PL218748B1 - Wyizolowane przeciwciało ludzkie lub jego część wiążąca antygen, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna, sposób hamowania aktywności ludzkiej IL-12 in vitro, zastosowanie przeciwciała lub jego części wiążącej antygen, sposób wykrywania ludzkiej IL-12, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, zrekombinowany wektor ekspresyjny, komórka gospodarz oraz sposób syntetyzowania ludzkiego przeciwciała lub jego części wiążącej antygen - Google Patents
Wyizolowane przeciwciało ludzkie lub jego część wiążąca antygen, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna, sposób hamowania aktywności ludzkiej IL-12 in vitro, zastosowanie przeciwciała lub jego części wiążącej antygen, sposób wykrywania ludzkiej IL-12, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, zrekombinowany wektor ekspresyjny, komórka gospodarz oraz sposób syntetyzowania ludzkiego przeciwciała lub jego części wiążącej antygenInfo
- Publication number
- PL218748B1 PL218748B1 PL351842A PL35184200A PL218748B1 PL 218748 B1 PL218748 B1 PL 218748B1 PL 351842 A PL351842 A PL 351842A PL 35184200 A PL35184200 A PL 35184200A PL 218748 B1 PL218748 B1 PL 218748B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- antibody
- amino acid
- seq
- binding portion
- acid sequence
- Prior art date
Links
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims abstract description 301
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 110
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 417
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims abstract description 415
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 397
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 394
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 394
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 193
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 44
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 44
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 237
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 208
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 208
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 74
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 56
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 46
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 46
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 45
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 30
- 206010005089 Blast cell proliferation Diseases 0.000 claims description 29
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 29
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 29
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 26
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 26
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 25
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 23
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 23
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 22
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 21
- GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N mercaptopurine Chemical compound S=C1NC=NC2=C1NC=N2 GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 21
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 20
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 20
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 19
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 19
- 239000005541 ACE inhibitor Substances 0.000 claims description 18
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 claims description 18
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 claims description 16
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 claims description 16
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 claims description 16
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 claims description 15
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims description 15
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 claims description 14
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 claims description 14
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 claims description 14
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 14
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims description 14
- 229960002170 azathioprine Drugs 0.000 claims description 14
- LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N azathioprine Chemical compound CN1C=NC([N+]([O-])=O)=C1SC1=NC=NC2=C1NC=N2 LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 claims description 14
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 claims description 14
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 claims description 12
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims description 12
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 claims description 12
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 12
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 claims description 12
- -1 CD86 Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims description 11
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 11
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 10
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims description 10
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 claims description 9
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 claims description 9
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 9
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 9
- UETNIIAIRMUTSM-UHFFFAOYSA-N Jacareubin Natural products CC1(C)OC2=CC3Oc4c(O)c(O)ccc4C(=O)C3C(=C2C=C1)O UETNIIAIRMUTSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 9
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 claims description 9
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 claims description 9
- 229960001940 sulfasalazine Drugs 0.000 claims description 9
- NCEXYHBECQHGNR-QZQOTICOSA-N sulfasalazine Chemical compound C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(\N=N\C=2C=CC(=CC=2)S(=O)(=O)NC=2N=CC=CC=2)=C1 NCEXYHBECQHGNR-QZQOTICOSA-N 0.000 claims description 9
- NCEXYHBECQHGNR-UHFFFAOYSA-N sulfasalazine Natural products C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(N=NC=2C=CC(=CC=2)S(=O)(=O)NC=2N=CC=CC=2)=C1 NCEXYHBECQHGNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 208000035408 type 1 diabetes mellitus 1 Diseases 0.000 claims description 9
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 claims description 8
- 102000003815 Interleukin-11 Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000177 Interleukin-11 Proteins 0.000 claims description 8
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 claims description 8
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 claims description 8
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 claims description 8
- 101710187830 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 claims description 8
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 8
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 8
- 229960001428 mercaptopurine Drugs 0.000 claims description 8
- 239000000041 non-steroidal anti-inflammatory agent Substances 0.000 claims description 8
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 claims description 8
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 8
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 claims description 8
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 claims description 8
- QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N tacrolimus Natural products CO[C@H]1C[C@H](CC[C@@H]1O)C=C(C)[C@H]2OC(=O)[C@H]3CCCCN3C(=O)C(=O)[C@@]4(O)O[C@@H]([C@H](C[C@H]4C)OC)[C@@H](C[C@H](C)CC(=C[C@@H](CC=C)C(=O)C[C@H](O)[C@H]2C)C)OC QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N 0.000 claims description 8
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 claims description 8
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 claims description 7
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 claims description 7
- 108090000426 Caspase-1 Proteins 0.000 claims description 7
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 claims description 7
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 claims description 7
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 7
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 7
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims description 7
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 claims description 7
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 claims description 7
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 7
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 7
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 claims description 7
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 claims description 7
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 claims description 7
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 7
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 claims description 7
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 claims description 7
- HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N Ibuprofen Chemical compound CC(C)CC1=CC=C(C(C)C(O)=O)C=C1 HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 claims description 7
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 claims description 7
- 102400000025 Interleukin-1 receptor type 1, soluble form Human genes 0.000 claims description 7
- 101800000542 Interleukin-1 receptor type 1, soluble form Proteins 0.000 claims description 7
- 102400000027 Interleukin-1 receptor type 2, soluble form Human genes 0.000 claims description 7
- 101800001003 Interleukin-1 receptor type 2, soluble form Proteins 0.000 claims description 7
- 102100036342 Interleukin-1 receptor-associated kinase 1 Human genes 0.000 claims description 7
- 101710199015 Interleukin-1 receptor-associated kinase 1 Proteins 0.000 claims description 7
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 7
- 102000049772 Interleukin-16 Human genes 0.000 claims description 7
- 101800003050 Interleukin-16 Proteins 0.000 claims description 7
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 claims description 7
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 claims description 7
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 claims description 7
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 7
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 claims description 7
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 claims description 7
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 claims description 7
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 7
- QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N Tacrolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1\C=C(/C)[C@@H]1[C@H](C)[C@@H](O)CC(=O)[C@H](CC=C)/C=C(C)/C[C@H](C)C[C@H](OC)[C@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)O[C@@]2(O)C(=O)C(=O)N2CCCC[C@H]2C(=O)O1 QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N 0.000 claims description 7
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 claims description 7
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 claims description 7
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000000464 adrenergic agent Substances 0.000 claims description 7
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 7
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 7
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 claims description 7
- 239000004074 complement inhibitor Substances 0.000 claims description 7
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 claims description 7
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 claims description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 7
- 229960001680 ibuprofen Drugs 0.000 claims description 7
- KBOPZPXVLCULAV-UHFFFAOYSA-N mesalamine Chemical compound NC1=CC=C(O)C(C(O)=O)=C1 KBOPZPXVLCULAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229960004963 mesalazine Drugs 0.000 claims description 7
- VOVIALXJUBGFJZ-KWVAZRHASA-N Budesonide Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1C[C@H]3OC(CCC)O[C@@]3(C(=O)CO)[C@@]1(C)C[C@@H]2O VOVIALXJUBGFJZ-KWVAZRHASA-N 0.000 claims description 6
- 102100035904 Caspase-1 Human genes 0.000 claims description 6
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims description 6
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 6
- 229940044094 angiotensin-converting-enzyme inhibitor Drugs 0.000 claims description 6
- 229960004436 budesonide Drugs 0.000 claims description 6
- 229940082638 cardiac stimulant phosphodiesterase inhibitors Drugs 0.000 claims description 6
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 claims description 6
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 6
- 229960000681 leflunomide Drugs 0.000 claims description 6
- VHOGYURTWQBHIL-UHFFFAOYSA-N leflunomide Chemical compound O1N=CC(C(=O)NC=2C=CC(=CC=2)C(F)(F)F)=C1C VHOGYURTWQBHIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 108010000525 member 1 small inducible cytokine subfamily E Proteins 0.000 claims description 6
- 239000003475 metalloproteinase inhibitor Substances 0.000 claims description 6
- RTGDFNSFWBGLEC-SYZQJQIISA-N mycophenolate mofetil Chemical compound COC1=C(C)C=2COC(=O)C=2C(O)=C1C\C=C(/C)CCC(=O)OCCN1CCOCC1 RTGDFNSFWBGLEC-SYZQJQIISA-N 0.000 claims description 6
- 229960004866 mycophenolate mofetil Drugs 0.000 claims description 6
- 229960004110 olsalazine Drugs 0.000 claims description 6
- QQBDLJCYGRGAKP-FOCLMDBBSA-N olsalazine Chemical compound C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(\N=N\C=2C=C(C(O)=CC=2)C(O)=O)=C1 QQBDLJCYGRGAKP-FOCLMDBBSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002571 phosphodiesterase inhibitor Substances 0.000 claims description 6
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 claims description 6
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 claims description 6
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 claims description 5
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 claims description 5
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 claims description 5
- 239000003379 purinergic P1 receptor agonist Substances 0.000 claims description 5
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 claims description 4
- 102400000792 Endothelial monocyte-activating polypeptide 2 Human genes 0.000 claims description 4
- 208000003456 Juvenile Arthritis Diseases 0.000 claims description 4
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 claims description 4
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 claims description 4
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 claims description 4
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 claims description 4
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 claims description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 4
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005671 spondyloarthropathy Diseases 0.000 claims description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 4
- SZXUTTGMFUSMCE-UHFFFAOYSA-N 2-(1h-imidazol-2-yl)pyridine Chemical class C1=CNC(C=2N=CC=CC=2)=N1 SZXUTTGMFUSMCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- NBGAYCYFNGPNPV-UHFFFAOYSA-N 2-aminooxybenzoic acid Chemical class NOC1=CC=CC=C1C(O)=O NBGAYCYFNGPNPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- NUKYPUAOHBNCPY-UHFFFAOYSA-N 4-aminopyridine Chemical compound NC1=CC=NC=C1 NUKYPUAOHBNCPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 3
- 206010003267 Arthritis reactive Diseases 0.000 claims description 3
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000008439 Biliary Liver Cirrhosis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000033222 Biliary cirrhosis primary Diseases 0.000 claims description 3
- 206010008874 Chronic Fatigue Syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 3
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 claims description 3
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 claims description 3
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims description 3
- 208000003807 Graves Disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 claims description 3
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 claims description 3
- 201000004331 Henoch-Schoenlein purpura Diseases 0.000 claims description 3
- 206010019617 Henoch-Schonlein purpura Diseases 0.000 claims description 3
- 206010019755 Hepatitis chronic active Diseases 0.000 claims description 3
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 claims description 3
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 claims description 3
- 208000031814 IgA Vasculitis Diseases 0.000 claims description 3
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 claims description 3
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 claims description 3
- 208000011200 Kawasaki disease Diseases 0.000 claims description 3
- 239000000867 Lipoxygenase Inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 206010029164 Nephrotic syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 claims description 3
- 229940123932 Phosphodiesterase 4 inhibitor Drugs 0.000 claims description 3
- 208000012654 Primary biliary cholangitis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 206010053879 Sepsis syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 claims description 3
- 206010051379 Systemic Inflammatory Response Syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 208000018254 acute transverse myelitis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000011341 adult acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims description 3
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 3
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 claims description 3
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 claims description 3
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 claims description 3
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003602 elastase inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 claims description 3
- 229960004979 fampridine Drugs 0.000 claims description 3
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000015446 immunoglobulin a vasculitis Diseases 0.000 claims description 3
- 102000009634 interleukin-1 receptor antagonist activity proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108040001669 interleukin-1 receptor antagonist activity proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 229960004584 methylprednisolone Drugs 0.000 claims description 3
- VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N metronidazole Chemical compound CC1=NC=C([N+]([O-])=O)N1CCO VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960000282 metronidazole Drugs 0.000 claims description 3
- 208000001725 mucocutaneous lymph node syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 3
- 239000002587 phosphodiesterase IV inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 208000002574 reactive arthritis Diseases 0.000 claims description 3
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 claims description 3
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 claims description 3
- 201000000306 sarcoidosis Diseases 0.000 claims description 3
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 claims description 3
- 206010043778 thyroiditis Diseases 0.000 claims description 3
- XFYDIVBRZNQMJC-UHFFFAOYSA-N tizanidine Chemical compound ClC=1C=CC2=NSN=C2C=1NC1=NCCN1 XFYDIVBRZNQMJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960000488 tizanidine Drugs 0.000 claims description 3
- 208000009174 transverse myelitis Diseases 0.000 claims description 3
- 239000002447 tumor necrosis factor alpha converting enzyme inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 claims description 3
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims description 3
- 102100030988 Angiotensin-converting enzyme Human genes 0.000 claims description 2
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 claims description 2
- 206010038546 Renal vasculitis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006045 Spondylarthropathies Diseases 0.000 claims description 2
- 230000001800 adrenalinergic effect Effects 0.000 claims description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 2
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000029766 myalgic encephalomeyelitis/chronic fatigue syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 claims description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 2
- 201000006292 polyarteritis nodosa Diseases 0.000 claims description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 2
- VHRSUDSXCMQTMA-PJHHCJLFSA-N 6alpha-methylprednisolone Chemical compound C([C@@]12C)=CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@](O)(C(=O)CO)CC[C@H]21 VHRSUDSXCMQTMA-PJHHCJLFSA-N 0.000 claims 1
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 claims 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 claims 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 claims 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 claims 1
- CKMOQBVBEGCJGW-LLIZZRELSA-L OC1=CC=C(C=C1C(=O)O[Na])\N=N\C1=CC=C(C=C1)C(=O)NCCC(=O)O[Na] Chemical compound OC1=CC=C(C=C1C(=O)O[Na])\N=N\C1=CC=C(C=C1)C(=O)NCCC(=O)O[Na] CKMOQBVBEGCJGW-LLIZZRELSA-L 0.000 claims 1
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 claims 1
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 claims 1
- 208000007475 hemolytic anemia Diseases 0.000 claims 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 claims 1
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 claims 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 29
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 12
- 229940040731 human interleukin-12 Drugs 0.000 abstract description 9
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 abstract description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 220
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 188
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 152
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 150
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 150
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 108
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 82
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 75
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 67
- 101000737793 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related antigen 1 Proteins 0.000 description 67
- 102100035361 Cerebellar degeneration-related protein 2 Human genes 0.000 description 66
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 description 66
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 66
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 57
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 55
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 54
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 47
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 41
- 102100034278 Annexin A6 Human genes 0.000 description 38
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 30
- 108090000663 Annexin A1 Proteins 0.000 description 29
- 102100030698 Interleukin-12 subunit alpha Human genes 0.000 description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 29
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 28
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 26
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 25
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 23
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 23
- 102220473219 Glycodelin_H52A_mutation Human genes 0.000 description 22
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 22
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 21
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 20
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 20
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 19
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 17
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 16
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 15
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 14
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 13
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 13
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 13
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 13
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 12
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 11
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 10
- 230000036541 health Effects 0.000 description 10
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 10
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 9
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 9
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 8
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 8
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 8
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 6
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 6
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 6
- 208000029523 Interstitial Lung disease Diseases 0.000 description 6
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 6
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 6
- 108020003519 protein disulfide isomerase Proteins 0.000 description 6
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 6
- 238000002702 ribosome display Methods 0.000 description 6
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 6
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 6
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 6
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 6
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 5
- 208000036487 Arthropathies Diseases 0.000 description 5
- 206010003827 Autoimmune hepatitis Diseases 0.000 description 5
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 5
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 5
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 5
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 102220484488 Nuclear factor erythroid 2-related factor 3_L30A_mutation Human genes 0.000 description 5
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 5
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 102220560724 Autophagy-related protein 101_H31S_mutation Human genes 0.000 description 4
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 4
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 4
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 4
- 102100031111 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 17 Human genes 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 4
- 102000004560 Interleukin-12 Receptors Human genes 0.000 description 4
- 108010017515 Interleukin-12 Receptors Proteins 0.000 description 4
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 102220482489 Serine/threonine-protein kinase Nek7_L31A_mutation Human genes 0.000 description 4
- 102100029946 Sialic acid-binding Ig-like lectin 7 Human genes 0.000 description 4
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 4
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 3
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 3
- 102000004559 Interleukin-13 Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010017511 Interleukin-13 Receptors Proteins 0.000 description 3
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 3
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 3
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 3
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 231100000945 benchmark dose level lower confidence bound Toxicity 0.000 description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 229940073621 enbrel Drugs 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 3
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 3
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 3
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 3
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 3
- 229950007278 lenercept Drugs 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 108091007505 ADAM17 Proteins 0.000 description 2
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 2
- 206010050245 Autoimmune thrombocytopenia Diseases 0.000 description 2
- 241001416181 Axis axis Species 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 201000003874 Common Variable Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 2
- 108010072051 Glatiramer Acetate Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 2
- 206010018634 Gouty Arthritis Diseases 0.000 description 2
- 206010072579 Granulomatosis with polyangiitis Diseases 0.000 description 2
- 239000003458 I kappa b kinase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 206010059176 Juvenile idiopathic arthritis Diseases 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- FQISKWAFAHGMGT-SGJOWKDISA-M Methylprednisolone sodium succinate Chemical compound [Na+].C([C@@]12C)=CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@](O)(C(=O)COC(=O)CCC([O-])=O)CC[C@H]21 FQISKWAFAHGMGT-SGJOWKDISA-M 0.000 description 2
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000012826 P38 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 2
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 206010042953 Systemic sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004241 Th2 cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000031981 Thrombocytopenic Idiopathic Purpura Diseases 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 2
- 206010003230 arteritis Diseases 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 239000004067 bulking agent Substances 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 229960003115 certolizumab pegol Drugs 0.000 description 2
- BFPSDSIWYFKGBC-UHFFFAOYSA-N chlorotrianisene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(Cl)=C(C=1C=CC(OC)=CC=1)C1=CC=C(OC)C=C1 BFPSDSIWYFKGBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 208000018631 connective tissue disease Diseases 0.000 description 2
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 2
- 229940038717 copaxone Drugs 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 2
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 201000002215 juvenile rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 241001515942 marmosets Species 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 2
- 239000002829 mitogen activated protein kinase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 201000008383 nephritis Diseases 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 229940116176 remicade Drugs 0.000 description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000012409 standard PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N theophylline Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1NC=N2 ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RZWIIPASKMUIAC-VQTJNVASSA-N thromboxane Chemical compound CCCCCCCC[C@H]1OCCC[C@@H]1CCCCCCC RZWIIPASKMUIAC-VQTJNVASSA-N 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XWTYSIMOBUGWOL-UHFFFAOYSA-N (+-)-Terbutaline Chemical compound CC(C)(C)NCC(O)C1=CC(O)=CC(O)=C1 XWTYSIMOBUGWOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 108091064702 1 family Proteins 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 3-(2-methoxyethoxy)benzohydrazide Chemical compound COCCOC1=CC=CC(C(=O)NN)=C1 GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical class O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical group CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012440 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 1
- 208000026872 Addison Disease Diseases 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 206010001889 Alveolitis Diseases 0.000 description 1
- 108010064733 Angiotensins Proteins 0.000 description 1
- 102000015427 Angiotensins Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 description 1
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 206010055128 Autoimmune neutropenia Diseases 0.000 description 1
- 208000031212 Autoimmune polyendocrinopathy Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 208000007190 Chlamydia Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010008609 Cholangitis sclerosing Diseases 0.000 description 1
- 206010056370 Congestive cardiomyopathy Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N Dansyl Chloride Chemical compound C1=CC=C2C(N(C)C)=CC=CC2=C1S(Cl)(=O)=O XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 1
- 201000010046 Dilated cardiomyopathy Diseases 0.000 description 1
- 101100012887 Drosophila melanogaster btl gene Proteins 0.000 description 1
- 101100012878 Drosophila melanogaster htl gene Proteins 0.000 description 1
- 102100027094 Echinoderm microtubule-associated protein-like 1 Human genes 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101000759376 Escherichia phage Mu Tail sheath protein Proteins 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000007984 Female Infertility Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 206010018498 Goitre Diseases 0.000 description 1
- 208000024869 Goodpasture syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 208000031856 Haemosiderosis Diseases 0.000 description 1
- 208000001204 Hashimoto Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 101000959738 Homo sapiens Annexin A1 Proteins 0.000 description 1
- 101000868215 Homo sapiens CD40 ligand Proteins 0.000 description 1
- 101000583935 Homo sapiens CDK-activating kinase assembly factor MAT1 Proteins 0.000 description 1
- 101000912009 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase 5 activator 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001057941 Homo sapiens Echinoderm microtubule-associated protein-like 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001038346 Homo sapiens GTP cyclohydrolase 1 feedback regulatory protein Proteins 0.000 description 1
- 101000980900 Homo sapiens Sororin Proteins 0.000 description 1
- 101000808126 Homo sapiens Uroplakin-3b Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010020850 Hyperthyroidism Diseases 0.000 description 1
- 208000013016 Hypoglycemia Diseases 0.000 description 1
- 208000000038 Hypoparathyroidism Diseases 0.000 description 1
- 206010021245 Idiopathic thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 206010021928 Infertility female Diseases 0.000 description 1
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 1
- 108010005716 Interferon beta-1a Proteins 0.000 description 1
- 108010005714 Interferon beta-1b Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000004557 Interleukin-18 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017537 Interleukin-18 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- ZCVMWBYGMWKGHF-UHFFFAOYSA-N Ketotifene Chemical compound C1CN(C)CCC1=C1C2=CC=CC=C2CC(=O)C2=C1C=CS2 ZCVMWBYGMWKGHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 208000012309 Linear IgA disease Diseases 0.000 description 1
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 description 1
- 208000003250 Mixed connective tissue disease Diseases 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101000653787 Mus musculus Protein S100-A11 Proteins 0.000 description 1
- 208000010428 Muscle Weakness Diseases 0.000 description 1
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 1
- 241000238367 Mya arenaria Species 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 206010033165 Ovarian failure Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 206010034277 Pemphigoid Diseases 0.000 description 1
- 201000011152 Pemphigus Diseases 0.000 description 1
- 241000721454 Pemphigus Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 208000031845 Pernicious anaemia Diseases 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 206010057244 Post viral fatigue syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000002500 Primary Ovarian Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 206010037457 Pulmonary vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 208000032056 Radiation Fibrosis Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010067953 Radiation fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 1
- GIIZNNXWQWCKIB-UHFFFAOYSA-N Serevent Chemical compound C1=C(O)C(CO)=CC(C(O)CNCCCCCCOCCCCC=2C=CC=CC=2)=C1 GIIZNNXWQWCKIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 206010042742 Sympathetic ophthalmia Diseases 0.000 description 1
- 201000009594 Systemic Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 229910052775 Thulium Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000024799 Thyroid disease Diseases 0.000 description 1
- 206010044248 Toxic shock syndrome Diseases 0.000 description 1
- 231100000650 Toxic shock syndrome Toxicity 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- BMQYVXCPAOLZOK-UHFFFAOYSA-N Trihydroxypropylpterisin Natural products OCC(O)C(O)C1=CN=C2NC(N)=NC(=O)C2=N1 BMQYVXCPAOLZOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 206010047642 Vitiligo Diseases 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 206010048249 Yersinia infections Diseases 0.000 description 1
- 208000025079 Yersinia infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 1
- 208000009621 actinic keratosis Diseases 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000048 adrenergic agonist Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- NDAUXUAQIAJITI-UHFFFAOYSA-N albuterol Chemical compound CC(C)(C)NCC(O)C1=CC=C(O)C(CO)=C1 NDAUXUAQIAJITI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000360 alopecia Toxicity 0.000 description 1
- 208000004631 alopecia areata Diseases 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003556 aminophylline Drugs 0.000 description 1
- FQPFAHBPWDRTLU-UHFFFAOYSA-N aminophylline Chemical compound NCCN.O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1NC=N2.O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1NC=N2 FQPFAHBPWDRTLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 230000009831 antigen interaction Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 201000003710 autoimmune thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 1
- 201000004982 autoimmune uveitis Diseases 0.000 description 1
- 229940003504 avonex Drugs 0.000 description 1
- 229960004168 balsalazide Drugs 0.000 description 1
- IPOKCKJONYRRHP-FMQUCBEESA-N balsalazide Chemical compound C1=CC(C(=O)NCCC(=O)O)=CC=C1\N=N\C1=CC=C(O)C(C(O)=O)=C1 IPOKCKJONYRRHP-FMQUCBEESA-N 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 229940021459 betaseron Drugs 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000006189 buccal tablet Substances 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 208000028512 chlamydia infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000019069 chronic childhood arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000025302 chronic primary adrenal insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000007118 chronic progressive multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000002288 cocrystallisation Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 201000001981 dermatomyositis Diseases 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 201000001155 extrinsic allergic alveolitis Diseases 0.000 description 1
- 206010016256 fatigue Diseases 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 201000003872 goiter Diseases 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 102000048091 human CDCA5 Human genes 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- XXSMGPRMXLTPCZ-UHFFFAOYSA-N hydroxychloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CCO)CC)=CC=NC2=C1 XXSMGPRMXLTPCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004171 hydroxychloroquine Drugs 0.000 description 1
- 208000022098 hypersensitivity pneumonitis Diseases 0.000 description 1
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003297 immature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000005934 immune activation Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 230000003960 inflammatory cascade Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 229940074383 interleukin-11 Drugs 0.000 description 1
- 230000019734 interleukin-12 production Effects 0.000 description 1
- 108010070145 interleukin-18 binding protein Proteins 0.000 description 1
- 102000044166 interleukin-18 binding protein Human genes 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- OEXHQOGQTVQTAT-JRNQLAHRSA-N ipratropium Chemical compound O([C@H]1C[C@H]2CC[C@@H](C1)[N@@+]2(C)C(C)C)C(=O)C(CO)C1=CC=CC=C1 OEXHQOGQTVQTAT-JRNQLAHRSA-N 0.000 description 1
- 229960001888 ipratropium Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960004958 ketotifen Drugs 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 1
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- RQTOOFIXOKYGAN-UHFFFAOYSA-N nedocromil Chemical compound CCN1C(C(O)=O)=CC(=O)C2=C1C(CCC)=C1OC(C(O)=O)=CC(=O)C1=C2 RQTOOFIXOKYGAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004398 nedocromil Drugs 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- BMQYVXCPAOLZOK-XINAWCOVSA-N neopterin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)C1=CN=C2NC(N)=NC(=O)C2=N1 BMQYVXCPAOLZOK-XINAWCOVSA-N 0.000 description 1
- 201000004535 ovarian dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 231100000539 ovarian failure Toxicity 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- NVOYVOBDTVTBDX-PMEUIYRNSA-N oxitropium Chemical compound CC[N+]1(C)[C@H]2C[C@@H](C[C@@H]1[C@H]1O[C@@H]21)OC(=O)[C@H](CO)C1=CC=CC=C1 NVOYVOBDTVTBDX-PMEUIYRNSA-N 0.000 description 1
- 229960000797 oxitropium Drugs 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 201000001976 pemphigus vulgaris Diseases 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 230000036178 pleiotropy Effects 0.000 description 1
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 208000005987 polymyositis Diseases 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 229940071643 prefilled syringe Drugs 0.000 description 1
- 206010036601 premature menopause Diseases 0.000 description 1
- 208000017942 premature ovarian failure 1 Diseases 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 201000000742 primary sclerosing cholangitis Diseases 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000011814 protection agent Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 238000010223 real-time analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 201000003068 rheumatic fever Diseases 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 229960002052 salbutamol Drugs 0.000 description 1
- 229960004017 salmeterol Drugs 0.000 description 1
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 208000010157 sclerosing cholangitis Diseases 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 239000008299 semisolid dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940074404 sodium succinate Drugs 0.000 description 1
- ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L sodium succinate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CCC([O-])=O ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- VIDRYROWYFWGSY-UHFFFAOYSA-N sotalol hydrochloride Chemical compound Cl.CC(C)NCC(O)C1=CC=C(NS(C)(=O)=O)C=C1 VIDRYROWYFWGSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 201000004595 synovitis Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 229940065721 systemic for obstructive airway disease xanthines Drugs 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 229960000195 terbutaline Drugs 0.000 description 1
- 229960000278 theophylline Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- FRNOGLGSGLTDKL-UHFFFAOYSA-N thulium atom Chemical compound [Tm] FRNOGLGSGLTDKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000021510 thyroid gland disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940046728 tumor necrosis factor alpha inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000002451 tumor necrosis factor inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/08—Bronchodilators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/16—Central respiratory analeptics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
- A61P5/16—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4 for decreasing, blocking or antagonising the activity of the thyroid hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/244—Interleukins [IL]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
Description
Opis wynalazku
Dziedzina wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest wyizolowane przeciwciało ludzkie lub jego część wiążąca antygen, które wiąże się z ludzką IL-12, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna, sposób hamowania aktywności ludzkiej IL-12 in vitro, zastosowanie przeciwciała lub jego części wiążącej antygen, sposób wykrywania ludzkiej IL-12, a także wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, zrekombinowany wektor ekspresyjny, komórka gospodarz oraz sposób syntetyzowania ludzkiego przeciwciała lub jego części wiążącej antygen.
Podstawa wynalazku
Ludzką interleukinę 12 (IL-12) scharakteryzowano ostatnio jako cytokinę mającą unikalną strukturę i cechującą się plejotropią (Kobayashi i in. (1989) J. Exp. Med. 170: 827-845; Seder i in. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 10188-10192; Ling i in. (1995) J. Exp. Med. 154: 116-127; Podlaski i in. (1992) Arch. Biochem. Biophys. 294: 230-237). IL-12 odgrywa krytyczną rolę w patologii związanej z kilkoma chorobami, obejmującymi odpowiedzi immunologiczne i zapalne. Przegląd dotyczący IL-12, jej aktywności biologicznej i jej roli w chorobach można znaleźć w Gately i in. (1998) Ann. Rev. Immunol. 16: 495-521.
Pod względem budowy, IL-12 jest heterodimerycznym białkiem składającym się z podjednostki o masie cząsteczkowej 35 kDa (p35) oraz podjednostki o masie cząsteczkowej 40 kDa (p40), które połączone są ze sobą wzajemnie mostkiem disiarczkowym (określanym jako „podjednostka p70”). Heterodimeryczne białko wytwarzane jest przede wszystkim przez komórki prezentujące antygeny, takie jak monocyty, makrofagi i komórki dendrytyczne. Te rodzaje komórek wydzielają również nadmiar podjednostki p40 w stosunku do podjednostki p70. Podjednostki p40 i p35 są genetycznie nie spokrewnione i dla żadnej z nich nie donoszono, że wykazuje aktywność biologiczną, chociaż homodimer p40 może działać jako antagonista IL-12.
Pod względem funkcjonalnym, IL-12 odgrywa główną rolę w regulacji równowagi pomiędzy specyficznymi wobec antygenu pomocniczymi limfocytami T typu 1 (Th1), a typu 2 (Th2). Komórki Th1 i Th2 kierują inicjacją i rozwojem zaburzeń autoimmunologicznych, a IL-12 odgrywa zasadniczą rolę w regulacji różnicowania i dojrzewania limfocytów Th1. Cytokiny uwalniane przez komórki Th1 są cytokinami zapalnymi i obejmują interferon γ (IFN;), IL-2 i limfotoksynę (LT). Komórki Th2 wydzielają IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 i IL-13, wspomagając odporność humoralną, reakcje alergiczne i immunosupresję.
Zgodnie z przewagą odpowiedzi Th1 w chorobach autoimmunologicznych i prozapalnych aktywności IFN-γ, IL-12 może odrywać główną rolę w patologii związanej z wieloma chorobami autoimmunologicznymi i zapalnymi, takimi jak reumatoidalne zapalenie stawów (RA), stwardnienie rozsiane (MS) i choroba Crohna.
U ludzi, pacjentów z MS, stwierdzano wzrost ekspresji IL-12, co udokumentowano poprzez poziomy mRNA p40 w blaszkach w ostrym MS. (Windhagen i in., (1995) J. Exp. Med. 182: 1985-1996). Ponadto, wynikiem stymulacji ex vivo komórek prezentujących antygeny przez komórki T, w których zachodzi ekspresja CD40L, pochodzące od pacjentów z MS, jest zwiększone wytwarzanie IL-12 w porównaniu z kontrolnymi komórkami T, co jest zgodne z obserwacją, że oddziaływania CD40/CD40L są silnym induktorem IL-12.
Podwyższone, w porównaniu do zdrowych kontroli, poziomy p70 IL-12 wykryto w mazi stawowej pacjentów z RA (Morita i in. (1998) Arthritis and Rheumatism 41: 306-314). Profil ekspresji matrycowego kwasu rybonukleinowego (mRNA) cytokin w mazi stawowej pacjentów z RA wykazał przeważającą ilość cytokin Th1. (Bucht i in., (1996) Clin. Exp. Immunol. 103: 347-367). IL-12 wydaje się również odgrywać zasadniczą rolę w patologii związanej z chorobą Crohna (CD). Zwiększoną ekspresję INF;.' i IL-12 obserwowano w jelitowej błonie śluzowej pacjentów z tą chorobą (Fais i in. (1994) J. Interferon Res. 14: 235-238; Parronchi i in. (1997) Am. J. Path. 150: 823-832; Monteleone i in., (1997) Gastroenterology 112: 1169-1178 oraz Berrebi i in., (1998) Am. J. Path. 152: 667-672). Profil wydzielania cytokin przez komórki T z blaszek właściwych pacjentów z CD charakteryzuje się przeważającą odpowiedzią Th1, włącznie ze znacznie podwyższonymi poziomami IFN; (Fuss i in., (1996) J. Immunol. 157: 1261-1270). Co więcej, skrawki tkanki okrężnicy pochodzące od pacjentów z CD wykazują znaczną ilość makrofagów, w których zachodzi ekspresja IL-12, oraz komórek T, w których zachodzi ekspresja IFN; (Parronchi i in. (1997) Am. J. Path. 150: 823-832).
PL 218 748 B1
Z powodu roli ludzkiej IL-12 w licznych zaburzeniach u człowieka, zaprojektowano strategie terapeutyczne mające na celu hamowanie lub przeciwdziałanie aktywności IL-12. W szczególności, jako środki do hamowania aktywności IL-12 poszukiwano przeciwciał, które wiążą się z, i neutralizują IL-12. Niektórymi z najwcześniej znalezionych przeciwciał były mysie przeciwciała monoklonalne (mAb), wydzielane przez hybrydomy przygotowane z limfocytów myszy immunizowanych IL-12 (patrz np. publikacja światowego zgłoszenia patentowego numer WO 97/15327, Strober i in.; Neurath i in. (1995) J. Exp. Med. 182: 1281-1290; Duchmann i in, (1996) J. Immunol. 26: 934-938). Zastosowanie tych mysich przeciwciał przeciw IL-12 in vivo jest ograniczone z powodu problemów związanych z podawaniem mysich przeciwciał ludziom, takich jak krótki okres półtrwania w surowicy, braku zdolności do wyzwalania pewnych funkcji efektorowych u ludzi oraz wywoływania niepożądanej odpowiedzi immunologicznej przeciw przeciwciału myszy u ludzi (reakcja „ludzkich przeciwciał przeciwmysich (HAMA)).
Generalnie, próby przezwyciężenia problemów związanych ze stosowaniem w pełni mysich przeciwciał u ludzi obejmowały zmiany przeciwciał metodami inżynierii genetycznej, tak aby były one „bardziej ludzkie”. Na przykład, przygotowywano przeciwciała chimeryczne, w których regiony zmienne łańcuchów przeciwciała są pochodzenia mysiego, a regiony stałe łańcuchów przeciwciała są pochodzenia ludzkiego (Junghans i in. (1990) Cancer Res. 50: 1495-1502; Brown i in. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 2663-2667; Kettleborough i in. (1991) Protein Engineering 4; 773-783). Jednakże, ponieważ te przeciwciała chimeryczne i humanizowane wciąż zachowują pewne sekwencje mysie, nadal mogą wywoływać niepożądaną reakcję immunologiczną, reakcję ludzkich przeciwciał przeciw przeciwciału chimerycznemu (HACA), szczególnie przy podawaniu w ciągu wydłużonych okresów.
Korzystniejszym od przeciwciał mysich lub ich pochodnych (np. przeciwciał chimerycznych lub humanizowanych) środkiem hamującym IL-12 powinno być całkowicie ludzkie przeciwciało przeciw IL-12, ponieważ taki środek nie powinien wywoływać reakcji HAMA, nawet w przypadku stosowania w ciągu przedłużonych okresów. Jednakże, przeciwciał takich nie opisywano w nauce i dlatego ciągle istnieje potrzeba ich otrzymania.
Istota wynalazku
Wynalazek dotyczy wyizolowanego przeciwciała ludzkiego lub jego części wiążącej antygen, które -4 -1 wiąże się z ludzką IL-12 i dysocjuje od ludzkiej IL-12 ze stałą szybkości koff wynoszącą 1 x 10-4 s-1 lub niższą, oznaczoną metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego, gdzie to przeciwciało hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny w oznaczeniu proliferacji komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny in vitro (oznaczeniu PHA) z IC50 wynoszącym 1 x 10-9 M lub niższym.
Korzystne jest wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, które dyso-5 -1 cjuje od ludzkiej IL-12 ze stałą szybkości koff wynoszącą 1 x 10-5 s-1 lub niższą.
Korzystne jest wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, które wiąże -10 się z ludzką IL-12 i dysocjuje od ludzkiej IL-12 ze stałą Kd wynoszącą 1,34 x 10-10 lub niższą.
Korzystne jest wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, które wiąże się z ludzką IL-12 i dysocjuje od ludzkiej IL-12 ze stałą szybkości Kd wynoszącą 9,74 X 10-11 M lub niższą.
Korzystne jest wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, które zawiera region stały łańcucha ciężkiego IgG1.
Korzystne jest wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, które hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny w oznaczeniu PHA in vitro z IC50 -10 wynoszącym 1 x 10-10 M lub niższym.
Korzystniej wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny w oznaczeniu PHA in vitro z IC50 wynoszącym 1 x 10-11 M lub niższym.
Korzystne jest wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, które wykazuje następujące cechy charakterystyczne:
a) zawiera CDR3 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 9; oraz
b) zawiera CDR3 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 10.
Korzystne jest wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, które ponadto zawiera CDR2 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 11 i zawiera CDR2 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 12.
PL 218 748 B1
Korzystne jest wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, które ponadto zawiera CDR1 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 13 i zawiera CDR1 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 14.
Korzystne jest wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, które zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 15 i zawiera region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 16.
Korzystne jest wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążącą antygen, które: a) zawiera CDR3 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy
SEQ ID NO: 404 - SEQ ID NO: 469; oraz
b) zawiera CDR3 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy SEQ ID NO: 534 - SEQ ID NO: 579.
Korzystne jest wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, które ponadto zawiera CDR2 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy SEQ ID NO: 335 - SEQ ID NO: 403, oraz CDR2 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy SEQ ID NO: 506 - 533.
Korzystne jest wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, które ponadto zawiera CDR1 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy SEQ ID NO: 288 - 334, oraz CDR1 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy SEQ ID NO: 470 - 505.
Korzystne jest wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, które: a) zawiera CDR3 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 25;
oraz
b) zawiera CDR3 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 26.
Korzystne jest wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, które ponadto zawiera CDR2 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 27, oraz CDR2 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 28.
Korzystne jest wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, które ponadto zawiera CDR1 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 29, oraz CDR1 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 30.
Korzystne jest wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, które zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 31, oraz region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 32.
Korzystne jest wyizolowane przeciwciało ludzkie, które zawiera region stały łańcucha ciężkiego wybrany z grupy składającej się z regionów stałych IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA i IgE.
Korzystne jest wyizolowane przeciwciało ludzkie, w którym region stały łańcucha ciężkiego przeciwciała jest regionem IgG1.
Korzystna jest część wyizolowanego przeciwciała ludzkiego, która jest fragmentem Fab.
Korzystna jest część wyizolowanego przeciwciała ludzkiego, która jest fragmentem F(ab')2.·
Korzystna jest część wyizolowanego przeciwciała ludzkiego, która jest jednołańcuchowym fragmentem Fv.
Korzystne jest wyizolowane przeciwciało ludzkie, które wiąże ludzką IL-12 i stanowi przeciwciało J695 lub jego część wiążącą antygen.
Wynalazek dotyczy również kompozycji farmaceutycznej, charakteryzującej się tym, że zawiera przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, zdefiniowane powyżej, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
Korzystna jest kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera ponadto dodatkowy środek.
Korzystna jest kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że dodatkowym środkiem jest środek terapeutyczny.
Korzystna jest kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że środek terapeutyczny wybrany jest z grupy składającej się z budezonidu, naskórkowego czynnika wzrostu, kortykosteroidów, cyklosporyny, sulfasalazyny, aminosalicylanów, 6-merkaptopuryny, azatiopryny, metronidazolu, inhibitorów lipoksygenazy, mesalaminy, olsalazyny, balsalazydu, przeciwutleniaczy, inhibitorów tromboksanu, antagonistów receptora IL-1, monoklonalnych przeciwciał przeciw IL-1 β, monoklonalnych przeciwciał przeciw IL-6, czynników wzrostu, inhibitorów elastazy, związków pirydynyloimidazolowych; przeciwciał względem lub agonistów TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II,
PL 218 748 B1
GM-CSF, FGF i PDGF, przeciwciał względem CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90, bądź ich ligandów, metotreksatu, cyklosporyny, FK506, rapamycyny, mykofenolanu mofetylu, leflunomidu, NSLPZ, ibuprofenu, kortykosteroidów, prednizolonu, inhibitorów fosfodiesterazy, agonistów adenozyny, środków przeciwzakrzepowych, inhibitorów dopełniacza, środków adrenergicznych, inhibitorów kinazy IRAK, NIK, IKK, p38, MAP, inhibitorów enzymu konwertującego IL-1 β, inhibitorów enzymu konwertującego TNFa, inhibitorów przekazywania sygnałów w komórkach T, inhibitorów metaloproteinaz, sulfasalazyny, azatiopryny, 6-merkaptopuryn, inhibitorów enzymu konwertującego angiotensynę, rozpuszczalnych receptorów cytokin, rozpuszczalnego receptora p55 TNF, rozpuszczalnego receptora p75 TNF, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, cytokin przeciwzapalnych, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 i TGFβ.
Korzystna jest kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że środek terapeutyczny jest wybrany z grupy składającej się z przeciwciał przeciw TNF i fragmentów tych przeciwciał, konstruktów TNFR-Ig, inhibitorów TACE, inhibitorów PDE4, kortykosteroidów, budezonidu, deksametazonu, sulfasalazyny, kwasu 5-aminosalicylowego, olsalazyny, inhibitorów enzymu konwertującego IL-1 β, IL-1ra, inhibitorów kinazy tyrozynowej, 6-merkaptopuryn i IL-11.
Korzystna jest kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że środek terapeutyczny jest wybrany z grupy składającej się z kortykosteroidów, prednizolonu, metyloprednizolonu, azatiopryny, cyklofosfamidu, cyklosporyny, metotreksatu, 4-aminopirydyny, tizanidyny, interferonuT1a, interferonu^1b, kopolimeru 1, tlenu pod nadciśnieniem, immunoglobuliny dożylnej, klabrybiny, przeciwciał przeciw lub agonistów TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, PDGF, przeciwciał przeciw CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90, bądź ich ligandów, metotreksatu, cyklosporyny, FK506, rapamycyny, mykofenolanu mofetylu, leflunomidu, NSLPZ, ibuprofenu, kortykosteroidów, prednizolonu, inhibitorów fosfodiesterazy, agonistów adenozyny, środków przeciwzakrzepowych, inhibitorów dopełniacza, środków adrenergicznych, inhibitorów kinazy IRAK, NIK, IKK, p38 lub MAP, inhibitorów enzymu konwertującego IL-1 β, inhibitorów TACE, inhibitorów przekazywania sygnałów w komórkach T, inhibitorów kinaz, inhibitorów metaloproteinaz, sulfasalazyny, azatiopryny, 6-merkaptopuryn, inhibitorów enzymu konwertującego angiotensynę, rozpuszczalnych receptorów cytokin, rozpuszczalnego receptora p55 TNF, rozpuszczalnego receptora p75 TNF, sIL-1RI, sIL-1RII, SIL-6R, SIL-13R, anty-P7s, liganda glikoproteiny p-seIektyny (PSGL), cytokin przeciwzapalnych, IL-4, IL-10, IL-13 i TGFβ.
Wynalazek dotyczy ponadto sposobu hamowania aktywności ludzkiej IL-12 in vitro, charakteryzującego się tym, że kontaktuje się ludzką IL-12 z przeciwciałem lub jego częścią wiążącą antygen zdefiniowanym powyżej, tak że aktywność Iudzkiej IL-12 ulega zahamowaniu.
Wynalazek dotyczy także zastosowania przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, zdefiniowanego powyżej, do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki zaburzenia wybranego z grupy obejmującej reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, młodzieńcze przewlekłe zapalenie stawów, zapalenie stawów związane z chorobą z Lyme, artropatię łuszczycową, odczynowe zapalenie stawów, spondyloartropatię, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, uogólniony liszaj rumieniowaty, chorobę Crohna, wrzodziejące zapalenie okrężnicy, zapalną chorobę jelit, stwardnienie rozsiane, cukrzycę insulinozależną, zapalenie tarczycy, astmę, choroby alergiczne, łuszczycę, zapalenie i stwardnienie skóry, reakcję przeszczepu przeciw gospodarzowi, odrzucanie przeszczepionych narządów, ostre lub przewlekłe choroby immunologiczne związane z przeszczepianiem narządów, sarkoidozę, miażdżycę tętnic, rozsiane wykrzepianie wewnątrznaczyniowe, chorobę Kawasakiego, chorobę Grave'a, zespół nerczycowy, zespół przewlekłego zmęczenia, guzkowate zapalenie tętnic, ziarniniaka Wegenera, plamicę Henocha-Schoenleina, mikroskopowe zapalenie naczyń nerki, przewlekłe aktywne zapalenie wątroby, zespół Sjogrena, zapalenie błony naczyniowej oka, posocznicę, wstrząs septyczny, zespół posocznicy, zespół zaburzeń oddechowych dorosłych, wyniszczenie, choroby zakaźne, choroby pasożytnicze, zespół nabytego niedoboru odporności, ostre poprzeczne zapalenie rdzenia, nużliwość mięśni, pląsawicę Huntingtona, chorobę Parkinsona, chorobę Alzheimera, udar, pierwotną żółciową marskość wątroby, zwłóknieniowe choroby płuc, niedokrwistość hemolityczną, choroby nowotworowe, niewydolność serca i zawał mięśnia sercowego, przez podawanie osobnikowi będącemu człowiekiem.
Korzystne jest zastosowanie, w którym zaburzeniem jest łuszczyca.
Korzystne jest zastosowanie, w którym zaburzeniem jest choroba Crohna.
Korzystne jest zastosowanie, w którym zaburzeniem jest stwardnienie rozsiane.
Korzystne jest zastosowanie, w którym zaburzeniem jest reumatoidalne zapalenie stawów.
PL 218 748 B1
Wynalazek dotyczy także sposobu wykrywania ludzkiej IL-12, charakteryzującego się tym, że kontaktuje się in vitro ludzką IL-12 z przeciwciałem lub jego częścią wiążącą antygen, zdefiniowanym powyżej, tak że ludzka IL-12 zostaje wykryta.
Korzystny jest sposób, charakteryzujący się tym, że ludzką IL-12 wykrywa się w próbce biologicznej w celach diagnostycznych.
Wynalazek dotyczy również wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego, która koduje ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, zdefiniowane powyżej, przy czym przeciwciało lub jego część wiążąca antygen zawiera CDR3 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 25.
Korzystna jest wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje region zmienny łańcucha ciężkiego przeciwciała.
Korzystna jest wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, gdzie CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przeciwciała obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 27.
Korzystna jest wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, gdzie CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przeciwciała obejmuje sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 29.
Korzystna jest wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje region zmienny łańcucha ciężkiego przeciwciała, obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 31.
Wynalazek dotyczy także wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego, która koduje ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, zdefiniowane powyżej, gdzie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen obejmuje CDR3 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 26.
Korzystna jest wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje region zmienny łańcucha lekkiego przeciwciała.
Korzystna jest wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, gdzie CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego przeciwciała obejmuje sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 28.
Korzystna jest wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, gdzie CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego przeciwciała obejmuje sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 30.
Korzystna jest wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje region zmienny łańcucha ciężkiego przeciwciała, obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 32.
Wynalazek dotyczy ponadto zrekombinowanego wektora ekspresyjnego, który zawiera wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zdefiniowaną powyżej.
Wynalazek dotyczy także komórki gospodarza, do której wprowadzono zrekombinowany wektor ekspresyjny zdefiniowany powyżej.
Korzystny jest zrekombinowany wektor ekspresyjny, który koduje
a) łańcuch ciężki przeciwciała zawierający region zmienny obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 31; oraz
b) łańcuch lekki przeciwciała zawierający region zmienny obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 32.
Korzystna jest komórka gospodarz, do której wprowadzono zrekombinowany wektor ekspresyjny bezpośrednio powyżej.
Wynalazek dotyczy również sposobu syntetyzowania ludzkiego przeciwciała lub jego części wiążącej antygen, zdefiniowanego powyżej, charakteryzującego się tym, że hoduje się komórkę gospodarza zdefiniowaną powyżej w podłożu hodowlanym, aż ludzkie przeciwciało, które wiąże się z ludzką IL-12 zostanie zsyntetyzowane przez komórkę.
Krótki opis rysunków
Figury 1A-1B przedstawiają przyporządkowania sekwencji aminokwasowych regionów zmiennych łańcuchów ciężkich szeregu przeciwciał ludzkich, które wiążą IL-12, w porównaniu z sekwencjami linii zarodkowych Cos-3/JH3 i Dp118 Lv1042. Do identyfikacji pozycji aminokwasowych zastosowano numerację Kabata. Dla Joe 9 typu dzikiego przedstawiono pełną sekwencję. Dla innych przeciwciał przedstawiono tylko te pozycje aminokwasowe, które różnią się od Joe 9 typu dzikiego.
Figury 1C-1D przedstawiają przyporządkowania sekwencji aminokwasowych regionów zmiennych łańcuchów lekkich szeregu przeciwciał ludzkich, które wiążą IL12. Do identyfikacji pozycji aminokwasowych zastosowano numerację Kabata. Dla Joe 9 typu dzikiego przedstawiono pełną sekwencję. Dla innych przeciwciał przedstawiono tylko te pozycje aminokwasowe, które różnią się od Joe 9 typu dzikiego.
PL 218 748 B1
Figury 2A-2E przedstawiają pozycje w CDR łańcucha ciężkiego przeciwciała Y61, które poddano mutacji przez ukierunkowaną mutagenezę, oraz odpowiednie podstawienia aminokwasowe w każdej pozycji. Wykresy po prawej stronie figur przedstawiają szybkości dysocjacji podstawionych przeciwciał (czarne słupki) w porównaniu z niezmutowanym Y61 (biały słupek).
Figury 2F-2H przedstawiają pozycje w CDR łańcucha lekkiego przeciwciała Y61, które poddano mutacji przez ukierunkowaną mutagenezę, oraz odpowiednie podstawienia aminokwasowe w każdej pozycji. Wykresy po prawej stronie figur przedstawiają szybkości dysocjacji podstawionych przeciwciał (czarne słupki) w porównaniu z niezmutowanym Y61 (biały słupek).
Figura 3 wykazuje skuteczność przeciwciała przeciw ludzkiej IL-12, J695, na poziomy neopteryny w osoczu makaków jawajskich in vivo.
Figura 4 przedstawia wykres średnią arytmetyczną oceny w zależności od dni po immunizacji myszy kolagenem, wykazując, że traktowanie C17.15 znacząco obniża objawy związane z zapaleniem stawów w porównaniu z traktowaniem IgG szczura.
Szczegółowy opis wynalazku
W celu ułatwienia zrozumienia niniejszego wynalazku, najpierw zdefiniowano niektóre terminy.
Termin „wzmacniająca aktywność reszta aminokwasowa obejmuje resztę aminokwasową, która poprawia aktywność przeciwciała. Powinno być zrozumiałe, że wzmacniająca aktywność reszta aminokwasowa może zastępować resztę aminokwasową w pozycji kontaktu, hipermutacji lub korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy oraz, ponadto, więcej niż jedna ze wzmacniających aktywność reszt aminokwasowych może być obecna w więcej niż jednym CDR. Wzmacniająca aktywność reszta aminokwasowa obejmuje resztę aminokwasową, która poprawia specyficzność/powinowactwo wiązania przeciwciała, na przykład wiązania przeciwciała przeciw ludzkiej IL-12 z ludzką IL-12. W zamierzeniu, wzmacniająca aktywność reszta aminokwasowa obejmuje resztę aminokwasową, która poprawia siłę neutralizacji przeciwciała, na przykład przeciwciała przeciw ludzkiej IL-12, które hamuje ludzką IL-12.
Termin „przeciwciało” obejmuje cząsteczkę immunoglobuliny składającą się z czterech łańcuchów polipeptydowych, dwóch łańcuchów ciężkich (H) i dwóch lekkich (L), połączonych ze sobą wzajemnie wiązaniami disiarczkowymi. Każdy łańcuch ciężki składa się z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (wobec którego w niniejszym opisie stosuje się skrót HCVR lub VH) oraz regionu stałego łańcucha ciężkiego. Region stały łańcucha ciężkiego składa się z trzech domen, CH1, CH2 i CH3. Każdy łańcuch lekki składa się z regionu zmiennego łańcucha lekkiego (wobec którego w niniejszym opisie stosuje się skrót LCVR lub VL) oraz regionu stałego łańcucha lekkiego. Region stały łańcucha lekkiego składa się z jednej domeny, CL. Regiony VH i VL można dalej podzielić na regiony hiperzmienności, nazwane regionami determinującymi komplementarność (CDR), występujące na przemian z regionami, które są bardziej konserwatywne, nazwanymi regionami zrębu (FR). Każdy VH i VL złożony jest z trzech CDR i czterech FR, ułożonych od końca aminowego do końca karboksylowego w następującej kolejności: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
Termin „część wiążąca antygen” przeciwciała (lub „część przeciwciała” obejmuje fragmenty przeciwciała, które zachowują zdolność specyficznego wiązania z antygenem (np. hlL-12). Wykazano, że funkcję wiązania antygenu przeciwciała mogą pełnić fragmenty przeciwciała o pełnej długości. Przykłady fragmentów wiążących objętych terminem „część wiążąca antygen” obejmują (i) fragment Fab, jednowartościowy fragment składający się z domen VL, VH, CL i CH1; (ii) fragment F(ab')2, dwuwartościowy fragment obejmujący dwa fragmenty Fab połączone mostkiem disiarczkowym w regionie zawiasowym; (iii) fragment Fd, składający się z domen VH i CH1; fragment Fv, składający się z domen VL i VH pojedynczego ramienia przeciwciała; (v) fragment dAb (Ward i in., (1989) Nature 341: 544-546), który składa się z domeny VH oraz (vi) wyizolowany region determinujący komplementarność (CDR). Ponadto, chociaż dwie domeny fragmentu Fv, VL i VH, kodowane są przez oddzielne geny, stosując metody rekombinacji można je łączyć poprzez syntetyczny łącznik, co umożliwia ich tworzenie jako pojedynczego łańcucha białkowego, w którym regiony VL i VH zostają sparowane z utworzeniem jednowartościowych cząsteczek (znanych jako jednołańcuchowy Fv (scFv): patrz np. Bird i in. (1988) Science 242: 423-426 oraz Huston i in. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 58795883). W zamierzeniu, takie jednołańcuchowe przeciwciała również objęte są terminem „część wiążąca antygen” przeciwciała. Obejmuje on również inne postacie przeciwciał jednołańcuchowych, takie jak diaciała. Diaciała są dwuwartościowymi, wykazującymi podwójną specyficzność przeciwciałami, których domeny VH i VL ulegają ekspresji w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym, ale z zastosowaniem łącznika, który jest zbyt krótki do umożliwienia parowania pomiędzy dwiema domenam
PL 218 748 B1 z tego samego łańcucha, w ten sposób wymuszając parowanie domen z komplementarnymi domenami innego łańcucha i tworzenie dwóch miejsc wiążących antygen (patrz np. Holliger, P. i in. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. L. i in. (1994) Structure 2: 1121-1123). Ponadto, przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, może być częścią większych cząsteczek immunoadhezyjnych, tworzonych przez kowalencyjne lub niekowalencyjne połączenie przeciwciała, lub części przeciwciała, z jednym lub większą liczbą białek lub peptydów. Przykłady takich cząsteczek immunoadhezyjnych obejmują zastosowanie regionu rdzeniowego streptawidyny do tworzenia tetramerycznej cząsteczki SCFv (Kipriyanov, S. M, i in. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6: 93-101) i zastosowanie reszty cysteinowej, peptydu markerowego i C-końcowego znacznika polihistydynowego do tworzenia dwuwartościowych i biotynylowanych cząsteczek scFv (Kipriyanov, S. M. i in. (1994) Mol. Immunol. 31: 1047-1058). Części przeciwciał, takie jak fragmenty Fab i F(ab')2, można przygotowywać z całych przeciwciał stosując konwencjonalne techniki, takie jak trawienie całych przeciwciał odpowiednio papainą lub pepsyną. Ponadto, przeciwciała, części przeciwciał i cząsteczki immunoadhezyjne można otrzymywać stosując standardowe techniki rekombinacji DNA, jak opisano w niniejszym opisie. Korzystnymi częściami wiążącymi antygen są pełne domeny lub pary pełnych domen.
Termin „mutacja wsteczna odnosi się do procesu, w którym część lub wszystkie ze zmutowanych somatycznie aminokwasów przeciwciała ludzkiego zastąpiono odpowiadającymi resztami linii zarodkowej z sekwencji homologicznego przeciwciała linii zarodkowej. Sekwencje łańcucha ciężkiego i lekkiego ludzkiego przeciwciała według wynalazku przyporządkowuje się oddzielnie do sekwencji linii zarodkowych z bazy danych VBASE, w celu identyfikacji sekwencji o najwyższej homologii. Różnice w ludzkim przeciwciele według wynalazku przywraca się do sekwencji linii zarodkowej przez mutowanie określonych pozycji nukleotydowych, kodujących takie różne aminokwasy. Rolę każdego tak zidentyfikowanego aminokwasu jako kandydata do mutacji wstecznej powinno się sprawdzać pod kątem bezpośredniej lub pośredniej roli w wiązaniu antygenu, i żadnego aminokwasu, dla którego stwierdzono po mutacji, że zaburza jakąkolwiek pożądaną cechę charakterystyczną przeciwciała Iudzkiego, nie powinno się włączać do końcowego przeciwciała ludzkiego; dla przykładu, aminokwasów wzmacniających aktywność, zidentyfikowanych w podejściu selektywnej mutagenezy, nie będzie się poddawać mutacji wstecznej. W celu minimalizacji liczby aminokwasów poddawanych mutacjom wstecznym, można pozostawić te pozycje aminokwasowe, dla których stwierdzono, że są różne od najbardziej podobnej sekwencji linii zarodkowej, ale identyczne z odpowiadającymi aminokwasami w drugiej sekwencji linii zarodkowej, pod warunkiem, że druga sekwencja linii zarodkowej jest identyczna i współliniowa z sekwencją przeciwciała ludzkiego dla co najmniej 10, korzystnie 12 aminokwasów, po obu stronach aminokwasu, którego to dotyczy. Mutacja wsteczna może zachodzić na jakimkolwiek etapie optymalizacji przeciwciała; korzystnie, mutacja wsteczna zachodzi bezpośrednio przed lub po podejściu selektywnej mutagenezy. Korzystniej, mutacja wsteczna zachodzi bezpośrednio przed podejściem selektywnej mutagenezy.
Zwrot „ludzka interleukina 12 (wobec której w niniejszym opisie stosuje się skróty hIL-12 lub IL-12), w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, obejmuje ludzką cytokinę, którą wydzielają przede wszystkim makrofagi i komórki dendrytyczne. Termin obejmuje heterodimeryczne białko złożone z podjednostki o masie cząsteczkowej 35 kD (p35) i podjednostki o masie cząsteczkowej 40 kD (p40), które są połączone ze sobą mostkiem disiarczkowym. Białko heterodimeryczne określa się jako „podjednostkę p70”. Strukturę ludzkiej IL-12 opisano dokładniej w, na przykład, Kobayashi i in. (1989) J. Exp. Med. 170: 827-845; Seder i in. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 10188-10192; Ling i in. (1995) J. Exp. Med. 154: 116-127; Podlaski i in. (1992) Arch. Biochem. Biophys. 294: 230-237. Termin ludzka IL-12 w zamierzeniu obejmuje zrekombinowaną ludzką IL-12 (rh IL-12), którą można przygotowywać standardowymi metodami ekspresji rekombinacyjnej.
Terminy „numeracja Kabata”, „definicje Kabata” i „oznaczenia Kabata” w niniejszym opisie stosuje się wymiennie. Terminy te, które są znane w tej dziedzinie, odnoszą się do systemu numeracji reszt aminokwasowych, które są bardziej zmienne (tj. hiperzmienne)), niż inne reszty aminokwasowe w regionach zmiennych łańcuchów ciężkich i lekkich przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen (Kabat i in. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190: 382-391 oraz Kabat, E. A. i in. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie piąte, U.S. Department of Health and Human Services, Publikacja NIH nr 91-3242). W przypadku regionu zmiennego łańcucha ciężkiego, region hiperzmienny rozciąga się od 31 do 35 pozycji aminokwasowej dla CDR1, od 50 do 56 pozycji aminokwasowej dla CDR2 i od 95 do 102 pozycji aminokwasowej dla CDR3. W przypadku regionu zmiennego łańcuPL 218 748 B1 cha lekkiego, region hiperzmienny rozciąga się od 24 do 34 pozycji aminokwasowej dla CDR1, od 50 do 56 pozycji aminokwasowej dla CDR2 i od 89 do 97 pozycji aminokwasowej dla CDR3.
Numerację Kabata stosuje się w niniejszym opisie do wskazania pozycji modyfikacji aminokwasowych dokonywanych w przeciwciałach według wynalazku. Na przykład, przeciwciało Y61 przeciw IL-12 można zmutować od seryny (S) do kwasu glutaminowego (E) w pozycji 31 CDR1 łańcucha ciężkiego (H31S > E), bądź glicynę (G) można zmutować do tyrozyny (Y) w pozycji 94 CDR3 łańcucha lekkiego (L94G > Y).
Termin „przeciwciało ludzkie” obejmuje przeciwciała mające regiony stałe i zmienne odpowiadające sekwencjom ludzkich immunoglobulin linii zarodkowych, opisanym przez Kabata i in. (patrz Kabat i in. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie piąte, U.S. Department of Health and Human Services, Publikacja NIH nr 91-3242). Ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą obejmować reszty aminokwasowe niekodowane przez sekwencje ludzkich immunoglobulin linii zarodkowych (np. mutacje wprowadzone przez losową lub ukierunkowaną mutagenezę in vitro, bądź mutację somatyczną in vivo), na przykład w CDR, a w szczególności CDR3. Mutacje korzystnie wprowadza się stosując opisane w niniejszym opisie „podejście selektywnej mutagenezy”. Przeciwciało ludzkie może mieć co najmniej jedną pozycję zastąpioną przez resztę aminokwasową, np. wzmacniającą aktywność resztą aminokwasową, która nie jest kodowana przez sekwencję ludzkiej immunoglobuliny linii zarodkowej. Przeciwciało może mieć do dwudziestu pozycji zastąpionych resztami aminokwasowymi, które nie są częścią sekwencji immunoglobuliny linii zarodkowej. W innych rozwiązaniach można zastąpić do dziesięciu, do pięciu, do trzech lub do dwóch pozycji. W korzystnym rozwiązaniu, zastąpienia te występują w obrębie regionów CDR, jak szczegółowo opisano poniżej. Jednakże, termin „przeciwciało ludzkie, w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, w zamierzeniu nie obejmuje przeciwciał, w których do ludzkich sekwencji zrębu przeszczepiono sekwencje CDR pochodzące z linii zarodkowej innego gatunku ssaka, takiego jak mysz.
Zwrot „zrekombinowane przeciwciało ludzkie” obejmuje przeciwciała ludzkie, które przygotowuje się, prowadzi ich ekspresję, tworzy lub izoluje sposobami rekombinacyjnymi, takie jak przeciwciała, których ekspresję prowadzi się z zastosowaniem zrekombinowanego wektora ekspresyjnego, którym stransfekowano komórkę gospodarza (opisano dokładniej poniżej w części II), przeciwciała wyizolowane z rekombinacyjnej, kombinatorycznej biblioteki przeciwciał ludzkich (opisanej dokładniej poniżej w części III), przeciwciał wyizolowanych ze zwierzęcia (np. myszy), które jest transgeniczne pod względem genów immunoglobulin ludzkich (patrz np. Taylor, L. D, i in. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295), bądź przeciwciała przygotowane, uzyskane przez ekspresję, utworzone lub wyizolowane jakimkolwiek innym sposobem, który obejmuje łączenie sekwencji ludzkich genów immunoglobulin lub innych sekwencji DNA. Takie zrekombinowane przeciwciała ludzkie mają regiony zmienne i stałe pochodzące z sekwencji ludzkich immunoglobulin linii zarodkowych (patrz Kabat i in. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie piąte, U.S. Department of Health and Human Services, Publikacja NIH nr 91-3242). W niektórych rozwiązaniach, jednakże, takie zrekombinowane przeciwciała ludzkie poddaje się mutagenezie in vitro (lub, gdy stosuje się zwierzęce sekwencje transgeniczne pod względem ludzkich sekwencji Ig, mutagenezie somatycznej in vivo), a zatem sekwencje regionów VH i VL zrekombinowanych przeciwciał są sekwencjami, które, o ile pochodzą z, i są podobne do ludzkich sekwencji VH i VL linii zarodkowych, mogą nie istnieć naturalnie w zestawie ludzkich przeciwciał linii zarodkowych in vivo. W niektórych rozwiązaniach, jednakże takie zrekombinowane przeciwciała powstają w wyniku podejścia selektywnej mutagenezy lub mutacji wstecznej, bądź obu.
„Wyizolowane przeciwciało” obejmuje przeciwciało, które jest zasadniczo wolne od innych przeciwciał, wykazujących inne specyficzności antygenowe (np. wyizolowane przeciwciało, które specyficznie wiąże hIL-12, jest zasadniczo wolne od przeciwciał, które specyficznie wiążą antygeny inne niż hlL-12). Wyizolowane przeciwciało, które specyficznie wiąże hlL-12, może wiązać cząsteczki IL-12 innych gatunków (co omówiono bardziej szczegółowo poniżej). Ponadto, wyizolowane przeciwciało może być zasadniczo wolne od innego materiału komórkowego lub związków chemicznych.
„Przeciwciało neutralizujące” (lub „przeciwciało, które neutralizuje aktywność IL-12”) obejmuje przeciwciało, dla którego wynikiem wiązania z hIL-12 jest hamowanie aktywności biologicznej hIL-12. To hamowanie biologicznej aktywności hIL-12 można oceniać przez pomiar jednego lub większej liczby wskaźników aktywności biologicznej hIL-12, takich jak hamowanie proliferacji ludzkich komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny w oznaczeniu proliferacji ludzkich komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny (PHA) lub hamowanie wiązania z receptorem w oznaczeniu wiązania z receptorem ludzkiej IL-12 (patrz Przykład 3 - Oznaczenie indukcji interferonu gamma). Te wskaźniki
PL 218 748 B1 aktywności biologicznej hIL-12 można oceniać dzięki jednemu lub większej liczbie z kilku znanych w tej dziedzinie standardowych oznaczeń in vitro i in vivo (patrz Przykład 3).
Termin „aktywność” obejmuje takie aktywności, jak specyficzność/powinowactwo wiązania przeciwciała z antygenem, na przykład przeciwciała, które wiąże się z antygenem IL-12, i/lub neutralizującą siłę przeciwciała, na przykład przeciwciała przeciw hIL-12, którego wiązanie z hIL-12 hamuje aktywność biologiczną hIL-12, np. hamowanie proliferacji komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny lub hamowanie wiązania z receptorem w oznaczeniu wiązania z receptorem Iudzkiej IL-12 (patrz Przykład 3).
Zwrot „powierzchniowy rezonans plazmonowy” obejmuje zjawisko optyczne, które umożliwia analizę w czasie rzeczywistym biospecyficznych oddziaływań przez wykrywanie zmian w stężeniach białka w macierzy biosensora, na przykład z zastosowaniem układu BIAcore (Pharmacia Biosensor
AB, Uppsala, Szwecja, oraz Piscataway, NJ). Dla dalszego opisu, patrz Przykład oraz Jonsson, U. i in. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jonsson, U. i in. (1991) Biotechniques 11: 620-627; Johnsson, B. i in. (1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131 oraz Johnsson, B. i in. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277.
Termin „Koff”, w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, w zamierzeniu odnosi się do stałej szybkości dysocjacji przeciwciała z kompleksu przeciwciało/antygen.
Termin „Kd, w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, w zamierzeniu odnosi się do stałej dysocjacji oddziaływań określonego przeciwciała z antygenem.
Zwrot „cząsteczka kwasu nukleinowego” obejmuje cząsteczki DNA i cząsteczki RNA. Cząsteczka kwasu nukleinowego może być jednoniciowa lub dwunicowa, ale korzystnie jest dwuniciowym DNA.
Zwrot „wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego”, stosowany w niniejszym opisie w odniesieniu do kwasów nukleinowych kodujących przeciwciała lub części przeciwciał (np. VH, VL, CDR3), które wiążą hIL-12 (włącznie z „wyizolowanymi przeciwciałami), obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego, w której sekwencje nukleotydowe kodujące przeciwciało lub część przeciwciała są wolne od innych sekwencji nukleotydowych, kodujących przeciwciała lub części przeciwciał, które wiążą antygeny inne niż hIL-12, które to inne sekwencje mogą naturalnie flankować kwas nukleinowy w ludzkim DNA genomowym. A zatem, na przykład, wyizolowany kwas nukleinowy według wynalazku, kodujący region VH przeciwciała przeciw IL-12, nie zawiera żadnych innych sekwencji kodujących inne regiony VH, które wiążą antygeny inne, niż IL-12. Zwrot „wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego w zamierzeniu obejmuje również sekwencje kodujące dwuwartościowe przeciwciała o podwójnej specyficzności, takie jak diaciała, w których regiony VH i VL nie zawierają żadnych sekwencji innych od sekwencji diaciała.
Termin „wektor” obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego, zdolną do przenoszenia innego kwasu nukleinowego, z którym została połączona. Jednym z rodzajów wektorów jest „plazmid”, który odnosi się do kolistej, dwuniciowej pętli DNA, z którą można ligować dodatkowe odcinki DNA. Innym rodzajem wektora jest wektor wirusowy, w którym z genomem wirusowym można ligować dodatkowe odcinki DNA. Niektóre wektory są zdolne do autonomicznej replikacji w komórce gospodarzu, do której zostały wprowadzone (np. wektory bakteryjne zawierające bakteryjne miejsce początku replikacji oraz episomalne wektory ssacze). Inne wektory (np. nieepisomalne wektory ssacze) mogą po wprowadzeniu do komórki gospodarza ulegać integracji z genomem komórki gospodarza i dzięki temu ulegać replikacji razem z genomem gospodarza. Ponadto, niektóre wektory są zdolne do kierowania ekspresją genów, z którymi połączono je w sposób umożliwiający działanie. Takie wektory określa się w niniejszym opisie jako „zrekombinowane wektory ekspresyjne (bądź po prostu „wektory ekspresyjne”). Generalnie, wektory użyteczne w technikach rekombinacji DNA mają często postać plazmidów. W niniejszym opisie, „plazmid” i „wektor” mogą być stosowane zamiennie, ponieważ plazmid jest najpowszechniej stosowaną postacią wektora. Jednakże, wynalazek w zamierzeniu obejmuje takie inne postacie wektorów ekspresyjnych, jak wektory wirusowe (np. retrowirusy defektywne pod względem replikacji, adenowirusy i wirusy adenosatelitarne), które pełnią równoważne funkcje.
Zwrot zrekombinowana komórka gospodarz” (bądź po prostu „komórka gospodarz”) obejmuje komórkę, do której wprowadzono zrekombinowany wektor ekspresyjny. Powinno być zrozumiałe, że takie terminy w zamierzeniu odnoszą się nie tylko do określonej tej komórki, ale także do potomstwa takiej komórki. Ponieważ w kolejnych pokoleniach mogą występować pewne modyfikacje z powodu albo mutacji, albo wpływów środowiskowych, takie potomstwo w rzeczywistości może nie być identyczne z komórką macierzystą, ale jest nadal objęte zakresem terminu „komórka gospodarz” w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie.
PL 218 748 B1
Termin „modyfikowanie”, w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, w zamierzeniu odnosi się do zmieniania jednego lub większej liczby aminokwasów w przeciwciałach lub ich częściach wiążących antygen. Zmianę można powodować przez dodanie, podstawienie lub wydeletowanie aminokwasu w jednej lub większej liczby pozycji. Zmianę można powodować stosując znane techniki, takie jak mutageneza przez PCR.
Zwrot „pozycja kontaktu” obejmuje pozycję aminokwasową w CDR1, CDR2 lub CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego lub regionu zmiennego łańcucha lekkiego przeciwciała, którą zajmuje aminokwas, który kontaktuje się z antygenem w jednej z dwudziestu sześciu znanych struktur przeciwciało-antygen. Jeśli aminokwas CDR w którejkolwiek z 26 znanych, określonych struktur kompleksów przeciwciało-antygen, wchodzi w kontakt z antygenem, to aminokwas ten można uważać za zajmujący pozycję kontaktu. Pozycje kontaktu posiadają wyższe prawdopodobieństwo ulegania zajęciu aminokwas, który wchodzi w kontakt z antygenem, niż pozycje nie będące pozycjami kontaktu. Korzystnie, pozycją kontaktu jest pozycja w CDR, która ma aminokwas wchodzący w kontakt z antygenem w więcej niż 3 z 26 struktur (> 11,5%). Najkorzystniej, pozycją kontaktu jest pozycja w CDR, która ma aminokwas wchodzący w kontakt z antygenem w więcej niż 8 z 25 struktur (> 32%).
Termin „pozycja hipermutacji” obejmuje resztę aminokwasową, która zajmuje pozycję w regionie CDR1, CDR2 lub CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego lub regionie zmiennym łańcucha lekkiego przeciwciała, którą uważa się za posiadającą wysoką częstość lub prawdopodobieństwo hipermutacji somatycznej podczas dojrzewania przeciwciała pod względem powinowactwa in vivo. „Wysoka częstość lub prawdopodobieństwo hipermutacji somatycznej” obejmuje częstości lub prawdopodobieństwa od 5 do 40% szansy, że reszta ulegnie hipermutacji somatycznej podczas dojrzewania przeciwciała pod względem powinowactwa in vivo. Powinno być zrozumiałe, że wszystkie zakresy w obrębie tego podanego zakresu również w zamierzeniu stanowią część wynalazku, np. od 5 do około 30%, np. od 5 do około 15%, np. od 15 do około 30%.
Termin „korzystna pozycja selektywnej mutagenezy” obejmuje resztę aminokwasową, która zajmuje pozycję w regionie CDR1, CDR2 lub CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego lub regionie zmiennym łańcucha lekkiego, którą można uważać za będącą zarówno pozycją kontaktu, jak i hipermutacji.
Zwrot „podejście selektywnej mutagenezy” obejmuje sposób poprawiania aktywności przeciwciała przez wybór i pojedynczo poddawanie mutacji aminokwasów CDR w co najmniej jednej korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji hipermutacji i/lub kontaktu. „Selektywnie zmutowanym przeciwciałem ludzkim jest przeciwciało, które ma mutację w pozycji wybranej przy zastosowaniu podejścia selektywnej mutagenezy. W innym rozwiązaniu, podejście selektywnej mutagenezy w zamierzeniu zapewnia sposób preferencyjnego poddawania mutacji wybranych pojedynczych reszt aminokwasowych w CDR1, CDR2 lub CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (dalej w niniejszym opisie odpowiednio H1, H2 i H3) bądź w CDR1, CDR2 lub CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego (dalej w niniejszym opisie odpowiednio L1, L2 i L3) przeciwciała. Reszty aminokwasowe można wybierać spośród korzystnych pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub pozycji hipermutacji. Pojedyncze aminokwasy wybiera się w oparciu o ich pozycję w regionie zmiennym łańcucha lekkiego lub ciężkiego. Powinno być zrozumiałe, że pozycja hipermutacji może być również pozycją kontaktu. W jednym rozwiązaniu, podejście selektywnej mutagenezy jest „podejściem ukierunkowanym. Określenie „podejście ukierunkowane” w zamierzeniu obejmuje sposób preferencyjnego poddawania mutacji wybranych pojedynczych reszt aminokwasowych w CDR1, CDR2 lub CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego, bądź w CDR1, CDR2 lub CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego przeciwciała w sposób ukierunkowany, np. „podejście ukierunkowane wobec grupy” lub „podejście ukierunkowane wobec CDR”. W „podejściu ukierunkowanym wobec grupy”, celem selektywnych mutacji są pojedyncze reszty aminokwasowe w określonych grupach, obejmujących grupę I (obejmującą L3 i H3), II (obejmującą H2 i L1) oraz III (obejmującą L2 i H1); grupy wymieniono w kolejności preferencyjności ukierunkowania. W „podejściu ukierunkowanym wobec CDR”, celem selektywnych mutacji są pojedyncze reszty aminokwasowe w określonych CDR w następującej kolejności preferencyjności: H3, L3, H2, L1, H1 i L2. Wybraną resztę aminokwasową poddaje się mutacjom np. do co najmniej dwóch innych reszt aminokwasowych, i określa się wpływ mutacji na aktywność przeciwciała. Aktywność mierzy się jako zmianę specyficzności/powinowactwa wiązania przeciwciała i/lub siły neutralizacji przez przeciwciało. Powinno być zrozumiałe, że podejście selektywnej mutagenezy można stosować do optymalizacji jakiegokolwiek przeciwciała pochodzącego z jakiegokolwiek źródła, włącznie z biblioteką prezentowaną przez fagi, zwierzętami transgenicznymi z ludzkimi genami linii
PL 218 748 B1 zarodkowych IgG i ludzkimi przeciwciałami wyizolowanymi z ludzkich komórek B. Korzystnie, podejście selektywnej mutagenezy stosuje się wobec przeciwciał, których nie można optymalizować dalej stosując technikę prezentacji przez fagi. Powinno być zrozumiałe, że przed lub po podejściu selektywnej mutagenezy, przeciwciała z jakiegokolwiek źródła, włącznie z biblioteką prezentowaną przez fagi, zwierzętami transgenicznymi z ludzkimi genami linii zarodkowych IgG i ludzkimi przeciwciałami wyizolowanymi z ludzkich komórek B, można poddawać mutacji wstecznej.
Termin „wzmacniająca aktywność reszta aminokwasowa” obejmuje resztę aminokwasową, która poprawia aktywność przeciwciała. Powinno być zrozumiałe, że wzmacniająca aktywność reszta aminokwasowa może zastępować resztę aminokwasową w korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub pozycji hipermutacji oraz, ponadto, że więcej niż jedna wzmacniająca aktywność reszta aminokwasowa może być obecna w jednym lub więcej z CDR. Wzmacniająca aktywność reszta aminokwasowa obejmuje resztę aminokwasową, która poprawia specyficzność/powinowactwo wiązania przeciwciała, na przykład wiązania przeciwciała przeciw ludzkiej IL-12 z ludzką IL-12. Wzmacniająca aktywność reszta aminokwasowa w zamierzeniu obejmuje również resztę aminokwasową, która poprawia siłę neutralizacji przeciwciała, na przykład przeciwciała przeciw ludzkiej IL-12, które hamuje ludzką IL-12.
Różne aspekty wynalazku opisano bardziej szczegółowo w poniższych częściach.
I. Ludzkie przeciwciała, które wiążą ludzką IL-12
Wynalazek ten dostarcza wyizolowane przeciwciała ludzkie, lub ich części wiążące antygen, jak opisano powyżej. Korzystnie, przeciwciała ludzkie według wynalazku są zrekombinowanymi, neutralizującymi przeciwciałami ludzkimi przeciw hIL-12. Przeciwciała według wynalazku, które wiążą się z ludzką IL-12, można wyselekcjonować, na przykład, przez przeszukanie jednej lub więcej bibliotek cDNA ludzkich VL i VH stosując hIL-12, tak jak technikami prezentacji przez fagi, jak opisano w przykładzie 1. W wyniku przeszukania bibliotek cDNA ludzkich VL i VH wstępnie zidentyfikowano szereg przeciwciał przeciw IL-12, z których jedno przeciwciało, określane w niniejszym opisie jako „Joe 9 (lub „Joe 9 typu dzikiego, wybrano do dalszego rozwoju. Joe 9 jest przeciwciałem przeciw ludzkiej IL-12 o stosunkowo niskim powinowactwie (np. Koff wynosi około 0,1 s-1), ale użyteczne jest do specyficznego wiązania i wykrywania hIL-12. Powinowactwo przeciwciała Joe 9 poprawiono przez przeprowadzenie mutagenezy CDR łańcucha ciężkiego i lekkiego, tworząc zestaw regionów zmiennych łańcuchów lekkiego i ciężkiego, które „mieszano i dopasowywano” oraz poddawano dalszym mutacjom, co doprowadziło do licznych dodatkowych przeciwciał przeciw hIL-12, o podwyższonym powinowactwie wobec hIL-12 (patrz Przykład 1, Tabela 2 (patrz Załącznik A) oraz przyporządkowania sekwencji na Figurach 1A-1D).
Spośród tych przeciwciał, ludzkie przeciwciało przeciw hIL-12, określane w niniejszym opisie jako Y61, wykazywało znacząco poprawione powinowactwo wiązania (np. Koff wynosi około
-4 -1 x 10-4 s-1. Przeciwciało Y61 przeciw hIL-12 wybrano do dalszego dojrzewania pod względem powinowactwa przez pojedyncze poddawanie mutacjom specyficznych reszt aminokwasowych w obrębie CDR łańcucha ciężkiego i lekkiego. Reszty aminokwasowe Y61 do mutacji specyficznej wobec miejsca (podejście selektywnej mutagenezy) wybierano w oparciu o resztę aminokwasową zajmującą korzystną pozycję selektywnej mutagenezy, pozycję kontaktu i/lub pozycję hipermutacji. Podsumowanie podstawień w wybranych pozycjach CDR łańcucha lekkiego i ciężkiego przedstawiono na Figurach 2A-2H. Korzystne zrekombinowane, neutralizujące przeciwciało według wynalazku określane w niniejszym opisie jako J695, było wynikiem podstawienia Gly do Tyr w pozycji 50 CDR2 łańcucha lekkiego Y61 oraz podstawienia Gly do Tyr w pozycji 94 CDR3 łańcucha lekkiego Y61.
Przyporządkowania sekwencji aminokwasowych regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i lekkiego zestawu przeciwciał przeciw IL-12 według wynalazku, w linii od Joe 9 typu dzikiego do J695, przedstawiono na Figurach 1A-1D. Przyporządkowania sekwencji umożliwiły identyfikację sekwencji konsensusowych dla korzystnych regionów zmiennych łańcucha lekkiego i ciężkiego przeciwciał według wynalazku, które wiążą hIL-12, jak również sekwencji konsensusowych dla CDR3, CDR2 i CDR1, w linii od Joe 9 do J695. Ponadto, podsumowana na Figurach 2A-2H analiza mutagenezy Y61 pozwoliła na identyfikację sekwencji konsensusowych dla CDR3, CDR2 i CDR1, które wiążą hIL-12, w linii od Y61 do J695, obejmujących sekwencje z modyfikacjami w stosunku do Y61, które nadal zachowują cechy dobrego wiązania hIL-12. Korzystne sekwencje CDR, VH i VL zgodne z wynalazkiem (obejmujące sekwencje konsensusowe), identyfikowane przez identyfikatory sekwencji w dołączonym Wykazie Sekwencji, podsumowano poniżej.
PL 218 748 B1
SEQ ID NO: | ŁAŃCUCH PRZECIWCIAŁA | REGION | SEKWENCJA |
1 | Konsensus od Joe 9 do J695 | CDR H3 | (H/S)-G-S-(H/Y)-D-(N/T/Y) |
2 | Konsensus od Joe 9 do J695 | CDR L3 | Q-<SZT)-Y-(D/E)-(S/R7K)-<S/G/Y)-(L/F/T/S)- (R/S/T/W/H)-(G/P)-(S/T/A/L)-(R/S/M/T/L)- (V/I/T/M/L) |
3 | Konsensus od Joe 9 do J695 | CDR H2 | F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V-K-G |
4 | Konsensus od Joe 9 do J695 | CDR L2 | (G/Y)-N-(D/S)-(Q/N)-R-P-S |
5 | Konsensus od Joe 9 do J695 | CDR H1 | F-T-F-S-(S/E)-Y-G-M-H |
6 | Konsensus od Joe 9 do J695 | CDR L1 | (S/T)-G-(G/S)-(R/S)-S-N-I-(G/V)-(S/A)- (N/G/Y)-(T/D)-V-(K/H) |
7 | Konsensus od Joe 9 do J695 | VH | (pełna sekwencja VH; patrz wykaz sekwencji) |
8 | Konsensus od Joe 9 do J695 | VL | (pełna sekwencja VH; patrz wykaz sekwencji) |
9 | Konsensus od Y61 do J695 | CDR H3 | H-(G/V/C/H)-(S/T)-(H/T/V/R//I)-(D/S)- (N/K/A/T/S/F/W/H) |
10 | Konsensus od Y61 do J695 | CDR L3 | Q-S-Y-(DZS)-(Xaa)- (G/D/Q/L/F/R/H/N/Y)-T-H-P-A-L-L |
11 | Konsensus od Y61 do J695 | CDR H2 | (F/T/Y)-I-(R/A)-Y-(D/S/E/A)-(G/R)-S- (Xaa)-K-(Y/E)-Y-A-D-S-V-K-G |
12 | Konsensus od Y61 do J695 | CDR L2 | (G/Y/S/T/N/Q)-N-D-Q-R-P-S |
13 | Konsensus od Y61 do J695 | CDR H1 | F-T-F-(Xaa)-(Xaa)-(Y/H)-(G/M/A/N/S)-M-H |
14 | Konsensus od Y61 do J695 | CDR L1 | S-G-G-R-S-N-I-G-(S/C/R/N/D/T)-(N/M/I)- (T/Y/D/H/K/P)-V-K |
15 | Konsensus od Y61 do J695 | VH | (pełna sekwencja VH; patrz wykaz sekwencji) |
16 | Konsensus od Y61 do J695 | VL | (pełna sekwencja VL; patrz wykaz sekwencji) |
17 | Y61 | CDR H3 | H-G-S-H-D-N |
18 | Y61 | CDR L3 | Q-S-Y-D-R-G-T-H-P-A-L- |
19 | Y61 | CDR H2 | F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V-K-G |
20 | Y61 | CDR L2 | G-N-D-Q-R-P-S |
21 | Y61 | CDR H1 | F-T-F-S-S-Y-G-M-H |
22 | Y61 | CDR L1 | S-G-G-R-S-N-I-G-S-N-T-V-K |
23 | Y61 | VH | (pełna sekwencja VH; patrz wykaz sekwencji) |
24 | Y61 | VL | (pełna sekwencja VL; patrz wykaz sekwencji |
25 | J695 | CDR H3 | H-G-S-H-D-N |
26 | J695 | CDR L3 | Q-S-Y-D-R-Y-T-H-P-A-L-L |
27 | J695 | CDR H2 | F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V-K-G |
28 | J695 | CDR L2 | Y-N-D-Q-R-P-S |
29 | J695 | CDR H1 | F-T-F-S-S-Y-Y-G-M-H |
30 | J695 | CDR L1 | S-G-S-R-S-N-I-G-S-N-T-V-K |
31 | J695 | VH | (pełna sekwencja VH; patrz wykaz sekwencji) |
32 | J695 | VL | (pełna sekwencja VL; patrz wykaz sekwencji) |
PL 218 748 B1
Przeciwciała utworzone w wyniku dojrzewania Joe 9 typu dzikiego pod względem powinowactwa scharakteryzowano funkcjonalnie przez analizę metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego w celu określenia Kd i szybkości Koff. Wytworzono szereg przeciwciał mających szybkości Koff -1 -5 -1 -4 -5 -1 w zakresie od około 0,1 s-1 do około 1 x 10-5 s-1, a korzystniej Koff od około 1 x 10-4 do 1 x 10-5 s-1 lub niższą. Przeciwciała scharakteryzowano również in vitro pod względem ich zdolności do hamowania proliferacji komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny (PHA), jak opisano w Przykładzie 3, Utworzono szereg przeciwciał wykazujących wartość IC50 w zakresie od około 1 x 10-6 M do około 1 x 10-11 Μ, korzystniej od około 1 x 10-10 do 1 x 10-11 M lub niższą.
Zgodnie z tym, w jednym aspekcie, ujawnienie dostarcza wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążącą antygen, które wiąże się z ludzką IL-12 i dysocjuje od ludzkiej IL-12 ze stałą szyb-1 kości Koff wynoszącą 0,1 s-1 lub niższą, oznaczoną przez powierzchniowy rezonans plazmonowy, bądź które hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny w oznaczeniu proliferacji komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny in vitro (oznaczeniu PHA) z IC50 wynoszącym 1 x 10-6 M lub niższym. Korzystnie, ujawnione tu wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część
-2 -1 wiążąca antygen, dysocjuje od ludzkiej IL-12 ze stałą szybkości Koff wynoszącą 1 x 10-2 s-1 lub niższą, bądź hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny w oznaczeniu PHA in vitro z IC50 wynoszącym 1 x 10-7 M lub niższym. Korzystnie, ujawnione tu wyizolowane przeciwciało przeciw ludzkiej IL-12, lub jego część wiążąca antygen, dysocjuje od ludzkiej IL-12 ze stałą szybkości
-3 -1
Koff wynoszącą 1 x 10-3 s-1 lub niższą, bądź hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny w oznaczeniu PHA in vitro z IC50 wynoszącym 1 x 10-8 M lub niższym. Zgodnie z wynalazkiem, wyizolowane przeciwciało przeciw ludzkiej IL-12, lub jego część wiążąca antygen,
-4 -1 dysocjuje od ludzkiej IL-12 ze stałą szybkości Koff wynoszącą 1 x 10-4 s-1 lub niższą, bądź hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny w oznaczeniu PHA in vitro z IC50 wynoszącym 1 x 10-9 M lub niższym. W korzystniejszych rozwiązaniach, wyizolowane przeciwciało przeciw ludzkiej IL-12, lub jego część wiążąca antygen, dysocjuje od ludzkiej IL-12 ze stałą szybkości Koff -5 -1 wynoszącą 1 x 10-5 s-1 lub niższą, bądź hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem fito-10 hemaglutyniny w oznaczeniu PHA in vitro z IC50 wynoszącym 1 x 10-10 M lub niższym. W jeszcze korzystniejszych rozwiązaniach, wyizolowane przeciwciało przeciw ludzkiej IL-12, lub jego część wiążą-5 -1 ca antygen, dysocjuje od ludzkiej IL-12 ze stałą szybkości Koff wynoszącą 1 x 10-5 s-1 lub niższą, bądź hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny w oznaczeniu PHA in vitro z IC50 wynoszącym 1 x 10-11 M lub niższym.
Stałą szybkości dysocjacji (Koff) przeciwciała przeciw IL-12 można określić dzięki powierzchniowemu rezonansowi plazmonowemu (patrz Przykład 5). Generalnie, w analizie techniką powierzchniowego rezonansu plazmonowego mierzy się w czasie rzeczywistym oddziaływania wiązania pomiędzy ligandem (zrekombinowaną ludzką IL-12, zimmobilizowaną na macierzy biosensora) a analizowaną substancją (przeciwciałami w roztworze) przez powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) z zastosowaniem układu BIAcore (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Analizę powierzchniowego rezonansu plazmonowego można również przeprowadzić przez immobilizację substancji analizowanej (przeciwciał na macierzy biosensora) i prezentowanie liganda (zrekombinowanej IL-12 w roztworze). Neutralizującą aktywność przeciwciał przeciw IL-12, lub ich części wiążących antygen, można oceniać stosując jedno lub więcej z kilku odpowiednich oznaczeń in vivo (patrz Przykład 3).
W nauce dobrze wiadomo, że CDR łańcuchów ciężkich i lekkich przeciwciał odgrywają ważną rolę w specyficzności/powinowactwie wiązania przeciwciała z antygenem. A zatem, ujawnienie dostarcza ludzkie przeciwciała zawierające CDR łańcucha lekkiego i ciężkiego z Joe 9, jak również inne przeciwciała zawierające CDR, które zmodyfikowano w celu poprawienia specyficzności/powinowactwa wiązania przeciwciała. Jak wykazano w Przykładzie I, wynikiem szeregu modyfikacji CDR łańcucha lekkiego i ciężkiego było dojrzewanie pod względem powinowactwa ludzkich przeciwciał przeciw hIL-12. Przyporządkowania sekwencji aminokwasowych regionów zmiennych łańcuchów ciężkich i lekkich szeregu ludzkich przeciwciał, w zakresie od Joe 9 typu dzikiego do J695, które wiążą ludzką IL-12, przedstawiono na Figurach 1A-1D. Konsensowe motywy sekwencji dla CDR przeciwciał można określić na podstawie przyporządkowania sekwencji (jak podsumowano w powyższej tabeli). Na przykład, motyw konsensusowy dla CDR3 VH w linii od Joe 9 do J695 obejmuje sekwencję aminokwasową: (H/S)-G-S-(H/Y)-D-(N/T/Y) (SEQ ID NO: 1), która obejmuje aminokwasy od 95 do 102 pozycji konsensusowego HCVR przedstawionego w SEQ ID NO: 7. Motyw konsensowy dla CDR3 VL obejmuje sekwencję aminokwasową: Q-(S/T)-Y-(D/E)-(S/R-K)-(S/G/Y)-(L/F/T/S)-(R/S/T/W/H)-(G/P)PL 218 748 B1
-(S/T/A/L)-(R/S/M/T/L-V/I/T/M/L) (SEQ ID NO: 2), która obejmuje aminokwasy od 89 do 97 pozycji konsensusowego LCVR, przedstawionego w SEQ ID NO: 8.
A zatem, w innym aspekcie, ujawnienie dostarcza wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążącą antygen, które wykazuje następujące cechy charakterystyczne:
a) hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny w oznaczeniu PHA in vitro z IC50 wynoszącym 1 x 10-6 M lub niższym;
b) zawiera CDR3 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 1; oraz
c) zawiera CDR3 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 2.
To przeciwciało zawiera ponadto CDR2 VH obejmujący sekwencję aminokwasową: F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID NO: 3) (która obejmuje aminokwasy od 50 do 65 pozycji konsensusowego HCVR obejmującego sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 7) i ponadto zawiera CDR2 VL obejmujący sekwencję aminokwasową; (G/Y)-N-(D/S)-(Q/N)-R-P-S (SEQ ID NO: 4) (która obejmuje aminokwasy od 50 do 56 pozycji konsensusowego LCVR obejmującego sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 8).
To przeciwciało zawiera ponadto CDR1 VH obejmujący sekwencję aminokwasową: F-T-F-S-(S/E)-Y-G-M-H (SEQ ID NO: 5) (która obejmuje aminokwasy od 27 do 35 pozycji konsensusowego HCVR obejmującego sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 7) i ponadto zawiera CDR1 VL, obejmujący sekwencję aminokwasową: (S/T)-G-(G/S)-(R/S)-S-N-I-(G/V)-(S/A)-(N/G/Y)(T/D)-V-(K/H) (SEQ ID NO: 6) (która obejmuje aminokwasy od 24 do 34 pozycji konsensusowego LCVR, obejmującego sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 8).
To ujawnione przeciwciało zawiera HCVR obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 7 oraz LCVR obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 8.
W oparciu o przeprowadzoną wobec Y61 analizę mutacyjną można określić dodatkowe motywy konsensusowe, które prowadzą do uzyskania przeciwciała J695 (podsumowane na Figurach 2A-2H). Jak wykazują wykresy przedstawione na Figurach 2A-2H, niektóre reszty CDR łańcucha ciężkiego i lekkiego Y61 podlegały podstawieniom bez znaczącego osłabiania właściwości wiązania hIL-12 przeciwciała. Na przykład, pojedyncze podstawienia w pozycji 30 w CDR H1 dwudziestoma różnymi aminokwasami nie obniżały znacząco szybkości Koff przeciwciała, co wskazuje, że ta pozycja może podlegać podstawieniom szeregiem różnych reszt aminokwasowych. A zatem, w oparciu o analizę mutacyjną (tj. pozycje w Y61, które mogły ulegać podstawieniom innymi resztami aminokwasowymi), określono motywy konsensusowe. Motywy konsensusowe dla CDR3 łańcucha ciężkiego i lekkiego przedstawiono odpowiednio w SEQ ID NO: 9 i 10, motywy konsensusowe dla CDR2 łańcucha ciężkiego i lekkiego przedstawiono odpowiednio w SEQ ID NO: 11 i 12, a motywy konsensusowe w CDR1 łańcucha ciężkiego i lekkiego przedstawiono odpowiednio w SEQ ID NO: 13 i 14. Motywy konsensusowe dla regionów VH i VL przedstawiono odpowiednio w SEQ ID NO: 15 i 16.
A zatem, w jednym aspekcie, wynalazek dostarcza wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążącą antygen, które wykazuje następujące cechy charakterystyczne:
a) hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny w oznaczeniu PHA in vitro z IC50 wynoszącym 1 x 10-9 M lub niższym;
b) zawiera CDR3 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 9; oraz
c) zawiera CDR3 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 10.
W korzystnym rozwiązaniu, przeciwciało zawiera ponadto CDR2 VH obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 11 i ponadto zawiera CDR2 VL obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 12.
W innym korzystnym rozwiązaniu, przeciwciało ponadto zawiera CDR1 VH obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 13 i ponadto zawiera CDR1 VL obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 14.
W jeszcze innym korzystnym rozwiązaniu, przeciwciało według wynalazku zawiera HCVR obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 15 oraz LCVR obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 16.
PL 218 748 B1
Korzystne przeciwciało według wynalazku, ludzkie przeciwciało Y61 przeciw hIL-12, utworzono przez dojrzewanie Joe 9 typu dzikiego pod względem powinowactwa przez mutagenezę CDR3 poprzez PCR (jak opisano w Przykładzie 1). Y61 ma poprawioną specyficzność/powinowactwo wiązania określone przez powierzchniowy rezonans plazmonowy i oznaczenia neutralizacji in vitro. CDR3 łańcucha ciężkiego i lekkiego Y61 przedstawiono odpowiednio w SEQ ID NO: 17 i 18, CDR2 łańcucha ciężkiego i lekkiego Y61 przedstawiono odpowiednio w SEQ ID NO: 19 i 20, a CDR1 łańcucha ciężkiego i lekkiego Y61 przedstawiono odpowiednio w SEQ ID NO: 21 i 22. VH Y61 zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 23, a VL Y61 zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 24 (sekwencje te przedstawiono również na Figurach 1A-1D, przyporządkowane do Joe 9).
A zatem, w jednym aspekcie, wynalazek dostarcza wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążącą antygen, które:
a) hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny w oznaczeniu PHA in vitro z IC50 wynoszącym 1 x 10-9 M lub niższym;
b) zawiera CDR3 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 17; oraz
c) zawiera CDR3 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 18.
W korzystnym rozwiązaniu, wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, zawiera CDR2 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 19 i CDR2 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID
NO: 20.
W innym korzystnym rozwiązaniu, wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, zawiera CDR1 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 21 i CDR1 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 22.
W jeszcze innym korzystnym rozwiązaniu, wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 23 oraz region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 24.
W niektórych rozwiązaniach, przeciwciało o pełnej długości zawiera region stały łańcucha ciężkiego, taki jak regiony stałe IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA i IgE, oraz jakikolwiek ich wariant allotypowy, jak opisano w Kabat (Kabat, E. A. i in. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie piąte, U.S. Department of Health and Human Services, Publikacja NIH nr 91-3242). Korzystnie, region stały łańcucha ciężkiego jest regionem stałym łańcucha ciężkiego IgG1. Alternatywnie, część przeciwciała może być fragmentem F(ab')2 lub jednołańcuchowym fragmentem Fv.
Modyfikacje pojedynczych reszt Y61 prowadzą do utworzenia zestawu przeciwciał, przedstawionych na Figurach 2A-2H. Specyficzność/powinowactwo wiązania każdego przeciwciała określono przez powierzchniowy rezonans plazmonowy i/lub przez oznaczenia neutralizacji in vitro.
A zatem, w innym aspekcie, wynalazek dostarcza wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążącą antygen, które:
a) hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny w oznaczeniu PHA in vitro z IC50 wynoszącym 1 x 10-9 M lub niższym;
b) zawiera CDR3 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji przedstawionych w SEQ ID NO: 404 - SEQ ID NO: 469; oraz
c) zawiera CDR3 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji przedstawionych w SEQ ID NO: 534 - SEQ ID NO: 579.
W korzystnym rozwiązaniu, wyizolowane przeciwciało Iudzkie, lub jego część wiążąca antygen, zawiera CDR2 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji przedstawionych w SEQ ID NO: 335 - SEQ ID NO: 403 i CDR2 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji przedstawionych w SEQ ID NO: 506 - SEQ ID NO: 533.
W innym korzystnym rozwiązaniu, wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, zawiera CDR1 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji przedstawionych w SEQ ID NO: 288 - SEQ ID NO: 334 i CDR1 łańcucha
PL 218 748 B1 lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji przedstawionych w SEQ ID NO: 470 - SEQ ID NO: 505.
W jeszcze innym korzystnym rozwiązaniu, wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 23 oraz region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną W SEQ ID NO: 24.
W niektórych rozwiązaniach, przeciwciało o pełnej długości zawiera region stały łańcucha ciężkiego, taki jak regiony stałe IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA i IgE, oraz jakikolwiek ich wariant allotypowy, jak opisano w Kabat (Kabat, E. A. i in. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie piąte, U.S. Department of Health and Human Services. Publikacja NIH nr 91-3242). Korzystnie, region stały łańcucha ciężkiego jest regionem stałym łańcucha ciężkiego IgG1. Alternatywnie, część przeciwciała może być fragmentem Fab, fragmentem F(ab')2 lub jednołańcuchowym fragmentem Fv.
Szczególnie korzystne zrekombinowane, neutralizujące przeciwciało według wynalazku, J695, utworzono przez ukierunkowaną mutagenezę lub reszt aminokwasowych kontaktu lub hipermutacji przeciwciała Y61 (patrz Przykład 2 i część III poniżej). J695 różni się od Y61 podstawieniem Gly do Tyr w pozycji 50 CDR2 łańcucha lekkiego i podstawieniem Gly do Tyr w pozycji 94 CDR3 łańcucha lekkiego. CDR3 łańcuchów ciężkiego i lekkiego J695 przedstawiono odpowiednio w SEQ ID NO: 25 i 26, CDR2 łańcuchów ciężkiego i lekkiego J695 przedstawiono odpowiednio w SEQ ID NO: 27 i 28, a CDR1 łańcuchów ciężkiego i lekkiego J695 przedstawiono odpowiednio w SEQ ID NO: 29 i 30. VH J695 zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 31, a VL J695 zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 32 (sekwencje te przedstawiono również na Figurach 1A-1D, przyporządkowane do Joe9).
A zatem, w innym aspekcie, wynalazek dostarcza wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążącą antygen, które:
a) hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny w oznaczeniu PHA in vitro z IC50 wynoszącym 1 x 10-9 M lub niższym;
b) zawiera CDR3 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 25; oraz
c) zawiera CDR3 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 26.
W korzystnym rozwiązaniu, wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, zawiera CDR2 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 27 i CDR2 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 28.
W innym korzystnym rozwiązaniu, wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, zawiera CDR1 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 29 i CDR1 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 30.
W jeszcze innym korzystnym rozwiązaniu, wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 31 oraz region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 32.
W niektórych rozwiązaniach, przeciwciało o pełnej długości zawiera region stały łańcucha ciężkiego, taki jak regiony stałe IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA i IgE, oraz jakikolwiek ich wariant allotypowy, jak opisano w Kabat (Kabat, E. A. i in. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie piąte, U.S. Department of Health and Human Services. Publikacja NIH nr 91-3242). Korzystnie, region stały łańcucha ciężkiego jest regionem stałym łańcucha ciężkiego IgG1. Alternatywnie, część przeciwciała może być fragmentem Fab, fragmentem F(ab')2 lub jednołańcuchowym fragmentem Fv.
W celu zapewnienia dodatkowych przeciwciał przeciw IL-12 według wynalazku, można dokonywać dodatkowych mutacji w korzystnych sekwencjach konsensusowych dla CDR3, CDR2 i CDR1 przeciwciał w linii od Joe 9 do J695 lub w linii od Y61 do J695. Takie metody modyfikacji można przeprowadzić stosując standardowe techniki biologii molekularnej, takie jak mutageneza przez PCR, ukierunkowana wobec pojedynczych aminokwasowych reszt kontaktu lub hipermutacji w CDR łańcucha lekkiego i/lub łańcucha ciężkiego, a następnie kinetyczną i funkcjonalną analizę zmodyfikowanych
PL 218 748 B1 przeciwciał, jak opisano w niniejszym opisie (np. opisane w Przykładzie 3 oznaczenia neutralizacji i analiza z zastosowaniem BIAcore, jak opisano w Przykładzie 5.
A zatem, w innym aspekcie, ujawnienie dostarcza wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążącą antygen, które:
a) hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny w oznaczeniu PHA in vitro z IC50 wynoszącym 1 x 10-6 M lub niższym;
b) zawiera CDR3 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 21, CDR2 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 3 i CDR1 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 5, lub jego mutanta mającego jedno lub większą liczbę podstawień aminokwasowych w korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy lub pozycji hipermutacji, przy czym ten mutant ma szybkość koff nie więcej niż 10-krotnie wyższą niż przeciwciało zawierające CDR3 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 1, CDR2 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 3 oraz CDR1 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 5; oraz
c) zawiera CDR3 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 2, CDR2 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 4 oraz CDR1 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 6, bądź jego mutanta mającego jedno lub większą liczbę podstawień aminokwasowych w korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy lub pozycji hipermutacji, przy czym ten mutant ma szybkość koff nie więcej niż 10-krotnie wyższą niż przeciwciało zawierające CDR3 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 2, CDR2 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 4 oraz CDR1 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 6.
W innym aspekcie, wynalazek dostarcza wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążącą antygen, które:
a) hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny w oznaczeniu PHA in vitro z IC50 wynoszącym 1 x 10-9 M lub niższym;
b) zawiera CDR3 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 9, CDR2 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 11 i CDR1 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 13, lub jego mutanta mającego jedno lub większą liczbę podstawień aminokwasowych w korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub pozycji hipermutacji, przy czym ten mutant ma szybkość koff nie więcej niż 10-krotnie wyższą niż przeciwciało zawierające CDR3 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 9, CDR2 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 11 oraz CDR1 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 13; oraz
c) zawiera CDR3 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 10, CDR2 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 12 oraz CDR1 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 14, bądź jego mutanta mającego jedno lub większą liczbę podstawień aminokwasowych w korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, lub pozycji hipermutacji, przy czym ten mutant ma szybkość koff nie więcej niż 10krotnie wyższą niż przeciwciało zawierające CDR3 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 10, CDR2 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 12 oraz CDR1 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 14.
Specjalista w tej dziedzinie będzie również wiedział, że w celu zapewnienia dodatkowych, przeciwciał przeciw IL-12 według wynalazku, można dokonywać dodatkowych mutacji w regionach CDR, na przykład Y61 lub J695. Takie metody modyfikacji można przeprowadzać stosując standardowe
PL 218 748 B1 techniki biologii molekularnej, jak opisano powyżej. Funkcjonalną i kinetyczną analizę zmodyfikowanych przeciwciał można prowadzić w sposób opisany odpowiednio w Przykładzie 3 i Przykładzie 5. Modyfikacje pojedynczych reszt Y61, które doprowadziły do zidentyfikowania J695, przedstawiono na Figurach 2A-2H i opisano w Przykładzie 2.
A zatem, w innym aspekcie, wynalazek dostarcza wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążącą antygen, które:
a) hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny w oznaczeniu PHA in vitro z IC50 wynoszącym 1 x 10-9 M lub niższym;
b) zawiera CDR3 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 17, CDR2 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 19 i CDR1 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 21, lub jego mutanta mającego jedno lub większą liczbę podstawień aminokwasowych w korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy lub pozycji hipermutacji, przy czym ten mutant ma szybkość koff nie więcej niż 10-krotnie wyższą niż przeciwciało zawierające CDR3 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 17, CDR2 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 19 oraz CDR1 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 21; oraz
c) zawiera CDR3 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 18, CDR2 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 20 oraz CDR1 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 22, bądź jego mutanta mającego jedno lub większą liczbę podstawień aminokwasowych w korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy lub pozycji hipermutacji, przy czym ten mutant ma szybkość koff nie więcej niż 10-krotnie wyższą niż przeciwciało zawierające CDR3 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 18, CDR2 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 20 oraz CDR1 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 22.
W innym aspekcie, wynalazek dostarcza wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążącą antygen, które:
a) hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny w oznaczeniu PHA in vitro z IC50 wynoszącym 1 x 10-9 M lub niższym;
b) zawiera CDR3 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 25, CDR2 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 27 i CDR1 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 29, lub jego mutanta mającego jedno lub większą liczbę podstawień aminokwasowych w korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy lub pozycji hipermutacji, przy czym ten mutant ma szybkość koff nie więcej niż 10-krotnie wyższą niż przeciwciało zawierające CDR3 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 25, CDR2 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 27 oraz CDR1 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 29; oraz
c) zawiera CDR3 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 26, CDR2 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 28 oraz CDR1 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 30, bądź jego mutanta mającego jedno lub większą liczbę podstawień aminokwasowych w korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy lub pozycji hipermutacji, przy czym ten mutant ma szybkość koff nie więcej niż 10-krotnie wyższą niż przeciwciało zawierające CDR3 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 26, CDR2 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 28 oraz CDR1 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 30.
W jeszcze innym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążącą antygen, które neutralizuje aktywność ludzkiej IL-12 oraz co najmniej jednej dodatkowej IL-12 naczelnych, wybranej z grupy składającej się z IL-12 pawiana, IL-12 marmozety, IL-12
PL 218 748 B1 szympansa, IL-12 makaka jawajskiego i IL-12 makaka rezusa, ale które nie neutralizuje aktywności IL-12 myszy.
II. Selekcjonowanie zrekombinowanych przeciwciał ludzkich
Zrekombinowane przeciwciała ludzkie według wynalazku można izolować przez przeszukiwanie rekombinacyjnej, kombinatorycznej biblioteki przeciwciał, korzystnie biblioteki scFv prezentowanych przez fagi, przygotowanej z zastosowaniem ludzkich cDNA VL i VH przygotowanych z mRNA otrzymanego z limfocytów ludzkich. Metody przygotowywania i przeszukiwania takich bibliotek są znane w tej dziedzinie. Poza dostępnymi w handlu zestawami do tworzenia bibliotek prezentowanych przez fagi (np. Recombinant Phage Antibody System Pharmacia, nr katalogowy 27-9400-01, oraz zestaw do prezentacji przez fagi SurfZAPTM Stratagene, nr kat. 240612), przykłady metod i odczynników szczególnie odpowiednich do stosowania w tworzeniu i przeszukiwaniu prezentowanych bibliotek przeciwciał można znaleźć, na przykład, w Kang i in., publikacja PCT nr WO 92/18619; Winter i in., publikacja PCT nr WO 92/20791; Breitling i in., publikacja PCT nr WO 93/01288; McCafferty i in., publikacja PCT nr WO 92/01047; Garrard i in., publikacja PCT nr WO 92/09690; Fuchs i in. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay i in. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85; Huse i in. (1989) Science 246: 12751281; McCafferty i in., Nature (1990) 348: 552-554; Griffiths i in. (1993) EMBO J. 12: 725-734; Hawkins i in. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896; Clackson i in. (1991) Nature 352: 624-628; Gram i in. (1992) PNAS 89: 3576-2580; Garrad i in. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom i in. (1991) Nuc. Acid Res. 4133-4137 oraz Barbas i in. (1991) PNAS 88 7978-7982.
Stosowanymi w tej metodzie bibliotekami przeciwciał są korzystnie biblioteki scFv przygotowane z ludzkich cDNA VL i VH. Biblioteki przeciwciał scFv korzystnie przeszukuje się stosując zrekombinowaną IL-12 jako antygen do selekcji ludzkich sekwencji łańcucha ciężkiego i lekkiego, wykazujących aktywność wiązania IL-12. W celu wyselekcjonowania przeciwciał specyficznych wobec podjednostki p35 IL-12 lub heterodimeru p70, przeprowadzono oznaczenia przeszukiwania w obecności nadmiaru wolnej podjednostki p40. Preferencje wobec podjednostek można określić, na przykład, przez mikromiareczkowanie Frigueta, jak opisano w Przykładzie 1.
Po wyselekcjonowaniu początkowych odcinków ludzkich VL i VH, prowadzi się doświadczenia „mieszania i dopasowywania”, w których różne pary wyselekcjonowanych odcinków VL i VH przeszukuje się pod kątem wiązania IL-12, w celu wyselekcjonowania korzystnych kombinacji par VL/VH (patrz Przykład 1). Dodatkowo, w celu dalszej poprawy powinowactwa i/lub obniżenia stałej szybkości dysocjacji wiązania z hIL-12, odcinki VL i VH korzystnej pary (par) VL/VH można losowo mutować, korzystnie w obrębie regionu CDR3 VH i/lub VL, w procesie analogicznym do procesu mutacji somatycznych in vivo, odpowiedzialnego za dojrzewanie przeciwciał pod względem powinowactwa podczas naturalnej odpowiedzi immunologicznej. To dojrzewanie pod względem powinowactwa in vitro można przeprowadzić przez amplifikowanie regionów VH i VL z zastosowaniem starterów PCR komplementarnych odpowiednio do CDR3 VH lub CDR3 VL, w których to starterach wprowadzono losowe podstawienia z zastosowaniem losowej mieszaniny czterech zasad nukleotydów w określonych pozycjach, tak że otrzymywane w wyniku produkty PCR kodują odcinki VH i VL, w których wprowadzono losowe mutacje w regionach CDR3 VH i/lub VL. Te losowo zmutowane odcinki VH i VL można ponownie selekcjonować i ponownie przeszukiwać pod kątem wiązania z hIL-12, i można wyselekcjonować sekwencje, które wykazują wysokie powinowactwo i niską szybkość dysocjacji wiązania z IL-12. Tabela 2 (patrz Załącznik A) przedstawia przeciwciała, które wykazywały zmienione specyficzność/powinowactwo wiązania, utworzone w wyniku dojrzewania pod względem powinowactwa in vitro.
Po selekcjonowaniu, wyizolowaniu i przeszukiwaniu przeciwciał przeciw hIL-12 według wynalazku z biblioteki prezentacji zrekombinowanych immunoglobulin, kwas nukleinowy kodujący wybrane przeciwciało można odzyskać z cząstki(-ek) fagowej(-ych) (np. z genomu faga) i zsubklonować w innych wektorach ekspresyjnych, stosując standardowe techniki rekombinacji DNA. Jeśli jest to pożądane, kwas nukleinowy można poddawać dalszym modyfikacjom w celu utworzenia innych postaci przeciwciała według wynalazku (np. łączyć z kwasem nukleinowym kodującym dodatkowe domeny immunoglobuliny, takie jak dodatkowe regiony stałe). Dla ekspresji zrekombinowanego przeciwciała ludzkiego wyizolowanego przez przeszukiwanie kombinatorycznej biblioteki, DNA kodujący przeciwciało klonuje się w zrekombinowanym wektorze ekspresyjnym i wprowadza do ssaczej komórki gospodarza, jak bardziej szczegółowo opisano w części IV poniżej.
Metody selekcjonowania przeciwciał wiążących ludzką IL-12 techniką prezentacji przez fagi, oraz dojrzewania pod względem powinowactwa wyselekcjonowanych przeciwciał przez losową lub ukierunkowaną mutagenezę regionów CDR, opisano bardziej szczegółowo w Przykładzie 1.
PL 218 748 B1
Jak opisano w Przykładzie 1, przez przeszukanie bibliotek cDNA ludzkich VL i VH zidentyfikowano szereg przeciwciał przeciw IL-12, z których do dalszego rozwijania wybrano przeciwciało Joe 9. Porównanie regionu zmiennego łańcucha ciężkiego Joe 9 z wybranymi z bazy danych VBASE sekwencjami łańcuchów ciężkich linii zarodkowych ujawniło, że Joe 9 było podobne do sekwencji linii zarodkowej COS-3. COS-3 należy do rodziny VH3 sekwencji linii zarodkowych.
Rodzina VH3 jest częścią zestawu ludzkich linii zarodkowych VH, który podzielono na siedem rodzin, VH1 - VH7, w oparciu o homologię sekwencyjną (Tomlinson i in. (1992) J. Mol. Biol., 227, 776-798 oraz Cook i in. (1995) Immunology Today, 16, 237-242). Rodzina VH3 zawiera największą liczbę przedstawicieli i tworzy największy wkład do zestawu linii zarodkowych. Dla jakiejkolwiek danej sekwencji ludzkiego przeciwciała linii zarodkowej VH3, identyczność sekwencji aminokwasowej w obrębie całej rodziny VH3 jest wysoka (patrz np. Tomlinson i in. (1992) J. Mol. Biol., 227, 776-798 oraz Cook i in. (1995) Immunology Today, 16, 237-242). Zakres identyczności sekwencji aminokwasowych pomiędzy jakimikolwiek dwiema sekwencjami linii zarodkowych VH z rodziny VH3 pozostaje w zakresie 69-98 reszt spośród około 100 reszt VH (tj. 69-98 homologii sekwencji aminokwasowej pomiędzy jakimikolwiek dwiema sekwencjami linii zarodkowych VH). Dla większości par sekwencji linii zarodkowych istnieje co najmniej 80 lub więcej identycznych reszt aminokwasowych (tj. co najmniej 80% homologia sekwencji aminokwasowych). Wynikiem wysokiego stopnia homologii sekwencji aminokwasowych pomiędzy przedstawicielami rodziny VH3 jest obecność określonych reszt aminokwasowych w kluczowych miejscach regionów CDR i zrębu łańcucha VH. Te reszty aminokwasowe nadają CDR cechy strukturalne.
Badania struktur przeciwciał wykazały, że konformacje CDR można podzielić na rodziny wzorcowych struktur CDR, w oparciu o kluczowe reszty aminokwasowe, które zajmują pewne pozycje w regionach CDR i zrębu. W konsekwencji, występują podobne miejscowe konformacje CDR w różnych przeciwciałach, które posiadają wzorcowe struktury o identycznych kluczowych resztach aminokwasowych (Chothia i in. (1987) J. Mol. Biol., 196, 901-917 oraz Chothia i in. (1989) Nature, 342, 877-883). W obrębie rodziny VH3 występuje zachowanie identyczności reszt aminokwasowych w kluczowych miejscach wzorcowych struktur CDR1 i CDR2 (Chothia i in. (1992) J. Mol. Biol., 2271, 799-817).
Gen VH linii zarodkowej COS-3 jest przedstawicielem rodziny VH3 i jest wariantem allelu VH linii zarodkowej 3-30 (DP-49). COS-3 różni się od sekwencji aminokwasowej VH Joe 9 tylko w 5 pozycjach. Wysoki stopień homologii sekwencji aminokwasowej pomiędzy VH Joe 9 a COS-3 oraz pomiędzy VH Joe 9 a innymi przedstawicielami rodziny VH3 nadaje również wysoki stopień homologii strukturalnej CDR (Chothia i in. (1992) J. Mol. Biol., 227, 799-817, Chothia i in. (1987) J. Mol. Biol., 196, 901-917 oraz Chothia i in. (1989) Nature, 342, 877-883).
Specjalista w tej dziedzinie będzie wiedział, że w oparciu o wysokie podobieństwa sekwencji aminokwasowych oraz wzorcowych struktur do Joe 9, innych przedstawicieli rodziny VH3 również można stosować do tworzenia przeciwciał, które wiążą się z IL-12. Można to przeprowadzić, na przykład, przez wyselekcjonowanie odpowiedniego VL techniką tasowania łańcuchów (Winter i in. (1994) Annual Rev. Immunol., 12, 433-55), bądź przez przeszczepienie CDR z przeciwciała gryzonia lub innego przeciwciała ludzkiego, włącznie z CDR z przeciwciał według wynalazku, do zrębu rodziny VH3.
Zestaw ludzkich linii zarodkowych V lambda podzielono na 10 rodzin, w oparciu o homologię sekwencji nukleotydowych (Williams i in. (1996) J. Mol. Biol., 264, 220-232). Porównanie regionu zmiennego łańcucha lekkiego Joe 9 z sekwencjami linii zarodkowych łańcuchów lekkich, wyselekcjonowanymi z bazy danych VBASE, ujawniło, że Joe 9 było podobne do linii zarodkowej DPL8 lambda. VL Joe 9 różni się od sekwencji DPL8 tylko w czterech pozycjach zrębu i jest wysoce homologiczny do sekwencji zrębu innych przedstawicieli rodziny VJ. W oparciu o wysoki stopień homologii sekwencji aminokwasowych i struktur wzorcowych do Joe 9, innych przedstawicieli rodziny VJ również można stosować do tworzenia przeciwciał, które wiążą się z IL-12. Można to przeprowadzić, na przykład, przez wyselekcjonowanie odpowiedniego VH techniką tasowania łańcuchów (Winter i in., supra), bądź przez przeszczepienie CDR z przeciwciała gryzonia lub innego przeciwciała ludzkiego, włącznie z CDR z przeciwciał według wynalazku, do zrębu rodziny VJ.
Sposoby według wynalazku w zamierzeniu obejmują zrekombinowane przeciwciała, które wiążą się z hIL-12, obejmujące region zmienny łańcucha ciężkiego pochodzący od przedstawiciela rodziny VH3 sekwencji linii zarodkowych oraz region zmienny łańcucha lekkiego pochodzący od przedstawiciela rodziny VJ sekwencji linii zarodkowych. Ponadto, specjalista w tej dziedzinie będzie wiedział, że jakiegokolwiek przedstawiciela sekwencji łańcucha ciężkiego z rodziny VH3 można połączyć z jakimkolwiek przedstawicielem sekwencji łańcucha lekkiego z rodziny VX1.
PL 218 748 B1
Specjalista w tej dziedzinie będzie również wiedział, że w populacji (np. populacji ludzkiej) mogą istnieć polimorfizmy sekwencji DNA, które prowadzą do zmian w sekwencjach aminokwasowych linii zarodkowej. Taki polimorfizm genetyczny sekwencji linii zarodkowej może występować pomiędzy osobnikami w populacji w wyniku naturalnego zróżnicowania alleli. Wynikiem takich naturalnych wariantów allelicznych jest zazwyczaj 1-5% zróżnicowanie w sekwencji nukleotydowej genu. Każdy i wszystkie takie różnice nukleotydowe i będące ich wynikiem polimorfizmy aminokwasów w sekwencjach linii zarodkowych, który jest wynikiem naturalnego zróżnicowania alleli, w zamierzeniu pozostają w zakresie wynalazku.
A zatem, w innym aspekcie, ujawnienie dostarcza wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążącą antygen, wykazujące następujące cechy charakterystyczne:
a) wiąże się z ludzką IL-12 i dysocjuje od ludzkiej IL-12 ze stałą szybkości koff wynoszącą 0,1 s-1 lub niższą, oznaczoną przez powierzchniowy rezonans plazmonowy, bądź które hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny w oznaczeniu proliferacji komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny in vitro (oznaczeniu PHA) z IC50 wynoszącym 1 x 10-6 M lub niższym.
b) zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną spośród przedstawicieli rodziny linii zarodkowej VH3, przy czym region zmienny łańcucha ciężkiego ma mutację w pozycji kontaktu lub hipermutacji do reszty aminokwasowej wzmacniającej aktywność.
c) zawiera region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną spośród przedstawicieli rodziny linii zarodkowej Vx1, przy czym region zmienny łańcucha lekkiego ma mutację w korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub pozycji hipermutacji, do reszty aminokwasowej wzmacniającej aktywność.
W korzystnym rozwiązaniu, wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, ma mutację w CDR3 łańcucha ciężkiego.
W innym korzystnym rozwiązaniu, wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, ma mutację w CDR3 łańcucha lekkiego.
W innym korzystnym rozwiązaniu, wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, ma mutację w CDR2 łańcucha ciężkiego.
W korzystnym rozwiązaniu, wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, ma mutację w CDR2 łańcucha lekkiego.
W innym korzystnym rozwiązaniu, wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, ma mutację w CDR1 łańcucha ciężkiego.
W korzystnym rozwiązaniu, wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, ma mutację w CDR1 łańcucha lekkiego.
Specjalista w tej dziedzinie będzie wiedział, że w oparciu o wysoki poziom podobieństwa sekwencji aminokwasowych pomiędzy przedstawicielami rodziny linii zarodkowych VH3, bądź pomiędzy przedstawicielami rodziny linii zarodkowych VX1 łańcuchów lekkich, mutacje sekwencji linii zarodkowych mogą zapewniać dodatkowe przeciwciała, które wiążą się z ludzką IL-12. Tabela 1 (patrz Załącznik A) przedstawia sekwencje przedstawicieli rodziny linii zarodkowych VH3 i wykazuje znaczącą homologię sekwencji pomiędzy przedstawicielami tej rodziny. W Tabeli 1 przedstawiono również sekwencje linii zarodkowych dla przedstawicieli VX1. Dla porównania podano sekwencje łańcucha ciężkiego i lekkiego Joe 9. Mutacji sekwencji linii zarodkowych przedstawicieli rodziny VH3 lub VX1 można dokonywać, w tych samych pozycjach aminokwasowych, jak te dokonywane w przeciwciałach według wynalazku (np. mutacje w Joe 9). Modyfikacje można prowadzić stosując standardowe techniki biologii molekularnej, takie jak mutageneza przez PCR, ukierunkowana wobec pojedynczych reszt aminokwasowych w sekwencjach linii zarodkowych, a następnie kinetyczną i funkcjonalną analizę zmodyfikowanych przeciwciał, jak opisano w niniejszym opisie (np. oznaczenia neutralizacji opisane w Przykładzie 3 oraz analiza z zastosowaniem BIAcore, jak opisano w Przykładzie 5).
A zatem, w innym aspekcie, wynalazek dostarcza wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążącą antygen, wykazujące następujące cechy charakterystyczne:
a) zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy SEQ ID NO: 595-667, przy czym region zmienny łańcucha ciężkiego ma mutację w korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji do reszty aminokwasowej wzmacniającej aktywność.
PL 218 748 B1
b) zawiera region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy SEQ ID NO: 669-675, przy czym region zmienny łańcucha lekkiego ma mutację w korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji do reszty aminokwasowej wzmacniającej aktywność.
Specjalista w tej dziedzinie będzie wiedział, że w oparciu o wysokie podobieństwo sekwencji aminokwasowych pomiędzy Joe 9 a sekwencją linii zarodkowej COS-3 łańcucha ciężkiego oraz pomiędzy Joe 9 a sekwencją linii zarodkowej DPL8 lambda, inne mutacje regionów CDR tych sekwencji linii zarodkowych mogą dostarczyć dodatkowe przeciwciała, które wiążą się z ludzką IL-12. Takie sposoby modyfikacji można przeprowadzać stosując standardowe techniki biologii molekularnej, jak opisano powyżej.
A zatem, w jednym aspekcie, ujawnienie dostarcza wyizoIowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążącą antygen, wykazujące następujące cechy charakterystyczne:
a) wiąże się z ludzką IL-12 i dysocjuje od ludzkiej IL-12 ze stałą szybkości koff wynoszącą 0,1 s-1 lub niższą, oznaczoną przez powierzchniowy rezonans plazmonowy, bądź hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyminy w oznaczeniu proliferacji komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny in vitro (oznaczeniu PHA) z IC50 wynoszącym 1 x 10-6 M lub niższym.
b) zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową linii zarodkowej COS-3, przy czym region zmienny łańcucha ciężkiego ma mutację w korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji do reszty aminokwasowej wzmacniającej aktywność.
c) zawiera region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową linii zarodkowej DPL8, przy czym region zmienny łańcucha lekkiego ma mutację w korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji do reszty aminokwasowej wzmacniającej aktywność.
W wyniku zajmowania przez pewne reszty aminokwasowe kluczowych miejsc w regionach CDR i zrębu w regionie zmiennym łańcucha lekkiego i ciężkiego, regionom tym nadawane są cechy strukturalne. W szczególności, regiony CDR2 i CDR1 podlegają klasyfikacji struktur wzorcowych. Ponieważ występuje wysoki stopień homologii sekwencji aminokwasowych pomiędzy przedstawicielami rodziny, te cechy wzorcowe są wspólne dla przedstawicieli rodziny. Specjalista w tej dziedzinie będzie wiedział, że modyfikacje reszt aminokwasowych, które nadają te struktury wzorcowe, powinny powodować powstawanie dodatkowych przeciwciał, które wiążą się z IL-12. Modyfikacje można prowadzić stosując standardowe techniki biologii molekularnej, jak opisano powyżej.
A zatem, w innym aspekcie, ujawnienie dostarcza wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążącą antygen, wykazujące następujące cechy charakterystyczne:
a) wiąże się z ludzką IL-12 i dysocjuje od ludzkiej IL-12 ze stałą szybkości koff wynoszącą
0,1 s-1 lub niższą, oznaczoną przez powierzchniowy rezonans plazmonowy, bądź hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny w oznaczeniu proliferacji komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny in vitro (oznaczeniu PHA) z IC50 wynoszącym 1 x 10-6 M lub niższym.
b) zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną spośród przedstawicieli rodziny linii zarodkowych VH3, przy czym region zmienny łańcucha ciężkiego obejmuje CDR2, który pod względem struktury jest podobny do CDR2 z innych przedstawicieli rodziny linii zarodkowych VH3, oraz CDR1, który pod względem struktury jest podobny do CDR1 z innych przedstawicieli rodziny linii zarodkowych VH3, i gdzie region zmienny łańcucha ciężkiego ma mutację w korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji do reszty aminokwasowej wzmacniającej aktywność.
c) zawiera region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną spośród przedstawicieli rodziny linii zarodkowych Vx1, przy czym region zmienny łańcucha lekkiego zawiera CDR2, który pod względem struktury jest podobny do CDR2 z innych przedstawicieli rodziny linii zarodkowej VX1, oraz CDR1, który pod względem struktury jest podobny do CDR1 z innych przedstawicieli rodziny linii zarodkowej Vx1, i gdzie region zmienny łańcucha lekkiego ma mutację w korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji do reszty aminokwasowej wzmacniającej aktywność.
Zrekombinowane przeciwciała ludzkie według wynalazku zawierają regiony zmienne i stałe, które są homologiczne do sekwencji ludzkich immunoglobulin linii zarodkowych wybranych z bazy da24
PL 218 748 B1 nych VBASE. Wynikiem mutacji zrekombinowanych przeciwciał ludzkich (np. przez mutagenezę losową lub mutagenezę poprzez PCR) są aminokwasy, które nie są kodowane przez sekwencje ludzkich immunoglobulin linii zarodkowych. Również biblioteki zrekombinowanych przeciwciał, które otrzymano od ludzkich dawców, zawierać będą sekwencje przeciwciał, które różnią się od odpowiadających im sekwencji linii zarodkowych w wyniku normalnego procesu mutacji somatycznych, który występuje podczas rozwoju komórek B. Należy zauważyć, że jeśli sekwencje „linii zarodkowych otrzymane przez amplifikację poprzez PCR kodują różnice aminokwasowe w regionach zrębu w stosunku do rzeczywistej konfiguracji linii zarodkowej (tj. różnice w zamplifikowanej sekwencji w porównaniu z rzeczywistą sekwencją linii zarodkowej), może być pożądane zmienienie tych różnic aminokwasowych z powrotem na rzeczywiste sekwencje linii zarodkowych (tj. „mutacja wsteczna reszt zrębu do konfiguracji linii zarodkowej). A zatem, niniejszy wynalazek może ewentualnie obejmować etap mutacji wstecznych. W celu ich przeprowadzenia, najpierw porównuje się sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego i lekkiego, kodowane przez linię zarodkową (którą można znaleźć na przykład w bazie danych VBASE) z sekwencjami aminokwasowymi zrębu łańcucha ciężkiego i lekkiego zmutowanej immunoglobuliny, w celu identyfikacji w sekwencji zrębu zmutowanej immunoglobuliny reszt aminokwasowych, które różnią się od najbardziej podobnych sekwencji linii zarodkowych. Następnie odpowiednie nukleotydy sekwencji zmutowanej immunoglobuliny poddaje się mutacji wstecznej do odpowiadającej sekwencji linii zarodkowej, stosując kod genetyczny do określenia, jakich zmian nukleotydowych należy dokonać. Mutagenezę sekwencji zrębu zmutowanej immunoglobuliny prowadzi się standardowymi metodami, takimi jak mutageneza za pośrednictwem PCR (w której zmutowane nukleotydy wprowadza się do starterów PCR, tak że produkt PCR ma mutację) lub ukierunkowana mutageneza. Rolę każdego aminokwasowego zidentyfikowanego jako kandydat do mutacji wstecznej powinno się badać pod względem bezpośredniej lub pośredniej roli w wiązaniu antygenu, i żadnego aminokwasu, dla którego stwierdzono, że po mutacji wpływa na jakąkolwiek pożądaną cechę charakterystyczną przeciwciała ludzkiego, nie powinno się włączać do ostatecznego przeciwciała ludzkiego; dla przykładu, wzmacniających aktywność reszt aminokwasowych zidentyfikowanych przez podejście selektywnej mutagenezy, nie będzie się poddawać mutacjom wstecznym. Oznaczenia do określania cech charakterystycznych przeciwciała otrzymanego w wyniku mutagenezy mogą obejmować ELISA, współzawodnicze ELISA, oznaczenia neutralizacji in vitro i in vivo i/lub (patrz np. Przykład 3), immunohistochemiczne badania skrawków tkankowych z różnych źródeł (włącznie z człowiekiem, naczelnymi i/lub innymi gatunkami).
W celu minimalizacji liczby aminokwasów poddawanych mutacjom wstecznym, można pozostawić te pozycje aminokwasowe, dla których stwierdzono, że są różne od najbardziej podobnej sekwencji linii zarodkowej, ale identyczne z odpowiadającymi aminokwasami w drugiej sekwencji linii zarodkowej, pod warunkiem, że druga sekwencja linii zarodkowej jest identyczna i współliniowa z sekwencją przeciwciała ludzkiego według wynalazku dla co najmniej 10, korzystnie 12 aminokwasów, po obu stronach aminokwasu, którego to dotyczy. Powinno to zapewnić, że jakikolwiek epitop peptydowy prezentowany układowi immunologicznemu przez „profesjonalne” komórki prezentujące antygen u osobnika leczonego ludzkim przeciwciałem według wynalazku nie będzie obcy, ale identyczny z antygenem własnym, tj. immunoglobuliną kodowaną przez drugą sekwencję linii zarodkowej. Mutacja wsteczna może zachodzić na jakimkolwiek etapie optymalizacji przeciwciała; korzystnie, mutacja wsteczna zachodzi bezpośrednio przed lub po podejściu selektywnej mutagenezy. Korzystniej, mutacja wsteczna zachodzi bezpośrednio przed podejściem selektywnej mutagenezy.
III. Modyfikacje korzystnych pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu i/lub pozycji hipermutacji.
Zazwyczaj selekcję przeciwciał o poprawionych powinowactwach można prowadzić stosując metody prezentacji przez fagi, jak opisano w części II powyżej. Można tego dokonywać przez losowe mutowanie kombinacji reszt CDR i tworzenie dużych bibliotek zawierających przeciwciała o różnych sekwencjach. Jednakże, aby te metody selekcji działały, reakcja antygen-przeciwciało musi wykazywać tendencję równowagi umożliwiającą, po pewnym czasie, preferencyjne wiązanie z antygenem przeciwciał o wyższych powinowactwach. Warunków selekcji, które umożliwiałyby ustalenie równowagi, nie można było ustalić (przypuszczalnie z powodu dodatkowych, niespecyficznych oddziaływań pomiędzy antygenem a cząstką fagową), gdy do poprawy powinowactwa wyselekcjonowanych przeciwciał przeciw IL-12 stosowano metody prezentacji przez fagi, po uzyskaniu pewnego osiąganego poziomu powinowactwa (tj. tego przeciwciała Y61). A zatem, metodami prezentacji przez fagi nie można selekcjonować przeciwciał o jeszcze wyższych powinowactwach. Zatem, dla co najmniej niePL 218 748 B1 których przeciwciał lub antygenów, metody prezentacji przez fagi wykazują ograniczenia pod względem zdolności selekcjonowania przeciwciał o wysoce poprawionych specyficzności/powinowactwie wiązania. Zgodnie z tym, w celu przezwyciężenia tego ograniczenia, opracowano sposób nazwany podejściem selektywnej mutagenezy, który nie wymaga dojrzewania przeciwciał pod względem powinowactwa w układzie prezentacji przez fagi, i wynalazek dostarcza ten sposób. Chociaż to podejście selektywnej mutagenezy opracowano dla przezwyciężenia ograniczeń stosowania układu prezentacji przez fagi, należy zauważyć, że sposób ten można również stosować łącznie z układem prezentacji przez fagi. Ponadto, podejście selektywnej mutagenezy można stosować do poprawy powinowactwa jakiegokolwiek przeciwciała.
Do poprawy aktywności (np. powinowactwa lub aktywności neutralizującej) przeciwciała, najlepiej byłoby poddawać mutacjom każdą pozycję w CDR zarówno w łańcuchu ciężkim, jak i lekkim, do każdej innej możliwej reszty aminokwasowej. Jednakże, ponieważ w przeciwciele istnieje przeciętnie 70 pozycji CDR, takie podejście byłoby bardzo czasochłonne i pracochłonne. A zatem, sposób zgodnie z wynalazkiem umożliwia poprawę aktywności przeciwciała przez mutowanie tylko niektórych, wybranych reszt w CDR łańcucha ciężkiego i lekkiego. Ponadto, sposób zgodnie z wynalazkiem umożliwia poprawę aktywności przeciwciała bez wpływania na inne jego pożądane właściwości.
Tego, które reszty aminokwasowe regionu zmiennego przeciwciała znajdują się w pozycjach kontaktu z antygenem, nie można dokładnie przewidzieć na podstawie sekwencji pierwszorzędowej lub ich pozycji w regionie zmiennym. Nie mniej jednak, przyporządkowania sekwencji przeciwciał o różnych specyficznościach, przeprowadzone przez Kabata i in., zidentyfikowały miejscowe regiony w CDR w obrębie regionów zmiennych, które znacząco różnią się pomiędzy przeciwciałami (Kabat i in. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190: 382-393, Kabat, E. A. i in. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie 5, U.S. Department of Health and Human Services, Publikacja NIH nr 91-3242), Badania strukturalne wykazały, że powierzchnię wiążącą antygen tworzą reszty aminokwasowe obecne w CDR. Wiadomo, że również inne reszty aminokwasowe, znajdujące się poza CDR, pełnią strukturalne funkcje lub są bezpośrednio zaangażowane w wiązaniu antygenu. Dlatego też, dla każdej pary antygen-przeciwciało mogą być ważne reszty aminokwasowe w obrębie i poza CDR.
W polegających na przyporządkowywaniu sekwencji badaniach Tomlisona i in. zidentyfikowano liczne pozycje w CDR1 i CDR2 łańcucha ciężkiego i lekkiego, oraz w części CDR3 łańcucha kappa, które są częstymi miejscami mutacji somatycznych (Tomlison i in. (1996) J. Mol. Biol. 256: 813-817). W szczególności, jako częste miejsca mutacji somatycznych zidentyfikowano pozycje H31, H31B, H33, H33B, H52B, H56, H58, L30, L31, L31A, L50, L53, L91, L92, L93 i L94. Jednakże, analiza ta nie obejmuje ważnych regionów CDR3 łańcuchów ciężkich oraz części CDR3 łańcuchów lekkich, o których wiadomo, że leżą w centrum miejsca wiązania antygenu i potencjalnie zapewniają ważne oddziaływania z antygenem. Ponadto, Tomlison i in. proponują, że samo zróżnicowanie somatyczne nie koniecznie pozwala na przewidzenie roli określonego aminokwasu w wiązaniu antygenu i sugerują konserwatywne reszty aminokwasowe, które kontaktują się z antygenem, oraz różnorodne reszty aminokwasowe, które nie wchodzą w kontakt z antygenem. Wniosek ten potwierdziły dalsze badania mutacyjne roli mutacji somatycznych w powinowactwie przeciwciał (Sharon, (1990) PNAS, 87: 4814-7).
Dziewiętnaście mutacji somatycznych przeciwciała przeciw p-azofenyloarsonianowi (ARS) zastąpiono jednocześnie odpowiadającymi im resztami linii zarodkowej, tworząc wersję przeciwciała linii zarodkowej przeciw Ars, które wykazywało dwustukrotne zmniejszenie aktywności. Pełne powinowactwo przeciwciała przeciw Ars można było odzyskać przez przywrócenie tylko trzech z dziewiętnastu mutacji somatycznych, co wykazuje, że możliwych jest wiele mutacji somatycznych, które nie przyczyniają się do aktywności wiązania antygenu.
Wynik ten można wyjaśnić częściowo charakterem samej różnorodności przeciwciał. Niedojrzałe komórki B mogą wytwarzać początkowo przeciwciała o niskim powinowactwie, które rozpoznają liczne z własnych lub obcych antygenów. Ponadto, przeciwciała mogą podlegać podczas dojrzewania pod względem powinowactwa zróżnicowaniu sekwencji, co może powodować reaktywność wobec własnych epitopów. Hipermutacje w takich przeciwciałach o niskim powinowactwie mogą służyć znoszeniu reaktywności wobec własnych epitopów („selekcja ujemna”) i zwiększeniu powinowactwa wobec antygenu obcego. Dlatego też, analiza danych sekwencyjnych i strukturalnych dla dużej liczby przeciwciał nie zapewnia sposobu przewidywania ani (1) roli miejsc hipermutacji somatycznych w procesie dojrzewania pod względem powinowactwa, w stosunku do procesu obniżania powinowac26
PL 218 748 B1 twa wobec niepożądanych antygenów, ani (2) w jaki sposób dany aminokwas przyczynia się do właściwości określonej pary antygen-przeciwciało.
Innych prób określenia roli specyficznych reszt aminokwasowych w rozpoznawaniu antygenu dokonywano przez analizowanie licznych krystalicznych struktur kompleksów antygen-przeciwciało (MacCallum i in. (1996) J. Mol. Biol. 262: 732-745). Wskazywano na potencjalną rolę pozycji położonych w obrębie i poza CDR. Pozycje w CDR, zaangażowane w wiązaniu antygenu w więcej niż 10 spośród 26 analizowanych struktur obejmowały H31, H33, H50, H52, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98 i H100 w łańcuchu ciężkim oraz L30A, L32, L91, L92, L93, L94 i L96 w łańcuchu lekkim. Jednakże, autorzy zauważyli, że przewidywanie kontaktów z antygenem z zastosowaniem tych, i innych, danych strukturalnych może prowadzić do zawyżania i zaniżania przewidywania pozycji kontaktu, co prowadzi do przypuszczenia, że dla różnych antygenów mogą być wykorzystywane różne strategie.
Pini i in. opisują wprowadzanie losowych zmian wielu reszt w sekwencjach CDR przeciwciał w dużej bibliotece prezentacji przez fagi do szybkiego zwiększania powinowactwa przeciwciał (Pini i in. (1998) J. Biol. Chem. 273: 21769-21776). Jednakże, dyskutowane przez Pini i in. przeciwciała o wysokim powinowactwie posiadają mutacje w łącznie ośmiu pozycjach, a redukcyjna analiza tego, które zmiany są bezwzględnie konieczne do poprawy powinowactwa przeciwciała, staje się niepraktyczna ze względu na dużą liczbę możliwych kombinacji, które muszą być testowane dla najmniejszej liczby wymaganych aminokwasów.
Ponadto, losowe zmiany licznych reszt nie muszą koniecznie zachowywać innych pożądanych właściwości przeciwciała. Pożądane właściwości lub cechy charakterystyczne przeciwciała są znane w tej dziedzinie i obejmują, na przykład, zachowanie braku reaktywności krzyżowej, np. z innymi białkami lub tkankami ludzkimi, oraz zachowanie sekwencji przeciwciała, które są podobne do ludzkich sekwencji immunoglobulin linii zarodkowych i poprawę siły neutralizacji. Inne pożądane właściwości lub cechy charakterystyczne obejmują zdolność do zachowywania międzygatunkowej reaktywności krzyżowej, zdolność do zachowywania specyficzności wobec epitopu i zdolność do zachowywania wysokich poziomów ekspresji białka w komórkach ssaczych. Pożądane właściwości lub cechy charakterystyczne można obserwować lub mierzyć stosując techniki znane w tej dziedzinie, obejmujące, ale nie ograniczające się do ELISA, współzawodniczego ELISA, oznaczeń neutralizacji in vitro i in vivo (patrz np. Przykład 3), immunohistochemicznych badań skrawków tkankowych z różnych źródeł, włącznie z człowiekiem, naczelnymi lub innymi źródłami, zgodnie z zachodzącą potrzebą, oraz badań ekspresji w komórkach ssaczych z zastosowaniem ekspresji krótkotrwałej lub ekspresji stabilnej.
Ponadto, metoda Pini i in. może wprowadzać więcej zmian od ich minimalnej liczby rzeczywiście wymaganej do poprawy powinowactwa i może prowadzić do przeciwciał wyzwalających powstawania odpowiedzi przeciw przeciwciałom ludzkim (HAMA) u osobników ludzkich.
Ponadto, jak dyskutowano w innym miejscu, prezentacja przez fagi, jak wykazano w niniejszym opisie, lub inna zbliżona metoda, włącznie z prezentacją przez rybosomy, może nie działać odpowiednio po osiągnięciu pewnych powinowactw pomiędzy przeciwciałem a antygenem, a warunki wymagane do osiągnięcia równowagi mogą nie ustalać się w rozsądnej skali czasowej, z powodu dodatkowych oddziaływań, obejmujących oddziaływania z innym składnikiem faga lub rybosomu, a antygenem.
Specjalista w tej dziedzinie może, na podstawie informacji i odnośników dyskutowanych powyżej, uzyskać interesujące informacje naukowe dotyczące pochodzenia zróżnicowania przeciwciał. Niniejszy wynalazek, jednakże, zapewnia sposób zwiększania powinowactwa przeciwciał określonej pary antygen-przeciwciało, z jednoczesnym zachowaniem innych istotnych cech lub pożądanych cech charakterystycznych przeciwciała. Jest to szczególnie ważne, gdy rozważa się pożądane nadawanie licznych różnych cech charakterystycznych określonemu przeciwciału, włącznie z wiązaniem antygenu.
Jeśli wyjściowe przeciwciało wykazuje pożądane właściwości lub cechy charakte rystyczne, które powinny zostać zachowane, podejście selektywnej mutagenezy może być najlepszą strategią zachowywania tych pożądanych właściwości z jednoczesną poprawą aktywności przeciwciała. Na przykład, w przypadku mutagenezy Y61, celem było zwiększenie powinowactwa do hIL-12 oraz poprawa siły neutralizacji przeciwciała, z jednoczesnym zachowaniem pożądanych właściwości. Pożądane właściwości Y61 obejmowały: (1) zachowanie braku reaktywności krzyżowej z innymi białkami lub tkankami ludzkimi, (2) zachowanie ścisłej specyficzności wobec epitopu, tj. rozpoznawania epitopu p40 preferencyjnie w kontekście heterodimeru p70 (p40/p35), co zapobiega zakłócaniu wiązania przez
PL 218 748 B1 wolne, rozpuszczalne p40; oraz (3) tworzenie przeciwciała o sekwencjach aminokwasowych łańcucha ciężkiego i lekkiego tak podobnych, jak jest to możliwe, do odpowiadających im sekwencji immunoglobulin linii zarodkowych.
W jednym rozwiązaniu, sposób zgodnie z wynalazkiem zapewnia podejście selektywnej mutagenezy jako strategię zachowywania pożądanych właściwości lub cechy charakterystycznej przeciwciała, z jednoczesną poprawą powinowactwa i/lub siły neutralizacji. Termin „podejście selektywnej mutagenezy” jest taki, jak zdefiniowano powyżej i obejmuje sposób pojedynczego poddawania mutacjom wybranych reszt aminokwasowych. Reszty aminokwasowe przeznaczone do mutacji można najpierw wybierać spośród korzystnych pozycji selektywnej mutagenezy, następnie spośród pozycji kontaktu, a następnie spośród pozycji hipermutacji. Pojedynczą wybraną pozycję można mutować do co najmniej dwóch innych reszt aminokwasowych, i określa się wpływ mutacji zarówno na pożądane właściwości przeciwciała, jak i na poprawę aktywności przeciwciała.
Podejście selektywnej mutagenezy obejmuje etapy:
wyboru pozycji będącej kandydatem do mutacji w kolejności 1) korzystne pozycje selektywnej mutagenezy, 2) pozycje kontaktu, 3) pozycje hipermutacji, oraz uszeregowania pozycji w oparciu o położenie pozycji w regionach zmiennych łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciała (CDR3 korzystniejszy od CDR2, który jest korzystniejszy od CDR1);
pojedynczo poddawania mutacjom będących kandydatami korzystnych pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu i/lub hipermutacji w kolejności uszeregowania, do wszystkich innych, możliwych reszt aminokwasowych i analizowania wpływu pojedynczych mutacji na aktywność przeciwciała, w celu określenia wzmacniających aktywność reszt aminokwasowych;
jeśli jest to konieczne, dokonywanie etapami kombinacji pojedynczych wzmacniających aktywność reszt aminokwasowych i analizowania wpływu różnych kombinacji na aktywność przeciwciał; selekcjonowania zmutowanych przeciwciał ze wzmacniającymi aktywność resztami aminokwasowymi oraz uszeregowanie zmutowanych przeciwciał w oparciu o położenie i rodzaj podstawień aminokwasowych pod względem ich potencjału immunogennego. Najwyższe pozycje w uszeregowaniu nadaje się zmutowanym przeciwciałom, które obejmują sekwencję aminokwasową, która jest prawie identyczna z sekwencją regionu zmiennego, którą opisano w bazie danych linii zarodkowych, lub zawiera sekwencję aminokwasową, która jest porównywalna z innymi przeciwciałami ludzkimi. Niższe pozycje w uszeregowaniu nadaje się zmutowanym przeciwciałom zawierającym podstawienia aminokwasowe, które rzadko spotyka się w sekwencji linii zarodkowej albo sekwencjach innych przeciwciał ludzkich. Najniższe pozycje w uszeregowaniu nadaje się zmutowanym przeciwciałom z podstawieniami aminokwasowymi, których nie napotkano w sekwencji linii zarodkowej lub sekwencji innego przeciwciała ludzkiego. Jak podano powyżej, zmutowane przeciwciała zawierające co najmniej jedną wzmacniającą aktywność resztę aminokwasową położoną w CDR3 są korzystniejsze od tych zawierających ją w CDR2, które są korzystniejsze od tych zawierających ją w CDR1. CDR regionów zmiennych łańcucha ciężkiego są korzystniejsze od tych w regionie zmiennym łańcucha lekkiego.
Zmutowane przeciwciała można również badać pod kątem poprawy aktywności, np. w porównaniu z odpowiadającym im przeciwciałem macierzystym. Poprawę aktywności zmutowanego przeciwciała można określić, na przykład, przez oznaczenie neutralizacji, lub specyficzność/powinowactwo wiązania przez analizę powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Korzystnie, poprawa aktywności może być co najmniej 2-20-krotna w porównaniu z przeciwciałem macierzystym. Poprawa aktywności może być co najmniej od „x1” do „x2”-krotna w porównaniu z przeciwciałem macierzystym, gdzie „x1” i „x2” są liczbami znajdującymi się pomiędzy i obejmującymi 2 i 20, włącznie z zakresami w obrębie podanego zakresu, np. 2-15, np. 5-10.
Zmutowane przeciwciała ze wzmacniającą aktywność resztą aminokwasową można także badać w celu określenia, czy po mutacji zachowana została co najmniej jedna inna pożądana właściwość. Na przykład, przez testowanie przeciwciał przeciw hIL-12 pod względem (1) zachowywania braku reaktywności krzyżowej z innymi białkami lub tkankami ludzkimi, (2) zachowywania rozpoznawania epitopu, tj. rozpoznawania epitopu p40 preferencyjnie w kontekście heterodimeru p70 (p40/p35), co zapobiega zakłócaniu wiązania przez wolne, rozpuszczalne p40; oraz (3) tworzenia przeciwciał o sekwencjach aminokwasowych łańcucha ciężkiego i lekkiego, które są tak podobne, jak jest to możliwe, do odpowiadających im sekwencji immunoglobulin linii zarodkowych, oraz określanie, które z nich z najmniejszym prawdopodobieństwem powodować będą wywoływanie ludzkiej odpowiedzi immunologicznej, w oparciu o liczbę różnic w stosunku do sekwencji linii zarodkowej. Tych samych obserwacji można dokonać wobec przeciwciała zawierającego więcej niż jedną wzmacniającą aktyw28
PL 218 748 B1 ność resztę aminokwasową, np. co najmniej dwie lub co najmniej trzy wzmacniające aktywność reszty aminokwasowe, w celu określenia, czy wystąpiło zachowanie pożądanej właściwości lub cechy charakterystycznej.
Przykład zastosowania „podejścia selektywnej mutagenezy” w mutagenezie Y61 opisano poniżej. Każda z pojedynczych mutacji H31S >E, L50 >Y lub L94G >Y poprawiała neutralizującą aktywność przeciwciała. Jednakże, gdy testowano klony łączone, aktywność łączonego klonu H31S >E + L50>Y + L94G>Y nie była lepsza, niż L50>Y + L94G>Y (J695). Dlatego też, zmiana reszty aminokwasowej linii zarodkowej, Ser na Glu w 31 pozycji CDR1, nie była konieczna dla poprawy aktywności J695 w stosunku do Y61. Dlatego, podejście selektywnej mutagenezy, zidentyfikowało minimalną liczbę zmian, które przyczyniają się do końcowej aktywności, w ten sposób obniżając potencjał immunogenny ostatecznego przeciwciała i zachowując inne pożądane właściwości przeciwciała.
Wyizolowany DNA kodujący VH i VL, utworzony przez podejście selektywnej mutagenezy, można przekształcić w geny łańcuchów przeciwciał o pełnej długości, geny fragmentów Fab lub gen scFV, jak opisano w części IV. Dla ekspresji utworzonych przez podejście selektywnej mutagenezy regionów VH i VL, ekspresyjnymi wektorami kodującymi łańcuch ciężki i lekki można transfekować różne komórki gospodarzy, jak szczegółowo opisano w części IV. Korzystne komórki gospodarze obejmują albo prokariotyczne komórki gospodarzy, na przykład E. coli, albo eukariotyczne komórki gospodarzy, na przykład komórki drożdży, np. S. cerevisiae. Najkorzystniejszymi eukariotycznymi komórkami gospodarzami są ssacze komórki gospodarze, szczegółowo opisano w części IV.
Podejście selektywnej mutagenezy zapewnia sposób tworzenia przeciwciał o poprawionych aktywnościach, bez wcześniejszego dojrzewania przeciwciała pod względem powinowactwa innymi sposobami. Podejście selektywnej mutagenezy zapewnia sposób tworzenia przeciwciał o poprawionych aktywnościach, które poddano mutacjom wstecznym. Podejście selektywnej mutagenezy zapewnia również sposób poprawiania aktywności przeciwciał po dojrzewaniu pod względem powinowactwa.
Specjalista w tej dziedzinie będzie wiedział, że podejście selektywnej mutagenezy można stosować w standardowych, znanych w tej dziedzinie technikach manipulowania przeciwciałami. Przykłady obejmują, ale nie ograniczają się do przeciwciał o przeszczepionych CDR, przeciwciał chimerycznych, fragmentów scFv, fragmentów Fab przeciwciał o pełnej długości oraz ludzkich przeciwciał z innych źródeł, np. transgenicznych myszy.
Szybka mutacyjna analiza na dużą skalę obejmuje transkrypcję i translację in vitro z zastosowaniem techniki prezentacji przez rybosomy (patrz np. Hanes i in. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 4937-4942, Dall Acqua i in. (1998) Curr. Opin. Struct. Biol. 8: 443-450; He i in., (1997) Nucleic Acid Res. 25: 5132-5134) oraz opisy patentowe US nr 5 643 768 i 5 658 754, przyznane Kawasaki. Podejście selektywnej mutagenezy zapewnia również sposób tworzenia przeciwciał o poprawionych właściwościach, które można selekcjonować stosując techniki prezentacji przez rybosomy.
W tych sposobach zgodnie z wynalazkiem, przeciwciała, lub ich części wiążące antygen, modyfikuje się dalej przez zmienianie pojedynczych pozycji w CDR HCVR i/lub LCVR. Chociaż modyfikacji tych można dokonywać w przeciwciałach prezentowanych przez fagi, sposób jest korzystny pod tym względem, że można go stosować wobec przeciwciał, które ulegają ekspresji w innych typach układów gospodarzy, takich jak układy ekspresyjne komórek bakteryjnych, drożdżowych lub ssaczych. Wybrane do modyfikacji pojedyncze pozycje w CDR wybiera się na podstawie tego, że są pozycjami kontaktu i/lub hipermutacji.
Korzystne pozycje kontaktu lub pozycje hipermutacji, jak zdefiniowano w niniejszym opisie, przedstawiono w Tabeli 3 (patrz Załącznik A), a ich modyfikowanie zgodnie ze sposobem według wynalazku opisano szczegółowo w Przykładzie 2. Korzystne pozycje kontaktu wybiera się z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 i L96. Korzystne pozycje hipermutacji wybiera się z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 i L93. Korzystniejsze reszty aminokwasowe (określane jako „korzystne pozycje selektywnej mutagenezy) są zarówno pozycjami kontaktu, jak i hipermutacji i wybiera się je z grupy składającej 30 się z H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 i L94. Szczególnie korzystne pozycje kontaktu wybiera się z grupy składającej się z L50 i L94.
Korzystne wzmacniające aktywność reszty aminokwasowe zastępują reszty aminokwasowe położone w pozycjach wybranych z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 i L96. Korzystniejsze wzmacniające aktywność reszty aminokwasowe zastępują reszty
PL 218 748 B1 aminokwasowe położone w pozycjach H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 i L94. W szczególności, korzystne wzmacniające aktywność reszty aminokwasowe zastępują reszty położone w pozycjach wybranych z grupy składającej z L50 i L94.
Generalnie, sposób zgodnie z wynalazkiem obejmuje wybór określonej korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu i/lub hipermutacji w obrębie CDR ciężkiego lub łańcucha lekkiego będącego przedmiotem zainteresowania przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen, losowe mutagenizowanie pojedynczej pozycji (np. sposobami genetycznymi, stosując mutagenny oligonukleotyd w celu utworzenia „minibiblioteki zmodyfikowanych przeciwciał), lub mutowanie pozycji do określonych pożądanych aminokwasów, w celu identyfikacji wzmacniających aktywność reszt aminokwasowych, ekspresja i oczyszczanie zmodyfikowanych przeciwciał (np. w innym niż układ prezentacji przez fagi układzie gospodarza), pomiar aktywności zmodyfikowanych przeciwciał wobec antygenu (np. przez pomiar stałej koff poprzez analizę z zastosowaniem BIAcore), powtarzanie tych etapów dla innych pozycji CDR, jak jest to konieczne i łączenie pojedynczych mutacji, dla których wykazano, że wykazują poprawioną aktywność oraz testowanie, czy kombinacja(-e) tworzy(-ą) przeciwciało o jeszcze wyższej aktywności (np. powinowactwie lub sile neutralizacji), niż przeciwciało macierzyste, lub jego część wiążąca antygen.
A zatem, w jednym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposób poprawiania aktywności przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, obejmujący:
a) zapewnianie przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen;
b) wybór w kolejności 1) korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, 2) pozycji kontaktu lub 3) pozycji hipermutacji w obrębie regionu determinującego komplementarność (CDR) do mutacji, w celu identyfikacji wybranej korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji;
c) pojedynczo poddawanie mutacji tej wybranej korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji do co najmniej dwóch innych reszt aminokwasowych, w celu utworzenia w ten sposób zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen;
d) ocenianie aktywności zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen;
e) ewentualnie, powtarzanie etapów od a) do d) dla co najmniej jednej innej korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji;
f) łączenie w macierzystym przeciwciele, lub jego części wiążącej antygen, pojedynczych mutacji, dla których wykazano, że zapewniają poprawę aktywności, w celu utworzenia łączonych przeciwciał lub ich części wiążących antygen; oraz
g) ocenianie aktywności łączonych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen;
dopóki nie otrzyma się przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, o poprawionej aktywności w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen. Korzystnie, wyselekcjonowane przeciwciało lub przeciwciała wykazują poprawioną aktywność bez utraty lub z zachowaniem co najmniej jednej pożądanej cechy charakterystycznej lub właściwości przeciwciała macierzystego, jak opisano powyżej. Pożądaną cechę charakterystyczną lub właściwość specjalista w tej dziedzinie może mierzyć lub obserwować stosując techniki znane w tej dziedzinie.
Korzystne pozycje kontaktu wybiera się z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 i L96. Korzystne miejsca hipermutacji wybiera się z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 i L93. Korzystniejsze korzystne pozycje selektywnej mutagenezy wybiera się z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 i L94. Szczególnie korzystne pozycje kontaktu wybiera się z grupy składającej się z L50 i L94.
W innym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposób poprawiania aktywności przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, obejmujący:
a) zapewnianie przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen;
b) wybór korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji w obrębie regionu determinującego komplementarność (CDR) do mutacji;
c) pojedynczo poddawanie mutacji tej wybranej korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji do co najmniej dwóch innych reszt aminokwasowych,
PL 218 748 B1 w celu utworzenia w ten sposób zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen;
d) ocenianie aktywności zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen, w ten sposób identyfikując wzmacniającą aktywność resztę aminokwasową;
e) ewentualnie, powtarzanie etapów od a) do d) dla co najmniej jednej innej korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji;
f) łączenie w macierzystym przeciwciele, lub jego części wiążącej antygen, dwóch pojedynczych wzmacniających aktywność reszt aminokwasowych, dla których wykazano, że zapewniają poprawę aktywności, w celu utworzenia łączonych przeciwciał lub ich części wiążących antygen; oraz
g) ocenianie aktywności łączonych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, z dwiema wzmacniającymi aktywność resztami aminokwasowymi, w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen;
dopóki nie otrzyma się przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, o poprawionej aktywności w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen.
Korzystne pozycje kontaktu wybiera się z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 i L96. Korzystne miejsca hipermutacji wybiera się z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 i L93. Korzystniejsze korzystne pozycje selektywnej mutagenezy wybiera się z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 i L94. Szczególnie korzystne pozycje kontaktu wybiera się z grupy składającej się z L50 i L94.
W innym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposób poprawiania aktywności przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, obejmujący:
a) zapewnianie przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen;
b) wybór korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji w obrębie regionu determinującego komplementarność (CDR) do mutacji;
c) pojedynczo poddawanie mutacji tej wybranej korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji do co najmniej dwóch innych reszt aminokwasowych, w celu utworzenia w ten sposób zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen;
d) ocenianie aktywności zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen, w ten sposób identyfikując wzmacniającą aktywność resztę aminokwasową;
e) ewentualnie, powtarzanie etapów od a) do d) dla co najmniej jednej innej korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji;
f) łączenie w macierzystym przeciwciele, lub jego części wiążącej antygen, trzech pojedynczych wzmacniających aktywność reszt aminokwasowych, dla których wykazano, że zapewniają poprawę aktywności, w celu utworzenia łączonych przeciwciał lub ich części wiążących antygen; oraz
g) ocenianie aktywności łączonych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, z dwiema wzmacniającymi aktywność resztami aminokwasowymi, w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen;
dopóki nie otrzyma się przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, o poprawionej aktywności w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen.
Korzystnie, wzmacniająca aktywność reszta aminokwasowa zastępuje reszty aminokwasowe położone w pozycjach wybranych z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 i L96.
Po mutagenezie pojedynczych wybranych pozycji, zmutowane klony można zsekwencjonować w celu określenia, które reszty aminokwasowe wprowadzono w wybranej pozycji w każdym klonie. Do sekwencjonowania można wybrać małą liczbę klonów (np. około 24), co statystycznie powinno doprowadzić do otrzymania 10-15 unikalnych przeciwciał, podczas gdy większe liczby klonów (np. większe niż 60) można zsekwencjonować dla zapewnienia, że zidentyfikowano przeciwciała o każdym możliwym podstawieniu w wybranej pozycji.
PL 218 748 B1
W jednym rozwiązaniu, do mutagenezy najpierw wybiera się pozycje kontaktu i/lub hipermutacji w obrębie regionów CDR3 łańcuchów ciężkiego i/lub lekkiego. Jednakże, w przypadku przeciwciał, które już poddano dojrzewaniu pod względem powinowactwa in vitro przez losową mutagenezę regionów CDR3 poprzez selekcję w układzie prezentacji przez fagi, korzystne może być wybranie najpierw pozycji kontaktu lub hipermutacji w obrębie CDR1 lub CDR2 łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego.
W korzystniejszym rozwiązaniu, do mutagenezy najpierw wybiera się korzystne pozycje selektywnej mutagenezy w obrębie regionów CDR3 łańcuchów ciężkiego i/lub lekkiego. Jednakże, w przypadku przeciwciał, które już poddano dojrzewaniu pod względem powinowactwa in vitro przez losową mutagenezę regionów CDR3 poprzez selekcję w układzie prezentacji przez fagi, korzystne może być wybranie najpierw korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy w obrębie CDR1 lub CDR2 łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego.
W innym korzystnym rozwiązaniu, optymalizacji przeciwciała wyselekcjonowanego przez podejście selektywnej mutagenezy dokonuje się następnie w następujący sposób: każdą z korzystnych pozycji selektywnej mutagenezy, wybranych z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H33,
H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 i L94, najpierw poddaje się mutacji do co najmniej 2 innych reszt aminokwasowych (korzystnie 5-14 innych aminokwasów), a otrzymane w wyniku przeciwciała charakteryzuje się pod kątem zwiększonego powinowactwa, siły neutralizacji (a ewentualnie również pod kątem co najmniej jednej dyskutowanej w innym miejscu zachowanej cechy charakterystycznej lub właściwości). Jeśli mutacja jednej korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy nie zwiększyła w ogóle lub dostatecznie powinowactwa lub siły neutralizacji, bądź jeśli nawet połączenie kilku wzmacniających aktywność reszt aminokwasowych, zastępujących aminokwasy w korzystnych pozycji selektywnej mutagenezy nie spowodowało w wyniku otrzymania łączonego przeciwciała, które zawiera aktywność docelową (włącznie z powinowactwem i/lub siłą neutralizacji), do selektywnej mutagenezy wybierać się będzie dodatkowe reszty aminokwasowe z grupy składającej się z H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A i L96, z których każdą poddaje się mutacji do co najmniej 2 innych aminokwasów (korzystnie 5-14 innych aminokwasów), a otrzymane w wyniku przeciwciała charakteryzuje się pod kątem zwiększonego powinowactwa, siły neutralizacji (a ewentualnie również pod kątem co najmniej jednej dyskutowanej w innym miejscu zachowanej cechy charakterystycznej lub właściwości).
Jeśli mutacja jednej reszty aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A i L96 nie zwiększyła w ogóle lub dostatecznie aktywności (włącznie z powinowactwem i/lub siłą neutralizacji), bądź jeśli nawet połączenie kilku wzmacniających aktywność reszt aminokwasowych, zastępujących aminokwasy w tych pozycjach nie spowodowało w wyniku otrzymania łączonego przeciwciała, które wykazuje aktywność docelową (włącznie z powinowactwem i/lub siłą neutralizacji), do selektywnej mutagenezy wybierać się będzie dodatkowe reszty aminokwasowe z grupy składającej się z H33B, H52B i L31A, z których każdą poddaje się mutacji do co najmniej 2 innych aminokwasów (korzystnie 5-14 innych aminokwasów), a otrzymane w wyniku przeciwciała charakteryzuje się pod kątem zwiększonego powinowactwa, siły neutralizacji (a ewentualnie również pod kątem co najmniej jednej dyskutowanej w innym miejscu zachowanej cechy charakterystycznej lub właściwości).
Powinno być zrozumiałe, że podejście etapowej selektywnej mutagenezy może zostać zakończone na każdym z etapów wymienionych powyżej, gdy tylko zidentyfikuje się przeciwciało o pożądanej aktywności (włącznie z powinowactwem i siłą neutralizacji). Jeśli podczas mutagenezy wstępnie wybranych pozycji zidentyfikuje się wzmacniające aktywność reszty aminokwasowe, ale łączone przeciwciało nadal nie spełnia celów wyznaczonych dla aktywności (włącznie z powinowactwem i siłą neutralizacji) i/lub jeśli wzmacniające aktywność reszty aminokwasowe wpływają również na inne pożądane cechy charakterystyczne i dlatego nie mogą zostać zaakceptowane, mutagenezie można poddać pozostałe reszty CDR (patrz część IV).
Sposób zgodnie z wynalazkiem można stosować do poprawiania aktywności przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, w celu osiągnięcia określonej wcześniej aktywności docelowej (np. określonego wcześniej powinowactwa i/lub siły neutralizacji) i/lub pożądanej właściwości lub cechy charakterystycznej).
A zatem, wynalazek dostarcza sposób poprawiania aktywności przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, w celu osiągnięcia wcześniej określonej aktywności docelowej, obejmujący:
PL 218 748 B1
a) zapewnianie przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen;
b) wybór korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy wybranej z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94;
c) pojedynczo poddawanie mutacji wybranej korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy do co najmniej dwóch innych reszt aminokwasowych, w celu utworzenia w ten sposób pierwszego zestawu zmutowanych przeciwciał lub ich części wiążących antygen;
d) ocenianie aktywności pierwszego zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w celu stwierdzenia, czy mutacja pojedynczej pozycji selektywnej mutagenezy tworzy przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, o wcześniej określonej aktywności docelowej lub częściowej aktywności docelowej;
e) łączenie, w sposób stopniowy, w macierzystym przeciwciele lub jego części wiążącej antygen, pojedynczych mutacji, dla których wykazano, że zapewniają poprawę aktywności, w celu utworzenia łączonych przeciwciał lub ich części wiążących antygen;
f) ocenianie aktywności łączonych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w celu stwierdzenia, czy łączone przeciwciała, lub ich części wiążące antygen, wykazują wcześniej określoną aktywność docelową lub częściową aktywność docelową;
g) jeśli w wyniku etapów d) lub f) nie otrzymano przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, wykazujących wcześniej określoną aktywność docelową, lub otrzymano przeciwciało o jedynie częściowej aktywności, poddaje się mutacjom dodatkowe reszty aminokwasowe wybrane z grupy składającej się z H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A i L96 do co najmniej dwóch innych reszt aminokwasowych, w celu utworzenia w ten sposób drugiego zestawu zmutowanych przeciwciał lub ich części wiążących antygen;
h) ocenianie aktywności drugiego zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w celu stwierdzenia, czy w wyniku mutacji pojedynczej reszty aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A i L96 otrzymano przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, wykazujące wcześniej określoną aktywność docelową lub częściową aktywność docelową.
i) łączenie, w sposób stopniowy, w macierzystym przeciwciele lub jego części wiążącej antygen, pojedynczych mutacji z etapu g), dla których wykazano, że zapewniają poprawę aktywności, w celu utworzenia łączonych przeciwciał lub ich części wiążących antygen;
j) ocenianie aktywności łączonych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w celu stwierdzenia, czy łączone przeciwciała, lub ich części wiążące antygen, wykazują wcześniej określoną aktywność docelową lub częściową aktywność docelową;
k) jeśli w wyniku etapów h) lub j) nie otrzymano przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, wykazujących wcześniej określoną aktywność docelową, lub otrzymano przeciwciało o jedynie częściowej aktywności, poddaje się mutacjom dodatkowe reszty aminokwasowe wybrane z grupy składającej się z H33B, H52B i L31A do co najmniej dwóch innych reszt aminokwasowych, w celu utworzenia w ten sposób trzeciego zestawu zmutowanych przeciwciał lub ich części wiążących antygen;
l) ocenianie aktywności trzeciego zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w celu stwierdzenia, czy w wyniku mutacji pojedynczej reszty aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z H33B, H52B i L31A otrzymano przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, wykazujące wcześniej określoną aktywność docelową lub częściową aktywność;
m) łączenie, w sposób stopniowy, w macierzystym przeciwciele lub jego części wiążącej antygen, pojedynczych mutacji z etapu k), dla których wykazano, że zapewniają poprawę aktywności, w celu utworzenia łączonych przeciwciał lub ich części wiążących antygen;
n) ocenianie aktywności łączonych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w celu stwierdzenia, czy łączone przeciwciała, lub ich części wiążące antygen, wykazują wcześniej określoną aktywność docelową, dla utworzenia w ten sposób przeciwciała, lub jego części wiążących antygen, o wcześniej określonej aktywności docelowej.
Można stosować liczne z metod mutagenezy, włącznie ze składaniem przez PCR, metodą Kunkela (dut-ung-) i ukierunkowaną mutagenezą za pośrednictwem tiofosforanów oligonukleotydów (zestaw Sculptor Amerscham).
Do ekspresji zmutowanych przeciwciał można stosować szeroki zakres ekspresyjnych układów gospodarza, włącznie z bakteryjnymi, drożdżowymi, bakulowirusowymi lub ssaczymi układami eksPL 218 748 B1 presyjnymi (jak również układy ekspresyjne prezentacji przez fagi). Przykładem odpowiedniego bakteryjnego wektora ekspresyjnego jest pUC119(Sfi). Inne układy ekspresji przeciwciał są znane w tej dziedzinie i opisano je poniżej w części IV.
Zmodyfikowane przeciwciała, lub ich części wiążące antygen, utworzone tym sposobem, zgodnie z wynalazkiem można identyfikować bez polegania na metodach prezentacji przez fagi do selekcji. Zgodnie z tym, sposób zgodnie z wynalazkiem jest szczególnie korzystny do poprawiania aktywności zrekombinowanego przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen, które otrzymano przez selekcję w układzie prezentacji przez fagi, ale którego aktywności nie można dalej poprawić przez mutagenezę w układzie prezentacji przez fagi.
A zatem, w innym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposób poprawiania aktywności przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, obejmujący:
a) zapewnianie przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen, które otrzymano przez selekcję w układzie prezentacji przez fagi, ale których aktywności nie można dalej poprawiać przez mutagenezę w tym układzie prezentacji przez fagi;
b) wybór korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub pozycji hipermutacji w obrębie regionu determinującego komplementarność (CDR) do mutacji, a tym samym ustalenie wybranej pozycji kontaktu lub hipermutacji;
c) pojedynczo poddawanie mutacji wybranej korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji do co najmniej dwóch innych reszt aminokwasowych, w celu utworzenia w ten sposób zestawu zmutowanych przeciwciał lub ich części wiążących antygen, oraz ekspresję tego zestawu w układzie innym, niż układ prezentacji przez fagi;
d) ocenianie aktywności zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen;
e) ewentualnie powtarzanie etapów od b) do d) dla co najmniej jednej innej pozycji korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, kontaktu lub hipermutacji;
f) łączenie, w macierzystym przeciwciele lub jego części wiążącej antygen, pojedynczych mutacji, dla których wykazano, że zapewniają poprawę aktywności, w celu utworzenia łączonych przeciwciał lub ich części wiążących antygen; oraz
g) ocenianie aktywności łączonych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen;
dopóki nie otrzyma się przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, o poprawionej aktywności w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen.
Korzystne pozycje kontaktu wybiera się z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 i L96. Korzystne pozycje hipermutacji wybiera się z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 i L93. Korzystniejsze pozycje selektywnej mutagenezy wybiera się z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 i L94. Szczególnie korzystne pozycje kontaktu wybiera się z grupy składającej się z L50 i L94.
Przy zastosowaniu dostępnych metod nie jest możliwe, bądź jest skrajnie pracochłonne, otrzymanie przeciwciała o zwiększonym powinowactwie wiązania i sile wiązania, z jednoczesnym zachowaniem innych właściwości lub cech charakterystycznych przeciwciał, jak dyskutowano powyżej. Dzięki sposobowi, jednakże zgodnie z wynalazkiem, łatwo zidentyfikować takie przeciwciała. Przeciwciała, z którymi postępuje się zgodnie ze sposobem zgodnie z wynalazkiem mogą pochodzić z jakiegokolwiek źródła.
Dlatego też, w innym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposób poprawiania aktywności przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, obejmujący:
a) zapewnianie zrekombinowanego przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen;
b) wybór korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji w obrębie regionu determinującego komplementarność (CDR) do mutacji, a tym samym ustalenie wybranej korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji;
c) pojedynczo poddawanie mutacji tej wybranej korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji do co najmniej dwóch innych reszt aminokwasowych,
PL 218 748 B1 w celu utworzenia w ten sposób zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, oraz ekspresję tego zestawu w odpowiednim układzie ekspresyjnym;
d) ocenianie aktywności zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen, w celu zidentyfikowania w ten sposób reszty aminokwasowej wzmacniającej aktywność;
e) ocenianie zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen, pod kątem co najmniej jednej innej właściwości lub cechy charakterystycznej, gdzie właściwością lub cechą charakterystyczną jest taka właściwość bądź cecha charakterystyczna, która musi być zachowana w przeciwciele;
dopóki nie otrzyma się przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, o poprawionej aktywności i co najmniej jednej zachowanej właściwości lub cesze charakterystycznej, w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen.
W korzystnym rozwiązaniu, pozycje kontaktu wybiera się z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 i L96, a inne cechy charakterystyczne wybiera się spośród 1) zachowania braku reaktywności krzyżowej z innymi białkami lub tkankami ludzkimi, 2) zachowania rozpoznawania epitopu, tj. rozpoznawania epitopu p40 preferencyjnie w kontekście heterodimeru p70 (p40/p35), co zapobiega zakłócaniu wiązania przez wolne, rozpuszczalne p40, i/lub 3) tworzenia przeciwciała o sekwencji podobnej do sekwencji immunoglobuliny linii zarodkowej.
W innym korzystnym rozwiązaniu, pozycje hipermutacji wybiera się z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 i L93, a inne cechy charakterystyczne wybiera się spośród 1) zachowania braku reaktywności krzyżowej z innymi białkami lub tkankami ludzkimi, 2) zachowania rozpoznawania epitopu, tj. rozpoznawania epitopu p40 preferencyjnie w kontekście heterodimeru p70 (p40/p35), co zapobiega zakłócaniu wiązania przez wolne, rozpuszczalne p40, i/lub 3) tworzenia przeciwciała o sekwencji podobnej do sekwencji immunoglobuliny linii zarodkowej.
W korzystniejszym rozwiązaniu, reszty do selektywnej mutagenezy wybiera się spośród korzystnych pozycji selektywnej mutagenezy z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 i L94, a inną cechę charakterystyczną wybiera się spośród 1) zachowania braku reaktywności krzyżowej z innymi białkami lub tkankami ludzkimi, 2) zachowania rozpoznawania epitopu, tj. rozpoznawania epitopu p40 preferencyjnie w kontekście heterodimeru p70 (p40/p35), co zapobiega zakłócaniu wiązania przez wolne, rozpuszczalne p40, i/lub 3) tworzenia przeciwciała o sekwencji podobnej do sekwencji immunoglobuliny linii zarodkowej.
W korzystniejszym rozwiązaniu, pozycje kontaktu wybiera się z grupy składającej się z L50 i L94, a inne cechy charakterystyczne wybiera się spośród 1) zachowania braku reaktywności krzyżowej z innymi białkami lub tkankami ludzkimi, 2) zachowania rozpoznawania epitopu, tj. rozpoznawania epitopu p40 preferencyjnie w kontekście heterodimeru p70 (p40/p35), co zapobiega zakłócaniu wiązania przez wolne, rozpuszczalne p40, i/lub 3) tworzenia przeciwciała o sekwencji podobnej do sekwencji immunoglobuliny linii zarodkowej.
Dlatego też, jeśli powinowactwo przeciwciała wobec określonego antygenu powinno zostać poprawione, ale metoda prezentacji przez fagi (lub zbliżony układ, włącznie z prezentacją przez rybosomy) nie znajduje dalej zastosowania, a inne pożądane właściwości lub cechy charakterystyczne powinny zostać zachowane, można stosować ten sposób zgodnie z wynalazkiem. A zatem, w innym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposób poprawiania aktywności przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, obejmujący:
a) zapewnianie zrekombinowanego przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen, które otrzymano przez selekcję w układzie prezentacji przez fagi, ale których aktywności nie można dalej poprawić przez mutagenezę w tym układzie prezentacji przez fagi;
b) wybór korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji w obrębie regionu determinującego komplementarność (CDR) do mutacji, a tym samym ustalenie wybranej korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji;
c) pojedynczo poddawanie mutacji tej wybranej korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji do co najmniej dwóch innych reszt aminokwasowych
PL 218 748 B1 w celu utworzenia w ten sposób zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, oraz ekspresję tego zestawu w układzie innym od układu prezentacji przez fagi;
d) ocenianie aktywności zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen, w celu zidentyfikowania w ten sposób reszty aminokwasowej wzmacniającej aktywność;
e) ocenianie zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen, pod kątem co najmniej jednej innej właściwości lub cechy charakterystycznej, gdzie inną właściwością lub cechą charakterystyczną jest taka właściwość bądź cecha charakterystyczna, która musi być zachowana, dopóki nie otrzyma się przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, o poprawionej aktywności i co najmniej jednej zachowanej właściwości lub cesze charakterystycznej, w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen.
f) ewentualnie powtarzanie etapów od a) do e) dla co najmniej jednej innej korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji;
g) łączenie, w macierzystym przeciwciele, lub jego części wiążącej antygen, co najmniej dwóch pojedynczych wzmacniających aktywność reszt aminokwasowych, dla których wykazano, że wykazują poprawioną aktywność, oraz co najmniej jedną zachowaną właściwość lub cechę charakterystyczną, w celu utworzenia łączonych przeciwciał lub ich części wiążących antygen; oraz
h) ocenianie aktywności łączonych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen; dopóki nie otrzyma się przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, o poprawionej aktywności i co najmniej jednej zachowanej właściwości lub cesze charakterystycznej, w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen.
W korzystnym rozwiązaniu, pozycje kontaktu wybiera się z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 i L96, a inne cechy charakterystyczne wybiera się spośród 1) zachowania braku reaktywności krzyżowej z innymi białkami lub tkankami ludzkimi, 2) zachowania rozpoznawania epitopu, tj. rozpoznawania epitopu p40 preferencyjnie w kontekście heterodimeru p70 (p40/p35), co zapobiega zakłócaniu wiązania przez wolne, rozpuszczalne p40, i/lub 3) tworzenia przeciwciała o sekwencji podobnej do sekwencji immunoglobuliny linii zarodkowej.
W innym korzystnym rozwiązaniu, pozycje hipermutacji wybiera się z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 i L93, a inną cechę charakterystyczną wybiera się spośród 1) zachowania braku reaktywności krzyżowej z innymi białkami lub tkankami ludzkimi, 2) zachowania rozpoznawania epitopu, tj. rozpoznawania epitopu p40 preferencyjnie w kontekście heterodimeru p70 (p40/p35), co zapobiega zakłócaniu wiązania przez wolne, rozpuszczalne p40, i/lub 3) tworzenia przeciwciała o sekwencji podobnej do sekwencji immunoglobuliny linii zarodkowej.
W korzystniejszym rozwiązaniu, reszty do selektywnej mutagenezy wybiera się spośród korzystnych pozycji selektywnej mutagenezy z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 i L94, a inną cechę charakterystyczną wybiera się spośród 1) zachowania braku reaktywności krzyżowej z innymi białkami lub tkankami ludzkimi, 2) zachowania rozpoznawania epitopu, tj. rozpoznawania epitopu p40 preferencyjnie w kontekście heterodimeru p70 (p40/p35), co zapobiega zakłócaniu wiązania przez wolne, rozpuszczalne p40, i/lub 3) tworzenia przeciwciała o sekwencji podobnej do sekwencji immunoglobuliny linii zarodkowej.
W korzystniejszym rozwiązaniu, pozycje kontaktu wybiera się z grupy składającej się z L50 i L94, a inną cechę charakterystyczną wybiera się spośród 1) zachowania braku reaktywności krzyżowej z innymi białkami lub tkankami ludzkimi, 2) zachowania rozpoznawania epitopu, tj. rozpoznawania epitopu p40 preferencyjnie w kontekście heterodimeru p70 (p40/p35), co zapobiega zakłócaniu wiązania przez wolne, rozpuszczalne p40, i/lub 3) tworzenia przeciwciała o sekwencji podobnej do sekwencji immunoglobuliny linii zarodkowej.
W innym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposób poprawiania aktywności przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, obejmujący:
PL 218 748 B1
a) zapewnianie zrekombinowanego przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen, które otrzymano przez selekcję w układzie prezentacji przez fagi, ale których aktywności nie można dalej poprawić przez mutagenezę w tym układzie prezentacji przez fagi;
b) wybór pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji w obrębie regionu determinującego komplementarność (CDR) do mutacji, a tym samym ustalenie wybranej pozycji kontaktu lub hipermutacji;
c) pojedynczo poddawanie mutacji tej wybranej korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji do co najmniej dwóch innych reszt aminokwasowych w celu utworzenia w ten sposób zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, oraz ekspresję tego zestawu w układzie innym od układu prezentacji przez fagi;
d) ocenianie aktywności zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen, w celu zidentyfikowania w ten sposób reszty aminokwasowej wzmacniającej aktywność;
e) ocenianie zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen, pod kątem co najmniej jednej innej właściwości lub cechy charakterystycznej, gdzie właściwością lub cechą charakterystyczną jest taka właściwość bądź cecha charakterystyczna, która musi być zachowa na w przeciwciele, dopóki nie otrzyma się przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, o poprawionej aktywności i co najmniej jednej zachowanej właściwości lub cesze charakterystycznej, w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen.
W korzystnym rozwiązaniu, pozycje kontaktu wybiera się z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 i L96, a inne cechy charakterystyczne wybiera się spośród 1) zachowania braku reaktywności krzyżowej z innymi białkami lub tkankami ludzkimi, 2) zachowania rozpoznawania epitopu, tj. rozpoznawania epitopu p40 preferencyjnie w kontekście heterodimeru p70 (p40/p35), co zapobiega zakłócaniu wiązania przez wolne, rozpuszczalne p40, i/lub 3) tworzenia przeciwciała o sekwencji podobnej do sekwencji immunoglobuliny linii zarodkowej.
W innym korzystnym rozwiązaniu, pozycje hipermutacji wybiera się z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 i L93, a inne cechy charakterystyczne wybiera się spośród 1) zachowania braku reaktywności krzyżowej z innymi białkami lub tkankami ludzkimi, 2) zachowania rozpoznawania epitopu, tj. rozpoznawania epitopu p40 preferencyjnie w kontekście heterodimeru p70 (p40/p35), co zapobiega zakłócaniu wiązania przez wolne, rozpuszczalne p40, i/lub 3) tworzenia przeciwciała o sekwencji podobnej do sekwencji immunoglobuliny linii zarodkowej.
W korzystniejszym rozwiązaniu, reszty do selektywnej mutagenezy wybiera się spośród korzystnych pozycji selektywnej mutagenezy z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 i L94, a inną cechę charakterystyczną wybiera się spośród 1) zachowania braku reaktywności krzyżowej z innymi białkami lub tkankami ludzkimi, 2) zachowania rozpoznawania epitopu, tj. rozpoznawania epitopu p40 preferencyjnie w kontekście heterodimeru p70 (p40/p35), co zapobiega zakłócaniu wiązania przez wolne, rozpuszczalne p40, i/lub 3) tworzenia przeciwciała o sekwencji podobnej do sekwencji immunoglobuliny linii zarodkowej.
W korzystniejszym rozwiązaniu, pozycje kontaktu wybiera się z grupy składającej się z L50 i L94, a inną cechę charakterystyczną wybiera się spośród 1) zachowania braku reaktywności krzyżowej z innymi białkami lub tkankami ludzkimi, 2) zachowania rozpoznawania epitopu, tj. rozpoznawania epitopu p40 preferencyjnie w kontekście heterodimeru p70 (p40/p35), co zapobiega zakłócaniu wiązania przez wolne, rozpuszczalne p40, i/lub 3) tworzenia przeciwciała o sekwencji podobnej do sekwencji immunoglobuliny linii zarodkowej.
W innym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposób poprawiania aktywności przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, obejmujący:
a) zapewnianie zrekombinowanego przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen, które otrzymano przez selekcję w układzie prezentacji przez fagi, ale których aktywności nie można dalej poprawić przez mutagenezę w tym układzie prezentacji przez fagi;
PL 218 748 B1
b) wybór korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji w obrębie regionu determinującego komplementarność (CDR) do mutacji, a tym samym ustalenie wybranej korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji;
c) pojedynczo poddawanie mutacji tej wybranej korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji do co najmniej dwóch innych reszt aminokwasowych w celu utworzenia w ten sposób zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, oraz ekspresję tego zestawu w układzie innym od układu prezentacji przez fagi;
d) ocenianie aktywności zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen, w celu zidentyfikowania w ten sposób reszty aminokwasowej wzmacniającej aktywność;
e) ocenianie zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen, pod kątem co najmniej jednej innej właściwości lub cechy charakterystycznej, gdzie właściwością lub cechą charakterystyczną jest taka właściwość bądź cecha charakterystyczna, która musi być zachowana w przeciwciele, dopóki nie otrzyma się przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, o poprawionej aktywności i co najmniej jednej zachowanej właściwości lub cesze charakterystycznej, w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen.
f) ewentualnie powtarzanie etapów od a) do e) dla co najmniej jednej innej korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji;
g) łączenie, w macierzystym przeciwciele, lub jego części wiążącej antygen, co najmniej dwóch pojedynczych reszt aminokwasowych wzmacniających aktywność, dla których wykazano, że wykazują poprawioną aktywność, oraz co najmniej jedną zachowaną właściwość lub cechę charakterystyczną, w celu utworzenia łączonych przeciwciał lub ich części wiążących antygen; oraz
h) ocenianie aktywności łączonych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen; dopóki nie otrzyma się przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, o poprawionej aktywności i co najmniej jednej zachowanej właściwości lub cesze charakterystycznej, w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen.
W korzystnym rozwiązaniu, pozycje kontaktu wybiera się z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 i L96, a inną cechę charakterystyczną wybiera się spośród 1) zachowania braku reaktywności krzyżowej z innymi białkami lub tkankami ludzkimi, 2) zachowania rozpoznawania epitopu, tj. rozpoznawania epitopu p40 preferencyjnie w kontekście heterodimeru p70 (p40/p35), co zapobiega zakłócaniu wiązania przez wolne, rozpuszczalne p40, i/lub 3) tworzenia przeciwciała o sekwencji podobnej do sekwencji immunoglobuliny linii zarodkowej.
W innym korzystnym rozwiązaniu, pozycje hipermutacji wybiera się z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 i L93, a inną cechę charakterystyczną wybiera się spośród 1) zachowania braku reaktywności krzyżowej z innymi białkami lub tkankami ludzkimi, 2) zachowania rozpoznawania epitopu, tj. rozpoznawania epitopu p40 preferencyjnie w kontekście heterodimeru p70 (p40/p35), co zapobiega zakłócaniu wiązania przez wolne, rozpuszczalne p40, i/lub 3) tworzenia przeciwciała o sekwencji podobnej do sekwencji immunoglobuliny linii zarodkowej.
W korzystniejszym rozwiązaniu, reszty do selektywnej mutagenezy wybiera się spośród korzystnych pozycji selektywnej mutagenezy z grupy składającej się z H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 i L94, a inną cechę charakterystyczną wybiera się spośród 1) zachowania braku reaktywności krzyżowej z innymi białkami lub tkankami ludzkimi, 2) zachowania rozpoznawania epitopu, tj. rozpoznawania epitopu p40 preferencyjnie w kontekście heterodimeru p70 (p40/p35), co zapobiega zakłócaniu wiązania przez wolne, rozpuszczalne p40, i/lub 3) tworzenia przeciwciała o sekwencji podobnej do sekwencji immunoglobuliny linii zarodkowej.
W korzystniejszym rozwiązaniu, pozycje kontaktu wybiera się z grupy składającej się z L50 i L94, a inną cechę charakterystyczną wybiera się spośród 1) zachowania braku reaktywności krzyżowej z innymi białkami lub tkankami ludzkimi, 2) zachowania rozpoznawania epitopu, tj. rozpoznawania
PL 218 748 B1 epitopu p40 preferencyjnie w kontekście heterodimeru p70 (p40/p35), co zapobiega zakłócaniu wiązania przez wolne, rozpuszczalne p40, i/lub 3) tworzenia przeciwciała o sekwencji podobnej do sekwencji immunoglobuliny linii zarodkowej.
IV. Modyfikacje innych reszt CDR
Ostatecznie, w jakikolwiek sposób identyfikuje się wszystkie reszty CDR w danej parze przeciwciało-antygen, które są resztami aminokwasowymi wzmacniającymi aktywność i/lub bezpośrednio lub pośrednio wymaganymi do wiązania antygenu i/lub zachowywania innych pożądanych właściwości lub cech charakterystycznych przeciwciała. Takie reszty CDR określa się jako „korzystne pozycje selektywnej mutagenezy”. Należy zauważyć, że w określonych okolicznościach te korzystne pozycje selektywnej mutagenezy można identyfikować także innymi sposobami, włącznie z kokrystalizacją przeciwciała i antygenu oraz modelowaniem molekularnym.
Jeśli wyczerpano korzystne próby identyfikacji wzmacniających aktywność aminokwasów, skupiając się na opisanych powyżej korzystnych pozycjach selektywnej mutagenezy, pozycjach kontaktu lub hipermutacji, lub wymagana jest dalsza poprawa, można modyfikować pozostałe reszty CDR, jak dyskutowano powyżej. Powinno być zrozumiałe, że przeciwciało mogło już zostać zmodyfikowane w jednej lub więcej pozycji kontaktu lub hipermutacji zgodnie z rozwiązaniami dyskutowanymi powyżej, ale może wymagać dalszej poprawy. Dlatego też, w innym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposób poprawiania aktywności przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, obejmujący:
a) zapewnianie przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen;
b) wybór reszty aminokwasowej w obrębie regionu determinującego komplementarność (CDR) do mutacji, innej niż H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 i L96;
c) pojedynczo poddawanie mutacji tej wybranej pozycji np. do co najmniej dwóch innych reszt aminokwasowych w celu utworzenia w ten sposób zmutowanego przeciwciała lub zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen;
d) ocenianie aktywności zmutowanego przeciwciała lub zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen, w celu zidentyfikowania w ten sposób reszty aminokwasowej wzmacniającej aktywność;
e) ocenianie zmutowanego przeciwciała lub zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen, pod kątem zmian co najmniej jednej innej właściwości lub cechy charakterystycznej, dopóki nie otrzyma się przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, o poprawionej aktywności w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen.
Korzystnie, inną cechę charakterystyczną lub właściwość wybiera się spośród 1) zachowania braku reaktywności krzyżowej z innymi białkami lub tkankami ludzkimi, 2) zachowania rozpoznawania epitopu, tj. rozpoznawania epitopu p40 preferencyjnie w kontekście heterodimeru p70 (p40/p35), co zapobiega zakłócaniu wiązania przez wolne, rozpuszczalne p40, i/lub 3) tworzenia przeciwciała o sekwencji podobnej do sekwencji immunoglobuliny linii zarodkowej.
Jeśli mutageneza jednej reszty nie jest wystarczająca, można nią objąć inne reszty; dlatego też, w innym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposób poprawiania aktywności przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, obejmujący:
a) zapewnianie przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen;
b) wybór reszty aminokwasowej w obrębie regionu determinującego komplementarność (CDR) do mutacji, innej niż H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54,
H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 i L96;
c) pojedynczo poddawanie mutacji tej wybranej pozycji do co najmniej dwóch innych reszt aminokwasowych w celu utworzenia w ten sposób zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen;
d) ocenianie aktywności zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen, w celu zidentyfikowania w ten sposób reszty aminokwasowej wzmacniającej aktywność;
PL 218 748 B1
e) powtarzanie etapów od b) do d) dla co najmniej jednej innej pozycji w CDR, która nie jest ani pozycją wybraną w b), ani pozycją H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 i L96;
f) łączenie, w macierzystym przeciwciele, lub jego części wiążącej antygen, co najmniej dwóch pojedynczych wzmacniających aktywność reszt aminokwasowych, dla których wykazano, że wykazują poprawioną aktywność, w celu utworzenia łączonych przeciwciał lub ich części wiążących antygen; oraz
g) ocenianie aktywności łączonych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, z dwiema wzmacniającymi aktywność resztami aminokwasowymi, w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen, dopóki nie otrzyma się przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, o poprawionej aktywności w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen.
Jeśli wyczerpano korzystne próby identyfikacji wzmacniających aktywność aminokwasów, skupiając się na opisanych powyżej pozycjach kontaktu lub hipermutacji, lub wymagana jest dalsza poprawa, a przeciwciała, którego to dotyczy, nie można dalej optymalizować metodami mutagenezy i prezentacji przez fagi (lub podobnej prezentacji przez rybosomy), można modyfikować pozostałe reszty CDR, jak dyskutowano powyżej. Powinno być zrozumiałe, że przeciwciało mogło już zostać zmodyfikowane w jednej lub więcej korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, pozycji kontaktu lub hipermutacji zgodnie z rozwiązaniami dyskutowanymi powyżej, ale może wymagać dalszej poprawy.
Dlatego też, w innym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposób poprawiania aktywności przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, obejmujący:
a) zapewnianie zrekombinowanego przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen, które otrzymano przez selekcję w układzie prezentacji przez fagi, ale których aktywności nie można poprawić dalej przez mutagenezę w tym układzie prezentacji przez fagi;
b) wybór reszty aminokwasowej w obrębie regionu determinującego komplementarność (CDR) do mutacji, innej niż H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94; oraz
c) pojedynczo poddawanie mutacji tej wybranej pozycji kontaktu lub hipermutacji do co najmniej dwóch innych reszt aminokwasowych w celu utworzenia w ten sposób zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, oraz ekspresję tego zestawu w układzie innym od układu prezentacji przez fagi;
d) ocenianie aktywności zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen, w celu zidentyfikowania w ten sposób reszty aminokwasowej wzmacniającej aktywność;
e) ocenianie zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen, pod kątem zmian co najmniej jednej innej właściwości lub cechy charakterystycznej, dopóki nie otrzyma się przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, o poprawionej aktywności w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen.
Korzystnie, inną cechę charakterystyczną lub właściwość wybiera się spośród 1) zachowania braku reaktywności krzyżowej z innymi białkami lub tkankami ludzkimi, 2) zachowania rozpoznawania epitopu, tj. rozpoznawania epitopu p40 preferencyjnie w kontekście heterodimeru p70 (p40/p35), co zapobiega zakłócaniu wiązania przez wolne, rozpuszczalne p40, i/lub 3) tworzenia przeciwciała o sekwencji podobnej do sekwencji immunoglobuliny linii zarodkowej.
Jeśli pojedyncza mutageneza nie jest wystarczająca do zwiększenia powinowactwa, mutagenezą można objąć inne reszty. Dlatego też, w innym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposób poprawiania aktywności przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, obejmujący:
a) zapewnianie zrekombinowanego przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen, które otrzymano przez selekcję w układzie prezentacji przez fagi, ale których aktywności nie można dalej poprawić przez mutagenezę w tym układzie prezentacji przez fagi;
b) wybór reszty aminokwasowej w obrębie regionu determinującego komplementarność (CDR) do mutacji, innej niż H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54,
PL 218 748 B1
H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 i L96;
c) pojedynczo poddawanie mutacji tej wybranej pozycji do co najmniej dwóch innych reszt aminokwasowych w celu utworzenia w ten sposób zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, oraz ekspresję w układzie innym od układu prezentacji przez fagi;
d) ocenianie aktywności zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen, w celu zidentyfikowania w ten sposób reszty aminokwasowej wzmacniającej aktywność;
e) powtarzanie etapów od b) do d) dla co najmniej jednej innej pozycji, która nie jest ani pozycją wybraną w b), ani pozycją H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93 i L94;
g) łączenie, w macierzystym przeciwciele lub jego części wiążącej antygen, co najmniej dwóch pojedynczych wzmacniających aktywność reszt aminokwasowych, dla których wykazano, że wykazują poprawioną aktywność, w celu utworzenia łączonych przeciwciał lub ich części wiążących antygen; oraz
h) ocenianie aktywności i innej właściwości lub cechy charakterystycznej łączonych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, z dwiema wzmacniającymi aktywność resztami aminokwasowymi, w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen;
dopóki nie otrzyma się przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, o poprawionej aktywności w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen.
Korzystnie, inną cechę charakterystyczną lub właściwość wybiera się spośród 1) zachowania braku reaktywności krzyżowej z innymi białkami lub tkankami ludzkimi, 2) zachowania rozpoznawania epitopu, tj. rozpoznawania epitopu p40 preferencyjnie w kontekście heterodimeru p70 (p40/p35), co zapobiega zakłócaniu wiązania przez wolne, rozpuszczalne p40, i/lub 3) tworzenia przeciwciała o sekwencji podobnej do sekwencji immunoglobuliny linii zarodkowej.
Korzystne próby identyfikacji wzmacniających aktywność aminokwasów, skupiające się na opisanych powyżej korzystnych pozycjach selektywnej mutagenezy, pozycjach kontaktu lub hipermutacji mogą zostać wyczerpane, lub może być wymagana dalsza poprawa, i ważne jest zachowanie innych właściwości lub cech charakterystycznych przeciwciała.
Dlatego też, w innym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposób poprawiania aktywności przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, bez wpływania na inne cechy charakterystyczne, obejmujący:
a) zapewnianie przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen;
b) wybór reszty aminokwasowej w obrębie regionu determinującego komplementarność (CDR) do mutacji, innej niż H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 i L96;
c) pojedynczo poddawanie mutacji tej wybranej pozycji do co najmniej dwóch innych reszt aminokwasowych w celu utworzenia w ten sposób zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen;
d) ocenianie aktywności zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen, w celu zidentyfikowania w ten sposób reszty aminokwasowej wzmacniającej aktywność;
e) ocenianie zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen, pod kątem zmian co najmniej jednej innej właściwości lub cechy charakterystycznej, dopóki nie otrzyma się przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, o poprawionej aktywności i zachowanej innej właściwości lub cesze charakterystycznej w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen.
Korzystnie, inną cechę charakterystyczną lub właściwość wybiera się spośród 1) zachowania braku reaktywności krzyżowej z innymi białkami lub tkankami ludzkimi, 2) zachowania rozpoznawania epitopu, tj. rozpoznawania epitopu p40 preferencyjnie w kontekście heterodimeru p70 (p40/p35), co
PL 218 748 B1 zapobiega zakłócaniu wiązania przez wolne, rozpuszczalne p40, i/lub 3) tworzenia przeciwciała o sekwencji podobnej do sekwencji immunoglobuliny linii zarodkowej.
Jeśli mutageneza jednej reszty nie jest wystarczająca, można nią objąć inne reszty; dlatego też, w innym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposób poprawiania aktywności przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, obejmujący:
a) zapewnianie przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen;
b) wybór reszty aminokwasowej w obrębie regionu determinującego komplementarność (CDR) do mutacji, innej niż H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 i L96;
c) pojedynczo poddawanie mutacji tej wybranej pozycji do co najmniej dwóch innych reszt aminokwasowych w celu utworzenia w ten sposób zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen;
d) ocenianie aktywności zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen, w celu zidentyfikowania w ten sposób reszty aminokwasowej wzmacniającej aktywność;
e) ocenianie zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen, pod kątem zmian co najmniej jednej innej cechy charakterystycznej lub właściwości,
e) powtarzanie etapów od b) do e) dla co najmniej jednej innej pozycji w CDR, która nie jest ani pozycją wybraną w b), ani pozycją H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 i L96;
f) łączenie, w macierzystym przeciwciele lub jego części wiążącej antygen, co najmniej dwóch pojedynczych wzmacniających aktywność reszt aminokwasowych, dla których wykazano, że wykazują poprawioną aktywność i nie wpływają na co najmniej jedną inną właściwość lub cechę charakterystyczną, w celu utworzenia łączonych przeciwciał lub ich części wiążących antygen; oraz
g) ocenianie aktywności i zachowywania co najmniej jednej innej właściwości lub cechy charakterystycznej łączonych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, z dwiema wzmacniającymi aktywność resztami aminokwasowymi, w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen, dopóki nie otrzyma się przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, o poprawionej aktywności i zachowanej co najmniej jednej innej właściwości lub cesze charakterystycznej, w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen.
Mutageneza korzystnej pozycji selektywnej mutagenezy, reszt kontaktu i hipermutacji może nie zwiększyć dostatecznie powinowactwa przeciwciała, a mutageneza i metoda prezentacji przez fagi (lub podobna metoda prezentacji przez rybosomy) mogą nie być dalej użyteczne i powinna zostać zachowana co najmniej jedna inna cecha charakterystyczna lub właściwość przeciwciała.
Dlatego też, w innym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposób poprawiania aktywności przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, obejmujący:
a) zapewnianie przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen; które otrzymano przez selekcję w układzie prezentacji przez fagi, ale których aktywności nie można dalej poprawić przez mutagenezę w tym układzie prezentacji przez fagi;
b) wybór reszty aminokwasowej w obrębie regionu determinującego komplementarność (CDR) do mutacji, innej niż H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 i L96;
c) pojedynczo poddawanie mutacji tej wybranej pozycji do co najmniej dwóch innych reszt aminokwasowych w celu utworzenia w ten sposób zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, oraz ekspresję w układzie innym od układu prezentacji przez fagi;
d) ocenianie aktywności lub zachowywania co najmniej jednej innej właściwości lub cechy charakterystycznej zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen, w celu zidentyfikowania w ten sposób reszty aminokwasowej wzmacniającej aktywność;
PL 218 748 B1
e) ocenianie zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, pod kątem zmian co najmniej jednej innej właściwości lub cechy charakterystycznej, dopóki nie otrzyma się przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, o poprawionej aktywności w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen.
Korzystnie, inną cechę charakterystyczną lub właściwość wybiera się spośród 1) zachowania braku reaktywności krzyżowej z innymi białkami lub tkankami ludzkimi, 2) zachowania rozpoznawania epitopu, tj. rozpoznawania epitopu p40 preferencyjnie w kontekście heterodimeru p70 (p40/p35), co zapobiega zakłócaniu wiązania przez wolne, rozpuszczalne p40, i/lub 3) tworzenia przeciwciała o sekwencji podobnej do sekwencji immunoglobuliny linii zarodkowej.
Jeśli mutageneza jednej reszty nie jest wystarczająca, można nią objąć inne reszty; dlatego też, w innym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposób poprawiania aktywności przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, obejmujący:
a) zapewnianie przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen; które otrzymano przez selekcję w układzie prezentacji przez fagi, ale których aktywności nie można dalej poprawić przez mutagenezę w tym układzie prezentacji przez fagi;
b) wybór reszty aminokwasowej w obrębie regionu determinującego komplementarność (CDR) do mutacji, innej niż H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 i L96;
c) pojedynczo poddawanie mutacji tej wybranej pozycji do co najmniej dwóch innych reszt aminokwasowych w celu utworzenia w ten sposób zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, oraz ekspresję w układzie innym od układu prezentacji przez fagi;
d) ocenianie aktywności lub zachowywania co najmniej jednej innej właściwości lub cechy charakterystycznej zestawu zmutowanych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, w stosunku do przeciwciała macierzystego lub jego części wiążącej antygen, w celu zidentyfikowania w ten sposób reszty aminokwasowej wzmacniającej aktywność;
e) powtarzanie etapów od b) do d) dla co najmniej jednej innej pozycji w CDR, która nie jest ani pozycją wybraną w b), ani pozycją H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 i L96;
f) łączenie, w macierzystym przeciwciele lub jego części wiążącej antygen, co najmniej dwóch pojedynczych wzmacniających aktywność reszt aminokwasowych, dla których wykazano, że wykazują poprawioną aktywność i nie wpływają na co najmniej jedną inną właściwość lub cechę charakterystyczną, w celu utworzenia łączonych przeciwciał lub ich części wiążących antygen; oraz
g) ocenianie aktywności i zachowywania co najmniej jednej innej właściwości lub cechy charakterystycznej łączonych przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, z dwiema wzmacniającymi aktywność resztami aminokwasowymi, w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen, dopóki nie otrzyma się przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, o poprawionej aktywności i zachowanej co najmniej jednej innej właściwości lub cesze charakterystycznej, w stosunku do przeciwciała macierzystego, lub jego części wiążącej antygen.
V. Ekspresja przeciwciał
Przeciwciało, lub część przeciwciała, według wynalazku można przygotowywać przez rekombinacyjną ekspresję genów łańcucha lekkiego i ciężkiego immunoglobuliny w komórce gospodarzu. W celu ekspresji przeciwciała na drodze rekombinacyjnej, komórkę gospodarza transfekuje się jednym lub większą liczbą zrekombinowanych wektorów zawierających fragmenty DNA kodujące immunoglobulinowe łańcuchy lekki i ciężki przeciwciała, tak że łańcuchy lekki i ciężki ulegają ekspresji w komórce gospodarzu i, korzystnie, wydzielaniu do podłoża, w którym hoduje się komórki gospodarzy, z którego to podłoża przeciwciała można odzyskiwać. Do otrzymania genów łańcuchów ciężkiego i lekkiego przeciwciała, wprowadzania tych genów do zrekombinowanych wektorów ekspresyjnych i wprowadzania wektorów do komórek gospodarzy stosuje się standardowe metody rekombinacji DNA, takie jak te opisane w Sambrook, Fritsch i Maniatis (red.). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie drugie. Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M. i in. (red.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) oraz w opisie patentowym US nr 4 816 397 Bossa i in.
PL 218 748 B1
W celu otrzymania fragmentu DNA kodującego region zmienny łańcucha ciężkiego przeciwciała Joe 9 typu dzikiego lub przeciwciała podobnego do Joe 9 typu dzikiego, biblioteki ludzkie przeszukano pod kątem przeciwciał specyficznych wobec ludzkiej IL-12 i mutowano, jak opisano w części II. Po otrzymaniu fragmentów DNA kodujących odcinki VH i VL Joe 9 typu dzikiego lub przeciwciała podobnego do Joe 9 typu dzikiego, przeprowadza się mutagenezę tych sekwencji stosując standardowe metody, takie jak ukierunkowana mutageneza przez PCR (mutageneza za pośrednictwem PCR, w której zmutowane nukleotydy wprowadza się do starterów PCR, tak że produkt PCR zawiera mutacje) lub inne metody ukierunkowanej mutagenezy. Przeciw IL-12 przeciwciała, które wykazywały niski poziom aktywności i specyficzność/powinowactwo wiązania, niż to pożądane, na przykład
J695, poddawano dalszym manipulacjom standardowymi technikami rekombinacji DNA, na przykład w celu przekształcenia genów regionów zmiennych w geny łańcuchów przeciwciał o pełnej długości, geny Fab lub w gen scFv. Podczas tych manipulacji fragment DNA kodujący VL lub VH łączy się w sposób umożliwiający działanie z innym fragmentem DNA, kodującym inne białko, takie jak region stały przeciwciała lub giętki łącznik. Termin „połączone w sposób umożliwiający działanie, w znaczeniu stosowanym w tym kontekście, w zamierzeniu oznacza, że dwa fragmenty DNA łączy się w taki sposób, że sekwencje aminokwasowe kodowane przez dwa fragmenty DNA pozostają w tej samej ramce odczytu.
Wyizolowany DNA kodujący region VH można przekształcić w gen łańcucha ciężkiego o pełnej długości poprzez połączenie w sposób umożliwiający działanie DNA kodującego VH z inną cząsteczką DNA, kodującą regiony stałe łańcucha ciężkiego (CH1, CH2 i CH3). Sekwencje genów regionów stałych ludzkiego łańcucha ciężkiego są znane w tej dziedzinie (patrz np. Kabat, E. A. i in. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie piąte, U.S. Department of Health and Human Services, Publikacja NIH nr 91-3242) i fragmenty DNA obejmujące te regiony można otrzymać poprzez standardową amplifikację przez PCR. Region stały łańcucha ciężkiego może być regionem stałym IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM lub IgD i jakimkolwiek ich wariantem allotypowym, jak opisano w Kabat (Kabat, E. A. i in. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie piąte, U.S. Department of Health and Human Services, Publikacja NIH nr 91-3242), ale najkorzystniej jest regionem stałym IgG1 lub IgG4. W przypadku genu łańcucha ciężkiego fragmentu Fab, DNA kodujący VH można połączyć w sposób umożliwiający działanie z inną cząsteczką DNA, kodującą tylko region stały CH1 łańcucha ciężkiego.
Wyizolowany DNA kodujący region VL można przekształcić w gen łańcucha lekkiego o pełnej długości (jak również gen łańcucha lekkiego Fab) przez połączenie w sposób umożliwiający działanie DNA kodującego VL z inną cząsteczką DNA, kodującą region stały łańcucha lekkiego, CL. Sekwencje genów regionów stałych ludzkiego łańcucha lekkiego są znane w tej dziedzinie (patrz np. Kabat, E. A. i in. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie piąte, U.S. Department of Health and Human Services, Publikacja NIH nr 91-3242) i fragmenty DNA obejmujące te regiony można otrzymać poprzez standardową amplifikację przez PCR. Region stały łańcucha Iekkiego może być regionem stałym kappa lub lambda, ale najkorzystniej jest regionem stałym lambda.
W celu utworzenia genu scFv, fragmenty DNA kodujące VH i VL łączy się w sposób umożliwiający działanie z innym fragmentem, kodującym giętki łącznik, np. kodującym sekwencję aminokwasową (gly4-Ser)3, tak że sekwencje VH i VL mogą ulegać ekspresji w postaci ciągłego, jednołańcuchowego białka, o regionach VL i VH połączonych giętkim łącznikiem (patrz np. Bird i in. (1988) Science 242: 423-426; Huston i in. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty i in., Nature (1990) 348: 552-554).
W celu ekspresji przeciwciał, lub części przeciwciał, według wynalazku, DNA kodujące łańcuchy lekki i ciężki o częściowej lub pełnej długości, otrzymane jak opisano powyżej, wstawia się do wektorów ekspresyjnych w taki sposób, że geny połączone są w sposób umożliwiający działanie z sekwencjami kontrolującymi transkrypcję i translację. W tym kontekście, termin „połączone w sposób umożliwiający działanie w zamierzeniu oznacza, że gen przeciwciała zligowano z wektorem w taki sposób, że sekwencje kontrolujące transkrypcję i translację w wektorze pełnią zamierzone funkcje regulacji transkrypcji i translacji genu przeciwciała. Wektor ekspresyjny i sekwencje kontrolujące ekspresję wybiera się w tak, aby były zgodne ze stosowaną do ekspresji komórką gospodarzem. Gen łańcucha lekkiego przeciwciała i gen łańcucha ciężkiego przeciwciała można wstawiać do oddzielnych wektorów lub, częściej, oba geny wstawia się do tego samego wektora ekspresyjnego. Geny przeciwciała wstawia się do wektora standardowymi metodami (np. Iigacja komplementarnych miejsc restrykcyjnych fragmentu z genem przeciwciała lub ligacja tępych końców, jeśli nie są obecne miejsca restryk44
PL 218 748 B1 cyjne). Przed wstawieniem sekwencji łańcucha lekkiego lub ciężkiego J695 lub przeciwciała zbliżonego do J695, wektor ekspresyjny może już zawierać sekwencje regionów stałych przeciwciała. Na przykład, jedno z podejść przekształcania sekwencji VH i VL J695 lub przeciwciała zbliżonego do J695 w geny przeciwciała o pełnej długości polega na ich wstawieniu do wektorów ekspresyjnych już kodujących odpowiednio regiony stałe łańcucha ciężkiego lub regiony stałe łańcucha lekkiego, w taki sposób, że odcinek VH połączony jest w sposób umożliwiający działanie z odcinkiem(ami) CH w wektorze, a odcinek VL połączony jest w sposób umożliwiający działanie z odcinkiem CL w wektorze. Dodatkowo, lub alternatywnie, zrekombinowany wektor ekspresyjny może kodować peptyd sygnałowy, który ułatwia wydzielanie łańcucha przeciwciała z komórki gospodarza. Gen łańcucha przeciwciała można sklonować w wektorze w taki sposób, że peptyd sygnałowy połączony jest w tej samej ramce odczytu z końcem aminowym w genie łańcucha przeciwciała. Peptyd sygnałowy może być peptydem sygnałowym immunoglobuliny lub heteroIogicznym peptydem sygnałowym (tj. peptydem sygnałowym białka nie będącego immunoglobuliną).
Poza genami łańcuchów przeciwciał, zrekombinowane wektory według wynalazku zawierają sekwencje regulujące, które kontrolują ekspresję genów łańcuchów przeciwciał w komórce gospodarzu. Termin „sekwencja regulująca” w zamierzeniu obejmuje promotory, sekwencje wzmacniające i inne elementy kontrolujące ekspresję (np. sygnały poliadenylacji), które kontrolują transkrypcję lub translację genów łańcuchów przeciwciała. Takie sekwencje regulujące opisano, na przykład, w Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Specjalista w tej dziedzinie będzie wiedział, że projektowanie wektora ekspresyjnego, włącznie z wyborem sekwencji regulujących, może zależeć od takich czynników, jak wybór przeznaczonej do transformowania komórki gospodarza, pożądanego poziomu ekspresji białka itp. Korzystne sekwencje regulujące dla ekspresji w ssaczych komórkach gospodarzach obejmują elementy wirusowe, które kierują ekspresją białka na wysokim poziomie w komórkach ssaczych, takie jak promotory i/lub sekwencje wzmacniające pochodzące z wirusa cytomegalii (CMV) (takie jak promotor/sekwencja wzmacniająca CMV), wirusa małpiego 40 (SV40) (takie jak promotor/sekwencja wzmacniająca SV40), adenowirusa (np. główny późny promotor adenowirusa (AdMLP)) i wirusa poIioma. Dalszy opis wirusowych elementów regulujących oraz ich sekwencji przedstawiono np. w opisie patentowym US nr 5 168 062 Sinskiego, opisie patentowym US nr 4 510 245 Bella i in., opisie patentowym US nr 4 968 615 Schaffnera i in., opisie patentowym US nr 5 464 758 Bujarda i in. oraz opisie patentowym US nr 5 654 168 Bujarda i in.
Poza genami łańcuchów przeciwciał i sekwencjami regulującymi, zrekombinowane wektory ekspresyjne według wynalazku mogą zawierać dodatkowe sekwencje, takie jak sekwencje, które regulują replikację wektora w komórkach gospodarzach (np. miejsca początku replikacji) oraz geny markerów selekcyjnych. Gen markera selekcyjnego ułatwia selekcję komórek gospodarzy, do których wprowadzono wektor (patrz np. opisy patentowe US nr 4 399 216, 4 634 665 oraz 5 179 017, wszystkie Axela i in.). Na przykład, zazwyczaj gen markera selekcyjnego nadaje oporność na leki, takie jak G418, higromycyna lub metotreksat, komórce gospodarzowi, do której wprowadzono wektor. Korzystne geny markerów selekcyjnych obejmują gen reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) (do stosowania w komórkach gospodarzach dhfr- przy selekcji/amplifikacji metotreksatem) oraz gen neo (do selekcji G418).
W celu ekspresji łańcuchów lekkiego i ciężkiego, wektorem(ami) ekspresyjnym(i) kodującym(i) łańcuchy ciężki i lekki transfekuje się komórki gospodarzy, stosując standardowe techniki. Różne odmiany terminu „transfekcja w zamierzeniu obejmują szeroki zakres technik powszechnie stosowanych do wprowadzania egzogennego DNA do prokariotycznych lub eukariotycznych komórek gospodarzy, np. elektroporację, wytrącanie fosforanem wapnia, transfekcję z udziałem DEAE-dekstranu i podobne. Chociaż teoretycznie możliwe jest prowadzenie ekspresji przeciwciał według wynalazku w komórkach prokariotycznych albo eukariotycznych, najkorzystniejsza jest ekspresja przeciwciał w komórkach eukariotycznych, najkorzystniej ssaczych, ponieważ w przypadku takich komórek eukariotycznych, a w szczególności komórek ssaczych, bardziej niż w przypadku komórek prokariotycznych, prawdopodobne jest składanie i wydzielanie właściwie ufałdowanego i immunologicznie aktywnego przeciwciała. Korzystne ssacze komórki gospodarze do ekspresji zrekombinowanych przeciwciał według wynalazku obejmują komórki jajnika chomika chińskiego (komórki CHO) (włącznie z komórkami CHO dhfr-, opisanymi w Urlaub i Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4126-4220, stosowanymi z markerem selekcyjnym DHFR, np. jak opisano w R. J. Kaufman i P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621), komórkami szpiczaka NS0, komórkami COS i komórkami SP2. Gdy do komórek wprowadza
PL 218 748 B1 się zrekombinowane wektory ekspresyjne kodujące geny przeciwciał, przeciwciała wytwarza się przez hodowanie komórek gospodarzy w ciągu czasu wystarczającego do umożliwienia ekspresji przeciwciała w komórkach gospodarzach lub, korzystniej, wydzielania przeciwciała do podłoża hodowlanego, w którym hoduje się komórki gospodarzy. Przeciwciała można odzyskiwać z podłoża hodowlanego stosując standardowe metody oczyszczania białek.
Komórki gospodarzy można stosować do wytwarzania części nietkniętych przeciwciał, takich jak fragmenty Fab lub cząsteczki scFv. Będzie zrozumiałe, że odmiany powyższej procedury objęte są zakresem niniejszego wynalazku. Na przykład, pożądane może być stransfekowanie komórki gospodarza DNA kodującym albo lekki łańcuch, albo ciężki łańcuch (ale nie oba) przeciwciała według wynalazku. Technikę rekombinacji DNA można również zastosować do usunięcia części lub całości DNA ko dującego albo jeden, albo oba z łańcuchów ciężkiego i lekkiego, które nie są konieczne do wiązania z hIL-12. Przeciwciała według wynalazku obejmują również cząsteczki ulegające ekspresji z takich skróconych cząsteczek DNA. Ponadto, można tworzyć przeciwciała bifunkcyjne, w których jeden łańcuch ciężki i jeden lekki są łańcuchami przeciwciała według wynalazku, a drugi łańcuch ciężki i lekki są specyficzne wobec antygenu innego, niż hIL-12, przez sieciowanie przeciwciała według wynalazku drugim przeciwciałem standardowymi metodami sieciowania chemicznego.
W korzystnym układzie do rekombinacyjnej ekspresji przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, według wynalazku, zrekombinowany wektor ekspresyjny, kodujący zarówno ciężki łańcuch przeciwciała, jak i lekki łańcuch przeciwciała, wprowadza się do komórek CHO dhfr- przez transfekcję za pośrednictwem fosforanu wapniowego. W zrekombinowanym wektorze ekspresyjnym każdy z genów łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego przeciwciała połączone są w sposób umożliwiający działanie ze wzmacniającymi/promotorowymi elementami regulującymi (np. pochodzącymi z SV40, CMV, adenowirusa i podobnych, takie jak element regulujący sekwencja wzmacniająca CMV/promotor AdMLP lub element regulujący sekwencja wzmacniająca SV40/promotor AdMLP) dla kierowania wysokimi poziomami transkrypcji genów. Zrekombinowany wektor ekspresyjny zawiera również gen DHFR, który umożliwia selekcję komórek CHO, które stransfekowano wektorem, z zastosowaniem selekcji metotreksatem/amplifikacji. Wyselekcjonowane stransformowane komórki hoduje się dla umożliwienia ekspresji łańcuchów ciężkiego i lekkiego przeciwciała i nietknięte przeciwciało odzyskuje się z podłoża hodowlanego. Do przygotowania zrekombinowanego wektora ekspresyjnego, stransfekowanych komórek gospodarzy, selekcji transformantów, hodowli komórek gospodarzy i odzyskiwania przeciwciała z podłoża hodowlanego stosuje się standardowe techniki biologii molekularnej. Ekspresję przeciwciał, lub ich części wiążące antygen, według wynalazku, można prowadzić w zwierzęciu (np. myszy), które jest transgeniczne pod względem ludzkich genów immunoglobulin (patrz np. Taylor, L. D. i in. (1992) Nucl Acids Res. 20: 6287-6295). Można również modyfikować komórki roślinne w celu tworzenia transgenicznych roślin, w których zachodzi ekspresja przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, według wynalazku.
Uwzględniając powyższe, inny aspekt wynalazku obejmuje kompozycje kwasu nukleinowego, wektora i komórek gospodarzy, które można stosować do rekombinacyjnej ekspresji przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, według wynalazku. Korzystnie, wynalazek dostarcza wyizolowane kwasy nukleinowe, które kodują CDR J695, bądź pełnej długości region zmienny łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego J695. A zatem, w jednym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza wyizolowany kwas nukleinowy kodujący ludzkie przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, według wynalazku, które to przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, zawiera CDR3 łańcucha ciężkiego J695, obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 25. Korzystnie, kodowane przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, zawiera ponadto CDR2 łańcucha ciężkiego J695, który obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 27. Korzystniej, kodowane przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, zawiera ponadto CDR1 łańcucha ciężkiego J695, który obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 29. Jeszcze korzystniej, wyizolowany kwas nukleinowy koduje region zmienny łańcucha ciężkiego przeciwciała, obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 31 (pełny region VH J695).
W innych rozwiązaniach, wynalazek dostarcza wyizolowany kwas nukleinowy kodujący ludzkie przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, według wynalazku, które to przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, zawiera CDR3 łańcucha lekkiego J695, obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 26. Korzystnie, kodowane przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, zawiera ponadto CDR2 łańcucha lekkiego J695, który obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 28. Korzystniej, kodowane przeciwciało, lub jego część wiążąca anty46
PL 218 748 B1 gen, zawiera ponadto CDR1 łańcucha lekkiego J695, który obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 30. Jeszcze korzystniej, wyizolowany kwas nukleinowy koduje region zmienny łańcucha lekkiego przeciwciała, obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 32 (pełny region VL J695).
Wynalazek dostarcza również zrekombinowany wektor ekspresyjny, kodujący:
a) ciężki łańcuch przeciwciała, zawierający region zmienny obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 31, oraz
b) lekki łańcuch przeciwciała, zawierający region zmienny obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 32.
Wynalazek dostarcza również komórki gospodarzy, do których wprowadzono jeden lub większą liczbę zrekombinowanych wektorów ekspresyjnych według wynalazku. Korzystnie, komórką gospodarzem jest ssacza komórka gospodarz, korzystniej, komórką gospodarzem jest komórka CHO, komórka NS0 lub komórka COS. Ponadto, wynalazek dostarcza sposób syntetyzowania zrekombinowanego przeciwciała ludzkiego według wynalazku przez hodowanie komórki gospodarza według wynalazku w odpowiednim podłożu hodowlanym, dopóki nie zostanie zsyntetyzowane zrekombinowane przeciwciało ludzkie wynalazku. Sposób może obejmować ponadto izolowanie zrekombinowanego przeciwciała ludzkiego z podłoża hodowlanego.
VI. Kompozycje farmaceutyczne i ich podawanie
Przeciwciała i części przeciwciał według wynalazku można włączać do kompozycji farmaceutycznych, odpowiednich do podawania osobnikom. Zazwyczaj, kompozycja farmaceutyczna zawiera przeciwciało, lub część przeciwciała, według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, termin „farmaceutycznie dopuszczalny nośnik” obejmuje jakikolwiek lub wszystkie rozpuszczalniki, podłoża dyspergujące, środki powlekające, środki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, środki zapewniające izotoniczność i opóźniające wchłanianie oraz podobne, które są zgodne fizjologicznie. Przykłady farmaceutycznie dopuszczalnych nośników obejmują jeden lub większą liczbę spośród wody, soli fizjologicznej, soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, dekstrozy, gliceryny, etanolu i podobnych, bądź ich kombinacji. W wielu przypadkach, korzystne będzie włączenie do kompozycji środków zapewniających izotoniczność, na przykład cukrów, polialkoholi, takich jak mannitol, sorbitol, bądź chlorku sodu. Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki mogą ponadto zawierać mniejsze ilości substancji pomocniczych, takich jak środki zwilżające lub emulgujące, środki konserwujące lub bufory, które zwiększają okres trwałości lub skuteczność przeciwciała lub części przeciwciała.
Przeciwciała, lub części przeciwciał, według wynalazku można włączać do kompozycji farmaceutycznej odpowiedniej do podawania pozajelitowego. Korzystnie, przeciwciało, lub części przeciwciała, przygotowywać się będzie w postaci roztworu iniekcyjnego, zawierającego 0,1-250 mg/ml przeciwciała. Roztwór iniekcyjny może mieć postać cieczy albo zliofilizowanej postaci dawkowania w fiolce ze szkła ołowiowego lub bursztynowego, ampułce lub wcześniej napełnionej strzykawce. Buforem może być L-histydyna (1-50 mM), najlepiej 5-10 mM, o pH od 5,0 do 7,0 (najlepiej pH 6,0). Inne odpowiednie bufory obejmują, ale nie ograniczają się do bursztynianu sodu, cytrynianu sodu, fosforanu sodu lub fosforanu potasu. Do modyfikowania toksyczności roztworu można stosować chlorek sodu o stężeniu 0-300 mM (w przypadku ciekłych postaci dawkowania najlepiej 150 mM). Do zliofilizowanych postaci dawkowania można włączać środki chroniące przy zamrażaniu, głównie 0-10% sacharozę (najlepiej 0,5-1,0%). Inne odpowiednie środki chroniące przy zamrażaniu obejmują trehalozę i laktozę. Do zliofilizowanych postaci dawkowania można włączać środki wypełniające, głównie 1-10% mannitol (najlepiej 2-4%). Zarówno w ciekłej, jak i zliofilizowanej postaci dawkowania można stosować środki stabilizujące, głównie 1-50 mM L-metioninę (najlepiej 5-10 mM). Inne odpowiednie środki wypełniające obejmują glicynę i argininę i można je włączyć, tak jak 0-0,05% Polysorbate-80 (najlepiej 0,005-0,01%). Dodatkowe środki powierzchniowo czynne obejmują, ale nie ograniczają się do środków powierzchniowo czynnych Polysorbate-20 i BRIJ.
W korzystnym rozwiązaniu, kompozycja farmaceutyczna obejmuje przeciwciało w dawce wynoszącej około 0,01 mg/kg - 10 mg/kg. Korzystniejsze dawki przeciwciała obejmują 1 mg/kg, podawany co drugi tydzień, lub 0,3 mg/kg, podawane co tydzień.
Kompozycja według wynalazku może występować w różnorodnych postaciach. Obejmują one, na przykład, ciekłe, półstałe i stałe postacie dawkowania, takie jak ciekłe roztwory (np. roztwory iniekcyjne lub infuzyjne), układy dyspersyjne lub zawiesiny, tabletki, pigułki, proszki, liposomy i czopki. Korzystna postać zależy od zamierzonego sposobu podawania i stosowania terapeutycznego. Typowe
PL 218 748 B1 korzystne kompozycje mają postać roztworów iniekcyjnych lub infuzyjnych, tak jak kompozycje podobne do tych stosowanych do biernej immunizacji ludzi innymi przeciwciałami. Korzystnym sposobem podawania jest podawanie pozajelitowe (np. dożylne, podskórne, dootrzewnowe, domięśniowe). W korzystnym rozwiązaniu, przeciwciało podaje się przez dożylną iniekcję lub infuzję. W innym korzystnym rozwiązaniu, przeciwciało podaje się przez iniekcję domięśniową lub podskórną.
Kompozycje terapeutyczne zazwyczaj muszą być jałowe i trwałe w warunkach wytwarzania i przechowywania. Kompozycji można nadawać postać roztworu, mikroemulsji, układu dyspersyjnego, liposomów lub innej uporządkowanej struktury odpowiedniej dla wysokiego stężenia leku. Jałowe roztwory iniekcyjne można przygotowywać przez wprowadzanie związku czynnego (tj. przeciwciała lub części przeciwciała) w wymaganej ilości w odpowiednim rozpuszczalniku, z jednym lub kombinacją składników wymienionych powyżej, jak jest to wymagane, a następnie wyjałowienie przez sączenie. Generalnie, układy dyspersyjne przygotowuje się przez wprowadzanie związku czynnego do jałowego podłoża, które obejmuje podstawowe podłoże dyspergujące i wymagane inne składniki spośród tych wymienionych powyżej. W przypadku jałowych, zliofilizowanych proszków do przygotowywania jałowych roztworów iniekcyjnych, korzystnymi metodami przygotowywania są suszenie pod zmniejszonym ciśnieniem i suszenie rozpyłowe, w wyniku których otrzymuje się proszek składnika aktywnego oraz jakiegokolwiek dodatkowego pożądanego składnika z uprzednio wyjałowionego przez sączenie ich roztworu. Właściwą płynność roztworu można utrzymywać, na przykład, przez stosowanie środka powlekającego, takiego jak lecytyna, przez utrzymywanie wymaganej wielkości cząstek w przypadku układu dyspersyjnego oraz poprzez stosowanie środków powierzchniowo czynnych. Przedłużone wchłanianie iniekcyjnej kompozycji można spowodować przez włączenie do kompozycji środka, który opóźnia wchłanianie, na przykład soli monostearynianowych i żelatyny.
Przeciwciała i części przeciwciał według wynalazku można podawać różnymi metodami znanymi w tej dziedzinie, chociaż w wielu zastosowaniach terapeutycznych korzystną drogą/sposobem podawania jest iniekcja podskórna, iniekcja dożylna lub infuzja. Jak będzie wiedział specjalista w tej dziedzinie, droga i/lub sposób podawania będą się różnić w zależności od pożądanych wyników. W niektórych rozwiązaniach związek aktywny można przygotowywać z nośnikiem, który będzie chronił związek przed szybkim uwalnianiem, tak jak w postaci o kontrolowanym uwalnianiu, włącznie z wszczepami, plastrami do podawania przezskórnego i układami do podawania w mikrokapsułkach. Można stosować zdolne do biodegradacji, zgodne biologicznie polimery, takie jak kopolimer etylenu z octanem winylu, polibezwodniki, kwas poliglikolowy, kolagen, poliortoestry i kwas polimlekowy. Wiele sposobów przygotowywania takich postaci zostało opatentowanych lub jest generalnie znanych specjalistom w tej dziedzinie. Patrz, np. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, red., Marcel Dekker, Inc., Nowy Jork, 1978.
W niektórych rozwiązaniach, przeciwciało lub część przeciwciała można podawać doustnie, np. w obojętnym rozcieńczalniku lub przyswajalnym, jadalnym nośniku. Związek (i inny składnik, jeśli jest to pożądane) można również zamykać w kapsułkach żelatynowych o twardych lub miękkich powłokach, prasować w tabletki lub wprowadzać bezpośrednio do diety osobnika. Do doustnego podawania terapeutycznego, związki można wprowadzać wraz z zaróbkami i stosować w postaci tabletek do połykania, tabletek podpoliczkowych, kołaczyków, kapsułek, eliksirów, zawiesin, syropów, opłatków i podobnych. Do podawania związku według wynalazku przez podawanie inne, niż pozajelitowe, konieczne może być powlekanie związku, lub wspólne podawanie związku z materiałem mającym na celu zapobieganie jego inaktywacji.
Do kompozycji można również wprowadzać dodatkowe związki aktywne. W niektórych rozwiązaniach, przeciwciału, lub części przeciwciała, według wynalazku nadaje się wspólną postać lub podaje je wspólnie z jednym lub więcej dodatkowymi środkami terapeutycznymi, które są użyteczne w leczeniu zaburzeń, w których szkodliwa jest IL-12. Na przykład, przeciwciału przeciw hIL-12, lub jego części, według wynalazku można nadawać wspólną postać lub podawać je wspólnie z jednym lub większą liczbą dodatkowych przeciwciał, które wiążą się z innymi celami (np. przeciwciałami, które wiążą inne cytokiny lub które wiążą cząsteczki powierzchni komórkowych). Ponadto, jedno lub więcej przeciwciał według wynalazku można stosować w kombinacji z jednym lub więcej spośród powyższych środków terapeutycznych. W takich terapiach kombinowanych można korzystnie wykorzystywać niższe dawki podawanych środków terapeutycznych, unikając w ten sposób możliwych toksyczności lub powikłań związanych z różnymi monoterapiami. Specjalista w tej dziedzinie będzie wiedział, że jeśli przeciwciała według wynalazku stosuje się jako część terapii kombinowanej, mogą być pożądane niższe dawki przeciwciała, niż w przypadku podawania osobnikowi samego przeciwciała (np. dzięki
PL 218 748 B1 zastosowaniu terapii kombinowanej można uzyskać synergistyczny wpływ terapeutyczny, który, z kolei, pozwala na stosowanie niższej dawki przeciwciała dla uzyskania pożądanego efektu terapeutycznego).
Interleukina 12 odgrywa krytyczną rolę w patologii związanej z szeregiem chorób obejmujących elementy immunologiczne i zapalne. Choroby te obejmują, ale nie ograniczają się do reumatoidalnego zapalenia stawów, zapalenia kości i stawów, młodzieńczego przewlekłego zapalenia stawów, zapalenia stawów związanego z chorobą z Lyme, artropatii łuszczycowej, odczynowego zapalenia stawów, spondyloartropatii, uogólnionego liszaja rumieniowatego, choroby Crohna, wrzodziejącego zapalenia okrężnicy, zapalnej choroby jelit, cukrzycy insulinozależnej, zapalenia tarczycy, astmy, chorób alergicznych, łuszczycy, zapalenia i stwardnienia skóry, atopowego zapalenia skóry, reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi, odrzucania przeszczepionych narządów, ostrych lub przewlekłych chorób immunologicznych związanych z przeszczepianiem narządów, sarkoidozy, miażdżycy tętnic, rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego, choroby Kawasakiego, choroby Grave'a, zespołu nerczycowego, zespołu przewlekłego zmęczenia, ziarniniaka Wegenera, plamicy Henocha-Schoenleina, mikroskopowego zapalenia naczyń nerki, przewlekłego aktywnego zapalenia wątroby, zapalenia błony naczyniowej oka, wstrząsu septycznego, zespołu wstrząsu toksycznego, zespołu posocznicy, wyniszczenia, chorób zakaźnych, chorób pasożytniczych, zespołu nabytego niedoboru odporności, ostrego poprzecznego zapalenia rdzenia, pląsawicy Huntingtona, choroby Parkinsona, choroby Alzheimera, udaru, pierwotnej żółciowej marskości wątroby, niedokrwistości hemolitycznej, chorób nowotworowych, niewydolności serca, zawału mięśnia sercowego, choroby Addisona, sporadycznej niedoczynności wielogruczołowej typu I i niedoczynności wielogruczołowej typu II, zespołu Schmidta, zespołu zaburzeń oddechowych dorosłych (ostrego), łysienia, wyłysienia plackowatego, artropatii surowiczo-ujemnej, artropatii, choroby Reitera, artropatii łuszczycowej, artropatii na tle wrzodziejącego zapalenia okrężnicy, enteropatycznego zapalenia błony maziowej, artropatii związanej z zakażeniami Chlamydia, Yersinia i Salmonella, spondyloartropatii, choroby miażdżycowej/stwardnienia tętnic, alergii atopowych, autoimmunologicznej choroby pęcherzowej, pęcherzycy zwykłej, pęcherzycy liściastej, pemfigoidu, linijnej choroby IgA, autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej, niedokrwistości hemolitycznej z dodatnim odczynem Coombsa, nabytej niedokrwistości złośliwej, zapalenia mózgu z bólami mięśniowymi/choroby Royal Free, przewlekłej śluzówkowo-skórnej kandydozy, olbrzymiokomórkowego zapalenia tętnicy skroniowej, pierwotnego stwardniającego zapalenia wątroby, skrytopochodnego autoimmunologicznego zapalenia wątroby, zespołu choroby nabytego niedoboru odporności, chorób związanych z nabytym niedoborem odporności, zapalenia wątroby typu C, pospolitego zmiennego niedoboru odporności (pospolitej zmiennej hipogammaglobulinemii), kardiomiopatii rozstrzeniowej, bezpłodności u kobiet, niewydolności jajników, przedwczesnej niewydolności jajników, choroby zwłóknieniowej płuc, skryto-pochodnego zwłókniającego zapalenia pęcherzyków płucnych, pozapalnej choroby śródmiąższowej płuc, śródmiąższowego zapalenia płuc, choroby śródmiąższowej płuc związanej z chorobą tkanki łącznej, choroby płuc związanej z mieszaną chorobą tkanki łącznej, choroby śródmiąższowej płuc związanej ze stwardnieniem układowym, choroby śródmiąższowej płuc związanej z reumatoidalnym zapaleniem stawów, choroby płuc związanej z uogólnionym liszajem rumieniowatym, choroby płuc związanej z zapaleniem skórnomięśniowym/zapaleniem wielomięśniowym, choroby płuc związanej z chorobą Sjogrena, choroby płuc związanej z zesztywniającym zapaleniem stawów kręgosłupa, choroby płuc z rozsianym zapaleniem naczyń, choroby płuc związanej z hemosyderozą, polekowej choroby śródmiąższowej płuc, zwłóknienia popromiennego, zarostowego zapalenia oskrzelików, przewlekłego eozynofilowego zapalenia płuc, choroby płuc z naciekami limfocytów, pozakaźnej choroby śródmiąższowej płuc, dnawego zapalenia stawów, autoimmunologicznego zapalenia wątroby, autoimmunologicznego zapalenia wątroby typu-1 (klasycznego autoimmunologicznego zapalenia wątroby lub zapalenia wątroby w toczniu rumieniowatym), autoimmunologicznego zapalenia wątroby typu 2 (zapalenia wątroby powodowanego przez przeciwciała przeciw LKM), hipoglikemii na tle autoimmunologicznym, oporności na insulinę typu B z rogowaceniem ciemnym, niedoczynności przytarczyc, ostrej choroby immunologicznej związanej z przeszczepianiem narządów, przewlekłej choroby immunologicznej związanej z przeszczepianiem narządów, gośćca zwyradniającego, pierwotnego stwardniającego zapalenia dróg żółciowych, leukopenii idiopatycznej, neutropenii autoimmunologicznej, choroby nerek NOS, zapalenia kłębuszków nerkowych, mikroskopowego zapalenia naczyń nerki, choroby z Lyme, ogniskowego liszaja rumieniowatego, idiopatycznej lub inaczej nie określonej bezpłodności mężczyzn, autoagresji wobec plemników, stwardnienia rozsianego (wszystkich podtypów), cukrzycy insulinozależnej, współczulnego zapalenia naczyniówki, nadciśnienia
PL 218 748 B1 płucnego wtórnego wobec choroby tkanki łącznej, zespołu Goodpasture'a, płucnych objawów zapalenia guzkowatego tętnic, ostrej gorączki reumatycznej, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, choroby Stilla, twardziny uogólnionej, choroby/zapalenia tętnic Takaysu, trombocytopenii autoimmunologicznej, trombocytopenii idiopatycznej, autoimmunologicznej choroby tarczycy, nadczynności tarczycy, autoimmunologicznej niedoczynności tarczycy z powstawaniem wola (choroby Hashimoto), zanikowej autoimmunologicznej niedoczynności tarczycy, pierwotnego obrzęku śl uzowatego, soczewkowego zapalenia błony naczyniowej oka, pierwotnego zapalenia naczyń i bielactwa nabytego. Przeciwciała ludzkie, lub części przeciwciał, według wynalazku można stosować do leczenia chorób autoimmunologicznych, w szczególności tych związanych ze stanami zapalnymi, włącznie z zesztywniającym zapaleniem stawów kręgosłupa, alergią, cukrzycą na tle autoimmunologicznym i zapaleniem błony naczyniowej oka na tle autoimmunologicznym.
Korzystnie, przeciwciała według wynalazku, lub ich części wiążące antygen, stosuje się do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów, choroby Crohna, stwardnienia rozsianego, cukrzycy insulinozależnej i łuszczycy, jak opisano bardziej szczegółowo w części VII.
Ludzkie przeciwciało, lub część przeciwciała, według wynalazku, można również podawać z jednym lub więcej dodatkowymi środkami terapeutycznymi, użytecznymi w leczeniu chorób autoimmunologicznych lub zapalnych.
Przeciwciała według wynalazku, lub ich części wiążące antygen, można stosować w leczeniu takich chorób same, bądź w kombinacji. Powinno być zrozumiałe, że przeciwciała według wynalazku, lub ich część wiążącą antygen, można stosować same lub w kombinacji z dodatkowym środkiem, np. środkiem terapeutycznym, przy czym ten dodatkowy środek wybiera specjalista w tej dziedzinie zgodnie z zamierzonym celem. Na przykład, dodatkowy środek może być środkiem terapeutycznym znanym w tej dziedzinie jako użyteczny w leczeniu choroby lub stanu, który leczy się przeciwciałem według wynalazku. Dodatkowy środek może również być środkiem, który wywiera korzystny wpływ na kompozycję terapeutyczną, np. środek, który wpływa na lepkość kompozycji.
Powinno być ponadto zrozumiałe, że kombinacje, które powinien obejmować ten wynalazek, są kombinacjami użytecznymi w ich zamierzonym celu. Środki wymienione poniżej służą celom ilustracyjnym i w zamierzeniu nie ograniczają zakresu wynalazku. Kombinacje, które stanowią część tego wynalazku, mogą również obejmować więcej niż jeden dodatkowy środek, np. dwa lub trzy dodatkowe środki, jeśli kombinacja jest taka, że utworzona kompozycja może spełniać swoją zamierzoną funkcję.
Korzystnymi składnikami kombinacji są niesteroidowy(e) lek(i) przeciwzapalny(e), określane również jako NLPZ, które obejmują leki w rodzaju ibuprofenu. Innymi korzystnymi składnikami kombinacji są kortykosteroidy, włącznie z prednizolonam; dobrze znane skutki uboczne stosowania steroidów można zmniejszyć, bądź nawet wyeliminować, przez stopniowe zmniejszanie dawki steroidu, wymaganej podczas leczenia pacjentów kombinacją przeciw IL-12 przeciwciałami według wynalazku. Nieograniczające przykłady środków terapeutycznych do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów, z którymi można łączyć przeciwciało, lub część przeciwciała, według wynalazku, obejmują następujące środki: obniżający(e) aktywność cytokin lek(i) przeciwzapalny(e) (CSAID); przeciwciała przeciw lub antagonistów innych ludzkich cytokin lub czynników wzrostu, na przykład TNF, LI, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL- 16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF i PDGF. Przeciwciała według wynalazku, lub ich części wiążące antygen, można łączyć z przeciwciałami przeciw cząsteczkom powierzchni komórkowych, takim jak CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, bądź ich ligandom, włącznie z CD145 (gp39 lub CD40L).
Korzystne kombinacje środków terapeutycznych mogą zakłócać różne punkty kaskady autoimmunologicznej i późniejszej zapalnej; korzystne przykłady obejmują antagonistów TNF, w rodzaju przeciw TNF przeciwciał chimerycznych, humanizowanych II ludzkich, D2E7 (zgłoszenie patentowe US numer kolejny 08/599 226, złożone 9 lutego 1996 r.), cA2 (RemicadeTM), CDP 571, fragmenty przeciwciał przeciw TNF (np. CDP870) oraz rozpuszczalne receptory TNF, p55 lub p75, ich pochodne (p75TNFRIgG (EnbrelTM p55TNFRIgG (Lenercept), rozpuszczalny receptor IL-13 (sIL-13), a także inhibitory enzymu konwertującego TNF a; podobnie, z tej samej przyczyny, mogą być skuteczne inhibitory IL-1 (np. inhibitory enzymu konwertującego interleukinę 1, takie jak Vx740, orlL-1Ra itp.). Inne korzystne kombinacje obejmują interleukinę 11, anty-P7s oraz ligand glikoproteiny p-selektyny (PSGL). Jeszcze innymi korzystnymi kombinacjami są inne składniki
PL 218 748 B1 odgrywające kluczową rolę w odpowiedzi autoimmunologicznej, które mogą działać równolegle do, zależnie od lub współdziałając z funkcjami IL-12; szczególnie korzystni są antagoniści IL-18, włącznie z przeciwciałami przeciw IL-18 oraz rozpuszczalne receptory IL-18, bądź białka wiążące IL-18. Wykazano, że IL-12 i IL-18 pełnią częściowo pokrywające się, lecz odrębne funkcje i kombinacje antagonistów ich obu mogą być najbardziej skuteczne. Jeszcze innymi korzystnymi kombinacjami są nieusuwające inhibitory anty-CD4. Jeszcze inne korzystne kombinacje obejmują antagonistów współstymulujących szlak CD80 (B7.1) lub CD86 (B7.2), włącznie z przeciwciałami, rozpuszczalnymi receptorami lub antagonistycznymi ligandami.
Przeciwciała według wynalazku, lub ich części wiążące antygen, można również łączyć z takimi środkami, jak metotreksat, 6-MP, azatiopryna, salfasalazyna, mesalazyna, olsalazyna, chlorochinina/hydroksychlorochina, penicylaminy, aurotiojabłczan (domięśniowo lub doustnie), azatiopryna, kochicyna, kortykosteroidy (doustnie, inhalacyjnie lub miejscowe iniekcje), agoniści receptorów adrenergicznych beta-2 (salbutamol, terbutalina, salmeterol), ksantyny (teofilina, aminofilina), kromoglikan, nedokromil, ketotifen, ipratropium i oksytropium, cyklosporyna, FK506, rapamycyna, mykofenolan mofetylu, leflunomid, NLPZ, na przykład ibuprofen, kortykosteroidy, takie jak prednizolon, inhibitory fosfodiesterazy, agoniści adenozyny, środki przeciwzakrzepowe, inhibitory dopełniacza, środki adrenergiczne, środki, które zakłócają przekazywanie sygnałów przez cytokiny prozapalne, takie jak TNFa lub IL-1 (np. inhibitory kinazy IRAK, NIK, IKK, p38 lub MAP), inhibitory enzymu konwertującego IL-1p (np. Vx740), anty-P7s, ligand glikoproteiny p-selektyny (PSGL), inhibitory enzymu konwertującego TNFa (TACE), inhibitory przekazywania sygnałów w komórkach T, takie jak inhibitory kinaz, inhibitory metaloproteinaz, salfasalazyna, azatiopryna, 6-merkaptopuryny, inhibitory enzymu konwertującego angiotensynę, rozpuszczalne receptory cytokin oraz ich pochodne (np. rozpuszczalne receptory TNF, p55 lub p75, i ich pochodne p75TNFRIgG (EnbrelTM) i p55TNFRIgG (Lenercept), sIL-1RI, sIL-1RII, SIL-6R, rozpuszczalny receptor IL-13 (sIL-13)) oraz cytokiny przeciwzapalne (np. IL-14, IL-10, IL-11, IL-13 i TGF3). Korzystne składniki kombinacji obejmują metotreksat lub Ieflunomid oraz, w umiarkowanych i ciężkich przypadkach reumatoidalnego zapalenia stawów, cyklosporynę.
Nieograniczające przykłady środków terapeutycznych do leczenia zapalnej choroby jelit, z którymi można łączyć przeciwciało, lub część przeciwciała, według wynalazku, obejmują następujące środki: budezonid; naskórkowy czynnik wzrostu; kortykosteroidy; cyklosporynę, salfasalazynę; aminosalicylany; 6-merkaptopurynę; azatiopryna; metronidazol; inhibitory lipoksygenazy; mesalaminę; olsalazynę; balsalazyd; środki przeciwutleniające; inhibitory tromboksanu; antagonistów receptora IL-1; monoklonalne przeciwciała przeciw IL-1 β; monoklonalne przeciwciała przeciw IL-6; czynniki wzrostu; inhibitory elastazy; związki pirydynyloimidazolowe; przeciwciała przeciw lub antagonistów innych ludzkich cytokin lub czynników wzrostu, na przykład TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL- 8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-11, GM-CSF, FGF i PDGF. Przeciwciała według wynalazku, lub ich części wiążące antygen, można łączyć z przeciwciałami przeciw cząsteczkom powierzchni komórkowych, takim jak CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90, bądź ich ligandom. Przeciwciała według wynalazku, lub ich części wiążące antygen, można również łączyć z takimi środkami, jak metotreksat, cyklosporyna, FK506, rapamycyna, mykofenolan mofetylu, leflunomid, NLPZ, na przykład ibuprofen, kortykosteroidy, takie jak prednizolon, inhibitory fosfodiesterazy, agoniści adenozyny, środki przeciwzakrzepowe, inhibitory dopełniacza, środki adrenergiczne, środki, które zakłócają przekazywanie sygnałów przez cytokiny prozapalne, takie jak TNFa lub IL-1 (np. inhibitory kinazy IRAK, NIK, IKK, p38 lub MAP), inhibitory enzymu konwertującego IL-^ (np. Vx740), anty-P7s, ligand glikoproteiny p-selektyny (PSGL), inhibitory enzymu konwertującego TNFa (TACE), inhibitory przekazywania sygnałów w komórkach T, takie jak inhibitory kinaz, inhibitory metaloproteinaz, salfasalazyna, azatiopryna, 6-merkaptopuryny, inhibitory enzymu konwertującego angiotensynę, rozpuszczalne receptory cytokin oraz ich pochodne (np. rozpuszczalne receptory TNF, p55 lub p75, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, rozpuszczalny receptor IL-13 (sIL-13)) oraz cytokiny przeciwzapalne (np. IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 i TGFβ).
Korzystne przykłady środków terapeutycznych do leczenia choroby Crohna, z którymi można łączyć przeciwciało, ich część wiążącą antygen, obejmują antagonistów TNF, na przykład przeciwciała przeciw TNF, D2E7 (zgłoszenie patentowe US numer kolejny 08/599 226, złożone 9 lutego 1996 r.), cA2 (RemicadeTM, CDP 571, fragmenty przeciwciał przeciw TNF (np. CDP870), konstrukty TNFR-Ig (p75TNFRIgG (EnbrelTM lub p55TNFRIgG (Lenercept), anty-P7s, ligand glikoproteiny p-selektyny (PSGL), rozpuszczalny receptor IL-13 (sIL-13) oraz inhibitory PDE4. Przeciwciała według wynalazku,
PL 218 748 B1 lub ich części wiążące antygen, można również łączyć z kortykosteroidami, przykładowo budezonidem i deksametazonem. Przeciwciała według wynalazku, lub ich części wiążące antygen, można również łączyć z takimi środkami, jak sulfasalazyna, kwas 5-aminosalicylowy i olsalazyna, oraz środkami, które zakłócają syntezę lub działanie cytokin prozapalnych, takich jak IL-1, na przykład inhibitorami enzymu konwertującego IL-1 β (np. Vx740) i IL-1ra. Przeciwciała według wynalazku, lub ich część wiążącą antygen, można również stosować z inhibitorami przekazywania sygnałów w komórkach T, na przykład inhibitorami kinaz tyrozynowych, 6-merkaptopurynami. Przeciwciała według wynalazku, lub ich części wiążące antygen, można łączyć z IL-11.
Nieograniczające przykłady środków terapeutycznych do leczenia stwardnienia rozsianego, z którymi można łączyć przeciwciało, lub część przeciwciała, według wynalazku, obejmują następujące środki: kortykosteroidy; prednizolon; metyloprednizolon; azatioprynę; cyklofosfamid; cyklosporynę; metotreksat; 4-aminopirydynę; tizanidynę; interferon-31a (Avonex; Biogen); interferonp1b (Betaseron; Chiron/Berlex); Kopolimer 1 (Cop-1; Copaxone; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); tlen pod podwyższonym ciśnieniem; immunoglobulina dożylna; klabrybina; przeciwciała przeciw lub antagonistów innych ludzkich cytokin lub czynników wzrostu, na przykład TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF i PDGF. Przeciwciała według wynalazku, lub ich części wiążące antygen, można łączyć z przeciwciałami przeciw cząsteczkom powierzchni komórkowych, takim jak CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90, bądź ich ligandom. Przeciwciała według wynalazku, lub ich części wiążące antygen, można również łączyć z takimi środkami, jak nitotreksat, cyklosporyna, FK506, rapamycyna, mykofenolan mofetylu, leflunomid, NLPZ, na przykład ibuprofen, kortykosteroidy, takie jak prednizolon, inhibitory fosfodiesterazy, agoniści adenozyny, środki przeciwzakrzepowe, inhibitory dopełniacza, środki adrenergiczne, środki, które zakłócają przekazywanie sygnałów przez cytokiny prozapalne, takie jak TNF a lub IL-1 (np. inhibitory kinazy IRAK, NIK, IKK, p38 lub MAP), inhibitory enzymu konwertującego IL-1 β (np. Vx740), anty-P7s oraz ligand glikoproteiny p-selektyny (PSGL), inhibitory TACE, inhibitory przekazywania sygnałów w komórkach T, takie jak inhibitory kinaz, inhibitory metaloproteinaz, salfasalazyna, azatiopryna, 6-merkaptopuryny, inhibitory enzymu konwertującego angiotensynę, rozpuszczalne receptory cytokin oraz ich pochodne (np. rozpuszczalne receptory TNF, p55 lub p75, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, rozpuszczalny receptor IL-13 (sIL-13)) oraz cytokiny przeciwzapalne (np. IL-4, IL-10, IL-13 i TGF3).
Korzystne przykłady środków terapeutycznych do leczenia stwardnienia rozsianego, z którymi można łączyć przeciwciało lub, lub jego część wiążącą antygen, obejmują interferon β, na przykład IFN31a lub IFN31a; kopakson, kortykosteroidy, inhibitory IL-1, inhibitory TNF lub przeciwciała przeciw Iigandowi CD40 bądź CD80.
Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą obejmować „ilość skuteczną terapeutycznie”, „ilość skuteczną profilaktycznie” przeciwciała, lub części przeciwciała, według wynalazku. „Ilość skuteczna terapeutycznie” odnosi się do ilości skutecznej, w dawce i okresach koniecznych do uzyskania pożądanego efektu terapeutycznego. Terapeutycznie skuteczna ilość przeciwciała lub części przeciwciała może być różna, zależnie od takich czynników, jak stan chorobowy, wiek, płeć i waga osobnika oraz zdolność przeciwciała, ^b części przeciwciała, do wywoływania pożądanej odpowiedzi u osobnika. Terapeutycznie skuteczną ilością jest także taka, przy której korzystne efekty terapeutyczne przeważają nad jakimikolwiek toksycznymi lub szkodliwymi wpływami przeciwciała, lub części przeciwciała. „Ilość skuteczna profilaktycznie odnosi się do ilości skutecznej, w dawce i okresach koniecznych do uzyskania pożądanego efektu profilaktycznego . Zazwyczaj, ponieważ dawkę profilaktyczną stosuje się u osobnika przed lub na wczesnych etapach choroby, ilość skuteczna profilaktycznie będzie mniejsza, niż ilość skuteczna terapeutycznie.
Schematy dawkowania można dostosowywać dla zapewnienia optymalnej pożądanej odpowiedzi (np. odpowiedzi terapeutycznej lub profilaktycznej). Na przykład, można podawać pojedynczą dużą dawkę, można podawać kilka dawek podzielonych rozłożonych w czasie, lub dawkę można proporcjonalnie zmniejszać lub zwiększać, zgodnie z wymaganiami sytuacji terapeutycznej. Szczególnie korzystne jest nadawanie kompozycjom postaci do jednostkowego dawkowania, dla łatwego podawania i jednolitości dawkowania. Postać do jednostkowego dawkowania, w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, odnosi się do fizycznie odrębnych jednostek odpowiednich do jednostkowego dawkowania dla leczonych osobników, będących ssakami; przy czym każda jednostka zawiera wcześniej określoną ilość związku aktywnego, obliczoną tak, aby powodowała pożądany efekt terapeutyczny z odpowiednim nośnikiem farmaceutycznym. Określenie postaci do
PL 218 748 B1 jednostkowego dawkowania zgodnie z wynalazkiem podyktowane jest i bezpośrednio zależy od (a) unikalnych cech charakterystycznych związku czynnego i określonego efektu, terapeutycznego lub profilaktycznego, jaki ma być osiągnięty, oraz (b) ograniczeń występujących w dziedzinie stosowania związków, takich jak związek czynny do leczenia podatności u osobników.
Przykładowy, nie ograniczający zakres skutecznych, terapeutycznie lub profilaktycznie, ilości przeciwciała lub części przeciwciała według wynalazku wynosi 0,01 - 20 mg/kg, korzystniej 1 - 10 mg/kg, jeszcze korzystniej 0,3 - 1 mg/kg. Należy zauważyć, że wartości dawek mogą różnić się w zależności od rodzaju i stopnia ciężkości stanu, który ma być leczony. Ponadto, powinno być zrozumiałe, że dla każdego konkretnego osobnika, powinien być dobrany konkretny schemat dawkowania na czas zgodny z indywidualnymi potrzebami i fachową opinią osoby podającej lub nadzorującej podawanie kompozycji, oraz, że ten zakres dawek przedstawiony w niniejszym opisie jest przykładowy i nie w zamierzeniu ograniczać zakresu lub praktycznego stosowania zastrzeganej kompozycji.
VII. Stosowanie przeciwciał według wynalazku
Biorąc pod uwagę ich zdolność do wiązania się z hIL-12, przeciwciała przeciw IL-12, lub ich części, według wynalazku można stosować do wykrywania hIL-12 (np. w próbce biologicznej, takiej jak surowica lub osocze), z zastosowaniem konwencjonalnych oznaczeń immunologicznych, takich jak immunosorbcyjne oznaczenia enzymatyczne (ELISA), oznaczenie radioimmunologiczne (RIA) lub oznaczenie immunohistochemiczne tkanek. Wynalazek dostarcza sposób wykrywania hIL-12 w próbce biologicznej, obejmujący kontaktowanie próbki biologicznej z przeciwciałem, lub częścią przeciwciała, według wynalazku i wykrywanie albo przeciwciała (lub części przeciwciała) związanego z hIL-12, albo niezwiązanego przeciwciała (lub części przeciwciała), aby w ten sposób wykrywać hIL-12 w próbce biologicznej. Dla ułatwienia wykrywania związanego lub niezwiązanego przeciwciała, przeciwciało znakuje się, bezpośrednio lub pośrednio, wykrywalną substancją. Odpowiednie wykrywalne substancje obejmują różne enzymy, grupy prostetyczne, substancje fluorescencyjne, substancje luminescencyjne i substancje promieniotwórcze. Przykłady odpowiednich enzymów obejmują peroksydazę chrzanową, fosfatazę alkaliczną, β-galaktozydazę lub acetylocholinoesterazę; przykłady odpowiednich kompleksów grup prostetycznych obejmują streptawidynę/biotynę i awidynę/biotynę; przykłady odpowiednich substancji fluorescencyjnych obejmują umbeliferon, fluoresceinę, izotiocyjanian fluoresceiny, rodaminę, dichlorotriazynyloaminofluoresceinę, chlorek dansylu lub fikoerytrynę; przykłady substancji
125 131 35 luminescencyjnych obejmują luminol; przykłady substancji promieniotwórczych obejmują 125I, 131I, 35S lub 3H.
Alternatywnie do znakowania przeciwciała, hIL-12 można oznaczać w płynach biologicznych we współzawodniczych oznaczeniach immunologicznych, stosując wzorce rhIL-12 wyznakowane wykrywalnymi substancjami i niewyznakowane przeciwciało przeciw hIL-12. W tym oznaczeniu, łączy się próbkę biologiczną, wyznakowane wzorce rhIL-12 oraz przeciwciało przeciw hlL-12 i określa się ilość wyznakowanego standardu rhIL-12 związanego z niewyznakowanym przeciwciałem. Ilość hIL-12 w próbce biologiczne jest odwrotnie proporcjonalna do ilości wyznakowanego wzorca rhIL-12 związanego z przeciwciałem przeciw hlL-12.
Przeciwciała Y61 i J695 według wynalazku można również stosować do wykrywania IL-12 pochodzącej z gatunków innych niż człowiek, w szczególności IL-12 pochodzącej z naczelnych. Na przykład, Y61 można stosować do wykrywania IL-12 u makaka jawajskiego i makaka rezusa. J695 można stosować do wykrywania IL-12 u makaka jawajskiego, makaka rezusa i pawiana. Jednakże, żadne przeciwciało nie reaguje krzyżowo z mysią lub szczurzą IL-12 (patrz Przykład 3, część F).
Przeciwciała i części przeciwciał według wynalazku są zdolne do neutralizacji aktywności hIL-12 in vitro (patrz Przykład 3) i in vivo (patrz Przykład 4). A zatem, przeciwciała i części przeciwciał według wynalazku można stosować do hamowania aktywności IL-12, np. w hodowli komórkowej zawierającej hIL-12. W korzystnym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążącą antygen, które neutralizuje aktywność ludzkiej IL-12, i co najmniej jednej dodatkowej IL-12 naczelnych, wybranej z grupy składających się z IL-12 pawiana, IL-12 marmozety, IL-12 szympansa, IL-12 makaka jawajskiego i IL-12 makaka rezusa, ale które nie neutralizuje aktywności mysiej IL-12. Korzystnie, IL-12 jest ludzka IL-12. Na przykład, do hodowli komórkowej, która zawiera lub przypuszczalnie zawiera hIL-12, można dodać do podłoża hodowlanego przeciwciało Iub część przeciwciała według wynalazku dla zahamowania aktywności hIL-12 in vitro w hodowli.
W innym rozwiązaniu, przeciwciało według wynalazku jest przydatne w sposobie hamowania aktywności IL-12 u osobnika cierpiącego na chorobę, w której aktywność IL-12 wywiera szkodliwy wpływ. Uważa się, że IL-12 jest związana z patofizjologią szeregu różnorodnych chorób (Windhagen
PL 218 748 B1 i in., (1995) J. Exp. Med. 182: 1985-1996; Morita i in. (1998) Arthritis and Rheumatism: 41: 306-314; Bucht i in., (1996) Clin. Exp. Immunol. 103: 347-367; Fais i in. (1994) J. Interferon Res. 14: 235-238; Parronchi i in., (1997) Am. J. Path. 150: 823-832; Monteleone i in., (1997) Gastroenterology 112: 1169-1178 i Berrebii in., (1998) Am. J. Path. 152: 667-672; Parronchi i in., (1997) Am. J. Path. 150: 823-832). Przeciwciało według wynalazku jest przydatne w sposobach hamowania aktywności IL- 12 u osobnika cierpiącego na taką chorobę, przy czym sposób obejmuje podawanie osobnikowi przeciwciała, lub części przeciwciała, według wynalazku tak, że aktywność IL-12 u osobnika jest hamowana. Korzystnie, IL-12 jest ludzka IL-12, a osobnikiem jest osobnik będący człowiekiem. Alternatywnie, może być ssakiem, w którym zachodzi ekspresja IL-12, z którą przeciwciało według wynalazku reaguje krzyżowo. Jeszcze dalej, osobnikiem może być ssak, do którego wprowadzono hIL-12 (np. przez podanie hIL-12 lub przez ekspresję transgenu hIL-12). Przeciwciało według wynalazku można podawać osobnikowi będącemu człowiekiem dla celów terapeutycznych (szerzej omówione poniżej). Ponadto, przeciwciało według wynalazku można podawać ssakowi innemu niż człowiek, u którego zachodzi ekspresja IL-12, z którą przeciwciało reaguje krzyżowo, dla celów weterynaryjnych bądź jako zwierzęcemu modelowi choroby człowieka. Odnośnie tego ostatniego, takie modele zwierzęce mogą być użyteczne do oceniania skuteczności terapeutycznej przeciwciał według wynalazku (np. testowania dawkowania i przebiegu czasowego podawania).
W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, zwrot zaburzenie, w którym aktywność IL-12 jest szkodliwa obejmuje w zamierzeniu choroby lub inne zaburzenia, dla których wykazano, że obecność IL-12 u osobnika cierpiącego na taką chorobę jest, lub przypuszcza się, że jest, odpowiedzialna za patofizjologię zaburzenia lub jest czynnikiem odpowiedzialnym za pogarszanie się zaburzenia. Zgodnie z tym, zaburzeniem, w którym aktywność IL-12 jest szkodliwa jest zaburzenie, w przypadku którego przypuszcza się, że hamowanie aktywności IL-12 złagodzi objawy i/lub rozwój zaburzenia. Takie zaburzenie może być potwierdzone, na przykład, przez wzrost stężenia IL-12 w płynie biologicznym osobnika cierpiącego na zaburzenie (np. wzrost stężenia IL-12 w surowicy, osoczu, płynie maziowym itd. osobnika). Jest wiele przykładów zaburzeń, w których aktywność IL-12 jest szkodliwa. W jednym rozwiązaniu, przeciwciała, lub ich części wiążące antygen, można stosować to w terapii do leczenia chorób lub zaburzeń opisanych w niniejszym opisie. W innym rozwiązaniu, przeciwciała, lub ich części wiążące antygen, można stosować do produkowania leku do leczenia chorób lub zaburzeń opisanych w niniejszym opisie. Stosowanie przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, według wynalazku w leczeniu kilku, nie ograniczających, szczególnych zaburzeń omówiono szerzej poniżej:
A. Reumatoidalne zapalenie stawów:
Uważa się, że interleukina-12 odgrywa rolę w chorobach zapalnych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów. W mazi stawowej pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów wykryto podlegający indukcji mRNA p40 IL-12, a płynie maziowym pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów wykazano obecność IL-12 (patrz np., Morita i in., (1998) Arthritis and Rheumatism 41: 306-314). Stwierdzono, że komórki dodatnie pod względem IL-12 obecne są w wyścielającej warstwie mazi stawowej w reumatoidalnym zapaleniu stawów. Ludzkie przeciwciała, i części przeciwciał, według wynalazku można stosować do leczenia, na przykład, reumatoidalnego zapalenia stawów, młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów, zapalenia stawów związanego z chorobą z Lyme, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, zapalenia kości i stawów oraz dnawego zapalenia stawów. Zazwyczaj, przeciwciało, lub część przeciwciała, według wynalazku podaje się ogólnoustrojowo, chociaż w przypadku pewnych zaburzeń może być korzystne miejscowe podawanie przeciwciała lub części przeciwciała. Przeciwciało, lub część przeciwciała, według wynalazku, można również podawać z jednym lub większą liczbą dodatkowych środków terapeutycznych użytecznych w leczeniu chorób autoimmunologicznych.
W mysim modelu reumatoidalnego zapalenia stawów, indukowanym kolagenem zapaleniu stawów (CIA), traktowanie myszy przeciwciałem monoklonalnym przeciw IL-12 (szczurze przeciwciało monoklonalne przeciw mysiej IL-12, C17.15) przed zapaleniem stawów całkowicie hamowało rozpoczęcie i zmniejszało ilość przypadków oraz stopień ciężkości choroby. Traktowanie przeciwciałem monoklonalnym przeciw IL-12 wcześniej przed rozpoczęciem zapalenia stawów zmniejszało stopień jego ciężkości, ale późniejsze, po rozpoczęciu choroby, traktowanie myszy przeciwciałem monoklonalnym przeciw IL-12 miało minimalny wpływ na stopień ciężkości choroby.
PL 218 748 B1
B. Choroba Crohna
Interleukina-12 odgrywa również rolę w zapalnej chorobie jelit, chorobie Crohna. Podwyższoną ekspresję IFN-γ i IL-12 stwierdzono w błonie śluzowej jelita pacjentów z chorobą Crohna (patrz, np.
Fais i in., (1994) J. Interferon Res. 14: 235-238; Parronchi i in., (1997) Amer. J. Pathol. 150: 823-832; Monteleone i in., (1997) Gastroenterology 112: 1169-1178; Berrebii in., (1998) Am. J. Pathol. 152: 667-672). Wykazano, że przeciwciała przeciw IL-12 hamują chorobę w mysich modelach zapalenia okrężnicy, np. indukowanym TNBS zapaleniu okrężnicy u myszy z usuniętym genem IL-2, a ostatnio u myszy z usuniętym genem IL-10. A zatem, przeciwciała, i części przeciwciał, według wynalazku można stosować w leczeniu zapalnych chorób jelit.
C. Stwardnienie rozsiane
Uważa się, że interleukina-12 jest kluczowym mediatorem w stwardnieniu rozsianym. Ekspresję podlegającego indukcji mRNA p40 IL-12 lub samej IL-12 można wykazać w zmianach u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym (Windhagen i in., (1995) J. Exp. Med. 182: 1985-1996, Drulovic i in., (1997) J. Neurol. Sci. 147; 145-150). Pacjenci z przewlekłym, postępującym stwardnieniem rozsianym mają podwyższone poziomy IL-12 w krwiobiegu. Badania z zastosowaniem komórek T i komórek prezentujących antygen (APC) pochodzących od pacjentów ze stwardnieniem rozsianym ujawniły jako podstawę postępującego stwardnienia rozsianego samonapędzający się szereg oddziaływań immunologicznych, prowadzących do odpowiedzi immunologicznej typu Th1. Zwiększone wydzielanie IFN-γ przez komórki T prowadzi do zwiększonego wytwarzania IL-12 przez APC, co napędza cykl prowadzący do przewlekłego stanu aktywacji immunologicznej typu Th1 i choroby (Balashov i in., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 599-603). Rolę IL-12 w stwardnieniu rozsianym badano stosując model mysi i szczurzy stwardnienia rozsianego, doświadczalnego alergicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE). W podlegającym nawrotomremisjom modelu EAE stwardnienia rozsianego u myszy, wstępne traktowanie przeciwciałem monoklonalnym przeciw IL-12 opóźniało wystąpienie paraliżu i zmniejszało punktację kliniczną. Traktowanie przeciwciałem monoklonalnym przeciw IL-12 podczas maksimum paraliżu lub w czasie okresu kolejnej remisji zmniejszało punktację kliniczną. A zatem, przeciwciała lub ich części wiążące antygen, według wynalazku mogą służyć do łagodzenia objawów związanych ze stwardnieniem rozsianym u ludzi.
D. Cukrzyca insulinozależna
Uważa się, że interleukina-12 jest ważnym mediatorem w cukrzycy insulinozależnej (IDDM). IDDM indukowano u myszy NOD przez podawanie IL-12, i przeciwciała przeciw IL-12 okazały się ochronne w modelu transferu adoptywnego IDDM. Wkrótce po zachorowaniu na IDDM, pacjenci często doświadczają tak zwanego „okresu miesiąca miodowego”, podczas którego funkcje niektórych pozostałych komórek wysp są utrzymywane. Te pozostałe komórki wysp wytwarzają insulinę i regulują poziomy glukozy we krwi lepiej, niż podawana insulina. Traktowanie pacjentów w tym wczesnym okresie choroby przeciwciałem przeciw IL-12 zapobiegać dalszej destrukcji komórek wysp, w ten sposób utrzymując endogenne źródło insuliny.
E. Łuszczyca
Uważa się, że interleukina-12 jest kluczowym mediatorem w łuszczycy. Łuszczyca obejmuje ostre i przewlekłe zmiany skórne, które są związane z profilem ekspresji cytokin typu TH1. (Hamid i in. (1996) J. Allergy Clin. Immunol. 1: 225-231; Turka i in. (1995) Mol. Med. 1: 690-699). W próbkach skóry chorych ludzi wykryto mRNA p35 i p40 IL-12. A zatem, przeciwciała, lub ich części wiążące antygen, według wynalazku mogą służyć do łagodzenia przewlekłych chorób skóry, takich jak łuszczyca.
Niniejszy wynalazek zilustrowano dalej poniższymi przykładami.
PL 218 748 B1
Tabela 1 Sekwecje aminokwasowe rodziny linii zarodkowych VH3. Numeracja według Kabata (Joe9 włączono dla poro Linia
PL 218 748 B1
Tabela 1 Sekwecje aminokwasowe rodziny linii zarodkowych VH3.
cd
Λ cd &O
Ό <υ <1>
s
Z
PL 218 748 B1
PL 218 748 B1
Tabela 2
s o un y cd a OIJ p-« | |||||||||||||||||||||
Oznaczenie PHA ICSO (M) | SC O UJ O © | 5.00E-07 | o ώ o ολ e-f | 2.00E-07 | r- 1 o 'G 1 rn | r- 1 W O v? 1 m | r- W o V 1 en | r- o ώ o o Ύ | r~ o UJ o o SC | 00 o ώ O o, rn | 00 C ‘ 3 g S© | ||||||||||
Oznaczenie RB IC50(M) | SO o uj © un | r- 9 w o o r-4 | r~ o 1 ω o ©. | Γ' O UJ o -o ci | Os O W © so | ||||||||||||||||
fc o | o uj o o i“H | 7 TT en | <N O W © en en | 9 W © e-t | © UJ o cs P | rj 1 U tT so | s 1 tn o o «X | © 1 ω mc P. nf | (N O ώ θ'. © Ύ | en O uj CN >n P | m © UJ ’Τ v, oe | CM O UJ so VI Y | n o UJ | en O 1 W SC r- Y | 4,4511-02 [ | en OJ V) Y | en 1 OJ ef P | ||||
L3 | 1 QSYDSSLRGSRV | oo s Di <Λ <Z) Ω > GO cy | I o OJ o *“s | S cr. u O ►—> | s OS Oj O ·-> | Os EL> o | 5 OS 0) O | £ CZ> 2 D< Q {/> σ | QSYDSSLRGSRV | QSYDSSLRGSRV | QSYDSSLTGSRV | > Di 00 O Si j ζΛ (Λ Ω > GO σ | •d- m oc l> | V en oć l> | er rn 00 r- | T en 00 r- | V 9 oc r- | V, en oe r- | si- eń oo r- | śT m 1 oo r~~ | © r* |
L3 SEQ ID NO: | © | o | O | o | O | O | O | CM | en | - | en | Ξ | « | m | en | - | |||||
en | j SGSYDY | I SGSYDY | HGSHDN | HGSHDN | 1 HGSYDY | RRRSNY | SGSIDY | s | 5 | s | s | s | CM o r— | cm © r- | en © r* | en © r- | en © r*· | en © r* | © Γ | © r- | © O |
H3 SEQ ID NO: | r- Γ | r- | 00 i> | oo I> | Os r- | O 00 | 00 | t>- r- | r- r* | r- r- | Γ~ r~ | r- t— | OS E~~ | Os h- | oo | oo | oo | oo | 00 | oo r- | oc o |
CS o Ξ | s o OJ O ·—1 | 1 s $ o | 1 © | 70-1 IgGl | ΓΝ © | Γγ © r- | en © r- | tj- en oo r- | Vi Γ4 oó | 00 CM oo | V en 00 r* | 1 © r- | τ 1 O | Ό. © | O 1 O | oo © | -Φ © | un © | 101-11(12) | 101-11 IgGl | 26-1 (2,3) |
PL 218 748 B1
Tabela 2
<XJ |s F y [j_ i—1 | |||||||||||||||||||||
Oznaczenie PHA ICSO (M) | Ι,ΟΟΕ-07 | Os O g o cT | Os O ώ o Φ \o | o o W o o QC | Os O w o <o l> | 2.00E-08 | 60-300T | Os O 1 ω o <o cc | OS O UJ o «Ο Cd | 0. o ώ φ o cc | 05 O ώ o Φ | neutralizujące | |||||||||
Oznaczenie RB IC50 (M) | O 1 W o <o Cd | O ώ o O cc | 1 Ι,ΟΟΕ-ΙΟ | O ώ o o CC | Os O ώ o O cd | O ώ o o oc | 0 o g «Ο Cd | 60-300’I | 05 ó Cl | o 1 ω o o TT | 1 O *X OO o | 1,2x10-10 i | 6x10-10 | 9x10-10 1 | 3x10-9 | 1,8x10-10 | 2x10-10 | ||||
koff | rc O ώ o rl C*T | cc o 1 ω o tc | 1.10E-03 | TJ- 4» r-^ | tJ* o UJ 8 -ry | TT O ώ o \0 | n o ώ o Os CN | fC o ώ o | s UJ O rd^ TT | NT O ω o Os oo | 4,5x10-3 | cc 1 O X l> CC | 1,02x10-3 | cc ó 'χ CC A Cd | CC ó X cc | CC Ó x cc cc Cd | 3,54x10-3 | 1,43x10-2 | 3,73x10-3 | ||
cc 0 | i QTYD1SESGSRV | > Ci ΓΖ O H fc o Ci β GC O | > ai (Z5 O i- Ll, C di Cs > t—1 θ' | 1 QTYDKGFTGSSV | QTYDKGFTGSSV | > oi cn O Ρ- Ω (Λ c- | QSYDWNFTGSRV 1 | QSYDRGFTGSRV | QSYDNGFTGSRV | | QSYDNAVTASKV 1 | > a ίΛ O b. U X O > t/1 O | QSYDRGFTGSRV | QSYDSSLWGTRV | Ω | ...E......M. | < Z | |||||
L3 SEQ ID NO: | Ό | r- | oo | 00 | o | 120 | Cd | 122 | 123 | 124 | 124 | 124 | 125 | 124 | 126 | 127 | 128 | ||||
cc 33 | HGSHDD | HGSHDD | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | | HGSHDN | TT HGSHDN WGOG | AK.......... | (Λ | H | iż | K.........11. | |||||
H3 SEQ ID NO: | Cd 00 | Cd 00 | CC 00 | CC oo | CC oo | cc 00 | CC 00 | CC 00 | CC 00 | CC oo | TT 90 | kn oo | Ό oo | oo | Tf oo | T oo | oo oo | Os OO | O 05 | T oo | |
Klon | 0\ <ó CC | 1 136-10 | T 1 Ό CC | 136-15 | Linia zarodkowa 136-15 | 136-16 | 136-17 | 136-18 | 136-21 | 136-24 | 101-11 | 2 <ć CC | 149-4 | 149-5 | j 149-6 | 149-7 | 00 0 T 1-^ | 149-9 | I 149-11 | Cd 0 2 |
PL 218 748 B1
- Tabela 2 | IFN gamma IC50 (M) | ||||||||||||||||||||||
Oznaczenie PHA ICSO (M) | CA o ώ o o sc | ||||||||||||||||||||||
Oznaczenie RB IC50 (M) | 5x10-10 | 1,5x10-10 | |||||||||||||||||||||
o | ΗΊ 1 O X cn c) c-f | 5.00E-03 | rn o ώ o o σ | en O ώ o o en | m O W o o NP | H £ -J cn cn | |||||||||||||||||
cn | > Λ <Λ O F- Eb u ai Q > 05 oi | Q | Pi | < iż | .. . E.....SM . | .T..K.....s. | o | OŚ | < z | . . E.....SM . : | .T..K.....s. | Q | PS | Z | . . . E.....SM . | | IZ iZ 3 | .... SSLW . T .. | ||||||
ΓΎ θ 3 w* | I 124 | Cl | θ' CN | 1 128 | 127 | o m | Ό CN | σ CN | 128 | c- CN | 130 | ‘Ό C-ł | 129 | 128 | 127 | O en | 124 | 125 | 125 | ||||
H3 | .. .R..N..... | I TTHGSHDN | F- | (— | H | H | H | t4 | Z | t4 | 24 | Η | H | ||||||||||
H3 SEQ ID NO: | cc | O\ | Cl σ | CO σ | en & | en <z. | rn OS | m σ' | σ | σ | CN σ | CN σ | CN σ | 94 | T σ | 94 | T σ | ’Τ σ | cn σ | CN σ | m σ | ||
Klon | cn σ Xf- | 149-14 | 156-1 | 156-2 | 156-3 | I 156-4 | Wl NP Wl | 156-6 | C- 1 wi | □o 1 xD Wl | σ \ó Wl | 156-10 | 156-11 | 156-12 | 156-13 | ’χΡ ώ wi | 156-15 ' | 156-16 | 156-17 | 00 NP Wl |
PL 218 748 B1
Tabela 2 | IFN gamma IC50 (M) | |||||||||||||||||
Oznaczenie PHA ICSO (M) | σ- ο ώ ο Ο | ο ω ο ο | 1.50Ε-09 | 1.20Ε-09 J | σ. o ώ o ντ | 9,00E-10 | ||||||||||||
Oznaczenie RB IC50 (M) | I ω ο ο | ο I ω ο | 1 ω ο ο 80 | 4-00Ε-11 | ll-TO9‘8 | ώ o sO oo | ||||||||||||
koff | 2,9x10-3 | 7,3x10-4 | 2,5x10-3 | 4,5x10-4 | 3,7x10-4 | 3,3x10-4 | 6,7 e-4 | 5,3 e-4 | ύ o | 2,35E-03 | ’Τ o 1 ω o oo 00 | ct o 1 ω | Nt O 1 ω oo | |||||
CT U | > Ci <Z □ H b O Ci o > tz cl | ; . Τ . . Κ.....S . | Η α | .....D.....Τ | (Ζ) Η | QSYDRGFTGSMV | QTYDKGFTGSSV | > oi < g U. O Oi a iz σ | QSYERGFTGARV | OSYDRGFTGSRYF | .........FK .. j | .......VSAY,. | 14 > U | ......Y.A.... | ||||
L3 SEQ ID NO: | 124 | CM | J 130 | 124 | ct | ο ct | 132 | 133 | 134 ] | 135 | 80 fC | O ct | 138 | Os CT | 140 | |||
H3 | TT HCSHDN | (4 θ' | CEi | 14 | Ω | 14 | KT HGSHDN | KT HGSHDN | TT HGSHDN : | TT HGSHDN | TT SGSYDY | |||||||
ó z Q θ' ω <Ζ I | CM θ' | ut σ. | \ο <σ | σ | 00 σ' | 66 | 100 | 001 | O | O | 102 | 102 | O | 102 | 102 | |||
Klon | 103-1 | j 103-2 . | 103-3 | Ό 1 rc Ο | I 103-7 | 103-8 | I 103-14 & 9 1 | 00 fń o | 103-4 j | 103-152 | 170-1 | 170-2 | 170-3 | 170-4 |
PL 218 748 B1
Tabela 2 | IFN gamma IC50 (M) | ||||||||||||||||||||||
Oznaczenie PHA ICSO (M) | |||||||||||||||||||||||
Oznaczenie RB IC50 (M) | o ώ o o. CM | O ώ o o un | 2.00E-IO 1 | 1 X o o V? | 00 X A | 00 1 X A | 00 1 X A | ||||||||||||||||
fc o | n- o X © en vn | 3 x o Ό ^r | en o ώ os | en O x en X ’Χ | en 9 ω o o | m o ώ os oo en | 5,60E-04 | en O 1 X O <o | 3 ώ o 00 ci | T o ś o | nr o ci | en O X Cs r- ci | nf O X O o. nf | T o X § Vi | en O 1 X on ΓΜ en | en O 1 X r~ o CM | en © X *n ci | ? a Y ci | 3J9E-03 | en 9 X s© Os en | |||
en X | fc | x x | fc > | 1 ......L..Y.L. | iii Q | X Oh | X | < | X | C/5 s | QSYDRDSTGSRVF | | X > QZ CZ3 O OZ X V3 5Λ O > CC O | Ru > a (Λ U fe U X o > <Z3 CS | 6 (Λ a | [Λ X (Λ fc | X z a | fc ΕΛ fc | X ί/Ί | E— | ||||
36 <Λ Z en Q u fc | tj- | ci nt- | en Tf | O T | OD tr | O T | Γ- η- | oo TT | □s rr | Ό en | O WD | Ά | Cl iin | en •Ci | ND rn | 'd· wn | ITD in | SD <n | r- n | co vn | Cs wn | ||
en fc | .. H..H.N | .. H..Q.N | .. H..H.N | z 6 a | z ά a < | HGSHDN | c o V3 U a | SGSYDY | SGSYDY | SGSYDY | SGSYDY | SGSYDY | SGSYDY | SGSYDY | |||||||||
H3 SEQ ID NO: | C4 O | ΓΜ © | cm o | CM O | en o | s | CM O | en O | Os O | 'Ci o | en oo | '·© O | MO © | c- o | C’ © | c- © | Γ- © 5 en C~ | r- O | C- © | ||||
ΰ o bd | (γ © r- | © c- | en 1 O r- | m 1 O r> | CS O | o | Cl O c- | en CM 1 O C' | CM 1 O Γ- | τ en o r- | OO en O r- | Cs en 1 O Γ- | \o en Ó Γ- | •Cl CM 0 l> | £ 1 en c- | CM X en | so X en r- | CM U en c- | s© O en C |
PL 218 748 B1
PL 218 748 B1
Tabela 2
©l o z ł y | ||||||||||||||||||||||||
Oznaczenie PHA ICSO (M) | ||||||||||||||||||||||||
Oznaczenie RB IC50(M) | ||||||||||||||||||||||||
1 | ω o © *sf | 8.49E-03 | <M O ώ © | 3 r* | g I s© | 4.42E-02 1 | 8.38E-03 [ | 8 u 60 οί | 8 ώ •Tl 60 | 4.62E-02 | | 8.16E-03 | | s ώ | CM 3 «—1 en | § w οολ en | CM O W en en en | CM © W ł“H 00 u-> | 00 »—< •n | ts 9 w O | 1 en | 9 ω c- t> | m 3 ł> oC | 6,16E-02 | en 3 © Os Os* | |
-1 Π | OSYDRCFTCSRYF1 | ......IH..... ' | ....S..P..... | [ ......SI i | J (Λ | ....I.M...... | | | ......TI | ,...S.V...... | | ......L.A.... | | | ......ts” | U H | ...,S.L...... | ....TAL...... 1 | 1 .... IR....... I | < | .... NRL......J | ... ETS....... | | ..,. sss...... ] | ..., S.., A.... | .T..K.....s.. ) | z | .... SDV...... | < | |
L3 SEQ ID NO: | s© cn | oo r- | 179 | 180 | 60 | CM 60 «—· | 183 | 3 ł—< | 185 | 60 | 186 | 60 | 187 | i 881 i | Os 00 | © Os | 191 | a OS »—· | 193 | 3 | ! 195 | 196 | 197 | 60 Os |
£H | HGSHDN | HGSHDN i | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | NGHSOH | i HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | j HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | |
Q M o [Λ /Ł £ | en ©0 | en 60 | en 60 | en 60 | en 00 | en 60 | en oo | en 60 | en 60 | en 60 | 83 | en 60 | o© | en 00 | en 60 | en 60 | en 00 | en 60 » | en 60 | en 60 | en oo | 83 | 83 | |
— Klon | s | M2 A4 | M2A5 | M2B1 | M2B3 | s § | M2B5 | M2B6 | M2C2 | M2C3 | M2C4 | M2C5 | M2D1 | M2D2 | 1 M2 D3 | M2D4 | M2D5 | 8 | M2E1 | M2E2 | s § | E | M2H5 |
PL 218 748 B1
Tabela 2
IFN gamma IC50 (M) ..... | ||||||||||||||||||||||
Oznaczenie PHA ICSO (M) | ||||||||||||||||||||||
Oznaczenie RB IC50 (M) | ||||||||||||||||||||||
fc o Ai | en o x CM | en O ώ m nr | en O ώ r-~ nr | en o ώ c- oo | rn o ώ C- oo F-H | en O ώ Γ- O ci | en o 1 w en ci CM | en O x r-- en c4 | en O 1 ω o nT <i | en O ώ CM nT ci | rn O 1 X un ri | m Q 1 W >c, c\ ci | en o 1 ω Ί- Ο en | C’i O ś en | m o 1 ω en m | en O W nT en en | rn o ώ 3 rn | en O W O eo en | rn O ώ °ϊ en | en o ώ •Ci Ch en | en o 1 ω r- O\ en | |
en J | > X co O H b O X Q > ce α | s a H | s ft, Βί B | H -J < X | ......THPWLH | > H 2 cn Z | σ x x X H | f- < a- 2 | hJ i | > G X | H oo X H σ | Z X £ | < J o a | > < X 0- o· | H x x £/l Z | IX rz: Z 2 x H | > X O X § 00 | a | o£ a X | ε θ' r- I X | X CZ) X z i | X i X |
G w 2 <zi Z | nt CM | o Oh | o o | o CM | CM O cm | en O cm | s cl | *n O CM | Ό O CM | Γ- o cm | 00 o CM | θ' o es | o CM | CM | CM CM | en CM | nr cM | in CM | Ό T—« CM | r- CM | oo CM | o\ CM |
m X | 2 Q X tn O X | 2 Q I <Λ Φ X | 2 G X VI O X | HGSHDN | § X ΙΛ O X | X 1Λ O X | 2 c X ΙΛ Φ τ | HGSHDN | 2 tn c X | 1 IZ) u X | | V. Φ X | 2 □ X cn O X | § X ΪΖ) O X | § X en O X | § X W c X | c X en o X | a X CZl O X | G X IZ) O X | Z O X cn O X | z w Φ X | z «5 Φ X | |
ó Z G O' ω (Λ cn X | m oo | en oo | en oo | en 00 | en oo | m 00 | en 00 | en 00 | en oo | m 00 | m 00 | en oo | en oo | en oo | m 00 | en 00 | m 00 | en 00 | m oo | en oo | m 00 | |
Klon | •Ci < | ci < | nT < | 'Ό < | o < | < | CM ϋ | 00 | 00 ffl | Ό U | m < | CQ | un ω | O U | nr U | en α | cm 3Q | CM < | •n U | < | o> u |
PL 218 748 B1
Tabela 2
CT O I ω CM ct5 | CT 9 ω 80 CT iri | CT o W WT ’Τ wt | ct o ώ 80 80 WT | i 5.83E-03 | | 5.85E-03 | I 6.04E-03 | CT o ώ 00 WT | CT O ώ oo r-' | CT O ώ 80 80 OO | ’Φ o ώ o Φ 'f | 5.50E-04 | ę ώ CM cr sd | 3 ώ tj- σ o | CT o 1 W CM CT | CT o 1 ω oo WT | o 1 ω 'Tj· Tf CT | 'd- o ώ o oo WT | TT O ώ O O ocT | B-OOE-04 | ||
...... TPSYPT | I .. ..S.TSNLLP | 1 ......DSNHDL | ......LPRLTH | ......IPTSYL | ......LRVQAP | ......LSDSPL | ... . S . SLRRIL | I ......PARTSP | £ z < i | > es w U b CJ Z c > 03 ó| | ......TQPAB1 | ......THPTMI | ......RIPABT | 2 £ ZE i- | ......SBPIPA | < CU K H | ......THPTMY | Pu μ z z | ......SHPAAE | ......TIPSIE | |
i 220 | 221 | 1 222 | CT Cl Π | T Cq CM | 225 | ‘Ό CM CM | 227 | 228 | o CM cM | 124 | 230 | CT CM | CM CT CM | cr CT CM | ’Τ r*T Cl | 235 | 80 CT C4 | c-' CT C4 | 00 CT CM | 239 | |
HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | ||
cr 00 | 83 | CT oo | CT 00 | CT 06 | CT oc | CT 06 | CT oo | CT oo | CT oo | CT oo | cr 00 | CT 00 | 00 | CT oo | CT 00 | CT 00 | 83 | 83 | CT 00 | ||
cr CQ | C8 | r- CQ | < | 1 C7 | C12 | 1 Bl° | Ό CQ | A9 | B9 1 | 177-D7 | 177-G6 | | 177-D9 | | 177-Có | | WT I t-ί Γ- | Ot £ r- | I 177-H10 | | | 144-F1 | 43-E3 | CT Tf |
PL 218 748 B1
Tabela 2
IFN gamma IC50 (M) | 01-309Ί | ||||||||||||||||||||
Oznaczenie PHA ICSO (M) | OO 1 UJ A | 00 1 ω A | σ o 1 uj o ••o CN | σ o 1 UJ O cn N | O UJ o np | o ώ o en | O ώ g en | O 1 UJ o wy nf | σ o UJ o o | σ o I UJ § CN | σ o ώ o o | £ | σ o UJ o 02 | ||||||||
CQ C4 Z? Έ δω λ 3 8 a o O | O 1 W o wy 'fr | ώ o o en | ώ o Wl W? | UJ o o nr' | ώ nr | UJ o NP | ώ § | 1 UJ en | ώ o | ώ Wj | UJ o NP o' | O UJ O wy CN | σ o W wy en | o ώ | |||||||
fc o JZ | Tf o ώ o O t-* | s w o o Os | a ci O cy w? | 'Τ- Ο 1 w O O wT | Wi O ώ o σ oo | T O ώ O CN CN | T o uj 00 CP w? | np o UJ l> | np ώ Wl Γ'· CN | nr o UJ o Wl | s ώ o wy | np o UJ Si wi- | np o ώ 9Ί | np O UJ NP N5 | np 9 UJ o wy nr | np 9 ω O wy w? | ^r o ώ CN OO | O UJ 00 o wT | |||
en | s < C- cn cn | 2 z | 2 2 X H | cn ćn 35 H | £ z X H b O a o > oi ©1 | δ s $5 z X ai g cn θ' | z 5 < Ł X X X Oi a z X | t 00 Ł H | > < ο- χ f- | U U X H | -J J < X H | -J Ęa H | H ο- Χ cn | E—· 3 CU X cn | W £U | 3 ?- Cl X cn | U 2 cn cu X | s a a- £ | H X < g | H J CU X H | |
Ó Z g θ' w (Λ m hJ | o T CN | n· C4 | CN ’Τ CN | en CN | n* C4 | nr nP CN | Wł n- CN | NP N- CN | C~ nr CN | oo nr CN | 00 np CN | 00 nr CN | σ nr CN | σ np CN | o V) fN | w CN | CN W| CN | en Wl CN | nr Wl Cl | Wl W5 CN | |
en X | z IZ O X | 1 cn X X | E X IZ X X | z Q X z X X | Z g z X X | Z z X X | | en 2 | 2 X z X X | 2 X z X X | § X z O X | Z Q X z X X | 2 X z X X | z Q X z X X | § X z X X | 2 X z X X | z o X z X X | 2 X z X X | z Q X Z X X | 2 X z § | ||
H3 SEQIDNO: | en oo | en oo | en oo | en 00 | en oo | m 00 | m oo | en oo | rn oo | en oo | m oo | en 00 | rn 00 | en 00 | en 00 | en oo | en 06 | en 00 | en 00 | ||
Klon | CN O cn N | en φ rn N- | '-O en | Wi X 1 en | C- > | O | oo en > | w, nr | ——1 ‘O | O 00 Ό | Linia zarodkowa Y61 IgG | o. m > | 3 Ofj l·—1 σ en | np r- | Γ- r- > | Wi < | ’<N < | σ Q | kC O |
PL 218 748 B1
Tabela 2
|f ga ł—1 | |||||||||||||||||||
Oznaczenie PHA ICSO (M) | as o ώ © O | oo o 1 ω © o | oo ώ Λ | © 1 lu © © ^r | © ώ © 00 cn | © 1 ω Mn (>_ | |||||||||||||
Oznaczenie RB IC50 (M) | o ώ ΜΊ cn | © W © nr | © ώ © •/γ CM | ώ © ©_ en | ώ © © CM | »—< 1 ΰ © *n cn | |||||||||||||
ta o -Z | cn © 1 W ©^ | m 9 w SC © | n· © ώ © rn Ά | nT © ώ nT O en | ^r 1 4J nr ©^ en | 3 1 Ul © Vł CM* | m © w © ητΛ on | cn © 1 W © wn | cn © ώ © oo nT | cn © 1 CU © M; wn | en 9 CU © rn rn | cn © i CU © © sr | cn © ώ © 9. nf | 9 LU © oc nf | m 9 CU © rn | cn © ώ © nr Mn | |||
rn U | H X H | H 53 H a § a > 'SI Q> | QSYDRGTHFQMY | H < C- g O C > ci· σ | J Ł s Pi O 5 Ł/l σ | s x | § Q > Gi θ' | s H X Ł X H s Q > Ci θ' | £ V, O H > O co G > co O | £ cz> O H U- C GO Q > on O | £ cO O X & <OJ Q > to O | > ać Li O X X Ci X > VI σ | > C/5 < Ł 5 o Ł > CO θ' | > cć go E S X H GO ίΖ) σ | > cć 1/5 o 1- GC u rzj O > gc O | > GC £ er g </} O | > A ci O | Ci O H Cu O Ci O Ci σ | ||
L3 SEQ ID NO: | Mn CM | SO cn CM | r- Mn Γ'ί | 00 wn CM | as IZ) CM | © © CM | © s© CM | © CM | CM SD CM | cn SD CM | tM sD CM | 3 fM | τ so CM | SD SD CM | Γ SD fM | 00 so CM | fM SO CM | ||
rn X | z Q a co z | z o Ci o X | z a X t/j o X | Z c X ci S | z o S ϋ O χ | z Q X Ci X X | § X co Φ X | § X co O X | § X ci O X | Z Q X ci O X | z Q X co U X | z X X ci O X | G X Ci O X | § X Ci O X | § X Ci O X | g X Ci o X | § X Ci a X | ||
ó z 3 o w Ci Q x | cn oo | cn 00 | cn 00 | cn 00 | rn oo | m oo | en oo | en oo | cn oo | en oo | en oo | rn oo | m 00 | en 00 | cn 00 | cn oo | cn 00 | ||
c o | 3 Cl? s© o | SD O | T 'ZD > | < | m O < | 1 cn O < | Linia zaroddkowa A03 IgG | Ξ © O | 3 CS os | nT x © © | © CU | r- X © © | X 1 © © | SD U- © © | a ŁL| © © | oo 9 © © | E 1 © © |
PL 218 748 B1
IFN gamma IC50(M) | ώ o o. τΓ | |||||||||||||||||||
Oznaczenie PHA ICSO (M) | 1 CU o o oo | ώ § so | W o <0 | ώ o ο GC | ||||||||||||||||
Oznaczenie RB 1C50 (M) | 2.00E-11 | ώ ο ο •0 | ||||||||||||||||||
o | cc W o oo | CC O ώ o cc | O o + ω 50 TT uc | O o + s cc | g i r- 50 | O I 0 0, Tf | O ? W C) uh CC | O ? w 0 50 CC | O ¥ ω CC CC | O + CU r- cC | O + cu 0 □χ TT | CJ ¥ £ n TT | o 2 cr n | O o + tu •ΖΊ CC | ΤΓ ο ώ Γ- η | |||||
cc | QSYLKSRAFSRV | ’ QSYDSRFTGSRV | OSYDRGFTGSRY | 1 ......FTGSMY | > s O z | ......FTGFDG | ......TAPALS | ......SYPALR | ......NWPNSN | H-l (Z) CU < H | ......FTGSMY | ......TTPRIR [ | ......FTGSMV | ......FTGSMV | ......MIPALT | QSYDRNTHPALL | J U < fl. X i— fc, OtS p > «3 c? | QSYDRYTHPAEI, | QSYDRYTHPALL | |
ó z Ω θ' W m m J | 0 50 Cl | 270 | 124 | 271 | 272 | 273 | 274 | 275 ' | 50 Γ- Cd | 277 | 00 Γ- η | 0 Γ- η | O 00 rd | 00 rd | 282 | 283 | 284 | CC 00 fd | 285 | |
cc E | HGSHDN | I HGSHDN | HGSHDN i | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | Z 3 z O | HGSHDN I | HGSHDN | HGSHDN | HGSHDN | | HGSHDN i | HGSHDN | HGSHDN | CKT HGSHDN | CKT HGSHDN | CKT HGSHDN | CKT HGSHDN | ||
H3 SEQ ID NO: | CC oo | CC 00 | CC 00 | rc 00 | CC 00 | CC oo | rc 90 | CC oo | CC oo | cc oo | CC OO | CC oo | cc oo | cc oo | s | 601 | 109 | 109 | ||
Klon | r- O 0 0 | [ 99-G11 | L3.3R3M-B1 | I L3.3R3M-B3 | I L3.3R3M-C6 | 0 Pu 2 2 rC CC U | 1 L3.3R3M-G8 1 | I L3.3R3M-H6 1 | L3.3R3M- H10 | L3.3R3M-A3 | L3.3R3M-F8 | | 5 2 cc oć rc <C U | ι- Ο 2 2 CC CC | I L3.3R3MHll | * 0 u 1 £ | Y61-L94F | > | > 3 o 1 0Ό i t—-1 |
PL 218 748 B1
Tabela 2 | wł |s °»8 z u X | 1 w o ©. ci | ώ © © en | X © o ci | X © © | CM X § on | > o nd fc © on X CM X fc O u * | 1 **CDRL2: L50G do Y; CDR HI: H31S doE |
< a - o .2 e, 5 O K w a O 1 | X © © ci | 1 X © O S© | X O © | Ύ X © o | ||||
1 s g X N θ o on ca O O | tul © o CM | 1 X © 9 on | ||||||
fc © X | on © 1 X 00 Os SO | on o 1 X Os os ci | on o X 3 X | on © 1 X n- on | ||||
en X | a £ a H O K Q > (Λ σ | a a < Cl, a H S £ UO O | a a < fe a a o X a > on σ | X χ i a H > fc O > 00 O | a a < Ł a F > X Q > [Z> θ' | |||
Ó Z Q O X ζΛ en X | so 00 CM | s© 00 CM | so 00 CM | c> 00 CM | C- oo CM | |||
en fc | z w 3 ug a | z H C kZ * u u O fc | z H 3 u a a | ag a | z η Θ u υ O a | |||
ó z □ o- w cc n a | S | © © | © © | Os © | ©s O | |||
G O 3 | > © on X s© > | * > o _ O ą en o > | J fc >- bil © ΙΟΊ * X *\ X W ξ en > a | Y61-L50YH31EŁ94Y** IgG | 1 fc on > sjq os X — S ' X |
PL 218 748 B1
PL 218 748 B1
Tabela 4 Aktywność neutralizująca w obecności nadmiaru wolnej IL-12 p40 | I Oznaczenie PIIA IC50 (M) p70:p40 1 1:50 | 4,00E-09 | 4.00E-09 | Ι,ΟΟΕ-09 | Cs O ώ o o | o a o oc 1—4 | o 1 M o cm ci | 1 a o νγ en | ||||||
Oznaczenie PHA IC50 (M) p70:p40 1:20 | Cs O 1 a cn o. on | 60-300‘Z | l,0OE-O9 | ! 2.50E-09 | ||||||||||
Oznaczenie PHA, IC50 (M) p70:p40 1:0 | 2,00E-09 | Cs o ώ o on | O 1 ω o o ci | Cs O 1 a o on en | O ώ o oo | o 1 W O on ci | W o o | |||||||
1 | Ό 1 SO rn | <rj 1 c\ | s£ 1 Cs ^l- | r- 1 Cs | O 00 Ό | δ 3 | on © | |||||||
SEQ ID NO: | c· a > | oo TT H-) > | on i-M > | ci •n J > | m on a > | ύ on > | oo X > | sO cM «—1 J > | ΟΊ CM X > | 'T CM -1 > | on 'O | 'sO sO I-I > | en HH HH > | CM en U > |
PL 218 748 B1
P R Z Y K Ł A D Y
Przeciwciała ujawnione w przykładach są częścią wynalazku w zakresie, w jakim spełniają wymagania zastrzeżenia 1.
P r z y k ł a d 1: Izolowanie przeciwciał przeciw IL-12
A. Przeszukiwanie pod kątem przeciwciał wiążących IL-12
Przeciwciała przeciw hIL-12 izolowano przez przeszukiwanie trzech odrębnych bibliotek prezentowanych przez fagi scFv przygotowanych z wykorzystaniem cDNA ludzkich VL i VH otrzymanych z mRNA pochodzących z ludzkich migdałków (określane jako scFv1), migdałków i limfocytów krwi obwodowej (PBL) (określane jako scFv2) oraz limfocytów pochodzących ze szpiku kostnego (określanych jako BMDL). Konstruowanie biblioteki oraz metody selekcji opisano w Vaughan i in. (1996) Nature Biotech. 14: 309-314.
Biblioteki przeszukiwano wykorzystując antygeny, podjednostkę p70 ludzkiej IL-12, podjednostkę p40 ludzkiej IL-12, chimerycznej IL-12 (p40 mysiej/p35 ludzkiej), mysiej IL-12, biotynylowanej ludzkiej IL-12 i biotynylowanej chimerycznej IL-12. Przeciwciała specyficzne wobec IL-12 wyselekcjonowano powlekając antygenem probówki immunologiczne, stosując standardowe procedury (Marks i in., (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597). Bibliotekę 2 scFv przeszukiwano stosując albo IL-12, albo biotynylowaną IL-12 i utworzono znaczącą liczbę specyficznych środków wiążących IL-12. Wyselekcjonowano pięć różnych typów klonów, określonych na podstawie wzoru trawienia enzymatycznego BstN1 i potwierdzonych przez sekwencjonowanie DNA. Głównymi typami klonów były VHDP58/VLDPL11, VHDP77/VLDPK31, VHDP47/VL oraz VHDP77/VLDPK31, z których wszystkie rozpoznawały podjednostkę p40 IL-12.
Przeszukiwanie biblioteki BMDL za pomocą p70 IL-12 dało trzy różne typy klonów. Stwierdzono, że dwa z nich były klonami reagującymi krzyżowo. Przeważający klon zsekwencjonowano i składał się on z VHDP35/VLDP. Klon ten rozpoznaje podjednostkę p40 IL-12. Przeszukiwanie biblioteki 1 scF za pomocą p70 IL-12, nie doprowadziło do uzyskania przeciwciał specyficznych wobec IL-12.
Do zidentyfikowania przeciwciał przeciw IL-12, które preferencyjnie wiążą się raczej z heterodimerem p70 lub podjednostką p35 IL-12, niż podjednostką p40, zastosowano połączone biblioteki 1 + 2 scFv oraz bibliotekę BMDL. W celu wyselekcjonowania przeciwciał przeciw IL-12, które rozpoznają heterodimer p70 lub podjednostkę p35, wstępnie inkubowano biblioteki fagowe i selekcjonowano w obecności wolnej p40. W wyniku sekwencjonowania wyizolowanych klonów ujawniono 9 różnych linii przeciwciał. Preferencje w stosunku do podjednostki analizowano następnie przez „mikromiareczkowanie Frigueta. Supernatant zawierający scFv miareczkowano na wychwyconej przez biotynę IL-12 w oznaczeniu ELISA i określono ED50. Stężenie scFV wywołujące 50% ED poddawano wstępnej inkubacji ze wzrastającymi stężeniami wolnych p70 lub p40 (inhibitorami). Mierzono spadek sygnału w oznaczeniu ELISA przeprowadzanym na płytkach powleczonych biotyną-IL-12 i wykreślano wobec stężenia wolnego p70 lub p40. Pozwoliło to uzyskać IC50 dla każdego klonu w odniesieniu do p70 i p40. Jeśli miereczkowania dla obu podjednostek pokrywają się, to scFv wiąże się zarówno z p40, jak i p70. Jakiekolwiek odchylenie od tego wyznacza stopień preferencji p70 w stosunku do p40.
B. Dojrzewanie pod względem powinowactwa linii przeciwciał specyficznych wobec IL-12 (Joe 9)
Klony testowano pod względem ich zdolności do hamowania wiązania IL-12 z jej receptorem, stosując oznaczenie wiązania receptora IL-12 (określane jako RBA) oraz pod względem ich zdolności do hamowania indukowanej IL-12 proliferacji ludzkich komórek blastycznych stymulowanych PHA (oznaczenie PHA), opisane w Przykładzie 3. Klon Joe 9 miał najniższą wartość IC50 w obu oznaczeniach, RBA i PHA, z wartością IC50 wynoszącą w obu oznaczeniach 1 x 10-6 M. Ponadto, region zmienny łańcucha ciężkiego (VH) Joe 9 miał najmniejszą liczbę zmian w porównaniu z najbardziej podobną sekwencją linii zarodkowej COS-3, zidentyfikowaną w bazie danych VBASE. Tabela 1 (patrz Załącznik A) przedstawia rodzinę VH3 sekwencji linii zarodkowej, której przedstawicielem jest COS-3, jak również przedstawicieli rodziny sekwencji linii zarodkowych VJ. Dlatego też, Joe 9 wybrano do dojrzewania pod względem powinowactwa. Sekwencje aminokwasowe VH i VL przeciwciała Joe9 typu dzikiego (Joe9 wt) przedstawiono na Figurach 1A - 1D.
W celu podwyższenia powinowactwa Joe9, dokonano różnych mutacji regionu determinującego komplementarność 3 (CDR3) obu łańcuchów, ciężkiego i lekkiego. Warianty CDR3 utworzono przez ukierunkowaną mutagenezę przez PCR, stosując zdegenerowane oligonukleotydy specyficzne albo wobec CDR3 łańcucha ciężkiego (określanego jako „H3”), albo CDR3 łańcucha lek74
PL 218 748 B1 kiego (określanego jako „L3), z przeciętnie podstawieniami trzech zasad w każdym CDR3 (określanymi jako „losowe podstawienia). W celu utworzenia zestawu mutantów CDR3 łańcucha ciężkiego, przeprowadzono mutagenezę przez PCR CDR3 łańcucha ciężkiego z użyciem zdegenerowanego oligonukleotydu łańcucha ciężkiego, obejmującego losową mieszaninę wszystkich czterech nukleotydów,
5' TGTCCCTTGGCCCCA (G) (T) (A) (G) (T) (C) (A) (T) (A) (G) (C) (T) (C) (C) (C) (A) (C) (T) GGTCGTACAGTAATA 3' (SEQ ID NO: 580) oraz oligonukleotydu pUC Reverse Tag, GAC ACC TCG ATC AGC TAA CAA TTTCAC ACA GG (SEQ ID NO: 581). Macierzysty łańcuch lekki zamplifikowano stosując odwrócony oligonukleotyd Joe 9 (5' TGG GGC CAA GGG ACA 3' (SEQ ID NO: 582) oraz oligonukleotyd fdteteseq 24+21 (5'-ATT CGT CCT ATA CCG TTC TAC TTT GTC GTC TTT CCA GAC GTT AGT-3' (SEQ ID NO: 583).
Komplementarność pomiędzy dwoma produktami PCR wykorzystano do łączenia tych dwóch fragmentów w reakcji składania przez PCR i bibliotekę pełnej długości zrekombinowanego scFv zamplifikowano stosując pUC Reverse Tag (SEQ ID NO: 581) i fdTag 5'-ATT CGT CCT ATA CCG TTC-3' (SEQ ID NO: 584). W celu utworzenia zestawu mutantów CDR3 łańcucha lekkiego, przeprowadzono mutagenezę przez PCR łańcucha lekkiego z użyciem oligonukleotydu łańcucha lekkiego, obejmującego losową mieszaninę wszystkich czterech nukleotydów,
5' GGTCCCAGTTCCGAAGACCCTCGAACC (C) (C) (T) (C) (A) (G) (G) (C) (T) (G) (C) (T) (G) (T) (C) ATA-TGACTGGCAGTAATAGTCAGC 3' (SEQ ID NO: 585) oraz odwróconego oligonukleotydu Joe9 5' TGG GGC CAA GGG ACA 3' (SEQ ID NO: 586). Macierzysty łańcuch ciężki zamplifikowano stosując pUC Reverse Tag (SEQ ID NO: 581) oraz oligonukleotydy HuJH3FOR TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC 3' (SEQ ID NO: 587). Komplementarność pomiędzy dwoma produktami PCR wykorzystano do łączenia tych dwóch fragmentów w reakcji składania przez PCR i bibliotekę pełnej długości zrekombinowanego scFv zamplifikowano stosując Reverse Tag, TGAC ACC TCG ATC AGC G (SEQ ID NO: 588) i oligonukleotyd HuJX2-3 FOR NOT 5' GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC 3' (SEQ ID NO: 589).
Mutanty CDR3 łańcucha ciężkiego selekcjonowano stosując 1nM biotynylowaną IL-12, i przemywano w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej w PBS zawierającej wolną IL-12 lub p40 w stężeniu 7 nM. Klony poddawano analizie w oznaczeniu ELISA fagów i te, które wiązały się z IL-12 testowano, w kinetycznych badaniach wiązania z zastosowaniem BIAcore, stosując chip z IL-12 o niskiej gęstości (patrz procedura analizy BIAcore w Przykładzie 5). Ogólnie rzecz biorąc, w analizie BIAcore mierzy się oddziaływania wiązania w czasie rzeczywistym pomiędzy ligandem (zrekombinowana IL-12 zimmobilizowana na macierzy biosensora) i substancją analizowaną (przeciwciałami w roztworze) przez powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), wykorzystując układ BIAcore (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Układ wykorzystuje optyczne właściwości SPR do wykrywania zmian w stężeniach białka w dekstranowej macierzy biosensora. Białka, o znanych stężeniach, są kowalencyjnie związane z macierzą dekstranową. Przeciwciała wstrzykuje się pomiędzy macierz dekstranową i specyficzne wiązanie pomiędzy wstrzykniętymi przeciwciałami i zimmobilizowanym ligandem powoduje wzrost stężenia białek macierzy oraz, w wyniku, zmianą sygnału SPR. Te zmiany sygnału SPR rejestruje się jako jednostki rezonansowe (RU) i wykreśla wobec czasu na osi y sensogramu. Do określania szybkości dysocjacji (koff), szybkości wiązania (kon) oraz stałej wiązania (Ka) i stałej dysocjacji (Kd) stosowano oprogramowanie do analizy kinetycznej BIAcore (wersja 2.1). Klony, które wykazywały poprawę pod względem szybkości koff, analizowano stosując oznaczenia neutralizacji, które obejmowały hamowanie wiązania przeciwciała przeciw IL-12 z jego receptorem (oznaczenie RBA), hamowanie indukowanej IL-12 proliferacji ludzkich komórek blastycznych stymulowanych PHA (oznaczenie PHA), hamowanie indukowanego IL-12 wytwarzania interferonu gamma przez ludzkie komórki blastyczne (oznaczenie IFN gamma). Podsumowanie szybkości dysocjacji i/lub wartości IC50 uzyskanych w oznaczeniach neutralizacji dla klonów z losowymi podstawieniami w CDR3 łańcucha ciężkiego, od 70-1 do 7013, przedstawiono w Tabeli 2 (patrz Załączn ik A). Klon 70-1 wykazywał lepszą szybkość koff niż macierzysty klon Joe9 i najniższą wartość IC50 wynoszącą 2,0 x 10-7 M. Dlatego też, klon 70-1 wybrano do przekształcania w pełną IgG1.
Mutanty CDR3 łańcucha lekkiego selekcjonowano stosując 1 nM biotynylowaną IL-12, i przemywano PBS zawierającą wolny p40 w stężeniu 7 nM. Klony przeszukiwano w oznaczeniu ELISA fagów i te, które wiązały się z IL-12, testowano w badaniach kinetyki wiązania z zastosowaniem BIAcore, wykorzystując chipy z IL-12 o niskiej gęstości. Klony, które wykazywały poprawę pod względem
PL 218 748 B1 szybkości dysocjacji, testowano stosując oznaczenia neutralizacji, w których mierzono albo hamowanie wiązania receptora IL-12, albo hamowanie proliferacji ludzkich komórek blastycznych stymulowanych PHA. Podsumowanie szybkości dysocjacji i/lub wartości IC50 uzyskanych w oznaczeniach neutralizacji dla klonów mutantów CDR3 łańcucha lekkiego, od 78-34 do 79-1, przedstawiono w Tabeli 2 (patrz Załącznik A).
Opierając się na szybkości koff stwierdzono, że klony 78-34 i 78-35 wykazywały poprawione szybkości koff, w porównaniu z macierzystym klonem Joe 9. Oba te klony wybrano do kombinacyjnej analizy z mutantami łańcucha ciężkiego.
C. Klony łączone
Klony mutantów łańcucha lekkiego i ciężkiego, które wykazywały najlepsze właściwości wiązania, stosowano do łączenia i składania scFv. Klony mutantów o poprawionych właściwościach siły łączono przez PCR dzięki zachodzącym na siebie wydłużeniom i przeciągnięciu zmutowanych odcinków VH i VL, jak opisano powyżej. Klony od 101-14 do 26-1, przedstawione w Tabeli 2 (patrz Załącznik A), utworzono w wyniku łączenia mutantów łańcucha ciężkiego (70-2, 70-13 i 70-1) i mutantów łańcucha lekkiego (78-34, 78-35 i 79-1). Szybkości koff i wartości IC50 uzyskane w oznaczeniach neutralizacji dla tych klonów przedstawiono w Tabeli 2.
W wyniku analizy wiązania z zastosowaniem BIAcore, zidentyfikowano klon 101-11, otrzymany w wyniku łączenia klonu mutanta CDR3 łańcucha ciężkiego 70-1 z klonem mutanta CDR3 łańcucha lekkiego 78-34, jako wykazujący szybkość dysocjacji wynoszącą 0,0045 s-1. Ta szybkość koff była znacząco poprawiona w porównaniu z szybkościami koff albo dla klonu mutanta
CDR3 łańcucha ciężkiego 70-1 (0,0134 s-1, albo dla klonu mutanta CDR3 łańcucha lekkiego 78-34 -1 (0,0164 s-1). Ponadto, klon 101-11 wykazywał znaczącą poprawę w oznaczeniach neutralizacji. Zgodnie z tym, klon 101-11 wybrano do dojrzewania pod względem powinowactwa, jak opisano poniżej.
D. Dojrzewanie pod względem powinowactwa klonu 101-11
Dalsze dojrzewanie pod względem powinowactwa klonu 101-11 składało się z powtarzanych cykli mutagenezy przez PCR obydwu CDR, łańcucha ciężkiego i lekkiego, klonu 101-11 z zastosowaniem starterów oligonukleotydowych z losowymi podstawieniami. Klony selekcjonowano na podstawie zmniejszającego się stężenia biotynylowanej IL-12 (bio-IL-12). Właściwości wiązania zmutowanych klonów oceniano przez analizę wiązania z zastosowaniem BIAcore i oznaczenia neutralizacji RBA i PHA. Szybkości koff i/lub wartości IC50 dla klonów od 136-9 do 170-25 przedstawiono w Tabeli 2 (patrz Załącznik A). Klon 103-14 wykazywał poprawioną IC50 w obydwu oznaczeniach, wiązania receptora i proliferacji komórek blastycznych pod wpływem PHA. Klon 103-14 wykazywał również niską szybkość koff, a zatem wybrano go do dalszego dojrzewania pod względem powinowactwa.
E. Tworzenie i selekcjonowanie losowych bibliotek CDR3 łańcucha lekkiego klonu 103-14
Do CDR3 łańcucha lekkiego klonu 103-14 (QSYDRGFTGSMV (SEQ ID NO: 590)) systematycznie poddawano losowym zmianom w 3 odcinkach z zastosowaniem różnych bibliotek, jak przedstawiono poniżej, gdzie X jest kodowany przez losowy kodon o sekwencji NNS, w której N jest dowolnym nukleotydem, a S jest albo deoksycytozyną, albo deoksyguanidyną.
L3.1 = XXXXXXFTGSMV (SEQ ID NO: 591)
L3.2 = QSYXXXXXXSMV (SEQ ID NO: 592)
L3.3 = QSYDRGXXXXXX (SEQ ID NO: 593)
Przeprowadzono losową mutagenezę wszystkich trzech CDR łańcucha lekkiego (określanych jako L3.1, L3.2 i L3.3) klonu 103-14. CDR3 łańcucha ciężkiego (określanego jako H3) klonu 103-14 nie poddawano mutacji. Skonstruowano cztery losowe biblioteki W oparciu o klon 103-14 (H3 i L3.1, L3.2 oraz L3.3) i poddano selekcji w bardzo różnych warunkach, które obejmowały stosowanie ograniczającego stężenia antygenu oraz obecności i nieobecności nadmiaru wolnego antygenu (p40 i p70). Klony otrzymane w wyniku selekcji (od 73-B1 do 99-G11) przeszukiwano przede wszystkim przez analizę zastosowaniem BIAcore, a okazyjnie RBA, i przedstawiono je w Tabeli 2 (patrz Załącznik A).
W wyniku losowej mutagenezy CDR łańcucha lekkiego 103-14 utworzono klon Y61, który wykazywał znaczącą poprawę pod względem wartości IC50 w porównaniu z macierzystym klonem 103-14. Y61 wybrano do przekształcenia w pełną IgG1. Pełna IgG1 Y61 wykazywała wartość IC50 w przybliżeniu 130 pM, określoną w oznaczeniu PHA. Na wartość IC50 nie wpływał 50-krotny molowy
PL 218 748 B1 namiar wolnego p40, co wskazuje, że wolne p40 nie reaguje krzyżowo z przeciwciałem Y61 przeciw IL-12 i dzięki temu nie obniża wiązania przeciwciała z heterodimerem. Pełną sekwencję regionu zmiennego łańcucha ciężkiego i regionu zmiennego łańcucha lekkiego Y61 przedstawiono poniżej.
Sekwencja peptydowa regionu zmiennego łańcucha ciężkiego Y61
CDR H1
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASFTFS SYGMH WVRQAPGKGLEWVA CDR H2
FIRYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCKT
CDR H3
HGSHDN WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 23)
Sekwencja peptydowa regionu zmiennego łańcucha lekkiego Y61 CDR L1
QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISC SGGRSNIGSNTVK WYQQLPGTAPKLLIY
CDR L2
GNDQRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYC CDR L3
QSYDRGTHPALL FGTGTKVTVLG (SEQ ID NO: 24)
Reszty CDR oznaczono zgodnie z numeracją Kabata.
P r z y k ł a d 2: Mutacja Y61 w pozycjach kontaktu i hipermutacji
Typową selekcję zrekombinowanych przeciwciał o poprawionym powinowactwie przeprowadzano stosując metody prezentacji przez fagi. Przeprowadza się ją przez poddawanie losowym mutacjom łączonych reszt CDR w celu utworzenia dużych bibliotek zawierających jednołańcuchowe przeciwciała o różnych sekwencjach. Zazwyczaj, przeciwciała o poprawionym powinowactwie selekcjonuje się w oparciu o ich zdolność do osiągania równowagi w reakcji przeciwciało-antygen. Jednakże, jeśli scFV Y61 poddawano ekspresji na powierzchni fagów i inkubowano go z IL-12, nie znaleziono warunków selekcji, które umożliwiałyby osiągnięcie przez układ normalnej równowagi reakcji przeciwciało-antygen. Kompleks scFV-fag pozostaje związany z IL-12, przypuszczalnie z powodu niespecyficznego oddziaływania, ponieważ oczyszczony scFv Y61 wykazuje normalną kinetykę dysocjacji. Ponieważ wobec Y61 nie można było zastosować zwykłych metod dojrzewania pod względem powinowactwa w układzie prezentacji przez fagi (tj. tworzenia biblioteki i selekcji przez mutagenezę wielu reszt CDR), opracowano nową strategię, zgodnie z którą poddawano mutacjom pojedyncze pozycje CDR.
Strategia ta obejmuje selekcję odpowiednich pozycji CDR do mutacji i opiera się na identyfikacji i selekcji aminokwasów, które są korzystnymi pozycjami selektywnej mutagenezy, pozycjami kontaktu i/lub pozycjami hipermutacji. Pozycje kontaktu definiuje się jako reszty, dla których istnieje wysokie prawdopodobieństwo kontaktu z antygenem, wtedy gdy antygen oddziałuje z przeciwciałem, podczas gdy pozycje hipermutacji definiuje się jako reszty uważane za wykazujące wysokie prawdopodobieństwo hipermutacji somatycznej podczas dojrzewania przeciwciała pod względem powinowactwa in vivo. Korzystnymi pozycjami mutagenezy selektywnej są pozycje CDR, które są zarówno pozycjami kontaktu i hipermutacji. Przeciwciało Y61 zoptymalizowano już w regionach CDR3 stosując procedurę opisaną w Przykładzie 1, dlatego też trudno by go było dalej poprawiać w regionie, który jest położony w centrum miejsca wiązania przeciwciała z zastosowaniem metod selekcji w układzie prezentacji przez fagi. Większą poprawę aktywności uzyskano przez poddawanie mutacji potencjalnych pozycji kontaktu położonych poza regionami CDR3 przez albo usuwanie niekorzystnej pozycji kontaktu antygen-przeciwciało, albo tworzenie technikami inżynierii genetycznej nowej pozycji kontaktu.
Reszty aminokwasowe Y61, które uważano za punkty kontaktu z antygenem, oraz te pozycje CDR, które są miejscami hipermutacji somatycznych podczas dojrzewania pod względem powinowactwa, przedstawiono w Tabeli 3 (patrz Załącznik A). Dla celów dojrzewania Y61 pod względem powinowactwa, do mutagenezy przez PCR wybrano 15 reszt poza CDR3, 3 reszty w obrębie pętli L3 i 5 reszt w obrębie pętli H3.
PL 218 748 B1
Gen scFV Y61 sklonowane do mutagenezy w wektorze plazmidowym pUC119(Sfi). Zaprojektowano i zsyntetyzowano oligonukleotydy stosując losowe kodony w celu zmutowania każdej wybranej pozycji. Po mutagenezie przez PCR zsekwencjonowano niewielką liczbę klonów (~24) i przeprowadzano ich ekspresję w komórkach gospodarzach, na przykład, bakteryjnych, drożdżowych lub ssaczych komórkach gospodarzach. Uzyskane w wyniku ekspresji przeciwciało oczyszczano i mierzono jego koff stosując układ BIAcore. Klony o poprawionej szybkości dysocjacji w porównaniu z Y61, testowano następnie w oznaczeniach neutralizacji. Procedurę tę powtarzano dla innych pozycji CDR. Pojedyncze mutacje dla których wykazano, że zapewniają poprawę aktywności neutralizacji, łączono w celu utworzenia przeciwciała o jeszcze większej sile neutralizacji.
Pozycje CDR Y61, które poddawano mutacji w celu poprawienia siły neutralizacji, i odpowiadające podstawienia aminokwasowe w każdej pozycji, przedstawiono na Figurach 2A-2H. Podano szybkości dysocjacji określone przez analizę z zastosowaniem BIAcore. Te szybkości dysocjacji przedstawiono również na histogramach po prawej strony każdej tabeli.
Wyniki podstawień w pozycjach H30, H32, H33, H50, H53, H54, H58, H95, H97, H101, L50, L92, L93, wykazały, że wszystkie podstawienia aminokwasowe dały w rezultacie przeciwciała o gorszych szybkościach dysocjacji niż Y61. W pozycjach H52, L32 i L50, stwierdzono tylko jedno podstawienie aminokwasowe, które poprawiło szybkość dysocjacji, wszystkie inne zmiany niekorzystnie wpłynęły na aktywność. Dla L50, ta pojedyncza zmiana Gly > Tyr znacząco (5-10 razy) poprawiła siłę neutralizacji Y61. Wyniki wykazały ważną rolę tych pozycji dla aktywności Y61 i sugerowały, że w większości przypadków zastosowanie podejścia prezentacji przez fagi pozwoliło na wyselekcjonowanie optymalnych reszt. Jednakże, w pozycjach H31, H56, L30 i L94 stwierdzono kilka podstawień, które poprawiają szybkość dysocjacji Y61, co sugeruje, że te pozycje są również ważne dla wiązania antygenu, chociaż podejście z zastosowaniem prezentacji przez fagi nie umożliwiło selekcji optymalnych reszt.
W wyniku selektywnych mutacji pozycji kontaktu i hipermutacji Y61, zidentyfikowano resztę aminokwasową L50 w CDR2 łańcucha lekkiego i resztę L94 CDR3 łańcucha lekkiego, które poprawiają zdolność neutralizacji Y61. Połączenie tych mutacji pozwoliło uzyskać efekt addytywny, utworzenie przeciwciała, J695, które wykazuje znaczący wzrost pod względem zdolności neutralizacji. Pełną sekwencję regionów zmiennych łańcuchów ciężkiego i lekkiego J695 przedstawiono poniżej.
Sekwencja peptydowa regionu zmiennego łańcucha ciężkiego J695 CDR H1
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFS SYGMH WVRQAPGKGLEWVA
CDR H2
FIRYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCKT
CDR H3
HGSHDN WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 31)
Sekwencja peptydowa regionu zmiennego łańcucha lekkiego J695 CDR L1
QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISC SGSRSNIGSNTVK WYQQLPGTAPKLLIY
CDR L2
YNDQRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYC CDR L3
QSYDRYTHPALL FGTGTKVTVLG (SEQ ID NO: 32).
Reszty CDR oznaczono zgodnie z numeracją Kabata.
Podsumowanie przyporządkowań sekwencji regionu zmiennego łańcucha ciężkiego i lekkiego, przedstawiające rozwój linii klonów, które przeszły drogę od Joe9 do J695, przedstawiono na Figurach 1A-1D. Numeracja CDR i reszt jest zgodna z numeracją Kabata.
P r z y k ł a d 3: Funkcjonalna aktywność przeciwciał przeciw hIL-12.
W celu sprawdzenia funkcjonalnej aktywności ludzkich przeciwciał przeciw ludzkiej IL-12 według wynalazku, przeciwciała stosowano w kilku oznaczeniach, w których mierzono zdolność przeciwciała do hamowania aktywności IL-12.
PL 218 748 B1
A. Przygotowywanie ludzkich komórek limfoblastycznych aktywowanych PHA
Ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) wyizolowano z frakcji leukocytów zebranej od zdrowego dawcy przez wirowanie w gradiencie Ficoll-Hypaque w ciągu 45 minut przy 1500 obrotów na minutę, jak opisano w Current Protocols in Immunology, rozdział 7.1. PMBC na granicy wodnego roztworu krwi i podłoża do rozdzielania limfocytów zebrano i przemyto trzy razy solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) przez wirowanie w ciągu 15 minut przy 1500 obrotów na minutę w celu usunięcia cząstek Ficoll-Paque.
Następnie aktywowano PBMC w celu utworzenia komórek Iimfoblastycznych, jak opisano w Current Protocols in Immunology, rozdział 6.16. Przemyte PBMC ponownie zawieszono w ilości 0,5-1 x 106 komórek/ml w kompletnym podłożu RPMI (podłoże RPMI 1640, 10% płodowa surowica bydlęca (FBS), 100 U/ml penicyliny, 100 pg/ml streptomycyny), uzupełnionym o 0,2% (v/v) PHA-P (difco, Detroit, MI) i hodowano w ciągu czterech dni w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Po czterech dniach, hodowle komórek rozcieńczano 1:1 objętościowo w kompletnym podłożu RPMI plus 0,2% (v/v) PHA-P i 50 U/ml zrekombinowanej ludzkiej IL-2. Zrekombinowaną ludzką IL-2 wytworzono przez transfekcję i ekspresję wektora zawierającego cDNA ludzkiej IL-2 w komórkach COS (patrz Kaufman i in., (1991) Nucleic Acids Res. 19, 4484-4490) i oczyszczono w sposób opisany w PCT/US96/01382. Hodowle komórek inkubowano następnie w ciągu dodatkowych od jednego do trzech dni. Zbierano komórki blastyczne aktywowane PHA, przemywano dwa razy kompletnym podłożem RPMI i zamrażano w 95% FBS, 5% EMSO przy gęstości 10 x 106 komórek/ml.
Komórki blastyczne aktywowane PHA do stosowania w oznaczeniu wiązania receptora IL-12 zebrano po jednym dniu hodowli w obecności IL-2, podczas gdy komórki blastyczne aktywowane PHA do stosowania w oznaczeniu proliferacji komórek blastycznych pod wpływem PHA (patrz część C) i oznaczeniu indukcji interferonu gamma (patrz część D) zebrano po trzech dniach hodowli w obecności IL-2.
B. Oznaczenie wiązania receptora IL-12
Zdolność przeciwciał przeciw IL-12 do hamowania wiązania znakowanej promieniotwórczo IL-12 z receptorami IL-12 z zastosowaniem komórek blastycznych aktywowanych PHA analizowano w następujący sposób. Różne stężenia przeciwciała przeciw IL-12 inkubowano wstępnie w ciągu
125 godziny w temperaturze 37°C z 50 - 100 pM i 125I-hIL-12 (wyznakowaną jodem hIL-12 przygotowano stosując metodę znakowania Boltona-Huntera, firmy NEN- Dupont, do aktywności właściwej wynoszącej 20-40 mCi/mg) w buforze do wiązania (RPMI 1640, 5% FBS, 25 mM Hepes pH 7,4). Komórki blastyczne aktywowane PHA, wyizolowane jak opisano powyżej, przemywano jeden raz i ponownie zawieszano w buforze do wiązania, do uzyskania gęstości komórek wynoszącej 2 x 107 komórek/ml.
Komórki blastyczne aktywowane PHA (1 x 106 komórek) dodawano do mieszaniny przeciwciało
125
- 125I-hIL-12 i inkubowano w ciągu dwóch godzin w temperaturze pokojowej. Związane komórki wyka125 zujące promieniotwórczość oddzielano od wolnej 125I-hIL-12 przez wirowanie oznaczanej mieszaniny w ciągu 30 sekund w temperaturze pokojowej, odsysanie płynu i przemywanie 0,1 ml buforu do wiązania, a następnie wirowanie w temperaturze 4°C w ciągu 4 minut przy 10 000 x g. Osad komórek sprawdzano pod względem promieniotwórczości związanych komórek stosując licznik promieniowania gamma. Całkowite wiązanie określano przy braku przeciwciała, a niespecyficzne wiązanie określano przez wprowadzenie do oznaczenia 25 nM nieznakowanej IL-12. Inkubacje prowadzono w dwóch powtórzeniach.
W oznaczeniu wiązania receptora IL-12, w którym stosowano ludzkie przeciwciała przeciw
IL-12, Y61 i J695, oba przeciwciała wykazywały porównywalne hamownie wiązania receptora IL-12.
Y61 hamowało wiązanie receptora IL-12 z wartością IC50 wynoszącą w przybliżeniu 1,6 x 10-11 M, -11 podczas gdy J695 wykazywało wartość IC50 wynoszącą w przybliżeniu 1,1 x 10-11 M.
C. Oznaczenie proliferacji ludzkich komórek blastycznych pod wpływem PHA
Przeciwciał przeciw IL-12 oceniano pod względem ich zdolności do hamowania proliferacji komórek blastycznych pod wpływem PHA (która to proliferacja jest stymulowana przez IL-12). Szereg kolejnych rozcieńczeń przeciwciała przeciw IL-12 inkubowano wstępnie w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO2, z 230 pg/ml hIL-12 w 100 ml kompletnego podłoża RPMI w płytce do mikromiareczkowania (z dnem w kształcie litery U, 96-studzie nkowa, Costar, Cambridge, MA). Komórki blastyczne aktywowane PHA wyizolowane jak opisano powyżej, przemywano jeden raz i ponownie zawieszano w kompletnym podłożu RPMI do uzyskania gęstości komórek wynoszącej
3 x 105 komórek/ml. Komórki blastyczne aktywowane PHA (100 ml, 3 x 104 komórek) dodawano do
PL 218 748 B1 mieszaniny przeciwciało/hlL-12, inkubowano w ciągu 3 dni w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO2, i znakowano w ciągu 4 - 6 godzin (3H)-tymidyną w ilości odpowiadającej 0,5 mCi/studzienkę (Amersham, Arlington, Heights, IL). Zawartość hodowli zbierano na sączki z włókna szklanego, stosu3 jąc aparat do zbierania komórek (Tomtee, Orange, CT), i mierzono ilość (3R)-tymidyny włączonej do komórkowego DNA stosując cieczowy licznik scyntylacyjny. Wszystkie próbki oznaczano w dwóch powtórzeniach.
Wyniki neutralizacji w obecności różnych stężeń p70:p40 (tj. stosunku heterodimeru IL-12 do wolnej podjednostki p40) przedstawiono w Tabeli 4 (patrz Załącznik A).
Analiza ludzkiego przeciwciała Y61 przeciw IL-12 w oznaczeniu proliferacji komórek blastycznych pod wpływem PHA wykazała, że przeciwciało hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem PHA, z wartością IC50 wynoszącą w przybliżeniu 1,8 x 10-10 M, w obecności samego p70 IL-12, bez jakiegokolwiek nadmiaru p40 (stosunek p70:p40 równy 1:0). W obecności 50-krotnego nadmiaru wolnego p40 (stosunek p70:p40 równy 1:50), przeciwciało Y61 hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem PHA z wartością IC50 wynoszącą w przybliżeniu 1,8 x 10-10 M. Wynik ten wskazuje, że zdolność Y61 do hamowania proliferacji komórek blastycznych nie ulega zakłócaniu pod wpływem obecności nadmiaru p40.
Ludzkie przeciwciało przeciw IL-12, J695, hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem PHA, z wartością IC50 wynoszącą w przybliżeniu 1,0 x 10-11 M, w obecności p70 i p40 w stosunku 1:0. W obecności p70 i p40 w stosunku 1:50, przeciwciało to hamuje proliferację komórek blastycz-12 nych pod wpływem PHA z wartością IC50 wynoszącą w przybliżeniu 5,8 ± 2,8 x 10-12 M (n = 2), co wykazuje, że nadmiar p40 wywiera tylko słaby wpływ hamujący na przeciwciało. Wszystkie wyniki wykazują poprawę aktywności neutralizacji J695 w porównaniu z Y61 w wyniku mutacji w pozycjach L50 i L94.
D. Oznaczenie indukcji interferonu gamma
Zdolność przeciwciał przeciw IL-12 do hamowania wytwarzania IFNy przez komórki blastyczne aktywowane PHA (które to wytwarzanie stymulowane jest przez IL-12) analizowano w następujący sposób. Różne stężenia przeciwciała przeciw IL-12 inkubowano wstępnie w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO2, z 200 - 400 pg/ml hIL-12 w 100 ml kompletnego podłoża RPMI w płytce do mikromiareczkowania (z dnem w kształcie litery U, 96studzienkowa, Costar). Komórki blastyczne aktywowane PHA, wyizolowane jak opisano powyżej, przemywano jeden raz i ponownie zawieszano w kompletnym podłożu RPMI do uzyskania gęstości komórek wynoszącej 1 x 107 komórek/ml. Komórki blastyczne aktywowane PHA (100 μl zawierające 1 x 106 komórek) dodano do mieszaniny przeciwciało/hIL-12 i inkubowano w ciągu 18 godzin w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO2. Po inkubacji, z każdej studzienki pobierano 150 μl supernatantu wolnego od komórek i mierzono poziom wytworzonego ludzkiego IFNy, stosując ELISA (Endogen Interferon gamma ELISA, Endogen, Cambridge, MA). Każdy supernatant oznaczano w dwóch powtórzeniach.
Analiza ludzkiego przeciwciała przeciw hIL-12. Y61, w tym oznaczeniu wykazała, że Y61 hamu-10 je wytwarzanie ludzkiego IFNy z wartością IC50 wynoszącą w przybliżeniu 1,6 x 10' M, podczas gdy ludzkie przeciwciało przeciw IL-12, J695, hamuje wytwarzanie ludzkiego IFNv z wartością IC50 wyno-12 szącą w przybliżeniu 5,0 ± 2,3 x 10-12 M (n = 3). Wynik wykazuje znaczącą poprawę powinowactwa J695 w wyniku modyfikacji w pozycjach L50 i L94.
E. Indukcja IL-12 gatunków innych niż człowiek w wyizolowanych PBMC
W celu sprawdzenia reaktywności krzyżowej ludzkich przeciwciał przeciw IL-12 z IL-12 pochodzącą od innych gatunków, inną niż ludzka IL-12 wytwarzano w następujący sposób. PBMC oddzielono ze świeżej, traktowanej heparyną krwi przez wirowanie w gradiencie gęstości, jak opisano powyżej, stosując Lymphoprep (Nycomed, Oslo, Norwegia) w przypadku PBMC makaka jawajskiego, pawiana i psa, Accu-paque (Accurate Chemicals & Sci. Corp., Westbury, NY) w przypadku PBMC psa lub Lympholyterat (Accurate Chemicals & Sci. Corp., Westbury, NY) w przypadku PBMC szczura.
Wytwarzanie IL-12 przez PBMC indukowano następnie w opisany sposób (D'Andrea i in., (1992) J. Exp. Med. 176, 1387-1398, Villinger i in., (1995) J. Immunol. 155, 3946-3954, Buettner i in., (1998) Cytokine 10, 241-248). Przemyte PBMC ponownie zawieszano, w ilości 1 x 106 komórek/ml, w kompletnym podłożu RPMI uzupełnionym o 0,0075% (wagowo/objętościowo) SAC (Pansorbin; Calbiochem-Behring Co., La Jolla, lub 1 - 5 mg/ml ConA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) i 0,0075% SAC oraz inkubowano w ciągu 18 godzin w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO2.
PL 218 748 B1
Podłoże wolne od komórek i wolne od SAC zbierano przez wirowanie i sączenie przez sączki o średnicy porów 0,2 mm.
IL-12 z makaka rezusa otrzymano jako zrekombinowaną IL-12 rezusa od Emory University School of Medicine, Atlanta, GA.
F. Oznaczenie proliferacji mysich komórek 2D6
Mysi klon komórek T 2D6 proliferuje w odpowiedzi na mysią IL-12, IL-4, IL-7 i IL-12 (Maruo i in., (1997) J. Leukocyte Biol. 61, 346-352). Znaczącą proliferację wykryto również w odpowiedzi na supernatanty szczurzych PBMC, zawierających szczurzą IL-12. Komórki nie odpowiadały na IL-12 psa, makaka jawajskiego, pawiana lub człowieka. Mysie komórki 2D6 namnażano w kompletnym podłożu RPMI uzupełnionym o 50 mM beta-merkaptoetanol (βΜΕ) i 30 ng/ml mysiej IL-12. Jeden dzień przed oznaczeniem, mysią IL-12 odmywano i komórki inkubowano przez noc w kompletnym podłożu RRMI plus βΜΕ.
Szereg kolejnych rozcieńczeń przeciwciała przeciw IL-12 inkubowano wstępnie w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO2, z 40 pg/ml mysiej IL-12 w 100 ml kompletnego podłoża RPMI w płytce do mikromiareczkowania (z dnem w kształcie litery U, 96-studzienkowa, Costar). Komórki 2D6 przemywano jeden raz i ponownie zawieszano w kompletnym 5 podłożu RPMI zawierającym βΜΕ, do uzyskania gęstości komórek wynoszącej 1 x 105 komórek/ml. Komórki 2D6 (100 pi, 1 x 104 komórek) dodawano do mieszaniny przeciwciało/hIL-12, inkubowano w ciągu 3 dni w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO2, i znakowano w ciągu 4 - 6 godzin (3H)-tymidyną w ilości odpowiadającej 0,5 mCi/studzienkę (Amersham, Ariington, Heights, IL). Zawartość hodowli zbierano i promieniotwórczość mierzono stosując licznik scyntylacyjny. Wszystkie próbki oznaczano w dwóch powtórzeniach.
G. Międzygatunkowa reaktywność krzyżowa J695 z IL-12 inną niż iudzka
Międzygatunkową reaktywność krzyżową J695 z IL-12 inną niż ludzka analizowano stosując
PBMC wyizolowane z kliku gatunków innych niż człowiek. Obecność aktywności IL-12 innej niż iudzka w supernatantach PBMC szczura, psa, makaka jawajskiego i pawiana potwierdzano stosując kilka oznaczeń biologicznych opisanych powyżej, takich jak oznaczenie proliferaji mysich komórek 2D6, oznaczenie proliferacji ludzkich komórek blastycznych pod wpływem PHA i oznaczenie indukcji interferonu gamma przez biokowanie odpowiedzi indukowanych PBMC innych niż ludzkie, króliczymi i/lub owczymi przeciwciałami poliklonalnymi przeciw mysiej i/lub ludzkiej IL-12. Reaktywność krzyżową ludzkich przeciwciał przeciw hIL-12, Y61 i J695, wobec innej niż ludzka IL-12 w supernatantach PBMC bądź oczyszczonej IL-12 myszy iub makaka rezusa oceniano następnie stosując takie samo(-e) oznaczenie(-a) biologiczne, przez określanie stężenia przeciwciała J695, przy którym obserwuje się 50% zahamowanie odpowiedzi. Wyniki międzygatunkowej reaktywności krzyżowej podsumowano w Tabeli 5. Wyniki wskazują, że Y61 i J695 są zdolne do rozpoznawania IL-12 małp (np. IL-12 makaka jawajskiego i makaka rezusa w przypadku Y61 oraz makaka jawajskiego, makaka rezusa i pawiana w przypadku J695); oraz że J695 jest w przybliżeniu 35-krotnie mniej aktywne wobec IL-12 psa; ani Y61, ani Y695 nie reaguje krzyżowo z mysią lub szczurzą IL-12.
PL 218 748 B1
-I—1 0) 3 Ο
K>t
Ν
Μ
Χζ
-Η
Ο '{« ο
>.
φ φ
Μ a?
Ο xJ
Φ σ»
Μ
Ό α>
Η β
ω ο
(V
Ν ϋ
>η
4J
Ο
Φ α
φ ο
u“>
Π5
Φ
Xł <Ό
Fu
S ο UT Ο | ό 73 a ο ja m' .2 3 *—1 | Oczyszczona | O 55 <o X | O O X O- | Cł O 55 o »X | |||
IL-12 pawia- na | Supematant PBMC | o Ó X o. ci | o 55 | |||||
IL-12 makaka rezusa | Oczyszczona | 1,0x10’10 | O O X o | Ó Γ-Ή X O | ||||
IL-12 makaka jawajskiego | Supematant PBMC | O ł O X CM | o 55 C4 ci | o 4 | ||||
IL-12 psa | Supematant PBMC | ........................................... | ó x on <x | |||||
IL-12 szczura | Supematant PBMC | O ó 3 kO | nie neutralizujące | |||||
IL-12 myszy | Oczyszczona | O 55 o rn | CS ó X | κζ tS 1 s •2 w fi δ | nie neutralizujące | |||
Przeciwciało | Specyficzność | cM *““< . 2 •zi P 3 N & o 3 N O « | amuIL12 królika | ahuIL12 myszy | ahuIL12 człowieka | ahu!L12 i człowieka | ||
Nazwa | C17.15 | R03B03 | C8.6.2 | I9A | on Os kO *-s |
PL 218 748 B1
Η. Specyficzność J695 wobec cytokin ludzkich
Specyficzność J695 testowano we współzawodniczym oznaczeniu ELISA, w którym zestaw ludzkich cytokin testowano pod względem ich zdolności do zakłócania wiązania rozpuszczalnego J695 z immobilizowaną ludzką IL-12. Zestaw ludzkich cytokin obejmujący IL-1a i IL-1 β (Genzyme, Boston, IL-2 (Endogen), IL-4, IL-10, IL-17, IFN-gamma i TGF-βΙ (R&D, Minneapolis, MN), IL-8 (Calbiochem), PDGF, IGF-I i IGF-II (Boehringer Mannheim Corp. Indianapolis, IN), ΤFNα i limfotoksynę, IL-6, rozpuszczalny receptor IL-6, IL-11, p70 IL-12, p40 IL-12, M-CSF oraz LIF, EBI-3, białko związane z p40 IL-12, które indukowane jest przez zakażenie wirusem Epsteina-Barr w limfocytach B (Devergne i in., (1996) J. Virol. 70, 1143-1153) poddawano ekspresji w postaci chimer z Fc ludzkiej IgG (EBI3/Fc). Testowano również jednoniciowy DNA spermy łososia (Sigma).
Płytki do mikromiareczkowania przez oznaczenie immunologiczne ELISA z płaskodennymi studzienkami (96-studzienkowe, o wysokiej zdolności wiązania, Costar) opłaszczano przez noc w temperaturze 4°C 0,1 ml ludzkiej IL-12 (2 pg/ml w 0,1 M buforze węglanowym do powlekania (4 objętości 0,1 M NaHCO3 i 8,5 objętości 0,1 M NaHCO3). Płytki przemywano dwa razy PBS zawierającą 0,05% Tween 20 (PBS-T), blokowano stosując 200 μl albuminy surowicy bydlęcej (BSA, Sigma) w stężeniu 1 mg/ml w PBS-T w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej, i ponownie dwukrotnie przemywano PBS-T. Dodawano próbki (100 μθ zawierające przeciwciało przeciw IL-12 J695 (100 ng/ml) i każdą cytokinę (2 nM) w PBS-T zawierającej 50 μ^ BSA (PBS- T/BSA), i inkubowano w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej. Płytki przemywano cztery razy i inkubowano w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej ze 100 μl kompleksu mysie przeciwciało przeciw ludzkiemu łańcuchowi Iambda-HRP (1:500 w PBS-T/BSA, Southern Biotech. Ass. Inc., Birmingham, AL). Płytki przemywano 4 razy i wywoływano stosując ABTS (Kirkegaard & Perry Lab., Gaithersburg, MD) w ciągu 20 - 30 minut w ciemności. OD450 nm odczytywano stosując czytnik do mikropłytek (Molecular Devices, Menlo Park, CA). Procent wiązania określano w stosunku do wiązania J695 z IL-12 opłaszczającą płytki przy nieobecności jakiejkolwiek rozpuszczalnej cytokiny.
Wyniki wskazują, że wiązanie J695 z immobilizowaną ludzką IL-12 było blokowane tylko przez p70 ludzkiej IL-12, w mniejszym stopniu przez p40 ludzkiej IL-12, i nie było blokowane przez żadną z innych testowanych cytokin.
I. Wiązanie z nową cząsteczką IL-12
Opisano alternatywny heterodimer IL-12, w którym podjednostkę p35 zastępuje nowa cząsteczka p19. P19 zidentyfikowano stosując wyszukiwanie homologii przestrzennej przedstawicieli rodziny IL-6/IL-12, i jest ono syntetyzowane przez aktywowane komórki dendrytyczne. P19 wiąże się z p40, tworząc dimer 19/p40, który wykazuje aktywność podobną do IL-12, ale nie jest tak silny jak heterodimer p35/p40 pod względem indukcji IFNy. Oczekuje się, że przeciwciała, które rozpoznają tylko p40, ale preferencyjnie w kontekście cząsteczki p70 (np. J695 i Y61, Przykład 3H), neutralizować będą zarówno cząsteczki p35/p40, jak i cząsteczki p19/p40.
P r z y k ł a d 4: Aktywność in vivo przeciwciał przeciw hIL-12
Wpływy in vivo przeciwciał przeciw IL-12 na odpowiedzi indukowane przez IL-12 sprawdzano stosując model zmodyfikowany w stosunku do modelu używanego przez Bree i in., w celu zbadania wpływu ludzkiej IL-12 na komórki krwi obwodowej makaka jawajskiego; Bree i in., (1994) Biochem. Biophys. Res. Comm. 204: 1150-1157. W tych wcześniejszych badaniach, podawanie ludzkiej IL-12 w ilości 1 pg/kg/dzień w ciągu 5 dni spowodowało, po 24 godzinach, obniżenie liczby krwinek białych (WBC), szczególnie z grup limfocytów i monocytów. Obniżenie liczby płytek krwi obserwowano w 72 godzinie. Poziomy neopteryny w osoczu, markera aktywacji monocytów w odpowiedzi na IFN-γ, zaczynały podwyższać się w 24 godzinie i były najwyższe w 72 godzinie.
W pierwszym badaniu z ludzkimi przeciwciałami przeciw hIL-12, piętnastu zdrowym makakom jawajskim o średniej wadze 5 kg podano leki uspakajające i podzielono je na 5 grup (n = 3). Grupa 1 otrzymała dożylnie (IV) 10 mg/kg ludzkiej immunoglobuliny dożylnej (IVIG, Miles, Eckhart, IN, oczyszczonej z zastosowaniem białka A-Sepharose). Grupa 2 otrzymała dożylnie 1 mg/kg C8.6.2 (neutralizujące mysie przeciwciało monoklonalne przeciw ludzkiej IL-12). Grupa 3 otrzymała dożylnie 10 mg/kg CS.6.2. Grupa 4 otrzymała dożylnie 1 mg/kg Y61 (ludzkie przeciwciało przeciw ludzkiej IL-12, oczyszczone z kondycjonowanego podłoża z hodowli komórek CHO). Grupa 5 otrzymała dożylnie 10 mg/kg Y61.
Jedną godzinę po podaniu przeciwciała wszystkie zwierzęta otrzymały pojedynczą podskórną (SC) iniekcję ludzkiej IL-12 (1 μg/kg). Pobrano próbki krwi w następujących punktach czasowych: początkowo, 8, 24, 48, 96 i 216 godzin, i analizowano je pod względem całkowitej liczby komórek krwi, różnicując je, oraz chemicznego składu surowicy. Mierzono również poziomy ludzkiej IL-12, przeciwPL 218 748 B1 ciała C8.6.2, przeciwciała Y61, małpiego IFN-gamma, małpiej IL-10, małpiej IL-6 w surowicy i neopteryny w osoczu.
Zwierzęta traktowane IL-12 i kontrolnym przeciwciałem IVIG (Grupa 1) wykazywały wiele oczekiwanych zmian hematologicznych, obejmujących obniżenie liczby WBC, płytek krwi, limfocytów i monocytów. Spadek ten nie był widoczny lub był mniej wyraźny u zwierząt traktowanych albo przeciwciałem C8.6.2, albo przeciwciałem Y61 w ilości 1 lub 10 mg/kg (grupy 2 - 5).
Próbki surowicy lub osocza anaiizowano w oznaczeniu ELISA specyficznym wobec małpiego IFN-gamma i małpiej IL-10 (Biosource Internationai, Camariiio, CA), małpiej IL-6 (Endogen) i neopteryny osocza (ICN Pharmaceuticais, Orangeburg, NY). IFN-gamma, IL-10 iub IL-6 nie wykryto u żadnego ze zwierząt traktowanych IL-12, włącznie ze zwierzętami kontrolnymi, traktowanymi IL-12 i IVIG. Prawdopodobnie przyczyną tego był niski poziom ekspozycji na IL-12 (tylko 1 dawka równa 1 pg/kg). Nie mniej jednak, poziomy neopteryny osocza wzrosły około trzykrotnie u zwierząt traktowanych IL-12 i IVIG, ale nie zmieniły się u wszystkich zwierząt traktowanych C8.6.2 lub Y61, włącznie ze zwierzętami traktowanymi niższą dawką Y61 (1 mg/kg), co wskazuje, że Y61 było skuteczne in vivo pod względem blokowania tej czułej odpowiedzi na IL-12.
W drugim badaniu, u makaków jawajskich sprawdzano aktywność in vivo i właściwości farmakodynamiczne (PD) J695, podając egzogenną rhIL-12 i określając, czy J695 może blokować lub zmniejszać odpowiedzi normalnie związane z podawaniem rhIL-12. Samcom makaków jawajskich (n = 3 na grupę) podawano pojedyncze dawki, wynoszące 0,05, 0,2 iub 1,0 mg/kg J695 iub 1 mg/kg immunoglobuliny dożylnej (IVIG), jako dożylne iniekcje (IV) bolusa do żyły odpiszczelowej lub iniekcje podskórne (SC) do skóry na grzbiecie. Jedną godzinę po podaniu J695 lub IVIG, wszystkie zwierzęta otrzymały pojedynczą podskórną (SC) iniekcję rhIL-12 w dawce 1 pg/kg do skóry na grzbiecie. Próbki krwi pobierano z żyły udowej do 28 dnia po podaniu J695. Z każdej próbki krwi uzyskiwano surowicę i oznaczano ją, stosując ELISA, pod względem IL-12, J695, IFN-γ i przeciwciał przeciw J695. Neopterynę oznaczano przez wysokosprawną chromatografię cieczową w odwróconym układzie faz.
Poziomy neopteryny, normalizowane w odniesieniu do poziomów neopteryny mierzonych przed podawaniem J695 iub rhiL-12, przedstawiono na Figurze 3. W celu porównania supresji poziomów neopteryny pomiędzy dwoma grupami, dla każdego zwierzęcia obliczano pole powierzchni pod krzywą (AUC) normalizowaną wobec poziomów neopteryny (Tabela 6). Ekspozycja na neopterynę (AUC) była hamowana w sposób zależny od dawki o w przybliżeniu od 71 do 93% w grupach, które otrzymały iniekcje dożylne, i o od 71 do 100% w grupach, które otrzymały iniekcje podskórne, w stosunku do grupy kontrolnej, która otrzymała IVIG. Wyniki te sugerują, że dawka J695 konieczna do 50% zahamowania odpowiedzi neopteryny (ED50) była mniejsza niż 0,05 mg/kg, kiedy podawano je albo dożylnie, albo podskórnie.
T a b e i a 6: Zależne od dawki hamowanie przez J695 neopteryny indukowanej IL-12 u makaków jawajskich
Droga dawkowania IVIG iub J695 i rhIL-12 | Dawka J695 (mg/kg) | Dawka IVIG (mg/kg) | AUC normalizowanych poziomów neopteryny | % obniżenia AUC neopteryny w porównaniu z kontrolą |
Pojedyncza iniekcja IV, a następnie 1 godzinę później ludzka IL-12 podana SC w dawce 1 pg/kg | - | 1,0 | 1745±845 | 0 |
0,05 | - | 502 ±135 | 71,3 | |
0,2 | - | 199 ± 316 | 88,6 | |
1,0 | - | 128 + 292 | 92,7 | |
Pojedyncza iniekcja SC, a następnie 1 godzinę później ludzka IL-12 podana SC w dawce 1 pg/kg | - | 1,0 | 1480±604 | 0 |
0,05 | - | 426 ±108 | 71,2 | |
0,2 | - | 395 ± 45,9 | 73,3 | |
1,0 | - | 0 ± 109 | 100 |
Traktowanie J695 również zapobiegało lub zmniejszało zmiany hematologicznie, zazwyczaj związane z podawaniem rhlL-12 (ieukopenia i trombocytopenia). W 24 godzinie po podawaniu rhIL-12, liczba limfocytów zmniejszyła się w przybliżeniu o 50% w porównaniu z wartościami podstawowymi w grupach kontrolnych, które otrzymały dożylnie i podskórnie IVIG. Podawanie J695, albo podskórnie, albo dożylnie, na wszystkich trzech poziomach dawek, zapobiegało temu
PL 218 748 B1 zmniejszeniu, w wyniku czego liczba limfocytów w 24 godzinie była w przybliżeniu taka sama, jak wartości podstawowe. W 48 godzinie po podaniu IL-12, liczba płytek krwi w grupach traktowanych dożylnie i podskórnie IVIG zmniejszyła się w przybliżeniu o 25% w porównaniu z wartościami podstawowymi.
Przykładowy schemat dawkowania, mający na celu utrzymanie poziomów w surowicy powyżej 90% poziomu wpływu powinien obejmować 1 mg/kg podawany dożylnie i podskórnie w przybliżeniu co drugi tydzień lub 0,3 mg/kg podawane w przybliżeniu co tydzień, zakładając niewielką akumulację podczas powtarzania dawkowania. To badanie wykazuje, że przeciwciało to można bezpiecznie podawać małpom w takich dawkach. W niezależnych badaniach toksyczności stwierdzono ponadto, że przeciwciało można bezpiecznie podawać małpom w dawkach do 100 mg/kg.
J695 było również skuteczne w zapobieganiu wytwarzania IFN-γ u myszy traktowanych chimeryczną IL-12, cząsteczką, w której połączono mysią podjednostkę p35 z podjednostką p40 ludzkiej IL-12. W przeciwieństwie do ludzkiej IL-12, która jest biologicznie nieaktywna u myszy, ta chimeryczna IL-12 zachowuje funkcje biologiczne u myszy, włącznie z indukowaniem IFN-γ. Dodatkowo, ludzka podjednostką p40 umożliwia wiązanie i neutralizację cząsteczki przez J695. Chimeryczną IL-12, w dawce 0,05 mg/kg, podawano dootrzewnowo samicom myszy C3H/HeJ (10/grupę doświadczalną) w pięciu dziennych dawkach, podawanych w dniach 0, 1, 2, 3 i 4. J695 podawano dootrzewno w dniach 0, 2 i 4, w dawkach 0,05, 0,01, 0,002, 0,0004, 0,00008 i 0,000016 mg/kg, 30 minut przed iniekcją IL-12. Kontrolną huIgGty podawano dootrzewnowo, w dawce 0,05 mg/kg, w dniach 0, 2 i 4. Myszom pobierano krew piątego dnia i oznaczono poziomy IFN-γ stosując ELISA. Wyniki wykazały, że J695 powoduje zależne od dawki hamowanie w ytwarzania IFN-γ, z ED50 wynoszącym w przybliżeniu 0,001 mg/kg. Łącznie, wyniki te wykazują, że J695 jest silnym inhibitorem aktywności IL-12 in vivo.
P r z y k ł a d 5: Analiza kinetyczna wiązania ludzkich przeciwciał ze zrekombinowaną ludzką IL-12 (rhIL-12)
Oddziaływania wiązania w czasie rzeczywistym pomiędzy wychwyconym ligandem (ludzkie przeciwciało przeciw rhIL-12 J695, wychwycone na macierzy biosensora) i substancją analizowaną (rhIL-12 w roztworze) mierzono przez powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) z zastosowaniem układu BIAcore (Biacore AB, Uppsala, Szwecja). Układ ten wykorzystuje optyczne właściwości SPR do wykrywania zmian w stężeniu białka w dekstranowej macierzy biosensora. Białka, w znanych stężeniach, są kowalencyjnie związane z macierzą dekstranową. Przeciwciała wstrzykuje się do macierzy dekstranowej i specyficzne wiązanie pomiędzy wstrzykniętymi przeciwciałami i zimmobilizowanym ligandem powoduje wzrost stężenia białek w macierzy oraz, w wyniku, zmianę sygnału SPR. Te zmiany sygnału SPR rejestruje się jako jednostki rezonansowe (RU) i wykreśla wobec czasu na osi y sensogramu.
W celu ułatwienia immobilizacji kozich przeciwciał przeciw ludzkiej IgG (Southern Biotechnology Associates, nr kat. 2040-01, Birmingham, AL) na macierzy biosensora, kozie przeciwciało przeciw ludzkiej IgG wiąże się kowalencyjnie z wolnymi grupami aminowymi macierzy dekstranowej, najpierw aktywując grupy karboksylowe macierzy 100 N-hydroksysukcynoimidem (NHS) i 400 mM chlorowodorkiem N-etylo-N'-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC). Następnie wstrzykuje się przez aktywowaną macierz kozie przeciwciało przeciw ludzkiej IgG. Trzydzieści pięć mikrolitrów koziego przeciwciała przeciw ludzkiej IgG (25 pl/ml), rozcieńczonego octanem sodu, pH 4,5, wstrzykuje się przez aktywowany biosensor i wolne grupy aminowe białka wiążą się bezpośrednio ze zaktywowanymi grupami karboksylowymi. Estry ECD macierzy, które nie uległy reakcji, inaktywuje się przez iniekcję 1M etanoloaminy. Standardowe zestawy do sprzęgania grup aminowych są dostępne w handlu (Biacore AB, nr kat. BR-1000-50, Uppsala, Szwecja).
J695 rozcieńczano buforem roboczym HBS (Biacore AB, nr kat. BR-1001-88, Uppsala, Szwecja) w celu wychwycenia na macierzy za pośrednictwem koziego przeciwciała przeciw ludzkiej IgG. W celu określenia zdolności przeciwciał specyficznych wobec rhIL-12 do wiązania ze zimmobilizowanymi kozimi przeciwciałami przeciw ludzkiej IgG, przeprowadzono oznaczenie wiązania w następujący sposób. Próbki J695 (25 μg/ml; próbki objętości 25 μθ wstrzykiwano przez macierz dekstranową ze sprzęgniętym kozim przeciwciałem poliklonalnym przeciw ludzkiej IgG, z natężeniem przepływu 5 pl/min. Przed wstrzykiwaniem białka i bezpośrednio po nim, przez każdą komorę przepływową przepuszczano sam bufor HBS. Różnicę netto sygnału pomiędzy linią podstawową i punktem odpowiadającym w przybliżeniu 30 sekundom po zakończeniu wstrzykiPL 218 748 B1 wania J695 przyjęto za odpowiadającą ilości IgG1 związanej J695 przybliżeniu 1200 RU). Mierzono bezpośrednie wiązanie przeciwciała specyficznego wobec rhIL-12 z rozpuszczalną rhIL-12. W buforze HBS rozcieńczano cytokiny i próbki o objętości 50 μl wstrzykiwano przez macierz ze zimmobilizowanym białkiem, z natężeniem przepływu 5 pl/minutę. Stosowano następujące stężenia rhlL-12: 10, 20, 25, 40, 50, 80, 100, 150 i 200 nM. Przed wstrzykiwaniem rhIL-12 i bezpośrednio po nim, przez każdą komorę przepływową przepuszczano sam bufor HBS. Różnicę netto sygnału pomiędzy linią podstawową i sygnałem po zakończeniu wstrzykiwania cytokiny przyjęto za odpowiadającą wartości wiązania określonej próbki. Macierze biosensora regenerowano przed wstrzykiwaniem następnej próbki stosując 100 mM HCl. W celu określenia stałej dysocjacji (szybkości dysocjacji) i stałej wiązania (szybkości wiązania) stosowano oprogramowanie do analizy kinetycznej BIAcore (wersja 2.1).
Reprezentatywne wyniki wiązania pochodzącego z CHO J695 z rhIL-12, w porównaniu z J695 pochodzącym z COS, przedstawiono w Tabeli 7.
T a b e l a 7: Wiązanie J695 pochodzącego z CHO lub COS z rhIL-12
Źródło | rhIL-12, nM | rhIL-12 związana, RU | Przeciwciało związane, RU | rhIL12/AB |
CHO | 200 | 1112 | 1613 | 1,48 |
CHO | 150 | 1033 | 1525 | 1,45 |
CHO | 100 | 994 | 1490 | 1,43 |
CHO | 80 | 955 | 1457 | 1,40 |
CHO | 50 | 912 | 1434 | 1,36 |
CHO | 40 | 877 | 1413 | 1,33 |
CHO | 25 | 818 | 1398 | 1,25 |
CHO | 20 | 773 | 1382 | 1,20 |
CHO | 10 | 627 | 1371 | 0,98 |
COS | 200 | 1172 | 1690 | 1,49 |
COS | 150 | 1084 | 1586 | 1,46 |
COS | 100 | 1024 | 1524 | 1,44 |
COS | 80 | 985 | 1489 | 1,42 |
COS | 50 | 932 | 1457 | 1,37 |
COS | 40 | 894 | 1431 | 1,34 |
COS | 25 | 833 | 1409 | 1,27 |
COS | 20 | 783 | 1394 | 1,20 |
COS | 10 | 642 | 1377 | 1,00 |
Molekularne oddziaływania kinetyczne pomiędzy wychwyconym J695 i rozpuszczoną rhIL-12 analizowano ilościowo stosując technikę z wykorzystaniem BIAcore. Przeprowadzono kilka niezależnych doświadczeń i analizowano wyniki w celu otrzymania kinetycznych stałych szybkości stosując dostępne oprogramowanie do analizy matematycznej BIAcore, jak przedstawiono w Tabeli 8.
T a b e l a 8: Pozorne szybkości kinetyczne i stałe powinowactwa J695 wobec rhIL-12
Przeciwciało | Źródło | Średnia szybkość wiązania (M-1s-1) | Średnia szybkość dysocjacji (s-1) | Średnia Kd (M) | |
J695 | CHO | 3,52E + 05 | 4,72E - 05 | 1,35E - 10 | |
J695 | COS | 3,40E + 05 | 2,61E - 05 | 9,74E - 11 |
PL 218 748 B1
Wystąpiła niewielka różnica pomiędzy obliczoną pozorną stałą (Kd) dla oddziaływań pomiędzy η 1 przeciwciałem J695 pochodzącym z CHO (Kd = 1,34-10 M-1 a J695 pochodzącym z COS (Kd = 9,74 x -11 -1
10-11 M-1). Pozorną stałą dysocjacji (Kd) pomiędzy J695 i rHIL-12 oceniano na podstawie obserwowanych stałych szybkości ze wzoru Kd = szybkość dysocjacji / szybkość wiązania.
W celu określenia pozornej stałej szybkości wiązania i dysocjacji dla oddziaływań pomiędzy J695 i rhIL-12, przeprowadzono kilka reakcji wiązania, stosując stałą ilość J695 (2 μg/ml) i różne stężenia rhIL-12. Sensogramy oddziaływań wiązania w czasie rzeczywistym pomiędzy wychwyconym J695 i rozpuszczalną rhIL-12 wykazały, że obie postacie przeciwciała były bardzo podobne pod względem obu faz, wiązania i dysocjacji.
W celu dalszej oceny zdolności wychwyconego przeciwciała monoklonalnego IgG1 J695 do wiązania rozpuszczalnej zrekombinowanej cytokiny, wykorzystano bezpośrednią metodę z zastosowaniem BIAcore. W metodzie tej, kozie przeciwciało przeciw ludzkiej IgG (25 pg/ml) sprzęgnięte z grupami karboksymetylowymi powierzchni sensora dekstranowego opłaszczano IgG1 J695 (2 μg/ml), a następnie dodawano zrekombinowaną cytokinę. Kiedy rozpuszczalną rhIL-12 wstrzykiwano przez powierzchnię biosensora z wychwyconą IgG1 J695, pochodzącą z CHO lub COS, wielkość sygnału wzrastała, gdy wzrastało stężenie cytokiny w roztworze. Nie obserwowano żadnego wiązania z rmIL-12 (R & D Systems, nr kat. 419-ML, Minneapolis. MN) lub rhIL-12 w żadnym z testowanych stężeń, aż do 1000 nM. Wyniki te potwierdzają wniosek, że przeciwciała IgG1 J695 rozpoznają odmienne determinanty na rhIL-12.
Tabela 9 pokazuje wyniki doświadczenia z zastosowaniem BIAcore w celu wykazania, że ludzkie przeciwciało monoklonalne IgG1 J695 wiąże się tylko z rozpuszczalną rhIL-12, a nie z żadną inną zrekombinowaną cytokiną.
T a b e l a 9: Mapowanie epitopu J695 z wykorzystaniem techniki BIAcore
Wychwycony ligand J695 COS | Wychwycony ligand J695 CHO | |
Rozpuszczalna substancja analizowana | ||
rekombinowana ludzka IL-12 | wynik dodatni | wynik dodatni |
rekombinowana mysia IL-12 | wynik ujemny | wynik ujemny |
P r z y k ł a d 6: Dalsze badania nad powinowactwem J695 wobec IL-12
Molekularne oddziaływania kinetyczne pomiędzy przeciwciałem J695 a ludzką IL-12 analizowano ilościowo stosując technikę rezonansu plazmonowego z wykorzystaniem BIAcore, i otrzymano kinetyczne pozorne stałe szybkości.
Do pomiaru wiązania rozpuszczalnej rhIL-12 z wychwyconym na fazie stałej J695 wykorzystano technikę BIAcore. Kozie przeciwciało przeciw ludzkiej IgG immobilizowano na chipach biosensora, a następnie wstrzykiwano i wychwycono na powierzchni stałą ilość J695. Stosowano różne stężenia rhIL-12, i mierzono, w funkcji czasu, wiązanie z J695 IL-12 w różnych stężeniach. Obliczano pozorne stałe szybkości dysocjacji i wiązania, zakładając kinetykę dysocjacji rzędu zerowego i kinetykę wiązania pierwszego rzędu, jak również proste oddziaływania w stosunku 1:1 pomiędzy J695 i IL-12. Przeprowadzono trzy niezależne doświadczenia i wartości przedstawiono jako średnie z tych trzech doświadczeń. Na podstawie tych pomiarów uzyskano pozorne stałe szybkości dysocjacji (kd) i wiązania (ka) i zastosowano je do obliczenia wartości Kd dla oddziaływań (patrz Tabela 10). Wyniki wskazują, że J695 zawiera wysokie powinowactwo do rhIL-12.
T a b e l a 10: Parametry kinetyczne oddziaływań pomiędzy J695 i ludzką IL-12
Parametr kinetyczny | Wartość |
kd | 3,71 ± 0,40 x 10'5s'1 |
ka | 3,81 ± 0,48 x 105 M1s1 |
Kd | 9,74 x 10'11 M (14 ng/ml) |
P r z y k ł a d 7: Cechy charakterystyczne i aktywność neutralizująca C17.15, szczurzego przeciwciała monoklonalnego przeciw mysiej interleukinie-12
W celu oszacowania znaczenia badań dotyczących traktowania IL-12 w mysich modelach chorób zapalnych i autoimmunologicznych z zastosowaniem przeciwciał monoklonalnych specyficznych
PL 218 748 B1 wobec mysiej IL-12 dla podobnych podejść w chorobach ludzi, badano oddziaływania C17.15, szczurzego przeciwciała monokionainego przeciw mysiej IL-12 z IL-12 myszy. Oceniano zdolność C17.15 do neutralizowania aktywności mysiej IL-12 w oznaczeniu proliferacji komórek blastycznych pod wpływem PHA i blokowania wiązania mysiej IL-12 z receptorami na powierzchni komórek, jak również kinetykę oddziaływań wiązania C17.15 - mysia IL-12.
W oznaczeniu proliferacji ludzkich komórek blastycznych pod wpływem PHA (patrz Przykład 3), szereg kolejnych rozcieńczeń C17.15 lub szczurzej IgG2a (przeciwciało kontrolne) inkubowano wstępnie z 230 pg/mi mysiej IL-12 w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C. Do mieszanin przeciwciało
- IL-12 dodawano komórki blastyczne stymulowane PHA i inkubowano w ciągu 3 dni w temperaturze 3
37°C. Następnie komórki znakowano w ciągu 6 godzin [3H]-tymidyną w stężeniu 1 pCi/studzienkę.
3
HodowIe zebrano i mierzono włączanie [3H]-tymidyny. Tło niespecyficznej proliferacji mierzono przy braku dodanej mysiej IL-12. Wszystkie próbki oznaczano w dwóch powtórzeniach. Stwierdzono, że
IC50 (M) C17.15 wobec zrekombinowanej mysiej IL-12 w tym oznaczeniu wynosiło 1,4 x 10-11; dia po-12 równania wartość IC50 obserwowana dia J695 wobec iudzkiej IL-12 wynosiła 5,8 x 10-12 w tych samych warunkach (patrz Tabeia 11).
T a b e i a 11: Porównanie właściwości przeciwciała monoklonalnego przeciw ludzkiej IL-12, J695 i szczurzego przeciwciała monoklonalnego przeciw IL-12 myszy, C17.15
Przeciw- ciało | Epitop | Oznaczenie oddziaływań biomoiekuiarnych | Oznaczenie wiązania z receptorem | Oznaczenie komórek biastycznych aktywowanych PHA | ||
ka, szybkość wiązania (M -1 s-1) | kd, szybkość dysocjacji | Kd (M) | IC50 (M) | IC50 (M) | ||
J695 | P40 Hu | 3,81 x 105 | 3,71 x 10'5 | 9,74 x 10'11 | 1,1 x 10'11 | 5,8 x 10'12 |
C17.15 | P40 Mu | 3,80 x 105 | 1,84 x 10'4 | 4,80 x 10'10 | 1,5 x 10'10 | 1,4 x 10'11 |
Mierzono również zdolność C17.15 do hamowania wiązania mysiej IL-12 z receptorami komórkowymi. Szereg kolejnych rozcieńczeń C17.15 inkubowano wstępnie w ciągu 1 godziny
125 w temperaturze 37°C z 100 pM [125I]-mysiej IL-12 w buforze do wiązania. Do mieszaniny przeciwciało/[125I]-mysia IL-12 dodawano komórki 2D6 (2 x 106) i inkubowano w ciągu 2 godzin w tempe125 raturze pokojowej. Komórki wykazujące promieniotwórczość oddzielono od wolnej -[125I]-IL-12, i określano pozostającą promieniotwórczość związaną z komórkami. Całkowite wiązanie znakowanej mysiej IL-12 z receptorami na komórkach 2D6 określano w nieobecności przeciwciała, a niespecyficzne wiązanie określano przez wprowadzenie do oznaczenia 25 nM nieznakowanej mysiej IL-12. Specyficzne wiązanie obliczano jako całkowite wiązanie minus wiązanie niespecyficzne. Inkubacje przeprowadzono w dwóch powtórzeniach. Wyniki wykazały, że C17.15 zawiera IC50 równą 1,5 x 10-10 dla hamowania wiązania mysiej IL-12 z receptorami komórkowymi.
Powinowactwo C17.15 wobec rekombinowanej mysiej IL-12 oceniano przez analizę oddziaływań biomolekularnych. Kozie przeciwciało przeciw IgG szczura immobilizowano na chipach biosensora, a następnie wstrzykiwano stałą ilość przeciwciała C17.15, uzyskując wychwycenie C17.15 na powierzchni chipa. Wobec powierzchni z C17.15 stosowano różne stężenia zrekombinowanej mysiej IL-12 i mierzono wiązanie mysiej IL-12 ze zimmobiiizowanym C17.15 w funkcji czasu. Obliczano pozorne stałe szybkości dysocjacji i wiązania, zakładając kinetykę dysocjacji rzędu zerowego i kinetykę wiązania pierwszego rzędu, jak również proste oddziaływania molekuiarne w stosunku 1:1 pomiędzy immobilizowanym C17.15 a mysią IL-12. Na podstawie tych pomiarów uzyskano pozorne stałe szybkości dysocjacji (kd, szybkość dysocjacji) i wiązania (ka, szybkość wiązania). Wyniki te zastosowano do obliczania wartości Kd dla oddziaływań. Dla oddziaływań zrekombinowana mysia IL-12 - C17.15 obserwowano szybkość wiązania równą c ή ή /14 ΊΑ
3,8 x 105 M-1s-1, szybkość dysocjacji równą 1,84 x 10-4s-1 i Kd równą 4,8 x 10-10.
Obserwowane aktywności C17.15 neutralizowania aktywności mysiej IL-12 i wiązania z receptorami na powierzchni komórek, jak również kinetyki wiązania C17.15 z mysią IL-12, skoreiowane są z podobnymi pomiarami dla oddziaływań J695 - rhIL-12. Wskazuje to, że sposób działania szczurzego przeciwciała przeciw mysiej IL-12, C17.15, i przeciwciała przeciw ludzkiej IL-12 jest prawie identyczny, w oparciu o szybkość wiązania, szybkość dysocjacji, Kd, IC50 i oznaczeniu komórek blastycznych aktywowanych PHA. Dlatego też, C17.15 stosowano jako przeciwciało
PL 218 748 B1 homologiczne do J695 w mysich modelach chorób zapalnych i autoimmunologicznych do badania wpływu blokowania IL-12 na inicjację i rozwój choroby w tych modelach zwierzęcych (patrz Przykład 8).
P r z y k ł a d 8: Leczenie chorób o podłożu autoimmunologicznym lub zapalnym u myszy przez podawanie przeciwciała przeciw mysiej a-IL-12
A. Hamowanie indukowanego kolagenem zapalenia stawów u myszy przez przeciwciało C17.15 przeciw a-IL-12.
Wykazano korelację pomiędzy poziomami IL-12 a reumatoidalnym zapaleniem stawów (RA). Na przykład, wykryto podwyższone poziomy p70 IL-12 w mazi stawowej pacjentów z RA w porównaniu ze zdrowymi pacjentami kontrolnymi (Morita i in. (1998) Arthritis and Rheumatism. 41: 306314). Dlatego też, oznaczano zdolność C17.15, szczurzego przeciwciała przeciw mysiej IL-12 do hamowania indukowanego kolagenem zapalenia stawów.
Samce myszy DBA/1 (10/grupę) immunizowano kolagenem typu II w dniu 0 i traktowano dootrzewnowo C17.15, lub kontrolną szczurzą IgG, w ilości 10 mg/kg co drugi dzień od dnia -1 (1 dzień przed immunizacją kolagenem) do dnia 12. Zwierzęta monitorowano klinicznie pod kątem rozwijania się zapalenia stawów w łapach do dnia 90. Zapalenie stawów oceniano: 0 - stan normalny; 1 - zapalenie stawów zlokalizowane w jednym stawie; 2 - zajęty więcej niż jeden staw, ale nie cała łapa; 3 - zajęta cała łapa; 4 - deformacja łapy; 5 - zesztywnienie zajętych stawów. Ocena zapalenia stawów myszy była sumą ocen zapalenia stawów dla każdej pojedynczej łapy myszy (maksymalnie = 20). Wyniki wyrażono jako średnią ± SEM w każdej grupie.
Wyniki, jak przedstawiono na Figurze 4, wskazują, że oceny zapalenia stawów można było dokonywać u myszy traktowanych C17.15 tylko po 50 dniu od leczenia i że maksimum średniej oceny zapalenia stawów otrzymanej dla myszy leczonych C17.15 było co najmniej 5-krotnie niższe od tego zmierzonego dla myszy traktowanych IgG. Wskazuje to, że szczurze przeciwciało przeciw mysiej IL-12, C17.15, zapobiega rozwojowi indukowanego kolagenem zapalenia stawów u myszy.
B. Hamowanie zapalenia okrężnicy u myszy przez szczurze przeciwciało przeciw mysiej a-IL-12, C17.15
Wykazano również, że IL-12 odgrywa rolę w rozwoju/patologii zapalenia okrężnicy. Na przykład, wykazano, że przeciwciała przeciw IL-12 hamują chorobę w mysich modelach zapalenia okrężnicy, np. indukowanym TNBS zapaleniu okrężnicy u myszy z usuniętym genem IL-2 myszy (Simpson i in. (1998) J. Exp. Med. 187 (8): 1225-34). Podobnie, wykazano, że przeciwciała przeciw IL-2 hamują powstawanie zapalenia okężnicy u myszy z usuniętym genem IL-10. Zdolność szczurzego przeciwciała przeciw IL-12 myszy, C17.15, do hamowania indukowanego TNBS zapalenia okrężnicy u myszy oceniano w dwóch badaniach (Davidson i in. (1998) J. Immunol. 161 (6): 3143-9).
W pierwszym badaniu, zapalenie okrężnicy indukowano u wolnych od patogenów myszy SJL przez podanie, za pomocą pediatrycznego cewnika do tętnicy pępk owej, 150 pl 50% roztworu etanolu zawierającego 2,0 TNBS do odbytnicy. Zwierzęta kontrolne traktowano tylko 150 pl 50% roztworu etanolu. Pojedyncze dawki, 0,75, 0,5, 0,25 lub 0,1 mg C17.15 lub 0,75 kontrolnej szczurzej IgG2a, podawano dożylnie do żyły ogonowej w 11 dniu i efekt terapeutyczny oceniano przez ważenie zwierząt w nich 11 i 17 oraz ocenę histologiczną w dniu 17. Waga myszy traktowanych C17.15 wzrastała w ciągu 48 godzin od traktowania przeciwciałem i normalizowała się 6 dnia po traktowaniu. Efekt traktowania C17.15 potwierdzano histologicznie. Ponadto, dokonywano również oceny wydzielania IFN-γ przez komórki T CD4+ ze śledziony i okrężnicy traktowanych myszy, jak również poziomy IL-12 w makrofagach pochodzących ze śledziony i okrężnicy traktowanych myszy (patrz Tabela 12).
W drugim badaniu, dawkowanie zoptymalizowano i myszy traktowano stosując dawkę całkowitą wynoszącą 0,1 mg lub 0,5 mg C17.15 lub 0,1 mg kontrolnej IgG2a, odpowiednio, podzieloną pomiędzy dni 12 a 14. Stwierdzono, że podawanie C17.15 w pojedynczej dawce wynoszącej 0,1 mg/mysz lub 0,25 mg/mysz prowadzi do tylko częściowej poprawy pod względem indukowanego TNBS zapalenia okrężnicy i nie powoduje znaczącego zmniejszania wytwarzania IFN-γ przez komórki T CD4+ in vitro, ale powoduje znaczące zmniejszenie wydzielania IL-12, w porównaniu z nietraktowanymi kontrolami. Odpowiedź obserwowano przy pojedynczej dawce wynoszącej 0,5 mg/mysz lub większej. Biorąc najniższą dawkę przeciwciała i podając ją w dwóch oddzielnych iniekcjach (w dniach 12 i 14), poprawiono schemat dawkowania, co wskazuje, że wielokrotne małe dawki mogą być bardziej skuteczne niż pojedyncza duża dawka. Uzyskane dane przedstawiono w Tabeli 12.
PL 218 748 B1
T a b e l a 12: Przeciwciało monoklonalne przeciw mysiej IL-12, C17.15, hamuje ustalone zapalenie okrężnicy u myszy
Dzień indukcji choroby, 0 | 11 dzień traktowania | Waga (g) | IFN-γ komórek CD4+ śledziony (U/ml) | IL-12 makrofagów śledziony (pg/ml) | |
Dzień 11 | Dzień 17 | ||||
TNBS + etanol | Kontrolna IgG2a 0,75 mg | 16,0 | 15,26 | 3326 | 300 |
TNBS + etanol | C17.15 0,75 mg | 16,0 | 20,21 | 1732 | 0 |
TNBS + etanol | C17.15 0,5 mg | 16,36 | 19,94 | 1723 | 0 |
TNBS + etanol | C17.15 0,25 mg | 16,28 | 17,7 | 3618 | 7 |
TNBS + etanol | C17.15 0,1 mg | 16,2 | 17,98 | 3489 | 22 |
Etanol, kontrola | - | 20,76 | 21,16 | 1135 | 0 |
Podawanie przeciw IL-12 przeciwciała monoklonalnego C17.15 w dawce podzielonej na dwie części, podawane w odstępie jednego dnia, wynoszącej w sumie 0,1 mg/mysz lub 0,05 mg/mysz prowadziło do całkowitego odwrócenia zapalenia okrężnicy, jak oceniano przez wyniszczenie i makroskopowy wygląd okrężnicy. Ponadto, ten schemat dawkowania prowadził do znaczącego zmniejszenia wytwarzania IFN-γ przez komórki T blaszek właściwych i wytwarzania IL-12 przez makrofagi, tak że to ostatnie było porównywalne z poziomami widocznymi u kontrolnych myszy traktowanych etanolem, bez indukowanego TNBS zapalenia okrężnicy. A zatem, podawanie C17.15 w mysich modelach indukowanego TNBS zapalenia okrężnicy odwracało rozwój choroby w sposób zależny od dawki.
C. Hamowanie doświadczalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) u myszy przez przeciwciała przeciw a-IL-12
Powszechnie uważa się, że IL-12 odgrywa rolę w patogenezie stwardnienia rozsianego (MS). Wykazano, że podlegający indukcji mRNA p40 IL-12 ulega ekspresji w blaszkach u pacjentów z ostrym MS, ale nie w niedokrwiennych uszkodzeniach mózgu na tle zapalnym (Winhagen, A. i in. (1995) J. Exp. Med. 182: 1985-1996). Komórki T od pacjentów z MS (ale nie kontrolne komórki T) stymulują wytwarzanie IL-12 przez komórki prezentujące antygen dzięki nie podlegającej regulacji ekspresji CD40L (Balashov, K. E. i in. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 599-603). Pacjenci z MS wykazują wzmocnione wydzielanie IFN-γ, które może być blokowane przez przeciwciała przeciw a-IL-12 in vitro (Balashov, Κ. Ε. i in. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 599-603). Wykryto podwyższone poziomy IL-12 w surowicy u pacjentów z MS, ale nie w przypadku innych chorób neurologicznych (Nicoletti, F. i in. (1996) J. Neuroimmunol. 70: 87-90). Wykazano, że podwyższone wytwarzanie IL-12 skorelowane jest z intensywnością choroby u pacjentów z MS (Cormabella, M. i in. (1998) J. Clin. Invest. 102: 671-678). Badano rolę IL-12 w patogenezie mysiego modelu stwardnienia rozsianego, doświadczalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) (Leonard, J.P. i in. (1995) J. Exp. Med. 181: 281-386; Banerjee, S. i In. (1998) Arthritis Rheum. (1998) 41: S33; i Segal, B.M. i in. (1998) J. Exp. Med. 187: 537-546). Wiadomo, że choroba w tym modelu indukowana jest przez podgrupę TH1 komórek T. Dlatego też, oceniano zdolność przeciwciał przeciw a-IL12 do zapobiegania powstawaniu ostrego EAE.
Stwierdzono, że przeciwciało przeciw a-IL-12 jest zdolne do hamowania powstawania ostrego EAE, hamowania choroby po rozpoczęciu i zmniejszania stopnia ciężkości nawrotów u myszy immunizowanych autoantygenem, zasadowym białkiem mielinowym (Banerjee, S. i in. (1998) Arthritis Rheum. (1998) 41: S33). Korzystne efekty traktowania przeciwciałem przeciw a-IL-12 u myszy utrzymywały się w ciągu dwóch miesięcy po zakończeniu leczenia. Wykazano również, że przeciwciała przeciw IL-12 hamują chorobę u myszy, które były biorcami powodujących zapalenie mózgu komórek T przez transfer adoptywny (Leonard, J.P. i in. (1995) J. Exp. Med. 181: 281-386).
P r z y k ł a d 9: Farmakologia kliniczna J695
W podwójnie zaślepionym badaniu krzyżowym, 64 zdrowych mężczyzn otrzymywało wzrastające dawki J695 lub placebo. Pomiar fragmentu dopełniacza C3a przed podaniem dawki i 0,25 godziny później nie wykazał aktywacji układu dopełniacza. Poziomy CPR i fibrynogenu były podniesione tylko u osób, u których obserwowano jednoczesne objawy zakażenia.
PL 218 748 B1
Wszyscy osobnicy przeżyli i ogólna tolerancja J695 była bardzo dobra. W żadnym z przypadków nie przerwano leczenia z powodu zdarzeń niepożądanych (AE). Najczęściej obserwowanymi AE były bóle głowy i zwykłe przeziębienie/zapalenie oskrzeli, z których żadnego nie zakwalifikowano jako ciężkie.
Jedna z badanych osób, 33-letni mężczyzna stanu wolnego, cierpiał na łuszczycę kropelkową na początku badania. Zgodnie z losowym programem badań, osoba ta przypadkowo otrzymała 5 mg/kg J695 przez podanie podskórne. Dziesięć dni przed podaniem przeciwciała, u osoby tej widoczne były tylko niewielkie, mało widoczne grudkowate zmiany na ramionach i nogach. W chwili podawania przeciwciała, u osoby tej występowało zwiększone zaczerwienienie, zgrubienie plam rumieniowych i podwyższona hiperkeratoza. Jeden tydzień po podaniu J695, osoba ta donosiła o poprawie stanu skóry, włącznie ze spłaszczeniem zmian i zmniejszeniem się łuszczenia. Krótko po drugim podaniu J695 (5 mg/kg, dożylnie), skóra tej osoby była zupełnie wolna od zmian łuszczycowych, przy braku jakiegokolwiek leczenia miejscowego. Plamy rumieniowe pokryte białymi łuskami ponownie pojawiły się jednocześnie z oczekiwanym usunięciem J695 z organizmu po drugim podaniu przeciwciała.
P r z y k ł a d 10: Porównanie J695 wytwarzanego przez dwie Iinie komórek CHO
W celu rekombinacyjnej ekspresji J695, zrekombinowany wektor ekspresyjny kodujący zarówno łańcuch ciężki przeciwciała, jak i łańcuch lekki przeciwciała, wprowadzono do komórek CHO dhfr- (Urlaub, G. i Chasin, L.A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220) stosując transfekcję za pośrednictwem fosforanu wapnia. W zrekombinowanym wektorze ekspresyjnym, geny łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego przeciwciała są połączone w sposób umożliwiający działanie z elementami regulującymi sekwencja wzmacniająca/promotor (np. pochodzącymi z SV40, CMV, adenowirusa i podobnych, element regulujący sekwencja wzmacniająca CMV/promotor AdMLP lub element regulujący sekwencja wzmacniająca SV40/promotor AdMLP) do prowadzania transkrypcji genów na wysokich poziomach. Zrekombinowany wektor ekspresyjny zawiera również gen DHFR, który umożliwia selekcję komórek CHO, które zostały stransfekowane wektorem, z zastosowaniem selekcji/amplifikacji metotreksatem.
150 mikrogramów wektora ekspresyjnego kodującego sekwencję peptydową ludzkiego przeciwciała J695 rozpuszczono w 2,7 ml wody w probówce stożkowej o pojemności 50 ml. Dodano 300 μl 2,5 M CaCl2 i tę mieszaninę DNA dodawano kroplami do 3 ml 2 x stężonej soli fizjologicznej buforowanej HEPES w probówce stożkowej o pojemności 50 ml. Po worteksowaniu w ciągu 5 sekund i inkubacji w temperaturze pokojowej w ciągu 20 minut, 1 ml rozmieszczono równo na każdej płytce (nadal w podłożu F12), i płytki inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu 4 godzin. Płyn usunięto przez odessanie i do każdej płytki dodano 2 ml 10% DMSO w F12. Szok DMSO kontynuowano w ciągu 1 minuty, po czym DMSO rozcieńczono przez dodanie do każdej płytki 5 ml PBS. Płytki przemyto dwa razy PBS, a następnie dodano 10 ml alfa MEM, uzupełnionego o H/T i 5% FBS (podłoże selektywne dla komórek, w których ulega ekspresji DHFR) i inkubowano przez noc w temperaturze 37°C. Komórki wysiano do 96-studzienkowych płytek, z gęstością 100 komórek na studzienkę, i płytki inkubowano w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO2, w ciągu dwóch tygodni, stosując jedną zmianę podłoża na tydzień.
Pięć dni po ostatniej zmianie podłoża, supernatanty hodowli rozcieńczono 1:50 i testowano przez oznaczenie ELISA, specyficzne wobec łańcucha gamma ludzkiej IgG. Klony wykazujące najsilniejszy sygnał w ELISA przeniesiono z 96-studzienkowych płytek do 12-studzienkowych płytek z 1,5 ml/studzienkę Alfa MEM + 5% dializowaną surowicą. Po 3 dniach, przeprowadzono kolejne oznaczenie ELISA, specyficzne wobec łańcucha gamma ludzkiej IgG i 12 klonów wykazujących najwyższą aktywność rozdzielono do alfa MEM + 5% dializowana surowica i 20 nM MTX. Linia komórkowa 031898218 rosła w podłożu zawierającym MTX, bez żadnych przypadków śmierci komórek lub zmniejszenia szybkości wzrostu, wytwarzając 1,8 pg/ml hIgG w ciągu oznaczenia trwającego trzy dni. Hodowle T-25 031898218, rosnące w podłożu zawierającym MTX, wytwarzały średnio 11,9 μg/ml J695. Linię, oznaczoną ALP903, wykorzystano do wzrostu w zawiesinie w warunkach wolnych od surowicy, gdzie wytwarzała ona 7,5 pg J695/komórkę/24 godziny.
Komórki ALP903, po początkowej selekcji w podłożu alfa MEM/5% FBS/20 nM MTX, przeniesiono ponownie do 20 mM MTX. Komórki hodowano w warunkach selekcji 100 MTX, a następnie przenoszono do 500 nM MTX dwa razy w ciągu następnych 30 dni. W tym czasie hodowla wytwarzała 32 pg J695/ml/24 godziny. Hodowlę zsubklonowano metodą rozcieńczeń granicznych. Subklon 218-22 wytworzył 16,5 pg/ml w 96-studzienkowej płytce w ciągu 2 dni i 50,3 pg/ml J695 w 12-studzienkowej płytce w ciągu 2 dni. Klon 218-22 hodowano w podłożu alfa MEM/5% dializowana FBS/500 nM MTX w ciągu 38 dni, a następnie stosując hodowlę z wytrząsaniem obrotowym w nieobecności surowicy, jak powyżej. Średnia specyficzna produktywność komórek, oznaczonych 905, w hodowli zawiesinowej wolnej od surowicy wynosiła 58 pg/komórkę/24 godziny.
PL 218 748 B1
Pierwsza linia komórkowa zastosowana do wytwarzania J695 (ALP 903) dała mniejsze ilości przeciwciała z hodowli niż linia druga, ALP 905. W celu upewnienia się, że J695 wytwarzane przez ALP 905 było funkcjonalnie identyczne z tym wytworzonym przez ALP 903, obie szarże przeciwciał oceniano pod względem powinowactwa do IL-12, zdolności do blokowania wiązania IL-12 z receptorami komórkowymi, zdolności do hamowania indukcji IFN-γ przez IL-12 i zdolności do hamowania proliferacji komórek blastycznych pod wpływem PHA, za pośrednictwem IL-12.
Powinowactwa J695, z szarży ALP 903 i ALP 905, wobec IL-12, określano przez pomiar kinetycznych stałych szybkości wiązania z IL-12 z zastosowaniem badań powierzchniowego rezonansu plazmonowego (analizy z zastosowaniem BIAcore). Stałą szybkości dysocjacji (kd) i stałą szybkości wiązania (ka) przeciwciał z szarż ALP 903 i ALP 905 dla wiązania z rhIL-12 określano w trzech doświadczeniach (jak opisano w Przykładzie 3). Powinowactwo, Kd, wiązania z IL-12 obiiczano dzieląc stałą szybkości dysocjacji przez stałą szybkości wiązania. Kd obliczano dla każdego oddzielnego doświadczenia, a następnie liczono średnią. Wyniki wykazały, że określone parametry kinetyczne i powinowactwo wiązania z rhIL-12 były bardzo podobne szarży ALP 903 i ALP905 J695: Obiiczona kd wynosiła 1,19 ± 0,22 x 10-10 M dla szarży ALP 903 i 1,49 ± 0,47 x 10-10 M dia szarży ALP 905 (patrz Tabeia 13).
Oceniano zdolność J695 pochodzącego z obu linii, ALP 903 i ALP 905, do blokowania wiązania rhIL-12 z receptorami IL-12 na iudzkich aktywowanych PHA komórkach limfoblastycznych T (patrz Przykład 3). Każdą próbkę J695 testowano w stężeniu wyjściowym równym 1 x 10-8 z 10-krotnymi kolejnymi rozcieńczeniami. Przeciwciało inkubowano wstępnie w ciągu 1 godziny w temperaturze
125 125
37°C z 50 pM [125I]-iudzkiej IL-12 w buforze do wiązania. Do mieszaniny przeciwciało/[125i]-iudzka IL-12 dodawano aktywowane PHA komórki blastyczne i inkubowano w ciągu 2 godzin w temperaturze
125 pokojowej. Komórki wykazujące promieniotwórczość oddzielano od wolnej [125I]-IL-12 przez etapy wirowania i przemywania, i obliczano % hamowania. Wartości IC50 dla J695 określano na podstawie krzywych hamowania wykorzystując 4-parametryczne dopasowywanie krzywych i potwierdzano w dwóch niezależnych doświadczeniach. Inkubacje prowadzano w dwóch powtórzeniach. Wyniki dla dwóch szarży J695 były bardzo podobne (patrz Tabela 13).
Oceniano zdolność J695, z obu komórek ALP 903 i ALp 905, do hamowania indukowanego rhIL-12 wytwarzania IFN-γ przez ludzkie aktywowane PHA komórki limfoblastyczne in vitro. Kolejne rozcieńczenia J695 inkubowano wstępnie z 200 pg/mi rhIL-12 w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C. Dodano komórki limfoblastyczne aktywowane PHA i inkubowano w ciągu 18 godzin w temperaturze 37°C. Po inkubacji, odciągano supernatant wolny od komórek i określano w nim poziom ludzkiego IFN-γ przez ELISA. Wartości IC50 określone na podstawie krzywych hamowania wykreślono w stosunku do stężenia przeciwciała stosując 4-parametryczne dopasowywanie krzywych. Wyniki wykazały, że zdolność obu szarży do hamowania wytwarzania IFN-γ jest bardzo podobna.
Oznaczenie proliferacji komórek blastycznych pod wpływem PHA in vitro zastosowano do pomiaru zdolności neutralizacji rhIL-12 przez J695 ALP 903 i J695 ALP 905. Kolejne rozcieńczenia J695 każdego inkubowano wstępnie z 230 pg/ml ludzkiej IL-12 w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C.
Następnie dodano komórki blastyczne aktywowane PHA i inkubowano w ciągu 3 dni w temperaturze 3
37°C. Następnie komórki znakowano w ciągu 6 godzin [ H]-tymidyną w ilości ^Ci/studzienkę. Hodowle zbierano i mierzono włączanie [3H]-tymidyny. Proliferację niespecyficzną (tło) mierzono w nieobecności rhIL-12. Stwierdzono, że wartości IC50 dla J695 ALP 903 i J695 ALP 905 były bardzo podobne; przedstawiono je w Tabeli 13.
Aktywność przeciwciał J695 pod względem neutralizowania aktywności rhIL-12, blokowania wiązania IL-12 z receptorami na powierzchni komórek i wiązania z rhIL-12 nie różniła się znacząco dla szarż ALP 903 i ALP 905, a zatem przeciwciała wytwarzane przez te dwa różne typy komórek są równoważne.
T a b e l a 13: Porównanie właściwości szarży J695, ALP 903 i ALP 905
Przeciwciało | ka, szybkość wiązania (M-1, s-1) | kd, szybkość dysocjacji | Kd(M) | Oznaczenie RB IC50 (M) | Oznaczenie komórek biastycznych aktywowanych PHA IC50 (M) | Oznaczenie ΙΡΝ-γ IC50 (M) |
J695 ALP 903 | 3,75 x 105 | 4,46 x 10'5 | 1,19 x 10'10 | 3,4 x 10'11 | 5,5 x 10'12 | 5,8 x 10'12 |
J695 ALP 905 | 3,91 x 105 | 5,59 x 10'5 | 1,49 x 10'10 | 3,0 x 10'11 | 4,4 x 10'12 | 4,3 x 10-12 |
Claims (53)
1. Wyizolowane przeciwciało ludzkie lub jego część wiążąca antygen, które wiąże się z ludz-4 -1 ką IL-12 i dysocjuje od ludzkiej IL-12 ze stałą szybkości koff wynoszącą 1 x 10-4 s-1 lub niższą, oznaczoną metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego, gdzie to przeciwciało hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny w oznaczeniu proliferacji komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny in vitro (oznaczeniu PHA) z IC50 wynoszącym 1 x 10-9 M lub niższym.
2. Wyizolowane przeciwciało ludzkie według zastrz. 1, lub jego część wiążąca antygen, które
-5 -1 dysocjuje od ludzkiej IL-12 ze stałą szybkości koff wynoszącą 1 x 10-5 s-1 lub niższą.
3. Wyizolowane przeciwciało ludzkie według zastrz. 1 lub jego część wiążąca antygen, które wiąże się z ludzką IL-12 i dysocjuje od ludzkiej IL-12 ze stałą Kd wynoszącą 1,34 x 10-10 M lub niższą.
4. Wyizolowane przeciwciało ludzkie według zastrz. 1 lub jego część wiążąca antygen, które wiąże się z ludzką IL-12 i dysocjuje od ludzkiej IL-12 ze stałą Kd wynoszącą 9,74 x 10-11 M lub niższą.
5. Wyizolowane przeciwciało ludzkie według zastrz. 1 lub jego część wiążąca antygen, które zawiera region stały łańcucha ciężkiego IgG1.
6. Wyizolowane przeciwciało ludzkie według zastrz. 1 albo 2 lub jego część wiążąca antygen, które hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny w oznaczeniu PHA in vitro z IC50 wynoszącym 1 x 10-10 M lub niższym.
7. Wyizolowane przeciwciało ludzkie według zastrz. 1 albo 2 lub jego część wiążąca antygen, które hamuje proliferację komórek blastycznych pod wpływem fitohemaglutyniny w oznaczeniu PHA in vitro z IC50 wynoszącym 1 x 10-11 M lub niższym.
8. Wyizolowane przeciwciało ludzkie według zastrz. 1, lub jego część wiążąca antygen, które wykazuje następujące cechy charakterystyczne:
a) zawiera CDR3 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 9;
oraz
b) zawiera CDR3 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 10.
9. Wyizolowane przeciwciało ludzkie według zastrz. 8, lub jego część wiążąca antygen, które ponadto zawiera CDR2 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 11 i zawiera CDR2 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 12.
10. Wyizolowane przeciwciało ludzkie według zastrz. 8, lub jego część wiążąca antygen, które ponadto zawiera CDR1 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 13 i zawiera CDR1 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 14.
11. Wyizolowane przeciwciało ludzkie według zastrz. 8, lub jego część wiążąca antygen, które zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 15 i zawiera region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 16.
12. Wyizolowane przeciwciało ludzkie według zastrz. 1 lub jego część wiążącą antygen, które:
a) zawiera CDR3 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy SEQ ID NO: 404 - SEQ ID NO: 469; oraz
b) zawiera CDR3 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy SEQ ID NO: 534-SEQ ID NO: 579.
13. Wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, według zastrz. 12, które ponadto zawiera CDR2 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy SEQ ID NO: 335 - SEQ ID NO: 403, oraz CDR2 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy SEQ ID NO: 506 - 533.
14. Wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, według zastrz. 12, które ponadto zawiera CDR1 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy SEQ ID NO: 288 - 334, oraz CDR1 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy SEQ ID NO: 470 - 505.
15. Wyizolowane przeciwciało ludzkie według zastrz. 1, lub jego część wiążąca antygen, które:
a) zawiera CDR3 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 25;
oraz
b) zawiera CDR3 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 26.
16. Wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, według zastrz. 15, które ponadto zawiera CDR2 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 27, oraz CDR2 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 28.
PL 218 748 B1
17. Wyizolowane przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążąca antygen, według zastrz. 15, które ponadto zawiera CDR1 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 29, oraz CDR1 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 30.
18. Wyizolowane przeciwciało ludzkie według zastrz. 15, lub jego część wiążąca antygen, które zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 31, oraz region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 32.
19. Wyizolowane przeciwciało ludzkie według zastrz. 15, które zawiera region stały łańcucha ciężkiego wybrany z grupy składającej się z regionów stałych IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA i IgE.
20. Wyizolowane przeciwciało ludzkie według zastrz. 19, w którym region stały łańcucha ciężkiego przeciwciała jest regionem IgG1.
21. Część wyizolowanego przeciwciała ludzkiego według zastrz. 18, która jest fragmentem Fab.
22. Część wyizolowanego przeciwciała ludzkiego według zastrz. 18, która jest fragmentem F(ab')2.
23. Część wyizolowanego przeciwciała ludzkiego według zastrz. 18, która jest jednołańcuchowym fragmentem Fv.
24. Wyizolowane przeciwciało ludzkie według zastrz. 1, które wiąże ludzką IL-12 i stanowi przeciwciało J695 lub jego część wiążącą antygen.
25. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, zdefiniowane w zastrz. 1-24, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
26. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 25, znamienna tym, że zawiera ponadto dodatkowy środek.
27. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 26, znamienna tym, że dodatkowym środkiem jest środek terapeutyczny.
28. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 27, znamienna tym, że środek terapeutyczny wybrany jest z grupy składającej się z budezonidu, naskórkowego czynnika wzrostu, kortykosteroidów, cyklosporyny, sulfasalazyny, aminosalicylanów, 6-merkaptopuryny, azatiopryny, metronidazolu, inhibitorów lipoksygenazy, mesalaminy, olsalazyny, balsalazydu, przeciwutleniaczy, inhibitorów tromboksanu, antagonistów receptora IL-1, monoklonalnych przeciwciał przeciw IL-1 β, monoklonalnych przeciwciał przeciw IL-6, czynników wzrostu, inhibitorów elastazy, związków pirydynyloimidazolowych; przeciwciał względem lub agonistów TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF i PDGF, przeciwciał względem CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90, bądź ich ligandów, metotreksatu, cyklosporyny, FK506, rapamycyny, mykofenolanu mofetylu, leflunomidu, NSLPZ, ibuprofenu, kortykosteroidów, prednizolonu, inhibitorów fosfodiesterazy, agonistów adenozyny, środków przeciwzakrzepowych, inhibitorów dopełniacza, środków adrenergicznych, inhibitorów kinazy IRAK, NIK, IKK, p38, MAP, inhibitorów enzymu konwertującego IL-1 β, inhibitorów enzymu konwertującego TNFa, inhibitorów przekazywania sygnałów w komórkach T, inhibitorów metaloproteinaz, sulfasalazyny, azatiopryny, 6-merkaptopuryn, inhibitorów enzymu konwertującego angiotensynę, rozpuszczalnych receptorów cytokin, rozpuszczalnego receptora p55 TNF, rozpuszczalnego receptora p75 TNF, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, cytokin przeciwzapalnych, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 i TGF3.
29. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 27, znamienna tym, że środek terapeutyczny jest wybrany z grupy składającej się z przeciwciał przeciw TNF i fragmentów tych przeciwciał, konstruktów TNFR-Ig, inhibitorów TACE, inhibitorów PDE4, kortykosteroidów, budezonidu, deksametazonu, sulfasalazyny, kwasu 5-aminosalicylowego, olsalazyny, inhibitorów enzymu konwertującego IL-1 β, IL-1ra, inhibitorów kinazy tyrozynowej, 6-merkaptopuryn i IL-11.
30. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 27, znamienna tym, że środek terapeutyczny jest wybrany z grupy składającej się z kortykosteroidów, prednizolonu, metyloprednizolonu, azatiopryny, cyklofosfamidu, cyklosporyny, n-totreksatu, 4-aminopirydyny, tizanidyny, interferonu-31a, interferonu-31b, kopolimeru 1, tlenu pod nadciśnieniem, immunoglobuliny dożylnej, klabrybiny, przeciwciał przeciw lub agonistów TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, PDGF, przeciwciał przeciw CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90, bądź ich ligandów, metotreksatu, cyklosporyny, FK506, rapamycyny, mykofenolanu mofetylu, leflunomidu, NSLPZ, ibuprofenu, kortykosteroidów, prednizolonu, inhibitorów fosfodiesterazy, agonistów adenozyny, środków przeciwzakrzepowych, inhibitorów dopełniacza, środków adrenergicznych, inhibitorów kinazy IRAK, NIK, IKK, p38 lub MAP, inhibitorów enzymu konwertującego IL-1 β, inhibitorów TACE, inhibitorów przekazywania sygnałów w komórkach T, inhibitorów kinaz, inhibitorów
PL 218 748 B1 metaloproteinaz, sulfasalazyny, azatiopryny, 6-markaptopuryn, inhibitorów enzymu konwertującego angiotensynę, rozpuszczalnych receptorów cytokin, rozpuszczalnego receptora p55 TNF, rozpuszczalnego receptora p75 TNF, sIL-1RI, sIL-1RII, SIL-6R, sIL-13R, anty-P7s, liganda glikoproteiny p-selektyny (PSGL), cytokin przeciwzapalnych, IL-4, IL-10, IL-13 i TGF3.
31. Sposób hamowania aktywności ludzkiej IL-12 in vitro, znamienny tym, że kontaktuje się ludzką IL-12 z przeciwciałem lub jego częścią wiążącą antygen zdefiniowanym w zastrz. 1-24, tak że aktywność ludzkiej IL-12 ulega zahamowaniu.
32. Zastosowanie przeciwciała lub jego części wiążącej antygen zdefiniowanego w zastrz. 1-24, do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki zaburzenia wybranego z grupy obejmującej reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, młodzieńcze przewlekłe zapalenie stawów, zapalenie stawów związane z chorobą z Lyme, artropatię łuszczycową, odczynowe zapalenie stawów, spondyloartropatię, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, uogólniony liszaj rumieniowaty, chorobę Crohna, wrzodziejące zapalenie okrężnicy, zapalną chorobę jelit, stwardnienie rozsiane, cukrzycę insulinozależną, zapalenie tarczycy, astmę, choroby alergiczne, łuszczycę, zapalenie i stwardnienie skóry, reakcję przeszczepu przeciw gospodarzowi, odrzucanie przeszczepionych narządów, ostre lub przewlekłe choroby immunologiczne związane z przeszczepianiem narządów, sarkoidozę, miażdżycę tętnic, rozsiane wykrzepianie wewnątrznaczyniowe, chorobę Kawasakiego, chorobę Grave'a, zespół nerczycowy, zespół przewlekłego zmęczenia, guzkowate zapalenie tętnic, ziarniniaka Wegenera, plamicę Henocha-Schoenleina, mikroskopowe zapalenie naczyń nerki, przewlekłe aktywne zapalenie wątroby, zespół Sjogrena, zapalenie błony naczyniowej oka, posocznicę, wstrząs septyczny, zespół posocznicy, zespół zaburzeń oddechowych dorosłych, wyniszczenie, choroby zakaźne, choroby pasożytnicze, zespół nabytego niedoboru odporności, ostre poprzeczne zapalenie rdzenia, nużliwość mięśni, pląsawicę Huntingtona, chorobę Parkinsona, chorobę Alzheimera, udar, pierwotną żółciową marskość wątroby, zwłóknieniowe choroby płuc, niedokrwistość hemolityczną, choroby nowotworowe, niewydolność serca i zawał mięśnia sercowego, przez podawanie osobnikowi będącemu człowiekiem.
33. Zastosowanie według zastrz. 32, w którym zaburzeniem jest łuszczyca.
34. Zastosowanie według zastrz. 32, w którym zaburzeniem jest choroba Crohna.
35. Zastosowanie według zastrz. 32, w którym zaburzeniem jest stwardnienie rozsiane.
36. Zastosowanie według zastrz. 32, w którym zaburzeniem jest reumatoidalne zapalenie stawów.
37. Sposób wykrywania ludzkiej IL-12, znamienny tym, że kontaktuje się in vitro ludzką IL-12 z przeciwciałem lub jego częścią wiążącą antygen, zdefiniowanym w zastrz. 1-24, tak że ludzka IL-12 zostaje wykryta.
38. Sposób według zastrz. 37, znamienny tym, że ludzką IL-12 wykrywa się w próbce biologicznej w celach diagnostycznych.
39. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, zdefiniowane w zastrz. 1, przy czym przeciwciało lub jego część wiążąca antygen zawiera CDR3 łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 25.
40. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 39, która koduje region zmienny łańcucha ciężkiego przeciwciała.
41. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 40, gdzie CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przeciwciała obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 27.
42. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 40, gdzie CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przeciwciała obejmuje sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 29.
43. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 42, która koduje region zmienny łańcucha ciężkiego przeciwciała, obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 31.
44. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, zdefiniowane w zastrz. 1, gdzie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen obejmuje CDR3 łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 26.
45. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 44, która koduje region zmienny łańcucha lekkiego przeciwciała.
46. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 45, gdzie CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego przeciwciała obejmuje sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 28.
47. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 45, gdzie CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego przeciwciała obejmuje sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 30.
PL 218 748 B1
48. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 47, która koduje region zmienny łańcucha ciężkiego przeciwciała, obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 32.
49. Zrekombinowany wektor ekspresyjny, który zawiera wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zdefiniowaną w zastrz. 39-48.
50. Komórka gospodarz, do której wprowadzono zrekombinowany wektor ekspresyjny zdefiniowany w zastrz. 49.
51. Zrekombinowany wektor ekspresyjny według zastrz. 49, który koduje:
a) łańcuch ciężki przeciwciała zawierający region zmienny obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 31; oraz
b) łańcuch lekki przeciwciała zawierający region zmienny obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 32.
52. Komórka gospodarz według zastrz. 50, do której wprowadzono zrekombinowany wektor ekspresyjny zdefiniowany w zastrz. 51.
53. Sposób syntetyzowania ludzkiego przeciwciała lub jego części wiążącej antygen, zdefiniowanego w zastrz. 1-24, znamienny tym, że hoduje się komórkę gospodarza zdefiniowaną w zastrz. 50 albo 52 w podłożu hodowlanym, aż ludzkie przeciwciało, które wiąże się z ludzką IL-12 zostanie zsyntetyzowane przez komórkę.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US12660399P | 1999-03-25 | 1999-03-25 | |
PCT/US2000/007946 WO2000056772A1 (en) | 1999-03-25 | 2000-03-24 | Human antibodies that bind human il-12 and methods for producing |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL351842A1 PL351842A1 (en) | 2003-06-16 |
PL218748B1 true PL218748B1 (pl) | 2015-01-30 |
Family
ID=22425740
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL409839A PL409839A1 (pl) | 1999-03-25 | 2000-03-24 | Ludzkie przeciwciała, które wiążą ludzką IL-12 i sposoby ich wytwarzania |
PL351842A PL218748B1 (pl) | 1999-03-25 | 2000-03-24 | Wyizolowane przeciwciało ludzkie lub jego część wiążąca antygen, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna, sposób hamowania aktywności ludzkiej IL-12 in vitro, zastosowanie przeciwciała lub jego części wiążącej antygen, sposób wykrywania ludzkiej IL-12, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, zrekombinowany wektor ekspresyjny, komórka gospodarz oraz sposób syntetyzowania ludzkiego przeciwciała lub jego części wiążącej antygen |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL409839A PL409839A1 (pl) | 1999-03-25 | 2000-03-24 | Ludzkie przeciwciała, które wiążą ludzką IL-12 i sposoby ich wytwarzania |
Country Status (29)
Country | Link |
---|---|
EP (4) | EP2319870A3 (pl) |
JP (3) | JP4841038B2 (pl) |
KR (6) | KR100818066B1 (pl) |
CN (4) | CN101066997B (pl) |
AR (3) | AR043274A1 (pl) |
AU (1) | AU3921600A (pl) |
BG (2) | BG66399B1 (pl) |
BR (1) | BR0009323A (pl) |
CA (3) | CA2365281C (pl) |
CY (2) | CY1113326T1 (pl) |
CZ (1) | CZ303725B6 (pl) |
DK (1) | DK2168984T3 (pl) |
ES (1) | ES2390849T3 (pl) |
HK (1) | HK1142083A1 (pl) |
HU (1) | HUP0200575A3 (pl) |
IL (3) | IL145134A0 (pl) |
LU (1) | LU92159I2 (pl) |
MX (1) | MXPA01009645A (pl) |
MY (2) | MY145191A (pl) |
NO (3) | NO334828B1 (pl) |
NZ (5) | NZ611563A (pl) |
PL (2) | PL409839A1 (pl) |
PT (1) | PT2168984E (pl) |
SI (1) | SI2168984T1 (pl) |
SK (1) | SK288082B6 (pl) |
TR (5) | TR200501367T2 (pl) |
TW (5) | TWI280980B (pl) |
WO (1) | WO2000056772A1 (pl) |
ZA (1) | ZA200107774B (pl) |
Families Citing this family (161)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7883704B2 (en) * | 1999-03-25 | 2011-02-08 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Methods for inhibiting the activity of the P40 subunit of human IL-12 |
US6914128B1 (en) | 1999-03-25 | 2005-07-05 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing |
CN101066997B (zh) * | 1999-03-25 | 2013-03-27 | 艾博特股份有限两合公司 | 结合人il-12的人抗体及其生产方法 |
EP1257585A2 (en) | 2000-02-10 | 2002-11-20 | Basf Aktiengesellschaft | Antibodies that bind human interleukin-18 and methods of making and using |
MXPA02012867A (es) | 2000-06-29 | 2003-09-05 | Abbott Lab | Anticuerpos de especificidad doble y metodos para la elaboracion y el uso de los mismos. |
US6902734B2 (en) * | 2000-08-07 | 2005-06-07 | Centocor, Inc. | Anti-IL-12 antibodies and compositions thereof |
BRPI0116728B1 (pt) | 2001-01-05 | 2018-10-30 | Abgenix Inc | anticorpos para receptor de fator de crescimento i semelhante à insulina |
NZ532021A (en) | 2001-10-04 | 2008-05-30 | Genetics Inst Llc | Methods and compositions for modulating interleukin-21 receptor activity |
JP5290489B2 (ja) | 2001-11-08 | 2013-09-18 | アッヴィ・バイオセラピューティクス・インコーポレイテッド | Igg抗体の安定な液体医薬製剤 |
WO2003082206A2 (en) * | 2002-03-26 | 2003-10-09 | Centocor, Inc. | Multiple sclerosis-related immunoglobulin derived proteins, compositions, methods and uses |
EP1494710A4 (en) * | 2002-03-26 | 2007-03-21 | Centocor Inc | DIABETES-RELEVANT IMMUNOGLOBULIN-BASED PROTEINS, COMPOSITIONS, PROCESSES AND USES |
US20040033228A1 (en) | 2002-08-16 | 2004-02-19 | Hans-Juergen Krause | Formulation of human antibodies for treating TNF-alpha associated disorders |
EP2108660A1 (en) | 2002-10-30 | 2009-10-14 | Genentech, Inc. | Inhibition of IL-17 production |
JP2006520584A (ja) | 2002-11-08 | 2006-09-14 | アブリンクス エン.ヴェー. | 安定化単一ドメイン抗体 |
AU2003286004A1 (en) | 2002-11-08 | 2004-06-07 | Ablynx N.V. | Single domain antibodies directed against interferon- gamma and uses therefor |
US20060034845A1 (en) | 2002-11-08 | 2006-02-16 | Karen Silence | Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor |
US9320792B2 (en) | 2002-11-08 | 2016-04-26 | Ablynx N.V. | Pulmonary administration of immunoglobulin single variable domains and constructs thereof |
DE10303974A1 (de) | 2003-01-31 | 2004-08-05 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
AU2004210679A1 (en) | 2003-02-10 | 2004-08-26 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Immunoglobulin formulation and method of preparation thereof |
AU2012202845B2 (en) * | 2003-02-10 | 2014-09-04 | Biogen Ma Inc. | Immunoglobulin formulation and method of preparation thereof |
ES2340280T3 (es) | 2003-03-14 | 2010-06-01 | Wyeth Llc | Anticuerpos dirigidos contra el receptor de il-21 humano y uso de los mismos. |
JP4638870B2 (ja) | 2003-08-13 | 2011-02-23 | ファイザー・プロダクツ・インク | 修飾ヒトigf−1r抗体 |
FR2859725B1 (fr) | 2003-09-16 | 2006-03-10 | Neovacs | Procede a haut rendement pour l'obtention d'anticorps humains neutralisant l'activite biologique d'une cytokine humaine |
US20050100965A1 (en) | 2003-11-12 | 2005-05-12 | Tariq Ghayur | IL-18 binding proteins |
EP1531162A1 (en) | 2003-11-14 | 2005-05-18 | Heinz Vollmers | Adenocarcinoma specific antibody SAM-6, and uses thereof |
DE10353175A1 (de) | 2003-11-14 | 2005-06-16 | Müller-Hermelink, Hans Konrad, Prof. Dr. | Humaner monoklonaler Antikörper mit fettsenkender Wirkung |
WO2005097832A2 (en) * | 2004-03-31 | 2005-10-20 | Genentech, Inc. | Humanized anti-tgf-beta antibodies |
ME00226B (me) | 2004-07-15 | 2011-02-10 | Medarex Llc | Humana anti-ngf neutrališuća antitijela kao selektivni inhibitori ngf signalne kaskade |
BRPI0515858A (pt) | 2004-12-21 | 2008-08-12 | Centocor Inc | anticorpos anti-il-12, epìtopos, composições, métodos e usos |
EP3520815B1 (en) * | 2005-02-08 | 2021-11-17 | Genzyme Corporation | Antibodies to tgfbeta |
AU2006214384A1 (en) | 2005-02-14 | 2006-08-24 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Use of IL-17F in diagnosis and therapy of airway inflammation |
AU2006214473A1 (en) | 2005-02-14 | 2006-08-24 | Wyeth | Interleukin-17F antibodies and other IL-17F signaling antagonists and uses therefor |
GT200600148A (es) | 2005-04-14 | 2006-11-22 | Metodos para el tratamiento y la prevencion de fibrosis | |
CN103146708A (zh) * | 2005-06-30 | 2013-06-12 | Abbvie公司 | Il-12/p40结合蛋白 |
EP2388277A3 (en) | 2005-07-18 | 2013-03-20 | Amgen, Inc | Human anti-B7RP1 neutralizing antibodies |
EP2500356A3 (en) | 2005-08-19 | 2012-10-24 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
EP2495257A3 (en) | 2005-08-19 | 2012-10-17 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
US8906864B2 (en) | 2005-09-30 | 2014-12-09 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Binding domains of proteins of the repulsive guidance molecule (RGM) protein family and functional fragments thereof, and their use |
PL1954718T3 (pl) | 2005-11-30 | 2015-04-30 | Abbvie Inc | Przeciwciała skierowane przeciwko A globulomerowi, ich reszty wiążące antygeny, odpowiednie hybrydomy, kwasy nukleinowe, wektory, komórki gospodarze, sposoby wytwarzania tych przeciwciał, kompozycje zawierające te przeciwciała, zastosowania tych przeciwciał i sposoby stosowania tych przeciwciał |
DK1976877T4 (en) | 2005-11-30 | 2017-01-16 | Abbvie Inc | Monoclonal antibodies to amyloid beta protein and uses thereof |
TWI417301B (zh) | 2006-02-21 | 2013-12-01 | Wyeth Corp | 對抗人類介白素-22(il-22)之抗體及其用途 |
TW200744634A (en) | 2006-02-21 | 2007-12-16 | Wyeth Corp | Methods of using antibodies against human IL-22 |
US7915388B2 (en) | 2006-09-08 | 2011-03-29 | Abbott Laboratories | Interleukin-13 binding proteins |
US8455626B2 (en) | 2006-11-30 | 2013-06-04 | Abbott Laboratories | Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies |
US8324350B2 (en) | 2006-12-29 | 2012-12-04 | Abbott Laboratories | Dual-specific IL-1α/IL-1β antibodies |
CN104524567A (zh) * | 2007-01-16 | 2015-04-22 | 阿布维公司 | 用于治疗银屑病的方法 |
US20100311767A1 (en) | 2007-02-27 | 2010-12-09 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Method for the treatment of amyloidoses |
KR20100014674A (ko) | 2007-03-29 | 2010-02-10 | 아보트 러보러터리즈 | 결정성 항-사람 il-12 항체 |
WO2009005673A1 (en) * | 2007-06-28 | 2009-01-08 | Schering Corporation | Anti-igf1r |
US20090181027A1 (en) * | 2007-09-28 | 2009-07-16 | Paul Dal Monte | Anti-IL-12/23p40 Antibodies, Epitopes, Formulations, Compositions, Methods and Uses |
EP2050764A1 (en) * | 2007-10-15 | 2009-04-22 | sanofi-aventis | Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof |
WO2009068625A2 (en) | 2007-11-27 | 2009-06-04 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences directed against her2 and polypeptides comprising the same for the treatment of cancers and/or tumors |
US8962803B2 (en) | 2008-02-29 | 2015-02-24 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Antibodies against the RGM A protein and uses thereof |
RU2497545C2 (ru) * | 2008-03-18 | 2013-11-10 | Эбботт Лэборетриз | Способ лечения псориаза (варианты) |
EP2282769A4 (en) | 2008-04-29 | 2012-04-25 | Abbott Lab | DUAL VARIABLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND ITS USES |
CN104628855A (zh) | 2008-05-05 | 2015-05-20 | 诺维莫尼公司 | 抗il-17a/il-17f交叉反应性抗体及其使用方法 |
EP2500361B1 (en) | 2008-05-09 | 2016-03-30 | AbbVie Deutschland GmbH & Co KG | Antibodies to receptor of advanced glycation end products (RAGE) and uses thereof |
EP3085773B1 (en) * | 2008-05-30 | 2020-03-18 | XBiotech, Inc | Uses of il-1 alpha antibodies |
EP2297209A4 (en) | 2008-06-03 | 2012-08-01 | Abbott Lab | IMMUNOGLOBULINS WITH TWO VARIABLE DOMAINS AND USES THEREOF |
JP5723769B2 (ja) | 2008-06-03 | 2015-05-27 | アッヴィ・インコーポレイテッド | 二重可変ドメイン免疫グロブリン及びその使用 |
SG192496A1 (en) | 2008-07-08 | 2013-08-30 | Abbott Lab | Prostaglandin e2 binding proteins and uses thereof |
EP2321422A4 (en) | 2008-07-08 | 2013-06-19 | Abbvie Inc | PROSTAGLANDINE E2 VARIABLE DOUBLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND USES THEREOF |
JP6113404B2 (ja) | 2008-10-29 | 2017-04-12 | アブリンクス エン.ヴェー. | 単一ドメイン抗原結合分子の精製方法 |
CN104740631B (zh) | 2008-10-29 | 2019-04-16 | 阿布林克斯公司 | 单域抗原结合性分子的制剂 |
BRPI0921320A2 (pt) * | 2008-11-28 | 2018-05-22 | Abbott Laboratories | composições de anticorpo estáveis e métodos para estabilizar os mesmos |
US8030026B2 (en) * | 2009-02-24 | 2011-10-04 | Abbott Laboratories | Antibodies to troponin I and methods of use thereof |
RU2015132478A (ru) | 2009-03-05 | 2015-12-10 | Эббви Инк. | Связывающие il-17 белки |
RU2605318C2 (ru) | 2009-05-05 | 2016-12-20 | Новиммун С.А. | Анти-il-17f антитела и способы их применения |
CN102741288B (zh) | 2009-08-29 | 2015-08-19 | Abbvie公司 | 治疗用dll4结合蛋白 |
SG178602A1 (en) | 2009-09-01 | 2012-04-27 | Abbott Lab | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
AU2010291927A1 (en) * | 2009-09-14 | 2012-04-12 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Methods for treating psoriasis |
WO2011047262A2 (en) | 2009-10-15 | 2011-04-21 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
UY32979A (es) | 2009-10-28 | 2011-02-28 | Abbott Lab | Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas |
WO2011053707A1 (en) | 2009-10-31 | 2011-05-05 | Abbott Laboratories | Antibodies to receptor for advanced glycation end products (rage) and uses thereof |
WO2011051466A1 (en) | 2009-11-02 | 2011-05-05 | Novartis Ag | Anti-idiotypic fibronectin-based binding molecules and uses thereof |
ES2562832T3 (es) | 2009-12-08 | 2016-03-08 | Abbvie Deutschland Gmbh & Co Kg | Anticuerpos monoclonales contra la proteína RGM para su uso en el tratamiento de la degeneración de la capa de fibra nerviosa de la retina |
EP2510948B1 (en) * | 2009-12-09 | 2015-09-09 | Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation | T cell activation inhibitor, pharmaceutical composition containing same, and screening method for t cell activation inhibiting substance |
JP5964249B2 (ja) | 2010-03-02 | 2016-08-03 | アッヴィ・インコーポレイテッド | 治療用dll4結合タンパク質 |
JP2013523182A (ja) | 2010-04-15 | 2013-06-17 | アボット・ラボラトリーズ | アミロイドベータ結合タンパク質 |
AR081246A1 (es) | 2010-05-14 | 2012-07-18 | Abbott Lab | Proteinas de union a il-1 |
WO2012006500A2 (en) | 2010-07-08 | 2012-01-12 | Abbott Laboratories | Monoclonal antibodies against hepatitis c virus core protein |
UY33492A (es) | 2010-07-09 | 2012-01-31 | Abbott Lab | Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas |
JP2013537415A (ja) | 2010-08-03 | 2013-10-03 | アッヴィ・インコーポレイテッド | 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用 |
EP2603524A1 (en) | 2010-08-14 | 2013-06-19 | AbbVie Inc. | Amyloid-beta binding proteins |
ES2665954T3 (es) | 2010-08-19 | 2018-04-30 | Zoetis Belgium S.A. | Anticuerpos anti-NGF y su uso |
CA2809433A1 (en) | 2010-08-26 | 2012-03-01 | Abbvie Inc. | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
CN103282042B (zh) | 2010-09-17 | 2014-12-10 | 巴克斯特国际公司 | 通过具有组氨酸的水性制剂在弱酸性至中性pH稳定的免疫球蛋白 |
BR112013015944A2 (pt) | 2010-12-21 | 2018-06-19 | Abbvie Inc | imunoglobulinas de domínio duplo variável il-1 alpha e beta biespecífico e seus usos. |
WO2012088094A2 (en) | 2010-12-21 | 2012-06-28 | Abbott Laboratories | Il-1 binding proteins |
KR20140061403A (ko) | 2011-07-13 | 2014-05-21 | 애브비 인코포레이티드 | 항―il―13 항체를 이용하여 천식을 치료하기 위한 방법 및 조성물 |
MX2014004977A (es) | 2011-10-24 | 2014-09-11 | Abbvie Inc | Inmunoaglutinantes dirigidos contra esclerostina. |
JP6342812B2 (ja) | 2011-12-14 | 2018-06-13 | アッヴィ・ドイチュラント・ゲー・エム・ベー・ハー・ウント・コー・カー・ゲー | 鉄関連障害を診断および治療するための組成物および方法 |
CA2855570A1 (en) | 2011-12-14 | 2013-06-20 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Composition and method for the diagnosis and treatment of iron-related disorders |
US9120870B2 (en) | 2011-12-30 | 2015-09-01 | Abbvie Inc. | Dual specific binding proteins directed against IL-13 and IL-17 |
CN107880124B (zh) | 2012-01-27 | 2021-08-13 | 艾伯维德国有限责任两合公司 | 用于诊断和治疗与神经突变性相关的疾病的组合物和方法 |
SI2852615T1 (sl) | 2012-05-22 | 2019-02-28 | Bristol-Myers Squibb Company | IL-17A/F IL-23 bispecifična protitelesa in njihova uporaba |
WO2013184871A1 (en) | 2012-06-06 | 2013-12-12 | Zoetis Llc | Caninized anti-ngf antibodies and methods thereof |
US9670276B2 (en) | 2012-07-12 | 2017-06-06 | Abbvie Inc. | IL-1 binding proteins |
EA201791717A1 (ru) | 2012-09-07 | 2018-03-30 | Кохерус Байосайенсис, Инк. | Стабильные водные составы адалимумаба |
BR112015009961B1 (pt) | 2012-11-01 | 2020-10-20 | Abbvie Inc. | proteína de ligação capaz de se ligar a dll4 e vegf, bem como composição que a compreende como composição que a compreende |
US9550986B2 (en) | 2012-12-21 | 2017-01-24 | Abbvie Inc. | High-throughput antibody humanization |
KR102068222B1 (ko) | 2013-02-20 | 2020-01-21 | 삼성디스플레이 주식회사 | 증착용 마스크 제조방법 |
US9458246B2 (en) | 2013-03-13 | 2016-10-04 | Amgen Inc. | Proteins specific for BAFF and B7RP1 |
JOP20140087B1 (ar) | 2013-03-13 | 2021-08-17 | Amgen Inc | بروتينات مخصصة ل baff و b7rp1 وإستخداماتها |
JP6505076B2 (ja) | 2013-03-14 | 2019-04-24 | アボット・ラボラトリーズAbbott Laboratories | Hcv抗原−抗体組み合わせアッセイおよびこれに使用するための方法および組成物 |
JP2016512241A (ja) | 2013-03-14 | 2016-04-25 | アボット・ラボラトリーズAbbott Laboratories | 改良された抗体検出のためのhcvns3組換え抗原およびこの突然変異体 |
MX2015012825A (es) | 2013-03-14 | 2016-06-10 | Abbott Lab | Anticuerpos monoclonales del dominio de union de lipido del núcleo del virus de la hepatitis c vhc. |
WO2014144280A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Abbvie Inc. | DUAL SPECIFIC BINDING PROTEINS DIRECTED AGAINST IL-1β AND / OR IL-17 |
US9469686B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-10-18 | Abbott Laboratories | Anti-GP73 monoclonal antibodies and methods of obtaining the same |
CN103275222B (zh) * | 2013-05-15 | 2014-04-16 | 中山康方生物医药有限公司 | 一种阻断白介素12 p40功能的单克隆抗体及其编码基因和应用 |
CA2914566A1 (en) | 2013-06-07 | 2014-12-11 | Duke University | Inhibitors of complement factor h |
FI3088517T3 (fi) * | 2013-12-26 | 2023-11-30 | Mitsubishi Tanabe Pharma Corp | Ihmisen Anti-IL-33 neutraloiva monoklonaalinen vasta-aine |
JP2017535528A (ja) * | 2014-10-03 | 2017-11-30 | ノバルティス アーゲー | 組み合わせ治療 |
KR20170065662A (ko) * | 2014-10-18 | 2017-06-13 | 화이자 인코포레이티드 | 항-il-7r 항체 조성물 |
AR102417A1 (es) | 2014-11-05 | 2017-03-01 | Lilly Co Eli | Anticuerpos biespecíficos anti-tnf- / anti-il-23 |
WO2016094881A2 (en) | 2014-12-11 | 2016-06-16 | Abbvie Inc. | Lrp-8 binding proteins |
DK3303395T3 (da) | 2015-05-29 | 2020-01-27 | Abbvie Inc | Anti-cd40-antistoffer og anvendelser deraf |
TW201710286A (zh) | 2015-06-15 | 2017-03-16 | 艾伯維有限公司 | 抗vegf、pdgf及/或其受體之結合蛋白 |
US11229702B1 (en) | 2015-10-28 | 2022-01-25 | Coherus Biosciences, Inc. | High concentration formulations of adalimumab |
CR20180365A (es) | 2015-12-16 | 2018-09-28 | Amgen Inc | PROTEÍNAS DE UNIÓN AL ANTÍGENO BISPECÍFICO DE ANTI-TL1A/ANTI-TNF-a Y SUS USOS |
CN105825196B (zh) * | 2016-03-28 | 2020-01-31 | 联想(北京)有限公司 | 一种信息处理方法和电子设备 |
EA201892190A1 (ru) | 2016-03-29 | 2019-04-30 | Янссен Байотек, Инк. | Лечение псориаза антителом к ил-12 и/или ил-23 с возрастанием интервала между введениями дозы |
US11071782B2 (en) | 2016-04-20 | 2021-07-27 | Coherus Biosciences, Inc. | Method of filling a container with no headspace |
JP7274413B2 (ja) * | 2016-09-23 | 2023-05-16 | マレンゴ・セラピューティクス,インコーポレーテッド | ラムダ及びカッパ軽鎖を含む多重特異性抗体分子 |
BR112019006710A2 (pt) | 2016-10-03 | 2019-06-25 | Abbott Lab | métodos aprimorados para avaliação do estado da uch-l1 em amostras de pacientes |
JP7346300B2 (ja) | 2017-03-23 | 2023-09-19 | アボット・ラボラトリーズ | 早期バイオマーカーであるユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼl1を使用する、ヒト対象における外傷性脳損傷の程度の診断及び決定の一助となるための方法 |
AU2018250688B2 (en) | 2017-04-15 | 2024-07-04 | Abbott Laboratories | Methods for aiding in the hyperacute diagnosis and determination of traumatic brain injury in a human subject using early biomarkers |
AU2018256845B2 (en) | 2017-04-28 | 2024-03-14 | Abbott Laboratories | Methods for aiding in the hyperacute diagnosis and determination of traumatic brain injury using early biomarkers on at least two samples from the same human subject |
US10865238B1 (en) | 2017-05-05 | 2020-12-15 | Duke University | Complement factor H antibodies |
WO2018218169A1 (en) | 2017-05-25 | 2018-11-29 | Abbott Laboratories | Methods for aiding in the determination of whether to perform imaging on a human subject who has sustained or may have sustained an injury to the head using early biomarkers |
BR112019025387A2 (pt) | 2017-05-30 | 2020-07-07 | Abbott Laboratories | métodos para auxiliar no diagnóstico e avaliação de uma lesão traumática cerebral branda em um indivíduo humano com o uso de troponina cardíaca i e biomarcadores precoces |
WO2019010131A1 (en) | 2017-07-03 | 2019-01-10 | Abbott Laboratories | IMPROVED METHODS FOR MEASURING CARBOXY TERMINATION HYDROLASE LEVELS OF UBIQUITIN L1 IN BLOOD |
IL272864B2 (en) | 2017-08-31 | 2024-03-01 | Mitsubishi Tanabe Pharma Corp | A therapeutic agent containing an IL-33 antagonist for the treatment of endometriosis |
TW201922780A (zh) * | 2017-09-25 | 2019-06-16 | 美商健生生物科技公司 | 以抗il12/il23抗體治療狼瘡之安全且有效之方法 |
CA3067055A1 (en) | 2017-12-09 | 2019-06-13 | Abbott Laboratories | Methods for aiding in diagnosing and evaluating a traumatic brain injury in a human subject using a combination of gfap and uch-l1 |
BR112019028254A2 (pt) | 2017-12-09 | 2020-07-14 | Abbott Laboratories | métodos para ajudar no diagnóstico e avaliação de um paciente que sofreu uma lesão ortopédica e que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça, tal como uma lesão cerebral traumática (lct) leve, usando a proteína ácida fibrilar glial (gfap) e/ou a hidrolase carbóxi-terminal da ubiquitina l1 (uch-l1) |
JP2021506794A (ja) * | 2017-12-13 | 2021-02-22 | ザ リサーチ ファウンデイション フォー ザ ステイト ユニバーシティー オブ ニューヨーク | 疼痛を治療し、疼痛感受性を増大させるためのペプチド及び他の薬剤 |
BR112020017701A2 (pt) | 2018-03-12 | 2020-12-29 | Zoetis Services Llc | Anticorpos anti-ngf e métodos dos mesmos |
US11578124B2 (en) | 2018-05-18 | 2023-02-14 | Janssen Biotech, Inc. | Safe and effective method of treating lupus with anti-IL12/IL23 antibody |
LT3883606T (lt) | 2018-09-24 | 2023-09-11 | Janssen Biotech, Inc. | Saugus ir veiksmingas opinio kolito gydymo būdas anti-il12/il23 antikūnu |
CN111057719B (zh) * | 2018-10-17 | 2022-11-11 | 南京大学 | 一种高效的小鼠骨髓来源巨噬细胞的转染方法及其应用 |
AU2020279987A1 (en) | 2019-05-23 | 2021-11-18 | Janssen Biotech, Inc. | Method of treating inflammatory bowel disease with a combination therapy of antibodies to IL-23 and TNF alpha |
CN110204736A (zh) * | 2019-06-07 | 2019-09-06 | 河南师范大学 | 一步合成不同形貌Pb-MOF金属有机骨架的方法 |
CN115397848A (zh) | 2020-02-05 | 2022-11-25 | 拉利玛生物医药公司 | Tat肽结合蛋白及其用途 |
CN111471655B (zh) * | 2020-03-19 | 2023-07-07 | 湖州正熙医学检验实验室有限公司 | 抗人il12/23稳转细胞株及其构建方法和应用 |
WO2022031804A1 (en) | 2020-08-04 | 2022-02-10 | Abbott Laboratories | Improved methods and kits for detecting sars-cov-2 protein in a sample |
WO2023102384A1 (en) | 2021-11-30 | 2023-06-08 | Abbott Laboratories | Use of one or more biomarkers to determine traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography scan that is negative for a tbi |
WO2022119841A1 (en) | 2020-12-01 | 2022-06-09 | Abbott Laboratories | Use of one or more biomarkers to determine traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography scan that is negative for a tbi |
WO2022147147A1 (en) | 2020-12-30 | 2022-07-07 | Abbott Laboratories | Methods for determining sars-cov-2 antigen and anti-sars-cov-2 antibody in a sample |
WO2022245920A1 (en) | 2021-05-18 | 2022-11-24 | Abbott Laboratories | Methods of evaluating brain injury in a pediatric subject |
JP2024521476A (ja) | 2021-06-14 | 2024-05-31 | アボット・ラボラトリーズ | 音響エネルギー、電磁エネルギー、過圧波及び/又は爆風により引き起こされる脳損傷の診断法又は診断の一助となる方法 |
CN113321729B (zh) * | 2021-07-01 | 2022-08-30 | 东大生物技术(苏州)有限公司 | 一组il-12单克隆抗体及其医药用途 |
CN118715440A (zh) | 2021-08-31 | 2024-09-27 | 雅培实验室 | 诊断脑损伤的方法和系统 |
CA3230038A1 (en) | 2021-08-31 | 2023-03-09 | Hongwei Zhang | Methods and systems of diagnosing brain injury |
CA3232176A1 (en) | 2021-09-30 | 2023-04-06 | Beth MCQUISTON | Methods and systems of diagnosing brain injury |
WO2023114978A1 (en) | 2021-12-17 | 2023-06-22 | Abbott Laboratories | Systems and methods for determining uch-l1, gfap, and other biomarkers in blood samples |
AU2023216317A1 (en) | 2022-02-04 | 2024-09-05 | Abbott Laboratories | Lateral flow methods, assays, and devices for detecting the presence or measuring the amount of ubiquitin carboxy-terminal hydrolase l1 and/or glial fibrillary acidic protein in a sample |
KR20230171660A (ko) | 2022-06-14 | 2023-12-21 | 오상민 | 공기 살균 정화기 |
WO2024006876A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Abbott Laboratories | Magnetic point-of-care systems and assays for determining gfap in biological samples |
WO2024059708A1 (en) | 2022-09-15 | 2024-03-21 | Abbott Laboratories | Biomarkers and methods for differentiating between mild and supermild traumatic brain injury |
WO2024211475A1 (en) | 2023-04-04 | 2024-10-10 | Abbott Laboratories | Use of biomarkers to determine whether a subject has sustained, may have sustained or is suspected of sustaining a subacute acquired brain injury (abi) |
Family Cites Families (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4399216A (en) | 1980-02-25 | 1983-08-16 | The Trustees Of Columbia University | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
US4634665A (en) | 1980-02-25 | 1987-01-06 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
US5179017A (en) | 1980-02-25 | 1993-01-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
US4510245A (en) | 1982-11-18 | 1985-04-09 | Chiron Corporation | Adenovirus promoter system |
GB8308235D0 (en) | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
US5168062A (en) | 1985-01-30 | 1992-12-01 | University Of Iowa Research Foundation | Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence |
US4968615A (en) | 1985-12-18 | 1990-11-06 | Ciba-Geigy Corporation | Deoxyribonucleic acid segment from a virus |
ES2118066T3 (es) | 1989-10-05 | 1998-09-16 | Optein Inc | Sintesis y aislamiento, exentos de celulas, de nuevos genes y polipeptidos. |
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
JPH06508511A (ja) | 1990-07-10 | 1994-09-29 | ケンブリッジ アンティボディー テクノロジー リミティド | 特異的な結合ペアーの構成員の製造方法 |
WO1992009690A2 (en) | 1990-12-03 | 1992-06-11 | Genentech, Inc. | Enrichment method for variant proteins with altered binding properties |
DK1471142T3 (da) | 1991-04-10 | 2009-03-09 | Scripps Research Inst | Heterodimere receptor-biblioteker under anvendelse af fagemider |
WO1994004679A1 (en) * | 1991-06-14 | 1994-03-03 | Genentech, Inc. | Method for making humanized antibodies |
DE4122599C2 (de) | 1991-07-08 | 1993-11-11 | Deutsches Krebsforsch | Phagemid zum Screenen von Antikörpern |
US5734014A (en) * | 1992-08-11 | 1998-03-31 | Tsumura & Co. | Elafin derivative |
US5654168A (en) | 1994-07-01 | 1997-08-05 | Basf Aktiengesellschaft | Tetracycline-inducible transcriptional activator and tetracycline-regulated transcription units |
US5464758A (en) | 1993-06-14 | 1995-11-07 | Gossen; Manfred | Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters |
EP0659766A1 (en) * | 1993-11-23 | 1995-06-28 | Schering-Plough | Human monoclonal antibodies against human cytokines and methods of making and using such antibodies |
ZA95960B (en) * | 1994-03-14 | 1995-10-10 | Genetics Inst | Use of interleukin-12 antagonists in the treatment of autoimmune diseases |
EP1709970A1 (en) * | 1995-04-27 | 2006-10-11 | Abgenix, Inc. | Human antibodies against EGFR, derived from immunized xenomice |
US5853697A (en) | 1995-10-25 | 1998-12-29 | The United States Of America, As Represented By The Department Of Health & Human Services | Methods of treating established colitis using antibodies against IL-12 |
PT936923E (pt) * | 1996-11-15 | 2004-04-30 | Kennedy Inst Of Rheumatology | Supressao de tnfalfa e il-12 em terapia |
CN101066997B (zh) * | 1999-03-25 | 2013-03-27 | 艾博特股份有限两合公司 | 结合人il-12的人抗体及其生产方法 |
US9601381B2 (en) | 2013-12-05 | 2017-03-21 | Stmicroelectronics (Crolles 2) Sas | Method for the formation of a finFET device with epitaxially grown source-drain regions having a reduced leakage path |
-
2000
- 2000-03-24 CN CN2005101286774A patent/CN101066997B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-24 AU AU39216/00A patent/AU3921600A/en not_active Abandoned
- 2000-03-24 CA CA002365281A patent/CA2365281C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-24 EP EP10180283A patent/EP2319870A3/en not_active Withdrawn
- 2000-03-24 KR KR1020017012238A patent/KR100818066B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-03-24 TR TR2005/01367T patent/TR200501367T2/xx unknown
- 2000-03-24 MY MYPI20064253A patent/MY145191A/en unknown
- 2000-03-24 EP EP09175437A patent/EP2168984B1/en not_active Revoked
- 2000-03-24 CN CNA2008100993235A patent/CN101333256A/zh active Pending
- 2000-03-24 IL IL14513400A patent/IL145134A0/xx unknown
- 2000-03-24 KR KR1020107002138A patent/KR101222450B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-03-24 DK DK09175437.4T patent/DK2168984T3/da active
- 2000-03-24 KR KR1020147017491A patent/KR20140094647A/ko not_active Application Discontinuation
- 2000-03-24 CZ CZ20013434A patent/CZ303725B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-03-24 PT PT09175437T patent/PT2168984E/pt unknown
- 2000-03-24 CN CNB008077835A patent/CN100439399C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-24 CA CA002669512A patent/CA2669512A1/en not_active Abandoned
- 2000-03-24 PL PL409839A patent/PL409839A1/pl unknown
- 2000-03-24 NZ NZ611563A patent/NZ611563A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-03-24 KR KR1020137024212A patent/KR20130105766A/ko not_active Application Discontinuation
- 2000-03-24 KR KR1020127020122A patent/KR20120091477A/ko not_active Application Discontinuation
- 2000-03-24 SI SI200031074T patent/SI2168984T1/sl unknown
- 2000-03-24 NZ NZ596723A patent/NZ596723A/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-03-24 BR BR0009323-8A patent/BR0009323A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-03-24 TR TR2005/03572T patent/TR200503572T2/xx unknown
- 2000-03-24 SK SK1367-2001A patent/SK288082B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-03-24 HU HU0200575A patent/HUP0200575A3/hu unknown
- 2000-03-24 NZ NZ529571A patent/NZ529571A/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-03-24 CA CA2796140A patent/CA2796140A1/en not_active Abandoned
- 2000-03-24 KR KR1020067020750A patent/KR20060127247A/ko not_active Application Discontinuation
- 2000-03-24 TR TR2001/02715T patent/TR200102715T2/xx unknown
- 2000-03-24 EP EP00918396A patent/EP1175446A1/en not_active Withdrawn
- 2000-03-24 MX MXPA01009645A patent/MXPA01009645A/es active IP Right Grant
- 2000-03-24 CN CN2010101952865A patent/CN101921772B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-24 JP JP2000606632A patent/JP4841038B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-24 NZ NZ513945A patent/NZ513945A/xx not_active Application Discontinuation
- 2000-03-24 EP EP10180107A patent/EP2301970A1/en not_active Withdrawn
- 2000-03-24 TR TR2008/02278T patent/TR200802278T2/xx unknown
- 2000-03-24 TR TR2006/03997T patent/TR200603997T1/xx unknown
- 2000-03-24 WO PCT/US2000/007946 patent/WO2000056772A1/en active Application Filing
- 2000-03-24 AR ARP000101321A patent/AR043274A1/es active IP Right Grant
- 2000-03-24 PL PL351842A patent/PL218748B1/pl unknown
- 2000-03-24 MY MYPI20001172A patent/MY142984A/en unknown
- 2000-03-24 NZ NZ592550A patent/NZ592550A/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-03-24 ES ES09175437T patent/ES2390849T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-18 TW TW89105501A patent/TWI280980B/zh not_active IP Right Cessation
- 2000-09-18 TW TW101120051A patent/TW201300412A/zh unknown
- 2000-09-18 TW TW100149356A patent/TWI410433B/zh not_active IP Right Cessation
- 2000-09-18 TW TW095145663A patent/TWI339209B/zh not_active IP Right Cessation
- 2000-09-18 TW TW099128334A patent/TWI365193B/zh not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-08-27 IL IL145134A patent/IL145134A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-09-20 ZA ZA200107774A patent/ZA200107774B/en unknown
- 2001-09-21 NO NO20014605A patent/NO334828B1/no not_active IP Right Cessation
- 2001-10-18 BG BG106027A patent/BG66399B1/bg unknown
-
2007
- 2007-11-08 AR ARP070104977A patent/AR063780A2/es not_active Application Discontinuation
-
2010
- 2010-07-15 IL IL207029A patent/IL207029A0/en unknown
- 2010-07-15 AR ARP100102574A patent/AR094125A2/es unknown
- 2010-09-06 HK HK10108446.1A patent/HK1142083A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-07-22 JP JP2011161258A patent/JP2012010702A/ja not_active Withdrawn
-
2012
- 2012-11-08 BG BG111337A patent/BG111337A/bg unknown
- 2012-11-12 CY CY20121101073T patent/CY1113326T1/el unknown
-
2013
- 2013-02-26 CY CY2013007C patent/CY2013007I1/el unknown
- 2013-02-27 LU LU92159C patent/LU92159I2/fr unknown
- 2013-11-07 NO NO20131482A patent/NO20131482L/no not_active Application Discontinuation
-
2014
- 2014-02-14 JP JP2014026148A patent/JP2014138594A/ja active Pending
- 2014-09-18 NO NO2014024C patent/NO2014024I1/no unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR100818066B1 (ko) | 사람 il-12에 결합하는 사람 항체 | |
AU2007338677B2 (en) | Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing | |
US7504485B2 (en) | Human antibodies that bind human IL-12 | |
AU2010206050B2 (en) | Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing | |
AU2005200515B2 (en) | Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing | |
AU2013254916A1 (en) | Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing |