JP2012010702A - ヒトil−12に結合するヒト抗体およびその産生法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヒトインターロイキン12(hIL−12)に特異的に結合し、in vitroおよびin vivoでhIL−12に高い親和性を有し、hIL−12活性を中和するヒト抗体、または、その抗原結合部分。前記ヒト抗体発現用の核酸、ベクター、および宿主細胞ならびに組換えヒト抗体の合成法。hIL−12活性が同定された障害を罹患したヒト被験体におけるhIL−12の検出またはhIL−12活性の阻害のための使用。
【選択図】なし
Description
a)in vitroPHAアッセイにおいて1×10−6M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
b)配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を有し、
c)配列番号2のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
a)in vitroPHAアッセイにおいて1×10−9M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
b)配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を有し、
c)配列番号10のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
b)配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を有し、
c)配列番号18のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
b)配列番号404〜配列番号469からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を有し、
c)配列番号534〜配列番号579からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
b)配列番号25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を有し、
c)配列番号26のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
b)配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および配列番号5のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、または接触位置または過剰変異位置に1つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および配列番号5のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1を含む抗体より10倍以下高いkoff速度を有し、
c)配列番号2のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、配列番号4のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、または接触位置または過剰変異位置で1つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号2のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR4、配列番号3のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1を含む抗体より10倍以下高いkoff速度を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
b)配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および配列番号13のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、または接触位置または過剰変異位置で1つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および配列番号13のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1を含む抗体より10倍以下高いkoff速度を有し、
c)配列番号10のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、または好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置で1つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号10のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1を含む抗体より10倍以下高いkoff速度を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
b)配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号19のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および配列番号21のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、または好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置で1つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号19のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および配列番号21のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1を含む抗体より10倍以下高いkoff速度を有し、
c)配列番号18のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、配列番号20のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、または好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置で1つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号18のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR4、配列番号20のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1を含む抗体より10倍以下高いkoff速度を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
b)配列番号25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号27のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および配列番号29のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、または好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置で1つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号27のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および配列番号29のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1を含む抗体より10倍以下高いkoff速度を有し、
c)配列番号26のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、配列番号28のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、または好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置で1つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号26のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、配列番号28のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1を含む抗体より10倍以下高いkoff速度を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
a)ヒトIL−12に結合し、表面プラスモン共鳴で測定すると0.1s−1のkoff速度定数でヒトIL−12から解離するか、in vitroフィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ(PHAアッセイ)において1×10−6M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
b)VH3生殖系列ファミリーメンバーから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変部を有し、前記重鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基による変異を有し、
c)Vλ1生殖系列ファミリーメンバーから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有し、前記軽鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基による変異を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
a)ヒトIL−12に結合し、表面プラスモン共鳴で測定すると0.1s−1以下のkoff速度定数でヒトIL−12から解離するか、in vitroフィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ(PHAアッセイ)において1×10−6M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
b)配列番号595〜667からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変部を有し、前記重鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基による変異を有し、
c)配列番号669〜675からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有し、前記軽鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基による変異を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
a)ヒトIL−12に結合し、表面プラスモン共鳴で測定すると0.1s−1以下のkoff速度定数でヒトIL−12から解離するか、in vitroフィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ(PHAアッセイ)において1×10−6M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
b)COS−3生殖系列アミノ酸配列を含む重鎖可変部を有し、前記重鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基による変異を有し、
c)DPL8生殖系列アミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有し、前記軽鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基による変異を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
a)ヒトIL−12に結合し、表面プラスモン共鳴で測定すると0.1s−1以下のkoff速度定数でヒトIL−12から解離するか、in vitroフィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ(PHAアッセイ)において1×10−6M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
b)VH3生殖系列ファミリーメンバーから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変部を有し、前記重鎖可変部は他のVH3生殖系列ファミリーメンバー由来のCDR2に構造的に類似したCDR2および他のVH3生殖系列ファミリーメンバー由来のCDR1に構造的に類似したCDR1を含み、前記重鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基による変異を有し、
c)Vλ1生殖系列ファミリーメンバーから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有し、前記軽鎖可変部は他のVλ1生殖系列ファミリーメンバー由来のCDR2に構造的に類似したCDR2および他のVλ1生殖系列ファミリーメンバー由来のCDR1に構造的に類似したCDR1を含み、前記軽鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基による変異を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
b)H30、H31、H31B、H32、H33、H53、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、およびL94からなる群から選択される好ましい選択的変異誘発位置を選択する工程と、
c)前記選択された好ましい選択的変異位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異することによって変異抗体またはその抗原結合物の第1のパネルを作製する工程と、
d)1つの選択的変異位置の変異により予め同定した目標活性または部分的標的活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるかどうかを決定するために、前記変異抗体またはその抗原結合部分の第1のパネルの活性を評価する工程と、
e)前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す各変異を段階的に組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
f)前記組み合わせ抗体またはその抗原結合部分が予め同定した目標活性または部分的標的活性を有するかどうかを決定するために、前記組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程と、
g)工程d)または工程f)で予め同定した目標活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られないか部分的活性のみを有する抗体が得られる場合、H35、H50、H53、H54、H95、H96、H97、H98、L30A、およびL96からなる群から選択されるさらなるアミノ酸残基を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にさらに変異して、変異抗体またはその抗原結合部分の第2のパネルを作製する工程をさらに包含し、
h)H35、H50、H53、H54、H95、H96、H97、H98、L30A、およびL96からなる群から選択される1つのアミノ酸残基の変異により予め同定した目標活性またはその部分的活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるかどうかを決定するために、前記変異抗体またはその抗原結合部分の第2のパネルの活性を評価する工程と、
i)前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す工程g)の各変異を段階的に組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
j)前記組み合わせ抗体またはその抗原結合部分が予め同定した目標活性または部分的標的活性を有するかどうかを決定するために、前記組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程と、
k)工程h)または工程j)で予め同定した目標活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られないか部分的活性のみを有する抗体が得られる場合、前記方法はH33B、H52B、およびL31Aからなる群から選択されるさらなるアミノ酸残基を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にさらに変異することによって変異抗体またはその抗原結合部分の第3のパネルを作製する工程をさらに包含し、
l)H33B、H52B、およびL31Aからなる群から選択される1つのアミノ酸残基の変異により予め同定した目標活性またはその部分的活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるかどうかを決定するために、前記変異抗体またはその抗原結合部分の第3のパネルの活性を評価する工程と、
m)前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す工程k)の各変異を段階的に組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
n)前記組み合わせ抗体またはその抗原結合部分が予め同定した目標活性または部分的標的活性を有することによって予め同定した目標活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるのかどうかを決定するために、前記組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程とを包含する、予め同定した目標活性を達成するための抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を特徴とする。
b)変異のために、相補性決定領域(CDR)内で好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を選択することによって選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を同定する工程と、
c)前記好ましい選択的変異誘発位置または接触位置または過剰変異位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製する工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価する工程と、
e)少なくとも1つの接触位置または過剰変異位置について工程b)〜d)を繰り返す工程と、
f)前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す各変異を組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
g)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程とを包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
b)変異のために、相補性決定領域(CDR)内で好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を選択することによって選択された接触位置または過剰変異位置を同定する工程と、
c)前記好ましい選択的変異誘発位置または接触位置または過剰変異位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、前記非ファージディスプレイ系におけるパネルを発現させる工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価する工程と、
e)少なくとも1つの他の接触位置または過剰変異位置について工程b)〜d)を繰り返す工程と、
f)前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す各変異を組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
g)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程とを包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
b)変異のために、相補性決定領域(CDR)内で好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を選択することによって選択された接触位置または過剰変異位置を同定する工程と、
c)前記好ましい選択的変異誘発位置または接触位置または過剰変異位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、前記適切な発現系におけるパネルを発現させる工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
e)親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも1つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも1つの他の特性または特徴について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程とを包含し、前記特性または特徴は抗体中での維持されなければならないものである、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
b)変異のために、相補性決定領域(CDR)内で好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を選択することによって選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を同定する工程と、
c)前記選択された好ましい変異誘発位置または接触位置または過剰変異位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、前記非ファージディスプレイ系におけるパネルを発現させる工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
e)親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも1つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも1つの他の特性または特徴について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程であって、前記特性または特徴は維持されなければならないものである、
