové potomstvo nemůže být ve skutečnosti identické s rodičovskou buňkou, ale stále jsou v rozsahu zde použitého termínu „hostitelská buňka.
Zde používaný termín „modifikace znamená změny jedné nebo více aminokyselin v protilátkách nebo v jejích částech vázajících se na antigen. Ke změně může dojít přidáním, substitucí nebo delecí aminokyseliny v jedné nebo ve více polohách. Změna může být provedena použitím známých metod, jako je mutageneze PCR.
Výraz „kontaktní poloha zahrnuje polohu aminokyseliny v CDR1, CDR2 nebo CDR3 variabilní oblasti těžkého řetězce nebo lehkého řetězce protilátky, která je obsazena aminokyselinou, která je v kontaktu s antigenem v jedné z dvaceti šesti známých struktur komplexu protilátek-antigen. Jestliže aminokyselina CDR v libovolné z 26 známých objasněných struktur protilátkových komplexů přijde do kontaktu s antigenem, pak tato aminokyselina může být považována, že obsadila kontaktní polohu. Kontaktní polohy vykazují vyšší pravděpodobnost být obsazeny aminokyselinou, která přijde do kontaktu s antigen, než polohy, které nejsou kontaktní. Kontaktní poloha s výhodou je poloha CDR, která obsahuje aminokyselinu, jenž přijde do kontaktu s antigenem ve více než 3 z 26 struktur (> 11,5 %) . Nejvýhodnější je, když kontaktní poloha je poloha CDR, která obsahuje aminokyselinu, která přijde do kontaktu s antigenem ve více než 8 z 25 struktur (> 32 %) .
Termín „hypermutační poloha zahrnuje aminokyselinový zbytek, který obsazuje polohu v oblasti CDR1, CDR2 nebo CDR3 variabilní oblasti těžkého nebo lehkého řetězce protilátky, o které se uvažuje, že má vysokou frekvenci nebo pravděpodobnost somatické hypermutace během afinitní maturace protilátky in vivo. Termín „vysoká frekvence nebo pravděpodobnost somatické hypermutace zahrnuje frekvenci nebo pravděpodobnost 5-ti až přibližně 40-ti% šance, že zbytek se podrobí somatické hypermutaci během afinitní maturace protilátky in vivo. Rozumí se, že všechna rozmezí v tomto daném rozmezí jsou součástí • ·
vynálezu, například 5 až přibližně 30 %, například 5 až přibližně 15 %, například 15 až přibližně 30 %.
Termín „výhodná (preferovaná) poloha selektivní mutageneze zahrnuje aminokyselinový zbytek, který obsazuje polohu v oblasti CDR1, CDR2 nebo CDR3 variabilní oblasti těžkého nebo lehkého řetězce, kterou je možné považovat za kontaktní nebo hypermutační polohu.
Výraz „přístup selektivní mutageneze zahrnuje způsob zlepšení aktivity protilátky selekcí a individuální mutací aminokyselin CDR v alespoň jedné výhodné poloze selektivní mutageneze, hypermutační a/nebo kontaktní poloze. Termín „selektivně mutovaná lidská protilátka je protilátka, která obsahuje mutaci v poloze vybrané použitím přístupu selektivní mutageneze. V jiném provedení podle vynálezu přístup selektivní mutageneze poskytuje způsob přednostně mutující vybrané jednotlivé aminokyselinové zbytky v CDR1, CDR2 nebo CDR3 variabilní oblasti těžkého řetězce (dále v textu Hl, H2 respektive H3) nebo CDR1, CDR2 nebo CDR3 variabilní oblasti lehkého řetězce (dále v textu se označuje jako LI, L2 respektive L3) protilátky. Aminokyselinové zbytky mohou být vybrány z výhodných poloh selektivní mutageneze, kontaktních poloh nebo hypermutačních poloh. Jednotlivé aminokyseliny se vybraly na základě jejich polohy ve variabilní oblasti těžkého nebo lehkého řetězce. Rozumí se, že hypermutační poloha může být též kontaktní poloha. V provedení vynálezu přístup selektivní mutageneze je „cílený přístup. Termín „cílený přístup zahrnuje způsob výhodného mutování vybraných jednotlivých aminokyselinových zbytků v CDR1, CDR2 nebo CDR3 variabilní oblasti těžkého řetězce nebo CDR1, CDR2 nebo CDR3 variabilní oblasti lehkého řetězce protilátky v cíleném způsobu, například „přístup cílený do skupin nebo „přístup cílený do CDR. V „přístupu cíleném do skupin jsou cíleny jednotlivé aminokyselinové zbytky v určitých skupinách na základě selektivních mutací, přičemž tyto skupiny zahrnují
999 9 . .J * 4 skupiny I (zahrnující L3 a H3) , II (zahrnující H2 a LI) a III (zahrnující L2 a Hl) a jsou uvedeny v pořadí odpovídajícím preferenci pro cílení. V „přístupu cíleném do CDR jednotlivé aminokyselinové zbytky v určitých CDR jsou cíleny na základě selektivních mutací v pořadí podle preference cílení, které je následující: H3, L3, H2, LI, Hl a L2. Vybraný aminokyselinový zbytek je mutován, například alespoň na dva jiné aminokyselinové zbytky, a je stanoven účinek mutace na aktivitu protilátky. Aktivita je měřena jako změna ve vazebné specifitě/afinitě a/nebo neutralizační síla protilátky. Rozumí se, že přístup selektivní mutageneze může být používán při optimalizaci libovolné protilátky získané z libovolného zdroje, který zahrnuje fágové zobrazení, transgenní zvířata s embryonálními geny lidského IgG, lidské protilátky izolované z lidských buněk B. S výhodou je přístup selektivní mutageneze využíván na protilátkách, které nemohou být optimalizovány dalším použitím technologie fágového zobrazení. Rozumí se, že protilátky z libovolného zdroje zahrnujícího fágové zobrazení, transgenní zvířata s embryonálními geny lidského IgG, lidské protilátky izolované z lidských buněk B mohou být subjektem zpětné mutace před nebo po přístupu selektivní mutageneze.
Termín „aminokyselinový zbytek zvyšující, resp. zesilující aktivitu zahrnuje aminokyselinový zbytek, který zlepšuje aktivitu protilátky. Rozumí se, že aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu může nahradit aminokyselinový zbytek ve výhodné poloze selektivní mutageneze, kontaktní poloze nebo hypermutační poloze a dále v jedné nebo více
CDR může být přítomen více jak jeden zbytek zvyšuj ící aktivitu.
Aminokyselinový zbytek zvyšuj ící aktivitu zahrnuj e aminokyselinový zbytek, který zlepšuje vazebnou specifitu/afinitu protilátky, například protilátky proti lidskému IL-12 vázající se na IL-12. Aminokyselinový zbytek zesilující aktivitu také zahrnuje aminokyselinový zbytek, ·· · ·· ·· • · · · · · ·· • ♦ · · 9· • · · 9 9 9· • · · ·e · ·· ··· ·· ···· který zlepšuje neutralizační sílu protilátky, například protilátky proti lidskému IL-12, která inhibuje lidský IL-12.
Různé aspekty vynálezu jsou detailněji popsány v následujících sekcích.
I. Lidské protilátky, které se vážou na lidský IL-12
Tento vynález popisuje izolované lidské protilátky nebo jejich části vázající se na antigen, které se vážou na lidský IL-12. Výhodně lidské protilátky podle vynálezu jsou rekombinantní lidské protilátky neutralizující hIL-12. Protilátky podle vynálezu, které se vážou na lidský IL-12, mohou být vybrány například testováním jedné nebo více lidských knihoven cDNA VL a VH s hIL-12, jako jsou postupy fágového zobrazení popsané v příkladu 1. Testování knihoven lidské cDNA VL a VH z počátku identifikovalo série protilátek proti IL-12, ze kterých se pro další vývoj vybrala jedna protilátka nazvaná „Joe 9 (nebo „Joe 9 divokého typu). Joe 9 je protilátka proti lidskému IL-12 s relativně nízkou afinitou (například hodnota KOff je přibližně 0,1 s’1) , přesto však je použitelná při specifickém navázání a detekci hIL-12. Afinita protilátky Joe 9 se zlepšila provedením mutageneze těžkého a lehkého řetězce CDR, přičemž se produkuje soubor variabilních oblastí lehkého a těžkého řetězce, které se „míchaly a párovaly a dále mutovaly, což vede k řadě dalších protilátek proti hIL-12 se zvýšenou afinitou pro hIL-12 (popisuje se v příkladu 1, tabulka č. 2 (doplněk A) a uspořádání sekvence na obrázku č. 1A až D).
Z těchto protilátek lidská protilátka proti hIL-12 označená jako Y61 demonstrovala podstatné zlepšení vazebné afinity (například, hodnota KOff je přibližně 2 x 10-4 s-1) .
Protilátky proti hIL-12 Y61 se vybraly pro další afinitní maturaci provedenou individuální mutací specifických aminokyselinových zbytků v CDR těžkého a lehkého řetězce. Aminokyselinové zbytky protilátky Y61 se vybraly pro místně specifickou mutaci (přístup selektivní mutace) založenou na aminokyselinovém zbytku, který zabírá preferovanou polohu selektivní mutageneze, kontaktní a/nebo hypermutační polohu. Shrnutí substitucí ve vybraných polohách v CDR těžkého a lehkého řetězce je zobrazeno na obrázku č. 2A až 2H.
Preferovaná rekombinantní neutralizační protilátka podle vynálezu, zde uvedená jako J695, je výsledkem substituce z Gly na Tyr v poloze 50 CDR2 lehkého řetězce protilátky Y61 a substituce Gly na Tyr v poloze 94 CDR3 lehkého řetězce protilátky Y61.
Uspořádání aminokyselinové sekvence variabilních oblastí těžkého a lehkého řetězce souboru protilátek proti IL-12 podle vynálezu při vývoji protilátky Joe divokého typu až J695 jsou zobrazena na obrázku č.
IA až ID. Tato uspořádání sekvencí umožnila identifikaci konvenčních sekvencí preferované variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce protilátek podle vynálezu, které se vážou na hIL-12, stejně jako konvenčních sekvencí CDR3, CDR2 a CDR1, při vývoji od protilátky Joe 9 až na J695. Kromě toho analýza mutageneze protilátky Y61 shrnutá na obrázku č. 2A až 2H umožnila identifikaci konvenčních sekvencí variabilních oblastí těžkého a lehkého řetězce, které se vážou na hIL-12, stejně jako konvenčních sekvencí CDR3, CDR2 a CDR1, které vážou hIL-12, při vývoji z Y61 na J695, které obsahují modifikované sekvence protilátky Y61 a ještě si zachovávají dobré vazebné charakteristiky pro hIL-12. Preferované sekvence CDR, VH a VL podle vynálezu (zahrnující konvenční sekvence) jak se identifikovalo sekvenčními identifikátory v přiloženém seznamu sekvencí, jsou shrnuty dále v textu.
SEQ ID NO: řetězec protilátky oblast sekvence
1 konvenční Joe 9 na J695 CDR H3 (H/S)-G-S-(H/Y)-D-(N/T/Y)
2 konvenční Joe 9 až J695 CDR L3 Q-(S/T)-Y-(D/E)-(S/R/K)- (S/G/Y)-(L/F/T/S)- (R/S/T/w/H)-(G/P)-(S/T/A/L)(R/S/M/T/L)-(V/I/T/M/L)
3 konvenční Joe 9 na J695 CDR H2 F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S- V-K-G
4 konvenční Joe 9 na J695 CDR L2 (G/Y)-N-(D/S)-(Q/N)-R-P-S
5 konvenční Joe 9 na J695 CDR H1 F-T-F-S-(S/E)-Y-G-M-H
6 konvenční Joe 9 na J695 CDR LI (S/T)-G-(G/S)-(R/S)-S-N-I- (G/V)-(S/A)-(N/G/Y) -(T/D)-V- (K/H)
7 konvenční Joe 9 na J695 VH (celá sekvence VH, uvedeno v seznamu sekvencí)
8 konvenční Joe 9 na J695 VL (celá sekvence VL, uvedeno v seznamu sekvencí)
9 konvenční Y61 na J695 CDR H3 H-(G/V/C/H)-(S/T)- (H/T/V/R/I)-(D/S)- (N/K/A/T/S/F/W/H)
10 konvenční Y61 na J695 CDR L3 Q-S-Y-(D/S)-(Xaa)- (G/D/Q/L/F/R/H/N/Y)-T-H-P-A- L-L
11 konvenční Y61 na J695 CDR H2 (F/T/Y)-I-(R/A)-Y-(D/S/E/A)- (G/R)-S-(Xaa)-K-(Y/E)-Y-A-D- S-V-K-G
12 konvenční Y61 na J695 CDR L2 (G/Y/S/T/N/Q)-N-D-Q-R-P-S
13 konvenčni CDR H1 F-T-F-(Xaa)-(Xaa)-(Y/H)-
♦ · φ φ * ·
Y61 na J695 (G/M/A/N/S)-M-H
14 konvenční Y61 na J695 CDR LI S-G-G-R-S-N-I-G- (S/C/R/N/D/T)-(N/M/I)- (T/Y/D/H/K/P)-V-K
15 konvenční Y61 na J695 VH (celá sekvence VH, uvedeno v seznamu sekvencí)
16 konvenční Y61 na J695 VL (celá sekvence VL, seznam sekvencí)
17 Y61 CDR H3 H-G-S-H-D-A
18 Y61 CDR L3 Q-S-Y-D-R-G-T-H-P-A-L-L
19 Y61 CDR H2 F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S- V-K-G
20 Y61 CDR L2 G-N-D-Q-R-P-S
21 Y61 CDR H1 F-T-F-S-S-Y-G-M-H
22 Y61 CDR LI S-G-G-R-S-N-I-G-S-N-T-V-K
23 Y61 VH (celá sekvence VH, uvedeno v seznamu sekvencí)
24 Y61 VL celá sekvence VL, uvedeno v seznamu sekvencí)
25 J695 CDR H3 H-G-S-H-D-A
26 J695 CDR 13 Q-S-Y-D-R-Y-T-H-P-A-L-L
27 J695 CDR H2 F-I-R-Y-D-G-S-A-K-Y-Y-A-D-S- V-K-G
28 J695 CDR L2 Y-N-D-Q-R-P-S
29 J695 CDR H1 F-T-F-S-S-Y-G-M-H
30 J695 CDR LI S-G-S-R-S-N-I-G-S-A-T-V-K
31 J695 VH (celá sekvence VH, uvedeno v seznamu sekvencí)
32 J695 VL (celá sekvence VL, uvedeno v seznamu sekvencí)
Protilátky produkované afinitní maturací protilátky Joe 9 divokého typu byly funkčně charakterizovány povrchovou ·· ··· · a Kd a Kof f.
hodnotu K plazmonovou rezonanci, aby se stanovila hodnot Produkovala se série protilátek, které vykazují v rozmezí přibližně 0,1 s1 až přibližně 1 x 105 s-1 a výhodněji hodnota KOff je přibližně 1 x 104 s”1 až 1 x 10~5 s'1 nebo méně. U protilátek se také in vitro charakterizovala schopnost inhibovat proliferaci fytohemaglutininových blastů (PHA), jak se popisuje v příkladu 3. Produkovaly se série protilátek, jejichž hodnota IC5o je v rozmezí přibližně 1 x 10'6 M až přibližně 1 x ΙΌ11 M, výhodnější je přibližně 1 x ΙΟ-10 M až 1 x 10-11 M nebo méně.
Vynález popisuje izolovanou lidskou protilátku nebo její část vázající se antigen, která se váže na lidský IL-12 a disociujě z lidského IL-12 při hodnotě rychlostní konstanty
KOff 0,1 s_1 nebo menší, jak se stanovilo povrchovou plazmonovou.
rezonancí, nebo která inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu proliferace fytohemaglutininových blastů (test PHA) in vitro s hodnotou
IC5o je 1 x 10~6 M nebo méně. V preferovaných provedeních podle vynálezu izolovaná protilátka proti lidskému IL-12 nebo její část vázající se antigen disociujě z lidského IL-12 při hodnotě rychlostní konstanty Koff 1 x 10-2 s’1 nebo menší nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 107 nebo méně. Ve více preferovaném provedení izolovaná protilátka proti IL-12 nebo její část vázající se na antigen disociujě z lidského IL-12 při hodnotě rychlostní konstanty Koff 1 x 10'3 s“1 nebo menší nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10'8 nebo menší. Ve výhodnějším provedení vynálezu izolovaná protilátka proti lidskému IL-12 nebo její část vázající se antigen disociujě z lidského IL12 při hodnotě rychlostní konstanty KOff 1 x 10’4 s_1 nebo menší nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10-9 nebo menší. Ve výhodnějším provedeni vynálezu izolovaná protilátka proti lidskému IL-12 •9 ···« « 9
nebo její část vázající se antigen disociuje z lidského IL-12 při hodnotě rychlostní konstanty Koff 1 χ 10'5 s-1 nebo menší nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC50 1 χ 1O-10 nebo menší. Ve výhodnějším provedení vynálezu izolovaná protilátka proti lidskému IL-12 nebo její část vázající se antigen disociuje z lidského IL-12 při hodnotě rychlostní konstanty Koff 1 χ 105 s’1 nebo menší nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC50 1 χ 10-11 nebo méně.
Rychlostní konstanta disociace (KOff) protilátky proti IL12 může být stanovena povrchovou plazmonovou rezonancí (popisuje se v příkladu 5) . V obecném případě analýza povrchovou plazmonovou rezonancí měří vazebné interakce v reálném čase mezi ligandem (rekombinantní lidská IL-12 imobilizovaná na matrici biosenzoru) a analytem (protilátka v roztoku) povrchovou plazmonovou rezonancí (SPR) použitím systému BIAcore (firma Pharmacia Biose.nsor, Piscataway, NJ) . Povrchová plazmonová analýza může být také uskutečněna §
imobilizací analytu (protilátka na matrici biosenzoru) a přítomností ligandů (rekombinantní IL-12 v roztoku). Neutralizační aktivita protilátek IL-12 nebo jejich částí vázajících se na antigen může být hodnocena použitím jednoho nebo více z několika vhodných testů in vitro (popisuje se v příkladu 3).
Je dobře známo v oboru, že CDR těžkého a lehkého řetězce protilátek hrají důležitou úlohu při vazebné specifitě/afinitě protilátky pro antigen. Proto vynález zahrnuje lidské protilátky, které vykazují CDR lehkého a těžkého řetězce protilátky Joe 9, stejně jako protilátky mající CDR, které byly modifikovány za účelem zlepšení vazebné specifity/afinity protilátky. Jak se popisuje v příkladu 1, série modifikací CDR lehkého a těžkého řetězce vede k afinitní maturaci lidských protilátek proti hIL-12.
Uspořádání aminokyselinové sekvence variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce sérií lidských • ti ····
• ·· ti ti ·· ti ti titi • ti titi • ti ti titi • ti titi ··· titi titititi protilátek vyskytujících se při vývoji od protilátky Joe 9 divokého typu na J695, které se váží na lidský IL-12, jsou zobrazeny na obrázcích 1A až ID. Motivy konvenční sekvence v případě CDR protilátek mohou být stanoveny z uspořádání sekvence (jak je shrnuto v tabulce shora v textu). Například konvenční motiv v případě VH CDR3 při vývoji od protilátky Joe 9 až na J695 obsahuje aminokyselinovou sekvenci: (H/S)-G-S(H/Y)-D-(N/T/Y) (SEQ ID NO: 1), která zahrnuje aminokyseliny z polohy 95 až 102 konvenční HCVR zobrazené v SEQ ID NO: 7. Konvenční motiv v případě VL CDR3 obsahuje aminokyselinovou sekvenci: Q-(S/T)-Y-(D/E)-(S/R/K)-(S/G/Y)-(L/F/T/S)(R/S/T/W/H) - (G/P) - (S/T/A/L) - (R/S/M/T/L-V/I/T/.M/L) (SEQ ID NO:
2), která obsahuje aminokyseliny od polohy 89 do 97 konvenční LCVR zobrazené v SEQ ID NO: 8.
Tedy v dalším aspektu vynález poskytuje izolovanou lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen, která má následující charakteristiky:
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC5o 1 χ 10-6 nebo nižší,
b) má CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1 a
c) má CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2.
V preferovaném provedeni vynálezu protilátka dále obsahuje VH CDR2 zahrnující aminokyselinovou sekvenci F-I-R-Y-D-G-S-NK-Y-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID NO: 3) (která obsahuje aminokyseliny od polohy 50 do 65 konvenční HCVR zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 7) a dále obsahuje VL CDR2 zahrnující aminokyselinovou sekvenci (G/Y)-N-(D/S)-(Q/N)-R-P-S (SEQ ID NO: 4) (která obsahuje aminokyseliny od polohy 50 do 56 konvenční LCVR zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 8) .
·· »·«·
V jiném preferovaném provedení vynálezu protilátka dále obsahuje VH CDR1 zahrnující aminokyselinovou sekvenci F-T-F-S(S/E)-Y-G-M-H (SEQ ID NO: 5) (která obsahuje aminokyseliny od polohy 27 do 35 konvenční HCVR obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 7) a dále obsahuje VL CDR1 zahrnující aminokyselinovou sekvenci (S/T)-G-(G/S)-(R/S)-S-N-I-(G/V)(S/A)-(N/G/Y)-(T/D)-V-(K/H) (SEQ ID NO: 6) (která obsahuje aminokyseliny od polohy 24 do polohy 34 konvenční LCVR obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 8).
V ještě jiném výhodném provedení vynálezu protilátka podle vynálezu obsahuje HCVR zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 7 a LCVR obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 8.
Další konvenční motivy mohou být stanoveny na základě mutační analýzy uskutečněné v případě protilátky Y61, která vede k protilátce J695 (shrnuto na obrázcích 2A až 2H) . Jak zobrazovaly grafy uvedené na obrázcích 2A až 2H) , jisté zbytky CDR lehkého a těžkého řetězce protilátky Y61 byly podrobeny substituci, aniž se podstatně zhoršily vazebné vlastnosti protilátky na hIL-12. Jednotlivé substituce v poloze 30 v CDR
H1 s dvanácti různými aminokyselinovými zbytky podstatně neredukují hodnotu rychlostní konstanty tato poloha zbytky. Pak v protilátce
KOff protilátky, substituci různými mutační analýzy což ukazuje, že aminokyselinovými (to znamená polohy například disociace . nepodléhá na základě
Y61, která byla podrobena substituci jinými aminokyselinovými zbytky) byly stanoveny konvenční motivy. Konvenční motivy v případě CDR3 těžkého a lehkého řetězce jsou zobrazeny v SEQ ID NO: 9 a 10^ v případě CDR2 těžkého a lehkého řetězce jsou uvedeny v SEQ ID NO: 11 respektive 12 a konvenční motivy CDR1 těžkého ^lehkého řetězce jsou zobrazeny v SEQ ID NO: 13 respektive 14. Konvenční motivy v případě oblastí VH a VL jsou zobrazeny v SEQ ID NO: 15 respektive 16.
í
9» »«·«
Obdobně v dalším aspektu vynálezu se charakterizuje izolovaná lidské protilátka nebo její části vázající se antigen, která má následující charakteristiky:
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10~9 nebo nižší,
b) má CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 9 a
c) má CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 10.
V preferovaném provedení vynálezu protilátka dále obsahuje VH CDR2 zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 11 a dále obsahuje VL CDR2 zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 12.
V jiném výhodném provedení protilátka dále obsahuje VH CDR1 zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 13 a dále obsahuje VL CDR1 zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 14.
V ještě jiném výhodném provedení vynálezu protilátka dále obsahuje HCVR zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 15 a dále obsahuje LCVR zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 16.
Preferovaná protilátka podle vynálezu, kterou je lidská protilátka proti h.IL-12 Y61, byla produkována afinitní matuřací protilátky Joe 9 divokého typu mutagenezí CDR3 (jak se popisuje v příkladu 3). Protilátka Y61 měla zlepšenou specifitu/vazebnou afinitu, což se stanovilo povrchovou plazmonovou rezonancí a neutralizačními testy in vitro. CDR3 těžkého a lehkého řetězce protilátky Y61 jsou zobrazeny v SEQ ID NO: 17 respektive 18, CDR2 těžkého a lehkého řetězce protilátky Y61 jsou zobrazeny v SEQ ID NO: 19 respektive 20 a CDR1 těžkého a lehkého řetězce protilátky Y61 jsou zobrazeny v SEQ ID NO: 21 respektive 22. VH protilátky Y61 má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 23 a VL protilátky Y61 má ·· ···« ·* • · • · »· »* » · 1 · aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 24 (tyto sekvence jsou také zobrazeny na obrázcích 1A až ID ve srovnání s protilátkou Joe 9).
Obdobně v dalším aspektu vynálezu se charakterizuje izolovaná lidská protilátka nebo její části vázající se antigen, která má následující charakteristiky:
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 109 nebo nižší,
b) má CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 17 a
c) má CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 18.
V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se antigen má CDR2 těžkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 19 a CDR2 lehkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 20.
V jiném výhodném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se antigen má CDR1 těžkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 21 a CDR1 lehkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 22.
V ještě jiném výhodném provedení izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se antigen obsahuje variabilní oblast těžkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 23 a variabilní oblast lehkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 24.
V jistých provedeních vynálezu protilátka plné délky obsahuje kontaktní oblast těžkého řetězce, jako jsou konstantní oblasti IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA a IgE, a libovolnou allotypickou variantu popsanou v publikaci Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, fifth Edition, U.S. Department of Health and Human • · ···· · · · · · · · • · · ···· · · · • · · ··· ··
Services, NIH Publication No. 91-3242). Konstantní oblast těžkého řetězce protilátky je s výhodou konstantní oblast těžkého řetězce IgGl. V jiném případě částí protilátky může být fragment Fab, fragment F(ab'2) nebo jednořetězcový fragment Fv.
Modifikace jednotlivých zbytků protilátky Y61 vede k produkci souboru protilátek zobrazených na obrázcích 2A až 2H. Specifita/vazebná afinita každé protilátky se stanovila povrchovou plazmonovou rezonancí a/nebo neutralizačními testy ín vitro.
Obdobně v dalším aspektu vynálezu se charakterizuje izolovaná lidská protilátka nebo její části vázající se antigen, která má následující charakteristiky:
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10'9 nebo nižší,
b) má CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 404 až SEQ ID NO: 469 a
c) má CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 534 až SEQ ID NO: 579
V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen dále obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 335 až SEQ ID NO: 403 a dále obsahuje CDR2 lehkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 506 až SEQ ID NO: 533.
V jiném výhodném provedeni vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen dále obsahuje CDR1 těžkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 288 až SEQ ID NO: 334 a dále obsahuje CDR1 lehkého řetězce zahrnující
aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 470 až SEQ ID NO: 505.
V ještě jiném výhodném provedení izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se antigen obsahuje variabilní oblast těžkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 23 a variabilní oblast lehkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 24.
V jistých provedeních vynálezu protilátka plné délky obsahuje kontaktní oblast těžkého řetězce, jako jsou konstantní oblasti IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA a IgE, a libovolnou allotypickou variantu jak se popisuje v publikaci Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) . Konstantní oblast těžkého řetězce protilátky je s výhodou konstantní oblast těžkého řetězce IgGl. V jiném případě částí protilátky může být fragment Fab, fragment F(ab'2) nebo jednořetězcový fragment Fv.
Zvláště výhodná rekombinantní neutralizační protilátka J695 podle vynálezu byla produkována místně řízenou mutagenezí kontaktních a hypermutačních aminokyselinových zbytků protilátky Y61 (popisuje se v příkladu 2 v sekci III dále v textu). Protilátka J695 se liší od protilátky Y61 substitucí Gly za Tyr v poloze 50 CDR2 lehkého řetězce protilátky Y61 a substitucí Gly za Tyr v poloze 94 lehkého řetězce CDR3. CDR3 těžkého a lehkého řetězce protilátky J695 jsou zobrazeny v SEQ ID NO: 25 respektive 26, CDR2 těžkého a lehkého řetězce protilátky J695 jsou zobrazeny v SEQ ID NO: 27 respektive 28 a CDR1 těžkého a lehkého řetězce CDR1 protilátky J695 jsou zobrazeny v SEQ ID NO: 29 respektive 30. VH protilátky J695 má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 31 a VL protilátky J695 má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 32 (tyto sekvence jsou také zobrazeny na obrázcích 1A až ID ve srovnání s protilátkou Joe 9) .
Tedy v dalším aspektu vynálezu se charakterizuje izolovaná
ΊΟ
lidská protilátka nebo její části vázající se antigen, která:
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10~9 nebo nižší,
b) má CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 25 a
c) má CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 26.
V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo těžkého řetězce její část vázající se na obsahující aminokyselinovou antigen sekvenci
NO: 27 a CDR2 lehkého řetězce obsahuj ící sekvenci
SEQ ID NO: 28.
V j iném výhodném provedení vynálezu má CDR2
SEQ ID aminokyselinovou izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen dále obsahuje
CDR1 těžkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ
ID NO: 29 a dále obsahuje CDR1 lehkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 30.
Ještě v jiném výhodném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se antigen obsahuje variabilní oblast těžkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 31 a variabilní oblast lehkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 32.
V jistých provedeních vynálezu protilátka plné délky obsahuje kontaktní oblast těžkého řetězce, jako jsou konstantní oblasti IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA a IgE, a libovolnou allotypickou variantu jak se popisuje v publikaci Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of
Immunological Interest, fifth Edition, U.S. Department of
Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242).
Konstantní oblast těžkého řetězce protilátky je s výhodou konstantní oblast těžkého řetězce IgGl. V jiném případě částí ♦····· · · · ·· ·· • · · · · ·· · · · · • · · · · · *··· · ··· ··· ··· ·· · ·· ··· ·· · ··· protilátky itůže být fragment Fab, fragment F(ab'2)nebo jednořetězcový fragment Fv.
Mohou být provedeny další mutace ve výhodných konvenčních sekvencích CDR3, CDR2 a CDR1 protilátek ve vývoji z protilátky Joe 9 na J695 nebo z protilátky Y61 na J695 za vzniku dalších protilátek proti IL-12 podle vynálezu. Takové metody úpravy mohou být uskutečněny použitím standardních postupů v molekulární biologii, jako je mutageneze PCR, cíleni jednotlivých kontaktních nebo hypermutačních aminokyselinových zbytků v CDR lehkého a/nebo těžkého řetězce. Dále následuje kinetická a funkční analýza upravených protilátek, jak se popisuje v textu (například neutralizační testy popsané v příkladu 3 a analýza BIAcore, jak se popisuje v příkladu 5).
Obdobně v dalším aspektu vynálezu se charakterizuje izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se antigen, která:
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC5o 1 x 10“6 M nebo nižší,
b) zahrnuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1 a CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 3 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 5, nebo jejich mutant, který má jednu nebo více substitucí aminokyselin v preferované poloze selektivní mutageneze nebo v hypermutační poloze, přičemž uvedený mutant nemá hodnotu rychlostní konstanty disociace vyšší než je desetinásobek hodnoty v případě protilátky zahrnující CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1 a CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 3 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 5a φ ·
Φ ·«·♦ Μ φ φφ ·· • φφφφ φ · φ φ • φφφ · · · • φφφ φφφφ φ • φφφ φφφ • ·· ··· φφ φφφφ
c) zahrnuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 a CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 4 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 6, nebo jejich mutant, který má jednu nebo více substitucí aminokyselin v preferované poloze selektivní mutageneze nebo v hypermutační poloze, přičemž uvedený mutant nemá hodnotu rychlostní konstanty disociace vyšší než je desetinásobek hodnoty v případě protilátky obsahující CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 a CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 4a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 6.
Obdobně v dalším aspektu vynálezu se charakterizuje izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se antigen, která:
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC5o 1 x 10“9 M nebo nižší,
b) obsahuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 9 a CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 11 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 13 nebo jejich mutant, který má jednu nebo více substitucí aminokyselin v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní poloze nebo v hypermutační poloze, přičemž uvedený mutant nemá hodnotu rychlostní konstanty disociace vyšší než je desetinásobek hodnoty v případě protilátky obsahující CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 9 a CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 11 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:
a
c) obsahuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 10 a CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:
a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 14, nebo jejich mutant, který má jednu nebo více substitucí aminokyselin v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní poloze nebo v hypermutační poloze, přičemž uvedený mutant nemá hodnotu rychlostní konstanty disociace vyšší než je desetinásobek hodnoty v případě protilátky obsahující
CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:
a CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci
SEQ ID NO:
a
CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 14.
Pro odborníka je výhodné, že další mutace v oblastech CDR protilátky podle vynálezu, například u protilátky Y61 nebo J695, mohou být provedeny za vzniku dalších protilátek proti
IL-12 podle vynálezu. Takové modifikační metody mohou být provedeny použitím standardních postupů molekulární biologie, jak se popisuje shora v textu.
Funkční a kinetická analýza upravených protilátek může být provedena podle popisu v příkladu respektive 5. Úpravy jednotlivých zbytků protilátky Y61, které vedou k identifikaci protilátky J695, jsou zobrazeny na obrázcích 2A až 2H a jsou popsány v příkladu
2.
Tedy v dalším provedení vynálezu se charakterizuje izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se antigen, která:
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 109 M nebo nižší,
«« 4^·· 4 * « ·« 4 4
• · 4 4 · • 4 4 4 4 4
4 4 4 • Λ 4 t ♦
4 4 4 i
4 4 4 • t • 4 4 •
1 · 4 • 4 • · 4 4 4 ··«·
obsahuj ící
b) obsahuje
CDR3 těžkého řetězce aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 17 a CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:
a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 21, nebo jejich mutant, který má jednu nebo více substitucí aminokyselin v preferované poloze selektivní mutageneze nebo v hypermutační poloze, přičemž uvedený mutant nemá hodnotu rychlostní konstanty disociace vyšší než je desetinásobek hodnoty v případě protilátky obsahující CDR3 obsahující aminokyselinovou sekvenci
CDR2 těžkého řetězce obsahující těžkého řetězce
SEQ ID NO: 17 a aminokyselinovou sekvenci
SEQ ID NO: 19 a CDR1 těžkého řetězce obsahuj ící aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 21 a
c) obsahuje
CDR3 lehkého řetězce obsahuj ící aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 18 a CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:
a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 22, nebo jejich mutant, který má jednu nebo více substitucí aminokyselin v preferované poloze selektivní mutageneze nebo v hypermutační poloze, přičemž uvedený mutant nemá hodnotu rychlostní konstanty disociace vyšší než je desetinásobek hodnoty v případě protilátky obsahující CDR3 obsahující aminokyselinovou sekvenci
CDR2 lehkého řetězce obsahující sekvenci SEQ ID NO: 2 0 a CDR1 lehkého řetězce aminokyselinovou lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 22.
V jiném aspektu vynálezu se charakterizuje izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se antigen, která:
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC50 1 χ ΙΟ-9 M nebo nižší, • · • · · · • ·
b) obsahuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 25, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 27 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 29, nebo její mutant, který má jednu nebo více substitucí aminokyselin v preferované poloze selektivní mutageneze nebo v hypermutační poloze, přičemž uvedený mutant nemá hodnotu rychlostní konstanty disociace vyšší než je desetinásobek hodnoty v případě protilátky obsahující CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 25, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 27 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 29 a
c) obsahuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 26, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 28 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 30 nebo jejich mutant, který má jednu nebo více substitucí aminokyselin v preferované poloze selektivní mutageneze nebo v hypermutační poloze, přičemž uvedený mutant nemá hodnotu rychlostní konstanty disociace vyšší než je desetinásobek hodnoty v případě protilátky obsahující CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci
SEQ ID NO:
a
CDR2 lehkého řetězce obsahující sekvenci SEQ ID NO: 28 a CDR1 aminokyselinovou lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 30.
V dalším provedení vynálezu se popisují izolované lidské protilátky nebo jejich části vázající se na antigen, které neutralizují aktivitu lidského IL-12 a alespoň jednoho dalšího IL-12 primátů vybraného ze skupiny zahrnující IL-12 paviána, IL-12 kosmana, IL-12 šimpanze, IL-12 cynomolga a makaka, ale které neneutralizuji aktivitu myšího IL-12.
• φ φ φ φ ♦
• · Φ Φ · · ·· · • ΦΦΦ · φ «
Φ · Φ · Φ · Φ φ Φ Φ · ΦΦΦ
ΦΦ ΦΦΦ ΦΦ ΦΦΦΦ
II. Výběr rekombinantních lidských protilátek
Rekombinantní lidské protilátky podle vynálezu mohou být izolovány testováním knihovny rekombinantních kombinačních protilátek, upřednostňuje se knihovna scFv zobrazující fága, připravená použitím cDNA lidského VL a VH, která se připravila z mRNA získané z lidských lymfocytů. Metodika přípravy a testování takové knihovny je známa v oboru. Navíc běžně dostupné sady pro vytvoření knihoven zobrazujících fága (například firma Pharmacia, Recombinant Phage Antibody Systém, kat. č. 27-9400-01 a firma Stratagene, sada pro vyjádření fága SurfZAP™, kat. č. 240612), příklady metod a činidel zvláště využitelných pro použití při přípravě a testování knihoven zobrazujících protilátky mohou být nalezeny například v publikaci Kang et al., přihláška PCT č. WO 92/18619, Winter et al., přihláška PCT WO 92/20791, Breitling et al., přihláška PCT č. WO 93/01288, McCafferty et al., přihláška PCT č. WO 92/01047, Gerrard et al., přihláška PCT č. WO 92/09690, Fuchs et al., (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372, Hay et al., (1992)
Hum. Antibody Hybridomas 3: 81-85, Huse et al., (1989) Science 246: 1275-1281, McCafferty et al., Nátuře (1990) 348: 552-554, Griffths et al., (1993) EMBO J. 12: 725-734, Hawkins et al., (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896, Clackson et al., (1991)
Nátuře 352: 624-628, Gram et al., (1992) PNAS 89: 3576-3580,
Garrad et al., (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377, Hoogenboom et al., (1991) Nuc. Acid Res. 19: 4133-4137 a Barbas et al., (1991) PNAS 88: 7978-7982.
Protilátkové knihovny užívané při této metodě jsou s výhodou knihovny scFv připravené z lidské cDNA VL a VH. Protilátkové knihovny scFv se s výhodou testují použitím rekombinantního lidského IL-12 jako antigenu za účelem vybrat sekvence lidského těžkého a lehkého řetězce, které vykazují vazebnou aktivitu pro IL-12. Za účelem vybrat protilátky specifické pro podjednotku p35 IL-12 nebo heterodimer p70, ··♦··· ·« · c· ·· • · · · · · · · · · « • · · ··· ··· ·· * ·· ··· ······ bylo provedeno testováni v přítomnosti nadbytku volné podjednotky p40. Preference podjednotky mohou být stanoveny například mikro-Friguetovou titrací, jak se popisuje v příkladu 1.
Když jsou vybrány počáteční lidské segmenty VL a VH, jsou provedeny experimenty „smíchání a párování, aby se vybraly výhodné kombinace párů VL/VH (popisuje se v příkladu 1). V těchto experimentech se testuje schopnost různých párů vybraných segmentů VL a VH vázat se na IL-12. Dále, pro další zlepšení afinity a/nebo dosažení nižší hodnoty rychlostní konstanty Koff pro navázání na hIL-12, segmenty VL a VH výhodného páru(ů) VL/VH mohou být náhodně mutovány, s výhodou v oblasti CDR3 VH a/nebo VL, postupem analogickým s postupem somatické mutace in vivo odpovědným za afinitní maturaci protilátek během přirozené imunitní odezvy. Tato afinitní maturace in vitro může být provedena amplifikací oblasti VH a VL použitím PCR primerů komplementárních s VH CDR3 nebo respektive VL CDR3, přičemž primery byly v jistých polohách prodlouženy náhodnou směsí čtyř nukleotidových bází tak, že výsledné produkty PCR kódují segmenty VH a VL, ve kterých jsou do oblastí VH a/nebo VL CDR3 zavedeny náhodné mutace. Tyto náhodně mutované segmenty VH a VL mohou být znovu vybrány a může se u nich testovat schopnost vázat se na hIL-12 a mohou být vybrány sekvence, které vykazují vysokou afinitu a nízkou hodnotu KOff v případě navázání na IL-12. Tabulka 2 (dodatek A) popisuje protilátky, které vyjadřovaly změněnou vazebnou specifitu/afinitu produkovanou jako výsledek afinitní maturace in vitro.
Po selekci, izolaci a testování protilátky proti hIL-12 podle vynálezu z rekombinantní knihovny zobrazující imunoglobulin, nukleová kyselina kódující vybranou protilátku může být získána z fágové částice(částic) (například z fágového genomu) a může být subklonována do jiných expresívních vektorů standardními postupy rekombinace DNA. Je78 <!
li to nutné, nukleová kyselina může být dále manipulována za vzniku jiných forem protilátky podle vynálezu (například navázané na nukleovou kyselinu kódující další domény imunoglobulinu takové, jako jsou další konstantní oblasti).
Aby se exprimovala rekombinantní lidská protilátka izolovaná testováním kombinační knihovny, klonována do rekombinantního expresívního
DNA kódující protilátku je vektoru a je zavedena do savčích hostitelských buněk, jak se popisuje detailněji v sekci IV dále v textu.
Metody selekce protilátek vázajících se na lidský IL-12 použitím fágové zobrazovací technologie a afinitní maturace vybraných protilátek náhodnou nebo místně řízenou mutagenezí oblastí CDR jsou popsány detailněji v příkladu 1.
Jak se popisuje v příkladu 1, testování cDNA knihovny VL a IL-12, z nichž byla Porovnání variabilní
VH identifikovalo vybrána pro další oblasti těžkého série protilátek proti vývoj protilátka Joe 9.
řetězce protilátky Joe s embryonálními sekvencemi těžkého řetězce vybranými z databáze VBASE odhalilo, že protilátka Joe 9 byla podobná se zárodečnou sekvencí COS-3. COS-3 patří k rodině zárodečných sekvencí VH3.
Rodina VH3 je součást zárodečného repertoáru lidské VH, který je rozdělen do sedmi rodin VH1 až VH7 založených na homologii nukleotidových sekvencí (popisuje se v publikaci
Tomlison et al., (1992) J. Mol. Biol., 227, 776-798 a Cook et al., (1995) Immunology nejvyšší počet členů
Today, 16, 237-242). Rodina a tvoří největší příspěvek repertoáru. V případě libovolné dané sekvence lidské protilátky VH3, rodině VH3 je vysoká
Tomlinson et al.,
Vh3 obsahuje zárodečného embryonální shoda aminokyselinových sekvencí v celé (popisuje se například v publikaci al., (1992)
J. Mol. Biol., 227, 776-798 a Cook et
Immunology aminokyselinové sekvence
Today, 16, mezi libovolnými
237-242). Rozmezí shody dvěma embryonálními sekvencemi VH rodiny VH3 kolísá od zbytků až 98 z přibližně
100 zbytků VH (to znamená, že mezi libovolnými dvěma
79 9 4 • 8 9 tl 9 · · · • 9 • · 9 9 9 9 9· | 99 9 9 9 1 9 9 9 9 9 9 9 • · · ♦ · · <99 · · • 9 · 9 · · 9
zárodečnými sekvencemi VH je 69 až 98% homologie
aminokyselinové sekvence) . V případě většiny párů zárodečných
sekvencí existuje alespoň 80 nebo více shodných
aminokyselinových zbytků (to je alespoň 80% homologie
aminokyselinové sekvence). Vysoký stupeň homologie
aminokyselinové sekvence mezi členy rodiny VH3 vede k tomu, že
jisté aminokyselinové zbytky jsou přítomny v klíčových místech v CDR a v oblastech kostry řetězce VH. Tyto aminokyselinové zbytky udílí strukturální rysy CDR.
Studie struktur protilátek ukázala, že prostorové uspořádání CDR se může rozdělit do rodin CDR s kanonickými (základními) strukturami založenými na klíčových aminokyselinových zbytcích, které obsazují jisté polohy v CDR a v oblastech kostry. V důsledku toho existují v různých protilátkách podobná lokální prostorová uspořádání CDR, která mají kanonické struktury se shodnými klíčovými aminokyselinovými zbytky (popisuje se v publikaci Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196, 901-917 a Chothia et al., (1989) Nátuře, 342, 877-883) . V rodině VH3 existuje konzervace shody aminokyselinových zbytků v klíčových místech kanonické struktury CDR1 a CDR2 (popisuje se v publikaci Chothia et al., (1992), J. Mol. Biol., 227, 799-817).
Embryonální gen VH COS-3 je členem rodiny VH3 a je variantou embryonální alely VH 3-30(DP-49). COS-3 se liší od aminokyselinových sekvencí VH protilátky Joe 9 pouze v pěti polohách. Vysoký stupeň homologie aminokyselinové sekvence mezi VH protilátky Joe 9 a COS-3 a mezi VH protilátky Joe 9 a jiných členů rodiny VH3 také udílí vysoký stupeň strukturální homologie CDR (popisuje se v publikaci Chothia et al., (1992)
J. Mol. Biol., 227, 799-817, Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol., 196, 901-917 a Chothia et al., (1989) Nátuře, 342, 877883) .
Pro odborníka je výhodné, že na základě vysoké podobnosti aminokyselinové sekvence a kanonické struktury s protilátkou • · · ·
Joe 9, mohou být používáni jiní členové rodiny VH3 za vzniku protilátek, které se vážou na lidský IL-12. To může být provedeno například selekcí vhodného VL metodami přeskupení řetězců (popisuje se v publikaci Winter et al., (1994) Annual
Rev. Immunol., 12, 433-55) nebo zavedení CDR z hlodavce nebo jiné lidské protilátky zahrnující CDR z protilátek podle vynálezu do základní struktury rodiny VH3.
Zárodečný repertoár lidského V lambda je rozdělen do 10-ti rodin založených na homologii nukleotidových sekvencí (popisuje se v publikaci Williams et al., (1996) J. Mol.
Biol., 264, 220-232). Porovnání variabilní oblasti lehkého řetězce protilátky Joe 9 se zárodečnými sekvencemi lehkého řetězce vybranými z databáze VBASE ukázalo, že protilátka Joe byla podobná embryonální DPL8 lambda. VL protilátky
Joe 9 se liší od sekvence
DPL8 pouze ve čtyřech polohách základní struktury a je vysoce homologní se sekvencemi základní struktury j iných členů rodiny V^l. Na základě homologie aminokyselinové sekvence a podobnosti kanonické struktury s protilátkou Joe 9 mohou být používány pro vytvoření protilátek, které se vážou na lidský IL-12, i jiní členové rodiny Υχΐ.
To může být uskutečněno například selekcí vhodného
VH metodami přeskupení řetězců (popisuje se v publikaci Winter et al., (1994) Annual Rev. Immunol., 12, 433-55 nebo zavedením
CDR jiné lidské protilátky nebo protilátky hlodavce, které obsahují CDR z protilátek podle vynálezu, do základní struktury rodiny V^l.
Metody podle vynálezu zahrnují rekombinantní protilátky, které se vážou na hIL-12, obsahující variabilní oblast těžkého řetězce získanou z člena rodiny VH3 zárodečných sekvencí a variabilní oblast lehkého řetězce získanou z člena rodiny V%1 zárodečných sekvencí. Pro odborníka je však výhodné, že sekvence těžkého řetězce libovolného člena rodiny VH3 může být kombinována se sekvencí lehkého řetězce libovolného člena rodiny V^l.
• · · ♦
9 ·
Pro odborníky bude také výhodné, že v populaci (například ·· 9 9 9 9 · *f 99
9 9 9« • 9999 .9 *91 lidská populace) mohou existovat polymorfizmy sekvencí DNA, které vedou ke změnám v aminokyselinových sekvencích embrya, genetický polymorfizmus způsobený přirozenou alelickou
Takový variantou může existovat mezi jedinci v populaci v zárodečných sekvencích. Takové přirozené v typickém případě vést k 1 až 5 alelické varianty mohou % diskrepanci nukleotidové sekvence genu. Libovolné a všechny takové nukleotidové variace a výsledné aminokyselinové polymorfizmy v embryonálních sekvencích, které jsou výsledkem přirozené alelické varianty, patří do rozsahu tohoto vynálezu.
Tedy v jednom aspektu vynálezu se popisuje izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, má následující charakteristiky:
váže se na lidský IL-12 a disociuje z lidského která
a)
IL-12 s hodnotou rychlostní konstanty disociace
0,1 s 1 nebo nižší, jak se stanovilo povrchovou plazmonovou
b) inhibuje fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro, přičemž hodnota IC50 je 1 χ 10~6 M nebo nižší, má variabilní
c) rezonancí, nebo proliferaci oblast těžkého řetězce obsahuj ící aminokyselinovou rodiny VH3, kde mutaci sekvenci vybranou variabilní oblast kontaktní z člena těžkého embryonální řetězce má hypermutační poloze s aminokyselinovým zbytkem zvyšujícím aktivitu, má variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci z člena embryonální rodiny
Vxl, kde variabilní oblast lehkého řetězce má mutaci v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní poloze nebo hypermutační poloze zbytkem zvyšujícím aktivitu.
s aminokyselinovým
V preferovaném provedení vynálezu protilátka nebo její část vázající se na izolovaná lidská antigen má mutaci v CDR3 těžkého řetězce.
♦· ····
V jiném výhodném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen má mutaci v CDR2 těžkého řetězce.
V jiném preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen má mutaci v CDR2 lehkého řetězce.
V jiném preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen má mutaci v CDR1 těžkého řetězce.
V jiném preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen má mutaci v CDR1 lehkého řetězce.
Pro odborníka je výhodné, že na základě vysoké podobnosti aminokyselinové sekvence mezi členy embryonální rodiny VH3 nebo mezi lehkými řetězci členů embryonální rodiny Výl, uvedené mutace embryonálních sekvencí mohou poskytnout další protilátky, které se vážou na lidský IL-12. Tabulka 1 (dodatek A) ukazuje embryonální sekvence členů rodiny VH3 a demonstruj e podstatnou sekvenční homologii u členů rodiny.
V tabulce 1 jsou zobrazeny embryonální sekvence členů rodiny
Υχΐ. Pro porovnání jsou poskytnuty sekvence těžkého a lehkého řetězce protilátky Joe 9. Mutace embryonálních sekvenci členů rodiny VH3 a Υχΐ mohou být provedeny například ve stejných polohách aminokyselin jako jsou ty provedené v protilátkách podle vynálezu (například mutace v protilátce Joe 9) . Úpravy mohou být provedeny použitím standardních technik molekulární biologie, jako je mutageneze PCR, cílení jednotlivých aminokyselinových zbytků do embryonálních sekvencí, pak následuje zde popsaná kinetická a funkční analýza upravených protilátek (například neutralizační testy popsané v příkladu 3 a analýza BIAcore, jak se popisuje v příkladu 5).
Tedy podle jednoho aspektu vynález poskytuje izolovanou lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen, která má následující charakteristiky:
a) má variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 595 až 667, kde variabilní oblast těžkého řetězce má mutaci v preferované poloze selektivní mutace, v kontaktní nebo v hypermutační poloze s aminokyselinovým zbytkem zvyšujícím aktivitu,
b) má variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 669 až 675, kde variabilní oblast lehkého řetězce má mutaci v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní poloze nebo hypermutační poloze s aminokyselinovým zbytkem zvyšujícím aktivitu.
Pro odborníka je výhodné, že na základě vysoké podobnosti aminokyselinové sekvence mezi protilátkou Joe 9 a embryonální sekvencí těžkého řetězce COS-3 a mezi protilátkou Joe 9 a embryonální sekvencí DPL8 lambda, jiné mutace oblastí CDR těchto embryonálních sekvencí mohou poskytovat dálší protilátky, které se vážou na lidský IL-12. Takové metody modifikace mohou být provedeny použitím standardních technik molekulární biologie, jak se popisuje shora v textu.
V jiném provedení vynálezu se popisuje izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která má následující charakteristiky:
a) váže se na lidský IL-12 a disociuje z lidského IL-12 s hodnotou rychlostní konstanty disociace nižší, jak se stanovilo povrchovou
0,1 s 1 nebo plazmonovou rezonancí, nebo inhibuj e fytohemaglutininových blastů v in vitro přičemž hodnota IC50 je 1 x 10~6 M nebo nižší, proliferaci testu PHA, ·· ·· * · · · • « · • · · • · · ·· «·· ·
b) má variabilní oblast těžkého řetězce obsahuj íci embryonální aminokyselinovou sekvenci
COS-3, kde variabilní oblast těžkého řetězce má mutaci v preferované poloze selektivní mutageneze, kontaktní a hypermutační poloze s aminokyselinovým zbytkem zvyšujícím aktivitu,
c) má variabilní oblast lehkého řetězce obsahuj ící embryonální aminokyselinovou sekvenci
DPL8, kde variabilní oblast lehkého řetězce má mutaci v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní poloze nebo hypermutační poloze s aminokyselinovým zbytkem zvyšujícím aktivitu.
Tím, že jisté aminokyselinové zbytky obsazují klíčová místa CDR a oblasti základní struktury ve variabilní oblasti lehkého a těžkého řetězce, udělují těmto oblastem strukturální rysy. Zvláště oblasti CDR1 a CDR2 j sou subjektem kanonických strukturálních klasifikací.
Protože zde existuje vysoký stupeň homologie aminokyselinových tyto kanonické rysy sekvencí mezi členy rodiny, jsou přítomny mezi členy rodiny. Odborník ocení, že modifikace aminokyselinových zbytků, které udílejí kanonické struktury, by měly produkovat další protilátky, které se vážou na
IL-12. Modifikace mohou být provedeny použitím standardních technik molekulární biologie, jak se popisuje shora v textu.
V jiném provedení vynálezu se popisuje izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která má následující charakteristiky:
a) váže se na lidský IL-12 a disociuje z lidského IL-12 s hodnotou rychlostní konstanty disociace
0,1 s’1 nebo nižší, jak se stanovilo povrchovou plazmonovou rezonancí, nebo inhibuj e proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA, přičemž hodnota IC50 je 1 x 10~6 M nebo nižší,
···· ·· · ·· · · • ···· ·♦♦· • · · · · · · • »·· · · · · · • · · · · · · * ·» ··· tt «···
b) vykazuje variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou z člena embryonální rodiny VH3, kde variabilní oblast těžkého řetězce obsahuje CDR2, která je strukturálně podobná CDR2 z jiných členů embryonální rodiny VH3, a CDR1, která je strukturálně podobná CDR1 z jiných členů embryonální rodiny VH3, a kde variabilní oblast těžkého řetězce má mutaci v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní nebo hypermutační poloze mutaci aminokyselinovým zbytkem, který zvyšuje aktivitu,
c) vykazuje variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou z člena embryonální rodiny V^l, kde variabilní oblast lehkého řetězce obsahuje CDR2, která je strukturálně podobná CDR2 z jiných členů embryonální rodiny VpJ, a CDR1, která je strukturálně podobná CDR1 z jiných členů embryonální rodiny V^l, a kde variabilní oblast těžkého řetězce má mutaci vykazuje v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní nebo hypermutační poloze mutaci aminokyselinovým zbytkem, který zvyšuje aktivitu.
Rekombinantní lidské protilátky podle vynálezu mají variabilní a konstantní oblasti, embr^nálními z databáze sekvencemi lidského
VBASE.
Mutace v které jsou homologní s vybranými lidských imunoglobulinu rekombinantních protilátkách
PCR) vedou (například náhodnou mutagenezí nebo ke vniku aminokyselin, sekvencemi lidského embryonálními knihovny rekombinantních protilátek, mutagenezí které nejsou kódovány imunoglobulinu. Také které byly získány z lidských donorů budou obsahovat protilátkové sekvence, které se liší od jejich odpovídajících embryonálních sekvencí, což způsobuje normální postup somatické mutace, který se objevuje během vývoje buňky B. Mělo by se poznamenat, že jestliže „embryonální sekvence získané amplifikací PCR kódují rozdíly v aminokyselinách v oblastech základní struktury ve srovnání
0 s opravdovou embryonální v amplifikované sekvenci ve *0»
0 0 • 0 0 · • 00
0 0
0 0000 konfigurací (to je rozdíly srovnání s opravdovou embryonální změnit tyto rozdíly aminokyselin opravdové embryonální sekvence (to je „zpětná mutace sekvencí), může být nutné zpět na zbytků základní struktury v embryonální vynález může volitelně zahrnovat krok konfiguraci). Tedy zpětné mutace. Aby k tomu došlo, aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce kódované embryonální DNA (jak se v databázi VBASE) zjistilo jako příklad jsou nejdříve porovnány s mutovanými aminokyselinovými sekvencemi základní struktury těžkého a lehkého řetězce imunoglobulinu, přičemž se aminokyselinové imunoglobulinu, identifikuj i zbytky v mutované sekvenci základní struktury které se liší od nejbližších embryonálních sekvencí. Pak použitím genetického kódu se stanoví, které změny nukleotidů by měly být provedeny a vhodné nukleotidy mutované imunoglobulinové sekvence jsou mutovány nazpět, aby odpovídaly embryonální sekvenci. Mutageneze mutované sekvence struktury imunoglobulinu je provedena standardními základní způsoby, mutované nukleotidy jsou začleněny do primerů PCR tak, že produkt
PCR obsahuje mutace) nebo místně řízená mutageneze.
Měla by se zkoumat přímá nebo nepřímá úloha každé aminokyseliny identifikované jako kandidát zpětné mutace při navázání na antigen a ovlivňuje libovolnou žádná aminokyselina, která po mutaci požadovanou charakteristiku lidské protilátky by se neměla zahrnout do konečné lidské protilátky, jako například aminokyseliny zvyšující aktivitu identifikované přístupem selektivní mutageneze nebudou subjektem mutace. Testy pro stanovení charakteristik protilátky, zpětné která je výsledkem mutageneze, mohou zahrnovat test
ELISA, kompetitivní test ELISA, neutralizační testy vivo a/nebo (popisuje se například in vitro a in v příkladu 3) imunohistochemické rozbory sekcí tkání z různých zdrojů (zahrnujících člověka, primáta a/nebo jiné druhy).
Aby se minimalizoval počet aminokyselin vystavených zpětné mutaci, mohou se zachovat ty polohy aminokyselin, u kterých se zjistilo, že se liší od nejbližší embryonální sekvence, ale jsou shodné s odpovídající aminokyselinou ve druhé embryonální sekvenci, přičemž dochází k tomu, že druhá embryonální sekvence je shodná a kolineární se sekvencí lidské protilátky podle vynálezu v případě alespoň deseti, s výhodou dvanácti aminokyselin na obou stranách diskutované aminokyseliny. To bude zaručovat, že libovolný peptidový epitop prezentovaný imunitnímu systému buňkami prezentujícími antigen v subjektu, který je léčen lidskou protilátkou podle vynálezu, nebude cizorodý, ale identický se samo-antigenem, to je imunoglobulinem kódovaným uvedenou druhou embryonální sekvencí.
Zpětná mutace se může objevit v libovolném stádiu optimalizace protilátky, přednostně se zpětná mutace objevuje přímo před nebo po použití přístupu selektivní mutageneze. Výhodněji, zpětná mutace se objevuje přímo před použitím ' přístupem selektivní mutageneze.
III: Modifikace výhodných poloh selektivní mutageneze, kontaktních a/nebo hypermutačních poloh
V typickém případě selekce protilátek se zlepšenými afinitami může být provedena použitím metod fágového zobrazení, jak se popisuje v sekci II shora v textu. To může být dosaženo kombinací náhodných mutací zbytků CDR a vytvořením velkých knihoven, které obsahují protilátky různých sekvencí. Avšak, aby tyto selekční metody fungovaly, reakce protilátka-antigen se musí blížit rovnováze, aby se po určité době umožnilo výhodné navázání protilátky s vyšší afinitou na antigen. Když byly použity metody zobrazující fága, aby se zlepšila afinita vybraných protilátek proti IL-12, nemohou být stanoveny (pravděpodobně v důsledku dalších nespecifických interakcí mezi antigenem a částicí fága) , selekční podmínky pro docílení jistého stupně dosažené afinity (to je stupeň
ΦΦ φφφφ φφ φ φφ φφ φ* * φφφφ ΦΦΦ· φφφ φφφ φ φ · • · · φφφ φφφ • · · φφ φφφ φφ φφφφ afinity protilátky Υ61), které by umožnily dosažení rovnováhy. Proto použitím metod fágového zobrazení nemohly být vybrány protilátky s ještě vyššími afinitami. Takže alespoň pro určité protilátky nebo antigeny, jsou metody fágového zobrazení limitující svou schopností vybrat protilátky s vysoce zlepšenou vazebnou speciíitou/afinitou. Aby se obešlo toto omezení, byl nalezen způsob nazvaný přistup selektivní mutageneze, který nevyžaduje fágové zobrazení afinitní maturace protilátek a je předmětem vynálezu. Ačkoli tento přístup selektivní mutageneze byl vyvinut k obejití omezení při použití systému fágového zobrazení, je třeba uvést, že tato metoda může být použita také spolu se systémem fágového zobrazení. Navíc přístup selektivní mutageneze může být používán ke zlepšení aktivity libovolné protilátky.
Ke zlepšení aktivity (například afinity nebo neutralizační aktivity) protilátky by bylo ideální mutovat každou polohu CDR v lehkém i těžkém řetězci na každý jiný možný aminokyselinový zbytek. Protože však v protilátce existuje průměrně 70 poloh CDR, takový přístup by byl poměrně časově náročný a pracný. Proto způsob podle vynálezu umožňuje zlepšit aktivitu protilátky mutací pouze určitých vybraných zbytků v CDR těžkého a/nebo lehkého řetězce. Navíc způsob podle vynálezu umožňuje zlepšit aktivitu protilátky bez ovlivnění jejich dalších požadovaných vlastností.
Stanovení, které aminokyselinové zbytky variabilní oblasti protilátky jsou v kontaktu s antigenem, není možno přesně předpovědět na základě primární sekvence nebo jejich poloh ve variabilní oblasti. Nicméně srovnání sekvencí z protilátek s různými specifitami provedené Kabatem a spol. identifikovalo oblasti CDR jako místní oblasti uvnitř variabilních oblastí, které se mezi protilátkami významně liší (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190, str. 382-393, Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH • · · · · · · ·♦ * ·♦ ··· ··
Publication No. 91-3242. Strukturní studie ukázaly, že povrch vázající antigen je tvořen aminokyselinovými zbytky přítomnými v CDR. Je známo, že jiné aminokyselinové zbytky mimo CDR mají také strukturní roli nebo se přímo účastní navázání antigenu. Proto mohou být pro každý pár antigen-protilátka významné aminokyselinové zbytky v CDR nebo mimo tuto oblast.
Studie uspořádání sekvencí popsané v publikaci Tomlison et al., identifikovaly řadu pozic v CDR1 a CDR2 těžkého a lehkého řetězce a v části CDR3 řetězce kappa, což jsou častá místa somatické mutace (Tomlison et al., (1996) J. Mol. Biol. 256: 813-817). Zvláště polohy H31, H31B, H33, H33B, H52B, H56, H58, L30, L31, L31A, L50, L53, L91, L92, L93 a L94 byly identifikovány jako častá místa pro somatickou mutaci. Tato analýza však vylučuje důležité oblasti CDR3 těžkého řetězce a sekce CDR3 lehkého řetězce, o kterých je známo, že leží v centru vazebného místa protilátky a potenciálně poskytují důležité interakce s antigenem. Dále se v publikaci Tomlison et al., (1996) J. Mol. Biol. 256: 813-817 se uvádí, že samotná somatická diverzita nezbytně nepředpokládá úlohu specifické aminokyseliny při navázání na antigen a naznačují se konzervované aminokyselinové zbytky, které kontaktují antigen, a diverzní aminokyselinové zbytky, které nekontaktují antigen. Tento závěr je dále podporován mutačními studiemi úlohy somatických mutací v protilátkové afinitě (Sharon, (1990), PNAS, 87: 4814-7). Devatenáct somatických mutací v protilátce proti p-azofenylarsonátu (Ars) s vysokou afinitou bylo současně nahrazeno odpovídajícími embryonálními zbytky, což vytvořilo embryonální verzi protilátek proti Ars, které měly dvěstěkrát nižší aktivitu. Plnou aktivitu protilátky proti Ars bylo možno znovu získat opětným provedením pouze tří z devatenácti somatických mutací, což ukazuje, že mohou být povoleny četné somatické mutace, které nepřispívají k vazebné aktivitě na antigen.
Výsledek je možné z části vysvětlit podstatou samotné protilátkové diverzity. Nezralé buňky B mohou zpočátku produkovat protilátky s nízkou afinitou, které rozeznávají řadu samo-antigenů nebo antigenů, které nejsou samo-antigeny. Protilátky však mohou projít v průběhu afinitní maturace sekvenčními variacemi, které mohou způsobit samo-reaktivitu. Hypermutace takových protilátek s nízkou afinitou mohou sloužit k eliminaci samo-reaktivity („negativní selekce) a ke zvýšení afinity pro cizorodý antigen. Proto analýza primárních a strukturálních dat velkého množství protilátek neposkytuje způsob předpovídající buď (1) úlohu somatických hypermutačních míst v postupu afinitní maturace versus v postupu snížení afinity vůči nechtěným antigenům nebo (2) jak se daná aminokyselina podílí na vlastnostech specifického páru antigen-protilátka.
Jiné pokusy adresované úloze specifických aminokyselinových zbytků při rozeznávání antigenů byly provedeny analýzou řady krystalických struktur komplexů antigen-protilátka (MacCallum et 262: 732-745). Byla naznačena lokalizovaných v CDR nebo mimo zahrnuté v navázání na antigen analyzovaných struktur zahrnovaly
H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98
al., (1996) J. Mol. Biol.
potencionální úloha poloh
tuto oblast. Polohy v CDR
ve více než 10 z 26
H31, H33, H50, H52, H53,
a H100 v těžkém řetězci a
L30A, L32, L91, L92, L93, L94, L96 v lehkém řetězci. Autoři však poznamenali, že předpoklad kontaktů antigenů použitím těchto a jiných strukturních dat může vést k nadměrnému nebo nedostatečnému předpokladu kontaktních poloh, což vede ke spekulaci, že pro různé antigeny mohou být aplikovány různé strategie.
Pini et al, popisuje náhodné rozdělení více zbytků do sekvencí CDR protilátky ve velké knihovně zobrazující fága za účelem rychle zvýšit protilátkovou afinitu (popisuje se v publikaci Pini et al., (1998) J. Biol. Chem. 273: 21769*· ····
21776). Protilátky s vysokou afinitou diskutované v publikaci Pini et al., (1998) J. Biol. Chem. 273: 21769-21776 měly mutace celkem v osmi polohách, jejich redukční analýza se stává nepraktická, protože se testuje velký počet možných kombinací pro nejmenší počet nutných aminokyselin. Změny poloh jsou absolutně nutné, aby se zlepšila afinita protilátky.
Vedle toho náhodné rozdělení množství zbytků nemusí nezbytně zachovat jiné požadované vlastnosti protilátky. Požadované vlastnosti a charakteristiky protilátky jsou v oboru známy a zahrnují například zachování nezkřížené reaktivity, například s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi a zachování sekvencí protilátek, které jsou blízké sekvencím lidského embryonálního imunoglobulinu, zlepšení neutralizační síly. Jiné požadované vlastnosti nebo charakteristiky zahrnují schopnost uchovat druhy zkřížené reaktivity, schopnost zachovat specifitu epitopu a schopnost zachovat vysokou sílu exprese proteinu v savčích buňkách. Požadované vlastnosti nebo charakteristiky mohou být pozorovány nebo měřeny použitím postupů známých v oboru, které zahrnují, ale nejsou omezeny na test ELISA, kompetitivní ELISA, neutralizační testy in vitro a in vivo (popisuje se například v příkladu 3), imunohistochemické testy tkáňových sekcí z různých zdrojů, které zahrnují člověka, primáta nebo jiné zdroje podle potřeby a studie exprese v savčích buňkách použitím dočasné nebo stabilní exprese.
Navíc způsob popsaný v publikaci Pini et al., (1998) J. Biol. Chem. 273: 21769-21776 může zavést více změn, než je minimální opravdu nutný počet, aby se zlepšila afinita, a může vést ke spuštění tvorby proti-lidských protilátek (HAMA) v lidských subjektech.
Dále, jak se diskutuje jinde, zde popsané fágové zobrazení nebo jiná příbuzná metoda zahrnující zobrazení ribozomu nemusí správně fungovat při dosažení jistých afinit mezi protilátkou a antigenem a podmínky nutné pro dosažení rovnováhy nemusí být »· ···* ·· * ·· ,, » · *···· · · · < • · · · · · ,, , ··· ··· · « , , ( ··· ··· · * , ·· · ·· «·· ·* ··,· nastoleny v náležitém časovém rámci vzhledem dalším interakcím, které zahrnují interakce s jinými fágovými nebo ribozomálními komponenty a antigenem.
Odborník může sbírat zajímavé vědecké informace o původu protilátkové diverzity z obsahu publikací diskutovaných shora v textu. Vynález však poskytuje způsob pro zvýšení protilátkové afinity specifického páru antigen-protilátka, zatímco zachovává jiné relevantní rysy nebo požadované charakteristiky protilátky. To je zvláště důležité, když se zvažuje nutnost propůjčení množství různých charakteristik specifické protilátce včetně navázání na antigen.
Jestliže počáteční protilátka má požadované vlastnosti nebo charakteristiky, které je potřeba zachovat, přístup selektivní mutageneze může být nej lepší strategie zachování těchto požadovaných vlastností, zatímco se zlepší aktivita protilátky. Například při mutagenezi protilátky Y61 bylo cílem zvýšit afinitu vůči hIL-12 a zlepšit neutralizační potenciál protilátky, zatímco si zachovává požadované vlastnosti. Požadované vlastnosti protilátky Y61 zahrnovaly (1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, (2) ochranu správné specifity epitopu, to je rozpoznávání epitopu p40 přednostně v souladu s heterodimerem p70 (p40/p35), čímž se zachovají vazebné interference od volné rozpustné podjednotky p40 a (3) vytvoření protilátky s aminokyselinovými sekvencemi těžkého a lehkého řetězce, které jsou natolik blízké jejich odpovídajícím sekvencím embryonálního imunoglobulinu, jak je to jen možné.
V jednom provedení vynálezu způsob poskytuje přístup selektivní mutageneze jako strategie zachování požadovaných vlastností nebo charakteristik protilátky, zatímco se zlepšuje afinita a/nebo neutralizační síla. Termín „přístup selektivní mutageneze se definuje shora v textu a zahrnuje způsob jednotlivé mutace vybraných aminokyselinových zbytků. Aminokyselinové zbytky, které budou mutovány, se nejdříve
• to *··· ··
• · • • •
* · • •
to · « · • •
• · • •
·· • ·<
vyberou z preferovaných poloh selektivní mutageneze, pak z kontaktních poloh a pak vybraná poloha může aminokyselinové zbytky požadované vlastnosti protilátky.
Přístup selektivní mutageneze zahrnuje výběr selektivní být hypermutačních poloh, mutována na je stanoven protilátky a alespoň účinek zlepšení kroky:
Jednotlivá dva jiné mutace na aktivity kandidátských poloh v pořadí 1) mutageneze, 2) preferované polohy kontaktní polohy, 3) hypermutační zařazení poloh na těžkého polohy a variabilních oblastech (CDR3 se preferuje před
CDR2 a základě lokace polohy ve a lehkého řetězce protilátky tato oblast se preferuje před
CDR1), jednotlivá mutace kandidátských preferovaných poloh selektivní mutageneze, hypermutačních a/nebo kontaktních poloh za účelem hodnocení na všechny možné jiné aminokyselinové zbytky a analýza účinku jednotlivých mutací na aktivitu protilátky za účelem stanovení aminokyselinových zbytků, které zesilují aktivitu protilátky, jestli je to nezbytné, vytvoření postupných kombinací jednotlivých aminokyselinových zbytků zvyšujících aktivitu protilátek, výběr mutovaných protilátek s aminokyselinovými zbytky zvyšujícími aktivitu a hodnoceni mutantnich protilátek založených na lokaci a shody substitucí aminokyselin s ohledem na jejich imunogenní potenciál. Nejvyšší hodnocení je uděleno mutantnim protilátkám, které obsahují aminokyselinovou sekvenci, která je skoro shodná se sekvencí variabilní oblasti, který je popsána v embryonální databázi nebo má aminokyselinovou sekvenci, která je porovnatelná s jinými lidskými protilátkami. Nižší hodnocení je dáno mutantnim protilátkám obsahujícím aminokyselinovou substituci, která se řídce objevuje v jejich embryonální sekvenci nebo v sekvencích jiných lidských protilátek. Nejnižší hodnocení je dáno mutantnim protilátkám s aminokyselinovou substitucí, která se v
···« ·· • · · · · • · · · · • · · · · · ♦ · · > · ·· · ><
·· «41 •· · · ♦♦ · •β · • · · «· ··*· nevyskytuje v embryonální sekvenci nebo v sekvenci jiné lidské protilátky. Jak je uvedeno shora v textu, mutantní protilátky obsahující alespoň jeden aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu lokalizovaný v CDR3 je preferován před CDR2, který je preferován před CDR1. CDR variabilních oblastí těžkého řetězce jsou preferovány před CDR variabilní oblasti lehkého řetězce.
U mutantnich protilátek může být také studováno zlepšení aktivity, například v porovnáni s jejich rodičovskou protilátkou. Zlepšení aktivity mutantní protilátky může být stanoveno například neutralizačními testy nebo vazebnou specifitou/afinitou analýzou povrchové plazmonové rezonance (popisuje se v příkladu 3) . Zlepšení aktivity může být s výhodou alespoň 2 až 20krát vyšší ve srovnání s rodičovskou protilátkou. Zlepšení aktivity může být alespoň „Xi a „x2krát vyšší ve srovnání s rodičovskou protilátkou, přičemž symboly „Xi a „x2 jsou celá čísla zahrnující čísla 2 až 20, zahrnující rozmezí ve stávajícím rozmezí například 2 až 15, například 5 až 10.
Mohou být také studovány mutantní protilátky s aminokyselinovým zbytkem zvyšujícím aktivitu, aby se stanovilo zda byla po mutaci zachována alespoň jedna požadovaná vlastnost. U protilátky proti hIL-12 se například testovaly 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopů, to je rozpoznání epitopů p40 přednostně v souladu s heterodimerem p70 (p40/p35), čímž se uchovává vazebná interference z volné rozpustné p40 a (3) vytvoření protilátek s aminokyselinovými sekvencemi těžkého a lehkého řetězce, které byly tak blízko svým sekvencím embryonálního imunoglobulinu, jak je to možné, a stanovení, která protilátka bude méně pravděpodobně vyvolávat lidskou imunní odezvu založenou na počtu rozdílů od embryonální sekvence. Stejná pozorování mohou být provedena s protilátkou, která má více jak jeden aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu, například alespoň dva nebo alespoň tři • · · · • 9 aminokyselinové zbytky zvyšující aktivitu, aby se stanovilo, zda dojde k zachování požadované vlastnosti nebo charakteristiky.
Příklad použití „přístupu selektivní mutageneze při mutagenezi protilátky Y61 je popsán dále v textu. Každá s jednotlivých mutací H31S-+E, L50-»Y nebo L94G-+Y zlepšila neutralizační aktivitu protilátky. Když však byly testovány kombinační klony, aktivita kombinovaného klonu H31S-»E + L50-+Y + L94G->Y nebyla lepší než L50—>Y + L94GX-Y (J695) . Proto změna embryonálního aminokyselinového zbytku Ser na Glu v poloze 31 CDR1 nebyla nezbytná pro zlepšení aktivity J695 ve srovnání s Y61. Přístup selektivní mutageneze proto identifikoval minimální počet změn, které přispívaly ke konečné aktivitě, čímž se redukuje imunogenní potenciál konečné protilátky a zachovávají se požadované vlastnosti protilátky. Izolovaná DNA kódující VH a VL produkovaný přístupem selektivní mutageneze může být přeměněna na geny řetězce protilátky plné délky, na geny fragmentu Fab, jako na gen scFV, jak je popsáno v sekci
IV. V případě exprese oblastí VH a VL produkovaných selektivní mutageneze, expresívní vektory kódující přístupem těžký a lehký řetězec mohou být transfektovány do různých hostitelských
Preferované buněk, jak hostitelské se popisuje v detailech sekci IV.
prokaryontní hostitelské cerevisiae.
buňky zahrnují buď hostitelské buňky, například E. coli nebo buňky, například kvasinkové buňky, eukaryontní například S.
Nejvíce preferované eukaryontní hostitelské buňky jsou savčí hostitelské buňky popsané detailněji v sekci IV.
Přístup selektivní mutageneze poskytuje způsob produkující protilátky se zlepšenými aktivitami bez předchozí afinitní maturace protilátky jinými způsoby. Přístup selektivní mutageneze poskytuje způsob produkující protilátky se zlepšenými afinitami, které byly předmětem zpětných mutací. Přístup selektivní mutageneze také poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátek s afinitní maturací.
• · · · • ·
Odborníkovi bude jasné, že přístup selektivní mutageneze může být používán při standardních postupech manipulace protilátek, které jsou známy v oboru. Příklady zahrnují, ale nejsou omezeny na protilátky se zavedeným CDR, chimérové protilátky, fragmenty scFV, fragmenty Fab protilátek plné délky a lidské protilátky z jiných zdrojů, například transgenní myši.
Rychlá mutační analýza protilátek ve velkém měřítku zahrnuje transkripci a translaci in vitro použitím fágové zobrazovací technologie (popisuje se například v publikaci Hanes et al., (1997) Proč. Nati. Acad. Sci. 94: 4937-4942,
Dali Acqua et al., (1998) Curr. Opin. Struc. Biol. 8: 443-450, He et al., (1997) Nucleic. Acid. Res. 25: 5132-5134 a patentový dokument USA č. 5 643 7 68 a 5 658 754 (Kawasaki) . Přístup selektivní mutageneze také poskytuje způsob produkce protilátek se zlepšenými aktivitami, které mohou být vybrány použitím postupů zobrazení ribozomu.
Ve způsobech podle vynálezu protilátky nebo jejich části vázající se na antigen jsou dále upraveny změnami jednotlivých poloh v DR HCVR a/nebo LCVR. Ačkoli tyto úpravy mohou být provedeny v protilátkách vyjádřených fágem, způsob je výhodný v tom, že může být proveden s protilátkami, které jsou exprimovány v jiných typech hostitelských systémů, jako jsou bakteriální, kvasinkové nebo savčí buněčné expresívní systémy. Jednotlivé polohy v CDR vybrané na základě své modifikace jsou založeny na polohách, kterou je kontaktní a/nebo hypermutační poloha.
Preferované zde definované kontaktní polohy a hypermutační polohy jsou zobrazeny v tabulce 3 (dodatek A) a jejich modifikace ve shodě s metodou podle vynálezu je popsána detailněji v příkladu 2. Preferované kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a
L96. Preferované hypermutační polohy jsou vybrány ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93. Více preferované aminokyselinové zbytky („preferované polohy selektivní mutageneze) jsou jak kontaktní tak hypermutační polohy a jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94. Zvláště preferované kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny zahrnující L50 a L94 .
Preferované aminokyselinové zbytky zvyšující aktivitu nahradí aminokyselinové zbytky lokalizované v polohách vybraných ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96. Více preferované aminokyselinové zbytky zvyšující aktivitu nahradí aminokyselinové zbytky lokalizované v polohách vybraných ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93,
L94. Zvláště preferované aminokyselinové zbytky zvyšující aktivitu nahradí aminokyselinové zbytky lokalizované v polohách vybraných ze skupiny obsahující L50 a L94.
V obecném případě způsob podle vynálezu zahrnuje výběr určité preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní polohu a/nebo hypermutační polohu v CDR těžkého a lehkého řetězce diskutované původní protilátky nebo její části vázající se na antigen, náhodnou mutaci v této individuální poloze (například genetickými způsoby použitím mutagenního oligonukleotidu za vzniku „mini-knihovny upravených protilátek) nebo mutací polohy na specifické požadované aminokyseliny, aby se identifikovaly aminokyselinové zbytky zvyšující aktivitu, expresi a čištění modifikovaných protilátek (například v hostitelském systému, který nezobrazuje fága) , měření aktivity modifikovaných protilátek vůči antigenu (například měření rychlostní konstanty kOff analýzou BIAcore) , opakování těchto kroků pro jiné polohy CDR, • · ·
·· · · •a • ·· • ·· • · · je-li to nezbytné, a kombinace jednotlivých mutací, o kterých je známo, že zlepšily aktivitu a testování skutečnosti, zda kombinace generují protilátku s ještě vyšší aktivitou (například afinitou nebo neutralizační silou) ve srovnání s rodičovskou protilátkou nebo s její částí vázající se na antigen.
Tedy v jednom provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen obsahuj ící:
a) poskytnutí původní protilátky nebo její části,
b) výběr v pořadí 1) preferovaná poloha selektivní mutageneze, 2) kontaktní poloha nebo 3) hypermutační poloha pro mutaci v oblasti určující komplementaritu, čímž se identifikuje vybraná poloha selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační poloha,
c) jednotlivé mutace uvedené vybrané preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se tvoří soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen,
e) je možné opakovat kroky a) až d) v případě alespoň jedné jiné preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní polohy nebo hypermutační polohy,
f) kombinace v původní protilátce nebo její části vázající se na antigen jednotlivých mutací, které mají zvýšenou aktivitu, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a
g) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, • · · · • · · ♦ · · · • · · · ·· ·· * · · · · · • · · I» · • · · · · · ♦ 4 · » dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou ve vztahu k původní protilátce nebo k její části vázající protilátka nebo protilátky aktivitu, aniž ztrácí
Vybraná zlepšenou se na antigen.
výhodou maj i s alespoň j ednu požadovanou charakteristiku nebo vlastnost původní protilátky nebo si ji zachovávají, j ak se popisuj e shora textu.
Požadovaná vlastnost nebo charakteristika může být měřena nebo pozorována odborníkem použitím metody známé v
Preferované kontaktní polohy oboru.
vybrány j sou ze skupiny
zahrnuj ící H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53,
H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30 , L31, L32, L34,
L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96. Preferované
hypermutační polohy j sou vybrány ze skupiny obsahuj ící H30,
H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93. Více
polohy selektivní mutageneze jsou vybrány výhodné preferované ze skupiny obsahující H30, H31, H31B,
H32, H33, H52, H56, H58,
L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 a
L94. Zvláště preferované kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny obsahující L50 a L94.
V jiném provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen zahrnuj ící:
a) poskytnutí původní protilátky nebo její části, výběr preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní polohy nebo hypermutační polohy pro mutaci
b)
d) v oblasti určující komplementaritu (CDR), jednotlivé mutace uvedené vybrané preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo polohy na alespoň dva jiné aminokyselinové se tvoří soubor mutovaných protilátek nebo vázajících se na antigen, hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu hypermutační zbytky, j ej ich čímž částí nebo
100 k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) je možné opakovat kroky a) až d) v případě alespoň jedné jiné preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní polohy nebo hypermutační polohy,
f) kombinace v původní protilátce nebo její části vázající se na antigen dvou jednotlivých aminokyselinových zbytků zvyšujících aktivitu, které prokázaly, že mají zvýšenou aktivitu, za vzniku kombinace protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a
g) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se dvěma aminokyselinovými zbytky zvyšujícími aktivitu ve vztahu k původní protilátce nebo k její
části vázající se na antigen.
Preferované kontaktní polohy j sou vybrány ze skupiny
zahrnuj ící H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53,
H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34,
L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93 , L94 a L96. Preferované
hypermutační polohy jsou vybrány ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93. Více výhodné preferované polohy selektivní mutageneze jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 a L94. Zvláště preferované kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny obsahující L50 a L94.
V dalším provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen zahrnuj ící:
a) poskytnutí původní protilátky nebo její části,
I
b) výběr preferované polohy selektivní mutageneze,
101
kontaktní polohy nebo hypermutační polohy pro mutaci v oblasti určující komplementaritu (CDR),
c) jednotlivé mutace uvedené vybrané preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se tvoři soubor mutovaných protilátek nebo jejich části vázajících se na antigen,
d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) je možné opakovat kroky a) až d) v případě alespoň jedné jiné preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní polohy nebo hypermutační polohy,
f) kombinace v původní protilátce nebo její části vázající se na antigen tří jednotlivých aminokyselinových zbytků zvyšujících aktivitu, které prokázaly, že mají zvýšenou aktivitu, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a;
g) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo, jejich částí vázajících se na antigen se dvěma.
aminokyselinovými zbytky zvyšujícími aktivitu vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou ve vztahu k původní protilátce nebo k její části vázající se na antigen.
Aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu s výhodou nahradí aminokyselinové zbytky v polohách vybraných ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34,
L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96.
• · ♦ ·
102
Po mutagenezi jednotlivých vybraných poloh, mutované klony mohou být sekvenovány za účelem identifikace, které aminokyselinové zbytky byly zavedeny do vybrané polohy každého klonu. Pro sekvenování může být vybrán malý počet klonů (například přibližně 24), což by statisticky mělo vést k 10 až 15 jednotlivým protilátkám, zatímco může být sekvenován větší počet klonů (například vyšší než 60), aby se zajistilo, že jsou identifikovány protilátky s každou možnou substitucí ve vybrané poloze.
V jednom provedení vynálezu jsou nejdříve vybrány za účelem mutageneze kontaktní a/nebo hypermutační polohy v oblastech CDR3 těžkého a/nebo lehkého řetězce. Avšak v případě protilátek, které už byly afinitně maturovány in vitro náhodnou mutagenezi oblastí CDR3 pomocí selekcí na základě fágového zobrazení, mohou být přednostně nejdříve vybrány kontaktní a/nebo hypermutační polohy v CDR1 nebo CDR2 těžkého a/nebo lehkého řetězce.
Ve více preferovaném provedení vynálezu jsou nejdříve pro mutagenezi vybrány preferované polohy selektivní mutageneze v oblastech CDR3 těžkého a/nebo lehkého řetězce. Avšak v případě protilátek, které už byly afinitně maturovány in vitro náhodnou mutagenezi oblastí CDR3 prostřednictvím selekce na základě fágového zobrazení, mohou být přednostně nejdříve vybrány preferované polohy selektivní mutageneze v CDR1 nebo CDR2 těžkého a/nebo lehkého řetězce.
V jiném preferovaném provedení vynálezu optimalizace vybrané protilátky přístupem selektivní mutageneze je provedena postupně následujícím způsobem: preferované polohy selektivní mutageneze vybrané ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 jsou mutovány každá nejdříve na alespoň 2 jiné aminokyselinové zbytky (výhodně 5 až 14 jiných aminokyselinových zbytků) a výsledné protilátky jsou charakterizovány zvýšenou afinitou, neutralizační silou (a
103 • ·
snad také alespoň jednou jinou Zachovalou charakteristikou a vlastností mimoto diskutovanou). Jestliže mutace jediné preferované polohy selektivní mutageneze vůbec nebo dostatečně nezvyšuje afinitu nebo neutralizační sílu a jestliže dokonce kombinace více aminokyselin zvyšující aktivitu nahrazujících aminokyseliny v preferovaných polohách selektivní mutageneze nevede ke kombinační protilátce, která vykazuje cílovou aktivitu (zahrnující afinitu a/nebo neutralizační sílu), budou vybrány další aminokyselinové zbytky pro selektivní mutagenezi ze skupiny zahrnující H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A a L96 a jsou mutovány na alespoň 2 jiné aminokyseliny (přednostně.5 až 14 jiných aminokyselin) a výsledné protilátky jsou charakterizovány zvýšenou afinitou, neutralizační silou (a snad také alespoň jednou jinou mimoto diskutovanou zachovanou charakteristikou nebo vlastnosti).
Jestliže mutace jediného aminokyselinového zbytku vybraného ze skupiny zahrnující H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A a L96 vůbec nebo dostatečně nezvyšuje aktivitu (zahrnující afinitu a/nebo neutralizační sílu) a jestliže dokonce kombinace více aminokyselin zvyšující aktivitu nahrazujících aminokyseliny v těchto polohách nevede ke kombinační protilátce, která vykazuje cílovou aktivitu (zahrnující afinitu a/nebo neutralizační sílu), budou vybrány další aminokyselinové zbytky pro selektivní mutagenezi ze skupiny zahrnující H33B, H52B, L31A a jsou.mutovány na alespoň 2 jiné aminokyseliny (přednostně 5 až 14 jiných aminokyselin) a výsledné protilátky jsou charakterizovány zvýšenou afinitou, neutralizační silou (a snad také alespoň jednou jinou mimoto diskutovanou zachovanou charakteristikou nebo vlastností).
Mělo by být jasné, že postupný přístup selektivní mutageneze může skončit v libovolném z kroků uvedených shora v textu, ihned jak byla identifikována protilátka s požadovanou aktivitou (zahrnující afinitu a neutralizační sílu) . Jestliže mutageneze předem vybraných poloh
104
identifikovala aminokyselinové zbytky zvyšující aktivitu, ale kombinační protilátka stále nevykazuje cílovou aktivitu (zahrnující afinitu a/nebo neutralizační silu) a/nebo jestliže identifikované aminokyseliny zvyšující aktivitu také ovlivňují jiné požadované charakteristiky a jsou proto nepřijatelné, zbývající zbytky CDR proto mohou být vystaveny mutagenezi (popisuje se v sekci IV) .
Způsob podle vynálezu může být používán ke zlepšení aktivity protilátky nebo části vázající se na antigen, aby se dosáhlo předem stanovené cílové aktivity (například předem stanovená afinita a/nebo neutralizační síla a/nebo požadovaná vlastnost nebo charakteristika).
Tedy vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen, aby se docílilo předem stanovené cílové aktivity, přičemž způsob zahrnuje:
a) poskytnutí původní protilátky nebo její části,
b) výběr preferované polohy selektivní mutageneze vybrané ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H52,
H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94,
c) jednotlivé mutace uvedené vybrané preferované polohy selektivní mutageneze na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se vytvoří soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
d) hodnocení aktivity prvního souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, aby se stanovilo zda mutace jedné polohy selektivní mutageneze produkuje protilátku nebo její část vázající antigen s předem stanovenou cílovou aktivitou nebo částečnou cílovou aktivitou,
e) kombinování postupným způsobem v původní protilátce nebo v její části vázající antigen jednotlivých mutací, které prokázaly, že mají zlepšenou aktivitu, za vzniku
105 φ φ φφφφ
kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
f) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen za účelem stanovení jestli kombinační protilátky nebo jejich části vázající se na antigen mají předem stanovenou cílovou aktivitu nebo částečnou cílovou aktivitu
g) jestliže kroky d) nebo f) nevedou ke vzniku protilátky nebo její části vázající se na antigen, které mají předem stanovenou cílovou aktivitu nebo vedou ke vzniku protilátky s pouze částečnou aktivitou, další aminokyselinové zbytky vybrané ze skupiny zahrnující H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A a L96 jsou mutovány na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se tvoří druhý soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
h) hodnocení aktivity druhého souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen za účelem stanovení, jestli mutace jediného aminokyselinového zbytku vybraného ze skupiny obsahující H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A a L96 vede ke vzniku protilátky nebo její části vázající se na antigen, která má předem stanovenou cílovou aktivitu nebo částečnou aktivitu,
i) kombinování postupným způsobem v původní protilátce nebo v její části vázající antigen jednotlivých mutací popsaných v kroku g), které prokázaly, že mají zlepšenou aktivitu, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
j) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen za účelem stanovení, jestli kombinační protilátky nebo jejich části vázající se na antigen mají předem stanovenou cílovou aktivitu nebo částečnou cílovou aktivitu,
106
k) jestliže kroky h) nebo j) nevedou ke vzniku protilátky nebo její části vázající se na antigen, které mají předem stanovenou cílovou aktivitu, nebo vedou ke vzniku protilátky s pouze částečnou aktivitou, další aminokyselinové zbytky vybrané ze skupiny zahrnující H33B, H52B a L31A jsou mutovány na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se tvoří třetí soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
l) hodnocení aktivity třetího souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen za účelem stanovení, jestli mutace jediného aminokyselinového zbytku vybraného ze skupiny obsahující H33B, H52B a L31A vede ke vzniku protilátky nebo její části vázající se na antigen, která má předem stanovenou cílovou aktivitu nebo částečnou aktivitu,
m) kombinování postupným způsobem v původní protilátce nebo v její části vázající antigen jednotlivých mutací kroku k) , které prokázaly, že mají zlepšenou aktivitu, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
n) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen za účelem stanovení, jestli kombinační protilátky nebo jejich části vázající se na antigen mají předem stanovenou cílovou aktivitu nebo částečnou cílovou aktivitu, čímž se produkuje protilátka nebo její část vázající se na antigen s předem stanovenou cílovou aktivitou.
Může být použita řada metod mutageneze, které zahrnují kompletaci pomocí PCR, mutagenezi podle Kunkela (dut-ung-) a mutagenezi řízenou trifosfátoligonukleotidy (Amersham Sculptor kit) .
Pro expresi mutovaných protilátek mohou být použity různé hostitelské expresívní systémy, které zahrnují bakteriální, • 0 ♦ 0 0 ·
0 0 • 00 •00
0000 kvasinkové, bakulovirové a savčí expresívní systémy (stejně jako expresívní systémy zobrazující fága).
bakteriálního expresívního vektoru je protilátkové expresívní systémy jsou známy popsány dále v textu v sekci IV.
107 • · 0 0 0 0 • ·9 •· 0 •00
0
Příkladem vhodného pUC119(Sfi). Jiné v oboru a/nebo jsou
Modifikované protilátky nebo jejich části vázající se na antigen produkované metodou identifikovány bez spoléháni se které se používají je zvláště výhodný při selekci.
protilátky nebo podle vynálezu mohou být na metody fágového zobrazení, Podobně, způsob podle vynálezu aktivity rekombinantní původní se na antigen, která se získala selekcí při zlepšení její části vázající fágového zobrazení, ale jejíž v systému aktivita nemůže být dále zlepšena mutagenezí v systému zobrazení.
fágového
Tedy v jiném provedení vynález poskytuje způsob zlepšení afinity protilátky nebo její části vázající se na antigen zahrnuj ící:
poskytnutí původní protilátky nebo její části, která byla získána selekcí v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita nemůže být dále zlepšena v uvedeném systému fágového zobrazení, výběr preferované polohy selektivní kontaktní polohy nebo hypermutační polohy v oblasti určující komplementaritu (CDR) identifikuje vybraná kontaktní
a)
b) poloha,
c) jednotlivé mutace uvedené vybrané selektivní mutageneze, kontaktní polohy na alespoň dva jiné se tvoří soubor mutovaných
d) mutagenezí mutageneze, pro mutaci , čímž se nebo hypermutační preferované polohy nebo hypermutační aminokyselinové protilátek nebo zbytky, čímž jejich částí a exprese uvedeného souboru jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu vázajících se na antigen v systému nefágového zobrazení, hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo ♦
108 k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen,
e) je možné opakovat kroky b) až d) v případě alespoň jedné jiné preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní polohy nebo hypermutační polohy,
f) kombinování v původní protilátce nebo její části vázající se na antigen jednotlivých mutací, které ukázaly, že vykazují zlepšenou aktivitu za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a
g) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vztaženo k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou ve vztahu k původní protilátce nebo k její části vázající se na antigen.
Preferované kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny
zahrnuj ící H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53,
H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30 , L31, L32, L34,
L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93 , L94 a L96. Preferované
hypermutační polohy jsou vybrány ze skupiny obsahuj ící H30,
H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93. Více
výhodné preferované polohy selektivní mutageneze jsou vybrány ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 a L94. Zvláště preferované kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny obsahující L50 a L94.
Pomocí dostupných metod není možné nebo je extrémně pracné získat protilátku se zvýšenou vazebnou afinitou a neutralizační silou, přičemž si zachovává jiné vlastnosti nebo charakteristiky protilátek, jak se diskutuje shora v textu. Způsob podle vynálezu však může snadno identifikovat takové protilátky. Protilátky vystavené způsobu podle vynálezu mohou pocházet z libovolného zdroje.
*· ·♦·· ··
109
Proto v dalším provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen obsahující:
a) poskytnutí původní protilátky nebo její části vázající se na antigen,
b) výběr preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní polohy nebo hypermutační polohy pro mutaci v oblasti určující komplementaritu (CDR), čímž se identifikuje vybraná preferovaná poloha selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační poloha,
c) jednotlivé mutace uvedené vybrané preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se tvoří soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese uvedeného souboru ve vhodném expresívním systému,
d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) v souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vztaženo k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen se hodnotí alespoň jedna jiná vlastnost nebo charakteristika, přičemž vlastnost nebo charakteristika je ta, kterou je nutné v protilátce zachovat, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou a alespoň jednou zachovanou vlastností nebo charakteristikou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen.
V preferovaném provedení vynálezu kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H35,
·· ···· * · · * · · ·· • * • · • · 99 · • ·
110 • · · B * · • · 9 · ·
· ·« ··-» ·«
H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101,
L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a
L96 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování
nezkřižené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi,
2) zachováni rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
V jiném preferovaném provedení vynálezu jsou hypermutačni polohy vybrány ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93 a další charakteristika je vybrána z 1) zachováni nezkřižené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
Ve více preferovaném provedení vynálezu zbytky vhodné pro selektivní mutagenezi jsou vybrány ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 a L94 a další · charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřižené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
Ve více preferovaném provedení vynálezu zvláště preferované kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny obsahující L50 a L94 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřižené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi,
111 í
2) zachování rozpoznání epitopů, to je rozpoznání epitopů podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
Kdyby tedy měla být afinita protilátky vůči specifickému antigenu zlepšena, ale způsob fágového zobrazeni (nebo příbuzný systém zahrnující zobrazení ribozomu) není déle aplikovatelný a měly by být zachovány jiné požadované vlastnosti nebo charakteristiky, může být použita metoda podle vynálezu.
Tedy v dalším provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající na antigen, který zahrnuj e:
a) poskytnutí rekombinantní původní protilátky nebo její části, která byla získána selekcí v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita nemůže být dále zlepšena mutagenezí v uvedeném systému fágového zobrazení,
b) výběr preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy pro mutaci v oblasti určující komplementaritu (CDR), čímž se identifikuje vybraná poloha selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační poloha,
c) jednotlivé mutace uvedené vybrané preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy alespoň na dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se tvoří soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese uvedeného souboru v systému nefágového zobrazení,
d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k původní protilátce nebo její části vázající se na
112 • 9 antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) v souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vztaženo k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen se hodnotí alespoň jedna jiná vlastnost nebo charakteristika, přičemž vlastnost nebo charakteristika je ta, kterou je nutné v protilátce zachovat, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou a alespoň jednou zachovanou vlastností nebo charakteristikou vzhledem k původní protilátce nebo na její části vázající se na antigen,
f) je možné opakovat kroky a) až e) v případě alespoň jedné jiné preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní polohy nebo hypermutační polohy,
g) kombinování v původní protilátce nebo její části vázající se na antigen alespoň dvou jednotlivých aminokyselinových zbytků zvyšujících aktivitu, které ukázaly, že vykazují zlepšenou aktivitu a alespoň jednu zachovanou vlastnost nebo charakteristiku, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a
h) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou vztaženo k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen.
V preferovaném provedení vynálezu kontaktní polohy jsou
vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H35,
H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101,
L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a
L96 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování
113
nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
V jiném preferovaném provedeni jsou hypermutační polohy vybrány ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
Ve více preferovaném provedení zbytky vhodné pro selektivní mutagenezí jsou vybrány ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 a L94 a další charakteristika je vybrána z 1) zachováni nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
Ve více preferovaném provedení vynálezu jsou kontaktní polohy vybrány ze skupiny obsahující L50 a L94 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznáni epitopu, to je rozpoznáni epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné
114 • · · · · ·
podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
V dalším provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající na antigen, který zahrnuj e:
a) poskytnutí rekombinantní původní protilátky nebo její části, která byla získána selekcí v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita nemůže být dále zlepšena mutagenezi v uvedeném systému fágového zobrazení,
b) výběr preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy pro mutaci v oblasti určující komplementaritu (CDR), čímž se identifikuje vybraná poloha selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační poloha,
c) jednotlivé mutace uvedené vybrané preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se tvoří soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese uvedeného souboru v systému nefágového zobrazení,
d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo jejich části vázajících se na antigen ve vztahu k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) v souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vztaženo k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen se hodnotí alespoň jedna jiná vlastnost nebo charakteristika, přičemž vlastnost nebo charakteristika je ta, kterou je nutné v protilátce zachovat, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou a alespoň jednou zachovanou vlastností nebo charakteristikou vzhledem k
115
• · • · • · · · • <9. · • « • • 9 • 9 • • 9 9 ·
: i e 9 • ♦ 9 · · • • • 9 9 • • 9
• * • 9 9 • • « • Λ • • · 9 9 9 9 9 4
původní protilátce nebo její části vázající se na antigen.
V preferovaném provedení vynálezu kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H35,
H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
V dalším preferovaném provedení vynálezu jsou hypermutační polohy vybrány ze skupiny obsahující H30,H31,
H31B, H32, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97,H98,
H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92,L93,
L94 a L96 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
Ve více preferovaném provedení vynálezu jsou zbytky pro selektivní mutagenezi vybrány ze skupiny sestávající z H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91,
L93, L94 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
116 •9 ····
Ve více preferovaném provedeni vynálezu jsou kontaktní polohy vybrány ze skupiny obsahující L50 a L94 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
V jiném provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající na antigen, který zahrnuj e:
a) poskytnutí rekombinantní původní protilátky nebo její části, která byla získána selekcí v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita nemůže být dále zlepšena mutagenezí v uvedeném systému fágového zobrazení,
b) výběr preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy pro mutaci v oblasti určující komplementaritu (CDR), čímž se identifikuje vybraná kontaktní nebo hypermutační poloha,
c) jednotlivé mutace uvedených vybraných preferovaných poloh selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy alespoň na dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se tvoří soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese uvedeného souboru v systému nefágového zobrazení,
d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) v souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen se hodnotí i !
*>»
999 99
9 9 ·· • · · · • >9
9··
• *>
• · • 9 · * alespoň jedna jiná vlastnost nebo charakteristika, přičemž vlastnost nebo charakteristika je ta, kterou je nutné v protilátce zachovat, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou a alespoň jednou zachovanou vlastností nebo charakteristikou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen,
f) je možné opakovat kroky a) až e) v případě alespoň jedné jiné preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní polohy nebo hypermutační polohy,
g) kombinování v původní protilátce nebo její části vázající se na antigen alespoň dvou jednotlivých aminokyselinových zbytků zvyšujících aktivitu, které ukázaly, že vykazují zlepšenou aktivitu a alespoň jednu zachovanou jinou charakteristiku za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a
h) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou a alespoň jednou zachovanou vlastností nebo charakteristikou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen.
V preferovaném provedení vynálezu kontaktní polohy jsou
vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H35,
H50, H52 , H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101,
L30, L31 , L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a
L96 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování
nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p7 0 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné
118 podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvenci blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
V jiném preferovaném provedení vynálezu jsou hypermutační polohy vybrány ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
Ve více preferovaném provedeni vynálezu zbytky vhodné pro selektivní mutagenezi jsou vybrány ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, Ή33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91,
L92, L93 a L94 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
Ve více preferovaném provedení vynálezu jsou kontaktní polohy vybrány ze skupiny obsahující L50 a L94 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
IV. Modifikace jiných zbytků CDR
Všechny zbytky CDR v daném páru protilátka-antigen identifikované libovolným způsobem jsou nutné jako aminokyselinové zbytky zvyšující aktivitu a/nebo jsou nutné přímo nebo nepřímo při navázání na antigen a/nebo při zachování jiných požadovaných vlastností nebo charakteristik protilátky. Takové zbytky CDR jsou označovány jako „preferované polohy selektivní mutageneze. Mělo by být poznamenáno, že při specifických okolnostech, tyto preferované zbytky selektivní mutageneze mohou být identifikovány také jinými způsoby, které zahrnují společnou krystalizaci protilátky a antigenu a molekulární modelování.
Jestliže jsou preferované pokusy identifikovat aminokyseliny zvyšující aktivitu zaměřující se na preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní a hypermutační polohy popsané shora v textu vyčerpány nebo jestliže jsou nutná další zlepšení, mohou být modifikovány zbývající zbytky CDR, jak se popisuje dále v textu. Mělo by být jasné, že protilátka by mohla už být modifikována v libovolné jedné nebo více kontaktních nebo hypermutačních polohách v souladu s provedeními vynálezu diskutovanými shora v textu, ale může být nutné další zlepšení. Proto v jiném provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen zahrnující:
a) poskytnutí původní protilátky nebo její části vázající se na antigen,
b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci, v poloze jiné než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
120
c) jednotlivé mutace uvedené vybrané polohy například na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se vytvoří mutovaná protilátka nebo soubor mutovaných protilátek nebo jejich části vázajících se na antigen,
d) hodnocení aktivity mutované protilátky nebo souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) u mutovaných protilátek a souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen se hodnotí změny alespoň jedné vlastnosti nebo charakteristiky, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající na antigen.
Přednostně se jiná charakteristika nebo vlastnost vybrala z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
Jestliže mutageneze jediného zbytku není dostatečná, mohou být zahrnuty jiné zbytky, proto se v jiném provedení vynálezu poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen, který zahrnuje:
a) poskytnutí původní protilátky nebo její části vázající se na antigen,
b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci, v poloze jiné než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96, • «
• 9 · ·
Φ • ♦
121
c) jednotlivé mutace uvedené vybrané polohy na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se vytvoří mutované protilátky nebo soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledemo k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) opakování kroků b) až d) pro alespoň jednu jinou polohu CDR, kterou není ani poloha vybraná v odstavci b) ani poloha H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
f) kombinování v původní protilátce nebo její části vázající se na antigen alespoň dvou aminokyselinových zbytků, které individuálně zvyšují aktivitu a které ukázaly, že mají zlepšenou aktivitu, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a
g) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich části vázající se na antigen se dvěma aminokyselinovými zbytky zesilujícími aktivitu ve vztahu k původní protilátce nebo k její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část, která se váže na antigen, se zlepšenou aktivitou vzhledem k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen.
Jestliže jsou preferované pokusy identifikovat aminokyseliny zvyšující aktivitu zaměřující se na kontaktní nebo hypermutační polohy popsané shora v textu vyčerpány nebo jestliže jsou nutná další zlepšení a diskutovaná protilátka nemůže být dále optimalizována mutagenezi a metodami fágového zobrazení (nebo příbuzným zobrazením ribozomu), mohou být • · · · · ·
122
modifikovány zbývající zbytky CDR, jak se popisuje dále v textu. Mělo by být jasné, že protilátka by mohla už být modifikována v libovolné jedné nebo více preferovaných polohách selektivní mutageneze, v kontaktních nebo hypermutačních polohách v souladu s provedeními vynálezu diskutovanými shora v textu, ale může být nutné další zlepšeni.
Proto v dalším provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen zahrnuj ící:
a) poskytnutí rekombinantní původní protilátky nebo její části vázající se na antigen, která se získala výběrem v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita nemůže být dále zlepšena mutagenezi v uvedeném systému fágového zobrazení,
b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující |l komplementaritu (CDR) pro mutaci, v poloze jiné než
H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53,
H54, H56, H58, H95, H96, H97 , H98, H101 , L30, L31, L32,
L34, L50, L52, L53, L55, L91, , L92, L93, L94 a
c) jednotlivé mutace uvedené vybrané kontaktní nebo
hypermutační polohy na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se vytvoří soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese uvedeného souboru v systému nefágového zobrazení,
d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) u souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen se hodnotí změny alespoň jedné vlastnosti nebo charakteristiky, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se
123 zlepšenou aktivitou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající na antigen.
Přednostně se jiná charakteristika nebo vlastnost vybrala z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopů podjednotky s heterodimerem p70 p40/p35, interferenci volné rozpustné rozpoznání epitopů, to je p40 výhodně v souvislosti což předchází vazebné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
Jestliže jediná mutageneze není dostatečná, aby zvýšila afinitu protilátky, mohou být do mutageneze zahrnuty jiné zbytky. Proto v jiném provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen, který zahrnuje:
a) poskytnutí původní protilátky nebo její části vázající se na antigen, která se získala selekcí v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita nemůže být dále zlepšena mutagenezí v uvedeném systému fágového zobrazení,
b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci, v poloze jiné než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) jednotlivé mutace uvedené vybrané polohy na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se vytvoří soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese v systému nefágového zobrazení,
d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
124
e) opakováni kroků b) až d) pro alespoň jednu jinou polohu CDR, kterou není ani poloha vybraná v odstavci b) ani poloha H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94,
f) kombinování v původní protilátce nebo její části vázající se na antigen alespoň dvou aminokyselinových zbytků individuálně zvyšujících aktivitu, které ukázaly, že mají zlepšenou aktivitu, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a
g) hodnocení aktivity kombinačních protilátek a jiných vlastností nebo charakteristik kombinačních protilátek nebo jejich částí vázající se na antigen s dvěma aminokyselinovými zbytky zesilujícími aktivitu ve vztahu k původní protilátce nebo k její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou, což se vztahuje k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen.
Přednostně se jiná charakteristika nebo vlastnost vybrala z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu podjednotky s heterodimerem p70 p40/p35, interferenci volné rozpustné produkce protilátky se sekvencí imunoglobulinu.
aktivitu mutageneze, v textu zlepšení rozpoznání epitopu, to je p40 výhodně v souvislosti což předchází vazebné podjednotky p40 a/nebo 3) blízkou sekvenci embryonálního aminokyseliny zvyšující polohy selektivní shora další nebo
Preferované pokusy identifikovat zaměřující se na preferované kontaktní nebo hypermutační polohy popsané mohou být vyčerpány nebo mohou být nutná a je důležité zachovat jiné vlastnosti charakteristiky protilátky.
125
Proto v dalším provedeni vynález poskytuje způsob zlepšeni aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen, bez ovlivnění jiných charakteristik, který zahrnuje:
a) poskytnutí původní protilátky nebo její části vázající se na antigen,
b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci, v poloze jiné než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) jednotlivé mutace uvedené vybrané polohy na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se vytvoří soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo k její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) u souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen se hodnotí změny alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky, vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou a zachovanou jednou vlastností nebo charakteristikou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající na antigen.
Přednostně se jiná charakteristika nebo vlastnost vybrala z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu podjednotky s heterodimerem p70 p40/p35, interferenci volné rozpustné rozpoznání epitopu, to je p40 výhodně v souvislosti což předchází vazebné podjednotky p40 a/nebo 3)
126 »«· · s · » · · *· « ·♦ ··· ·· ··♦♦ produkce protilátky se sekvenci blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
Jestliže mutageneze jediného zbytku není dostatečná, mohou být zahrnuty jiné zbytky, proto se v jiném provedení vynálezu popisuje metoda zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen, která zahrnuje:
a) poskytnutí původní protilátky nebo její části vázající se na antigen,
b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci, v poloze jiné než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) jednotlivé mutace uvedené vybrané polohy na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se vytvoří soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) u souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se antigen, se hodnotí změny alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky,
f) opakování kroků b) až e) pro alespoň jednu jinou polohu
CDR, kterou není ani poloha vybraná v odstavci b) ani poloha H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A,
H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
g) kombinování v původní protilátce nebo její části vázající se na antigen alespoň dvou aminokyselinových zbytků, které individuálně zvyšují aktivitu a které
127 ’ a
•« ♦··· ukázaly, že mají zlepšenou alespoň jednu jinou vlastnost
9·
9 · • 9♦ • 9 99 ··
9· ♦ aktivitu nebo ·♦
9 » * ♦ · · • · · · ·
9 9 · · ♦ neovlivňuj i ^ristiku, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a
h) hodnocení aktivity a zachování alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen s dvěma aminokyselinovými zbytky zesilujícími aktivitu ve vztahu k původní protilátce nebo k její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část, která se váže na antigen, se zlepšenou aktivitou a alespoň jednou zachovanou jinou vlastností nebo charakteristikou vztaženo k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen.
Mutageneze preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktních a hypermutačních zbytků nemusí dostatečně zvýšit afinitu protilátky a mutageneze a způsob zobrazující fága (nebo příbuzná metoda zobrazující ribozom) nemusí být dále použitelné a měla by být zachována alespoň jedna charakteristika nebo vlastnost protilátky.
Proto v dalším provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen, který zahrnuje:
a) poskytnutí původní protilátky nebo její části vázající se na antigen, která se získala selekcí v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita nemůže být dále zlepšena mutagenezí zobrazení, v uvedeném systému fágového
b) výběr aminokyselinového komplementaritu (CDR) pro zbytku mutaci, v oblasti určuj ící v poloze j iné než
H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53,
H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32,
L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
128
c) jednotlivé mutace uvedené vybrané polohy na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se vytvoří soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese v systému nefágového zobrazení,
d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu, “
e) u souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen se hodnotí změny alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající na antigen.
Přednostně se jiná charakteristika nebo vlastnost vybrala z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu podjednotky s heterodimerem p70 p40/p35, interferenci volné rozpustné rozpoznání epitopu, to je p40 výhodně v souvislosti což předchází vazebné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
Jestliže mutageneze jediného zbytku není dostatečná, mohou být zahrnuty jiné zbytky, proto v jiném provedení vynález poskytuje metodu zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen, která zahrnuje:
a) poskytnutí původní protilátky nebo její části vázající se na antigen, která se získala selekcí v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita nemůže být dále zlepšena mutagenezí v uvedeném systému fágového zobrazení,
b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci, v poloze jiné než
129
H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53,
H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32,
L34, L5O, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) jednotlivé mutace uvedené vybrané polohy alespoň na dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se vytvoří soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese v systému nefágového zobrazení,
d) hodnocení aktivity a zachování alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky panelu mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) opakování kroků b) až d) pro alespoň jednu jinou polohu CDR, kterou není ani poloha vybraná v odstavci b) ani poloha H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
f) kombinování v původní protilátce nebo její části vázající se na antigen alespoň dvou aminokyselinových zbytků, které individuálně zvyšují aktivitu a které ukázaly, že mají zlepšenou aktivitu a neovlivňují alespoň jednu jinou vlastnost nebo charakteristiku, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a
g) hodnocení aktivity a zachování alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky kombinačních protilátek nebo jejich části vázající se na antigen s dvěma aminokyselinovými zbytky zesilujícími aktivitu vztaženo k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou a alespoň jednou zachovanou jinou vlastností nebo ·* • · · • ·
charakteristikou vzhledem k původní protilátce nebo
130 její části vázající se na antigen.
V. Exprese protilátek
Protilátka nebo část protilátky podle vynálezu může být připravena rekombinantní expresí genů lehkého a těžkého řetězce imunoglobulinu v hostitelské buňce. Aby došlo k expresi rekombinantní protilátky, hostitelská buňka se transfekovala jedním nebo více rekombinantními expresívními vektory, které nesou fragmenty DNA kódující imunoglobulinový lehký a těžký řetězec protilátky tak, že lehký a těžký řetězec je exprimován v hostitelské buňce a přednostně se vylučuje do média, ve kterém jsou kultivovány hostitelské buňky a ze kterého jsou protilátky získávány. Aby se získaly geny těžkého a lehkého řetězce protilátky, jsou používány standardní metody rekombinace DNA, přičemž se tyto geny začlení do rekombinantních expresívních vektorů a vektory se zavedou do hostitelských buněk, jak se popisuje v publikaci Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M. et al., (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) a v patentu US č. 4 816 397 ÍBoss et al.,).
Aby se získal fragment DNA kódující variabilní oblast těžkého řetězce protilátky Joe 9 wt nebo protilátky příbuzné Joe 9 wt, testovaly se a mutovaly se protilátky specifické pro lidský IL-12 pocházející z lidské knihovny, jak se popisuje v sekci II. Když jsou získány fragmenty DNA kódující segmenty VH a VL protilátky Joe 9 wt nebo protilátky příbuzné protilátce Joe 9 wt, mutageneze těchto sekvencí je provedena
131
standardními metodami, jako je místně řízená mutageneze (mutageneze zprostředkovaná PCR, ve které jsou mutované nukleotidy začleněny do primeru
PCR tak, že produkt PCR obsahuje mutace) nebo j inými metodami místně řízené mutageneze. Protilátky proti lidskému IL-12, které vyjadřovaly potřebný stupeň aktivity a vazebné specifity/afinity, jako je například J695, byly dále manipulovány standardními metodami rekombinace DNA, například se variabilní oblasti genů přemění na geny řetězců protilátky plné délky, na geny fragmentů Fab nebo na gen scFv. Při těchto manipulacích DNA kódující fragment VL nebo VH je operativně spojený s jiným fragmentem DNA, který kóduje jiný protein, jako je konstantní oblast protilátky nebo flexibilní spojka. Termín „operativně spojený používaný v tomto kontextu znamená, že dva fragmenty DNA jsou spojeny tak, že aminokyselinové sekvence kódované dvěma fragmenty DNA zůstávají v rámci.
Izolovaná DNA kódující oblast VH může být přeměněna na gen těžkého řetězce plné délky operativním spojením DNA kódující
VH k jiné molekule DNA kódující konstantní oblasti těžkého řetězce (CH1, CH2 a CH3) . V oboru jsou známy sekvence genů konstantní oblasti lidského těžkého řetězce (popisuje se například v publikaci Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication č. 91-3242) a fragmenty DNA obsahující tyto oblasti mohou být získány standardní amplifikaci PCR. Konstantní oblast těžkého řetězce může být konstantní oblast IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM nebo IgD a libovolná alotypická varianta, jak se popisuje v publikaci Kabat, E.A. et al., (1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), ale nejvýhodnější je konstantní oblast IgGl nebo IgG4. V případě genu těžkého řetězce fragmentu Fab DNA
132 kódující VH může být operativně spojena s jinou molekulou DNA, která kóduje pouze konstantní oblast CH1 těžkého řetězce.
Izolovaná DNA kódující oblast VL může být přeměněna na gen lehkého řetězce plné délky (stejně jako gen lehkého řetězce fragmentu Fab) operativním spojením DNA kódující VL s jinou molekulou DNA, která kóduje konstantní oblast lehkého řetězce CL. Sekvence genů konstantní oblasti lidského lehkého řetězce jsou známy v oboru (popisuje se například v publikaci Kabat, E. A., et al., (1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), a fragmenty DNA obsahující tyto oblasti mohou být získány standardní amplifikací pomocí PCR. Konstantní oblast lehkého řetězce může být konstantní oblast kappa nebo lambda, ale nejvýhodnější je konstantní oblast lambda.
Aby se vytvořil gen scFv, fragmenty DNA kódující VH a VL jsou operativně spojeny s jiným fragmentem kódujícím flexibilní spojku, například kódující aminokyselinovou sekvenci (Gly4-Ser3) tak, že sekvence VH a VL mohou být exprimovány jako kontinuální jednořetězcový protein s oblastmi VL a VH spojenými flexibilní spojkou (popisuje se například v publikaci Bird et al., (1988) Science 242: 423-426, Huston et al., (1988) Proč. Nati. Acad. sci. USA 85: 5879-5883,
McCafferty et al., Nátuře (1990) 348: 552-554).
Aby se exprimovaly protilátky nebo části protilátek podle vynálezu, DNA kódující lehké a těžké řetězce částečné nebo plné délky získané způsobem popsaným shora v textu, jsou začleněny do expresívních vektorů tak, že geny jsou operativně spojeny se sekvencemi, které řídí transkripci a translaci. V tomto kontextu termín „operativně spojený znamená, že gen protilátky je ligován do vektoru tak, že sekvence řídící transkripci a translaci ve vektoru plní svou funkci regulace transkripce a translace genu protilátky. Expresivní vektor a sekvence řídící expresi jsou vybrány tak, aby byly
133 kompatibilní s užívanou expresívní hostitelskou buňkou. Gen lehkého a těžkého řetězce protilátky může být začleněn do nezávislého vektoru nebo ve více typickém případě se oba geny začlenily do stejného expresívního vektoru. Geny protilátky jsou začleněny do expresívního vektoru standardními metodami (například ligací komplementárních restrikčních míst ve fragmentu genu protilátky nebo vektoru nebo ligací tupých konců, jestliže není přítomné žádné restrikční místo). Před začleněním sekvencí lehkého nebo těžkého řetězce protilátky J695 nebo protilátky příbuzné J695, expresívní vektor může už nést sekvence konstantní oblasti protilátky. Jeden přístup konverze sekvenci VH a VL protilátky J695 nebo protilátky příbuzné protilátce J695 na geny protilátky plné délky je jejich začlenění do expresívnich vektorů, které už kódují konstantní oblasti těžkého a lehkého řetězce, respektive tak, že segment VH je operativně spojen se segmentem(y) CH ve vektoru a segment VL je operativně spojen se segmentem CL ve vektoru. Navíc nebo v jiném případě rekombinantní expresívní vektor může kódovat signální peptid, který umožňuje vylučováni řetězce protilátky z hostitelské buňky. Gen řetězce protilátky může být klonován do vektoru tak, že signální peptid je spojen v rámci s N-koncem genu řetězce protilátky. Signální peptid může být signální peptid imunoglobulinu nebo heterologní signální peptid (to je signální peptid z proteinu, který není imunoglobulin) .
Vedle genů řetězce protilátky rekombinantní expresívní vektory podle vynálezu nesou regulační sekvence, které řídí expresi genů řetězce protilátky v hostites^ké buňce. Termín „regulační sekvence zahrnuje promotory, zesilovače a jiné elementy řídící expresi (například polyadenylační signály), které řídí transkripci nebo translaci genů řetězce protilátky. Takové regulační sekvence jsou popsány například v publikaci Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academie Press, San Diego, CA (1990). Pro odborníka je
134
99 ·· • ·· ··
• » « • • • · • • • ·
• • · • a • • • •
• • · • « • • • •
·· • • · • a · ·· ·· φ ·
přínosné, když provedení expresívního vektoru zahrnující selekci regulačních sekvencí může záviset na takových faktorech jako je volba hostitelské buňky, která bude transformována, síla exprese požadovaného proteinu atd. . Preferované regulační sekvence exprese savčí hostitelské buňky zahrnují virové elementy, které řídí vysokou sílu exprese proteinu v savčích buňkách tak, jako promotory a/nebo zesilovače získané z cytomegeloviru (CMV) (jako je promotor/zesilovač CMV) , promotor/zesilovač SV40) hlavní pozdní promotor regulačních elementů opičího viru 40 (SV40) (jako je (například adenovirový Popis virových v patentových , adenoviru (AdMLP)) a sekvencí polyoma.
se uvádí dokumentech patent US
5,168,062 (Stinski) , patent uS
4,510,254 (Bell et al.) patent US č.
4,968,615 et al.,), patent US
5,654,168 (Bujard
Vedle genů rekombinantní expresívní vektory podle
č. 5,464,758 (Bujard et al.,).
řetězce protilátky et al., ) a patent US regulačních sekvencí vynálezu mohou nést další sekvence, jako jsou sekvence, které regulují replikaci vektoru v hostitelských buňkách (např. počátek replikace) a selektovatelné markerové geny. Selektovatelný markerový gen umožňuje selekci hostitelských buněk, do kterých byl zaveden vektor (popisuje se například v dokumentech patent US č. 4,399,216, 4,634,665 a 5,179,017 (Axel et al.). V typickém případě například selektovatelný markerový gen poskytuje hostitelské buňce, do které byl vektor zaveden, rezistenci na léky, jako je G418, hygromycin nebo methotrexát. Preferované selektovatelné markerové geny zahrnují gen dihydrofolátové reduktázy (DHFR) (pro použití v hostitelských buňkách dhfr“s se selekcí na methotrexátu/amplifikací) a gen neo (v případě selekce pomocí G418).
Aby se dosáhlo exprese lehkého a těžkého řetězce, expresívní vektor(y) kódující těžký a lehký řetězec je transfekován do hostitelské buňky standardními postupy.
135
• · • · • • • · • · • ·· • ·· • • *· • · ·
• «9
• · • « · • • • •
·· • ·* ·♦· ·· ··· ·
Variační formy terminy „transfekce zahrnují široký sortiment postupů běžně užívaných pro zavedení exogenní DNA do prokaryontní nebo eukaryontní hostitelské buňky, například elektroporaci, srážením fosforečnanem vápenatým, transfekcí dextranem-DEAE a podobně. Ačkoli je teoreticky možné exprimovat protilátky podle vynálezu buď v prokaryontních nebo eukaryontních hostitelských buňkách, nejvíce je preferována exprese protilátek v eukaryontních buňkách a nej výhodněji v savčích hostitelských buňkách, protože takové eukaryontní buňky a zvláště savčí buňky s větší pravděpodobnosti ve srovnání s prokaryontními buňkami tvoří a vylučují správně sbalenou a imunologicky aktivní protilátku. Preferované savčí hostitelské buňky vhodné pro expresi rekombinantních protilátek podle vynálezu zahrnují buňky vaječníků čínských křečků (buňky CHO) (zahrnující buňky dhfr-CHO popsané v publikaci Urlaub and Chasin, (1980) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, užívané se selekčním markrem DHFR, například jak se popisuje v publikaci Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621), buňky myelomu NSO, buňky COS a SP2. Když rekombinantní expresívní vektory kódující geny protilátek jsou zavedeny do savčích hostitelských buněk, protilátky jsou produkovány kultivací hostitelských buněk po časový úsek, který je dostatečný, aby umožnil expresi protilátky v hostitelských buňkách nebo výhodněji, vylučování protilátky do kultivačního média, ve kterem 3sou kultivovaný hostitelské buňky. Protilátky mohou být získány z kultivačního média za použití standardních metod čištění proteinu.
Hostitelské buňky mohou být také užívány k produkci částí intaktních protilátek, jako jsou fragmenty Fab nebo molekuly scFV. Rozumí se, že varianty shora popsaného postupu jsou obsahem vynálezu. Může být například nutné transfekovat hostitelskou buňku DNA kódující buď lehký nebo těžký řetězec (ale nikoliv oba řetězce) protilátky podle vynálezu. Technologie rekombinace DNA může také být používána *136
k odstraněni části nebo celé DNA kódující buď lehký nebo těžký řetězec nebo oba, která není nutná při navázání na hIL-12. Molekuly exprimované z takových zkrácených molekul DNA jsou také zahrnuty protilátkami podle vynálezu. Navíc mohou být produkovány bifunkční protilátky, ve kterých jeden těžký a jeden lehký řetězec je protilátka podle vynálezu a další těžký a lehký řetězec je specifický pro antigen jiný než hIL-12, prokřížením protilátky podle vynálezu s druhou protilátkou standardními metodami chemického zesítění.
V preferovaném systému pro expresi rekombinantní protilátky nebo její části vázající se na antigen podle vynálezu, je rekombinantní expresívní vektor kódující těžký a lehký řetězec protilátky zaveden do buněk dhfrCHO transfekcí zprostředkovanou fosforečnanem vápenatým. V rekombinantním expresívním vektoru jsou geny těžkého a lehkého řetězce protilátky každý operativně spojen s regulačními elementy zesilovače/promotoru (získané například z SV40, CMV, adenoviru a podobně, jako je zesilovač CMV/promotorový regulační element AdMLP nebo zesilovač SV40/promotorový regulační element AdMLP), aby došlo k vysokému stupni transkripce genů. Rekombinantní expresívní vektor také nese gen DHFR, který umožňuje selekci buněk CHO, které byly transfekovány vektorem za použití · methotrexátové selekce/amplifikace. Vybrané transformované hostitelské buňky jsou kultivovány, aby se umožnila exprese těžkého a lehkého řetězce protilátky a z kultivačního média je získávána intaktní protilátka. Pro přípravu rekombinantního expresívního vektoru, transfekovaných hostitelských buněk, při výběru transformantů, při kultivaci hostitelských buněk a získání protilátky z kultivačního média jsou používány standardní metody molekulární biologie. Protilátky nebo jejich části vázající se na antigen podle vynálezu mohou být exprimovány ve zvířeti (například v myši), které je transgenní v případě genů lidského imunoglobulinu (popisuje se například v publikaci Taylor L.D. et al., (1992)
137
Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295) .
Rostlinné buňky mohou být také modifikovány za vzniku transgennich rostlin, které exprimují protilátku nebo její část vázající se na antigen podle vynálezu.
Na základě předchozího textu vynález popisuje směs nukleové kyseliny, vektoru a hostitelské buňky, která může být použita při expresi rekombinantní protilátky a části protilátek podle vynálezu. Vynález s výhodou charakterizuje izolované nukleové kyseliny, které kódují CDR protilátky J695 nebo variabilní oblast celého těžkého a/nebo lehkého řetězce protilátky J695. Podobně v jednom provedení vynálezu se charakterizuje izolovaná nukleová kyselina kódující variabilní oblast těžkého řetězce protilátky, která kóduje CDR3 těžkého řetězce protilátky J695 obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 25. Přednostně nukleová kyselina kódující variabilní oblast těžkého řetězce protilátky dále kóduje CDR2 těžkého řetězce protilátky J695, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 27. Výhodnější je, když nukleová kyselina kódující variabilní oblast těžkého řetězce protilátky dále kóduje CDR1 těžkého řetězce protilátky J695, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 29. Dokonce výhodnější je, když izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilní oblast těžkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 31 (celá oblast VH protilátky J695).
V jiných provedeních vynálezu se charakterizuje izolovaná nukleová kyselina kódující variabilní obe^st lehkého řetězce protilátky, která kóduje CDR3 lehkého řetězce protilátky J695 obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 26. Výhodnější je, když nukleová kyselina kódující variabilní oblast lehkého řetězce protilátky dále kóduje CDR2 lehkého řetězce protilátky J695, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 28. Výhodnější je, když nukleová kyselina kódující variabilní oblast lehkého řetězce protilátky dále kóduje CDR1 lehkého
138 řetězce protilátky, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 30. Dokonce výhodnější je, když izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilní oblast lehkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 32 (celá oblast VL protilátky J695).
Vynález také poskytuje rekombinantní expresívní vektory kódující těžký a lehký řetězec protilátky. V jednom provedení vynálezu se například popisuje rekombinantní expresívní vektor kóduj ící:
a) těžký řetězec protilátky, který má variabilní oblast obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 31 a
b) lehký řetězec protilátky, který má variabilní oblast obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 32.
Vynález také poskytuje hostitelské buňky, do kterých byly zavedeny rekombinantní expresívní vektory podle vynálezu. Hostitelskou buňkou je s výhodou savčí -hostitelská buňka, výhodnější je, když hostitelskou buňkou je buňka CHO, NSO nebo COS. Vynález dále poskytuje způsob syntézy rekombinantní lidské protilátky podle vynálezu kultivací hostitelské buňky podle vynálezu ve vhodném kultivačním médiu, dokud není syntetizována rekombinantní lidská protilátka podle vynálezu. Způsob může dále zahrnovat izolaci rekombinantní lidské protilátky z kultivačního média.
VI. Farmaceutické prostředky a farmaceutická aplikace
Protilátky a části protilátek podle vynálezu mohou být začleněny do farmaceutických prostředků vhodných pro aplikaci subjektu. V typickém případě farmaceutický prostředek obsahuje protilátku nebo její část vázající se na antigen a farmaceuticky přijatelný nosič. V tomto vynálezu termín „farmaceuticky použitelný nosič zahrnuje libovolná a všechna rozpouštědla, disperzní média, potahová činidla, antibakteriální a fungicidní činidla, izotonická činidla a činidla zpožďující absorpci a podobně, která jsou fyziologicky
139 ♦ · · · · • · · · · · • · · · · • · · · · ···· kompatibilní. Příklady farmaceuticky přijatelných nosičů zahrnují jeden nebo více činidel ze skupiny obsahující vodu, fyziologický roztok, fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem, dextrózu, glycerol, ethanol a podobně, stejně jako jejich kombinace. V mnoha případech bude výhodné, když prostředek zahrnuje izotonická činidla například cukry, polyalkoholy, jako je manitol, sorbitol nebo chlorid sodný. Farmaceuticky přijatelné nosiče mohou dále obsahovat malé množství pomocných látek, jako je smáčecí nebo emulgační činidlo, konzervační činidlo nebo pufry, které prodlužují možnou dobu skladování nebo účinnost protilátky nebo její části.
Protilátky nebo jejich části podle vynálezu mohou být začleněny do farmaceutického prostředku vhodného pro parenterální aplikaci. Přednostně protilátka nebo její části budou připravovány jako roztok obsahující 0,1 až 250 mg/ml protilátky vhodný pro zavedení injekcí. Roztok vhodný pro aplikaci injekcí může být obsažen buď v kapalné nebo ’ lyofilizované dávkové formě ve zkumavce, ampuli nebo předem naplněné injekční stříkačce z bílého nebo ambrového skla.
Pufrem může být L-histidin (1 až 50 mM, v optimálním případě 5 až 10 mM s hodnotou pH 5,0 až 7,0 (v optimálním případě hodnota pH je 6,0). Jiné vhodné pufry zahrnují, ale nejsou omezeny na sukcinát sodný, citrát sodný, fosforečnan sodný nebo fosforečnan vápenatý. Chlorid sodný může být používán k modifikaci toxicity roztoku v koncentraci 0 až 300 mM (v případě kapalné dávkové formy je optimální hodnota koncentrace 150 mM) . Ochranná činidla proti poškození při hlubokém zmrazení mohou být zahrnuty v lyofilizované dávkové formě, v principu jde o 0 až 10 % sacharózy (v optimálním případě 0,5 až 1,0 %) . Jiná vhodná ochranná činidla proti poškození při hlubokém zmrazení zahrnují trehalózu a laktózu. V lyofilizované dávkové formě mohou být obsažena objemová činidla, hlavně 1 až 10% manitolu (v optimálním případě 2 až
140
4%). Jak v kapalné tak lyofilizované dávkové formě mohou být používány stabilizační činidla, hlavně 1 až 50 mM L-methionin (v optimálním případě 5 až 10 mM) . Jiná vhodná objemová činidla zahrnují glycin, arginin a mohou být obsaženy jako 0 až 0,05% polysorbát-80 (v optimálním případě 0,005 až 0,01%). Další povrchově aktivní činidla zahrnují, ale nejsou omezena na polysorbát 20 a BRIJ.
V preferovaném provedení vynálezu farmaceutický prostředek zahrnuje protilátku v dávce přibližně 0,01 mg/kg až 10 mg/kg. Výhodnější dávky protilátky zahrnují 1 mg/kg aplikovaný ob týden nebo 0,3 mg/kg aplikovaný jednou týdně.
Prostředky podle vynálezu mohou být v různých formách. Tyto formy zahrnují například kapalné, semi-pevné a pevné dávkové formy, jako je kapalné roztoky (například roztoky vhodné pro zavedení injekcí a infúzí), disperze nebo suspenze, tablety, pilulky, prášky, lipozomy a čípky. Výhodná forma závisí na módu aplikace a na terapeutické aplikaci. Typické výhodné prostředky jsou ve formě roztoků vhodných pro zavedení injekcí a infúzí, jako jsou prostředky podobné těm používaným v případě pasivní imunizace lidí s jinými protilátkami. Výhodný mód aplikace je parenterální (například intravenózní, subkutánní, intraperitoneální, intramuskulární).
V preferovaném provedení vynálezu je intravenózní infúzí nebo injekcí.
protilátka aplikována
V jiném preferovaném provedení vynálezu je protilátka aplikována intramuskulární nebo subkutánní injekcí.
Terapeutické prostředky musí být v typickém případě za výrobních a skladovacích podmínek sterilní a stabilní. Prostředek může tvořit roztok, mikroemulzi, disperzi, lipozom nebo jinou uspořádanou strukturu vhodnou pro léky s vysokou koncentrací. Sterilní roztoky vhodné pro zavedení injekcí mohou být připraveny začleněním aktivní látky (to je protilátky nebo její části) v požadovaném množství ve vhodném rozpouštědle, je-li potřeba, dohromady s jednou z ingrediencí
141 • · ···· ·<· · ·· ·· • · · «··« * · · • · · ····· ··· ··· · · · «« ··· ······ ·· ♦ · · · · · ·· ··· uvedených shora v textu nebo s jejich kombinaci. Pak následuje sterilizace filtrací. V obecném případě jsou disperze připraveny začleněním aktivní sloučeniny do sterilního vehiklu, který obsahuje bazické disperzní médium a požadované jiné ingredience z těch vyjmenovaných shora v textu. V případě sterilních, lyofilizovaných prášků pro přípravu sterilních roztoků vhodných pro aplikaci injekcí jsou preferované metody přípravy sušení ve vakuu a sušení rozprašováním, přičemž vzniká prášek aktivní ingredience plus libovolná další požadovaná ingredience z jejich roztoků, které byly před tím sterilizovány filtrací. Správná tekutost roztoku může být udržována například použitím potahů, jako je lecitin, v případě disperze udržováním požadované velikosti částic a použitím povrchově aktivních činidel. Prolongovaná absorpce prostředků vhodných pro zavedení injekcí může být uskutečněna, když se do prostředku zahrne činidlo, které zpožďuje absorpci například monostearátové sole a želatina.
Protilátky a části protilátek podle vynálezu mohou být aplikovány různými metodami známými v oboru, ačkoli v případě řady terapeutických aplikací je výhodnou cestou/modem aplikace subkutánní a intravenózní injekce nebo infúze. Pro odborníka je výhodné, aby způsob a/nebo mód aplikace byl různý v závislosti na požadovaných výsledcích. V jistých provedeních vynálezu může být aktivní látka připravena s nosičem, který bude chránit sloučeninu proti rychlému uvolnění, jako je formulace s řízeným uvolňováním, zahrnující implantáty, transdermálni náplasti a mikrokapsulární zaváděcí systémy. Mohou být použity biologicky rozložitelné a biologicky kompatibilní polymery, jako je etylen-vinylacetát, polyanhydridy, polyglykolová kyselina, kolagen, polyortoestery a kyselina polymléčná. Řada metod přípravy takových formulací je chráněná patentem nebo je obecně známa v oboru (popisuje se například v publikaci Sustained and Controlled Release Drug
142
Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, lne. New York, 1978.
V jistých provedeních vynálezu protilátka nebo její část podle vynálezu může být aplikována orálně, například s inertním ředidlem nebo s přizpůsobitelným poživatelným nosičem. Látka (a jiné ingredience, je-li to nutné) mohou také být uzavřeny v tvrdé nebo měkké želatinové duté kapsli, lisovány do tablet nebo přidány přímo do jídla subjektu. V případě orální aplikace látky mohou být začleněny s excipienty a mohou být používány ve formě poživatelných tablet, bukálních tablet, pastilek, kapslí, elixírů, suspenzí, sirupů, oplatek a podobně. Aby se látka podle vynálezu aplikovala jinou než parenterální aplikací, může být nezbytné potáhnout jí materiálem, který brání její deaktivaci, nebo látku s tímto materiálem aplikovat dohromady.
Do prostředků mohou také být začleněny doplňkové aktivní sloučeniny. V jistých provedeních vynálezu je protilátka nebo její část podle vynálezu připravena společně s jedním nebo s více terapeutickými činidly nebo se s nimi dohromady aplikuje. Uvedená činidla jsou použitelná při léčbě pcruch, kde je aktivita IL-12 škodlivá. Například protilátka proti hIL-12 nebo její část podle vynálezu může být připravena společně s jednou nebo více dalších protilátek, které se vážou na jiné cíle, nebo je s nimi společně aplikována (například protilátky, které se vážou na jiné cytokiny nebo které se vážou na molekuly na buněčném povrchu). Navíc jedna nebo více protilátek podle vynálezu může být použita v kombinaci s dvěma nebo více cizorodými terapeutickými činidly. Takové kombinační terapie mohou s výhodou využívat nižší dávky aplikovaných terapeutických činidel, tak předejít možné toxicitě nebo komplikacím spojených s různými jednotlivými terapiemi. Pro odborníka bude výhodné, že když jsou používány protilátky podle vynálezu jako část kombinační terapie, může být požadována nižší dávka, než když se subjektu aplikuje samotná protilátka (použitím kombinační terapie
143
dosáhnout synergického terapeutického účinku, což pak umožňuje použití nižší dávky protilátky k dosažení požadovaného terapeutického efektu).
Interleukin 12 má kritickou roli v patologii spojené s různými onemocněními zahrnujícími imunitní a zánětlivé elementy. Tato onemocněni zahrnují, ale nejsou omezena na reumatoidní artritidu, osteoartritidu, chronickou artritidu u mladistvých, Lymskou artritidu, psoriatickou artritidu, reaktivní -artritidu, systémový lupus erythematosus, Crohnovu chorobu, ulcerativní kolitidu, zánětlivé onemocnění střeva, inzulín dependentní cukrovku, tyreoiditidu, astma, alergická onemocnění, psoriázu, dermatitidu skleroderma, atopickou dermatitidu, onemocnění hostitele versus transplantát, odmítnutí transplantovaného orgánu, akutní a chronické imunitní onemocnění spojené s transplantací orgánu, sarkoidózu, aterosklerózu, diseminovanou intravaskulární koagulaci, Kawasakiho onemocnění, exoftalmickou strumu, nefrotický syndrom, chronický únavový syndrom, Wegenerovu granulomatózu, Henochovu-Schoenleinovu purpuru, mikroskopickou vaskulitidu ledvin, chronickou aktivní hepatitidu, uveitidu, septický infekční šok, syndrom toxického šoku, sepsi, kachexii, onemocnění, parazitická onemocnění, syndrom získané imunitní nedostatečnosti, akutní myelitis transversa,
Huntingtonovu choreu, Parkinsonovu chorobu,
Alzheimerovu chorobu, mrtvici, primární biliární cirhózu, hemolytickou anémii, zhoubné bujení, selhání srdce, infarkt myokardu,
Addisonovu chorobu, sporadickou polyglandulární deficienci typu I a polyglandulární deficienci typu II,
Schmidtův syndrom, syndrom (akutního) stiženého dýchání dospělých, alopecii, alopecii aerata, seronegativní artropatii, artropatii,
Reiterovu chorobu, lupénkovou artropatii, artropatii při ulcerativní kolitidě, enteropatickou synovitidu, artropatii nebo spondyloartropatii spojenou s ♦
·· ·« ♦
144 ··♦· chlamydiemi, yersiniemi salmonelou, *
*··
arteriosklerózu, atopickou alergii, autoimunitní bulózní onemocnění, pemfigus vvulgaris, listovitý pemfigus, pemfigoid, lineární onemocnění IgA, autoimunitní hemolytickou anémii,
Coombs-pozitivní hemolytickou anémii, získanou perniciózni anémii, juvenilní perniciózni anémii, myalgickou encefalitidu/Royal Free Disease, chronickou mukokutánní kandidózu, gigantocelulárni arteritidu, primární sklerotizuj ící hepatitidu, kryptogenní autoimunitní hepatitidu; onemocnění spojená s
AIDS, hepatitidu C, běžnou smíšenou imunonedostatečnost (běžnou variabilní hypogamaglobulinemii), dilatační kardiomyopatii, neplodnost u žen, nefunkčnost vaječníků, předčasnou nefunkčnost vaječníků, fibrotické onemocnění plic, kryptogenní fibrotizující alveolitidu, post-zánětlivé intersticiální onemocnění plic, intersticiální zápal plic, intersticiální onemocnění plic spojené s onemocněním pojivové tkáně, onemocnění plic spojené se smíšeným onemocněním konektivní tkáně, intersticiální onemocnění plic spojené se systémovou sklerózou, intersticiální onemocnění plic spojené s reumatoidní artritidou, onemocnění plic spojené se systémovým lupus' erythematosus, onemocnění plic spojené s dermatomyositidou/polymyositidou, onemocnění plic spojené se Sjogrenovou chorobou, onemocnění plic spojené s ankylozující spondylitidou, vaskulitické difusní onemocnění plic, onemocnění plic spojené s hemosiderózou, intersticiální onemocnění plic vyvolané léky, radiační fibrózu, obliterující bronchiolitidu, chronický eosinofilní zápal plic, lymfocytární infiltrační onemocnění plic, postinfekční intersticiální onemocnění plic, dnavou artritidu, autoimunitní hepatitidu, autoimunitní hepatitidu typu I (klasickou autoimunitní nebo lupoidní hepatitidu), autoimunitní hepatitidu typu 2 (anti-LKM protilátkovou hepatitidu), autoimunitně zprostředkovanou hypoglykémii, rezistenci na inzulín typ B s acanthosis i
nigricans, hypoparatyreózu, akutní imunitní onemocnění
145 s transplantací orgánu, chronické imunitní onemocnění • φ
s transplantací orgánu, osteoartrózu, primární sklerotizující cholangitidu, idiopatickou leukopenii, autoimunitní neutropenii, renální onemocnění jinak nespecifikovaná, glomerulonefritidy, mikroskopickou vaskulitidu ledvin, lymskou borreliózu, diskoidní lupus erythematosus, idiopatickou nebo jinak nespecifikovanou mužskou neplodnost, spermatickou autoimunitu, roztroušenou sklerózu (všechny subtypy), inzulín dependentnf diabetes mellitus, sympatický oční zánět, plicni hypertenzi sekundární při onemocnění pojivové tkáně, syndrom Goodpasture, nodózní polyarteritidu projevující se v plicích, akutní reumatickou horečku, reumatickou spondylitidu, Stillovu chorobu, systémovou sklerózu, Takayasuovu chorobu/arteritidu, autoimunitní trombocytopenii, idiopatickou trombocytopenii, autoimunitní onemocnění štítné žlázy, hypertyreózu, autoimunitní hypotyreózu se strumou (Hashimotova choroba), atrofickou autoimunitní hypotyreózu, primární myxedém, fakogenní uveitidu, primární vaskulitidu a vitiligo. Lidské protilátky a jejich části podle vynálezu mohou být používány k léčbě autoimunitních onemocnění, zvláště těch, která jsou spojena se zánětem, která zahrnují reumatoidní spondylitidu, alergii, autoimunitní diabetes, autoimunitní uveitidu.
Protilátky podle vynálezu nebo jejich části vázající s ena antigen se přednostně používají k léčbě reumatoidní artritidy, Crohnovy choroby, roztroušené sklerózy, inzulín dependentní cukrovky a lupénky, jak se popisuje detailněji v sekci VII.
Lidská protilátka nebo její část podle vynálezu může být také aplikována s jedním nebo více dalšími terapeutickými činidly použitelnými při léčbě autoimunitních a zánětlivých onemocnění.
Protilátky podle vynálezu nebo jejich části vázající se na antigen mohou být používány při léčbě takových onemocnění i
146
samotné nebo v kombinaci. Mělo by být zřejmé, že protilátky podle vynálezu nebo jejich části vázající na antigen mohou být používány samotné nebo v kombinaci s dalším činidlem, například terapeutickým činidlem. Uvedené další činidlo je vybráno odborníkem pro jeho určený účel. Další činidlo může být například terapeutické činidlo, které je známé v oboru jako použitelné při léčbě onemocnění nebo stavu protilátkou podle vynálezu. Dalším činidlem může být také činidlo, které propůjčuje terapeutickému prostředku příznivou charakteristickou vlastnost, například činidlo, které ovlivňuje viskozitu prostředku.
Dále by mělo být zřejmé, že kombinace, které jsou zahrnuty ve vynálezu, jsou ty kombinace použitelné pro jejich určený účel. Činidla popsaná dále v textu jsou ilustrativní a nejsou omezena. Kombinace, které jsou součástí vynálezu mohou být protilátky podle vynálezu a alespoň jedno další činidlo vybrané ze seznamů dále v textu. Kombinace mohou také zahrnovat více než jedno další činidlo, například dvě nebo tři další činidla, jestliže kombinace je taková, že vytvořený prostředek může provádět jeho funkci.
Preferované kombinace jsou nesteroidní protizánětlivé léky, které jsou známy jako NSAIDS, které zahrnují léky jako je ibuprofen. Jiné preferované kombinace jsou kortikosteroidy zahrnující prednisolon, dobře známé vedlejší účinky při použití steroidu mohou být redukovány nebo dokonce eliminovány snížením nutné dávky steroidu, když se pacient léčí steroidem v kombinaci s protilátkou proti IL-12 podle vynálezu. Neomezující příklady terapeutických činidel pro revmatoidní artritidu, se kterými protilátka nebo její část podle vynálezu může být kombinována, zahrnuje následující: proti zánětlivý lék(y) potlačující cytokiny (CSAID), protilátky proti jiným lidským cytokinům nebo antagonísty jiných lidských cytokinů nebo růstové faktory, například TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF a PDGF.
147
Protilátky podle vynálezu nebo jejich části vázající se na antigen mohou být kombinovány s protilátkami vůči molekulám na buněčném povrchu, jako CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80(B7.1), CD86(B7.2), CD90 nebo jejich ligandy zahrnující CD154(gp39 nebo CD40L).
Preferované kombinace terapeutických činidel mohou interferovat v různých bodech v autoimunitní a následné zánětlivé kaskádě, preferované příklady zahrnují TNF antagonisty podobné chimérovým, humanizovaným nebo lidským TNF protilátkám, D2E7, (patentová přihláška US sériové číslo 08/599, 226, podaná 9.2.1996), cA2 (Remicade™) , CDP 571, fragmenty anti-TNF protilátek (například CDP870) a rozpustné receptory TNF p55 nebo p75, jejich deriváty, (p75TNFRlgG(Enbrel™) nebo p55TNFRlgG(Lenercept), rozpustný receptor IL-13 (sIL-13) a také inhibitory enzymu přeměny TNFa (TÁCE) , podobně inhibitory IL-1 (například inhibitory enzymu přeměňující interleukin 1, jako je Vx740, nebo IL-1RA atd.) mohou být ze stejného důvodu efektivní. Jiné preferované kombinace zahrnují interleukin 11, anti-P7 a p-selektinový glykoproteinový ligand (PSGL). Ještě jiná preferovaná kombinace jsou jiní klíčový hráči autoimunitní odezvy, která může působit paralelně, v závislosti nebo ve shodě s funkcí IL-12, zvláště preferované jsou antagonisté IL-18 zahrnující protilátky proti IL-18 nebo rozpustné receptory IL-18 nebo proteiny vázající se na IL-18. Ukázalo se, že IL-12 a IL-18 mají překrývající se, ale odlišné funkce a nejúčinnější může být kombinace antagonistů vůči IL-12 a IL-18. Ještě jiná preferovaná kombinace jsou anti-CD4 inhibitory. Ještě jiné preferované kombinace zahrnují antagonisty ko-stimulační dráhy CD80(B7.1) nebo protilátky zahrnující CD86(B7.2), rozpustné receptory nebo antagonistické ligandy.
Protilátky podle vynálezu nebo jejich části vázající se na antigen mohou také být kombinovány s antigeny, jako je metotrexát, 6-MP, sulfasalazin azathioprinu, mesalazin, • 0
0
0
0 • 0
148 chlorochinin aurothiomalát kochicin, injekce), terbutalin, •0 000Φ •0 •0 •0
0 olsalazinu/hydroxychlorochin, (intramuskulární a orální), •0 00 • 0 0 0 • 0 · • 00 0
0Φ •0 0000 penicilinamin, azathioprin, kortikosteroidy (orální, inhalované agonisté beta-2 adrenoreceptoru salmeteral), xanthiny (theofylin, a lokální (salbutamol, aminofylin), kromoglykát, nedokromil, ketotifen, ipratropium oxitropium, cyklosporin,
FK506, rapamycin, mykofenolát mofetilu, leflunomid,
NSAID, například ibuprofen, kortikosteroidy, jako je prednisolon, inhibitory fosfodiesterázy, agonisté adenosinu, antitrombotická činidla, adrenergická činidla, činidla, inhibitory komplementu, která interferují se signalizací pro-zánětlivých cytokinů, jako je TNFa nebo IL-1 (například IRÁK, NIK, IKK, p38 nebo inhibitory kinázy MAP) , inhibitory enzymu přeměňujícího IL-Ιβ (například Vx740), antiP7, p-selektinový glykoproteinový ligand (PSGL), inhibitory enzymu přeměňujícího TNFa, inhibitory signalizace buněk T, jako jsou inhibitory kinázy, inhibitory metaloproteinázy, sulfasalazin, azathioprin, 6-merkaptopuriny, inhibitory enzymu přeměňujícího angiotenzin, rozpustné receptory cytokinů a jejich deriváty (například rozpustné receptory TNF p55 nebo p75 a deriváty p75TNFRIgG (Enbrel™) a p55TNFRIgG (Lenercept), sIL-lRI, sIL-lRII, SIL-6R, rozpustný receptor IL-13 (sIL-13) ) a protizánětlivé cytokiny (například IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 a ΤΰΓβ). Preferované kombinace zahrnují metotrexát nebo leflunomid a v případě mírné nebo silné revmatické artritidy cyklosporin.
Nelimitující příklady terapeutických činidel syndromu zánětlivého střeva, se kterými může být protilátka nebo její část podle vynálezu kombinována, zahrnují následující: budenosid, epidermální růstový faktor, kortikosteroidy, cyklosporin, sulfasalazin, aminosalicylát, 6-merkaptopurin, azathioprin, metronidazol, inhibitory lipoxygenázy, mesalamin, olsalazin, belsalazid, antioxidanty, inhibitory tromboxanu, antagonosty receptorů IL-1, monoklonální protilátky proti IL·· ····
149 : : · · • · · · · ? · · · · · • · · · · ·· « ·· ·· • · · · •· · • ·9
999999
1β, monoklonální protilátky proti inhibitory
IL-6, růstové faktory, elastázy, protilátky proti jiným faktorům nebo antagonisté růstových faktorů, například IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, sloučeniny lidským cytokinům jiných lidských TNF, LT, IL-1, pyridinyl-imidazolu, nebo růstovým nebo cytokinů
IL-2, IL-6,
IL-7,
PDGF.
EMAP-II, GM-CSF, FGF a jejich časti vazajici protilátkami proti molekulám CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, se na
Protilátky podle vynálezu nebo antigen mohou být kombinovány s na buněčném povrchu, jako CD2,
CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 nebo jiné ligandy. Protilátky podle vynálezu nebo jejich části vázající se na antigen mohou také být cyklosporin, leflunomid, prednisolon, antitrombotická činidla, kombinovány s činidly,
FK506, rapamycin,
NSAID, například ibuprofen, inhibitory fosfodiesterázy, inhibitory komplementu, činidla, činidla, která interferují se signalizací projako je metotrexát, mykofenolát mofetilu, kortikosteroidy, jak agonisté adenosinu, adrenergická zánětlivých cytokinů, jako je
NIK, IKK, p38 nebo inhibitory
TNFa nebo IL-1 (například IRÁK, kinázy MAP), inhibitory enzymu přeměňující IL-Ιβ (například glykoproteinový ligand (PSGL),
Vx740), anti-P7, p-selektinový inhibitory enzymy přeměňujícího
T-buňky, jako jsou inhibitory sulfasalazin,
TNFa, inhibitory signalizace kinázy, metaloproteinázové azathioprin, 6-merkaptopuriny, angiotensin, rozpustné receptory cytokinů a (například rozpustné receptory p55 nebo p75,
IL-13 inhibitory, inhibitory enzymu přeměňující jejich deriváty
SIL-1RI, sIL1RII, SIL-6R, rozpustný receptor protizánětlivé cytokiny (například IL-4,
IL-10,
IL-13 a
TGFP).
Preferované příklady terapeutických činidel pro nemoc, ve kterých může být protilátka nebo její část se na antiejgn kombinována, TNF, například sériové číslo
Crohnovu vázaj ici zahrnují následující: antagonisty protilátky proti TNF, D2E7 (patentová přihláška 08/599,226, podáno 9.2.1996), cA2 (Remicade™),
150
CDP 571, fragmenty protilátek proti TNF, (například CDP870), konstrukty TNFR-Ig(p75TNFRIgG(Enbrel™) a p55TNFRIgG (Lenercept)), anti-P7, p-selektinový glykoproteinový ligand (PSGL), rozpustný receptor IL-13 (sIL-13) a inhibitory PDE4. Protilátky podle vynálezu nebo jejich části vázající se na antigen mohou být kombinovány s kortikosteroidy například budenosid a dexametason. Protilátky podle vynálezu nebo jejich části vázající se na antigen mohou také být kombinovány s činidly, jako je sulfasalazin, 5-aminosalicylová kyselina a olsalazin a činidla, která interferují se syntézou nebo působení pro-zánětlivých cytokinů jako IL-1, například inhibitory enzymu přeměňující IL-Ιβ (např. VX740) a IL-lra. Protilátky podle vynálezu nebo její část vázající antigen může také být užívána s inhibitory signalizace T buněk například inhibitory tyrozinové kinázy 6-merkaptopuriny. Protilátky podle vynálezu nebo jejich části vázající se na antigen mohou být kombinovány s IL-11.
Nelimitující příklady terapeutických činidel v případě roztroušené sklerózy, se kterými může být kombinována protilátka nebo její část, zahrnují: kortikosteroidy, prednisolon, methylprednisolon, azathioprin, cyklofosfamid, cyklosporin, metotrexát, 4-aminopyridin, tizanidin, interferon^la (Avonex, Biogen) , interferon^lb (Betaseron, Chiron/Berlex), Copolymer 1 (Cop-1, Copaxone, Teva Pharmaceutical Industries, lne.), hyperbarický kyslík, intravenózní imunoglobulin, klabribin, protilátky proti jiným lidským cytokinům a růstovým faktorům nebo antagonisty jiných lidských cytokinů nebo růstových faktorů například TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF a PDGF. Protilátky podle vynálezu nebo jejich části vázající se na antigen mohou být kombinovány s protilátkami k molekulám na buněčném povrchu, jako CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 nebo jiné ligandy. Protilátky podle vynálezu nebo jejich části ·· «*♦· ·« vázající se na antigen mohou také být kombinovány s činidly, jako metotraxát, cyklosporin, FK506, rapamycin, mykofenolát mofetilu, leflunomid, NSAID například ibuprofen,
151 kortikosteroidy jako prednisolon, inhibitory fosfodiesterázy, agonisté adenosinu, antitrombotická činidla, inhibitory komplementu, adrenergická činidla, která interferují se signalizací prozánětlivých cytokinů jako TNFa nebo IL-1 (například IRÁK, NIK, IKK, p38 nebo inhibitory kinázy MAP) , inhibitory enzymu přeměňující IL-Ιβ (například Vx740), anti-P7, p-selektinový glykoproteinový ligand (PSGL). Inhibitory TÁCE, inhibitory signalizace T-buňky jako inhibitory kinázy, inhibitory metaloproteinázy, sulfasalazin, azathioprin, 6merkaptopuriny, inhibitory enzymu přeměňující angiotensin, rozpustné cytokinové receptory rozpustné receptory TNF p55 nebo 6R, rozpustný receptor IL-13 a jeho deriváty (například p75, sIL-lRI, (sIL-13)) a sIL-lRII, sILprotizánětlivé cytokiny (například IL-4, IL-10, IL-13 a ΤΰΕβ).
Preferované příklady terapeutických činidel pro roztroušenou sklerózu, ve kterých může být protilátka nebo její část vázající se na antigen kombinována, aby zahrnovaly interferon-β, například ΙΕΝβΙ a ΙΓΝβΙ^ kopaxon, kortikosteroidy, inhibitory IL-1, inhibitory TNF a protilátky proti ligandu CD40 a CD80.
Farmaceutické prostředky podle vynálezu mohou zahrnovat „terapeuticky účinné množství nebo „profylakticky účinné množství protilátky nebo její části podle vynálezu. Termín „terapeuticky účinné množství znamená množství účinné při dávkách a po časové úseky nezbytné pro dosažení požadovaného terapeutického výsledku. Terapeuticky účinné množství protilátky nebo její části může kolísat v souladu s faktory, jako je stádium onemocnění, věk, pohlaví a hmotnost jednotlivce a schopnost protilátky nebo její části vyvolat u jedince požadovanou odezvu. Terapeuticky účinné množství je také to, při kterém libovolné toxické nebo škodlivé účinky
·· • · · · • · ·
152 • · · *
9 9 ·· *··» protilátky nebo její části jsou vyváženy terapeuticky prospěšnými účinky. Termín „profylakticky účinné množství znamená množství účinné při dávkách a v časových úsecích nezbytných pro dosažení požadovaného profylaktického výsledku. V typickém případě je proto profylakticky účinné množství užíváno u subjektů před onemocněním nebo v jeho časné fázi. Profylakticky účinné množství bude menší než terapeuticky účinné množství.
Dávkové režimy mohou být upraveny tak, aby se dosáhlo optimální požadované odezvy (například terapeutická a profylaktická odezva). Může být aplikována například jedna tableta, v časových úsecích se může aplikovat několik rozdělených dávek nebo dávka může proporcionálně redukována nebo zvýšena podle naléhavosti terapeutické situace. Za účelem jednoduchosti aplikace a jednotnosti dávky je zvláště výhodné vytvořit parenterální prostředky v jednotkové dávkové formě.
Jednotková dávková forma zde znamená fyzikálně diskrétní jednotky vhodné jako unitární dávky pro savčí léčené subjekty; každá jednotka obsahující předem stanovené množství aktivní sloučeniny vypočítané tak, aby produkovala požadovaný terapeutický účinek ve spojení požadovaným farmaceutickým nosičem. Specifikace pro jednotkové dávkové formy podle vynálezu jsou předepsány (a) jedinečnými charakteristikami aktivní látky a určitým terapeutickým nebo profylaktickým účinkem, kterého se má dosáhnout a (b) omezení vlastní oboru přípravy směsí jako je aktivní látka pro léčbu citlivosti u jedinců, a nebo na těchto faktorech přímo závisí.
Příkladem neomezujícího rozmezí pro terapeuticky nebo profylakticky účinné množství protilátky nebo její části podle vynálezu je 0,01 až 20 mg/kg, výhodnější je 1 až 10 mg/kg, dokonce ještě výhodnější je 0,3 až 1 mg/kg. Je nutné poznamenat, že hodnoty dávek mohou kolísat s typem a vážností stavu, který se má zmírnit. Je nutné vědět, že v případě libovolného určitého subjektu by se měly upravit specifické
• · ··· · • · · • · · ·» ·· ·«·· · · · «
• · · ♦ · ♦ · · ;
153 : : : ··· ···· · • · · · · ·
• · · •· ··· ·· ····
dávkové režimy v průběhu času v souladu s individuální
potřebou a profesionálním úsudkem osoby, která aplikuje nebo
dohlíží na aplikaci prostředků a že zde uvedená dávková
rozmezí jsou pouze příkladem a neomezují rozsah nebo praktické použití nárokovaného prostředku.
VII. Použití protilátek podle vynálezu
Na základě jejich schopností vázat se na hIL-12, protilátky proti hIL-12 nebo jejich části podle vynálezu mohou být použity k detekci hIL-12 (například v biologickém vzorku, jako je sérum nebo plazma) použitím běžných testů, jako je test ELISA, radioimunologický test (RIA) nebo imunohistochemický test tkáně. Vynález popisuje způsob detekce hIL-12 v biologickém vzorku, který zahrnuje kontakt biologického vzorku s protilátkou nebo s jeho částí podle vynálezu a detekci jejich protilátky (nebo části protilátky) vázané na hIL-12 nebo nevázané protilátky (nebo části protilátky), čímž se detekuje hIL-12 v biologickém vzorku. Protilátka je značena přímo nebo nepřímo detekovatelnou látkou, která umožňuje detekci vázané nebo nevázané protilátky. Vhodné detekovatelné látky zahrnují různé enzymy, protetické skupiny, fluorescenční materiály, luminiscenční materiály a radioaktivní materiály. Příklady vhodných enzymů zahrnuj i křenovou peroxidázu, alkalickou fosfatázu, βgalaktozidázu nebo acetylcholinesterázu, příklady vhodných prostetických skupinových komplexů zahrnuj i streptavidin/biotin a avidin/biotin, příklady vhodných fluorescenčních materiálů zahrnují umbeliferon, fluorescein, isothiokyanát fluoresceinu, rodamin, dichlorotriazinylamin fluoresceinu, dansylchlorid nebo fykoerytrin, příklad luminiscenčního materiálu zahrnuje luminol a příklady vhodného radioaktivního materiálu zahrnuje 125I, 131I, 35S nebo 3H.
Vedle značení protilátky může být v biologických tekutinách přítomnost hIL-12 testována kompetitivním
154
imunotestem, který využívá standardů rhIL-12 značených detekovatelnou látkou a nedetekovatelnou protilátkou proti hIL-12. V tomto testu jsou kombinovány biologický vzorek, značené standardy rHIL-12 a protilátka proti hIL-12 a je stanoveno množství značeného standardu rhIL-12 vázaného na neznačenou protilátku. Množství hIL-12 v biologickém vzorku je nepřímo úměrný množství značené standardní rhIL-12 vázané na protilátku proti hIL-12.
Protilátky Y61 a J695 podle vynálezu mohou být také používány k detekci IL-12 z druhů jiných než je člověk, zvláště IL-12 z primátů. Například protilátka Y61 může být používána k detekci IL-12 u opice cynomolgus a makak. Protilátka J695 může být používána k detekci IL-12 u opice cynomulgus, makak a pavián. Žádná protilátka však nereaguje zkříženě s myším nebo krysím IL-12 (popisuje se v příkladu 3 podsekce F).
Protilátky a části protilátek podle vynálezu jsou schopné neutralizovat aktivitu hIL-12 in vitro (popisuje se v příkladu
3) a in vivo (popisuje se v příkladu 4). Podobně protilátky a části protilátek podle vynálezu mohou být používány k inhibici aktivity IL-12, například v buněčné kultuře obsahující hIL-12, vlidských subjektech nebo v jiných savčích subjektech, které obsahují IL-12, s nímž protilátka podle vynálezu zkříženě reaguje (například primáti, jako je pavián, cynomulgus a makak). V preferovaném provedení vynálezu se popisuje izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která neutralizuje aktivitu lidské IL-12 a alespoň jednoho dalšího IL-12 z primáta zahrnující IL-12 paviána, kosmana, vybraného za skupiny šimpanze, cynomolga a makaka, ale který neneutralizuje aktivitu myšího IL-12.
Výhodně je, když IL-12 je lidské IL-12. Aby se inhibovala aktivita hIL-12 v kultuře, může být do kultivačního média kultury buněk obsahující hIL-12 nebo kde se předpokládá, že
155
terý trpí poruchou, při
IL-12 byl zahrnut od
poruch (popisuj e se
J. Exp. Med. 182: 1 985-
and Rheumatism 41: 306-
obsahuje hIL-12, protilátka nebo část protilátky podle vynálezu.
V jiném provedení podle vynálezu se popisuje metoda inhibice aktivity IL-12 v subjektu, které aktivita IL-12 je škodlivá, patofyziologie širokého rozmezí v publikaci Windhagen et al., (1995) 1996, Morita et al. , (1998) Arthriti,
314, Bucht et al., (1996) Clin. Exp. Immunol. 103: 347-367,
Fais et al., (1994) . Interferon Res. 14: 235-238, Parronchi et al., (1997) Am. J. Path. 150: 823-832, Monteleone et al., (1997) Gastroenterology 112: 1169-1178 and Berrebi et al., (1998) Am. J. Path 152: 667-672, Parronchi et al (1997) Tůn. J. Path. 150: 823-832). Vynález poskytuje způsoby inhibice aktivity IL-12 v subjektu, který trpí takovou poruchou, přičemž způsob obsahuje aplikaci protilátky nebo části 7 protilátky podle vynálezu subjektu tak, že je aktivita IL-12 v subjektu inhibována. Upřednostňuje se, když IL-12 je lidský * IL-12 a subjekt je lidský subjekt. V jiném případě subjektem může být savec exprimující IL-12, se .kterým protilátka podle vynálezu zkříženě reaguje. Subjektem může dále být savec, do kterého byl zaveden hIL-12 (například aplikací hIL-12 nebo expresí transgenu hIL-12). Protilátka podle vynálezu může být aplikována lidskému subjektu pro terapeutické účely (jak se diskutuje dále v textu). Protilátka podle vynálezu však může být aplikována savci, který není člověk a který exprimuje IL12, se kterou protilátka zkříženě reaguje, což se využívá pro veterinární účely nebo jako zvířecí model lidského onemocnění.
S ohledem na posledně uvedené takové zvířecí modely mohou být použitelné pro hodnocení terapeutické účinnosti protilátek podle vynálezu (například testování dávek a časové průběhy aplikace).
Zde používaný termín „porucha, kde aktivita IL-12 je škodlivá zahrnuje onemocnění a jiné poruchy, ve kterých se • · • · · · • 9
• ·· ·· • · * ♦ ·· • · ·· • · · ·· • · ·· · · ·· · ··· ukázalo, že přítomnost IL-12 u subjektu trpícím poruchou, odpovídá za patofyziologii poruchy nebo je faktorem, který přispívá ke zhoršení poruchy. Tedy porucha, kde aktivita IL-12 je škodlivá, je poruchou, u které se očekává, že inhibice aktivity IL-12 zmírní symptomy a/nebo postup poruchy. Takové poruchy mohou být prokázány například zvýšením koncentrace IL12 v biologické tekutině subjektu, který trpí poruchou (například zvýšením koncentrace IL-12 v séru, plazmě, synoviální tekutině atd. subjektu), která může být detekována například použitím protilátky proti IL-12, jak se popisuje shora v textu. Existuje řada příkladů poruch, kde aktivita IL12 je škodlivá. V jednom provedení vynálezu protilátky nebo její části vázající se na antigen mohou být použity při terapii, kdy se léčí zde popsané onemocnění nebo poruchy. V jiném provedení vynálezu protilátky nebo její části vázající se na antigen mohou být použity při výrobě léku pro léčbu zde « popsaných onemocnění nebo poruch. Použití protilátek a částí ‘ protilátek podle vynálezu při léčbě několika neomezujících specifických poruch je diskutováno dále v textu:
A. Reumatoidní artritida:
Interleukin-12 se podílí na důležité úloze při zánětlivých onemocněních, jako je reumatoidní artritida. V kloubním mazu pacientů trpících reumatoidní artritidou byla detekována indukovatelná mRNA IL-12p40 a ukázalo se, že IL-12 je přítomen v synoviálních tekutinách u pacientů trpících reumatoidní artritidou (popisuje se například v publikaci Morita et al., (1998) Arthritis and Reumatism 41: 306-314). Zjistilo se, že buňky pozitivní na IL-12 jsou přítomny v povrchové vrstvě kloubní mazotvorné blány zasažené reumatoidní artritidou. Lidské protilátky a části lidských protilátek podle vynálezu mohou být používány k léčbě například reumatoidní artritidy, Lymské artritidy, reumatoidní spondylitidy, osteoartritidy a dnavé artritidy. V typickém případě protilátka nebo její část
157 je aplikována systémově, ačkoli při výhodné aplikovat protilátku nebo jistých poruchách může být část protilátky lokálně.
Protilátka nebo její část podle aplikována s vynálezu může být také jedním nebo více dalších terapeutických činidel použitelných při léčbě autoimunitního onemocnění.
V myším modelu pro kolagenem (CIA) léčba myší reumatoidní artritidu vyvolanou monoklonálními protilátkami proti
IL-12 (krysí monoklonální protilátka proti myšímu
IL-12 vznikem artritidy zcela potlačila vznik onemocnění a omezila jeho výskyt a vážnost.
Léčba monoklonální protilátkou proti IL-12 časně po vzniku artritidy omezila vážnost onemocnění, ale pozdější léčba myší monoklonálními protilátkami proti IL-12
Po vzniku onemocnění měla minimální účinek na vážnost onemocnění.
B. Crohnova choroba
Interleukin-12 onemocnění střev, také má důležitou úlohu při zánětlivém
Crohnově chorobě. U pacientů trpících
Crohnovou chorobou se objevuje ve střevní sliznici zvýšená exprese IFN-γ a IL-12 (popisuje se například v publikaci Fais et al., (1994) J. Interferon res. 14: 235-238, Parronchi et al., (1997) Amer. J. Pathol. 150: 823-832, Monteleone et al., (1997) Gastroenterology 112: 1169-1178, Berrebi et al., (1998)
Amer. J. Pathol. 152: 667-672). Ukázalo se, že protilátky proti IL-12 potlačují onemocnění v myších modelech kolitidy, například kolitida u myší vyřazených pomocí IL-12 indukovaná TNBS a v poslední době i myší vyřazených IL-10. Tedy, při léčbě zánětlivých onemocnění střev mohou být použity protilátky nebo jejich části podle vynálezu.
C. Roztroušená skleróza
Interleukin-12 působí při roztroušené skleróze jako klíčový mediátor. V lézích u pacientů s roztroušenou sklerózu může být demonstrována exprese indukovatelné mRNA IL-12p40 •· ··»· • · · • · · • · · ·* · • ·
158 nebo samotného IL-12 (popisuje se v publikaci Windhagen et
Med. 182:
1985-1996, Drulovec et al. , (1997) J. Neurol.
Sci. 147:
145-150) . U chronických progresivních pacientů trpících roztroušenou sklerózou se zvýšilo množství cirkulujícího IL-12. Výzkum buněk T a buněk prezentuj icích antigen (APC) pocházejících od pacientů s roztroušenou sklerózou ukázal samopokračující série imunitních reakcí jako základ progresivní roztroušené sklerózy vedoucí k imunitní odezvě typu Thl. Zvýšené vylučování IFN-γ u buněk T vedoucí ke zvýšené produkci IL-12 buňkami APC, což má za následek pokrčování cyklu vedoucího k chronickému stádiu imunitní aktivace typu Thl a k onemocnění (Balashov et al., (1997) Proč. Nati. Acad. Sci. 94: 599-603). Úloha IL-12 při roztroušené skleróze se zkoumala za použití myších a krysích experimentálních modelů alergické enčefalomyelitidy
Předchozí léčba monoklonální protilátkou proti IL-12 v modelu recidivuj ící-ustupuj ící
EAE roztroušené sklerózy u myší oddálila paralýzu a redukovala klinické skóre.
Léčba monoklonální protilátkou proti
IL-12 při vrcholu paralýzy nebo během následného období remise redukovala klinické skóre. Tedy protilátky nebo jejich části vázající se na antigen podle vynálezu mohou sloužit ke zmírnění s ymptomů spojených s roztroušenou sklerózou u lidí.
D. Inzulín dependentní cukrovka
Interleukin-12 byl implikován j ako důležitý mediátor inzulín dependentní cukrovky (IDDM).
IDDM byl vyvolán u myší
NOD aplikací IL-12 a v adoptivním transferovém modelu IDDM působily protilátky proti IL-12 jako ochrana. Pacienti při časné fázi onemocnění IDDM mají často zkušenost s tzv.
obdobím „honeymoon, během kterého je udržována funkce některých zbylých ostrůvkových buněk.
Tyto zbylé ostrůvkové buňky produkují inzulín a regulují množství glukózy lépe než aplikovaný inzulín. Léčba těchto pacientů během časné fáze
159
s protilátkou IL-12 může bránit dalšímu poškození ostrůvkových buněk, čímž se udržuje endogenní zdroj inzulínu.
D. Lupénka (psoriáza)
Interleukin-12 působí jako klíčový mediátor lupénky. Lupénka zahrnuje akutní a chronické kožní léze, které jsou spojeny s profilem exprese cytokinů typ TH1 (Hamid et al., (1996) J. Allergy Clin. Immunol. 1: 225-231, Turka et al., (1995) Mol. Med. 1: 690-699). Ve vzorcích kůže nemocného člověka byla detekována mRNA IL-12p35 a p40. Tedy, protilátky a jejich části vázající se na antigen podle vynálezu mohou zmírnit chronické kožní poruchy takové lupénky.
Vynález je dále ilustrován následujícími příklady, které by neměly být v žádném případě chápány jako omezující. Obsahy všech citovaných referencí, které zahrnují citace literatury, zmiňované pacienty a zveřejněné patentové jsou citovány v této přihlášce začleněni pomocí citace. Dále přiřazených tabulek (uvedeno v textu citací.
jsou tímto je zřejmé, přihlášky, které způsobem úmyslně že obsahy všech dodatku A) jsou začleněny do
V • « ♦ · · ·
CO 4J co Λ cO
X
d) <—I Ό
O
Ch
Ή -i—>
O i—I m xr4 >υ <p ω
*d)
M
d)
X λ:
co x
>
0
xj σ
sH Φ
£ ο
1—1 I-D
'(0 ΓΜ
£ >1 X
0 Λ! tt Q
>1 4-> (J
M 'C0
X) γΗ
g -Η
d) 4-1
Ο
Jo C Μ Ch
H Ό 0 X >
$4 0
4-1
0) d
0 d
C Μ
Φ X χ
> <0 tt
>4 Ν Ο
d) <J
w Φ
•Γ~ι
<D
> Ή
0
c '(0
-H C
H >
d) ο
ω μ
>1 ο
Λ! Ch
O
c Ο
Ή Μ
Ch
ϊ—1
< >θ
Si Λ Q) Si
4->7] fO2
Tj ή
O<0
Q H
• · ·
cú
4-> fÚ JO rtf ω I—i Ό
O
SX srl m
i—I co sr4 >υ
Φ co
Ό)
P
Φ P 44 on >
O Λ Ή β to '<o
β o >1
P
β •H
O P cn Φ O to
-P 'Φ to to P o P (X >
<D O β Φ > 44
Φ co
-Φ > o β -Η rH
Φ co >1 44
Ο β to
Ο Ρ β Μ 44
Φ
Ν
Φ •Π to β
'Φ β
>
Ο Μ
Ο ίΧ
Ο ρ (X < >υ χ φ φ 44 Ρ to
Φ 3
Ό -Q
Ο Λ
Q Η ··· ·
<Ν
Ο
Ρ <ΰ Λ
Φ φ
1------1
Ό
Ο
Ο.
η
Γ~1 ω
Ή >υ φ
ω
-φ ρ φ Ρ
φ
Φ -π
>
ο Ή
ρ Ρ
•Η Ό
<—1 C
Φ >
ω ο
>1 Μ
44 Ο
Ο ίλ
Ρ
Η Ο
Φ Ρ Φ
Ό
Ο
Q (0 γΗ
Λ
Ο
Η
Η <- Η
> > >
X X X
Ο ο Ο
13 <3 ο
tu X X
X Η e
X ο ο
tf) V) V»
>· X X
υ ο Ο
<Λ V) <Λ
»-4
·- Η e
> > >
X χ
ο Ο ο
χ Ο ο
ο· X α»
χ X X
C\1
Dodatek A >0 r—| p Λ
H ·· ··«·
ΙΌ ΙΟ c\j ·· »ί· ·
• φφ 4Φ
• · φ · • «
• • φ
• • · φ Φ
• • φ φ
• · φ • · • Φφφ
<
Φ -Ρ
Φ Ό
Ο Q >0
Ο λ: I---------1
Ό <0 Η
<ϋ Σ
Ε Π3 en Ο
ζ «η U
ÍM »-*
ο tO <Λ
<*Ί ca <Ν
1 I 1
Ο ο Ο
r- Γ* Γ*
»—4
Dodatek A
O .·
ω Ol
<Λ X
ΓΊ o
X «-Μ
kO r~H
>υ
(ΰ
(D Λί
+-> 1--------1
(ΰ 3
Ό Λ
0 φ
Q Η
Dodatek A
Tabulka č
Ó ro
Q H
Dodatek A
XX X
Q □ Q
X X X
to to co
0 o o
X X X
ςύ a: a; al
co m CO oo
on on on on
J vO
< >υ
Al (0
0) Al
P i—1
<0 2
τ> A
0
Q H
% U*|>«
«r XT I*·*
<ηΙσ>
tí >4|U
0 • 1 1
rH r-< «-< !·“<
X NO no Ι'-ο
>* >· |>·
<N u
u CL
CL o
O o
o ♦
• · • · · ·
OJ Γοο < >υ
AJ (D 4-> rO
Ό O Q <0 A! i—I
Λ rO H
• ♦ · · · ·
Dodatek A , <·
Tabulka c. 4: Neutralizační aktivita v přítomnosti nadbytku volné podjednotky P40 IL-12
174
Přehled obrázků na výkrese
Na obrázcích IA až IB jsou zobrazena uspořádání aminokyselinové sekvence variabilních oblastí těžkých řetězců série lidských protilátek, které se vážou na lidský IL-12 ve srovnání s embryonálními sekvencemi Cos-3/JH3 a Dpll8 Lvl042. Při identifikaci poloh aminokyselin se používá číslování podle Kabata. V případě protilátky Joe9 je zobrazena celá sekvence. V případě jiných protilátek jsou zobrazeny pouze ty polohy aminokyselin, které se liší od protilátky Joe9 divokého typu.
Na obrázcích 1C až ID jsou zobrazena uspořádání aminokyselinových sekvencí variabilních oblastí lehkých řetězců sérií lidských protilátek, které se vážou na lidský IL-12. Při identifikaci poloh aminokyselin se používá číslování podle Kabata. V případě protilátky Joe9 je zobrazena celá sekvence. V případě jiných protilátek jsou zobrazeny pouze ty polohy aminokyselin, které se liší od divokého typu Joe9.
Na obrázcích 2A až 2E jsou zobrazeny polohy CDR v těžkém řetězci protilátky Y61, které se mutovaly místně řízenou mutagenezi a příslušné substituce aminokyselin v každé poloze. Grafy na pravé straně obrázku zobrazují rychlostní konstantu disociace v případě substituovaných protilátek (černé sloupce) ve srovnání s nemutovanou protilátkou Y61 (prázdný sloupec).
Na obrázcích 2B až 2H jsou zobrazeny polohy CDR lehkého řetězce protilátky Y61, které se mutovaly místně řízenou mutagenezi a příslušné aminokyselinové substituce v každé poloze. Grafy na pravé straně obrázku zobrazují rychlostní konstantu disociace v případě substituovaných protilátek (černé sloupce) ve srovnání s nemutovanou protilátkou Y61 (prázdný sloupec).
Obrázek č. 3 demonstruje účinnost in vivo lidské protilátky J695 proti IL-12 na množství plazmového neopterinu u opic cynomolgus.
•· 999 9
175 ::: · : :
·· · ·· ··· 9 · ·99·
Obrázek č. 4 zobrazuje graf průměrného výskytu artritidy versus dny po imunizaci myší kolagenem, což ukazuje, že ošetření s C17.15 podstatně snižuje symptomy spojené s artritidou ve srovnání s léčbou krysím IgG.
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1: Izolace protilátek proti IL-12
A. Testování protilátek vázajících se na IL-12
Protilátky proti IL-12 byly izolovány testováním tří jednotlivých knihoven zobrazujících fága připravených použitím cDNA lidského VL a VH z mRNA získané z lidských mandlí (označených jako scFv 1) , mandlí a lymfocytů periferní krve (PBL) (označených jako scFv 2) a lymfocytů získaných z kostní dřeně (označených jako BMDL). Konstrukce knihovny a způsoby selekce jsou popsány v publikaci Vaughan et al., (1996) Nátuře Biotech 14: 309-314.
Knihovny se testovaly použitím antigenů, podjednotky p70 lidského IL-12, podjednotky p40 lidského IL-12, chimérického IL-12 (myší p40/lidská p35), myšího IL-12, biotinylovaného lidského IL-12 a biotinylovaného chimérického IL-12. Protilátky specifické pro IL-12 byly vybrány na základě potažení antigenů na stěny imunologických zkumavek použitím standardních postupů (popisuje se v publikaci Marks et al., (1991) J. Mol. Biol. 222: 528-597). scFv knihovna 2 se testovala buď použitím IL-12 nebo biotinylovaného IL-12 a vytvořilo se podstatné množství vazeb specifických pro IL-12. Bylo vybráno pět odlišných klonotypů stanovených paterny štěpením enzymem BstNl a potvrdily se sekvenováním DNA. Hlavní klonotypy byly VHD58/VLDPL11, VHDP77/VLDPK31, VHDP47/VL a VHDP77/VLDPK31, přičemž každý z nich rozpoznal podjednotku p40 IL-12.
Testování knihovny BMDL použitím IL-12 p70 generovalo tři různé klonotypy. Zjistilo se, že dva z nich jsou zkříženě
176
a obsahoval reagující klony.
Dominantní klon byl sekvenován
VHDP35/VLDP. Tento klon rozeznává podjednotku p40
IL-12.
Testování knihovny scFv použitím IL-12p70 neprodukuj e specifické protilátky proti IL-12.
Za účelem identifikovat protilátky proti IL-12, které se přednostně váží na heterodimer p70 nebo podjednotku p35 IL-12, spíše než na podjednotku p40, byly použity kombinované knihovny scFv 1 + 2 a BMDL. Aby se vybraly protilátky proti
IL-12, které rozeznávají heterodimer p70 nebo podjednotku p35, fágové knihovny byly předem inkubovány a vybrány v přítomnosti volného p40. Sekvenování izolovaných klonů ukázalo devět různých linií protilátek. Preferenční podjednotky byly dále analyzovány mikro-Friguetovou titrací. Supernatant obsahující scFv byl titrován IL-12 značeným biotinem v testu ELISA a stanovila se hodnota ED50. Koncentrace scFv produkující 50 % ED byla předem inkubována se zvýšenou koncentrací volné podjednotky p70 nebo p40 (inhibitory). Byl měřen pokles signálu v testu ELISA na destičkách potažených IL-12 značeným biotinem a hodnoty se vynesly proti koncentraci volné podjednotky p70 nebo p40. Jestliže se titrace v případě obou podjednotek překrývá, pak scFv se váže na obě podjednotky p4 0 a p70. Libovolná odchylka od překryvu udává stupeň preference podjednotky p70 před p40.
B. Afinitní maturace linie protilátek specifických pro IL-12 (Joe 9)
U klonů byla testována jejich schopnost inhibovat navázání IL-12 na svůj receptor v testu navázání IL-12 na svůj receptor (označil se RBA) a schopnost inhibovat proliferaci lidských blastových buněk stimulovaných PHA vyvolanou IL-12 (test PHA), jak se popisuje v příkladu 3. Klon Joe 9 vykazoval v testu RBA a PHA nejnižší hodnotu IC50. Tato hodnota v obou testech je 1 x 106 M. Navíc variabilní oblast (VH) těžkého řetězce protilátky Joe 9 měla ve srovnání s nejbližší embryonální
177 sekvenci COS-3 nejmenší počet změn, což se zjistilo z databáze VBASE. Tabulka č. 1 (uvádí se v dodatku A) zobrazuje embryonální sekvence rodiny VH3, jejíž členem je sekvence COS-3 stejně jako členové embryonálních sekvencí rodiny νλΐ. Proto pro afinitní maturaci byla vybrána protilátka Joe 9. Aminokyselinové sekvence VH a VL protilátky Joe 9 divokého typu (Joe 9 wt) jsou zobrazeny na obrázku č. 1A až ID.
Za účelem zvýšit afinitu protilátky Joe 9 byly provedeny různé mutace oblasti 3 stanovující komplementaritu (CDR3) těžkého i lehkého řetězce. Použitím místně řízené PCR mutageneze s degenerativními oligonukleotidy specifickými pro CDR3 těžkého řetězce (označených jako „H3) nebo lehkého řetězce (označených jako „L3) se vytvořily varianty CDR3 s průměrným počtem substitucí tří bází v každém CDR3 (označuje se jako „spike). Mutageneze PCR CDR3 těžkého řetězce byla provedena použitím degenerativního oligonukleotidu těžkého řetězce, který obsahuje náhodnou směs všech čtyř nukleotidů
5’TGTCCCTTGGCCCCA(G)(T)(A)(G)(T)(C)(A)(T)(A)(G)(C)(T)(C)(C)(C)(A)(C)(T) GGTCGTACAGTAATA 3’ (SEQ ID NO: 580) a oligonukleotidu pUC Reverse Tag
GAC ACC TCG ATC AGC GGA TAA CAA TTTCAC ACA GG (SEQ ID NO: 581) za vzniku souboru mutantů CDR3 těžkého řetězce. Původní lehký řetězec byl amplifikována použitím reverzního oligonukleotidu protilátky Joe 9 (5' TGG GGC CAA GGG ACA 3' (SEQ ID NO: 582) a fdteteseq 24 + 21 oligonukleotidu (5'- ATT CGT CCT ATA CCG TTC TAC TTT GTC GTC TTT CCA GAC GTT AGT -3' (SEQ ID NO: 583).
Komplementarita mezi dvěma produkty PCR byla používána k průběhu tepelné hybridizace dvou fragmentů v reakci PCR a rekombinační knihovna scFv plné délky byla amplifikována s pUC Reverse Tag (SEQ ID NO: 581) a fdTag 5'-ATT CGT CCT ATA CCG TTC-3'(SEQ ID NO: 584). Mutageneze PCR lehkého řetězce byla provedena použitím oligonukleotidu lehkého řetězce obsahující směs všech čtyř nukleotidů
5'GGTCCCAGTTCCGAAGACCCTCGAACC(C)(C)(T)(C)(A)(G)(G)
178 (C) (T) (G) (C) (T) (G) (T) (C)ATATGACTGGCAGTAATAGTCAGC3' (SEQ ID NO:
585) a reverzního oligonukleotidu protilátky Joe
5'TGG GGC
CAA GGG ACA 3' (SEQ ID NO: 586) za vzniku souboru mutantů CDR3 lehkého řetězce. Výchozí těžký řetězec se amplifikoval s pUC Reverse Tag (SEQ ID NO: 581) a oligonukleotidu HuJH3F0R 5'TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC3' (SEQ ID NO: 587). Komplementarita mezi dvěmi produkty PCR byla použita k průběhu teplotní hybridizace dvou fragmentů v reakci PCR a rekombinovaná knihovna scFv plné délky byla amplifikována s Reverse Tag GAC
ACC TCG ATC AGC G (SEQ ID NO: 588) as oligonukleotidem HuJÁ 23 FOR NOT 5'GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACC TAG GAC GGT
CAG CTT GGT CCC 3' (SEQ ID NO: 589).
Mutanti CDR3 těžkého řetězce byli vybráni použitím 1 nM IL-12 značeného biotinem a promývali se po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti v PBS, který obsahuje volný IL-12 nebo podjednotku p40 v koncentraci 7 nM. Klony se analyzovaly fágovým testem ELISA a ty, které se váží na IL-12 byly testovány v kinetických vazebných studiích BIAcore použitím čipu s IL-12 s nízkou hustotou (popisuje se v příkladu 5 v postupu analýzy BIAcore). V obecném případě analýza BIAcore měří vazebné interakce v reálném čase mezi ligandem (rekombinantní lidský IL-12 imobilizovaný na biosensorové matrici) a analytem (protilátkou v roztoku) povrchovou plazmonovou rezonancí (SPR) použitím systému BIAcore (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Systém využívá optické vlastnosti SPR k detekci změn v koncentracích proteinu v dextranové biosensorové matrici. Proteiny jsou kovalentně vázány na dextranovou matrici ve známé koncentraci. Protilátky jsou zavedeny injekcí přes dextranovou matrici a specifické navázání mezi protilátkami zavedenými injekcí a imobilizovaným ligandem vede ke zvýšené koncentraci matricového proteinu a výsledné změně v signálu SPR. Tyto změny v signálu SPR jsou zaznamenávány jako jednotky rezonance (RU) a jsou vyjádřeny s ohledem na čas na ose Y sensogramu. Aby se stanovily hodnoty
179 kOff, kon, asociační konstanta (Ka) a disociační konstanta (Kd) , byl používán software hodnotící kinetiku BIAcore (verze 2.1). Klony, které demonstrovaly zlepšení rychlostní konstanty koff, byly analyzovány neutralizačními testy, které zahrnovaly inhibici protilátkou proti IL-12 vázající se na svůj receptor (test RBA), inhibici proliferace vyvolané IL-12 v lidských blastových buňkách stimulovaných PHA (test PHA) a inhibici produkce interferonu gamma vyvolanou IL-12 lidskými blastovými buňkami (test IFN gamma). Souhrn disociačních konstant a/nebo hodnot IC50 z neutralizačních testů klonů 70-1 až 70-13 s přidaným CDR3 těžkého řetězce je prezentován v tabulce č. 2 (popisuje se v dodatku A) . Klon 7 0-1 vykazoval rychlostní konstantu kOff lepší než původní klon Joe9 a vykazoval nejnižší hodnotu IC50 2,0 x ΙΟ-7 M. Proto byl klon 70-1 vybrán pro konverzi na úplný IgGl.
Mutanti s CDR3 lehkého řetězce byli vybráni použitím lnM IL-12 značeného biotinem a promyli se PBS, který obsahuje 7 nM volnou podjednotku p40. Klony se testovaly ve fágovém testu ELISA a ty, které se vázaly na IL-12, byly testovány vazebnou analýzou BIAcore použitím čipů s IL-12 s nízkou hustotou. Klony, které vykazovaly hodnotu koff lepší než původní klon Joe 9, byly testovány v neutralizačních testech, které měřily buď inhibici navázání na receptor IL-12 nebo inhibici proliferace PHA blastových buněk. Souhrn hodnot disociačních rychlostí a/nebo hodnot IC50 z neutralizačních testů mutantních klonů CDR3 lehkého řetězce 78-34 až 79-1 je prezentován v tabulce č. 2 (popisuje se v dodatku A).
Založeno na hodnotě rychlostní konstanty kOff, klony 78-34 a 78-35 vykazovaly zlepšenou hodnotu kOff ve srovnání s původní protilátkou Joe9. Oba tyto klony byly vybrány pro kombinační analýzu s mutanty těžkého řetězce.
C. Kombinační klony • · · · · ·
Klony s mutovaným lehkým a těžkým řetězcem,
180 vykazovaly nej lepši vazebné charakteristiky byly používány při kombinaci a kompletaci scFv. Mutantní klony se zlepšenými účinnými charakteristikami byly kombinovány přesahující extenzí pomocí PCR a prodlužováním mutovaných segmentů VH a VL, jak se popisuje shora v textu. Klony 101-14 až 26-1 zobrazené v tabulce č. 2 (popisuje se v dodatku A) byly produkovány z kombinace mutantů těžkého řetězce (70-2, 70-13 a
70-1) s mutanty lehkého řetězce (78-34, 78-35 a 79-1) . Hodnoty rychlostní konstanty koff a/nebo IC50 získané z neutralizačních testů pro tyto klony jsou prezentovány v tabulce č. 2.
Vazebná analýza BIAcore identifikovala klon 101-11 produkovaný z kombinace mutantního klonu CDR3 těžkého řetězce 70-1 s mutantním klonem CDR3 lehkého řetězce 78-34 mající disociační konstantu (kOff) 0, 0045 s-1. Hodnota disociační konstanty byla podstatně zlepšena ve srovnání s hodnotou disociačních konstant samotného mutovaného klonu CDR3 lehkého řetězce 78-34 (0,0164 s_1). Navíc, klon 101-11 vykazoval podstatné zlepšení v neutralizačních testech. Tedy klon 101-11 byl vybrán pro afinitní maturaci, jak se popisuje dále v textu.
D. Afinitní maturace klonu 101-11
Další afinitní maturace klonu 101-11 zahrnovala opakované cykly PCR mutageneze obou CDR3 těžkého a lehkého řetězce 10111 použitím přidaných oligonukleotidových primerů. Klony byly vybrány pomocí snižujících se koncentrací IL-12 značeného biotinem (bio-IL-12). Vazebné charakteristiky mutovaných klonů byly odhadnuty vazebnou analýzou BIAcore a RBA, PHA neutralizačními testy. Hodnoty rychlostní konstanty koff a/nebo IC50 v případě klonů 136-9 až 170-25 jsou přítomny v tabulce č. 2 (uvedeno v dodatku A) . Klon 103-14 demonstroval zlepšenou hodnotu IC50 v testu navázání na receptor a PHA blastovém
181
• · • · · 9 • · * ·· • 9
* · · • • • · 9 « • ·
• · 9 • • 9 • • •
• · · 9 • « • * 9
• · • ·· ♦ · · • 9
testu. Klon 103-14 také demonstroval nízkou hodnotu rychlostní konstanty koff a podobně byl vybrán pro další afinitní maturaci.
E. Vytvoření a výběr náhodných knihoven řetězce klonu 103-14 CDR3 lehkého
CDR3 lehkého řetězce klonu 103-14 (QSYDRGFTGSMV (SEQ ID použitím symbol X symbol A ) byl systematicky náhodně rozdělen do 3 segmentů 3 různých knihoven, jak je uvedeno dále v textu, kde je kódován náhodným kodonem sekvence NNS, přičemž je libovolný nukleotid a symbol S je buď deoxyguanidin.
deoxycytozin nebo
L3.1 = XXXXXXFTGSMV (SEQ ID NO: 591)
L3.2 = QSYXXXXXXSMV (SEQ ID NO: 592)
L3.3 = QSYDRGXXXXXX (SEQ ID NO: 593)
Byla provedena řetězce (označených náhodná mutageneze všech tří jako L3.1, L3.2 a L3.3) klonu
CDR lehkého
103-14. CDR3 těžkého řetězce (označený H3) klonu 103-14 nebyl mutován. Byly zkonstruovány čtyři náhodné knihovny založené na klonu 103-14
(H3 a L3.1, L3.2 a L3.3) a byly vystaveny mnoha různým
selekčním podmínkám, které zahrnovaly použití limitující
koncentrace antigenu a přítomnost nebo absenci nadbytku
volného antigenu (p40 a p70). Výstupy z výběrů (klony 73-B1 až byly testovány primárně analýzou BIAcore a v případě nutnosti testem RBA a jsou zobrazeny v tabulce č. 2 (zobrazeno v dodatku A) .
Náhodná mutageneze CDR lehkého řetězce 103-14 vytvořila klon Y61, který vykazoval podstáhé zlepšení hodnoty IC50 ve srovnáni s původním klonem 103-14. Klon Y61 byl vybrán pro získání celého IgGl. Celý ΥβΙ-IgGl měl hodnotu IC50 přibližně 130 pM stanovenou testem PHA. Hodnota IC50 nebyla ovlivněna 50ti násobným molárním nadbytkem volného p40, což demonstruje, že volný p40 nereaguje zkříženě s Y61 protilátkou proti IL-12, čím snižuje navázání protilátky na heterodimer. Sekvence plné
182
« · • ··> • · · ·*
• 9 « • · · · ♦ · · ·
• · · • · ·
• · • ·· ♦· ·
délky variabilní oblasti těžkého řetězce a variabilní oblast lehkého řetězce Y61 jsou zobrazeny dále v textu.
Peptidová sekvence variabilní oblasti těžkého řetězce Y61
CDR H1
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASFTFS SYGMH WVRQAPGKGLEWV A
CDR H2
FIRYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRÁEDTAVYYCKT
CDR H3
HGSHDN WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 23)
Peptidová sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce Y61
CDR LI
QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISC SGGRSNIGSNTVK WYQQLPGTAPKLLIY
CDR L2 !
GNDQRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCj
CDR L3|
QSYDRGTHPALL FGTGTKVTVLG (SEQ ID NO:24)I
Zbytky CDR jsou označeny podle definic Kabata.
Příklad 2: Mutace Y61 v hypermutačních a kontaktních polohách
V typickém případě selekce rekombinantních protilátek se zlepšenými afinitami mohou být provedeny použitím metod vyjadřujících fága. To je docíleno náhodně mutujícími kombinacemi zbytků CDR za vzniku velkých knihoven, které obsahují jednořetězcové protilátky různých sekvencí. V typickém případě protilátky se zlepšenými afinitami jsou vybrány na základě jejich schopnosti dosáhnout rovnováhy v reakci protilátka-antigen. Když se však exprimovala na ·· «*·«
183 povrchu fága Y61 scFV a inkubovala se s IL-12, nemohly být nalezeny selekční podmínky, které by nechaly systém dosáhnout normální rovnováhy protilátka-antigen. scFV-fág zůstal navázaný na IL-12, což pravděpodobně způsobila nespecifická interakce, protože čištěná Y61 scFv vykazovala normální disociační kinetiky. Poněvadž nemohly být využity obvyklé metody fága vyjadřující afiníjiní maturace na Y61 (to je vytvoření knihovny a selekce mutagenezí více zbytků CDR), byla vyvinuta nová strategie, při které byly mutovány jednotlivé polohy CDR.
Tato strategie zahrnuje selekci poloh CDR vhodných pro mutaci a je založena na identifikaci a selekci aminokyselin, které jsou preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní polohy a/nebo hypermutační polohy. Kontaktní polohy jsou definovány jako zbytky, které mají vysokou pravděpodobnost kontaktu s antigenem, když antigen interaguje s protilátkou, zatímco hypermutační polohy jsou definovány jako zbytky, o nichž se uvažuje, že mají vysokou pravděpodobnost somatické hypermutace během afinitní maturace protilátky in vivo. Preferované polohy selektivní mutageneze jsou polohy CDR, které jsou jak kontaktní tak hypermutační polohy. Protilátka Y61 byla už optimalizována v oblastech CDR3 použitím postupu popsaném v příkladu 1, proto bylo obtížné dále zlepšit oblast, která leží ve středu vazebného místa protilátky použitém selekčních metod vyjádření fága. Větší zlepšení aktivity byla získána mutací potencionálních kontaktních poloh vně oblasti CDR3 buď odstraněním škodlivého kontaktu antigen-protilátka nebo vytvořením nového kontaktu.
Aminokyselinové zbytky protilátky Y61, které byly považovány za kontaktní body s antigenem a ty polohy CDR, které jsou místa somatických hypermutací během afinitní maturace in vivo, jsou zobrazeny v tabulce č. 3 (zobrazeno v dodatku A). V případě afinitní maturace Y61 bylo vybráno pro
184 • ·· • ·9
9 * ·* · • · ··
999 ··
9 9 9
9 9 mutagenezi PCR 15 zbytků vně CDR3, tři zbytky ve smyčce L3 a 5 zbytků ve smyčce H3.
Gen Y61 scFv byl klonován za účelem mutageneze do plazmidového vektoru pUC119(Sfi). Oligonukleotidy byly navrženy a syntetizovány s náhodnými kodony, aby se mutovala každá vybraná poloha. Po PCR mutagenezi byl sekvenován malý počet klonů (přibližně 24) a exprimoval se v hostitelské buňce, například v bakteriální, kvasinkové nebo savčí hostitelské buňce. Čistila se exprimovaná protilátka a kOff se měřila použitím systému BIAcore. Tento postup se opakoval v případě jiných poloh CDR. Jednotlivé mutace, které mají zlepšenou neutralizační aktivitu byly kombinovány za vzniku protilátky s ještě větší neutralizační silou.
Polohy CDR protilátky Y61, které byly mutovány za účelem zlepšit neutralizační sílu a aminokyselinové substituce v každé poloze jsou zobrazeny na obrázcích 2A až 2H. Hodnoty konstanty rychlosti disociace jsou dány, jak se stanovilo analýzou BIAcore. Tyto hodnoty konstanty rychlosti disociace jsou také zobrazeny v histogramech na pravé straně každé tabulky.
Výsledky těchto substitucí v polohách H30, H32, H33, H50, H53, H54, H58, H95, H97, H101, L50, L92, L93 demonstrovaly, že všechny zkoumané substituce aminokyselin vedly k protilátkám s menšími hodnotami konstanty rychlosti disociace než jsou hodnoty protilátky Y61. V polohách H52, L32 a L50 byla zjištěna pouze jedna substituce aminokyseliny, aby se zlepšila hodnota konstanty rychlosti disociace protilátky Y61, všechny jiné změny nepříznivě ovlivňovaly aktivitu. V případě L50 jediná změna Gly -> Tyr podstatně (5 až lOkrát) zlepšila neutralizační sílu protilátky Y61. Výsledky demonstrovaly důležitost těchto poloh vzhledem aktivity protilátky Y61 a naznačují, že ve většině případů fágového zobrazení bylo možné vybrat optimální zbytky. Bylo zjištěno, že několik substitucí v polohách H31, H56, L30 a L94 zlepšilo hodnotu konstanty
185 rychlosti disociace protilátky Y61, což naznačuje, že tyto polohy byly také důležité pro navázání antigenu, ačkoli přístup Zpbrazení fága neumožňoval selekci optimálních zbytků.
Selektivní mutace kontaktních a hypermutačních poloh protilátky Y61 identifikoval aminokyselinový zbytek L50 v CDR2 lehkého řetězce a zbytek L94 CDR3 lehkého řetězce, ktere zlepšily neutralizační schopnost protilátky Y61.
Kombinace těchto mutací produkovala aditivní účinek generuj ící protilátku J695, která vykazovala podstatné zvýšení neutralizační schopnosti. Sekvence plné délky variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce protilátky Y61 je zobrazena dále v textu.
Peptidová sekvence variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky J695
CDRHI
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFS SYGMH WVRQAPGKGLEWVA
CDR H2
FIRYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCKT
CDR H3
HGSHDN WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 31)
Peptidová sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce protilátky J695
CDR LI
QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISC SGSRSNIGSNTVK WYQQLPGTAPKLLIY
CDR L2
YNDQRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYC
CDR L3
QSYDRYTHPALL FGTGTKVTVLG (SEQ ID NO: 32) ·· φφ φ · · · φ · · φ···ο·φ· ·· φ ·· ·*· ·· ····
Zbytky CDR jsou označeny podle definic Kabata.
Shrnutí uspořádání sekvence variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce zobrazující postup vývoje klonů, které byly na dráze vývoje z protilátky Joe9 na protilátku J695 je zobrazeno na obrázcích IA až ID. Číslování CDR a zbytků je podle Kabata.
Příklad 3: Funkční aktivita protilátek proti hIL-12
Aby se testovala funkční aktivita lidských protilátek proti lidskému IL-12 podle vynálezu, protilátky byly používány v několika testech, které měří schopnost protilátky inhibovat aktivitu IL-12.
A. Příprava lidských lymfoblastů aktivovaných PHA
Lidské jednojaderné buňky periferní krve ' (OBMC) byly izolovány z leukopaku získaného ze zdravého dárce centrifugaci s gradientem směsi fikol-Hypaque po dobu 45 minut při rychlosti 1 500 ot./min., jak se popisuje v publikaci Current Protocols in Immunology, Unit 7.1 PBMC. PBMC na rozhraní vodného roztoku krve a média pro. separaci lymfocytů byly sebrány a za účelem odstranění částic směsi fikol-Paque se třikrát promyly fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem (PBS) a centrifugovaly po dobu 15 minut při 1 500 ot./min.
PBMC byly pak aktivovány za vzniku lymfoblastů, jak se popisuje v publikaci Current Protocols in Immunology, Unit 6.16. Promyté PBMC byly resuspendovány v úplném médiu RPMI v koncentraci 0,5 až 1 x 106 buněk/ml (médium RPMI 1640, 10% fetální bovinní sérum (FBS), 100 U/ml penicilinu, 100 gg/ml streptomycinu), doplněného 0,2 % (objem/objem) PHA-P (Difco, Detroit, MI) a kultivovaly se po dobu 4 dní při teplotě 37 °C v atmosféře 5% CO2. Po čtyřech dnech byly buněčné kultury rozděleny v poměru 1:1 do objemu úplného média RPMI plus 0,2% (objem/objem) PHA-P a 50 U/ml rekombinantního lidského IL-2.
• ·· ·
I
187
Rekombinantni lidský IL-2 byl produkován transfekci expresívního vektoru, který nese cDNA lidského IL-2 do buněk
COS (popisuje se v publikaci Kaufman et al., (1991) Nucleic
Acids Res. 19, 4484-4490) a čistil se, jak se popisuje v dokumentu PCT/US96/01382. Buněčné kultury byly pak inkubovány po další jeden až tři dny. Sklidily se blastové buňky, dvakrát se promyly úplným médiem RPMI a zamrazily se v % FBS, 5 % DMSO v koncentraci lOxlO6 buněk/ml.
Za účelem použití v testu navázání IL-12 na svůj receptor (popisuje se v sekci Β) PHA blastové buňky se sesbíraly po jednodenní kultivaci v přítomnosti IL-2, zatímco PHA blastové buňky, které budou používané v PHA blastovém proliferačním testu (popisuje se v sekci C) a testu indukce interferonu gamma (popisuje ·se v sekci D) byly sesbírány po třídenní kultivaci v přítomnosti IL-2.
B. Test navázání IL-12 na svůj receptor
Analyzovala se schopnost protilátek proti IL-12 inhibovat navázání radioaktivně značeného IL-12 na receptory IL-12 na PHA blastech následujícím způsobem. Různé koncentrace protilátky proti IL-12 byly předem inkubovány po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C s 50 až 100 pM 125I-hIL-12 (hIL-12 značený jódem byl připraven použitím značící metody BoltonHunter se se^acifickou aktivitou 20 až 40 mCi/mg, od firmy NENDupont) ve vazebném pufru (RPMI 1640, 5% FBS, 25 mM Hepes pH7,4). PHA blastové buňky izolované jak se popisuje shora v textu, byly jednou promyty a resuspendovány ve vazebném pufru s hustotou buněk 2xl07 buněk/ml. PHA blasty (v množství lxlO6 buněk) byly přidány k protilátkové směsi 125I-hIL-12 a inkubovaly se po dobu dvou hodin při teplotě místnosti. Buněčná vazebná radioaktivita se oddělila od volného 125I-hIL12 centrifugaci testované směsi po dobu 30 vteřin při teplotě místnosti, roztok se odsál a zbytek se promyl 0,1 ml vazebného pufru, pak následuje centrifugace při teplotě 4 °C po dobu 4 · ·· · · · « «φ ·« • · · · · · · · · «
188 • f · · · · · · ·· * t- · ·»· »» 0··<
minuty při 10 000 x g. V buněčném peletu se testovala buněčná vazebná radioaktivita použitím počítače gamma. Celkové navázání bylo stanoveno v nepřítomnosti protilátky a nespecifické navázání bylo stanoveno inkluzi 25 nM neznačeného IL-12 v testu. Inkubace byla provedena ve dvojím provedení.
V testu navázání IL-12 na svůj receptor se použily lidské protilátky proti IL-12 Y61 a J695, přičemž obě protilátky demonstrovaly srovnatelnou inhibici navázání IL-12 na receptor. Protilátka Y61 inhibovala navázání IL-12 na receptor s hodnotou ICSo přibližně 1,6 x 10-11 M, zatímco protilátka J695 měla hodnotu IC50 přibližně 1,1 x 1011 M.
C. Test proliferace lidských PHA blastů
U protilátek proti IL-12 byla hodnocena jejich schopnost inhibovat proliferaci PHA blastů (přičemž proliferace je stimulována IL-12) . Sériové ředění protilátky proti IL-12 byla předem inkubovány po dobu jedné hodiny při teplotě 37°C, v atmosféře 5% CO2 s 230 pg/ml hIL-12 ve 100 ml úplného média RPMI na mikrotitrační destičce (dno ve tvaru U, 96 prohlubní, Costar, Cambridge, MA) . PHA blastové buňky izolované jak se popisuje shora v textu byly jednou promyty a resuspendovaly v úplném médiu RPMI s hustotou buněk 3xl05 buněk/ml. PHA blasty (objem lOOml, množství 3 x 104 buněk) byly přidány do směsi protilátka/hIL-12, vše se inkubovalo po dobu tří dní při teplotě 37 °C v 5 % atmosféře CO2 a značilo se po dobu 4 až 6 hodin s 0,5 mCi/jamku (3H)-tymidinu (Amersham, Arlington Heights, IL). Obsahy kultur byly zachyceny na filtrech ze skleněných vláken podle způsobu pomoci zařízení pro sesbírání buněk (Tomtec, Orange, CT) a začlenění (3H)-tymidinu do buněčné DNA bylo měřeno počítačem v scintilačním roztoku. Všechny vzorky se testovaly dvojmo.
Výsledky neutralizace v přítomnosti různých koncentrací p70:p40) to je poměr heterodimeru IL-12 k volné podjednotce p40) jsou zobrazeny v tabulce 4 (popisuje se v dodatku A).
189
Analýza lidské protilátky proti IL-12 v testu proliferace PHA blastů demonstrovala, že protilátka inhibovala proliferaci PHA blastů s hodnotou IC5o přibližně 1,8 x ΙΟ10 M v přítomnosti samotné podjednotky p70 IL-12 bez nadbytku podjednotky p40 (poměr p70:p40 je 1:0). V přítomnosti 50-ti násobného nadbytku volné podjednotky p40 (poměr p70:p40 je 1 : 50) protilátka Y61 inhibovala proliferaci PHA blastů s hodnotou IC50 přibližně 1,8 x ΙΟ10 M. Tento výsledek demonstruje, že schopnost protilátky Y61 inhibovat proliferaci blastů není oslabena přítomností nadbytku podjednotky p40.
Lidská protilátka proti IL-12 J695 inhibovala proliferaci PHA blastů s hodnotou IC5o přibližně 1,0 x 10-11 M v přítomnosti podjednotky p70 a p40 v poměru 1:0. V přítomnosti podjednotek p70 a p40· v poměru 1:50 tato protilátka inhibuje proliferaci PHA blastů s hodnotou IC50 přibližně 5,8 ± 2,8 x ΙΟ12 M (n=2), což demonstruje, že nadbytek podjednotky p40 měl na protilátku pouze slabý inhibiční účinek. Celkově výsledky demonstrují zlepšenou neutralizační aktivitu protilátky J695 ve srovnání s protilátkou Y61, což způsobily mutace v L50 a L94.
D. Test indukce interferonu gamma
Schopnost protilátek proti IL-12 inhibovat produkci IFNy PHA blasty (jejichž produkce je stimulována IL-12) byla analyzována následujícím způsobem. Různé koncentrace protilátky proti IL-12 byly předem inkubovány po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C, v atmosféře 5 % CO2 s 200 až 400 pg/ml hIL-12 ve 100 ml úplného média RPMI v mikrotitračni destičce (dno ve tvaru U, 96 prohlubní, Costar). PHA blastové buňky izolované, jak se popisuje shora v textu, byly jednou promyty a resuspendovaly se v úplném médiu RPMI s buněčnou hustotou 1 x 107 buněk/ml. PHA blasty (objem 100 μΐ, množství 1 x 106 buněk) byly přidány do směsi protilátka/hIL-12 a inkubovaly se po dobu 18 hodin při teplotě místnosti a v atmosféře 5 % CO2. Po inkubaci se z každé jamky odebralo 150
190
• 9 * · · · * • • * 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9
9 • 9 • 4 • 4 9 • · 9
• * • 4 9 • 9 9 9
•9 « • · 4*9 9 · 9 9 9
μΐ supernatantů bez buněk a testem ELISA bylo měřeno množství lidského produkovaného IFNy (test ELISA pro stanoveni endogenního interferonu gama, Endogen, Cambridge, MA) . Každý supernatant se testoval ve dvou provedeních.
Analýza lidské protilátky proti hIL-12 Y61 v tomto testu demonstrovala, že protilátka Y61 inhibovala produkci lidského IFNy s hodnotou IC5o přibližně 1,6 χ ΙΟ“10 M, zatímco lidská protilátka proti IL-12 J695 inhibovala produkci lidského IFNy s hodnotou IC50 přibližně 5,0 ± 2,3 χ 10'12 M (n = 3) . Výsledek demonstruje podstatné zlepšení afinity protilátky J695 jako výsledek modifikací v L50 a L94.
E. Indukce IL-12, který není lidský, z izolovaných PBMC
Aby se testovala zkřížená reaktivita lidských protilátek proti hIL-12 s IL-12 z jiných druhů, IL-12, který nepochází z člověka, byl produkován následujícím postupem. PBMC byly separovány z čerstvé krve ošetřené heparinem centrifugací s hustotním gradientem, jak se popisuje shora v textu za použití sady Lymphoprep (Nycomed, . Oslo, Norsko) v případě PBMC opice cynomolgus, paviána a psa, v případě PBMC psa se použije sada Accu-paque (Accurate Chemical and Sci. Corp., Westbury, NY) nebo v případě krysích PBMC se použije sada Lympholyte-rat (Accurate Chemical and Sci. Corp., Westbury, NY).
PBMC byly pak indukovány za vniku IL-12, jak se popisuje v publikaci D'Andrea et al., (1992) J. Exp. Med. 176, 13871398, Villinger et al., (1995) J. Immuol. 155, 3946-3954,
Buettner et al., (1998) Cytokine 10, 241-248). Promyté PBMC byly resuspendovány v koncentraci 1 χ 106 buněk/ml úplného média RPMI doplněném 0,0075 % (hmotn./objem) SAC (Pansorbin, Calbiochem-Behring Co., La Jolla, CA) nebo 1 až 5 mg/ml ConA. (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) plus 0, 0075 % SAC a inkubovalo se po dobu 18 hodin při teplotě 37 °C v atmosféře 5% CO2. Médium bez buněk a SAC se shromáždilo centrifugací a filtrací přes filtr s póry 0,2 nm.
191 «* Φ Φ· Φ « Φ φ φφ ·« • · · ΦΦΦΦ « · ·»
Φ Φ φ · · · ΦΦφ ··· φ·φ ΦΦΦΦφ ··· ΦΦΦ φφφ • · · ·· · Φ · Φ· ΦΦΦ»
IL-12 z opice makak byl získán jako rekombinantní IL-12 makaka z instituce Emory University School of Medicine,
Atlanta, GA.
F. Proliferační test s myšími buňkami 2D6
Klon 2D6 myších T buněk proliferuje jako odezva na myší IL-2, IL-4, IL-7 a IL-12 (Maruo et al., (1997) J. Leukocyte
Biol. 61, 346-352). Podstatná proliferace byla také detekována jako odezva na supernatanty s krysími PBMC, které obsahují krysí IL-12. Buňky nevykazují odezvu na IL-12 pocházejícího ze psa, opice cynomolgus, paviána a člověka. Myší buňky 2D6 byly propagovány v úplném médiu RPMI doplněném 50 mM betamerkaptoetanolu (βΜΕ) a 30 ng/ml myšího IL-12. Jeden den před testem byl myši IL-12 vymyt a buňky se inkubovaly přes noc v úplném médiu RPMI plus βΜΕ.
Sériová ředění protilátky proti IL-12 byla předem inkubována po dobu 1 h při teplotě 37 °C v atmosféře 5 % CO2 se 40 pg/ml myšího IL-12 ve 100 ml RPMI úplného média plus βΜΕ v mikrotitrační destičce (dno ve tvaru U, 96 jamek’, Costar) . Buňky 2D6 byly jednou promyty a resuspendovaly se v úplném médiu RPMI obsahujícím βΜΕ s hustotou buněk 1 x 105 buněk/ml. Buňky 2D6 (objem 100 μΐ, množství 1 x 104 buněk) byly přidány do směsi protilátka/hIL-12, inkubovaly se po dobu 3 dní při teplotě 37 °C v atmosféře 5 % CO2 a značily se dobu 4 až 6 hodin s 0,5 mCi na jamku pomocí (3H)-tymidin. Obsahy kultury byly sklizeny a intenzita radiace se stanovila počítačem v scintilačním roztoku. Všechny vzorky se testovaly dvojmo.
G. Zkřížená reaktivita protilátky J695 s IL-12, který
nepochází z člověka, mezi druhy
Zkřížená reaktivita protilátky J695 s IL-12, který
nepochází z člověka, mezi druhy byla analyzována použitím PBMC izolovaných z několika druhů, mezi kterými není člověk. Přítomnost aktivity IL-12, který nepochází z člověka, v PBMC ··«··· 9 9 β ·» • β · 9 9 9 9 9*9* • 99 999 99 » supernatantech z krysy, psa, opice cynomolgus a paviána, byla potvrzena použitím několika biotestů popsaných shora v textu, jako je proliferační test myších 2D6, proliferační test lidských PHA blastů a test indukce interferonu-gama blokováním odezev indukovaných nelidskými PBMC králičími a/nebo ovčími polyklonálními protilátkami s myším a/nebo lidským IL-12. Zkřížená reaktivita lidských protilátek proti hIL-12 Y61 a J695 s nelidským IL-12 v PBMC supernatantech nebo s čištěným IL-12 myši a makaka byl pak odhadnuta v některém biotestů(ech) stanovením koncentrace protilátky J695, při které byla pozorována 50% inhibice odezvy. Výsledky zkřížené reaktivity mezi druhy jsou shrnuty do tabulky č. 5. Výsledky demonstrují, že každá protilátka Y61 a J695 je schopná rozeznávat IL-12 z opic (například IL-12 cynomolga a makaka v případě protilátky Y61 a cynomolga, makaka a paviána v případě protilátky J695) a že protilátka J695 je přibližně 35krát méně aktivní v případě psího IL-12. Ani protilátka Y61 ani J695 nereagují zkříženě s myším nebo krysím IL-12.
H. Specifita protilátky J695 vůči lidskému cytokinů
Specifita protilátky J695 byla kompetitivním testu ELISA, ve kterém se u souboru lidských testovala jejich schopnost interferovat s navázáním cytokinů rozpustné
J695 na
J695 testována imobilizovaný lidský IL-12. Soubor lidských cytokinů zahrnoval
IL-Ια a IL-Ιβ (Genzyme,
Boston, MA) , IL-2 (Endogen),
IL-10, IL-17, IFN-gama a TGF-βΙ (R&D,
Minneapolis,
MN)
IL-8 (Calbiochem), PDGF,
IGF-1
IGF-II (Boehringer
Mannheim Corp., Indianapolis,
IN) ,
TNFa a lymfotoxin,
IL-12p40, M-CSF a protein příbuzný LIF, EBI-3 a který je indukován infekcí virem Epstein-Barrové v B
IL-6, rozpustný receptor IL-6,
IL-11,
IL-12p70,
IL-12p40, lymfocytech (popisuje se v publikaci Devergne et al., (1996)
J. Virol. 70, 1143-1153), byl exprimován jako chiméra lidského
193
IgG Fc (EBI 3/Fc). Byla také testována jednořetězcová DNA (Sigma) lososího spermatu.
♦ · ·♦· ·
Tabulka č. 5: Data zkřížené reaktivity mezi druhy
1 (W)05OI lidský IL- 1 čištěný O «— X o UD O r-4 X r- r-4 O i—1 X o LÍD
IL-12 paviána ÍX 3 CO O s fQ tú O <—1 X o CN O r-4 X LÍD r—l
IL-12 makaka '>1 C >0) 4-> ><0 •H >U o •H O r—1 X o r4 O r4 X o r-4 O r-4 X O r—l
kyno IL-12 d w u s PQ CU 3 M O i—l X CN i—{ 3 4 O r4 X CN CN O r4 X o r4
psí IL-12 d <n U S CQ 0« 3 O r-4 X UD OD
krysí IL-12 i <0 O s PQ PU o H O <—1 X o kD neneutralizují cl
myší IL-12 '>1 C >d) 4J M Ή >u O r4 X O n o O r-4 X uD r4 neneutralizují ci neneutralizují cí
protilátka specifita CN r-4 M Í 1 Ή <n -X králičíctmuIL12 CM rH ř-q H 3 Λ d I 'Η >C0 >1 £ CN r-4 i-q H 3 Λ d 1 Αν) TJ •H <—1 CN t—l H 3 Λ d t '>1 A4 10 Ό Ή r—l
> 0) N OJ c iD «-4 OD O PQ OD O CN kD CO O t—1 kD >4 ID σι kD
• 99· ·* · ·· 99 • · «·· · · « « • 9 9 9 9 9 4
195
Mikrotitrační destičky pro imunologický test ELISA s plochým dnem (96 prohlubní, pro vysoké navázání, Costar) byly potaženy přes noc při teplotě 4 °C s 0,1 ml lidského IL12 (2 μ9/ιη1) v 0,1 M uhličitanovém potahovacím pufru (4 objemy 0,1 M NaHCO3 plus 8,5 objemů 0,1 M NaHC03) ) . Destičky byly promývány dvakrát PBS, který obsahuje 0,05 % Tween 20 (PBS-T), blokovány 200 μΐ bovinního sérového albuminu o koncentraci 1 mg/ml (BSA, Sigma) v PBS-T po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti a opět se promyly dvakrát PBS-T. Byly přidány vzorky (objem 100 μΐ) obsahující protilátky proti IL-12 J695 (100 ng/ml) a každý cytokin (v koncentraci 2 nM) v PBS-T obsahující 50 μg/ml BSA (PBS-T/BSA) a inkubovaly se po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Plotny byly promyty čtyřikrát a inkubovaly se po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti se 100 μΐ myšího anti-lidského lambda-HRP (1:500 v PBS-T/BSA, Southern Biotech. Ass. Inc., Birmingham, AL). Destičky byly promyty čtyřikrát a vyvíjely se pomocí ABTS (Kirkegaard & Perry Lab., Gaithersburg, MD) po dobu 20 až 30 minut ve tmě. Hodnoty OD při vlnové délce 450 nm byly odečítány použitím čtecího zařízení (Molecular Devices, Menlo Park, CA). Procento navázání bylo stanoveno ve vztahu k navázání protilátky J695 na destičku potaženou IL-12 v nepřítomnosti libovolného rozpustného cytokinů.
Výsledky demonstrovaly, že navázání protilátky J695 na imobilizovaný lidský IL-12 bylo blokováno pouze lidským IL12p70 a v menším rozsahu lidským IL-12p40 a nikoliv libovolnými jinými testovanými cytokiny.
I. Navázání na novou molekulu IL-12
Byl popsán alternativní heterodimer IL-12, ve kterém podjednotka p35 je nahrazena novou molekulou pl9. Molekula pl9 byla identifikována použitím vyhledávání homologie 3D
196 v případě členů rodiny IL-6/IL-12 a je syntetizována aktivovanými dendritickými buňkami. Molekula pl9 se váže na podjednotku p4C za vzniku diméru pl9/p40, který měl aktivitu podobnou IL-12, ale při indukci IFNy není tak silný jako heterodimér p35/p40. Předpokládá se, že protilátky, které rozeznávají samotnou podjednotku p40, ale přednostně v souvislosti s molekulou p70 (například protilátka J695 a Y61, popisuje se v příkladu 3H) také neutralizují obě molekuly p35/p40 a molekuly pl9/p40.
Příklad 4: Aktivita protilátek proti hIL-12 in vivo
Účinky in vivo protilátek proti IL-12 na odezvy vyvolané IL-12 byly testovány v modelu, kterým je upravený model použitý ke studiu účinku lidského IL-12 na periferní hematologii u opice cynomolgus (popisuje se v publikaci Bree et al., (1994) Biochem. Biophys. Res. Comm. 204: 1150-1157. V těchto předchozích studiích aplikace lidského IL-12 v koncentraci 1 μg/kg/den po dobu pěti dní vedla ke snížení počtu bílých krvinek (WBC) , Po 24 hodinách zvláště v podsouborech lymfocytů a monocytů. Snížení počtu červených krvinek bylo pozorováno po 72 hodinách. Množství plazmového neopterinu, což je markér pro aktivaci monocytů při odezvě na IFN-γ, začíná růst po 24 hodinách a nejvyši bylo po 72 hodinách.
V první studii s lidskými protilátkami proti hIL-12, bylo sedativy zklidněno 15 zdravých opic cynomolgus s průměrnou tělesnou hmotností 5 kg a rozdělilo se do 5 skupin (n = 3) . Skupině 1 se provedla intravenózně aplikace (IV) 10 mg/kg lidského intravenózního imunoglobulinu (IVIG, Miles, Eckhart, IN, čištěný použitím sefarózy s proteinem A) . Skupině 2 se provedla intravenózní aplikace 1 mg/kg protilátky 08.6.2 (neutralizační myší monoklonální protilátka proti lidskému IL12) . Skupině 3 se provedla intravenózní aplikace 10 mg/kg protilátky C8.6.2. Skupině 4 se provedla intravenózní aplikace
197 ti ti tititi · • ti ti • ti · • ti ti • ti ti • ti ti ti tititi tititi tititi • ti *·· • ti ti • ti ti • ti • ti ti ti· titi
1 mg/kg protilátky Y61 (lidské protilátky proti IL-12,
izolovala se z upraveného média vhodného pro buňky CHO) .
Skupině 5 se aplikovalo intravenózně 10 mg/kg protilátky Y61.
Jednu hodinu po aplikaci protilátky všechna zvířata obdržela jedinou podkožní injekci (SC) lidského IL-12 (1 Hg/kg). Krevní vzorky byly odebrány v následujících časech: základní čas, 8, 24, 48, 96 a 216 hodin a analyzoval se celkový počet krevních buněk pomocí rozdílů a chemickou analýzou séra. Byl také měřen sérový lidský IL-12, protilátka C8,6.2, protilátka Y61, opičí IFN-gama, opičí IL-10, opičí IL6 a množství neopterinu v plazmě.
Zvířata ošetřená IL-12 plus kontrolní protilátkou IVIG (skupina 1) vykazovala řadu očekávaných hematologických změn, které zahrnují snížení WBC, červených krvinek, počtu lymfocytů a monocytů. Tato snížení nebylo možné vidět nebo bylo méně výrazné u zvířat ošetřených buď protilátkou C8.6.2 nebo Y61 při koncentraci 1 nebo 10 mg/kg (skupina 2 až 5) .
Vzorky séra a plazmy byly analyzovány testem ELISA specifickým pro opičí IFN-gama a opičí IL-10 (Biosource International,· Camarillo, CA) , opičí IL-6 (Endogen) a plazmový neopterin (ICN Pharmaceuticals, Orangeburg, NY). IFN-gama, IL10 nebo IL-6 nebyly detekovány u žádného ze zvířat ošetřených IL-12, která zahrnují kontrolní zvířata ošetřená IL-12 plus IVIG. To bylo pravděpodobně způsobeno nízkým stupněm expozice IL-12 (pouze jedna dávka v koncentraci 1 μg/kg). Přesto množství neopterinu v plazmě se zvýšilo u zvířat ošetřených IL-12 plus IVIG přibližně třikrát, ale neměnilo se u zvířat ošetřených protilátkou C8.6.2 nebo Y61, které zahrnují zvířata ošetřená nižší dávkou protilátky Y61 (1 mg/kg), což indikuje, že protilátka Y61 byla účinná in vivo při blokování této citlivé odezvy na IL-12.
Při druhé studii byly studovány aktivity in vivo a farmakodynamiky (PD) protilátky J695 u opic cynomolgus aplikací exogenního rhIL-12 a stanovilo se, zda protilátka
198 ·· ··«· ·* · ,, ,, • · · · · · ····· • · · · · · · ·' ··· * ♦ ♦ · · · ·· ♦·· · · · · ·φ ·· · φ· ··· ·Φ ··«·
J695 by mohla blokovat nebo redukovat odezvu, která je v normálním případě spojena s aplikací rhIL-12. Samcům opic cynomolgus (3 ve skupině) byla aplikována jediná dávka protilátky J695 v koncentraci 0,05, 0,3 nebo 1,0 mg/kg nebo 1 mg/kg intravenózního imunoglobulinu (IVIG) jako bolusová intravenózní (IV) injekce do safenozní žíly nebo podkožně (SC) do kůže na zádech. Jednu hodinu po aplikaci protilátky J695 nebo IVIG, obdržela všechna zvířata jedinou dávku 1/mg/kg rhIL-12 (SC) aplikovanou do kůže na zádech. Vzorky krve se odebraly z femorální žíly až 29 dní po aplikaci protilátky J695. Z každého vzorku krve se získalo sérum a testem ELISA se testovala přítomnost IL-12, J695, IFN-γ a protilátky proti
J695. Neopterih se testoval pomocí HPLC s reverzní fází.
Množství neopterinu normalizované s ohledem na množství neopterinu, které se naměřilo před aplikací protilátky J695 nebo rhIL-12, je uvedeno na obrázku č. 3. Aby se porovnalo snížení množství neopterinu mezi skupinami, byla vypočítána v případě každého zvířete oblast pod křivkou (AUG) normalizována pro množství neopterinu (tabulka č. 6) . Vystaveni neopterinu (AUC) bylo potlačeno způsobem závislým na dávce mezi přibližně 71 a 93 % ve skupinách IV a mezi 71 a 100 % ve skupinách SC, vztaženo ke kontrolní skupině IVIG. Tyto výsledky naznačují, že dávka protilátky J695 nezbytná pro 50 % inhibici neopterinové odezvy (ED50) byla nižší než 0,05 mg/kg, když se aplikovala buď IV nebo SC cestou.
Tabulka č. 6: Na dávce závislé potlačení neopterinu indukovatelného IL-12 protilátkou J695 u opic cynomolgus.
Způsob dávkování dávka J695 dávka IVIG AUC % snížení AUC
IVIG nebo J695 a (mg/kg) (mg/kg) normáli zovaného neopterinu ve
rhIL-12 množství srovnání
neopterinu s kontrolou
199
jediná IV injekce následována o jednu hodinu později dávkou 1 gg/kg lidského IL-12 podaného SC - 1,0 1 745 ± 845 0
0,05 - 502 ± 135 71,3
0,2 - 199 ± 316 92,7
1,0 - 1 480 ± 604 0
jediná injekce SC následována o hodinu pozděj i dávkou 1 μς/kg lidského IL-12 podaného SC - 1,0 1 480 ± 604 0
0,05 - 426 ± 108 71,2
0,2 - 395 ± 45,9 73, 3
1,0 - 0 ± 109 100
Léčba protilátkou J695 také zabránila změnám nebo redukovala změny v hematologii, které jsou normálně spojeny s aplikací rhIL-12 (leukopenie a trombocytopenie). 24 hodin po aplikaci rhIL-12 byly sníženy počty lymfocytů o přibližně 50 % v porovnání se základními hodnotami v kontrolních skupinách ošetřených IV a SC IVIG. Aplikace protilátky J695 buď cestou SC nebo IV v celkovém množství tří dávek předešla této redukci s tím výsledkem, že počty lymfocytů po 24 hodinách přibližně odpovídají základním hodnotám. 48 hodin po aplikaci IL-12 počty červených krvinek ve skupinách ošetřených IV a SV IVIG byly sníženy o přibližně 25 % ve srovnání se základními hodnotami.
Příkladem dávkového rozvrhu cíleného k udržení sérového množství nad 90 % účinného množství by mělo být 1 mg/kg IV a SC dáno přibližně ob týden nebo 0,3 mg/kg podáno přibližně každý týden, přičemž se předpokládá, že během opakovaných dávek dochází k slabé akumulaci. Tato studie ukazuje, že aplikace protilátky opicím v takové dávce je bezpečná. V nezávislé studii toxicity bylo dále zjištěno, že pro opice může být bezpečná až dávka protilátky 100 mg/kg.
Protilátka J695 byla také účinná při prevenci produkce IFN-gama u myší ošetřených chimérickým IL-12, molekulou, která kombinuje myší podjednotku p35 s lidskou podjednotkou p40 IL·· ··· ·
·♦ ·· • · · · • · · • · ·
9 9 ·· 9999
200
12. Na rozdíl od lidského IL-12, který není u myší biologicky aktivní, tento chimérický IL-12 si zachovává u myší biologickou funkci, což zahrnuje indukci IFN-gama. Navíc lidská podjednotka p40 umožňuje molekule, aby byla vázána a neutralizována protilátkou J695. Samicím myší C3H/HeJ (10 myší v experimentální skupině) byl aplikován chimérický IL-12 v pěti denních dávkách i.p. v den 0, 1, 2, 3 a 4, přičemž dávka obsahuje 0,05 mg/kg. 30 minut před aplikací injekcí IL12 byla aplikována v den 0, 2 a 4 protilátka J695 v dávce 0, 05, 0, 01, 0, 002, 0, 0004, 0, 00008 a 0, 000016 mg/kg i.p.. Kontrolní hulgGly byl aplikován IP v dávce 0,05 mg/kg v den 0, 2 a 4. Myším se odebraly krevní vzorky v den 5 a testem ELISA bylo stanoveno množství IFN-gama v séru. Výsledky demonstrovaly, že protilátka J695 způsobila inhibici produkce IFN-gama závislé na dávce s hodnotou ED50 přibližně 0,001 mg/kg. Tyto výsledky dohromady demonstrují, že protilátka J695 je potencionální inhibitor aktivity IL-12 in vivo.
Příklad 5: Kinetická analýza navázání lidských protilátek na rekombinantní lidský IL-12 (rh'IL-12)
Vazebné interakce v reálném čase mezi značeným ligandem (lidská protilátka J695 proti rhIL-12, zachycená na biosenzorové matrici) a analytem (rhIL-12 v roztoku) byly měřeny povrchovou plazmonovou rezonancí (SPR) použitím systému BIAcore (Biacore AB, Uppsala, Švédsko). Systém využívá optických vlastností SPR k detekci změn v koncentraci proteinu na dextranové biosenzorové matrici. Proteiny jsou kovalentně vázány na dextranovou matrici ve známých koncentracích. Protilátky jsou zavedeny injekcí přes dextranovou matrici a specifické navázání injekcí zavedených protilátek a imobilizovaného ligandů vede ke zvýšení koncentrace proteinu a k výsledné změně v signálu SPR. Tyto změny v signálu SPR jsou zaznamenávány jako jednotky rezonance (RU) a jsou vyjádřeny s ohledem na čas vynesený na osu Y sensogramu.
• · φφφφ • φ
201
Aby se umožnila imobilizace kozího anti-lidského IgG /Southern Biotechnology Associates, kat. č. 2040-01, Birmingham, AL) na biosenzorové matrici, kozí anti-lidské IgG jsou kovalentně spojeny přes volné aminoskupiny s dextranovou matricí pomocí prvních aktivačních karboxylových skupin na matrici se 100 mM N-hydroxysukcinimidu (NHS) a 400 mM N-etyl-N'-(3dimetylaminopropyl)-karbodiimidhydrochloridu (EDC). Jako další se přes aktivovanou matrici injekcí zavede kozí anti-lidský IgG. Přes aktivovaný biosenzor je injekcí zavedeno 35 mikrolitrů kozího anti-lidského IgG (25 μς/πιΐ) ředěného v acetátu sodném pH 4,5 a volné aminy proteinu jsou vázány přímo na aktivované karboxylové skupiny. Nezreagované estery vázané na matrici EDC jsou deaktivovány injekcí 1M ethanolaminu. Standardní kity spojování aminů byly běžně dostupné (Biacore AB, kat. č. BR-1000-50, Uppsala, Švédsko).
Protilátka J695 byla ředěna v pufru HBS (Biacore AB, kat. č. BR-1001-88, Uppsla, Švédsko), aby byla zachycena na matrici přes kozí proti-lidský IgG. Aby se stanovila kapacita protilátek specifických pro rhIL-12 vázat se na imobilizovaný kozí anti-lidský IgG, provedl se vazebný test následujícím způsobem. Alikvoty protilátky J695 (25 μg/ml), alikvoty o objemu 25 mikrolitrů) byly zavedeny injekcí přes dextranovou matrici spojenou s kozími polyklonálními protilátkami proti lidskému IgG s průtokovou rychlostí 5 mikrolitrů za minutu. Před injekcí proteinu a bezprostředně po ní protekl samotný pufr HBS každou volnou buňkou. Množství vázané komplexu IgGl J695 reprezentuje čistý rozdíl signálu mezi základní hodnotou a hodnotou v bodě odpovídajícímu přibližně 30 vteřinám po dokončení zavedení protilátky J695 injekcí (přibližně 1200 RU) . Měřilo se přímé navázání protilátky specifické pro rhIL12 na rozpustný rhIL12. Cytokiny byly ředěny v pufru používaném pro provedení HBS a alikvoty o objemu 50 μΐ byly injekcí zavedeny přes matrice s imobilizovaným proteinem s průtokovou rychlostí 5 mikrolitrů za minutu. Používané koncentrace rhIL·· »···
202 byly 10, 20, 25, 30, 40, 50, 80, 100, 150 a 200 nM. Před injekci rhIL-2 a bezprostředně po ní, samotný pufr HBS protekl každou volnou buňkou. Aby se reprezentovala vazebná hodnota určitého vzorku, byl stanoven čistý rozdíl základního signálu a signálu po zavedení cytokinú injekcí. Před aplikací dalšího vzorku injekcí byly biosenzorové matrice regenerovány použitím 100 mM HC1. Aby se stanovila konstanta rychlosti disociace a konstanta rychlosti asociace byl použit software pro hodnoceni kinetiky BIAcore (verze 2.1).
Reprezentativní výsledky navázání protilátky získané z CHO na rhIL-12 ve srovnání s protilátkou J695 získanou z buněk COS jsou uvedeny v tabulce č. 7.
Tabulka č. 7: Navázání protilátky J695 získané z buněk CHO a
COS na rhIL-12
zdroj rhIL12, nM rhIL12 vázanýRU'S Ab vázaný RU*s rhlL12/AB
CHO 200 1112 1613 1.48
CHO 150 1033 1525 1.45
CHO 100 994 1490 1.43
CHO 80 955 1457 1.40
CHO 50 912 1434 1.36
CHO 40 877 1413 1.33
CHO 25 818 1398 1.25
CHO 20 773 1382 1.20
CHO 10 627 1371 0.98
zdroj rhILI2. nM rhlL12vázaný RU's Ab,vázaný RU's rhIL12<'AB
COS 200 1172 1690 1.49
cos 150 1084 1586 1.46
cos 100 1024 1524 1.44
cos 80 985 1489 1.42
cos 50 932 1457 1.37
cos 40 894 1431 1.34
cos 25 833 1409 1.27
cos 20 783 1394 1.20
cos 10 642 1377 1.00
*· *···>·
Za použiti technologie BIAcore byly kvantitativně
203 analyzovány molekulové kinetické interakce mezi značenou protilátkou
J695 a rozpustným rhIL-12.
Provedlo se několik nezávislých experimentů a výsledky byly analyzovány dostupným softwarem BIAcore pro matematickou analýzu, aby se získaly kinetické rychlostní konstanty, jak je zobrazeno v tabulce č. 8.
Tabulka č. 8: Zdánlivá kinetická rychlost a afinitní konstanty protilátky J695 pro rhIL-12
protilátka zdroj kon (μΆ-1) , průměrná hodnota koff (s x) , průměrná hodnota Kd(M) průměrná hodnota
J695 CHO 3,52E+5 4,72E-5 l,34E-10
J695 COS 3,40E+5 2,61E-5 9,74E-11
Existoval zde malý rozdíl mezi vypočítanou zdánlivou konstantou (Kd) v případě interakce mezi protilátkou J695 získané z CHO (Kd = 1,34~10 M1) a protilátkou J695 získanou z COS (Kd - 9,74 x 10'11 M1) . Domnělá disociační konstanta (Kd) mezi protilátkou J695 a rhIL12 byla odhadnuta z pozorovaných rychlostních konstant podle vzorce Kd = kOff/kOn·
Aby se stanovila zdánlivá asociační a disociační rychlostní konstanta pro interakci mezi protilátkou J695 a rhIL-12, provedlo se několik vazebných reakcí za použití fixovaného množství protilátky J695 (2 μρ/ml) a různé koncentrace rhIL-12. Senzogramy vazebných interakcí mezi značeným J695 a rozpustným rhIL12 vykazovaly, že obě formy protilátky byly velmi podobné pro asociační a disociační fázi.
Za účelem dalšího hodnocení kapacity značené monoklonální protilátky IgGl J695 vázat rozpustný rekombinantní cytokin byla použita přímá metoda BIAcore. Při této metodě kozí antilidský IgG (25 μρ/ml) spojený se sensorovým povrchem karboxymethyldextranu byl potažen IgGl J695 (2 μρ/ml) a pak byl
204 ♦· ····
• ··
·· 9 • * ·
• • Φ •
• • · • 9
• • •
přidán rekombinantní cytokin. Když se rozpustný rhIL12 zavedl injekcí přes biosensorový povrch spojený s IgGl J695 získaným z CHO nebo COS, vzrostla v roztoku síla signálu v souladu se zvýšením koncentrace cytokinů. V případě rmIL12 (R&D Systems, kat. č. 419-ML, Minneapolis, MN) nebo rhIL12 v libovolné testované koncentraci až do 1 000 nM nedošlo k žádnému nevázání. Tyto výsledky podporují závěr, že protilátky IgGl J695 rozeznávají odlišnou determinantu na rhIL12.
Tabulka č. 9 ukazuje výsledky experimentálního použití BIAcore, aby demonstrovala navázání lidské protilátky IgGl J695 pouze na rozpustný rhIL12 a nikoli na jiné rekombinantní cytokiny.
Tabulka č. 9: Epitop mapující protilátku J695 použitím technologie BIAcore
značený ligand COS J695 značený ligand CHO J695
rozpustný analyt
rek. lidský IL12 pozitivní pozitivní
rek. myší IL12 negativní negativní
Příklad 6: Další studie afinity protilátky J695 pro IL-12
Molekulární kinetické interakce mezi protilátkou J695 a lidským IL-12 byly kvantitativně analyzovány použitím technologie plazmonové rezonance BIAcore a byly odvozeny zdánlivé kinetické rychlostní konstanty.
Technologie BIAcore byla používána k měření navázání rozpustného IL-12 protilátku J695 vázané na pevné fázi. Kozí anti-lidská protilátka IgG byla imobilizována na biosenzorové čipy, pak fixované množství protilátky J695 bylo zavedeno injekcí a zachyceno na povrchu. Byly aplikovány různé koncentrace rhIL-12 a bylo měřeno navázání IL-12 v různých koncentracích na protilátku J695 jako funkce času. Byla vypočtena zdánlivá asociační a disociační rychlostní
205 • · ···· ·· « ·» ·· • · · ···· ·«·· ··· ··· · · · • · · <* · · ···· · • · · · · · · · · ·· 9 ·· «·· ·· ···· konstanta, přičemž se předpokládá disociační kinetika nultého řádu a asociační kinetika prvního řádu, stejně jako jednoduchá interakce jedna ku jedné mezi protilátkou J695 a IL-12. Uskutečnily se tři nezávislé experimenty a zobrazené hodnoty jsou průměry hodnot získaných ve třech experimentech. Z těchto měření byla získány zdánlivé disociační (kd) a asociační (ka)rychlostní konstanty a použily se k výpočtu hodnoty Kd pro interakci (popisuje se v tabulce č. 10) . Výsledky indikovaly, že protilátka J695 vykazovala vysokou afinitu pro rhIL-12.
Tabulka č. 10: Kinetické parametry interakce mezi protilátkou
J695 a lidským IL-12
kinetický parametr hodnota
kd 3,71 ± 0,40 x 105 s_1
ka 3,81 ± 0,48 x 10~5
Kd 9,74 x 10'11 M (14 ng/ml)
Příklad 7: Charakteristiky a neutralizační aktivita krysí monoklonální protilátky C17.15 proti myšímu interleukinu-12
Aby se odhadla relevantnost studií léčby IL-12 zánětlivých a autoimunitních onemocnění použitím monoklonálních protilátek specifických pro myší IL-12 v myších modelech s podobnými přístupy u lidského onemocnění, testovala se interakce krysí monoklonální protilátky proti myším interleukinu-12 C17.15 s myším IL-12. Byla odhadnuta schopnost protilátky C17.15 neutralizovat aktivitu myšího IL-12 v testu proliferace PHA blastů a blokovat navázání myšího IL-12 na buněčné povrchové receptory, stejně jako kinetiky vazebné interakce C17.15-myší IL-12.
V testu proliferace lidských PHA blastů (popisuje se v příkladu 3) sériová ředění C17.15 nebo krysího IgG2a (kontrolní protilátka) byly předem inkubovány s 230 pg/ml myšího IL-12 po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C. Blastové
206 ·· ···· φ φ φ φφ φφ φ φ · φφφφ Φ·Φ· φφφ φφφ φφ · φ φ φ φφφ φφφφ φ • · φ φφφ φφφ ·· · φ· φφφ φφ φφφφ buňky stimulované ΡΗΑ byly přidány ke směsi protilátky IL-12 a inkubovaly se po dobu tří dní při teplotě 37 °C. Buňky byly následně značeny po dobu 6 hodin s [3H]-tymidinem v intenzitě 1 gCi/jamku. Kultury byly shromážděny a byl měřen začleněný [3H]tymidin. Pozadí nespecifické proliferace bylo měřeno v nepřítomnosti přidaného myšího IL-12. Všechny vzorky byly testovány dvojmo. Hodnoty IC50 (M) protilátky C17.15 v případě rekombinantního myšího IL-12 v tomto testu byly 1,4 x 1CT11 srovnáno s hodnotou IC50 5,8 x 10-12 pozorovanou pro protilátku J695 vytvořenou proti rekombinantnímu lidskému IL-12 za stejných podmínek (popisuje se v tabulce č. 11).
Tabulka č. 11: Porovnání vlastností monoklonální protilátky
J695 proti lidskému IL-12 a krysí monoklonální protilátky C17.15 proti myšímu IL-12
protilátka epitop biomolekulární interakční test test navázání na receptor test PHA blastů
k« (M*1s_1) ka (s*1) Ka (M) IC50 (M) IC50 (M)
J695 Hu p4 0 3,81 x 10’ 3,71 x 10*’ 9,74 X 10*xx 1,1 x 10*xx 5,8 x 10*lz
C17.15 Mu p4 0 3,80 x 10° 1,84 x 10’ 4,80 x 10*xu 1,5 x 10*xu 1,4 x 10*xx
Také byla měřena schopnost protilátky C17.15 inhibovat navázání myšího IL-12 na buněčné receptory. Sériová ředění protilátky C17.15 byla předem inkubována po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C s 100 pM [125I]-myšího IL-12 ve vazebném pufru. Ke směsi protilátka/[125I]-myší IL-12 byly přidány buňky 2D6 (v množství 2 x 106) a směs se inkubovala po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Na buňky vázaná radioaktivita se oddělila od volného [125I]-IL-12 a byla stanovena zbývající radioaktivita vázaná na buňky. Bylo stanoveno celkové navázání značeného myšího IL-12 na receptory na buňkách 2D6 v nepřítomnosti protilátky a v testu bylo stanoveno ·· ··· · ·· · ·· ·· • · · ···· · · · ·
207
nespecifické navázání inkluzí 25 nM neznačeného myšího IL-12. Specifické navázání bylo vypočteno jako celkové navázání mínus nespecifické navázání. Inkubace byly provedeny dvojmo. Výsledky ukazovaly, že protilátka C17.15 vykazuje pro inhibici navázání myšího IL-12 na buněčné receptory hodnotu IC50 1,5 x ΙΟ’10 M.
Afinita protilátky C17.15 pro rekombinantní myší IL-12 byla odhadnuta analýzou biomolekulárních interakcí. Kozí protilátka proti krysímu IgG byla imobilizována na biosenzorových čipech, pak následovala injekce fixního množství protilátky C17.15, což vede k navázání protilátky C17.15 na povrch čipu. Různé koncentrace rekombinantního myšího IL-12 byly aplikovány na povrchu vázanou protilátku C17.15 a bylo měřeno navázání myšího IL-12 na imobilizovanou protilátku C17.15 jako funkce času. Byly vypočítány zdánlivé disociační a asociační rychlostní konstanty, přičemž se předpokládá disociační kinetika nultého řádu a asociační kinetika prvního řádu, stejně jako jednoduchá interakce jedna ku jedné mezi imobilizovanou protilátkou C17.15 a myším IL-12. Z těchto měření byly vypočteny zdánlivé disociační (kd) a asociační (ka) konstanty. Tyto výsledky byly použity pro výpočet hodnoty Kd v případě interakce. V případě interakce rekombinantního myšího IL-12 - C17.15 byla pozorována hodnota ka 3,8 χ 105 M1s~1, kd 1,84 χ 10'4 s-1 a Kd 4,8 χ 1O10.
Pozorované aktivity protilátky C17.15 při neutralizaci aktivity myšího IL-12 a navázání na buněčné povrchové receptory stejně jako kinetiky navázání protilátky C17.15 na myší IL-12 korelují s podobnými měření v případě interakce J695-rhIL-12. To indikuje, že módy působení krysí protilátky C17.15 proti myšímu IL-12 a protilátky J695 proti lidskému IL12 jsou skoro shodné, co se týče hodnot ka, kd, Kd, IC50 a testu s PHA blasty. Proto protilátka C17.15 byla použita jako homologní protilátka v případě protilátky J695 v myších modelech zánětlivého a autoimunitního onemocnění pro studium • · · ·· ·
208 vznik a postup onemocnění u těchto modelových zvířat (popisuje se v příkladu 8) .
Příklad 8: Léčba autoimunních a zánětlivých onemocnění u myší aplikací α-myší IL-12 protilátky
A. Potlačení artritidy vyvolané kolagenem u myší pomocí protilátky C17.15 proti a-IL-12
Byla demonstrována korelace mezi množstvím IL-12 a revmatickou artritidou (RA). Bylo například detekováno zvýšené množství IL-12p70 v klobním mazu pacientů trpících revmatickou artritidou ve srovnání se zdravými kontrolami (popisuje se v publikaci Morita et al., (1998) Arthritis and Rheumatism. 41: 306-315). Proto byla hodnocena schopnost protilátky
C.17.15, což je krysí protilátka proti myšímu IL-12, potlačit artritidu vyvolanou kolagenem.
Samci myší DBA/1 (10 myší ve skupině) byli imunizováni kolagenem typu II v den 0 a ošetřily se protilátkou C17.15 nebo kontrolním krysím IgG v koncentraci 10 mg/kg intraperitoneálně ob den ode dne -1 (jeden den před imunizací kolagenem) až do dne 12. U zvířat byl klinicky sledován vývoj artritidy pacek až do dne 90. Artritida byla rozdělena do stupňů: symbol 0 znamená normální stav, symbol 1 znamená artritida lokalizovaná v jednom kloubu, symbol 2 znamená, že je zahrnut více jak jeden kloub, ale nikoli celá packa, symbol 3 znamená, že je zahrnuta celá packa, symbol .4 označuje deformaci packy, symbol 5 označuje ankylózu zahrnutých kloubů. Artritické skóre u myši byl součet artritických stupňů pro každou jednotlivou packu dané myši (maximální hodnota je 20) . Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM v každé skupině.
Výsledky, jak jsou zobrazeny na obrázku č. 4, indikují, že artritické skóre byla měřitelné u myší ošetřených protilátkou C17.15 pouze po dni 50 po léčbě a tak maximum průměrné hodnoty artritického skóre získaného u myší ošetřených protilátkou C17.15 bylo alespoň 5 krát nižší než maximum měřené u myší ·· · · · · · · · to* ·· • · · ···· ···«
209 ošetřených IgG. To demonstrovalo, že krysí protilátka C17.15 proti myšímu IL-12 zabránila u myší vývoji artritidy vyvolané kolagenem.
B. Potlačení kolitidy u myší krysí protilátkou C17.15 proti α-myšímu IL-12
Ukázalo se, že IL-12 má úlohu při vývoji/patologii kolitidy. Dále se ukázalo, že například protilátky proti IL-12 potlačují onemocnění v myších modelech kolitidy, například kolitidy vyvolané TNBS u myší postižených účinkem IL-12 (popisuje se v publikaci Simpson et al., (1998) J. Exp. Med. 187(8): 1225-34). Podobně se ukázalo, že protilátky proti IL12 potlačují vznik kolitidy u myší postižených účinkem IL-10. Ve dvou studiích byla hodnocena schopnost krysí protilátky proti myšímu IL-12 C17.15 potlačit TNBS kolitidu u myší (popisuje se v publikaci Davidson et al., (1998) J. Immunol. 161(6): 3143-9).
V první studii byla kolitida vyvolána u myší SJL, které neobsahují antigen, aplikací 150 μΐ 50% roztoku etanolu, který obsahuje 2,0 mg TNBS zavedeného dětským umbilikálním arteriálním katetrem do konečníku. Kontrolní zvířata byla ošetřena pouze 150 μΐ 50% roztoku etanolu. Ocasní žilou byla aplikována intravenózně v den 11 jediná dávka 0,75, 0,5, 0,25, nebo 0,1 mg protilátky C17.15 nebo 0,75 mg kontrolního krysího IgG2a a hodnotil se terapeutický účinek léčby vážením zvířat v den 11 a 17 a histologickým vyšetřením v den 17. Tělesná hmotnost myší ošetřených protilátkou C17.15 vzrostla během 48 hodin léčby protilátkou a normalizovala se v den 6 po léčbě. Účinek léčby s protilátkou C17.15 byl potvrzen histologicky. Dále bylo provedeno hodnocení vylučování IFN-γ buňkami T CD4+ ze sleziny a tlustého střeva ošetřených myší, stejně jako množství IL-12 z makrofágů získaných ze sleziny a tlustého střeva pocházejících z ošetřených myší (popisuje se v tabulce č. 12) .
• · ··· ·
210
Při druhé studii bylo optimalizované dávkování a myši se ošetřily celkovou dávkou 0,1 mg nebo 0,5 mg protilátky C17.15 nebo respektive 0,1 mg kontrolního IgG2a rozdělených do dnů 12 a 14. Zjistilo se, že aplikace protilátky C17.15 v jediné dávce, kdy se aplikovalo jedné myší 0,1 mg nebo 0,5 mg, vedlo pouze k částečnému zlepšení kolitidy vyvolané TNBS a nevedlo k podstatné redukci produkce IFN-γ v buňkách T CD4+ in vitro, ale výsledkem bylo podstatné snížení vylučování IL-12 ve srovnání s neléčenými kontrolami. Byla pozorována odezva, když se jedné myši v jediné dávce aplikovalo 0,5 mg nebo více. Když se vzala nejnižší dávka testované protilátky a aplikovala se ve dvou rozdělených injekcích (v den 12 a 14) zlepšil se dávkovacího režim, což indikuje, že vícenásobné nízké dávky mohou být více účinné ve srovnání s jednou bolusovou dávkou. Získaná data jsou zobrazena v tabulce č. 12.
Tabulka č. 12: Monoklonální protilátka C17.15 proti myšímu IL12 potlačuje prokázanou kolitidu u myší
vyvolání onemocnění v den 0 léčba den 11 hmotnost (g) IFN-γ vyluč. buňkami CD4+ (U/ml) IL-12 vyluč. makrofágy sleziny (pg/ml)
den 11 den 17
TNBS+etanol kontrol IgG2a 0.75 mg 16, 0 15, 26 3 326 300
TNBS+etanol C17.15 0,75 mg 16,0 20,21 1 732 0
TNBS+etanol C17.15 0, 5 mg 16, 36 19, 94 1 723 0
TNBS+etanol C17.15 0,25 mg 16, 28 17,7 3 618 7
···· ·* * φφ φφ • ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ • ΦΦΦ φ φ «
211 • Φ Φφφ ·ΦΦ φΦ ΦφΦφ
TNBS+etanol C17.15 mg 16, 2 17, 98 3 489 22
kontrol. etanol 20, 76 21,16 1 135 0
Aplikace monoklonální protilátky C17.15 proti IL-12 ve dvou rozdělených dávkách v intervalu jednoho dne, přičemž celková dávka je 0,1 mg/myš nebo 0,05 mg/myš, vedla k úplnému zvratu kolitidy, jak se hodnotilo na základě celkového stavu a makroskopického vzhledu tlustého střeva. Navíc tento dávkový rozvrh vedl k podstatné negativní regulaci produkce IFN-γ T buněk slizničního vaziva a produkce IL-12 makrofágů, tak že později byly produkce porovnatelné s množstvím identifikovaným u myší ošetřených kontrolním roztokem etanolu, u kterých nedošlo ke vzniku TNBS-kolitidy. Tak aplikace protilátky C17.15 v myších modelech vhodných pro TNBS kolitidu zvrátila postup onemocnění v závislosti na dávce.
C. Potlačení experimentální autoimunitní encefalomyelitidy (ΕΆΕ) u myší protilátkami proti a-IL-12
Běžně se věří, že IL-12 má úlohu při patogenezi roztroušené sklerózy (MS). Ukázalo se, že indukovatelná mRNA IL-12 p40 byla exprimována v akutních plakách pacientů trpících roztroušenou sklerózou, ale nikoli v zánětlivých mozkových infarktových lézích (popisuje se v publikaci Windhagen, A et al., (1995) J. Exp. Med. 182: 1985-1996). Buňky T z pacientů trpících roztroušenou sklerózou (ale nikoliv kontrolní T buňky) stimulují produkci IL-12 v buňkách prezentujících antigen přes neregulovanou expresi CD40L (popisuje se v publikaci Balashov, K. E. et al., (1997) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94: 599-603). Pacienti trpící roztroušenou sklerózou vykazují zvýšenou sekreci IFN-γ, která může být blokována in vitro protilátkami proti a-IL-12 (popisuje se v publikaci Balashov, K. E. et al., (1997) Proč.
212
Nati. Acad. Sci. USA 94: 599-603). U pacientů trpících roztroušenou sklerózou, nikoliv však jinými neurologickými nemocemi, je detekováno zvýšené množství sérového IL-12 (popisuje se v publikaci Nicoletti, F. et al., (1996) J. Neuroimmunol. 70: 87-90). Ukázalo se, že zvýšená produkce IL12 koreluje s aktivitou onemocnění u pacientů s MS (popisuje se v publikaci Cormabella, M. et al., (1998) J. Clin. Invest.
102: 671-678). Byla studována úloha IL-12 v patogenezi myšího modelu roztroušené sklerózy, experimentální autoimunitní encefalomyelitidy (EAE) (popisuje se v publikaci Leonard, J.
P. et al., (1995) J. Exp. Med. 181: 281-386, Banerjee, S. et al·., (1998) Arthritis Rheum. (1998) 41: S33, a Segal, Β. M. et al., (1998) J. Exp. Med. 187: 537-546) . Je známo, že onemocnění v tomto modelu bylo indukováno T buňkami podsouboru ΤΗχ. Proto se hodnotila schopnost protilátek proti a-IL-12 předcházet vzniku akutní EAE.
Zjistilo se, že protilátky proti a-IL-12 budou schopny inhibovat vznik akutní EAE, aby se potlačilo onemocnění po jeho vzniku, a snížit vážnost recidivy u myší imunizovaných autoantigenem, kterým je myelinový základní protein (popisuje se v publikaci Banerjee, S. et al., (1998) Arthritis Rheum. (1998) 41: S33). Výhodné účinky léčby myší protilátkou proti a-IL-12 přetrvávaly více jak dva měsíce po ukončení léčby. Také se ukázalo, že protilátky proti IL-12 potlačují onemocnění u myší, které jsou recipienty encefalitogenních buněk T adoptivním přenosem (popisuje se v publikaci Leonard,
J. P. et al., (1995) J. Exp. Med. 181: 281-386).
Příklad 9: Klinická farmakologie protilátky J695
V rekombinantní studii se 64 zdravým mužům aplikovala stoupající dávka protilátka J695 nebo placebo. Měření fragmentu komplementu C3a před aplikací dávky a 15 minut po aplikaci nedemonstrovalo aktivaci systému komplementu. U
213
• · ···· • · 0 00 0 0 • • 0 • 0 00 0 «0 0
0 0 0 • 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 · 0 0 0 0
subjektů, kde byly pozorovány symptomy konkurenční infekce vzrostlo pouze množství CRP a fibrinogenu.
Všechny subjekty přežily a obecná tolerovatelnost protilátky J695 byla velmi dobrá. Ani v jednom případě nemusela být léčba zastavena na základě nežádoucích jevů (AE) . Nejběžněji pozorované ΆΕ byly bolest hlavy a běžná rýma/bronchitida, žádný z těchto příznaků nebyl zařazen do kategorie vážných příznaků.
Jeden ze studovaných subjektů 33 let starý svobodný muž trpěl na začátku studie onemocněním psoriasis guttata. Podle náhodného navržení studie tento subjekt měl šanci dostat 5 mg/kg protilátky J695 SC aplikací. Deset dní před aplikací protilátky subjekt vykazoval pouze malé diskrétní papulární léze na pažích a dolních končetinách. V době aplikace protilátky subjekt vykazoval zvýšené začervenání, zvýšenou tloušťku erytematózních plaků a zvýšenou hyperkaratózu. Jeden týden po aplikaci protilátky J695 subjekt hlásil zlepšení stavu kůže zahrnující zeslabení lézí a snížení odlupování kůže. Krátce po druhé aplikaci protilátky J695 (5 mg/kg IV) kůže subjektu byla zcela bez lupénkových lézí, aniž by došlo k jakékoli lokální léčbě. Erytematózní plaky pokryté bílými šupinami se znovu objevily v souladu s očekávaným vymizením protilátky J695 po druhé aplikaci protilátky.
Příklad 10: Porovnání protilátky J695 produkované dvěmi buněčnými liniemi CHO
Za účelem dosažení rekombinantní exprese protilátky J695 je rekombinantní expresívní vektor kódující těžký a lehký řetězec protilátky zaveden do buněk dhfr- CHO (Urlaub, G. and Chasin, L. A. (1980) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220) transfekcí zprostředkovanou fosforečnanem vápenatým. V rekombinantním expresívním vektoru je každý gen těžkého a lehkého řetězce protilátky spojen s regulačními elementy zesilovačem/promotorem (například získanými z SV40, CMV,
214 • · • 9 • · • 9 • 9 A· • ·· · 9 9 9 '* 9 9 9 9 * 9 9 9 • 9 9 9 · • 9 9 9 • 99 ·>· 99 • « 9 4 9 9 9 9 9 • 9
adenoviru a podobně, jako je regulační element CMV
zesilovač/AdMLP promotor nebo regulační element SV4 0
zesilovač/AdMLP promotor), aby řídily silnou transkripci genů. Rekombinantní expresívní vektor také nese gen DHFR, který umožňuje selekci buněk CHO, které byly transfekovány vektorem použitím methotrexátové selekce/amplifikace.
Stopadesát mikrogramů expresívního vektoru kódujícího peptidové sekvence lidské protilátky J695 bylo rozpuštěno v
2,7 ml vody v kónické zkumavce o objemu 50 ml. Bylo přidáno 300 μΐ 2,5 M CaCl2 a tato směs DNA byla přidána po kapkách do 3 ml 2 x koncentrovaného fyziologického roztoku upraveného pufrem HEPES v kónické zkumavce o objemu 50 ml. Po zamíchání na vortexu po dobu 5 vteřin a inkubaci při teplotě místnosti po dobu 20 minut na každou plotnu se nanesl 1 ml směsi (stále v médiu F12) a plotny byly inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 4 hodin. Kapalina se odsála a do každé plotny byly přidány 2 ml 10% DMSO v médiu F12. Šok způsobený DMSO pokračoval po dobu jedné minuty, pak se DMSO naředil přidáním 5 ml PBS na každou plotnu. Plotny byly dvakrát promyty v PBS a pak následovalo přidání 10 ml MEM alfa doplněného .H/T a 5% FBS (selekce pro buňky exprimující DHFR) a inkubace přes noc při teplotě 37°C. Buňky byly přeneseny na destičky s 96 jamkami s hustotou 100 buněk v jedné jamce a plotny byly inkubovány při teplotě 37 °C v atmosféře 5 % CO2 po dobu dvou týdnů, přičemž médium bylo vyměňováno jednou týdně.
Pět dní po poslední výměně média byly supernatanty kultur ředěny v poměru 1:50 a byly testovány použitím testu ELISA specifickým pro řetězec lidského IgG gama. Klony, které poskytují nejvyšší signál v testu ELISA byly přeneseny z destiček s 96 prohlubněmi na destičky s 12 jamkami, kde v jedné jamce bulo 1,5 ml média alfa MEM a 5% dialyzované sérum. Po třech dnech byl proveden jiný test ELISA specifický pro řetězec lidského IgG gama a 12 klonů s nejvyšší aktivitou bylo rozděleno do média alfa MEM s 5% dialyzovaným sérem a 20
215 • · · ··* · · ** · ·· Μ·· «· nM MTX. Buněčná linie 031898218 rostla v přítomnosti 20 nM MTX, aniž došlo k zjevnému odumírání buněk nebo ke snížení růstové rychlosti a produkovala ve třídenním testu 1,8 pg/ml hlgG. Kultury T-25 linie 031898218 rostoucí v médiu, které obsahuje MTX, produkovaly v průměru 11,9 pg/ml protilátky J695. Linie označená ALP903 byla přizpůsobena růstu ve suspenzi za podmínek bez séra, kde produkovala 7,5 pg protilátky J695 v případě jedné buňky za 24 hodin.
Buňky ALP903 po počáteční selekci v kultivačním médiu alfa MEM/5% FBS/20 nM MTX byly opět pasážovány v 20 nM MTX. Buňky byly kultivovány při selekci 100 nM MTX a pak následovalo dvakrát pasážování v 500 nM MTX v průběhu dalších 30-ti dní. V tuto dobu kultura produkovala 32 pg/ml protilátky J695 za 24 hodin. Kultura byla subklonována v limitujícím ředění. Subklon 218-22 produkoval ve dvou dnech 16,5 pg/ml protilátky J695 na plotně s 96 jamkami a 50,3 pg/ml na plotně s 12 jamkami. Klon 218-22 byl kultivován v kultivační médiu alfa MEM/5% dialyzované FBS/500 nM MTX po dobu 38 dní, pak následovala adaptace na kultivaci v kultivačním médiu bez séra, jak se popisuje shora v textu. Průměrná buněčná specifická produktivita suspenze kultury bez séra označené ALP 905 byla 58 pg/buňku za 24 hodin.
První buněčná linie používaná k produkci protilátky J695 (ALP 903) vykazovala nižší výtěžky protilátky ve srovnání s druhou buněčnou linií ALP 905. Aby bylo jisté, že protilátka J695 produkovaná ALP 905 byla funkčně shodná s protilátkou produkovanou ALP 903, u obou protilátek byla hodnocena IL-12 afinita, schopnost blokovat navázání IL-12 na buněčné receptory, schopnost inhibovat indukci IFN-γ pomocí IL-12 a schopnost inhibovat proliferaci PHA blastů zprostředkovanou IL-12.
Afinita protilátky J695 z buněk ALP 903 a ALP 905 pro IL12 byla stanovena měřením kinetických rychlostních konstant »» ·*τ· *· • · · · * • · » · · • · · · · · • · * · * ·· · «·
216
• ·· ·*
• · • · « ·
• • ·
• • · · •
• • · •
··· ·· • •l ·
navázáni
IL-12 studiemi povrchové plazmonové rezonance (analýzy BIAcore). Konstanta rychlosti disociace (kd) a asociace (ka) protilátky z buněčné linie ALP 903 a ALP 905 pro navázání na rhIL-12 byly stanoveny ve třech experimentech (jak se popisuje v příkladu 3) . Afinita (Kd) navázání IL-12 byla vypočítána dělením konstanty kd a ka. Hodnota Kd byla vypočítána pro každý jednotlivý experiment a pak se vypočítal průměr hodnot. Výsledky ukázaly, že stanovené kinetické parametry a afinita navázání na rhIL-12 byly velmi podobné pro protilátku J695 z obou buněčných linií ALP 903 a ALP 905: vypočtená hodnota Kd byla 1,19 ± 0,22 x ΙΟ10 M v případě ALP 203 a 1,49 ± 0,47 x 10”10 M v případě ALP 905 (uvedeno v tabulce č. 13) .
Byla hodnocena schopnost protilátky J695 získané z ALP 903 a ALP 905 blokovat navázání rhIL-12 na receptory IL-12 na lidských T-lymfoblastech aktivovaných PHA (popisuje se v příkladu 3) . Každý vzorek protilátky J695 byl testován při počáteční koncentraci 1 x 108 s desetinásobným sériovým ředěním. Protilátka byla předem inkubována po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C s 50 pM [125I]-lidského IL-12 ve vazebném pufru. PHA blastové buňky byly přidány do směsi protilát ka/[125I]-lidský IL-12 a vše se inkubovalo po dobu 2 hodiny při teplotě místnosti. Radioaktivita vázaná na buňce byla oddělena od volné [125I]-IL-12 centrifugací a promývacími kroky a vypočítalo se procento inhibice. Hodnoty IC50 v případě protilátky J695 byly stanoveny z inhibičních křivek použitím křivky odpovídající čtyřem parametrům a byly potvrzeny dvěma nezávislými experimenty. Inkubace byly provedeny ve dvouch provedeních. Výsledky pro oba druhy protilátek J695 byly velmi podobné (popisuje se v tabulce č. 13).
Byla hodnocena schopnost protilátky J695 z buněk ALP 903 a ALP 905 inhibovat produkci IFN-gama vyvolanou rhIL-12 lidskými lymfoblasty aktivovanými PHA in vitro. Sériová ředění protilátky J695 byly předem inkubovány s 200 pg/ml rhIL-12 po • · dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C. Byly přidány PHA lymfoblasty a byly inkubovány po dobu 18 hodin při teplotě 37 °C. Po inkubaci byl izolován supernatant bez buněk a testem ELISA se stanovilo množství IFN-gama. Hodnoty IC50 získané z inhibičních křivek byly vyneseny do grafů proti koncentraci protilátky použitím křivky odpovídající 4 parametrům. Výsledky demonstrují, že schopnost obou protilátek inhibovat produkci IFN-gama je velmi podobná.
K měření neutralizační kapacity ALP 903 a ALP 905 pro rhIL-12 byl použit test proliferace PHA blastů in vitro.
Sériová ředění protilátky J695 každého typu byly předem inkubovány s 230 pg/ ml lidského IL-12 po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C. Byly přidány další PHA blastové buňky a inkubovaly se po dobu tří dní při teplotě 37 °C. Buňky byly pak značeny po dobu 6 hodin s yCi/prohlubeň [3H]-tymidinem.
Kultury byly shromážděny a měřila se začlenění [3H]-tymidinu. V nepřítomnosti rhIL-12 byla měřena nespecifická proliferace (pozadí). Bylo zjištěno, že hodnoty IC50 pro protilátku J695 produkovanou buňkami ALP 903 a ALP 905 jsou velmi podobné a jsou uvedeny v tabulce č. 13.
Aktivita protilátek J695 produkovaných buňkami ALP 903 a ALP 905 při neutralizaci ' aktivity rhIL-12 při blokování navázání IL-12 na receptory buněčného povrchu a navázání na rhIL-12 se podstatně neliší a tak protilátky produkované těmito různými buněčnými typy byly ekvivalentní.
Tabulka č. 13: Porovnání vlas‘f^ostí protilátky J695 šarže ALP
903 a ALP 905
protilátka k. kd (s~x) Kd (M) RB test IC50 PHA blastový test IC50 (M) IFN-γ test
ICso (M)
J695 ALP 903 3,75 x 10b 4,46 x 10’5 1, 19 x 10‘10 3,4 x 10’11 5,5 X 10'lž 5,8 x 10’12
J695 ALP 905 3,91 x 10b 5,59 x 10’5 1,49 x 10‘lu 3,0 x 10‘u 4,4 x 10-12 4,3 x 1012
218 ·· ···· ·· «·· ·· • · · ···*···· • · · *···· · • · · ··· · · · 99 • · · ♦ · ····
9· 4 ·· ··· 4· ····
Ekvivalenty
Oborníci v oboru rozpoznají nebo budou schopni určit použitím ne víc než rutinního experimentu řadu ekvivalentů zde popsaných specifických provedení vynálezu. Takové ekvivalenty jsou zahrnuty v následujících nárocích.

Claims (25)

1. Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která se váže na lidský IL-12, kde uvedená lidská protilátka je neutralizující protilátka.
2. Selektivně mutovaná lidská protilátka proti IL-12 obsahující lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen selektivně mutovanou v preferované poloze selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutačni poloze aminokyselinovým zbytkem zvyšujícím aktivitu tak, že se protilátka váže na lidský IL-12.
3. Selektivně mutovaná lidská protilátka proti IL-12 obsahující lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen selektivně mutovanou v preferované poloze selektivní mutageneze aminokyselinovým zbytkem zvyšujícím aktivitu tak, že se protilátka váže na lidský IL-12.
4. Selektivně mutovaná lidská protilátka proti IL-12 podle nároku 2, kde lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen je selektivně mutovaná ve více než jedné preferované poloze selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutačni poloze aminokyselinovým zbytkem zvyšujícím aktivitu.
5. Selektivně mutovaná lidská protilátka proti IL-12 podle nároku 4, kde lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen je selektivně mutovaná ne ve více než ve třech preferovaných polohách selektivní mutageneze, kontaktních nebo hypermutačnich polohách.
6. Selektivně mutovaná lidská protilátka proti IL-12 podle nároku 4, kde lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen je selektivně mutovaná ne ve více než ve dvou preferovaných polohách selektivní mutageneze, kontaktních nebo hypermutačních polohách.
• · ···· ·· • · « · « ♦
220
Ί. Selektivně mutovaná lidská protilátka proti IL-12 podle nároku 2, kde lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen je selektivně mutována tak, že je dosaženo cílového stupně specifické afinity, uvedený cílový stupeň je zlepšen ve srovnání s dosažitelným stupněm, když se provede selekce protilátky proti stejnému antigenu použitím fágové zobrazovací technologie.
8. Selektivně mutovaná lidská protilátka proti IL-12 podle nároku 7, která si dále zachovává alespoň jednu požadovanou vlastnost nebo charakteristiku.
9. Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která se váže na lidský IL-12 a disociuje z lidského IL-12 s hodnotou rychlostní konstanty kOff 0,1 s1 nebo nižší, stanoveno povrchovou plazmonovou rezonancí, nebo která inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu proliferace fytohemaglutininových blastů in vitro (PHA test) s hodnotou IC50 1 x 10~6 M nebo nižší.
10. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 9 nebo její část vázající se na antigen, která disociuje z lidského IL-12 s hodnotou rychlostní konstanty koff 1 x 10-2 s-1 nebo nižší, stanoveno povrchovou plazmonovou rezonancí, nebo která inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu proliferace fytohemaglutininových blastů in vitro (PHA test) s hodnotou IC50 1 x 10”7 M nebo nižší.
11. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 9 nebo její část vázající se na antigen, která disociuje z lidského IL-12 s hodnotou rychlostní konstanty kOff 1 x 10~3 s1 nebo nižší, stanoveno povrchovou plazmonovou rezonancí, nebo která inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu proliferace fytohemaglutininových blastů in vitro (PHA test) s hodnotou IC50 1 x 108 M nebo nižší.
12. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 9 nebo její část vázající se na antigen, která disociuje z lidského IL-12 s hodnotou rychlostní konstanty kOff 1 x 104 s1 nebo nižší, !» · · · · · ·· · · * · · • · 6 *··· · · · »
6 · · · · · ·· ·
221 stanoveno povrchovou plazmonovou rezonancí, nebo která inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu proliferace fytohemaglutininových blastů in vitro (PHA test) s hodnotou IC5o 1 x ΙΟ9 M nebo nižší.
13. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 9 nebo její část vázající se na antigen, která disociujě z lidského IL-12 s hodnotou rychlostní konstanty koff 1 x 105 s-1 nebo nižší, stanoveno povrchovou plazmonovou rezonancí, nebo která inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu proliferace fytohemaglutininových blastů in vitro (PHA test) s hodnotou IC50 1 x ΙΟ'10 M nebo nižší.
14. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 9 nebo její část vázající se na antigen, která disociujě z lidského IL-12 s hodnotou rychlostní konstanty koff 1 x 105 s“1 nebo nižší, stanoveno povrchovou plazmonovou rezonancí, nebo která inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu proliferace fytohemaglutininových blastů in vitro (PHA test) s hodnotou IC5o 1 x ΙΟ11 M nebo nižší.
15. Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen, která má následující charakteristiky:
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x ΙΟ-6 M nebo nižší,
b) vykazuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1 a c) vykazuje CDR3 lehkého řetězce obsahuj ící aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2.
16. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 15 nebo její část vázající se na antigen, která dále vykazuje CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 3a CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 4.
17. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 15 nebo její část vázající se na antigen, která dále vykazuje CDR1 těžkého
222
9 9 řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 5a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 6.
18.Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen podle nároku 16, která má variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 7 a variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 8.
19. Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen, která má následující charakteristiky:
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC50 1 χ 10“9 M nebo nižší,
b) vykazuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 9 a
c) vykazuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 10.
20. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 19 nebo její část vázající se na antigen, která dále má CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 11 a CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 12.
21. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 19 nebo její část vázající se na antigen, která dále vykazuje CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 13 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 14.
22. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 19, která má variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 15 a variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 16.
23.Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen, která ·· 99 • » φ Φ
223
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 109 M nebo nižší,
b) vykazuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 17 a
c) vykazuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 18.
24. Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen podle nároku 23, která dále má CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 19 a CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 20.
25. Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen podle nároku 23, která dále vykazuje CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 21 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 22.
26. Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se antigen, která má variabilní oblast těžkého řetězce
obsahuj ící aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 23 a variabilní oblast lehkého řetězce obsahuj ící aminokyselinovou sekvenci SEQ ID ŇO: 24. 27. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 26 obsahuj ící konstantní oblast těžkého řetězce vybranou ze skupiny zahrnuj ící konstantní oblasti IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA a IgE. 28.Izolovaná lidská protilátka podle nároku 27, kde konstantní
oblast těžkého řetězce protilátky je IgGl.
29. Izolovaná lidská fragment Fab. protilátka podle nároku 26, kterou je 30. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 26, kterou je fragment F (ab')2. 31.Izolovaná lidská protilátka podle nároku 26, kterou je
jednořetězcový fragment Fv.
224
32. Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen, která
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC5o 1 x 109 M nebo nižší,
b) vykazuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 404 až 469 nebo
c) vykazuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 534 až 579.
33.Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen podle nároku 32, která dále má CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou z SEQ ID NO: 335 až 403 nebo CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou z SEQ ID NO: 506 až 533.
34. Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen podle nároku 32, která dále vykazuje CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 288 až 334 nebo CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 470 až 505.
35. Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se antigen, která má variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ
ID
NO: 23 a variabilní oblast lehkého řetězce obsahuj ící aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:
24.
36. Izolovaná lidská protilátka podle nároku obsahuj ící konstantní oblast těžkého řetězce vybranou ze skupiny zahrnuj ící konstantní oblasti IgGl,
IgG2, IgG3,
IgG4, IgM,
IgA a IgE.
37. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 36, kde konstantní oblast těžkého řetězce protilátky je IgGl.
38. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 35, kterou je fragment Fab.
225 • · • · • · • · • · • 99 · • • 9 · · • · ♦ · • · · « 9 · • · · · · • · • • • 9 · 39. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 35, kterou je fragment F(ab')2. 40. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 35, kterou je jednořetězcový fragment Fv. 41. Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázaj ící
antigen, která
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10“9 M nebo nižší,
b) vykazuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 25 a
c) vykazuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 26.
42. Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen podle nároku 41, která dále má CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 27 a CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 28.
43. Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen podle nároku 41, která dále vykazuje CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 29 nebo CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 30.
44. Izolovaná antigen, lidská protilátka nebo její část vázající se na která má variabilní oblast těžkého řetězce obsahuj ící aminokyselinovou sekvenci SEQ
ID
NO: 31 a variabilní oblast lehkého řetězce obsahuj ící aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:
32.
45.Izolovaná lidská protilátka podle nároku obsahuj ící konstantní oblast těžkého řetězce vybranou ze skupiny zahrnuj ící konstantní oblasti IgGl,
IgG2, IgG3,
IgG4, IgM,
IgA a IgE.
46. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 45, kde konstantní oblast těžkého řetězce protilátky je IgGl.
226
47. Izolovaná lidská fragment Fab. protilátka podle nároku 44, kterou je 48 . Izolovaná lidská protilátka podle nároku 44, kterou je fragment F (ab')2. 49. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 44, kterou je
jednořetězcový fragment Fv.
50. Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen, která
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10~6 M nebo nižší,
b) zahrnuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 3a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 5 nebo jejich mutant, který má jednu nebo více aminokyselinových substitucí v kontaktní nebo hypermutační poloze, přičemž uvedený mutant nemá hodnotu rychlostní konstanty kOff vyšší než je desetinásobek hodnoty u protilátky zahrnující CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 3 a CDR1 těžkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 5 a
c) zahrnuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 4 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 6 nebo jejich mutant, který má jednu nebo více aminokyselinových substitucí v kontaktní nebo hypermutační poloze, přičemž uvedený mutant nemá hodnotu rychlostní konstanty kOff vyšší než je desetinásobek hodnoty u protilátky zahrnující CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ
227
ID NO: 4 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 6.
51. Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen, která
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC5o 1 x 109 M nebo nižší,
b) zahrnuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 9, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 11 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 13 nebo jejich mutant, který má jednu nebo více aminokyselinových substitucí v kontaktní nebo hypermutační poloze, přičemž uvedený mutant nemá hodnotu rychlostní konstanty kOff vyšší než je desetinásobek hodnoty u protilátky zahrnující CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 9, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 11 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 13 a
c) zahrnuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 10, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 12 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 14 nebo jejich mutant, který má jednu nebo více aminokyselinových substituci v kontaktní nebo hypermutační poloze, přičemž uvedený mutant nemá hodnotu rychlostní konstanty kOff vyšší než je desetinásobek hodnoty u protilátky zahrnující CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 10, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 12 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 14.
52. Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen, která ·· ίΜ· Φ 0 0 00 00
00 0 00 00 00«
228
0 0 0 000 000 0* · 00 000 #0 0000
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x ΙΟ9 M nebo nižší,
b) zahrnuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 17, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 19 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:
21 nebo jejich mutant, který má jednu nebo více aminokyselinových substitucí v kontaktní nebo hypermutační poloze, přičemž uvedený mutant nemá hodnotu rychlostní konstanty koff vyšší než je desetinásobek hodnoty u protilátky zahrnující CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 17, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 19 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 21 a
c) zahrnuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 18, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 20 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:
22 nebo jejich mutant, který má jednu nebo více aminokyselinových substitucí v kontaktní nebo hypermutační poloze, přičemž uvedený mutant nemá hodnotu rychlostní konstanty koff vyšší než je desetinásobek hodnoty u protilátky zahrnující CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 18, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 20 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 22.
53. Izolovaná nukleová kyselina kódující CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 17.
54. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 53, která kóduje variabilní oblast těžkého řetězce protilátky.
229
55. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 54, kde CDR2 variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 19.
56. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 54, kde CDR1 variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 21.
57. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 56, která kóduje variabilní oblast těžkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 23.
58. Izolovaná nukleová kyselina kódující CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 18.
59. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 58, která kóduje variabilní oblast lehkého řetězce protilátky.
60. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 59, kde CDR2 variabilní oblasti lehkého řetězce protilátky obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 20.
61. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 59, kde CDR1 variabilní oblasti lehkého řetězce protilátky obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 22.
62. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 61, která kóduje variabilní oblast lehkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 24.
63. Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která
a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC5o 1 x 109 M nebo nižší,
b) zahrnuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 25, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 27 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 29 nebo jejich mutant, který má jednu nebo vice aminokyselinových substitucí v kontaktní nebo hypermutační poloze, přičemž uvedený mutant nemá hodnotu rychlostní konstanty kOff vyšší než je desetinásobek ·· · · · · · φ 9 999 9
9 9 · 9 9 99 9 9 99
230
9 9 9 9 9 9 9 99
99 · ·· 999 999999 hodnoty u protilátky zahrnující CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 25, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 27 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 29 a
c) zahrnuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 26, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 8 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 30 nebo jejich mutant, který má jednu nebo více aminokyselinových substitucí v kontaktní nebo hypermutační poloze, přičemž uvedený mutant nemá hodnotu rychlostní konstanty koff vyšší než je desetinásobek hodnoty u protilátky zahrnující CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 26, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 28 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 30.
64. Izolovaná nukleová kyselina kódující CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 25.
65. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 64, která kóduje variabilní oblast těžkého řetězce protilátky.
66. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 65, kde CDR2 variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 27.
67. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 65, kde CDR1 variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 29.
68. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 67, která kóduje variabilní oblast těžkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 31.
69. Izolovaná nukleová kyselina kódující CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 26.
231
10. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 69, která kóduje variabilní oblast lehkého řetězce protilátky.
71. Izolovaná nukleová kyselina variabilní oblasti lehkého aminokyselinovou sekvenci SEQ
72. Izolovaná nukleová kyselina variabilní oblasti lehkého aminokyselinovou sekvenci SEQ podle nároku 70, kde CDR2 řetězce protilátky obsahuje ID NO: 28.
podle nároku 70, kde CDR1 řetězce protilátky obsahuje ID NO: 30.
73. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 72, která kóduje variabilní oblast těžkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 32.
74. Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která má následující charakteristiky:
a) váže se na lidský IL-12 a disociuje z lidského IL-12 s hodnotou rychlostní konstanty koff 0,1 s“1 nebo nižší, stanoveno povrchovou plazmonovou rezonancí, nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu proliferace fytohemaglutininových blastů in vitro (test PHA) s hodnotou IC50 1 x 106 M nebo nižší,
b) má variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou z člena embryonální rodiny VH3, kde variabilní oblast těžkého řetězce má mutaci v kontaktní nebo hypermutační poloze s aminokyselinovým zbytkem zvyšujícím aktivitu,
c) má variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou z člena embryonální rodiny νλΐ, kde variabilní oblast lehkého řetězce má mutaci v kontaktní nebo hypermutační poloze s aminokyselinovým zbytkem zvyšujícím aktivitu.
75. Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která má následující charakteristiky:
a) váže se na lidský IL-12 a disociuje z lidského IL-12 s hodnotou rychlostní konstanty kOff 0,1 s1 nebo nižší, stanoveno povrchovou plazmonovou rezonancí, nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových
232 • · proliferace fytohemaglutininových blastů in vitro (test PHA) s hodnotou IC50 1 x 10-6 M nebo nižší,
b) má variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 595 až 667, kde variabilní oblast těžkého řetězce má mutaci v kontaktní nebo hypermutační poloze aminokyselinovým zbytkem zesilujícím aktivitu,
c) má variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminckyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO:· 669 až 675, kde variabilní oblast lehkého řetězce má mutaci v kontaktní nebo hypermutační poloze s aminokyselinovým zbytkem zesilujícím aktivitu.
76.Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která má následující charakteristiky:
a) váže se na lidský IL-12 a disociuje z lidského IL-12 s hodnotou rychlostní konstanty koff 0,1 s1 nebo nižší, stanoveno povrchovou plazmonovou rezonancí, nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu proliferace fytohemaglutininových blastů in vitro (test PHA) s hodnotou IC50 1 x ΙΟ6 M nebo nižší,
b) má variabilní oblast těžkého řetězce obsahující embryonální aminokyselinovou sekvenci COS-3, kde variabilní oblast těžkého řetězce má mutaci v kontaktní nebo hypermutační poloze s aminokyselinovým zbytkem zvyšujícím aktivitu,
c) má variabilní oblast lehkého řetězce zahrnující embryonální aminokyselinovou sekvenci DPL8, kde variabilní oblast lehkého řetězce má mutaci v kontaktní nebo hypermutační poloze s aminokyselinovým zbytkem zvyšujícím aktivitu.
77. Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která má následující charakteristiky:
i ·» • * • ή váže se na
233 lidský IL-12 a disociuje z lidského IL-12 ··» s hodnotou rychlostní konstanty kOff 0,1 s1 nebo nižší, stanoveno povrchovou plazmonovou rezonancí, nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu proliferace fytohemaglutininových blastů in vitro (test PHA) s hodnotou IC50 1 x ΙΟ-6 M nebo nižší,
b) má variabilní oblast těžkého řetězce aminokyselinovou sekvenci vybranou z člena obsahuj ící embryonální rodiny VH3, kde variabilní oblast těžkého řetězce obsafiuje CDR2, která je strukturou podobná CDR2 z jiných členů embryonální rodiny VH3, a CDR1, strukturálně podobná CDR1 z jiných členů která je embryonální rodiny VH3, a kde variabilní oblast těžkého řetězce má mutaci v kontaktní nebo hypermutační poloze s aminokyselinovým zbytkem zvyšujícím aktivitu,
c) má variabilní oblast lehkého řetězce obsahuj ící aminokyselinovou sekvenci vybranou ze člena embryonální rodiny Υλΐ, kde variabilní oblast lehkého řetězce obsahuje CDR2, která je strukturálně podobná CDR2 z jiných členů embryonální rodiny νλΐ, a CDR1, která je strukturálně podobná CDR1 z' jiných členů embryonální rodiny νλΐ, a kde variabilní oblast lehkého řetězce má mutaci v kontaktní nebo hypermutační poloze aminokyselinovým zbytkem zvyšujícím aktivitu.
78.
Izolovaná lidská protilátka nebo antigen podle nároku 74, 75, 76 v CDR3 těžkého řetězce.
79.
Izolovaná lidská protilátka nebo antigen podle nároku 74, 75, 76 v CDR3 lehkého řetězce.
80.
Izolovaná lidská protilátka nebo antigen podle nároku 74, 75, 76
její část vázající se na nebo 77, kde mutace je její část vázající se na nebo 77, kde mutace je její část vázající se na nebo 77, kde mutace je
v CDR2 těžkého řetězce.
• ·
234
.Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázaj ící se na antigen podle nároku 74, 75, 76 nebo 77, kde mutace je v CDR2 lehkého řetězce. .Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázaj ící se na antigen podle nároku 74, 75, 76 nebo 77, kde mutace je v CDR1 těžkého řetězce. . Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen podle nároku 74, 75, 76 nebo 77, kde mutace je
v CDR1 lehkého řetězce.
.Rekombinantní expresní vektor kódující:
a) těžký řetězec protilátky mající variabilní oblast obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 31 a
b) lehký řetězec protilátky mající variabilní oblast obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 32.
. Hostitelská buňka, do které byl zaveden rekombinantní expresní vektor podle nároku 84.
. Způsob syntézy lidské protilátky, která se váže na lidský IL-12, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelské buňky podle nároku 85 v kultivačním médiu, dokud není buňkou syntetizována lidská protilátka, která se váže na lidský IL-12.
. Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která neutralizuje aktivitu lidského IL-12 a alespoň jednoho dalšího IL-12 primáta vybraného ze skupiny zahrnující IL-12 paviána, kosmana, šimpanze, cynomolga a makaka, ale která neneutralizuje aktivitu myšího IL-12.
. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící
Se tím, že zahrnuje protilátku nebo její část vázající se na antigen podle kteréhokoli z nároků 1 až 52, 74 až 83 a 87 a farmaceuticky přijatelný nosič.
Prostředek, v y z načuj ící s e t i m, že zahrnuje protilátku nebo její část vázající se na antigen podle kteréhokoli z nároků 1 až 52, 74 až 83 a 87 a další
činidlo.
•· ···· ·· • · · · · · • · · · · ·· ·· • · ·
235
90.Prostředek se tím, podle nároku 89, ž e dalším činidlem je podle nároku 90, vyzná terapeutické č u j i c činidlo.
se tím, zahrnuj icí vyzná ž e terapeutické činidlo je budenozid, epidermální kortikosteroidy, aminosalicyláty, metronidazol, olsalazin, inhibitory, vybráno ze růstový skupiny faktor, cyklosporin,
6-merkaptopurin, inhibitory lipoxygenázy, antioxidanty, sulfasalazin, azathioprin, mesalamin, balsalazid, tromboxanové antagonísty receptorů IL-1, monoklonální protilátky proti IL-Ιβ, monoklonální protilátky proti IL-6, růstové faktory, inhibitory elastázy, pyridinylimidazolu, protilátky nebo
1, IL-2, IL-6, IL-7,· IL-8, IL-15, sloučeniny agonisty k TNF, LT, ILIL-16, IL-18, EMAP-II,
GM-CSF, FGF a PDGF, protilátky proti CD2, CD3, CD4, CD8, CD40, CD45, CD69,
CD25, CD28, CD30,
CD90
FK506, nebo jejich rapamycin, ibuprofen, ligandy, metotrexát, cyklosporin, mykofenolát mofetil, leflunomid, kortikosteroidy, prednisolon, inhibitory fosfodiesterázy, agonisty adenosinu, antitrombotická činidla, inhibitory
NSAID, komplementu, adrenergika, IRÁK, NIK, IKK, p38, inhibitory kinázy MAP, inhibitory enzymu konvertujícího IL-Ιβ, inhibitory enzymu konvertujícího
TNFa, inhibitory signalizace
T-buňky, sulfasalazin, enzymu konvertujícího cytokinů, inhibitory azathioprin, 6-merkaptopuriny, inhibitory angiotensin, rozpustný receptor p55 metaloproteinázy, p75 TNF, cytokiny,
SlL-lRI, sIL-lRII, rozpustné receptory
TNF, rozpustný receptor protizánětlivé
SIL-6R,
IL-4,
IL-10, IL-11,
IL-13 a TGFp.
92.Terapeutický vyznačuj prostředek ící podle tím, ž nároku
90, činidlo je vybráno ze skupiny terapeutické protilátky proti zahrnuj lei
TNF a jejich protilátkové fragmenty, konstrukty TNFR-Ig, inhibitory TÁCE, inhibitory PDE4, kortikosteroidy,
236 budenozid, dexamethazon, sulfasalazin, kyselinu 5aminosalicylovou, olsalazin, inhibitory enzymu konvertujícího IL-Ιβ, IL-lra, inhibitory tyrozinové kinázy, 6-merkaptopuriny a IL-11.
93. Terapeutický prostředek podle nároku 90, vyznačující setím, že terapeutické činidlo je vybráno ze skupiny zahrnující kortikosteroidy, prednisolon, metylprednisolon, azathioprin, cyklofosfamid, cyklosporin, metotrexát, 4-aminopyridin, tizanidin, interf eron^la, interferon^lb, kopolymer 1, hyperbarický kyslík, intravenózní imunoglobulin, klabribin, protilátky nebo agonisty k TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL15, IL-16, IL-18, ΕΜΆΡ-ΙΙ, GM-CSF, FGF a PDGF, protilátky proti CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45,
CD69, CD80, CD89, CD90 nebo jejich ligandy, metotrexát, cyklosporin, FK506, rapamycin, mykofenolát mofetil, leflunomid, NSAID, ibuprofen, kortikosteroidy, prednisolon, inhibitory fosfodiesterázy, agonisty adenosinu, antitrombotická činidla, inhibitory komplementu, adrenergika, IRÁK,
NIK, IKK, p38, inhibitory kinázy MAP, inhibitory enzymu konvertujícího IL-Ιβ, inhibitory TÁCE, inhibitory signalizace T-buňky, inhibitory kinázy, inhibitory metaloproteinázy, sulfasalazin, azathioprin, 6merkaptopuriny, inhibitory enzymu konvertujícího angiotensin, rozpustné receptory cytokinů, rozpustný receptor p55 TNF, rozpustný receptor p75 TNF, sIL-lRI, sIL1RII, sIL-6R, SIL-13R, anti-P7s, glykoproteinový ligand pselektinu (PSGL), protizánětlivé cytokiny, IL-4, IL-10, IL13 a ΤΘΓβ.
94 . Způsob inhibice aktivity lidského
IL-12, vyznačuj ící se tím, ž e zahrnuje kontakt lidského IL-12 s protilátkou podle nároku 44 tak, že je inhibována aktivita lidského IL-12.
• · · ♦ · · • ·
237
95. Způsob inhibice aktivity lidského IL-12 u lidského subjektu trpícího poruchou, při které je aktivita IL-12 škodlivá, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci protilátky podle nároku 44 lidskému subjektu tak, že je u lidského subjektu inhibována aktivita lidského IL-12.
96. Způsob podle nároku 95, vyznačuj ící se tím, že porucha je vybrána ze skupiny zahrnující reumatoidní artritidu, osteoartritidu, chronickou artritidu u mladistvých, lymskou artritidu, psoriatickou artritidu, reaktivní artritidu, spondyloartropatii, ankylozující spondylitidu, systémový lupus erythematosus, Crohnovu chorobu, ulcerativní kolitidu, syndrom zánětlivého střeva, roztroušenou sklerózu, inzulín dependentní cukrovku,
97 .
tyreoiditidu, astma, alergická onemocnění, dermatitidu skleroderma, zánět štítné žlázy, psoriázu, onemocnění transplantát, versus hostitel, odmítnutí transplantovaného orgánu, akutní nebo chronické imunitní onemocnění spojené s transplantací orgánu, sarkoidózu, aterosklerózu, diseminovanou intravaskulární koagulaci, Kawasakiho chorobu, chronický
Wegenerovu exoftlamickou strumu, nefrotický syndrom, únavový syndrom, nodózní polyarteritidu, granulomatózu, Henoch-Schoenleinovu mikroskopickou vaskulitidu ledvin, chronickou hepatitidu, Sjogrenův syndrom, uveitidu, sepsi, šok, syndrom dýchání u parazitická toxického dospělých, šoku, syndrom (akutního) onemocnění, nedostatečnosti, akutní kachexii, syndrom myelitis myastenii, Hungtingtonovu choreu, purpuru, aktivní septický ztíženého infekční onemocnění, získané imunitní transversa,
Parkinsonovu
Alzheimerovu chorobu, mrtvici, primární biliární fibrotické onemocnění plic, hemolytickou anémii, bujení, selhání srdce a infarkt myokardu.
Způsob podle nároku
95, těžkou chorobu, cirhózu, zhoubné vyznačuj ící se tím, že poruchou je Crohnova choroba.
238
98. Způsob podle nároku 95, vyznačuj ici se tím, že poruchou je roztroušená skleróza.
99. Způsob podle nároku 95, vyznačuj ici se tím, že poruchou je reumatoidní artritida.
100. Způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen, aby se dosáhlo předem stanovené cílové aktivity, vyznačující se tím, že zahrnuj e:
a) poskytnutí původní protilátky nebo její části vázající se na antigen,
b) výběr preferované polohy selektivní mutageneze vybrané ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33,
H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94,
c) jednotlivé mutace vybrané preferované polohy selektivní mutageneze alespoň dvou odlišných aminokyselinových zbytků, čímž vzniká první soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
d) hodnocení aktivity prvního souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, aby se stanovilo zda mutace jednotlivé polohy selektivní mutageneze produkuje protilátku nebo její část vázající se na antigen s předem stanovenou cílovou aktivitou nebo částečnou cílovou aktivitou,
e) kombinování v původní protilátce nebo v její části vázající se na antigen postupným způsobem jednotlivých mutací, u který se zjistila zlepšená aktivita, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
f) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, aby se stanovilo, zda kombinační protilátky nebo jejich části vázající se na antigen mají předem stanovenou cílovou aktivitu nebo částečnou cílovou aktivitu, • ti ti··· ·· · ·· ·· • ti ti ti · ti · ···
239 • · · ··· ··· •ti ti ·· ··· ·· ····
g) jestliže výsledkem kroků popsaných v odstavcích d) nebo f) není protilátka nebo její část vázající se na antigen vykazující předem stanovenou cílovou aktivitu nebo protilátka pouze s částečnou aktivitou, pak způsob dále zahrnuje mutaci dalších aminokyselinových zbytků vybraných ze skupiny zahrnující H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A a L96 na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká druhý soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
h) hodnoceni aktivity druhého souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, aby se stanovilo, zda výsledkem mutace jediného aminokyselinového zbytku vybraného ze skupiny zahrnující H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A a L96 je protilátka nebo její část vázající se na antigen, která má předem stanovenou cílovou aktivitu nebo částečnou aktivitu,
i) kombinování jednotlivých mutací popsaných v kroku g) vykazujících zlepšenou aktivitu postupným způsobem v původní protilátce nebo její části vázající se na antigen za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
j) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí, aby se stanovilo, zda kombinační protilátky nebo jejich části vázající se na antigen mají předem stanovenou cílovou aktivitu nebo částečnou cílovou aktivitu,
k) jestliže výsledkem kroku h) nebo j) není protilátka nebo její část vázající se na antigen mající předem stanovenou cílovou aktivitu nebo protilátka pouze s částečnou aktivitou, způsob dále zahrnuje mutaci dalších aminokyselinových zbytků vybraných ze skupiny zahrnující H33B, H52B a L31A na alespoň dva jiné aminokyselinové f ····
240 zbytky, čímž vzniká třetí soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázající se na antigen,
l) hodnoceni aktivity třetího souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, aby se stanovilo, zda výsledkem mutace jediného aminokyselinového zbytku vybraného ze skupiny zahrnující H33B, H52B a L31A je protilátka nebo její část vázající se na antigen, která má předem stanovenou cílovou aktivitu nebo částečnou aktivitu,
m) kombinování jednotlivých mutací popsaných v kroku k) vykazujících zlepšenou aktivitu postupným způsobem v původní protilátce nebo její části vázající se na antigen za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
n) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, aby se stanovilo, zda kombinační protilátky nebo jejich části vázající se na antigen mají předem stanovenou cílovou aktivitu, čímž se produkuje protilátka nebo její část vázající se na antigen s předem stanovenou cílovou aktivitou.
101. Způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen vyznačuj ící se tím, že zahrnuje:
a) poskytnutí původní protilátky nebo její části vázající se na antigen,
b) výběr preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutačni polohy v oblasti určuj ící komplementaritu (CDR) pro mutaci, čímž se identifikuje vybraná preferovaná poloha selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutačni poloha,
c) jednotlivé mutace uvedené preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutačni polohy na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, přičemž vzniká soubor
241
40 0 é
0000 »0 «·
0· • 0 0 • 0 0 4 • 0 0
d)
e) mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na mutovaných protilátek nebo na antigen vzhledem k původní vázající se na antigen, v případě alespoň jedné jiné antigen, hodnocení aktivity souboru jejich částí vázajících se protilátce nebo její části opakování kroků b) až d) preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy, jestliže není získána požadovaná aktivita protilátky,
f) kombinování jednotlivých mutací vykazujících zlepšenou aktivitu postupným způsobem v původní protilátce nebo její části vázající se na antigen za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a
g) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen.
102. Způsob podle nároku 101, vyznačuj ící se tím, že kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31,
L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96.
103. Způsob podle nároku 101, vyznačuj ící se tím, že hypermutační polohy jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93.
104. Způsob podle nároku 101, vyznačuj ící se tím, že preferované polohy jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30,
L31, L32, L50, L91, L92, L93 a L94.
I
242
*· • • 9 99 • • 9 9 9 • * 9 • « • t 9 • 9 « • • 9 « • • • 9 • « 0 • 99 « 9 9999
105. Způsob podle nároku 101, vyznačuj ící se tím, že kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny
obsahující L50 a L94. 106. Způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázaj ící se na antigen vyzná č u j ící se tím, ž e zahrnuje: a) poskytnutí rekombinantní původní protilátky nebo její
části vázající se na antigen, která se získala selekcí
b) v systému fágového zobrazení, ale dále v uvedeném systému fágového jejíž aktivita není zobrazení zlepšována mutagenezí, výběr preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační komplementaritu (CDR) vybraná preferovaná polohy v oblasti pro mutaci, čímž se určuj ící identifikuj e poloha selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační poloha,
c) jednotlivé mutace uvedené preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, přičemž vzniká soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese uvedeného souboru v systému nefágového zobrazení,
d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen,
e) opakování kroků b) až d) v případě alespoň jedné jiné preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy, jestliže není získána požadovaná aktivita protilátky,
f) kombinování jednotlivých mutací vykazujících zlepšenou aktivitu postupným způsobem v původní protilátce nebo její části vázající se na antigen za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
243
g) hodnoceni aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen.
107. Způsob podle nároku 106, vyznačuj ící se tím, že kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A,
H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31,
L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96.
108. Způsob podle nároku 106, vyznačuj ící se tím, že hypermutační polohy jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93.
109. Způsob podle nároku 106, vyznačující se tím, že preferované polohy selektivní mutageneze jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32,
H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94.
110. Způsob podle nároku 106, vyznačuj ící se tím, že kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny obsahující L50 a L94.
111. Způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen vyznačuj ící se tím, že zahrnuje:
a) poskytnutí rekombinantní původní protilátky nebo její části vázající se na antigen,
b) výběr preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci, čímž se identifikuje vybraná preferovaná poloha selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační poloha,
c) jednotlivé mutace uvedené preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy na alespoň • · ···· ·· · ·· ·· • · · · · ♦ · · · · ·
244 ♦ · · ·· · · · · · ···· dva jiné aminokyselinové zbytky, přičemž vzniká soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese uvedeného souboru ve vhodném expresním systému,
d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vztaženo na původní protilátku nebo její část vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) hodnocení alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky v souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, kde vlastnost nebo charakteristika je taková, kterou je nutné v protilátce zachovat, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou a alespoň jednou zachovanou vlastností nebo charakteristikou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen.
• Způsob . podle nároku 111, vyzná č u j ící s e tím, ž e kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny zahrnuj ící H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L.30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a kde j iná vlastnost nebo charakteristika je vybrána ze
skupiny zahrnující zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny, zachování nezkřížené reaktivity s jinými lidskými tkáněmi, zachování rozeznání epitopu a protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
113. Způsob podle nároku 111, vyznačuj ící se tím, že hypermutační polohy jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30,
L31, L32, L53 a L93 a kde jiná vlastnost nebo charakteristika je vybrána ze skupiny zahrnující zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny, zachování ·· ♦··· ·* • · · · · ·
245 nezkřižené reaktivity s jinými lidskými tkáněmi, zachování rozpoznání epitopu a protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
114. Způsob podle nároku 111, vyznačuj icí se tím, že preferované polohy selektivní mutageneze jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 a kde jiná vlastnost nebo charakteristika je vybrána ze skupiny zahrnující zachování nezkřižené reaktivity s jinými proteiny, zachování nezkřižené reaktivity s jinými lidskými tkáněmi, zachování rozpoznání- epitopu a protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
115. Způsob se tím, zahrnuj ící podle nároku 111, vyznačuj ící polohy jsou vybrány ze skupiny a kde jiná vlastnost nebo ze skupiny zahrnující s jinými jinými lidskými protilátky se imunoglobulinu.
ž e kontaktní
L50 a L94 charakteristika je vybrána reaktivity reaktivity epitopu nezkřižené nezkřižené proteiny, tkáněmi, zlepšení aktivity protilátky antigen ž e zahrnuje:
se na
a)
b) zachování zachování zachování sekvencí blízkou nebo její č u j části ící rozpoznání sekvenci embryonálního
116. Způsob vázaj ící e tím, poskytnutí rekombinantní původní protilátky části vázající se na antigen, v systému fágového zobrazení, ale být dále zlepšována mutagenezi nebo která byla získána jejíž aktivita v uvedeném její selekcí nemůže systému fágového zobrazení, výběr preferované polohy hypermutační selektivní nebo polohy mutageneze, v oblasti kontaktní určuj ící komplementaritu (CDR) vybraná preferovaná čímž se pro mutaci, poloha selektivní identifikuj e mutageneze, kontaktní nebo hypermutační poloha, ····»· ·· ♦ ·· ·· • · · · · · · « · φ ·
246 φφφ φ · φ φφφ φφ · φφ φφφ φφ φφφφ
c) individuální mutace uvedené preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, přičemž vzniká soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese uvedeného souboru v systému nefágového zobrazení,
d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) hodnocení alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky, souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, kde vlastnost nebo charakteristika je taková, kterou je nutné zachovat, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou a alespoň jednou zachovanou vlastností nebo charakteristikou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen,
f) opakování kroků popsaných v odstavci a) až e) v případě alespoň jedné jiné preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy,
g) kombinování v původní protilátce nebo v její části vázající se na antigen alespoň dvou individuálních aminokyselinových zbytků zvyšujících aktivitu, které vykazují zlepšenou aktivitu a alespoň jednu zachovanou vlastnost nebo charakteristiku za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a
h) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na • · • · · · • · antigen se zlepšenou aktivitou a alespoň jednou zachovanou vlastností nebo charakteristikou vztaženo
k původní protilátce nebo k její antigen. části vázající se na . Způsob podle nároku 116, vyzná č u j ící se tím, ž e kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny zahrnuj ící H30, H31, H31B, H32, H33 , H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a jiná vlastnost nebo charakteristika je vybrána ze skupiny zahrnuj ící zachování nezkřížené reaktivity s jinými
proteiny, zachování nezkřížené reaktivity s jinými lidskými tkáněmi, zachování rozpoznání epitopu a protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
118. Způsob podle nároku 116, vyznačující se tím, že hypermutační polohy jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93 a jiná vlastnost nebo charakteristika je vybrána ze skupiny zahrnující zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny, zachování nezkřížené reaktivity s jinými lidskými tkáněmi, zachování rozpoznání epitopu a protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
119. Způsob podle nároku 116, vyznačuj ící se tím, že preferované polohy selektivní mutageneze jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 a L94 a jiná vlastnost nebo charakteristika je vybrána ze skupiny zahrnující zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny, zachování nezkřížené reaktivity s jinými lidskými tkáněmi, zachování rozpoznání epitopu a protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
120. Způsob podle nároku 116, vyznačuj ící se tím, že kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny zahrnující L50 a L94 a jiná vlastnost nebo charakteristika
248 je vybrána ze skupiny zahrnující zachování nezkřižené reaktivity s jinými proteiny, zachování nezkřižené reaktivity s jinými lidskými tkáněmi, zachování rozpoznání epitopu a protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
121. Způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen vyznačuj ící se tím, že zahrnuje:
a) poskytnutí rekombinantní původní protilátky nebo její části vázající se na antigen, která byla získána selekcí v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita nemůže být dále zlepšována mutagenezi v uvedeném systému fágového zobrazení,
b) výběr kontaktní nebo hypermutačni polohy v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci, čímž se identifikuje vybraná kontaktní nebo hypermutačni poloha,
c) individuální mutace uvedené vybrané kontaktní nebo hypermutačni polohy alespoň na dva jiné aminokyselinové zbytky, přičemž vzniká soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese uvedeného souboru v systému nefágového zobrazení,
d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo
e) jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající aminokyselinový se na antigen, čímž se identifikuje aktivitu, zbytek zvyšující jedné jiné mutovaných protilátek nebo na antigen vzhledem k původní souboru vlastnost zachovat, vázaj ící vlastnosti nebo vázající se na antigen, kde kterou je nutné nebo její část hodnoceni alespoň charakteristiky u jejich částí vázajících se protilátce nebo její části nebo charakteristika je taková, dokud se nezíská protilátka se na antigen se zlepšenou aktivitou a alespoň ♦ · ♦ ·♦ · · · · ·· ·· • · · · · · · · « · ·
249 • · · ··· · · · • · 9 ·♦ *·· · · ···· jednou zachovanou vlastností nebo charakteristikou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen.
122. Způsob podle nároku 121, vyznačuj ici se tím, že kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny
zahrnuj ici H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a
jiná vlastnost nebo charakteristika je vybrána ze skupiny zahrnující zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny, zachování nezkřížené reaktivity s jinými lidskými tkáněmi, zachování rozpoznání epitopů a protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
123. Způsob podle nároku 121, vyznačuj ici se tím, že hypermutační polohy jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93 a jiná vlastnost nebo charakteristika je vybrána ze skupiny zahrnující zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny, zachování nezkřížené reaktivity s jinými lidskými tkáněmi, zachování rozpoznání epitopů a protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
124. Způsob podle nároku 121, vyznačuj ici se tím, že kontaktní polohy .jsou vybrány ze skupiny zahrnující L50 a L94 a jiná vlastnost nebo charakteristika je vybrána ze skupiny zahrnující zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny, zachování nezkřížené reaktivity s jinými lidskými tkáněmi, zachování rozeznání epitopů a protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
125. Způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen vyznačuj ici se tím, že zahrnuje:
poskytnutí rekombinantní původní protilátky nebo její části vázající se na antigen, která byla získána
250 selekci v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita nemůže být dále zlepšována mutagenezí v uvedeném systému fágového zobrazení, výběr preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy v oblasti komplementaritu (CDR) pro mutaci, čímž se určuj ící identifikuje vybraná preferovaná mutageneze, poloha selektivní kontaktní nebo hypermutační poloha, individuální mutace uvedené preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese uvedeného souboru v systému nefágového zobrazení,
d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) hodnocení alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky v souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, kde vlastnost nebo charakteristika je taková, kterou je nutné zachovat, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou a alespoň jednou zachovanou vlastností nebo charakteristikou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen,
f) opakování kroků popsaných v odstavci a) až e) v případě alespoň jedné jiné preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy,
251
g) kombinování v původní protilátce nebo v její části vázající se na antigen alespoň dvou individuálních aminokyselinových zbytků zvyšujících aktivitu, které vykazují zlepšenou aktivitu a alespoň jednu zachovanou vlastnost nebo charakteristiku za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a
h) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich části vázajících se na antigen vztaženo na původní protilátku nebo její část vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou a alespoň jednou zachovanou vlastností nebo charakteristikou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen.
126. Způsob podle nároku 125, vyznačuj ící se tím, že kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A,
H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31,
L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a jiná vlastnost nebo charakteristika je vybrána ze skupiny zahrnující zachování nezkřížené reaktivity s j inými proteiny, zachování nezkřížené reaktivity s jinými lidskými tkáněmi, zachování rozpoznání epitopu a protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinů.
127. Způsob podle nároku 125, vyznačuj ící se tím, že hypermutační polohy jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30,
L31, L32, L53 a L93 a jiná vlastnost nebo charakteristika je vybrána ze skupiny zahrnující zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny, zachování nezkřížené reaktivity s jinými lidskými tkáněmi, zachování rozpoznání epitopu a protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinů.
··· · ·· ··
252 • · ·· ·
128 .
Způsob podle nároku 125, vyzná č u j ící tím, e preferované polohy selektivní mutageneze j sou vybrány ze skupiny zahrnující
H30, H31,
H31B, H32,
H33,
H52, H56,
H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 a L94 a jiná vlastnost nebo charakteristika je vybrána ze skupiny zahrnující zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny, zachování nezkřížené reaktivity s jinými lidskými tkáněmi, zachování rozpoznání epitopu a protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
129. Způsob podle nároku 125, vyznačující se tím, že kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny zahrnující L50 a L94 a jiná vlastnost nebo charakteristika je vybrána ze skupiny zahrnující zachování nezkřížené reaktivity- s jinými proteiny, zachování nezkřížené reaktivity s jinými lidskými tkáněmi, zachování rozpoznání epitopu a protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.
130. ' Způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen vyznačující se tím, že zahrnuje:
a) poskytnutí původní protilátky nebo její části vázající se na antigen,
b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující
komplementaritu (CDR) pro mutaci v poloze j iné než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50,
L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) individuální mutace uvedené vybrané polohy na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo jejich části vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž ···· ·· · ·· 99
9 9 · 9 9 99 9 9 9 9
253
9 9 9 9 9 9 9 9 9
99 9 99 999 99 9999 se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) hodnocení změn alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky v souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou a alespoň jednou zachovanou vlastností nebo charakteristikou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen.
131. Způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen vyznačuj ící se tím, že zahrnuje:
a) poskytnutí původní protilátky nebo její části vázající se na antigen,
b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující
komplementaritu (CDR) pro mutaci v poloze jiné než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50,
L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) individuální mutace uvedené vybrané polohy na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) opakování kroků popsaných v odstavci b) až d) v případě alespoň jedné jiné polohy v CDR, kterou není poloha vybraná v odstavci b) ani poloha H30, H31, H31B, H32,
H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, ·»·»·· ·· · 44 ··
4 4 · · 4 4 · 4 4 4 4
254 • · · 444444
44 4 ·4 444 ··4444
Η97, Η98, Η101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53,L55,
L91, L92, L93, L94 a L96,
f) kombinováni v původní protilátce nebo v její části vázající se na antigen alespoň dvou individuálních aminokyselinových zbytků zvyšujících aktivitu, které vykazují zlepšenou aktivitu za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a
g) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen se dvěma aminokyselinovými zbytky zvyšujícími aktivitu vztaženo na původní protilátku nebo její část vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou vztaženo k původní protilátce nebo k její části vázající se na antigen.
132. Způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázaj ící se na antigen vyznačující se tím, že zahrnuje:
a) poskytnutí rekombinantní původní protilátky nebo její části vázající se na antigen, která byla získána selekcí v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita nemůže být dále zlepšována mutagenezí v uvedeném systému fágového zobrazení,
b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci v poloze jiné než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50,
L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a
c) individuální mutace uvedené vybrané kontaktní a hypermutační polohy na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese uvedeného souboru v systému nefágového zobrazení,
d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní ·»»··· ·· *» ·· ·· • ♦ * ···· ····
255 * · · ··· · · · ·· · ·· *·· ·« ·<«» protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) hodnocení změn alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky v souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vztaženo k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou a alespoň jednou zachovanou vlastností nebo charakteristikou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen.
133. Způsob zlepšeni aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen vyznačuj íci se t i m, že zahrnuje:
a) poskytnutí původní protilátky nebo její části vázající se na antigen, která byla získána selekcí v sýstému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita nemůže být dále zlepšována mutagenezí v uvedeném systému fágového zobrazení,
b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci v poloze jiné než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96
c) individuální mutace uvedené vybrané kontaktní a hypermutační polohy na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese uvedeného souboru v systému nefágového zobrazení,
d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
256
9 ♦ » »· · • ΦΦ • · ♦ • · * · 9 · • Φ • • · • «4 • ·« *·· • · ·«··
e) opakování kroků popsaných v odstavci b) až d) v případě alespoň jedné jiné polohy v CDR, kterou není poloha vybraná v odstavci b) ani poloha H30, H31, H31B, H32,
H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94,
f) kombinování v původní protilátce nebo v její části vázající se na antigen alespoň dvou individuálních aminokyselinových zbytků zvyšujících aktivitu, které vykazují zlepšenou aktivitu za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a
g) hodnocení aktivity a jiné vlastnosti nebo charakteristik kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen se dvěma aminokyselinovými zbytky zvyšujícími aktivitu vztaženo na původní protilátku nebo její část vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen.
134. Způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen vyznačuj ící se tím, že zahrnuje:
a) poskytnutí původní protilátky nebo její části vázající se na antigen,
b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující
komplementaritu (CDR) pro mutaci v poloze j iné než H30, Η31, Η31Β, Η32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, Η58, Η95, Η96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50,
L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) individuální mutace uvedené vybrané polohy na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
257
d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo částí vázajících se na antigen vztaženo na část vázající se na aminokyselinový zbytek j ej ich původní antigen, protilátku nebo její čímž se identifikuje zvyšuj ici aktivitu,
e) hodnoceni změn alespoň jedné charakteristiky u souboru mutovaných protilátek nebo jiné vlastnosti nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, přičemž je nutné vlastnost nebo charakteristiku zachovat, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen.
135. Způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen vyznačuj ící se tím, že zahrnuje:
a) poskytnutí původní protilátky nebo její části vázající se na antigen,
b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci v poloze jiné než H30,
H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) individuální mutace uvedené vybrané polohy na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,
d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu, • ·
258 ·· hodnocení změn alespoň jedné vlastnosti nebo
g)
h)
136.
charakteristiky v jejich částí protilátce nebo její části vázající se na antigen, opakování kroků popsaných v odstavci b) až e) v alespoň jedné jiné polohy v CDR, kterou není vybraná v odstavci b) ani souboru mutovaných protilátek vázajících se na antigen vzhledem k nebo původní případě poloha poloha H30, H31, H31B,
H32,
H33,
H97,
L91,
H35,
H98,
L92,
H50, H52,
H101, L30,
L93, L94 a
H52A,
L31,
L96,
H53, H54,
L32, L34, kombinování v původní protilátce
H56,
L50, nebo
H58, H95,
L52, L53, vázající se na antigen alespoň aminokyselinových zbytků zvyšujících aktivitu, vykazují zlepšenou aktivitu, ale neovlivňují jednu jinou vlastnost nebo kombinačních protilátek nebo na antigen s alespoň jednou charakteristikou a dvou
H96,
L55, v její individuálních části které alespoň charakteristiku, za vzniku jejich částí vázajících se zachovanou vlastností nebo hodnocení aktivity a zachování alespoň charakteristiky kombinačních protilátek vázajících se na antigen zbytky zvyšujícími aktivitu nebo její části vázající se protilátka zlepšenou vlastností jedné vlastnosti nebo jejich částí aminokyselinovými vzhledem k původní protilátce na antigen, dokud se dvěma se nezíská nebo její část aktivitou a vázaj ící alespoň nebo charakteristikou nebo její části vázající sé na j ednou vzhledem antigen se zachovanou k původní protilátce zlepšeni aktivity protilátky antigen se na antigen.
Způsob vázaj ící se t í nebo m,
a) poskytnutí se na její části č u j ící ž e zahrnuje:
části vázající se původní protilátky nebo její na antigen, která byla získána selekcí v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita nemůže být dále zlepšována mutagenezí v uvedeném systému fágového zobrazení,
b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující
259
komplementaritu (CDR) pro mutaci v poloze j iné než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50,
L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) individuální mutace uvedené vybrané polohy alespoň na dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese v systému nefágového zobrazení,
d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) hodnocení změn alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky u souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen.
137. Způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen vyznačuj ící se tím, že zahrnuje:
a) poskytnutí původní protilátky nebo její části vázající se na antigen, která byla získána selekcí v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita nemůže být dále zlepšována mutagenezi v uvedeném systému fágového zobrazení,
b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci v poloze jiné než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
260
c) individuální mutace uvedené vybrané polohy alespoň na dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese v systému nefágového zobrazení,
d) hodnocení aktivity a zachování alespoň jedné vlastnosti nebo charakteristiky u souboru mutovaných protilátek nebo jejich části vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se . identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,
e) opakování kroků popsaných v odstavci b) až d) v případě alespoň jedné jiné polohy v CDR, kterou není poloha
vybraná v odstavci b) ani poloha H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54 , H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34 , L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96, kombinování v původní protilátce nebo v její části vázaj ící se na antigen alespoň dvou individuálních aminokyselinových zbytků zvyšujících aktivitu, které
vykazují zlepšenou aktivitu, ale neovlivňují alespoň jednu jinou vlastnost nebo charakteristiku, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a
g) hodnocení aktivity a zachování alespoň jedné vlastnosti nebo charakteristiky kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen se dvěma aminokyselinovými
138.
zbytky zvyšujícími aktivitu nebo její části vázající se protilátka zlepšenou vlastností nebo její část aktivitou a vzhledem k původní protilátce na antigen, dokud vázaj ící alespoň nebo charakteristikou nebo její se na j ednou vzhledem se nezíská antigen se zachovanou protilátce
Způsob podle nároků části
130, vázaj ící se na
131, 132, 133, nebo 137, vyzná ící se t k původní antigen.
134, 135, 136 i m, že jiná vlastnost nebo charakteristika je
261 zahrnuj ici proteiny, zachování nezkřížené zachování nezkřížené reaktivity lidskými tkáněmi, zachování rozeznání epitopu a s j inými protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu. 139. Způsob detekce lidského IL-12, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje kontakt lidského IL-12 s protilátkou nebo její částí vázající se na antigen podle kteréhokoli z nároků 1 až 52, 74 až 83 a 87 tak, že je detekován lidský IL-12.
140. Způsob podle nároku 139, vyznačuj ící s e tím, ž e lidský IL-12 je detekován in vitro. 141. Způsob podle nároku 139, vyznačuj i c i s e tím, ž e lidský IL-12 ! je detekován v biologickém
vzorku pro diagnostické účely.
142 . Použití protilátky nebo její části vázající se na antigen podle kteréhokoli z nároků 1 až 52, 74 až 83 a 87 při terapii. 143 . Použití protilátky nebo její části vázající se na antigen podle libovolného z nároků 1 až 52, 74 až 83 a 87 při
výrobě léčiva pro léčbu poruchy, při které aktivita IL-12 je škodlivá.
144. Použití podle nároku 143, kde porucha je vybrána ze skupiny zahrnující reumatoidní artritidu, osteoartritidu, chronickou artritidu u mladistvých, lymskou artritidu, psoriatickou artritidu, reaktivní artritidu, spondyloartropatii, ankylozující spondylitidu, systémový lupus erythematosus,
Crohnovu chorobu, ulcerativní kolitidu, zánětlivé onemocnění střev, roztroušenou sklerózu, inzulín dependentní cukrovku, tyreoiditidu, astma, alergické onemocnění, psoriázu, dermatitidu skleroderma, zánět štítné žlázy, onemocnění transplantát versus hostitel, odmítnutí transplantovaného orgánu, akutní a chronické imunitní onemocnění spojené s transplantací i
262 orgánu, sarkoidózu, aterosklerózu, diseminovanou intravaskulárni koagulaci, Kawasakiho chorobu, exoftlamičkou strumu, nefrotický syndrom, chronický únavový syndrom, nodózní polyarteritidu, Wegenerovu granulomatózu, Henoch-Schoenleinovu purpuru, mikroskopickou vaskulitidu ledvin, chronickou aktivní hepatitidu, Sjogrenův syndrom, uveitidu, sepsi, septický šok, syndrom toxického šoku, syndrom (akutního) stiženého dýchání u dospělých, kachexii, infekční onemocnění, parazitické onemocnění, syndrom získané imunitní nedostatečnosti, akutní myelitis transversa, těžkou myastenii, Hungtingtonovu choreu, Parkinsonovu chorobu, Alzheimerovu chorobu, mrtvici, primární biliární cirhózu, fibrotické onemocnění plic, hemolytickou anémii, zhoubné bujení, selhání srdce a infarkt myokardu.
145. Použití choroba. podle nároku 143, kde poruchou j e Crchnova 146 . Použití skleróza. podle nároku 143, kde poruchou je roztroušená 147 . Použití artritida. podle nároku 143, kde poruchou je reumatoidní
« ♦
CZ20013434A 1999-03-25 2000-03-24 Lidské protilátky, které se vází na lidský IL-12 a zpusoby jejich produkce CZ303725B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12660399P 1999-03-25 1999-03-25

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20013434A3 true CZ20013434A3 (cs) 2002-08-14
CZ303725B6 CZ303725B6 (cs) 2013-04-03

Family

ID=22425740

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20013434A CZ303725B6 (cs) 1999-03-25 2000-03-24 Lidské protilátky, které se vází na lidský IL-12 a zpusoby jejich produkce

Country Status (29)

Country Link
EP (4) EP2301970A1 (cs)
JP (3) JP4841038B2 (cs)
KR (6) KR20130105766A (cs)
CN (4) CN101066997B (cs)
AR (3) AR043274A1 (cs)
AU (1) AU3921600A (cs)
BG (2) BG66399B1 (cs)
BR (1) BR0009323A (cs)
CA (3) CA2365281C (cs)
CY (2) CY1113326T1 (cs)
CZ (1) CZ303725B6 (cs)
DK (1) DK2168984T3 (cs)
ES (1) ES2390849T3 (cs)
HK (1) HK1142083A1 (cs)
HU (1) HUP0200575A3 (cs)
IL (3) IL145134A0 (cs)
LU (1) LU92159I2 (cs)
MX (1) MXPA01009645A (cs)
MY (2) MY145191A (cs)
NO (3) NO334828B1 (cs)
NZ (5) NZ611563A (cs)
PL (2) PL409839A1 (cs)
PT (1) PT2168984E (cs)
SI (1) SI2168984T1 (cs)
SK (1) SK288082B6 (cs)
TR (5) TR200501367T2 (cs)
TW (5) TWI339209B (cs)
WO (1) WO2000056772A1 (cs)
ZA (1) ZA200107774B (cs)

Families Citing this family (160)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130105766A (ko) * 1999-03-25 2013-09-25 애보트 게엠베하 운트 콤파니 카게 사람 ｉｌ-12에 결합하는 사람 항체 및 이의 제조방법
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
US7883704B2 (en) * 1999-03-25 2011-02-08 Abbott Gmbh & Co. Kg Methods for inhibiting the activity of the P40 subunit of human IL-12
AU2001236807A1 (en) 2000-02-10 2001-08-20 Abbott Laboratories Antibodies that bind human interleukin-18 and methods of making and using
CA2411374C (en) 2000-06-29 2012-10-30 Abbott Laboratories Dual specificity antibodies and methods of making and using
US6902734B2 (en) 2000-08-07 2005-06-07 Centocor, Inc. Anti-IL-12 antibodies and compositions thereof
OA12589A (en) 2001-01-05 2006-06-08 Abgenix Inc Antibodies to insulin-like growth factor i receptor.
DK1432431T3 (en) 2001-10-04 2017-07-10 Genetics Inst Llc Methods and compositions for modulating interleukin-21 activity
KR100913714B1 (ko) 2001-11-08 2009-08-24 패시트 바이오테크 코포레이션 Ｉｇｇ 항체의 안정한 액상 약학 제형물
WO2003082206A2 (en) * 2002-03-26 2003-10-09 Centocor, Inc. Multiple sclerosis-related immunoglobulin derived proteins, compositions, methods and uses
AU2003218432A1 (en) * 2002-03-26 2003-10-13 Centocor, Inc. Diabetes-related immunoglobulin derived proteins, compositions, methods and uses
US20040033228A1 (en) 2002-08-16 2004-02-19 Hans-Juergen Krause Formulation of human antibodies for treating TNF-alpha associated disorders
KR101053412B1 (ko) 2002-10-30 2011-08-01 제넨테크, 인크. Ｉｌ―１７ 생성의 억제
WO2004041865A2 (en) 2002-11-08 2004-05-21 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies
US9320792B2 (en) 2002-11-08 2016-04-26 Ablynx N.V. Pulmonary administration of immunoglobulin single variable domains and constructs thereof
AU2003286004A1 (en) 2002-11-08 2004-06-07 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against interferon- gamma and uses therefor
US20060034845A1 (en) 2002-11-08 2006-02-16 Karen Silence Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
AU2012202845B2 (en) * 2003-02-10 2014-09-04 Biogen Ma Inc. Immunoglobulin formulation and method of preparation thereof
JP4728948B2 (ja) 2003-02-10 2011-07-20 エラン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 免疫グロブリン製剤およびその調製の方法
CN1777621A (zh) 2003-03-14 2006-05-24 Wyeth公司 抗人il－21受体的抗体及其应用
WO2005016967A2 (en) 2003-08-13 2005-02-24 Pfizer Products Inc. Modified human igf-1r antibodies
FR2859725B1 (fr) 2003-09-16 2006-03-10 Neovacs Procede a haut rendement pour l'obtention d'anticorps humains neutralisant l'activite biologique d'une cytokine humaine
US20050100965A1 (en) 2003-11-12 2005-05-12 Tariq Ghayur IL-18 binding proteins
DE10353175A1 (de) 2003-11-14 2005-06-16 Müller-Hermelink, Hans Konrad, Prof. Dr. Humaner monoklonaler Antikörper mit fettsenkender Wirkung
EP1531162A1 (en) 2003-11-14 2005-05-18 Heinz Vollmers Adenocarcinoma specific antibody SAM-6, and uses thereof
AU2005230848B9 (en) * 2004-03-31 2011-06-02 Genentech, Inc. Humanized anti-TGF-beta antibodies
ME00226B (me) 2004-07-15 2011-02-10 Medarex Llc Humana anti-ngf neutrališuća antitijela kao selektivni inhibitori ngf signalne kaskade
SG158150A1 (en) 2004-12-21 2010-01-29 Centocor Inc Anti-il-12 antibodies, epitopes, compositions, methods and uses
HUE042689T2 (hu) 2005-02-08 2019-07-29 Genzyme Corp TGFbéta elleni antitestek
EP1849011A2 (en) 2005-02-14 2007-10-31 University of Pittsburgh of the Commonwealth System of Higher Education Use of il-17f in diagnosis and therapy of airway inflammation
EP1848743A2 (en) 2005-02-14 2007-10-31 Wyeth Interleukin-17f antibodies and other il-17f signaling antagonists and uses therefor
GT200600148A (es) 2005-04-14 2006-11-22 Metodos para el tratamiento y la prevencion de fibrosis
CN101379085B (zh) * 2005-06-30 2013-03-27 Abbvie公司 Il-12/p40结合蛋白
EP2397498A3 (en) 2005-07-18 2013-11-27 Amgen, Inc Human anti-B7RP1 neutralizing antibodies
BRPI0615026A8 (pt) 2005-08-19 2018-03-06 Abbott Lab imunoglobulina de domínio variável duplo e seus usos
EP2500359A3 (en) 2005-08-19 2012-10-17 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP1928905B1 (de) 2005-09-30 2015-04-15 AbbVie Deutschland GmbH & Co KG Bindungsdomänen von proteinen der repulsive guidance molecule (rgm) proteinfamilie und funktionale fragmente davon sowie deren verwendung
KR101667623B1 (ko) 2005-11-30 2016-10-19 애브비 인코포레이티드 아밀로이드 베타 단백질에 대한 모노클로날 항체 및 이의 용도
PL1954718T3 (pl) 2005-11-30 2015-04-30 Abbvie Inc Przeciwciała skierowane przeciwko A globulomerowi, ich reszty wiążące antygeny, odpowiednie hybrydomy, kwasy nukleinowe, wektory, komórki gospodarze, sposoby wytwarzania tych przeciwciał, kompozycje zawierające te przeciwciała, zastosowania tych przeciwciał i sposoby stosowania tych przeciwciał
TW200744634A (en) 2006-02-21 2007-12-16 Wyeth Corp Methods of using antibodies against human IL-22
TWI417301B (zh) 2006-02-21 2013-12-01 Wyeth Corp 對抗人類介白素-２２（ｉｌ-２２）之抗體及其用途
CN101512008B (zh) 2006-09-08 2015-04-01 艾伯维巴哈马有限公司 白介素-13结合蛋白
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
EP2114443A4 (en) 2006-12-29 2011-08-10 Abbott Lab IL-1A / IL-1B ANTIBODY WITH DOUBLE SPECIFICITY
CN104524567A (zh) * 2007-01-16 2015-04-22 阿布维公司 用于治疗银屑病的方法
EP2124952A2 (en) 2007-02-27 2009-12-02 Abbott GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
WO2008121301A1 (en) 2007-03-29 2008-10-09 Abbott Laboratories Crystalline anti-human il-12 antibodies
WO2009005673A1 (en) * 2007-06-28 2009-01-08 Schering Corporation Anti-igf1r
EP2205276A4 (en) * 2007-09-28 2012-08-15 Janssen Biotech Inc ANTI-IL-12 / 23P40 ANTIBODIES, EPITOPES, FORMULATIONS, COMPOSITIONS, METHODS AND USES
EP2050764A1 (en) * 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
AU2008328781A1 (en) 2007-11-27 2009-06-04 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against heterodimeric cytokines and/or their receptors and polypeptides comprising the same
US8962803B2 (en) 2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof
KR20100126515A (ko) * 2008-03-18 2010-12-01 아보트 러보러터리즈 건선의 치료방법
US9029508B2 (en) 2008-04-29 2015-05-12 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20090317400A1 (en) 2008-05-05 2009-12-24 Krzysztof Masternak Anti-IL 17A/IL-17F Cross-Reactive Antibodies and Methods of Use Thereof
ES2579554T3 (es) 2008-05-09 2016-08-12 Abbvie Deutschland Gmbh & Co Kg Anticuerpos para el receptor de productos terminales de glicación avanzada (RAGE) y usos de los mismos
CN103656638B (zh) * 2008-05-30 2016-04-27 埃克斯生物科技公司 白细胞介素-1α抗体及使用方法
PE20100092A1 (es) 2008-06-03 2010-03-12 Abbott Lab Inmunoglobulina con dominio variable dual y usos de la misma
PE20100054A1 (es) 2008-06-03 2010-03-03 Abbott Lab Inmunoglobulina con dominio variable dual
EP2810654A1 (en) 2008-07-08 2014-12-10 AbbVie Inc. Prostaglandin E2 binding proteins and uses thereof
RU2011104348A (ru) 2008-07-08 2012-08-20 Эбботт Лэборетриз (Us) Иммуноглобулины с двойным вариабельным доменом против простагландина е2 и их применение
AU2009314311B2 (en) 2008-10-29 2013-01-10 Ablynx N.V. Methods for purification of single domain antigen binding molecules
BR122018013284B1 (pt) 2008-10-29 2022-03-03 Ablynx N.V Formulações de moléculas de ligação ao antígeno de domínio único, seu método de formulação e seu uso, kit ou artigo de fabricação, bem como método para preparar uma formulação reconstituída contendo uma molécula de sdab
US20100172862A1 (en) * 2008-11-28 2010-07-08 Abbott Laboratories Stable antibody compositions and methods of stabilizing same
US8030026B2 (en) * 2009-02-24 2011-10-04 Abbott Laboratories Antibodies to troponin I and methods of use thereof
RU2015132478A (ru) 2009-03-05 2015-12-10 Эббви Инк. Связывающие il-17 белки
PE20120815A1 (es) 2009-05-05 2012-07-08 Novimmune Sa Anticuerpos anti il-17f y metodos de uso de los mismos
EP3029070A1 (en) 2009-08-29 2016-06-08 AbbVie Inc. Therapeutic dll4 binding proteins
NZ598929A (en) 2009-09-01 2014-05-30 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2011032148A1 (en) * 2009-09-14 2011-03-17 Abbott Laboratories Methods for treating psoriasis
AR078651A1 (es) 2009-10-15 2011-11-23 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
TW201121568A (en) 2009-10-31 2011-07-01 Abbott Lab Antibodies to receptor for advanced glycation end products (RAGE) and uses thereof
WO2011051466A1 (en) 2009-11-02 2011-05-05 Novartis Ag Anti-idiotypic fibronectin-based binding molecules and uses thereof
MX2012006560A (es) 2009-12-08 2012-10-05 Abbott Gmbh & Co Kg Anticuerpos monoclonales contra la proteina rgm a para utilizarse en el tratamiento de degeneracion de capa de fibra de nervio retinal.
KR102284780B1 (ko) 2009-12-09 2021-08-02 미쓰비시 타나베 파마 코퍼레이션 Ｔ 세포 활성화 저해제, 이것을 함유하는 의약 조성물 및 ｔ 세포 활성화 저해 물질의 스크리닝 방법
MY160628A (en) 2010-03-02 2017-03-15 Abbvie Inc Therapeutic DLL4 Binding Proteins
MX336196B (es) 2010-04-15 2016-01-11 Abbvie Inc Proteinas de union a amiloide beta.
KR101539683B1 (ko) 2010-05-14 2015-07-30 애브비 인코포레이티드 Ｉｌ－１ 결합 단백질
WO2012006500A2 (en) 2010-07-08 2012-01-12 Abbott Laboratories Monoclonal antibodies against hepatitis c virus core protein
UY33492A (es) 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
MY160445A (en) 2010-08-03 2017-03-15 Abbvie Inc Dual Variable Domain Immunoglobulins And Uses Thereof
MX358739B (es) 2010-08-14 2018-09-03 Abbvie Inc Star Proteinas de union a amiloide beta.
ES2910305T3 (es) 2010-08-19 2022-05-12 Zoetis Belgium S A Anticuerpos anti-NGF y su uso
JP2013539364A (ja) 2010-08-26 2013-10-24 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
KR101879885B1 (ko) 2010-09-17 2018-07-18 박스알타 인코퍼레이티드 약산성 내지 중성 ｐｈ에서 히스티딘을 갖는 수성 제형을 통한 면역글로불린의 안정화
BR112013015944A2 (pt) 2010-12-21 2018-06-19 Abbvie Inc imunoglobulinas de domínio duplo variável il-1 alpha e beta biespecífico e seus usos.
TW201307388A (zh) 2010-12-21 2013-02-16 Abbott Lab Ｉｌ－１結合蛋白
MX2014000531A (es) 2011-07-13 2014-12-05 Abbvie Inc Metodos y composiciones para el tratamiento del asma usando anticuerpos anti-il-13.
SG11201401791WA (en) 2011-10-24 2014-08-28 Abbvie Inc Immunobinders directed against sclerostin
AU2012352168C1 (en) 2011-12-14 2018-01-25 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Composition and method for the diagnosis and treatment of iron-related disorders
CN104136462B (zh) 2011-12-14 2017-06-09 艾伯维德国有限责任两合公司 用于诊断和治疗铁相关病症的组合物和方法
EP2797955A2 (en) 2011-12-30 2014-11-05 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins against il-13 and/or il-17
IL297229A (en) 2012-01-27 2022-12-01 Abbvie Inc The composition and method for the diagnosis and treatment of diseases related to the degeneration of nerve cells
SI2852615T1 (sl) 2012-05-22 2019-02-28 Bristol-Myers Squibb Company IL-17A/F IL-23 bispecifična protitelesa in njihova uporaba
EP2859018B1 (en) 2012-06-06 2021-09-22 Zoetis Services LLC Caninized anti-ngf antibodies and methods thereof
AR091755A1 (es) 2012-07-12 2015-02-25 Abbvie Inc Proteinas de union a il-1
KR102238677B1 (ko) 2012-09-07 2021-04-12 코히러스 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 아달리무맙의 안정한 수성 제형
KR20210111353A (ko) 2012-11-01 2021-09-10 애브비 인코포레이티드 항-ｖｅｇｆ／ｄｌｌ4 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
US9550986B2 (en) 2012-12-21 2017-01-24 Abbvie Inc. High-throughput antibody humanization
KR102068222B1 (ko) 2013-02-20 2020-01-21 삼성디스플레이 주식회사 증착용 마스크 제조방법
US9458246B2 (en) 2013-03-13 2016-10-04 Amgen Inc. Proteins specific for BAFF and B7RP1
JOP20140087B1 (ar) 2013-03-13 2021-08-17 Amgen Inc بروتينات مخصصة ل baff و b7rp1 وإستخداماتها
US9371374B2 (en) 2013-03-14 2016-06-21 Abbott Laboratories HCV core lipid binding domain monoclonal antibodies
CN105228649B (zh) 2013-03-14 2019-01-18 雅培制药有限公司 Hcv抗原-抗体组合测定和方法以及用在其中的组合物
MX2015012824A (es) 2013-03-14 2016-06-24 Abbott Lab Antigenos recombinantes ns3 del vhc y mutantes de los mismos para la deteccion mejorada de anticuerpos.
EP2970459A2 (en) 2013-03-15 2016-01-20 AbbVie Inc. Dual specific binding proteins directed against il-1beta and il-17
US9469686B2 (en) 2013-03-15 2016-10-18 Abbott Laboratories Anti-GP73 monoclonal antibodies and methods of obtaining the same
CN103275222B (zh) * 2013-05-15 2014-04-16 中山康方生物医药有限公司 一种阻断白介素12 p40功能的单克隆抗体及其编码基因和应用
WO2014197885A2 (en) 2013-06-07 2014-12-11 Duke University Inhibitors of complement factor h
MX2016008472A (es) * 2013-12-26 2016-10-28 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Anticuero monoclonal neutralizador de anti-il-33-humana.
EP3200775B1 (en) * 2014-10-03 2019-11-20 Novartis AG Combination therapies
BR112017007393A2 (pt) * 2014-10-18 2017-12-19 Pfizer composições de anticorpo anti-il-7r
AR102417A1 (es) 2014-11-05 2017-03-01 Lilly Co Eli Anticuerpos biespecíficos anti-tnf- / anti-il-23
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
SI3303395T1 (sl) 2015-05-29 2020-03-31 Abbvie Inc. Protitelesa proti CD40 in njihove uporabe
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
US11229702B1 (en) 2015-10-28 2022-01-25 Coherus Biosciences, Inc. High concentration formulations of adalimumab
CR20180365A (es) 2015-12-16 2018-09-28 Amgen Inc PROTEÍNAS DE UNIÓN AL ANTÍGENO BISPECÍFICO DE ANTI-TL1A/ANTI-TNF-a Y SUS USOS
CN105825196B (zh) * 2016-03-28 2020-01-31 联想(北京)有限公司 一种信息处理方法和电子设备
US10765724B2 (en) 2016-03-29 2020-09-08 Janssen Biotech, Inc. Method of treating psoriasis with increased interval dosing of anti-IL12/23 antibody
US11071782B2 (en) 2016-04-20 2021-07-27 Coherus Biosciences, Inc. Method of filling a container with no headspace
CA3036564A1 (en) * 2016-09-23 2018-03-29 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific antibody molecules comprising lambda and kappa light chains
JP2019530875A (ja) 2016-10-03 2019-10-24 アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 患者サンプルにおけるｕｃｈ−ｌ１状況を評価する改善された方法
US11016092B2 (en) 2017-03-23 2021-05-25 Abbott Laboratories Methods for aiding in the diagnosis and determination of the extent of traumatic brain injury in a human subject using the early biomarker ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1
WO2018191531A1 (en) 2017-04-15 2018-10-18 Abbott Laboratories Methods for aiding in the hyperacute diagnosis and determination of traumatic brain injury in a human subject using early biomarkers
BR112019022476A2 (pt) 2017-04-28 2020-05-12 Abbott Laboratories Métodos para o auxílio no diagnóstico e determinação hiperagudos de lesão cerebral traumática usando biomarcadores iniciais em pelo menos duas amostras a partir do mesmo ser humano
US10865238B1 (en) 2017-05-05 2020-12-15 Duke University Complement factor H antibodies
AU2018272054A1 (en) 2017-05-25 2019-09-26 Abbott Laboratories Methods for aiding in the determination of whether to perform imaging on a human subject who has sustained or may have sustained an injury to the head using early biomarkers
JP7269182B2 (ja) 2017-05-30 2023-05-08 アボット・ラボラトリーズ 心臓トロポニンｉ及び早期バイオマーカーを使用する、ヒト対象における軽度外傷性脳損傷を診断及び査定する一助となるための方法
US11169159B2 (en) 2017-07-03 2021-11-09 Abbott Laboratories Methods for measuring ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 levels in blood
JP7177446B2 (ja) 2017-08-31 2022-11-24 田辺三菱製薬株式会社 Ｉｌ－３３アンタゴニストを含む子宮内膜症治療剤
TW201922780A (zh) * 2017-09-25 2019-06-16 美商健生生物科技公司 以抗ｉｌ１２／ｉｌ２３抗體治療狼瘡之安全且有效之方法
AU2018378084A1 (en) 2017-12-09 2020-05-14 Abbott Laboratories Methods for aiding in diagnosing and evaluating a traumatic brain injury in a human subject using a combination of GFAP and UCH-L1
WO2019113525A2 (en) 2017-12-09 2019-06-13 Abbott Laboratories Methods for aiding in the diagnosis and evaluation of a subject who has sustained an orthopedic injury and that has or may have sustained an injury to the head, such as mild traumatic brain injury (tbi), using glial fibrillary acidic protein (gfap) and/or ubiquitin carboxy-terminal hydrolase l1 (uch-l1)
WO2019118779A2 (en) * 2017-12-13 2019-06-20 The Research Foundation For The State University Of New York Peptides and other agents for treating pain and increasing pain sensitivity
AU2019234213A1 (en) 2018-03-12 2020-09-03 Zoetis Services Llc Anti-NGF antibodies and methods thereof
EP3793521A4 (en) 2018-05-18 2022-02-23 Janssen Biotech, Inc. SAFE AND EFFECTIVE METHOD OF TREATING LUPUS WITH AN ANTI-IL12/IL23 ANTIBODY
DK3883606T5 (da) 2018-09-24 2024-01-02 Janssen Biotech Inc Sikker og effektiv fremgangsmåde til behandling af colitis ulcerosa med anti-il12/il23-antistof
CN111057719B (zh) * 2018-10-17 2022-11-11 南京大学 一种高效的小鼠骨髓来源巨噬细胞的转染方法及其应用
MX2021014302A (es) 2019-05-23 2022-01-04 Janssen Biotech Inc Metodo para tratar la enfermedad inflamatoria del intestino con una terapia de combinacion de anticuerpos contra il-23 y tnf alfa.
CN110204736A (zh) * 2019-06-07 2019-09-06 河南师范大学 一步合成不同形貌Pb-MOF金属有机骨架的方法
US20230061973A1 (en) 2020-02-05 2023-03-02 Larimar Therapeutics, Inc. Tat peptide binding proteins and uses thereof
CN111471655B (zh) * 2020-03-19 2023-07-07 湖州正熙医学检验实验室有限公司 抗人il12/23稳转细胞株及其构建方法和应用
WO2022031804A1 (en) 2020-08-04 2022-02-10 Abbott Laboratories Improved methods and kits for detecting sars-cov-2 protein in a sample
WO2022119841A1 (en) 2020-12-01 2022-06-09 Abbott Laboratories Use of one or more biomarkers to determine traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography scan that is negative for a tbi
WO2023102384A1 (en) 2021-11-30 2023-06-08 Abbott Laboratories Use of one or more biomarkers to determine traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography scan that is negative for a tbi
EP4271998A1 (en) 2020-12-30 2023-11-08 Abbott Laboratories Methods for determining sars-cov-2 antigen and anti-sars-cov-2 antibody in a sample
BR112023024169A2 (pt) 2021-05-18 2024-02-06 Abbott Lab Métodos para avaliar lesão cerebral em um indivíduo pediátrico
EP4356129A1 (en) 2021-06-14 2024-04-24 Abbott Laboratories Methods of diagnosing or aiding in diagnosis of brain injury caused by acoustic energy, electromagnetic energy, an over pressurization wave, and/or blast wind
CN113321729B (zh) * 2021-07-01 2022-08-30 东大生物技术(苏州)有限公司 一组il-12单克隆抗体及其医药用途
WO2023034777A1 (en) 2021-08-31 2023-03-09 Abbott Laboratories Methods and systems of diagnosing brain injury
WO2023056268A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Abbott Laboratories Methods and systems of diagnosing brain injury
AU2022413677A1 (en) 2021-12-17 2024-06-27 Abbott Laboratories Systems and methods for determining uch-l1, gfap, and other biomarkers in blood samples
WO2023129942A1 (en) 2021-12-28 2023-07-06 Abbott Laboratories Use of biomarkers to determine sub-acute traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography (ct) scan that is negative for a tbi or no head ct scan
WO2023150652A1 (en) 2022-02-04 2023-08-10 Abbott Laboratories Lateral flow methods, assays, and devices for detecting the presence or measuring the amount of ubiquitin carboxy-terminal hydrolase l1 and/or glial fibrillary acidic protein in a sample
KR20230171660A (ko) 2022-06-14 2023-12-21 오상민 공기 살균 정화기
WO2024006876A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Abbott Laboratories Magnetic point-of-care systems and assays for determining gfap in biological samples
WO2024059708A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Abbott Laboratories Biomarkers and methods for differentiating between mild and supermild traumatic brain injury

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
ES2118066T3 (es) 1989-10-05 1998-09-16 Optein Inc Sintesis y aislamiento, exentos de celulas, de nuevos genes y polipeptidos.
DK0585287T3 (da) 1990-07-10 2000-04-17 Cambridge Antibody Tech Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
CA2405246A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with alterred binding properties
DE69233750D1 (de) 1991-04-10 2009-01-02 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer Rezeptoren mittels Phagemiden
WO1994004679A1 (en) * 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
US5734014A (en) * 1992-08-11 1998-03-31 Tsumura & Co. Elafin derivative
US5654168A (en) 1994-07-01 1997-08-05 Basf Aktiengesellschaft Tetracycline-inducible transcriptional activator and tetracycline-regulated transcription units
US5464758A (en) 1993-06-14 1995-11-07 Gossen; Manfred Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters
EP0659766A1 (en) * 1993-11-23 1995-06-28 Schering-Plough Human monoclonal antibodies against human cytokines and methods of making and using such antibodies
ZA95960B (en) * 1994-03-14 1995-10-10 Genetics Inst Use of interleukin-12 antagonists in the treatment of autoimmune diseases
KR20050085971A (ko) * 1995-04-27 2005-08-29 아브게닉스, 인크. 면역화된 제노마우스 유래의 인간 항체
US5853697A (en) 1995-10-25 1998-12-29 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health & Human Services Methods of treating established colitis using antibodies against IL-12
ES2213209T3 (es) * 1996-11-15 2004-08-16 Kennedy Institute Of Rheumatology Supresion de tnfalfa e il-12 en terapia.
KR20130105766A (ko) * 1999-03-25 2013-09-25 애보트 게엠베하 운트 콤파니 카게 사람 ｉｌ-12에 결합하는 사람 항체 및 이의 제조방법
US9601381B2 (en) 2013-12-05 2017-03-21 Stmicroelectronics (Crolles 2) Sas Method for the formation of a finFET device with epitaxially grown source-drain regions having a reduced leakage path

Also Published As

Publication number Publication date
TWI410433B (zh) 2013-10-01
CN101921772B (zh) 2013-03-27
JP2012010702A (ja) 2012-01-19
NO20131482L (no) 2001-11-26
PL351842A1 (en) 2003-06-16
NZ592550A (en) 2012-12-21
TW200738749A (en) 2007-10-16
PL409839A1 (pl) 2015-03-30
NO2014024I1 (no) 2014-09-18
CA2365281A1 (en) 2000-09-28
JP2002542770A (ja) 2002-12-17
NO334828B1 (no) 2014-06-10
MY142984A (en) 2011-02-14
EP2168984A1 (en) 2010-03-31
CA2365281C (en) 2009-08-04
TR200102715T2 (tr) 2002-09-23
NO20014605D0 (no) 2001-09-21
EP2301970A1 (en) 2011-03-30
BG111337A (bg) 2013-02-28
EP2319870A3 (en) 2011-10-26
KR20020026416A (ko) 2002-04-10
PT2168984E (pt) 2012-09-24
CZ303725B6 (cs) 2013-04-03
NO20014605L (no) 2001-11-26
JP4841038B2 (ja) 2011-12-21
TR200802278T2 (tr) 2008-08-21
PL218748B1 (pl) 2015-01-30
KR100818066B1 (ko) 2008-03-31
CN100439399C (zh) 2008-12-03
JP2014138594A (ja) 2014-07-31
TR200501367T2 (tr) 2005-09-21
NZ513945A (en) 2001-09-28
BR0009323A (pt) 2002-01-08
MY145191A (en) 2011-12-30
TR200503572T2 (tr) 2006-04-21
EP1175446A1 (en) 2002-01-30
LU92159I2 (fr) 2013-04-29
DK2168984T3 (da) 2012-12-10
TWI365193B (en) 2012-06-01
KR20120091477A (ko) 2012-08-17
KR20100021669A (ko) 2010-02-25
CN101066997B (zh) 2013-03-27
HK1142083A1 (en) 2010-11-26
HUP0200575A2 (en) 2002-06-29
CA2796140A1 (en) 2000-09-28
SI2168984T1 (sl) 2012-12-31
CN101333256A (zh) 2008-12-31
AU3921600A (en) 2000-10-09
KR20060127247A (ko) 2006-12-11
AR094125A2 (es) 2015-07-15
KR101222450B1 (ko) 2013-01-16
EP2168984B1 (en) 2012-08-29
NZ596723A (en) 2013-07-26
TW201300412A (zh) 2013-01-01
NZ529571A (en) 2006-03-31
IL145134A0 (en) 2002-06-30
CN101921772A (zh) 2010-12-22
CN101066997A (zh) 2007-11-07
TWI280980B (en) 2007-05-11
CY1113326T1 (el) 2016-06-22
SK288082B6 (sk) 2013-06-03
BG66399B1 (bg) 2013-12-31
BG106027A (bg) 2002-06-28
TW201043639A (en) 2010-12-16
CY2013007I1 (el) 2020-05-29
TW201215619A (en) 2012-04-16
EP2319870A2 (en) 2011-05-11
WO2000056772A1 (en) 2000-09-28
AR063780A2 (es) 2009-02-18
IL207029A0 (en) 2010-12-30
IL145134A (en) 2010-11-30
CA2669512A1 (en) 2000-09-28
CN1351614A (zh) 2002-05-29
KR20140094647A (ko) 2014-07-30
AR043274A1 (es) 2005-07-27
ES2390849T3 (es) 2012-11-19
TR200603997T1 (tr) 2010-01-21
MXPA01009645A (es) 2003-09-04
HUP0200575A3 (en) 2004-11-29
KR20130105766A (ko) 2013-09-25
ZA200107774B (en) 2002-12-20
NZ611563A (en) 2015-01-30
SK13672001A3 (sk) 2002-03-05
TWI339209B (en) 2011-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100818066B1 (ko) 사람 ｉｌ-１２에 결합하는 사람 항체
AU2007338677B2 (en) Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
AU2006225302B2 (en) Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
JP2011515404A (ja) 乾癬を治療するための方法
AU2005200515B2 (en) Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
AU2013254916A1 (en) Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
AU2014202200A1 (en) Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20160324