BG106027A - Човешки антитела, които свързват човешки il-12 и методи за получаване - Google Patents

Човешки антитела, които свързват човешки il-12 и методи за получаване Download PDF

Info

Publication number
BG106027A
BG106027A BG106027A BG10602701A BG106027A BG 106027 A BG106027 A BG 106027A BG 106027 A BG106027 A BG 106027A BG 10602701 A BG10602701 A BG 10602701A BG 106027 A BG106027 A BG 106027A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
antigen
antibody
amino acid
activity
binding portion
Prior art date
Application number
BG106027A
Other languages
English (en)
Other versions
BG66399B1 (bg
Inventor
Jochen Salfeld
Michael Roguska
Michael Paskind
Subhashis Banerjee
Daniel TRACEY
Michael White
Zehra Kaymakcalan
Boris Labkovsky
Paul Sakorafas
Stuart Friedrich
Angela Myles
Geertruida Veldman
Amy Venturini
Nicholas WARNE
Angela Widom
John ELVIN
Alexander Duncan
Elaine DERBYSHIRE
Sara Carmen
Stephen Smith
Thor HOLTET
FOU Sarah DU
Original Assignee
Genetics Institute, Llc
Abbott Gmbh & Co. Kg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22425740&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BG106027(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genetics Institute, Llc, Abbott Gmbh & Co. Kg filed Critical Genetics Institute, Llc
Publication of BG106027A publication Critical patent/BG106027A/bg
Publication of BG66399B1 publication Critical patent/BG66399B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/16—Central respiratory analeptics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A61P5/16—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4 for decreasing, blocking or antagonising the activity of the thyroid hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до човешки антитела, по-специално до рекомбинантни човешки антитела, свързващи специфично човешки интерлевкин-12 (hIL-12). Теимат висока специфичност за hIL-12 и неутрализират активността на hIL-12 in vivo и in vitro, като могат да бъдат с пълна дължина или антиген-свързващи части от антитяло. Антителата или частите от тяхса полезни при откриване на hIL-12 и за инхибиране активността му при хора, страдащи от заболявания, при които активността на hIL-12 е вредна. Изобретението се отнася също до нуклеинови киселини, до вектори, до клетки-гостоприемници за експресията на рекомбинантните човешки антитела, както и до методи за синтезиране на рекомбинантни човешки антитела.