f)少なくとも1つの他の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置について工程a)〜e)を繰り返す工程と、
g)前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性および少なくとも1つの保持された特性または特徴を有することを示す少なくとも2つの各活性を向上させるアミノ酸残基を組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
h)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも1つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程とを包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
b)変異のために、相補性決定領域(CDR)内で接触または過剰変異位置を選択することによって選択した接触位置または過剰変異位置を同定する工程と、
c)前記接触または過剰変異位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、前記非ファージディスプレイ系におけるパネルを発現させる工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
e)親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも1つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも1つの他の特性または特徴について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程とを包含し、前記特性または特徴は維持されなければならないものである、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
b)相補性決定領域(CDR)内で好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を変異について選択することによって選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を同定する工程と、
c)前記選択された好ましい変異誘発位置または接触位置または過剰変異位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、前記非ファージディスプレイ系におけるパネルを発現させる工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
e)親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも1つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも1つの他の特性または特徴について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程であって、前記特性または特徴は維持されなければならないものである、
f)少なくとも1つの他の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置について工程a)〜e)を繰り返す工程と、
g)前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性および少なくとも1つの保持された特性または特徴を有することを示す少なくとも2つの各活性を向上させるアミノ酸残基を組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
h)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも1つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程とを包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
b)変異のために、H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94、およびL96以外の位置で相補性決定領域(CDR)内でアミノ酸残基を選択する工程と、
c)前記選択位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基に変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製する工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
e)親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも1つの他の特性または特徴の変化について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程とを包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
b)変異のために、H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94、およびL96以外の位置で相補性決定領域(CDR)内でアミノ酸残基を選択する工程と、
c)前記選択位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基に変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製する工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
e)工程b)で選択された位置でもH30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94、およびL96での位置でもないCDR内の少なくとも1つの他の位置について工程b)〜工程d)を繰り返す工程と、
f)前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す少なくとも2つの各活性を向上させるアミノ酸残基を組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
g)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して、活性を向上させるアミノ酸残基を有する組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程とを包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
b)変異のために、H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、およびL94以外の位置で相補性決定領域(CDR)内でアミノ酸残基を選択する工程と、
c)前記選択した接触または過剰変異位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、前記非ファージディスプレイ系におけるパネルを発現させる工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
e)親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも1つの他の特性または特徴の変化について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程とを包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
b)変異のために、H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94、およびL96以外の位置で相補性決定領域(CDR)内でアミノ酸残基を選択する工程と、
c)前記選択位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、非ファージディスプレイ系で発現させる工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
e)工程b)で選択された位置でもH30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、およびL94での位置でもないCDR内の少なくとも1つの他の位置について工程b)〜工程d)を繰り返す工程と、
f)前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す少なくとも2つの各活性を向上させるアミノ酸残基を組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
g)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記組換え抗体またはその抗原結合部分と比較して、2つの活性を向上させるアミノ酸残基を有する組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性および他の特性または特徴を評価する工程とを包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
b)H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94、およびL96以外の位置で相補性決定領域(CDR)内でアミノ酸残基を変異について選択する工程と、
c)前記選択位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製する工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
e)少なくとも1つの他の特性または特徴の変化について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程と、
f)工程b)で選択された位置でもH30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94、およびL96での位置でもない少なくとも1つのCDR位置について工程b)〜工程e)を繰り返す工程と、
g)前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示すが少なくとも1つの特性または特徴に影響を与えない少なくとも2つの各活性を向上させるアミノ酸残基を組み合わせて、少なくとも1つの特性または特徴を保持した組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
h)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも1つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して、2つの活性を向上させるアミノ酸残基を有する組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性および少なくとも1つの特性または特徴を評価する工程とを包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
b)変異のために、H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94、およびL96以外の位置で相補性決定領域(CDR)内でアミノ酸残基を選択する工程と、
c)前記選択位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、非ファージディスプレイ系で発現させる工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
e)親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも1つの他の特性または特徴の変化について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを評価する工程とを包含する、他の特性に影響を与えない抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
b)変異のために、H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94、およびL96以外の位置で相補性決定領域(CDR)内でアミノ酸残基を選択する工程と、
c)前記選択位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製する工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
e)少なくとも1つの他の特性または特徴の変化について、前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを評価する工程と、
f)工程b)で選択された位置でもH30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94、およびL96での位置でもない少なくとも1つの他のCDR位置について工程b)〜工程d)を繰り返す工程と、
g)前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示すが少なくとも1つの他の特性または特徴に影響を与えない少なくとも2つの各活性を向上させるアミノ酸残基を組み合わせて、少なくとも1つの保持された特性または特徴を有する組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
h)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも1つの他の保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記組換え抗体またはその抗原結合部分と比較して、活性を向上させる2つのアミノ酸残基を有する組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性および少なくとも1つの他の特性または特徴の保持を評価する工程とを包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
b)変異のために、H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94、およびL96以外の位置で相補性決定領域(CDR)内でアミノ酸残基を選択する工程と、
c)前記選択位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製する工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
e)親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも1つの他の特性または特徴の変化について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを評価する工程とを包含する、他の特徴に影響を与えない抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
b)変異のために、H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94、およびL96以外の位置で相補性決定領域(CDR)内でアミノ酸残基を選択する工程と、
c)前記選択位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、非ファージディスプレイ系で発現させる工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性および少なくとも1つの他の特性または特徴の保持を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
e)工程b)で選択された位置でもH30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、およびL94での位置でもない少なくとも1つの他のCDR位置について工程b)〜工程d)を繰り返す工程と、
f)前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示し、且つ少なくとも1つの他の特性または特徴に影響を与えない少なくとも2つの各活性を向上させるアミノ酸残基を組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
g)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも1つの他の保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記組換え抗体またはその抗原結合部分と比較して、活性を向上させる2つのアミノ酸残基を有する組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性および少なくとも1つの他の特性または特徴の保持を評価する工程とを包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
本発明をより容易に理解するために、最初に一定の用語を定義する。
本発明は、ヒトIL−12に結合するヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。好ましくは、本発明のヒト抗体は、組換え中和ヒト抗hIL−12抗体である。ヒトIL−12に結合する本発明の抗体を、例えば、hIL−12を用いた1つまたは複数のVLおよびVH cDNAライブラリーのスクリーニング(実施例1に記載のファージディスプレイ技術など)によって選択することができる。ヒトVLおよびVH cDNAライブラリーのスクリーニングにより、一連の抗IL−12抗体をまず同定し、本明細書中で「Joe 9」(「Joe 9野生型」)という抗体をさらなる展開のために選択した。Joe 9は、比較的低親和性のヒトIL−12抗体(例えば、約0.1秒−1のKoff)であるが、hIL−12の特異的結合および検出に有用である。Joe 9抗体の親和性を、重鎖および軽鎖CDRの変異誘発の誘導、「混合および適合」ならびにさらに変異させた軽鎖および重鎖可変部パネルの作製によって改良し、hIL−12の親和性が増加した多数のさらなる抗hIL−12抗体を誘導した(実施例1、表2(添付物Aを参照のこと)、および図1A〜図Dの配列アラインメントを参照のこと)。
a)in vitroPHAアッセイにおいて1×10−6M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
b)配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を有し、
c)配列番号2のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
a)in vitroPHAアッセイにおいて1×10−9M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
b)配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を有し、
c)配列番号10のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。
b)配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を有し、
c)配列番号18のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。
b)配列番号404〜配列番号469からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を有するか、
c)配列番号534〜配列番号579からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。
b)配列番号25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を有し、
c)配列番号26のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。
b)配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および配列番号5のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、または好ましい選択的変異誘発位置または過剰変異位置に1つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および配列番号5のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1を含む抗体より10倍以下高いkoff速度を有し、
c)配列番号2のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、配列番号4のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、または好ましい選択的変異誘発位置または過剰変異位置で1つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号2のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR4、配列番号3のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1を含む抗体より10倍以下高いkoff速度を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。
b)配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および配列番号13のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、または好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置で1つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および配列番号13のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1を含む抗体より10倍以下高いkoff速度を有し、
c)配列番号10のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、または好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置で1つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号10のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1を含む抗体より10倍以下高いkoff速度を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。
b)配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号19のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および配列番号21のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、または好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置で1つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号19のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および配列番号21のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1を含む抗体より10倍以下高いkoff速度を有し、
c)配列番号18のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、配列番号20のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、または好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置で1つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号18のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR4、配列番号20のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1を含む抗体より10倍以下高いkoff速度を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。
b)配列番号25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号27のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および配列番号29のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、または好ましい選択的変異誘発位置または過剰変異位置で1つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号27のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および配列番号29のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1を含む抗体より10倍以下高いkoff速度を有し、
c)配列番号26のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、配列番号28のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、または好ましい選択的変異誘発位置または過剰変異位置で1つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号26のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、配列番号28のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1を含む抗体より10倍以下高いkoff速度を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。
本発明の組換えヒト抗体を、ヒトリンパ球由来のmRNAから調製したヒトVLおよびVH cDNAを使用して調製した組換え組み合わせ抗体ライブラリー(好ましくはscFvファージディスプレイライブラリー)のスクリーニングによって単離することができる。このようなライブラリーの調製法およびスクリーニング法は、当業者に既知である。市販のファージディスプレイライブラリー作製用キット(例えば、Pharmacia組換えファージ抗体系、カタログ番号27−9400−01およびStratagene SurfZAPTMファージディスプレイキット、カタログ番号240612)に加えて、抗体ディスプレイライブラリーの作製およびスクリーニングに特に利用することができる方法および試薬の例は、例えば、Kang et al.のPCT公開番号WO 92/18619;Winter et al.のPCT公開番号WO 92/20791;Breitling et al.のPCT公開番号WO 93/01288;McCafferty et al.のPCT公開番号WO 92/01047;Garrard et al.のPCT公開番号WO 92/09690;Fuchs et al.、1991、Bio/Technology、9、1370〜1372;Hay et al.、1992、Hum Antibod.Hybridomas、3、81〜85;Huse et al.、1989、Science、246、1275〜1281;McCafferty et al.、Nature、1990、348、552〜554、Griffiths et al.、1993、EMBO J.、12、725〜734;Hawkins et al.、1992、J.Mol.Biol.、226、889〜896;Clackson et al.、1991、Nature、352、624〜628;Gram et al.、1992、PNAS、89、3576〜3580;Garrad et al.、1991、Bio/Technology、9、1373〜1377;Hoogenboom et al.、1991、Nuc.Acid Res.、19、4133〜4137;およびBarbas et al.、1991、PNAS、88、7978〜7982に見出すことができる。
a)ヒトIL−12に結合し、表面プラスモン共鳴で測定したところ0.1s−1のkoff速度定数でヒトIL−12から解離するか、in vitroフィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ(PHAアッセイ)において1×10−6M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
b)VH3生殖系列ファミリーメンバーから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変部を有し、前記重鎖可変部は接触または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基との変異を有し、
c)Vλ1生殖系列ファミリーメンバーから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有し、前記軽鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基との変異を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。
a)配列番号595〜667からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変部を有し、前記重鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基との変異を有し、
b)配列番号669〜675からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有し、前記軽鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基との変異を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。
a)ヒトIL−12に結合し、表面プラスモン共鳴で測定したところ0.1s−1以下のkoff速度定数でヒトIL−12から解離するか、in vitroフィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ(PHAアッセイ)において1×10−6M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
b)COS−3生殖系列アミノ酸配列を含む重鎖可変部を有し、前記重鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基との変異を有し、
c)DPL8生殖系列アミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有し、前記軽鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基との変異を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。
a)ヒトIL−12に結合し、表面プラスモン共鳴で測定したところ0.1s−1以下のkoff速度定数でヒトIL−12から解離するか、in vitroフィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ(PHAアッセイ)において1×10−6M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
b)VH3生殖系列ファミリーメンバーから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変部を有し、前記重鎖可変部は他のVH3生殖系列ファミリーメンバー由来のCDR2に構造的に類似したCDR2および他のVH3生殖系列ファミリーメンバー由来のCDR1に構造的に類似したCDR1を含み、前記重鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基との変異を有し、
c)Vλ1生殖系列ファミリーメンバーから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有し、前記軽鎖可変部は他のVλ1生殖系列ファミリーメンバー由来のCDR2に構造的に類似したCDR2および他のVλ1生殖系列ファミリーメンバー由来のCDR1に構造的に類似したCDR1を含み、前記軽鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基との変異を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。
典型的には、親和性が改善された抗体の選択は、上記の第II節に記載されているようにファージディスプレー法を使用して行うことができる。これは、CDR残基の組合せをランダムに変異させて、異なる配列の抗体を含む大きなライブラリーを作製することによって達成することができる。しかし、これらの選択法が機能するためには、抗体抗原反応が、より大きな親和性を有する抗体の抗原に対する優先的な結合が、時間経過にわたって可能にする平衡になるようにならなければならない。平衡を達成させるための選択条件は、ファージディスプレー法が、達成された特定の親和性レベル(すなわち、抗体Y61の親和性レベル)を得る際に、選択された抗IL−12抗体の親和性を改善するために使用された場合、(おそらくは、抗原とファージ粒子との間でのさらなる非特異的な相互作用のために)決定することができない。従って、さらにより大きな親和性を有する抗体は、ファージディスプレー法によって選択することができない。このため、少なくともある種の抗体または抗原の場合、ファージディスプレー法は、大きく改善された結合特異性/親和性を有する抗体を選択するその能力に限界がある。従って、抗体のファージディスプレー親和性成熟化を必要としない選択的変異誘発法と名付けられた方法が、このような限界を克服するために確立されており、本発明により提供される。この選択的変異誘発法は、ファージディスプレーシステムを使用する限界を克服するために開発されたが、この方法はまたファージディスプレーシステムとともに使用できることに留意しなければならない。さらに、選択的変異誘発法は、任意の抗体の活性を改善するために使用することができる。
さらに、随所に議論されているように、本明細書中で明らかにされているファージディスプレー、またはリボソームディスプレーを含む他の関連する方法は、抗体と抗原との間におけるある種の親和性に達する際には適切に機能しないことがあり、そして平衡に達するために必要とされる条件は、他のファージ成分またはリボソーム成分と抗原との相互作用を含むさらなる相互作用のために合理的な時間枠で確立することができない。
候補位置を、1)好ましい選択的変異誘発位置;2)接触位置;3)過変異位置の順で選択して、その位置を抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域における位置の場所(CDR1よりもCDR2が好ましく、CDR2よりもCDR3が好ましい)に基づいて評価する工程;
活性増強アミノ酸残基を決定するために、候補の好ましい選択的変異誘発位置、過変異位置および/または接触位置を、評価した順にすべての可能な他のアミノ酸残基に個々に変異させ、そして抗体の活性について個々の変異の影響を分析する工程;
必要な場合には、個々の活性増強アミノ酸残基の段階的な組合せを行い、抗体の活性に対する様々な組合せの影響を分析する工程;活性増強アミノ酸残基を有する変異型抗体を選択して、その免疫原能に関してアミノ酸置換の存在位置および正体に基づいて変異型抗体を評価する工程。最も大きな評価付けが、生殖系列データベースに記載されている可変領域配列にほぼ一致するアミノ酸配列を含む変異型抗体、あるいは他のヒト抗体に匹敵し得るアミノ酸配列を有する変異型抗体に与えられる。低い評価付けが、生殖系列配列または他のヒト抗体の配列のいずれかにおいて稀にしか見出されないアミノ酸置換を含有する変異型抗体に与えられる。最も低い評価付けが、生殖系列配列または他のヒト抗体の配列において見出されないアミノ酸置換を有する変異型抗体に与えられる。上記に示されているように、CDR3内に存在する活性増強アミノ酸残基を少なくとも1つ含む変異型抗体はCDR2よりも好ましく、CDR2はCDR1よりも好ましい。重鎖可変領域のCDRは、軽鎖可変領域のCDRよりも好ましい。
好ましい活性増強アミノ酸残基は、H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94およびL96からなる群から選択される位置に存在するアミノ酸残基と置換される。より好ましい活性増強アミノ酸残基は、H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94の位置に存在するアミノ酸残基と置換される。特に、好ましい活性増強アミノ酸残基は、L50およびL94からなる群から選択される位置に存在するアミノ酸残基と置換される。
a)元の抗体またはその抗原結合部分を提供すること;
b)相補性決定領域(CDR)内の、1)好ましい選択的変異誘発位置、2)接触位置、または3)過変異位置を変異のためにこの順で選択し、それにより、選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を同定するすること;
c)前記の選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製すること;
d)変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること;
e)必要な場合には、少なくとも1つの他の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置について工程a)〜d)を繰り返すこと;
f)改善された活性を有することが明らかにされた個々の変異を元の抗体またはその抗原結合部分において組み合わせて、混合抗体またはその抗原結合部分を作製すること;および
g)混合抗体またはその抗原結合部分の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること
を含む方法を提供する。好ましくは、選択された抗体(1つまたは2つ以上)は、上記に記載されているように、元の抗体の少なくとも1つの望ましい特性または性質を失っていないか、または元の抗体の少なくとも1つの望ましい特性または性質を保持している改善された活性を有する。そのような望ましい特性または性質は、当分野で認識されている技術を使用して当業者によって測定または観察され得る。
a)元の抗体またはその抗原結合部分を提供すること;
b)相補性決定領域(CDR)内の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を変異のために選択すること;
c)前記の選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製すること;
d)変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること;
e)必要な場合には、少なくとも1つの他の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置について工程a)〜d)を繰り返すこと;
f)改善された活性を有することが明らかにされた2つの個々の活性増強アミノ酸残基を元の抗体またはその抗原結合部分において組み合わせて、混合抗体またはその抗原結合部分を作製すること;および
g)2つの活性増強アミノ酸残基を有する混合抗体またはその抗原結合部分の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること
を含む方法を提供する。
a)元の抗体またはその抗原結合部分を提供すること;
b)相補性決定領域(CDR)内の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を変異のために選択すること;
c)前記の選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製すること;
d)変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること;
e)必要な場合には、少なくとも1つの他の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置について工程a)〜d)を繰り返すこと;
f)改善された活性を有することが明らかにされた3つの個々の活性増強アミノ酸残基を元の抗体またはその抗原結合部分において組み合わせて、混合抗体またはその抗原結合部分を作製すること;および
g)2つの活性増強アミノ酸残基を有する混合抗体またはその抗原結合部分活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること
を含む方法を提供する。
a)元の抗体またはその抗原結合部分を提供すること;
b)H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94からなる群から選択される好ましい選択的変異誘発位置を選択すること;
c)選択された選択的変異誘発位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、これにより変異抗体またはその抗原結合部分の第1の集団を作製すること;
d)変異抗体またはその抗原結合部分の前記第1の集団の活性を評価して、1個の選択的変異誘発位置の変異により、所定の目標とする活性または部分的な目標とする活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られているかどうかを明らかにすること;
e)改善された活性を有することが明らかにされた個々の変異を段階的な様式で元の抗体またはその抗原結合部分において組み合わせて、混合抗体またはその抗原結合部分を作製すること;
f)混合抗体またはその抗原結合部分の活性を評価して、混合抗体またはその抗原結合部分が所定の目標とする活性または部分的な目標とする活性を有するかどうかを明らかにすること;
g)工程d)またはf)により、所定の目標とする活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られない場合、または部分的な活性のみを有する抗体が得られる場合には、H35、H50、H53、H54、H95、H96、H97、H98、L30AおよびL96からなる群から選択されるさらなるアミノ酸残基を少なくとも2つの他のアミノ酸残基に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の第2の集団を作製すること;
h)変異抗体またはその抗原結合部分の前記第2の集団の活性を評価して、H35、H50、H53、H54、H95、H96、H97、H98、L30AおよびL96からなる群から選択される1個のアミノ酸残基の変異により、所定の目標とする活性または部分的な活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られているかどうかを明らかにすること;
i)改善された活性を有することが明らかにされた工程g)の個々の変異を段階的な様式で元の抗体またはその抗原結合部分において組み合わせて、混合抗体またはその抗原結合部分を作製すること;
j)混合抗体またはその抗原結合部分の活性を評価して、混合抗体またはその抗原結合部分が所定の目標とする活性または部分的な目標とする活性を有するかどうかを明らかにすること;
k)工程h)またはj)により、所定の目標とする活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られない場合、または部分的な活性のみを有する抗体が得られる場合には、H33B、H52BおよびL31Aからなる群から選択されるさらなるアミノ酸残基を少なくとも2つの他のアミノ酸残基に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の第3の集団を作製すること;
l)変異抗体またはその抗原結合部分の前記第3の集団の活性を評価して、H33B、H52BおよびL31Aからなる群から選択される1個のアミノ酸残基の変異により、所定の目標とする活性または部分的な活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られたかどうかを明らかにすること;
m)改善された活性を有することが明らかにされた工程k)の個々の変異を段階的な様式で元の抗体またはその抗原結合部分において組み合わせて、混合抗体またはその抗原結合部分を作製すること;
n)混合抗体またはその抗原結合部分の活性を評価して、混合抗体またはその抗原結合部分が所定の目標とする活性を有するかどうかを明らかにし、それにより、所定の目標とする活性を有する抗体またはその抗原結合部分を作製することを含む方法を提供する。
a)ファージディスプレーシステムにおける選択によって得られたが、その活性を前記ファージディスプレーシステムにおける変異誘発によってさらに改善することができない元の組換え抗体またはその抗原結合部分を提供すること;
b)相補性決定領域(CDR)内の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を変異のために選択し、それにより、選択された接触位置または過変異位置を同定すること;
c)前記の選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製し、そして前記集団を非ファージディスプレーシステムにおいて発現させること;
d)変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること;
e)必要な場合には、少なくとも1つの他の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置について工程b)〜d)を繰り返すこと;
f)改善された活性を有することが明らかにされた個々の変異を元の抗体またはその抗原結合部分において組み合わせて、混合抗体またはその抗原結合部分を作製すること;および
e)混合抗体またはその抗原結合部分の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること
を含む方法を提供する。
a)元の組換え抗体またはその抗原結合部分を提供すること;
b)相補性決定領域(CDR)内の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を変異のために選択し、それにより、選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を同定すること;
c)前記の選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製し、そして前記集団を適切な発現系において発現させること;
d)変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること;
e)変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団を、抗体において保持されなければならない少なくとも1つの他の性質または特性について元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること
を含む方法を提供する。
a)ファージディスプレーシステムにおける選択によって得られたが、その活性を前記ファージディスプレーシステムにおける変異誘発によってさらに改善することができない元の組換え抗体またはその抗原結合部分を提供すること;
b)相補性決定領域(CDR)内の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を変異のために選択し、それにより、選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を同定すること;
c)前記の選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製し、そして前記集団を非ファージディスプレーシステムにおいて発現させること;
d)変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること;
e)元の抗体またはその抗原結合部分に対して、改善された活性を有し、かつ少なくとも1つの性質または特性が保持されている抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を、保持されなければならない少なくとも1つの他の性質または特性について元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること;
f)必要な場合には、工程a)〜e)を、少なくとも1つの他の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置について繰り返すこと;
g)改善された活性を有し、かつ少なくとも1つの性質または特性が保持されたことが明らかにされた少なくとも2つの個々の活性増強アミノ酸残基を元の抗体またはその抗原結合部分において組み合わせて、混合抗体またはその抗原結合部分を作製すること;および
h)混合抗体またはその抗原結合部分の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること
を含む方法を提供する。
a)ファージディスプレーシステムにおける選択によって得られたが、その活性を前記ファージディスプレーシステムにおける変異誘発によってさらに改善することができない元の組換え抗体またはその抗原結合部分を提供すること;
b)相補性決定領域(CDR)内の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を変異のために選択し、それにより、選択された接触位置または過変異位置を同定すること;
c)前記の選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製し、そして前記集団を非ファージディスプレーシステムにおいて発現させること;
d)変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること;
e)変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団を、保持されなければならない少なくとも1つの他の性質または特性について元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること;
を含む方法を提供する。
a)ファージディスプレーシステムにおける選択によって得られたが、その活性を前記ファージディスプレーシステムにおける変異誘発によってさらに改善することができない元の組換え抗体またはその抗原結合部分を提供すること;
b)相補性決定領域(CDR)内の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を変異のために選択し、それにより、選択された接触位置または過変異位置を同定すること;
c)前記の選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製し、そして前記集団を非ファージディスプレーシステムにおいて発現させること;
d)変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること;
e)元の抗体またはその抗原結合部分に対して、改善された活性を有し、かつ少なくとも1つの性質または特性が保持されている抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団を、保持されなければならない少なくとも1つの他の性質または特性について元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること;
f)必要な場合には、工程a)〜e)を、少なくとも1つの他の選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置について繰り返すこと;
g)改善された活性を有し、かつ少なくとも1つの性質または特性が保持されたことが明らかにされた少なくとも2つの個々の活性増強アミノ酸残基を元の抗体またはその抗原結合部分において組み合わせて、混合抗体またはその抗原結合部分を作製すること;および
h)混合抗体またはその抗原結合部分の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること
を含む方法を提供する。
最後には、所与の抗体抗原ペアにおけるすべてのCDR残基が、活性増強アミノ酸残基として必要であり、かつ/または抗原に対する結合のために、直接的または間接的に必要であり、および/または抗体の他の望ましい性質もしくは特性の保持のために必要であるいずれかの手段により同定される。そのようなCDR残基は「好ましい選択的変異誘発位置」として示される。特定の状況では、そのような好ましい選択的変異誘発残基はまた、抗体と抗原との同時結晶化および分子モデル化を含む他の手段によって同定できることに留意しなければならない。
a)元の抗体またはその抗原結合部分を提供すること;
b)H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94およびL96とは異なる相補性決定領域(CDR)内のアミノ酸残基を変異のために選択すること;
c)前記の選択された位置を、例えば、少なくとも2つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより、変異抗体、または変異抗体もしくはその抗原結合部分の集団を作製すること;
d)前記変異抗体の活性、または変異抗体もしくはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること;
e)前記変異抗体、または変異抗体もしくはその抗原結合部分の前記集団を、少なくとも1つの他の性質または特性における変化について元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること
を含む方法を提供する。
a)元の抗体またはその抗原結合部分を提供すること;
b)H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94およびL96とは異なる相補性決定領域(CDR)内のアミノ酸残基を変異のために選択すること;
c)前記の選択された位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製すること;
d)変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること;
e)工程b)で選択された位置、またはH30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94およびL96における位置のいずれでもない少なくとも1つの他のCDR位置について工程b)〜d)を繰り返すこと;
f)改善された活性を有することが明らかにされた少なくとも2つの個々の活性増強アミノ酸残基を元の抗体またはその抗原結合部分において組合せて、混合抗体またはその抗原結合部分を作製すること;および
g)2つの活性増強アミノ酸残基を有する混合抗体またはその抗原結合部分の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること
を含む方法を提供する。
a)ファージディスプレーシステムにおける選択によって得られたが、その活性を前記ファージディスプレーシステムにおける変異誘発によってさらに改善できない元の組換え抗体またはその抗原結合部分を提供すること;
b)H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94とは異なる相補性決定領域(CDR)内のアミノ酸残基を変異のために選択すること;
c)前記の選択された接触位置または過変異位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製し、そして前記集団を非ファージディスプレーシステムにおいて発現させること;
d)変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること;
e)変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団を、少なくとも1つの他の性質または特性における変化について元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること
を含む方法を提供する。
a)ファージディスプレーシステムにおける選択によって得られたが、その活性を前記ファージディスプレーシステムにおける変異誘発によってさらに改善することができない元の抗体またはその抗原結合部分を提供すること;
b)H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94およびL96とは異なる相補性決定領域(CDR)内のアミノ酸残基を変異のために選択すること;
c)前記の選択された位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製し、そして非ファージディスプレーシステムにおいて発現させること;
d)変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること;
e)工程b)で選択された位置、またはH30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94における位置のいずれでもない少なくとも1つの他の位置について工程b)〜d)を繰り返すこと;
f)改善された活性を有することが明らかにされた少なくとも2つの個々の活性増強アミノ酸残基を元の抗体またはその抗原結合部分において組合せて、混合抗体またはその抗原結合部分を作製すること;および
g)2つの活性増強アミノ酸残基を有する混合抗体またはその抗原結合部分の活性および他の性質または特性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること
を含む方法を提供する。
a)元の抗体またはその抗原結合部分を提供すること;
b)H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94およびL96とは異なる相補性決定領域(CDR)内のアミノ酸残基を変異のために選択すること;
c)前記の選択された位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製すること;
d)変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること;
e)変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団を、元の抗体またはその抗原結合部分に対して、少なくとも1つの他の性質または特性における変化について評価すること
を含む方法を提供する。
a)元の抗体またはその抗原結合部分を提供すること;
b)H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94およびL96とは異なる相補性決定領域(CDR)内のアミノ酸残基を変異のために選択すること;
c)前記の選択された位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製すること;
d)変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること;
e)変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団を、元の抗体またはその抗原結合部分に対して、少なくとも1つの他の性質または特性における変化について評価すること
e)工程b)で選択された位置、またはH30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94およびL96における位置のいずれでもない少なくとも1つの他のCDR位置について工程b)〜e)を繰り返すこと;
f)改善された活性を有することが明らかにされ、かつ少なくとも1つの他の性質または特性に影響を及ぼさない少なくとも2つの個々の活性増強アミノ酸残基を元の抗体またはその抗原結合部分において組合せて、混合抗体またはその抗原結合部分を作製すること;および
g)2つの活性増強アミノ酸残基を有する混合抗体またはその抗原結合部分の活性および少なくとも1つの他の性質または特性の保持を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること
を含む方法を提供する。
a)ファージディスプレーシステムにおける選択によって得られたが、その活性を前記ファージディスプレーシステムにおける変異誘発によってさらに改善することができない元の抗体またはその抗原結合部分を提供すること;
b)H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94およびL96とは異なる相補性決定領域(CDR)内のアミノ酸残基を変異のために選択すること;
c)前記の選択された位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製し、そして非ファージディスプレーシステムにおいて発現させること;
d)変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること;
e)変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団を、元の抗体またはその抗原結合部分に対して、少なくとも1つの他の性質または特性における変化について評価すること
を含む方法を提供する。
a)ファージディスプレーシステムにおける選択によって得られたが、その活性を前記ファージディスプレーシステムにおける変異誘発によってさらに改善することができない元の抗体またはその抗原結合部分を提供すること;
b)H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94およびL96とは異なる相補性決定領域(CDR)内のアミノ酸残基を変異のために選択すること;
c)前記の選択された位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製し、そして非ファージディスプレーシステムにおいて発現させること;
d)変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性および少なくとも1つの他の性質または特性の保持を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること;
e)工程b)で選択された位置、またはH30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94およびL96における位置のいずれでもない少なくとも1つの他のCDR位置について工程b)〜d)を繰り返すこと;
f)改善された活性を有し、かつ少なくとも1つの他の性質または特性に影響を及ぼさないことが明らかにされた少なくとも2つの個々の活性増強アミノ酸残基を元の抗体またはその抗原結合部分において組合せて、混合抗体またはその抗原結合部分を作製すること;および
g)2つの活性増強アミノ酸残基を有する混合抗体またはその抗原結合部分の活性および少なくとも1つの性質または特性の保持を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること
を含む方法を提供する。
本発明の抗体または抗体の一部は、免疫グロブリンの軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子の宿主細胞における組換え発現によって調製することができる。抗体を組換え発現させるために、宿主細胞は、抗体の免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖をコードするDNAフラグメントを有する1つまたは2つ以上の組換え発現ベクターでトランスフェクションされ、その結果、軽鎖および重鎖が宿主細胞において発現され、好ましくは宿主細胞が培養される培地に分泌され、そしてそのような培地から抗体を回収することができる。標準的な組換えDNA方法論を使用して、抗体の重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子が得られ、これらの遺伝子が組換え発現ベクターに組み込まれ、そしてベクターが宿主細胞に導入される。そのような方法論は、例えば、Sambrook、FritschおよびManiatis(編)、Molecular Cloning;A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor、N.Y.(1989);Ausubel,F.M.(編)、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates(1989);および米国特許第4,816,397号(Bossら)に記載されている。
a)配列番号31のアミノ酸配列を含む可変領域を有する抗体重鎖;および
b)配列番号32のアミノ酸配列を含む可変領域を有する抗体軽鎖
をコードする組換え発現ベクターを提供する。
本発明の抗体および抗体の一部は、患者への投与に好適な薬学的組成物に配合することができる。典型的には、薬学的組成物は、本発明の抗体または抗体の一部と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。本明細書中で使用されている「薬学的に許容可能なキャリア」には、生理学的に適合し得る任意のすべての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容可能なキャリアの例には、水、生理食塩水、リン酸塩緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの1つまたは2つ以上、ならびにそれらの組合せが含まれる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物に含めることは好ましい。薬学的に許容可能なキャリアはさらに、抗体または抗体の一部の保存寿命または有効性を高める、湿潤化剤または乳化剤、保存剤または緩衝剤などの補助物質を微量含むことができる。
hIL−12に結合する能力を考慮すると、本発明の抗hIL−12抗体又はその部分は、酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)又は免疫組織化学のような従来の免疫測定法を使用して、hIL−12を検出する(例えば血清又は血漿のような生物学的サンプルにおいて)ために使用できる。本発明は、生物学的サンプルを本発明の抗体又は抗体部分に接触させ、hIL−12に結合した抗体(又は抗体部分)又は結合していない抗体(又は抗体部分)のいずれかを検出し、それによって生物学的サンプル中のhIL−12を検出することを含む、生物学的サンプルにおいてhIL−12を検出するための方法を提供する。結合又は非結合抗体の検出を容易にするために、検出可能な物質で抗体を直接又は間接的に標識する。適当な検出可能物質は、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光材料、及び放射性物質を含む。適当な酵素の例は、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含む;適当な補欠分子族複合体の例は、ストレプタビジン/ビオチン及びアビジン/ビオチンを含む;適当な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリトリンを含む;発光材料の例はルミノールを含む;そして適当な放射性物質の例は、125I、131I、35S又は3Hを含む。
A.慢性関節リウマチ
インターロイキン−12は、慢性関節リウマチのような炎症性疾患において役割を果たすことが示唆されてきた。誘導性IL−12p40メッセージが慢性関節リウマチ患者からの滑液において検出され、IL−12が慢性関節リウマチ患者の滑液中に存在することが示された(例えば、Moritaら(1998)Arthritis and Rheumatism 41:306−314参照)。IL−12陽性細胞が慢性関節リウマチ滑膜の下内層に存在することが認められた。本発明のヒト抗体及び抗体部分は、例えば、慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、ライム関節炎、リウマチ様脊椎炎、変形性関節症及び痛風性関節炎を治療するために使用できる。典型的には、当該抗体又は抗体部分は全身的に投与されるが、一部の疾患については抗体又は抗体部分の局所投与が有益であると考えられる。本発明の抗体又は抗体部分は、自己免疫疾患の治療において有用な1つ又はそれ以上の追加治療薬と共に投与することもできる。
インターロイキン−12は、炎症性腸疾患であるクローン病においても役割を果たす。クローン病の患者の腸粘膜ではIFN−γ及びIL−12の発現上昇が起こる(例えばFaisら(1994)J.Interferon Res.14:235−238;Parronchiら(1997)Amer.J.Pathol.150:823−832;Monteleoneら(1997)Gastroenterology 112:1169−1178;Berrebiら(1998)Amer.J.Pathol.152:667−672参照)。抗IL−12抗体は、大腸炎のマウスモデル、例えばTNBS誘発大腸炎のIL−2ノックアウトマウスにおいて、また最近ではIL−10ノックアウトマウスにおいて疾患を抑制することが示された。それ故、本発明の抗体及び抗体部分は炎症性腸疾患の治療において使用することができる。
インターロイキン−12は、多発性硬化症の鍵となるメディエイタとして示唆されてきた。誘導性IL−12p40メッセージ又はIL−12自体の発現を多発性硬化症の患者の病巣において明らかにすることができる(Windhagenら(1995)J.Exp.Med.182:1985−1996、Drulovicら(1997)J.Neurol.Sci.147:145−150)。多発性硬化症の慢性進行性患者はIL−12の高い循環レベルを有している。多発性硬化症の患者からのT細胞と抗原呈示細胞(APC)を検討すると、Th1型免疫応答を導く進行性多発性硬化症の基礎として、自己永続系の免疫相互作用が明らかになった。T細胞からのINF−γの分泌上昇がAPCによるIL−12産生の上昇を導き、それがTh1型免疫の活性化と疾患の慢性状態へと導くサイクルを永続化させた(Balashovら(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94:599−603)。多発性硬化症におけるIL−12の役割は、多発性硬化症のマウス及びラットの実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)モデルを使用して検討されてきた。マウスにおける多発性硬化症の再発性−弛張性EAEモデルにおいて、抗IL−12mAbによる前処置は麻痺を遅延させ、臨床スコアを低下させた。麻痺のピーク時又はその後の寛解期の間に抗IL−12mAbで処置すると、臨床スコアを低下させた。従って、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、ヒトにおける多発性硬化症に関連する症状を軽減するのに役立つと考えられる。
インターロイキン−12は、インスリン依存性糖尿病(IDDM)の重要なメディエイタとして示唆されてきた。IDDMはIL−12の投与によりNODマウスにおいて誘発され、抗IL−12抗体はIDDMの養子免疫伝達モデルにおいて保護的であった。早期発症のIDDM患者はしばしば、ある程度の残存膵島細胞機能が維持される、いわゆる「ハネムーン期間」を経験する。これらの残存膵島細胞はインスリンを産生し、投与されるインスリンよりも良好に血中グルコースレベルを調節する。抗IL−12抗体でこれらの早期発症患者を治療することは、膵島細胞のさらなる破壊を予防し、それによってインスリンの内因性ソースを維持すると考えられる。
インターロイキン−12は乾癬の鍵となるメディエイタとして示唆されてきた。乾癬は、TH1型サイトカイン発現プロフィールに関連する急性及び慢性皮膚病変を含む。(Hamidら(1996)J.Allergy Clin.Immunol.1:225−231;Turkaら(1995)Mol.Med.1:690−699)。罹病ヒト皮膚サンプルにおいてIL−12p35及びp40mRNAが検出された。それ故、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、乾癬のような慢性皮膚疾患を軽減するのに役立つと考えられる。
ヒト扁桃(scFv1と称される)、扁桃と末梢血リンパ球(PBL)(scFv2と称される)、及び骨髄由来リンパ球(BMDLと称される)から誘導されるmRNAからのヒトVL及びVH cDNAを使用して調製した3つの別個のファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによってhIL−12に対する抗体を単離した。ライブラリーの構築と選択のための方法は、Vaughanら(1996)Nature Biotech.14:309−314に記述されている。
クローンを、IL−12レセプタ結合アッセイ(RBAと称する)においてIL−12がそのレセプタに結合するのを阻害する能力に関して試験し、また実施例3で述べるように、IL−12が誘発する、PHA刺激ヒト芽細胞の増殖を阻害する能力に関して試験した(PHAアッセイ)。クローンJoe9はRBA及びPHAアッセイの両方でIC50値が最も低く、両方のアッセイにおいてIC50値は1×10−6Mであった。さらに、Joe9のH鎖可変領域(VH)は、VBASEデータベースから同定された最も近い生殖細胞系配列、COS−3と比べて最小の変化を有していた。表1(付属物A参照)は、COS−3がそのメンバーである生殖細胞系配列のVH3ファミリー、ならびに生殖細胞系配列のVλ1ファミリーのメンバーを示している。それ故、Joe9を親和性成熟のために選択した。Joe9野生型(Joe9wt)抗体のVH及びVLのアミノ酸配列を図1A−1Dに示す。
最良の結合特性を示した突然変異体L鎖及びH鎖クローンを、組合せとscFvの構築のために使用した。改善された効力特性を持つ突然変異体クローンを、上述したような突然変異を生じたVH及びVLセグメントのPCRオーバーラップ伸長とプル・スルー(pull−through)によって組み合わせた。表2(付属物A参照)に示すクローン101−14から26−1までが、H鎖突然変異体(70−2、70−13及び70−1)とL鎖突然変異体(78−34、78−35及び79−1)の組合せから生成された。これらのクローンに関する中和アッセイからのkoff速度及び/又はIC50を表2に示す。
クローン101−11のさらなる親和性成熟は、スパイクオリゴヌクレオチドプライマーを使用した101−11のH鎖及びL鎖CDR3の両方のPCR突然変異導入のサイクルの繰り返しから成るものであった。ビオチニル化IL−12(bio−IL−12)の濃度が低いクローンを選択した。突然変異を生じたクローンの結合特性をBIAコア結合アッセイ及びRBA、PHA中和アッセイによって評価した。クローン136−9から170−25までについてのkoff速度及び/又はIC50値を表2に示す(付属物A参照)。クローン103−14は、レセプタ結合アッセイとPHA芽細胞アッセイの両方で改善されたIC50値を示した。クローン103−14は低いkoff速度も示し、それ故、さらなる親和性成熟のための選択した。
クローン103−14のL鎖CDR3(QSYDRGFTGSMV(配列番号590))を、下記に概説する3つの異なるライブラリーを使用して系統的にランダム化した。Xは、配列NNS配列のランダム化コドンによってコードされ、Nは何らかのヌクレオチド、Sはデオキシシトシン又はデオキシグアニジンのいずれかである。
L3.1=XXXXXXFTGSMV(配列番号591)
L3.2=QSYXXXXXXSMV(配列番号592)
L3.3=QSYDRGXXXXXX(配列番号593)
典型的には、改善された親和性を持つ組換え抗体の選択はファージディスプレイ法を用いて実施できる。これは、CDR残基の組合せをランダムに突然変異させて、異なる配列の一本鎖抗体を含む大きなライブラリーを作製することによって実現される。典型的には、抗体−抗原反応において平衡に達する能力に基づいて、改善された親和性を持つ抗体を選択する。しかし、Y61scFVがファージ表面に発現されて、IL−12と共にインキュベーションしたとき、系が正常な抗体−抗原平衡に達することを可能にする選択条件を見出すことができなかった。精製Y61scFvは正常な解離動態を示すので、scFV−ファージは、おそらく非特異的相互作用のためにIL−12に結合したままであった。Y61へのファージディスプレイ親和性成熟の通常の方法(すなわち多数のCDR残基の突然変異誘発によるライブラリーの作製と選択)が使用できなかったため、個々のCDR位置を突然変異させる新しい戦略を開発した。
本発明のヒト抗ヒトIL−12抗体の機能的活性を調べるため、抗体がIL−12活性を阻害する能力を測定するいくつかのアッセイにおいて抗体を使用した。
Current Protocols in Immunology,Unit 7.1に述べられているように1500rpmで45分間のフィコール−ハイパック比重差遠心によって健常ドナーから採集したロイコパックから、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を単離した。水性血液溶液とリンパ球分離媒質の界面でPBMCを採集し、1500rpmで15分間の遠心分離によりリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄してフィコール−パック粒子を除去した。
抗IL−12抗体が、PHA芽細胞上のIL−12レセプタへの放射標識IL−12の結合を阻害する能力を次のように分析した。種々の濃度の抗IL−12抗体を、結合緩衝液(RPMI 1640、5%FBS、25mM Hepes pH7.4)中で50−100pMの125I−hIL−12(Bolton−Hunter標識法を使用してNEN−Dupontからヨウ素標識hIL−12を20−40mCi/mgの比活性で調製した)と共に37℃で1時間プレインキュベーションした。上述したように分離したPHA芽細胞を1回洗浄して、結合緩衝液中に2×107細胞/mlの細胞密度で再懸濁した。PHA芽細胞(1×106細胞)を抗体/125I−hIL−12混合物に加え、室温で2時間インキュベーションした。アッセイ混合物を室温で30秒間遠心分離にかけ、液体を吸引して、0.1ml結合緩衝液で洗ったあと、10,000×gで4分間、4℃で遠心分離して、細胞結合放射能を遊離125I−hIL−12から分離した。ガンマカウンターを使用して、細胞ペレットを細胞結合放射能に関して検査した。抗体不在下で総結合を測定し、アッセイに25nM非標識IL−12を含めることによって非特異的結合を測定した。インキュベーションは2回実施した。
抗IL−12抗体を、PHA芽細胞増殖(かかる増殖はIL−12によって刺激される)を阻害する能力に関して評価した。抗IL−12抗体の連続希釈を、マイクロタイタープレート(U底、96穴、Costar,Cambridge,MA)の100ml RPMI完全培地中で、230pg/mlのhIL−12と共に5%CO2、37℃で1時間プレインキュベーションした。上述したように分離したPHA芽細胞を1回洗浄し、RPMI完全培地中に3×105細胞/mlの細胞密度で再懸濁した。PHA芽細胞(100ml、3×104細胞)を抗体/hIL−12混合物に加え、5%CO2、37℃で3日間インキュベーションし、0.5mCi/穴(3H)−チミジン(Amersham,Arlington Heights,IL)で4−6時間標識した。培養内容物をセルハーベスター(Tomtec,Orange,CT)によってガラス繊維フィルター上に採集し、細胞DNAへの(3H)−チミジンの取込みを液体シンチレーションカウンターで測定した。すべてのサンプルを2回検定した。
抗IL−12抗体が、PHA芽細胞によるIFNγの産生(かかる産生はIL−12によって刺激される)を阻害する能力を次のように分析した。種々の濃度の抗IL−12抗体を、マイクロタイタープレート(U底、96穴、Costar)の100ml RPMI完全培地中で、200−400pg/mlのhIL−12と共に5%CO2、37℃で1時間プレインキュベーションした。上述したように単離したPHA芽細胞を1回洗浄し、RPMI完全培地中に1×107細胞/mlの細胞密度で再懸濁した。PHA芽細胞(1×106細胞 100μl)を抗体/hIL−12混合物に加え、5%CO2、37℃で18時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞不含上清150μlを各穴から取り出し、産生されたヒトIFNγのレベルをELISA(Endogen Interferon gamma ELISA,Endogen,Cambridge,MA)によって測定した。
ヒト抗hIL−12抗体と他の種からのIL−12の交叉反応性を調べるため、非ヒトIL−12を次のように生成した。カニクイザル、ヒヒ及びイヌ、PBMCについてはリンホプレップ(Nycomed,Oslo,Norway)、イヌPBMCについてはAccu−paque(Accurate Chemical & Sci.Corp.,Westbury,NY)、あるいはラットPBMCについてはLympholyte−rat(Accurate Chemcial & Sci.Corp.,Westbury,NY)を使用して、上述したような密度勾配遠心分離によって新鮮ヘパリン化血からPBMCを分離した。
マウスT細胞クローン2D6はマウスIL−2、IL−4、IL−7及びIL−12に応答して増殖する(Maruoら(1997)J.Leukocyte Biol.61,346−352)。ラットIL−12を含むラットPBMC上清に応答した有意の増殖も検出された。かかる細胞はイヌ、カニクイザル、ヒヒ又はヒトIL−12には応答しない。50mM β−メルカプトエタノール(βME)と30ng/mlのマウスIL−12を補足したRPMI完全培地中でマウス2D6細胞を増殖させた。アッセイの1日前に、マウスIL−12を洗い出し、細胞をRPMI完全培地プラスβME中でひと晩インキュベーションした。
いくつかのヒト以外の種から分離したPBMCを使用して非ヒトIL−12とJ695の種交叉反応性を分析した。ラット、イヌ、カニクイザル及びヒヒPBMC上清中の非ヒトIL−12活性の存在を、マウス2D6細胞増殖アッセイ、ヒトPHA芽細胞増殖アッセイ、及びマウス及び/又はヒトIL−12に対するウサギ及び/又はヒツジポリクローナル抗体で非ヒトPBMC誘導の応答を遮断することによるインターフェロン−γ誘導アッセイのような、上述したいくつかのバイオアッセイを用いて確認した。ヒト抗hIL−12抗体Y61及びJ695と、PBMC上清中の非ヒトIL−12又は精製マウス及びアカゲザルIL−12の交叉反応性を、応答の50%阻害が認められるJ695抗体の独活を測定することにより、同じバイオアッセイにおいて評価した。種交叉反応性の結果を表5に要約する。結果は、Y61とJ695がそれぞれサルからのIL−12(例えばY61についてはカニクイザル及びアカゲザルIL−12、J695についてはカニクイザル、アカゲザル及びヒヒ)を認識することができ、J695はイヌIL−12に対して約35倍活性が低く、Y61及びJ695のいずれもがマウス又はラットIL−12と交叉反応しないことを示している。
ヒトサイトカインのパネルを、可溶性J695の固定ヒトIL−12への結合に干渉する能力に関して試験する、競合ELISAにおいてJ695の特異性を検討した。ヒトサイトカインのパネルは、IL−1α及びIL−1β(Genzyme,Boston,MA)、IL−2(Endogen)、IL−4、IL−10、IL−17、IFN−γ、及びTGF−β1(R&D,Minneapolis,MN)、IL−8(Calbiochem)、PDGF、IGF−I及びIGF−II(Boehringer Mannheim Corp.,Indianapolis,IN)、TNFα及びリンホトキシン、IL−6、可溶性IL−6レセプタ、IL−11、IL−12p70、IL−12p40、M−CSF、及びLIFを含む。Bリンパ球においてエプスタイン−バーウイルス感染によって誘導されるIL−12p40関連タンパクであるEBI−3(Devergneら(1996)J.Virol.70,1143−1153)は、ヒトIgG−Fcキメラ(EBI−3/Fc)として発現された。一本鎖サケ精子DNA(Sigma)も試験した。
p35サブユニットが新規p19分子で置換された代替的なIL−12ヘテロダイマーが記述されている。p19は、IL−6/IL−12ファミリーメンバーに関する3D相同性検索を用いて同定されたもので、活性化樹状細胞によって合成される。p19はp40に結合して、IL−12様活性を持つp19/p40ダイマーを形成するが、IFNγ誘導におけるp35/p40ヘテロダイマーほど強力ではない。p40だけを認識する抗体であるが、好ましくはp70分子(例えばJ695及びY61、実施例3H参照)に関連して、p35/p40分子とp19/p40分子の両方を中和することも予想される。
カニクイザルにおける末梢血液学へのヒトIL−12の作用を調べるため、Breeらが使用したものから改変したモデルにおいてIL−12誘導応答へのIL−12抗体のin vivo作用を検討した(Breeら(1994)Biochem Biophys Res.Comm.204:1150−1157)。それらこれまでの試験では、1μg/kg/日のヒトIL−12の5日間にわたる投与は、24時間後に白血球数(WBC)、特にリンパ球と単球のサブセットの低下を生じた。IFN−γに応答した単球活性化のマーカーである血漿ネオプテリンのレベルが24時間目に上昇し始め、72時間目に最も高くなった。
捕獲したリガンド(ヒト抗rhIL−12抗体J695、バイオセンサーマトリックス上で捕獲)と分析物(溶液中のrhIL−12)間のリアルタイムでの結合相互作用を、BIAコアシステム(Biacore AB,Uppsala,Sweden)を用いた表面プラスモン共鳴(SPR)によって測定した。このシステムは、SPRの光学特性を利用してデキストランバイオセンサーマトリックス内のタンパク濃度の変化を検出する。デキストランマトリックスを通して抗体を注入すると、注入した抗体と固定されたリガンド間の特異結合がマトリックスタンパク濃度の上昇をもたらし、SPRシグナルの変化を生じさせる。SPRシグナルのこれらの変化は共鳴ユニット(RU)として記録され、センサーグラムのy軸に沿って経時的に表示される。
J695抗体とヒトIL−12間の分子反応速度相互作用をBIAコアプラスモン共鳴テクノロジーを用いて定量的に分析し、見かけ反応速度定数を推定した。
マウスIL−12に特異的なモノクローナル抗体を使用した炎症と自己免疫のマウスモデルにおけるIL−12処置試験の、ヒト疾患での同様のアプローチとの関連性を評価するため、ラット抗マウスIL−12モノクローナル抗体、C17.15とマウスIL−12の相互作用を検討した。PHA芽細胞増殖アッセイにおいてC17.15がマウスIL−12活性を中和し、マウスIL−12が細胞表面レセプタに結合するのを遮断する能力を、C17.15−マウスIL−12結合相互作用の動態として評価した。
A.α−IL−12抗体C17.15によるマウスでの膠原誘発関節炎の抑制
IL−12レベルと慢性関節リウマチ(RA)の相関が明らかにされている。例えば、健常対照と比較してRA患者の滑液におけるIL−12p70レベルの上昇が検出された(Moritaら(1998)Arthritis and Rheumatism 41:306−314)。それ故、ラット抗マウスIL−12抗体、C17.15がマウスにおいて膠原誘発関節炎を抑制する能力を評価した。
IL−12が大腸炎の発症/病理において役割を果たすことも明らかにされた。例えば、抗IL−12抗体は、大腸炎のマウスモデルにおける疾患、例えばIL−2ノックアウトマウスにおけるTNBS誘発の大腸炎を抑制することが示されている(Simpsonら(1998)J.Exp.Med.187(8):1225−34)。同様に、抗IL−2抗体はIL−10ノックアウトマウスにおける大腸炎を抑制することが明らかにされている。ラット抗マウスIL−12抗体、C17.15がマウスにおいてTNBS大腸炎を抑制する能力を2つの試験で評価した(Davidら(1998)J.Immunol.161(6):3143−9)。
IL−12は多発性硬化症(MS)の病因において役割を果たすと一般的に信じられている。誘導性IL−12p40メッセージがMS患者の急性斑において発現されるが、炎症性脳梗塞病巣では発現されないことが示された(Windhagen,A.ら(1995)J.Exp.Med.182:1985−1996)。MS患者からのT細胞は、調節されないCD40L発現を通して抗原呈示細胞からのIL−12産生を刺激する(対照T細胞は刺激しない)(Balashov,K.E.ら(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:599−603)。MS患者は、in vitroでα−IL−12抗体によって遮断されうる高いIFN−γ分泌を有する(Balashov,K.E.ら(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:599−603)。MS患者では高いレベルの血清IL−12が検出されるが、これは他の神経学的疾患では見られない(Nicoletti,F.ら(1996)J.Neuroimmunol.70:87−90)。MS患者ではIL−12産生の上昇は疾患の活動と相関することが示された(Cormabella,M.ら(1998)J.Clin.Invest.102:671−678)。多発性硬化症のマウスモデル、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)の病因におけるIL−12の役割が検討されている(Leonard,J.P.ら(1995)J.Exp.Med.181:281−386;Banerjee,S.ら(1998)Arthritis Rheum.(1998)41:S33;及びSegal,B.M.ら(1998)J.Exp.Med.187:537−546)。このモデルにおける疾患は、TH1サブセットのT細胞によって誘発されることが知られている。それ故、α−IL−12抗体が急性EAEの発症を予防する能力を評価した。
二重盲検交叉試験試験において、ヒト男性被験者に漸増用量のJ695又はプラセボを投与した。投与前と15分後の補体断片C3aの測定は補体系の活性化を示さなかった。併発感染の症状が認められた被験者においてのみCRPとフィブリノーゲンレベルが上昇した。
J695の組換え発現のために、抗体H鎖と抗体L鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを、リン酸カルシウムを介したトランスフェクションによってdhfr−CHO細胞(Urlaub,G.とChasin,L.A.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216−4220)に導入する。組換え発現ベクター内で、抗体H鎖とL鎖の遺伝子を各々エンハンサー/プロモーター調節要素(例えば、CMVエンハンサー/AdMLPプロモーター調節要素又はSV40エンハンサー/AdMLPプロモーター調節要素のような、SV40、CMV、アデノウイルス等から誘導した)に作動可能に連結して、高いレベルの遺伝子転写を駆動する。組換え発現ベクターはDHFR遺伝子も担い、かかる遺伝子は、メトトレキセート選択/増幅を用いてベクターでトランスフェクションされたCHO細胞の選択を可能にする。
当業者は、常套的な実験だけを用いてここで述べた本発明の特定実施形態の多くの等価物を認識する、若しくは確認できるであろう。そのような等価物は特許請求の範囲に包含されることが意図されている。
Claims (147)
- ヒト抗体が中和抗体である、ヒトIL−12に結合する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- ヒトIL−12に結合するように、好ましい選択的変異位置、接触位置、または過剰変異位置において活性を向上させるアミノ酸残基により選択的に変異させた、ヒト抗体またはその抗体結合部分を含む、選択的変異ヒトIL−12抗体。
- ヒトIL−12に結合するように、好ましい選択的変異位置において活性を向上させるアミノ酸残基により選択的に変異させたヒト抗体またはその抗体結合部分を含む、選択的変異ヒトIL−12抗体。
- 前記ヒト抗体またはその抗原結合部分が、1つを超える好ましい選択的変異位置、接触位置、または過剰変異位置で活性を向上させるアミノ酸残基により選択的に変異された、請求項2に記載の選択的変異ヒトIL−12抗体。
- 前記ヒト抗体またはその抗原結合部分が、3箇所以下の好ましい選択的変異位置、接触位置、または過剰変異位置において選択的に変異された、請求項4に記載の選択的変異ヒトIL−12抗体。
- 前記ヒト抗体またはその抗原結合部分が、2箇所以下の好ましい選択的変異位置、接触位置、または過剰変異位置で選択的に変異された、請求項4に記載の選択的変異ヒトIL−12抗体。
- 前記ヒト抗体またはその抗原結合部分が、ファージディスプレイ技術を用いて同一の抗原に対して抗体を選択した場合に達成可能なレベルを超えるように目標特異性親和性レベルを達成するように選択的に変異される、請求項2に記載の選択的変異ヒトIL−12抗体。
- 前記選択的変異ヒト抗体が、少なくとも1つの所望の特性または特徴をさらに保持する、請求項7に記載の選択的変異ヒトIL−12抗体。
- ヒトIL−12に結合し、表面プラスモン共鳴で測定すると0.1s−1以下のkoff速度定数でヒトIL−12から解離するか、in vitroフィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ(PHAアッセイ)において1×10−6M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- 表面プラスモン共鳴で測定すると1×10−2s−1以下のkoff速度定数でヒトIL−12から解離するか、in vitroPHAアッセイにおいて1×10−7M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害する、請求項9に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- 表面プラスモン共鳴で測定すると1×10−3s−1以下のkoff速度定数でヒトIL−12から解離するか、in vitroPHAアッセイにおいて1×10−8M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害する、請求項9に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- 表面プラスモン共鳴で測定すると1×10−4s−1以下のkoff速度定数でヒトIL−12から解離するか、in vitroPHAアッセイにおいて1×10−9M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害する、請求項9に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- 表面プラスモン共鳴で測定すると1×10−5s−1以下のkoff速度定数でヒトIL−12から解離するか、in vitroPHAアッセイにおいて1×10−10M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害する、請求項9に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- 表面プラスモン共鳴で測定すると1×10−5s−1以下のkoff速度定数でヒトIL−12から解離するか、in vitroPHAアッセイにおいて1×10−11M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害する、請求項9に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- 以下の特徴:
a)in vitroPHAアッセイにおいて1×10−6M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
b)配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を有し、
c)配列番号2のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。 - 配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号4のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2をさらに有する、請求項15に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- 配列番号5のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1および配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1をさらに有する、請求項15に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- 配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変部および配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- 以下の特徴:
a)in vitroPHAアッセイにおいて1×10−9M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
b)配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を有し、
c)配列番号10のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。 - 配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2をさらに有する、請求項19に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- 配列番号13のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1および配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1をさらに有する、請求項19に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- 配列番号15のアミノ酸配列を含む重鎖可変部および配列番号16のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有する、請求項19に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- a)in vitroPHAアッセイにおいて1×10−9M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
b)配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を有し、
c)配列番号18のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。 - 配列番号19のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号20のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2をさらに有する、請求項23に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- 配列番号21のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1および配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1をさらに有する、請求項23に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- 配列番号23のアミノ酸配列を含む重鎖可変部および配列番号24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、およびIgE定常部からなる群から選択される重鎖定常部を含む、請求項26に記載の単離ヒト抗体。
- 前記抗体重鎖定常部がIgG1である、請求項27に記載の単離ヒト抗体。
- Fabフラグメントである、請求項26に記載の単離ヒト抗体。
- F(ab’)2フラグメントである、請求項26に記載の単離ヒト抗体。
- 短鎖Fvフラグメントである、請求項26に記載の単離ヒト抗体。
- a)in vitroPHAアッセイにおいて1×10−9M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害するか、
b)配列番号404〜配列番号469からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を有するか、
c)配列番号534〜配列番号579からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。 - 配列番号335〜配列番号403からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2または配列番号506〜配列番号533からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2をさらに有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- 配列番号288〜配列番号334からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1または配列番号470〜配列番号505からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1をさらに有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- 配列番号23のアミノ酸配列を含む重鎖可変部および配列番号24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、およびIgE定常部からなる群から選択される重鎖定常部を含む、請求項35に記載の単離ヒト抗体。
- 前記抗体重鎖定常部がIgG1である、請求項36に記載の単離ヒト抗体。
- Fabフラグメントである、請求項35に記載の単離ヒト抗体。
- F(ab’)2フラグメントである、請求項35に記載の単離ヒト抗体。
- 短鎖Fvフラグメントである、請求項35に記載の単離ヒト抗体。
- a)in vitroPHAアッセイにおいて1×10−9M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
b)配列番号25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を有し、
c)配列番号26のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。 - 配列番号27のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2および配列番号28のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2をさらに有する、請求項41に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- 配列番号29のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1および配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1をさらに有する、請求項41記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- 配列番号31のアミノ酸配列を含む重鎖可変部および配列番号32のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、およびIgE定常部からなる群から選択される重鎖定常部を含む、請求項44に記載の単離ヒト抗体。
- 前記抗体重鎖定常部がIgG1である、請求項45に記載の単離ヒト抗体。
- Fabフラグメントである、請求項44に記載の単離ヒト抗体。
- F(ab’)2フラグメントである、請求項44に記載の単離ヒト抗体。
- 短鎖Fvフラグメントである、請求項44に記載の単離ヒト抗体。
- a)in vitroPHAアッセイにおいて1×10−6M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
b)配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および配列番号5のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、または接触位置または過剰変異位置に1つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および配列番号5のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1を含む抗体より10倍以下高いkoff速度を有し、
c)配列番号2のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、配列番号4のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、または接触位置または過剰変異位置で1つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号2のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR4、配列番号3のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1を含む抗体より10倍以下高いkoff速度を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。 - a)in vitroPHAアッセイにおいて1×10−9M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
b)配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および配列番号13のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、または接触位置または過剰変異位置で1つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および配列番号13のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1を含む抗体より10倍以下高いkoff速度を有し、
c)配列番号10のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、または接触位置または過剰変異位置で1つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号10のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1を含む抗体より10倍以下高いkoff速度を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。 - a)in vitroPHAアッセイにおいて1×10−9M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
b)配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号19のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および配列番号21のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、または接触位置または過剰変異位置で1つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号19のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および配列番号21のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1を含む抗体より10倍以下高いkoff速度を有し、
c)配列番号18のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、配列番号20のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、または接触位置または過剰変異位置で1つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号18のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR4、配列番号20のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1を含む抗体より10倍以下高いkoff速度を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。 - 配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3をコードする単離核酸。
- 抗体重鎖可変部をコードする、請求項53に記載の単離核酸。
- 前記抗体重鎖可変部のCDR2が配列番号19のアミノ酸配列を含む、請求項54に記載の単離核酸。
- 前記抗体重鎖可変部のCDR1が配列番号21のアミノ酸配列を含む、請求項54に記載の単離核酸。
- 配列番号23のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変部をコードする、請求項56に記載の単離核酸。
- 配列番号18のアミノ酸を含む軽鎖CDR3をコードする単離核酸。
- 抗体軽鎖可変部をコードする、請求項58に記載の単離核酸。
- 前記抗体軽鎖可変部のCDR2が配列番号20のアミノ酸配列を含む、請求項59に記載の単離核酸。
- 前記抗体軽鎖可変部のCDR1が配列番号22のアミノ酸配列を含む、請求項59に記載の単離核酸。
- 配列番号24のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変部をコードする、請求項61に記載の単離核酸。
- a)in vitroPHAアッセイにおいて1×10−9M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
b)配列番号25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号27のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および配列番号29のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、または接触位置または過剰変異位置で1つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号27のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および配列番号29のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1を含む抗体より10倍以下高いkoff速度を有し、
c)配列番号26のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、配列番号28のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、または接触位置または過剰変異位置で1つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号26のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、配列番号28のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1を含む抗体より10倍以下高いkoff速度を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。 - 配列番号25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3をコードする単離核酸。
- 抗体重鎖可変部をコードする、請求項64に記載の単離核酸。
- 前記抗体重鎖可変部のCDR2が配列番号27のアミノ酸配列を含む、請求項65に記載の単離核酸。
- 前記抗体重鎖可変部のCDR1が配列番号29のアミノ酸配列を含む、請求項65に記載の単離核酸。
- 配列番号31のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変部をコードする、請求項67に記載の単離核酸。
- 配列番号26のアミノ酸を含む軽鎖CDR3をコードする単離核酸。
- 抗体軽鎖可変部をコードする、請求項69に記載の単離核酸。
- 前記抗体軽鎖可変部のCDR2が配列番号28のアミノ酸配列を含む、請求項70に記載の単離核酸。
- 前記抗体軽鎖可変部のCDR1が配列番号30のアミノ酸配列を含む、請求項70に記載の単離核酸。
- 配列番号32のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変部をコードする、請求項72に記載の単離核酸。
- 以下の特徴:
a)ヒトIL−12に結合し、表面プラスモン共鳴で測定すると0.1s−1のkoff速度定数でヒトIL−12から解離するか、in vitroフィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ(PHAアッセイ)において1×10−6M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
b)VH3生殖系列ファミリーメンバーから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変部を有し、前記重鎖可変部は接触または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基との変異を有し、
c)Vλ1生殖系列ファミリーメンバーから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有し、前記軽鎖可変部は接触または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基との変異を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。 - 以下の特徴:
a)ヒトIL−12に結合し、表面プラスモン共鳴で測定すると0.1s−1以下のkoff速度定数でヒトIL−12から解離するか、in vitroフィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ(PHAアッセイ)において1×10−6M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
b)配列番号595〜667からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変部を有し、前記重鎖可変部は接触または過剰変異位置における活性を向上させるアミノ酸残基による変異を有し、
c)配列番号669〜675からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有し、前記軽鎖可変部は接触または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基との変異を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。 - 以下の特徴:
a)ヒトIL−12に結合し、表面プラスモン共鳴で測定すると0.1s−1以下のkoff速度定数でヒトIL−12から解離するか、in vitroフィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ(PHAアッセイ)において1×10−6M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
b)COS−3生殖系列アミノ酸配列を含む重鎖可変部を有し、前記重鎖可変部は接触または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基による変異を有し、
c)DPL8生殖系列アミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有し、前記軽鎖可変部は接触または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基による変異を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。 - 以下の特徴:
a)ヒトIL−12に結合し、表面プラスモン共鳴で測定すると0.1s−1以下のkoff速度定数でヒトIL−12から解離するか、in vitroフィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ(PHAアッセイ)において1×10−6M以下のIC50でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
b)VH3生殖系列ファミリーメンバーから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変部を有し、前記重鎖可変部は他のVH3生殖系列ファミリーメンバー由来のCDR2に構造的に類似したCDR2および他のVH3生殖系列ファミリーメンバー由来のCDR1に構造的に類似したCDR1を含み、前記重鎖可変部は接触または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基による変異を有し、
c)Vλ1生殖系列ファミリーメンバーから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有し、前記軽鎖可変部は他のVλ1生殖系列ファミリーメンバー由来のCDR2に構造的に類似したCDR2および他のVλ1生殖系列ファミリーメンバー由来のCDR1に構造的に類似したCDR1を含み、前記軽鎖可変部は接触または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基による変異を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。 - 前記変異が前記重鎖CDR3中に存在する、請求項74、請求項75、請求項76、または請求項77に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- 前記変異が前記軽鎖CDR3中に存在する、請求項74、請求項75、請求項76、または請求項77に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- 前記変異が前記重鎖CDR2中に存在する、請求項74、請求項75、請求項76、または請求項77に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- 前記変異が前記軽鎖CDR2中に存在する、請求項74、請求項75、請求項76、または請求項77に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- 前記変異が前記重鎖CDR1中に存在する、請求項74、請求項75、請求項76、または請求項77に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- 前記変異が前記軽鎖CDR1中に存在する、請求項74、請求項75、請求項76、または請求項77に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- a)配列番号31のアミノ酸配列を含む可変部を有する抗体重鎖および
b)配列番号32のアミノ酸配列を含む可変部を有する抗体軽鎖を含む、組換え発現ベクター。 - 請求項84に記載の組換え発現ベクターが移入されている、宿主細胞。
- ヒトIL−12に結合するヒト抗体が細胞によって合成されるまで、培養培地中で請求項85に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、ヒトIL−12に結合するヒト抗体の合成法。
- ヒトIL−12ならびにヒヒIL−12、マーモセットIL−12、チンパンジーIL−12、カニクイザルIL−12、およびアカゲザルIL−12からなる群から選択される少なくとも1つのさらなる霊長類IL−12の活性を中和するがマウスIL−12の活性を中和しない、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
- 請求項1〜52、請求項74〜83、および請求項87のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合部分および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
- 請求項1〜52、請求項74〜83、および請求項87のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合部分およびさらなる薬剤を含む組成物。
- 前記さらなる薬剤が治療薬である、請求項89に記載の組成物。
- 前記治療薬が、ブデノシド、上皮成長因子、コルチコステロイド、シクロスポリン、スルファラジン、アミノサリチレート、6−メルカプトプリン、アザチオプリン、メトロニダゾール、リポキシゲナーゼインヒビター、メサラミン、オルサラジン、バルサラジド、抗酸化薬、トロンボキサンインヒビター、IL−1レセプタアンタゴニスト、抗IL−1βモノクローナル抗体、抗IL−6モノクローナル抗体、成長因子、エラスターゼインヒビター、ピリジニル−イミダゾール化合物、TNF、LT、IL−1、IL−2、IL−6、IL−7、IL−8、IL−15、IL−16、IL−18、EMAP−II、GM−CSF、FGF,およびPDGFの抗体またはアゴニスト、CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90の抗体またはそのリガンド、メトトレキセート、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノマイド、NSAID、イブプロフェン、コルチコステロイド、プレドニゾロン、ホスホジエステラーゼインヒビター、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、捕体インヒビター、アドレナリン作用薬、IRAK、NIK、IKK,p38、MAPキナーゼインヒビター、IL−1β変換酵素インヒビター、TNFα変換酵素インヒビター、T細胞シグナル伝達インヒビター、メタロプロテイナーゼインヒビター、スルファサラジン、アザチオプリン、6−メルカプトプリン、アンギオテンシン変換酵素インヒビター、可溶性サイトカインレセプタ、可溶性p55TNFレセプタ、可溶性p75TNFレセプタ、sIL−1RI、sIL−1RII、sIL−6R、抗炎症性サイトカイン、IL−4、IL−10、IL−11、IL−13、およびTGFβからなる群から選択される、請求項90に記載の組成物。
- 前記治療薬が、抗TNF抗体およびその抗体フラグメント、TNFR−Ig構築物、TACEインヒビター、PDE4インヒビター、コルチコステロイド、ブデノシド、デキサメタゾン、スルファサラジン、5−アミノサリチル酸、オルサラジン、IL−1β変換酵素インヒビター、IL−1ra、チロシンキナーゼインヒビター、6−メルカプトプリン、ならびにIL−11からなる群から選択される、請求項90に記載の治療組成物。
- 前記治療薬が、コルチコステロイド、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキセート、4−アミノピリジン、チザニジン、インターフェロンβ1a、インターフェロンβ1b、コポリマー1、高圧酸素、静脈内免疫グロブリン、クラブリビン(clabribine)、TNF、LT、IL−1、IL−2、IL−6、IL−7、IL−8、IL−15、IL−16、IL−18、EMAP−II、GM−CSF、FGF、およびPDGFの抗体またはアゴニスト、CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45,CD69、CD80、CD86、CD90の抗体またはそのリガンド、メトトレキセート、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノマイド、NSAID、イブプロフェン、コルチコステロイド、プレドニゾロン、ホスホジエステラーゼインヒビター、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、捕体インヒビター、アドレナリン作用薬、IRAK、NIK、IKK、p38またはMAPキナーゼインヒビター、IL−1β変換酵素インヒビター、TACEインヒビター、T細胞シグナル伝達インヒビター、キナーゼインヒビター、メタロプロテイナーゼインヒビター、スルファサラジン、アザチオプリン、6−メルカプトプリン、アンギオテンシン変換酵素インヒビター、可溶性サイトカインレセプタ、可溶性p55TNFレセプタ、可溶性p75TNFレセプタ、sIL−1RI、sIL−1RII、sIL−6R、sIL−13R、抗P7、p−セレクチン糖タンパク質リガンド(PSGL)、抗炎症性サイトカイン、IL−4、IL−10、IL−13、およびTGFβからなる群から選択される、請求項90に記載の治療組成物。
- ヒトIL−12活性を阻害するようにヒトIL−12と請求項44に記載の抗体とを接触させる工程を包含する、ヒトIL−12活性の阻害法。
- ヒト対象におけるヒトIL−12活性が阻害されるようにヒト対象に請求項44に記載の抗体を投与する工程を包含する、IL−12活性が有害な障害を有するヒト被験体におけるヒトIL−12活性の阻害法。
- 前記障害が、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、若年型慢性関節炎、ライム関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、強直性脊椎炎、全身性紅斑性狼瘡、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、喘息、アレルギー性疾患、乾癬、皮膚炎、強皮症、甲状腺炎、移植片対宿主疾患、臓器移植拒絶、臓器移植に関連する急性もしくは慢性免疫疾患、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、血管内凝固症候群、川崎病、グレーブス病、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、結節性多発性動脈炎、ヴェグナー肉芽腫症、ヘーノホ−シェーンライン紫斑病、腎臓の微視的脈管炎、慢性滑動性肝炎、シェーグレン症候群、ブドウ膜炎、敗血症、敗血症性ショック、敗血症症候群、成人呼吸窮迫症候群、悪液質、感染症、寄生虫症、後天性免疫不全症候群、急性横断性脊髄炎、重症筋無力症、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、原発性胆汁性肝硬変、線維性肺疾患、溶血性貧血、悪性腫瘍、心不全、および心筋梗塞からなる群から選択される、請求項95に記載の方法。
- 前記障害がクローン病である、請求項95に記載の方法。
- 前記障害が多発性硬化症である、請求項95に記載の方法。
- 前記障害が慢性関節リウマチである、請求項95に記載の方法。
- a)親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
b)H30、H31、H31B、H32、H33、H53、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、およびL94からなる群から選択される好ましい選択的変異誘発位置を選択する工程と、
c)前記選択された好ましい選択的変異位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異することによって変異抗体またはその抗原結合物の第1のパネルを作製する工程と、
d)1つの選択的変異位置の変異により予め同定した目標活性または部分的目標活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるかどうかを決定するために、前記変異抗体またはその抗原結合部分の第1のパネルの活性を評価する工程と、
e)前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す各変異を段階的に組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
f)前記組み合わせ抗体またはその抗原結合部分が予め同定した目標活性または部分的目標活性を有するかどうかを決定するために、前記組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程と、
g)工程d)または工程f)で予め同定した目標活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られないか部分的活性のみを有する抗体が得られる場合、前記方法はH35、H50、H53、H54、H95、H96、H97、H98、L30A、およびL96からなる群から選択されるさらなるアミノ酸残基を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にさらに変異して、変異抗体またはその抗原結合部分の第2のパネルを作製する工程をさらに包含し、
h)H35、H50、H53、H54、H95、H96、H97、H98、L30A、およびL96からなる群から選択される1つのアミノ酸残基の変異により予め同定した目標活性またはその部分的活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるかどうかを決定するために、前記変異抗体またはその抗原結合部分の第2のパネルの活性を評価する工程と、
i)前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す工程g)の各変異を段階的に組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
j)前記組み合わせ抗体またはその抗原結合部分が予め同定した目標活性または部分的標的活性を有するかどうかを決定するために、前記組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程と、
k)工程h)または工程j)で予め同定した目標活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られないか部分的活性のみを有する抗体が得られる場合、前記方法はH33B、H52B、およびL31Aからなる群から選択されるさらなるアミノ酸残基を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にさらに変異することによって変異抗体またはその抗原結合部分の第3のパネルを作製する工程をさらに包含し、
l)H33B、H52B、およびL31Aからなる群から選択される1つのアミノ酸残基の変異により予め同定した目標活性またはその部分的活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるかどうかを決定するために、前記変異抗体またはその抗原結合部分の第3のパネルの活性を評価する工程と、
m)前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す工程k)の各変異を段階的に組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
n)前記組み合わせ抗体またはその抗原結合部分が予め同定した目標活性または部分的標的活性を有し、それによって予め同定した目標活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるのかどうかを決定するために、前記組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程と、
を包含する、予め同定した目標活性を達成するための抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。 - a)親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
b)変異のために、相補性決定領域(CDR)内で好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を選択することによって選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を同定する工程と、
c)前記好ましい選択的変異誘発位置または接触位置または過剰変異位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製する工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価する工程と、
e)前記所望の抗体活性が得られない場合、少なくとも1つの他の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置について工程b)〜d)を繰り返す工程と、
f)前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す各変異を段階的に組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
g)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程と、
を包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。 - 前記接触位置が、H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94、およびL96からなる群から選択される、請求項101に記載の方法。
- 前記過剰変異位置が、H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53、およびL93からなる群から選択される、請求項101に記載の方法。
- 前記好ましい位置が、H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、およびL94からなる群から選択される、請求項101に記載の方法。
- 前記接触位置が、L50およびL94からなる群から選択される、請求項101に記載の方法。
- a)ファージディスプレイ系での選択によって得られたがその活性を前記ファージディスプレイ系における変異誘発によってさらに改良することができない組換え親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
b)変異のために、相補性決定領域(CDR)内で好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を選択することによって選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を同定する工程と、
c)前記好ましい選択的変異誘発位置または接触位置または過剰変異位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、前記非ファージディスプレイ系におけるパネルを発現させる工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価する工程と、
e)前記所望の抗体活性が得られない場合、少なくとも1つの他の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置について工程b)〜d)を繰り返す工程と、
f)前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す各変異を組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
g)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程と、を包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。 - 前記接触位置が、H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94、およびL96からなる群から選択される、請求項106に記載の方法。
- 前記過剰変異位置が、H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53、およびL93からなる群から選択される、請求項106に記載の方法。
- 前記好ましい選択的変異誘発位置が、H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、およびL94からなる群から選択される、請求項106に記載の方法。
- 前記接触位置が、L50およびL94からなる群から選択される、請求項106に記載の方法。
- a)組換え親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
b)相補性決定領域(CDR)内で好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を変異について選択することによって選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を同定する工程と、
c)前記選択された好ましい選択的変異誘発位置または接触位置または過剰変異位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、前記適切な発現系におけるパネルを発現させる工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
e)親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも1つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも1つの他の特性または特徴について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程と、を包含し、前記特性または特徴は抗体中で維持されなければならないものである、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。 - 前記接触位置が、H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94、およびL96からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な抗体からなる群から選択される、請求項111に記載の方法。
- 前記過剰変異位置が、H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53、およびL93からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項111に記載の方法。
- 前記好ましい選択的変異誘発位置が、H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、およびL94からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項111に記載の方法。
- 前記接触位置が、L50およびL94からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項111に記載の方法。
- a)ファージディスプレイ系での選択によって得られたがその活性を前記ファージディスプレイ系における変異誘発によってさらに改良することができない親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
b)相補性決定領域(CDR)内で好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を変異について選択することによって選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を同定する工程と、
c)前記選択された好ましい変異誘発位置または接触位置または過剰変異位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、前記非ファージディスプレイ系におけるパネルを発現させる工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
e)親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも1つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも1つの他の特性または特徴について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程であって、前記特性または特徴は維持されなければならないものである、
f)少なくとも1つの他の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置について工程a)〜e)を繰り返す工程と、
g)前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性および少なくとも1つの保持された特性または特徴を有することを示す少なくとも2つの各活性を向上させるアミノ酸残基を組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
h)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも1つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程とを包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。 - 前記接触位置が、H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94、およびL96からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項116に記載の方法。
- 前記過剰変異位置が、H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53、およびL93からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項116に記載の方法。
- 前記好ましい選択的変異誘発位置が、H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、およびL94からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項116に記載の方法。
- 前記接触位置が、L50およびL94からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項116に記載の方法。
- a)ファージディスプレイ系での選択によって得られたがその活性を前記ファージディスプレイ系における変異誘発によってさらに改良することができない組換え親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
b)相補性決定領域(CDR)内で接触位置または過剰変異位置を変異について選択することによって選択した接触位置または過剰変異位置を同定する工程と、
c)前記接触位置または過剰変異位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、前記非ファージディスプレイ系におけるパネルを発現させる工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
e)親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも1つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも1つの他の特性または特徴について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程と、を包含し、前記特性または特徴は維持されなければならないものである、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。 - 前記接触位置が、H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94、およびL96からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項121に記載の方法。
- 前記過剰変異位置が、H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53、およびL93からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項121に記載の方法。
- 前記接触位置が、L50およびL94からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項111に記載の方法。
- a)ファージディスプレイ系での選択によって得られたがその活性を前記ファージディスプレイ系における変異誘発によってさらに改良することができない組換え親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
b)相補性決定領域(CDR)内で好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を変異について選択することによって選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を同定する工程と、
c)前記好ましい選択的変異誘発位置または接触位置または過剰変異位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、前記非ファージディスプレイ系におけるパネルを発現させる工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
e)親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも1つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも1つの他の特性または特徴について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程であって、前記特性または特徴は維持されなければならないものである、
f)少なくとも1つの他の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置について工程a)〜e)を繰り返す工程と、
g)前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性および少なくとも1つの保持された特性または特徴を有することを示す少なくとも2つの各活性を向上させるアミノ酸残基を組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
h)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも1つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程と、を包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。 - 前記接触位置が、H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94、およびL96からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項125に記載の方法。
- 前記過剰変異位置が、H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53、およびL93からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項125に記載の方法。
- 前記好ましい選択的変異誘発位置が、H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、およびL94からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項125に記載の方法。
- 前記接触位置が、L50およびL94からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項125に記載の方法。
- a)親親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
b)変異のために、H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94、およびL96以外の位置で相補性決定領域(CDR)内でアミノ酸残基を選択する工程と、
c)前記選択位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基に変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製する工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
e)親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも1つの他の特性または特徴の変化について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程と、を包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。 - a)親親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
b)変異のために、H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94、およびL96以外の位置で相補性決定領域(CDR)内でアミノ酸残基を選択する工程と、
c)前記選択位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基に変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製する工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
e)工程b)で選択された位置でもH30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94、およびL96での位置でもないCDR内の少なくとも1つの他の位置について工程b)〜工程d)を繰り返す工程と、
f)前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す少なくとも2つの各活性を向上させるアミノ酸残基を組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
g)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して、活性を向上させるアミノ酸残基を有する組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程と、を包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。 - a)ファージディスプレイ系での選択によって得られるがその活性を前記ファージディスプレイ系における変異誘発によってさらに改良することができない組換え抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
b)変異のために、H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、およびL94以外の位置で相補性決定領域(CDR)内でアミノ酸残基を選択する工程と、
c)前記選択した接触または過剰変異位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、前記非ファージディスプレイ系におけるパネルを発現させる工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
e)親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも1つの他の特性または特徴の変化について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程とを包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。 - a)ファージディスプレイ系での選択によって得られたがその活性を前記ファージディスプレイ系における変異誘発によってさらに改良することができない親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
b)変異のために、H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94、およびL96以外の位置で相補性決定領域(CDR)内でアミノ酸残基を選択する工程と、
c)前記選択位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、非ファージディスプレイ系で発現させる工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
e)工程b)で選択された位置でもH30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、およびL94での位置でもないCDR内の少なくとも1つの他の位置について工程b)〜工程d)を繰り返す工程と、
f)前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す少なくとも2つの各活性を向上させるアミノ酸残基を組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
g)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記組換え抗体またはその抗原結合部分と比較して、2つの活性を向上させるアミノ酸残基を有する組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性および他の特性または特徴を評価する工程と、を包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。 - a)親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
b)変異のために、H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94、およびL96以外の位置で相補性決定領域(CDR)内でアミノ酸残基を選択する工程と、
c)前記選択位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製する工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
e)親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも1つの他の特性または特徴の変化について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを評価する工程と、を包含し、前記特性または特徴は維持されなければならないものである、他の特性に影響を与えない抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。 - a)親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
b)変異のために、H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94、およびL96以外の位置で相補性決定領域(CDR)内でアミノ酸残基を選択する工程と、
c)前記選択位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製する工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
e)少なくとも1つの他の特性または特徴の変化について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程と、
f)工程b)で選択された位置でもH30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94、およびL96での位置でもない少なくとも1つのCDR位置について工程b)〜工程e)を繰り返す工程と、
g)前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示すが少なくとも1つの特性または特徴に影響を与えない少なくとも2つの各活性を向上させるアミノ酸残基を組み合わせて、少なくとも1つの特性または特徴を保持した組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
h)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも1つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して、2つの活性を向上させるアミノ酸残基を有する組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性および少なくとも1つの特性または特徴を評価する工程と、を包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。 - a)ファージディスプレイ系での選択によって得られたがその活性を前記ファージディスプレイ系における変異誘発によってさらに改良することができない親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
b)変異のために、H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94、およびL96以外の位置で相補性決定領域(CDR)内でアミノ酸残基を選択する工程と、
c)前記選択位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、非ファージディスプレイ系で発現させる工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
e)親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも1つの他の特性または特徴の変化について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを評価する工程と、を包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。 - a)ファージディスプレイ系での選択によって得られたがその活性を前記ファージディスプレイ系における変異誘発によってさらに改良することができない親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
b)変異のために、H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94、およびL96以外の位置で相補性決定領域(CDR)内でアミノ酸残基を選択する工程と、
c)前記選択位置を少なくとも2つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、非ファージディスプレイ系で発現させる工程と、
d)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性および少なくとも1つの他の特性または特徴の保持を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
e)工程b)で選択された位置でもH30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、およびL94での位置でもない少なくとも1つの他のCDR位置について工程b)〜工程d)を繰り返す工程と、
f)前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示し、且つ少なくとも1つの他の特性または特徴に影響を与えない少なくとも2つの各活性を向上させるアミノ酸残基を組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
g)前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも1つの他の保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記組換え抗体またはその抗原結合部分と比較して、活性を向上させる2つのアミノ酸残基を有する組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性および少なくとも1つの他の特性または特徴の保持を評価する工程と、を包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。 - 前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項130、131、132、133、134、135、136、または137のいずれか1項に記載の方法。
- ヒトIL−12が検出されるように、IL−12と請求項1〜52、74〜83、および87のいずれか1項に記載のヒトIL−12と抗体またはその抗原結合部分とを接触させる工程を包含する、ヒトIL−12の検出法。
- 前記ヒトIL−12がin vitroで検出される、請求項139に記載の方法。
- 前記ヒトIL−12が診断目的で生体サンプル中で検出される、請求項139に記載の方法。
- 治療における請求項1〜52、74〜83、および87のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合部分の使用。
- IL−12活性が有害である障害の治療用の薬物製造における請求項1〜52、74〜83、および87のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合部分の使用。
- 前記障害が、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、若年型慢性関節炎、ライム関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、強直性脊椎炎、全身性紅斑性狼瘡、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、喘息、アレルギー性疾患、乾癬、皮膚炎、強皮症、甲状腺炎、移植片対宿主疾患、臓器移植拒絶、臓器移植に関連する急性もしくは慢性免疫疾患、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、血管内凝固症候群、川崎病、グレーブス病、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、結節性多発性動脈炎、ヴェグナー肉芽腫症、ヘーノホ−シェーンライン紫斑病、腎臓の微視的脈管炎、慢性滑動性肝炎、シェーグレン症候群、ブドウ膜炎、敗血症、敗血症性ショック、敗血症症候群、成人呼吸窮迫症候群、悪液質、感染症、寄生虫症、後天性免疫不全症候群、急性横断性脊髄炎、重症筋無力症、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、原発性胆汁性肝硬変、線維性肺疾患、溶血性貧血、悪性腫瘍、心不全、および心筋梗塞からなる群から選択される、請求項143に記載の使用。
- 前記障害がクローン病である、請求項143に記載の使用。
- 前記障害が多発性硬化症である、請求項143に記載の使用。
- 前記障害が慢性関節リウマチである、請求項143に記載の使用。
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