Description

Човешки антитела, които свързват човешки IL-12 и методи за получаване
Сродни заявки
Тази заявка е не-временна заявка, претендираща за приоритет спрямо временна заявка от Съединените щати Сериен № 60/126,603, подадена на 25 март 1999 г., чието съдържание е приложено тук като референция.
Област на техниката
Човешкият интерлевкин-12 (IL-12) неотдавна беше охарактеризиран като цитокин с уникална структура и плейотропни ефекти (Kobayashi, et al. (1989) J. Exp. Med. 170:827-845; Seder, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:10188-10192; Ling, et al. (1995) J. Exp. Med. 154:116-127; Podlaski, et al. (1992) Arch. Biochem. Biophys. 294:230-237). IL-12 играе важна роля в патологията, свързана с няколко болести, включващи имунен и възпалителен отговор. Обзор на IL-12, неговата биологична активност и ролята му при болести, може да бъде открит в Gately et al. (1998) Ann. Rev. Immunol. 16:495521.
Структурно IL-12 е хетеродимерен белтък, състоящ се от една субединица с 35 kDa (р35) и една субединица с 40 kDa (р40), които са свързани помежду си с помощта на дисулфиден мост (означена като “субединица р70”). Хетеродимерният белтък се образува първоначално в клетки, притежаващи антиген, такива като моноцити, макрофаги и дендритни клетки. Тези типове клетки секретират освен това и излишък на субединица р40 в сравнение със субединицата р70. Субединиците р35 и р40 генетически не са родствени и никога не е било съобщавано да притежават биологическа активност, въпреки че монодимерът на р40 може да функционира като антагонист на IL-12.
Функционално hIL-12 играе централна роля в регулирането на баланса между антиген специфичните Т-лимфоцити от помощен тип (Thl) и от тип 2 (Th2). Thl и Th2 клетките направляват започването и развитието на автоимунните разстройства, a IL-12 е съществено важен за регулацията на диференциацията и узряването на Thlлимфоцитите. Освобождаваните от Thl клетките цитокини са възпалителни и включват интерферон γ (IFNy), IL-2 и лимфотоксин (LT). Th2 клетките секретират IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 и IL-13, за да спомогнат за хуморалния имунитет, алергичните реакции и имуносупресията.
В съответствие с пребладаващите отговори на Thl при автоимунните болести и провъзпалителните активности на IFNy, IL12 може да играе основна роля в патологията, свързана с много автоимунни и възпалителни болести, такива като ревматоиден артрит (РА), множествена склероза (МС) и болестта на Крон.
Пациенти с МС са показали повишаване на експресията на IL12, както е документирано чрез нивата на иРНК на р40 в акутни МС плаки (Windhagen et al., (1995) J. Exp. Med. 182:1985-1996). B допълнение, ex vivo стимулирането на антиген-прпретежаващи клетки с експресиращи CD40L Т-клетки от МС пациенти доведе до повишена продукция на IL-12 в сравнение с контролните Т-клетки, което е в съгласие с наблюдението, че взаимодействията CD40/CD40L са възможни индуктори на IL-12.
Повишени нива на IL-12 р70 спрямо здрави контроли са били открити в синовните на РА пациенти (Morita et al., (1998) Arthritis and Rheumatism, 41:306-314). Експресионният профил на информационната рибонуклеинова киселина (иРНК) на цитокина в
РА синовните откри преобладаващо Thl цитокини. (Bucht et al., (1996) Clin. Exp. Immunol. 103:347-367). IL-12 изглежда, че играе важна роля в патологията, свързана с болестта на Крон (БК). Повишена експресия на IFNy и IL-12 е била наблюдавана в чревната лигавица на пациенти с тази болест (Fais et al., (1994) J. Interferon Res. 14:235-238; Parronchi et al., (1997) Am. J. Path. 150:823-832; Monteleone et al., (1997) Gastroenterology, 112:1169-1178, Berrebi et al., (1998) Am. J. Path. 152:667-672). Секреционният профил на цитокина на Т-клетките от ламина проприя на БК пациенти се характеризира с преобладаващ Thl отговор, включително силно повишени нива на IFNy, (Fuss et al., (1996/ J. Immunol. 157:12611270). Нещо повече, части от дебелото черво от БК пациенти показват изобилие от експресиращи IL-12 макрофаги и експресиращи IFNy Т-клетки (Parronchi et al., (1997) Am. J. path. 150:823-832).
Поради участието на човешки IL-12 в множество човешки разстройства, са разработени терапевтични стратегии за инхибиране или противодействие на активността на IL-12. По-конкретно антитела, които свързват и неутрализират IL-12 са разглеждани като средство за инхибиране на активността на IL-12. Някои от тези найпърви антитела бяха миши моноклонални антитела (mAbs), секретирани от хибридоми, получени от лимфоцити от мишки, които са били имунизирани с IL-12 (виж напр. World Patent Application Publication No. WO97/15327 by Strober et al.; Neurath et al. (1995) J. Exp. Med. 182:1281-1290; Duchmann et al. (1996) J. Immunol. 26:934-938). Тези миши IL-12 антитела са ограничени в употребата си in vivo поради проблеми, свързани с даването на хора на антитела от мишка, такива като кратко време на полуживот на серума, неспособност да отключат някои човешки ефекторни функции и предизвикване на нежелан имунен отговор срещу мишите антитела при човека (реакция “човешко антимишо антитяло” (НАМА)).
Като цяло опитите да се преодолее проблема, свързан с използването на напълно миши антитела при хора, включват генетично конструиране на антителата, за да бъдат повече “човекоподобни”. Например, получени са химерни антитела, в които променливите региони на веригите на антитялото са получени от мишка, а постоянните региони от веригите на антитялото са получени от човек (Junghans et al. (1990) Cancer Res. 50:1495-1502; Brown et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:2663-2667; Kettleborough et al. (1991) Protein Engineering 4:773-783). Ho тъй като тези химерни и хуманизирани антитела все още запазват някои миши последователности, те пак могат да предизвикат нежелана имунна реакция, реакцията на човешкото анти-химерно антитяло (НАСА), особено когато се дават за по-дълго време.
Предпочитан IL-12 инхибиращ агент за миши антитела или производни от тях (напр. химерни и хуманизирани антитела) би било напълно човешко анти-1Ь-12 антитяло, тъй като подобен агент не би предизвикал НАМА реакцията, дори и да се използва попродължителен период. Но такива антитела досега не са описани в литературата, следователно все още има нужда от тях.
Резюме на изобретението,
Настоящото изобретение осигурява човешки антитела, които свързват човешки IL-12. Изобретението се отнася и до третиране или предпазване на акутни и хронични болести или състояния, чиято патология включва IL-12, с помощта на човешките анти-1Ь-12 антитела, съгласно изобретението.
В един от аспектите изобретението осигурява изолирано човешко антитяло или антниген-свързваща част от него, което се свързва към човешки IL-12.
В едно изпълнение изобретението осигурява селективно мутирано човешко IL-12 антитяло, характеризиращо се с:
човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, селективно мутирано на предпочитана за селективна мутагенеза позиция, контактна или хипермутационна позиция с повишаващ активността аминокиселинен остатък така, че то да свързва човешки IL-12.
В едно изпълнение изобретението осигурява селективно мутирано човешко IL-12 антитяло, характеризиращо се с:
човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, селективно мутирано на предпочитана за селективна мутагенеза позиция с повишаващ активността аминокиселинен остатък така, че то да свързва човешки IL-12.
В друго предпочитано изпълнение селективно мутираното човешко IL-12 антитяло или антиген-свързващата част от него е селективно мутирано на повече от една предпочитана за селективна I мутагенеза позиция, контактна или хипермутационна позиция с повишаващ активността аминокиселинен остатък така, че то да свързва човешки IL-12. В друго предпочитано изпълнение селективно мутираното човешко IL-12 антитяло или антигенсвързващата част от него е селективно мутирано на не повече от три | предпочитани за селективна мутагенеза позиции, контактни или хипермутационни позиции. В друго предпочитано изпълнение
I селективно мутираното човешко IL-12 антитяло или антиген-[ свързващата част от него е селективно мутирано на не повече от две| предпочитани за селективна мутагенеза позиции, контактни илиI
I хипермутационни позиции. И пак в друго предпочитано изпълнение селективното мутиране е така, че е достигнато афинитетно ниво за целева специфичност, което е подобрено доста над това, което се достига, когато се селектира антитяло срещу същия антиген с помощта на технологията на фагово проявяване. В друго предпочитано изпълнение селективно мутираното човешко IL-12 антитяло запазва и по-нататък поне едно желано свойство или характеристика, напр. запазване на некръстосана реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани, запазване на разпознаването на епитопи, получаване на антитяло с близка до родителската линия имуноглобулин последователност.
В друго изпълнение изобретението дава изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което свързва човешки IL-12 и се дисоциира от човешки IL-12 със скоростна константа Koff от 0.1 s'1 или по-малка, както е определено чрез повърхностен плазмен резонанс, или което инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro анализ на фитохемаглутининовата бластна пролиферация (ФХА анализ) с 1С5о от 1 х ΙΟ'6 М или по-малко. По-специално, изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него се дисоциира от човешки IL-12 със скоростна константа Koff от 1 х 10‘2 s’1 или помалка, или инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ФХА с IC50 от 1 х 10' М или по-малко. По-специално изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него се дисоциира от човешки IL-12 със скоростна константа Koff от 1 х 10' s’ или по-малка, или инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ФХА анализ с 1С50 от 1 х 10‘8 М или помалко. По-специално изолираното човешко антитяло или антигенсвързваща част от него се дисоциира от човешки IL-12 със скоростна константа Koff от 1 х IO4 s'1 или по-малка, или инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ФХА анализ с 1С50 от 1 х ΙΟ'9 М или по-малко. По-специално, изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него се дисоциира от човешки IL-12 със скоростна константа Koff от 1 х 10'5 s1 или помалка, или инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ФХА анализ с IC50 от 1 х ΙΟ'10 М или по-малко. Още поспециално дори изолираното човешко антитяло или антигенсвързваща част от него се дисоциира от човешки IL-12 със скоростна константа KOff от 1 х 10‘5 s’1 или по-малка, или инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ФХА анализ с IC50 от 1 х 1011 М или по-малко.
В друго изпълнение изобретението осигурява изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което притежава следните характеристики:
A) инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ФХА анализ с 1С50 от 1 х ΙΟ’6 М или по-малко;
Б) има CDR3 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 1; иj
B) има CDR3 на лека верига, характеризиращ се сI аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 2.
В друго изпълнение изолираното човешко антитяло илиί антиген-свързваща част от него има CDR2 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 3; и има CDR2 на лека верига, характеризиращ се с| аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 4. ВI ϊ
предпочитано изпълнение изолираното човешко антитяло или| антиген-свързваща част от него има CDR1 на тежка верига,ί характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID|
I
I ί
NO: 5; и има CDR1 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 6. В предпочитано изпълнение изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него има вариабилен регион на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 7; и има вариабилен регион на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 8.
В друго изпълнение изобретението осигурява изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което притежава следните характеристики:
A) инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ФХА анализ с 1С50 от 1 х ΙΟ'9 М или по-малко;
Б) има CDR3 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 9; и
B) има CDR3 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 10.
В друго изпълнение изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него има CDR2 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 11; и има CDR2 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 12. В предпочитано изпълнение изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него има CDR1 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 13; и има CDR1 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 14. В предпочитано изпълнение изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него има вариабилен регион на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 15; и има вариабилен регион на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 16.
В друго изпълнение изобретението осигурява изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което притежава следните характеристики:
A) инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ФХА анализ с 1С5о от 1 х ΙΟ'9 М или по-малко;
Б) има CDR3 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 17; и
B) има CDR3 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 18.
В друго изпълнение изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него има CDR2 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 19; и има CDR2 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 20. В предпочитано изпълнение изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него има CDR1 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 21; и има CDR1 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 22. В предпочитано изпълнение изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него има вариабилен регион на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 23; и вариабилен регион на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 24. В друго изпълнение изолираното човешко антитяло съдържа постоянен регион на тежка верига, подбран от групата, състояща се от постоянните региони на IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA и IgE или всяка алелна тяхна вариация, както е дискутирано в Kabat et al. (Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Inerest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), приложена тук като референция. В поспециално изпълнение постоянният регион на тежката верига на антитялото е IgGl. В друго предпочитано изпълнение изолираното човешко антитяло е Fab фрагмент или F(ab’)2 фрагмент или едноверижен Fv фрагмент.
В друго изпълнение изобретението осигурява изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което:
A) инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ФХА анализ с 1С50 от 1 χ ΙΟ'9 М или по-малко;
Б) има CDR3 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 404-SEQ ID NO: 469; и
B) има CDR3 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 534-SEQ ID NO: 579.
В друго изпълнение изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него има CDR2 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност, подбрана от групата, състояща се от SEQ ID NO: 335-SEQ ID NO: 403; и CDR2 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност, подбрана от групата, състояща се от SEQ ID NO: 506-SEQ ID NO: 533. В предпочитано изпълнение изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него има CDR1 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност, подбрана от групата, състояща се от SEQ ID NO: 288-SEQ ID N0:334; и CDR на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 470-SEQ ID N0:505. В предпочитано изпълнение изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него има вариабилен регион на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 23, и вариабилен регион на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID N0:24. В предпочитано изпълнение изолираното човешко антитяло съдържа постоянен регион на тежка верига или Fab фрагмент, или F(ab’)2 фрагмент, или едноверижен Fv фрагмент, както е описано по-горе.
В друго изпълнение изобретението осигурява изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което:
A) инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ФХА анализ с 1С50 от 1 х ΙΟ’9 М или по-малко;
Б) има CDR3 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 25; и
B) има CDR3 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 26.
В друго изпълнение изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него има CDR2 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 27; и CDR2 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 28. В предпочитано изпълнение изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него има CDR1 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 29; и CDR1 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 30. В предпочитано изпълнение изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него има вариабилен регион на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 31; и вариабилен регион на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 32. В предпочитано изпълнение изолираното човешко антитяло съдържа постоянен регион на тежка верига или Fab фрагмент, или F(ab’)2 фрагмент, или едноверижен Fv фрагмент, както е описано по-горе.
В друго изпълнение изобретението осигурява изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което:
A) инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ФХА анализ с 1С50 от 1 х ΙΟ'6 М или по-малко;
Б) съдържа CDR3 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 1, CDR2 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 3 и CDR1 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 5, или негов мутант, имащ едно или повече аминокиселинни замествания на контактна позиция или хипермутационна позиция, при което въпросният мутант има скорост KOff не повече от 10 пъти по-висока от антитялото, съдържащо CDR3 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 1, CDR2 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 3 и CDR1 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 5; и
B) съдържа CDR3 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 2, CDR2 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 4 и CDR1 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 6, или негов мутант, имащ едно или повече аминокиселинни замествания на контактна позиция или хипермутационна позиция, при което въпросният мутант има скорост Koff не повече от 10 пъти по-висока от антитялото, съдържащо CDR3 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 2, CDR2 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 4 и CDR1 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 6.
В друго изпълнение изобретението осигурява изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което:
А) инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro РНА анализ с IC50 от 1 х 10'9 М или по-малко;
Б) съдържа CDR3 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 9, CDR2 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 11 и CDR1 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 13, или негов мутант, имащ едно или повече аминокиселинни замествания на контактна позиция или хипермутационна позиция, при което въпросният мутант има скорост Koff не повече от 10 пъти по-висока от антитялото, съдържащо CDR3 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 9, CDR2 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 11 и CDR1 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 13; и
В) съдържа CDR3 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 10, CDR2 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 12 и CDR1 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 14, или негов мутант, имащ едно или повече аминокиселинни замествания на предпочитана за селективна мутагенеза позиция, контактна позиция или хипермутационна позиция, при което въпросният мутант има скорост Koff не повече от 10 пъти по-висока от антитялото, съдържащо CDR3 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 10, CDR2 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 12 и CDR1 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 14.
В друго изпълнение изобретението осигурява изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което:
А) инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ФХА анализ с IC50 от 1 х ΙΟ'9 М или по-малко;
Б) съдържа CDR3 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 17, CDR2 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 19 и CDR1 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 21, или негов мутант, имащ едно или повече аминокиселинни замествания на предпочитана за селективна мутагенеза позиция, контактна позиция или хипермутационна позиция, при което въпросният мутант има скорост Koff не повече от 10 пъти по-висока от антитялото, съдържащо CDR3 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 17, CDR2 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 19 и CDR1 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 21; и
В) съдържа CDR3 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 18, CDR2 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 20 и CDR1 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 22, или негов мутант, имащ едно или повече аминокиселинни замествания на предпочитана за селективна мутагенеза позиция, контактна позиция или хипермутационна позиция, при което въпросният мутант има скорост Koff не повече от 10 пъти по-висока от антитялото, съдържащо CDR3 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 18, CDR2 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 20 и CDR1 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 22.
Това изобретение се отнася и до молекули нуклеинова киселина, кодиращи антитела или антиген-свързващи части от тях, съгласно изобретението. Предпочитана изолирана нуклеинова киселина кодира CDR3 на тежката верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 17. Изолираната нуклеинова киселина кодира вариабилен регион на тежка верига на антитяло. В друго изпълнение изолираната нуклеинова киселина кодира CDR2 от вариабилния регион на тежката верига на антитялото, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 19. В друго изпълнение изолираната нуклеинова киселина кодира CDR1 от вариабилния регион на тежката верига на антитялото, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 21. В друго изпълнение изолираната нуклеинова киселина кодира вариабилен регион на тежката верига на антитялото, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 23. В друго изпълнение изолираната нуклеинова киселина кодира CDR3 на леката верига, характеризираща се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 18. Изолираната нуклеинова киселина, кодираща вариабилен регион на лека верига на антитяло. В друго изпълнение изолираната нуклеинова киселина кодира CDR2 от вариабилния регион на леката верига на антитялото, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 20. В друго изпълнение изолираната нуклеинова киселина кодира CDR1 от вариабилния регион на леката верига на антитялото, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 22. В друго изпълнение изолираната нуклеинова киселина кодира вариабилен регион на леката верига на антитялото, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 24.
В друго изпълнение изобретението осигурява изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което:
А) инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ФХА анализ с IC50 от 1 х 10'9 М или по-малко;
Б) съдържа CDR3 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 25, CDR2 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 27 и CDR1 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 29, или негов мутант, имащ едно или повече аминокиселинни замествания на предпочитана за селективна мутагенеза позиция, контактна позиция или хипермутационна позиция, при което въпросният мутант има скорост Koff не повече от 10 пъти по-висока от антитялото, съдържащо CDR3 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 25, CDR2 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 27 и CDR1 на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 29; и
В) съдържа CDR3 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 26, CDR2 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 28 и CDR1 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 30, или негов мутант, имащ едно или повече аминокиселинни замествания на предпочитана за селективна мутагенеза позиция, контактна позиция или хипермутационна позиция, при което въпросният мутант има скорост Koff не повече от 10 пъти по-висока от антитялото, съдържащо CDR3 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 26, CDR2 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 28 и CDR1 на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 30.
Предпочитана изолирана нуклеинова киселина кодира CDR3 на тежката верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 25. Изолираната нуклеинова киселина, кодираща вариабилен регион на тежка верига на антитяло. В друго изпълнение изолираната нуклеинова киселина кодира CDR2 от вариабилния регион на тежката верига на антитялото, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 27. В друго изпълнение изолираната нуклеинова киселина кодира CDR1 от вариабилния регион на тежката верига на антитялото, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 29. В друго изпълнение изолираната нуклеинова киселина кодира вариабилен регион на тежката верига на антитялото, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 31. В друго изпълнение изолираната нуклеинова киселина кодира CDR3 на леката верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 26. Изолираната нуклеинова киселина, кодираща вариабилен регион на лека верига на антитяло. В друго изпълнение изолираната нуклеинова киселина кодира CDR2 от вариабилния регион на леката верига на антитялото, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 28. В друго изпълнение изолираната нуклеинова киселина кодира CDR1 от вариабилния регион на леката верига на антитялото, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 30. В друго изпълнение изолираната нуклеинова киселина кодира вариабилен регион на леката верига на антитялото, характеризиращ се с аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 32.
В друг аспект изобретението се отнася до изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което има следните характеристики:
A) което се свързва към човешки IL-12 и се дисоциира от човешки IL-12 със скоростна константа Koff от 0.1 s'1 или по-малка както е определено чрез повърхностен плазмен резонанс, или което инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro анализ на фитохемаглутининовата бластна пролиферация (ФХА анализ) с IC50 от 1 χ 10'6 М или по-малко.
Б) има вариабилен регион на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинна последователност, подбрана от член на VH3 семейството зародишни линии, при което вариабилният регион на тежката верига има мутация на предпочитана за селективна мутагенеза позиция, контактна или хипермутационна позиция с усилващ активността аминокиселинен остатък.
B) има вариабилен регион на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинна последователност, подбрана от член на семейство от родителска линия νλ1, при което вариабилният регион на леката верига има мутация на предпочитана за селективна мутагенеза позиция, контактна или хипермутационна позиция с усилващ активността аминокиселинен остатък.
В друго изпълнение изобретението се отнася до изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което има следните характеристики:
А) което се свързва към човешки IL-12 и се дисоциира от човешки IL-12 с скоростна константа Koff от 0.1 s’1 или по-малка както е определено чрез повърхностен плазмен резонанс, или което инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro анализ на фитохемаглутининовата бластна пролиферация (ФХА анализ) с IC50 от 1 х 10‘6 М или по-малко.
Б) има вариабилен регион на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинна последователност, подбрана от групата, състояща се от SEQ ID NO: 595-667, където вариабилният регион на тежката верига има мутация на предпочитана за селективна мутагенеза позиция, контактна позиция или хипермутационна позиция с усилващ активността аминокиселинен остатък.
В) има вариабилен регион на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинна последователност, подбрана от групата, състояща се от SEQ ID NO: 669-675, при което вариабилният регион на леката верига има мутация на предпочитана за селективна мутагенеза позиция, контактна или хипермутационна позиция с усилващ активността аминокиселинен остатък.
В друго изпълнение изобретението се отнася до изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което има следните характеристики:
A) което се свързва към човешки IL-12 и се дисоциира от човешки IL-12 с скоростна константа Koff от 0.1 s’1 или по-малка както е определено чрез повърхностен плазмен резонанс, или което инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro анализ на фитохемаглутининовата бластна пролиферация (ФХА анализ) с 1С50 от 1 х ΙΟ'6 М или по-малко.
Б) има вариабилен регион на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинна последователност от COS-З родителска линия, където вариабилният регион на тежката верига има мутация на предпочитана за селективна мутагенеза позиция, контактна или хипермутационна позиция с усилващ активността аминокиселинен остатък.
B) има вариабилен регион на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинната последователност от DPL8 родителска линия, при което вариабилният регион на леката верига има мутация на предпочитана за селективна мутагенеза позиция, контактна или хипермутационна позиция с усилващ активността аминокиселинен остатък.
В друго изпълнение изобретението се отнася до изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което има следните характеристики:
A) което се свързва към човешки IL-12 и се дисоциира от човешки IL-12 с скоростна константа Koff от 0.1 s’1 или по-малка както е определено чрез повърхностен плазмен резонанс, или което инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro анализ на фитохемаглутининовата бластна пролиферация (ФХА анализ) с IC50 от 1 χ 10'6 М или по-малко.
Б) има вариабилен регион на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинна последователност, подбрана от член на Vh3 семейство от родителска линия, където вариабилният регион на тежката верига съдържа CDR2, който структурно е подобен на CDR2 от други членове от член на семейство от родителска линия VH3, и CDR1, който структурно е подобен на CDR1 от други членове на семейството от родителска линия VH3, и където вариабилният регион на тежката верига има мутация на предпочитана за селективна мутагенеза позиция, контактна позиция или хипермутационна позиция с усилващ активността аминокиселинен остатък.
B) има вариабилен регион на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинна последователност, подбрана от член на семейство от родителска линия νλ1, където вариабилният регион на леката верига съдържа CDR2, който структурно е подобен на CDR2 от други членове на семейството на родителска линия νλ1, и CDR1, който структурно е подобен на CDR1 от други членове на семейството на родителска линия νλ1, и където вариабилният регион на тежката верига има мутация на предпочитана за селективна мутагенеза позиция, контактна или хипермутационна позиция с усилващ активността аминокиселинен остатък.
В предпочитано изпълнение изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него има мутация в CDR3 на тежката верига. В друго предпочитано изпълнение изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него има мутация в CDR3 на леката верига. В друго предпочитано изпълнение изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него има мутация в CDR2 на тежката верига. В друго предпочитано изпълнение изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него има мутация в CDR2 на леката верига. В друго предпочитано изпълнение изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него има мутация в CDR1 на тежката верига. В друго предпочитано изпълнение изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него има мутация в CDR1 на леката верига.
В друг аспект изобретението се отнася до рекомбинантни експресионни вектори, носещи кодиращите антитялото нуклеинови киселини съгласно изобретението, и клетки-гостоприемник, в които са били внедрени такива вектори, също са обхванати от изобретението, както и методи за получаване на антителата, съгласно изобретението, чрез култивиране на клеткитегостоприемник, съгласно изобретението.
В друг аспект изобретението се отнася до изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което неутрализира активността на човешки IL-12 и поне един допълнителен IL-12 от примати, подбран от групата, състояща се от IL-12 на бабун, IL-12 на мармозетка, IL-12 на шимпанзе, IL-12 на циномолгус и IL-12 на резус, но който не неутрализира активността на миши IL-12.
В друг аспект изобретението се отнася до фармацевтичен препарат, съдържащ антитялото или антитяло или антигенсвързваща част от него съгласно изобретението, и фармацевтично приемлив носител.
В друг аспект изобретението се отнася до препарат, съдържащ антитялото или антиген-свързваща част от него и допълнителен агент, например, терапевтичен агент.
В друг аспект изобретението се отнася до метод за инхибиране активността на човешки IL-12, характеризиращ се с това, че включва влизането в контакт на човешкия IL-12 и антитялото, съгласно изобретението, т.е. J695, така, че се инхибира активността на човешкия IL-12.
В друг аспект изобретението се отнася до метод за инхибиране на активността на човешки IL-12 в индивиди, страдащи от разстройство, при което активността на IL-12 е вредна, включващ даването на индивида на антитялото, съгласно изобретението, т.е. J695, по такъв начин, че се инхибира активността на човешкия IL-12 в индивида. Разстройство може да бъде например болестта на Крон, множествена склероза или ревматоиден артрит.
В друг аспект изобретението разкрива метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързващата част от него, за да се получи предопределена целева активност, характеризираща се с:
А) осигуряване на родителско антитяло или антигенсвързваща част от него;
Б) подбиране на предпочитана позиция за селективна мутагенеза, подбрана от група, състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94.
В) индивидуално мутиране на избраната позиция за селективна мутагенеза до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин се създава първи панел на мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях;
Г) оценяване активността на първия панел от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, за да се определи дали мутация в една единствена позиция за селективна мутагенеза произвежда антитяло или антиген-свързваща част от него с предопределената целева активност или частична целева активност;
Д) комбиниране поетапно в родителското тяло или антигенсвързваща част от него на индивидуални мутации, които са показали подобрена активност, за да се образуват комбинирани антитела или антиген-свързващи части от тях;
Е) оценяване активността на комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях, за да се определи дали комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях имат предопределената целева активност или частична целева активност;
Ж) ако етапи г) или е) не доведат до антитяло или антигенсвързваща част от него, имащо предопределената целева активност, или се получи антитяло само с частична целева активност, на мутация се подлагат допълнителни аминокиселинни остатъци, подбрани от групата, състояща се от Н35, Н50, Н53, Н54, Н95, Н97, Н98, L30A и L96 до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин създава втори панел на мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях;
3) оценяване активността на втория панел от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, за да се определи дали мутацията на единичен аминокиселинен остатък, подбран от групата, състояща се от Н35, Н50, Н53, Н54, Н95, Н97, Н98, L30A и
L96 води до получаване на антитяло или антиген-свързваща част от него с предопределената целева активност или частична целева активност;
И) комбиниране поетапно в родителското тяло или антигенсвързваща част от него на отделните мутации от етап ж), които са показали подобрена активност, за да се образуват комбинирани антитела или антиген-свързващи части от тях.
К) оценяване активността на комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях, за да се определи дали комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях имат предопределената целева активност или частична целева активност;
Л) ако етапи з) или к) не доведат до антитяло или антигенсвързваща част от него, имащо предопределената целева активност, или се получи антитяло само с частична целева активност, на мутация се подлагат допълнителни аминокиселинни остатъци, подбрани от групата, състояща се от НЗЗВ, Н52В и L31A до наймалко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин се създава трети панел на мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях;
М) оценяване активността на третия панел от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, за да се определи дали мутация на единичен аминокиселинен остатък, подбран от групата, състояща се от НЗЗВ, Н52В и L31A води до получаване на антитяло или антиген-свързваща част от него с предопределената целева активност или частична целева активност;
Н) комбиниране поетапно в родителското тяло или антигенсвързваща част от него на отделните мутации от етап л), които са показали подобрена активност, за да се образуват комбинирани антитела или антиген-свързващи части от тях;
О) оценяване активността на комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях, за да се определи дали комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях имат предопределената целева активност, и по този начин да се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с предопределена целева активност.
В друг аспект изобретението разкрива метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързващата част от него, характеризиращ се с:
A) осигуряване на родителско антитяло или антигенсвързваща част от него;
Б) подбиране на предпочитана позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция с определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, като по този начин се идентифицира предпочитана позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция.
B) индивидуално мутиране на въпросната избраната позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин се създава панел на мутирани антитела или антигенсвързващи части от тях;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях в сравнение с родителското тяло или антиген-свързваща част от него;
Д) повторение на етапи б) до г) за най-малко една друга контактна или хипермутационна позиция;
Е) комбиниране в родителското тяло или антиген-свързваща част от него на индивидуални мутации, които са показали подобрена активност, за да се образуват комбинирани антитела или антиген шаййММ свързващи части от тях; и
Ж) оценяване активността на комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях в сравнение с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него; докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност в сравнение с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него.
В едно изпълнение изобретението се отнася до метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързващата част от него, характеризиращ се с:
A) осигуряване на рекомбинантно родителско антитяло или антиген-свързваща част от него, което е било получено чрез селекция в система на фагово проявяване, но чиято активност понататък не е била подобрена чрез мутагенеза във въпросната система на фагово проявяване;
Б) подбиране на предпочитана позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, като по този начин се идентифицира контактна или хипермутационна позиция.
B) индивидуално мутиране на въпросната избраната позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин се създава панел на мутирани антитела или антигенсвързващи части от тях, и експресиране на въпросния панел в система за не-фагово проявяване;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях в сравнение с родителското тяло или антиген-свързваща част от него;
Д) повторение на етапи б) до г) за най-малко една друга контактна или хипермутационна позиция;
Е) комбиниране в родителското тяло или антиген-свързваща част от него на индивидуални мутации, които са показали подобрена активност, за да се образуват комбинирани антитела или антигенсвързващи части от тях; и
Ж) оценяване активността на комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях в сравнение с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него; докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност, в сравнение с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него.
В предпочитано изпълнение контактните позиции са подбрани от групата, състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50,Н52,Н52А,Н53,Н54,Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96. В друго предпочитано изпълнение хипермутационните позиции са подбрани от групата, състояща се от НЗО, НЗ1, НЗ IB, Н32, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L53 и L93. В по-предпочитано изпълнение остатъците за селективна мутагенеза са подбрани от предпочитаните позиции за селективна мутагенеза от групата, състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94. В по-предпочитано изпълнение контактните позиции са подбрани от групата, състояща се от L50 и L94.
В друго изпълнение изобретението се отнася до метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързващата част от него, характеризиращ се с:
А) осигуряване на рекомбинантно родителско антитяло или антиген-свързваща част от него;
Б) подбиране на предпочитана позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, като по този начин се идентифицира избрана контактна или хипермутационна позиция.
В) индивидуално мутиране на въпросната избраната позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин се създава панел на мутирани антитела или антигенсвързващи части от тях, и експресиране на въпросния панел в подходяща експресионна система;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях в сравнение с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, като по този начин се определя усилващ активността аминокиселинен остатък;
Д) оценяване на панела от мутирани антитела или антигенсвързващи части от тях в сравнение с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, за поне едно друго качество или характеристика, при което качеството или характеристиката е такова, че е необходимо да бъде запазено в антитялото;
докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност и най-малко едно запазено качество или характеристика в сравнение с родителското антитяло или антигенсвързваща част от него.
В предпочитано изпълнение контактните позиции са подбрани от групата, състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35,Н50,Н52,Н52А,Н53,Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96, а другите характеристики са подбрани от 1) запазване на не30 кръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани; 2) запазване на разпознаване на епитопа, т.е. разпознаване на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимера, предотвратяващ свързващата интерференция от свободен, разтворим р40 и/или 3) да се получи антитяло с близка последователност до тази на имуноглобулин от родителската линия. В друго предпочитано изпълнение хипермутационните позиции са подбрани от групата, състояща се от НЗО, НЗ 1, НЗ IB, Н32, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L53 и L93, а другите характеристики са подбрани от 1) запазване на не-кръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани; 2) запазване на разпознаване на епитопа, т.е. разпознаване на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимера, предотвратяващ свързващата интерференция от свободен, разтворим р40 и/или 3) да се получи антитяло с последователност, близка до тази на родителската линия имуноглолубин. В по-предпочитано изпълнение остатъците за селективна мутагенеза са подбрани от предпочитаните позиции за селективна мутагенеза от групата, състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94, а другите характеристики са подбрани от 1) запазване на некръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани; 2) запазване на разпознаване на епитопа, т.е. разпознаване на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимера, предотвратяващ свързващата интерференция от свободен, разтворим р40 и/или 3) да се получи антитяло с последователност, близка до тази на родителската линия имуноглобулин. В по-предпочитано изпълнение контактните позиции са подбрани от групата, състояща се от L50 и L94, а другите характеристики са подбрани от 1) запазване на не-кръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани; 2) запазване на разпознаване на епитопа, т.е. разпознаване на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимера, предотвратяващ свързващата интерференция от свободен, разтворим р40 и/или 3) да се получи антитяло с последователност, близка до тази на родителската линия имуноглобулин.
В едно изпълнение изобретението се отнася до метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързващата част от него, характеризиращ се с:
A) осигуряване на рекомбинантно родителско антитяло или антиген-свързваща част от него, което е било получено чрез селекция във фагова дисплей система, но чиято активност понататък не може да бъде подобрена чрез мутагенеза във въпросната система на фагово проявяване;
Б) подбиране на предпочитана позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, като по този начин се идентифицира предпочитана позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция.
B) индивидуално мутиране на въпросната избраната позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин се създава панел на мутирани антитела или антигенсвързващи части от тях, и експресиране на въпросния панел в система за не-фагово проявяване;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях в сравнение с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, като по този начин се идентифицира усилващ активността аминокиселинен остатък;
Д) оценяване на панела от мутирани антитела или антигенсвързващи части от тях в сравнение с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, за поне едно друго качество или характеристика, при което качеството или характеристиката е такова, че е необходимо да бъде запазено в антитялото; докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност и най-малко едно запазено качество или характеристика, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него
Е) повторение на етапи а) до д) за най-малко една друга избраната позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция;
Ж) комбиниране в родителското тяло или антиген-свързваща част от него на най-малко два отделни усилващи активността аминокиселинни остатъка, които са показали подобрена активност, и най-малко едно запазено качество или характеристика, за да се получат комбинирани антитела или антиген-свързващи части от тях.
3) оценяване активността на комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях в сравнение с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него; докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност и най-малко едно запазено качество или характеристика, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него.
В предпочитано изпълнение контактните позиции са подбрани от групата, състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50,Н52,Н52А,Н53,Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96, а другите характеристики са подбрани от 1) запазване на некръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани; 2) запазване на разпознаване на епитопа, т.е. разпознаване на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р4О/р35 хетеродимера, предотвратяващ свързващата интерференция от свободен, разтворим р40 и/или 3) да се получи антитяло с последователност, близка до тази на родителската линия имуноглобулин. В друго предпочитано изпълнение хипермутационните позиции са подбрани от групата, състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L53 и L93, а другите характеристики са подбрани от 1) запазване на некръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани; 2) запазване на разпознаване на епитопа, т.е. разпознаване на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимера, предотвратяващ свързващата интерференция от свободен, разтворим р40 и/или 3) да се получи антитяло с последователност, близка до тази на родителската линия имуноглобулин. В по-предпочитано изпълнение остатъците за селективна мутагенеза са подбрани от предпочитаните позиции за селективна мутагенеза от групата, състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94, а другите характеристики са подбрани от 1) запазване на некръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани; 2) запазване на разпознаване на епитопа, т.е. разпознаване на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимера, предотвратяващ свързващата интерференция от свободен, разтворим р40 и/или 3) да се получи антитяло с последователност, близка до тази на родителската линия имуноглобулин. В по-предпочитано изпълнение контактните позиции са подбрани от групата, състояща се от L50 и L94, а другите характеристики са подбрани от 1) запазване на не-кръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани; 2) запазване на разпознаване на епитопа, т.е. разпознаване на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимера, предотвратяващ свързващата интерференция от свободен, разтворим р40 и/или 3) да се получи антитяло с последователност, близка до тази на родителската линия имуноглобулин.
В друго изпълнение изобретението се отнася до метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързващата част от него, характеризиращ се с това, че включва:
A) осигуряване на рекомбинантно родителско антитяло или антиген-свързваща част от него, което е било получено чрез селекция в система за фагово проявяване, но чиято активност понататък не може да бъде подобрена чрез мутагенеза във въпросната система за фагово проявяване;
Б) подбиране на контактна или хипермутационна позиция в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, като по този начин се идентифицира избрана контактна или хипермутационна позиция.
B) индивидуално мутиране на въпросната избраната контактна или хипермутационна позиция до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин се създава панел на мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, и експресиране на въпросния панел в нефагова дисплей система;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях в сравнение с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, като по този начин се определя усилващ активността аминокиселинен остатък;
Д) оценяване на панела от мутирани антитела или антигенсвързващи части от тях в сравнение с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, за поне едно друго качество или характеристика, при което качеството или характеристиката е такова, че е необходимо да бъде запазено в антитялото;
докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност и най-малко едно запазено качество или характеристика, сравнено с родителското антитяло или антигенсвързваща част от него.
В предпочитано изпълнение контактните позиции са подбрани от групата, състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96, а другите характеристики са подбрани от 1) запазване на не-кръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани; 2) запазване на разпознаване на епитопа, т.е. разпознаване на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимера, предотвратяващ свързващата интерференция от свободен, разтворим р40 и/или 3) да се получи антитяло с последователност, близка до тази на родителската линия имуноглобулин. В друго предпочитано изпълнение хипермутационните позиции са подбрани от групата, състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L53 и L93, а другите характеристики са подбрани от 1) запазване на не-кръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани; 2) запазване на разпознаване на епитопа, т.е. разпознаване на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимера, предотвратяващ свързващата интерференция от свободен, разтворим р40 и/или 3) да се получи антитяло с последователност, близка до тази на родителската линия имуноглобулин. В по-предпочитано изпълнение остатъците за селективна мутагенеза са подбрани от предпочитаните позиции за селективна мутагенеза от групата, състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94, а другите характеристики са подбрани от 1) запазване на некръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани; 2) запазване на разпознаване на епитопа, т.е. разпознаване на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимера, предотвратяващ свързващата интерференция от свободен, разтворим р40 и/или 3) да се получи антитяло с последователност, близка до тази на родителската линия имуноглобулин. В по-предпочитано изпълнение контактните позиции са подбрани от групата, състояща се от L50 и L94, а другите характеристики са подбрани от 1) запазване на не-кръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани; 2) запазване на разпознаване на епитопа, т.е. разпознаване на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимера, предотвратяващ свързващата интерференция от свободен, разтворим р40 и/или 3) да се получи антитяло с последователност, близка до тази на родителската линия имуноглобулин.
В едно изпълнение изобретението се отнася до метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързващата част от него, характеризиращ се с:
А) осигуряване на рекомбинантно родителско антитяло или антиген-свързваща част от него, което е било получено чрез селекция в система за фагово проявяване, но чиято активност понататък не може да бъде подобрена чрез мутагенеза във въпросната система за фагово проявяване;
Б) подбиране на предпочитана позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, като по този начин се идентифицира предпочитана позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция.
В) индивидуално мутиране на въпросната избраната позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин се създава панел на мутирани антитела или антигенсвързващи части от тях, и експресиране на въпросния панел в система за не-фагово проявяване;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях в сравнение с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, като по този начин се идентифицира усилващ активността аминокиселинен остатък;
Д) оценяване на панела от мутирани антитела или антигенсвързващи части от тях в сравнение с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, за поне едно друго качество или характеристика, при което качеството или характеристиката е такова, че е необходимо да бъде запазено; докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност и наймалко едно запазено качество или характеристика сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него
Е) повторение на етапи а) до д) за най-малко една друга избраната позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция;
Ж) комбиниране в родителското тяло или антиген-свързваща част от него на най-малко два отделни усилващи активността аминокиселинни остатъка, които са показали подобрена активност, и най-малко едно запазено качество или характеристика, за да се получат комбинирани антитела или антиген-свързващи части от тях.
3) оценяване активността на комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях в сравнение с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него; докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност и най-малко едно запазена качество или характеристика ,сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него.
В предпочитано изпълнение контактните позиции са подбрани от групата, състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96, а другите характеристики са подбрани от 1) запазване на не-кръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани; 2) запазване на разпознаване на епитопа, т.е. разпознаване на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимера, предотвратяващ свързващата интерференция от свободен, разтворим р40 и/или 3) да се получи антитяло с последователност, близка до тази на родителската линия имуноглобулин. В друго предпочитано изпълнение хипермутационните позиции са подбрани от групата, състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L53 и L93, а другата характеристика е подбрана от 1) запазване на не-кръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани; 2) запазване на разпознаване на епитопа, т.е. разпознаване на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимера, предотвратяващ свързващата интерференция от свободен, разтворим р40 и/или 3) да се получи антитяло с последователност, близка до тази на родителската линия имуноглобули. В по-предпочитано изпълнение остатъците за селективна мутагенеза са подбрани от предпочитаните позиции за селективна мутагенеза от групата, състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94, а другата характеристика е подбрана от 1) запазване на некръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани; 2) запазване на разпознаване на епитопа, т.е. разпознаване на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимера, предотвратяващ свързващата интерференция от свободен, разтворим р40 и/или 3) да се получи антитяло с последователност, близка до тази на родителската линия имуноглобули. В по-предпочитано изпълнение контактните позиции са подбрани от групата, състояща се от L50 и L94, а другите характеристики са подбрани от 1) запазване на не-кръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани; 2) запазване на разпознаване на епитопа, т.е. разпознаване на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимера, предотвратяващ свързващата интерференция от свободен, разтворим р40 и/или 3) да се получи антитяло с последователност, близка до тази на родителската линия имуноглобулин.
В друго изпълнение изобретението се отнася до метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързващата част от него, характеризиращ се с:
A) осигуряване на родителско антитяло или антигенсвързваща част от него;
Б) подбиране на аминокиселинен остатък в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, различен от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91,L92, L93,L94hL96.
B) индивидуално мутиране на въпросната избраната до наймалко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин се създава панел на мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях в сравнение с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, като по този начин се идентифицира усилващ активността аминокиселинен остатък;
Д) оценяване панела мутирали антитела или антигенсвързващи части от тях, в сравнение с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него за промени в най-малко в едно друго качество или характеристика;
докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него.
По-специално другата характеристика или качество е подбрано измежду 1) запазване на не-кръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани; 2) запазване на разпознаване на епитопа, т.е. разпознаване на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимера, предотвратяващ свързващата интерференция от свободен, разтворим р40 и/или 3) да се получи антитяло с последователност, близка до тази на родителската линия имуноглобулин.
В друго изпълнение изобретението се отнася до метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързващата част от него, характеризиращ се с:
А) осигуряване на родителско антитяло или антигенсвързваща част от него;
Б) подбиране на аминокиселинен остатък в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, различен от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53,
L55, L91, L92, L93, L94 и L96.
В) индивидуално мутиране на въпросната избраната позиция до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин се създава панел на мутирани антитела или антигенсвързващи части от тях;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях в сравнение с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, като по този начин се идентифицира усилващ активността аминокиселинен остатък;
Д) повторение на стъпки б) до г) за най-малко една друга CDR позиция, която нито е избраната в б) позиция, нито е позиция от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96.
Е) комбиниране в родителското тяло или антиген-свързваща част от него на най-малко на два отделни усилващи активността аминокиселинни остатъка, които са показали подобрена активност, за да се получат комбинирани антитела или антиген-свързващи части от тях.
Ж) оценяване активността на комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях с два усилващи активността аминокиселинни остатъка в сравнение с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него; докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него.
В друго изпълнение изобретението се отнася до метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързващата част от него, характеризиращ се с:
А) осигуряване на рекомбинантно родителско антитяло или антиген-свързваща част от него, което е било получено чрез селекция в система на фагово проявяване, но чиято активност понататък не може да бъде подобрена чрез мутагенеза във въпросната система на фагово проявяване;
Б) подбиране на аминокиселинен остатък в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, различен от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91,L92, L93, L94 и;
В) индивидуално мутиране на въпросната избрана контактна или хипермутационна позиция до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин създава панел на мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях в сравнение с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, като по този начин се идентифицира усилващ активността аминокиселинен остатък;
Д) оценяване на панела от мутирани антитела или антигенсвързващи части от тях за промени в поне едно друго качество или характеристика, докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него.
По-специално другата характеристика или качество е подбрано измежду 1) запазване на не-кръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани; 2) запазване на разпознаване на епитопа, т.е. разпознаване на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимера, предотвратяващ свързващата интерференция от свободен, разтворим р40 и/или 3) да се получи антитяло с последователност, близка до тази на родителската линия имуноглобулинт.
В друго изпълнение изобретението се отнася до метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързващата част от него, характеризиращ се с:
A) осигуряване на родителско антитяло или антигенсвързваща част от него, което е било получено чрез селекция в система на фагово проявяване, но чиято активност по-нататък не може да бъде подобрена чрез мутагенеза във въпросната система на фагово проявяване;
Б) подбиране на аминокиселинен остатък в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, различен от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96.
B) индивидуално мутиране на въпросната избраната до наймалко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин се създава панел на мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях и експресия в система на не-фагово проявяване;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях в сравнение с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, като по този начин се идентифицира усилващ активността аминокиселинен остатък;
Д) повторение на стъпки б) до г) за най-малко една друга CDR позиция, която нито е избраната в б) позиция, нито е позиция на НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91,L92, L93,L94.
Е) комбиниране в родителското тяло или антиген-свързваща част от него най-малко на два отделни усилващи активността аминокиселинни остатъка, които са показали подобрена активност, за да се получат комбинирани антитела или антиген-свързващи части от тях; и
Ж) оценяване активността и другото качество или характеристика на комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях с два усилващи активността аминокиселинни остатъка в сравнение с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него;
докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него.
По-специално другата характеристика или качество е подбрано измежду 1) запазване на не-кръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани; 2) запазване на разпознаване на епитопа, т.е. разпознаване на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимера, предотвратяващ свързващата интерференция от свободен, разтворим р40 и/или 3) да се получи антитяло с последователност, близка до тази на родителската линия имуноглобули.
В друго изпълнение изобретението се отнася до метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързващата част от него, характеризиращ се с:
А) осигуряване на родителско антитяло или антигенсвързваща част от него;
Б) подбиране на аминокиселинен остатък в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, различен от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53,
L55, L91, L92, L93, L94 и L96.
В) индивидуално мутиране на въпросната избрана позиция до най-малко два други аминокиселинни остатъка като по този начин се създава панел на мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях в сравнение с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, като по този начин се идентифицира усилващ активността аминокиселинен остатък;
Д) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тя, в сравнение с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, за промени в най-малко едно друго качество или характеристика;
Е) повторение на стъпки б) до д) за най-малко една друга CDR позиция, която нито е избраната в б) позиция, нито е позиция от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96.
Е) комбиниране в родителското тяло или антиген-свързваща част от него най-малко на два отделни усилващи активността аминокиселинни остатъка, които са показали подобрена активност, като не се засяга поне едно друго качество или характеристика, за да се получат комбинирани антитела или антиген-свързващи части от тях; и
Ж) оценяване активността и запазването на поне едно друго качество или характеристика на комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях с два усилващи активността аминокиселинни остатъка в сравнение с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него;
докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност и поне едно запазено качество или характеристика, сравнено с родителското антитяло или антигенсвързваща част от него.
В друго изпълнение изобретението се отнася до метод за подобряване афинитета на антитяло или антиген-свързващата част от него, характеризиращ се с това, че включва:
A) осигуряване на рекомбинантно родителско антитяло или антиген-свързваща част от него, което е било получено чрез селекция в система на фагово проявяване, но чиято активност понататък не може да бъде подобрена чрез мутагенеза във въпросната система на фагово проявяване;
Б) подбиране на аминокиселинен остатък в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, различен от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96.
B) индивидуално мутиране на въпросната избраната позиция до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин създава панел от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, и експресия в система на не-фагово проявяване;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях в сравнение с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, като по този начин се идентифицира усилващ активността аминокиселинен остатък;
Д) оценяване на панела от мутирани антитела или антигенсвързващи части от тях в сравнение с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него, за промени в най-малко едно друго качество или характеристика, докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него.
В друго изпълнение изобретението се отнася до метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързващата част от него, характеризиращ се с:
A) осигуряване на родителско антитяло или антигенсвързваща част от него;
Б) подбиране на аминокиселинен остатък в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, различен от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96.
B) индивидуално мутиране на въпросната избраната позиция до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин се създава панел от мутирани антитела или антигенсвързващи части от тях;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях в сравнение с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, като по този начин се идентифицира усилващ активността аминокиселинен остатък;
Д) оценяване на панела от мутирани антитела или антигенсвързващи части от тях в сравнение с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, за промени в най-малко едно друго качество или характеристика;
Е) повторение на стъпки б) до д) за най-малко една друга CDR позиция, която нито е избраната в б) позиция, нито е позиция от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96.
Е) комбиниране в родителското тяло или антиген-свързваща част от него най-малко на два отделни усилващи активността аминокиселинни остатъка, които са показали подобрена активност, като не се засяга поне едно друго качество или характеристика, за да се получат комбинирани антитела или антиген-свързващи части от тях с поне едно запазено качество или характеристика; и
Ж) оценяване активността и запазването на поне едно друго качество или характеристика на комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях, с два усилващи активността аминокиселинни остатъка в сравнение с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него; докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност и поне едно запазено качество или характеристика, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него.
По-специално другата характеристика или качество е подбрано измежду 1) запазване на не-кръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани; 2) запазване на разпознаване на епитопа, т.е. разпознаване на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимера, предотвратяващ свързващата интерференция от свободен, разтворим р40 и/или 3) да се получи антитяло с последователност, близка до тази на родителската линия имуноглобулин.
В друго изпълнение изобретението се отнася до метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързващата част от него, без да се засягат други характеристики, характеризиращ се с:
А) осигуряване на родителско антитяло или антигенсвързваща част от него;
Б) подбиране на аминокиселинен остатък в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, различен от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96.
В) индивидуално мутиране на въпросната избрана позиция до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин създава панел от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях в сравнение с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, като по този начин се идентифицира усилващ активността аминокиселинен остатък;
Д) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях в сравнение с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, за промени в най-малко едно друго качество или характеристика, докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност и запазено друго качество или характеристика, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него.
В друго изпълнение изобретението се отнася до метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързващата част от него, характеризиращ се с:
А) осигуряване на родителско антитяло или антигенсвързваща част от него, което е било получено чрез селекция в система на фагово проявяване, но чиято активност по-нататък не може да бъде подобрена чрез мутагенеза във въпросната система на фагово проявяване;
Б) подбиране на аминокиселинен остатък в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, различен от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96.
В) индивидуално мутиране на въпросната избрана позиция до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин създава панел от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, и експресия в система на не-фагово проявяване;
Г) оценяване активността и запазването на поне едно друго качество или характеристика на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях в сравнение с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, като по този начин се идентифицира усилващ активността аминокиселинен остатък;
Д) повторение на стъпки б) до г) за най-малко една друга CDR позиция, която нито е избраната в б) позиция, нито е позиция от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96.
Е) комбиниране в родителското тяло или антиген-свързваща част от него най-малко на два отделни усилващи активността аминокиселинни остатъка, които са показали подобрена активност, като не се засяга поне едно друго качество или характеристика, за да се получат комбинирани антитела или антиген-свързващи части от тях; и
Ж) оценяване активността и запазването на поне едно друго качество или характеристика на комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях с два усилващи активността аминокиселинни остатъка в сравнение с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него; докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност и поне едно запазено качество или характеристика, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него.
По-специално другата характеристика или качество е подбрано измежду 1) запазване на не-кръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани; 2) запазване на разпознаване на епитопа, т.е. разпознаване на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимера, предотвратяващ свързващата интерференция от свободен, разтворим р40 и/или 3) да се получи антитяло с последователност, близка до тази на родителската линия имуноглобулин.
Кратко описание на фигурите
Фигури 1А-1Б показват подреждането на аминокиселинните последователности на вариабилен регион на тежка верига на серия човешки антитела, които свързват човешки IL-12, в сравнение с последователности Cos-3/JH3 и Dpi 18Lv 1042 от родителската линия. За идентифициране на позициите на аминокиселините е използвано номериране по Kabat. Показана е пълната последователност на дивия тип Joe 9. За другите антитела са показани само онези позиции на аминокиселините, които се различават от дивия тип Joe 9.
Фигури 1В-1Г показват подреждането на аминокиселинните последователности на вариабилен регион на лека верига на серия човешки антитела, които свързват човешки IL-12. За идентифициране на позициите на аминокиселините е използвано номериране на Kabat. Показана е пълната последователност на дивия тип Joe 9. За другите антитела са показани само онези позиции на аминокиселините, които се различават от дивия тип Joe 9.
Фигури 2А-2Е показват CDR позициите в тежката верига на антитялото Y61, които са били мутирани чрез сайт-насочена мутагенеза, и съответните аминокиселинни замествания на всяка позиция. Графиките от дясната страна на фигурите показват скоростите на дисоцииране за заместените антитела (в черно) в сравнение с немутираното Y61 (в бяло).
Фигури 2Е-23 показват CDR позициите в леката верига на антитялото Y61, които са били мутирани чрез сайт-насочена мутагенеза, и съответните аминокиселинни замествания на всяка позиция. Графиките от дясната страна на фигурите показват скоростите на дисоцииране за заместените антитела (в черно) в сравнение с немутираното Y61 (в бяло).
Фигура 3 изобразява in vivo ефикасността на човешкото антиIL-12 антитяло J695 върху нивата на плазмен неоптерин в маймуни циномолгус.
Фигура 4 показва графика на средния резултат за развитие на артрит спрямо дните след имунизиране на мишки с колаген, демонстрирайки, че третирането с С17.15 съществено намалява свързаните с артрита симптоми в сравнение с третиране с плъши IgG.
Подробно описание на изобретението
С цел по-лесното разбиране на настоящото изобретение, първо ще бъдат дефинирани някои понятия.
Понятието “аминокиселинен остатък, усилващ активността” включва аминокиселинен остатък, който подобрява активността на антитялото. Трябва да се разбира, че аминокиселинен остатък, усилващ активността може да замести аминокиселинния остатък в мястото на контакта, хипермутация или предпочитано място за селективен мутагенез, и в допълнение в рамките на един или няколко CDR могат да присъстват един или повече аминокиселини остатъци, усилващи активността.
Аминокиселинен остатък, усилващ активността включва аминокиселинен остатък, който подобрява свързващата специфичност / афинитет на антитялото, например свързването на анти-човешко IL12 антитяло с човешки IL-12. Освен това понятието аминокиселинен остатък, усилващ активността включва аминокиселинен остатък, който подобрява неутрализиращия потенциал на антитяло, например човешко IL-12 антитяло, което инхибира човешки IL-12.
Понятието “антитяло” включва имуноглобулинова молекула състояща се от четири полипептидни вериги, две тежки (Н) вериги и две леки (L) вериги свързани помежду чрез дисулфидни мостове. Всяка тежка верига включва вариабилен регион на тежка верига (съкратено обозначена тук като HCVR или VH) и постоянен регион на тежка верига. Постоянният регион на тежка верига включва три домена, СН1, СН2 и СНЗ. Всяка лека верига включва вариабилен регион на лека верига (съкратено обозначена тук като LCVR или VL) и постоянен регион на лека верига. Постоянният регион на лека верига включва един домен - CL. VH и VL регионите могат да бъдат допълнително разделени на хипервариабилни региони, гранични региони, определящи комплементарността (CDRs), осеяни с региони, които са по-консервативни, наречени рамкови региони (FR). Всеки VH и VL регион е изграден от три CDRs и четири Frs, подредени от амино-края към карбоксилния край в следния ред: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
Понятието “антиген-свързващ участък” на антитяло (или “участък на антитяло”) включва фрагменти от антитяло, които запазват способността специфично да се свързват към антиген (например hlL12). Показано е, че антиген-свързващата функция на антитяло може да бъде представена от фрагменти по цялата дължина на антитялото. Примери на свързващи фрагменти, обхванати от понятието “антиген свързващ участък” на антитяло включват: (i) Fab фрагмент, моновалентен фрагмент, състоящ се от VL, VH, CL и СН1 домени; (ii) F(ab’)2 фрагмент, бивалентен фрагмент, включващ два Fab фрагмента, свързани чрез дисулфиден мост в свързващия регион; (iii) Fd фрагмент, състоящ се от VH и СН1 домени; (iv) Fv фрагмент, състоящ се от VL и VH домени от единично рамо на антитяло; (v) dAb фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), който се състои от VH домен и (vi) изолиран регион, определящ комплементарността (CDR). В допълнение, въпреки че двата домена на Fv фрагмент, VL и VH се кодират от отделни гени, те могат да бъдат свързани, използвайки рекомбинантни методи, чрез синтетичен линкер, който подпомага образуването на една белтъчна верига, в която VL и VH регионите образуват двойка, формирайки моновалетни молекули (известни като едно верижни Fv (scFv): виж например Bird et al., (1988) Science 242:423-426 и Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:58795883). Такива едноверижни антитела също се обхващат от понятието “антиген-свързващ участък” на антитяло. Също така в това понятие са включени други форми на едноверижни антитела, например диа-тела. Диателата са бивалентни, биспецифични антитела, при които VH и VL домените са експресирани на една полипептидна верига, използвайки линкер, който е прекалено къс за да позволи образуването на двойка между двата домена на същата верига, по този начин подтиква домените да образуват двойки с комплементарни домени от друга верига и така се създават два сайта за свързване с антиген (виж например Holliger Р. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:64446448; Poljak R.J. et al., (1994) Structure 2:1121-1123). Освен това, антитяло или негов антиген-свързващ участък може да бъде част от поголяма имуно-прикрепваща молекула, образувана чрез ковалентна или нековалентна асоциация на антитяло или участък от антитяло с един или повече други белтъци или пептиди. Примери за такива имуноприкрепващи молекули включват използването на стрептавидинов основен регион за образуването на тетрамерна scFv молекула (Kipriyanov S.M. et al., (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93101) и използването на цистеинов остатък, маркерен пептид и С-краен полихистидинов свободен край за получаването на бивалентни и биотинилирани scFv молекули (Kipriyanov S.M. et al, (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Участъци от антитяло като Fab или F(ab’)2 фрагменти могат да бъдат получени от цели антитела, използвайки традиционни техники като например смилане с папаин или пепсин съответно на цели антитела. Нещо повече, антитела, участъци от антитела и имуноприкрепващи молекули могат да бъдат получени, използвайки стандартни рекомбинантни ДНК техники, както са описани в настоящото изобретение. Предпочитани антиген свързващи участъци са цели домени или двойки от цели домени.
Понятието “обратна мутация” се отнася до процес, при който няколко или всички соматично мутирани аминокиселини на човешко антитяло са заместени със съответните остатъци предшественици от хомоложна последователност, предшественик на антитяло. Последователностите на тежките и леки вериги на човешко антитяло от настоящото изобретение са разположени в последователност отделно от последователностите предшественици в VBASE база данни за да се идентифицират последователностите с най-висока хомоложност. Разликите в човешкото антитяло от изобретението са върнати в последовтелността предшественик чрез мутиране на обределени нуклеотидни позиции, кодиращи такива различни аминокиселини. Значението на всяка аминокиселина така идентифицирана като кандидат за обратна мутация трябва да бъде изследвана за пряка и непряка роля при антигенното свързване и всяка аминокиселина, за която е установено, че след мутация повлиява желаните характеристики на човешкото антитяло не трябва да бъде включена в крайното човешко антитяло, като пример, аминокиселини, усилващи активността, идентифицирани чрез подхода на селективен мутагенез няма да бъдат обект на обратна мутация. За да се намали броят на аминокиселините, предмет на обратна мутация, позициите на аминокиселини, за които е установено, че са различни от най- близката последователност предшественик, но идентични на съответствуващата аминокиселина във втората последователност предшественик, могат да останат, като се гарантира, че втората последователност предшественик е идентична и сълинейна на последователността на човешко антитяло от изобретението в поне 10, по-специално 12 аминокиселини от двете страни на разглежданата аминокиселина. Обратна мутация може да възникне във всеки етап на оптимизиране на антитялото, по-специално, обратна мутация възниква непосредствено преди или след подхода на селективен мутагенез.
Изразът “човешки интерлейкин 12” (съкратено обзначен тук като hIL-12 или IL-12) както е използван в изобретението, включва човешки цитокин, който се отделя главно от макрофаги и дендритни клетки. Понятието включва хетеродимерен белтък, включващ субединица от 35 kD (р35) и субединица от 40 kD (р40), които са свързани заедно с дисулфиден мост. Хетеродимерният белтък се обозначава като “р70 субединица”. Структурата на човешки 11-12 е описана, например от Kobayashi et al., (1989) J. Exp. Med. 170:827-845; Seder et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:10188-10192; Ling et al., (1995) J. Exp. Med 154:116-127; Podlaski et al., (1992) Arch. Biochem. Biophys. 294:230-237. Понятието човешки IL-12 включва рекомбинантен човешки IL-12 (rh IL-12), който може да бъде получен чрез стандартни рекомбинантни методи на експресия.
Понятията “Kabat номериране”, “Kabat определяне” и “Kabat обоззначаване” са изпозвани тук взаимозаменяемо. Тези понятия, които са признати в съществуващото ниво на техниката се отнасят до система за номериране на аминокиселинни остатъци, които са повариабилни (т.е. хипервариабилни) от други аминокиселинни остатъци във вариабилните региони на тежката и лека вериги на антитялото или техен антиген-свързващ участък (Kabat et al., (1971) Ann NY. Acad. Sci. 190:382-391 и Kabat E.A. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). За вариабилния регион на тежката верига, хипервариабилния регион варира от аминокиселини позиции 31 до 35 за CDR1, аминокиселини позиции 50 до 65 за CDR2, и аминокиселини позиции 95 до 102 за CDR3. За вариабилния регион на леката верига, хипервариабилния регион варира от аминокиселини позиции 24 до 34 за CDR1, аминокиселини позиции 50 до 56 за CDR2, и аминокиселини позиции 89 до 97 за CDR3.
Kabat номерирането е използвано тук за да се посочат позициите на аминокиселинни модификации, направени в антителата на изобретението. Например, Y61 анти-1Ь-12 антитяло може да бъде мутирано от серин (S) до глутаминова киселина (Е) в позиция 31 на тежката верига CDR1 (НЗ1S—>Е) или глицин (G) може да бъде мутиран до тирозин (Y) в позиция 94 на леката верига CDR3 (L94G->Y).
Понятието “човешко антитяло” включва антитела, притежаващи вариабилни и постоянни региони, съответствуващи на последователности предшественици на човешки имуноглобулин, както е описано от Kabat et al. (виж Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Човешките антитела от изобретението могат да включват аминокиселини остатъци, които не са кодирани от последователност предшественик на човешки имуноглобулин (например мутации въведени чрез случаен или сайтово специфичен мутагенез in vitro или чрез соматечни мутации in vivo) например в CDRs и по-специално в CDR3. По-специално, мутациите са въведени, използвайки “подход на селективен мутагенез”, описан в настоящото изобретение. Човешкото антитяло може да има поне една позиция, заместена с аминокиселинен остатък, например аминокиселинен остатък, усилващ активността, който не е кодиран от последователност предшественик на човешки имуноглобулин. Човешкото антитяло може да притежава до 20 позиции, заместени с аминокиселинни остатъци, които не са част от последователността предшественик на човешки имуноглобулин. В други методи, са земестени до 10, до 5, до 3 или до 2 позиции. В предпочитан метод, тези замествания са в рамките на CDR региони, както е подробно описано по-долу. Обаче с понятието “човешко антитяло”, както е използвано в настоящото изобретение, не се има предвид включването на антитела, в които CDR последователностите произлизат от предшественик от друг вид бозайници, като например миши последователности, въведени в рамката на човешки последователности.
Изразът “рекомбинантно човешко антитяло” включва човешки антитела, които са получени, експресирани, създадени или изолирани чрез рекомбинантни методи, като например антитела, експресирани, използвайки рекомбинантен експресионен вектор, прехвърлен в клетка гостоприемник (описани по-долу в част II), антитела изолирани от рекомбинантна комбинаторна библиотека на човешки антитела (описани по-долу в част III), антитела изолирани от животни (например мишки), които са трансгенни за човешки имуноглобулинови гени (виж Taylor L.D. et al., (1992) Nuc. Acids Res. 20:6287-6295) или антитела, получени, експерсирани, създадени или изолирани чрез някакъв друг метод, който включва сплайсинг на човешки имуноглобулинови гении последователности в други ДНК последователности. Такива рекомбинантни човешки антитела притежават вариабилен и постоянен региони, произлизащи от последователности предшественици на човешки имуноглобулин (виж Rabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). В някои методи, обаче, такива рекомбинантни човешки антитела са подложени на in vitro мутагенез (или когато се използва животно, трансгенно за човешка Ig последователност, in vivo соматичен мутагенез) и следователно аминокиселинните последователности на VH и VL регионите на рекомбинантните антитела са последователности, когато са произлезли от, или са свързани с човешки последователности предшественици на VH и VL региони, може естествено да не съществуват в in vivo последователността предшественик на човешки антитела. В някои методи, обаче такива рекомбинантни антитела са резултат от подход на селективен мутагенез или обратна мутация или и на двата подхода.
Изразът “изолирано антитяло” включва антитяло, което е фактически свободно от други антитела, притежаващи различни антигенни особености (например изолирано антитяло, което специфично се свързва с hIL-12 е фактически свободно от антитела, които специфично свързват антигени, различни от hIL-12). Изолирано антитяло, което специфично свързва hIL-12 може да свързва IL-12 молекули от други видове (описани подробно по-долу). Нещо повече, изолирано антитяло може фактически да е свободно от друг клетъчен материал и/или химични съединения.
Изразът “неутрализиращо антитяло” (или “антитяло, което неутрализира активността на hIL-12) включва антитяло, чието свързване към IL-12 води до инхибирането на биологичната активност на hIL-12. Това инхибиране на биологичната активност на hIL-12 може да бъде оценено чрез измерване на един или повече индикатори на биологичната активност на hIL-12, като например инхибирането на човешка фитохемаглутинин бласт пролиферация в фитохемаглутининов бласт пролиферационен анализ (РНА) или инхибиране на рецепторно свързване в анализ на рецепторно свързване на човешки IL-12 (виж Пример 3 - анализ на индукция на 3-гамаинтерферон). Тези индикатори на hIL-12 биологична активност могат да бъдат оценени чрез един или повече стандартни анализи in vivo или in vitro, известни в съществуващото ниво на техниката (виж Пример 3).
Понятието “активност” включва такава активност, като свързваща специфичност / афинитет на антитяло за антиген, например, анти-Ь1Ь-12 антитяло, чието свързване към hIL-12 инхибира биологичната активност на hIL-12, т.е. инхибиране на РНА бласт пролиферация или инхибиране на рецепторното свързване при анализ на рецепторното свързване на човешки IL-12 (виж Пример 3).
Изразът “повърхностен плазмен резонанс” включва оптически феномен, който позволява анализът на биоспецифично свързване в реално време чрез детекция на промени в белтъчната концентрация в биосензорен носител, например, използвайки системата BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweeden & Piscataway, NJ). 3a допълнителни описания виж Пример 5 и Jonssen U. et al., (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonssen U., et al. (1991) Biotechniques 11: 620 - 627; Johnsson B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131 и Johnsson B. et al. (\99\)Anal. Biochem. 198:268-277.
Понятието “Кой·” както е използвано тук се отнася до свободната скоростна константа на дисоциация на антитяло от комплекс антитяло / антиген.
Понятието “Ка”, както е използвано тук се отнася до дисоциационната константа на определено антиген - антитяло взаимодействие.
Изразът “молекула нуклеинова киселина” включва ДНК молекули и РНК молекули. Молекулата нуклеинова киселина може да бъде едно-верижна или двойно-верижна, но по-специално е двойноверижна ДНК.
Изразът “изолирана молекула нуклеинова киселина”, както е използван тук по отношение на нуклеинови киселини, кодиращи антитела или участъци от антитела (т.е. VH, VL, CDR3, които свързват hIL-12 включително “изолирани антитела”), включва молекула нуклеинова киселина, в която нуклеотидните последователности, кодиращи антитяло или участък от антитяло са сбободни от други нуклеотидни последователности, кодиращи антитела или участъци на антитела, които свързват антигени, различни от hIL-12, като тези други последователности може естествено да граничат с нуклеинова киселина в човешка геномна ДНК. Например, изолирана нуклеинова киселина, съгласно изобретението кодираща VH регион на анти-1Ь-12 антитяло не съдържа други последователности кодиращи други VH региони, които свързват антигени различни от IL-12. Изразът “изолирана молекула нуклеинова киселина” освен това е предназначен да включва последователности, кодиращи бивалентни биспецифични антитела, като например диатела, при които VH и VL регионите не съдържат други последователности, различни от последователностите на диатялото.
Понятието “вектор” включва молекула нуклеинова киселина, която притежава способност да транспортира друга нуклеинова киселина, за която той е свързан. Един вид вектор е “плазмид”, който се отнася до кръгова двойно-верижна ДНК примка, в която могат да бъдат лигирани допълнителни ДНК сегменти. Друг вид вектор е вирусен вектор, където допълнителни ДНК сегменти могат да бъдат лигирани във векторния геном. Определени вектори притежават способност за автономна репликация в клетка гостоприемник, в която те са въведени (например бактериални вектори, притежаващи бактериална последователност, отговорна за начало на репликация и епизомални вектори на бозайници). Други вектори (например неепизомални вектори на бозайници) могат да бъдат интегрирани в генома на клетка гостоприемник при въвеждане в клетка гостоприемник и там те се реплицират заедно с генома на гостоприемника. Нещо повече, определени вектори притежават способност да насочват експресията на гени, с които те са оперативно свързани. Такива вектори са обозначени в настоящото изобретение като “рекомбинантни експресионни вектори” (или просто “експресионни вектори”). По принцип, експресионните вектори като средство в рекомбинантните ДНК техники са често под формата на плазмиди. В настоящата спесификация, “плазмид” и “вектор” могат да бъдат използвани взаимозаменяемо т.к. плазмидът е най-често използваната форма на вектор. Обаче изобретението възнамерява да включи и други форми на експресионни вектори като например вирусни вектори (например дефектни по отношение на репликацията ретро вируси, аденовируси и адено-асоциирани вируси), които имат еквивалентна функция.
Изразът “рекомбинантна клетка гостоприемник” (или просто “клетка гостоприемник” включва клетка, в която е въведен рекомбинантен експресионен вектор. Трябва да се има в предвид, че такива понятия се отнасят не само до определена клетка обект, но и до потомството на такава клетка. Тъй като могат да възникнат определени модификации, дължащи се както на мутация така и на влияния на околната среда, такова потомство може в същност и да не е идентично на родителската клетка, но въпреки това то се включва в обхвата на понятието “клетка гостоприемник”, както е използвано в изобретението.
Понятието “модифициране”, както е използвано тук се отнася до промяна на една или няколко аминокиселини в антитела или техни антиген свързващи участъци. Промяната може да бъде получена чрез добавяне, заместване или делеция на аминокиселина в една или повече позиции. Промените могат да бъдат получени, използвайки техники, известни в съществуващото ниво на техниката, като например PCR мутагенез.
Изразът “позиция на контакт” включва аминокиселинна позиция в CDR1, CDR2 или CDR3 на вариабилния регион на тежката верига или вариабилния регион на леката верига на антитяло, която е заета от аминокиселина, която се свързва с антигена в една от известните 26 структури антитяло - антиген. Ако CDR аминокиселината, в която и да е от 26 те известни структури на антитяло-антиген комплексите се свързва с антигена, то за тази аминокиселина може да се счита, че тя заема позиция на контакт. Позиците на контакт притежават по-голяма вероятност да бъдат заети от аминокиселини, които се свързват с антигена, отколкото позициите, в които такъв контакт не се осъществява. По-специално, позиция на контакт е CDR позиция, която съдържа аминокиселина, която се свързва с антигена в повече от 3 от общо 26-те структури (>11.5 %). По-специално, позиция на контакт е
CDR позиция, която съдържа аминокиселина, която се свързва с антигена в повече от 8 от общо 26-те структури (>32 %).
Понятието “позиция на хипермутация” включва аминокиселинен остатък, който притежава позиция в CDR1, CDR2, CDR3 регион на вариабилен регион на тежка верига или вариабилен регион на лека верига на антитяло, за което се счита, че притежава висока честота или вероятност за соматична хипермутация при in vivo афинитетно съзряване на антитялото. “Висока честота или вероятност за соматична хипермутация” включва честотата или вероятностите от 5 до около 40 % вероятност, че остатъкът ще претърпи соматична хипермутация при in vivo афинитетно съзряване на антитялото. Трябва да се знае, че всички обхвати в рамките на този деклариран диапазон са също предназначени да са част от настоящото изобретение, т.е 5 до около 30 %, т.е. 5 до около 15 %, т.е. 15 до около 30 %.
Понятието “предпочитана позиция за селективен мутагенез” включва аминокиселинен остатък, който заема позиции в CDR1, CDR2, CDR3 региона на вариабилен регион на тежка верига или вариабилен регион на лека верига, които могат да бъдат считани както в позиция на контакт така и в позиция на хипермутация.
Изразът “подход на селективен мутагенез” включва метод за подобряване на активността на антитяло чрез селекциониране и индивидуален мутагенез на CDR аминокиселина в поне една предпочитана позиция на селективен мутагенез, хипермутация и/или позиция на контакт. “Селективно мутирано” човешко антитяло е антитяло, което съдържа мутация в избрана позиция, използвайки подход на селективен мутагенез. Съгласно друг метод, подход на селективен мутагенез е предназначен да осигури метод за преференциално мутиране на избран индивидуален аминокиселинен остатък в CDR1, CDR2 или CDR3 на вариабилен регион на тежка верига (тук по-долу обозначени съответно Hl, Н2 и НЗ) или в CDR1, CDR2 или CDR3 на вариабилен регион на лека верига (тук по-долу обозначени съответно LI, L2 и L3) на антитяло. Аминокиселинните остатъци могат да бъдат избрани от предпочитани позиции на селективен мутагенез, позиции на контакт или позиции на хипермутация. Индивидуалните аминокиселини са подбрани, основавайки се на тяхната позиция във вариабилния регион на тежката и леки вериги. Трябва да се разбира, че позицията на хипермутация може също така да бъде и позиция на контакт. Съгласно друг метод, подход на селективен мутагенез е “целеви подход”. С понятието “целеви подход” се има предвид метод за предпочитано мутиране на селекционирани индивидуални аминокиселинни остатъци в CDR1, CDR2 или CDR3 на вариабилен регион на тежка верига или в CDR1, CDR2 или CDR3 на вариабилен регион на лека верига на антитяло по целеви начин, например “Групово смислен целеви подход” или “CDRсмислен целеви подход”. При “Групово смислен целеви подход” индивидуалните аминокиселинни остатъци, и по-специално групи са цели на селективни мутации, включително групи I (включващи L3 и НЗ), II (включващи Н2 и L1) и III (включващи L2 и Н1), групите са изброени в ред на предпочитани цели. При “CDR смислен целеви подход”, индивидуални аминокиселинни остатъци, по-специално CDRs, са цели на селективни мутации с ред на предпочитане както следва: НЗ, L3, Н2, LI, Н1 и L2. Избраният аминокиселинен остатък е мутиран, например до поне два аминокиселинни остатъци и е определен ефекта от мутацията върху активността на антитялото. Активността е измерена като промяна в свързващата специфичност / афинитет на антитяло и/или неутрализиращия потенциал на антитялото. Трябва да се разбира, че подходът на селективен мутагенез може да бъде използван за оптимизиране на всяко антитяло, произлизащо от какъвто и да е източник, включително фаги, трансгенни животни с предшественици човешки IgG гени, човешки антитела, изолирани от човешки В-клетки. По-специално, подхода на селективен мутагенез се използва върху антитела, които не могат допълнително да бъдат оптимизирани, използвайки фаговопредставена технология. Трябва да се разбира, че антителата, от който и да е източник, включително фаги, трансгенни животни с предшественици човешки IgG гени, човешки антитела, изолирани от човешки В-клетки, могат да бъдат подложени на обратна мутация преди или след подхода на селективен мутагенез.
Понятието “аминокиселинен остатък, усилващ активността” включва аминокиселинен остатък, който подобрява активността на антитяло. Трябва да се разбира, че аминокиселинен остатък, усилващ активността може да замести аминокиселинен остатък в предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция за контакт или позиция на хипермутация и в допълнение в един или повече CDRs може да присъстват повече от един аминокиселинен остатък, усилващ активността. Аминокиселинен остатък, усилващ активността включва аминокиселинен остатък, който подобрява свързващата специфичност / афинитет на антитяло, например анти-човешко IL-12 антитяло свързано с човешки IL-12. Освен това аминокиселинен остатък, усилващ активността е предназначен да включва аминокиселинен остатък, който подобрява неутрализиращия потенциал на антитяло, например човешко IL-12 антитяло, което инхибира човешки IL-12.
Различни аспекти на настоящото изобретение са подробно описани в следващите части.
I. Човешки антитела, които свързват човешки IL-12
Настоящото изобретение осигурява изолирани човешки антитела, или техни антиген свързващи участъци, които се свързват към човешки IL-12. По-специално човешките антитела от изобретението са рекомбинантни, неутрализиращи човешки анти-hIL12 антитела. Антителата от изобретението, които се свързват към човешки II-12 могат да бъдат селекционирани, например чрез скрининг на една или повече човешки VL и VH кДНК библиотеки с hIL-12, като например с фагово-представена техника, както е описано в Пример 1. Скринингът на човешки VL и VH кДНК библиотеки първоначално идентифицира серия от aHTH-IL-12 антитела, от които едно антитяло, обозначено тук като “Joe 9” (или “Joe 9 див тип”) беше селекционирано за последваща разработка. Joe 9 е човешко IL-12 антитяло, с относително нисък афинитет (т.е. е около 0.1 sec.i), но е удобно за специфично свързване и детектиране на hIL-12. Афинитетът на Joe 9 антитялото беше подобрен чрез провеждане на мутагенез на CDRs от тежка и лека вериги, получавайки панел от вариабилни региони на тежки и леки вериги, които бяха “смесени и свързани” и след това мутирани, което доведе до голям брой допълнителни aHTH-hIL-12 антитела, с увеличен афинитет за hIL-12 (виж Пример 1, Таблица 2, виж Приложение А и последователностите на Фигури 1 А - Г).
От тези антитела, човешкото aHTH-hIL-12 антитяло, обозначено тук по-долу като Y61 показа значително подобряване на свързващия афиниет (т.е. KofF около 2 х IO’4 sec’1). Y61 aHTH-hIL-12 антитялото беше селекционирано за последващо афинитетно зреене чрез индивидуално мутиране на специфични аминокиселинни остатъци в рамките на CDRs на тежки и леки вериги. Аминокиселинните остатъци на Y61 бяха селекционирани за сайтово специфична мутация (подход на селективен мутагенез) на основата на аминокиселинни остатъци, заемащи предпочитани позиции за мутагенез, позиции за контакт и/или хипермутация. Обобщение на заместванията на селекционираните позиции в CDRs на тежката и леки вериги са показани на Фигури 2А68
23. Предпочитано рекомбинантно, неутрализиращо антитяло от изобретението, обозначено тук като J695, беше получено в резултат на заместване на глицин с тирозин в позиция 50 на CDR2 на лека верига на Y61 и заместване на глицин с тирозин в позиция 94 на CDR3 на лека верига на Y61.
Подредбата на аминокиселинните остатъци на вариабилните региони на тежката и лека вериги на панела от анти-IL-12 антитела от изобретението, на линейната подредба на дивия тип Joe 9 към J695 са показани на Фигури ΙΑ - 1Г. Подредбата на тези последователности позволява идентифицирането на консенсусните последователности за предпочитаните вариабилни региони на тежка и леки вериги на антителата от изобретението, които свързват hIL-12, както и консенсусни последователности за CDR3, CDR2 и CDR1 на линенията от Joe 9 към J695. Нещо повече, анализът на мутагенеза на Y61 обобщен на фигури 2А-23 позволи да се идентифицират консенсусните последователности за вариабилни региони на тежки и леки вериги, които свързват hIL-12, както и консенсусните последователности за CDR3, CDR2 и CDR1, които свързват hIL-12 на линията от Joe 9 към J695, които включват последователности с модификации от Y61, които все още запазват добри свързващи с hIL-12 характеристики. Предпочитани CDR, VH и VL последователности на изобретението (включително консенсусни последователности) както са идентифицирани от идентификатори на последователностите от приложения списък на последователностите, са обобщени по-долу:
SEQ ID NO: ВЕРИГА НА АНТИТЯЛО РЕГИОН ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ
1 Консенсус CDR НЗ (H/S) - G - S - (H/Y) - D - (N/T/Y)
Joe 9 до J695
2 Консенсус Joe 9 до J695 CDR L3 Q - (S/T) - Y - (D/Е) - (S/R/K) - (S/G/Y) (L/F/T/S) - (R/S/T/W/H) - (G/P) - (S/T/A/L) (R/S/M/T/L) - (V/I/T/M/L)
3 Консенсус Joe 9 до J695 CDRH2 F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V-K-G
4 Консенсус Joe 9 до J695 CDRL2 (G/Y) - N - (D/S) - (Q/N) - R - Р - S
5 Консенсус Joe 9 до J695 CDRH1 F-T-F-T- (S/E) - Y-G-M-H
6 Консенсус Joe 9 до J695 CDRL1 (S/T) - G - (G/S) - (R/S) - S-N-I- (G/V) - (S/A) - (N/G/Y) - (T/D) - V - (К/Н)
7 Консенсус Joe 9 до J695 VH (пълна VH последователност, виж списък на последоватлностите)
8 Консенсус Joe 9 до J695 VL (пълна VL последователност, виж списък на последоватлностите)
9 Консенсус Y61 до J695 CDR НЗ Н- (G/V/C/H) - (S/T) - (H/T/V/R/I) - (D/S) - (N/K/A/T/S/F/W/H)
10 Консенсус Y61 до J695 CDRL3 Q-S-Y- (D/S) - (Хаа) - (G/D/Q/L/F/R/H/N/Y) - T-H-P-A-L-L
11 Консенсус Y61 до J695 CDR Н2 (F/T/Y)-I-(R/A)-Y-(D/S/E/A)-(G/R)-S-(Xaa)K-(Y/E)-Y-A-D-S-V-K-G
12 Консенсус Y61 до1695 CDRL2 (G/Y/S/T/N/Q)-N-D-Q-R-P-S
13 Консенсус Y61 до J695 CDRH1 F-T-F-(Xaa)-(Xaa)-(Y/H)-(G/M/A/N/S)-M-H
14 Консенсус Y61 до1695 CDRL1 S-G-G-R-S-N-I-G-(S/C/R/N/D/T)-(N/M/T)- (T/Y/D/H/K/P)-V-K
15 Консенсус Y61 до J695 VH (пълна VH последователност, виж списък на последоватлностите)
16 Консенсус Y61 до J695 VL (пълна VL последователност, виж списък на последоватлностите)
17 Y61 CDR НЗ H-G-S-H-D-N
18 Y61 CDRL3 Q-S-Y-D-R-G-T-H-P-A-L-L
19 Y61 CDR Н2 F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V-K-G
20 Y61 CDRL2 G-N-D-Q-R-P-S
21 Y61 CDRH1 F-T-F-S-S-Y-G-M-H
22 Y61 CDRL1 S-G-G-R-S-N-I-G-S-N-T-V-K
23 Y61 VH (пълна VH последователност, виж списък на последоватлностите)
24 Y61 VL (пълна VL последователност, виж списък на последоватлностите)
25 J695 CDR НЗ H-G-S-H-D-N
26 J695 CDRL3 Q-S-Y-D-R-Y-T-H-P-A-L-L
27 J695 CDRH2 F-I-R-Y-F-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V-K-G
28 J695 CDRL2 Y-N-D-Q-R-P-S
29 J695 CDRH1 F-T-F-S-S-Y-G-M-H
30 J695 CDRL1 S-G-S-R-S-N-I-G-S-N-T-V-K
31 J695 VH (пълна VH последователност, виж списък на последоватлностите)
32 J695 VL (пълна VL последователност, виж списък на последоватлностите)
Антителата, получени от афинитетно съзряване на див тип Joe 9 бяха функционално охарактеризирани чрез повърхностно плазмен резонансен анализ за определяне на скоростните константи и Koff.
Бяха получени серия от антитела, притежаващи скоростна константа KoffB диапазона от около 0.1 s1 до около 1 xlO'5 s'1, и по-специално Koff от около 1 χ 10'4 s1 до 1 χ IO’5 s’1 или по-ниска.Освен това, антителата бяха охарактеризирани in vitro за тяхната способност да инхибират фитохемаглутинова (РНА) бласт пролиферация, както е описано в Пример 3. Бяха получени серия от антитела, притежаващи 1С50 стойност в диапазона от около 1 χ ΙΟ’6 М до около 1 χ 10'11 М, поспециално около 1хЮ'10Мдо1х10'пМ или по-ниска.
Съгласно един аспект, настоящото изобретение осигурява изолирано човешко антитяло или негов антиген свързващ участък, които се свързват с човешки IL-12 и дисоциират от човешки IL-12 със скоростна константа Koff от 0.1 s'1 или по-ниска, както беше определено с повърхностен плазмен резонанс или, които инхибират фитохемаглутинова бласт пролиферация при in vitro анализ на фитохемаглутинова бласт пролиферация (РНА анализ) с IC50 от 1 χ 10'6 М или по-ниска. В предпочитан метод, изолираното човешко IL-12 антитяло или негов антиген-свързващ участък, дисоциира от човешки IL-12 със скоростна константа Koff от 1 х 10‘2 s'1 или по-ниска, или инхибира фитохемаглутинова бласт пролиферация при in vitro РНА анализ с 1С50 от 1 χ ΙΟ’7 М или по-ниска. В по-предпочитан метод, изолираното човешко IL-12 антитяло или негов антиген-свързващ участък, дисоциира от човешки IL-12 със скоростна константа Koff от 1 χ 10'3 s1 или по-ниска, или инхибира фитохемаглутинова бласт пролиферация при in vitro РНА анализ с 1С50 от 1 χ 10’8 М или пониска. В по-предпочитан метод, изолираното човешко IL-12 антитяло или негов антиген-свързващ участък, дисоциира от човешки IL-12 със скоростна константа Koff от 1 х 10‘4 s'1 или по-ниска, или инхибира фитохемаглутинова бласт пролиферация при in vitro РНА анализ с IC50 от 1 χ ΙΟ’9 М или по-ниска. В по-предпочитан метод, изолираното човешко IL-12 антитяло или негов антиген-свързващ участък, дисоциира от човешки IL-12 със скоростна константа Koff от 1 х 10‘5 s'1 или по-ниска, или инхибира фитохемаглутинова бласт пролиферация при in vitro РНА анализ с 1С50 от 1 χ ΙΟ'10 М или по-ниска. В дори попредпочитан метод, изолираното човешко IL-12 антитяло или негов антиген - свързващ участък, дисоциира от човешки IL-12 със скоростна константа от 1 χ 10'5 s’1 или по-ниска, или инхибира фитохемаглутинова бласт пролиферация при in vitro РНА анализ с IC50 от 1 χ 10’11 М или по-ниска.
Скоростната константа на дисоцииране (Kofr) на IL-12 антитяло може да бъде определена чрез повърхностно плазмен резонанс (виж Пример 5). По-принцип, анализът на повърхностно плазмен резонанс измерва взаимодействията на свързване в реално време между лиганд (рекомбинантен човешки IL-12, имобилизиран върху биосензорен носител) и анализен образец (антитела в разтвор) чрез повърхностно плазмен резонанс (SPR), използвайки BIAcore система (Pharmacia Biosensor, Pitcataway, NJ). Повърхностния плазмен анализ може да бъде проведен също така чрез имобилизиране на анализен образец (антитела върху биосензорен носител) и поставяне в контакт с лиганд (рекомбинантен IL-12 в разтвор). Неутрализиращата активност на IL12 антитела или техни антиген-свързващи участъци може да бъде оценена чрез един или повече подходящи in vitro анализи (виж Пример 3).
Добре известно е в съществуващото ниво на техниката, че CDRs на тежката и лека вериги на антитяло играят важна роля за свързващата специфичност / афинитет на антитялото за даден антиген. Съответно, изобретението обхваща човешки антитела, притежаващи CDRs на тежка и лека вериги на Joe 9, както и други антитела, притежаващи CDRs, които са модифицирани за да подобрят свързващата специфичност / афинитет на антитялото. Както е показано в Пример 1, серия от модификации в CDRs на тежка и леки вериги водят до афинитетно съзряване на човешки анти-МЬ-12 антитела. Аминокиселинните последователности на вариабилните региони на серия от човешки антитела обхващащи от див тип Joe 9 до J695, които свързват човешки IL-12 са показани на Фигури 1А-1Г. Мотивите на консенсусни последователности за CDRs на антитела могат да бъдат определени от подредбата на последователността (както беше обобщено в таблицата по-горе). Например, консунсусния мотив на VH CDR3 на линията от Joe 9 до J695 включва аминокиселинна последователност: (H/S)-G-S-(H/Y)-D-(N/T/Y) (SEQ ID NO: 1), обхващаща аминокиселини от позиция 95 до 102 на консунсусната HCVR, показана на SEQ ID NO: 7. Консунсусен мотив за VL CDR3 включва аминокиселинна последователност: Q-(S/T)-Y-(D/E)-(S/R/K)(S/G/Y)-(L/F/T/S)- (R/S/T/W/H)-(G/P)-(S/T/A/L)-(R/S/M/T/L)(V/I/T/MZL) (SEQ ID NO: 2), която обхваща аминокиселините от позиции 89 до 97 на консенсусната LCVR, показана на SEQ ID NO: 8.
Съгласно друг аспект, изобретението осигурява изолирано човешко антитяло, или негов антиген-свързващ участък, които притежават следните характеристики:
а) инхибира фитохемаглутинин бласт пролиферация при in vitro РНА анализ с 1С50 от 1 х ΙΟ'6 М или по-ниска;
б) притежава CDR3 на тежка верига, съдържаща аминокиселинната последователност от SEQ ID NO: 1, и
в) притежава CDR3 на лека верига, съдържаща аминокиселинната последователност от SEQ ID NO: 2.
В предпочитан метод, антитялото допълнително съдържа VH CDR2, съдържаща аминокиселинна последователност: F-I-R-Y-D-G-SN-K-Y-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID NO: 3) (която обхваща аминокиселините от позиции 50 до 65 на консенсусната HCVR, включваща аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 7) и допълнително съдържа VL CDR2, съдържаща аминокиселинна последователност: (G/Y)-N-(D/S)-(Q/N)-R-P-S (SEQ ID NO: 4) (която обхваща аминокиселините от позиции 50 до 65 на консенсусната LCVR, включваща аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 8).
В друг предпочитан метод, антитялото допълнително съдържа VH CDR1, съдържаща аминокиселинна последователност: F-T-F-T(S/E)-Y-G-M-H (SEQ ID NO: 5) (която обхваща аминокиселините от позиции 27 до 35 на консенсусната HCVR, включваща аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 7) и допълнително съдържа VL CDR1, съдържаща аминокиселинна последователност: (S/T)-G-(G/S)-(R/S)-S-N-I-(G/V)-(S/A)-(N/G/Y)-(T/D)-V-(K/H) (SEQ ID NO: 6) (която обхваща аминокиселините от позиции 24 до 34 на консенсусната LCVR, включваща амино-киселинната последователност на SEQ ID NO: 8).
В друг предпочитан метод, антитялото от изобретението съдържа HCVR, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 7 и LCVR, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 8.
Допълнителни консенсусни мотиви могат да бъдат определени на основата на мутационен анализ, проведен върху Y61, който е довел до образуването на J695 антитялото (обобщено на Фигури 2А-23). Както се вижда от графиките, показани на Фигури 2А-23, определени остатъци от CDRs на тежката и леки вериги на Y61 са податливи на заместване, без да нарушават значително hIL-12 свързващите характеристики на антитялото. Например, индивидуалните замествания в позиция 30 на CDR Н1 с 12 различни аминокиселинни остатъци не намали значително скоростната константа КоЯ- на антитялото, показвайки че тази позиция е податлива на замествания с разнообразни аминокиселинни остатъци. Следователно, основавайки се на мутационния анализ (т.е. позиции в рамките на Y61, които са податливи на заместване от аминокиселинни остатъци), бяха определени консенсусните мотиви. Консенсусните мотиви за CDR3s на тежката и леки вериги са показани съответно на SEQ ID NO: 9 и 10, консенсусните мотиви за CDR2s на тежката и леки вериги са показани съответно на SEQ ID NO: 11 и 12, и консенсусните мотиви за CDR3s на тежката и леки вериги са показани съответно на SEQ ID NO: 13 и 14. Консенсусните мотиви на VH и VL регионите са показани съответно на SEQIDNO: 15 и 16.
Съгласно един аспект, изобретението характеризира изолирано човешко антитяло, или негов антиген-свързващ участък, което притежава следните характеристики:
а) инхибира фитохемаглутинин бласт пролиферация при in vitro РНА анализ с 1С50 от 1 х ΙΟ'9 М или по-ниска;
б) притежава CDR3 на тежка верига, включваща аминокиселинната последователност от SEQ ID NO: 9, и
в) притежава CDR3 на лека верига, включваща аминокиселинната последователност от SEQ ID NO: 10.
В предпочитан метод, антитялото допълнително съдържа VH CDR2, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 11 и допълнително съдържа VL CDR2, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 12
В друг предпочитан метод, антитялото допълнително съдържа VH CDR1, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 13 и допълнително съдържа VL CDR1, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 14.
В друг предпочитан метод, антитялото от изобретението съдържа
HCVR, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 15 и LCVR, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID
NO: 16.
Предпочитаното антитяло на изобретението, човешко анти-hIL12 антитяло Y61, беше получено чрез афинитетно зреене на див тип Joe 9 чрез PCR мутагенез на CDR3 (както е описано в Пример 1). Y61 притежава подобрен специфичност / свързващ афинитет, определен чрез повърхностен плазмен резонанс и чрез in vitro неутрализационен анализ. CDR3s на тежките и леки вериги на Y61 са показани съответно на SEQ ID NO: 17 и 18, CDR2s на тежките и леки вериги на Y61 са показани съответно на SEQ ID NO: 19 и 20, и CDRls на тежките и леки вериги на Y61 са показани съответно на SEQ ГО NO: 21 и 22. VH на Y61 притежава аминокиселинна последователност от SEQ ID N0: 23 и VL на Y61 притежава аминокиселинна последователност от SEQ ГО N0: 24 (тези последователности са също така показани на Фигури 1А 1Г, представени съвместно с Joe 9).
Съгласно друг аспект, изобретението характеризира изолирано човешко антитяло, или негов антиген-свързващ участък, който:
а) инхибира фитохемаглутинин бласт пролиферация при in vitro РНА анализ с IC50 от 1 х 10'9 М или по-ниска;
б) притежава CDR3 на тежка верига, включваща аминокиселинната последователност от SEQ ID N0: 17, и
в) притежава CDR3 на лека верига, включваща аминокиселинната последователност от SEQ ID NO: 18.
В предпочитан метод, изолираното човешко антитяло, или негов антиген свързващ участък притежава CDR2 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID N0: 19 и CDR2 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO:
20.
В друг предпочитан метод, изолираното човешко антитяло, или негов антиген свързващ участък включва вариабилен регион на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 23 и вариабилен регион на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 24.
В определени методи, пълната дължина на антитялото включва постоянен регион на тежка верига, като например IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA и IgE постоянни региони, и който и да е техен алотипичен вариант, както е описано от Kabat (Kabat Е.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Ineterest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91 - 3242). По специално, постоянния регион на тежката верига на антитялото е IgGl постоянен регион на тежка верига. Алтернативно, участък на антитялото може да бъде Fab фрагмент, F(ab’2) фрагмент или едноверижен Fv фрагмент.
Модификации на индивидуалните остатъци на Y61 доведоха до получаването на панел от антитела, показани на Фигури 2А - 23. Специфичността / свързващия афинитет на всяко антитяло бяха определени чрез повърхностен плазмен резонанс и/или чрез in vitro неутрализационен анализ.
Съгласно друг аспект, изобретението характеризира изолирано човешко антитяло, или негов антиген-свързващ участък, което:
а) инхибира фитохемаглутинин бласт пролиферация при in vitro РНА анализ с 1С50 от 1 х ΙΟ’9 М или по-ниска;
б) притежава CDR3 на тежка верига, включваща аминокиселинна последователност, селекционирана от група, състояща се от SEQ ID NO: 404-SEQ ID NO: 469, и
в) притежава CDR3 на лека верига, включваща аминокиселинна последователност, селекционирана от група, състояща се от SEQ ID
N0:534 - SEQ ID NO: 579.
В предпочитан метод, изолираното човешко антитяло, или негов антиген-свързващ участък притежава CDR2 на тежка верига, включваща аминокиселинна последователност, селекционирана от група, състояща се от SEQ ID N0: 335 - SEQ ID NO: 403; и CDR2 на лека верига, включваща аминокиселинна последователност, селекционирана от група, състояща се от SEQ ID N0: 506 - SEQ ID NO: 533.
В друг предпочитан метод, изолираното човешко антитяло, или негов антиген свързващ участък притежава CDR1 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност, селекционирана от група, състояща се от SEQ ID N0: 288 - SEQ ID NO: 334; и CDR1 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност, селекционирана от група, състояща се от SEQ ID N0: 470 - SEQ ID NO: 505.
В друг предпочитан метод, изолираното човешко антитяло, или негов антиген свързващ участък включва вариабилен регион на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID N0: 23 и вариабилен регион на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID N0: 24.
В определени методи, пълната дължина на антитялото включва постоянен регион на тежка верига, като например IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA и IgE постоянни региони, и който и да е техен алотипичен вариант, както е описано от Kabat (Kabat Е.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Ineterest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91 - 3242). По специално, постоянния регион на тежката верига на антитялото е
IgGl постоянен регион на тежка верига. Алтернативно, участък на антитялото може да бъде Fab фрагмент, F(ab’2) фрагмент или едноверижен Fv фрагмент.
Особено предпочитано рекомбинантно, неутрализиращо антитяло от изобретението J695 беше получено чрез сайтово насочен мутагенез на контактни и хипермутационни аминокиселинни остатъци на антитяло Y61 (виж Пример 2 и Част III по-долу). J695 се различава от Y61 по заместването на тирозин с глицин в Y61 в позиция 50 на CDR2 на лека верига и чрез заместването на тирозин с глицин в позиция 94 на CDR3 на лека верига. CDR3s на тежката и леки вериги на J 695 са показани съответно на SEQ ID NO: 25 и 26, CDR2s на тежката и леки вериги на J 695 са показани съответно на SEQ ID NO: 27 и 28 и CDRls на тежката и леки вериги на J 695 са показани съответно на SEQ ID NO: 29 и 30. VH на J695 притежава аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 31 и VL на J695 притежава аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 32 (тези последователности са също така показани на Фигури 1А-1Г, представени съвместно с Joe 9).
Съгласно друг аспект, изобретението характеризира изолирано човешко антитяло, или негов антиген-свързващ участък, което:
а) инхибира фитохемаглутинин бласт пролиферация при in vitro РНА анализ с 1С5о от 1 х 10'9 М или по-ниска;
б) притежава CDR3 на тежка верига, включваща аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 25, и
в) притежава CDR3 на лека верига, включваща аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 26.
В предпочитан метод, изолираното човешко антитяло, или негов антиген свързващ участък притежава CDR2 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 27; и CDR2 на лека
верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 28.
В друг предпочитан метод, изолираното човешко антитяло, или негов антиген свързващ участък притежава CDR1 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 29; и CDR1 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 30.
В друг предпочитан метод, изолираното човешко антитяло, или негов антиген свързващ участък включва вариабилен регион на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 31 и вариабилен регион на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 32.
В определени методи, пълната дължина на антитялото включва постоянен регион на тежка верига, като например IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA и IgE постоянни региони, и който и да е техен алотипичен вариант, както е описано от Kabat (Kabat Е.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Ineterest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91 - 3242). По специално, постоянния регион на тежката верига на антитялото е IgGl постоянен регион на тежка верига. Алтернативно, участък на антитялото може да бъде Fab фрагмент, F(ab’2) фрагмент или едноверижен Fv фрагмент.
Допълнителни мутации на предпочитаните консенсусни последователности за CDR3, CDR2 и CDR1 на антитела по линията от Joe 9 до J695 или от линията Y61 към J695 могат да бъдат направени, така че да се осигурят допълнителни анти-11-12 антитела от изобретението. Такива методи на модифициране могат да бъдат проведени, използвайки стандартни молекулярно биологични техники, като например PCR мутагенез, насочен индивидуален контакт или
хипермутация на аминокиселинни остатъци в CDRs на лека и / или тежка верига, последвани от кинетични или функционални анализи на модифицираните антитела, както е описано тук (т.е. неутрализационни анализи, описани в Пример 3 и чрез BIAcore анализа, както е описано в Пример 5).
Съгласно друг аспект, изобретението характеризира изолирано човешко антитяло, или негов антиген-свързващ участък, което:
а) инхибира фитохемаглутинин бласт пролиферация при in vitro РНА анализ с 1С50 от 1 х ΙΟ’6 М или по-ниска;
б) съдържа CDR3 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 1, CDR2 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 3 и CDR1 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 5 или техен мутант, притежаващ едно или повече аминокиселинни замествания в предпочитани позиции на селективен мутагенез или хипермутационни позиции, характеризиращ се с това, че въпросният мутант притежава скоростна константа Koff не повече от 10-кратно повисока от тази на антитяло, съдържащо CDR3 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 1, CDR2 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 3 и CDR1 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 5; и
в) съдържа CDR3 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 2, CDR2 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 4 и CDR1 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 6 или техен мутант, притежаващ едно или повече аминокиселинни замествания в предпочитани позиции на селективен мутагенез или хипермутационни позиции, характеризиращ се с това, че въпросният мутант притежава скоростна константа Koff не повече от 10-кратно повисока от тази на антитяло, съдържащо CDR3 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 2, CDR2 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 4 и CDR1 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 6.
Съгласно друг аспект, изобретението характеризира изолирано човешко антитяло, или негов антиген-свързващ участък, което:
а) инхибира фитохемаглутинин бласт пролиферация при in vitro РНА анализ с 1С50 от 1 х ΙΟ'9 М или по-ниска;
б) съдържа CDR3 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 9, CDR2 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 11 и CDR1 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO:
или техен мутант, притежаващ едно или повече аминокиселинни замествания в предпочитани позиции на селективен мутагенез или хипермутационни позиции, характеризиращ се с това, че въпросният мутант притежава скоростна константа Koff не повече от 10-кратно повисока от тази на антитяло, съдържащо CDR3 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 9, CDR2 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 11 и CDR1 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 13; и
в) съдържа CDR3 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 10, CDR2 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 12 и CDR1 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO:
или техен мутант, притежаващ едно или повече аминокиселинни замествания в предпочитани позиции на селективен мутагенез или хипермутационни позиции, характеризиращ се с това, че въпросният мутант притежава скоростна константа Koff не повече от 10-кратно повисока от тази на антитяло, съдържащо CDR3 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 10, CDR2 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 12 и CDR1 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 14.
Всеки с опит в съществуващото ниво на техниката също така ще оцени, че могат да бъдат направени допълнителни мутации на CDR региони на антитяло от изобретението, например в Y61 или в J695, с цел да се осигурят допълнителни анти-IL-12 антитела от изобретението. Такива методи на модификация могат да бъдат проведени, използвайки стандартни молекулярно биологични техники, както бяха описани по-горе. Функционалните и кинетични анализи на модифицираните антитела могат да бъдат проведени както е описано съответно в Пример 3 и Пример 5. Модификации на индивидуалните остатъци на Y61, които доведоха до идентификацията на J695, са показани на Фигури 2А - 23 и са описани в Пример 2.
Съгласно друг аспект, изобретението характеризира изолирано човешко антитяло, или негов антиген-свързващ участък, което:
а) инхибира фитохемаглутинин бласт пролиферация при in vitro РНА анализ с IC50 от 1 х 10'9 М или по-ниска;
б) съдържа CDR3 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 17, CDR2 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 19 и CDR1 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 21 или техен мутант, притежаващ едно или повече аминокиселинни замествания в предпочитани позиции на селективен мутагенез или хипермутационни позиции, характеризиращ се с това, че въпросният мутант притежава скоростна константа К^не повече от 10-кратно повисока от тази на антитяло, съдържащо CDR3 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 17, CDR2 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 19 и CDR1 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 21; и
в) съдържа CDR3 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 18, CDR2 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 20 и CDR1 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 22 или техен мутант, притежаващ едно или повече аминокиселинни замествания в предпочитани позиции на селективен мутагенез или хипермутационни позиции, характеризиращ се с това, че въпросният мутант притежава скоростна константа Когг не повече от 10-кратно повисока от тази на антитяло, съдържащо CDR3 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 18, CDR2 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 20 и CDR1 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 22.
Съгласно друг аспект, изобретението характеризира изолирано човешко антитяло, или негов антиген-свързващ участък, което:
а) инхибира фитохемаглутинин бласт пролиферация при in vitro РНА анализ с IC50 от 1 х ΙΟ'9 М или по-ниска;
б) съдържа CDR3 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 25, CDR2 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 27 и CDR1 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 29 или техен мутант, притежаващ едно или повече аминокиселинни замествания в предпочитани позиции на селективен мутагенез или хипермутационни позиции, характеризиращ се с това, че въпросният мутант притежава скоростна константа Koff не повече от 10-кратно повисока от тази на антитяло, съдържащо CDR3 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 25, CDR2 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 27 и CDR1 на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 29; и
в) съдържа CDR3 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 26, CDR2 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 28 и CDR1 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 30 или техен мутант, притежаващ едно или повече аминокиселинни замествания в предпочитани позиции на селективен мутагенез или хипермутационни позиции, характеризиращ се с това, че въпросният мутант притежава скоростна константа Koff не повече от 10-кратно повисока от тази на антитяло, съдържащо CDR3 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 26, CDR2 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 28 и CDR1 на лека верига, включващ аминокиселинна последователност от SEQ ID NO: 30.
Съгласно друг метод, изобретението осигурява изолирани човешки антитела или техни антиген - свързващи участъци, които неутрализират активността на човешки IL-12 и поне на един допълнителен IL-12 на примат, селекциониран от група, състояща се от IL-12 на песоглавец, IL-12 на маймуна мармозетка, IL-12 на шимпанзе, IL-12 на маймуна циномолгус и IL-12 на резус, но които не неутрализират активността на IL-12 на мишки.
Селекция на рекомбинантни човешки антитела
Рекомбинантни човешки антитела от изобретението могат да бъдат изолирани чрез скрининг на рекомбинантна комбинаторна библиотека на антитела, по-специално scFv фагово представена библиотека, получена използвайки човешки VL и VH кДНК, получени от иРНК, произлезли от човешки лимфоцити. Методологиите за получаване и скрининг на такива библиотеки са известни в съществуващото ниво на техниката. В допълнение на налични в търговската мрежа набори за генериране на фагово представени библиотеки (например Рекомбинантна фагова система антитела на Фармасия, каталожен N 27-9400-01 и SurfZAP™ фагово представен набор на Стратаджиин, каталожен N 240612), примери за методи и реактиви специално подходящи за използване при генериране и скрининг на библиотеки, представящи антитела могат да бъдат открити например в Kang et al., РСТ Публикация N WO 92/18619; Winter et al. PCT Публикация N WO 92/20791; Breitling et al. PCT Публикация N WO 93/01288; McCafferty et al. PCT Публикация N WO 92/01047; Garrard et al. PCT Публикация N WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (19927 Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al., (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid. Res. 19:4133-4137; и Barbas etal. (1991) PNAS 88:7978-7982.
Използваните при този метод библиотеки антитела са поспециално scFv библиотеки, получени от човешки VL и VH кДНК. Библиотеките антитела scFv са по-специално скринирани, използвайки рекомбинантни човешки IL-12 като антиген, с цел да се селекционират човешки последователности на тежки и леки вериги, притежаващи свързваща активност към IL-12. За да се проведе селекция на антитела специфични за р35 субединицата на IL-12 или р70 хетеро димер, бяха проведени скринингови анализи в присъствието на излишък от свободни р40 субединици. Предпочитанията към субединицата могат да бъдат определени например чрез микро-Friguet титруване, както е описано в Пример 1.
След като са селекционирани началните човешки VL и VH сегменти, бяха проведени експерименти за “смесване и съчетаване”, при които различни двойки от селекционираните VL и VH сегменти са скринирани за свързване с IL-12 , за да се селекционират предпочитани комбинации VL / VH ( Виж Пример 1). В допълнение, за допълнително подобряване на афинитета и/или намаляване на скоростната константа Koff за свързване с hIL-12, VL и VH сегментите на предпочитаните VL / VH двойки могат да бъдат мутирани по случаен начин, по специално в рамките на CDR3 региона на VL и/или VH , при използването на процес, аналогичен на in vivo соматичен мутационен процес, отговорен за афинитетно съзряване на антитела при естествен имунен отговор. Това in vitro афинитетно съзряване може да бъде осъществено чрез амплифициране на VL и VH региони, използвайки PCR праймери комплементарни съответно на VH CDR3 или VL CDR3, които праймери са “прободени”със случайна смес от четири нуклеотида в определени позиции, така че получените след PCR процедурата продукти, кодерат VL и VH сегменти, в които са въведени случайни мутации във VL и/или VH CDR3 регионите. Тези, подложени на случайна мутация VL и VH сегменти, могат да бъдат повторно селекционирани и скринирани за свързване към hIL-12 и могат да бъдат селекционирани последователностите, които показват висок афинитет и ниска скоростна константа Koff за свързване с IL-12. В Таблица 2 (виж Приложение А) са показани антителата, които показват променена специфичност / афинитет към свързване, получени в резултат на in vitro афинитетно съзряване.
След селекция, изолиране и скрининг на анти-МЬ-12 антитяло от изобретението от рекомбинантната библиотека на имуноглобулини, от фагови частички могат да бъдат изолирани нуклеиновата киселина, кодираща антитялото (например от генома на фага) и субклонирани в други експресионни вектори чрез стандартни рекомбинантни ДНК техники. Ако е желателно, нуклеиновата киселина може допълнително да бъде манипулирана за получаването на други форми на антитела от изобретението (например свързани с нуклеинова киселина, кодираща допълнителни имуноглобулинови домени, като например допълнителни постоянни региони). За да се експресира рекомбинантното човешко антитяло, изолирано чрез скрининг на комбинаторна библиотека, ДНК, кодираща антитялото е клонирана в рекомбинантен експресионен вектор и въведена в клетка гостоприемник на бозайник, както е описано подробно в Част IV подолу.
В Пример 1 са подробно описани методите за скрининг на човешки антитела, свързващи IL-12 чрез фагово представена технология и афинитетно зреене на селекционираните антитела чрез случаен или сайтово насочен мутагенез на CDR региони.
Както е описано в Пример 1, скрининга на човешки VL и VH кДНК библиотеки идентифицира серии от анти-1Ь-12 антитела, от които антитялото Joe 9 беше селекционирано за следващо развитие. Сравнение на вариабилния регион на тежката верига на Joe 9 с последователността предшественик на тежка верига от VBASE база данни показа, че Joe 9 е подобно на последователността предшественик COS-3. COS-З принадлежи на семейството последователности предшественици VH3.
Семейството VH3 е част от групата предшественици VH, която е групирана в седем семейства, VH1- VH7, на основата на хомология на нуклеотидните последователности (Tomilinson et al. (1992) J. Mol. Biol., 227, 776-798 и Cook et al. (1995) Immunology Today, 16, 237-242). Vh3 семейството съдържа най-високия брой представители и има найголям принос към последователностите предшественици. За всяка дадена човешка VH3 последователност на антитяло, идентичността на аминокиселинната последователност в рамките на цялото Vh3 семейство е висока (виж например Tomilinson et al. (1992) J. Mol. Biol., 227, 776-798 и Cook et al. (1995) Immunology Today, 16, 237-242). Диапазона на идентичността на аминокиселинните последователности между които и да е две VH последователности предшественици на VH3 семейството варира от 69-98 остатъци до приблизително 100 VH остатъци (т.е 69-98 % аминокиселинна хомоложност между които и да е две VH последователности предшественици). За повечето двойки от последователностите предшественици има поне 80 или повече идентични аминокиселинни остатъци (т.е. поне 80 % хомоложност на аминокиселинната последователност). В резултат на високата степен на хомоложност на аминокиселинните остатъци между представителите на VH3 семейството, определени аминокиселинни остатъци присъстват в ключови позиции в CDR и рамковите региони на VH веригата. Тези аминокиселинни остатъци определят структурните особености на CDRs.
Изследвания на структурите на антителата показват, че конформациите на CDR могат да бъдат групирани в семейства от канонични CDR структури, основавайки се на ключови аминокиселинни остатъци, които заемат определени позиции в CDR и рамковите региони. Следователно има подобни локални CDR конформации в различните антитела, които имат канонична структура с идентични ключови аминокиселинни остатъци (Clothia et al., (1987) J. Mol. Biol., 196, 901-917 и Clothia et al., (1989) Nature, 342, 877-883). B рамките на VH3 семейството има съхраняване на идентичността на аминокиселинните остатъци в ключовите позиции в каноничните структури на CDR1 и CDR2 (Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol. 227, 799817).
COS-3 предшественика на VH гена е член на VH3 семейството и е вариант на 3-30 (DP-49 VH алел предшественик). COS-З се различава от VH аминокиселинната последователност на Joe 9 само в 5 позиции. Високата степен на хомоложност на аминокиселинната последователност между Joe 9 VH и COS-З и между Joe 9 VH и други представители на Vr3 семейството също определя висока степен на CDR структурна хомоложност (Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol. 227, 799-817; Chothia et al (1987) J. Mol. Biol. 196, 901-917 и Chothia et al. (1989) Nature, 342, 877-883).
Всеки c опит в съществуващото ниво на техниката ще оцени, че основавайки се на високата подобност на аминокиселинната последователност и канонична структура на Joe 9, семейството могат също така да бъдат използвани други представители на VH3 за генерирането на антитела, които се свързват с човешки IL-12. Това може да бъде проведено например чрез селекция на подходяща VL чрез техниката на изтегляне на верига (Winter et al. (1994) Annual Rev. Immunol., 12, 433-55) или чрез включване на CDRs от човешки антитела или антитела от гризачи, включващи CDRs от антитела от настоящото изобретение в рамката на VH3 семейството.
Човешките V ламбда предшественици са групирани в 10 семейства на основата на хомоложност на нуклеотидните последователности (Williams et al. (1996) J. Mol. Biol., 264, 220-232). Сравнение на вариабилния регион на леката верига на Joe 9 с предшественици на последователности предшественици на лека верига, селекционирани от VBASE база данни показа, че Joe 9 е подобно на предшественика DPL8 ламбда. Joe 9 се различава от DPL8 последователността само в четири рамкови позиции и е високо хомоложно на рамковата последователност на други представители на νλ1 семейството. Основавайки се на високата хомоложност на аминокиселинната последователност и подбността на каноничната структура на Joe 9, за генерирането на антитела, които се свързват с IL12 могат да бъдат използвани и други представители на VJ семейството. Това може да бъде осъществено например чрез селекциониране на подходящи VH чрез техника на верижно удължаване (Winter et al. Supra) или чрез въвеждането на CDRs от гризачи или други човешки антитела включитело CDRs от настоящото изобретение в рамката на νλ1 семейството.
Методите на изобретението са предназначени да включват рекомбинантни антитела, които се свързват с hIL-12, включващи вариабилни региони на тежка верига, произлизащи от представител на VH3 семейството от последователности предшественици и вариабилни региони на лека верига, произлизащи от представители на νλ1 семейството от последователности предшественици. Нещо повече, всеки с опит в съществуващото ниво на техниката ще оцени, че всеки представител на последователности на тежка верига на VH3 семейството може да бъде комбиниран с който и да е представител на последователности на лека верига от \\1 семейството.
Също така, всеки с опит в ъсществуващото ниво на техниката ще оцени, че полиморфизма на ДНК последователността, който води до промени в аминокиселинните последователности на предшествениците, може да съществува в рамките на популация (например човешка популация). Такъв генетичен полиморфизъм в последователностите предшественици може да съществува между индивиди в рамките на популация в резултат на естествени алелни вариации. Такива естествени алелни вариации може най-общо да доведат до 1 - 5 % вариране в нуклеотидната последователност на гена. Която и да е такава или всички нуклеотидни вариации и получения в резултат на това аминокиселинен полиморфизъм на последователностите предшественици, които са резултат от естествени алелно вариране, попада в в обхвата на настоящото изобретение.
Съответно, в един аспект, изобретението характеризира изолирано човешко антитяло или негов антиген-свързващ участък, които притежават следните характеристики:
а) свързват се с човешки IL-12 и дисоциират от човешки IL-12 със скоростна константа Kofr от 0.1 s'1 или по-ниска, определена чрез повърхностно плазмен резонанс, или които инхибират фитохемаглутининова бластна пролиферация при in vitro фитохемаглутинин бласт пролиферационен анализ (РНА анализ) с 1С50 от 1 х ΙΟ'6 М или по-ниска.
б) притежават вариабилен регион на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност, селекционирана от представител на VH3 семейство предшественици, характеризираща се с това, че вариабилния регион на тежка верига притежава мутация в позиция на контакт или хипермутация с аминокиселинен остатък, усилващ активността.
в) притежават вариабилен регион на лека верига, включващ аминокиселинна последователност, селекционирана от представител на νλ1 семейство предшественици, характеризираща се с това, че вариабилния регион на лека верига притежава мутация в позиция на контакт или хипермутация с аминокиселинен остатък, усилващ активността.
В предпочитан метод, изолираното човешко антитяло или антиген - свързващ участък има мутация в CDR3 на тежка верига.
В друг предпочитан метод, изолираното човешко антитяло или антиген - свързващ участък има мутация в CDR3 на лека верига.
В друг предпочитан метод, изолираното човешко антитяло или антиген - свързващ участък има мутация в CDR2 на тежка верига.
В друг предпочитан метод, изолираното човешко антитяло или антиген - свързващ участък има мутация в CDR2 на лека верига.
В друг предпочитан метод, изолираното човешко антитяло или антиген - свързващ участък има мутация в CDR1 на тежка верига.
В друг предпочитан метод, изолираното човешко антитяло или антиген - свързващ участък има мутация в CDR1 на лека верига.
Всеки с опит в съществуващото ниво на техниката ще оцени, че на основата на високата степен на подобност на аминокиселинните последователности между представителите на VH3 семейството предшественици или между представителите на νλ1 семейство предшественици на лека верига, че мутации в последователностите на предшествениците могат да осигурят допълнителни антитела, които се свързват с човешки IL-12. В Таблица 1 (виж Приложение А) са показани последователности предшественици на представителите на VH3 семейството и показва значителната хомоложност на последователностите при представителите на семейството. Освен това, в Таблица 1 са показани последователностите предшественици на представителите на V\1 семейството. За сравнение са представени последователностите на тежката и лека вериги на Joe 9. Могат да бъдат направени мутации в последователностите предшественици на представители на УцЗ или Vxl семействата, например в същите аминокиселинни позиции като тези направени в антителата от изобретението (например мутации в Joe 9). Модификации могат да бъдат направени, използвайки стандартни молекулярно биологични техники, като например PCR мутагенез, насочен към индивидуални аминокиселинни остатъци в последоватерностите предшественици, последвано от кинетичен и функционален анализ на модифицираните антитела, както е описано в настоящото изобретение (т.е. неутрализационен анализ описан в Пример 3 и BIAcore анализ, описан в Пример 5).
Съответно, в един аспект, изобретението характеризира изолирано човешко антитяло или негов антиген-свързващ участък, които притежават следните характеристики:
а) притежават вариабилен регион на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност, селекционирана от група, състояща се от SEQ ID NO: 595-667, характеризираща се с това, че вариабилния регион на тежка верига притежава мутация в предпочитана позиция на селективен мутагенез, позиция на контакт или хипермутация с аминокиселинен остатък, усилващ активността.
б) притежават вариабилен регион на лека верига, включващ аминокиселинна последователност, селекционирана от група, състояща се от SEQ ID NO: 669-675, характеризираща се с това, че вариабилния регион на лека верига притежава мутация в предпочитана позиция на селективен мутагенез, позиция на контакт или хипермутация с аминокиселинен остатък, усилващ активността.
Всеки с опит в съществуващото ниво на техниката ще оцени, че на основата на високата степен на подобност на аминокиселинната последователност между Joe 9 и последователностите на предшественици на тежка верига COS-З и между Joe 9 и DPL8 ламбда последователност предшественик, че други мутации в последователностите на CDR регионите на тези предшествениците могат да осигурят допълнителни антитела, които се свързват с човешки
IL-12. Такива методи на модификация могат да бъдат проведени, използвайки стандартни молекулярно биологични техники както беше описано по-горе.
Съответно, в един аспект, изобретението характеризира изолирано човешко антитяло или негов антиген-свързващ участък, които притежават следните характеристики:
а) свързват се с човешки IL-12 и дисоциират от човешки IL-12 със скоростна константа Koff от 0.1 s'1 или по-ниска, определена чрез повърхностно плазмен резонанс, или които инхибират фитохемаглутининова бластна пролиферация при in vitro фитохемаглутинин бласт пролиферационен анализ (РНА анализ) с 1С5о от 1 х 10'6 М или по-ниска.
б) притежават вариабилен регион на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност на COS-З предшественици, характеризираща се с това, че вариабилния регион на тежка верига притежава мутация в предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт или хипермутация с аминокиселинен остатък, усилващ активността.
в) притежават вариабилен регион на лека верига, включващ аминокиселинна последователност на DPL8 предшественик, характеризираща се с това, че вариабилния регион на лека верига притежава мутация в предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт или хипермутация с аминокиселинен остатък, усилващ активността.
Благодарение на това, че определени аминокиселинни остатъци заемат ключови сайтове в CDR и рамковите региони във вариабилните региони на тежка и лека вериги, са обсъдени структурните характеристики на тези региони. По-специално, CDR1 и CDR2 регионите са обект на канонична структурна класификация. Тъй като има висока степен на хомоложност на аминокиселинните последователности между представителите на семействата, тези канонични характеристики присъстват между представителите на семействата. Всеки с опит в съществуващото ниво на техниката ще оцени, че модификации в аминокиселинните остатъци, които определят тези канонични структури би довело до получаването на допълнителни антитела, които се свързват с IL-12. Тези модификации могат да бъдат проведени, използвайки стандартни молекулярно биологични техники, както е описано по-горе.
Съответно, в друг аспект, изобретението характеризира изолирано човешко антитяло или негов антиген-свързващ участък, които притежават следните характеристики:
а) свързват се с човешки IL-12 и дисоциират от човешки IL-12 със скоростна константа К<,п· от 0.1 s1 или по-ниска, определена чрез повърхностно плазмен резонанс, или които инхибират фитохемаглутининова бластна пролиферация при in vitro фитохемаглутинин бласт пролиферационен анализ (РНА анализ) с 1С50 от 1 х ΙΟ'6 М или по-ниска.
б) притежават вариабилен регион на тежка верига, включващ аминокиселинна последователност, селекционирана от представител на VH3 семейство предшественици, характеризираща се с това, че вариабилния регион на тежка верига включва CDR2, който е структурно подобен на CDR2s от представители на VH3 семейство предшественици и CDR1, който е структурно подобен на CDRls от други представители на VH3 семейство предшественици, и където вариабилния регион на тежка верига притежава мутация в | i предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт !
j или хипермутация с аминокиселинен остатък, усилващ активността. I ί i ι
в) притежават вариабилен регион на лека верига, включващ аминокиселинна последователност, селекционирана от представител на νλ1 семейство предшественици, характеризираща се с това, че вариабилния регион на лека верига включва CDR2, който е структурно подобен на CDR2s от представители на V?1 семейство предшественици и CDR1, който е структурно подобен на CDRls от други представители на νχΐ семейство предшественици, и където вариабилния регион на лека верига притежава мутация в предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт или хипермутация с аминокиселинен остатък, усилващ активността.
Рекомбинантните човешки антитела от изобретението притежават вариабилни и постоянни региони, които са хомоложни на човешки последователности предшественици на имуноглобулини, селекционирани от VBASE база данни. Мутации на рекомбинантните човешки антитела (например чрез случаен мутагенез или PCR мутагенез) водят до аминокиселини, които не са кодирани от човешки имуноглобулинови последователности предшественици. Освен това, библиотеките от рекомбинантни антитела, които произлизат от човешки донори ще съдържат последователности на антитела, които се различават от техните съответстващи последователности предшественици, дължащо се на нормален процес на соматична мутация, който възниква при развитието на В-клетки. Трябва да се отбележи, че ако последователността “предшественик” получена чрез PCR амплификация кодира аминокиселини, които се различават в рамковите региони от истинската конфигурация на предшественика (например разлики в амплифицираните последователности сравнени с истинските последователности предшественици) може да е желателно да се променят тези аминокиселинни различия обратно в последователностите предшественици (например “обратна мутация” на ммйЙНМММ рамкови остатъци в конфигурацията на предшественика). Следователно, настоящото изобретение може по избор да включва етап на обратна мутация. За да се постигне това, аминокиселинните последователности на тежка и лека вериги, кодирани от предшественика (както е установени в примери на VBASE базата данни) са първо сравнени с мутирани аминокиселинни рамкови последователности на тежка и лека вериги, с цел да се определят аминокиселинните остатъци в мутираната имуноглобулинова рамкова последователност, които се различават от най-близката последователност предшественик. След това подходящи нуклеотиди от мутираната имуноглобулинова последователност са подложени на обратна мутация, така че да съответствуват на последователността предшественик, използвайки генетичен код за да се определи кои промени на нуклеотиди трябва да се направят. Проведен е мутагенез на мутирана имуноглобулинова рамкова последователност чрез стандартни методи като PCR медииран мутагенез (при който мутираните нуклеотиди са инкорпорирани в PCR праймери, така че PCR продукта да съдържа мутациите) или сайтово насочен мутагенез. Ролята на всяка аминокиселина, идентифицирана като кандидат за обратна мутация трябва да бъде изследвана за пряка или непряка роля за свързването с антиген и всяка аминокиселина, за която е установено, че повлиява, която и да е от желаните характеристики на човешкото антитяло не трябва да бъде включена в крайното човешко антитяло; като например, аминокиселинни остатъци, усилващи активността, идентифицирани чрез подхода на селективен мутагенез няма да бъдат обект на обратна мутация. Анализи за определяне на характеристиките на антитялото, получени в резултат на мутагенез, могат да включват ELISA, конкурентен ELISA, in vivo и in vitro неутрализационни анализи и/или (виж например Пример 3) имунохистохимия с тъканни части от различни източници (включващи човешки, от примати и/или други източници).
За да се намали броят на аминокиселините, предмет на обратна мутация, тези аминокиселинни позиции, за които е установено че са различни от най-близката последователност предшественик, но са идентични на съответстващата аминокиселина във втора последователност предшественик, може да остане, ако се установи че втората последователност предшественик е идентична или съ-линейна на последователността на човешко антитяло от изобретението по отношение на поне 10, по-специално 12 аминокиселини, от двете страни на разглежданата аминокиселина. Това ще гарантира, че всеки пептиден епитоп, представен на имунната система чрез професионална, антиген представяща клетка в обект, третиран с човешкото антитяло от изобретението, няма да бъде чуждородна, а идентична на собствен антиген, т.е. имуноглобулина, кодиран от тази втора последователност предшественик. На всеки етап от оптимизирането на антитялото може да възникне обратна мутация, поспециално, обратна мутация възниква непосредствено преди или след прилагането на подхода на селективен мутагенез. По-специално, обратна мутация възниква непосредствено преди подхода на селективен мутагенез.
III. Модификации на предпочитани позиции на селективен мутагенез, позиции на контакт и/или позиции на хипермутация
Обикновено, селекцията на антитела с подобрен афинитет може да бъде проведена, използвайки фагово представени методи, както е описано в Част II, по-горе. Това може да бъде осъществено чрез случайно мутирани комбинации от CDR остатъци и да се генерират големи библиотеки, съдържащи антитела от различни
100 последователности. Обаче за да работят тези селекционни методи, реакциите антиген-антитяло, те трябва да клонят към равновесие за да позволи навременно преференциално свързване на антитела с по-висок афинитет към антигена. Условията на селекция, които биха позволили установяването на равновесие, не могат да бъдат определени (обикновено в резултат на допълнителни неспецифични взаимодействия между антигена и фаговата частица), когато се използват фагово представени методи за подобряване на афинитета на селекционираните анти-1Ь-12 антитела, при достигане на определено ниво на афинитет (например случаят с антитяло Y61). Съответно, антителата с дори по-висок афинитет не могат да бъдат селекционирани чрез фагово представените методи. Следователно, за поне някои определени антитела или антигени, фагово представените методи са лимитиращи по отношение на тяхната способност да селекционират антитела със силно подобрена спицифичност / афинитет на свързване. Следователно за преодоляване на тези ограничения, беше създаден метод наречен Подход за селективен мутагенез, който метод е осигурен от настоящото изобретение. Въпреки че този подход на селективен мутагенез беше създаден за да се преодолеят ограниченията при използването на фагово представена система, трябва да се отбележи, че този метод може също така да бъде използван с фагово представена система. Нещо повече, подходът на селективен мутагенез може да бъде използван за подобряване активността на което и да е антитяло.
За да се подобри активността (т.е. афинитета или неутрализиращата активност) на антитяло, идеалния вариант би бил да се мутира всяка CDR позиция както в тежката, така и в леката вериги, във всеки възможен аминокиселинен остатък. Обаче като се има предвид, че има средно 70 CDR позиции в рамките на едно антитяло,
101 такъв подход би отнел много време и труд. Съответно, метода на изобретението позволява да се подобри активността на антитяло чрез мутиране само на определени селекционирани остатъци в рамките на CDRs на тежка и/или лека верига. Нещо повече, методът на изобретението позволява подобряване на активността на антитялото без да се повлияват други желани характеристики на антитялото.
Основавайки се на първичната структура или позициите на аминокиселините във вариабилния регион, не може точно да се преположи кои аминокиселинни остатъци от вариабилния регион на антитялото са в контакт с антигена. Въпреки това, подредбата на последователностите на антитела с различни особености, определена от Kabat et al. показа локалните региони на CDRs в рамките на вариабилните региони, които се различават значително между антителата (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-393, Kabat E.A. et al., (1991) Sequesnces of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication, No. 91-3242). Структурни изследвания показаха, че антиген свързващата повърхност се образува от аминокиселинни остатъци присъстващи в CDRs. Също е известно, че други аминокиселинни остатъци извън CDR играят структурна роля или участват директно в свързването с антигена. Следователно за всяка двойка антиген антитяло, могат да бъдат важни аминокиселинните остатъци вътре и извън CDRs.
Изследванията на подредбата на последователности, проведени от Tomlison et al., показаха позиции в CDR1 и CDR2 на тежката и лека вериги и в участъци на CDR3 на капа веригата, които са чести сайтове на соматични мутации (Tomlison et al. (1996) J. Mol. Biol. 256:813-817). По-специално, позиции H31, H31B, НЗЗ, НЗЗВ, Н52 В, Н56, Н58, L30, L31, L31A, L50, L53, L91, L92, L93 и L94 бяха идентифицирани като
102 чести сайтове на соматична мутация. Обаче този анализ изключва важни CDR3 региони на тежка верига и части от CDR3 на лека верига, за които е известно, че лежат в центъра на сайта за свързване на антитялото с антигена. Нещо повече, Tomlison et al. предполагат, че соматичното разнообразие само по себе си не предполага роля на специфична аминокиселина при свързването с антигена, и предлага консервативни аминокиселинни остатъци, които се свързват с антигена и разнообразни аминокиселинни остатъци, които не се свързват с антигена. Това заключение е допълнително подкрепено от мутационни изследвания върху ролята на соматичните мутации за афинитета на антитялото (Sharon (1990), PNAS, 87:4814-7). Деветнайсет соматични мутации в антитяло с висок афинитет анти-р-азофениларсонат (Ars) бяха едновременно заместени с техните съответстващи остатъци предшественици, генерирайки версия на предшественика на анти-Ars антитяло, което имаше двеста пъти загуба на активност. Пълния афинитет на анти-Ars антитяло, може да бъде възстановен чрез възстановяване на само три от деветнайсетте соматични мутации, което показа, че много соматични мутации може да не допринасят за антиген свързващата активност.
Резултатът може частично да бъде обяснен с природата на разнообразието на самото антитяло. Незрели В-клетки могат първоначално да продуцират антитела с нисък афинитет, които разпознават определени собствени и несобствени антигени. Нещо повече, антителата могат да претърпят вариране на последователностите по време на афинитетното зреене, които могат да предизвикат собствена реактивоспособност. Хипермутация на такива антитела с нисък афинитет може да служи за отстраняване на собствената реактивоспособност (“отрицателна селекция”) и да увеличи афинитета към чуждия антиген. Следователно, анализът на
103 първичните и структурни данни на голям брой антитела не осигурява метод за предсказване както на (1) ролята на соматични хипермутационни сайтове в процеса на афинитетно съзряване срещу процеса на намаляване афинитета срещу нежелани антигени, така и на (2) как дадена аминокиселина допринася към характеристиките на специфична двойка антиген - антитяло.
Други опити да се насочи ролята на аминокиселинните остатъци при разпознаването на антигени, бяха направени чрез анализирането на някои кристални структури от комплексите антиген - антитяло (MacCallum et al., (1996) J. Mol. Biol. 262:732-745). Посочени са потенциалната роля на позициите разположени във и извън CDRs. Позициите в CDRs, учасващи в свързването с антигена в повече от 10 от двадесет и шестте анализирани структури включват Н31, НЗЗ, Н50, Н52, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98 и Н100 в тежката верига и L30A, L32, L91, L92, L93, L94, L96 в леката верига. Обаче авторите отбелязват, че предсказването на контактите с антигена, използвайки тези и други структурни данни може да не предскаже всички контактни позиции, което може да доведе до спекулацията, че трябва да бъдат прилагани различни стратегии към различните антигени.
Pini et al. описват случайни множествени остатъци в CDR последователностите на антитяло в голяма фагово представена библиотека, коиото бързо увеличават афинитета на антитялото (Pini et al. (1989) J. Biol. Chem. 273:21769-21776). Обаче антителата c висок афинитет дискутирани от Pini et al. имат мутации в общо осем позиции и е абсолютно необходим редукционен анализ на тези промени, и така този метод на подобряване афинитета на антитялото става непрактичен поради големия брой от възможни комбинации, които трябва да бъдат изследвани за малкия брой необходими аминокиселини.
104
Нещо повече при случайният подбор на множествени остатъци не е задължително да се запазят други желани характеристики на антитялото. Желани свойства или характеристики на антитяло са посочени в съществуващото ниво на техниката и включват например запазване на некръстосана реактивоспособност, например с други белтъци или човешки тъкани и запазване на последователностите на антитялото, които са близки до човешките имуноглобулинови последователности предшественици, подобряване на неутрализиращия потенциал. Други желани свойства и характеристики включват способност да се запазва видовата кръстосана реакивоспособност, способност да се запазва епитопната специфичност и способност да се запазват високи нива на експресия на белтъци в клетки на бозайници. Желаните свойства и характеристики могат да бъдат наблюдавани или измервани, използвайки известни техники в съществуващото ниво на техниката, включващи, но неограничаващи се до, ELISA анализ, конкурентен ELISA анализ, in vitro и in vivo неутрализационен анализи (виж Пример 3), имунохистохимия с части от тъкани от различни източници, включително човешки или от примати или от други източници ако е необходимо, и изследвания на експресия в клетки на бозайници използвайки преходна и стабилна експресия.
В допълнение, методът на Pini et al. може да въведе повече промени отколкото е минималният брой реално необходим за подобряване на афинитета и може да доведе до антитела, насочени към формирането на анти-човешки-антитела (НАМА) в човешки обекти. Нещо повече, както е обсъждано на много други места, фаговото представяне както е показано тук или други свързани методи, включително рибозомно представяне може и да не функционира подходящо при достигане на определени афинитета между антитяло и антиген и условията, които са необходими за достигане на равновесие
105 може и да не се установят в разумно време поради допълнителни взаимодействия включително взаимодействия с други фагови или рибозомни компоненти и антигена.
Всеки с опит в съществуващото ниво на техниката може да събере интересна научна информация за произхода на разнообразието на антитялото от циираната по-горе литература. Настоящото изобретение осигурява метод за увеличаване афинитета на антитялото на специфични двойки антиген - антитяло като в същото време запазва други характеристики или желани характеристики на антитялото. Това е особено важно, когато се разглежда доколко е желана промяната на съвкупността от няколко характеристики за специфично антитяло, включително за свързването му с антиген.
Ако началното антитяло има желани свойства и характеристики, които трябва да бъдат запазени, подходът на селективен мутагенез може да бъде най-добрата стратегия за запазване на тези желани свойства като в същото време се подобрява активността на антитялото. Например, при мутагенеза на Y61, целта беше да се увеличи афинитета за hIL-12 и да се подобри неутрализиращия потенциал на антитялото, като в същото време се запазят желаните свойства. Желани характеристики на Y61 включват (1) запазване на некръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани, (2) запазване на фината епитопна специфичност, т.е разпознаването на р40 епитопа по специално в контекста на р70 (р40/р35) хетеродимер, и по такъв начин предотвратяване на нарушаване на свързването от свободни разтворими р40 и (3) генерирането на антитяло с аминокиселинна последователности на тежка и лека верига, които са колкото е възможно по-близки до техните съответни имуноглобулинови последователности предшественици.
106
Съгласно един метод, методът на изобретението осигурява подход на селективен мутагенез като стратегия за запазване на желани свойства или характеристики на антитялото, като едновременно с това се подобрява афинитетния и/или неутрализационен потенциал. Понятието “подход на селективен метагенез” беше дефинирано погоре и включва метод на индивидуално мутиране на селекционирани аминокиселинни остатъци. Аминокиселинните остатъци, които ще бъдат подложени на мутагенез, може първо да бъдат селекционирани от предпочинтани позиции за селективен мутагенез, след това от позиции за контакт и след това от позиции за хипермутации. Ивдивидуалните селекционирани позиции могат да бъдат мутирани до поне два други аминокиселинни остатъци и се определя ефекта от мутацията както върху желаните свойства на антитялото, така и върху подобряване активността на антитялото.
Подходът на селективен мутагенез включва етапи на: селекциониране на кандидати за позиции в следния ред 1) предпочитани позиции за селективен мутагенез, 2) позиции за контакт; 3) позиции за хипермутации и класифициране на позициите на основата на локализацията на позицията във вариабилните региони на тежка и лека вериги на антитялото (CDR3 е предпочитан пред CDR2, предпочитан пред CDR1);
индивидуално мутиране на кандидатите от предпочитани позиции за селективен мутагенез, позиции за контакт и позиции за хипермутиране в класификационния ред до всички възможни други аминокиселинни остатъци и анализиране на ефекта от индивидуалните мутации върху активността на антитялото с цел да се определят аминокиселинните остатъци, усилващи активността;
ако е необходимо могат да бъдат направени степенни комбинации на индивидуалните аминокиселинни остатъци, усилващи
107 активността на антителата, селекциониране на мутантни антитела с аминокиселинни остатъци усилващи активността и класифициране на мутираните антитела, основавайки се на локализацията и идентичността на аминокиселинните замествания с оглед техния имуногенен потенциал. Най-високо място в класификацията се дава на мутантни антитела, които включват аминокиселинна последователност, която е най-близко идентична на последователността на вариабилен регион, която е описана в базата данни от предшественици или притежава аминокиселинна последователност, която е сравнима с други човешки антитела. Найниско място в класификацията се дава на мутантни антитела с аминокиселинни замествания, които не са били отчетени в последователността предшественик или в последователността на друго човешко антитяло. Както беше казано по-горе, мутантните антитела, включващи поне един аминокиселинен остатък усилващ активността, локализиран в CDR3 са предпочитани пред CDR2, които са предпочитани пред CDR1. CDRs от вариабилните региони на тежката верига се предпочитани пред тези от вариабилните региони на леката верига.
Също така, мутантните антитела могат да бъдат изследвани за подобряване на активността им, т.е. като са сравнени със съответните родителски антитела. Подобряването на активността на мутантното антитяло може да бъде определена например чрез неутрализационен анализ, или свързващата им специфичност / афинитет чрез повърхностно плазмен резонансен анализ (виж Пример 3). Поспециално подобряването на активността може да бъде поне 2-20 пъти по-висока отколкото на родителското антитяло. Подобряването на активността може да бъде поне “xj” до “х2” пъти по-висока, отколкото на родителското антитяло, където “χι” и “х2” са цели числа
108 между и включващи 2 до 20, включително диапазони в рамките на упоменатия диапазон, например 2-15, например 5-10.
Мутантни антитела с аминокиселинен остатък, усилващ активността също така могат да бъдат изследвани с цел да се определи дали поне едно друго желано свойство е запазено след мутацията. Например, по отношение на анти-Ь1Ь-12 антителата, изследване за (1) съхраняване на некръстосана реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани, (2) запазване на епитопното разпознаване, т.е. разпознаване по-специално на р40 епитопа в контекста на р70 (р40/р35) хетеродимер, и по такъв начин предотвратяване на нарушаване на свързването от свободни разтворими р40, и (3) генерирането на антитяло с аминокиселинна последователности на тежка и лека верига, които са колкото е възможно по-близки до техните съответни имуноглобулинови последователности предшественици, и определяне кои от тези характеристики имат наймалка вероятност да предизвикат имунен отговор при хора на основата на броя различия от последователността предшественик. Същото наблюдение може да бъде направено по отношение на антитяло, притежаващо повече от един аминокиселинен остатък, усилващ активността, т.е. поне два или поне три аминокиселинни остатъци, усилващи активността, за определяне дали е запазено желаното свойство или характеристика.
По-долу е описан пример за използване на “подход за селективен мутагенез” при мутагенеза на Y61. Всяка от индивидуалните мутации H31S-»E, L50->Y или L94G—>Y подобрява неутрализационната активност на антитялото. Обаче, когато бяха анализирани комбинация от клонове, активността на комбинирания клон H31S-»E+L50->Y+ L94G->Y, не беше по-добра от L50-»Y+L94G->Y (J695).
Следователно, променяната в аминокиселинната последователност
109 предшественик Ser до Glu в позиция CDR1 не беше необходима за подобрената активност на J695 в сравнение с Y61. Следователно подходът на селективен мутагенез, идентифицира минималният брой промени, които допринасят за крайната активност, и по този начин намалява имуногенния потенциал на крайното антитяло и съхранява други желани характеристики на антитялото.
Изолирана ДНК, кодираща VL и VH, продуцирана чрез подхода на селективен мутагенез, може да бъде превърната в пълна верига гени на антитяло, гени на Fab фрагменти или scFV гени, както е описано в Част IV. За експресия на VL и VH региони, продуцирани чрез подход на селективен мутагенез, експресионните вектори, кодиращи тежката и лека вериги могат да бъдат прехвърлени в различни клетки гостоприемници, както е подробно описано в част IV. Предпочитани клетки гостоприемници включват както прокариотни клетки гостоприемници, например Е. coli, така и еукариотни клетки гостоприемници, например дрождеви клетки, например S. cerevisiae. Най-предпочитани клетки гостоприемници са клетки гостоприемници на бозайници, описани подробно в част IV.
Подходът на селективен мутагенез осигурява метод за продукцията на антитела с подобрени активности без предварително афинитетно съзряване на антитялото чрез други методи. Подходът на селективен мутагенез осигурява метод за продукцията на антитела с подобрени афинитета, които са били подложени на обратни мутации. Подходът на селективен мутагенез също така осигурява метод за подобряване активността на афинитетно съзрели антитела.
Всеки с опит в съществуващото ниво на техниката ще отчете, че подходът на селективен мутагенез може да бъде използван в стандартни техники за манипулириране на антитела, известни в съществуващото ниво на техниката. Примери включват, но без да се no ограничават, антитела с включени CDR, химерни антитела, scFv фрагменти, Fab фрагменти на цели антитела и човешки антитела от други източници, например трансгенни мишки.
Бърз мащабен мутационен анализ на антитела включва in vitro транскрипция и транслация, използвайки рибозомно представена технология (виж например Hanes et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:4937-4942; Dall Acqua et al. (1998) Curr. Opin. Struc. Biol. 8:443-450; He et al., (1997) Nucleic Acid Res. 25:5132-5134) и патенти на САЩ N 5,643,768 и 5,658,754, издадени на Kawasaki. Подходът на селективен мутагенез също така осигурява метод за продукцията на антитела с подобрени активности, които могат да бъдат селекционирани, използвайки рибозомно представени техники.
В методите на изобретението, антителата или техни антиген свързващи участъци са допълнително модифицирани чрез промяна на индивидуалните позиции в CDRs и HCVR и / или LCVR. Въпреки, че тези модификации могат да бъдат направени във фагово предтавени антитела, преимуществата на метода са, че той може да бъде проведен с антитела, които са експресирани в друг вид гостоприемници, като например бактериални, дрождеви клетки или клетки на бозайници. Ивдивидуалните позиции в CDRs, селекционирани за модифициране, се основават на позициите, които са позиции на контакт и/или позиции на хипермутиране.
Предпочитани позиции на контакт и хипермутации както са определени тук, са показани в Таблица 3 (виж Приложение А) и техни модификации в съответствие с метода на изобретението, описан подробно в Пример 3. Предпочитани позиции на контакт са селекционирани от група, състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96.
Ill
Предпочитани позиции за хипермутиране са селекционирани от група състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L53 и L93. По-предпочитани аминокиселинни остатъци (обозначени като “предпочитани позиции за селективен мутагенез”) са както позиции за контакт, така и за хипермутации и са селекционирани от група състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94. По-специално, предпочитани позиции за контакт са селекционирани от група състояща се от L50 и L94.
Предпочитани аминокиселинни остатъци, усилващи активността заместват аминокиселинни остатъци, локализирани в позиции, селекционирани от група състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96. Поспециално, аминокиселинни остатъци, усилващи активността заместват аминокиселинни остатъци, локализирани в позиции, НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94. По-специално, предпочитани аминокиселинни остатъци, усилващи активността заместват аминокиселинни остатъци, локализирани в позиции L50 и L94.
По принцип, методът на изобретението включва селекцията на определена предпочитана позиция на селективен мутагенез, позиция на контакт и/или хипермутиране CDR на тежка или лека верига на интересуващото ни родителско антитяло, или негов антиген свързващ участък, подлагайки на случаен мутагенез тази индивидуална позиция (например чрез генетични средства, използвайки мутагенен олигонуклеотид за генерирането на “мини-библиотека” от модифицирани антитела), или мутирането на позиция на специфично желана аминокиселина, за да се идентифицира експресията на аминокиселинен остатък, усилващ активността и пречистване на
112 модифицираните антитела (например в нефагово представена система гостоприемници), измерване на активността на мидифицираните ентитела за даден антиген (например чрез измерване на скоростната константа Koff чрез BIAscore анализ), повтаряне на тези етапи за други CDR позиции, ако е необходимо, и комбиниране на индивидуалните мутации, показващи подобрени активности, анализ дали комбинацията(ите) генерират антитяло с дори по-висока активност (например афинитетен или неутрализиращ потенциал) в сравнение с родителското антитяло или негов антиген свързващ участък.
Съответно, в един метод, изобретението осигурява метод за подобряване активността на антитяло или негов антиген-свързващ участък, включващ:
а) осигуряване на родителско антитяло или негов антигенсвързващ участък;
б) селекциониране в следния ред 1) предпочитана позиция за селективен мутагенез, 2) позиция на контакт, или 3) позиция на хипермутация в определящ комплиментарността регион (CDR) за мутация, и по такъв начин идентифициране на предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт, или позиция на хипермутация;
в) индивидуално мутиране на въпросната селекционирана предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт, или позиция на хипермутация до поне два други аминокиселинни остатъци, така че да се създаде панел от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци;
г) оценяване на активността на панела от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци, свързани с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък;
113
д) по избор повтаряне на етапи а) до г) за поне една друга предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт, или позиция на хипермутация;
е) комбиниране в родителското антитяло или негов антигенсвързващ участък, на индивидуалните мутации, които са показали подобрена активност с цел образуването на комбинирани антитела или техни антиген-свързващи участъци;
ж) оценяване на активността на комбинираните антитела или техни антиген-свързващи участъци, свързани с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък; докато се получи антитяло или негов антиген-свързващ участък с подобрена активност. По-специално, селекционираното антитяло или антитела имат подобрена активност, без загуба и запазвайки поне една желана характеристика или свойство на родителското антитяло, както е описано по-горе. Желаните характеристика или свойство могат да бъдат измерени или наблюдавани от всеки с опит в съществуващото ниво на техниката, използвайки известни признати техники.
Предпочитани позиции на контакт са селекционирани от група, състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96. Предпочитани позиции за хипермутация са селекционирани от група състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L53 и L93. По-предпочитани, предпочитани позиции за селективен мутагенез са селекционирани от група състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 и L94. Особено предпочитани позиции за контакт са селекционирани от група състояща се от L50 и L94.
114
В друг метод, изобретението осигурява метод за подобряване активността на антитяло или негов антиген-свързващ участък, включващ:
а) осигуряване на родителско антитяло или негов антигенсвързващ участък;
б) селекциониране на предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт, или позиция на хипермутация в определящ комплиментарността регион (CDR) за мутация;
в) индивидуално мутиране на въпросната селекционирана предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт, или позиция на хипермутация до поне два други аминокиселинни остатъци, така че да се създаде панел от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци;
г) оценяване на активността на панела от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци, свързани с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък, и по този начин определяне на аминокиселинен остатък, усилващ активността;
д) по избор повтаряне на етапи а) до г) за поне една друга предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт, или позиция на хипермутация
е) комбиниране в родителското антитяло или негов антигенсвързващ участък, на два индивидуални аминокиселинни остатъци, усилващи активността, които са показали подобрена активност с цел образуването на комбинирани антитела или техни антиген-свързващи участъци;
е) оценяване на активността на комбинираните антитела или техни антиген-свързващи участъци, с два аминокиселинни остатъци, усилващи активността, свързани с родителското антитяло или негов
115 антиген-свързващ участък; докато се получи антитяло или негов антиген-свързващ участък с подобрена активност.
Предпочитани позиции на контакт са селекционирани от група, състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96. Предпочитани позиции за хипермутация са селекционирани от група състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L53 и L93. По-предпочитани, предпочитани позиции за селективен мутагенез са селекционирани от група състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 и L94. Особено предпочитани позиции за контакт са селекционирани от група състояща се от L50 и L94.
В друг метод, изобретението осигурява метод за подобряване активността на антитяло или негов антиген-свързващ участък, включващ:
а) осигуряване на родителско антитяло или негов антигенсвързващ участък;
б) селекциониране на предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт, или позиция на хипермутация в определящ комплиментарността регион (CDR) за мутация;
в) индивидуално мутиране на въпросната селекционирана предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт, или позиция на хипермутация до поне два други аминокиселинни остатъци, така че да се създаде панел от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци;
г) оценяване на активността на панела от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци, свързани с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък, и по този начин определяне аминокиселинен остатък, усилващ активността;
116
д) по избор повтаряне на етапи а) до г) за поне една допълнителна предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт, или позиция на хипермутация;
е) комбиниране в родителското антитяло или негов антигенсвързващ участък, на три индивидуални аминокиселинни остатъци, усилващи активността, които са показали подобрена активност с цел образуването на комбинирани антитела или техни антиген-свързващи участъци;
ж) оценяване на активността на комбинираните антитела или техни антиген-свързващи участъци, с два индивидуални аминокиселинни остатъци, усилващи активността, свързани с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък; докато се получи антитяло или негов антиген-свързващ участък с подобрена активност.
По-специално, аминокиселинен остатък, усилващ активността замества аминокиселинен остатък локализиран в позиции, селекционирани от група, състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96.
След мутагенез на индивидуалните селекционирани позиции, мутираните клонове могат да бъдат секвенирани, за да се определи, кои аминокиселинни остатъци са въведени в селекционираните позиции на всеки клон. Малък брой клонове (например около 24) може да бъде селекциониран за секвениране, което статистически трябва да даде 10 - 15 уникални антитела, докато по-голям брой клонове, (например повече от 60) могат да бъдат секвенирани, за да се гарантира, че са идентифицирани антителата със всяко възможно заместване в селекционираната позиция.
117
В един метод, за мутагенез първо са селекционирани позициите на контакт и/или хипермутации в CDR3 регионите на тежка и/или лека вериги. Обаче, за антитела, които вече са афинитетно съзрели in vitro чрез случаен мутагенез на CDR3 региони чрез фагово представена селекция, може да е за предпочитане първо да се селекционират позициите на контакт и /или хипермутация в CDR1 или CDR2 на тежка и/или лека верига.
В по-предпочитан метод, за мутагенез първо са селекционирани предпочитани позиции на селективен мутагенез в CDR3 регионите на тежка и/или лека вериги. Обаче, за антитела, които вече са афинитетно съзрели in vitro чрез случаен мутагенез на CDR3 региони чрез фагово представена селекция, може да е за предпочитане първо да се селекционират позициите на контакт и /или хипермутация в CDR1 или CDR2 на тежка и/или лека верига.
В друг предпочитан метод, оптимизацията на селекционирано антитяло чрез подхода на селективен мутагенез се провежда в следната последователност: предпочитани позиции на селективен мутагенез, селекционирани от група, състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 са мутирани първо до поне две други аминокиселини (по-специално 5-14 други аминокиселини) и получените в резултат на това антитела са охарактеризирани по отношение на увеличен афинитет, неутрализиращ потенциал (и е възможно също така за поне една друга запазена характеристика или свойство, дискутирани на други места). Ако мутация на една предпочитана позиция за селективен мутагенез не увеличава афинитета или неутрализиращия потенциал изобщо или в достатъчна степен и ако дори комбинацията от множество аминокиселини, усилващи активността, заместени в аминокиселини в предпочитани позиции за селективен мутагенез, не води до
118 образуването на антитяло, което задоволява целевата активност (включително афинитетен и/или неутрализиращ потенциал), ще бъдат селекционирани допълнителни аминокиселинни остатъци за селективен мутагенез от група, състояща се от Н35, Н50, Н53, Н54, Н95, Н96, Н97, Н98, L30A и L96 и ще бъдат мутирани до поне две други аминокиселини (по-специално 5-14 други аминокиселини) и получените в резултат на това антитела са охарактеризирани по отношение на увеличен афинитет, неутрализиращ потенциал (и е възможно също така за поне една друга запазена характеристика или свойство, дискутирани на други места).
Ако мутацията на един аминокиселинен остатък, селекциониран от група, състояща се от Н35, Н50, Н53, Н54, Н95, Н96, Н97, Н98, L30A и L96 не увеличава активността (включително афинитета или неутрализиращия потенциал) изобщо или в достатъчна степен и ако дори комбинацията от множество аминокиселини, усилващи активността, заместващи аминокиселини в тези позиции, не води до образуването на комбинаторно антитяло, което задоволява целевата активност (включително афинитетен и/или целеви неутрализиращ потенциал), ще бъдат селекционирани допълнителни аминокиселинни остатъци за селективен мутагенез от група, състояща се от НЗЗВ, Н52В, L31A и ще бъдат мутирани до поне две други аминокиселини (по-специално 5-14 други аминокиселини) и получените в резултат на това антитела са охарактеризирани по отношение на увеличен афинитет, неутрализиращ потенциал (и е възможно също така за поне една друга запазена характеристика или свойство, дискутирани на други места).
Трябва да се разбере, че последователния подход на селективен мутагенез може да бъде прекратен на всеки очертан по-горе етап, веднага след като е идентифицирано антитяло с желаната активност
119 (включително афинитетен и/или целеви неутрализиращ потенциал). Ако мутагенезът на предварително селекционираните позиции идентифицира аминокиселинни остатъци, усилващи активността, но комбинаторното антитяло все още не задоволява поставената като цел активност (включително афинитетен и/или целеви неутрализиращ потенциал), и/или, ако идентифицираните аминокиселинни остатъци, усилващи активността също така повлияват други желани характеристики и следователно не са приемливи, оставащите CDR остатъци могат да бъдат подложени на мутагенез (виж част IV).
Методът на изобретението може да бъде използван за подобряване активността на антитяло, или негов антиген - свързващ участък, за достигяне на предварително зададена целева активност (например, предварително зададен афинитетен и/или целеви неутрализиращ потенциал, и/или желано свойство или характеристика).
Съответно, изобретението осигурява метод за подобряване активността на антитяло или негов антиген-свързващ участък, за постигане на предварително зададена целева активност, включващ:
а) осигуряване на родителско антитяло или негов антигенсвързващ участък;
б) селекциониране на предпочитана позиция за селективен мутагенез, селекционирана от група, състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94;
в) индивидуално мутиране на селекционираната предпочитана позиция за селективен мутагенез до поне два други аминокиселинни остатъци, така че да се създаде първия панел от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци;
г) оценяване на активността на първия панел от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци, за да се определи
120 дали мутация на една позиция за селективен мутагенез продуцира антитяло, или негов антиген-свързващ участък, с предварително зададената целева активност, или частична целева активност;
д) комбиниране на степенен принцип в родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък, индивидуални мутации, които са показали подобрена активност с цел образуването на комбинирани антитела или техни антиген-свързващи участъци;
е) оценяване на активността на комбинирани антитела или техни антиген-свързващи участъци, за да се определи дали комбинираното антитяло или негов антиген-свързващ участък има предварително зададената целева активност, или частична целева активност;
ж) ако етапи г) и е) водят до антитяло или негов антигенсвързващ участък с предварително зададената целева активност, или водят до антитяло само с частична активност, допълнителни аминокиселинни остатъци, селекционирани от група, състояща се от Н35, Н50, Н53, Н54, Н95, Н96, Н97, Н98, L30A и L96 са мутирани до поне два други аминокиселинни остатъци, така че да се създаде втория панел от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци, притежаващи предварително зададена целева активност или частична ективност;
з) оценяване на активността на втория панел от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци, за да се определи дали мутация на един аминокиселинен остатък, селекциониран от група, състояща се от Н35, Н50, Н53, Н54, Н95, Н96, Н97, Н98, L30A и L96, води до образуването на антитяло, или негов антиген-свързващ участък, с предварително зададената целева активност, или частична активност;
и) комбиниране на степенен принцип в родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък, индивидуални мутации от етап
121
ж), които са показали подобрена активност с цел образуването на комбинирани антитела или техни антиген-свързващи участъци;
й) оценяване на активността на комбинирани антитела или техни антиген-свързващи участъци, за да се определидали дали комбинираното антитяло или негов антиген-свързващ участък има предварително зададената целева активност, или частична целева активност;
к) ако етапи з) и й) не водят до антитяло или негов антигенсвързващ участък с предварително зададената целева активност, или водят до антитяло само с частична активност, допълнителни аминокиселинни остатъци, селекционирани от група, състояща се от НЗЗВ, Н52В и L31A са мутирани до поне два други аминокиселинни остатъци, така че да се създаде третия панел от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци, притежаващи предварително зададена целева активност или частична активност;
л) оценяване на активността на третия панел от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци, за да се определи дали мутация на един аминокиселинен остатък, селекциониран от група, състояща се от НЗЗВ, Н52В и L31A, води до образуването на антитяло, или негов антиген-свързващ участък, с предварително зададената целева активност, или частична активност;
м) комбиниране на степенен принцип в родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък, индивидуални мутации от етап к), които са показали подобрена активност с цел образуването на комбинирани антитела или техни антиген-свързващи участъци;
н) оценяване на активността на комбинаторни антитела или техни антиген-свързващи участъци, за да се определидали дали комбинираното антитяло или негов антиген-свързващ участък има предварително зададената целева активност за да се продуцира
122 антитяло или негов антиген-свързващ участък с предварително зададената целева активност.
Могат да бъдат използвани различни мутагенни методи, включително PCR асамблиране, Kunkel (dut-ung) и тиофосфат (Amersham Sculptor kit) олиготидно насочен мутагенез.
За експресия на мутирани антитела, могат да бъдат използвани разнообразни експресионни системи гостоприемници, включително бактериални, дрождеви експресионни системи и експресионни системи от бакуловируси и бозайници (както и фагово представени експресионни системи). Пример за добър бактериален експресионен вектор е pUC119(Sfi). Други експресионни системи за антитела са известни в съществуващото ниво на техниката и/или са описани подолу в част IV.
Модифицираните антитела, или техни антиген-свързващи участъци, продуцирани с метода на изобретението, могат да бъдат идентифицирани без да се разчита на фагово представените методи за селекция. Съответно, метода на изобретението е особено преимуществен за подобряване на активността на рекомбинантно родитилско антитяло или нагов антиген-свързващ участък, които са получени чрез селекция с фагово представена система, но чиято активност не може да бъде допълнително подобрена чрез мутагенез във фагофо представена система.
Съответно, в друг метод, изобретението осигурява метод за подобряване активността на антитяло или негов антиген-свързващ участък, включващ:
а) осигуряване на рекомбинантно родителско антитяло или негов антиген-свързващ участък, които са получени чрез селекция с фагово представена система, но чиято активност не може допълнително да
123 бъде подобрена чрез мутагенез във въпросната фагово представена система;
б) селекциониране на предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт, или позиция на хипермутация в определящ комплиментарността регион (CDR) за мутация, и по такъв начин идентифициране на позиция на контакт, или позиция на хипермутация;
в) индивидуално мутиране на въпросната селекционирана предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт, или позиция на хипермутация до поне два други аминокиселинни остатъци, така че да се създаде панел от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци и експресиране на въпросния панел в нефагово представена система;
г) оценяване на активността на панела от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци, свързани с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък;
д) по избор повтаряне на етапи б) до г) за поне една допълнителна предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт, или позиция на хипермутация;
е) комбиниране в родителското антитяло или негов антигенсвързващ участък, на индивидуалните мутации, които са показали подобрена активност с цел образуването на комбинирани антитела или техни антиген-свързващи участъци;
ж) оценяване на активността на комбинираните антитела или техни антиген-свързващи участъци, свързани с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък; докато се получи антитяло или негов антиген-свързващ участък с подобрена активност, свързана с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък.
124
Предпочитани позиции на контакт са селекционирани от група, състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96. Предпочитани позиции за хипермутация са селекционирани от група състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L53 и L93. По-предпочитани, предпочитани позиции за селективен мутагенез са селекционирани от група състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 и L94. Особено предпочитани позиции за контакт са селекционирани от група състояща се от L50 и L94.
Не е възможно, с наличните методи или е изключително трудоемко, да се получи антитяло с повишен афинитет на свързване и неутрализиращ потенциал, като едновременно с това се запазват други свойства или характеристики на антителата, както веше дискутирано по-горе. Методът на настоящото изобретение, обаче може бързо да идентифицира такива антитела. Антителата, подложени на метода на настоящото изобретение могат да произлизат от всякакви източници.
Следователно, в друг метод, изобретението осигурява метод за подобряване активността на антитяло или негов антиген-свързващ участък, включващ:
а) осигуряване на рекомбинантно родителско антитяло или негов антиген-свързващ участък;
б) селекциониране на предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт, или позиция на хипермутация в определящ комплиментарността регион (CDR) за мутация, и по такъв начин идентифициране на селекционираната предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт, или позиция на хипермутация;
125
в) индивидуално мутиране на въпросната селекционирана предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт, или позиция на хипермутация до поне два други аминокиселинни остатъци, така че да се създаде панел от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци и експресиране на въпросния панел в подходяща експресионна система;
г) оценяване на активността на панела от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци, свързани с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък и по този начин идентифициране на аминокиселинен остатък, усилващ активността;
д) оценяване на панела от мутирани антитела или техни антигенсвързващи участъци, свързани с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък по отношение на поне едно друго свойство или характерисика, въпросното свойство или характеристика е такова, което трябва да бъде запазено в антитялото; докато се получи антитяло или негов антиген-свързващ участък с подобрена активност и със запазени поне едно друго свойство или характерисика, свързани с родителското антитяло.
В предпочитан метод, позициите на контакт са селекционирани от група, състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96 и другите характеристики са селекционирани от 1) съхраняване на некръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани, 2) съхраняване на епитопното разпознаване, т.е. разпознаване по-специално на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р4О/р35 хетеродимер, предотвратявайки нарушаване на свързването от свободни разтворими р40 и 3) продукцията на антитяло, близко до имуноглобулиновата последователност предшественик.
126
В друг предпочитан метод, предпочитани позиции за хипермутация са селекционирани от група състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L53 и L93 и другите характеристики са селекционирани от 1) съхраняване на некръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани, 2) съхраняване на епитопното разпознаване, т.е. разпознаване по-специално на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/рЗ 5 хетеродимер, предотвратявайки нарушаване на свързването от свободни разтворими р40 и 3) продукцията на антитяло, близко до имуноглобулиновата последователност предшественик.
В по-предпочитан метод, остатъците за селективен мутагенез са селекционирани от група състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 и другите характеристики са селекционирани от 1) съхраняване на некръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани, 2) съхраняване на епитопното разпознаване, т.е. разпознаване по-специално на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р4О/р35 хетеродимер, предотвратявайки нарушаване на свързването от свободни разтворими р40 и 3) продукцията на антитяло, близко до имуноглобулиновата последователност предшественик.
В по-предпочитан метод, позициите за контакт са селекционирани от група състояща се от L50 и L94 и другите характеристики са селекционирани от 1) съхраняване на некръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани, 2) съхраняване на епитопното разпознаване, т.е. разпознаване по-специално на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимер, предотвратявайки нарушаване на свързването от свободни разтворими р40 и 3) продукцията на антитяло, близко до имуноглобулиновата последователност предшественик.
127
Ако следователно, афинитета на антитялото за специфичен антиген трябва да бъдат подобрен, но ако метода на фагово представяне (или подобна система, включително рибозомно представяне) е неприложим, и трябва да се запазят други желани свойства и характеристики, може да бъде използван метода от настоящото изобретение. Съответно, в друг метод, изобретението осигурява метод за подобряване активността на антитяло или негов антиген-свързващ участък, включващ:
а) осигуряване на рекомбинантно родителско антитяло или негов антиген-свързващ участък, които са получени чрез селекция с фагово представена система, но чиято активност не може допълнително да бъде подобрена чрез мутагенез във въпросната фагово представена система;
б) селекциониране на предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт, или позиция на хипермутация в определящ комплиментарността регион (CDR) за мутация, и по такъв начин идентифициране на позиция на контакт, или позиция на хипермутация;
в) индивидуално мутиране на въпросните селекционирани предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт, или позиция на хипермутация до поне два други аминокиселинни остатъци, така че да се създаде панел от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци и експресиране на въпросния панел в нефагово представена система;
г) оценяване на активността на панела от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци, свързани с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък, идентифицирайки аминокиселинен остатък, усилващ активността;
128
д) оценяване на панела от мутирани антитела или техни антигенсвързващи участъци, свързани с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък по отношение на поне едно друго свойство или характерисика, въпросното свойство или характеристика е такова, което трябва да бъде запазено, докато се получи антитяло или негов антиген-свързващ участък с подобрена активност и със запазени поне едно друго свойство или характерисика, свързано с родителското антитяло;
е) по избор повтаряне на етапи а) до д) за поне една допълнителна предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт, или позиция на хипермутация;
ж) комбиниране в родителското антитяло или негов антигенсвързващ участък, на поне два индивидуални аминокиселинни участъци, усилващи активността, които са показали подобрена активност и е запазено поне едно свойство или характеристика, до образуването на комбинирани антитела или техни антиген-свързващи участъци
з) оценяване на активността на комбинираните антитела или техни антиген-свързващи участъци, свързана с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък; до получаването на антитяло или негов антиген-свързващ участък с подобрена активност и е запазено поне едно свойство или характеристика, свързана с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък.
В предпочитан метод, позициите на контакт са селекционирани от група, състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96 и другите характеристики са селекционирани от 1) съхраняване на некръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки
129 тъкани, 2) съхраняване на епитопното разпознаване, т.е. разпознаване по-специално на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимер, предотвратявайки нарушаване на свързването от свободни разтворими р40 и (3) продукцията на антитяло, близко до имуноглобулиновата последователност предшественик.
В друг предпочитан метод, предпочитани позиции за хипермутиране са селекционирани от група състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L53 и L93 и другите характеристики са селекционирани от 1) съхраняване на некръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани, 2) съхраняване на епитопното разпознаване, т.е. разпознаване по-специално на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимер, предотвратявайки нарушаване на свързването от свободни разтворими р40 и 3) продукцията на антитяло, близко до имуноглобулиновата последователност предшественик.
В по-предпочитан метод, остатъците за селективен мутагенез са селекционирани от група състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 и другите характеристики са селекционирани от 1) съхраняване на некръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани, 2) съхраняване на епитопното разпознаване, т.е. разпознаване по-специално на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/рЗ 5 хетеродимер, предотвратявайки нарушаване на свързването от свободни разтворими р40 и 3) продукцията на антитяло, близко до имуноглобулиновата последователност предшественик.
В по-предпочитан метод, позициите за контакт са селекционирани от група състояща се от L50 и L94 и другите характеристики са селекционирани от 1) съхраняване на некръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки
130 тъкани, 2) съхраняване на епитопното разпознаване, т.е. разпознаване по-специално на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимер, предотвратявайки нарушаване на свързването от свободни разтворими р40 и 3) продукцията на антитяло, близко до имуноглобулиновата последователност предшественик.
В друг метод, изобретението осигурява метод за подобряване активността на антитяло или негов антиген-свързващ участък, включващ:
а) осигуряване на рекомбинантно родителско антитяло или негов антиген-свързващ участък, които са получени чрез селекция с фагово представена система, но чиято активност не може допълнително да бъде подобрена чрез мутагенез във въпросната фагово представена система;
б) селекциониране на предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт, или позиция на хипермутация в определящ комплиментарността регион (CDR) за мутация, и по такъв начин идентифициране на селекционирана позиция на контакт, или позиция на хипермутация;
в) индивидуално мутиране на въпросните селекционирани предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт, или позиция на хипермутация до поне два други аминокиселинни остатъци, така че да се създаде панел от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци и експресиране на въпросния панел в нефагово представена система;
г) оценяване на активността на панела от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци, свързани с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък, идентифицирайки аминокиселинен остатък, усилващ активността;
131
д) оценяване на панела от мутирани антитела или техни антигенсвързващи участъци, свързани с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък по отношение на поне едно друго свойство или характерисика, въпросното свойство или характеристика е такова, което трябва да бъде запазено, докато се получи антитяло или негов антиген-свързващ участък с подобрена активност и със запазени поне едно друго свойство или характерисика, свързано с родителското антитяло.
В предпочитан метод, позициите на контакт са селекционирани от група, състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96 и другите характеристики са селекционирани от 1) съхраняване на некръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани, 2) съхраняване на епитопното разпознаване, т.е. разпознаване по-специално на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимер, предотвратявайки нарушаване на свързването от свободни разтворими р40 и (3) продукцията на антитяло, близко до имуноглобулиновата последователност предшественик.
В друг предпочитан метод, предпочитани позиции за хипермутиране са селекционирани от група състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L53 и L93 и другите характеристики са селекционирани от 1) съхраняване на некръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани, 2) съхраняване на епитопното разпознаване, т.е. разпознаване по-специално на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимер, предотвратявайки нарушаване на свързването от свободни разтворими р40 и 3) продукцията на антитяло, близко до имуноглобулиновата последователност предшественик.
132
В по-предпочитан метод, остатъците за селективен мутагенез са селекционирани от група състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 и другите характеристики са селекционирани от 1) съхраняване на некръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани, 2) съхраняване на епитопното разпознаване, т.е. разпознаване по-специално на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимер, предотвратявайки нарушаване на свързването от свободни разтворими р40 и (3) продукцията на антитяло, близко до имуноглобулиновата последователност предшественик.
В по-предпочитан метод, позициите за контакт са селекционирани от група състояща се от L50 и L94 и другите характеристики са селекционирани от 1) съхраняване на некръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани, 2) съхраняване на епитопното разпознаване, т.е. разпознаване по-специално на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимер, предотвратявайки нарушаване на свързването от свободни разтворими р40 и 3) продукцията на антитяло, близко до имуноглобулиновата последователност предшественик.
В друг метод, изобретението осигурява метод за подобряване активността на антитяло или негов антиген-свързващ участък, включващ:
а) осигуряване на рекомбинантно родителско антитяло или негов антиген-свързващ участък, които са получени чрез селекция с фагово представена система, но чиято активност не може допълнително да бъде подобрена чрез мутагенез във въпросната фагово представена система;
б) селекциониране на предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт, или позиция на хипермутация в
133 определящ комплиментарността регион (CDR) за мутация, и по такъв начин идентифициране на позиция на контакт, или позиция на хипермутация;
в) индивидуално мутиране на въпросните селекционирани предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт, или позиция на хипермутация до поне два други аминокиселинни остатъци, така че да се създаде панел от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци и експресиране на въпросния панел в нефагово представена система;
г) оценяване на активността на панела от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци, свързани с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък, идентифицирайки аминокиселинен остатък, усилващ активността;
д) оценяване на панела от мутирани антитела или техни антигенсвързващи участъци, свързани с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък по отношение на поне едно друго свойство или характерисика, въпросното свойство или характеристика е такова, което трябва да бъде запазено докато се получи антитяло или негов антиген-свързващ участък с подобрена активност и със запазени поне едно друго свойство или характерисика, свързани с родителското антитяло.
е) по избор повтаряне на етапи а) до д) за поне една допълнителна предпочитана позиция за селективен мутагенез, позиция на контакт, или позиция на хипермутация;
ж) комбиниране в родителското антитяло или негов антигенсвързващ участък, на поне два индивидуални аминокиселинни остатъци, усилващи активността, които са показали подобрена активност и е запазена поне една друга характеристика, до
134 образуването на комбинирани антитела или техни антиген-свързващи участъци
з) оценяване на активността на комбинираните антитела или техни антиген-свързващи участъци, свързана с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък; до получаването на антитяло или негов антиген-свързващ участък с подобрена активност и е запазено поне едно свойство или характеристика, свързана с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък.
В предпочитан метод, позициите на контакт са селекционирани от група, състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96 и другите характеристики са селекционирани от 1) съхраняване на некръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани, 2) съхраняване на епитопното разпознаване, т.е. разпознаване по-специално на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/рЗ 5 хетеродимер, предотвратявайки нарушаване на свързването от свободни разтворими р40 и (3) продукцията на антитяло, близко до имуноглобулиновата последователност предшественик.
В друг предпочитан метод, предпочитани позиции за хипермутиране са селекционирани от група състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L53 и L93 и другите характеристики са селекционирани от 1) съхраняване на некръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани, 2) съхраняване на епитопното разпознаване, т.е. разпознаване по-специално на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/рЗ 5 хетеродимер, предотвратявайки нарушаване на свързването от свободни разтворими р40 и 3) продукцията на антитяло, близко до имуноглобулиновата последователност предшественик.
135
В по-предпочитан метод, остатъците за селективен мутагенез са селекционирани от група състояща се от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 и другите характеристики са селекционирани от 1) съхраняване на некръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани, 2) съхраняване на епитопното разпознаване, т.е. разпознаване по-специално на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимер, предотвратявайки нарушаване на свързването от свободни разтворими р40 и (3) продукцията на антитяло, близко до имуноглобулиновата последователност предшественик.
В по-предпочитан метод, позициите за контакт са селекционирани от група състояща се от L50 и L94 и другите характеристики са селекционирани от 1) съхраняване на некръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани, 2) съхраняване на епитопното разпознаване, т.е. разпознаване по-специално на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р4О/рЗ 5 хетеродимер, предотвратявайки нарушаване на свързването от свободни разтворими р40 и 3) продукцията на антитяло, близко до имуноглобулиновата последователност предшественик.
IV. Модифициране на други CDR остатъци
Безусловно, за всички CDR остатъци в дадена двойка антигенантитяло, идентифицирана с каквито и да е необходими средства се изисква да бъдат аминокиселинен остатък, усилващ активността, и/или необходим пряко или непряко за свързването с антигена, и/или за запазване на други желани свойства или характеристики на антитялото. Такива CDR остатъци са обозначени като “предпочитани позиции за селективен мутагенез” Трябва да се отбележи, че при специфични обстоятелства, такива предпочитани остатъци за селективен мутагенез могат също така да бъдат идентифицирани с други средства, μμμμμ
136 включително съвместна кристализация на антитялото и антигена и молекулярно моделиране.
Ако предпочитаните опити за идентифициране на аминокиселинни остатъци, усилващи активността, фокусираните предпочитани позиции за селективен мутагенез, позиции на контакт или позици на хипермутации, са изчерпани, или ако са необходими допълнителни подобрения, оставащите CDR остатъците могат да бъдат модифицирани както е описано по-долу. Трябва да се разбере, че антитялото може вече да бъде модифицирано в една или няколко позиции на контакт или хипермутации, съгласно методите описани погоре, но може да се изискват и допълнителни подобрения.
Следователно, в друг метод, изобретението осигурява метод за подобряване активността на антитяло или негов антиген-свързващ участък, включващ:
а) осигуряване на родителско антитяло или негов антигенсвързващ участък;
б) селекциониране на аминокиселинен остатък в определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, различен от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
в) индивидуално мутиране на въпросната селекционирана позиция, т.е. до поне два други аминокиселинни остатъци, така че да се създаде мутирано антитяло или панел от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци;
г) оценяване на активността на мутираното антитяло или панела от мутирани антитела, или техни антиген-свързващи участъци, свързани с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък за идентифициране на аминокиселинен остатък, усилващ активността;
137
д) оценяване на активността на мутираното антитяло или панела от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци, свързани с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък за промени в поне едно друго свойство или характерисика, докато се получи антитяло или негов антиген-свързващ участък с подобрена активност.
По-специално, друга характеристика или свойство са селекционирани от 1) съхраняване на некръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани, 2) съхраняване на епитопното разпознаване, т.е. разпознаване поспециално на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимер, предотвратявайки нарушаване на свързването от свободни разтворими р40 и 3) продукцията на антитяло, близко до имуноглобулиновата последователност предшественик.
Ако мутагенезът на един остатък не е достатъчен, могат да бъдат включени други остатъци; следователно, в друг метод, изобретението осигурява метод за подобряване активността на антитяло или негов антиген-свързващ участък, включващ:
а) осигуряване на родителско антитяло или негов антигенсвързващ участък;
б) селекциониране на аминокиселинен остатък в определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, различен от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
в) индивидуално мутиране на въпросната селекционирана позиция до поне два други аминокиселинни остатъци, така че да се създаде панел от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци;
138
г) оценяване на активността на панела от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци, свързани с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък, за идентифициране на аминокиселинен остатък, усилващ активността;
д) повтаряне на етапи б) до г) за поне една друга CDR позиция, която не е позиция селекционирана в т. б) нито позиция в НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
е) комбиниране в родителското антитяло, или негов антиген свързващ участък, поне два индивидуални аминокиселинни остатъци, усилващи активността, които са показали подобрена активност за образуването на комбинирано антитяло или негов антиген-свързващ участък;
д) оценяване на активността на комбинираните антитела или техни антиген-свързващи участъци, с два аминокиселинни остатъци, усилващи активността, свързани с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък, до получаването на антитяло или негов антиген-свързващ участък с подобрена активност, свързано с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък.
Ако предпочитаните опити за идентифициране на аминокиселинни остатъци, усилващи активността, фокусирайки се на позиции на контакт или позици на хипермутации описани по-горе са изчерпани, или ако са необходими допълнителни подобрения, и въпросното антитяло не може допълнително да бъде оптимизирано чрез мутагенез или фагово представени (или свързани рибозомно представени) методи, оставащите CDR остатъците могат да бъдат модифицирани както е описано по-долу. Трябва да се разбере, че антитялото може вече да бъде модифицирано в една или няколко
йШМЙЙ
139 позиции на контакт или хипермутации, съгласно методите описани погоре, но може да се изискват допълнителни подобрения.
Следователно, в друг метод, изобретението осигурява метод за подобряване активността на антитяло или негов антиген-свързващ участък, включващ:
а) осигуряване на рекомбинантно родителско антитяло или негов антиген-свързващ участък, което е получено чрез селекция във фагово представена система, но чиято активност не може да бъде допълнително подобрена чрез мутагенез във въпросната фагово представена система;
б) селекциониране на аминокиселинен остатък в определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, различен от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и;
в) индивидуално мутиране на въпросната селекционирана позиция на контакт или хипермутация до поне два други аминокиселинни остатъци, така че да се създаде панел от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци и експресиране на въпросния панел в нефагово представена система;
г) оценяване на активността на панела от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци, свързани с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък за идентифициране на аминокиселинен остатък, усилващ активността;
д) оценяване на активността на комбинираните антитела или техни антиген-свързващи участъци, свързани с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък, за промени в поне едно друго свойство или характеристика, до получаването на антитяло или негов антиген-свързващ участък с подобрена активност, свързано с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък.
По-специално, друга характеристика или свойство са селекционирани от 1) съхраняване на некръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани, 2) съхраняване на епитопното разпознаване, т.е. разпознаване поспециално на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р4О/р35 хетеродимер, предотвратявайки нарушаване на свързването от свободни разтворими р40 и 3) продукцията на антитяло, близко до имуноглобулиновата последователност предшественик.
Ако една мутация не е достатъчна за увеличаване афинитета на антитялото, могат да бъдат включени други остатъци в мутагенеза. Следователно, в друг метод, изобретението осигурява метод за подобряване активността на антитяло или негов антиген-свързващ участък, включващ:
а) осигуряване на родителско антитяло или негов антигенсвързващ участък, което е получено чрез селекция във фагово представена система, но чиято активност не може да бъде допълнително подобрена чрез мутагенез във въпросната фагово представена система;
б) селекциониране на аминокиселинен остатък в определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, различен от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
в) индивидуално мутиране на въпросната селекционирана позиция до поне два други аминокиселинни остатъци, така че да се създаде панел от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци и експресия в нефагово представена система;
141
г) оценяване на активността на панела от мутирани антитела или техни антиген-свързващи участъци, свързани с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък за идентифициране на аминокиселинен остатък, усилващ активността;
д) повтаряне на етапи б) до г) за поне една друга позиция, която не е позиция селекционирана в т. б) нито позиция в НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94;
е) комбиниране в родителското антитяло, или негов антиген свързващ участък, поне два индивидуални аминокиселинни остатъци, усилващи активността, които са показали подобрена активност за образуването на комбинирано антитяло или негов антиген-свързващ участък;
д) оценяване на активността и друго свойство или характеристика на комбинираните антитела или техни антигенсвързващи участъци, с два аминокиселинни остатъци, усилващи активността, свързани с родителското антитяло или негов антигенсвързващ участък, до получаването на антитяло или негов антигенсвързващ участък с подобрена активност, свързано с родителското антитяло или негов антиген-свързващ участък.
По-специално, друга характеристика или свойство са селекционирани от 1) съхраняване на некръстосаната реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани, 2) съхраняване на епитопното разпознаване, т.е. разпознаване поспециално на р40 епитопа, по-специално в контекста на р70 р40/р35 хетеродимер, предотвратявайки нарушаване на свързването от свободни разтворими р40 и 3) продукцията на антитяло, близко до имуноглобулиновата последователност предшественик.
142
Предпочитаните опити за идентифициране на аминокиселинни остатъци, усилващи активността, фокусирани на описаните предпочитани позиции за селективен мутагенез, позиции на контакт или позици на хипермутации описани по-горе, могат да бъдат изчерпани, или са необходими допълнителни подобрения, и е важно да се запазят други свойства или характеристики на антитялото.
Следователно, в друг метод, изобретението осигурява метод за подобряване активността на антитяло или негов антиген-свързващ участък, без да се повлияват други характеристики, включващ:
а) осигуряване на родителско антитяло или негов антигенсвързващ участък;
б) селекциониране на аминокиселинен остатък в определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, различен от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91,L92, L93, L94hL96;
в) индивидуално мутиране на въпросната подбрана позиция в най-малкото два други аминокиселинни остатъци, за да се създаде по този начин панел от антитела или части от тях, свързващи антиген;
г) оценяване на активността на панела от антитела или части от тях, свързващи антигена, по отношение на родителското антитяло или част от него, свързваща антиген, като по този начин се идентифицира аминокиселинният остатък, усилващ активността;
д) оценяване на панела от мутирали антитела или части от тях, свързващи антиген, по отношение на родителското антитяло или част от него, свързваща антиген, за промени в поне едно друго качество или характеристика, докато се получи антитяло или част от него, свързваща антиген, с доказана активност и запазено друго качество или характеристика по отношение на родителското
143 антитяло или част от него, свързваща антиген.
Преимуществено, другата характеристика или качество са подбрани измежду 1) запазване на не-кръстосана реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани, 2) запазване на епитопното разпознаване, т.е. разпознаване на епитоп р40, преимуществено в контекста на р70 р40/р35 хетеродимер, предотвратяващ възпрепятстване на свързването от свободен разтворим р40 и/или 3) произвеждане на антитела с близка последователност до тази на имуноглобулин от родителска линия.
Ако мутирането на единичен остатък не е достатъчно, могат да се включат и други остатъци; следователно при едно друго приложение, изобретението осигурява метод за подобряване на активността на антитяло или част от него, свързваща антиген, характеризиращ се с това, че включва:
а) осигуряване на родителско антитяло или част от него, свързваща антиген;
б) подбор на аминокиселинен остатък в района, определящ комплементарност (РОК) за мутация, различна от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
в) индивидуално мутиране на въпросната подбрана позиция в най-малкото два други аминокиселинни остатъци, за да се създаде по този начин панел от антитела или части от тях, свързващи антиген;
г) оценяване на активността на панела от антитела или части от тях, свързващи антиген, по отношение на родителското антитяло или част от него, свързваща антиген, като по този начин се идентифицира аминокиселинният остатък, усилващ активността;
144
д.) оценяване на панела от мутирали антитела или части от тях, свързващи антиген, по отношение на родителското антитяло или част от него, свързваща антиген, за промени в поне една друга характеристика или качество;
д) повторение на стъпки от б) до д) за поне една друга РОК позиция, която не е нито позиция, подбрана измежду б) нито позиция НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
е) обединяване в родителското антитяло или част от него, свързваща антиген, на най-малко два индивидуални аминокиселинни остатъка, усилващи активността, които е показано, че притежават подобрена активност и неповлияване на най-малко едно друго качество или характеристика, за да се образуват комбинирани антитела или части от тях, свързващи антиген; и
ж) оценяване на активността и задържането на поне едно друго качество или характеристика на комбинираните антитела или части от тях, свързващи антиген с два индивидуални аминокиселинни остатъка, усилващи активността по отношение на родителското антитяло или части от него, свързващи антиген, докато се получи антитяло или част от него, свързваща антиген, с подобрена активност и запазено поне едно друго качество или характеристика по отношение на родителското антитяло или част от него, свързваща антиген.
Мутагенез на предпочитаната подбрана позиция за мутиране, контактът и хипермутационните остатъци, може да не повлияят достатъчно афинитета към антитялото и мутагенезът, както и методът на фагово проявяване (или подобен метод на рибозомно проявяване) могат да не се окажат полезни, така че поне една друга
145 характеристика или качество на антитялото трябва да се запази.
Ето защо, в едно друго приложение изобретението осигурява метод за подобряване на афинитета на антитялото или част от него, свързваща антиген, характеризиращ се с това, че се състои от:
а) осигуряване на родителско антитяло или част от него, свързваща антиген, получено чрез селекция в система за фагово проявяване, но чиято активност не може да бъде допълнително подобрена чрез мутагенез във въпросната система за фагово проявяване;
б) подбор на аминокиселинен остатък в района, определящ комплементарност (РОК) за мутация, различна от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
в) индивидуално мутиране на въпросната подбрана позиция в най-малкото два други аминокиселинни остатъци, за да се създаде по този начин панел от антитела или части от тях, свързващи антиген и експресия в система за не-фагово проявяване;
г) оценяване на активността на панела от антитела или части от тях, свързващи антиген, по отношение на родителското антитяло или част от него, свързваща антиген, като по този начин се идентифицира аминокиселинният остатък, усилващ активността;
д) оценяване на панела от мутирали антитела или части от тях, свързващи антиген, по отношение на родителското антитяло или част от него, свързваща антиген, за промени в поне едно друго качество или характеристика, докато се получи антитяло или част от него, свързваща антиген, с подобрена активност по отношение на родителското антитяло или част от него, свързваща антиген.
Преимуществено, другата характеристика или качество са
146 подбрани измежду 1) запазване на не-кръстосана реактивоспособност с други белтъци или човешки тъкани, 2) запазване на епитопното разпознаване, т.е. разпознаване на епитоп р40, преимуществено в контекста на р70 р40/р35 хетеродимер, предотвратяващ възпрепятстване на свързването от свободен разтворим р40 и/или 3) произвеждане на антитела с близка последователност до тази на имуноглобулин от родителската линия.
Ако мутирането на единичен остатък не е достатъчно, могат да се включат и други остатъци; следователно, при едно друго приложение изобретението се осигурява метод за подобряване на активността на антитяло или част от него, свързваща антиген, характеризиращ се с това, че включва:
а) осигуряване на родителско антитяло или част от него, свързваща антиген, получено чрез селекция в система за фагово проявяване, но чиято активност не може да бъде допълнително подобрена чрез мутагенез във въпросната система за фагово проявяване;
б) подбор на аминокиселинен остатък в района, определящ комплементарност (РОК) за мутация, различна от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
в) индивидуално мутиране на въпросната подбрана позиция в най-малкото два други аминокиселинни остатъци, за да се създаде по този начин панел от антитела или части от тях, свързващи антиген, и експресия в система за не-фагово проявяване;
г) оценяване на активността и запазване на най-малко едно качество или характеристика на панела от антитела или части от тях, свързващи антиген, по отношение на родителското антитяло или
147 част от него, свързваща антиген, като по този начин се идентифицира аминокиселинният остатък, усилващ активността;
д) повторение на стъпки от б) до г) за поне една друга РОК позиция, която не е нито позиция, подбрана измежду б) нито позиция НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
е) обединяване в родителското антитяло или част от него, свързваща антиген, на най-малко два индивидуални аминокиселинни остатъка, усилващи активността, които е показано, че притежават подобрена активност и неповлияване на най-малко едно друго качество или характеристика, за да се образуват комбинирани антитела или части от тях, свързващи антиген; и
ж) оценяване на активността и задържането на поне едно друго качество или характеристика на комбинираните антитела или части от тях, свързващи антиген, с два индивидуални аминокиселинни остатъка, усилващи активността по отношение на родителското антитяло или части от него, свързващи антиген, докато се получи антитяло или част от него, свързваща антиген, с подобрена активност и запазено поне едно друго качество или характеристика по отношение на родителското антитяло или част от него, свързваща антиген.
V. Експресия на антителата
Антитяло или част от антитяло, съгласно изобретението, може да бъде изготвено чрез рекомбинантна експресия на гените за лека и тежка верига на имуноглобулин в клетка гостоприемник. За да се експресира едно антитяло по рекомбинантен път клетката гостоприемник се трансфектира с един или повече рекомбинантни
148 експресионни вектора, носещи ДНК фрагменти, кодиращи леката и тежка вериги на имуноглобулин от антитяло, така че леката и тежка вериги се експресират в клетката гостоприемник и преимуществено се секретират в средата, в която се култивират клетките гостоприемник, от която среда антителата могат да бъдат изолирани. За получаването на гените за леката и тежка вериги, за инкорпорирането им в рекомбинантни експресионни вектори и внедряване на тези вектори в клетката гостоприемник, се използват стандартни ДНК рекомбинатни методологии, като тези, описани в Sambrock, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F.M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989), и в U.S. Patent No 4,816,397 на Boss et al.
За да се получи ДНК фрагмент, кодиращ променливия регион от тежката верига на Joe 9 wt или Joe 9 wt-сродно антитяло, се скринират от човешки библиотеки и мутират антитела, специфични за човешки IL-12, както е описано в раздел II. Веднъж получени ДНК фрагментите, кодиращи VH и VL сегментите на Joe 9 wt или Joe 9 wt-сродно антитяло, тези последователности се подлагат на мутагенез чрез стандартни методи, такива като PCR място-насочен мутагенез (опосредстван от PCR мутагенез, при който мутираните нуклеотиди се внедряват в PCR праймерите, така че полученият PCR продукт съдържа мутациите) или други методи за място-насочен мутагенез. Човешките IL-12 антитела, които показват желаното ниво на активност и специфичност/афинитет на свързване, например J695, по-нататък се манипулират чрез стандартни ДНК рекомбинантни техники, например конвертиране на гените за променливия регион в гени за верига на антитялото с пълна дължина, в гени за Fab
149 фрагмента или в scFv ген. При тези манипулации ДНК фрагментът, кодиращ VL или VH е свързан оперативно с друг ДНК фрагмент, кодиращ друг белтък, такъв като постоянния регион от антитялото или гъвкав линкер. Терминът “оперативно свързан”, както е употребен в този контекст, означава, че двата ДНК фрагмента са обединени така, че аминокиселинните последователности, кодирани от двата ДНК фрагмента остават в рамката за четене.
Изолираната ДНК, кодираща VH региона, може да бъде конвертирана до ген за тежка верига с пълна дължина, чрез оперативно свързване на VH кодиращата ДНК с друга молекула ДНК, кодираща постоянните региони на тежката верига (CHI, СН2 и СНЗ). Тези последователности от човешките гени, кодиращи постоянния регион на тежката верига, са известни в науката (виж напр. Rabat, Е. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) и ДНК фрагментите, обграждащи тези региони, могат да се получат чрез стандартна PCR амплификация. Постоянният регион на тежката верига може да бъде постоянен регион от IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD и всеки техен алотипичен вариант, както е описано в Rabat, (Rabat, Е.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 913242), но най-вече се предпочита постоянният регион на IgGl или IgG4. За гена, кодиращ тежката верига на Fab фрагмента, VH кодиращата ДНК може да бъде оперативно свързана с друга ДНК молекула, кодираща само постоянния СН1 регион на тежката верига.
Изолираната ДНК, кодираща VL региона, може да бъде конвертирана до ген за лека верига с пълна дължина (както и до ген за Fab лека верига), чрез оперативно свързване на VL кодиращата
150
ДНК с друга молекула ДНК, кодираща постоянните региони на леката верига, CL. Тези последователности от човешките гени, кодиращи постоянния регион на леката верига, са известни в науката (виж напр. Kabat, Е.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) и ДНК фрагментите, обграждащи тези региони, могат да се получат чрез стандартна PCR амплификация. Постоянният регион на леката верига може да бъде капа или ламбда постоянен регион.
За да се създаде гена scFv ДНК фрагментите, кодиращи VH и VL, са оперативно свързани с друг фрагмент, кодиращ гъвкав линкер, напр. кодиращ аминокиселинна последователност (Gly4Ser)3, такава че VH и VL последователностите могат да се експресират като слепен едноверижен белтък, с VL и VH региони, обединени с гъвкъв линкер (виж напр. Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:58795883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554).
За да се експресират антителата съгласно изобретението, или части от тях, ДНКи, кодиращи лека и тежка верига, с частична или пълна дължина, получени както е описано по-горе, се включват в експресионни вектори така, че гените са оперативно свързани с транскрипционните и транслационни контролни последователности. В този контекст терминът “оперативно свързан” означава, че ген за антитяло се лигира във вектор, така че транскрипционните и транслационни контролни последователности във вектора изпълняват своите функции на регулиране на транскрипцията и транслацията на гена за антитялото. Експресионният вектор и експрсионните контролни последователности са избрани така, че да са съвместими с клетката гостоприемник, използвана за експресията.
151
Генът за леката верига на антитялото и този за тежката такава могат да бъдат включени в отделни вектори или, по-типично - и двата гена се включват в един и същ експресионен вектор. Гените за антитялото се включват в експресионния вектор с помощта на стандартни методи (напр. лигиране на комплементарни рестрикционни места от фрагмента от гена за антитялото и вектора или лигиране с тъпи краища, ако няма рестрикционни места). Преди внедряването на последователностите за J695 и J695-свързани лека или тежка вериги, експресионният вектор може вече да носи последователности за постоянните региони на антитялото. Например, един подход за конвертиране на J695 и 1695-свързани VH и VL последователности към гените за антитяло с пълна дължина, е чрез внедряването им в експресионни вектори, които вече кодират постоянните региони на тежката и лека вериги, съответно, така че VH сегмента е оперативно свързан с СН сегмента(ите) във вектора и VL сегмента е оперативно свързан с CL сегмента във вектора. В допълнение или алтернативно, рекомбинантният експресионен вектор може да кодира сигнален пептид, който улеснява секрецията на веригата на антитялото от клетката гостоприемник. Генът за веригата на антитялото може да бъде клониран във вектора по такъв начин, че сигналният пептид да е свързан с азотния край на гена за веригата на антитялото в една и съща рамка. Сигналният пептид може да бъде имуноглобулинен сигнален белтък или хетероложен сигнален пептид (напр. сигнален пептид от неимуноглобулинен белтък).
В допълнение на гените за веригата на антитялото, рекомбинантните експресионни вектори съгласно изобретението, носят регулаторни последователности, които контролират експресията на гените за веригата на антитялото в клетката
152 гостоприемник. Терминът “регулаторна последователност” включва промотори, усилители и контролни елементи на експресията (напр. сигнали за полиаденилиране), които контролират транскрипцията или транслацията на гените за веригата на антитялото. Тези регулаторни последователности са описани, например в Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Учените c познания в специфичната област са наясно, че аранжирането на експресионния вектор, включително селекцията на регулаторни последователности, може да зависи от такива фактори като подбор на клетката гостоприемник, която ще се трансформира, ниво на експресия на желания белтък и т.н. Предпочитаните регулаторни последователности за експресия в клетки гостоприемник от бозайник включват вирусни елементи, които насочват високи нива на експресия на белтъци в клетки от бозайници, такива като промотори и/или усилители, получени от цитомегаловирус (CMV) (като например промотор/усилител от CMV), Симиан вирус 40 (SV 40) (като например промотор/усилител от SV40), аденовирус (напр. главният късен промотор от аденовирус (AdMLP)) и полиома. За по-нататъшно описание на вирусните регулаторни елементи и техни последователности виж напр. U.S. Patent No 5,168,062 от Stinski, U.S. Patent No 4,510,245 от Bell et al. и U.S. Patent No 4,968,615 от Schaffner et al., U.S. Patent No 5,464,758 от Bujard et al. и U.S. Patent No 5,654,168 от Bujard et al.
В допълнение на гените за веригата на антитялото, рекомбинантните експресионни вектори, съгласно изобретението, могат да носят допълнителни последователности, такива като последователности, които регулират репликацията на вектора в клетката гостоприемник (напр. начало на репликация) и гени за селективни маркери. Тези гени за селективни маркери улесняват
153 селекцията на клетките гостоприемник, в които е внедрен векторът (виж напр. U.S. Patents Nos 4,399,216, 4,634,665 и 5,179,017, всичките от Axel et al.). Например, обикновено генът за селективен маркер придава устойчивост на лекарствени средства, такива като G418, хигромицин или метотрексат, на клетката гостоприемник, в която е внедрен векторът. Предпочитани гени като селективни маркери са тези, включващи генът за дихидрофолат редуктаза (DHFR) (за употреба в dhfr клетки гостоприемник със селекция/амплификация по метотрексат) и генът пео (за селекция по G418).
За експресия на леката и тежка вериги, експресионният(те) вектор(и), кодиращ(и) тежката и лека вериги се трансфектира(т) в клетката гостоприемник с помощта на стандартни техники. Различните форми на термина “трансфекция” са употребени така, че да обхванат широко разнообразие от техники, обикновено използвани за внедряване на екзогенна ДНК в прокариотна или еукариотна клетка гостоприемник, напр. електропорация, преципитация с калциев фосфат, DEAE-декстран трансфекция и други подобни. Въпреки че е възможно теоретично да се експресират антителата, съгласно изобретението, както в прокариотни, така и в еукариотни клетки гостоприемник, експресията на антителата в еукариотните клетки, и преди всичко в клетки от бозайник, е най-предпочитана, защото такива еукариотни клетки и преди всичко тези от бозайник, с много по-голяма вероятност от прокариотните клетки, сглобяват и секретират правилно нагънато и имунологично активно антитяло. Предпочитаните клетки гостоприемник от бозайник за експресия на рекомбинантни антитела, съгласно изобретението, включват Чинезе Хамстер Овари (СНО клетки) (включително dhfr' СНО клетки,
154 описани от Urlaub и Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:42164220, употребявани със селективен маркер DHFR, напр. както е описано в R.J. Kaufman и P.A.Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-6211 NSO миеломни клетки, COS клетки, и SP2 клетки. Когато рекомбинантните експресионни вектори, кодиращи гените за антителата, се внедрят в клетки гостоприемник от бозайник, антителата се образуват чрез култивиране на клетките гостоприемник или за предпочитане - чрез секреция на антитялото в културалната среда, в която са култивирани клетките гостоприемник. Антителата могат да се изолират от културалната среда с помощта на стандартни методи за пречистване на белтъци.
Клетките гостоприемник могат да се използват също така за образуване на части от интактни антитела, такива като Fab фрагменти от scFv молекули. Разбираемо е, е вариации на гореописаната процедура са в рамките на обсега на настоящето изобретение. Например, може да е желателно да се трансфектира клетка гостоприемник с ДНК, кодираща или леката или тежката верига (но не и двете) на антитялото, съгласно изобретението. Могат също така да се използват рекомбинантни ДНК технологии за отстраняване на част или цялата ДНК, кодираща някоя или и двете вериги, която не е необходима за свързването на hIL-12. Молекулите, експресирани от такива “окастрени” ДНК молекули, са обект на изобретението. В допълнение, могат да се образуват бифункционални антитела, при които едната лека и едната тежка вериги са от антитялото съгласно изобретението и другите лека и тежка вериги са специфични за антиген, различен от hIL-12, получен чрез кръстосано свързване на антитялото, съгласно изобретението с второ антитяло, с помощта на стандартни методи за кръстосано свързване.
155
В една предпочитана система за рекомбинационна експресия на антитялото или част от него, свързваща антиген, съгласно изобретението, рекомбинантен експресионен вектор, кодиращ както тежката, така и леката верига на атитялото, се внедрява в dhfr СНО клетки чрез трасфекция, опосредствана от калциев фосфат. В рамките на рекомбинантния експресионен вектор гените за леката и тежка вериги на антитялото, са всеки по отделно оперативно свързан с регулаторните елементи усилител/промотор (напр. от SV40, CMV, аденовирус и други такива регулаторни елементи като CMV усилител/ AdMLP промотор или SV40 усилител/ AdMLP промотор), за да се осигурят високи нива на транскрипция на гените. Рекомбинантният експресионен вектор носи също така гена DHFR, който позволява селекция на СНО клетки, които са трансфектирани с помощта на метотраксан селекция / амплификация. Селекционираните трансформирани клетки гостоприемник се култивират, за да може да се експресират леката и тежка вериги на антитялото и интактното антитяло се изолира от културалната среда. За изготвяне на рекомбинантния експресионен вектор, трансфектиране на клетките гостоприемник, селекциониране на трансформантите, култивиране на клетките гостоприемник и събиране на антитялото от културалната среда, се използват стандартни техники на молекулярната биология. Антителата или части от тях, свързващи антиген съгласно изобретението, могат да бъдат експресирани в животно (напр. мишка), което е трансгенно по гените за човешки имуноглобулин (виж напр. Taylor L.D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295). Растителни клетки могат също така да бъдат модифицирани, така че да се получат трансгенни растения, които експресират антитялото или част от него, свързваща антиген, съгласно изобретението.
156
В светлината на гореспоменатото, един друг аспект на изобретението се отнася до състави от нуклеинова киселина, вектор и клетка гостоприемник, които могат да бъдат използвани за рекомбинантна експресия на антителата и части от тях, съгласно изобретението. За предпочитане изобретението включва изолирани нуклеинови киселини, които кодират CDRs на J695 или пълния променлив регион от тежката и/или леката вериги на J695. Съответно в едно приложение изобретението включва изолирана нуклеинова киселина, която кодира променливия регион от тежката верига на антитяло, който кодира CDR на J695 тежка верига, представляваща аминокиселинна последователност SEQ ID NO: 25.
За предпочитане е, нуклеиновата киселина, която кодира променливия регион от тежката верига на антитяло, допълнително да кодира CDR2 на J695 тежка верига, представляваща аминокиселинна последователност SEQ ID NO: 27. С по-голямо предпочитание, нуклеиновата киселина, която кодира променливия регион от тежката верига на антитялото, допълнително кодира CDR1, представляваща аминокиселинна последователност SEQ ID NO: 29. И с още по-голямо предпочитание, изолираната нуклеинова киселина, която кодира променливия регион от тежката верига на антитялото, представлява аминокиселинна последователност SEQ ID NO: 31 (пълният VH регион на J695).
При други приложения изобретението включва изолирана нуклеинова киселина, кодираща променливия регион на леката верига на антитялото, който кодира CDR3 на J695 лека верига, представляваща аминокиселинна последователност SEQ ID NO: 26. За предпочитане, нуклеиновата киселина, която кодира променливия регион от леката верига на антитялото, допълнително кодира CDR2 на J695 лека верига, представляваща аминокиселинна
157 последователност SEQ ID NO: 28. C по-голямо предпочитание, нуклеиновата киселина, която кодира променливия регион от леката верига на антитялото, допълнително кодира CDR1 на J695 лека верига, представляваща аминокиселинна последователност SEQ ID NO: 30. И с още по-голямо предпочитание, изолираната нуклеинова киселина, която кодира променливия регион от леката верига на антитялото, представлява аминокиселинна последователност SEQ ID NO: 32 (пълният VL регион на J695).
Изобретението осигурява също така рекомбинантни експресионни вектори, кодиращи както тежката така и леката вериги на антитялото. Например, в едно приложение изобретението осигурява рекомбинантен експресионен вектор, кодиращ:
а) тежка верига на антитяло, притежаваща променлив регион, състоящ се от аминокиселинна последователност SEQ ID NO: 31; и
б) лека верига на антитяло, притежаваща променлив регион, състоящ се от аминокиселинна последователност SEQ ID NO: 32.
Изобретението осигурява също така клетки гостоприемник, в които са внедрени един или повече рекомбинантни експресионни вектори, съгласно изобретението. За предпочитане клетките гостоприемник са от бозайник, с по-голямо предпочитание - СНО клетки, NS0 клетки или COS клетки. В допълнение изобретението осигурява метод за синтезиране на рекомбинантно антитяло, съгласно изобретението, чрез култивиране на клетките гостоприемник, съгласно изобретението, в подходяща среда докато се синтезира рекомбинантното човешко антитяло, съгласно изобретението. Методът може допълнително да се характеризира с това, че включва изолиране на рекомбинантното човешко антитяло от културалната среда.
158
VI. Фармацевтични състави и фармацевтично предписание
Антителата и части от тях, съгласно изобретението, могат да бъдат включвани във фармацевтични състави, подходящи за предписване на даден субект. Обикновено, фармацевтичните състави се характеризират с това, че включват антитяло или част от него, съгласно изобретението, и фармацевтично приемлив носител. Както е употребено тук понятието “фармацевтично приемлив носител” включва всеки или всички разтворители, дисперсионни среди, обвивки, антибактериални и противогъбни агенти, изотонични агенти и такива, забавящи абсорбцията и други подобни, които са физиологично съвместими. Примери за фармацевтично приемливи носители включват един или повече от следните: вода, физиологичен разтвор, фосфатен буфер, декстроза, глицерол, етанол и други подобни, както и техни комбинации. При много случаи за предпочитане би било в състава да се включат изотонични агенти, например захари, полиалкохоли като манитол, сорбитол или натриев хлорид. Фармацевтично приемливите носители могат по-нататък да включват малки количества от странични субстанции, като агенти за компенсиране на теглото или емулгатори, консерванти или буфери, които удължават срока на съхранение или улесняват ефективността на антитялото или негова част.
Антителата и части от тях, съгласно изобретението, могат да бъдат включвани във фармацевтични състави, подходящи за парентерално приложение. За предпочитане антитялото или негови части се изготвят като инжектируем разтвор, съдържащ 0.1 - 250 mg/ml от антитялото. Инжектируемият разтвор може да се състои или от течност или да бъде като лиофилна доза в кристален или кехлибарен мускал, ампула или предварително напълнена спринцовка. Буферът може да бъде L-хистидин (1-50 mM),
159 оптимално 5-10 mM, pH 5.0 до 7.0 (оптимално pH 6.0). Други подходящи буфери включват, но не се ограничават до натриев сукцинат, натриев цитрат, натриев фосфат или калиев фосфат. Натриевият хлорид може да се използва за модифициране на токсичността на разтвора в концентрация 0-300 тМ (оптимално 150 тМ за течна дозирана форма). Могат да се включат криопротектори за лиофилизираните дозирани форми, принципно 0-10% захароза (оптимално 0.5-1.0%). Други подходящи криопротектори включват трехалоза и лактоза. В лиофилизираните дозирани форми могат да се добавят набухващи агенти, принципно 1-10% манитол (оптимално 2-4%). В течните, както и при лиофилизираните дозирани форми могат да се употребяват стабилизатори, принципно 1-50 тМ L-метионин (оптимално 5-10 тМ). Могат да бъдат включени и други подходящи набухващи агенти, включващи глицин, аргинин, като 0-0.05% полисорбат-80 (оптимално 0.0050.01%). Допълнителни повърхностно активни вещества включват, но не се ограничават до полисорбат 20 и BRIJ ПАВ.
В предпочитан метод, фармацефтичният препарат включва антитяло в доза от около 0,01 mg/kg -10 mg/kg. По-специално дозите на антитялото включват 1 mg/kg прилагани еднократно в продължение на седмица или 0.3 mg/kg ежеседмично.
Съставите, съгласно изобретението, могат да бъдат в разнообразни форми. Те включват например течна, полутвърда и твърда дозирани форми, такива като течни разтвори (напр. разтвори за инжектиране или за вливане), дисперсии или суспензии, таблети, хапчета, прахове, липозоми и супозитории. Предпочитаната форма зависи от намерението за метода на предписване и терапевтичното приложение. Типичните предпочитани състави са под формата на разтвори за инжектиране или за вливане, такива като състави,
160 подобни на тези, използвани за пасивна имунизация на хора с други антитела. Предпочитаният начин на приложение е парентералният (напр. интравенозно, подкожно, интраперитонеално, интрамускулно). В един предпочитан вариант на изобретението антитялото се прилага чрез интрамускулна или подкожна инжекция.
Терапевтичните състави по принцип трябва да бъдат стерилни и стабилни при условията на производство и съхранение. Съставите трябва да бъдат формулирани като разтвор, микроемулсия, дисперсия, липозома или друга подредена структура, подходяща за високата концентрация в лекарството. Стерилните инжекционни разтвори могат да се изготвят чрез разтваряне на активната съставка в желаното количество (напр. антитялото или част от него), в подходящ разтворител с една или комбинация от съставки, изброени по-горе, както се изисква, последвано от стерилизация през филтър. Обикновено, дисперсиите се изготвят чрез смесване на активната съставка със стерилен носител, който съдържа основна дисперсионна среда и всички останали необходими съставки, от тези изброени по-горе. В случая на стерилни лиофилизирани прахове за изготвяне на стерилни инжектируеми разтвори, предпочитаните методи за изготвяне са изсушаване под вакуум и разпрашително сушене, които водят до получаване на прах от активната съставка плюс всяка допълнителна желана съставка от предварително стерилизирания чрез филтруване разтвор. Правилната флуидност на разтвора може да се поддържа, например чрез употреба на покритие такова като лецитин, чрез поддържане на желания размер на частиците в случаите на дисперсия и с употребата на ПОВ. Продължителната абсорбция на инжектируемите състави може да се осигури чрез включване в състава на агент, който забавя абсорбцията, например соли на моностеарата и желатин.
161
Антителата и частите от тях, съгласно настоящето изобретение, могат да се прилагат чрез различни методи, известни в науката, въпреки че за много терапевтични приложения, предпочитаният път/метод на приложение е подкожното инжектиране, интравенозното инжектиране или инфузия. Както е известно на експериментаторът с опит в тази област пътят/методът на приложение ще варира в зависимост от желаните резултати. При определени варианти на изобретението, активната съставка може да се изготви с носител, който ще защитава съединението от бързо освобождаване, като съставите с контролирано освобождаване, включително импланти, трансдермални парчета и микроинкапсулирани системи за доставка. Могат да се използват биодеградими, биологично съвместими полимери, като етилен винил ацетат, полианхидриди, полигликолова киселина, колаген, полиортоестери и полибутират. Много от методите за изготвяне на тези състави са патентовани или са широко известни на тези с опит в областта. Виж напр. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
При някои варианти антитялото или негова част, съгласно изобретението, могат да се прилагат орално, например с инертен разтворител или асимилируем ядлив носител. Съединението (и други съставки, ако е желателно) може също така да се включи в твърда или мека желатинова капсула, да се формова в таблети или директно да се включи в храненето на пациента. За орално терапевтично приложение съединението може да се включи в носители и да се употребява под формата на разградими таблети, таблети за смучене, таблетки, капсули, елексири, суспензии, сиропи, вафлички и други подобни. За да се приложи съединение, съгласно изобретението по друг, различен от парентералния начин, може да е
162 необходимо да се обвие съединението с или да се прилага заедно с материал, който го предпазва от инактивиране.
Допълнителни активни съставки могат също така да се включат в съставите. При определени примери антитяло или част от него, съгласно изобретението, се формулира и/или прилага съвместно с един или повече допълнителни терапевтични агенти, които са полезни за лечение на нарушения, при които IL-12 активността е вредна. Например, анти-Ъ1Ь-12 антитяло или част от него, съгласно изобретението, може да се формулира съвместно и/или да се прилага съвместно с едно или повече допълнителни антитела, които се свързват към други мишени (напр. антитела, които се свързват с други цитокини или които свързват молекули по клетъчната повърхност). Допълнително, едно или няколко антитела, съгласно изобретението, могат да се използват в комбинация с два или повече от следващите по-долу терапевтични агенти. Такива комбинативни терапии могат с предимство да използват по-ниски дози от прилаганите терапевтични агенти, като по този начин се избягват възможните токсичности или усложнения, свързани с различните монотерапии. Опитните експериментатори биха приветствали факта, че когато антителата, съгласно изобретението, се употребяват като част от комбирана терапия, една по-ниска доза от антитялото може да е желателна в сравнение с прилагането в пациент на антитялото в самостоятелен вид (напр. може да се постигне синергичен терапевтичен ефект с употребата на комбинирана терапия, което на свой ред позволява използването на по-ниска доза от антитялото за постигане на желания терапевтичен ефект).
Интерлевкин 12 играе критична роля в патологичните прояви, свързани с редица болести, включващи имунни и възпалителни
163 елементи. Тези болести включват, но не се ограничават само до ревматоиден артрит, остеоартрит, хроничен артрит в младежка възраст, артрит на Лайм, псориатичен артрит, реактивен артрит, спондилоартропатия, систематичен лупус еритематозус, болест на Крон, язвен колит, възпаление на вътрешните органи, инсулин зависим захарен диабет, тироидит, астма, алергични заболявания, псориазис, склеродермален дерматит, атопичен дерматит, графтверсус-хост, отхвърляне на трансплант, органсаркоидоза, атеросклероза, разпространена интраваскуларна коагулация, болест на Кавазаки, болест на Грейв, вефротичен синдром, синдром на хроничната умора, грануломатоза на Вегенер, пурпуреа ХенохШонлайн, микроскопичен васкулит на бъбреците, хроничен активен хепатит, увеит, септичен шок, синдром на токсичния шок, синдром на сепсис, кахексия, инфекциозни заболявания, паразитни заболявания, синдром на придобитата имунна недостатъчност, остър трансверсален миелит, хорея на Хънтинктън, болест на Паркинсон, болест на Алцхаймер, удар, първична билиарна цироза, хемолитична анемия, злокачествени образувания, сърдечна недостатъчност, инфаркт на миокарда, болест на Адисон, спорадия, полигландуларен дефицит от тип I и полигландуларен дефицит от тип II, остър синдром на Шмид, (при възрастни) синдром на респираторно изтощаване, косопад, косопад на зони, серонегативна артропатия, ентеропатичен синовит, артропатия, свързана с хламидия, иерсения и салмонела, спондилоартопатия, атероматозна болест / артериосклероза, атопична алергия, заболяване булос, пемфигус вулгарис, пемфигус фолиацеус, пемфигоид, линейна болест на IgA, автоимунна хемолитична анемия, положителна хемолитична анемия на Куме, придобита пернициозна анемия, пернициозна анемия в младежка възраст, миалгичен енцефалит / заболяване Royal Free,
164 хроничен мукозен кандидиадис, артерит на гигантските клетки, първичен склерозен хепатит, криптогенен автоимунен хепатит, Придобит Синдром на Имунната Недостатъчност, Придобит Синдром на Свързаните с Имунна Недостатъчност Заболявания, хепатит С, различна обща имунна дефицитност (обща варираща хипогамаглобулинемия), кардиомиопатия с разширения, женско безплодие, недостатъчност на яйчниците, недостатъчност на яйчниците в незряла възраст, фибротична болест на белите дробове, криптогенен фиброзен алвеолит, след-възпалително интерстиално заболяване на белите дробове, интерстиален пнеумонит, заболяване на съединителната тъкан, свързано с интерстиално заболяване на белите дробове, смесено заболяване на съединителната тъкан, свързано с интерстиално заболяване на белите дробове, систематична склероза, свързана с интерстиално заболяване на белите дробове, ревматоиден артрит, свързан с интерстиално заболяване на белите дробове, заболявания на белите дробове, свързани със систематичен лупус еритематозус, заболявания на белите дробове, свързани с дерматомиозит/ полимиозит, заболявания на белите дробове, свързани с болест на Сьорген, заболявания на белите дробове, свързани с анкилозен спонгилит, заболявания на белите дробове, свързани с васкуларно проникване, заболявания на белите дробове, свързани с хемосидероза, интерстициални заболявания на белите дробове, индуцирани от лекарства, радиационна фиброза, бронхиолитис облитеранс, хронична еозинофилна пневмония, лимфоцитна инфилтрация на белите дробове, пост-инфекциозно интерстициално заболяване на белите дробове, гути артрит, автоимунен хепатит, автоимунен хепатит тип-1 (класически автоимунен или лупоиден), автоимунен хепатит тип-2 (хепатит на анти-LKM антитяло), автоимунно
165 опосредствана хипогликемия, устойчивост на инсулин тип В с акантозис нигриканс, хипопаратироидизъм, остро имунно заболяване, свързано с органна трансплантация, хронично имунно заболяване, свързано с органна трансплантация,, остеоартроза, първичен склеротичен холангит, идиопатична леукопения, автоимунна неутропения, бъбречно заболяване NOS, гломерулонефрит, микроскопичен вазулит на бъбреците, лаймска болест, дискоиден лупус еритематозус, мъжка стерилност идоипатична или NOS, спермална автоимунност, множествена склероза (всички подтипове), инсулин зависим диабет, симпатетична офталмия, пулмонарно свръх налягане - вторично към болестта на съединителната тъкан, синдром на Гудпасчър, белодробно манифестиране на полиартритна нодоза, остра ревматоидна треска, ревматоиден спондилит, болест на Стил, системна склероза, болест/артрит на Такаяши, автоимунна тромбоцитопения, идиопатична тромбоцитопения, автоимунна тироидна болест, хипертироидизъм, автоимунен хипотироидизъм (болест на Хашимото), атрофичен автоимунен хипотироидизъм, първична миксодема, фагогенен увеит, първичен васкулит и витилиго. Човешките антитела и части от тях, съгласно изобретението могат да се използват за лечение на автоимунни заболявания, по-специално на тези, свързани с възпаление, включително ревматоиден спондилит, алергия, автоимунен диабет, автоимунен увеит.
За предпочитане антителата, съгласно изобретението или части от тях, се използват за лечение на ревматоиден артрит, болест на Крон, множествена склероза, инсулин зависим диабет и псориазис, както е описано в повече детайли в раздел VII.
166
Едно човешко антитяло, съгласно изобретението или част от него, може да се прилага и с един или повече допълнителни терапевтични агенти, полезни при лечението на автоимунни или възпалителни заболявания.
Антителата, съгласно изобретението или части от тях, свързващи антиген, могат да се използват самостоятелно или в комбинация за лечение на такива заболявания. Трябва да се разбира, че антителата, съгласно изобретението или части от тях, свързващи антиген, могат да се използват самостоятелно или в комбинация с допълнителен агент, напр. терапевтичен агент, като въпросният допълнителен агент е подбран от компетентният експериментатор според поставената цел. Например, допълнителният агент може да бъде терапевтичен агент, известен в науката като полезен за лечение на заболяване или състояние, което се лекува с антитялото, съгласно настоящето изобретение. Допълнителният агент може да бъде също така агент, който придава допълнителна стойност на терапевтичния състав, напр. агент, който повлиява вискозността на състава.
Трябва в допълнение да се разбира, че комбинациите, които се включват в това изобретение са тези комбинации, полезни за поставените цели. Посочените по-долу агенти са примерни такива за целите, но не целят ограничаване. Комбинациите, които са част от това изобретение, могат да бъдат антителата, съгласно настоящето изобретение и поне един допълнителен агент, подбран измежду списъка, посочен по-долу. Комбинацията може също така да включва повече от един допълнителен агент, напр. два или три допълнителни агента, ако комбинацията е такава, че образуваният състав може да изпълнява своята целева функция.
Предпочитаните комбинации са не-стероидни и противовъзпалителни лекарства, известни още като НСПВЛ, които включват
167 лекарства като ибупрофен. Други предпочитани комбинации са кортикостероидите, включително преднизолон; добре известните странични ефекти на употребата на стероиди могат да се намалят или дори елиминират чрез прецизиране на необходимата стероидна доза при лечение на пациенти с комбинация с анти-1Ь-12 антитела, съгласно изобретението. Неограничаващите примери на терапевтични агенти за ревматоиден артрит, с които може да се комбинира антитялото, съгласно изобретението или част от него, включват следн(о)ите: противо-възпалителн(о)и лекарство(а), подтискащи цитокините (ПВЛПЦ); антитела към или антагонисти на други човешки цитокини или растежни фактори, например, TNF, LT, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, ЕМАР-П, GM-CSF, FGF и PDGF. Антителата, съгласно изобретението или части от тях, свързващи антиген, могат да се комбинират с антитела към молекули от клетъчната повърхност, такива като CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (В7.1), CD80 (В7.2), CD90 или техни лиганди включително CD 154 (gp39 или CD40L).
Предпочитаните комбинации от терапевтични агенти могат да се намесят на различни етапи в автоимунната и последваща възпалителна каскада; предпочитаните примери включват TNF антагонисти като химерични, хуманизирани или човешки TNF антитела, D2E7 (заявка на САЩ, № 08/599,226 от 9 февруари, 1996), сА2 (Remicade™), CDP 571, фрагменти от антитялото анти-TNF, (напр. CDP870) и техните разтворими рецептори р55 или р75 (напр. p75TNFRlgG (Enbrel™) или p55TNFRlgG (Lenercept), разтворим рецептор за IL-13 (sIL-13) и също така инхибитори на ензим, превръщащ TNFa (ЕПТ); по подобен начин - инхибитори на IL-1 (напр. инхибитори на ензим, превръщащ Интерлевкин-1, такива като
ММмш
168
Vx740 или IL-1RA и т.н.) могат да бъдат ефективни поради същата причина. Други предпочитани комбинации включват Интерлевкин 11, анти-Р7 и лиганд за р-селектин гликопротеин (ЛРСГ). Още една предпочитана комбинация включва други ключови фигури в автоимунния отговор, които могат да действат успоредно в зависимост от или в синхрон с функцията на IL-12; особено предпочитани са антагонистите на IL-18, включително антителата срещу IL-18 или разтворими рецептори за IL-18, или белтъци, свързващи IL-18. Показано е, че IL-12 и IL-18 имат припокриващи се, но обособени функции и една комбинация от антагонисти към двете съставки, може да бъде най-ефективна. Една друга предпочитана комбинация включва не изтощаващи се инхибитори на CD4. Други предпочитани комбинации включват антагонисти на ко-стимулаторния път CD80 (В7.1) или CD86(B7.2), включващи антитела, разтворими рецептори или лиганди на антагонистите.
Антителата, съгласно изобретението или части от тях, свързващи антиген, могат също така да се комбинират с агенти, такива като метотрексат, 6-МР, азатиоприн сулфасалазин, месалазин, олсалазин хлорохинин/хидроксихлорокин, пенциламин, ауротиомалат (интрамускулно или орално), азатиоприн, кохицин, кортикостероиди (орално, чрез инхалиране или местни инжекции), агонисти на бета-2 адренорецептор (салбутамол, тербуталин, салметерал), ксантини (тиофилин, аминофилин), хромогликат, недохромил, кетотифен, ипратропиум и окситропиум, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофенолат мофетил, лефлуномид, НСПВЛ, например ибупрофен, кортикостероиди като преднизолон, инхибитори на фосфодиестеразите, антагонисти на аденозин, антитромботични агенти, инхибитори на комплемента, адренергични агенти, които вредят на сигнализирането от про
169 възпалителните цитокини, такива като TNFa или IL-1 (напр. IRAK, NIK, IKK, р38 или инхибитори на MAP киназа), инхибитори на превръщането на IL-Ιβ (напр. Vx740), анти-Р7, лиганд за р-селектин гликопротеин (ЛРСГ), инхибитори на превръщането на TNFa (ИПТА), инхибитори на Т-сигнализирането като киназни инхибитори, инхибитори на металопротеинази, сулфасалазин, азатиоприн, 6-меркаптопурини, инхибитори на превръщането на ангиотенсин, разтворими рецептори за цитокини или техни производни (напр. рецептори за разтворим р55 или р75 TNF и производните на p55TNFRlgG (Lenercept), sIL-lRI, sIL-lRII, sIL-6R, разтворим рецептор за IL-13 (sIL-13)) и противовъзпалителни цитокини (напр. IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 и TGFp). Предпочитаните комбинации включват метотрексат или лефлуномид и при случаите на умерен или остър ревматоиден артрит - циклоспорин.
Неограничаващи примери за терапевтични агенти при заболявания на възпаление на вътрешните органи, с които може да се комбинира антитяло, съгласно изобретението или част от него, включват следните: буденозит; епидермален растежен фактор; кортикостероиди; циклоспорин, сулфасалазин; аминосалицилати; 6меркаптопурин; азатиоприн; метронидазол; инхибитори на липоксигеназа; мезаламин; алзалазин; балсалазид; антиоксиданти; инхибитори на тромбоксан; антагонисти на рецептор за IL-1; анти IL-Ιβ моноклонални антитела; анти IL-6 моноклонални антитела; растежни фактори; инхибитори на еластаза; пиридинил-имидазол съединения; антитела срещу или антагонисти на други човешки цитокини или растежни фактори, например TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, ЕМАР-П, GM-CSF, FGF и PDGF. Антитела, съгласно изобретението или части от тях, свързващи антиген, могат да се комбинират с антитела към молекули от
170 клетъчната повърхност, такива като CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 или техни лиганди. Антителата, съгласно изобретението или части от тях, свързващи антиген, могат също така да се свържат с агенти, такива като метотрексат, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофенолат мофетил, лефлуномид, НСПВЛи, например ибупрофен, кортикостероиди като преднизолон, инхибитори на фосфодиестераза, антагонисти на аденозин, антитромботични агенти, инхибитори на комплемента, адренергични агенти, които вредят на сигнализирането от про-възпалителните цитокини, такива като TNFa или IL-1 (напр. IRAK, NIK, IKK, р38 или инхибитори на MAP киназа), ензимни инхибитори на превръщането на IL-1 β (напр. Vx740), анти-Р7, лиганд за р-селектин гликопротеин (ЛРСГ), ензимни инхибитори на превръщането на TNFa (ИПТА), инхибитори на Т-сигнализирането като киназни инхибитори, инхибитори на металопротеинази, сулфасалазин, азатиоприн, 6меркаптопурини, ензимни инхибитори на превръщането на ангиотенсин, разтворими рецептори за цитокини или техни производни (напр. рецептори за разтворим р55 или р75 TNF и sIL1RI, sIL-lRII, sIL-6R, разтворим рецептор за IL-13 (sIL-13)) и противовъзпалителни цитокини (напр. IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 и TGF3).
Предпочитаните примери за терапевтични агенти за болест на Крон, при които едно антитяло или част от него, свързваща антиген могат да се комбинират, включват следните: TNF антагонисти, например анти-TNF антитела, D2E7 (заявка на САЩ, № 08/599,226 от 9 февруари, 1996), сА2 (Remicade™), CDP 571, фрагменти от антитялото анти-TNF, (напр. CDP870), TNFR-Ig конструкти (p75TNFRlgG (Enbrel™) и p55TNFRlgG (Lenercept), анти-Р7, лиганд
171 за р-селектин гликопротеин (ЛРСГ), рецептор за разтворим IL-13 (sIL-13) и инхибитори на PDE4. Антителата, съгласно изобретението или части от тях, които свързват антиген, могат също така да се комбинират с агенти, такива като сулфасалазин, 5-амино салицилова киселина и олсалазин и агенти, които вредят на синтезата или действието на про-възпалителните цитокини, такива IL-1, например ензимни инхибитори на превръщането на IL-Ιβ (напр. Vx740), и IL1га. Антителата, съгласно изобретението или части от тях, които свързват антиген, могат също така да се комбинират с инхибитори на Т-сигнализирането, например 6-меркаптопурини - инхибитори на тирозин киназа. Антителата, съгласно изобретението или части от тях, които свързват антиген, могат да се комбинират с IL-11.
Неограничаващи примери за терапевтични агенти при множествена склероза, с които може да се комбинира антитяло, съгласно изобретението или част от него, включват следните: кортикостероиди; преднизолон; метилпреднизолон; азатиоприн; циклофосфамид; циклоспорин; метотрексат; 4-аминопиридин; тризанидин; интерферон~31а (Авонекс, Biogen); интерферон-31Ь (Бетасерон; Chiron/Berlex); Кополимер 1 (Коп-1; Копаксон; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); кислород под хиперналягане; интравенозен имуноглобулин; клабрибин; антитела срещу или антагонисти на други човешки цитокини или растежни фактори, например TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, ЕМАР-П, GM-CSF, FGF и PDGF. Антитела, съгласно изобретението или части от тях, свързващи антиген, могат да се комбинират с антитела към молекули от клетъчната повърхност, такива като CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 CD86 CD90 или техни лиганди. Антителата, съгласно изобретението или части от тях, свързващи антиген, могат също така да се свържат с
172 агенти, такива като метотрексат, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофенолат мофетил, лефлуномид, НСПВЛи, например ибупрофен, кортикостероиди като преднизолон, инхибитори на фосфодиестераза, антагонисти на аденозин, антитромботични агенти, инхибитори на комплемента, адренергични агенти, които вредят на сигнализирането от про-възпалителните цитокини, такива като TNFa или IL-1 (напр. IRAK, NIK, IKK, р38 или инхибитори на MAP киназа), ензимни инхибитори на превръщането на IL-Ιβ (напр. Vx740), анти-Р7, лиганд за р-селектин гликопротеин (ЛРСГ), ензимни инхибитори на И11ТА, инхибитори на Т-сигнализирането като киназни инхибитори, инхибитори на металопротеинази, сулфасалазин, азатиоприн, 6-меркаптопурини, ензимни инхибитори на превръщането на ангиотенсин, разтворими рецептори за цитокини или техни производни (напр. рецептори за разтворим р55 или р75 TNF и sIL-lRI, sIL-lRII, sIL-6R, разтворим рецептор за IL13 (sIL-13)) и противовъзпалителни цитокини (напр. IL-4, IL-10, IL11,IL-13hTGF3).
Предпочитаните примери за терапевтични агенти за множествена склероза, при които едно антитяло или част от него, свързваща антиген могат да се комбинират, включват следните: интерферон β, например IF^la и ΙΡΝβ16; копаксон, кортикостероиди, инхибитори на IL-1, инхибитори на TNF или антитела към лиганд CD40 и CD80.
Терапевтичните състави, съгласно изобретението могат да включват “терапевтично ефективно количество” или “профилактично ефективно количество” от антитялото, съгласно изобретението или част от него. “Терапевтично ефективно количество” се отнася до количество, ефективно при дози и периоди от време, необходими да се достигне желан терапевтичен резултат.
173
Терапевтично ефективното количество от антитялото или част от него може да варира според такива фактори, като състояние на заболяването, възраст, пол и тегло на индивида и способността на антитялото или част от него да предизвика желания отговор в този индивид. Терапевтично ефективно количество е също това количество, при което всички токсични или вредни ефекти на антитялото или негови части се компенсират с терапевтично
I ! полезните ефекти. “Профилактично ефективното количество” се j
отнася до количество, ефективно при дози и периоди от време, необходими да се достигне желан профилактичен резултат. Обикновено, тъй като профилактичната доза се употребява в пациенти преди или в началните стадии на заболяването, профилактично ефективното количество е по-малко от терапевтично
Ϊ ефективното такова.
I ] Режимите на дозиране могат да се нагласят така, че да
I осигуряват оптимален желан отговор (напр. терапевтичен или
I ί профилактичен отговор). Например, може да се приложи единична
I » доза, няколко отделни дози за определен период или дозата може да !
бъде пропорционално намалявана или увеличавана според индикациите на терапевтичната ситуация. Особено удачно е формулирането на парентерални състави в единични дози за леснота на прилагането и еднородност на дозите. Единичната дозирана форма, както е употребена тук, се отнася до физически дискретни [ единици, съставени като дози за лечение на бозайници, като всяка | единица съдържа предварително определено количество от активната съставка, изчислено така, че да произвежда желания терапевтичен ефект в комбинация с необходимия фармацевтичен > носител. Спецификациите за единичните форми на дозиране, съгласно изобретението, се диктуват от и са директно зависими от
174 (а) уникалните характеристики на активната съставка и специфичния терапевтичен или профилактичен ефект, който трябва да се постигне и (б) ограниченията, съществуващи в науката, при съставянето на такива съединения за лечение на чувствителност в индивидите.
Един примерен, но не ограничаващ обхват на терапевтично или профилактично ефективно количество от антитялото, съгласно изобретението или част от него, е 0.01 - 20 mg/kg, за предпочитане 1 -10 mg/kg, още повече за предпочитане 0.3 - 1 mg/kg. Трябва да се отбележи, че стойностите на дозите могат да варират според типа и остротата на състоянието, което се облекчава. Трябва да се знае и това, че при много определени обекти трябва да се подберат специфични режими на дозиране с времето според индивидуалните нужди и професионалната преценка на човека, предписващ или наблюдаващ прилагането на съставите и че границите на дозиране, определени по-горе, са само примерни и нямат за цел да ограничат целите или практиката на състава, за който се предявяват претенции.
VII. Употреби на антителата, съгласно изобретението
Имайки предвид способността им да се свързват с hIL-12, aHTH-hIL-12 антителата, съгласно изобретението или части от тях, могат да бъдат използвани за откриване на hIL-12 (напр. в биологични проби, такива като серум или плазма), с помощта на конвенционални имуноанализи, като напр. ELISA, радиоимуно анализ (РИА) или тъканна имунохистохимия. Изобретението осигурява метод за откриване на hIL-12 в биологични проби, характеризиращ се с това, че включва осигуряване на контакт на биологична проба с антитялото, съгласно изобретението или част от него и откриване или на антитялото (или част от него), свързано с
175 hIL-12q или несвързаното антитяло (или част от него), като по този начин се открива hIL-12 в биологичната проба. Антитялото е директно или индиректно белязано с откриваема субстанция, за да се улесни откриването на свързаното или несвързано антитяло. Подходящи субстанции за свързване са тези, които включват различни ензими, простетични групи, флуоресцентни материали, луминисцентни материали и радиоактивни материали. Примерите за подходящи ензими включват пероксидаза от хрян, алкална фосфатаза, β-галактозидаза или ацетилхолин естераза; примерите за подходящи комплекси от простетични групи включват стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примерите за подходящи флуоресцентни материали включват умбелиферон, флуоресцин, флуоресцин изотиоцианат, родамин, дихлоротриазиниламин флуоресцин, дансил хлорид или фикоеритрин; примерите за луминисцентни материали включват луминол и примерите за подходящи радиоактивни материали включват I, I, S или Н.
Алтернативно на бележене на антитялото, hIL-12 може да бъде определено в биологични течности чрез конкурентен имуноанализ, използвайки rhIL-12 стандарти, белязани с откриваема субстанция и небелязано анти-МЬ-12 антитяло. При този анализ биологичната проба, белязаните rhIL-12 стандарти и анти-МЬ-12 антитялото се комбинират и се определя количеството белязан rhIL-12 стандарт, свързано с небелязаното антитяло. Количеството от hIL-12 в биологичните проби е обратно пропорционално на количеството от белязан rhIL-12 стандарт, свързан към aHTH-hIL-12 антитялото.
Антителата Y61 и J695, съгласно изобретението, могат също така да се използват за откриване на IL-12 от видове, различни от човека, по-специално IL-12 от примати. Например, Y61 може да се използва за откриване на IL-12 в маймуна циномолгус и маймуна
176 резус. J695 може да се използва за откриване на IL-12 в маймуна циномолгус, маймуна резус и бабун. Обаче, антитялото не проявява кръстосана реактивоспособност нито с миши, нито с плъши IL-12 (виж Пример 3, подраздел Е).
Антителата, съгласно изобретението, или части от тях са способни да неутрализират активността на IL-12 in vitro (виж Пример 3) и in vivo (виж Пример 4). Съответно, антителата съгласно изобретението, или части от тях могат да се използват за инхибиране на активността на IL-12, напр. в клетъчни култури, съдържащи hlL12, в хора или в други бозайници, притежаващи IL-12, с които антитялото, съгласно изобретението проявява кръстосана реактивоспособност (напр. примати като бабун, циномолгус и резус). В един предпочитан вариант на изобретението то предлага изолирано човешко антитяло или част от него, свързваща антиген, което неутрализира активността на човешки IL-12 и на поне един допълнителен IL-12 с приматен произход, избран измежду група, състояща се от IL-12 на бабун, IL-12 на мармосет, IL-12 на шимпанзе, IL-12 на циномолгус и IL-12 на резус, но които не неутрализират активността на миши IL-12. За предпочитане, IL-12 е човешки IL-12. Например, в клетъчни култури, съдържащи или които се предполага, че съдържат IL-12, може да се добави антитялото, съгласно изобретението или част от него, към културалната среда, за да се инхибира hIL-12 активността в културата.
В друг вариант изобретението предлага метод за инхибиране на IL-12 активността в обект, страдащ от нарушения, при които IL12 активността е вредна. IL-12 се включва в патофизиологията на широк набор от нарушения (Windhagen et al., (1995) J. Exp. Med. 182: 1985-1996; Morita et al. (1998) Arthritis and Rheumatism. 41: 306-314;
ΥΊΊ
Bucht et al., (1996) Clin. Exp. Immunol. 103: 347-367; Fais et al., (1994) J. Interferon Res. 14: 235-238; Parronchi et al., (1997) Am. J. Path. 150:823-832; Monteleone et al., (1997) Gastroenterology. 112:11691178 и Berrebi et al., (1998) Am. J. Path 152:667-672; Parronchi et al (1997) Am. J. Path. 150:823-832). Изобретението предлага методи за инхибиране на активността на IL-12 в обект, страдащ от такова заболяване, който метод се характеризира с това, че включва прилагане в обект на антитяло, съгласно изобретението или на част от него така, че активността на IL-12 в обекта се инхибира. За предпочитане IL-12 е човешки IL-12 и обектът е човек. Алтернативно, обектът може да е бозайник, експресиращ IL-12, с който антитялото, съгласно изобретението или част от него, проявяват кръстосана реактивоспособност. И още, обектът може да бъде бозайник, в който е внедрен IL-12 (напр. чрез прилагане на hlL12 или чрез експресия на трансген за hL-12). Антитялото, съгласно изобретението, може да бъде прилагано на човек за терапевтични цели (това приложение се обсъжда допълнително по-долу). Нещо повече, антитялото съгласно изобретението, може да бъде прилагано в бозайник, но не човек, който експресира IL-12, с който антитялото проявява кръстосана реактивоспособност, за ветеринарни цели или като животински модел на човешки заболявания. По-отношение на последното, такива животински модели могат да са полезни за оценка на терапевтичната ефективност на антителата, съгласно изобретението (напр. тестване на дозата или времето за прилагане).
Както е употребена тук фразата “заболяване, при което активността на IL-12 е вредна” включва болести и други нарушения, в които наличието на IL-12 в обект, страдащ от нарушение, е показано че е от значение или се предполага че е или отговорен за патофизиологията на заболяването или е фактор, който допринася за
178 влошаване на нарушението. Съответно, нарушение, при което активността на IL-12 е вредна, е такова нарушение, при което инхибирането на IL-12 се очаква, че ще облекчи симптомите и/или напредването на това нарушение. Такива нарушения могат да се докажат, например чрез увеличаване на концентрацията на IL-12 в биологична течност от обект, страдащ от нарушението (напр. увеличение в концентрацията на IL-12 в серум, плазма, синовиална течност, и.т.н. от обекта), което може да се определи, например с помощта на анти-1Ь-12 антитяло, както е описано по-горе. Има множество примери на нарушения, при които IL-12 активността е вредна. В един вариант антителата или части от тях, свързващи антиген, могат да се използват при терапия за лечение на заболяванията или нарушенията, описани тук. Употребата на антителата, съгласно изобретението или на части от тях за лечение на някои не-ограничаващи специфични нарушения, се обсъжда подолу:
А. Ревматоиден артрит:
Счита се, че интерлевкин-12 играе ключова роля във възпалителните заболявания, такива като ревматоиден артрит. Индуцируемо “съобщение” за IL-12p40 е установено в синовните на пациенти с ревматоиден артрит и е показано, че IL-12 присъства в синовиалните течности на пациенти с ревматоиден артрит (виж напр. Morita et al., (1998) Arthritis and Rheumatism 41: 306-314). Клетки, положителни no IL-12 е установено, че присъстват в подлежащите слоеве на синовия с ревматоиден артрит. Човешките антитела, съгласно изобретението или части от тях, могат да се използват за лечение, например на равматоиден артрит, ревматоиден артрит в ранна възраст, артрит на Лайм, ревматоиден спондилит, остеоартрит и гути артрит. Типично антитялото, съгласно
179 изобретението или част от него, се прилага системно, въпреки че при някои нарушения местното прилагане та антитялото или част от него може да има положителен ефект. Антитяло, съгласно изобретението или част от него, може да се прилага с един или повече терапевтични агенти, полезни при третирането на автоимунни заболявания.
В миши модел за ревматоиден артрит, с колаген индуциран артрит (КИА), лечението на мишки с анти-1Ь-12 mAb (моноклонално анти-мишо IL-12 антитяло от плъх С17.15) преди артрита, основно подтиска атаката и намалява разпространението и суровостта на заболяването. Лечение с анти-1Ь-12 mAb веднага след атаката от артрита намалява сериозността, но по-късното лечение на мишките с анти-1Ь-12 mAb, след атаката на заболяването има минимален ефект върху сериозността на заболяването.
Б. Болест на Крон
Интерлевкин-12 играе също така роля при възпалението на вътрешните органи, болест на Крон. Увеличена експресия на IFN-γ и IL-12 се наблюдава в мукозата на червата в пациенти с болест на Крон (виж напр. Fais et al., (1994) J. Interferon Res. 14: 235-238; Parronichi et al., (1997) Amer. J. Pathol. 150: 823-832; Monteleone et al., (1997) Gastroenterology 112: 1169-1178; Berribi etal., (1998)Amer. J. Pathol. 152: 667-672). Ahth-IL-12 антитела е показано, че подтискат болестта в миши модели на колит; напр. TNBC индуцира колит в мишки, третирани с IL-12, а напоследък - и с IL-10. Съответно, антителата, съгласно изобретението или части от тях, могат да бъдат употребявани за лечение на възпаление на вътрешните органи.
180
В. Множествена склероза
Счита се, че интерлевкин-12 играе роля на ключов посредник в множествената склероза. Експресия на индуцируемо “съобщение” за IL-12p40 или самият IL-12 могат да бъдат установени в пациенти, поразени от множествена склероза (Windhagen et al., (1995) J. Exp. Med. 182: 1985-1996, Drulovic et al., (1997) J. Neurol. Sci. 147: 145150). Пациенти c хронично прогресираща множествена склероза показват повишени нива на циркулация на IL-12. Изследванията с Тклетки и клетки, притежаващи антиген (КПАи) от пациенти с множествена склероза показват самопроникваща серия от имунни взаимодействия като основа на множествената склероза, водещи до Thl-тип на имунен отговор. Увеличената секреция на IFNy от Тклетките води по повишена продукция на IL-12 от КПАи, които повтарят цикъла, водещо до хронично състояние на Th 1-типа на имунно активиране и заболяване (Balashov et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 599-603). Ролята на IL-12 в множествената склероза е изследвана с помощта на миши и плъши модели на множествена склероза с експериментално предизвикан алергичен енцефаломиелит (ЕПАЕ). В ЕПАЕ модела на повторно влошаване-подобрение на множествена склероза в мишки, предварителното прилагане на антиIL-12mAb забавя парализата или по време на последващата ремисия - намалява клиничните резултати. Съответно антителата, съгласно изобретението, могат да служат за намаляване на симптомите, свързани с множествената склероза в човека.
Г. Инсулин-зависим диабет
Счита се, че интерлевкин-12 играе роля на ключов посредник в инсулин-зависимия диабет (ИЗД). ИЗД е индуциран в NOD мишки чрез прилагане на IL-12 и антителата aHTH-IL-12 играят защитна
181 роля в адоптивния трансферен модел на ИЗД. Пациенти с ранна атака на ИЗД често преминават през т.нар. период на “меден месец”, по време на който се поддържа известна остатъчна функция на островните клетки. Тези остатъчни островни клетки произвеждат инсулин и регулират нивата на глюкозата по-добре от прилагания инсулин. Лечението на тези пациенти с ранна атака на заболяването с антитела анти-IL-12 може да предотврати по-нататъшно разрушаване на островните клетки като по този начин поддържа ендогенния източник на инсулин.
Д. Псориазис
Счита се, че интерлевкин-12 играе роля на ключов посредник в псориазиса. Псориазисът включва остри и хронични кожни наранявания, които са свързани с TH 1-тип на профил на експресия на цитокините. (Hamid et al. (1996) J. Allergy Clin. Immunol. 1:225231; Turka et al. (1995) Mol. Med. 1:690-699). Бяха открити иРНКи за IL-12р35 и р40 в кожни проби от болни хора. Съответно, антителата, съгласно изобретението или части от тях, които свързват антиген, могат да служат за намаляване на хроничните кожни заболявания такива като псориазис.
Настоящето изобретение по-нататък се илюстрира със следните примери, които не бива в никакъв случай да се възприемат като ограничаващи. Съдържанието на всички цитирани литературни източници, включително литературните референции, издадени патенти и публикувани патенти, цитирани в тази заявка, са включени в нея като литературна справка. Трябва да се разбира, че съдържанието на всички таблици, прикрепени по-долу (Приложение А) е включено като литературен източник.
pCT/USOO/07946
WO 00/56772
182
ПРИЛОЖЕНИЕ A >>
X u
>· &
X
V
A »« U
Λ.
>
Μ
X
X
V >· a
tai u a bi •Л >· >
>· > X > X
X ο > X s ο
X Ο U >· U Η ζ £ И ο Μ £
И
X Ζ Η ζ £
V) Q
Λ
VI
U
VI Ζ
X . ο ο U >νΐ ζ Σ <л «Λ X X X X ο ο (Λ
X
X ο
X U ΙΑ Ζ X ο U £ U
VI ζ £ ο
VI > χ χ Α X Ο Ο U U X χ »· >
X
Σ
Ο «Л £
X
A ζ
X
ΙΑ α ζ a u ΙΛ
VI X <u •A
X X ζ
Q _ - £ νι νι νι νι νι
VI ζ _ ο Λ £ χ £ >· U VI ζ
X ζ ο £ VI ζ £ И
Ο Ο £ νΐ ζ £ VI a a я
VI
VI ο ο <л >> U
X X V) ο ο £ <Λ
VI ζ X Ο U
VI ζ Σ Ο >U ζ £
VI
VI
Ο Ο Ο Ο
X £ VI VI
Σ Ο «4 >£
VI ο ο «л
VI <Α ζ ζ Σ Σ ο ο
U 4
VI VI ζ ζ ζ * χ χ ζ ζ ο ο £ £ VI VI u
VI u
1Л
X £ ν> Ζ ο νι z
Σ σ ο >»
b. ζ ο «4 νι
VI ζ a
U VI ζ
X
X ζ
VI ζ ζ X χ VI X ζ ζ ο ο
VI ζ £
X ζ a «л
VI VI Σ a > >· u ζ £
VI ζ ο £
и ζ a _ _ £
V4 VI VI VI VI VI >»
X ίο
U
X £
И > X X ο
ΙΑ ο X ο •Λ > X A a υ
X
VI a £
VI >* >
A ο U
X
VI > X A ο и
X ο »· >
>
X
X u>
> Μ >·
Q
W
X
X >~ >
>>
» >
X
Ζ Ο 4 >· u <A
K.
U VI ζ Σ ο a a a
W W U 0 w <
K
VI VI VI VI ζ ζ ζ ζ Ζ Σ Σ Σ
-J ζ
Σ ____ _
Ο Ο Ο Ο Ο -j _J u .4 >·>·>«>.>·
X <Λ ζ a £
VI ζ X и ζ a νι
ΙΛ
ΙΑ 2 a
Λ
VI vi z a v>
<л
ΙΛ
VI ο £ VI ζ ζ X X νι νι ζ ζ a a £ A
VI VI μ μ μ ИИ
Ζ Ζ Ζ 2Ζ
X £ X AA
VI VI VI XX
Ζ Ζ Ζ ΖΖ
Q Q Ο WνΑ & £ £ £A
VI VI VI V»VI
X S е; s а δ ο β >s I α> ο л X δ g PS I n o s δ
K aj Я X X 4 ω o X a o x X I ο S X ω X X X Q< ο Λ co се X ο X 1 η ο ο α> ο ес
а.
ν. £ ta.ta.ta.ta.ta. £ £ £ £ &
Ε|
Ь
31
J се •S κ
t=!
X >
VI Ο £
VI
X
VI a
X
X > VI u m ш _ Q <X<>XA<XX >·>·ζχοαοζοοζζ ~ VIK^XbHbl'Hb·»-- .. ,4 .я t> ..
X > QVIVtV>VIVIV>V>«ov»v. A
4(xxxx0oaaaxx<x<x< «XXXXXXX XXX<<<CXX< »4ta4taJUJtai0QA>«xXO^i2ZOl4 μ. μ. HVIVlta*.
)%>>.>.>.Q00VIVI>>U00
I4VIVIVIVIV1000VIV1000 ΙΐΖΖΖΖΖΖΟνίνίΖ^^Λ IK X X X < · · - — -r
K K £ K · · Ι1ΛΖΖΖΖΧΧΧ ll<X££UIZVI «4 χ >
£ £
0 χ χ > >
A A
0 0 XXX > > > VI νΐ VI
0 0 « £ £ £ X > > > >
VI Vi VI -. QQOOO0°° > vt
X X Z >- A AA
A A H l·· A AA>
£ £ X й VI Q0
O 0 0 0 O Vi VI VI --.·.
O U 0 V 0 νΊ Vt O «4<?
zoaaaooQzzzzx XAAHAAAUQ2X2A • — — ^47<£X£VIV1V)VIVI0 • 0 νι νι νι νι νι νι • £ Ж tai Ж £ £ £ . νι V» .
. <л VI £ £ £ £
0
K £ > >
vt VI £<XQK<££* aAaA£££*^ (/ινινιπζΖΖΣΖ
4^^VlИ^Λ«ΛZ*«л··^ « -»»s “ s r, s; s > >
V) VI 0 ο
A X >· >>.>·>·>· > > V) VI Q Ο
U 0 4J w - -. - Q 0 O 0 0 O 0 0 V» V» ta, v. _
Q00VIV>0O00000U0000000000000O0O00Q0 - - » — -»»<ν>ΑΑνΐ2ζζΗθααοοοααοζζαοαχν, •0O0VIV|«1U>AAAAAAaaVIV1>AAAVI \ЛИ(Л<ЛИИ0И1Л<Л(Л<Л0ИИИИИИ0и <Л > > > ^
VI VI VI VI VI VI VI >>>>>>>
X X X >»>·>. 2 biUihJWbJWWM-UJUIWUUWU 000000000000000
К£££Х££ХЖ1£КХ£££
- - u (J 0 U 0 0 C
SSSSSSSSOOOOOOO»?ϊϊϊϊϊϊϊϊ|χχχχ| »____ «-^-ν.>·Α>·νΐΧ<£** aa£aaoQ°aux2XZX )« VI VI ν> «Λ II A A A 1« A A ' I’ A A „>>>>>>> и» vt >
ОООООООмидчл».^ £££££££££^^.^^^-0ΧΖΖνΐχχχχχ3-χχ_._
Ζ Ζ X VI Σ Σ X X Ο Q Ο > VI VI >· ζ ζ ζ ζ νι
QO0VIVIVI00V>V>VIVIVIV)V1V1V)V>V1V)V>V} > ·- <— ΑΑΑΑΑαΑΑΑΑΑΑΑΑ>ΑΑΑ
НААНАИННННАА
AAAAAAAAAAAAAAta.itaw.w- —
-- — .taM^»4<tv>V)V>VIVI«.
ν> νι VI Ζ Σ Σ Η X χ X X Ο X X Ζ и ζ ζ ζ χ
VI V» VI и. и. и· ь.
VI U №> ш ч> W. ,. .
AAAAAAAAAAA b-AHAAAA^“·!- A A AAAAAAAAAAA •*0000000000000 П vt vr v. -. .·. ~ Ί 4Λ VI VI VI V| VI VI VI /< XXXXXXXXXXA^ z < ' ' iiXXXXXXXXXXXXXX i/VUWUUUOUUMOVVU • ‘Л<Л1Л1ЛИИ<ЛИ1ЛИИИ <л
ИИИИ0И1ЛИИ
U. to. ta. ta. ~ — - ta.ta.ta.ta.ta,ta.ta.t— — ta.Ata.Ata.ta.ta.ta.AAAta.ta.».
- -- .. ··« .4 44 <| O Q C 0
VI VI VI <J00000OQ04,Ww___
L. S’ U Ί* ~ ‘ ^^^‘^‘‘'’VIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIV) *,^^£ххххх<<<о0<хх<<<<< <<VIV1<<<<<
V>VlVI<AVlWI</1VIV1VlVIVIV)VIV>VfV1V1V1 — — ΓίΓ _ £££X££££££££££<<££ £££Α£αααααδ.^.λ.(\. y^Ata -. - _ _
Ο Ο Ο 0 K Ο X £ Ο Κ £ £ Κ £<ООООй1О
Ο ^««taouuoxooooSo '***t»00eui£OW(<5^woc
М00000*·500 С<Х1ЛИ<<£<*
J 0 W V v M Λνινινινινιν*<Λνι«· _J U ..
JiUU<44JW4^ta. _пИИИИИИИИИ..
I· —J wj wJ wJ —J »4 »1 —J <4 «4«4 tt ££££££££££££££«, (<u«juauuta4ta>uuu^uuw3
- - .ta .Λ ο,у,
SSSSSS55555o»«
5 > iO t > K V u
« S 1 0
g4 S 10 s »° A· i VI »u
s CU
ω ,o
s o O I > lb» 0)
οσσοοοοοσο«>>> > ? ? : ϊ Ϊ В > J -1 <L>
£> -Π Η
-λ·λ·α**1^λ/-»/ιλΛΟΟΟΟΟΟΟΖ οσσοοοσσοοο^5;^;>>>>>
tai M Ш Ш ta* W. — _
OOOOOCOO00OOOOOOO
- — Π tai οσоοοооο σ οο о u w |£|
0’
X1
X» <41 Q X >
I £ |Ο iC <л l-j <A \O <Л ο θ' tai χ
V* ζ»
Ιθ iSy |w» £
:Ο
ΙΟ.
ι>
vil <Ν β vl r<l П Λ
1«
22' sl υ
l·® .Σ' c« IV.
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
PCT/US00/07946
183
ПРИЛОЖЕНИЕ A
WO 00/56772
< Λ X X « Λ X X X
X X X X X X X X
V <J u <J u u u u u
>· >· >· >· >· >· H H >*
>4 J- M >· >* >· >· >* >·
> > > > > > > >
X X X X X X X X
¢4 H H £ H H H
o a o O a a a o o
M Μ M U w M X M M
o X X X X X X X X
4( χ Λ Λ Λ M X X X
J a u X a u u •4 X
·> и и v· VI VI VI VI
X X X z X X X X X
X X X X X X X X X
o ο ο o o o o 9 0
«4 U u u «4 u u
>« >« >· >· >* >· > >· >·
«j •4 u u u U J •J «4
VI VI ·» VI v> V» H W V»
X z x X X X X X X
M· X X X X X X X X
«< X x X X X X X X
X X Z z z z z z z
o O Q a a a a a q
X X X X X x X X X
VI 4A « « VI V» «1 VI VI
<5 0 0
X X X
> > >
VI VI M
a a a
XXX
X >· >
>* M VI
μ W H
h а V»
μ Ο V*
vt Ο O
vi ь a
O o o o o o
x x A* X X X
o o o o a o
> > > > > >
> > > > >
o ID o o o o
o O o o o o
o O o o o o
bl Ш u bl ω
> > > > >
•4 J u u u u
o a o o o o
> > > > > >
a o o o 0 o
«Л X <5 o o o o
<5 o <5 o o o
X x X bi X X
a o X X X a
> > > > >· >
> •j u u u
o o a o o O
o o o o o o
e o o o o <5 tA
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
PCT/USOO/07946
184
ПРИЛОЖЕНИЕ A
WO 00/56772
4« 0 u u u U u u u
It >· >4 >- >* >- >4 H
44 >· > >- >· >- >4 M
<D «$ Q Q a Q a a a Q
IS •4 X X X X X X X
• 1 Ш Ш 14 <4 (4 14 w M
X 4t Q a a O O a a o
<υ 41 0 14 (4 14 «4 (4 44 M
X 44 t* a. <Λ <n Vt tn X X
»t o X o x 0 o o 0
2 it -J u 4 u u u u
ii 0 o 0 0 0 0 <9 o
CX >4 #“· H <n <n и H b ь
Q >5 ·· *· — *4 ·”· ►4 w ►4
4¼ 4Λ V» <n <A <n <n <Λ
•4 0 0 0 0 0 0* 0 O
X X X X X X *
H ь b K H H H
0 0 0 0 0 0 o
O' a· 0» ft* a> A· At
u u «4 u u u »3
0 a 0 0 a o 2
0 o 0 0 0 a a
>· >· > > >· Й
* X X X X X X
Таблица 1
> > > X > > > > ο * 1
X >· • >- > и ζ}
>· X z z 0 0 X 04
X V) «1 Z X X Μ 04
0 0 0 0 0 0 υ
X ►4 w ►4 Η
Q Z z Z Ζ Ζ X 4Г
4Λ vt V» Vi VI ΙΑ 4П 40
Vt Vt Vi СЛ in СП X 04
<Л <П VI tn <л <Λ 0
0 0 0 0 0 0 0
СЛ <Λ 1Λ ΙΛ н Η Λ Ю
U 0 0 0 0 0 0 σ*
Vt 5Л Vt СА <л И Μ 05
1* > > > > >
Ц X κ tt Λ Λ
и ο ο Ο ο ο
Η 0 0 0 0 Λ
14 Α* Α· ο. α. α.
it X X Η ь X
υ X X 0 0 С4
И 01 «η Vi <η VI
1» > > X X >
> «Л U 0и Q W U 0» Q Г4 U Cta Q m U Λ» Q •4 U οα «5 U ο· Q « U 0. Q $ 05
Ген Л •Ό «-4 υ ·-» σ »4 • ^4 «4 «4 • *4
a οέ ω β VI «Β 40 40 σ» ЧО Ο Г“ Ό *4 Γ* Ό Γ4 «Ο Г» Г* sO Г* 4> 45 Г* Ό
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) pCT/USOO/07946
WO 00/56772
ПРИЛОЖЕНИЕ A
.03
103 ® I® k103
I co I CD
103 ]<N |<N r* ® I®
136-24
g «IX < z
έ Q1Q Q
>*
w co I co CO
O ole IO
z z >
o O Q
X X .>-
co to iCO
o A3 Ю
X |X X
m
I®
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
WO 00/56772
PCT/US00/07946
186
ПРИЛОЖЕНИЕ A
Таблица 2
• E- e-
« Z z
• u u
* ω V)
• сл cn
:
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
PCT/VS00/07946
187
WO 00/56772
ПРИЛОЖЕНИЕ A
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
PCT/US00/07946
188
WO 00/56772
ПРИЛОЖЕНИЕ A
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
PCT/US00/07946
WO 00/56772
189
ПРИЛОЖЕНИЕ A
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
PCT/US00/07946
WO 00/56772
190
ПРИЛОЖЕНИЕ A ι
μ |*n |<ή
o |o |o o |o
1 1 · 1 * «Ιω|ω и ta
r* lr*> ]γ* O ГЧ
O |ГЧ |r> * ·*
Ci lei Ifi Ci c<
x x = <n <л <л 0 o <J
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
PCT/US00/07946
WO 00/56772
191
ПРИЛОЖЕНИЕ A
Io o|o
o o (·“* •-4 I··*
1 u ι 1 * wu
o t~5 iO o|o
sO rS |·4Γ n |n
ru r-4 |<-И
\O
co
ГЛ <n
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
PCTAJSO0/O7946
WO 00/56772
ПРИЛОЖЕНИЕ A
192
o O
·—<
ω U)
o o
o CO
|<n
m Irn ΓΊ **Ί r”> m
ad I co CD CO
40 |r~ β X «1 -
u> |u« *7 + e
t 1 1 σ' A CH 1 X &
& O' O'
»•4 m
ca Ш υ
S S s
co m m
ex a: СЙ
co m m
* • •
m m m
u J u
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
193
WO 00/56772
PCTAJS00/07946
ПРИЛОЖЕНИЕ A
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
194 io
PCTAJS00/07946
WO 00/56772
ПРИЛОЖЕНИЕ A
102 z
101 Q X3
98 X >4
97 ω X3
96 o >4
95 X >4
n J tf O O 97 96 9 SC 95B 95A 95 94 93 92 91 90 89 J J < tf X ίο tf Q >< U) O X >3 >3 xi X >4 C j 1 1 —— (
ГЧ U tf Q U 56 55 54 53 52 51 50 <л tf tf o Q Z o X >3 X >4 >3
SUBSTITUTE SHEET (RULE»)
195
WO 00/56772
PCT/US00/07946
ПРИЛОЖЕНИЕ А
Неутрализационна активност в присъствие на излишък от свободен IL12 р40
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
196
ПРИМЕРИ
ПРИМЕР 1: Изолиране на антитела анти-1Ь-12
А. Скрининг на антитела, свързващи IL-12
Антитела към hIL-12 бяха изолирани чрез скрининг на три отделни scFv фагови библиотеки, изготвени с помощта на сДНК за човешка VL и VH от РНК, получена от човешки сливици (наречена scFv 1), лимфоцити от сливици и периферна кръв (ЛСПК) (наречена scFv 2) и лимфоцити от костен мозък (наречена ЛКМ). Конструирането на библиотеките и методите за селекция са описани в Vaugham et al. (1996) Nature Biotech. 14: 309-314.
Библиотеките бяха скринирани с помощта на антигени, субединица на човешки IL-12p70, субединица на човешки IL-12p40, химеричен IL-12 (миши р40/човешки р35), миши IL-12, биотинилиран човешки IL-12 и биотинилиран химеричен IL-12. IL12 специфичните антитела бяха селекционирани чрез наслагване на антигена върху имуноепруветки с помощта на стандартни процедури (Marks et al., (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597). scFv библиотека 2 беше скринирана c помощта на IL-12 или биотинилиран-IL-12 и доведе до получаване на значителен брой специфично свързващи се с IL-12 елементи. Бяха селекционирани пет различни клонотипа, определени чрез рестрикционно смилане с BstNl и потвърдени чрез ДНК секвениране. Главните клонотипове бяха VHDP58/VLDP11, VHDP77/VLDPK31, VHDP47/VL и VHDP77/VLDPK31, всеки от които разпознава субединицата р40 от IL-12.
Скринингът на библиотеката ЛКМ с IL-12p70 доведе до получаване на 3 различни клонотипа. Два от тях бяха клонове, които дават кръстосана реактивоспособност. Доминантният клон беше
197 секвениран и се установи, че това е VHDP35/VLDP. Този клон разпознаваше субединицата р40 на IL-12. Скринирането на библиотеката scFv 1 с помощта на IL-12p70 не доведе до получаване на специфични антитела към IL-12.
С цел да се идентифицират антителата IL-12, които преимуществено се свързват с хетеродимера р70 или субединицата р35 на IL-12, в сравнение със субединицата р40 на IL-12, бяха използвани обединените библиотеки scFv 1 + 2 и ЛКМ библиотеката. За да се подберат антитела, които разпознават р70 хетеродимера или субединицата р35, фаговите библиотеки бяха преинкубирани и селекционирани в присъствие на свободен р40. Секвенирането на изолираните клонове показа 9 различни линии на антитела. Предпочитанията към субединиците бяха по-нататък анализирани чрез титриране “микро-Фриге”. Супернатантата, съдържаща scFv беше титрувана със свързан с биотин IL-12 в ELISA и беше измерена ED50. Тази концентрация на scFv, която продуцира 50% ED, беше преинкубирана с нарастващи концентрации на свободен р70 или р40 (инхибитори). Беше измерено намалението в сигнала на ELISA в плаките, покрити с 6hothh-IL-12 и плотирано срещу концентрацията на свободен р70 или р40. Това даде 1С50 за всеки клон по отношение на р70 и р40. Ако титруванията на двете субединици се припокриваха, то тогава scFv се свързваше и с р70 и с р40. Всяко вариране от тези данни даваше степента на предпочитание на р70 пред р40.
Б. Афинитетно зреене на линията от антитела, специфични за IL12 (Joe 9)
Клоновете бяха изследвани за способността им да инхибират свързването на IL-12 с неговия рецептор в анализа на свързване на
198 рецептор с IL-12 (наречен тук АСР) и за тяхната способност да инхибират индуцираната от IL-12 пролиферация на стимулирани с ФХА човешки бластни клетки (анализ ФХА), описани в Пример 3. Клонът Joe 9 показа най-ниските стойности за 1С50 и при двата анализа - АСР и ФХА - IC50 = 1 х 10‘6 М и за двата анализа. Допълнително, променливият регион на тежката верига (VH) на Joe 9 показа най-малък брой промени в сравнение с най-сродната последователност на родителска линия COS-З, идентифицирана от базата данни VBASE. Таблица 1 (виж Приложение А) показва семейството VH3 от родителски последователности. Ето защо Joe 9 беше избран за афинитетно зреене. Аминокиселинните последователности на VH и VL на антитяло Joe 9 див тип (Joe 9 wt) са показани на Фигура 1А - 1Г.
С цел да се увеличи афинитета на Joe 9 бяха направени различни мутации на регион 3 (CDR3) определящ комплементарност, от двете тежка и лека вериги. CDR3 вариантите бяха създадени чрез място специфичен PCR мутагенез с помощта на дегенерирани олигонукпеотиди, специфични за CDR3 от тежката (наречени тук “НЗ”) или CDR3 от леката (наречени тук “L3”) верига, средно с три заместгвания в базите на всеки CDR3 (наречен тук “шип”). PCR мутагенезът на CDR3 от тежката верига беше проведен с помощта на дегенериран олигонуклеотид от тежката верига, съдържащ случайна смес от всичките четири нуклеотида, 5’TGTCCCTTGGCCCCA(G)(T)(A)(G)(T)(C)(A)(T)(A)(G)(C)(T)(C)(C) (C)(A)(C)(T)GGTCGTACAGTAATA3’ (SEQ ID NO: 580), и олигонуклеотид pUC Обратна Tag GAC ACC TCG ATC AGC GGA TAA CAA TTTCAC ACA GG (SEQ ID NO: 581), за да се генерира разнообразие от мутанти по CDR3 от тежката верига. Родителската лека верига беше амплифицирана с помощта на обратен
199
олигонуклеотид за Joe 9 (5’TGG GGC CAA GGG AC A3’ (SEQ ID NO: 582) и fdteteseq олигонуклеотидът 24 + 21 (5’-ATT CGT CCT ATA CCG TTC TAC TTT GTC GTC TTT CCA GAC GTT AGT-3’ (SEQ ID NO: 583).
Комплементарността между двата PCR продукта беше използвана за насочване на свързването на двата фрагмента в аранжираната PCR реакция и рекомбинираната scFv библиотека в пълна дължина беше амплифицирана с обратна Tag от pUC (SEQ ID NO: 581) и fdTag 5’-ATT CGT CCT ATA CCG TTC-3’ (SEQ ID NO: 584). PCR мутагенезът на леката верига беше проведен с помощта на олигонуклеотид от леката верига, съдържащ смес от всичките четири нуклеотида 5’GGTCCCAGTTCCGAAGACCCTCGAACC(C) (C)(T)(C)(A)(G)(G)(C)(T)(G)(C)(T)(G)(T)(C)(ATATGACTGGCAGTA ATAGTCAGC3’ (SEQ ID NO: 585) и обратен олитонуклеотид за Joe 9 5’TGG GGC CAA GGG ACA3’ (SEQ ID NO: 586), за да се получи набор от мутанти по CDR3 от леката верига. Родителската тежка верига беше амплифицирана с обратна Tag от pUC (SEQ ID NO: 581) и HuJH3FOR олигонуклеотид 5’TGAAGAGACGGTGACCATTGT CCC3’ (SEQ ID NO: 587). Комплементарността между двата PCR продукта беше използвана за насочване на свързването на двата фрагмента в аранжираната PCR реакция и рекомбинираната scFv библиотека в пълна дължина беше амплифицирана с обратна Tag от GAC ACC TCG ATC AGC G (SEQ ID NO: 588) и HuJX 2-3 FOR NOT олигонуклеотид 5’GAG ТСА TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC 3’ (SEQ ID NO: 589).
Мутантите no CDR3 от тежката верига бяха селекционирани с помощта на 1 пМ биотинилиран IL-12 и промити за 1 h при стайна температура в PBS, съдържащ свободен IL-12 или р40 в концентрация 7 пМ. Клоновете бяха анализирани чрез фагова ELISA
Μ·
200 и тези, които се свързваха с IL-12, бяха изследвани чрез BIAcore кинетични анализи на свързване с помощта на чип от IL-12 с ниска плътност (виж процедурата за BIAcore анализ в Пример 5). Найобщо BIAcore анализът измерва взаимодействията на свързване в реално време между лиганд (рекомбинантен човешки IL-12, имобилизиран върху биосензорен матрикс) и аналит (антитела в разтвор) чрез повърхностен плазмен резонанс (ППР) с помощта на BIAcore система (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Системата използва оптичните качества на ППР за откриване на промени в концентрацията на белтъци в биосензорен декстранов матрикс. Белтъците са ковалентно свързани с декстрановия матрикс в известни концентрации. Антителата се инжектират в декстрановия матрикс и специфичното свързване между инжектираните антитела и имобилизираният лиганд води до получаване на увеличена белтъчна концентрация и резултира в промяна в 111 IP сигнала. Тези промени в ППР сигнала се записват като резонансни единици (РЕ) и се визуализират по отношение на времето по дължината на ординатата на една сензограма. За да се определят константите на скоростта на напускане (koff), скоростта на навлизане (kon), скоростта на асоцииране (Ка) и скоростта на дисоциация (Kd) се използва BIAcore софтуеърен продукт за оценка на кинетичните параметри (версия 2.1). Клоновете, които показаха подобрение в скоростта koff> бяха анализирани чрез анализ по неутрализиране, който включва инихибиране чрез антитяло на свързването на IL-12 с неговия рецептор (АСР анализ), инхибиране на индуцираната от IL-12 пролиферация на стимулирани с ФХА човешки бластни клетки (ФХА анализ) и инхибиране на продукцията на индуциран от IL-12 гама интерферон от човешки бластни клетки (INF гама анализ). Резюме на дисоциационните скорости и/или 1С50 стойностите от
201 неутрализационните анализи на “типовите” клонове 70-1 до 70-13 на CDR3 от тежката верига е представено в таблица 2 (виж Приложение А). Клон 70-1 показва скорост на koff по-добра от родителския клон Joe 9 и има най-ниската 1С50 стойност = 2.0 х 10’7 М. следователно клон 70-1 беше подбран за конверсия в пълен IgGl.
Мутантите по CDR3 от леката верига бяха селекционирани с помощта на 1 пМ биотин-1Ь-12 и промити със PBS, съдържащ 7 пМ свободен р40. Клоновете бяха анализирани чрез фагова ELISA и тези, които се свързваха с IL-12, бяха изследвани чрез BIAcore анализ на свързване с помощта на чипове от IL-12 с ниска плътност Клоновете, които показваха скорост на koff по-добра от родителския клон Joe 9 бяха изследвани с помощта на анализ по неутрализиране, който измерваше или инхибирането на свързването с рецептор на IL12 или инхибиране на пролиферацията на ФХА бластни клетки. Резюме на дисоциационните скорости и/или 1С5о стойностите от неутрализационните анализи на мутантните клонове от CDR3 на леката верига на 78-34 до 79-1 е представено в Таблица 2 (виж Приложение А).
На базата на стойностите за koff клоновете 78-34 и 78-35 показаха подобрени стойности на koff скоростта в сравнение с родителския клон Joe 9. R двата клона бяха подбрани за комбинационен анализ с мутанти по леката верига.
В. Комбинационни клонове
Клоновете с мутантна лека и тежка вериги, които показват най-добрите характеристики на свързване, бяха използвани за комбиниране и аранжиране на scFvs. Мутантните клонове с подобрени характеристики на потентност бяха комбинирани чрез PCR припокриване с удължаване и изтеглени от мутантните VH и
202
VL сегменти както е описано по-горе. Клонове 101-14 до 26-lq показани в Таблица 2 (виж Приложение A)q бяха получени от комбиниране на мутанти по тежката верига (70-2, 70-13 и 70-1) с мутанти по леката верига (78-34, 78-35 и 79-1). Скоростите koff и/или IC50 стойностите от неутрализационните анализи на тези клонове са представени в Таблица 2.
BIAcore анализът на свързване идентифицира клон 101-11, получен от комбинация на CDR3 мутантен по тежката верига клон 70-1 с CDR3 мутантен по леката верига клон 78-34, като притежаващ скорост на напускане 0.0045s'1. Тази koff скорост е значително подобрена в сравнение с kOff скоростите както на CDR3 мутантен по тежката верига клон 70-1 (0.0134s'1), така и на CDR3 мутантен по леката верига клон 78-34 (0.0164s'1). Нещо повече, клон 101-11 показа значително подобрение в неутрализационните анализи. Съответно, клон 101-11 беше подбран за афинитетно зреене, както е описано по-долу.
Г. Афинитетно зреене на клон 101-11
Допълнителното афинитетно зреене на клон 101-11 се състоеше от повторени цикли на PCR мутагенез на CDR както на тежката, така и на леката верига на клон 101-11, с помощта на олигонуклеотидни “шип” праймери. Клоновете бяха селекционирани чрез намаляващи концентрации на биотинилиран IL-12 (bioll-12). Характеристиките на свързване на мутантните клонове бяха изследвани чрез BIAcore анализ на свързване и КПА, ФХА неутрализационни анализи. Скоростите kOff и/или 1С5о стойностите от неутрализационните анализи на клонове 136-9 до 170-25 са представени в Таблица 2 (виж Приложение А). Клон 10314 показва подобрена 1С50 стойност както при анализа на свързване с
203 рецептор, така и ФХА бласт анализа. Клон 103-14 също така показа ниска скорост koff и съответно беше подбран за по-нататъшно афинитетно зреене.
Д. Генериране и подбор на случайни библиотеки от клон 103-14 лека CDR3
Леката верига CDR3 от клон 103-14 (QSYDRGFTGSMV (SEQ ID NO: 590)) беше систематично и случайно разпределена в 3 сегмента с помощта на 3 различни библиотеки, както е показано подолу, където X се кодира от случаен кодон от последователност NNS, в която N е нуклеотид и S е или дезоксицитозин или дезоксигуанидин.
L3.1=XXXXXXFTGSMV (SEQ ID NO: 591) L3.2=QSYXXXXXXSMV (SEQ ID NO: 592) L3.3=QSYDRGXXXXXX (SEQ ID NO: 593)
Беше проведен случаен мутагенез на всичките три CDR от леката верига (означени като L3.1, L3.2 и L3.3) от клон 103-14. CDR3 от тежката верига (означен като НЗ) от клон 103-14 не беше мутиран. Четири случайни библиотеки на основата на клон 103-14 (НЗ и L3.1, L3.2 и L3.3) бяха конструирани и подложени на широк набор от селекционни условия, които включват използването на ограничаващи концентрации антиген и наличие или отсъствие на излишък от свободен антиген (р40 и р70). Резултатите от селекциите (клонове 73-В 1 до 99-G11) бяха скринирани първоначално чрез BIAcore и в някои случаи с КПА, и са показани в Таблица 2 (виж Приложение А).
Случайният мутагенез на CDR от леката верига на клон 103-14 доведе до получаване на клон Y61, който показа значително подобрение в 1С50 стойността в сравнение с родителския клон 103204
14. Y61 беше избран за превръщане в цялостен IgGl. Цялостният Y61-IgGl показа IC50 стойност приблизително 130 рМ, определена чрез ФХА анализа. 1С50 стойността не се влияеше от 50-кратен моларен излишък на свободен р40, което показа че р40 не показва кръстосана реактивоспособност с Y61 анти-1Ь-12 антитяло, като по този начин намалява свързването на антитялото към хетеродимера. Пълната последователност на променливия регион от тежката и леката вериги на Y61 са показани по-долу.
Пептидна последователност на променливия регион от тежката верига на Y61
CDRH1
QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASFTFS SYGMH
WVRQAPGKGLEWVA
CDR Н2
FIRYDGSNKYYADSVKG
RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCKT
CDRH3
HGSHDN WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 23)
Пептидна последователност на променливия регион от леката верига на Y61
CDRL1
QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISC WYQQLPGTAPKLLIY
SGGRSNIGSNTVK
205
CDR L2
GNDQRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYC
CDR L3
QSYDRGTHPALL FGTGTKVTVLG (SEQ ID NO: 24)
CDR последователностите са означени съгласно дефинициите на Kabat.
ПРИМЕР 2: Мутации в Y61 на хипермутационни и контактни позиции
Обикновено селекцията на рекомбинантни антитела с подобрен афинитет може да се проведе с помощта на методи за проявяване на фаги. Това се осъществява чрез случайно мутиране на комбинации от CDR остатъци, за да се получат големи библиотеки, съдържащи едноверижни антитела с различни последователности. Обикновено, антителата с подобрен афинитет се селекционират на основата на тяхната способност да достигат равновесие в реакция на антитяло-антиген. Обаче, когато Y61 scFV беше експресирана на фаговата повърхност и инкубирана с IL-12, не можаха да се намерят селекционни условия, които да позволят на системата да достигне нормално равновесие на антиген-антитяло. ScFV-фагът остава свързан към IL-12 по презумпция, вероятно поради неспецифично взаимодействие, тъй като пречистен Y61 scFV показва нормална дисоциационна кинетика. Тъй като обикновените методи на афинитетно зреене на Y61 чрез проявяване на фаги (т.е. генериране на библиотека и подбор чрез мутагенез на множествени CDR
206 остатъци) не могат да се използват, беше разработена нова стратегия, в която бяха мутирани индивидуални CDR позиции.
Тази стратегия включва селекция на подходящи CDR позиции за мутиране и се основава на идентификация и селекция на аминокиселини, които са предпочитани селективни позиции за мутиране, контактни позиции и/или хипермутационни позиции. Контактните позиции се дефинират като остатъци, които се характеризират с висока вероятност на контакт с даден антиген, когато този антиген взаимодейства с антитялото, докато хипермутационните позиции са дефинират като остатъци, за които се смята че проявяват висока склонност към соматична хипермутация по време на in vivo афинитетното зреене на антитялото. Предпочитаните селективни хипермутационни позиции са CDR позициите, които са както контактни, така и хипермутационни позиции. Тъй като антитялото Y61 беше вече оптимизирано в CDR регионите с помощта на процедури, описани в Пример 1, беше трудно допълнително да се подобри областта, която лежи в центъра на свързващото място в антитялото, с помощта на селекционни методи по проявяване на фаги. По-големи подобрения в активността бяха получени чрез мутация на потенциални контактни позиции извън CDR3 регионите или чрез отстраняване на вредния контакт антиген-антитяло или чрез конструиране на нов контакт.
Аминокиселинните остатъци от Y61, които са приети за контактни точки за антигена и тези CDR позиции, които са места на соматични хипермутации по време на in vivo афинитетно зреене, са показани в Таблица 3 (виж Приложение А). За афинитетното зреене на Y61 бяха подбрани с помощта на PCR мутагенез 15 остатъка CDR3, 3 остатъка в L3 бримка и 5 остатъка в НЗ бримката.
207
Генът scFv на Y61 беше клониран в плазмиден вектор за мутагенез pUC119(Sfi). Олигонуклеотидите бяха аранжирани и синтезирани със случайни кодони, за да се мутира всяка подбрана позиция. След PCR мутагенеза един малък брой клонове (около 24) беше секвениран и експресиран в клетка-гостоприемник, напр. в бактериална, дрождева или от бозайник. Експресираното антитяло беше пречистено и koff - измерена с помощта на BIAcore система. Тази процедура беше повторена и за другите CDR позиции. Индивидуалните мутации, които показаха че притежават подобрена неутрализационна активност, бяха комбинирани, за да се получи антитяло, дори с по-висок неутрализационния потенциал.
CDR позициите в Y61, които бяха мутирани за да се подобри неутрализационния потенциал, и съответните аминокиселинни замествания във всяка позиция, са показани на фигури 2А - 23. Дадени са скоростите на напускане, определени чрез BIAcore анализ. Тези скорости на напускане са показани и на хистограмите, отдясно на всяка таблица.
Резултатите от тези замествания в позиции НЗО, Н32, НЗЗ, Н50, Н53, Н54, Н58, Н95, Н97, Н101, L50, L92, L93 показват, че всички изследвани замествания водят до получаване на антитела с по-слаби скорости на напускане от Y61. Беше установено, че в позиции Н52, L32 и L50 само едно заместване в аминокиселинната последователност подобрява скоростта на напускане на Y61, всички останали промени напротив, повлияват активността. За L50 тази единствена промяна Gly—>Туг значително (5-10 пъти) подобрява неутрализационния потенциал на Y61. Резултатите показват важността на тези позиции за активността на Y61 и предполагат, че в повечето случаи проявяването на фаги може да открива оптималните остатъци. Обаче, беше установено, че в Н31, Н56 L30 и
208
L94 няколко замествания подобряват скоростта на напускане на Y61, което предполага че тези позиции са също така важни за свързването с антигена, въпреки че подходът за проявяване на фаги не позволява селекция на оптималните остатъци.
Селективната мутация в контактни и хипермутационни позиции от Y61 идентифицира аминокиселинен остатък L50 в CDR2 и остатък L94 в CDR3 на леката верига, които подобряват неутрализационната способност на Y61. Комбинация от тези мутации води до адитивен ефект, генерирайки антитяло J695, което показва значително подобряване в неутрализационната си способност. Пълната последователност на променливите региони в леката и тежка вериги на J695 е показана по-долу.
Пептидна последователност на променливия регион от тежката верига на J695
CDRH1
QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVA
CDR Н2
FIRYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCKT ι
ί
I CDRH3
I HGSHDN WGQGTMVTVSS (SEQ ID N0:31)
I ι
ί i ι
Пептидна последователност на променливия регион от леката верига на J695
CDRL1
QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCSGSRSNIGSNTVKWYQQLPGTAPKLLIY
209
CDR L2
YNDQRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYC
CDRL3
QSYDRYTHPALL FGTGTKVTVLG (SEQ ID NO: 32) CDR последователностите са означени съгласно дефинициите на Rabat.
Резюме на съпоставянето на последователностите от променливите региони в леката и тежка вериги, показващо развитието на линиите от клоновете по пътя на Joe 9 до J695, е показано на фигури ΙΑ - 1Г. Номерирането на CDR и остатъците е съгласно Rabat.
ПРИМЕР 3: Функционална активност на анти-1Ь-12 антителата
За да се изследва функционалната активност на човешки античовешки IL-12 антитела, съгласно изобретението, антителата бяха използвани в няколко анализа за измерване на способността на дадено антитяло да инхибира IL-12 активността.
А. Изготвяне на човешки ФХА-активирани лимфобласти
Човешки мононуклеарни клетки от периферна кръв (МЖПК) бяха изолирани от левкопак, взет от здрав донор чрез градиентно центрофугиране Ficoll-Hypaque за 45 минути при 1500 грш, както е описано в Current Protocols in Immunology, Unit 7.1. MHRIIK в интерфазата на водния разтвор на кръв и среда за отделяне на
Η
210 лимфоцити бяха събрани и промити три пъти с PBS чрез центрофугиране за 15 минути при 1500 rpm за отделяне на частиците от Ficoll-Paque.
След това МНКПК бяха aKTHBnpaHHq за да се образуват лимфобласти, както е описано в Current Protocols in Immunology, Unit 6.16. Промитите МНКПК бяха ресуспендирани в концентрация 0.5 - 1 х 106 cells/ml в RPMI пълноценна среда (RPMI 1640 среда, 10% зародишен говежди албумин (ЗГА), 100 U/ml пеницилин, 100 pg/ml стрептомицин), към която е добавен 0.2 % (v/v) РНА-Р (Difco, Detroit, MI) и култивирани за четири дни при 37°С в 5 % СО2 атмосфера. След четири дни клетъчните култури се разреждат 1:1 по обем в RPMI пълноценна среда плюс 0.2 % (v/v) РНА-Р и 50 U/ml рекомбинантен човешки IL-2. Рекомбинантният човешки IL-2 е получен чрез трансфекция на експресионен вектор, носещ човешка сДНК за IL-2 в COS клетки (виж Kaufman et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19, 4484-4490) и пречистен както е описано в PCT/US96/01382. Клетъчните култури след това бяха инкубирани за още един до три дни. ФХА бластните клетки бяха събрани, промити два пъти с RPMI пълноценна среда и замразени в 95 % PBS, 5 % DMSO при 10 х 106 cells/ml.
ФХА бластните клетки, предназначени за използване при анализа на свързване на IL-12 с рецептор (виж Раздел Б), бяха събрани след еднодневно култивиране в присъствие на IL-2, докато ФХА бластните клетки, предназначени за употреба при анализ на ФХА бласт пролиферация (виж Раздел В) и анализ за индукция на интерферон гама (виж Раздел Г) бяха събрани след тридневно култивиране в присъствие на IL-2.
211
Б. Анализ на свързването на IL-12 с рецептор
Способността на анти-1Ь-12 антителата да инхибират свързването на радиоактивно белязан IL-12 към рецептори за IL-12 върху ФХА бластни клетки беше анализирана както следва. Различни концентрации от анти-1Ь-12 антитяло бяха преинкубирани за 1 час при 37°С с 50-100 рМ 125I-hIL-12 (йодираният hIL-12 беше изготвен с помощта на методът за белязане на Bolton-Hunter със специфична активност от 20-40 mCi/mg от NEN-Dupond) в свързващ буфер (RPMI 1640, 5 % ЗГС, 25 mM Hepes pH 7.4). ФХА бластните клетки, изолирани както е описано по-горе, се промиват веднъж и ресуспендират в свързващ буфер до клетъчна плътност от 2 х 107 cells/ml. ФХА бластните клетки (1 х 106 cells) се добавят към сместа, съдържаща I-hIL-12, и инкубират за два часа при стайна температура. Радиоактивно белязаните клетки се отделят от свободния I-hIL-12 чрез центрофугиране на сместа за 30 секунди при стайна температура, аспириране на течността и промиване с 0.1 ml свързващ буфер, последвано от центрофугиране при 4°С за 4 мин при 10 000 х g. Клетъчната утайка се изследва за радиоактивност с помощта на гама брояч. Тоталното свързване се определя в отсъствие на антитяло и неспецифичното свързване се определя чрез включване на 25 пМ небелязан IL-12 в изследването. Инкубациите се провеждат в две повторения.
При анализа на свързване на IL-12 с рецептор с помощта Y61 и J695 човешки анти-1Ь-12 антитела, и двата вида антитела показват сравними нива на инхибиране на свързването на IL-12 с рецептора. Y61 инхибира свързването на IL-12 с рецептор с IC50 стойност от около 1.6 х 10'11 М, докато J695 има 1С5о стойност приблизително 1.1 х10'пМ.
212
В. Анализ на пролиферацията на човешки ФХА бластни клетки
Ahth-IL-12 антителата бяха оценени за тяхната способност на инхибират пролиферацията на ФХА бластни клетки (чиято пролиферация се стимулира от IL-12). Серийни разреждания от анти-1Ь-12 антитела бяха преинкубирани за един час при 37°С, 5 % СО2 с 230 pg/ml hIL-12 в 100 mM RPMI пълноценна среда в микротитърна плака (U-дъно, 96 ямки, Costar Cambridge, МА). ФХА бластните клетки, изолирани както е описано по-горе, бяха промити веднъж и ресуспендирани в RPMI пълноценна среда до клетъчна плътност 3 х 105 cells/ml. ФХА бластните клетки (100 ml, 3 х 104 cells) бяха добавяни към сместа от антитяло / hIL-12, инкубирани за три дни при 37°С, 5 % СО2 и белязяни за 4 - 6 часа с 0.5 mCi/well (Н)-тимидин (Amersham, Arlinfton heights, IL). Съдържанието на културата беше събрано с помощта на стъклен филтър като средство за събиране на клетки (Tomtec, Orange, СТ) и инкорпорипането на (3Н)-тимидин в клетъчната ДНК беше измерено чрез броене в течен сцинтилационен брояч. Всички проби бяха изследвани в две повторения.
Резултатите по неутрализацията в присъствие на различни концентрации на р70 : р40 (т.е. съотношението на хетеродимера IL12 към р40 субединицата) е показано в Таблица 4 (виж Приложение А).
Анализът на Y61 човешко aHTH-IL-12 антитяло в изследването на пролиферацията на ФХА бластни клетки демонстрира, че антитялото инхибира пролиферацията на ФХА бластни клетки с IC50 стойност приблизително 1.8 х 10'11 М в присъствие само на IL-12 р70, без излишък от р40 (р70 : р40 = 1 : 0). В присъствие на 50 кратен излишък от свободен р40 (р70 : р40 = 1 : 50), Y61 антитялото инхибира пролиферацията на ФХА бластни клетки с 1С50 стойност
ШМН·
213 от около 1.8 х 10‘10 М. Този резултат показва, че способността на Y61 да инхибира пролиферацията на бластните клетки не е компрометирана от наличието на излишък от р40.
Човешкото анти-1Ь-12 антитяло J695 инхибира пролиферацията на ФХА бластни клетки с 1С50 стойност от около 1.0 х 10’11 М в присъствие на р70 : р40 = 1 : 0. В присъствие на р70 : р40 = 1 : 50, това антитяло инхибира пролиферацията на ФХА бластни клетки с IC50 стойност от около 5.8 + 2.8 х 10' М (п=2), показвайки че излишъкът от р40 има само слаб инхибиторен ефект върху антитялото. Цялостните резултати показват подобрена неутрализационна активност на J695 в сравнение с Y61 поради мутациите L50 и L94.
Г. Анализ на индуциране на гама интерферон
Способността на анти-1Ь-12 антителата да инхибират производството на IFNy от ФХА бластни клетки (чиято продукция се стимулира от IL-12) беше анализирана както следва. Различни концентрации от анти-1Ь-12 антитела бяха преинкубирани за един час при 37°С, 5 % СО2 с 200-400 pg/ml hIL-12 в 100 mM RPMI пълноценна среда в микротитърна плака (U-дъно, 96 ямки, Costar). ФХА бластните клетки, изолирани както е описано по-горе, бяха промити веднъж и ресуспендирани в RPMI пълноценна среда до клетъчна плътност 1x10 cells/ml. ФХА бластните клетки (100 μΐ, 1 х 106 cells) бяха добавяни към сместа от антитяло/Ъ1Ь-12 и инкубирани за 18 часа при 37°С и 5 % СО2. След инкубиране, 150 μΐ от свободната от клетки супернатанта бяха отделени от всяка ямка и нивото на продуцираният човешки IFNy беше измерено чрез ELISA (Endogen Interferon gamma ELISA, Endogen, Cambridge, МА). Всички проби бяха изследвани в две повторения.
214
Анализът на Y61 човешко анти-IL-12 антитяло в това изследване показа, че Y61 инхибира производството на IFNy с IC50 стойност приблизително 1.6 χ ΙΟ’10 М, докато човешкото анти-IL-12 антитяло, J695, инхибира производството на IFNy с 1С50 стойност приблизително 5.0 + 2.3 х 10’ М (п=3). Този резултат показва значително подобрение на афинитета на J695, поради модификациите в L50 и L94.
Д. Индуциране на но-човешки IL-12 от изолирани МНКПК
За да се изследва кръстосаната реактивоспособност на човешки анти-IL-12 антитела с IL-12 от други видове, не-човешки IL-12 беше получен както следва. МНКПК бяха отделени от прясно хепаринизирана кръв чрез градиентно центрофугиране, както е описано по-горе с помощта на лимфопреп (Nycomed, Oslo, Norway) за маймуна циномолгус, баун и куче, Accu-paque (Accurate Chemical & Sci. Corp., Westbury, NY) за кучешки МНКПК или Lympholyte-rat (Accurate Chemical & Sci. Corp., Westbury, NY) за МНКПК от плъх.
След това МНКПК бяха индуцирани за да се образуват IL-12, както е описано (D’Andrea et al., (1992) J. Exp. Med 176, 1378-1398, Vilinger et al., (1995) J. Immunol. 155, 3946-3954, Buettner et al., (1998) Cytokine 10, 241-248). Промитите МНКПК бяха ресуспендирани в концентрация 1 х 106 cells/ml в RPMI пълноценна среда, към която е добавен 0.0075 % (wt/vol) SAC (Pansorbin; Calbiochem-Behring Co., LaJolla, СА) или 1-5 mg/ml ConA (Sigma Chemical Co., St. Louis, МО) плюс 0.0075 % SAC и инкубирани за 18 часа при 37°С в 5 % СО2 атмосфера. Среда, свободна от клетки и такава, свободна от SAC беше събрана чрез центрофоцугиране и филтрувана през 2 mm филтри.
215
IL-12 за резус маймуните беше получен като рекомбинантен резус IL-12 от Emory University School of Medicine, Atlanta, GA.
Е. Анализ на клетъчната пролиферация на миши 2D6
Миши Т клетки, клон 2D6 пролиферират в отговор на миши II2,11-4,11-7 и 11-12 (Maruo et al., (1997) J. Leukocyte Biol. 61, 346-352). Значителна прполиферация беше също така открита в отговор на супернатанти от плъши МНКПК, съдържащи плъши IL-12. Клетките не отговарят на IL-12 от куче, циномолгус, баун или човек. Миши 2D6 клетки бяха размножени в RPMI пълноценна среда, към която е добавен 50 шМ бета-меркаптоетанол (βΜΕ) и 30 ng/ml миши IL-12. Един ден преди анализа мишият IL-12 бе отмит и клетките бяха инкубиранив RPMI пълноценна среда плюс βΜΕ.
Серийни разреждания от aHTH-IL-12 антитялото бяха инкубирани за 1 час при 37°С, 5 % СО2 с 40 pg/ml миши IL-12 в 100 ml RPMI пълноценна среда плюс βΜΕ в микротитърна плака (Uдъно, 96 ямки, Costar). 2D6 клетките бяха промити веднъж и ресуспендирани в RPMI пълноценна среда, съдържаща βΜΕ до клетъчна плътност 1 х 105 cells/ml. 2D6 клетките (100 μΐ, 1 х 104 cells) бяха добавяни към сместа от антитяло/Ъ1Е-12 и инкубирани за 3 дни при 37°С, 5 % СО2. и белязани за 4-6 часа с 0.5 mCi/well (ЗН)тимидин. Съдържанието на културите бе събирано и преброено чрез течен сцинтилационен брояч. Всички проби бяха изследвани в две повторения.
Ж. Кръстосана реактивоспособност на J695 с не-човешки IL-12
Кръстосаната реактивоспособност на J695 с не-човешки IL-12 беше анализирана с помощта на МНКПК, изолирани от няколко нечовешки вида. Наличието на не-човешки IL-12 активност в
216 супернатанти от МНКПК на плъх, куче, циномлгус и бабун беше потвърдено с помощта на няколко биологични анализи, описани погоре, като например анализ на пролиферацията на миши 2D6 клетки, на пролиферацията на човешки ФХА бластни клетки и анализът по индукция на интерферон гама чрез блокиране на индуцирания отговор на не-човешки МНКПК със заешки/или овчи поликлонални антитела към миши и/или човешки IL-12. Кръстосаната реактивоспособност на човешки анти-1Ь-12 антитела Y61 и J695 с не-човешки IL-12 в супернатанти от МНКПК или пречистен миши или резус IL-12, беше изследвана с помощта на същите биоанализи чрез определяне на концентрацията на антитялото J695, при която се наблюдава 50 % инхибиране на отговора. Резултатите по кръстосаната реактивоспособност са обобщени в Таблица 5. Резултатите показват, че Y61 и J695, всеки по отделно могат да разпознават IL-12 от маймуни (напр. IL-12 за Y61 от циномолгус и резус и IL-12 за J695 от циномолгус, резус и бабун) и че J695 е приблизително 35 пъти по-малко активен за IL-12 от куче; нито Y61, нито J695 проявяват кръстосана реактивоспособност с миши или плъши IL-12.
3. Специфичност на J695 за човешки цитокини
Специфичността на J695 беше изследвана в сравнителен ELISA, в който беше изследван един панел от човешки цитокини за способността им да възпрепятстват свързването на разтворим J695 с имобилизиран човешки IL-12. Панелът от човешки цитокини включваше IL-12a и IL-12β (Genozyme, Boston, МА) IL-2 (Endogen), IL-4, IL-10, IL-17, IFN-гама и TGF-βΙ (R&D, Mineapolis, MN) IL-8 (Calbiochim), PDGF, IGF-1 и IGF-II (Boehringer Manheim Corp., Indianapolis, IN), TNFa и лимфотоксин, IL-6, разтворим рецептор аз
217
IL-6, IL-11, IL-12 p70 IL-12 p40, M-CSF и LIF. EBI-3, свързан c IL-12 p40 белтък, който се индуцира от Епщайн-Бар вирусна инфекция в В лимфоцити (Devergne et al., (1996) J. Virol. 70, 1143-1153), беше експресиран като химеричен IgG-Fc (EBI-3/Fc). Беше изследвана и едноверижна ДНК от сперма на пъстърва (Sigma).
Плоскодънни ELISA микротитърни плаки (96 ямки, висока степен на свързване, Costar) бяха покрити за една нощ при 4°С с 0.1 ml човешки IL-12 (2 pg/ml в 0.1 М карбонатен буфер за покриване (4 обема 0.1 М NaHCO3 плюс 8.5 обема NaHCO3)). Плаките бяха промити два пъти с PBS, съдържащ 0.05 % Tween 20 (PBS-T), блокирани с 200 μΐ от 1 mg/ml говежди серумен албумин (ГСА, Sigma) в PBS-Т за 1 час при стайна температура и отново промити два пъти с PBS-Т. Проби (100 μΐ), съдържащи IL-12 антитяло J695 (100 ng/ml) и всеки от цитокините (2 пМ) в PBS-Т, съдържащ 50 pg/ml ГСА, (PBS-Т/ГСА) бяха добавяни и инкубирани за 2 часа при стайна температура. Плаките бяха промити 4 пъти и инкубирани за 1 ч при стайна температура със 100 μΐ миши анти-човешки ламбдаHRP (1:500 в PBS-Т/ГСА, Southern Biotech. Ass. Inc., Birmingham, AL). Плаките бяха промити 4 пъти и проявени в ABT (Kirkegaard & Perry Lab., Gaithersburg, MD) за 20-30 минути на тъмно. След това беше отчетена OD450 nm (Molecular devices, Menlo Park, СА). Процентът на свързване бе определен по отношение на свързването на J695 към покритата с IL-12 плака в отсъствие на разтворим цитокин.
Резултатите показват, че свързването на J695 към имобилизиран човешки IL-12 се блокира само от човешки IL-12 р70 и в по-малка степен от човешки IL-12 р40 и не се блокира от който и да е друг изследван цитокин.
Таблица 5 Данни за кръстосаната реактивоспособност на видовете
t υ Η·1 IL-12 от човек Пречистен © χ © «Ζ 9 Φ χ N © X! ©
IL-12 от бабун 1 ο © ,-Η © 04 1.5x10“
IL-12 от резус Пречистен ο Φ X! Ο ο Φ X! Φ © X ο
IL-12 от циномоглус МНКПК sup © X СЧ 9 © φ X φ
IL-12 от куче МНКПК sup 2 © X Η CO
IL-12 от плъх МНКПК sup s © X Φ Не-неутрализиращ
IL-12 от мишка Пречистен ф X! О СО ο ь χ Не-неутрализиращ Не-неутрализиращ
Антитяло Специфичност ГЧ 1 1 I X (D cd CO Мишка-ahull 12 Човек-ahull 12 Човек- ahull 12
Наименование С17.15 R03B03 C8.6.2 Υ61 J605
I
219
И. Свързване с нова IL-12 молекула
Беше описан един алтернативен IL-12 хетеродимер, в който субединицата р35 е заместена с нова молекула р19. Р19 беше идентифициран с помощта на 3D хомоложно търсене на членове от семейството IL-6/IL-12 и синтезиран чрез активирани дендритни клетки. Р19 се свързва с р40 и образува димер р19/р40, който има активност, подобна на IL-12, но не е толкова мощен като хетеродимера р35/р40 при индуцирането на IFNy. Антителата, които разпознават само р40, но предпочитаемо в контекста на молекула р70 (напр. J695 и Y61, виж Пример 33), се очаква също така да неутрализират както молекулите р35/р40, така и молекулите р19/р40.
ПРИМЕР 4: In vivo активност на aHTH-hIL-12 антителата
Бяха изследвани in vivo ефектите на антителата IL-12 върху индуцираните от IL-12 отговори на модел, модификация на един от тези, употребявани от Bree et al., за да се изучава ефекта на човешки IL-12 върху периферната хематология в маймуна циномолгус Bree et al., (1994) Biochem Biophys Res. Comm. 204: 1150-1157. В тези предварителни изследвания, разпространението на човешки IL-12 при доза от 1 pg/kg/day за период от 5 дни доведе до намаление в броя бели кръвни клетки (БКК), особено в лимфоцитите и моноцитите след 24 часа. Намаление в броя беше наблюдавано и след 72 часа. Нивата на плазмения пеопротеин, маркер за активиране на моноцитите в отговор на IFNy, започваха да се покачват на 24 час и бяха най-високи на 72 час.
В първото изследване с човешки антитела aHTH-hIL-12, петнадесет здрави маймуни циномолгус със средно тегло от 5 kg бяха упоени и разделени в 5 групи (п = 3). Група 1 получи
220 интравенозно (ИВ) 10 mg/kg човешки интравенозен имуноглобулин (IVIG, Miles, Eckhart, IN, пречистен с помощта на белтъчна сефароза А). Група 2 получи интравенозно 1 mg/kg С8.6.2 (неутрализиращо мишо анти-човешко IL-12 моноклонално антитяло). Група 3 получи интравенозно 10 mg/kg С8.6.2. Група 4 получи интравенозно 1 mg/kg Y61 (човешко анти-човешко IL-12 антитяло, пречистено от среда с СНО клетки). Група 5 получи интравенозно 10 mg/kg Y61.
Един час след прилагането на антителата всички животни получиха единична подкожна инжекция (ПК) на човешки IL-12 (1 pg/kg). Кръвните проби бяха взимани в следните времеви точки: базова линия, 8, 24, 48, 96 и 216 часа, и анализирани за пълно преброяване на клетките за диференциална и серумна химична картина. Нивата на серумното човешко IL-12 С8.6.2. антитяло, антитялото Y61, маймунски IFN-гама, маймунски IL-10, маймунски IL-6 и плазмен неоптерин бяха също така измерени.
Животните, третирани с IL-12 плюс IVIC контролно антитяло (Група 1) показаха много от очакваните хематологични промени, включително намаление в БКК, общия брой, лимфоцитите и моноцитите. Тези намаления бяха невидими или лошо проявени в животните, третирани с антитела С8.6.2. или Y61 в доза 1 или 10 mg/kg (Групи 2 - 5).
Серумните или плазмени проби бяха анализирани чрез ELISA, специфичен за IFN-гама от маймуни и маймунски IL-10 (Bisource International, Camarillo, СА), за маймунски IL-6 (endogen) и плазмен неоптерин (ICN Pharmaceuticals, Orangeburg, NY). IFN-гама, IL-10 или IL-6 не бяха открити в нито едно от третираните с IL-12 животни, включително и в контролните животни, третирани с IL-12 плюс IVIC. Това вероятно се дължеше на ниското ниво на експониране на IL-12 (само 1 доза от 1 pg/kg). Независимо от това,
221 нивата на неоптерин в плазмата се увеличиха около 3 пъти в животните, третирани с IL-12 плюс IVIC, но не се промениха във всичките третирани с С8.6.2. или Y61 животни, включително и при най-ниската доза (1 mg/kg) на третираните с Y61 животни, което показва че Y61 е ефективно in vivo в блокирането на този чувствителен отговор към IL-12.
В едно второ изследване беше проучена активността in vivo и фармакодинамиката (ФД) на J695 в маймуна циномолгус чрез прилагане на екзогенен rhIL-12 и определяне дали J695 може да блокира или намали отговора, нормално свързан с прилагането на rhIL-12. На мъжки маймуни циномолгус (п = 3 за група) беше приложена единична доза от 0.05, 0.2 или 1.0 mg/kg J695 или 1 mg/kg интравенозен имуноглобулин (IVIG) като еднократна интравенозна (ИВ) инжекция през сафеонната вена или подкожно (ПК) в дорзалната кожа. Един час лед прилагането на J695 или IVIC всички животни получиха единична ПК доза от 1 pg/kg rhIL-12 в дорзалната кожа. Кръвни проби бяха взимани от феморалната вена до 28 дни след прилагането на J695. От всяка кръвна проба беше получен серум и изследван за IL-12, J695, IFNy и анти-1695 антитела чрез ELISA. Неоптеринът беше изследван чрез обратно фазова високо ефективна течна хроматография.
Нивата на неоптерин, нормализирани по отношение на нивата на неоптерин, които са измерени преди прилагането на J695 или rhIL-12, са показани на Фигура 3. За да се сравни подтискането на неоптерина между двете групи, за всяко животно беше изчислена областта под кривата (AUC), нормализирана за нива неоптерин (Таблица 6). Излагането на неоптерин (AUC) беше подтиснато по зависим от дозата начин между приблизително 71 и 93 % в ИВ групите и между 71 и 100 % в ПК групите, по отношение на IVIC
222 контролните групи. Тези резултати предполагат, че дозата от J695, необходима за 50 % инхибиране на неоптериновия отговор (ED5o), е по-малка от 0.05 mg/kg, когато се прилага по ИВ или ПК начин.
Таблица 6 Зависимо от дозата подтискане от J695 на индуциран от
IL-12 неопротеин в маймуни циномолгус
Начин на дозиране Доза от Доза от AUC на % на намаление
на IVIG или J695 и J695 IVIG нормализирани на неопртеин
rhll-12 (mg/kg) (mg/kg) нива AUC в сравнение
неопротеин с контролата
Единично ИВ инжек- 1.0 1745 ± 845 0
тиране, последвано 0.05 502 ±135 71.3
след 1 ч от доза 0.2 - 199 ± 316 88.6
lpg/kg човешки IL- 1.0 - 128 + 292 92.7
12, приложен ПК
Единично ПК инжек- - 1.0 1480 ±604 0
тиране, последвано 0.05 - 426 ±108 71.2
след 1 ч от доза 0.2 395 ±45.9 73.3
lpg/kg човешки IL- 1.0 - 0 ± 109 100
12, приложен ПК
Третирането с J695 също така предотвратява или намалява хематологичните промени, обикновено свързани с прилагане на rhIL-12 (леукопения и тромбоцитопения). На 24 час след прилагането на rhIL-12 броят на лимфоцитите се намалява с около 50 % в сравнение с базовата линия в контролните, ИВ и ПК третирани с IVIC, групи. Прилагането на J695 ИВ или ПК във
223 всичките три дози, предотвратява това намаление, което води до брой на лимфоцитите на 24 час приблизително до този в базовата линия. На 48 час след прилагането на IL-12, общият брой на клетките в групите, третирани ИВ и ПК с IVIC беше намален с около 25 % в сравнение с базовите стойности.
Един примерен режим на дозиране, насочен към поддържане на серумните нива над 90 % показва, че ефективното ниво трябва да е 1 mg/kg ИВ и ПК, прилагано приблизително всяка втора седмица или 0.3 mg/kg, прилагано приблизително всяка седмица, като се приема леко натрупване по време на повтарящите се дози. Това изследване показва, че антитялото може да се дава безопасно на маймуни при такива дози. В независими изследвания на токсичността беше установено по-нататък, че до 100 mg/kg от антитялото могат да се дават без опасност за маймуните.
J695 беше също така ефективно при предотвратяване на продукцията на IFNy в мишки, третирани с химерично IL-12, молекула която комбинира миша р35 субединица с човешка IL-12 р40 субединица. За разлика от човешки IL-12, който е биологично неактивен в мишки, това химерично IL-12 запазва биологичните си функции в мишки, включително индукцията на IFNy. В допълнение, човешка субединица р40 позволява на молекулата да се свърже и неутрализира от J695. Химеричното IL-12 в доза от 0.05 mg/kg и.п. беше приложено на женски мишки C3H/HeJ (10 / експериментална група) в 5 дневни дози на ден 0, 1, 2, 3 и 4. J695 беше дадено на ден 0,2 и 4 в дози 0.05, 0.01, 0.002, 0.0004, 0.00008 и 0.000016 mg/kg и.п., 30 мин преди инжекциите с IL-12. Контролното huIgGly беше приложено ИП в доза 0.05 mg/kg на ден 0, 2 и 4. На мишките беше взета кръв на ден 5 и нивата на серумен IFNy бяха определени чрез ELISA. Резултатите показаха, че J695 причинява зависимо от дозата
224 инхибиране на продукцията на IFNy с ED50 от около 0.001 mg/kg.
Като цяло тези резултати показват, че J695 е мощен инхибитор на in vivo активността IL-12.
ПРИМЕР 5: Кинетичен анализ на свързването на човешки антитела към рекомбинантен човешки IL-12 (rhIL-12)
Взаимодействията при свързване между блокирания лиганд (човешко антитяло aHTH-rhIL-12 J695, блокиран в биосензорен матрикс) и аналит (rhIL-12 в разтвор) в реално време бяха измерени чрез повърхностен плазмен резонанс (1111Р) с помощта на системата BIAcore (Biacore AB, Uppsala, Sweden). Системата използва оптичните качества на 1111Р за откриване на промени в белтъчната концентрация в рамките на декстранов биосензорен матрикс. Белтъците са ковалентно свързани към декстрановия матрикс с известна концентрация. Антителата се инжектират през декстрановия матрикс и специфичното свързване между инжектираните антитела и имобилизирания лиганд води до повишаване на концентрацията на белтъка в матрикса, което от своя страна рефлектира в ППР сигнал. Тези промени в ППР сигнала се записват като резонансни единици (РЕ) и се визуализират по отношение на времето по дължината на ординатната ос на сеизмограмата.
За да се улесни имобилизацията на кози анти-човешки IgG (Sauthem Biotechnologiy Associates, Cat. No 2040-01, Birmingham, AL) върху биосензорен матрикс, кози анти-човешкии IgG се свързва ковалентно чрез свободните си амино групи към декстранов матрикс като първоначално се активират карбоксилните групи на матрикса
225 със 100 mM N-хидроксисукцинимид (NHS) и 400 mM Ν-ετΗΠ-Ν’-(3диметиламинопропил)-карбодиимид хидрохлорид (EDC). След това козият анти-човешки IgG се инжектира в активирания матрикс. Тридесет и пет микролитра от козия анти-човешки IgG (25 pg/ml), разреден в натриев ацетат, pH 4.5, се инжектират в активирания биосензор и свободните амини на белтъка са свързват директно с активираните карбоксилни групи. Нереагиралите матриксни EDCестери се дезактивират чрез инжектиране на 1 М етаноламин. В търговската мрежа има налични стандартни китове за сдвояване на амини (Biacore AB, Cat. No. BR-1000-50, Uppsala, Sweden).
J695 беше разреден в HBS буфер за нанасяне (Biacore AB, Cat. No BR-1001-88, Uppsala, Sweden), за да се свърже с матрикса чрез кози анти-човешки IgG. За да се определи капацитета специфичните rhIL12 антитела да се свързват с имобилизиран кози анти-човешки IgG, беше проведен анализ на свързване както следва. Аликвоти от J695 (25 pg/ml; аликвота от 25 μΐ) бяха инжектирани в сдвоения с кози анти-човешки IgG поликлонални антитела декстранов матрикс при скорост от 5 μΙ/min. Преди инжектирането на белтъка и веднага след това беше пропускан свободно да тече през всяка клетка HBS буфер. Чистата разлика в сигнала между базовата линия и точката, съответствуваща на приблизително 30 секунди след завършването на инжектирането на J695, беше отчетена като стойност, представяща количеството свързан IgGl J695 (приблизително 1200 RU’s). Директното свързване на специфични антитела rhIL12 към разтворим rhIL12 беше измерено. Цитокините бяха разреждани в HBS буфер за нанасяне и аликвоти от 50 μΐ бяха инжектирани в имобилизираните белтъчни матрикси при скорост от 5 μΙ/min. Концентрациите на използваното rhIL-12 бяха 10, 20, 25, 40, 50, 80, 100, 150 и 200 пМ. Преди инжектирането на rhIL-12 и веднага след
226 това през всяка клетка беше пропускан само HBS буфер. Чистата разлика в сигнала между базовата линия и сигнала след завършването на инжектирането на цитокина, беше отчетена като стойността на свързване за дадена проба. Биосензорните матрикси бяха регенерирани с помощта на 100 mM НС1 преди инжектиране на следващата проба. За да се определи дисоциационната константа (скоростта на напускане), константата на асоцияция (скоростта на навлизане), беше използван софтуеър BIAcore (версия 2.1) за кинетична оценка.
Представителни резултати за свързване на J695, получено от СНО, към rhIL-12 сравнени с J695, получено от COS, са представени в Таблица 7.
Таблица 7. Свързване на J695, производно на СНО или COS към rhIL-12
Източник rhIL12, пМ свързан rhIL 12, RU’s Ab, свързано, RU’s rhIL12/AB
СНО 200 1112 1613 1.4
СНО 150 1033 1525 1.45
СНО 100 994 1490 1.43
СНО 80 955 1457 1.40
СНО 50 912 1434 1.36
СНО 40 877 1413 1.33
СНО 25 818 1398 1.25
СНО 20 773 1382 1.20
СНО 10 627 1371 0.98
Източник rhIL12, пМ свързан rhILl 2, Ab, свързано, rhIL12/AB
227
RU’s RU’s
COS 200 1171 1690 1.49
cos 150 1084 1586 1.46
cos 100 1024 1524 1.44
cos 80 985 1489 1.42
cos 50 932 1457 1.37
cos 40 894 1431 1.34
cos 25 833 1409 1.27
cos 20 783 1394 1.20
cos 10 642 1377 1.00
Молекулните кинетични взаимодействия между свързаното J695 и разтворимо rhIL-12 бяха количествено анализирани с помощта на технологията BIAcore. Няколко независими експеримента бяха проведени и резултатите бяха анализирани чрез наличният софтуеър BIAcore за математичен анализ, за да се получат кинетичните скоростни константи, както е показано в Таблица 8.
Таблица 8 Видими константи за кинетичната скорост и афинитет на J695 към rhIL-12.
Антитяло Източник Скорост на навлизане (М-ls-l), Ср. Скорост на напускане (s-Ι), Ср. Kd (М), Ср.
J695 СНО 3.52Е + 05 4.72Е - 05 1.34Е-10
J695 COS 3.40Е + 05 2.61Е-05 9.74Е-11
228
Съществуваше малка разлика между изчислената чиста константа (Kd) за взаимодействието между антителата J695, получено от СНО (Kd = 1.34 _1° М'1) и J695, получено от COS (Kd = 9.74 х ΙΟ’11 М1). Чистата дисоциационна константа (Kd) между J695 и rhIL12 беше определена с помощта на наблюдаваните константи по формулата Kd = скорост на напускане / скорост на навлизане.
За да се определят чистите скоростни константи на асоциация и дисоциация за взаимодействието между J695 и rhIL12, бяха проведени няколко реакции на свързване с помощта на фиксирано количество от J695 (2 pg/ml) и различни концентрации от rhIL12. Сензограмите на взаимодействие при свързването в реално време между свързаното J695 и разтворимото rhIL12 показаха, че двете форми на антитялото са много сходни и при двете фази на асоциация и дисоциация.
За да се оцени по-нататък капацитета на свързаното IgGl J695 mAB да свързва разтворими рекомбинантни цитокини, беше използван директен BIAcore метод. В този метод кози анти-човешки IgG (25 pg/ml) сдвоен с карбоксиметил декстран сензорна повърхност, беше покрит с IgGl J695 (2 pg/ml) е беше добавен рекомбинантен цитокин. Когато разтворимият rhIL12 беше инжектиран в биосензорната повърхност, натоварена с IgGl J695 от СНО или COS, количеството на сигнала се увеличаваше с нарастване на концентрацията на цитокина в разтвора. Не беше наблюдавано свързване с rmIL12 (R & D Systems, Cat. No 419-ML, Mineapolis, MN) или c rhIL12 при нито една от тестваните концентрации, до 1000 пМ. Тези резултати поддържат заключението, че антителата IgGl J695 разпознават определена детерминанта от rhIL-12.
229
Таблица 9 показва резултатите от експериментите с помощта на BIAcore, демонстрирайки че човешки IgGl J695 mAb се свързва само с разтворимо rhIL12 и с нито един друг от рекомбинантните цитокини.
Таблица 9: Епитопно картиране на J695 с помощта на технологията BIAcore.
Уловен лиганд COS J695 Уловен лиганд СНО J695
Разтворим аналит
Рек. Човешки IL12 Положителен Положителен
Рек. Човешки IL12 Отрицателен Отрицателен
ПРИМЕР 6: Следващи изследвания на афинитета на J695 към IL-12
Молекулните кинетични взаимодействия между J695 и човешки IL-12 бяха анализирани количествено с помощта на BIAcore технология за плазмен резонанс и чистите кинетични скоростни константи бяха изчислени.
BIAcore технологията беше използвана за измерване на свързването на разтворим rhIL-12 към прикрепения към твърдата фаза J695. Козе антитяло към анти-човешки IgG беше имобилизирано върху биосензорни чипове, след което фиксирано количество от J695 беше инжектирано и захванато към повърхността. Различни концентрации от rhIL-12 бяха приложени и беше измерено свързването на IL-12 при различни концентрации на J695 като функция от времето.
230
Чистите дисоциационни и асоциационни скоростни константи бяха изчислени, прилагайки дисоциационна кинетика от нулев порядък и асоциационна кинетика от първи порядък, както и просто, едно към едно, молекулно взаимодействие между J695 и IL-12. Бяха проведени три независими експеримента и показаните стойности са средни такива от трите експеримента. От тези измервания, чистите дисоциационни (ка) и асоциационни (ка) скоростни константи бяха получени и използвани за изчисление на Ка на взаимодействието (виж Таблица 10). Тези резултати показват, че J695 притежава висок афинитет към rhIL-12.
Таблица 10:кинетични параметри на взаимодействието между J695 и човшки IL-12
Кинетичен параметър Стойност
ка 3.71 + 0.40 х 10’5 s'1
ka 3.81 ± 0.48 хЮ5 mV
Ка 9.74 х 10'11 M(14ng/mL)
ПРИМЕР 7: Характеристики и неутрализационна активност на С17.15, моноклонално антитяло от плъх към миши интерлевкин-12
За да се прецени пригодността на изследванията по лечение с IL-12 на миши модели при възпаления и автоимунност с помощта на моноклонални антитела, специфични за миши IL-12, към подобни подходи при заболявания на човека, беше изследвано взаимодействието на С17.15, анти-мише IL-12 моноклонално
231 антитяло с миши IL-12 от плъх. Беше изследвана способността на
С17.15 да неутрализира активността на миши IL-12 в анализа по пролиферация на ФХА бластни клетки и да блокира свързването на миши IL-12 към рецепторите от клетъчната повърхност, както и кинетиката на взаимодействието при свързване на миши IL-12.
В анализа на пролиферация на човешки ФХА бластни клетки (виж Пример 3), серийни разреждания от С17.15 или плъши IgG2a (контролно антитяло) бяха преинкубирани с 230 pg/ml миши IL-12 за 12 часа при 37°С. ФХА-стимулирани бластни клетки бяха добавяни към антиттяло-1Ь-12 смесите и инкубирани за 3 дни при 37°С. Клетките бяха след това белязяни за 6 часа с 1 pCi/well [Зн]тимидин. Културите бяха събрани и инкорпорирането на [Зн]тимидин беше измерено. Фоновата неспецифична пролиферация беше измерена при отсъствие на добавено мише IL-12 в сместа. Всички проби бяха изследвани в две повторения. Беше установена 1С50 (М) за С17.15 по отношение на рекомбинантния миши IL-12 на стойност 1.4 х 10'11, докато 1С50 стойността , наблюдавана за J695 по отношение на рекомбинантен IL-12 при същите тест условия беше
5.8 х 10’12.
Таблица 11. Сравнение на качествата на анти-човешки IL-12 моноклонално антитяло J695 и плъше анти-мише моноклонално антитяло IL-12 С17.15
Анти- Епитоп Анализ на биомолекулното Анализ по Анализ
тяло взаимодействие свързване на ФХА
с рецептор бластни
клетки
ка. ск. на k<j,CK. на Kj(M) 1С50(М) 1С50(М)
232
навлизане (M'V0 напускане 0)
J695 Нир40 3.81 х 105 3.71 х 10'5 9.74 х 10'11 1.1 х 10’12 5.8 х 10'12
С17.15 Мир40 3.80 х 105 1.84 хЮ4 3.80 х 1О'10 1.5 х 1О’10 1.4Х10’11
Способността на Cl7.15 да инхибира свързването на миши IL12 към клетъчните рецептори беше също така измерена. Серийни разреждания от С17.15 бяха преинкубирани за 1 час при 37°С със 100 рМ [1251]-миши IL-12 в буфер за свързване. 2D6 клетки (2 х 106) бяха добавяни към антитяло/[ 1]-миши IL-12 смесите и инкубирани за 2 часа при стайна температура Радиоактивните клетки бяха след това отделени от свободния [125I]-IL-12 и останалата радиоактивност, асоциирана с клетките беше измерена. Тоталното свързване на белязания IL-12 към рецепотрите на 2D6 клетките беше определено при отсъствие на антитяло и неспецифичното свързване беше определено чрез включване в сместа на 25 пМ небелязан миши IL-12. Специфичното свързване беше изчислено като тотално свързване минус неспецифично такова. Инкубациите бяха проведени в две повторения. Резултатите показват, че С17.15 притежава IC50 (М) на стойност 1.5 х 1О'10 за инхибиране на свързването на миши IL-12 към клетъчните рецептори.
Афинитетът на С17.15 към рекомбинантен миши IL-12 беше оценен чрез биомолекулярен анализ на взаимодействие. Козе антиплъшо IgG антитяло беше имобилизирано в биосензорен чип, последвано от инжектиране на фиксирано количество от антитяло С17.15, водещо до захващане на С17.15 към повърхността на чипа. Различни концентрации от рекомбинанет миши IL-12 бяха приложени към повърхността на С17.15 и беше измерено
233 свързването на мишия IL-12 към имобилизирания С.17.15 като функция от времето. Чистите дисоциационни и асоциационни скоростни константи бяха изчислени, прилагайки дисоциационна кинетика от нулев порядък и асоциационна кинетика от първи порядък, както и просто, едно към едно, молекулно взаимодействие между С17.15 и IL-12. От тези измервания, чистите дисоциационни (kd, скорост на напускане) и асоциационни (ка, скорост на навлизане) скоростни константи бяха изчислени. Тези резултати бяха използвани за изчисление на Ка стойността на взаимодействие. За взаимодействието на рекомбинантния миши IL-12-C17.15 бяха наблюдавани скорост на напускане 3.8 х 105 NT’s'1, скорост на навлизане 1.84 х 10‘4 s’1 и Ка = 4.8 х 1О’10.
Наблюдаваните активности на С17.15 при неутрализиране на активността на миши IL-12 и свързването му към рецепторите от клетъчната повърхност, както и кинетиката на свързване на С17.15. към миши IL-12, са в съответствие с подобни измервания на взаимодействието T695-IL-12. Това показва, че начинът на действие на плъши анти-миши IL-12 антитяло С17.15 и антитяло J695 за античовешки IL-12 са почти идентични, на базата на скоростта на навлизане, напускане К^, 1С50 и анализът на ФХА бластни клетки. Ето защо С17.15 бе използвано като хомоложно антитяло на J695 в мишите модели на възпаление и автоимунни заболявания за изучаване на ефекта на блокиране на IL-12 върху инициирането или развитието на заболяване в тези моделни животни (виж Пример 8).
ПРИМЕР 8: Лечение на автоимунни и възпалителни болести в мишки чрез прилагане на антитяло α-миши IL-12
234
А. Подтискане на колаген-индуцирания артрит в мишки чрез аIL-12 антитяло С17.15
Беше демонстрирана корелация между нивата на IL-12 и нивата на ревматоиден артрит (РА)- например, повишени нива на IL12 р70 бяха установени в синовните на пациенти с РА, сравнени със здрави контролни пациенти (Morita et al (1998) Arthritis and Rheumatotism. 41: 306-314). Ето защо, способността на Cl7.15, плъше анти-мише IL-12 антитяло, да подтиска колаген-индуцирания артрит в мишки беше оценена.
Мъжки DBA/1 мишки (10/група) бяха имунизирани с колаген тип II на ден 0 и лекувани с С17.15., или контролни плъши IgG в доза 10 mg/kg, интраперитонеално от ден -1 (1 ден преди имунизирането с колаген) до ден 12. животните бяха наблюдавани клинично за развитие на артрит на лапите до ден 90. Артритът беше градиран като: 0 - нормален; 1- артрит, локализиран в една става; 2 повече от една става включени, но не цялата лапа; 3 - включена цялата лапа; 4 - деформация на лапата; 5 - анкилоза на включените стави. Сборният резултат за артрит в мишките представляваше сума от степените на артрит във всяка индивидуална лапа на една мишка (мах = 20). Резултатите са представени като средна стойност + SEM за всяка група.
Резултатите, представени на Фигура 4, показват, че сборният резултат за артрит беше измерим в мишките, третирани с С17.15 само след 50 пост-третирания и пиковата средна стойност, получена при третираните с С17.15 мишки, беше поне с 5 пъти по-ниска от тази, измерена в третираните с IgG мишки. Това демонстрира, че антитяло плъши анти-миши IL-12 С17.15 предотвратява развитието на индуцирания от колаген артрит в мишки.
235
Б. подтискане на колит в мишки от плъше α-мише IL-12 антитяло С17.15
Показано бе също така, че IL-12 играе роля в развитието/патологията на колита. Например, анти-1Ъ-12 антитела подтискат болестта в миши модели на колит, напр. TNBS индуциран колит в мишки, третирани с IL-2 (Simpson et al. (1998) J. Exp. Med. 187(8): 1225-34). По подобен начин анти-1Ь-2 антитела е показано, че подтискат образуването на колит в мишки, третирани с IL-10. Способността на плъше анти-1Ь-12 антитяло, С17.15, да подтиска TNBS колит в мишки, беше оценена в две изследвания (Davidson et al. (1998)/ Immunol. 161(6): 3143-9).
В първото изследване, колитът беше индуциран в мишки SJL, свободни от патоген чрез прилагане на 150 μΐ 50 % етанол, съдържащ 2.0 mg TNBS, подаден през педиатричен умбиликален артериален катетър в ректума. Контролните животни бяха третирани със 150 μΐ 50 % етанол. Единична доза от 0.75, 0.5, 0.25 или 0.1 mg Cl7.15 или 0.75 mg IgG2a беше подадена интравенозно през опашната вена на ден 11 и терапевтичният ефект на третирането беше оценен чрез измерване на теглото на животните на ден 11 и 17 и хистологични изследвания на ден 17. Теглото на мишките, третирани с С17.15 се увеличаваше за 48 часа от началото на третирането с антитялото и се нормолизира на ден 6 след третирането. Ефектът на лечението с С17.15 беше потвърден и хистологично. По-нататък беше оценена секрецията на IFNy от CD4+ Т-клетки от далака и дебелото черво от третираните мишки, както и бяха измерени нивата на IL-12 от макрофаги от далака или дебелото черво на третираните мишки (виж Таблица 12).
При второто изследване дозите бяха оптимизирани и мишките бяха третирани с тотална доза от 0.1 mg или 0.5 mg С17.15 или 0.1
236 mg от контролния IgG2a, съответно, разделени между ден 12 и 14. Беше установено, че прилагането на С17.15 в единична доза при дозировка 0.1 mg/мишка или 0.25 mg/мишка води само до частично подобрение в TNBS-индуцирания колит и не води до значително намаление в продукцията на INFy от CD4+ Т-клетките in vitro, но води до значително намаление в секрецията на IL-12, в сравнение с нетретираните контроли. При единична доза 0.5 mg/мишка или повисока беше наблюдаван отговор. Взимайки най-ниската доза от изследваното антитяло и прилагайки я, разделена на две инжекции (на ден 12 и 14) подобри режима на дозиране, показвайки че множествените ниски дози могат да бъдат по-ефективни, отколкото единична болус доза. Получените данни са показани в Таблица 12.
Таблица 12: Анти-миши IL-12 mAb С17.15 подтиска доказан колит в мишки
Ден 0 от индуциране на болестта Ден 11 от лечението Тегло (g) IFNy CD4+ далачни клетки (U/ml) IL-12 далачни макрофаги (pg/ml)
Ден 11 Ден 17
TNBS + етанол Контрола IgG2a 0.75 mg 16.0 15.26 3326 300
TNBS + етанол C17.15 0.75mg 16.0 20.21 1732 0
TNBS + етанол C17.15 0.5mg 16.36 19.94 3618 0
TNBS + етанол С17.15 0.25 mg 16.28 17.7 3489 7
TNBS + етанол C17.15 0.lmg 16.2 17.98 1135 22
Контрола Етанол 20.76 21.16 0
м·
237
Прилагането на Cl7.15 моноклонално анти-IL-12 в две разделени дози спестява един ден настрана от факта, че тоталната доза от 0.1 mg/мишка или 0.05 mg/мишка водят до пълна промяна на колита, като беше определено от мироскопския вид на червото. В допълнение, тази дозировка води до значителна регулация на продукцията на IFNy от Т-клетки на lamina propria и продукцията на IL-12 от макрофагите, така че нивото на последните е сравнимо с нивата, наблюдавани в контролните, третирани с етанол, мишки с TNBS-колит. Така, прилагането на С17.15 в миши модели на TNBSколит, спира разпространението на болестта по зависим от дозата начин.
В. Подтискане на експериментален автоимунен енцефаломиелит (ЕИЕ) в мишки от q-IL-12 антитела
Широко разпространено е мнението, че IL-12 играе роля в патогенезата на множествената склероза (МС). Индуцируемото IL12 р40 “съобщение” е показано, че се експресира в пациенти с остри плаки от МС, но не и във възпалителни лезии при мозъчен инфаркт (Windhagen, A. et al. (1995) J. Exp. Med. 182: 1985-1996). T клетките от пациенти c МС (но не и контролните Т клетки) стимулират продукцията на IL-12 от антиген-съдържащи клетки, чрез нерегулирана експресия на CD40L (Balashov, К.Е. et al. (1997/ Proc. Natl. Acad. Sci USA 94: 599-603). Пациенти c МС притежават повишени нива на секреция на IFNy и могат да бъдат блокирани с аIL-12 антитела in vitro (Balashov, К.Е. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci USA 94: 599-603). Повишени нива на серумен IL-12 са открити в пациенти с МС, но не и при други неврологични болести (Nicoletti, F. et al. (1996) J. Neuroimmunol. 70: 87-90). Повишена продукция на
238
IL-12 е показано, че корелира с активността на заболяването в пациенти с МС (Cormabella, М. et al. (1998) J. Clin. Invest. 102: 671678). Изследвана е ролята на IL-12b патогенезата на миши модел на множествена склероза, експериментален автоимунен енцефаломиелит (ЕИЕ) (Leonard, J.P. et al. (1995) J. Exp. Med. 181: 281-386; Banerjee, S. et al. (1998) Arthritis Rheum. (1998) 41: S33; и Segal, B.M. et al. (1998) J. Exp.Med. 187: 537-546). Болестта в този модел, е известно че се индуцира от Т-клетки, подлиния ТНЬ Ето защо способността на антителата a-IL-12 да предотвратяват атаката на остър ЕИЕ беше изследвана.
Беше установено, че антитялото а-1Б-12може да инхибира атаката на остър ЕИЕ, да подтиска болестта след атака й и да намалява суровостта на рецидивите в мишки, имунизирани с автоантиген, миелинов основен белтък (Banerjee, S. et al. (1998) Arthritis Rheum. (1998) 41: S33). Благоприятният ефект на лечението с антитела a-IL-12 в мишки продължи за над два месеца след прекратяване на лечението. Показано е също така, че антитела антиIL-12 подтискат болестта в мишки, които са реципиенти на енцефалитогенни т клетки чрез адоптивен трансфер (Leonard, J.P. et al. (1995)7 Exp. Med. 181: 281-386).
ПРИМЕР 9: Клинична фармакология на J695
В “двойно-сляпо” кръстосано изследване на 64 мъже бяха приложени увеличаващи се дози от J695 или плацебо. Измерванията на СЗ фрагмента от Комплемента преди и 0.25 ч след дозирането не показаха активиране на системата на Комплемента. Нивата на CRP и фибриноген бяха повишени само в обектите, при които бяха наблюдавани симптоми на конкурентни инфекции.
239
Всички обекти оживяха и толерантността към J695 беше много добра. Не се наложи да се спира лечението при нито един от случаите, поради различни събития (PC). Най-често наблюдаваните
PC бяха главоболие и обикновени настинки/бронхити, нито едно от които не беше категоризирано като сериозно.
Един от изследваните обекти, 33-тодишен ерген, страдаше от псориазис гутата в началото на изследването. В съответствие със случайния дизайн на анализа, този обект по случайност получи 5 mg/kg J695 чрез ПК прилагане. Десет дни преди прилагането на антитялото, обектът показа само слаби дискретни папиларни лезии по ръцете и краката. По време на прилагането на антитялото, обектът показа повишено зачервяване, удебеляване на еритематозните плаки и повишена хиперкаратоза. Една седмица след прилагането на J695 обектът докладва за подобрение в състоянието на кожата, включително закърняване на лезиите и намаление в сърбежа. Накратко, след второто прилагане на J695 (5 mg/kg, ИВ), кожата на обекта беше напълно чиста от псориатични лезии, при липсата на каквото и да е местно третиране.
Еритематозните плаки, покрити с бели корички, се появяват
съпътстващо с очакваното проясняване на J695 след второто
прилагане на антитялото
ПРИМЕР 10: Сравнение на J695, продуцирани от две
клетъчни линии СНО
За рекомбинантната експресия на J695 в dhfr-СНО клетки се внедрява рекомбинантен експресионен вектор, кодиращ тежката и лека вериги на антитялото (Uriah, G. and Chasin, L.A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci USA 77:4216-4220) чрез трансфекция, опосредсвана от
240 калциев фосфат. В рамките на експресионни рекомбинантен вектор гените за тежката и лека вериги, всеки по отделно е оперативно свързан с регулаторни елементи усилител/промотор (напр. от SV40, CMV, аденовирус и други подобни, като регулаторен елемент усилител от CMV/ AdMLP промотор или регулаторен елемент усилител от SV40/ AdMLP промотор), за да се осигурят високи нива на транскрипция на тези гени. Рекомбинантният експресионен вектор носи също така гена DHFR, който позволява селекция на СНО клетките, които са трансфектирани с вектора, с помощта на метотрексат селекция/амплификация.
Сто и петдесет микрограма от експресионен вектор, кодиращ пептидната последователност на човешко антитяло J695, бяха разтворени в 2.7 ml вода в 50 ml-ова конична епруветка. Триста μΐ от
2.5 М СаС12 бяха добавени и към тази ДНК смес беше добавен на капки до 3 ml 2 х HEPES буфер в 50 ml-ова конична епруветка. След размесване на вортекс за 5 сек. и инкубиране на стайна температура за 20 мин, 1 ml беше разпределен върху всяка плака (все още в средата F12) и плаките бяха инкубирани при 37°С за 4 часа. Течността беше отстранена чрез аспириране и 2 ml от 10 % DMSO във F12 бяха добавени към всяка плака. Шокът с DMSO продължи 1 мин, след което DMSO беше разреден с добавяне на 5 ml PBS към всяка плака. Плаките бяха промити два пъти в PBS, последвано от добавяне на 10 ml от алфа МЕМ, съдържащ допълнително Н/Т и 5 % FBS (подбран за клетки, експресиращи DHFR) и инкубиране за една нощ при 37°С. Клетките бяха посети в плаки с 96 ямки при клетъчна плътност 100 клетки на ямка и плаките бяха инкубирани при 37°С, 5 % СО2 за две седмици с една смяна на средата за седмица.
Пет дни след последната смяна на средата, супернатантите от културите бяха разредени 1 : 50 и изследвани с помощта на ELISA,
241 специфичен за гама верига на човешки IgG. Клоновете, които показаха най-висок ELISA сигнал, бяха прехвърлени от плаката с 96 ямки в такава с 12 в 1.5 ml/well Алфа МЕМ + 5 % диализиран серум. След 3 дни друг ELISA, специфичен за гама верига от човешки IgG, беше проведен и 12 клона, с най-висока активност бяха отделени в алфа МЕМ + 5 % диализиран серум и 20 пМ МТХ. Клетъчна линия 031898218 растеше в присъствие на 20 пМ МТХ без да се забелязва клетъчна смърт или намалени с растежната скорост, продуцираше
1.8 pg/ml hlgG при 3-дневния анализ. Т-25 културите от 031898218, растящи в среда съдържаща МТХ, образуваха средно по 11.9 pg/ml J695. Линията, означена като ALP903, беше адаптирана за растеж в суспензия при условия без серум, където тя продуцираше 7.5 pg J695/cell/24h.
Клетките ALP903, след първоначалната селекция в среда алфа МЕМ/5 % FBS/20 пМ МТХ, бяха пасажирани отново в 20 пМ МТХ. Клетките бяха култивирани при селекция със 100 пМ МТХ, последвана от двукратно пасажиране в 500 пМ МТХ през следващите 30 дни. По това време културата продуцираше 32 pg J695/ml/24h. Културата беше субклонирана чрез ограничаващи разреждания. Субклон 218-22 продуцираше 16.5 pg/ml в плака с 96 ямки за 2 дни и 50.3 pg /ml от J695 в плака с 12 ямки за 2 дни. Клон 218-22 беше култивиран в среда алфа МЕМ/5 % диализиран FBS/500 пМ МТХ за 38 дни, последвано от адаптация към свободна от серум суспенсионна култура, както е описано по-горе. Средната клетъчноспецифична продуктивност на свободната от серум суспенсионна култура, означена като ALP 905, беше 58 pg/cell/24 h.
Първата клетъчна линия, използвана за получаване на J695 (ALP 903) показа по-нисък добив от антитяло от културата отколкото втората клетъчна линия, ALP 905. За да се потвърди, че
242 продуцираното от ALP 905 J695 е функционално идентично на това, продуцирано от ALP 903, двете партиди от антитела бяха оценени за афинитет към IL-12, за способност да блокират свързването на IL-12 към клетъчните рецептори, за способност да инхибират индукцията на IFNy от IL-12 и за способността им да инхибират опосредстваната от ФХА пролиферация на бластни клетки.
Афинитетът на J695 партидите ALP 903 и ALP 905 към IL-12 беше определен чрез измерване на кинетичните скоростни константи на свързване на IL-12 с помощта на измерване на плазмения повърхностен резонанс (BIAcore анализ). Скоростта на напускане (kd) и скоростта на навлизане (ка) на антителата от партиди ALP 903 и ALP 905 при свързване към rhIL-12 бяха определени в три експеримента (както е описано в Пример 3). Афинитетът, Ка, на свързване към IL-12 беше изчислен чрез разделяне на константата на скоростта на напускане на константата на скоростта на навлизане. Ка беше изчислена за всеки отделен експеримент и след това усреднена. Резултатите показват, че определените кинетични параметри и афинитет на свързване към rhIL-12 са много сходни за J695 партидите ALP 903 и ALP 905: Изчислената Ка беше 1.19 + 0.22 х ΙΟ’10 М за партида ALP 903 и 1.49 + 0.47 х ΙΟ’10 М за партида ALP 905. (виж Таблица 13).
Беше изследвана способността на J695, получен от ALP 903 и ALP 905, да блокира свързването на rhIL-12 с рецепторите за IL-12 от активирани с ФХА Т-лимфобласти (виж Пример 3). Всяка проба от J695 беше тествана при начална концентрация от 1 х 108 с 10кратни серийни разреждания. Антитялото беше преципитирано за 1 час при 37°С със смес от 50 рМ [1251]-човешки IL-12 в буфер за свързване. Към сместа от антитяло/[ 1]-човешки IL-12 бяха добавени ФХА бластни клетки и инкубирани за 2 часа при стайна
243 температура. Клетъчно свързаната радиоактивност беше отделена от свободния [125I]-IL-12 чрез центрофугиране и промиване и беше изчислен % на инхибиране. Стойността 1С50 за J695 беше определена от кривите на инхибиране с помощта на съпоставяне на 4 параметъра и беше потвърдена чрез два независими експеримента. Инкубациите бяха проведени в две повторения. Резултатите от двете партиди J695 са много сходни (виж Таблица 13).
Беше изследвана способността на J695 от клетки ALP 903 и ALP 905 да инхибира индуцираната от rhIL-12 продукция на IFNy от човешки ФХА-активирани лимфобласти in vitro. Серийни разреждания на J695 бяха приинкубирани с 200 pg/ml rhIL-12 за 1 час при 37°С. ФХА лимфобластните клетки бяха добавени и инкубирани за 18 часа при 37°С. След инкубирането клетъчната супернатанта беше отстранена и нивото на човешки IFNy беше определено с помощта на ELISA. Стойностите за IC50 от кривите на инхибиране бяха плотирани срещу концентрацията на антитялото с помощта на съпоставяне на 4 параметъра на кривата. Резултатите показват, че способността та двете партиди да инхибират продукцията на IFNy е много сходна.
Анализът in vitro на пролиферацията на ФХА бластните клетки беше използван за измерване на неутрализационния капацитет на ALP 903 и ALP 905 J695 за rhIL-12. Серийни разреждания от J695 от всеки един тип бяха преинкубирани с 230 pg/ml човешки IL-12 за 1 час при 37°С. След това бяха добавени ФХА бластни клетки и инкубирани за 3 дни при 37°С. Клетките бяха след това белязани за 6 часа с 1 yCi/well [ Н]-тимидин. Културите бяха събрани и инкорпорираният [3Н]-тимидн - измерен. Неспецифичната пролиферация (фон) беше измерена в отсъствие на
244 rhIL-12. Стойностите на 1С5о за ALP 903 и ALP 905 J695 бе установено, че са много сходни и са представени в Таблица 13.
Активността на антителата J695 при неутрализиране на активността на rhIL-12, при блокиране на свързването на rhIL-12 към рецепторите за клетъчна повърхност и при свързването на rhIL-12 не се различаваше значително в партидите ALP 903 и ALP, и по този начин антителата, продуцирани от тези две различни клетъчни типа, се оказаха еквивалентни.
Таблица 13:Сравнение на качествата на партиди J695 ALP 903 и
ALP 905
Анти- тяло ка, ск. на навлизане (NT's’0 к<1, ск. на напускане (S'1) Kd(M) Анализ СР1С50 (М) Анализ ФХА бластни клетки 1Сзо(М) Анализ на IFNy 1С50(М)
J695 ALP903 3.75 х 105 4.46 х 10'5 1.19 х10’10 3.75 х 105 3.4x1ο41 5.5 х 10’12
J695 ALP905 3.91 х 105 5.59 х 10’5 1.49 х КГ10 3.75 х 105 З.ОхЮ41 4.3 х 10’12
ЕКВИВАЛЕНТИ
Тези, с познания в даденото ниво на техниката, ще разпознаят или могат да установят употребата на повече от един рутинни експерименти, много еквиваленти на специфичните варианти, съгласно изобретението, описани тук. Последващите патентни претенции имат намерение да заобиколят такива еквиваленти.
ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

Claims (52)

1. Изолирано човешко антитяло или антиген-свързващата част от него, което свързва човешки IL-12, характеризиращ се с това, че въпросното човешко антитяло е неутрализиращо антитяло.
2. Човешко IL-12 антитяло със селективна мутация, състоящо се от:
човешко антитяло или антиген-свързващата част от него със селективна мутация на предпочитана позиция за селективна мутагенеза, контакт или хипермутация, с усилващ активността аминокиселинен остатък, такъв, че свързва човешки IL-12.
3. Човешко IL-12 антитяло със селективна мутация, състоящо се от:
човешко антитяло или антиген-свързващата част от него със селективна мутация на предпочитана позиция за селективна мутагенеза с усилващ активността аминокиселинен остатък, такъв, че свързва човешки IL-12.
4. Човешкото IL-12 антитяло със селективна мутация съгласно патентна претенция 2, характеризиращо се с това, че човешкото антитяло или антиген-свързващата част от него имат селективна мутация на повече от една предпочитана позиция за селективна мутагенеза, контакт или хипермутация с усилващ активността аминокиселинен остатък.
5. Човешкото IL-12 антитяло със селективна мутация съгласно патентна претенция 4, характеризиращо се с това, че човешкото антитяло или антиген-свързващата част от него имат селективна мутация на повече от три предпочитани позиции за селективна мутагенеза, контакт или хипермутация.
6. Човешкото IL-12 антитяло със селективна мутация съгласно патентна претенция 4, характеризиращо се с това, че човешкото антитяло или антиген-свързващата част от него имат селективна мутация на повече от две предпочитани позиции за селективна мутагенеза, контакт или хипермутация.
7. Човешкото IL-12 антитяло със селективна мутация съгласно патентна претенция 2, характеризиращо се с това, че човешкото антитяло или антиген-свързващата част от него имат такава селективна мутация, че е достигнато ниво на афинитет на целевата специфичност, като въпросното целево ниво е подобрено над това, което се достига при селекция на антитяло срещу същия антиген, използвайки технология на фагово проявяване.
8. Човешкото IL-12 антитяло със селективна мутация съгласно патентна претенция 7, характеризиращо се с това, че човешкото антитяло или антиген-свързващата част от него със селективна мутация запазват по-нататък най-малко едно желано качество или характеристика.
9. Изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което се свързва към човешки IL-12 и се дисоциира от човешки IL-12 с скоростна константа Koff от 0.1 s'1 или по-малка, както е определено чрез повърхностен плазмен резонанс, или което инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro анализ на фитохемаглутининовата бластна пролиферация (ФХА анализ) с IC50 от 1 х ΙΟ’6 М или по-малко.
10. Изолираното човешко антитяло съгласно патентна претенция 9 или антиген-свързваща част от него, което дисоциира от човешки IL-12 със скоростна константа Koff от 1 х IO’2 s'1 или помалка, както е определено чрез повърхностен плазмен резонанс, или което инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ФХА анализ с 1С5о от 1 х ΙΟ’7 М или по-малко.
11. Изолираното човешко антитяло съгласно патентна претенция 9 или антиген-свързваща част от него, което дисоциира от човешки IL-12 със скоростна константа Koff от 1 х IO'3 s'1 или помалка, както е определено чрез повърхностен плазмен резонанс, или което инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ФХА анализ с IC50 от 1 х ΙΟ’8 М или по-малко.
12. Изолираното човешко антитяло съгласно патентна претенция 9 или антиген-свързваща част от него, което дисоциира от човешки IL-12 със скоростна константа KOff от 1 х 10‘4 s'1 или помалка, както е определено чрез повърхностен плазмен резонанс, или което инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ФХА анализ с 1С5о от 1 х ΙΟ'9 М или по-малко.
13. Изолираното човешко антитяло съгласно патентна претенция 9 или антиген-свързваща част от него, което дисоциира от човешки IL-12 със скоростна константа Koff от 1 х IO’5 s’1 или помалка както е определено чрез повърхностен плазмен резонанс, или което инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ПРА анализ с 1С50 от 1 х ΙΟ’10 М или по-малко.
14. Изолираното човешко антитяло съгласно патентна претенция 9 или антиген-свързваща част от него, което дисоциира от човешки IL-12 със скоростна константа от 1 х IO’5 s’1 или помалка, както е определено чрез повърхностен плазмен резонанс, или което инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ФХА анализ с IC50 от 1 х 1О‘П М или по-малко.
15. Изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което има следните характеристики:
А) инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ФХА анализ с 1С50 от 1 х ΙΟ’6 М или по-малко;
Б) има CDR3 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 1; и
В) има CDR3 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 2.
16. Изолираното човешко антитяло съгласно патентна претенция 15 или антиген-свързваща част от него, което по-нататък има CDR2 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност SEQ ID NO: 3; и има CDR2 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 4.
17. Изолираното човешко антитяло съгласно патентна претенция 15 или антиген-свързваща част от него, което по-нататък има CDR1 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност SEQ ID NO: 5; и има CDR1 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 6.
18. Изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него съгласно патентна претенция 16, което по-нататък има вариабилен регион на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност SEQ ID NO: 7; и има вариабилен регион на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 8.
19. Изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което има следните характеристики:
A) инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ФХА анализ с IC50 от 1 х 10'9 М или по-малко;
Б) има CDR3 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 9 и
B) има CDR3 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 10.
20. Изолираното човешко антитяло съгласно патентна претенция 19 или антиген-свързваща част от него, което по-нататък има CDR2 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност SEQ ID NO: 11; и има CDR2 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 12.
21. Изолираното човешко антитяло съгласно патентна претенция 19 или антиген-свързваща част от него, което по-нататък има CDR1 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност SEQ ID N0:13; и има CDR1 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 14.
22. Изолираното човешко антитяло съгласно патентна претенция 19, което по-нататък има вариабилен регион на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност SEQ ID N0: 15; и има вариабилен регион на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 16.
23. Изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което:
A) инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ФХА анализ с 1С50 от 1 χ ΙΟ'9 М или по-малко;
Б) има CDR3 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 17; и
B) има CDR3 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 18.
24. Изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него съгласно патентна претенция 23, което по-нататък има CDR2 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност SEQ ID N0: 19; и има CDR2 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 20.
25. Изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него съгласно патентна претенция 23, което по-нататък има
CDR1 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност SEQ ID NO: 21; и има CDR1 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 22.
26. Изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, имащо вариабилен регион на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност SEQ ID NO: 23; и вариабилен регион на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 24.
27. Изолираното човешко антитяло съгласно патентна претенция 26, обхващащо константен регион на тежка верига подбран от групата, състояща се от постоянните региони на IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA и IgE.
28. Изолираното човешко антитяло съгласно патентна претенция 27, характеризиращо се с това, че постоянният регион на тежка верига на антитялото е IgGl.
29.
Изолираното човешко антитяло съгласно патентна претенция 26, което е Fab фрагмент.
30.
Изолираното човешко антитяло съгласно патентна претенция 26, което е F(ab’)2 фрагмент.
31.
Изолираното човешко антитяло съгласно патентна претенция 26, което е едноверижен Fv фрагмент.
32. Изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което:
A) инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ФХА анализ с 1С5о от 1 х ΙΟ’9 М или по-малко;
Б) има CDR3 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност, подбрана от групата, състояща се от SEQ ID NO: 404-SEQ ID NO: 469; и
B) има CDR3 на лека верига, включващ аминокиселинната
Ί последователност, подбрана от групата, състояща се от SEQ ID NO: 534- SEQ ID NO: 579.
33. Изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него съгласно патентна претенция 32, което по-нататък има CDR2 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност, подбрана от групата, състояща се от SEQ ID NO: 335- SEQ ID NO: 403; или има CDR2 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност, подбрана от групата, състояща се от SEQ ID NO: 506- SEQ ID NO: 533.
34. Изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него съгласно патентна претенция 32, което по-нататък има CDR1 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност, подбрана от групата, състояща се от SEQ ID NO: 288- SEQ ID NO: 334; или има CDR1 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност, подбрана от групата, състояща се от на SEQ ID NO: 470-SEQ ID N0:505.
35. Изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, имащо вариабилен регион на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност от SEQ ID NO: 23; и вариабилен регион на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 24.
36. Изолираното човешко антитяло съгласно патентна претенция 35, обхващащо постоянен регион на тежка верига, подбран от групата, състояща се от постоянните региони на IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA и IgE.
37. Изолираното човешко антитяло съгласно патентна претенция 36, характеризиращо се с това, че постоянният регион на тежка верига на антитялото е IgGl.
38. Изолираното човешко антитяло съгласно патентна претенция 35, което е Fab фрагмент.
39. Изолираното човешко антитяло съгласно патентна претенция 35, което е F(ab’)2 фрагмент.
40. Изолираното човешко антитяло съгласно патентна претенция 35, което е едноверижен Fv фрагмент.
41. Изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което:
A) инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ФХА анализ с IC50 от 1 х 10’9 М или по-малко;
Б) има CDR3 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 25; и
B) има CDR3 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 26.
42. Изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него съгласно патентна претенция 41, което по-нататък има CDR2 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност SEQ ID NO: 27; и има CDR2 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 28.
43. Изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него съгласно патентна претенция 41, което по-нататък има CDR1 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност SEQ ID NO: 29; и има CDR1 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 30.
44. Изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, имащо вариабилен регион на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност SEQ ID NO: 31; и вариабилен регион на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 32.
45. Изолираното човешко антитяло съгласно патентна претенция 44, обхващащо постоянен регион на тежка верига подбран от групата, състояща се от постоянните региони на IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA и IgE.
46. Изолираното човешко антитяло съгласно патентна претенция 45, характеризиращо се с това, че постоянният регион на тежка верига на антитялото е IgGl.
47.
Изолираното човешко антитяло съгласно патентна претенция 44, което е Fab фрагмент.
48.
Изолираното човешко антитяло съгласно патентна претенция 44 което е F(ab’)2 фрагмент.
49.
Изолираното човешко антитяло съгласно патентна претенция 44, което е едноверижен Fv фрагмент.
50. Изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което:
А) инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ФХА анализ с 1С50 от 1 х 10'6 М или по-малко;
Б) съдържа CDR3 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 1, CDR2 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 3 и CDR1 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 5 или негов мутант, имащ едно или повече аминокиселинни замествания на контактна или хипермутационна позиция, характеризиращ се с това, че въпросният мутант има скорост Koff не повече от 10 пъти по-висока от антитялото, съдържащо CDR3 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност от SEQ ID N0:1, CDR2 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 3, CDR1 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 5; и
В) съдържа CDR3 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 2, CDR2 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 4 и CDR1 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 6 или негов мутант, имащ едно или повече аминокиселинни замествания на контактна или хипермутационна позиция, характеризиращ се с това, че въпросният мутант има скорост KOff не повече от 10 пъти по-висока от антитялото, съдържащо CDR3 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност от SEQ ID N0:2, CDR2 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 4 и CDR1 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 6.
51. Изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което:
А) инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ФХА анализ с 1С5о от 1 χ ΙΟ’9 М или по-малко;
Б) съдържа CDR3 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 9, CDR2 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 11 и CDR1 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 13 или негов мутант, имащ едно или повече аминокиселинни замествания на контактна или хипермутационна позиция, характеризиращ се с това, че въпросният мутант има скорост KOff не повече от 10 пъти повисока от антитялото, съдържащо CDR3 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност от SEQ ID N0:9, CDR2 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 11, CDR1 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 13; и последователност на SEQ ID NO: 21; и
В) съдържа CDR3 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 18, CDR2 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 20 и CDR1 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 22 или негов мутант, имащ едно или повече аминокиселинни замествания на контактна или хипермутационна позиция, характеризиращ се с това, че въпросният мутант има скорост кой· не повече от 10 пъти по-висока от антитялото, съдържащо CDR3 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност от SEQ ID N0:18, CDR2 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 20 и CDR1 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 22.
53. Изолирана нуклеинова киселина, кодираща CDR3 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност от SEQIDNO: 17.
54. Изолираната нуклеинова киселина съгласно патентна претенция 53, която кодира вариабилен регион на тежка верига на антитяло.
55. Изолираната нуклеинова киселина съгласно патентна претенция 54, характеризираща се с това, че CDR2 на вариабилния регион на тежката верига на антитялото включва аминокиселинната последователност от SEQ ID NO: 19.
56. Изолираната нуклеинова киселина съгласно патентна претенция 54, характеризираща се с това, че CDR1 на вариабилния регион на тежката верига на антитялото включва аминокиселинната последователност от SEQ ID NO: 21.
57. Изолираната нуклеинова киселина съгласно патентна
В) съдържа CDR3 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 10, CDR2 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 12 и CDR1 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 14 или негов мутант, имащ едно или повече аминокиселинни замествания на контактна или хипермутационна позиция, характеризиращ се с това, че въпросният мутант има скорост Koff не повече от 10 пъти по-висока от антитялото, съдържащо CDR3 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност от SEQ ID N0:10, CDR2 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 12 и CDR1 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 14.
52. Изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което:
А) инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ФХА анализ с 1С50 от 1 х ΙΟ’9 М или по-малко;
Б) съдържа CDR3 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 17, CDR2 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 19 и CDR1 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 21 или негов мутант, имащ едно или повече аминокиселинни замествания на контактна или хипермутационна позиция, характеризиращ се с това, че въпросният мутант има скорост KOff не повече от 10 пъти повисока от антитялото, съдържащо CDR3 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност от SEQ ID N0:17, CDR2 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 19, CDR1 на тежка верига, включващ аминокиселинната претенция 56, която кодира вариабилен регион на тежка верига на антитяло, включващ аминокиселинната последователност от SEQ ID
NO: 23.
58. Изолирана нуклеинова киселина, кодираща CDR3 на леката верига, включващ аминокиселинната последователност от SEQIDNO: 18.
59. Изолираната нуклеинова киселина съгласно патентна претенция 58, която кодира вариабилен регион на лека верига на антитяло.
60. Изолираната нуклеинова киселина съгласно патентна претенция 59, характеризираща се с това, че CDR2 на вариабилния регион на леката верига на антитялото включва аминокиселинната последователност от SEQ ID NO: 20.
61. Изолираната нуклеинова киселина съгласно патентна претенция 59, характеризираща се с това, че CDR1 на вариабилния регион на леката верига на антитялото включва аминокиселинната последователност от SEQ ID NO: 22.
62. Изолираната нуклеинова киселина съгласно патентна претенция 61, която кодира вариабилен регион на лека верига на антитяло, включващ аминокиселинната последователност от SEQ ID NO: 24
63. Изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което:
А) инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro ФХА анализ с 1С5о от 1 х ΙΟ’9 М или по-малко;
Б) съдържа CDR3 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 25, CDR2 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 27 и CDR1 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 29 или негов мутант, имащ едно или повече аминокиселинни замествания на контактна или хипермутационна позиция, характеризиращ се с това, че въпросният мутант има скорост Koff не повече от 10 пъти повисока от антитялото, съдържащо CDR3 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност от SEQ ID N0:25, CDR2 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 27, CDR1 на тежка верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 29; и
В) съдържа CDR3 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 26, CDR2 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 28 и CDR1 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 30 или негов мутант, имащ едно или повече аминокиселинни замествания на контактна или хипермутационна позиция, характеризиращ се с това, че въпросният мутант има скорост κΟβ· не повече от 10 пъти по-висока от антитялото, съдържащо CDR3 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност от SEQ ID N0:26, CDR2 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 28 и CDR1 на лека верига, включващ аминокиселинната последователност на SEQ ID N0: 30.
64. Изолирана нуклеинова киселина, кодираща CDR3 на тежката верига, включващ аминокиселинната последователност от SEQ ID N0: 25.
65. Изолираната нуклеинова киселина съгласно патентна претенция 64, която кодира вариабилен регион на тежка верига на антитяло.
66. Изолираната нуклеинова киселина съгласно патентна претенция 65, характеризираща се с това, че CDR2 на вариабилния регион на тежката верига на антитялото включва аминокиселинната последователност от SEQ ID NO: 27.
67. Изолираната нуклеинова киселина съгласно патентна претенция 65, характеризираща се с това, че CDR1 на вариабилния регион на тежката верига на антитялото включва аминокиселинната последователност от SEQ ID NO: 29.
68. Изолираната нуклеинова киселина съгласно патентна претенция 67, която кодира вариабилен регион на тежка верига на антитяло, включващ аминокиселинната последователност от SEQ ID N0:31.
69. Изолирана нуклеинова киселина, кодираща CDR3 на леката верига, вклюващ аминокиселинната последователност от SEQ ID N0: 26.
70. Изолираната нуклеинова киселина съгласно патентна претенция 69, която кодира вариабилен регион на лека верига на антитяло.
71. Изолираната нуклеинова киселина съгласно патентна претенция 70, характеризираща се с това, че CDR2 на вариабилния регион на леката верига на антитялото включва аминокиселинната последователност от SEQ ID N0: 28.
72. Изолираната нуклеинова киселина съгласно патентна претенция 70, характеризираща се с това, че CDR1 на вариабилния регион на леката верига на антитялото включва аминокиселинната последователност от SEQ ID N0: 30.
73. Изолираната нуклеинова киселина съгласно патентна претенция 72, която кодира вариабилен регион на тежка верига на антитяло, включващ аминокиселинната последователност от SEQ ID N0: 32.
74. Изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което има следните характеристики:
A) което се свързва към човешки IL-12 и се дисоциира от човешки IL-12 със скоростна константа Koff от 0.1 s’1 или по-малка, както е определено чрез повърхностен плазмен резонанс, или което инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro анализ на фитохемаглутининовата бластна пролиферация (ФХА анализ) с 1С5о от 1 х ΙΟ'6 М или по-малко.
Б) има вариабилен регион на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинна последователност, подбрана от член на семейство VH3 на родителската линия, при което вариабилният регион на тежката верига има мутация на контактна или хипермутационна позиция с усилващ активността аминокиселинен остатък.
B) има вариабилен регион на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинна последователност, подбрана от член на семейство \\1 на родителската линия, при което вариабилният регион на леката верига има мутация на контактна или хипермутационна позиция с усилващ активността аминокиселинен остатък.
75. Изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което има следните характеристики:
А) което се свързва към човешки IL-12 и се дисоциира от човешки IL-12 със скоростна константа Коя от 0.1 s'1 или по-малка както е определено чрез повърхностен плазмен резонанс, или което инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro анализ на фитохемаглутининовата бластна пролиферация (ФХА анализ) с IC50 от 1 х ΙΟ'6 М или по-малко.
Б) има вариабилен регион на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинна последователност, подбрана от групата, състояща се от SEQ ID NOs: 595-667, при което вариабилният регион на тежката верига има мутация на контактна или хипермутационна позиция с усилващ активността аминокиселинен остатък.
В) има вариабилен регион на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинна последователност, подбрана от групата, състояща се от SEQ ID NOs: 669-675, при което вариабилният регион на леката верига има мутация на контактна или хипермутационна позиция с усилващ активността аминокиселинен остатък.
76. Изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което има следните характеристики:
A) което се свързва към човешки IL-12 и се дисоциира от човешки IL-12 със скоростна константа Koff от 0.1 s'1 или по-малка както е определено чрез повърхностен плазмен резонанс, или което инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro анализ на фитохемаглутининовата бластна пролиферация (ФХА анализ) с 1С5о от 1 х 10'6 М или по-малко.
Б) има вариабилен регион на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинна последователност на COS-З родителска линия, при което вариабилният регион на тежката верига има мутация на контактна или хипермутационна позиция с усилващ активността аминокиселинен остатък.
B) има вариабилен регион на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинна последователност на DPL8 родителска линия, при което вариабилният регион на леката верига има мутация на контактна или хипермутационна позиция с усилващ активността аминокиселинен остатък.
77. Изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което има следните характеристики:
А) което се свързва към човешки IL-12 и се дисоциира от човешки IL-12 със скоростна константа KOff от 0.1 s'1 или по-малка както е определено чрез повърхностен плазмен резонанс, или което инхибира фитохемаглутининовата бластна пролиферация в in vitro анализ на фитохемаглутининовата бластна пролиферация (ФХА анализ) с IC50 от 1 χ 10'6 М или по-малко.
Б) има вариабилен регион на тежка верига, характеризиращ се с аминокиселинна последователност, подбрана от член на семейство VH3 на родителската линия, при което вариабилният регион на тежката верига включва CDR2, който структурно е подобен на CDR2 от други членове на семейство VH3 на родителската линия и CDR1, който структурно е подобен на CDR1 от други членове на семейство VH3 на родителската линия, и характеризиращ се с това, че вариабилният регион на тежката верига има мутация на контактна или хипермутационна позиция с усилващ активността аминокиселинен остатък.
В) има вариабилен регион на лека верига, характеризиращ се с аминокиселинна последователност, подбрана от член на семейство νλΐ на родителската линия, който структурно е подобен на CDR2 от други членове на семейство νλΐ на родителската линия и CDR1, който структурно е подобен на CDR1 от други членове на семейство νλΐ на родителската линия, и характеризиращ се с това, че вариабилният регион на леката верига има мутация на контактна или хипермутационна позиция с усилващ активността аминокиселинен остатък.
78. Изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него съгласно патентни претенции 74, 75, 76 или 77, характеризиращо се с това, че мутацията е в CDR3 на тежката верига.
79. Изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него съгласно патентни претенции 74, 75, 76 или 77, допълнителен IL-12 от примат, подбран от групата, състояща се от IL-12 на бабун, IL-12 на мармозет, IL-12 на шимпанзе, IL-12 циномолгус и IL-12 на резус, но което не неутрализира активността на миши IL-12.
88. Фармацевтичен състав, включващ антитялото или антигенсвързваща част от него, от всяка една от патентните претенции 1-52, 74-83 и 87 и фармацевтично приемлив носител.
89. Състав, включващ антитялото или антиген-свързваща част от него, от всяка една от патентните претенции 1-52, 74-83 и 87 и допълнителен агент.
90. Състав, съгласно патентна претенция 89, характеризиращ се с това, че допълнителният агент е терапевтичен агент.
91. Състав, съгласно патентна претенция 90, характеризиращ се това, че терапевтичният агент е подбран от групата, съставена от буденозид, епидермален растежен фактор, кортикостероиди, циклоспорин, сулфасалацин, аминосалицилати, 6-меркаптопурин, азатиоприн, метронидазол, инхибитори на липоксигеназа, мезаламин, олсалацин, балсалазид, антиоксиданти, инхибитори на тромбоксан, IL-1 рецепторни антагонисти, aHTH-IL-Ιβ моноклонални антитела, aHTH-IL-б моноклонални антитела, растежни фактори, инхибитори на еластаза, пиридинил-имидазолови съединения, антитела или агонисти на TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, ЕМАР-П, GM-CSF, FGF и PDGF, антитела на CD2 CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 или техни лиганди, метотрексат, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофенолат мофетил, лефлуномид, NSAIDs, ибупрофен, коптикостероиди, преднизолон, инхибитори на фосфодиестераза, аденозинови агонисти, антитромботични агенти, комплементарни инхибитори, адренергични агенти, IRAK, NIK, IKK, р38, характеризиращо се с това, че мутацията е в CDR3 на леката верига.
80. Изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него съгласно патентни претенции 74, 75, 76 или 77, характеризиращо се с това, че мутацията е в CDR2 на тежката верига.
81. Изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него съгласно патентни претенции 74, 75, 76 или 77, характеризиращо се с това, че мутацията е в CDR2 на леката верига.
82. Изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него съгласно патентни претенции 74, 75, 76 или 77, характеризиращо се с това, че мутацията е в CDR1 на тежката верига.
83. Изолираното човешко антитяло или антиген-свързваща част от него съгласно патентни претенции 74, 75, 76 или 77, характеризиращо се с това, че мутацията е в CDR1 на леката верига.
84. Рекомбинантен експресионен вектор, кодиращ
А) тежка верига на антитяло, имащо вариабилен регион, включващ аминокиселинната последователност SEQ ID NO: 31; и
Б) лека верига на антитяло, имащо вариабилен регион, включващ аминокиселинната последователност SEQ ID NO: 32.
85. Клетка-гостоприемник, в която е бил въведен рекомбинантния експресионен вектор съгласно патентна претенция 84.
86. Метод за синтезиране на човешко антитяло, което свързва човешки IL-12, включващ култивиране на клетката-гостоприемник съгласно патентна претенция 85 в хранителна среда докато клетката синтезира човешко антитяло, което свързва човешки IL-12.
87. Изолирано човешко антитяло или антиген-свързваща част от него, което неутрализира активността на човешки IL-12 и поне един инхибитори на MAP киназа, IL-Ιβ превръщащи ензимни инхибитори, TNFa превръщащи ензимни инхибитори, Т-клетъчни сигнални инхибитори, инхибитори на металопротеинази, сулфасалацин, азатиоприн, 6-меркаптопурини, ангиотензин превръщащи ензимни инхибитори, рецептори на разтворим цитокин, разтворим р55 TNF рецептор, разтворим р75 TNF рецептор, sIL-lRI, sIL-RII, sIL-6R, противовъзпалителни цитокини, IL-4, IL-10, IL-11, ΙΕ-13ΗΤΟΡβ.
92. Терапевтичен състав, съгласно патентна претенция 90, характеризиращ се това, че терапевтичният агент е подбран от групата, състояща се от анти-TNF антитела и фрагменти от тези антитела, TNFR-Ig конструкти, ТАСЕ инхибитори, PDE4 инхибитори, кортикостероиди, буденозид, дексаметазон, сулфасалацин, 5-аминосалицилова киселина, олсалацин, IL-Ιβ превръщащи ензимни инхибитори, IL-lra, инхибитори на тирозин киназа, 6-меркаптопурини и IL-11.
93. Терапевтичен състав, съгласно патентна претенция 90, характеризиращ се това, че терапевтичният агент е подбран от групата, състояща се от кортикостероиди, преднизолон, метилпреднизолон, азатиоприн, циклофосфамид, циклоспорин, метотрексат, 4-аминопиридин, тизанидин, интерферон-β 1 а, интерферон-βΐΐ), Кополимер 1, кислород под налягане, интравенозен имуноглобулин, клабрибин, антитела или агонисти на TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, ЕМАР-П, GM-CSF, FGF, PDGF, антитела на CD2 CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 или техни лиганди, метотрексат, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофенолат мофетил, лефлуномид, NSAIDs, ибупрофен, кортикостероиди, преднизолон, инхибитори на фосфодиестераза, агонисти на аденозида, антитромботични агенти, комплементарни инхибитори, адренергични агенти, IRAK, NIK, IKK, р38 или инхибитори на MAP киназа, IL-Ιβ превръщащи ензимни инхибитори, ТАСЕ инхибитори, Т-клетъчни сигнални инхибитори, инхибитори на кинази, инхибитори на металопротеинази, сулфасалацин, азатиоприн, 6меркаптопурини, ангиотензин превръщащи ензимни инхибитори, рецептори на разтворим цитокин, разтворим р55 TNF рецептор, разтворим р75 TNF рецептор, sIL-lRI, sIL-lRII, sIL-6R, sIL-13R, aHTH-P7s, р-селектин гликопротеин лиганд (PSGL), противовъзпалителни цитокини, IL-4, IL-10, IL-13 и TGFp.
94. Метод за инхибиране на активността на човешки IL-12, характеризиращ се с това, че включва встъпване на човешки IL-12 в контакт с антитялото от патентна претенция 44, така че активността на човешкият IL-12 е инхибирана.
95. Метод за инхибиране на активността на човешки IL-12 в човек, страдащ от разстройство, в което активността на IL-12 е вредна, характеризиращ се с това, че включва даването на човека на антитялото от патентна претенция 44, така че активността на човешкия IL-12 в човешкия субект е инхибирана.
96. Методът съгласно патентни претенция 95, характеризиращ се с това, че разстройството е подбрано от групата, състояща се от ревматоиден артрит, остеоартрит, хроничен артрит в младежка възраст, артрит на Лайм, псориатичен артрит, реактивен артрит, спондилоартропатия, систематичен лупус еритематозус, болест на Крон, язвен колит, възпаление на вътрешните органи, инсулин зависим захарен диабет, тироидит, астма, алергични заболявания, псориазис, склеродермален дерматит, атопичен дерматит, графтверсус-хост, отхвърляне на трансплант, органсаркоидоза, атеросклероза, разпространена интраваскуларна коагулация, болест на Кавазаки, болест на Грейв, вефротичен синдром, синдром на хроничната умора, грануломатоза на Вегенер, пурпуреа ХенохШонлайн, микроскопичен васкулит на бъбреците, хроничен активен хепатит, увеит, септичен шок, синдром на токсичния шок, синдром на сепсис, кахексия, инфекциозни заболявания, паразитни заболявания, синдром на придобитата имунна недостатъчност, остър трансверсален миелит, хорея на Хънтинктън, болест на Паркинсон, болест на Алцхаймер, удар, първична билиарна цироза, хемолитична анемия, злокачествени образувания, сърдечна недостатъчност, инфаркт на миокарда.
97. Методът съгласно патентна претенция 95, характеризиращ се с това, че разстройството е болестта на Крон.
98. Методът съгласно патентна претенция 95, характеризиращ се с това, че разстройството е множествена склероза.
99. Методът съгласно патентна претенция 95, характеризиращ се с това, че разстройството е ревматоиден артрит.
100. Метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързваща част от него, за да се придобие предварително определена целева активност, характеризиращ се с това, че включва:
A) осигуряване на родителско антитяло или антигенсвързваща част от него;
Б) избор на позиция за селективна мутагенеза, подбрана от група, включваща НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94.
B) индивидуално мутиране на избраната предпочитана позиция за селективна мутагенеза до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин създава първи панел на мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях;
Г) оценяване активността на първия панел от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, за да се определи, дали мутацията на една позиция за селективна мутагенеза произвежда антитяло или антиген-свързваща част от него с предварително определената целева активност или частична целева активност;
Д) комбиниране последователно по етапи в родителското тяло или антиген-свързваща част от него, на отделни мутации, показали, че имат подобрена активност, за да се образуват комбинирани антитела или антиген-свързващи части от тях.
Е) оценяване на активността на комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях, за да се определи, дали комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях имат предварително определената целева активност или частична целева активност;
Ж) ако етапи г) до е) не доведат до получаване на антитяло или антиген-свързваща част от него, имащо предварително определената целева активност, или доведат до антитяло само с частична активност, по-нататък методът включва мутиране на допълнителни аминокиселинни остатъци, подбрани от групата, включваща Н35, Н50, Н53, Н54, Н95, Н96, Н97, Н98, L30A и L96 до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин се създава втори панел от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях;
3) оценяване активността на втория панел мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, за да се определи дали мутацията на един аминокиселинен остатък, подбран от групата, включваща Н35, Н50, Н53, Н54, Н95, Н96, Н97, Н98, L30A и L96, води до антитяло или антиген-свързваща част от него, имащо предварително определената целева активност или частична активност;
и) комбиниране последователно по етапи в родителското тяло или антиген-свързваща част от него на отделни мутации от етап ж), показали, че имат подобрена активност, за да се образуват комбинирани антитела или антиген-свързващи части от тях.
К) оценяване на активността на комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях, за да се определи, дали комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях имат предварително определената целева активност или частична целева активност;
Л) ако етапи з) до к) не доведат до получаване на антитяло или антиген-свързваща част от него, имащо предварително определената целева активност, или доведат до антитяло само с частична активност, по-нататък методът включва мутиране на допълнителни аминокиселинни остатъци, подбрани от групата, включваща НЗЗВ, Н52В и L31A до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин се създава трети панел от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях;
М) оценяване активността на третия панел мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, за да се определи дали мутацията на един аминокиселинен остатък, подбран от групата, включваща НЗЗВ, Н52В и L31A, е довела до антитяло или антигенсвързваща част от него, имащо предварително определената целева активност или частична активност;
Н) комбиниране последователно по етапи в родителското тяло или антиген-свързваща част от него, на отделни мутации от етап л), показали, че имат подобрена активност, за да се образуват комбинирани антитела или антиген-свързващи части от тях;
| К) оценяване на активността на комбинираните антитела или
I антиген-свързващи части от тях, за да се определи, дали комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях имат предварително определената целева активност като по този начин се получава антитяло или антиген-свързваща част от него с предварително определена целева активност.
101. Метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързваща част от него, характеризиращ се с това, че включва:
A) осигуряване на родителско антитяло или антигенсвързваща част от него;
Б) подбиране на предпочитана позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция в рамките в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, като по този начин се идентифицира избрана предпочитана позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция.
B) индивидуално мутиране на въпросната позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиця до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин създава панел на мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, сравнено с родителското тяло или антиген-свързваща част от него;
Д) повторение на етапи б) до г) за най-малко една друга предпочитана позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция, ако не е получена желаната активност на антитялото;
Е) комбиниране последователно по етапи в родителското тяло от групата, включваща НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н52, Н56, Н58,
L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94.
105. Метод, съгласно патентна претенция 101, характеризиращ се с това, че контактните позиции са подбрани от групата, включваща L50 и L94.
106. Метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързваща част от него, характеризиращ се с това, че включва:
A) осигуряване на родителско антитяло или антигенсвързваща част от него, което е било получено чрез селекция в система на фагово проявяване, но чиято активност по-нататък не е била подобрена чрез мутагенеза във въпросната система на фагово проявяване;
Б) подбиране на предпочитана позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, като по този начин се идентифицира избрана предпочитана позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция.
B) индивидуално мутиране на въпросната позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин създава панел на мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях и експресиране на въпросния панел в система на не-фагово проявяване;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, сравнено с родителското тяло или антиген-свързваща част от него;
Д) повторение на етапи б) до г) за най-малко една друга предпочитана позиция за селективна мутагенеза, контактна или
Мйаай други аминокиселинни остатъка, като по този начин създава панел на мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, сравнено с родителското тяло или антиген-свързваща част от него;
Д) повторение на етапи б) до г) за най-малко една друга предпочитана позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция, ако не е получена желаната активност на антитялото;
Е) комбиниране последователно по етапи в родителското тяло или антиген-свързваща част от него, на отделни мутации, показали, че имат подобрена активност, за да се образуват комбинирани антитела или антиген-свързващи части от тях; и
Ж) оценяване активността на комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях, докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него.
102. Метод, съгласно патентна претенция 101, характеризиращ се с това, че контактните позиции са подбрани от групата, включваща НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96.
103. Метод, съгласно патентна претенция 101, характеризиращ се с това, че хипермутационните позиции са подбрани от групата, включваща НЗО, Н31, Н31В, Н32, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L53hL93.
104. Метод, съгласно патентна претенция 101, характеризиращ се с това, че предпочитаните позиции са подбрани хипермутационна позиция, ако не е получена желаната активност на антитялото;
Е) комбиниране в родителското тяло или антиген-свързваща част от него, на отделни мутации, показали, че имат подобрена активност, за да се образуват комбинирани антитела или антигенсвързващи части от тях; и
Ж) оценяване активността на комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях, сравнено с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него.
107. Метод, съгласно патентна претенция 106, характеризиращ се с това, че контактните позиции са подбрани от групата, включваща НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96.
108. Метод, съгласно патентна претенция 106, характеризиращ се с това, че хипермутационните позиции са подбрани от групата, включваща НЗО, Н31, Н31В, Н32, Н52, Н56, Н58, L30, L31,L32, L53hL93.
109. Метод, съгласно патентна претенция 106, характеризиращ се с това, че предпочитаните позиции за селективна мутагенеза са подбрани от групата, включваща НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94.
110. Метод, съгласно патентна претенция 106, характеризиращ се с това, че контактните позиции са подбрани от групата, включваща L50 и L94.
111. Метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързваща част от него, включващ:
A) осигуряване на родителско антитяло или антигенсвързваща част от него;
Б) подбиране на предпочитана позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, като по този начин се идентифицира избрана предпочитана позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция.
B) индивидуално мутиране на въпросната позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин създава панел на мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях и експресиране на въпросния панел в подходяща експресионна система;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, сравнено с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, като по този начин се идентифицира усилващ активността аминокиселинен остатък;
Д) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, сравнено с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, за най-малко едно друго качество или характеристика, характеризиращ се с това, че качеството или характеристиката е такова, което трябва да бъде запазено в антитялото;
докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност и най-малко едно запазено качество или характеристика, сравнено с родителското антитяло или антигенсвързваща част от него.
112. Метод, съгласно патентна претенция 111, характеризиращ се с това, че контактните позиции са подбрани от групата, включваща НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н1О1, L3O, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96, и характеризиращ се с това, че другото качество или характеристика е подбрана от групата, включваща запазване на некръстосана реактивоспособност с други белтъци, запазване на некръстосана реактивоспособност с други човешки тъкани, запазване на разпознаването на епитоп и на антитяло с близка последователност да тази на родителската линия имуноглобулин.
113. Метод, съгласно патентна претенция 111, характеризиращ се с това, че хипермутационните позиции са подбрани от групата, включваща НЗО, Н31, Н31В, Н32, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L53 и L93 и характеризиращ се с това, че другото качество или характеристика е подбрана от групата, включваща запазване на некръстосана реактивоспособност с други белтъци, запазване на некръстосана реактивоспособност с други човешки тъкани, запазване на разпознаването на епитоп и на антитяло с близка последователност да тази на родителска линия имуноглобулин.
114. Метод, съгласно патентна претенция 111, характеризиращ се с това, че предпочитаните позиции за селективна мутагенеза са подбрани от групата, включваща НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 и L94, и характеризиращ се с това, че другото качество или характеристика е подбрана от групата, включваща запазване на некръстосана реактивоспособност с други белтъци, запазване на некръстосана реактивоспособност с други човешки тъкани, запазване на разпознаването на епитоп и на антитяло с близка последователност да тази на родителска линия имуноглобулин.
115. Метод, съгласно патентна претенция 111, характеризиращ се с това, че контактните позиции са подбрани от групата, включваща L50 и L94, и характеризиращ се с това, че другото качество или характеристика е подбрана от групата, включваща запазване на некръстосана реактивоспособност с други белтъци, запазване на некръстосана реактивоспособност с други човешки тъкани, запазване на разпознаването на епитоп и на антитяло с близка последователност да тази на родителска линия имуноглобулин.
116. Метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързваща част от него, характеризиращ се с това, че включва:
A) осигуряване на рекомбинантно родителско антитяло или антиген-свързваща част от него, което е било получено чрез селекция в система на фагово проявяване, но чиято активност понататък не може да бъде подобрена чрез мутагенеза във въпросната система на фагово проявяване;
Б) подбиране на предпочитана позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, като по този начин се идентифицира избрана предпочитана позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция.
B) индивидуално мутиране на въпросната подбрана позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин се създава панел на мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях и експресиране на въпросния панел в система на не-фагово проявяване;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, сравнено с родителското тяло или антиген-свързваща част от него като по този начин се идентифицира усилващ активността аминокиселинен остатък;
Д) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, сравнено с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, за най-малко едно друго качество или характеристика, характеризиращ се с това, че качеството или характеристиката е такова, което трябва да бъде запазено в антитялото, докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност и най-малко едно запазено качество или характеристика, сравнено с родителското антитяло или антигенсвързваща част от него;
Е) повторение на етапи а) до д) за най-малко една друга предпочитана позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция;
Ж) комбиниране в родителското тяло или антиген-свързваща част от него, на най-малко две отделни усилващи активността аминокиселинни остатъци, показали, че имат подобрена активност, и най-малко едно запазено качество или характеристика, за да се образуват комбинирани антитела или антиген-свързващи части от тях; и
3) оценяване активността на комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях, сравнено с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност и поне едно запазено качество или характеристика, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него.
117. Метод, съгласно патентна претенция 116, характеризиращ се с това, че контактните позиции са подбрани от групата, включваща НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96, и характеризиращ се с това, че другото качество или характеристика е подбрана от групата, включваща запазване на некръстосана реактивоспособност с други белтъци, запазване на некръстосана реактивоспособност с други човешки тъкани, запазване на разпознаването на епитоп и на антитяло с близка последователност да тази на родителската линия имуноглобулин.
118. Метод, съгласно патентна претенция 116, характеризиращ се с това, че хипермутационните позиции са подбрани от групата, включваща НЗО, Н31, Н31В, Н32, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L53 и L93 и характеризиращ се с това, че другото качество или характеристика е подбрана от групата, включваща запазване на некръстосана реактивоспособност с други белтъци, запазване на некръстосана реактивоспособност с други човешки тъкани, запазване на разпознаването на епитоп и на антитяло с близка последователност да тази на родителска линия имуноглобулин.
119. Метод, съгласно патентна претенция 116, характеризиращ се с това, че предпочитаните позиции за селективна мутагенеза са подбрани от групата, включваща НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 и L94, и характеризиращ се с това, че другото качество или характеристика е подбрана от групата, включваща запазване на некръстосана реактивоспособност с други белтъци, запазване на некръстосана реактивоспособност с други човешки тъкани, запазване на разпознаването на епитоп и на антитяло с близка последователност да тази на родителска линия имуноглобулин.
120. Метод, съгласно патентна претенция 116, характеризиращ се с това, че контактните позиции са подбрани от групата, включваща L50 и L94, и характеризиращ се с това, че другото качество или характеристика е подбрана от групата, включваща запазване на некръстосана реактивоспособност с други белтъци, запазване на некръстосана реактивоспособност с други човешки тъкани, запазване на разпознаването на епитоп и на антитяло с близка последователност да тази на родителска линия имуноглобулин.
121. Метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързваща част от него, характеризиращ се с това, че включва:
A) осигуряване на рекомбинантно родителско антитяло или антиген-свързваща част от него, което е било получено чрез селекция в система на фагово проявяване, но чиято активност понататък не може да бъде подобрена чрез мутагенеза във въпросната система на фагово проявяване;
Б) подбиране на контактна или хипермутационна позиция в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, като по този начин се идентифицира избрана контактна или хипермутационна позиция.
B) индивидуално мутиране на въпросната подбрана контактна или хипермутационна позиция до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин се създава панел на мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях и експресиране на въпросния панел в система на не-фагово проявяване;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, сравнено с родителското тяло или антиген-свързваща част от него като по този начин се идентифицира усилващ активността аминокиселинен остатък;
Д) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, сравнено с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, за най-малко едно друго качество или характеристика, характеризиращ се с това, че качеството или характеристиката е такова, което трябва да бъде запазено в антитялото, докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност и най-малко едно запазено качество или характеристика, сравнено с родителското антитяло или антигенсвързваща част от него.
122. Метод, съгласно патентна претенция 121, характеризиращ се с това, че контактните позиции са подбрани от групата, включваща НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96, и характеризиращ се с това, че другото качество или характеристика е подбрана от групата, включваща запазване на некръстосана реактивоспособност с други белтъци, запазване на некръстосана реактивоспособност с други човешки тъкани, запазване на разпознаването на епитоп и на антитяло с близка последователност до тази на родителска линия имуноглобулин.
123. Метод, съгласно патентна претенция 121, характеризиращ се с това, че хипермутационните позиции са подбрани от групата, включваща НЗО, Н31, Н31В, Н32, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L53 и L93 и характеризиращ се с това, че другото качество или характеристика е подбрана от групата, включваща запазване на некръстосана реактивоспособност с други белтъци, запазване на некръстосана реактивоспособност с други човешки тъкани, запазване на разпознаването на епитоп и на антитяло с близка последователност до тази на родителска линия имуноглобулин.
124. Метод, съгласно патентна претенция 121, характеризиращ се с това, че контактните позиции са подбрани от групата, включваща L50 и L94, и характеризиращ се с това, че другото качество или характеристика е подбрана от групата, включваща запазване на некръстосана реактивоспособност с други белтъци, запазване на некръстосана реактивоспособност с други човешки тъкани, запазване на разпознаването на епитоп и на антитяло с близка последователност да тази на родителска линия имуноглобулин.
125. Метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързваща част от него, характеризиращ се с това, че включва:
A) осигуряване на рекомбинантно родителско антитяло или антиген-свързваща част от него, което е било получено чрез селекция в система на фагово проявяване, но чиято активност понататък не може да бъде подобрена чрез мутагенеза във въпросната система на фагово проявяване;
Б) подбиране на предпочитана позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, като по този начин се идентифицира избрана контактна или хипермутационна позиция.
B) индивидуално мутиране на въпросната подбрана предпочитана позиция за селективна мутагенеза, контактна или
38 хипермутационна позиция до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин се създава панел на мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях и експресиране на въпросния панел в система на не-фагово проявяване;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, сравнено с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, като по този начин се идентифицира усилващ активността аминокиселинен остатък;
Д) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, сравнено с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, за най-малко едно друго качество или характеристика, характеризиращ се с това, че качеството или характеристиката е такова, което трябва да бъде запазено в антитялото, докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност и най-малко едно запазено качество или характеристика, сравнено с родителското антитяло или антигенсвързваща част от него;
Е) повторение на етапи а) до д) за най-малко една друга предпочитана позиция за селективна мутагенеза, контактна или хипермутационна позиция;
Ж) комбиниране в родителското тяло или антиген-свързваща част от него, на най-малко две отделни усилващи активността аминокиселинни остатъци, показали, че имат подобрена активност, и най-малко едно запазено качество или характеристика, за да се образуват комбинирани антитела или антиген-свързващи части от тях; и
3) оценяване активността на комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях, сравнено с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност и поне едно запазено качество или характеристика, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него.
126. Метод, съгласно патентна претенция 125, характеризиращ се с това, че контактните позиции са подбрани от групата, включваща НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96, и характеризиращ се с това, че другото качество или характеристика е подбрана от групата, включваща запазване на некръстосана реактивоспособност с други белтъци, запазване на некръстосана реактивоспособност с други човешки тъкани, запазване на разпознаването на епитоп и на антитяло с близка последователност да тази на родителска линия имуноглобулин.
127. Метод, съгласно патентна претенция 125, характеризиращ се с това, че хипермутационните позиции са подбрани от групата, включваща НЗО, Н31, Н31В, Н32, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L53 и L93 и характеризиращ се с това, че другото качество или характеристика е подбрана от групата, включваща запазване на некръстосана реактивоспособност с други белтъци, запазване на некръстосана реактивоспособност с други човешки тъкани, запазване на разпознаването на епитоп и на антитяло с близка последователност да тази на родителска линия имуноглобулин.
128. Метод, съгласно патентна претенция 125, характеризиращ се с това, че предпочитаните позиции за селективна мутагенеза са подбрани от групата, включваща НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н52, Н56, Н58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 и L94, и характеризиращ се с това, че другото качество или характеристика е подбрана от групата, включваща запазване на некръстосана реактивоспособност с други белтъци, запазване на некръстосана реактивоспособност с други човешки тъкани, запазване на разпознаването на епитоп и на антитяло с близка последователност да тази на родителска линия имуноглобулин.
129. Метод, съгласно патентна претенция 125, характеризиращ се с това, че контактните позиции са подбрани от групата, включваща L50 и L94, и характеризиращ се с това, че другото качество или характеристика е подбрана от групата, включваща запазване на некръстосана реактивоспособност с други белтъци, запазване на некръстосана реактивоспособност с други човешки тъкани, запазване на разпознаването на епитоп и на антитяло с близка последователност да тази на родителска линия имуноглобулин.
130. Метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързваща част от него, характеризиращ се с това, че включва:
A) осигуряване на родителско антитяло или антигенсвързваща част от него;
Б) подбиране на аминокиселинен остатък в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация на позиция, различна от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96.
B) индивидуално мутиране на въпросната избрана позиция до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин се създава панел на мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, сравнено с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, като по този начин се идентифицира усилващ активността аминокиселинен остатък;
Д) оценяване панела мутирали антитела или антигенсвързващи части от тях, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него за промени в най-малко едно друго качество или характеристика, докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него
131. Метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързваща част от него, включващ:
A) осигуряване на родителско антитяло или антигенсвързваща част от него;
Б) подбиране на аминокиселинен остатък в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация на позиция, различна от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
B) индивидуално мутиране на въпросната избрана позиция до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин се създава панел на мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, сравнено с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, като по този начин се идентифицира усилващ активността аминокиселинен остатък;
Д) повторение на етапи б) до г) за най-малко една друга предпочитана позиция в рамките на CDR, която нито е избраната в т.
Б) позиция, нито позиция от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
Е) комбиниране в родителското тяло или антиген-свързваща част от него, на най-малко два отделни усилващи активността аминокиселинни остатъка, показали, че имат подобрена активност, за да се образуват комбинирани антитела или антиген-свързващи части от тях; и
Ж) оценяване активността на комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях, сравнено с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него, докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него.
132. Метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързваща част от него, характеризиращ се с това, че включва:
A) осигуряване на рекомбинантно родителско антитяло или антиген-свързваща част от него, което е било получено чрез селекция в система на фагово проявяване, но чиято активност понататък не може да бъде подобрена чрез мутагенеза във въпросната система на фагово проявяване;
Б) подбиране на аминокиселинен остатък в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация на позиция, различна от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и;
B) индивидуално мутиране на въпросната избрана контактна или хипермутационна позиция до най-малко два други «ммт аминокиселинни остатъка, като по този начин се създава панел на мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, и експресиране на въпросния панел в система на не-фагово проявяване;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, сравнено с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, като по този начин се идентифицира усилващ активността аминокиселинен остатък;
Д) оценяване панела мутирали антитела или антигенсвързващи части от тях, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него за промени в най-малко едно друго качество или характеристика, докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него.
133. Метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързваща част от него, характеризиращ се с това, че включва:
A) осигуряване на рекомбинантно родителско антитяло или антиген-свързваща част от него, което е било получено чрез селекция в система на фагово проявяване, но чиято активност понататък не може да бъде подобрена чрез мутагенеза във въпросната система на фагово проявяване;
Б) подбиране на аминокиселинен остатък в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация в позиция, различна от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
B) индивидуално мутиране на въпросната подбрана предпочитана до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин се създава панел на мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях и експресиране на въпросния панел в система на не-фагово проявяване;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, сравнено с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, като по този начин се идентифицира усилващ активността аминокиселинен остатък;
Д) повторение на етапи б) до г) за най-малко една друга предпочитана позиция в рамките на CDR, която нито е избраната в т. Б) позиция, нито позиция от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94;
Е) комбиниране в родителското тяло или антиген-свързваща част от него, на най-малко два отделни усилващи активността аминокиселинни остатъка, показали, че имат подобрена активност, и най-малко едно запазено качество или характеристика, за да се образуват комбинирани антитела или антиген-свързващи части от тях; и
Ж) оценяване активността и други качества или характеристики на комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях с два усилващи активността аминокиселинни остатъка, сравнено с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него.
134. Метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързваща част от него, без да се засягат други качества, характеризиращ се с това, че включва:
A) осигуряване на родителско антитяло или антигенсвързваща част от него;
Б) подбиране на аминокиселинен остатък в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация на позиция, различна от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
B) индивидуално мутиране на въпросната избрана позиция до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин се създава панел на мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, сравнено с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, като по този начин се идентифицира усилващ активността аминокиселинен остатък;
Д) оценяване панела мутирали антитела или антигенсвързващи части от тях, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него за промени в най-малко едно друго качество или характеристика, характеризиращ се с това, че качеството или характеристиката е необходимо да бъдат запазени, докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност и запазено качество или характеристика, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него.
135. Метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързваща част от него, характеризиращ се с това, че включва:
А) осигуряване на родителско антитяло или антигенсвързваща част от него;
Б) подбиране на аминокиселинен остатък в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация на позиция, различна от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
В) индивидуално мутиране на въпросната избрана позиция до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин се създава панел на мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, сравнено с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, като по този начин се идентифицира усилващ активността аминокиселинен остатък;
Д) оценяване панела мутирали антитела или антигенсвързващи части от тях, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него за промени в най-малко едно друго качество или характеристика;
Е) повторение на етапи б) до д) за най-малко една друга CDR позиция, която нито е избраната в т. Б) позиция, нито позиция от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
Ж) комбиниране в родителското тяло или антиген-свързваща част от него, на най-малко два отделни усилващи активността аминокиселинни остатъка, показали, че имат подобрена активност, но без да се засяга поне едно друго качество или характеристика, за да се образуват комбинирани антитела или антиген-свързващи части от тях с поне едно запазено качество или характеристика; и
3) оценяване активността и запазването на поне едно друго качество или характеристика на комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях с два усилващи активността аминокиселинни остатъка, сравнено с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност и поне едно запазено качество или характеристика, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него.
136. Метод за подобряване афинитета на антитяло или антиген-свързваща част от него, характеризиращ се с това, че включва:
A) осигуряване на рекомбинантно родителско антитяло или антиген-свързваща част от него, което е било получено чрез селекция в система на фагово проявяване, но чиято активност понататък не може да бъде подобрена чрез мутагенеза във въпросната система на фагово проявяване;
Б) подбиране на аминокиселинен остатък в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, различна от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
B) индивидуално мутиране на въпросната избрана позиция до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин се създава панел на мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях и експресиране в система на не-фагово проявяване;
Г) оценяване активността на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, сравнено с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, като по този начин се идентифицира усилващ активността аминокиселинен остатък;
Д) оценяване панела мутирали антитела или антигенсвързващи части от тях, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него за промени в най-малко едно друго качество или характеристика, докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него.
137. Метод за подобряване активността на антитяло или антиген-свързваща част от него, характеризиращ се с това, че включва:
A) осигуряване на рекомбинантно родителско антитяло или антиген-свързваща част от него, което е било получено чрез селекция в система на фагово проявяване, но чиято активност понататък не може да бъде подобрена чрез мутагенеза във въпросната система на фагово проявяване;
Б) подбиране на аминокиселинен остатък в рамките на определящ комплементарността регион (CDR) за мутация, различна от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
B) индивидуално мутиране на въпросната избрана позиция до най-малко два други аминокиселинни остатъка, като по този начин се създава панел на мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях и експресиране в система на не-фагово проявяване;
Г) оценяване активността и на запазването на поне едно друго качество или характеристика на панела от мутирани антитела или антиген-свързващи части от тях, сравнено с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, като по този начин се идентифицира усилващ активността аминокиселинен остатък;
Д) повторение на етапи б) до г) за най-малко една друга CDR позиция, която нито е избраната в т. Б) позиция, нито позиция от НЗО, Н31, Н31В, Н32, НЗЗ, Н35, Н50, Н52, Н52А, Н53, Н54, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Н101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
Е) комбиниране в родителското тяло или антиген-свързваща част от него, на най-малко два отделни усилващи активността аминокиселинни остатъка, показали, че имат подобрена активност, но без да се засяга поне едно друго качество или характеристика, за да се образуват комбинирани антитела или антиген-свързващи части;и
Ж) оценяване активността и запазването на поне едно друго качество или характеристика на комбинираните антитела или антиген-свързващи части от тях с два усилващи активността аминокиселинни остатъка, сравнено с родителското тяло или антиген-свързваща част от него, докато се получи антитяло или антиген-свързваща част от него с подобрена активност и поне едно запазено качество или характеристика, сравнено с родителското антитяло или антиген-свързваща част от него.
138. Метод, съгласно патентни претенции 130, 131, 132, 133, 134,135,136 или 137, характеризиращ се с това, че другото качество или характеристика е подбрано от групата, включваща запазване на некръстосана реактивоспособност с други белтъци, запазване на некръстосана реактивоспособност с други човешки тъкани, запазване на разпознаването на епитоп и на антитяло с близка последователност да тази на родителста линия имуноглобулин.
139. Метод за детектиране на човешки IL-12, характеризиращ се с това, че човешкият IL-12 влиза в контакт с антитялото или антиген-свързваща част съгласно всяка от патентните претенции 152, 74-83 и 87, така че да се открие човешки IL-12.
140. Метод, съгласно патентна претенция 139, характеризиращ се с това, че човешкият IL-12 се детектира in vitro.
141. Метод, съгласно патентна претенция 139, характеризиращ се с това, че човешкият IL-12 се детектира в биологична проба за целите на диагностиката.
142. Използване на антитялото или антиген-свързваща част от него, съгласно всяка от патентните претенции 1-52, 74-83 и 87 в терапията.
143. Използване на антитялото или антиген-свързваща част от него, съгласно всяка от патентните претенции 1-52, 74-83 и 87 в получаването на медикамент за третиране на разстройство, при което активността на IL-12 е вредна.
63. У потреба, съгласно патентна претенция 143, характеризираща се с това, че разстройството е подбрано от групата, включваща ревматоиден артрит, остеоартрит, хроничен артрит в младежка възраст, артрит на Лайм, псориатичен артрит, реактивен артрит, спондилоартропатия, систематичен лупус еритематозус, болест на Крон, язвен колит, възпаление на вътрешните органи, инсулин зависим захарен диабет, тироидит, астма, алергични заболявания, псориазис, склеродермален дерматит, атопичен дерматит, графт-версус-хост, отхвърляне на трансплант, органсаркоидоза, атеросклероза, разпространена интраваскуларна коагулация, болест на Кавазаки, болест на Грейв, вефротичен синдром, синдром на хроничната умора, грануломатоза на Вегенер, пурпуреа Хенох-Шонлайн, микроскопичен васкулит на бъбреците, хроничен активен хепатит, увеит, септичен шок, синдром на токсичния шок, синдром на сепсис, кахексия, инфекциозни заболявания, паразитни заболявания, синдром на придобитата имунна недостатъчност, остър трансверсален миелит, хорея на Хънтинктън, болест на Паркинсон, болест на Алцхаймер, удар, първична билиарна цироза, хемолитична анемия, злокачествени образувания, сърдечна недостатъчност, инфаркт на миокарда.
144. Употреба, съгласно патентна претенция 143, характеризираща се с това, че разстройството е болестта на Крон.
145. Употреба, съгласно патентна претенция 143, характеризираща се с това, че разстройството е множествена склероза.
146. Употреба, съгласно патентна претенция 143, характеризираща се с това, че разстройството е ревматоден артрит.
BG106027A 1999-03-25 2001-10-18 Човешки антитела, които свързват човешки il-12 и методи за получаване BG66399B1 (bg)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12660399P 1999-03-25 1999-03-25
PCT/US2000/007946 WO2000056772A1 (en) 1999-03-25 2000-03-24 Human antibodies that bind human il-12 and methods for producing

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG106027A true BG106027A (bg) 2002-06-28
BG66399B1 BG66399B1 (bg) 2013-12-31

Family

ID=22425740

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG106027A BG66399B1 (bg) 1999-03-25 2001-10-18 Човешки антитела, които свързват човешки il-12 и методи за получаване
BG111337A BG111337A (bg) 1999-03-25 2012-11-08 Човешки антитела, които свързват човешки il-12 и методи за получаване

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG111337A BG111337A (bg) 1999-03-25 2012-11-08 Човешки антитела, които свързват човешки il-12 и методи за получаване

Country Status (29)

Country Link
EP (4) EP2168984B1 (bg)
JP (3) JP4841038B2 (bg)
KR (6) KR101222450B1 (bg)
CN (4) CN101921772B (bg)
AR (3) AR043274A1 (bg)
AU (1) AU3921600A (bg)
BG (2) BG66399B1 (bg)
BR (1) BR0009323A (bg)
CA (3) CA2365281C (bg)
CY (2) CY1113326T1 (bg)
CZ (1) CZ303725B6 (bg)
DK (1) DK2168984T3 (bg)
ES (1) ES2390849T3 (bg)
HK (1) HK1142083A1 (bg)
HU (1) HUP0200575A3 (bg)
IL (3) IL145134A0 (bg)
LU (1) LU92159I2 (bg)
MX (1) MXPA01009645A (bg)
MY (2) MY145191A (bg)
NO (3) NO334828B1 (bg)
NZ (5) NZ596723A (bg)
PL (2) PL409839A1 (bg)
PT (1) PT2168984E (bg)
SI (1) SI2168984T1 (bg)
SK (1) SK288082B6 (bg)
TR (5) TR200102715T2 (bg)
TW (5) TWI339209B (bg)
WO (1) WO2000056772A1 (bg)
ZA (1) ZA200107774B (bg)

Families Citing this family (160)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
CZ303725B6 (cs) * 1999-03-25 2013-04-03 Abbott Gmbh & Co. Kg Lidské protilátky, které se vází na lidský IL-12 a zpusoby jejich produkce
US7883704B2 (en) * 1999-03-25 2011-02-08 Abbott Gmbh & Co. Kg Methods for inhibiting the activity of the P40 subunit of human IL-12
TWI335336B (bg) 2000-02-10 2011-01-01 Abbott Gmbh & Co Kg
PE20020132A1 (es) 2000-06-29 2002-03-04 Abbott Lab Anticuerpos de especificidad doble y metodos para la elaboracion y el uso de los mismos
US6902734B2 (en) 2000-08-07 2005-06-07 Centocor, Inc. Anti-IL-12 antibodies and compositions thereof
EP2275446A3 (en) 2001-01-05 2012-08-15 Pfizer Inc. Antibodies to insulin-like growth factor I receptor
CA2460916A1 (en) 2001-10-04 2003-04-10 Laura Carter Methods and compositions for modulating interleukin-21 receptor activity
JP5290489B2 (ja) 2001-11-08 2013-09-18 アッヴィ・バイオセラピューティクス・インコーポレイテッド Ｉｇｇ抗体の安定な液体医薬製剤
WO2003082206A2 (en) * 2002-03-26 2003-10-09 Centocor, Inc. Multiple sclerosis-related immunoglobulin derived proteins, compositions, methods and uses
US20040018195A1 (en) * 2002-03-26 2004-01-29 Griswold Don Edgar Diabetes-related immunoglobulin derived proteins, compositions, methods and uses
US20040033228A1 (en) 2002-08-16 2004-02-19 Hans-Juergen Krause Formulation of human antibodies for treating TNF-alpha associated disorders
NZ539271A (en) 2002-10-30 2008-12-24 Genentech Inc Inhibition of the production of proinflammatory cytokine interleukin-17 (IL-17) by T cells, using an antagonist of interleukin-23 (IL-23)
EP1558645B1 (en) 2002-11-08 2011-07-27 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies in pharmaceutical composition adapted for inhalation
JP2006520584A (ja) 2002-11-08 2006-09-14 アブリンクス エン．ヴェー． 安定化単一ドメイン抗体
US9320792B2 (en) 2002-11-08 2016-04-26 Ablynx N.V. Pulmonary administration of immunoglobulin single variable domains and constructs thereof
US20060034845A1 (en) 2002-11-08 2006-02-16 Karen Silence Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
AU2012202845B2 (en) * 2003-02-10 2014-09-04 Biogen Ma Inc. Immunoglobulin formulation and method of preparation thereof
EP3777880A1 (en) 2003-02-10 2021-02-17 Biogen MA Inc. Immunoglobulin formulation and method of preparation thereof
NZ542306A (en) 2003-03-14 2008-04-30 Wyeth Corp Antibodies against human IL-21 receptor and uses therefor
CA2535071A1 (en) 2003-08-13 2005-02-24 Pfizer Products Inc. Modified human igf-1r antibodies
FR2859725B1 (fr) 2003-09-16 2006-03-10 Neovacs Procede a haut rendement pour l'obtention d'anticorps humains neutralisant l'activite biologique d'une cytokine humaine
US20050100965A1 (en) 2003-11-12 2005-05-12 Tariq Ghayur IL-18 binding proteins
DE10353175A1 (de) 2003-11-14 2005-06-16 Müller-Hermelink, Hans Konrad, Prof. Dr. Humaner monoklonaler Antikörper mit fettsenkender Wirkung
EP1531162A1 (en) 2003-11-14 2005-05-18 Heinz Vollmers Adenocarcinoma specific antibody SAM-6, and uses thereof
ZA200608130B (en) * 2004-03-31 2008-12-31 Genentech Inc Humanized anti-TGF-beta antibodies
ME00226B (me) 2004-07-15 2011-02-10 Medarex Llc Humana anti-ngf neutrališuća antitijela kao selektivni inhibitori ngf signalne kaskade
EA016022B1 (ru) 2004-12-21 2012-01-30 Сентокор, Инк. Выделенное антитело млекопитающего против il-12 и способ изменения его активности
ES2905923T3 (es) 2005-02-08 2022-04-12 Genzyme Corp Anticuerpos de TGFbeta
AR052289A1 (es) 2005-02-14 2007-03-07 Wyeth Corp Anticuerpos para interleucina-17f y otros antagonistas de la senalizacion de il-17f y sus usos
JP2008532493A (ja) 2005-02-14 2008-08-21 ワイス Ｉｌ−１７ｆとｉｌ−１７ｒとの間の相互作用の特性解析
GT200600148A (es) 2005-04-14 2006-11-22 Metodos para el tratamiento y la prevencion de fibrosis
KR20130080058A (ko) * 2005-06-30 2013-07-11 아보트 러보러터리즈 Ｉｌ-12/ｐ40 결합 단백질
EP1915398B1 (en) 2005-07-18 2016-04-20 Amgen Inc. Human anti-b7rp1 neutralizing antibodies
EP2500355A3 (en) 2005-08-19 2012-10-24 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
CA2618482C (en) 2005-08-19 2014-10-07 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
JP2009510002A (ja) 2005-09-30 2009-03-12 アボット ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ウント コンパニー コマンディトゲゼルシャフト 反発誘導分子（ｒｇｍ）タンパク質ファミリーのタンパク質の結合ドメイン、及びその機能的断片、及びそれらの使用
CN102898519B (zh) 2005-11-30 2015-10-28 Abbvie公司 抗淀粉样β蛋白的单克隆抗体及其用途
PL2289909T3 (pl) 2005-11-30 2015-04-30 Abbvie Inc Sposób przeszukiwania, proces oczyszczania niedyfundujących oligomerów Abeta, selektywne przeciwciała przeciw niedyfundującym oligomerom Abeta i sposób wytwarzania tych przeciwciał
TW200744634A (en) 2006-02-21 2007-12-16 Wyeth Corp Methods of using antibodies against human IL-22
TWI417301B (zh) 2006-02-21 2013-12-01 Wyeth Corp 對抗人類介白素-２２（ｉｌ-２２）之抗體及其用途
AU2007351514B2 (en) 2006-09-08 2013-02-21 Abbvie Inc. Interleukin -13 binding proteins
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
US8324350B2 (en) 2006-12-29 2012-12-04 Abbott Laboratories Dual-specific IL-1α/IL-1β antibodies
CA2675233A1 (en) 2007-01-16 2008-07-24 Abbott Laboratories Methods for treating psoriasis
US20100311767A1 (en) 2007-02-27 2010-12-09 Abbott Gmbh & Co. Kg Method for the treatment of amyloidoses
EP2527364A1 (en) * 2007-03-29 2012-11-28 Abbott Laboratories Crystalline anti-human IL-12 antibodies
US20110014117A1 (en) * 2007-06-28 2011-01-20 Schering Corporation Anti-igf1r
US20090181027A1 (en) * 2007-09-28 2009-07-16 Paul Dal Monte Anti-IL-12/23p40 Antibodies, Epitopes, Formulations, Compositions, Methods and Uses
EP2050764A1 (en) * 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
WO2009068630A1 (en) 2007-11-27 2009-06-04 Ablynx N.V. Immunoglobulin constructs
US8962803B2 (en) 2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof
CN102037011A (zh) * 2008-03-18 2011-04-27 雅培制药有限公司 用于治疗银屑病的方法
EP2282769A4 (en) 2008-04-29 2012-04-25 Abbott Lab DUAL VARIABLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND ITS USES
CA2721713C (en) 2008-05-05 2019-07-09 Novimmune Sa Anti-il-17a/il-17f cross-reactive antibodies and methods of use thereof
AU2009245354C1 (en) 2008-05-09 2016-05-19 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies to receptor of advanced glycation end products (RAGE) and uses thereof
PL3085773T3 (pl) * 2008-05-30 2021-01-11 Xbiotech, Inc Zastosowanie przeciwciał il-1 alfa
US9109026B2 (en) 2008-06-03 2015-08-18 Abbvie, Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CA2726087A1 (en) 2008-06-03 2009-12-10 Tariq Ghayur Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CA2728909A1 (en) 2008-07-08 2010-01-14 Abbott Laboratories Prostaglandin e2 binding proteins and uses thereof
KR20110031369A (ko) 2008-07-08 2011-03-25 아보트 러보러터리즈 프로스타글란딘 ｅ2 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
JP6113404B2 (ja) 2008-10-29 2017-04-12 アブリンクス エン．ヴェー． 単一ドメイン抗原結合分子の精製方法
EP4104821A1 (en) 2008-10-29 2022-12-21 Ablynx N.V. Formulations of single domain antigen binding molecules
RU2011126338A (ru) * 2008-11-28 2013-01-10 Эбботт Лэборетриз Стабильные композиции антител и способы их стабилизации
US8030026B2 (en) * 2009-02-24 2011-10-04 Abbott Laboratories Antibodies to troponin I and methods of use thereof
CN105254758A (zh) 2009-03-05 2016-01-20 Abbvie公司 Il-17结合蛋白
MX348013B (es) 2009-05-05 2017-05-23 Novimmune Sa Anticuerpos anti il-17f y metodos de uso de los mismos.
JP5903382B2 (ja) 2009-08-29 2016-04-13 アッヴィ・インコーポレイテッド 治療用ｄｌｌ４結合タンパク質
MX2012002651A (es) 2009-09-01 2012-05-22 Abbott Lab Inmunoglobulinas de dominio variable doble y usos de las mismas.
KR20140048229A (ko) * 2009-09-14 2014-04-23 애브비 인코포레이티드 건선을 치료하는 방법
PE20121531A1 (es) 2009-10-15 2012-12-22 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
WO2011053707A1 (en) 2009-10-31 2011-05-05 Abbott Laboratories Antibodies to receptor for advanced glycation end products (rage) and uses thereof
WO2011051466A1 (en) 2009-11-02 2011-05-05 Novartis Ag Anti-idiotypic fibronectin-based binding molecules and uses thereof
CA2780069C (en) 2009-12-08 2018-07-17 Abbott Gmbh & Co. Kg Monoclonal antibodies against the rgm a protein for use in the treatment of retinal nerve fiber layer degeneration
US9334323B2 (en) 2009-12-09 2016-05-10 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Method of reducing recurrence of multiple sclerosis symptoms in a mammal by administering an anti-repulsive guidance molecule neutralizing antibody
CN105037543B (zh) 2010-03-02 2020-11-03 Abbvie 公司 治疗性dll4结合蛋白
EP2558494B1 (en) 2010-04-15 2018-05-23 AbbVie Inc. Amyloid-beta binding proteins
TWI615405B (zh) 2010-05-14 2018-02-21 艾伯維有限公司 Ｉｌ-１結合蛋白
WO2012006500A2 (en) 2010-07-08 2012-01-12 Abbott Laboratories Monoclonal antibodies against hepatitis c virus core protein
UY33492A (es) 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
CN103298834A (zh) 2010-08-03 2013-09-11 Abbvie公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
US9062101B2 (en) 2010-08-14 2015-06-23 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
ES2910305T3 (es) 2010-08-19 2022-05-12 Zoetis Belgium S A Anticuerpos anti-NGF y su uso
CA2809433A1 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CN103282042B (zh) 2010-09-17 2014-12-10 巴克斯特国际公司 通过具有组氨酸的水性制剂在弱酸性至中性pH稳定的免疫球蛋白
MX2013007332A (es) 2010-12-21 2014-01-23 Abbvie Inc Inmunoglobulinas de dominio variable doble biespecificas de il-1 alfa y beta y su uso.
US20120275996A1 (en) 2010-12-21 2012-11-01 Abbott Laboratories IL-1 Binding Proteins
KR20140061403A (ko) 2011-07-13 2014-05-21 애브비 인코포레이티드 항―ｉｌ―１３ 항체를 이용하여 천식을 치료하기 위한 방법 및 조성물
RU2014120981A (ru) 2011-10-24 2015-12-10 Эббви Инк. Иммунные связывающие агенты против склеростина
CA2855570A1 (en) 2011-12-14 2013-06-20 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Composition and method for the diagnosis and treatment of iron-related disorders
EP2791173B1 (en) * 2011-12-14 2020-07-29 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Composition and method for the diagnosis and treatment of iron-related disorders
EP2797955A2 (en) 2011-12-30 2014-11-05 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins against il-13 and/or il-17
MY194587A (en) 2012-01-27 2022-12-05 Abbvie Inc Composition and method for the diagnosis and treatment of diseases associated with neurite degeneration
US9708401B2 (en) 2012-05-22 2017-07-18 Bristol-Myers Squibb Company IL-17A/F cross-reactive monoclonal antibodies and methods of using the same
EP2859018B1 (en) 2012-06-06 2021-09-22 Zoetis Services LLC Caninized anti-ngf antibodies and methods thereof
TW201402608A (zh) 2012-07-12 2014-01-16 Abbvie Inc Ｉｌ－１結合蛋白質
JP6463268B2 (ja) 2012-09-07 2019-01-30 コヒラス・バイオサイエンシズ・インコーポレイテッド 安定水性アダリムマブ製剤
CN104884472B (zh) 2012-11-01 2021-10-15 艾伯维公司 抗-vegf/dll4双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
US9550986B2 (en) 2012-12-21 2017-01-24 Abbvie Inc. High-throughput antibody humanization
KR102068222B1 (ko) 2013-02-20 2020-01-21 삼성디스플레이 주식회사 증착용 마스크 제조방법
US9458246B2 (en) 2013-03-13 2016-10-04 Amgen Inc. Proteins specific for BAFF and B7RP1
JOP20140087B1 (ar) 2013-03-13 2021-08-17 Amgen Inc بروتينات مخصصة ل baff و b7rp1 وإستخداماتها
CN105228649B (zh) 2013-03-14 2019-01-18 雅培制药有限公司 Hcv抗原-抗体组合测定和方法以及用在其中的组合物
EP3564384A1 (en) 2013-03-14 2019-11-06 Abbott Laboratories Hcv core lipid binding domain monoclonal antibodies
EP2970947A4 (en) 2013-03-14 2016-10-12 Abbott Lab RECOMBINANT HCV NS3 ANTIGENS AND THEIR MUTANTS FOR ENHANCED ANTIBODY DETECTION
WO2014144280A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Abbvie Inc. DUAL SPECIFIC BINDING PROTEINS DIRECTED AGAINST IL-1β AND / OR IL-17
US9469686B2 (en) 2013-03-15 2016-10-18 Abbott Laboratories Anti-GP73 monoclonal antibodies and methods of obtaining the same
CN103275222B (zh) * 2013-05-15 2014-04-16 中山康方生物医药有限公司 一种阻断白介素12 p40功能的单克隆抗体及其编码基因和应用
WO2014197885A2 (en) 2013-06-07 2014-12-11 Duke University Inhibitors of complement factor h
EP3088517B1 (en) 2013-12-26 2023-11-01 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Human anti-il-33 neutralizing monoclonal antibody
US20170209574A1 (en) * 2014-10-03 2017-07-27 Novartis Ag Combination therapies
CN107073113A (zh) * 2014-10-18 2017-08-18 辉瑞大药厂 抗il‑7r抗体组合物
AR102417A1 (es) 2014-11-05 2017-03-01 Lilly Co Eli Anticuerpos biespecíficos anti-tnf- / anti-il-23
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
UA125208C2 (uk) 2015-05-29 2022-02-02 Еббві Інк. Антитіло до cd40
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
US11229702B1 (en) 2015-10-28 2022-01-25 Coherus Biosciences, Inc. High concentration formulations of adalimumab
CR20180365A (es) 2015-12-16 2018-09-28 Amgen Inc PROTEÍNAS DE UNIÓN AL ANTÍGENO BISPECÍFICO DE ANTI-TL1A/ANTI-TNF-a Y SUS USOS
CN105825196B (zh) * 2016-03-28 2020-01-31 联想(北京)有限公司 一种信息处理方法和电子设备
BR112018069776A2 (pt) 2016-03-29 2019-02-05 Janssen Biotech Inc tratamento de psoríase com intervalo de dosagem aumentado de anticorpos anti-il-12 e/ou anti-il-23
US11071782B2 (en) 2016-04-20 2021-07-27 Coherus Biosciences, Inc. Method of filling a container with no headspace
CN118005799A (zh) * 2016-09-23 2024-05-10 马伦戈治疗公司 包含λ轻链和κ轻链的多特异性抗体分子
AU2017339858B2 (en) 2016-10-03 2022-02-17 Abbott Laboratories Improved methods of assessing GFAP status in patient samples
JP7346300B2 (ja) 2017-03-23 2023-09-19 アボット・ラボラトリーズ 早期バイオマーカーであるユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼｌ１を使用する、ヒト対象における外傷性脳損傷の程度の診断及び決定の一助となるための方法
US10877048B2 (en) 2017-04-15 2020-12-29 Abbott Laboratories Methods for aiding in the hyperacute diagnosis and determination of traumatic brain injury in a human subject using early biomarkers
WO2018200823A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Abbott Laboratories Methods for aiding in the hyperacute diagnosis and determination of traumatic brain injury using early biomarkers on at least two samples from the same human subject
US10865238B1 (en) 2017-05-05 2020-12-15 Duke University Complement factor H antibodies
CA3078725A1 (en) 2017-05-25 2018-11-29 Abbott Laboratories Methods for aiding in the determination of whether to perform imaging on a human subject who has sustained or may have sustained an injury to the head using early biomarkers
EP3631467A1 (en) 2017-05-30 2020-04-08 Abbott Laboratories Methods for aiding in diagnosing and evaluating a mild traumatic brain injury in a human subject using cardiac troponin i
CA3068041C (en) 2017-07-03 2024-06-25 Abbott Laboratories Improved methods for measuring ubiquitin carboxy-terminal hydrolase l1 levels in blood
SG11202001786PA (en) 2017-08-31 2020-03-30 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Il-33 antagonist-containing therapeutic agent for endometriosis
TW201922780A (zh) * 2017-09-25 2019-06-16 美商健生生物科技公司 以抗ｉｌ１２／ｉｌ２３抗體治療狼瘡之安全且有效之方法
EP3721234A1 (en) 2017-12-09 2020-10-14 Abbott Laboratories Methods for aiding in diagnosing and evaluating a traumatic brain injury in a human subject using a combination of gfap and uch-l1
CA3067057A1 (en) 2017-12-09 2019-06-13 Abbott Laboratories Methods for aiding in the diagnosis and evaluation of a subject who has sustained an orthopedic injury and that has or may have sustained an injury to the head, such as mild traumatic brain injury (tbi), using glial fibrillary acidic protein (gfap) and/or ubiquitin carboxy-terminal hydrolase l1 (uch-l1)
EP3723781A4 (en) * 2017-12-13 2021-07-21 The Research Foundation for the State University of New York PEPTIDES AND OTHER AGENTS FOR PAIN TREATMENT AND PAIN SENSITIVITY
KR20200130696A (ko) 2018-03-12 2020-11-19 조에티스 서비시즈 엘엘씨 항-ngf 항체 및 이의 방법
JP7421500B2 (ja) 2018-05-18 2024-01-24 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｉｌ１２／ｉｌ２３抗体でループスを治療する安全かつ有効な方法
JP7359845B2 (ja) 2018-09-24 2023-10-11 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｉｌ１２／ｉｌ２３抗体で潰瘍性大腸炎を治療する安全かつ有効な方法
CN111057719B (zh) * 2018-10-17 2022-11-11 南京大学 一种高效的小鼠骨髓来源巨噬细胞的转染方法及其应用
BR112021023295A2 (pt) 2019-05-23 2022-02-08 Janssen Biotech Inc Método de tratamento de doença inflamatória intestinal com uma terapia de combinação de anticorpos para il-23 e tnf-alfa
CN110204736A (zh) * 2019-06-07 2019-09-06 河南师范大学 一步合成不同形貌Pb-MOF金属有机骨架的方法
AU2021215936A1 (en) 2020-02-05 2022-08-25 Larimar Therapeutics, Inc. TAT peptide binding proteins and uses thereof
CN111471655B (zh) * 2020-03-19 2023-07-07 湖州正熙医学检验实验室有限公司 抗人il12/23稳转细胞株及其构建方法和应用
US20220043000A1 (en) 2020-08-04 2022-02-10 Abbott Laboratories Methods and kits for detecting sars-cov-2 protein in a sample
WO2022119841A1 (en) 2020-12-01 2022-06-09 Abbott Laboratories Use of one or more biomarkers to determine traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography scan that is negative for a tbi
WO2023102384A1 (en) 2021-11-30 2023-06-08 Abbott Laboratories Use of one or more biomarkers to determine traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography scan that is negative for a tbi
WO2022147147A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 Abbott Laboratories Methods for determining sars-cov-2 antigen and anti-sars-cov-2 antibody in a sample
CA3216320A1 (en) 2021-05-18 2022-11-24 Abbott Laboratories Methods of evaluating brain injury in a pediatric subject
US20240118279A1 (en) 2021-06-14 2024-04-11 Abbott Laboratories Methods of diagnosing or aiding in diagnosis of brain injury caused by acoustic energy, electromagnetic energy, an over pressurization wave, and/or blast wind
CN113321729B (zh) * 2021-07-01 2022-08-30 东大生物技术(苏州)有限公司 一组il-12单克隆抗体及其医药用途
AU2022339759A1 (en) 2021-08-31 2024-03-07 Abbott Laboratories Methods and systems of diagnosing brain injury
AU2022354059A1 (en) 2021-09-30 2024-03-28 Abbott Laboratories Methods and systems of diagnosing brain injury
AU2022413677A1 (en) 2021-12-17 2024-06-27 Abbott Laboratories Systems and methods for determining uch-l1, gfap, and other biomarkers in blood samples
AU2022423989A1 (en) 2021-12-28 2024-07-04 Abbott Laboratories Use of biomarkers to determine sub-acute traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography (ct) scan that is negative for a tbi or no head ct scan
WO2023150652A1 (en) 2022-02-04 2023-08-10 Abbott Laboratories Lateral flow methods, assays, and devices for detecting the presence or measuring the amount of ubiquitin carboxy-terminal hydrolase l1 and/or glial fibrillary acidic protein in a sample
KR20230171660A (ko) 2022-06-14 2023-12-21 오상민 공기 살균 정화기
WO2024006876A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Abbott Laboratories Magnetic point-of-care systems and assays for determining gfap in biological samples
WO2024059708A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Abbott Laboratories Biomarkers and methods for differentiating between mild and supermild traumatic brain injury

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
DE69032483T2 (de) 1989-10-05 1998-11-26 Optein, Inc., Seattle, Wash. Zellfreie synthese und isolierung von genen und polypeptiden
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
AU665190B2 (en) 1990-07-10 1995-12-21 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
CA2108147C (en) 1991-04-10 2009-01-06 Angray Kang Heterodimeric receptor libraries using phagemids
WO1994004679A1 (en) * 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
US5734014A (en) * 1992-08-11 1998-03-31 Tsumura & Co. Elafin derivative
US5654168A (en) 1994-07-01 1997-08-05 Basf Aktiengesellschaft Tetracycline-inducible transcriptional activator and tetracycline-regulated transcription units
US5464758A (en) 1993-06-14 1995-11-07 Gossen; Manfred Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters
EP0659766A1 (en) * 1993-11-23 1995-06-28 Schering-Plough Human monoclonal antibodies against human cytokines and methods of making and using such antibodies
ZA95960B (en) * 1994-03-14 1995-10-10 Genetics Inst Use of interleukin-12 antagonists in the treatment of autoimmune diseases
EP1978033A3 (en) 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5853697A (en) 1995-10-25 1998-12-29 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health & Human Services Methods of treating established colitis using antibodies against IL-12
AU4959997A (en) * 1996-11-15 1998-06-10 Kennedy Institute Of Rheumatology, The Suppression of tnf alpha and il-12 in therapy
CZ303725B6 (cs) * 1999-03-25 2013-04-03 Abbott Gmbh & Co. Kg Lidské protilátky, které se vází na lidský IL-12 a zpusoby jejich produkce
US9601381B2 (en) 2013-12-05 2017-03-21 Stmicroelectronics (Crolles 2) Sas Method for the formation of a finFET device with epitaxially grown source-drain regions having a reduced leakage path

Also Published As

Publication number Publication date
CA2365281A1 (en) 2000-09-28
AR063780A2 (es) 2009-02-18
CZ20013434A3 (cs) 2002-08-14
SK288082B6 (sk) 2013-06-03
KR20130105766A (ko) 2013-09-25
TWI365193B (en) 2012-06-01
NZ592550A (en) 2012-12-21
EP2168984A1 (en) 2010-03-31
NZ611563A (en) 2015-01-30
MY145191A (en) 2011-12-30
NZ513945A (en) 2001-09-28
CN101066997B (zh) 2013-03-27
PL218748B1 (pl) 2015-01-30
ZA200107774B (en) 2002-12-20
EP2301970A1 (en) 2011-03-30
PL351842A1 (en) 2003-06-16
MY142984A (en) 2011-02-14
TW201300412A (zh) 2013-01-01
JP2014138594A (ja) 2014-07-31
CN1351614A (zh) 2002-05-29
TR200102715T2 (tr) 2002-09-23
NZ596723A (en) 2013-07-26
TW200738749A (en) 2007-10-16
KR101222450B1 (ko) 2013-01-16
JP2012010702A (ja) 2012-01-19
JP2002542770A (ja) 2002-12-17
KR100818066B1 (ko) 2008-03-31
TW201215619A (en) 2012-04-16
AR094125A2 (es) 2015-07-15
HUP0200575A2 (en) 2002-06-29
TWI280980B (en) 2007-05-11
CN100439399C (zh) 2008-12-03
NO2014024I1 (no) 2014-09-18
CN101921772A (zh) 2010-12-22
HK1142083A1 (en) 2010-11-26
EP2168984B1 (en) 2012-08-29
KR20100021669A (ko) 2010-02-25
BG66399B1 (bg) 2013-12-31
NZ529571A (en) 2006-03-31
AU3921600A (en) 2000-10-09
CA2669512A1 (en) 2000-09-28
TR200501367T2 (tr) 2005-09-21
BG111337A (bg) 2013-02-28
KR20060127247A (ko) 2006-12-11
CY2013007I1 (el) 2020-05-29
BR0009323A (pt) 2002-01-08
IL207029A0 (en) 2010-12-30
SK13672001A3 (sk) 2002-03-05
CN101333256A (zh) 2008-12-31
NO20014605D0 (no) 2001-09-21
IL145134A (en) 2010-11-30
MXPA01009645A (es) 2003-09-04
TWI410433B (zh) 2013-10-01
CA2365281C (en) 2009-08-04
WO2000056772A1 (en) 2000-09-28
CZ303725B6 (cs) 2013-04-03
KR20020026416A (ko) 2002-04-10
DK2168984T3 (da) 2012-12-10
NO334828B1 (no) 2014-06-10
NO20131482L (no) 2001-11-26
IL145134A0 (en) 2002-06-30
CN101921772B (zh) 2013-03-27
CA2796140A1 (en) 2000-09-28
PL409839A1 (pl) 2015-03-30
LU92159I2 (fr) 2013-04-29
HUP0200575A3 (en) 2004-11-29
ES2390849T3 (es) 2012-11-19
EP1175446A1 (en) 2002-01-30
TW201043639A (en) 2010-12-16
JP4841038B2 (ja) 2011-12-21
TR200802278T2 (tr) 2008-08-21
KR20120091477A (ko) 2012-08-17
EP2319870A2 (en) 2011-05-11
CN101066997A (zh) 2007-11-07
CY1113326T1 (el) 2016-06-22
NO20014605L (no) 2001-11-26
AR043274A1 (es) 2005-07-27
TR200503572T2 (tr) 2006-04-21
SI2168984T1 (sl) 2012-12-31
TWI339209B (en) 2011-03-21
PT2168984E (pt) 2012-09-24
TR200603997T1 (tr) 2010-01-21
EP2319870A3 (en) 2011-10-26
KR20140094647A (ko) 2014-07-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BG106027A (bg) Човешки антитела, които свързват човешки il-12 и методи за получаване
JP2010513529A (ja) ヒトｉｌ−１２を結合するヒト抗体及び製造方法
RU2497545C2 (ru) Способ лечения псориаза (варианты)
RU2475265C2 (ru) Способы лечения псориаза
AU2010206050B2 (en) Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
AU2013254916A1 (en) Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing