本申请要求于2008年3月18日提交的美国临时申请号61/069,840;于2008年9月8日提交的美国临时申请号61/095,275;和于2009年2月18日提交的美国临时申请号61/207,904的利益,所述美国临时申请各自的完整内容引入本文作为参考。
本申请将ASCII文本文件引入作为参考,所述ASCII文本文件通过名称SequenceListing.txt鉴定,包含785KB数据,于2009年3月10日创建并且以计算机可读形式(CRF)提交。
发明概述
本发明提供了使用结合人IL-12和/或人IL-23的抗体或其抗原结合部分,用于治疗银屑病例如慢性银屑病的方法和组合物。
在一个方面,本发明提供了治疗受试者中的银屑病的方法,所述方法包括给受试者施用抗体或其抗原结合部分,其能够与IL-12和/或IL-23的p40亚单位表位结合,其中在抗体或其抗原结合部分的最初施用后,受试者维持至少PASI 75应答第一个延长的时间段,其中在抗体或其抗原结合部分的施用中断后,受试者显示应答丧失,并且其中在抗体或其抗原结合部分的再施用后,受试者维持至少PASI 75应答第二个延长的时间段,从而治疗受试者中的银屑病。
在一个实施方案中,第一个延长的时间段是至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14周,且优选12周。
在一个实施方案中,抗体的施用中断至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14周,且优选12周。
在一个实施方案中,第二个延长的时间段是至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14周,且优选12周。
在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分每两周施用一次。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分每周施用一次。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分以单剂施用。
在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分以约100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg、210或220mg的剂量施用。
在一个实施方案中,银屑病是慢性银屑病。在一个实施方案中,银屑病是斑状银屑病,例如慢性斑状银屑病。在另一个实施方案中,银屑病是慢性银屑病,例如慢性斑状银屑病。在另外一个实施方案中,银屑病是中度至重度银屑病,例如中度至重度斑状银屑病、中度至重度慢性银屑病、或中度至重度慢性斑状银屑病。在一个实施方案中,受试者已具有银屑病的临床诊断至少6个月。在另一个实施方案中,受试者已具有稳定斑状银屑病至少2个月。
在另一个方面,本发明提供了治疗受试者中的银屑病的方法,所述方法包括给受试者施用单剂的抗体或其抗原结合部分,其能够与IL-12和/或IL-23的p40亚单位表位结合,其中在抗体或其抗原结合部分的施用后达到至少一种药物代谢动力学特征,所述药物代谢动力学特征选自至少约3天的半衰期、小于或等于约4天的Tmax、和至少约40%的生物利用率。
在各种实施方案中,达到至少约2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天的半衰期。
在各种实施方案中,达到小于或等于约1天、2天、3天、4天、5天、6天或更多天的Tmax。
在各种实施方案中,达到至少约0.1%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或更多的生物利用率。
在一个实施方案中,抗体经由静脉内注射进行施用。
在一个实施方案中,抗体经由皮下注射进行施用。
在一个实施方案中,单剂是约0.1-约5.0mg/kg(例如,约0.1-约1.0mg/kg、约0.1-约2.0mg/kg、约0.1-约3.0mg/kg、约0.1-约4.0mg/kg、约1.0-约2.0mg/kg、约1.0-约3.0mg/kg、约1.0-约4.0mg/kg或约1.0-约5.0mg/kg)抗体或其抗原结合部分。
在另一个方面,本发明提供了治疗受试者中的银屑病的方法,所述方法包括给受试者施用抗体或其抗原结合部分,其能够与IL-12和/或IL-23的p40亚单位表位结合,其中在抗体或其抗原结合部分的最初施用后,受试者维持至少PASI 75应答第一个延长的时间段,其中在抗体或其抗原结合部分的施用中断后,受试者显示应答丧失,并且其中在抗体或其抗原结合部分的再施用后,受试者维持至少PASI 50应答第二个延长的时间段,从而治疗受试者中的银屑病。
在一个实施方案中,第一个延长的时间段是至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14周,且优选12周。
在一个实施方案中,抗体的施用中断至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14周,且优选12周。
在一个实施方案中,第二个延长的时间段是至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14周,且优选12周。
在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分每两周施用一次。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分每周施用一次。
在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分以单剂施用。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分以约100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg或200mg的剂量施用。
在一个实施方案中,银屑病是慢性银屑病。
在另一个方面,本发明提供了治疗受试者中的银屑病的方法,所述方法包括给受试者施用抗体或其抗原结合部分,其能够与IL-12和/或IL-23的p40亚单位表位结合,其中在抗体或其抗原结合部分的最初施用后,受试者维持至少PASI 75应答第一个延长的时间段,其中在抗体或其抗原结合部分的施用中断后,受试者显示应答丧失,并且其中在抗体或其抗原结合部分的再施用后,受试者维持清除或最低限度的PGA得分第二个延长的时间段,从而治疗受试者中的银屑病。
在一个实施方案中,第一个延长的时间段是至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14周,且优选12周。
在一个实施方案中,抗体的施用中断至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14周,且优选12周。
在一个实施方案中,第二个延长的时间段是至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14周,且优选12周。
在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分每两周施用一次。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分每周施用一次。
在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分以单剂施用。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分以约100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg或200mg的剂量施用。
在一个实施方案中,银屑病是慢性银屑病。
在另外一个方面,本发明提供了治疗受试者中的银屑病的方法,所述方法包括给受试者施用单剂的抗体或其抗原结合部分,其能够与IL-12和/或IL-23的p40亚单位表位结合,其中在抗体或其抗原结合部分的施用后达到至少一种药物代谢动力学特征,所述药物代谢动力学特征选自约0.15-约150μg/mL(例如,约0.2-约140μg/mL、约0.5-约125μg/mL、约1.0-约100μg/mL、约10-约90μg/mL、约25-约75μg/mL、约35-约60μg/mL、和约40-约50μg/mL)的最大血清浓度(Cmax),和约80-约13,000μg x小时/mL(例如,约100-约12,000μg x小时/mL、约150-约10,000μg x小时/mL、约200-约8,000μg x小时/mL、约400-约6,000μg x小时/mL、约800-约4,000μg x小时/mL、约1000-约2,000μg x小时/mL、约145-约13,000μg x小时/mL、和约80-约5,000μg x小时/mL)的血清浓度-时间曲线下面积(AUC)。
在一个实施方案中,抗体经由静脉内注射进行施用。
在优选实施方案中,Cmax是约1-约150μg/mL(例如,约2-约125μg x小时/mL、约5-约100μg x小时/mL、约10-约80μg x小时/mL、约20-约60μg x小时/mL、约30-约50μg x小时/mL、约1-约20μg x小时/mL、约20-约300μg x小时/mL、和约140-约150μg x小时/mL)。
在优选实施方案中,AUC是约145-约13,000μg x小时/mL(例如,约200-约11,000μg x小时/mL、约500-约10,000μg x小时/mL、约1000-约5,000μg x小时/mL、约2000-约4000μg x小时/mL、约145-约165μg x小时/mL、约500-约600μg x小时/mL、约2000-约3000μg x小时/mL、和约12000-约13000μg x小时/mL)。
在一个实施方案中,抗体经由皮下注射进行施用。
在优选实施方案中,Cmax是约0.15-约20μg/mL(例如,约0.25-约15μg/mL、约0.5-约13μg/mL、约1-约10μg/mL、约2-约8μg/mL、约0.15-约0.3μg/mL、约0.5-约2μg/mL、约2-约4μg/mL、和约10-约15μg/mL)。
在优选实施方案中,AUC是约80-约5000μg x小时/mL(例如,约200-3000μg x小时/mL、约400-2000μg x小时/mL、约500-1500μg x小时/mL、约4000-5000μg x小时/mL、约80-90μg x小时/mL、和约200-300μg x小时/mL)。
在一个实施方案中,单剂是约0.1-约5.0mg/kg(例如,约0.1-约1.0mg/kg、约0.1-约2.0mg/kg、约0.1-约3.0mg/kg、约0.1-约4.0mg/kg、约1.0-约2.0mg/kg、约1.0-约3.0mg/kg、约1.0-约4.0mg/kg、或约1.0-约5.0mg/kg)抗体或其抗原结合部分。
在另一个方面,本发明提供了治疗受试者中的银屑病的方法,所述方法包括给受试者施用单剂的抗体或其抗原结合部分,其能够与IL-12和/或IL-23的p40亚单位表位结合,其中在抗体或其抗原结合部分的静脉内施用后达到至少一种药物代谢动力学特征,所述药物代谢动力学特征选自约30-约600mL/小时(例如,约50-约500mL/小时、约75-约400mL/小时、约100-约300mL/小时、约150-约250mL/小时、约30-约40mL/小时、约40-约60mL/小时、和约500-约600mL/小时)的清除率(CL),和约8-约11L(例如,约8-约10L、约8-约9L、约9-约10L、约10-约11L、和约8.5-9.5L)的分布容积(Vz)。
在相关方面,本发明提供了治疗受试者中的银屑病的方法,所述方法包括给受试者施用单剂的抗体或其抗原结合部分,其能够与IL-12和/或IL-23的p40亚单位表位结合,其中在抗体或其抗原结合部分的皮下施用后达到至少一种药物代谢动力学特征,所述药物代谢动力学特征选自约90-约250mL/小时(例如,约100-约225mL/小时、约125-约200mL/小时、约140-约180mL/小时、约90-约100mL/小时、约150-约200mL/小时、和约200-约250mL/小时)的表观清除率(CL/F),和约23-约67L(例如,约25-约60L、约30-约55L、约35-约50L、约40-约45L、约23-约35L、和约60-约70L)的表观分布容积(V/F)。
在一个实施方案中,单剂是约0.1-约5.0mg/kg(例如,约0.1-约1.0mg/kg、约0.1-约2.0mg/kg、约0.1-约3.0mg/kg、约0.1-约4.0mg/kg、约1.0-约2.0mg/kg、约1.0-约3.0mg/kg.约1.0-约4.0mg/kg、或约1.0-约5.0mg/kg)抗体或其抗原结合部分。
在另一个方面,本发明提供了治疗受试者中的银屑病的方法,所述方法包括给受试者施用抗体或其抗原结合部分,其能够与IL-12和/或IL-23的p40亚单位表位结合,其中在抗体或其抗原结合部分的最初施用后,受试者显示PASI 75应答,其中在抗体或其抗原结合部分的施用中断后,受试者显示应答丧失,并且其中到抗体或其抗原结合部分的再施用后约25天时,受试者显示至少PASI 75应答,从而治疗受试者中的银屑病。
在一个实施方案中,到抗体或其抗原结合部分的再施用后约50天时,受试者显示至少PASI 75应答。在一个实施方案中,到抗体或其抗原结合部分的再施用后约60天时,受试者显示至少PASI 75应答。在一个实施方案中,到抗体或其抗原结合部分的再施用后约30、35、40、45、50、60、65、70、75、80、85、90或更多天时,受试者显示至少PASI 75应答。
在一个实施方案中,抗体的最初施用是至少约12周。
在一个实施方案中,抗体的施用中断至少约4、5、6、7、8、9、10、11或12周。
在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分每两周施用一次。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分每周施用一次。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分以单剂施用。
在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分以约100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg或200mg的剂量施用。
在一个实施方案中,银屑病是慢性银屑病。
在另外一个方面,本发明提供了治疗受试者中的银屑病的方法,所述方法包括给受试者施用抗体或其抗原结合部分,其能够与IL-12和/或IL-23的p40亚单位表位结合,其中在抗体或其抗原结合部分的最初施用后,受试者显示PASI 75应答,其中到抗体或其抗原结合部分的施用中断后约60天时,受试者显示应答丧失,并且其中在抗体或其抗原结合部分的再施用后,受试者达到PASI 75应答,从而治疗受试者中的银屑病。
在一个实施方案中,到抗体或其抗原结合部分的施用中断后约120天时,受试者显示应答丧失。在一个实施方案中,到抗体或其抗原结合部分的施用中断后约180天时,受试者显示应答丧失。在一个实施方案中,到抗体或其抗原结合部分的施用中断后约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多天时,受试者显示应答丧失。
在一个实施方案中,抗体的最初施用是至少约12周。
在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分每两周施用一次。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分每周施用一次。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分以单剂施用。
在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分以约100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg或200mg的剂量施用。
在一个实施方案中,银屑病是慢性银屑病。
在另一个方面,本发明提供了治疗受试者中的银屑病的方法,所述方法包括给受试者施用每两周一次、每周一次或单剂的抗体或其抗原结合部分,其针对人IL-12和/或人IL-23。在相关方面,本发明提供了治疗受试者中的银屑病的方法,所述方法包括步骤:(i)选择患有慢性银屑病的受试者;和(ii)给受试者施用抗体或其抗原结合部分,其能够与IL-12和/或IL-23的p40亚单位表位结合;从而治疗受试者中的慢性银屑病。
在另一个相关方面,本发明提供了治疗受试者中的银屑病的方法,所述方法包括给受试者施用抗体或其抗原结合部分,其能够与IL-12和/或IL-23的p40亚单位表位结合,其中在抗体或其抗原结合部分的施用中断后,受试者维持至少PASI 50应答、至少PASI 75应答或至少PASI 90应答延长的时间段,从而治疗受试者中的银屑病。
在另外一个方面,本发明提供了治疗受试者中的银屑病的方法,所述方法包括给受试者施用抗体或其抗原结合部分,其能够与受试者的IL-12和/或IL-23的p40亚单位表位结合,其中在抗体或其抗原结合部分的最初施用后,受试者维持清除或最低限度的PGA等级延长的时间段,从而治疗受试者中的银屑病。
在再进一步的方面,本发明提供了治疗受试者中的银屑病的方法,所述方法包括给受试者施用抗体或其抗原结合部分,其能够与受试者的IL-12和/或IL-23的p40亚单位表位结合,其中到抗体或其抗原结合部分的最初施用后约8周时,受试者显示改善的PASI得分,从而治疗受试者中的银屑病。在一个实施方案中,到抗体或其抗原结合部分的最初施用后约7周、约6周、约5周、约4周、约3周、约2周或约1周时,受试者显示改善的PASI得分。
在一个实施方案中,抗体施用中断后的延长的时间段是至少约12周。在一个实施方案中,延长的时间段是至少约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24周。在一个实施方案中,抗体施用至少约12周。
在一个实施方案中,在本发明的方法中使用的抗体或其抗原结合部分能够与IL-12的p40亚单位表位结合。
在另一个实施方案中,当p40亚单位与IL-12的p35亚单位结合时,抗体或其抗原结合部分能够与p40亚单位表位结合。在另外一个实施方案中,当p40亚单位与p19亚单位结合时,抗体或其抗原结合部分能够与p40亚单位表位结合。在一个实施方案中,当p40亚单位与IL-12的p35亚单位结合时,并且当p40亚单位与p19亚单位结合时,抗体或其抗原结合部分能够与p40亚单位表位结合。
在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分与IL-12的p40亚单位表位结合,选自Y61和J695的抗体与所述IL-12的p40亚单位表位结合。
在另一个实施方案中,抗体进一步能够与第一种异二聚体结合,并且还能够与第二种异二聚体结合,其中第一种异二聚体包括11-12的p40亚单位和I1-12的p35亚单位,并且其中第二种异二聚体包括IL-12的p40亚单位和p19亚单位。
在进一步的实施方案中,抗体中和第一种异二聚体的活性。在另一个实施方案中,抗体中和第二种异二聚体的活性。在另外一个实施方案中,抗体中和第一种异二聚体和第二种异二聚体的活性。
在进一步的实施方案中,在本发明的方法中使用的抗体或其抗原结合部分在体外PHA测定中以1x10-9M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖,或以1x10-10M或更少的IC50抑制人IFNγ生产。
在一个实施方案中,在本发明的方法中使用的抗体或其抗原结合部分以1x10-10M或更少的Kd或1x10-3s-1或更少的koff速率常数与IL-12的p40亚单位解离,如通过表面等离振子共振测定的。
在一个实施方案中,在本发明的方法中使用的分离抗体或其抗原结合部分是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
在另一个实施方案中,在本发明的方法中使用的抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:25的氨基酸序列的重链CDR3、和包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链CDR3。
在进一步的实施方案中,在本发明的方法中使用的抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链CDR2、和包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链CDR2。
在一个实施方案中,在本发明的方法中使用的抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链CDR1和包括SEQID NO:30的氨基酸序列的轻链CDR1。
在另一个实施方案中,在本发明的方法中使用的抗体或其抗原结合部分能够与包括p40亚单位的白细胞介素结合。在一个实施方案中,白细胞介素包括p40亚单位和p35亚单位,例如白细胞介素是IL-12。在另一个实施方案中,白细胞介素包括p40亚单位和p19亚单位。在另外一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分中和白细胞介素的活性。
在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分与p40亚单位表位结合。
在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分以药物组合物施用于受试者,所述药物组合物包括抗体或其抗原结合部分、和药学上可接受的载体。药物组合物还可以包括另外试剂,例如治疗剂,例如布地奈德(budenoside),表皮生长因子,皮质类固醇,环孢菌素,柳氮磺吡啶,氨基水杨酸盐,6-巯基嘌呤,硫唑嘌呤,甲硝唑,脂肪加氧酶抑制剂,美沙拉秦,奥沙拉嗪,巴柳氮,抗氧化剂,血栓烷抑制剂,IL-1受体拮抗剂,抗IL-1β单克隆抗体,抗IL-6单克隆抗体,生长因子,弹性蛋白酶抑制剂,吡啶基-咪唑化合物,TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF的抗体或激动剂,CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配体的抗体,氨甲蝶呤,环孢菌素,FK506,雷帕霉素,霉酚酸酯,来氟洛米,NSAIDs,布洛芬,皮质类固醇,强的松龙,磷酸二酯酶抑制剂,腺苷激动剂,抗凝剂,补体抑制剂,肾上腺素能药,IRAK、NIK、IKK、p38、MAP激酶抑制剂,IL-1β转换酶抑制剂,TNFα转换酶抑制剂,T细胞发信号抑制剂,金属蛋白酶抑制剂,柳氮磺吡啶,硫唑嘌呤,6-巯基嘌呤,血管紧张素转换酶抑制剂,可溶性细胞因子受体,可溶性p55TNF受体,可溶性p75TNF受体,sIL-1RI,sIL-1RII,sIL-6R,抗炎细胞因子,IL-4,IL-10,IL-11,IL-13和TGFβ。
在另一个实施方案中,施用于受试者的药物组合物中的治疗剂可以选自抗TNF抗体及其抗体片段、TNFR-Ig构建体、TACE抑制剂、PDE4抑制剂、皮质类固醇、布地奈德、地塞米松、柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸、奥沙拉嗪、IL-1β转换酶抑制剂、IL-1ra、酪氨酸激酶抑制剂、6-巯基嘌呤和IL-11。
在另一个实施方案中,治疗剂可以选自皮质类固醇,强的松龙,甲基强的松龙,硫唑嘌呤,环磷酰胺,环孢菌素,氨甲蝶呤,4-氨基吡啶,替扎尼定,干扰素-β1a,干扰素-β1b,共聚物1,高压氧,静脉内免疫球蛋白,克拉屈滨(clabribine),TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF、PDGF的抗体或激动剂,针对CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90或其配体的抗体,氨甲蝶呤,环孢菌素,FK506,雷帕霉素,霉酚酸酯,来氟洛米,NSAIDs,布洛芬,皮质类固醇,强的松龙,磷酸二酯酶抑制剂,腺苷激动剂,抗凝剂,补体抑制剂,肾上腺素能药,IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂,IL-1β转换酶抑制剂,TACE抑制剂,T细胞发信号抑制剂,激酶抑制剂,金属蛋白酶抑制剂,柳氮磺吡啶,硫唑嘌呤,6-巯基嘌呤,血管紧张素转换酶抑制剂,可溶性细胞因子受体,可溶性p55TNF受体,可溶性p75 TNF受体,sIL-1RI,sIL-1RII,sIL-6R,sIL-13R,抗P7s,p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL),抗炎细胞因子,IL-4,IL-10,IL-13和TGFβ。
在一个实施方案中,在本发明的方法中使用的抗体或其抗原结合部分与人IL-12和/或人IL-23结合,并且以1x10-10M或更少的Kd和1x10-3s-1或更少的koff速率常数分别与人IL-12和/或人IL-23解离,如通过表面等离振子共振测定的。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分以1x10-4s-1或更少的koff速率常数与人IL-12和/或人IL-23解离。在另一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分以1x10-5s-1或更少的koff速率常数与人IL-12和/或人IL-23解离。
在另一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分与人IL-12和/或人IL-23结合,并且以1x10-2s-1或更少的koff速率常数分别与人IL-12和/或人IL-23解离,如通过表面等离振子共振测定的。在另外一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分以1x10-3s-1或更少的koff速率常数与人IL-12和/或人IL-23解离。在再进一步的另一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分以1x10-4s-1或更少的koff速率常数与人IL-12和/或人IL-23解离。在另一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分以1x10-5s-1或更少的koff速率常数与人IL-12和/或人IL-23解离。
在另外一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分与人IL-12和/或人IL-23结合,并且以1.34x10-10M或更少的Kd分别与人IL-12和/或人IL-23解离。在另外一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分与人IL-12和/或人IL-23结合,并且以9.74x10-11M或更少的Kd分别与人IL-12和/或人IL-23解离。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分是重组抗体或其抗原结合部分。
在一个实施方案中,在本发明的方法中使用的抗体或其抗原结合部分是中和抗体,例如中和人IL-12和/或人IL-23的活性。在一个实施方案中,中和抗体或其抗原结合部分在体外PHA测定中以1x10-9M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖。在另一个实施方案中,中和抗体或其抗原结合部分在体外PHA测定中以1x10-10M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖。在另外一个实施方案中,中和抗体或其抗原结合部分在体外PHA测定中以1x10-11M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖。在另外一个实施方案中,中和抗体或其抗原结合部分在体外植物凝集素胚细胞增殖测定(PHA测定)中以1x10-7M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖。在另外一个实施方案中,中和抗体或其抗原结合部分在体外PHA测定中以1x10-8M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖。在一个实施方案中,中和抗体或其抗原结合部分以1x10-10M或更少的IC50抑制人IFNγ生产。在另外一个实施方案中,中和抗体或其抗原结合部分以1x10-11M或更少的IC50抑制人IFNγ生产。在另外一个进一步的实施方案中,中和抗体或其抗原结合部分以5x10-12M或更少的IC50抑制人IFNγ生产。
在一个实施方案中,在本发明的方法中使用的抗体或其抗原结合部分
a)在体外PHA测定中以1x10-9M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖;
b)具有包括SEQ ID NO:25的氨基酸序列的重链CDR3;和
c)具有包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链CDR3。在一个实施方案中,抗体进一步具有包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链CDR2;和包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链CDR2。在另外一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分进一步具有包括SEQ IDNO:29的氨基酸序列的重链CDR1;和包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链CDR1。在另外一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分在体外PHA测定中以1x10-10M或更少的IC50进一步抑制植物凝集素胚细胞增殖。在另外一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分在体外PHA测定中以1x10-11M或更少的IC50进一步抑制植物凝集素胚细胞增殖。
在一个实施方案中,在本发明的方法中使用的抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列的重链可变区、和包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中,在本发明的方法中使用的抗体或其抗原结合部分包括选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定区的重链恒定区。在一个实施方案中,抗体重链恒定区是IgG1。在另一个实施方案中,抗体是Fab片段、F(ab′)2片段或单链Fv片段。
在一个实施方案中,在本发明的方法中使用的抗体或其抗原结合部分以1x10-10M或更少的Kd与人IL-12和/或人IL-23解离,并且与人IL-12和/或人IL-23的p40亚单位上的表位结合。
在一个实施方案中,在本发明的方法中使用的抗体或其抗原结合部分是人抗体或其抗原结合部分,其
a)以1x10-3s-1或更少的koff速率常数与人IL-12解离,如通过表面等离振子共振测定的;
b)具有包括SEQ ID NO:25的氨基酸序列的重链CDR3;和
c)具有包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链CDR3。
在另一个实施方案中,在本发明的方法中使用的抗体或其抗原结合部分以1x10-4s-1或更少的koff速率常数与人IL-12解离。在进一步的实施方案中,人抗体或其抗原结合部分以1x10-5s-1或更少的koff速率常数与人IL-12解离。
在一个实施方案中,在本发明的方法中使用的抗体或其抗原结合部分是人抗体或其抗原结合部分,其与人IL-12结合并且包含:
包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链CDR3结构域;和
包括SEQ ID NO:25的氨基酸序列的重链CDR3结构域。
在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分具有轻链可变区(LCVR)且具有重链可变区(HCVR),所述LCVR具有包括SEQ IDNO:26的氨基酸序列的CDR3结构域,所述HCVR具有包括SEQ IDNO:25的氨基酸序列的CDR3结构域。在另一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分包括LCVR和HCVR,所述LCVR进一步具有包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR2结构域,所述HCVR进一步具有包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2结构域。在另外一个实施方案中,LCVR进一步具有包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR1结构域,并且HCVR具有包括SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1结构域。
在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分与人IL-12和/或人IL-23结合,并且是抗体J695(也称为ABT-874),或其抗原结合部分。
在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分与人IL-12和/或人IL-23结合,并且以1.34x10-10M或更少的Kd与人IL-12解离,并且中和人IL-12和/或人IL-23。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分以9.74x10-11M或更少的Kd与人IL-12和/或人IL-23解离。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分在体外PHA测定中以1x10-7M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分在体外PHA测定中以1x10-8M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分在体外PHA测定中以1x10-9M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分在体外PHA测定中以1x10-10M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分在体外PHA测定中以1x10-11M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分以1x10-10M或更少的IC50抑制人IFNγ生产。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分以1x10-11M或更少的IC50抑制人IFNγ生产。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分以5x10-12M或更少的IC50抑制人IFNγ生产。
在一个实施方案中,在本发明的方法中使用的抗体或其抗原结合部分在IL-12或IL-23受体结合测定(RBA)中以1x10-9M或更少的IC50分别抑制IL-12和/或IL-13与其受体结合。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分在IL-12或IL-23受体结合测定(RBA)中以1x10-10M或更少的IC50分别抑制IL-12和/或IL-13与其受体结合。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分在IL-12或IL-23受体结合测定(RBA)中以1x10-11M或更少的IC50分别抑制IL-12和/或IL-13与其受体结合。
发明详述
为了本发明可以更容易理解,首先定义了某些术语。
术语“活性增强氨基酸残基”包括改善抗体活性的氨基酸残基。应当理解活性增强氨基酸残基可以替换在接触、高变或优选选择性诱变位置处的氨基酸残基,并且进一步地,超过一个活性增强氨基酸残基可以存在于一个或多个CDRs内。活性增强氨基酸残基包括改善抗体的结合特异性/亲和力的氨基酸残基,所述抗体例如与人IL-12结合的抗人IL-12抗体。活性增强氨基酸残基也预期包括改善抗体的中和效力的氨基酸残基,所述抗体例如抑制人IL-12的人IL-12抗体。
术语“抗体”包括由4条多肽链(通过二硫键互联的2条重(H)链和2条轻(L)链)组成的免疫球蛋白分子。每条重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由1个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步再分成称为互补性决定区(CDRs)的高变区,由称为构架区(FR)的更保守区域点缀。每个VH和VL由3个CDRs和4个FRs组成,从氨基末端到羧基末端以下述顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在一个实施方案中,在本发明的组合物和方法中使用的抗体是在引入本文作为参考的美国专利号6,914,128中描述的抗体。在另一个实施方案中,在本发明的组合物和方法中使用的抗体是抗体ABT-874(也称为J695;AbbottLaboratories)。
术语抗体的“抗原结合部分”(或“抗体部分”)包括保留与抗原(例如,hIL-12)特异性结合的能力的抗体片段。已显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。在术语抗体的“抗原结合部分”内包括的结合片段例子包括(i)Fab片段,由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段;(ii)F(ab′)2片段,包括在铰链区通过二硫键连接的2个Fab片段的二价片段;(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段;(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段,(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546);和(vi)分离的互补性决定区(CDR)。此外,尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由分开的基因编码,但它们可以使用重组法通过合成接头进行连接,所述合成接头使得它们能够制备为单条蛋白质链,其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv);参见例如,Bird等人(1988)Science 242:423-426;和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此种单链抗体也意欲包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。还包括其他形式的单链抗体,例如双抗体。双抗体是二价、双特异性抗体,其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达,但使用太短而不允许相同链上的2个结构域之间的配对的接头,从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对且产生2个抗原结合部位(参见例如,Holliger,P.,等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448;Poljak,R.J.,等人(1994)Structure2:1121-1123)。再进一步地,抗体或其抗原结合部分可以是更大免疫粘附分子的部分,所述更大免疫粘附分子由抗体或抗体部分与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成。此种免疫粘附分子的例子包括使用链霉抗生物素蛋白核心区以制备四聚scFv分子(Kipriyanov,S.M.,等人(1995)Human Antibodies and Hybridomas6:93-101),以及使用半胱氨酸残基、标记肽和C末端聚组氨酸标记以制备二价且生物素化的scFv分子(Kipriyanov,S.M.,等人(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058)。抗体部分例如Fab和F(ab′)2片段可以使用常规技术由全抗体制备,例如分别对全抗体的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外,抗体、抗体部分和免疫粘附分子可以使用标准重组DNA技术获得,如本文描述的。优选的抗原结合部分是完整结构域或完整结构域对。
术语“回复突变”指其中人抗体的一些或全部体细胞突变的氨基酸由来自同源种系抗体序列的相应种系残基替换的过程。本发明的人抗体的重和轻链序列与VBASE数据库中的种系序列分别比对,以鉴定具有最高同源性的序列。通过使编码此种不同氨基酸的限定核苷酸位置突变,使本发明的人抗体中的差异恢复至种系序列。应就在抗原结合中的直接或间接作用研究因此鉴定为回复突变候选物的每个氨基酸的作用,并且发现在突变后影响人抗体的任何所需特征的任何氨基酸不应包括在最终人抗体中;作为例子,通过选择性诱变法鉴定的活性增强氨基酸将不实施回复突变。为了使实施回复突变的氨基酸数目降到最低,可以保留发现与最接近种系序列不同但与第二个种系序列中的相应氨基酸相同的那些氨基酸位置,前提是在所讨论的氨基酸两侧上,第二个种系序列与本发明的人抗体序列对于至少10、优选12个氨基酸相同且共线。回复突变可以在抗体最佳化的任何阶段时发生;优选地,回复突变在选择性诱变法前或后直接发生。更优选地,回复突变在选择性诱变法前直接发生。
如本文使用的,短语“人白细胞介素12”(本文缩写为hIL-12或IL-12)包括主要由巨噬细胞和树突细胞分泌的人细胞因子。该术语包括异二聚蛋白质,其包含由二硫键连接在一起的35kD亚单位(p35)和40kD亚单位(p40)。异二聚蛋白质被称为“p70亚单位”。人IL-12的结构在例如Kobayashi,等人(1989)J.Exp Med.170:827-845;Seder,等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90:10188-10192;Ling,等人(1995)J.Exp Med.154:116-127;Podlaski,等人(1992)Arch.Biochem.Biophys.294:230-237中进一步描述。术语人IL-12预期包括可以通过标准重组表达法制备的重组人IL-12(rh IL-12)。
术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文中可互换使用。本领域公认的这些术语指编号在抗体或其抗原结合部分的重和轻链可变区中比其他氨基酸残基更可变(即高变)的氨基酸残基的系统(Kabat等人(1971)Ann.NY Acad,Sci.190:382-391,和Kabat,E.A.,等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开号91-3242)。对于重链可变区,高变区对于CDR1从氨基酸位置31到35,对于CDR2从氨基酸位置50到65,且对于CDR3从氨基酸位置95到102。对于轻链可变区,高变区对于CDR1从氨基酸位置24到34,对于CDR2从氨基酸位置50到56,且对于CDR3从氨基酸位置89到97。
Kabat编号在本文中用于指出在本发明的抗体中进行氨基酸修饰的位置。例如,Y61抗IL-12抗体可以在重链CDR1的位置31处从丝氨酸(S)突变成谷氨酸(E)(H31S→E),或在轻链CDR3的位置94处的甘氨酸(G)可以突变成酪氨酸(Y)(L94G→Y)。
术语“人抗体”包括具有与人种系免疫球蛋白序列对应的可变和恒定区的抗体,如由Kabat等人(参见Kabat,等人(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department of Healthand Human Services,NIH公开号91-3242)描述的。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如,通过体外随机或位点专一诱变或通过体内体细胞突变引入的突变),例如在CDRs且特别是CDR3中。突变优选使用本文描述的“选择性诱变法”引入。人抗体可以具有由氨基酸残基替换的至少一个位置,所述氨基酸残基例如不由人种系免疫球蛋白序列编码的活性增强氨基酸残基。人抗体可以具有由并非人种系免疫球蛋白序列部分的氨基酸残基替换的最高达20个位置。在其他实施方案中,替换最高达10、最高达5、最高达3或最高达2个位置。在优选实施方案中,这些替换在如下文详细描述的CDR区内。然而,如本文使用的,术语“人抗体”不意欲包括其中衍生自另一个哺乳动物物种例如小鼠种系的CDR序列已嫁接到人构架序列上的抗体。
短语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的人抗体,例如使用转染到宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体(在下文部分II中进一步描述),从重组、组合人抗体文库中分离的抗体(在下文部分III中进一步描述),从对于人免疫球蛋白基因是转基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体(参见例如,Taylor,L.D.,等人(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295),或通过任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体,所述任何其他方法涉及使人免疫球蛋白基因序列到其他DNA序列的剪接。此种重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区(参见Kabat,E.A.,等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开号91-3242)。然而,在特定实施方案中,对此种重组人抗体实施体外诱变(或,当使用对于人Ig序列转基因的动物时,体内体细胞诱变),并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列,其尽管衍生自且涉及人种系VH和VL序列,但可能并非天然存在于体内人抗体种系谱(repertoire)内。然而,在特定实施方案中,此种重组抗体是选择性诱变法或回复突变或两者的结果。
“分离的抗体”包括基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如,特异性结合hIL-12的分离的抗体基本上不含特异性结合除hIL-12外的抗原的抗体)。特异性结合hIL-12的分离的抗体可以结合来自其他物种的IL-12分子(在下文进一步详细讨论)。此外,分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学制品。
“中和抗体”(或“中和hIL-12活性的抗体”)包括其与hIL-12的结合导致hIL-12生物活性的抑制的抗体。hIL-12生物活性的这种抑制可以通过测量hIL-12生物活性的一种或多种指示剂进行评估,例如在植物凝集素胚细胞增殖测定(PHA)中人植物凝集素胚细胞增殖的抑制,或在人IL-12受体结合测定中受体结合的抑制(参见美国专利号6,914,128的实施例3-干扰素-γ诱导测定)。hIL-12生物活性的这些指示剂可以通过本领域已知的几种标准体外或体内测定中的一种或多种进行评估(参见美国专利号6,914,128的实施例3)。
术语“活性”包括活性例如抗体对于抗原的结合特异性/亲和力,例如与IL-12抗原结合的抗hIL-12抗体,和/或抗体的中和效力,例如其与hIL-12的结合抑制抑制hIL-12生物活性的抗hIL-12抗体,例如PHA胚细胞增殖的抑制或在人IL-12受体结合测定中受体结合的抑制(参见美国专利号6,914,128的实施例3)。
短语“表面等离振子共振”包括允许通过检测生物传感器基质内蛋白质浓度中的改变分析实时生物特异性相互作用的光学现象,例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden andPiscataway,NJ)。关于进一步描述,参见美国专利号6,914,128的实施例5和U.,等人(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26;U.,等人(1991)Biotechniques 11:620-627;Johnsson,B.,等人(1995)J.Mol.Recognit.8:125-131;和Johnnson,B.,等人(1991)Anal.Biochem.198:268-277。
如本文使用的,术语“Koff”意指关于抗体从抗体/抗原复合物解离的解离速率常数。
如本文使用的,术语“Kd”意指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。
短语“核酸分子”包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的,但优选是双链DNA。
如本文提及编码结合hIL-12的抗体或抗体部分(例如,VH、VL、CDR3)包括“分离的抗体”)的核酸中使用的,短语“分离的核酸分子”包括核酸分子,其中编码抗体或抗体部分的核苷酸序列不含编码结合除hIL-12外的抗原的抗体或抗体部分的其他核苷酸序列,所述其他序列可以天然侧接人基因组DNA中的核酸。因此,例如,编码抗IL-12抗体的VH区的本发明分离的核酸不包含编码其他VH区的其他序列,所述其他VH区结合除IL-12外的抗原。短语“分离的核酸分子”也预期包括编码二价、双特异性抗体的序列,例如其中VH和VL区不包含除双抗体序列外的其他序列的双抗体。
术语“载体”包括能够转运它已与之连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”,其指另外DNA区段可以连接到其内的环状双链DNA环。另一种类型的载体是其中另外DNA区段可以连接到病毒基因组内的病毒载体。特定载体能够在它们引入其内的宿主细胞中自主复制(例如,具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。在引入宿主细胞内后,其他载体(例如,非附加型哺乳动物载体)可以整合到宿主细胞的基因组内,并且从而连同宿主基因组一起复制。此外,特定载体能够指导它们与之可操作地连接的基因表达。此种载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简单地,“表达载体”)。一般而言,在重组DNA技术中有用的表达载体通常为质粒的形式。在本文说明书中,“质粒”和“载体”可以互换使用,因为质粒是最常用形式的载体。然而,本发明预期包括发挥等价功能的此种其他形式的表达载体,例如病毒载体(例如,复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
短语“重组宿主细胞”(或简单地,“宿主细胞”)包括重组表达载体已引入其内的细胞。应当理解此种术语不仅意指特定主题细胞而且还指此种细胞的后代。因为由于突变或环境影响,特定修饰可以在后续世代中发生,所以此种后代事实上可能不等同于亲本细胞,但仍包括在如本文使用的术语“宿主细胞”范围内。
如本文使用的,术语“修饰”意指改变抗体或其抗原结合部分中的一个或多个氨基酸。改变可以通过添加、取代或缺失一个或多个位置处的氨基酸产生。改变可以使用已知技术例如PCR诱变产生。
短语“接触位置”包括抗体重链可变区或轻链可变区的CDR1、CDR2或CDR3中的氨基酸位置,其由在26种已知抗体-抗原结构之一中接触抗原的氨基酸占据。如果26种已知解决的抗体-抗原复合物结构的任何一种中的CDR氨基酸接触抗原,那么那个氨基酸可以被视为占据接触位置。接触位置具有比非接触位置由接触抗原的氨基酸占据的更高可能性。优选地,接触位置是包含在26种结构的超过3种中接触抗原的氨基酸的CDR位置(>11.5%)。最优选地,接触位置是包含在25种结构的超过8种中接触抗原的氨基酸的CDR位置(>32%)。
术语“高变位置”包括占据抗体重链可变区或轻链可变区的CDR1、CDR2或CDR3区中的位置的氨基酸残基,其被视为具有关于在抗体的体内亲和力成熟过程中体细胞高变的高频率或可能性。“关于体细胞高变的高频率或可能性”包括残基在抗体的体内亲和力成熟过程中将经历体细胞高变的5-约40%机会的频率或可能性。应当理解在这个所述范围内的所有改变也预期是本发明的部分,例如,5-约30%,例如,5-约15%,例如,15-约30%。
术语“优选选择性诱变位置”包括占据重链可变区或轻链可变区的CDR1、CDR2或CDR3区中的位置的氨基酸残基,其被视为是接触和高变位置。
术语“选择性诱变法”包括通过选择且个别突变在至少一个优选选择性诱变位置、高变和/或接触位置处的CDR氨基酸而改善抗体活性的方法。“选择性突变的”人抗体是包含在使用选择性诱变法选择的位置处的突变的抗体。在另一个实施方案中,选择性诱变法预期提供这样的方法,其优先突变在抗体的重链可变区的CDR1、CDR2或CDR3(下文分别地H1、H2和H3)或轻链可变区的CDR1、CDR2或CDR3(下文分别称为L1、L2和L3)中的所选个别氨基酸残基。氨基酸残基可以选自优选选择性诱变位置、接触位置或高变位置。个别氨基酸基于其在轻或重链可变区中的位置进行选择。应当理解高变位置也可以是接触位置。在一个实施方案中,选择性诱变法是“靶向法”。语言“靶向法”预期包括这样的方法,其以靶向方式优先突变在抗体的重链可变区的CDR1、CDR2或CDR3或轻链可变区的CDR1、CDR2或CDR3中的所选个别氨基酸残基,所述靶向方式例如“逐组(Group-wise)靶向法”或“逐CDR(CDR-wise)靶向法”。在“逐组靶向法”中,靶向特定组中的个别氨基酸残基用于选择性突变,包括组I(包括L3和H3)、II(包括H2和L1)和III(包括L2和H1),组按用于靶向的优先次序列出。在“逐CDR靶向法”中,靶向特定CDRs中的个别氨基酸残基用于选择性突变,其中用于靶向的优先次序如下:H3、L3、H2、L1、H1和L2。例如使所选择的氨基酸残基突变成至少2个其他氨基酸残基,并且测定突变对抗体活性的作用。活性测量为抗体的结合特异性/亲和力、和/或抗体的中和效力中的改变。应当理解选择性诱变法可以用于最佳化衍生自任何来源的任何抗体,包括噬菌体展示、具有人IgG种系基因的转基因动物、从人B细胞中分离出的人抗体。优选地,对不能使用噬菌体展示技术进一步最优化的抗体使用选择性诱变法。应当理解在选择性诱变法前或后,可以对来自任何来源的抗体实施回复突变,包括噬菌体展示、具有人IgG种系基因的转基因动物、从人B细胞中分离出的人抗体。
术语“活性增强氨基酸残基”包括改善抗体活性的氨基酸残基。应当理解活性增强氨基酸残基可以替换在优选选择性诱变位置、接触位置或高变位置处的氨基酸残基,并且进一步地,超过一个活性增强氨基酸残基可以存在于一个或多个CDRs内。活性增强氨基酸残基包括改善抗体的结合特异性/亲和力的氨基酸残基,所述抗体例如与人IL-12结合的抗人IL-12抗体。活性增强氨基酸残基也预期包括改善抗体的中和效力的氨基酸残基,所述抗体例如抑制人IL-12的人IL-12抗体。
术语“Cmax”指在试剂施用后在受试者中观察到的试剂的最大限度或峰血清或血浆浓度。
术语“Tmax”指Cmax在其下发生的时间。
术语“生物利用率”或“F%”指在给定剂型施用后被吸收且进入体循环的剂量分数或百分比。试剂的剂量可以通过任何途径并且优选经由静脉内或皮下注射施用。
如本文使用的,术语“给药”指施用物质(例如,抗-IL-12、抗-IL-23抗体)以达到治疗目的(例如,类风湿性关节炎的治疗)。
如本文使用的,术语“每两周一次给药方案”、“每两周一次给药”和“每两周一次施用”指将物质(例如,抗IL-12、抗IL-23抗体)施用于受试者以达到治疗目的的时间过程,其中时间过程是每隔一周(eow)。每两周一次给药方案不预期包括每周一次给药方案。优选地,每9-19天、更优选地每11-17天、更加优选地每13-15天、且最优选地每14天施用物质。
如在短语“与第二种试剂组合的第一种试剂”中的术语“组合”包括第一种试剂和第二种试剂的共施用,其例如可以在相同药学上可接受的载体中溶解或混合,或施用第一种试剂随后为第二种试剂,或施用第二种试剂随后为第一种试剂。因此,本发明包括组合治疗处理方法和组合药物组合物。
如在短语“伴随治疗处理”中的术语“伴随”包括在第二种试剂的存在下施用试剂。伴随治疗处理法包括其中第一种、第二种、第三种或另外试剂共施用的方法。伴随治疗处理法还包括其中第一种或另外试剂在第二种或另外试剂的存在下施用的方法,其中第二种或另外试剂例如可以已先前施用。伴随治疗处理法可以通过不同行动者逐步执行。例如,一个行动者可以给受试者施用第一种试剂,并且第二个行动者可以给受试者施用第二种试剂,并且施用步骤可以同时或接近同时或在远隔的时间执行,只要第一种试剂(和另外试剂)在第二种试剂(和另外试剂)的存在下后施用。行动者和受试者可以是相同实体(例如,人)。
如本文使用的,术语“联合治疗”指施用2种或更多种治疗物质,例如抗IL-12、抗IL-23抗体和另一种药物。一种或多种其他药物可以在抗IL-12、抗IL-23抗体的施用同时、之前或之后施用。
如本文使用的,术语“试剂盒”指包括本发明的抗IL-12、抗IL-23抗体与之一起施用用于治疗IL-12相关病症的组分的包装产物。试剂盒优选包括容纳试剂盒组分的盒或容器。盒或容器粘贴有标记或食品与药品管理局(Food and Drug Administration)批准的规程。盒或容器容纳本发明的组分,其优选包含在塑料、聚乙烯、聚丙烯、乙烯或丙烯容器内。容器是加盖管或瓶。试剂盒还可以包括关于施用抗IL-12、抗IL-23抗体的说明书。
本发明的各个方面在下文小节中进一步详细描述。
I.结合人IL-12的人抗体
本发明提供了关于使用结合人IL-12的人抗体或其抗原结合部分用于治疗银屑病的方法和组合物。本发明还包括关于使用结合IL-12和IL-23两者的抗体的方法和组合物。优选地,在本发明中使用的人抗体是重组、中和人抗hIL-12抗体。
在一个实施方案中,在本发明中使用的抗体是抗体ABT-874(参见美国专利号6,914,128)。ABT-874是针对白细胞介素12(IL-12)和IL-23的全人抗体。它以极大亲和力与银屑病(Ps)治疗中确认的靶IL-12和IL-23两者共有的p40亚单位结合。
例如通过用hIL-12筛选一个或多个人VL和VH cDNA文库,例如通过如美国专利号6,914,128的实施例1中描述的噬菌体展示技术,可以选择与人IL-12结合的抗体。人VL和VH cDNA文库的筛选最初鉴定了一系列抗IL-12抗体,选择在本文中称为“Joe 9”(或“Joe 9野生型”)的其中一种抗体用于进一步开发。Joe 9是相对低亲和力的人IL-12抗体(例如,约0.1sec-1的Koff),然而对于特异性结合且检测hIL-12有用。这样改善Joe 9抗体的亲和力:进行重和轻链CDRs的诱变,产生“混合和匹配”并且进一步突变的轻和重链可变区实验对象组(panel),导致对于hIL-12具有增加的亲和力的众多另外抗hIL-12抗体(参见美国专利号6,914,128的实施例1,表2(参见与之附着的附录A的表2))和美国专利号6,914,128的图1A-D的序列比对(参见本文的图8A-D)。
在这些抗体中,在本文中称为Y61的人抗hIL-12抗体展示了结合亲和力中的显著改善(例如,约2x10-4sec-1的Koff)。选择Y61抗hIL-12抗体用于进一步通过个别突变在重和轻链CDRs内的特定氨基酸残基而亲和力成熟。基于占据优选选择性诱变位置、接触位置和/或高变位置的氨基酸残基,选择Y61的氨基酸残基用于位点特异突变(选择性诱变法)。在重和轻链CDRs的所选位置处的取代概括显示于美国专利号6,914,128的图2A-2H中(本文的图9A-H)。本发明的优选重组中和抗体在本文中称为J695(也称为ABT-874(AbbottLaboratories),由在Y61轻链CDR2的位置50处从Gly到Tyr的取代,和在Y61轻链CDR3的位置94处从Gly到Tyr的取代得到。
关于从Joe 9野生型到J695的谱系,在本发明中使用的抗IL-12抗体实验对象组的重和轻链可变区的氨基酸序列比对,显示于美国专利号6,914,128的图1A-1D中(本文的图8A-D)。这些序列比对允许鉴定关于从Joe 9到J695的谱系,对于结合hIL-12的本发明抗体的优选重和轻链可变区的共有序列,以及对于CDR3、CDR2和CDR1的共有序列。此外,在US 6,914,128的图2A-2H(本文的图9A-H)中概括的Y61诱变分析允许鉴定关于从Y61到J695的谱系,对于结合hIL-12的重和轻链可变区的共有序列,以及对于结合hIL-12的CDR3、CDR2和CDR1的共有序列,所述谱系包括具有自Y61的修饰然而仍保留良好的hIL-12结合特征的序列。如附着的序列表中通过序列标识符鉴定的本发明的优选CDR、VH和VL序列(包括共有序列)在下文概括。
由Joe 9野生型的亲和力成熟产生的抗体通过表面等离振子共振分析进行功能表征,以测定Kd和Koff速率。产生了一系列抗体,其具有在约0.1s-1-约1x10-5s-1范围内的Koff速率,且更优选约1x10-4s-1-1x10-5s-1或更少的Koff。抗体还在体外就其抑制植物凝集素(PHA)胚细胞增殖的能力进行表征,如美国专利号6,914,128的实施例3中所述。产生了一系列抗体,其具有在约1x10-6M-约1x10-11M范围内、更优选约1x10-10M-1x10-11M或更少的IC50值。
因此,在一个方面,本发明提供了关于使用分离的人抗体或其抗原结合部分的方法和组合物,所述分离的人抗体或其抗原结合部分与人IL-12结合,并且如通过表面等离振子共振测定的,以0.1s-1或更少的Koff速率常数与人IL-12解离,或在体外植物凝集素胚细胞增殖测定(PHA测定)中以1x10-6M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖。在优选实施方案中,分离的人IL-12抗体或其抗原结合部分以1x10-2s-1或更少的Koff速率常数与人IL-12解离,或在体外PHA测定中以1x10-7M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖。在更优选的实施方案中,分离的人IL-12抗体或其抗原结合部分以1x10-3s-1或更少的Koff速率常数与人IL-12解离,或在体外PHA测定中以1x10-8M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖。在更优选的实施方案中,分离的人IL-12抗体或其抗原结合部分以1x10-4s-1或更少的Koff速率常数与人IL-12解离,或在体外PHA测定中以1x10-9M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖。在更优选的实施方案中,分离的人IL-12抗体或其抗原结合部分以1x10-5s-1或更少的Koff速率常数与人IL-12解离,或在体外PHA测定中以1x10-10M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖。在更加优选的实施方案中,分离的人IL-12抗体或其抗原结合部分以1x10-5s-1或更少的Koff速率常数与人IL-12解离,或在体外PHA测定中以1x10-11M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖。
通过表面等离振子共振可以测定IL-12抗体的解离速率常数(Koff)(参见美国专利号6,914,128的实施例5)。一般地,表面等离振子共振分析通过使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor,Piscataway,NJ)的表面等离振子共振(SPR)测量配体(固定在生物传感器基质上的重组人IL-12)和分析物(在溶液中的抗体)之间的实时结合相互作用。表面等离振子分析还可以通过固定分析物(在生物传感器基质上的抗体)且呈递配体(在溶液中的重组IL-12)来执行。IL-12抗体或其抗原结合部分的中和活性可以使用几种合适的体外测定中的一种或多种进行评估(参见美国专利号6,914,128的实施例3)。
本领域众所周知抗体重和轻链CDRs在抗体对于抗原的结合特异性/亲和力中起重要作用。因此,本发明包括具有Joe 9的轻和重链CDRs的人抗体,以及具有已进行修饰以改善抗体的结合特异性/亲和力的CDRs的其他抗体。如美国专利号6,914,128的实施例1中证实的,对于轻和重链CDRs的一系列修饰导致人抗hIL-12抗体的亲和力成熟。结合人IL-12的从Joe 9野生型到J695的一系列人抗体的重和轻链可变区氨基酸序列比对显示于美国专利号6,914,128的图1A-1D中(本文的图8A-D)。关于抗体CDRs的共有序列基序可以由序列比对进行确定。例如,关于从Joe 9到J695谱系的VH CDR3的共有基序包括氨基酸序列:(H/S)-G-S-(H/Y)-D-(N/T/Y)(SEQ ID NO:1),其包括从SEQ ID NO:7中显示的共有HCVR位置95到102的氨基酸。关于VL CDR3的共有基序包括氨基酸序列:Q-(S/T)-Y-(D/E)-(S/R/K)-(S/G/Y)-(L/F/T/S)-(R/S/T/W/H)-(G/P)-(S/T/A/L)-(R/S/M/T/L-V/I/T/M/L)(SEQ ID NO:2),其包括从SEQ ID NO:8中显示的共有LCVR位置89到97的氨基酸。
因此,在另一个方面,本发明提供了包括分离的人抗体或其抗原结合部分的方法和组合物,其具有下述特征:
a)在体外PHA测定中以1x10-6M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖;
b)具有包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR3;和
c)具有包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链CDR3。
在优选实施方案中,抗体进一步包括包含氨基酸序列:F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V-K-G(SEQ ID NO:3)的VH CDR2(其包括从包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的共有HCVR位置50到65的氨基酸),并且进一步包括包含氨基酸序列:(G/Y)-N-(D/S)-(Q/N)-R-P-S(SEQ ID NO:4)的VL CDR2(其包括从包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的共有LCVR位置50到65的氨基酸)。
在另一个优选实施方案中,抗体进一步包括包含氨基酸序列:F-T-F-S-(S/E)-Y-G-M-H(SEQ ID NO:5)的VH CDR1(其包括从包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的共有HCVR位置27到35的氨基酸),并且进一步包括包含氨基酸序列:(S/T)-G-(G/S)-(R/S)-S-N-I-(G/V)-(S/A)-(N/G/Y)-(T/D)-V-(K/H)(SEQ ID NO:6)的VL CDR1(其包括从包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的共有LCVR位置24到34的氨基酸)。
在另外一个优选实施方案中,在本发明中使用的抗体包括包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCVR,和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCVR。
另外的共有基序可以基于对Y61执行的导致J695抗体的突变分析进行确定(在美国专利号6,914,128的图2A-2H中概括;本文的图9A-H)。如通过美国专利号6,914,128的图2A-2H(本文的图9A-H)中显示的图表证实的,Y61重和轻链CDRs的特定残基适合于取代,而不显著损害抗体的hIL-12结合性质。例如,在CDR H1中位置30处由12种不同氨基酸残基的个别取代不显著减少抗体的Koff速率,从而指示该位置适合于由多种不同氨基酸残基的取代。因此,基于突变分析(即在Y61内适合于由其他氨基酸残基取代的位置),确定共有基序。关于重和轻链CDR3s的共有基序分别显示于SEQ ID NOs:9和10中,关于重和轻链CDR2s的共有基序分别显示于SEQ ID NOs:11和12中,并且关于重和轻链CDR1s的共有基序分别显示于SEQ IDNOs:13和14中。关于VH和VL区的共有基序分别显示于SEQ IDNOs:15和16中。
因此,在一个方面,本发明包括分离的人抗体或其抗原结合部分,其具有下述特征:
a)在体外PHA测定中以1x10-9M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖;
b)具有包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR3;和
c)具有包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链CDR3。
在优选实施方案中,抗体进一步包括包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH CDR2,且进一步包括包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL CDR2。
在另一个优选实施方案中,抗体进一步包括包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH CDR1,且进一步包括包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL CDR1。
在另外一个优选实施方案中,在本发明中使用的抗体包括包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HCVR,和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的LCVR。
在本发明中使用的优选抗体,人抗hIL-12抗体Y61,可以通过经由CDR3的PCR诱变的Joe 9野生型亲和力成熟而产生(如美国专利号6,914,128的实施例1中所述)。Y61具有通过表面等离振子共振和通过体外中和测定而测定的改善的特异性/结合亲和力。Y61的重和轻链CDR3s分别显示于SEQ ID NOs:17和18中,Y61的重和轻链CDR2s 分别显示于SEQ ID NOs:19和20中,并且Y61的重和轻链CDR1s分别显示于SEQ ID NOs:21和22中。Y61的VH具有SEQ IDNO:23的氨基酸序列,并且Y61的VL具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列(这些序列也显示于美国专利号6,914,128的图1A-1D(本文的图8A-D)中,与Joe9比对)。
因此,在另一个方面,本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合部分的用途,其
a)在体外PHA测定中以1x10-9M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖;
b)具有包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链CDR3;和
c)具有包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链CDR3。
在优选实施方案中,在本发明的方法和组合物中使用的分离的人抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链CDR2,和包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链CDR2。
在另一个优选实施方案中,在本发明的方法和组合物中使用的分离的人抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链CDR1,和包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链CDR1。
在另外一个优选实施方案中,在本发明的方法和组合物中使用的分离的人抗体或其抗原结合部分包括包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变区,和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变区。
在特定实施方案中,全长抗体包括重链恒定区,例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定区,和如Kabat中描述的其中任何同种异型变体(Kabat,E.A.,等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH公开号91-3242)。优选地,抗体重链恒定区是IgG1重链恒定区。可替代地,抗体部分可以是Fab片段、F(ab’2)片段或单链Fv片段。
Y61的个别残基的修饰导致美国专利号6,914,128的图2A-2H(本文的图9A-H)中显示的抗体实验对象组的产生。每种抗体的特异性/结合亲和力通过表面等离振子共振和/或体外中和测定进行测定。
因此,在另一个方面,本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合部分,其
a)在体外PHA测定中以1x10-9M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖;
b)具有包括选自SEQ ID NO:404-SEQ ID NO:469的氨基酸序列的重链CDR3;和
c)具有包括选自SEQ ID NO:534-SEQ ID NO:579的氨基酸序列的轻链CDR3。
在优选实施方案中,在本发明的方法和组合物中使用的分离的人抗体或其抗原结合部分具有包括选自SEQ ID NO:335-SEQ ID NO:403的氨基酸序列的重链CDR2;和包括选自SEQ ID NO:506-SEQ ID NO:533的氨基酸序列的轻链CDR2。
在另一个优选实施方案中,分离的人抗体或其抗原结合部分具有包括选自SEQ ID NO:288-SEQ ID NO:334的氨基酸序列的重链CDR1;和包括选自SEQ ID NO:470-SEQ ID NO:505的氨基酸序列的轻链CDR1。
在另外一个优选实施方案中,分离的人抗体或其抗原结合部分包括包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变区,和包含SEQ IDNO:24的氨基酸序列的轻链可变区。
在特定实施方案中,全长抗体包括重链恒定区,例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定区,和如Kabat中描述的其中任何同种异型变体(Kabat,E.A.,等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH公开号91-3242)。优选地,抗体重链恒定区是IgG1重链恒定区。可替代地,抗体部分可以是Fab片段、F(ab’2)片段或单链Fv片段。
在本发明中可以使用的特别优选的重组、中和抗体J695,通过抗体Y61的接触和高变氨基酸残基的位点定向诱变而产生(参见美国专利号6,914,128的实施例2和下文部分III)。J695与Y61区别在于在Y61中轻链CDR2位置50处的Gly至Tyr取代和轻链CDR3位置94处的Gly至Tyr取代。J695的重和轻链CDR3s分别显示于SEQ IDNOs:25和26中,J695的重和轻链CDR2s 分别显示于SEQ ID NOs:27和28中,并且J695的重和轻链CDR1s分别显示于SEQ ID NOs:29和30中。J695的VH具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列,并且J695的VL具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列(这些序列也显示于美国专利号6,914,128的图1A-1D(本文的图8A-D)中,与Joe9比对)。
因此,在另一个方面,本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合部分,其a)在体外PHA测定中以1x10-9M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖;b)具有包括SEQ ID NO:25的氨基酸序列的重链CDR3;和c)具有包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链CDR3。
在优选实施方案中,在本发明中使用的分离的人抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链CDR2;和包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链CDR2。
在另一个优选实施方案中,在本发明中使用的分离的人抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链CDR1;和包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链CDR1。
在另外一个优选实施方案中,在本发明中使用的分离的人抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列的重链可变区,和包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链可变区。
在特定实施方案中,全长抗体包括重链恒定区,例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定区,和如Kabat中描述的其中任何同种异型变体(Kabat,E.A.,等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH公开号91-3242)。优选地,抗体重链恒定区是IgG1重链恒定区。可替代地,抗体部分可以是Fab片段、F(ab’2)片段或单链Fv片段。
可以进行关于从Joe 9到J695的谱系或从谱系Y61到J695的抗体CDR3、CDR2和CDR1的优选共有序列中的另外突变,以提供本发明的另外抗IL-12抗体。此种修饰方法可以使用标准分子生物学技术执行,例如通过PCR诱变,靶向轻链和/或重链CDRs中的个别接触或高变氨基酸残基,随后为如本文所述的修饰抗体的动力学和功能分析(例如,美国专利号6,914,128的实施例3中描述的中和测定,以及通过BIAcore分析,如美国专利号6,914,128的实施例5中描述的)。
因此,在另一个方面,本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合部分的用途,其
a)在体外PHA测定中以1x10-6M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖;
b)包括包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQID NO:3的氨基酸序列的重链CDR2和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR1,或其在优选选择性诱变位置或高变位置处具有一个或多个氨基酸取代的突变体,其中与包括包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR2和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR1的抗体相比较,所述突变体具有不超过10倍高的koff速率;和
c)包括包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链CDR3、包含SEQID NO:4的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR1,或其在优选选择性诱变位置或高变位置处具有一个或多个氨基酸取代的突变体,其中与包括包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链CDR3、包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR1的抗体相比较,所述突变体具有不超过10倍高的koff速率。
在另一个方面,本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合部分的用途,其
a)在体外PHA测定中以1x10-9M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖;
b)包括包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQID NO:11的氨基酸序列的重链CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链CDR1,或其在优选选择性诱变位置、接触位置或高变位置处具有一个或多个氨基酸取代的突变体,其中与包括包含SEQ IDNO:9的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链CDR1的抗体相比较,所述突变体具有不超过10倍高的koff速率;和
c)包括包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链CDR3、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1,或其在优选选择性诱变位置、接触位置或高变位置处具有一个或多个氨基酸取代的突变体,其中与包括包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链CDR3、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1的抗体相比较,所述突变体具有不超过10倍高的koff速率。
普通技术人员还应当理解,可以进行对于抗体例如在Y61或J695中的CDR区的另外突变,以提供本发明的另外抗IL-12抗体。此种修饰方法可以使用标准分子生物学技术进行,如上所述。修饰抗体的功能和动力学分析可以分别如美国专利号6,914,128的实施例3和美国专利号6,914,128的实施例5中所述进行。导致J695鉴定的Y61个别残基的修饰显示于美国专利号6,914,128的图2A-2H(本文的图9A-H)中,并且在美国专利号6,914,128的实施例2中描述。
因此,在另一个方面,本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合部分的用途,其
a)在体外PHA测定中以1x10-9M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖;
b)包括包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链CDR2和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链CDR1,或其在优选选择性诱变位置或高变位置处具有一个或多个氨基酸取代的突变体,其中与包括包含SEQ IDNO:17的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链CDR2和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链CDR1的抗体相比较,所述突变体具有不超过10倍高的koff速率;和
c)包括包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链CDR3、包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链CDR1,或其在优选选择性诱变位置或高变位置处具有一个或多个氨基酸取代的突变体,其中与包括包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列的轻链CDR3、包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链CDR1的抗体相比较,所述突变体具有不超过10倍高的koff速率。
在另一个方面,本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合部分的用途,其
a)在体外PHA测定中以1x10-9M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖;
b)包括包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链CDR2和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链CDR1,或其在优选选择性诱变位置或高变位置处具有一个或多个氨基酸取代的突变体,其中与包括包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链CDR2和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链CDR1的抗体相比较,所述突变体具有不超过10倍高的koff速率;和
c)包括包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链CDR3、包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链CDR1,或其在优选选择性诱变位置或高变位置处具有一个或多个氨基酸取代的突变体,其中与包括包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列的轻链CDR3、包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链CDR1的抗体相比较,所述突变体具有不超过10倍高的koff速率。
在另外一个实施方案中,本发明提供了分离的人抗体或其抗原结合部分的用途,其中和人IL-12以及选自下述的至少一种另外灵长类动物IL-12的活性:狒狒IL-12、狨猴IL-12、黑猩猩IL-12、食蟹猴IL-12和猕猴IL-12,但不中和小鼠IL-12的活性。
II.重组人抗体的选择
通过筛选重组组合抗体文库,优选scFv噬菌体展示文库,可以分离可以在本发明中使用的重组人抗体,所述文库使用由衍生自人淋巴细胞的mRNA制备的人VL和VH cDNAs制备。用于鉴定可以在本发明的方法和组合物中使用的抗体的方法在引入本文作为参考的美国专利号6,914,128中描述。用于制备且筛选此种文库的方法是本领域已知的。除用于产生噬菌体展示文库的商购可得试剂盒外(例如,Pharmacia Recombinant Phage Antibody System,目录号27-9400-01;和Stratagene SurfZAPTM噬菌体展示试剂盒,目录号2400612),特别适合用于在产生且筛选抗体展示文库中使用的方法和试剂例子可以在例如下述中发现:Kang等人PCT公开号WO 92/18619;Winter等人PCT公开号WO 92/20791;Breitling等人PCT公开号WO 93/01288;McCafferty等人PCT公开号WO 92/01047;Garrard等人PCT公开号WO 92/09690;Fuchs等人(1991)Bio/Technology 9:1370-1372;Hay等人(1992)Hum Antibod Hybridomas 3:81-85;Huse等人(1989)Science246:1275-1281;McCafferty等人,Nature(1990)348:552-554;Griffiths等人(1993)EMBO J 12:725-734;Hawkins等人(1992)J Mol Biol226:889-896;Clackson等人(1991)Nature 352:624-628;Gram等人(1992)PNAS89:3576-3580;Garrad等人(1991)Bio/Technology9:1373-1377;Hoogenboom等人(1991)Nuc Acid Res 19:4133-4137;和Barbas等人(1991)PNAS 88:7978-7982。
在这种方法中使用的抗体文库优选是由人VL和VH cDNAs制备的scFv文库。scFv抗体文库优选使用重组人IL-12作为抗原进行筛选,以选择具有针对IL-12的结合活性的人重和轻链序列。为了选择对于IL-12的p35亚单位或p70异二聚体特异的抗体,在过量游离p40亚单位的存在下执行筛选测定。亚单位优先可以例如通过微Friguet滴定(micro-Friguet titration)进行测定,如美国专利号6,914,128的实施例1中描述的。
一旦选择了最初人VL和VH区段,就执行“混合和匹配”实验,其中所选VL和VH区段的不同对就IL-12结合进行筛选,以选择优选的VL/VH对组合(参见美国专利号6,914,128的实施例1)。另外,为了进一步改善关于hIL-12结合的亲和力和/或降低关于其的解离速率常数,以类似于负责天然免疫应答过程中抗体的亲和力成熟的体内体细胞突变方法的方法,可以随机突变优选VL/VH对的VL和VH区段,优选在VH和/或VL的CDR3区内。通过使用分别与VH CDR3或VL CDR3互补的PCR引物扩增VH和VL区,可以实现这种体外亲和力成熟,所述引物已在特定位置处用4种核苷酸碱基的随机混合物“掺加(spike)”,从而使得所得到的PCR产物编码随机突变已引入VH和/或VL CDR3区内的VH和VL区段。这些随机突变的VH和VL区段可以就与hIL-12的结合进行再选择和再筛选,并且可以选择显示对于IL-12结合的高亲和力和低解离速率的序列。美国专利号6,914,128的附录A的表2(参见与之附着的附录A的表2)显示由于体外亲和力成熟产生的抗体,其显示改变的结合特异性/亲和力。
在从重组免疫球蛋白展示文库中选择、分离和筛选本发明的抗hIL-12抗体后,编码所选抗体的核酸可以从一种或多种噬菌体颗粒中(例如,从噬菌体基因组中)回收,并且通过标准重组DNA技术亚克隆到其他表达载体内。若需要,则核酸可以进一步处理,以制备本发明的其他抗体形式(例如,与编码另外免疫球蛋白结构域例如另外恒定区的核酸连接)。为了表达通过筛选组合文库分离的重组人抗体,将编码抗体的DNA克隆到重组表达载体内,并且引入哺乳动物宿主细胞内,如下文部分IV中进一步详细描述的。
关于通过噬菌体展示技术选择人IL-12结合抗体的方法,和通过CDR区的随机或位点定向诱变的所选抗体亲和力成熟,在美国专利号6,914,128的实施例1中进一步详细描述。
如美国专利号6,914,128的实施例1中描述的,人VL和VH cDNA文库的筛选鉴定了一系列抗IL-12抗体,其中选择Joe 9抗体用于进一步开发。Joe 9的重链可变区与选自VBASE数据库的重链种系序列的比较揭示Joe 9类似于COS-3种系序列。COS-3属于种系序列的VH3家族。
VH3家族是人VH种系谱(repertoire)的部分,基于核苷酸序列同源性,其分组成7个家族VH1-VH7(Tomlinson等人(1992)J.Mol.Biol.,227,776-798和Cook等人(1995)Immunology Today,16,237-242)。VH3家族包含最高数目的成员,并且对种系谱作出最大贡献。对于任何给定人VH3-种系抗体序列,在整个VH3家族内的氨基酸序列同一性是高的(参见例如,Tomlinson等人(1992)J.Mol.Biol.,227,776-798和Cook等人(1995)Immunology Today,16,237-242)。在VH3家族的任何2个种系VH序列之间的氨基酸序列同一性范围为约100个VH残基中的69到98残基(即,在任何2个种系VH序列之间69-98%的氨基酸序列同源性)。对于大多数种系序列对,存在至少80个或更多个相同氨基酸残基(即,至少80%的氨基酸序列同源性)。在VH3家族成员之间的高程度氨基酸序列同源性导致存在于VH链CDR和构架区中的关键位点处的特定氨基酸残基。这些氨基酸残基对CDRs赋予结构特征。
抗体结构的研究已显示基于占据CDR和构架区中的特定位置的关键氨基酸残基,CDR构象可以分组成规范CDR结构家族。因此,在具有含相同关键氨基酸残基的规范结构的不同抗体中存在相似的局部CDR构象(Chothia等人(1987)J.Mol.Biol.,196,901-917和Chothia等人(1989)Nature,342,877-883)。在VH3家族内,在关于CDR1和CDR2规范结构的关键位点处存在氨基酸残基同一性的保守性(Chothia等人(1992)J.Mol.Biol.,227,799-817)。
COS-3种系VH基因是VH3家族成员,并且是3-30(DP-49)种系VH等位基因的变体。COS-3在仅5个位置处不同于Joe9 VH氨基酸序列。在Joe9 VH和COS-3之间以及在Joe9 VH和其他VH3家族成员之间的高程度氨基酸序列同源性还赋予高程度CDR结构同源性(Chothia等人(1992)J.Mol.Biol.,227,799-817;Chothia等人(1987)J.Mol.Biol.,196,901-917和Chothia等人(1989)Nature,342,877-883)。
技术人员将理解基于与Joe 9的高氨基酸序列和规范结构相似性,其他VH3家族成员也可以用于产生与人IL-12结合的抗体。这可以例如通过下述进行:通过链改组技术选择合适VL(Winter等人(1994)Annual Rev.Immunol.,12,433-55),或将来自啮齿类动物或其他人抗体的CDRs包括来自本发明抗体的CDRs嫁接到VH3家族构架上。
基于核苷酸序列同源性,人Vλ种系谱分组成10个家族(Williams等人(1996)J.Mol.Biol.,264,220-232)。Joe 9的轻链可变区与选自VBASE数据库的轻链种系序列的比较揭示Joe 9类似于DPL8λ种系。Joe9VL在仅4个构架位置处不同于DPL8序列,并且与其他Vλ1家族成员的构架序列高度同源。基于与Joe 9的高氨基酸序列同源性和规范结构相似性,其他Vλ1家族成员也可以用于产生与人IL-12结合的抗体。这可以例如通过下述进行:通过链改组技术选择合适VH(Winter等人同上,或将来自啮齿类动物或其他人抗体的CDRs包括来自本发明抗体的CDRs嫁接到Vλ1家族构架上。
本发明的方法意欲包括与hIL-12结合的重组抗体,其包括衍生自种系序列的VH3家族成员的重链可变区,和衍生自种系序列的Vλ1家族成员的轻链可变区。此外,技术人员将认识到VH3家族重链序列的任何成员都可以与Vλ1家族轻链序列的任何成员组合。
技术人员还将认识到导致种系氨基酸序列中的改变的DNA序列多态性可以存在于群体(例如,人群体)内。由于天然等位基因变异,种系序列中的此种遗传多态性可以存在于群体内的个体中。此种天然等位基因变异一般可以导致基因核苷酸序列中的1-5%差异。作为天然等位基因变异结果的种系序列中的任何和所有此种核苷酸变异和所得到的氨基酸多态性预期在本发明的范围内。
因此,在一个方面,本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合部分,其具有下述特征:
a)与人IL-12结合,并且如通过表面等离振子共振测定的,以0.1s-1或更少的Koff速率常数与人IL-12解离,或在体外植物凝集素胚细胞增殖测定(PHA测定)中以1x10-6M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖。
b)具有包括选自VH3种系家族成员的氨基酸序列的重链可变区,其中所述重链可变区具有在含活性增强氨基酸残基的接触或高变位置处的突变。
c)具有包括选自Vλ1种系家族成员的氨基酸序列的轻链可变区,其中所述轻链可变区具有在含活性增强氨基酸残基的优选选择性诱变位置、接触或高变位置处的突变。
在优选实施方案中,分离的人抗体或抗原结合具有在重链CDR3中的突变。在另一个优选实施方案中,分离的人抗体或抗原结合具有在轻链CDR3中的突变。在另一个优选实施方案中,分离的人抗体或抗原结合具有在重链CDR2中的突变。在另一个优选实施方案中,分离的人抗体或抗原结合具有在轻链CDR2中的突变。在另一个优选实施方案中,分离的人抗体或抗原结合具有在重链CDR1中的突变。在另一个优选实施方案中,分离的人抗体或抗原结合具有在轻链CDR1中的突变。
普通技术人员将认识到基于在VH3种系家族成员之间、或在轻链Vλ1种系家族成员之间的高氨基酸序列相似性,对于种系序列的突变可以提供与人IL-12结合的另外抗体。美国专利号6,914,128的表1(参见与之附着的附录A的表1)显示VH3家族成员的种系序列,并且证实在家族成员内的显著序列同源性。在美国专利号6,914,128的表1(参见与之附着的附录A的表1)中还显示的是Vλ1家族成员的种系序列。提供Joe 9的重和轻链序列作为比较。关于VH3或Vλ1家族成员种系序列的突变可以例如在与本发明抗体中进行的那些相同的氨基酸位置处(例如,Joe 9中的突变)进行。修饰可以使用标准分子生物学技术执行,例如通过PCR诱变,靶向种系序列中的个别氨基酸残基,随后为如本文所述的修饰抗体的动力学和功能分析(例如,美国专利号6,914,128的实施例3中描述的中和测定,以及通过BIAcore分析,如美国专利号6,914,128的实施例5中描述的)。
因此,在一个方面,本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合部分的用途,其具有下述特征:
a)具有包括选自SEQ ID NOs:595-667的氨基酸序列的重链可变区,其中所述重链可变区具有在含活性增强氨基酸残基的优选选择性诱变位置、接触或高变位置处的突变。
b)具有包括选自SEQ ID NOs:669-675的氨基酸序列的轻链可变区,其中所述轻链可变区具有在含活性增强氨基酸残基的优选选择性诱变位置、接触或高变位置处的突变。
普通技术人员将认识到基于在Joe 9和COS-3重链种系序列之间、和在Joe 9和DPL8λ种系序列之间的高氨基酸序列相似性,对于这些种系序列CDR区的其他突变可以提供与人IL-12结合的另外抗体。此种修饰方法可以如上所述使用标准分子生物学技术执行。
因此,在一个方面,本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合部分的用途,其具有下述特征:
a)与人IL-12结合,并且如通过表面等离振子共振测定的,以0.1s-1或更少的koff速率常数与人IL-12解离,或在体外植物凝集素胚细胞增殖测定(PHA测定)中以1x10-6M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖。
b)具有包括COS-3种系氨基酸序列的重链可变区,其中所述重链可变区具有在含活性增强氨基酸残基的优选选择性诱变位置、接触或高变位置处的突变。
c)具有包括DPL8种系氨基酸序列的轻链可变区,其中所述轻链可变区具有在含活性增强氨基酸残基的优选选择性诱变位置、接触或高变位置处的突变。
由于占据轻和重链可变区中的CDR和构架区中的关键位点的特定氨基酸残基,在这些区域处赋予结构特征。具体地,对CDR2和CDR1区实施规范结构分类法。因为在家族成员之间存在高程度氨基酸序列同源性,所以这些规范特征存在于家族成员之间。技术人员将认识到在赋予这些规范结构的氨基酸残基处的修饰将产生与IL-12结合的另外抗体。修饰可以如上所述使用标准分子生物学技术执行。
因此,在另一个方面,本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合部分的用途,其具有下述特征:
a)与人IL-12结合,并且如通过表面等离振子共振测定的,以0.1s-1或更少的koff速率常数与人IL-12解离,或在体外植物凝集素胚细胞增殖测定(PHA测定)中以1x10-6M或更少的IC50抑制植物凝集素胚细胞增殖。
b)具有包括选自VH3种系家族成员的氨基酸序列的重链可变区,其中所述重链可变区包括在结构上与来自其他VH3种系家族成员的CDR2s类似的CDR2,和在结构上与来自其他VH3种系家族成员的CDR1s类似的CDR1,并且其中所述重链可变区具有在含活性增强氨基酸残基的优选选择性诱变位置、接触或高变位置处的突变;
c)具有包括选自Vλ1种系家族成员的氨基酸序列的轻链可变区,其中所述轻链可变区包括在结构上与来自其他Vλ1种系家族成员的CDR2s类似的CDR2,和在结构上与来自其他Vλ1种系家族成员的CDR1s类似的CDR1,并且其中所述轻链可变区具有在含活性增强氨基酸残基的优选选择性诱变位置、接触或高变位置处的突变。
在本发明中使用的重组人抗体具有与选自VBASE数据库的人种系免疫球蛋白序列同源的可变和恒定区。对于重组人抗体的突变(例如,通过随机诱变或PCR诱变)导致不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸。同样,衍生自人供体的重组抗体文库将包含由于在B细胞发育过程中发生的体细胞突变的天然过程而与其相应种系序列不同的抗体序列。应当指出如果通过PCR扩增获得的“种系”序列编码在构架区中与真实种系构型的氨基酸差异(即与真实种系序列相比较,在扩增的序列中的差异),那么可能希望使这些氨基酸差异回复至真实种系序列(即,构架残基“回复突变”成种系构型)。因此,本发明可以任选包括回复突变步骤。为了完成这点,使由种系(如VBASE数据库中作为例子发现的)编码的重和轻链氨基酸序列首先与突变的免疫球蛋白重和轻链构架氨基酸序列比较,以鉴定在突变的免疫球蛋白构架序列中不同于最接近的种系序列的氨基酸残基。随后,使突变的免疫球蛋白序列的合适核苷酸回复突变,以与种系序列对应,其中使用遗传密码测定应进行何种核苷酸改变。突变的免疫球蛋白构架序列的诱变通过标准方法执行,例如PCR介导的诱变(其中将突变的核苷酸引入PCR引物内,从而使得PCR产物包含突变)或位点定向诱变。应就在抗原结合中的直接或间接作用研究鉴定为回复突变候选物的每个氨基酸的作用,并且发现在突变后影响人抗体的任何所需特征的任何氨基酸不应包括在最终人抗体中;作为例子,通过选择性诱变法鉴定的活性增强氨基酸将不实施回复突变。测定起因于诱变的抗体特征的测定可以包括ELISA、竞争ELISA、体外和体内中和测定和/或(参见例如,美国专利号6,914,128的实施例3)用来自各种来源(包括人、灵长类动物和/或其他物种)的组织切片的免疫组织化学。
为了使实施回复突变的氨基酸数目降到最低,可以保留发现与最接近种系序列不同但与第二个种系序列中的相应氨基酸相同的那些氨基酸位置,前提是在所讨论的氨基酸两侧上,第二个种系序列与本发明的人抗体序列对于至少10、优选12个氨基酸相同且共线。这将确保在用本发明的人抗体治疗的受试者中通过专职抗原呈递细胞呈递给免疫系统的任何肽表位将不是外来的,而等同于自身抗原,即由第二个种系序列编码的免疫球蛋白。回复突变可以在抗体最佳化的任何阶段时发生;优选地,回复突变在选择性诱变法前或后直接发生。更优选地,回复突变在选择性诱变法前直接发生。
III.对优选选择性诱变位置、接触和/或高变位置的修饰
一般地,具有改善的亲和力的抗体选择可以使用噬菌体展示方法进行,如上文部分II和引入本文作为参考的美国专利号6,914,128中描述的。这可以通过随机突变CDR残基组合且产生包含不同序列的抗体的大型文库来实现。然而,为了这些选择方法起作用,抗体-抗原反应必须趋于平衡,以允许随着时间过去更高亲和力抗体与抗原的优先结合。在达到特定水平的所获得的亲和力(即,抗体Y61的那种)后,当噬菌体展示方法用于改善所选抗IL-12抗体的亲和力时,不能测定将允许平衡确立的选择条件(推测是由于抗原和噬菌体颗粒之间的另外非特异性相互作用)。因此,具有甚至更高亲和力的抗体不能通过噬菌体展示方法进行选择。因此,对于至少特定抗体或抗原,噬菌体展示方法在其选择具有高度改善的结合特异性/亲和力的抗体的能力中有限。因此,确立了称为选择性诱变法的方法,其不需要抗体的噬菌体展示亲和力成熟,以克服这种局限性,并且由本发明提供。尽管开发了这种选择性诱变法以克服使用噬菌体展示系统的局限性,但应当指出这种方法也可以与噬菌体展示系统一起使用。此外,选择性诱变法可以用于改善任何抗体的活性。
为了改善抗体的活性(例如,亲和力或中和活性),人们理想地意欲使重和轻链中的每一个CDR位置突变成每一个其他可能的氨基酸残基。然而,因为平均起来在抗体内存在70个CDR位置,所以此种方法将是非常耗时且劳力密集的。因此,本发明的方法允许人们通过突变重和/或轻链CDRs内的仅特定选择的残基来改善抗体的活性。此外,本发明的方法允许抗体活性中的改善,而不影响抗体的其他所需性质。
基于一级序列或其在可变区内的位置不能精确预测测定抗体可变区的哪些氨基酸残基与抗原接触。然而,通过Kabat等人进行的来自具有不同特异性的抗体的序列比对已鉴定CDRs为在抗体中显著不同的可变区内的局部区域(Kabat等人(1971)Ann.NY Acad,Sci.190:382-393,,Kabat,E.A.,等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH公开号91-3242)。结构研究已显示抗原结合表面通过CDRs中存在的氨基酸残基形成。也已知在CDR外的其他氨基酸残基起结构作用或直接与抗原结合有关。因此,对于每个抗原-抗体对,在CDRs内和外的氨基酸残基可能都是重要的。
通过Tomlison等人的序列比对研究鉴定了在重和轻链CDR1和CDR2中以及在κ链CDR3的部分中的许多位置,其是体细胞突变的频繁位点。(Tomlison等人(1996)J.Mol.Biol.256:813-817)。具体地,位置H31、H31B、H33、H33B、H52B、H56、H58、L30、L31、L31A、L50、L53、L91、L92、L93和L94鉴定为关于体细胞突变的频繁位点。然而,这种分析排除了重要的重链CDR3区和轻链CDR3的部分,其已知位于抗体结合位点中心,且潜在提供与抗原的重要相互作用。此外,Tomlison等人提出单独体细胞多样性不必定预测特定氨基酸在抗原结合中的作用,并且暗示接触抗原的保守氨基酸残基、和不接触抗原的多样氨基酸残基。这个结论得到关于体细胞突变对抗体亲和力的作用的突变研究进一步支持(Sharon,(1990),PNAS,87:4814-7)。高亲和力抗对偶氮苯胂酸盐(Ars)抗体中的19个体细胞突变同时用其相应种系残基替换,产生在活性中具有200倍丧失的抗Ars抗体的种系形式。抗Ars抗体的全部亲和力可以通过仅恢复19个体细胞突变中的3个而重新获得,从而证实不促成抗原结合活性的许多体细胞突变是可以允许的。
结果可以部分通过抗体多样性自身的性质加以解释。幼B细胞最初可以产生识别许多自身或非自身抗原的低亲和力抗体。此外,抗体可能经历引起自身反应性的亲和力成熟序列变异的过程。此种低亲和力抗体的高变可以用来取消自身免疫性(“负选择”),并且增加对于外来抗原的亲和力。因此,大量抗体的一级和结构数据的分析不提供预测下述的方法:(1)在亲和力成熟过程与降低针对不希望有的抗原的亲和力的过程相比较中体细胞高变位点的作用,或(2)给定氨基酸如何有助于特定抗原-抗体对的性质。
处理特定氨基酸残基在抗原识别中的作用的其他尝试通过分析抗原-抗体复合物的许多晶体结构来进行(MacCallum等人(1996)J.Mol.Biol.262:732-745)。指出了位于CDRs内和外的位置的潜在作用。在26种分析的结构的超过10种中与抗原结合有关的CDRs中的位置包括重链中的H31、H33、H50、H52、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98和H100,以及轻链中的L30A、L32、L91、L92、L93、L94、L96。然而,该作者注意到使用这些和其他结构数据预测抗原接触可能过度预测(over predict)接触位置和对其预测不足(underpredict),从而导致可能必须对不同抗原应用不同策略的思考。
Pini等人描述了随机化大型噬菌体展示文库中的抗体CDR序列中的多个残基,以快速增加抗体亲和力(Pini等人(1998)J.Biol Chem.273:21769-21776)。然而,由Pini等人讨论的高亲和力抗体具有总共8个位置中的突变,并且哪些改变是改善抗体亲和力绝对需要的简化(reductionary)分析变得不实际,这是由于对于最小数目的所需氨基酸待测试大量可能组合。
此外,随机化多重残基可能不必定保存抗体的其他所需性质。抗体的所需性质或特征是领域公认的,并且包括例如与其他蛋白质或人组织的非交叉反应性的保存,和改善中和效力的接近于人种系免疫球蛋白序列的抗体序列的保存。其他所需性质或特征包括保存物种交叉反应性的能力,保存表位特异性的能力,和保存蛋白质在哺乳动物细胞中的高表达水平的能力。所需性质或特征可以使用领域公认的技术进行观察或测量,所述技术包括但不限于ELISA、竞争ELISA、体外和体内中和测定(参见例如,美国专利号6,914,128的实施例3)、用来自不同来源(包括人、灵长类动物或需要时可以是其他物种)的组织切片的免疫组织化学,和使用瞬时表达或稳定表达研究在哺乳动物细胞中的表达。
此外,Pini等人的方法可能引入比改善亲和力实际所需的最低限度数目更多的改变,并且可能导致触发在人受试者中的抗人抗体(HAMA)形成的抗体。此外,如其他地方讨论的,如本文证实的噬菌体展示或其他相关方法包括核糖体展示可能不适当地影响达到抗体和抗原之间的特定亲和力,并且达到平衡所需的条件可能不在合理时间范围内确立,这是由于另外的相互作用包括与其他噬菌体或核糖体组分和抗原的相互作用。
根据上文讨论的参考文献的教导,普通技术人员可以收集关于抗体多样性起源的有趣科学信息。然而,本发明提供了用于增加特定抗原-抗体对的抗体亲和力,同时保存抗体的其他相关特点或所需特征的方法。当考虑对特定抗体赋予许多不同特征包括抗原结合的愿望时,这是特别重要的。
如果起始抗体具有需要保留的所需性质或特征,那么选择性诱变法可以是用于保存这些所需性质同时改善抗体活性的最佳策略。例如,在Y61的诱变中,目标是增加对于hIL-12的亲和力,且改善抗体的中和效力同时保存所需性质。Y61的所需性质包括(1)与其他蛋白质或人组织的非交叉反应性的保存,(2)精细表位特异性的保存,即优选在p70(p40/p35)异二聚体的背景中识别p40表位,从而预防来自游离可溶性p40的结合干扰,和(3)具有重和轻链氨基酸序列的抗体产生,所述重和轻链氨基酸序列尽可能接近其各自的种系免疫球蛋白序列。
在一个实施方案中,本发明的方法提供了选择性诱变法作为用于保存抗体的所需性质或特征同时改善亲和力和/或中和效力的策略。术语“选择性诱变法”如上定义,并且包括个别突变所选氨基酸残基的方法。待突变的氨基酸残基可以首先选自优选选择性诱变位置,随后选自接触位置,并且随后选自高变位置。个别所选位置可以突变成至少2个其他氨基酸残基,并且测定突变对抗体的所需性质和抗体活性中的改善的作用。
选择性诱变法包括步骤:
按次序1)优选选择性诱变位置;2)接触位置;3)高变位置选择候选位置,并且基于位置在抗体重和轻链可变区内的定位分级位置(CDR3优选超过CDR2优选超过CDR1);
按分级次序使候选优选选择性诱变位置、高变和/或接触位置个别突变成所有可能的其他氨基酸残基,且分析个别突变对抗体活性的作用,以测定活性增强氨基酸残基;
若需要,则进行个别活性增强氨基酸残基的逐步组合,且分析各种组合对抗体活性的作用;选择具有活性增强氨基酸残基的突变抗体,并且基于就其免疫原性潜力而言的氨基酸取代位置和同一性分级突变抗体。最高等级给予包括这样的氨基酸序列的突变抗体,所述氨基酸序列几乎等同于在种系数据库中描述的可变区序列,或具有与其他人抗体可比较的氨基酸序列。较低等级给予包含这样的氨基酸取代的突变抗体,所述氨基酸取代在种系序列或其他人抗体序列中很少遇到。最低等级给予具有这样的氨基酸取代的突变抗体,所述氨基酸取代在种系序列或其他人抗体序列中尚未遇到。如上所述,包括位于CDR3中的至少一个活性增强氨基酸残基的突变抗体优选超过CDR2,所述CDR2优选超过CDR1。重链可变区的CDRs优选超过轻链可变区的那些。
突变抗体还可以就活性中的改善进行研究,例如当与其相应亲本抗体相比较时。例如通过中和测定可以测定突变抗体活性中的改善,或通过经由表面等离振子共振分析可以测定突变抗体结合特异性/亲和力中的改善(参见美国专利号6,914,128的实施例3)。优选地,活性中的改善可以为亲本抗体的至少2-20倍高。活性中的改善可以是亲本抗体的至少“x1”至“x2”倍高,其中“x1”和“x2”是2-20之间且包括2和20的整数,包括在所述范围内的范围,例如2-15,例如5-10。
还可以研究具有活性增强氨基酸残基的突变抗体,以测定在突变后至少一种其他所需性质是否已保留。例如,对于抗hIL-12抗体测试:(1)与其他蛋白质或人组织的非交叉反应性的保存,(2)表位识别的保存,即优选在p70(p40/p35)异二聚体的背景中识别p40表位,从而预防来自游离可溶性p40的结合干扰,和(3)具有重和轻链氨基酸序列的抗体产生,所述重和轻链氨基酸序列尽可能接近其各自的种系免疫球蛋白序列,并且基于与种系序列的差异数目,测定何种将最不可能引发人免疫应答。相同观察可以对具有超过一个活性增强氨基酸残基的抗体进行,例如至少2个或至少3个活性增强氨基酸残基,以测定所需性质或特征的保留是否已发生。
在Y61诱变中使用“选择性诱变法”的例子在下文描述。个别突变H31S→E、L50→Y或L94G→Y各自改善抗体的中和活性。然而,当测试组合克隆时,组合克隆H31S→E+L50→Y+L94G→Y的活性不优于L50→Y+L94G→Y(J695)。因此,使CDR1位置31处的种系氨基酸残基Ser改变成Glu对于J695超过Y61的改善的活性是不必要的。因此,选择性诱变法鉴定了有助于最终活性的最低限度改变数目,从而减少最终抗体的免疫原性潜力且保存抗体的其他所需性质。
通过选择的诱变法产生的编码VH和VL的分离的DNA可以转变成全长抗体链基因,至Fab片段基因如至scFv基因,如部分IV中描述的。对于通过选择的诱变法产生的VH和VL区的表达,可以将编码重和轻链的表达载体转染到多种宿主细胞内,如部分IV中详细描述的。优选宿主细胞包括原核宿主细胞,例如大肠杆菌(E coli),或真核宿主细胞,例如酵母细胞,例如啤酒糖酵母(S.cerevisae)。最优选的真核宿主细胞是在部分IV中详细描述的哺乳动物宿主细胞。
选择性诱变法提供产生具有改善的活性的抗体的方法,无需通过其他方法的抗体先前亲和力成熟。选择性诱变法提供产生具有改善的亲和力的抗体的方法,所述抗体已实施回复突变。选择性诱变法还提供改善亲和力成熟抗体的活性的方法。
技术人员将认识到选择性诱变法可以用于本领域已知的标准抗体操作技术中。例子包括但不限于,CDR嫁接的抗体、嵌合抗体、scFv片段、全长抗体的Fab片段、和来自其他来源例如转基因小鼠的人抗体。
抗体的快速大规模突变分析包括使用核糖体展示技术的体外转录和翻译(参见例如Hanes等人,(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94:4937-4942;Dall Acqua等人(1998)Curr.Opin.Struc.Biol.8:443-450;He等人,(1997)Nucleic Acid Res.25:5132-5134),以及授予Kawasaki的美国专利号5,643,768和5,658,754。选择性诱变法还提供产生具有改善的活性的抗体的方法,所述抗体可以使用核糖体展示技术进行选择。
在本发明的方法中,抗体或其抗原结合部分通过改变HCVR和/或LCVR的CDRs中的个别位置进行进一步修饰。尽管这些修饰可以在噬菌体展示的抗体中进行,但该方法是有利的,因为它可以用在其他类型的宿主系统中表达的抗体执行,所述其他类型的宿主系统例如细菌、酵母或哺乳动物细胞表达系统。在CDRs内选择用于修饰的个别位置基于作为接触和/或高变位置的位置。
如本文定义的优选接触位置和高变位置显示于美国专利号6,914,128的表3中(参见美国专利号6,914,128的附录A和与之附着的附录A的表3),并且其依照本发明的方法的修饰在美国专利号6,914,128的实施例2中详细描述。优选接触位置选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96。优选高变位置选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93。更优选的氨基酸位置(被称为“优选选择性诱变位置”)是接触和高变位置,并且选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94。特别优选的接触位置选自L50和L94。优选的活性增强氨基酸残基替换位于选自下述的位置处的氨基酸残基:H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96。更优选的活性增强氨基酸残基替换位于位置H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94处的氨基酸残基。具体地,优选的活性增强氨基酸残基替换位于选自L50和L94的位置处的氨基酸残基。
一般而言,本发明的方法涉及选择在目的亲本抗体或其抗原结合部分的重或轻链CDR内特别优选的选择性诱变位置、接触和/或高变位置,随机诱变个别位置(例如,通过使用诱变寡核苷酸的遗传方法,以产生修饰的抗体的“小型文库(mini-library)”),或使位置突变成特定所需氨基酸,以鉴定活性增强氨基酸残基,表达且纯化修饰的抗体(例如,在非噬菌体展示宿主系统中),测量修饰的抗体对于抗原的活性(例如,通过经由BIAcore分析测量koff速率),需要时对于其他CDR位置重复这些步骤,并且使显示具有改善的活性的个别突变组合,且测试一种或多种组合是否产生具有比亲本抗体或其抗原结合部分甚至更大活性(例如,亲和力或中和效力)的抗体。
因此,在一个实施方案中,本发明提供了用于改善抗体或其抗原结合部分活性的方法,其包括:
a)提供亲本抗体或其抗原结合部分;
b)按次序选择在互补性决定区(CDR)内的1)优选选择性诱变位置、2)接触位置或3)高变位置用于突变,从而鉴定所选的优选选择性诱变位置、接触位置或高变位置;
c)使所述所选的优选选择性诱变位置、接触或高变位置个别突变成至少2个其他氨基酸残基,以从而生成突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组;
d)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,评估突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组的活性;
e)任选地,对于至少一个其他优选选择性诱变位置、接触或高变位置,重复步骤a)到d);
f)在亲本抗体或其抗原结合部分中组合显示具有改善的活性的个别突变,以形成组合抗体或其抗原结合部分;和
g)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,评估组合抗体或其抗原结合部分的活性;
直至获得相对于亲本抗体或其抗原结合部分,具有改善的活性的抗体或其抗原结合部分。优选地,所选择的一种或多种抗体具有改善的活性,而不丧失如上所述亲本抗体的至少一种所需特征或性质或保留如上所述亲本抗体的至少一种所需特征或性质。所需特征或性质可以通过普通技术人员使用领域公认技术进行测量或观察。
优选的接触位置选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96。优选的高变位置选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93。更优选的优选选择性诱变位置选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93和L94。特别优选的接触位置选自L50和L94。
在另一个实施方案中,本发明提供了用于改善抗体或其抗原结合部分活性的方法,其包括:
a)提供亲本抗体或其抗原结合部分;
b)选择在互补性决定区(CDR)内的优选选择性诱变位置、接触或高变位置用于突变;
c)使所述所选的优选选择性诱变位置、接触或高变位置个别突变成至少2个其他氨基酸残基,以从而生成突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组;
d)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,评估突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组的活性,从而鉴定活性增强氨基酸残基;
e)任选地,对于至少一个其他优选选择性诱变位置、接触或高变位置,重复步骤a)到d);
f)在亲本抗体或其抗原结合部分中组合显示具有改善的活性的2个个别活性增强氨基酸残基,以形成组合抗体或其抗原结合部分;和
g)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,评估具有2个活性增强氨基酸残基的组合抗体或其抗原结合部分的活性;
直至获得相对于亲本抗体或其抗原结合部分,具有改善的活性的抗体或其抗原结合部分。
优选的接触位置选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96。优选的高变位置选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93。更优选的优选选择性诱变位置选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93和L94。特别优选的接触位置选自L50和L94。
在另一个实施方案中,本发明提供了用于改善抗体或其抗原结合部分活性的方法,其包括:
a)提供亲本抗体或其抗原结合部分;
b)选择在互补性决定区(CDR)内的优选选择性诱变位置、接触或高变位置用于突变;
c)使所述所选的优选选择性诱变位置、接触或高变位置个别突变成至少2个其他氨基酸残基,以从而生成突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组;
d)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,评估突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组的活性,从而鉴定活性增强氨基酸残基;
e)任选地,对于至少一个其他优选选择性诱变位置、接触或高变位置,重复步骤a)到d);
f)在亲本抗体或其抗原结合部分中组合显示具有改善的活性的3个个别活性增强氨基酸残基,以形成组合抗体或其抗原结合部分;和
g)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,评估具有2个活性增强氨基酸残基的组合抗体或其抗原结合部分的活性;
直至获得相对于亲本抗体或其抗原结合部分,具有改善的活性的抗体或其抗原结合部分。
优选地,活性增强氨基酸残基替换位于选自下述位置处的氨基酸残基:H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96。
在个别所选位置诱变后,突变的克隆可以进行测序,以鉴定哪些氨基酸残基已引入每个克隆中的所选位置内。可以选择少量克隆(例如,约24个)用于测序,其在统计学上应产生10-15种独特抗体,而更大量的克隆(例如,超过60个)可以进行测序,以确保鉴定在所选位置处具有每一个可能取代的抗体。
在一个实施方案中,首先选择在重和/或轻链CDR3区内的接触和/或高变位置用于诱变。然而,对于已经由噬菌体展示选择通过CDR3区的随机诱变在体外亲和力成熟的抗体,可能优选首先选择在重和/或轻链CDR1或CDR2内的接触和/或高变位置。
在更优选的实施方案中,首先选择在重和/或轻链CDR3区内的优选选择性诱变位置用于诱变。然而,对于已经由噬菌体展示选择通过CDR3区的随机诱变在体外亲和力成熟的抗体,可能优选首先选择在重和/或轻链CDR1或CDR2内的优选选择性诱变位置。
在另一个优选实施方案中,所选抗体通过选择性诱变法的最优化如下顺次进行:首先使选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94的优选选择性诱变位置各自突变成至少2个其他氨基酸(优选5-14个其他氨基酸),并且所得到的抗体就增加的亲和力、中和效力(以及可能也就其他地方讨论的至少一种其他保留的特征或性质)进行表征。如果单个优选选择性诱变位置的突变根本不增加或不充分增加亲和力或中和效力,并且如果甚至替换优选选择性诱变位置中的氨基酸的多重活性增强氨基酸的组合不导致满足靶活性(包括亲和力和/或中和效力)的组合抗体,那么将从H35、H50、H53、H54、H95、H96、H97、H98、L30A和L96中选择另外氨基酸残基用于选择性诱变,并且各自突变成至少2个其他氨基酸(优选5-14个其他氨基酸),并且所得到的抗体就增加的亲和力、中和效力(以及可能也就其他地方讨论的至少一种其他保留的特征或性质)进行表征。
如果选自H35、H50、H53、H54、H95、H96、H97、H98、L30A和L96的单个氨基酸残基的突变根本不增加或不充分增加活性(包括亲和力和/或中和效力),并且如果甚至替换那些位置中的氨基酸的多重活性增强氨基酸的组合不导致满足靶活性(包括亲和力和/或靶中和效力)的组合抗体,那么将从H33B、H52B、L31A中选择另外氨基酸残基用于选择性诱变,并且各自突变成至少2个其他氨基酸(优选5-14个其他氨基酸),并且所得到的抗体就增加的亲和力、中和效力(以及可能也就其他地方讨论的至少一种其他保留的特征或性质)进行表征。
应当理解,一旦已鉴定具有所需活性(包括亲和力和中和效力)的抗体,顺次选择性诱变法就可以在上文概述的任何步骤处结束。如果预选位置的诱变已鉴定活性增强氨基酸残基,但组合抗体仍不满足关于活性(包括亲和力和中和效力)的靶设定,和/或如果鉴定的活性增强氨基酸还影响其他所需特征并且因此是不可接受的,那么可以对剩余CDR残基实施诱变(参见部分IV)。
本发明的方法可以用于改善抗体或其抗原结合部分的活性,以达到预定靶活性(例如,预定亲和力和/或中和效力,和/或所需性质或特征)。
因此,本发明提供了改善抗体或其抗原结合部分活性,以达到预定靶活性的方法,其包括:
a)提供亲本抗体或其抗原结合部分;
b)选择选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94的优选选择性诱变位置。
c)使所选的优选选择性诱变位置个别突变成至少2个其他氨基酸残基,以从而生成第一个突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组;
d)评估第一个突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组的活性,以测定单个选择性诱变位置的突变是否产生具有预定靶活性或部分靶活性的抗体或其抗原结合部分;
e)以逐步方式在亲本抗体或其抗原结合部分中组合显示具有改善的活性的个别突变,以形成组合抗体或其抗原结合部分。
f)评估组合抗体或其抗原结合部分的活性,以测定组合抗体或其抗原结合部分是否具有预定靶活性或部分靶活性。
g)如果步骤d)或f)不导致具有预定靶活性的抗体或其抗原结合部分,或导致仅具有部分活性的抗体,那么使选自H35、H50、H53、H54、H95、H96、H97、H98、L30A和L96的另外氨基酸残基突变成至少2个其他氨基酸残基,以从而生成第二个突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组;
h)评估第二个突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组的活性,以测定选自H35、H50、H53、H54、H95、H96、H97、H98、L30A和L96的单个氨基酸残基的突变是否导致具有预定靶活性或部分活性的抗体或其抗原结合部分;
i)以逐步方式在亲本抗体或其抗原结合部分中组合显示具有改善的活性的步骤g)的个别突变,以形成组合抗体或其抗原结合部分;
j)评估组合抗体或其抗原结合部分的活性,以测定组合抗体或其抗原结合部分是否具有预定靶活性或部分靶活性;
k)如果步骤h)或j)不导致具有预定靶活性的抗体或其抗原结合部分,或导致仅具有部分活性的抗体,那么使选自H33B、H52B和L31A的另外氨基酸残基突变成至少2个其他氨基酸残基,以从而生成第三个突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组;
l)评估第三个突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组的活性,以测定选自H33B、H52B和L31A的单个氨基酸残基的突变是否导致具有预定靶活性或部分活性的抗体或其抗原结合部分;
m)以逐步方式在亲本抗体或其抗原结合部分中组合显示具有改善的活性的步骤k)的个别突变,以形成组合抗体或其抗原结合部分;
n)评估组合抗体或其抗原结合部分的活性,以测定组合抗体或其抗原结合部分是否具有预定靶活性,以从而产生具有预定靶活性的抗体或其抗原结合部分。
可以使用许多诱变方法,包括PCR装配、Kunkel(dut-ung-)和硫代硫酸(Amersham Sculptor试剂盒)寡核苷酸指导的诱变。
广泛多样的宿主表达系统可以用于表达突变的抗体,包括细菌、酵母、杆状病毒和哺乳动物表达系统(以及噬菌体展示表达系统)。合适细菌表达载体的例子是pUC119(Sfi)。其他抗体表达系统是本领域已知的和/或在下文部分IV中描述。
可以鉴定通过本发明的方法产生的修饰的抗体或其抗原结合部分,而不依赖于噬菌体展示方法用于选择。因此,本发明的方法对于改善重组亲本抗体或其抗原结合部分的活性特别有利,其通过在噬菌体展示系统中的选择而获得,但其活性不能通过噬菌体展示系统中的诱变进一步改善。
因此,在另一个实施方案中,本发明提供了用于改善抗体或其抗原结合部分亲和力的方法,其包括:
a)提供重组亲本抗体或其抗原结合部分;其通过在噬菌体展示系统中的选择而获得,但其活性不能通过噬菌体展示系统中的诱变进一步改善;
b)选择在互补性决定区(CDR)内的优选选择性诱变位置、接触或高变位置用于突变,从而鉴定所选接触或高变位置;
c)使所述所选的优选选择性诱变位置、接触或高变位置个别突变成至少2个其他氨基酸残基,以从而生成突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组,并且在非噬菌体展示系统中表达所述实验对象组;
d)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,评估突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组的活性;
e)任选地,对于至少一个其他优选选择性诱变位置、接触或高变位置,重复步骤b)到d);
f)在亲本抗体或其抗原结合部分中组合显示具有改善的活性的个别突变,以形成组合抗体或其抗原结合部分;和
g)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,评估组合抗体或其抗原结合部分的活性;
直至获得相对于亲本抗体或其抗原结合部分,具有改善的活性的抗体或其抗原结合部分。
优选的接触位置选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96。优选的高变位置选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93。更优选的优选选择性诱变位置选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93和L94。特别优选的接触位置选自L50和L94。
用可用方法不可能或极其费力地获得这样的抗体,其具有增加的结合亲和力和中和效力,同时保留如上讨论的抗体的其他性质或特征。然而,本发明的方法可以容易地鉴定此种抗体。实施本发明的方法的抗体可以来自任何来源。
因此,在另一个实施方案中,本发明提供了用于改善抗体或其抗原结合部分活性的方法,其包括:
a)提供重组亲本抗体或其抗原结合部分;
b)选择在互补性决定区(CDR)内的优选选择性诱变位置、接触或高变位置用于突变,从而鉴定所选的优选选择性诱变位置、接触或高变位置;
c)使所述所选的优选选择性诱变位置、接触或高变位置个别突变成至少2个其他氨基酸残基,以从而生成突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组,并且在合适表达系统中表达所述实验对象组;
d)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,评估突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组的活性,从而鉴定活性增强氨基酸残基;
e)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,就至少一种其他性质或特征评估突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组,其中所述性质或特征是在抗体中需要保留的那种;
直至获得相对于亲本抗体或其抗原结合部分,具有改善的活性和至少一种保留的性质或特征的抗体或其抗原结合部分。
在优选实施方案中,接触位置选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96,并且其他特征选自1)与其他蛋白质或人组织的非交叉反应性的保存,2)表位识别的保存,即优选在p70p40/p35异二聚体的背景中识别p40表位,从而预防来自游离、可溶性p40的结合干扰,和/或3)产生具有接近于种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个优选实施方案中,高变位置选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93,并且其他特征选自1)与其他蛋白质或人组织的非交叉反应性的保存,2)表位识别的保存,即优选在p70p40/p35异二聚体的背景中识别p40表位,从而预防来自游离、可溶性p40的结合干扰,和/或3)产生具有接近于种系免疫球蛋白序列的抗体。
在更优选的实施方案中,用于选择性诱变的残基选自来自由H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94组成的组的优选选择性诱变位置,并且其他特征选自1)与其他蛋白质或人组织的非交叉反应性的保存,2)表位识别的保存,即优选在p70 p40/p35异二聚体的背景中识别p40表位,从而预防来自游离、可溶性p40的结合干扰,和/或3)产生具有接近于种系免疫球蛋白序列的抗体。
在更优选的实施方案中,接触位置选自L50和L94,并且其他特征选自1)与其他蛋白质或人组织的非交叉反应性的保存,2)表位识别的保存,即优选在p70 p40/p35异二聚体的背景中识别p40表位,从而预防来自游离、可溶性p40的结合干扰,和/或3)产生具有接近于种系免疫球蛋白序列的抗体。
如果因此,应改善抗体对于特异性抗原的亲和力,但其中噬菌体展示(或相关系统包括核糖体展示)方法不再适用,并且应保留其他所需性质或特征,那么可以使用本发明的方法。因此,在另一个实施方案中,本发明提供了用于改善抗体或其抗原结合部分活性的方法,其包括:
a)提供重组亲本抗体或其抗原结合部分;其通过在噬菌体展示系统中的选择而获得,但其活性不能通过所述噬菌体展示系统中的诱变进一步改善;
b)选择在互补性决定区(CDR)内的优选选择性诱变位置、接触或高变位置用于突变,从而鉴定所选的优选选择性诱变位置、接触或高变位置;
c)使所述所选的优选选择性诱变位置、接触或高变位置个别突变成至少2个其他氨基酸残基,以从而生成突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组,并且在非噬菌体展示系统中表达所述实验对象组;
d)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,评估突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组的活性,从而鉴定活性增强氨基酸残基;
e)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,就至少一种其他性质或特征评估突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组,其中所述性质或特征是需要保留的那种,直至获得相对于亲本抗体或其抗原结合部分,具有改善的活性和至少一种保留的性质或特征的抗体或其抗原结合部分。
f)任选地,对于至少一个其他优选选择性诱变位置、接触或高变位置,重复步骤a)到e);
g)在亲本抗体或其抗原结合部分中组合显示具有改善的活性和至少一种保留的性质或特征的至少2个个别活性增强氨基酸残基,以形成组合抗体或其抗原结合部分;和
h)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,评估组合抗体或其抗原结合部分的活性;
直至获得相对于亲本抗体或其抗原结合部分,具有改善的活性和至少一种保留的其他性质或特征的抗体或其抗原结合部分。
在优选实施方案中,接触位置选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96,并且其他特征选自1)与其他蛋白质或人组织的非交叉反应性的保存,2)表位识别的保存,即优选在p70p40/p35异二聚体的背景中识别p40表位,从而预防来自游离、可溶性p40的结合干扰,和/或3)产生具有接近于种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个优选实施方案中,高变位置选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93,并且其他特征选自1)与其他蛋白质或人组织的非交叉反应性的保存,2)表位识别的保存,即优选在p70 p40/p35异二聚体的背景中识别p40表位,从而预防来自游离、可溶性p40的结合干扰,和/或3)产生具有接近于种系免疫球蛋白序列的抗体。
在更优选的实施方案中,用于选择性诱变的残基选自来自由H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94组成的组的优选选择性诱变位置,并且其他特征选自1)与其他蛋白质或人组织的非交叉反应性的保存,2)表位识别的保存,即优选在p70 p40/p35异二聚体的背景中识别p40表位,从而预防来自游离、可溶性p40的结合干扰,和/或3)产生具有接近于种系免疫球蛋白序列的抗体。
在更优选的实施方案中,接触位置选自L50和L94,并且其他特征选自1)与其他蛋白质或人组织的非交叉反应性的保存,2)表位识别的保存,即优选在p70 p40/p35异二聚体的背景中识别p40表位,从而预防来自游离、可溶性p40的结合干扰,和/或3)产生具有接近于种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个实施方案中,本发明提供了用于改善抗体或其抗原结合部分活性的方法,其包括:
a)提供重组亲本抗体或其抗原结合部分;其通过在噬菌体展示系统中的选择而获得,但其活性不能通过所述噬菌体展示系统中的诱变进一步改善;
b)选择在互补性决定区(CDR)内的优选选择性诱变位置、接触或高变位置用于突变,从而鉴定所选的接触或高变位置;
c)使所述所选的优选选择性诱变位置、接触或高变位置个别突变成至少2个其他氨基酸残基,以从而生成突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组,并且在非噬菌体展示系统中表达所述实验对象组;
d)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,评估突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组的活性,从而鉴定活性增强氨基酸残基;
e)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,就至少一种其他性质或特征评估突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组,其中所述性质或特征是需要保留的那种,直至获得相对于亲本抗体或其抗原结合部分,具有改善的活性和至少一种保留的性质或特征的抗体或其抗原结合部分。
在优选实施方案中,接触位置选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96,并且其他特征选自1)与其他蛋白质或人组织的非交叉反应性的保存,2)表位识别的保存,即优选在p70 p40/p35异二聚体的背景中识别p40表位,从而预防来自游离、可溶性p40的结合干扰,和/或3)产生具有接近于种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个优选实施方案中,高变位置选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93,并且其他特征选自1)与其他蛋白质或人组织的非交叉反应性的保存,2)表位识别的保存,即优选在p70 p40/p35异二聚体的背景中识别p40表位,从而预防来自游离、可溶性p40的结合干扰,和/或3)产生具有接近于种系免疫球蛋白序列的抗体。
在更优选的实施方案中,用于选择性诱变的残基选自来自由H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94组成的组的优选选择性诱变位置,并且其他特征选自1)与其他蛋白质或人组织的非交叉反应性的保存,2)表位识别的保存,即优选在p70 p40/p35异二聚体的背景中识别p40表位,从而预防来自游离、可溶性p40的结合干扰,和/或3)产生具有接近于种系免疫球蛋白序列的抗体。
在更优选的实施方案中,接触位置选自L50和L94,并且其他特征选自1)与其他蛋白质或人组织的非交叉反应性的保存,2)表位识别的保存,即优选在p70 p40/p35异二聚体的背景中识别p40表位,从而预防来自游离、可溶性p40的结合干扰,和/或3)产生具有接近于种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个实施方案中,本发明提供了用于改善抗体或其抗原结合部分活性的方法,其包括:
a)提供重组亲本抗体或其抗原结合部分;其通过在噬菌体展示系统中的选择而获得,但其活性不能通过所述噬菌体展示系统中的诱变进一步改善;
b)选择在互补性决定区(CDR)内的优选选择性诱变位置、接触或高变位置用于突变,从而鉴定所选的接触或高变位置;
c)使所述所选的优选选择性诱变位置、接触或高变位置个别突变成至少2个其他氨基酸残基,以从而生成突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组,并且在非噬菌体展示系统中表达所述实验对象组;
d)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,评估突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组的活性,从而鉴定活性增强氨基酸残基;
e)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,就至少一种其他性质或特征评估突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组,其中所述性质或特征是需要保留的那种,直至获得相对于亲本抗体或其抗原结合部分,具有改善的活性和至少一种保留的特征的抗体或其抗原结合部分。
f)任选地,对于至少一个其他优选选择性诱变位置、接触或高变位置,重复步骤a)到e);
g)在亲本抗体或其抗原结合部分中组合显示具有改善的活性和至少一种保留的其他特征的至少2个个别活性增强氨基酸残基,以形成组合抗体或其抗原结合部分;和
h)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,评估组合抗体或其抗原结合部分的活性;
直至获得相对于亲本抗体或其抗原结合部分,具有改善的活性和至少一种保留的性质或特征的抗体或其抗原结合部分。
在优选实施方案中,接触位置选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96,并且其他特征选自1)与其他蛋白质或人组织的非交叉反应性的保存,2)表位识别的保存,即优选在p70 p40/p35异二聚体的背景中识别p40表位,从而预防来自游离、可溶性p40的结合干扰,和/或3)产生具有接近于种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个优选实施方案中,高变位置选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93,并且其他特征选自1)与其他蛋白质或人组织的非交叉反应性的保存,2)表位识别的保存,即优选在p70p40/p35异二聚体的背景中识别p40表位,从而预防来自游离、可溶性p40的结合干扰,和/或3)产生具有接近于种系免疫球蛋白序列的抗体。
在更优选的实施方案中,用于选择性诱变的残基选自来自由H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94组成的组的优选选择性诱变位置,并且其他特征选自1)与其他蛋白质或人组织的非交叉反应性的保存,2)表位识别的保存,即优选在p70 p40/p35异二聚体的背景中识别p40表位,从而预防来自游离、可溶性p40的结合干扰,和/或3)产生具有接近于种系免疫球蛋白序列的抗体。
在更优选的实施方案中,接触位置选自L50和L94,并且其他特征选自1)与其他蛋白质或人组织的非交叉反应性的保存,2)表位识别的保存,即优选在p70 p40/p35异二聚体的背景中识别p40表位,从而预防来自游离、可溶性p40的结合干扰,和/或3)产生具有接近于种系免疫球蛋白序列的抗体。
IV.其他CDR残基的修饰
最后,在给定抗体-抗原对中的所有CDR残基通过任何方法鉴定为作为活性增强氨基酸残基所必需的,和/或对于与抗原结合和/或保留抗体的其他所需性质或特征直接或间接所必需的。此种CDR残基被称为“优选选择性诱变位置”。应当指出在特定环境中优选选择性诱变位置也可以通过其他方法进行鉴定,包括抗体和抗原的共结晶和分子建模。
如果集中于上述优选选择性诱变位置、接触或高变位置以鉴定活性增强氨基酸的优选尝试被用尽,或如果需要另外改善,那么剩余CDR残基可以如下所述进行修饰。应当理解抗体可以已根据上文讨论的实施方案在任何一个或多个接触或高变位置中进行修饰,但可能需要进一步改善。因此,在另一个实施方案中,本发明提供了用于改善抗体或其抗原结合部分活性的方法,其包括:
a)提供亲本抗体或其抗原结合部分;
b)选择除H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96外,在互补性决定区(CDR)内的氨基酸残基用于突变;
c)使所述所选位置个别突变成例如至少2个其他氨基酸残基,以从而生成突变的抗体或者突变的抗体的实验对象组或其抗原结合部分;
d)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,评估突变的抗体或者突变的抗体的实验对象组或其抗原结合部分的活性,从而鉴定活性增强氨基酸残基;
e)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,就至少一种其他性质或特征中的改变评估突变的抗体或者突变的抗体的实验对象组或其抗原结合部分,直至获得相对于亲本抗体或其抗原结合部分,具有改善的活性的抗体或其抗原结合部分。
优选地,其他特征或性质选自1)与其他蛋白质或人组织的非交叉反应性的保存,2)表位识别的保存,即优选在p70 p40/p35异二聚体的背景中识别p40表位,从而预防来自游离、可溶性p40的结合干扰,和/或3)产生具有接近于种系免疫球蛋白序列的抗体。
如果单个残基的诱变不足够,那么可以包括其他残基;因此,在另一个实施方案中,本发明提供了用于改善抗体或其抗原结合部分活性的方法,其包括:
a)提供亲本抗体或其抗原结合部分;
b)选择除H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96外,在互补性决定区(CDR)内的氨基酸残基用于突变;
c)使所述所选位置个别突变成至少2个其他氨基酸残基,以从而生成突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组;
d)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,评估突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组的活性,从而鉴定活性增强氨基酸残基;
e)对于至少一个其他CDR位置,重复步骤b)到e),所述其他CDR位置既不是在b)下选择的位置,也不是在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96处的位置;
f)在亲本抗体或其抗原结合部分中组合显示具有改善的活性的至少2个个别活性增强氨基酸残基,以形成组合抗体或其抗原结合部分;和
g)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,评估具有2个活性增强氨基酸残基的组合抗体或其抗原结合部分的活性,直至获得相对于亲本抗体或其抗原结合部分,具有改善的活性的抗体或其抗原结合部分。
如果集中于上述接触或高变位置以鉴定活性增强氨基酸的优选尝试被用尽,或如果需要另外改善,并且所讨论的抗体不能通过诱变和噬菌体展示(或相关核糖体展示)方法进行进一步最优化,那么剩余CDR残基可以如下所述进行修饰。应当理解抗体可以已根据上文讨论的实施方案在任何一个或多个优选选择性诱变位置、接触或高变位置中进行修饰,但可能需要进一步改善。
因此,在另一个实施方案中,本发明提供了用于改善抗体或其抗原结合部分活性的方法,其包括:
a)提供重组亲本抗体或其抗原结合部分;其通过在噬菌体展示系统中的选择而获得,但其活性不能通过所述噬菌体展示系统中的诱变进一步改善;
b)选择除H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94外,在互补性决定区(CDR)内的氨基酸残基用于突变;
c)使所述所选的接触或高变位置个别突变成至少2个其他氨基酸残基,以从而生成突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组,并且在非噬菌体展示系统中表达所述实验对象组;
d)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,评估突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组的活性,从而鉴定活性增强氨基酸残基;
e)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,就至少一种其他性质或特征中的改变评估突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组,直至获得相对于亲本抗体或其抗原结合部分,具有改善的活性的抗体或其抗原结合部分。
优选地,其他特征或性质选自1)与其他蛋白质或人组织的非交叉反应性的保存,2)表位识别的保存,即优选在p70 p40/p35异二聚体的背景中识别p40表位,从而预防来自游离、可溶性p40的结合干扰,和/或3)产生具有接近于种系免疫球蛋白序列的抗体。
如果单个诱变不足以增加抗体的亲和力,那么其他残基可以包括在诱变中。因此,在另一个实施方案中,本发明提供了用于改善抗体或其抗原结合部分活性的方法,其包括:
a)提供亲本抗体或其抗原结合部分,其通过在噬菌体展示系统中的选择而获得,但其活性不能通过所述噬菌体展示系统中的诱变进一步改善;
b)选择除H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96外,在互补性决定区(CDR)内的氨基酸残基用于突变;
c)使所述所选位置个别突变成至少2个其他氨基酸残基,以从而生成突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组,并且在非噬菌体展示系统中表达;
d)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,评估突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组的活性,从而鉴定活性增强氨基酸残基;
e)对于至少一个其他位置,重复步骤b)到d),所述其他位置既不是在b)下选择的位置,也不是在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94处的位置;
g)在亲本抗体或其抗原结合部分中组合显示具有改善的活性的至少2个个别活性增强氨基酸残基,以形成组合抗体或其抗原结合部分;和
h)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,评估具有2个活性增强氨基酸残基的组合抗体或其抗原结合部分的活性和其他性质或特征;
直至获得相对于亲本抗体或其抗原结合部分,具有改善的活性的抗体或其抗原结合部分。
优选地,其他特征或性质选自1)与其他蛋白质或人组织的非交叉反应性的保存,2)表位识别的保存,即优选在p70 p40/p35异二聚体的背景中识别p40表位,从而预防来自游离、可溶性p40的结合干扰,和/或3)产生具有接近于种系免疫球蛋白序列的抗体。
集中于所述优选选择性诱变位置、接触或高变位置以鉴定活性增强氨基酸的优选尝试可能被用尽,或可能需要另外改善,并且重要的是保留抗体的其他性质或特征。
因此,在另一个实施方案中,本发明提供了用于改善抗体或其抗原结合部分活性,而不影响其他特征的方法,其包括:
a)提供亲本抗体或其抗原结合部分;
b)选择除H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96外,在互补性决定区(CDR)内的氨基酸残基用于突变;
c)使所述所选位置个别突变成至少2个其他氨基酸残基,以从而生成突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组;
d)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,评估突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组的活性,从而鉴定活性增强氨基酸残基;
e)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,就至少一种其他性质或特征中的改变评估突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组,直至获得相对于亲本抗体或其抗原结合部分,具有改善的活性和保留的其他性质或特征的抗体或其抗原结合部分。
优选地,其他特征或性质选自1)与其他蛋白质或人组织的非交叉反应性的保存,2)表位识别的保存,即优选在p70 p40/p35异二聚体的背景中识别p40表位,从而预防来自游离、可溶性p40的结合干扰,和/或3)产生具有接近于种系免疫球蛋白序列的抗体。
如果单个残基的诱变不足够,那么可以包括其他残基;因此,在另一个实施方案中,本发明提供了用于改善抗体或其抗原结合部分活性的方法,其包括:
a)提供亲本抗体或其抗原结合部分;
b)选择除H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96外,在互补性决定区(CDR)内的氨基酸残基用于突变;
c)使所述所选位置个别突变成至少2个其他氨基酸残基,以从而生成突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组;
d)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,评估突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组的活性,从而鉴定活性增强氨基酸残基;
e.)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,就至少一种其他特征或性质中的改变评估突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组;
e)对于至少一个其他CDR位置,重复步骤b)到e),所述其他CDR位置既不是在b)下选择的位置,也不是在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96处的位置;
f)在亲本抗体或其抗原结合部分中组合至少2个个别活性增强氨基酸残基,所述活性增强氨基酸残基显示具有改善活性并且不影响至少一种其他性质或特征,以形成组合抗体或其抗原结合部分;和
g)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,评估具有2个活性增强氨基酸残基的组合抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种其他性质或特征的保留,直至获得相对于亲本抗体或其抗原结合部分,具有改善的活性和至少一种保留的其他性质或特征的抗体或其抗原结合部分。
优选选择性诱变位置、接触和高变位置的诱变可能未充分增加抗体的亲和力,并且诱变和噬菌体展示方法(或相关核糖体展示方法)可能不再有用,并且应保留抗体的至少一种其他特征或性质。
因此,在另一个实施方案中,本发明提供了用于改善抗体或其抗原结合部分活性的方法,其包括:
a)提供亲本抗体或其抗原结合部分,其通过在噬菌体展示系统中的选择而获得,但其活性不能通过所述噬菌体展示系统中的诱变进一步改善;
b)选择除H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96外,在互补性决定区(CDR)内的氨基酸残基用于突变;
c)使所述所选位置个别突变成至少2个其他氨基酸残基,以从而生成突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组,并且在非噬菌体展示系统中表达;
d)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,评估突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组的活性,从而鉴定活性增强氨基酸残基;
e)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,就至少一种其他性质或特征中的改变评估突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组,直至获得相对于亲本抗体或其抗原结合部分,具有改善的活性的抗体或其抗原结合部分。
优选地,其他特征或性质选自1)与其他蛋白质或人组织的非交叉反应性的保存,2)表位识别的保存,即优选在p70p40/p35异二聚体的背景中识别p40表位,从而预防来自游离、可溶性p40的结合干扰,和/或3)产生具有接近于种系免疫球蛋白序列的抗体。
如果单个残基的诱变不足够,那么可以包括其他残基;因此,在另一个实施方案中,本发明提供了用于改善抗体或其抗原结合部分活性的方法,其包括:
a)提供亲本抗体或其抗原结合部分,其通过在噬菌体展示系统中的选择而获得,但其活性不能通过所述噬菌体展示系统中的诱变进一步改善;
b)选择除H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96外,在互补性决定区(CDR)内的氨基酸残基用于突变;
c)使所述所选位置个别突变成至少2个其他氨基酸残基,以从而生成突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组,并且在非噬菌体展示系统中表达;
d)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,评估突变的抗体或其抗原结合部分的实验对象组的活性和至少一种其他性质或特征的保留,从而鉴定活性增强氨基酸残基;
e)对于至少一个其他CDR位置,重复步骤b)到d),所述其他CDR位置既不是在b)下选择的位置,也不是在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96处的位置;
f)在亲本抗体或其抗原结合部分中组合至少2个个别活性增强氨基酸残基,所述活性增强氨基酸残基显示具有改善的活性并且不影响至少一种其他性质或特征,以形成组合抗体或其抗原结合部分;和
g)相对于亲本抗体或其抗原结合部分,评估具有2个活性增强氨基酸残基的组合抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种其他性质或特征的保留,直至获得相对于亲本抗体或其抗原结合部分,具有改善的活性和至少一种其他保留的特征或性质的抗体或其抗原结合部分。
V.抗体的表达
本发明的抗体或抗体部分可以通过免疫球蛋白轻和重链基因在宿主细胞中的重组表达而制备。为了重组表达抗体,用携带DNA片段的一种或多种重组表达载体转染宿主细胞,所述DNA片段编码抗体的免疫球蛋白轻和重链,从而使得轻和重链在宿主细胞中表达,并且优选分泌到宿主细胞在其中培养的培养基内,从所述培养基中可以回收抗体。标准重组DNA方法用于获得抗体重和轻链基因,将这些基因掺入重组表达载体内,并且将载体引入宿主细胞内,例如Sambrook,Fritsch和Maniatis(编辑),Molecular Cloning;A LaboratoryManual,Second Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989),Ausubel,F.M.等人(编辑)Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing Associates,(1989)和Boss等人的美国专利号4,816,397中描述的那些。
为了获得编码Joe 9wt或Joe 9wt相关抗体的重链可变区的DNA片段,从人文库中筛选对于人IL-12特异的抗体并且突变,如部分II中所述。一旦获得编码Joe 9wt或Joe 9wt相关VH和VL区段的DNA片段,就通过标准方法执行这些序列的诱变,所述标准方法例如PCR位点定向诱变(PCR介导的诱变,其中将突变的核苷酸掺入PCR引物内,从而使得PCR产物包含突变)或其他位点定向诱变方法。显示所需活性和结合特异性/亲和力水平的人IL-12抗体例如J695通过标准重组DNA技术进行进一步操作,例如以使可变区基因转变成全长抗体链基因,至Fab片段基因或至scFv基因。在这些操作中,使编码VL或VH的DNA片段与编码另一种蛋白质的另一种DNA片段可操作地连接,所述另一种蛋白质例如抗体恒定区或柔性接头。如本文背景中使用的,术语“可操作地连接”意指2个DNA片段这样连接,从而使得由2个DNA片段编码的氨基酸序列保留在框内。
通过使编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一种DNA分子可操作地连接,可以使编码VH区的分离的DNA转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如,Kabat,E.A.,等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH公开号91-3242),并且包含这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区,和如Kabat中描述的其中任何同种异型变体(Kabat,E.A.,等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH公开号91-3242),但最优选是IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因,编码VH的DNA可以与仅编码重链CH1恒定区的另一种DNA分子可操作地连接。
通过使编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一种DNA分子可操作地连接,可以使编码VL区的分离的DNA转变成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如,Kabat,E.A.,等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH公开号91-3242),并且包含这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区,但最优选是λ恒定区。
为了生成scFv基因,使编码VH和VL的DNA片段与另一种片段可操作地连接,所述另一种片段编码柔性接头,例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3,从而使得VH和VL序列可以表达为连续的单链蛋白质,其中VL和VH区通过柔性接头连接(参见例如,Bird等人(1988)Science 242:423-426;Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883;McCafferty等人,Nature(1990)348:552-554)。
为了表达本发明的抗体或抗体部分,将如上所述获得的编码部分或全长轻和重链的DNAs这样插入表达载体内,从而使得基因与转录和翻译控制序列可操作地连接。在这个背景中,术语“可操作地连接”意指抗体基因这样连接到载体内,从而使得在载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节抗体基因转录和翻译的预期功能。选择表达载体和表达控制序列以与所使用的表达宿主细胞相容。抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入分开载体内,或更一般地,2种基因都插入相同表达载体内。抗体基因通过标准方法(例如,在抗体基因片段和载体上的互补限制位点的连接,或如果不存在限制位点,那么平端连接)插入表达载体内。在插入J695或J695相关轻或重链序列前,表达载体可以已携带抗体恒定区序列。例如,使J695或J695相关VH和VL序列转变成全长抗体基因的一种方法是将其插入已分别编码重链恒定区和轻链恒定区的表达载体内,从而使得VH区段与载体内的一个或多个CH区段可操作地连接,并且VL区段与载体内的CL区段可操作地连接。另外或可替代地,重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞中分泌的信号肽。抗体链基因可以这样克隆到载体内,从而使得信号肽与抗体链基因的氨基末端在框内连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即,来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。
除抗体链基因外,本发明的重组表达载体还携带控制抗体链基因在宿主细胞中的表达的调节序列。术语“调节序列”意欲包括启动子、增强子和控制抗体链基因转录或翻译的其他表达控制元件(例如,多腺苷酸化信号)。此种调节序列例如在Goeddel;Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990)中描述。本领域技术人员将认识到表达载体的设计,包括调节序列的选择,可以依赖于此种因素如待转化的宿主细胞的选择,所需蛋白质的表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括指导哺乳动物细胞中的高水平蛋白质表达的病毒元件,例如衍生自巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如,腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤的启动子和/或增强子。关于病毒调节元件及其序列的进一步描述,参见例如,Stinski的美国专利号5,168,062,Bell等人的美国专利号4,510,245和Schaffner等人的美国专利号4,968,615,Bujard等人的美国专利号5,464,758和Bujard等人的美国专利号5,654,168。
除抗体链基因和调节序列外,本发明的重组表达载体还可以携带另外序列,例如调节载体在宿主细胞中的复制的序列(例如,复制起点)和选择标记基因。选择标记基因促进载体已引入其内的宿主细胞的选择(参见例如,全部为Axel等人的美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如,一般地选择标记基因对载体已引入其内的宿主细胞赋予针对药物的抗性,所述药物例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于在具有氨甲蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞中使用)和neo基因(用于G418选择)。
对于轻和重链的表达,通过标准技术将编码重和轻链的一种或多种表达载体转染到宿主细胞内。各种形式的术语“转染”意欲包括常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞内的广泛多样技术,例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管理论上可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体,但在真核细胞且最优选哺乳动物宿主细胞中的抗体表达是最优选的,因为此种真核细胞且特别地哺乳动物细胞比原核细胞更可能装配且分泌正确折叠且免疫学活性的抗体。用于表达本发明的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括在Urlaub和Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中描述的dhfr-CHO细胞,与例如如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621中描述的DHFR选择标记一起使用)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞内时,通过使宿主细胞培养足以允许抗体在宿主细胞中表达,或更优选地,抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养基内的时间段而产生抗体。抗体可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收。
宿主细胞还可以用于产生完整抗体的部分,例如Fab片段或scFv分子。应当理解关于上述程序的变化在本发明的范围内。例如,可能希望用编码本发明抗体的轻链或重链(但并非两者)的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可以用于去除对于与hIL-12结合不必要的编码轻和重链任一或两者的一些或全部DNA。由此种截短的DNA分子表达的分子也由本发明的抗体包括。此外,通过经由标准化学交联方法使本发明的抗体与第二种抗体交联,可以产生双功能抗体,其中一条重链和一条轻链是本发明的抗体,并且另一条重和轻链对于除hIL-12外的抗原特异。
在用于本发明的抗体或其抗原结合部分重组表达的优选系统中,通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入dhfr-CHO细胞内。在重组表达载体内,使抗体重和轻链两者基因各自与增强子/启动子调节元件(例如,衍生自SV40、CMV、腺病毒等,例如CMV增强子/AdMLP启动子调节元件或SV40增强子/AdMLP启动子调节元件)可操作地连接,以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因,其允许选择已使用氨甲蝶呤选择/扩增用载体转染的CHO细胞。使所选转化体宿主细胞培养,以允许抗体重和轻链表达,并且从培养基中回收完整抗体。标准分子生物学技术用于制备重组表达载体,转染宿主细胞,选择转化体,培养宿主细胞且从培养基中回收抗体。本发明的抗体或其抗原结合部分可以在对于人免疫球蛋白基因是转基因的动物(例如,小鼠)中表达(参见例如,Taylor,L.D.等人(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)。植物细胞也可以进行修饰,以生成表达本发明的抗体或其抗原结合部分的转基因植物。
由前文看来,本发明的另一个方面涉及可以用于本发明的抗体和抗体部分的重组表达的核酸、载体和宿主细胞组合物。优选地,本发明的特征在于编码J695的CDRs、或J695的全重和/或轻链可变区的分离的核酸。因此,在一个实施方案中,本发明的特征在于编码抗体重链可变区的分离的核酸,其编码包括SEQ ID NO:25的氨基酸序列的J695重链CDR3。优选地,编码抗体重链可变区的核酸进一步编码包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列的J695重链CDR2。更优选地,编码抗体重链可变区的核酸进一步编码包括SEQ ID NO:29的氨基酸序列的J695重链CDR1。甚至更加优选地,分离的核酸编码包括SEQID NO:31的氨基酸序列的抗体重链可变区(J695的全VH区)。
在其他实施方案中,本发明的特征在于编码抗体轻链可变区的分离的核酸,其编码包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列的J695轻链CDR3。优选地,编码抗体轻链可变区的核酸进一步编码包括SEQ IDNO:28的氨基酸序列的J695轻链CDR2。更优选地,编码抗体轻链可变区的核酸进一步编码包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列的J695轻链CDR1。甚至更加优选地,分离的核酸编码包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列的抗体轻链可变区(J695的全VL区)。
本发明还提供了编码抗体重链和抗体轻链两者的重组表达载体。例如,在一个实施方案中,本发明提供了重组表达载体,其编码:
a)具有包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列的可变区的抗体重链;和
b)具有包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列的可变区的抗体轻链。
本发明还提供了本发明的一种或多种重组表达载体已引入其内的宿主细胞。优选地,宿主细胞是哺乳动物宿主细胞,更优选地宿主细胞是CHO细胞、NS0细胞或COS细胞。再进一步地,本发明提供了合成本发明的重组人抗体的方法,其通过在合适培养基中培养本发明的宿主细胞,直至合成本发明的重组人抗体来实现。该方法可以进一步包括从培养基中分离重组人抗体。
VI.药物组合物和药物施用
本发明的抗体和抗体部分可以掺入适合于施用于受试者的药物组合物内。一般地,药物组合物包括本发明的抗体或抗体部分和药学上可接受的载体。如本文使用的,“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的例子包括水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一种或多种,及其组合。在许多情况下,将优选在组合物中包括等渗剂,例如糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇、或氯化钠。药学上可接受的载体可以进一步包括增强抗体或抗体部分的保存期限或有效性的小量辅助物质,例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂。
本发明的抗体和抗体部分可以掺入适合于肠胃外施用的药物组合物内。优选地,抗体或抗体部分将制备为包含0.1-250mg/ml抗体的可注射溶液。可注射溶液可以由在火石或琥珀小瓶、安瓿或预装填注射器中的液体或冻干剂型组成。缓冲液可以是L-组氨酸(1-50mM),最佳地5-10mM,在pH 5.0-7.0下(最佳地pH 6.0)。其他合适缓冲液包括但不限于,琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。氯化钠可以用于修饰在0-300mM(对于液体剂型最佳地150mM)的浓度下的溶液毒性。对于冻干剂型可以包括冷冻保护剂,主要是0-10%蔗糖(最佳地0.5-1.0%)。其他合适的冷冻保护剂是海藻糖和乳糖。对于冻干剂型可以包括膨胀剂,主要是1-10%甘露糖醇(最佳地2-4%)。稳定剂可以用于液体和冻干剂型内,主要是1-50mM L-甲硫氨酸(最佳地5-10mM)。其他合适的膨胀剂包括甘氨酸、精氨酸,可以包括作为0-0.05%聚山梨醇酯-80(最佳地0.005-0.01%)。另外的表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。
在优选实施方案中,药物组合物包括约100mg-200mg剂量的抗体。
本发明的组合物可以为多种形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂型,例如液体溶液(例如,可注射和可输注溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。优选形式依赖于预期施用方式和治疗应用。一般优选的组合物为可注射或可输注溶液形式,例如类似于用于人用其他抗体的被动免疫接种的那些的组合物。优选施用方式是肠胃外(例如,静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在优选实施方案中,抗体通过皮下注射进行施用。
治疗组合物一般必须是在制造和贮存条件下无菌且稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳剂、分散体、脂质体或对于高药物浓度合适的其他有序结构。无菌可注射溶液可以通过根据需要将所需量的活性化合物(即,抗体或抗体部分)与上文列举成分的一种或组合掺入合适溶剂中,随后为过滤灭菌来进行制备。一般地,分散体通过将活性化合物掺入无菌媒介物内进行制备,所述无菌媒介物包含基本分散介质和来自上文列举那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌、冻干粉末的情况下,优选制备方法是真空干燥和喷雾干燥,这从其先前无菌过滤的溶液得到活性成分加上任何另外所需成分的粉末。溶液的正确流动性可以这样得到维持:例如通过使用包衣例如卵磷脂,在分散体的情况下通过所需颗粒大小的维持和通过表面活性剂的使用。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂来达到,所述试剂例如单硬脂酸盐和明胶。
本发明的抗体和抗体部分可以通过本领域已知的多种方法施用,尽管对于许多治疗应用,优选施用途径/方式是皮下注射、静脉内注射或输注。如技术人员将认识到的,施用途径和/或方式将依赖于所需结果而改变。在特定实施方案中,活性化合物可以用将保护化合物免于快速释放的载体进行制备,例如控释剂,包括植入物、经皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物,例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此种制剂的许多方法是受专利权保护的,或本领域技术人员一般已知的。参见例如,Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
在特定实施方案中,本发明的抗体或抗体部分可以例如与惰性稀释剂或可同化食用载体一起经口施用。化合物(若需要则和其他成分)也可以封装在硬或软壳明胶胶囊中,压缩成片剂,或直接掺入受试者的饮食内。对于经口治疗施用,化合物可以与赋形剂一起掺入,并且以可摄食片剂、口腔含化片剂、含锭、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、薄片等的形式使用。为了通过除肠胃外施用外施用本发明的化合物,可能必须用预防其失活的材料包被化合物,或使化合物与预防其失活的材料一起共施用。
辅助活性化合物也可以掺入组合物内。在特定实施方案中,本发明的抗体或抗体部分可以与一种或多种另外治疗剂共配制和/或共施用,所述另外治疗剂用于治疗其中IL-12活性有害的病症。例如,本发明的抗hIL-12抗体或抗体部分可以与一种或多种另外抗体共配制和/或共施用,所述另外抗体结合其他靶(例如,结合其他细胞因子或结合细胞表面分子的抗体)。此外,本发明的一种或多种抗体可以与2种或更多种上述治疗剂组合使用。此种联合治疗可以有利地利用较低用量的所施用治疗剂,因此避免与各种单一疗法相关的可能毒性或并发症。技术人员将认识到当本发明的抗体作为联合治疗的部分使用时,可能需要比当抗体单独施用于受试者更低剂量的抗体(例如,协同疗效可以通过联合治疗的使用来达到,所述联合治疗又允许使用较低剂量的抗体以达到所需疗效)。
白细胞介素12在与涉及免疫和炎症要素的多种疾病相关的病理学(pathology)中起关键作用。这些疾病包括但不限于,类风湿性关节炎、骨关节炎、青少年慢性关节炎、莱姆关节炎、银屑病关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、全身性红斑狼疮、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变应性疾病、银屑病、皮炎硬皮病、特应性皮炎、移植物抗宿主病、器官移植排斥、与器官移植相关的急性或慢性免疫性疾病、肉状瘤病、动脉粥样硬化、弥散性血管内凝血、Kawasaki氏病、Grave氏病、肾病综合征、慢性疲乏综合征、韦格纳氏肉芽肿病、过敏性紫癜(Henoch-Schoenlein purpurea)、肾显微血管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、脓毒性休克、中毒性休克综合征、脓毒病综合征、恶病质、传染病、寄生虫病、获得性免疫缺陷综合征、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬变、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭、心肌梗死、Addison氏病、散发性多腺性I型缺乏和多腺性II型缺乏、Schmidt氏综合征、成人(急性)呼吸窘迫综合征、秃头、斑秃(alopecia areata)、血清反应阴性关节病(arthropathy)、关节病、Reiter氏病、牛皮癣性关节病、溃疡性结肠炎性关节病、肠病性滑膜炎、衣原体、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关性关节病、脊椎关节病(spondyloarthopathy)、动脉粥样化疾病/动脉硬化、特应性变态反应、自身免疫性大疱性疾病、寻常天疱疮、落叶状天疱疮、类天疱疮、线性IgA疾病、自身免疫性溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、青少年性恶性贫血、肌痛脑炎/Royal Free疾病、慢性粘膜皮肤念珠菌病、巨细胞性动脉炎、原发性硬化性肝炎、隐原性自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷病综合征、获得性免疫缺陷相关病、丙型肝炎、常见的各种免疫缺陷(常见的可变低丙种球蛋白血症)、扩张型心肌病、女性不育、卵巢衰竭、过早卵巢衰竭、纤维化肺疾病、隐原性纤维化肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、结缔组织病相关性间质性肺病、混合性结缔组织病相关性肺病、全身性硬皮病相关性间质性肺病、类风湿性关节炎相关性间质性肺病、全身性红斑狼疮相关性肺病、皮肌炎/多肌炎相关性肺病、
氏病相关性肺病、强直性脊柱炎相关性肺病、脉管炎性弥散性肺病、含铁血黄素沉着病相关性肺病、药物诱导的间质性肺病、放射性纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴细胞性浸润性肺病、传染后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎(传统自身免疫性或狼疮样肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)、自身免疫介导的低血糖、具有黑棘皮症的B型胰岛素耐受性、甲状旁腺机能减退、与器官移植相关的急性免疫性疾病、与器官移植相关的慢性免疫性疾病、骨关节病、原发性硬化性胆管炎、特发性白细胞减少(leucopenia)、自身免疫性嗜中性白细胞减少症、肾脏病NOS、肾小球肾炎(glomerulonephritides)、肾显微血管炎(vasulitis)、莱姆病、盘状红斑狼疮、特发性男性不育症或NOS、精子自身免疫性、多发性硬化(所有亚型)、胰岛素依赖性糖尿病、交感性眼炎、结缔组织病继发的肺动脉高压、Goodpasture氏综合征、结节性多动脉炎的肺表现、急性风湿热、类风湿性脊椎炎、Still氏病、全身性硬皮病、Takayasu氏病/动脉炎、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少症、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿性(goitrous)自身免疫性甲状腺功能减退(Hashimoto氏病)、萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退、原发性粘液性水肿、晶状体性(phacogenic)葡萄膜炎、原发性血管炎和白癜风。本发明的人抗体和抗体部分可以用于治疗自身免疫疾病,特别是与炎症相关的那些,包括类风湿性脊椎炎、变态反应、自身免疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎。
优选地,本发明的抗体或其抗原结合部分用于治疗类风湿性关节炎、Crohn氏病、多发性硬化、胰岛素依赖性糖尿病和银屑病,如部分VII中更详细描述的。
本发明人的抗体或抗体部分还可以与在自身免疫和炎性疾病治疗中有用的一种或多种另外治疗剂一起施用。
本发明的抗体或其抗原结合部分可以单独或组合使用以治疗此种疾病。应当理解本发明的IL-12抗体或其抗原结合部分可以单独或与另外试剂例如治疗剂组合使用,所述另外试剂由技术人员就其预期目的选择。例如,另外试剂可以是领域公认为治疗由本发明的抗体治疗的疾病或状况有用的治疗剂。另外试剂还可以是对治疗组合物赋予有利属性的试剂,例如影响组合物粘度的试剂。
应进一步理解待包括在本发明内的组合是对于其预期目的有用的那些组合。下文阐述的试剂是举例说明性目的的并且不意欲是限制性的。作为本发明的部分的组合可以是本发明的抗体和选自下文列出的至少一种另外试剂。组合还可以包括超过一种另外试剂,例如2或3种另外试剂,如果组合是这样的,从而使得所形成的组合物可以执行其预期功能的话。此外,与IL-12抗体组合使用的在本文中描述的另外试剂不限于它们被认为用于治疗的病症。
优选组合是一种或多种非类固醇消炎药也称为NSAIDS,其包括药物如布洛芬。其他优选组合是皮质类固醇包括强的松龙;当与本发明的抗IL-12抗体组合治疗患者时,通过逐渐减少所需类固醇剂量可以减少或甚至消除类固醇使用的众所周知的副作用。本发明的抗体或抗体部分可以与之组合用于类风湿性关节炎的治疗剂的非限制性例子包括下述:一种或多种细胞因子抑制性消炎药(CSAIDs);针对其他人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂,所述其他人细胞因子或生长因子例如TNF(包括阿达木单抗(adalimumab)/HUMIRA)、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF。本发明的抗体或其抗原结合部分可以与针对细胞表面分子或其配体包括CD154(gp39或CD40L)的抗体组合,所述细胞表面分子例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90。
治疗剂的优选组合可以在自身免疫和后续炎症级联中的不同点上进行干扰;优选例子包括TNF拮抗剂如嵌合、人源化或人TNF抗体,D2E7(于1996年2月9日提交的美国申请系列号08/599,226),cA2(RemicadeTM),CDP 571,抗TNF抗体片段(例如,CDP870),和可溶性p55或p75 TNF受体,其衍生物,(p75TNFR1gG(EnbrelTM)或p55TNFR1gG(Lenercept),可溶性IL-13受体(sIL-13),以及TNFα转换酶(TACE)抑制剂;类似地由于相同原因,IL-1抑制剂(例如,白细胞介素-1转换酶抑制剂,例如Vx740或IL-1RA等)可以是有效的。其他优选组合包括白细胞介素11、抗P7s和p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)。另外一种优选组合是自身免疫应答的其他关键参与物(player),其可以与IL-12功能平行作用,依赖于IL-12功能或与IL-12功能协同作用;尤其优选的是IL-18拮抗剂,包括IL-18抗体或可溶性IL-18受体、或IL-18结合蛋白质。已显示IL-12和IL-18具有重叠但不同的功能,并且针对两者的拮抗剂组合可能是最有效的。另外一种优选组合是非耗尽性抗CD4抑制剂。另外一种优选组合包括共刺激途径CD80(B7.1)或CD86(B7.2)的拮抗剂,包括抗体、可溶性受体或拮抗性配体。
抗IL-12抗体或其抗原结合部分也可以与下述试剂组合,所述试剂例如氨甲蝶呤、6-MP、硫唑嘌呤柳氮磺吡啶、美沙拉秦、奥沙拉嗪氯喹(chloroquinine)/羟氯喹、青霉胺、硫化苹果酸金(肌内和经口)、硫唑嘌呤、秋水仙碱、皮质类固醇(经口、吸入和局部注射)、β-2肾上腺素受体激动剂(沙丁胺醇、特布他林、沙美特罗(salmeteral)、黄嘌呤(茶碱、氨茶碱)、色甘酸盐、萘多罗米、酮替芬、异丙托铵和乙东碱、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟洛米、NSAIDs例如布洛芬、皮质类固醇例如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷(adensosine)激动剂、抗凝剂、补体抑制剂、肾上腺素能药、干扰经由促炎细胞因子例如TNFα或IL-1发信号的试剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转换酶抑制剂(例如Vx740)、抗P7s、p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)、TNFα转换酶(TACE)抑制剂、T细胞发信号抑制剂例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如可溶性p55或p75 TNF受体以及衍生物p75TNFRIgG(EnbrelTM)和p55TNFRIgG(Lenercept)、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R、可溶性IL-13受体(sIL-13))和抗炎细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)。优选组合包括氨甲蝶呤或来氟洛米,并且在中度或重度类风湿性关节炎的情况下,环孢菌素。
抗IL-12抗体或抗体部分可以与之组合用于炎性肠病的治疗剂的非限制性例子包括下述:布地奈德;表皮生长因子;皮质类固醇;环孢菌素,柳氮磺吡啶;氨基水杨酸盐;6-巯基嘌呤;硫唑嘌呤;甲硝唑;脂肪加氧酶抑制剂;美沙拉秦;奥沙拉嗪;巴柳氮;抗氧化剂;血栓烷抑制剂;IL-1受体拮抗剂;抗IL-1β单克隆抗体;抗IL-6单克隆抗体;生长因子;弹性蛋白酶抑制剂;吡啶基-咪唑化合物;针对其他人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂,所述其他人细胞因子或生长因子例如TNF(包括阿达木单抗/HUMIRA)、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF。本发明的抗体或其抗原结合部分可以与针对细胞表面分子或其配体的抗体组合,所述细胞表面分子例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90。本发明的抗体或其抗原结合部分还可以与下述试剂组合,所述试剂例如氨甲蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟洛米、NSAIDs例如布洛芬、皮质类固醇例如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、补体抑制剂、肾上腺素能药、干扰经由促炎细胞因子例如TNFα或IL-1发信号的试剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转换酶抑制剂(例如Vx740)、抗P7s、p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)、TNFα转换酶抑制剂、T细胞发信号抑制剂例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如可溶性p55或p75TNF受体、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R、可溶性IL-13受体(sIL-13))和抗炎细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)。
其中抗体或抗原结合部分可以组合用于Crohn氏病的治疗剂的优选例子包括下述:TNF拮抗剂,例如抗TNF抗体,D2E7(阿达木单抗/HUMIRA),cA2(RemicadeTM),CDP 571,抗TNF抗体片段(例如,CDP870),TNFR-Ig构建体(p75TNFRIgG(EnbrelTM)和p55TNFRIgG(Lenercept)),抗P7s,p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL),可溶性IL-13受体(sIL-13)和PDE4抑制剂。本发明的抗体或其抗原结合部分可以与皮质类固醇例如布地奈德和地塞米松组合。抗体还可以与下述试剂组合,所述试剂例如柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸和奥沙拉嗪,以及干扰促炎细胞因子例如IL-1的合成或作用的试剂,例如IL-1β转换酶抑制剂(例如Vx740)和IL-1ra。抗体或其抗原结合部分还可以与T细胞发信号抑制剂例如酪氨酸激酶抑制剂6-巯基嘌呤一起使用。抗体或其抗原结合部分可以与IL-11组合。
抗体或抗体部分可以与之组合用于多发性硬化的治疗剂的非限制性例子包括下述:皮质类固醇;强的松龙;甲基强的松龙;硫唑嘌呤;环磷酰胺;环孢菌素;氨甲蝶呤;4-氨基吡啶;替扎尼定;干扰素-β1a(Avonex;Biogen);干扰素-β1b(Betaseron;Chiron/Berlex);共聚物1(Cop-1;Copaxone;Teva Pharmaceutical Industries,Inc.);高压氧;静脉内免疫球蛋白;克拉屈滨(clabribine);针对其他人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂,所述其他人细胞因子或生长因子例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF。本发明的抗体或其抗原结合部分可以与针对细胞表面分子的抗体组合,所述细胞表面分子或其配体例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90。本发明的抗体或其抗原结合部分还可以与下述试剂组合,所述试剂例如氨甲蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟洛米、NSAIDs例如布洛芬、皮质类固醇例如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、补体抑制剂、肾上腺素能药、干扰经由促炎细胞因子例如TNFα或IL-1发信号的试剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转换酶抑制剂(例如Vx740)、抗P7s、p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)、TACE抑制剂、T细胞发信号抑制剂例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如可溶性p55或p75 TNF受体、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R、可溶性IL-13受体(sIL-13))和抗炎细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)。
其中抗体或其抗原结合部分可以组合用于多发性硬化的治疗剂的优选例子包括干扰素-β例如IFNβ1a和IFNβ1b;考帕松、皮质类固醇、IL-1抑制剂、TNF抑制剂、以及针对CD40配体和CD80的抗体。
抗体、抗体部分可以与其他试剂组合用于治疗皮肤状况。例如,本发明的抗体、抗体部分或其他IL-12抑制剂与PUVA疗法组合。PUVA是用于治疗许多不同皮肤状况的补骨脂素(P)和长波紫外辐射(UVA)的组合。本发明的抗体、抗体部分或其他IL-12抑制剂还可以与吡美莫司组合。在另一个实施方案中,本发明的抗体用于治疗银屑病,其中抗体与他克莫司组合施用。在进一步的实施方案中,他克莫司和IL-12抑制剂与氨甲蝶呤和/或环孢菌素组合施用。在另外一个实施方案中,本发明的IL-12抑制剂与准分子激光治疗一起施用用于治疗银屑病。
本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体或抗体部分。“治疗有效量”指在所需剂量和时间段有效达到所需治疗结果的量。抗体或抗体部分的治疗有效量可以根据因素而改变,所述因素例如个体的疾病状态、年龄、性别和重量,和抗体或抗体部分在个体中引发所需应答的能力。治疗有效量还是其中治疗有利作用大于抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用的量。“预防有效量”指在所需剂量和时间段有效达到所需预防结果的量。一般地,因为预防剂量在疾病前或在疾病较早阶段时在受试者中使用,所以预防有效量将小于治疗有效量。
剂量方案可以进行调整以提供最佳所需应答(例如,治疗或预防应答)。例如,可以施用快速灌注剂,可以随着时间过去施用几个分份剂量,或可以如由治疗情形的紧急状态所指示的按比例减少或增加剂量。为了易于施用和剂量一致,以单位剂型配制肠胃外组合物是特别有利的。如本文使用的,单位剂型指适合作为单一用量用于待治疗的哺乳动物受试者的物理上不连续单位;每个单位包含计算的与所需药学载体结合产生所需疗效的预定量活性化合物。关于本发明单位剂型的详细说明由下述指定且直接依赖于下述:(a)活性化合物的独特特征和待达到的具体治疗或预防作用,和(b)配合这种用于治疗个体中的敏感性的活性化合物的领域中的固有局限性。
在一个实施方案中,IL-12抗体或其抗原结合部分在两周一次给药方案上施用,包括例如约50-300mg的两周一次剂量、约100mg-约200mg的剂量、和约125-约175mg的剂量。可替代地,IL-12抗体可以作为一次给药施用,包括例如约200mg剂量的给药、约100mg的给药。在另一个实施方案中,IL-12抗体在每周一次给药方案上施用,包括例如约50-300mg的剂量、约100mg-约200mg的剂量、和约125-约175mg的剂量。应当指出在指定范围内的剂量也包括在本文中,例如85mg、97mg等。
在另一个实施方案中,人IL-12抗体或其抗原结合部分作为单剂施用于具有病症的受试者,在所述病症中IL-12活性是有害的,例如银屑病,其导致治疗。对IL-12抗体或其抗原结合部分的应答可以在受试者中维持延长的时间段。应答的维持可以依照治疗的病症进行监控。例如,用IL-12抗体或其抗原结合部分对于治疗银屑病的应答维持可以通过随着时间过去受试者的PASI 75应答进行测定。对于治疗银屑病的应答维持还可以通过随着时间过去受试者的PASI 50应答或PASI 90应答进行测定。对于治疗银屑病的应答维持可以可替代地通过随着时间过去受试者达到“清除”或“最低限度”PGA得分进行测定,例如0或1的PGA得分。
应当指出剂量值可以随着待减轻的状况类型和严重程度而改变。应进一步理解对于任何具体受试者,根据个体需要和施用或监督组合物施用的人的专业判断,应随着时间过去调整特定剂量方案,并且本文阐述的剂量范围仅是示例性的,并且不意欲限制请求保护的组合物的范围或实践。
VII.本发明的使用
本发明提供了用于抑制受试者中的IL-12活性的方法,所述受试者患有其中IL-12活性有害的病症。在一个实施方案中,本发明提供了治疗银屑病的方法,其包括施用单剂的IL-12抗体或其抗原结合部分。
IL-12 已牵涉于广泛多样病症的病理生理学(Windhagen等人,(1995)J.Exp.Med.182:1985-1996;Morita等人(1998)Arthritis andRheumatism.41:306-314;Bucht等人,(1996)Clin.Exp.Immunol.103:347-367;Fais等人(1994)J.Interferon Res.14:235-238;Parronchi等人,(1997)Am.J.Path.150:823-832;Monteleone等人,(1997)Gastroenterology.112:1169-1178,和Berrebi等人,(1998)Am.J.Path152:667-672;Parronchi等人(1997)Am.J.Path.150:823-832)。本发明提供了用于抑制患有此种病症的受试者中的IL-12活性的方法,所述方法包括给受试者施用本发明的抗体或抗体部分,从而使得抑制受试者中的IL-12活性。优选地,IL-12是人IL-12,并且受试者是人受试者。可替代地,受试者可以是表达本发明的抗体与之交叉反应的IL-12的哺乳动物。再进一步地,受试者可以是hIL-12已引入其内(例如,通过施用hIL-12或通过表达hIL-12转基因)的哺乳动物。本发明的抗体可以施用于人受试者用于治疗目的(下文进一步讨论)。此外,本发明的抗体可以施用于表达抗体与之交叉反应的IL-12的非人哺乳动物用于兽医学目的或作为人疾病的动物模型。就后者而言,此种动物模型可以用于评估本发明的抗体的治疗效果(例如,测试施用剂量和时间过程)。
如本文使用的,短语“其中IL-12活性有害的病症”意欲包括这样的疾病和其他病症,其中在患有病症的受试者中IL-12的存在已显示负责或怀疑负责病症的病理生理学,或者是或怀疑是促使病症恶化的因子。因此,其中IL-12活性有害的病症是其中IL-12活性的抑制预期减轻病症的症状和/或进展的病症。此种病症可以例如通过患有病症的受试者的生物液体中IL-12浓度中的增加(例如,在受试者的血清、血浆、滑液等中IL-12浓度中的增加)得以证明,这可以例如使用如上所述的抗IL-12抗体进行检测。存在其中IL-12活性有害的病症的众多例子。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分可以在疗法中用于治疗本文描述的疾病或病症。在另一个实施方案中,抗体或其抗原结合部分可以用于制造用于治疗本文描述的疾病或病症的药物。本发明的抗体和抗体部分在少数非限制性特定病症的治疗中的用途在下文进一步讨论:
A.类风湿性关节炎:
白细胞介素-12已暗示在炎性疾病例如类风湿性关节炎中起作用。已在来自类风湿性关节炎患者的滑液中检测出可诱导的IL-12p40信息(message),并且已显示IL-12存在于来自具有类风湿性关节炎的患者的滑液中(参见例如,Morita等人,(1998)Arthritis and Rheumatism41:306-314)。已发现IL-12阳性细胞存在于类风湿性关节炎滑膜的衬里下层(sublining layer)中。本发明的人抗体和抗体部分可以用于治疗例如类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、莱姆关节炎、类风湿性脊椎炎、骨关节炎和痛风性关节炎。一般地,全身性施用抗体或抗体部分,尽管对于特定病症,抗体或抗体部分的局部施用可以是有利的。本发明的抗体或抗体部分也可以与在自身免疫疾病治疗中有用的一种或多种另外治疗剂一起施用。
在关于类风湿性关节炎的胶原诱导的关节炎(CIA)鼠类模型中,在关节炎前用抗IL-12 mAb(大鼠抗小鼠IL-12单克隆抗体,C17.15)治疗小鼠深刻抑制疾病的发作,并且减小疾病的发病率和严重程度。在关节炎发作后早期用抗IL-12 mAb治疗减小严重程度,但在疾病发作后小鼠用抗IL-12 mAb的更迟治疗对疾病严重程度具有最低限度作用。
B.Crohn氏病
白细胞介素-12还在炎性肠病——Crohn氏病中起作用。IFN-γ和IL-12的表达增加在具有Crohn氏病患者的肠粘膜中发生(参见例如,Fais等人,(1994)J.Interferon Res.14:235-238;Parronchi等人,(1997)Amer.J.Pathol.150:823-832;Monteleone等人,(1997)Gastroenterology 112:1169-1178;Berrebi等人,(1998)Amer.J.Pathol.152:667-672)。已显示抗IL-12抗体抑制在结肠炎小鼠模型例如TNBS诱导的结肠炎IL-12敲除小鼠中,和近期在IL-10敲除小鼠中的疾病。因此,本发明的抗体和抗体部分可以用于治疗炎性肠病。
C.多发性硬化
白细胞介素-12已暗示为多发性硬化的关键介质。可诱导的IL-12p40信息或IL-12自身的表达可以在具有多发性硬化的患者的损伤中得到证实(Windhagen等人,(1995)J.Exp.Med.182:1985-1996,Drulovic等人,(1997)J.Neurol.Sci.147:145-150)。具有多发性硬化的慢性进行性患者具有升高的IL-12循环水平。用来自具有多发性硬化的患者的T细胞和抗原呈递细胞(APCs)的研究揭示自持(self-perpetuating)系列的免疫相互作用作为进行性多发性硬化的基础,导致Th 1型免疫应答。来自T细胞的IFN-γ的分泌增加导致通过APCs增加的IL-12产生,这维持导致Th1型免疫激活和疾病的慢性状态的循环(Balashov等人,(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94:599-603)。IL-12在多发性硬化中的作用已使用多发性硬化的小鼠和大鼠实验性变应性脑脊髓炎(EAE)模型进行研究。在小鼠中多发性硬化的复发-缓和EAE模型中,用抗IL-12 mAb的预处理延迟瘫痪且减少临床得分。在瘫痪顶峰或在后续缓和时间段过程中用抗IL-12mAb治疗减少临床得分。因此,本发明的抗体或其抗原结合部分可以用来减轻在人中与多发性硬化相关的症状。
D.胰岛素依赖性糖尿病
白细胞介素-12已暗示为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)的重要介质。通过施用IL-12在NOD小鼠中诱导IDDM,并且抗IL-12抗体在IDDM的过继转移模型中是保护性的。早期发作的IDDM患者通常经历所谓的“蜜月期”,在这个过程中一些残留胰岛细胞功能得以维持。这些残留胰岛细胞产生胰岛素,并且比施用的胰岛素更好地调节血糖水平。这些早期发作患者用抗IL-12抗体的治疗可以预防胰岛细胞的进一步破坏,从而维持胰岛素的内源来源。
E.银屑病
白细胞介素-12(IL-12)和相关细胞因子IL-23已暗示为银屑病中的关键介质。银屑病涉及与TH1-型细胞因子表达概况相关的急性和慢性皮肤损伤(Hamid等人(1996)J.Allergy Clin.Immunol.1:225-231;Turka等人(1995)Mol.Med.1:690-699)。IL-12和IL-23都有助于1型T辅助细胞(Th1)免疫应答在银屑病中的发展。此外,IL-12 p40和IL-23 p40信使RNA在银屑病皮肤损伤中超表达。因此,本发明的抗体或其抗原结合部分可以用于减轻慢性皮肤病症例如银屑病。
在一个实施方案中,本发明提供了用于治疗银屑病的方法。用于银屑病的治疗通常包括局部皮质类固醇、维生素D类似物和局部或经口类视黄醇、或其组合。在一个实施方案中,IL-12和/或IL-23抗体与这些常见治疗之一组合施用,或在这些常见治疗之一的存在下施用。可以与IL-12和/或IL-23抗体组合用于治疗银屑病的另外治疗剂在下文更详细地描述。
银屑病的诊断通常基于皮肤的外观。另外,可能需要皮肤活组织检查、或皮肤斑的刮术和培养,以排除其他皮肤病症。如果关节疼痛存在且持久,那么x射线可以用于检查银屑病关节炎。
受试者中银屑病的改善可以通过受试者的银屑病面积和严重程度指数(Psoriasis Area and Severity Index)(PASI)进行监控。用于测定PASI的方法已在Fredriksson和Pettersson(1978)Dermatologica157:238和Marks等人(1989)Arch Dermatol 125:235中描述。简言之,指数基于4个解剖部位(包括头、上肢、躯干和下肢)关于红斑、硬结和脱屑的评估,其中使用5点量表(0=无症状;1=轻度;2=中度;3=显著;4=非常显著)。基于给定解剖部位中的损伤程度,对受累区域指定数值(0=0;1=<10%;2=10-29%;3=30-49%;4=50-69%;5=70=89%;6=90-100%)。然后计算PASI得分,其中PASI得分的可能范围是0.0-72.0,其中最高得分代表最严重程度的完全红皮症。
在本发明的一个实施方案中,IL-12和/或IL-23抗体用于治疗银屑病,包括慢性斑状银屑病、滴状银屑病、皮褶银屑病、脓疱性银屑病、寻常天疱疮、红皮性银屑病、与炎性肠病(IBD)相关的银屑病、和与类风湿性关节炎(RA)相关的银屑病。在另一个实施方案中,IL-12和/或IL-23抗体例如J695/ABT-874与PsA组合用于治疗具有银屑病的受试者。在本发明的治疗方法中包括的银屑病的具体类型在下文详细描述:
a.慢性斑状银屑病
慢性斑状银屑病(也称为牛皮癣)是最常见形式的银屑病。慢性斑状银屑病的特征在于从硬币大小到大得多的隆起变红的皮肤斑。在慢性斑状银屑病中,斑可以单个或多个,它们在大小中可以从数毫米到几厘米不等。斑通常是具有鳞状表面的红色,并且当轻轻搔抓时反射光,从而产生“银色”效果。来自慢性斑状银屑病的损伤(其通常是对称的)遍及身体发生,但偏爱伸肌面,包括膝、肘、腰骶区、头皮和指甲。偶然地,慢性斑状银屑病可以在阴茎、女阴和弯曲上发生,但通常不存在起鳞(scaling)。具有慢性斑状银屑病的患者的诊断通常基于上文描述的临床特征。特别地,在慢性斑状银屑病中损伤的分布、颜色和一般银色起鳞是慢性斑状银屑病的特征。
b.滴状银屑病
滴状银屑病指具有特征性水滴形鳞状斑的银屑病形式。滴状银屑病的突然爆发一般在感染后,最特别在链球菌咽喉感染后。滴状银屑病的诊断通常基于皮肤的外观,和通常存在近期咽喉痛史的事实。
c.皮褶银屑病
皮褶银屑病是其中患者具有平滑、通常潮湿的皮肤区域的银屑病形式,所述皮肤区域是红色和发炎的,不像与斑状银屑病相关的起鳞。皮褶银屑病也称为擦烂性(intertiginous)银屑病或屈侧银屑病。皮褶银屑病主要在腋窝、腹股沟、乳房下以及在生殖器和臀周围的其他皮肤褶中发生,并且由于呈现的位置,摩擦和出汗可以刺激受累区域。
d.脓疱性银屑病
脓疱性银屑病也称为掌跖银屑病,是引起充满脓性的水泡的银屑病形式,所述充满脓的水泡在大小和位置方面不同,但通常在手和足上发生。水泡可以是局限性的或传播经过身体的大面积。脓疱性银屑病可以是触痛和疼痛的,并且可以引起发烧。
e.其他银屑病病症
可以用IL-12和/或IL-23抗体治疗的银屑病病症的其他例子包括红皮性银屑病、寻常的、与IBD相关的银屑病、和与关节炎包括类风湿性关节炎相关的银屑病。
本发明通过下述实施例进一步举例说明,所述实施例不应视为以任何方式限制性的。如本申请自始至终引用的所有引用参考文献的内容,包括文献参考资料、授权的专利和公开的专利申请,在此特别引入本文作为参考。应进一步理解与之附着的所有表(参见与之附着的附录A和美国专利号6,914,128的附录A)的内容以及美国专利号6,914,128的完整内容引入本文作为参考。
实施例
实施例1:全人IL-12/IL-23单克隆抗体ABT-874在中度至重度斑状银屑病治疗中的功效。
ABT-874是针对白细胞介素-12(IL-12)和IL-23的全人抗体。它以巨大亲和力与银屑病(Ps)治疗中的2种确认靶IL-12和IL-23共有的p40亚单位结合。
下述研究的目的是评估ABT-874的皮下注射在具有中度至重度斑状Ps的患者治疗中的功效。
在基线时具有影响≥10%体表面积(BSA)以及银屑病面积和严重程度指数(PASI 75)得分≥12的Ps的成年人患者对于这项12周、双盲、安慰剂对照研究是合格的。将患者随机化到6个臂(arms)之一:1)100-mg ABT-874每隔一周(eow)进行12周;2)在第0周时一次200-mg ABT-874给药;3)200-mg ABT-874每周进行4周;4)200-mg ABT-874 eow进行12周;5)200-mg ABT-874每周进行12周;或6)安慰剂。初级终点是在第12周时的≥PASI75应答。其他功效评估包括PASI50和医生全局评价(Physician’s Global Assessment)(PGA)。满足初级终点的患者进入36周不知情/再治疗期,并且就应答丧失的时间进行监控。
总共180个患者入组研究,每个臂中30个。基线特征在臂之间是相似的且指示中度至重度Ps(除男性%外全是平均值):年龄,46岁,74%男性;21年Ps持续时间;PASI 19;和25%受累BSA。在第12周时,达到≥PASI75的患者百分比对于在5个ABT-874臂的每一个中的患者与安慰剂比较在统计学上显著更大(分别93%、63%、90%、93%、90%与3%比较,p<0.001,ITT)。此外,达到≥PASI50的患者百分比对于在5个ABT-874臂的每一个中的患者与安慰剂比较在统计学上显著更大(100%、77%、97%、97%和100%与17%比较,p<0.001)。在第12周时,PASI中的平均百分比下降(改善)在ABT-874臂中分别是90%、70%、92%、92%和90%,并且对于安慰剂是26%。类似地,具有清除/最低限度PGA的患者百分比在ABT-874臂中分别是83%、50%、73%、87%和87%,并且对于安慰剂是3%。
总的来说,在中度至重度斑状银屑病治疗中ABT-874比安慰剂显著更有效。
实施例2:全人IL-12/-23单克隆抗体ABT-874在中度至重度斑状银屑病治疗中的安全性和功效
ABT-874是针对白细胞介素12(IL-12)和IL-23的全人抗体。它以巨大亲和力与银屑病(Ps)治疗中的确认靶IL-12和IL-23共有的p40亚单位结合。这项II期研究的目的是研究ABT-874的皮下注射在中度至重度斑状Ps的治疗中的功效和安全性。
具有影响≥10%体表面积(BSA)和PASI得分≥12的Ps的成年人对于这项12周、双盲、安慰剂对照研究是合格的。将患者随机化到6个臂之一:1)100-mg ABT-874每隔一周(eow)进行12周;2)在第0周时一次200-mg ABT-874给药;3)200-mg ABT-874每周进行4周;4)200-mg ABT-874 eow进行12周;5)200-mg ABT-874每周进行12周;或6)安慰剂。初级终点是在第12周时的≥PASI75应答。满足初级终点的患者进入36周不知情/再治疗期,并且就应答丧失的时间进行监控。所有患者就安全性评估直到第54周。
180个患者入组,每个臂中30个。基线特征在臂之间是相似的(除男性%外全是平均值):年龄,46岁,74%男性;21年Ps持续时间;PASI=19;和25%受累BSA。在第12周时,具有≥PASI75的患者%在5个ABT-874臂的每一个中与安慰剂比较在统计学上显著更大(分别93%、63%、90%、93%、90%与3%比较,p<0.001,ITT)。在12周、DB期过程中,对于ABT-874组的传染性AEs是23-43%,并且对于安慰剂组是23%,其中最常见的是鼻咽炎(对于ABT-874 7-17%;对于安慰剂3%)。在组之间不存在统计学上显著的差异。未报告严重传染性AEs,并且未发生死亡。
总的来说,在中度至重度斑状Ps治疗中ABT-874比安慰剂显著更有效,并且看起来具有有利的安全性概况。
实施例3:在中度至重度斑状银屑病治疗中用全人IL-12/-23单克隆抗体ABT-874的应答维持
在12周、II期、随机化对照的试验和36周随访期中评估ABT-874的功效和安全性。下述实施例的目的是分析在中度至重度斑状Ps治疗中ABT-874的皮下注射的这项II期研究的第二个12周过程中,治疗中断后的应答维持。
具有影响≥10%体表面积(BSA)和PASI得分≥12的Ps的成年人对于这项12周、双盲、安慰剂对照研究是合格的。将患者随机化到6个臂之一:
1)100-mg ABT-874每隔一周(eow)进行12周;
2)在第0周时一次200-mg ABT-874给药;
3)200-mg ABT-874每周进行4周;
4)200-mg ABT-874 eow进行12周;
5)200-mg ABT-874每周进行12周;或
6)安慰剂。
初级终点是在第12周时的≥PASI75应答。满足初级终点的患者进入36周不知情/再治疗期。用研究药物的治疗中断,并且患者就应答丧失的时间(在36周随访时间段过程中的任何时间,PASI得分中至<PASI 50的下降)进行监控。PASI应答的维持评估直到第24周。
总共180个患者入组,每个臂中30个。基线特征在臂之间是相似的(除男性%外全是平均值):年龄,46岁,74%男性;21年Ps持续时间;PASI=19;和25%受累BSA。
在第12周时,具有≥PASI75的患者百分比在5个ABT-874臂的每一个中与安慰剂比较在统计学上显著更大(表1)。在第24周时,在主动治疗臂中相当大百分比的PASI 75应答者已维持至少PASI 50应答。
表1:ABT-874的24周功效
*与安慰剂比较p<0.001,NRI。
总的来说,在中度至重度斑状Ps治疗中ABT-874比安慰剂显著更有效。在主动治疗中断后,在第24周时相当大百分比的PASI 75应答者维持这些应答。
实施例4:ABT-874全人IL-12/-23单克隆抗体在中度至重度慢性斑状银屑病治疗中的安全性和功效
下述实施例的目的是证实在具有临床上稳定的中度至重度慢性斑状银屑病的患者治疗中,与安慰剂相比较,一系列人IL-12/23单克隆抗体(ABT-874)给药的功效和安全性。
I.材料与方法
A.研究设计:下述研究是在美国(16个场所)和加拿大(8个场所)的24个中心进行的12周、多中心、随机化、双盲、II期、安慰剂对照试验。ABT-874(Abbott Laboratories,Abbott Park,IL)是具有基因工程改造的互补性决定区的人单克隆抗体,所述互补性决定区对于IL-12/23 p40亚单位蛋白质具有高亲和力。患者以1∶1∶1∶1∶1∶1比进行随机化,以接受6种治疗之一:200mg ABT-874,在第0周时1次给药(200mg×1);100mg ABT-874每隔一周(eow)进行12周(100mg eow);200mg ABT-874每周进行前4周(200mg×4);200mg ABT-874 eow进行12周(200mg eow);200mg ABT-874每周进行12周(200mg每周);或安慰剂。在第12周后,达到银屑病面积和严重程度指数中的至少75%减少(PASI 75)应答的所有患者继续进入36周不知情观察/再治疗期内。
B.患者:患者年龄≥18岁,并且具有至少6个月的银屑病临床诊断(通过患者会诊和通过经由研究人员的体格检查的诊断证实测定),在筛选前至少2个月和在基线就诊时如通过受试者会诊测定的稳定斑状银屑病,在基线就诊时通过≥10%体表面积(BSA)累及定义的中度至重度斑状银屑病,在基线就诊时≥12的PASI得分,和在基线就诊时至少中度疾病的医生全局评价(PGA)。
如果患者具有先前对全身性或生物学抗IL-12疗法的暴露;非斑状银屑病;在基线就诊前不能中断下述疗法:至少2周前的局部银屑病疗法、至少2周前的紫外线B光线疗法、至少4周前的补骨脂素-紫外线光线疗法、至少4周前的全身疗法、和至少12周前的生物学疗法;在研究过程中需要摄取经口或可注射皮质类固醇(允许用于稳定医学状况的吸入皮质类固醇);在筛选前10年中需要住院治疗的哮喘恶化;关于严重感染的感染或危险因子;除成功治疗的基底细胞癌(排除具有鳞状细胞癌史的患者)或原位宫颈癌外的恶性肿瘤史;或针对含免疫球蛋白G试剂(例如,静脉内丙种球蛋白、融合蛋白或单克隆抗体)的主要免疫反应(例如,血清病或过敏样反应)史,那么他们是不合适的。
在研究过程期间允许患者继续用不包含皮质类固醇的含药洗发剂,温和性(不含β-或α-羟酸)润滑药,或在其掌、足底、面部、乳头下区域和腹股沟区域上的VI或VII类低效局部用皮质类固醇的治疗。这些局部银屑病治疗的应用不在研究就诊24小时内发生。在用ABT-874给药前1个月内、在研究过程中、或在研究药物的最后一剂施用后1个月,不允许用活病毒剂的接种疫苗。
下述临床上显著的异常实验室结果中任何一种的发生导致患者从研究中立即撤出:天冬氨酸转氨酶或丙氨酸转氨酶>正常上限5倍;血清总胆红素>正常上限3倍;血清肌酸酐>正常上限3倍;肌酸磷酸激酶>正常上限5倍;血红蛋白<8g/dL;白细胞计数<2×109/L;或血小板计数<75×109/L。
C.功效评估:初级功效评估是在第12周时达到PASI 75应答的患者百分比,所述PASI 75应答定义为相对于基线得分在PASI得分中的至少75%减少。PASI是银屑病损伤(就红斑、硬结和脱屑而言)严重程度和BSA累及程度的量度。PASI得分为0(无银屑病)到72(严重疾病)(Fredriksson T,Pettersson U.Dermatologica 1978;157:238-44)。其他功效测量包括在第1、2、4和8周时达到至少PASI 75的患者百分比;在第1、2、4、8和12周时达到至少PASI 50或PASI 90的患者百分比;和在第12周时以及在第1、2、4和8周时获得清除或最低限度PGA的患者百分比。PGA在6点量表上测量疾病严重程度,所述6点量表为0(无疾病,或清除)到5(非常严重)(Ko H-S.Clinical trial design in psoriasis.Presented at:49th Meeting ofthe Dermatologic and Ophthalmologic Advisory Committee;March 20,1998;Bethesda,MD)。
D.安全性评估:研究自始至终评估不利事件、实验室数据和生命体征。患者就感染病征、恶性肿瘤和免疫反应进行密切监控。治疗引出的AEs被定义为在第0周和最后一次未遗漏(nonmissing)研究药物给药后45天早些时候或第一次再治疗给药前1天(对于继续到36周试验的那些患者)之间发生的那些事件。
E.统计学分析:使用nQuery
4.0(Statistical Solutions,Saugus,MA)计算样本大小。假定安慰剂组中的15%患者在第12周时将达到PASI 75应答,研究设计者确定在每个剂量组中26的样本大小将足以检测来自治疗组的至少45%差异,其中使用在0.05双侧(2-side)显著水平上具有90%势(power)的Fisher精确检验。该研究设计为使约180个患者入组,其中在每个组中30个患者。
意向治疗群体包括在第0周时随机化且接受研究药物的至少1次注射的所有患者;这个群体用于功效分析。所有检验在α=0.05下进行。非应答者归咎用于所有功效分析;在任何就诊时具有遗漏PASI或PGA得分的任何患者都被视为在那次就诊时的非应答者。为了评估遗漏数据的影响,使用末次观察推进法(last-observation-carried-forwardmethod)完成12周数据的灵敏度分析。在第12周时PASI 75应答的初级分析使用下述顺序执行以调整多重性:200mg每周与安慰剂比较、200mg eow与安慰剂比较、100mg eow与安慰剂比较、200mg×4与安慰剂比较、和200mg×1与安慰剂比较。对于PASI得分中的平均百分比改变,在每个ABT-874治疗组和安慰剂组之间的治疗差异使用方差分析进行评估,其中基线PASI得分和治疗组作为因子。使用安全性群体进行安全性分析,这包括接受研究药物的至少1次注射的所有患者。
II.结果
A.患者:总共180个患者入组,并且随机化至6个治疗组之一(图1)。大多数患者(76.7%的安慰剂治疗患者和98%的所有ABT-874治疗组患者)完成了研究的12周部分。
就人口统计学特征和疾病活动性而言患者跨越治疗组良好平衡(表1)。患者占优势地是男性(74.4%)和白人(92.2%)。平均BSA累及是25%,并且平均PASI得分是18.8。
B.功效:在第12周时达到PASI 75应答的初级终点的患者百分比与安慰剂(3.3%,30个中的1个)相比较在所有ABT-874治疗组(200mg×1:63.3%,30个中的19个;100mg eow:93.3%,30个中的28个;200mg×4:90.0%,30个中的27个;200mg eow:93.3%,30个中的28个;200mg每周:90.0%,30个中的27个)中在统计学上显著更大(p<0.001)。对于这个试验相对短的持续时间,在所有ABT-874治疗组中的PASI 75应答是相似的,除200mg×1治疗组外(图2)。
通过人口统计学(性别、年龄、种族和重量)、基线疾病特征(银屑病关节炎史、BSA和PASI得分)、和在接受研究治疗的12个月内关于银屑病的基线治疗(全身性生物学和非生物学、局部和光线疗法)的亚组分析证实,在各个亚组内的ABT-874治疗患者在第12周时一致地达到高水平的PASI 75应答。
到第12周时接近100%的较高ABT-874剂量组获得至少PASI 50应答(200mg×1:76.7%,30个中的23个;100mg eow:100.0%,30个中的30个;200mg×4:96.7%,30个中的29个;200mg eow:96.7%,30个中的29个;200mg每周:100.0%,30个中的30个;安慰剂:16.7%,30个中的5个;对于与安慰剂的每次比较p<0.001)。当与安慰剂相比较时,在第12周时达到至少PASI 90应答的患者百分比在除1个(200mg×1)外的所有ABT-874治疗组中在统计学上显著更大(p<0.001),如下:200mg×1:16.7%,30个中的5个;100mg eow:53.3%,30个中的16个;200mg×4:63.3%,30个中的19个;200mg eow:76.6%,30个中的23个;200mg每周:53.3%,30个中的16个;和安慰剂:0%,30个中的0个。此外,到第12周时,与安慰剂组中的患者相比较,在所有ABT-874治疗组中显著更多(p<0.001)的患者已获得清除或最低限度的PGA等级,如下:200mg×1:50.0%,30个中的15个;100mg eow:83.3%,30个中的25个;200mg×4:73.3%,30个中的22个;200mg eow:86.7%,30个中的26个;200mg每周:86.7%,30个中的26个;与安慰剂比较:3.3%,30个中的1个。
与安慰剂相比较(0%,30个中的0个),在第12周时达到PASI100应答的初级终点的患者百分比在下述ABT-874治疗组(200mgeow:46.7%,30个中的14个;200mg每周:36.7%,30个中的11个)中在统计学上显著更大(p<0.001)。
针对ABT-874的应答是快速的。对于所有ABT-874治疗组,自基线的PASI得分中的平均百分比改善随着时间过去增加(图3),并且在每个时间点上与安慰剂相比较对于每个ABT-874治疗组在统计学上显著更大(p<0.001,除在第1周时的100mg eow组外,p=0.023)。
C.安全性:ABT-874治疗一般是良好耐受的(表2)。由于局限性皮肤脱色,用ABT-874治疗的1个(0.7%)患者中断研究;用安慰剂治疗的2个(6.7%)患者中断研究,1个是由于牛皮癣性关节病和1个是由于卵巢癌。2个(1.1%)患者经历严重不利事件(AEs);1个安慰剂治疗的患者在第37天时诊断有卵巢癌,并且1个ABT-874治疗的患者(200mg×1)在第10天时诊断有肋软骨炎。没有患者经历心肌或大脑梗死,并且不存在死亡。
接受任何ABT-874给药的患者比接受安慰剂的患者显著(p=0.033)更可能经历至少可能与研究药物有关的AE(ABT-874:36.0%,150个中的54个;安慰剂:10.0%,30个中的3个;表2);这些AEs中的大多数与注射部位有关(注射部位反应、红斑、瘙痒或刺激)。
大多数AEs是轻度的(轻度AEs在46.0%[150个中的69个]ABT-874治疗的患者和30.0%[30个中的9个]安慰剂治疗的患者中发生)。最常见AE是注射部位反应,在用任何ABT-874给药治疗的16.7%(150个中的25个)患者中发生(对于安慰剂治疗的患者未报告注射部位反应;p=0.028;表3)。与安慰剂治疗的患者相比较,在ABT-874治疗的患者中在其他AEs的发生率之间不存在统计学上的显著差异。接下来最常报告的AEs是鼻咽炎和上呼吸道感染。
传染性AEs由所有患者的32.8%(180个中的59个)报告(安慰剂:23.3%,30个中的7个;所有ABT-874治疗的患者:34.7%,150个中的52个)。对于任何ABT-874治疗组报告的最常见传染性AEs是鼻咽炎(12.0%,150个中的18个)、上呼吸道感染(10.7%,150个中的16个)、以及支气管炎和病毒感染(两者都是2.7%,150个中的4个)。未报告严重传染性AEs。
2个患者在研究过程中报告恶性肿瘤。1个安慰剂治疗的患者诊断有卵巢癌,这自第129天时起形成(ongoing)。1个ABT-874治疗的患者(200mg×4)诊断有非黑素瘤皮肤癌(鳞状细胞癌),这在第133天时除去。关于这个患者的医疗史包括在2005年3月良性皮肤生长的除去。
与安慰剂相比较,不存在临床上显著的血液病、化学(包括血糖浓度)或生命体征改变。
III.结论
在这个实施例中描述的II期、多中心、随机化、双盲、安慰剂对照试验证实ABT-874在中度至中度慢性斑状银屑病治疗中统计学上和临床上显著的功效。除ABT-874 200mg×1治疗组外,与3.3%安慰剂治疗的患者相比较,在所有ABT-874治疗组中90%或更多的患者到第12周时达到PASI 75或更大。甚至在接受研究药物的仅1次给药的组(200mg×1)中,大多数(63.3%)患者到第12周时已达到至少PASI 75。此外,几乎100%用ABT-874治疗的患者到第12周时达到PASI 50或更大,这被视为临床上显著的改善(Carlin CS,FeldmanSR,Krueger JG,Menter A,Krueger GG.J Am Acad Dermatol 2004;50:859-66)。关于其他次级终点例如PASI 90和清除或最低限度的PGA的结果与初级功效分析一致,并且支持初级功效分析。
针对ABT-874的应答是快速的。对于PASI得分中的平均百分比改善,在安慰剂和ABT-874治疗的患者之间统计学上显著的分离早在第1周时发生。改善对于试验的12周持续时间持续,甚至对于在ABT-874 200mg×1和200mg×4剂量组中的患者。
ABT-874是良好耐受的,并且大多数AEs是轻度的。尽管ABT-874治疗的患者明显更可能经历至少可能与研究药物有关的AE,但其中大多数是注射部位相关AEs(注射部位反应、红斑、瘙痒或刺激)。在增加的ABT-874剂量和增加的AEs发生率之间不存在明显关联。重要地,不存在心肌或大脑梗死。
对于接受抗IL-12/23抗体的患者,免疫学相关事件是特别有利的。最常报告的传染性AEs是鼻咽炎、上呼吸道感染、支气管炎和病毒感染。对于这个试验的持续时间未报告严重传染性AEs。在研究过程中诊断出的2个恶性肿瘤中,卵巢癌在安慰剂治疗的患者中诊断出,并且非黑素瘤皮肤癌在ABT-874治疗的患者中诊断出,其具有良性皮肤生长史。
总起来说,ABT-874显示了用于治疗具有中度至中度慢性斑状银屑病的患者的统计学上和临床上显著的利益,并且是良好耐受的。
实施例5:全人IL-12/-23单克隆抗体ABT-874在中度至重度斑状银屑病治疗中的应答维持
在12周、II期、随机化对照试验和36周随访期中评估ABT-874的功效和安全性。下述实施例的目的是分析在中度至重度斑状Ps治疗中ABT-874的皮下注射的这项II期研究的第二个12周过程中,治疗中断后的应答维持。
具有影响≥10%体表面积(BSA)和PASI得分≥12的Ps的成年人对于这项12周、双盲、安慰剂对照研究是合格的。将患者随机化到6个臂之一:
1)100-mg ABT-874每隔一周(eow)进行12周;
2)在第0周时一次200-mg ABT-874给药;
3)200-mg ABT-874每周进行4周;
4)200-mg ABT-874eow进行12周;
5)200-mg ABT-874每周进行12周;或
6)安慰剂。
初级终点是在第12周时的≥PASI75应答。满足初级终点的患者进入36周不知情/再治疗期。用研究药物的治疗中断,并且在36周随访时间段过程中的各个时间点上,患者就PASI得分进行监控,包括PASI50、PASI 75和PASI 90应答。PASI应答的维持评估直到第24周。
总共180个患者入组,每个臂中30个。基线特征在臂之间是相似的(除男性%外全是平均值):年龄,46岁,74%男性;21年Ps持续时间;PASI=19;和25%受累BSA。
在第12周时,具有≥PASI75的患者百分比在5个ABT-874臂的每一个中与安慰剂比较在统计学上显著更大(表4)。在第24周时,在主动治疗臂中相当大百分比的PASI 75应答者已维持至少≥PASI 50的PASI得分。此外,在主动治疗臂中相当大百分比的PASI 75应答者也已维持至少≥PASI 75的PASI得分,以及≥PASI 90的PASI得分(表4和图4A-C)。在24周时间段过程中随时间过去维持PASI 75应答的患者百分比在图4D中描述。
表4:ABT-874的24周功效
*与安慰剂比较p<0.001,NRI。
总的来说,在中度至重度斑状Ps治疗中ABT-874比安慰剂显著更有效。在主动治疗中断后,在第24周时相当大百分比的PASI 75应答者维持≥PASI 50、≥PASI 75和≥PASI 90的应答。
实施例6:在中度至重度斑状银屑病治疗中用全人IL-12/-23单克隆抗体ABT-874的再治疗应答的维持
在48周、II期、随机化对照试验(其包括12周初始治疗期和响应初始治疗患者的36周再治疗期)中评估ABT-874的功效和安全性。初始12周功效结果和应答维持结果在上述实施例中描述。下述实施例的目的是在中度至重度斑状Ps治疗中ABT-874的皮下注射的这项II期研究的丧失其初始应答的患者中,检查在36周再治疗/随访期过程中的再治疗应答。下述实施例的进一步目的是在中度至重度斑状Ps治疗中检查ABT-874的皮下注射的安全性直到48周。
在基线时,人口统计学和临床特征跨越治疗组是相似的(在下表5中概括)。
表5:基线人口统计学和临床特征
具有影响≥10%体表面积和银屑病面积和严重程度指数(PASI)得分≥12的银屑病的成年人随机化到6个臂之一:1)在第0周时一次200-mg给药ABT-874;2)100mg ABT-874每隔一周(eow)进行12周;3)200-mg ABT-874每周进行4周;4)200-mg ABT-874 eow进行12周;5)200-mg ABT-874每周进行12周;或6)安慰剂。初级终点是在第12周时的≥PASI75应答。满足初级终点的患者进入36周再治疗期。用研究药物的治疗中断,并且在12-36周过程中丧失应答(≤PASI 50)的患者接受用在初始12周时间段过程中指定的相同给药方案的再治疗。再治疗持续12周。与安排无关,对于研究的整个持续时间或直至中断监控所有患者。
在最初入组的180个患者中,130个(1个安慰剂)进入再治疗期,并且58个(全部ABT-874)进行再治疗。在第12周时达到≥PASI75和随后在再治疗后12周时再次达到≥PASI 75的患者百分比对于每个组如下:分别地,一次200-mg给药,63%与55%比较;100mg eow,93%与94%比较;200mg每周4周,90%与69%比较;200mg eow,93%与75%比较;和200mg每周,90%与83%比较。在再治疗的总共58个患者中,76%在再治疗后12周时达到≥PASI 75。
对于再治疗的患者随着时间过去PASI得分中的改善在图5A-B中描绘。具体地,图5A显示在PASI应答者中从第4周到第12周在PASI得分中距离基线的平均百分比改善,并且图5B显示在PASI 75应答者中从再治疗后第4周到第12周在PASI得分中距离基线的平均百分比改善。
在再治疗后在第12周时达到≥PASI 50的患者百分比对于每个组如下:一次200-mg给药,82%;100mg eow,100%;200mg每周4周,77%;200mg eow,83%;和200mg每周,100%。在再治疗的总共58个患者中,88%在再治疗后在第12周时达到≥PASI 50。
在再治疗后在第12周时达到“清除”或“最低限度”PGA的患者百分比对于每个组如下:一次200-mg给药,36%;100mg eow,75%;200mg每周4周,62%;200mg eow,67%;和200mg每周,83%。在再治疗的总共58个患者中,64%在再治疗后在第12周时达到“清除”或“最低限度”PGA。
在至少1个治疗组中直到第48周以递减顺序发生≥5%的不利事件(AEs)是:鼻咽炎、注射部位反应、上呼吸道感染、头痛、高血压和关节痛。直到第48周的治疗引出的不利事件概述显示于下表6中。在任何治疗组中发生率≥5%的治疗引出的不利事件概述显示于下表7中。
表6:直到第48周临床治疗引出的不利事件概述*
表7:直到第48周在任何治疗组中发生率为5%的治疗引出的不利事件*
前述数据证实ABT-874在中度至重度银屑病治疗中是高度有效的。在应答丧失和再治疗后,大多数患者能够再次达到PASI 75应答。此外,ABT-874看起来具有长期有利的安全性概况。
实施例7:全人IL-12/-23单克隆抗体ABT-874在正常健康志愿者中的药物代谢动力学
在随机化、双盲、安慰剂对照的剂量范围研究中评估一系列ABT-874给药的可耐受性、安全性和药物代谢动力学(PK)。下述实施例的目的是研究在健康志愿者中ABT-874的静脉内(IV)和皮下(SC)注射的药物代谢动力学。
主要包括标准是:(i)18到45岁的健康男性志愿者;(ii)在筛选检查研究(体格检查、生命体征、心电图、生物化学、血液学、尿分析、血清学)的任何一种中无临床相关异常;和(iii)在进入研究前12个月内胸部X线检查正常。主要排除标准是:(i)每天抽烟超过10根;(ii)每天喝酒超过30g;(iii)尿药物筛选阳性;(iv)尤其是经由细胞内细菌性病原体例如结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的慢性感染;和(v)在先前2年内需要住院治疗或IV抗生素的主要感染。
年轻的(18-45岁)、健康男性志愿者在2时间段交叉(2×2拉丁方)设计中接受0.1、0.3、1.0或5.0mg/kg ABT-874的2次相等给药(间隔8周施用的1次IV和1次SC)。在第一次给药前(0)以及在给药后第0.5、1、1.5、2、4、8、12、24、48、72、120、168、336、504和672小时时,收集血样用于测定ABT-874浓度。通过酶联免疫吸附测定来测量ABT-874的血清浓度。
ABT-874血清浓度个别制表,通过统计学特征(包括几何平均值和几何标准差)描述,并且显示为关于IV和SC治疗以及每个治疗组的个体以及平均值、中值和几何平均浓度与时间比较的曲线。使用非区室(noncompartmental)法评估下述PK参数:
·Cmax 最大血清浓度(μg/mL)
·Tmax 达到Cmax的时间(小时)
·AUC 清浓度-时间曲线下面积(μg×小时/mL)
·t1/2 半衰期(小时)
·CL 清除率(mL/小时)(对于IV施用)
·Vz 分布容积(mL)(对于IV施用)
·CL/F 表观CL(mL/小时)(对于SC施用)
·V/F 表观Vz(mL)(对于SC施用)
总共64个患者进行随机化;对于每个给药组,12个接受ABT-874,并且4个接受安慰剂。ABT-874看起来在IV施用后遵循双指数动力学,在施用后约7天进入末期。对于0.1-、0.3-、1.0-和3.0-mg IV给药的平均值±SD终末半衰期分别是81.2±55.6、147±73.2、208±79.2和196±55.4小时。对于0.1-、0.3-、1.0-和3.0-mg SC给药的平均值±SD终末半衰期分别是221±103、161±92.6、210±90.9和208±79.2小时。关于IV施用的平均终末半衰期是81.2±55.6小时到208±79.2小时。关于SC施用的平均终末半衰期是161±92.6小时到221±103小时。总平均终末半衰期是8-9天。
在IV和SC施用后,ABT-874的药物代谢动力学(药物最大浓度[Cmax]或曲线下面积[AUC])与剂量成比例增加。关于IV和SC给药的血清浓度-时间曲线分别显示于图6A和6B中。分布容积为IV施用后的约8-10L到SC施用后的24-67L。在SC施用后,达到Cmax的时间是约3-4天。在SC施用后的生物利用率对于评估的给药是42%-62%。在每次给药时在IV或SC施用后的药物代谢动力学参数,包括Cmax(以μg/mL表示的最大血清浓度)、AUC(以μgx小时/mL表示的血清浓度-时间曲线下面积)、tmax(以小时表示的达到Cmax的时间)、t1/2(以小时表示的半衰期)、CL(以mL/小时表示的清除率)和Vz(分布容积(mL)),显示于下表8中。
表8:在ABT-874的IV或SC施用后,
在健康人志愿者中的PK参数(平均值±SD)
前述数据证实以0.1-5.0mg/kg的单次给药IV和SC施用的ABT-874由年轻健康男性个体良好耐受。ABT-874的药物代谢动力学性质伴随其8-9天的半衰期为如对于IgG1抗体所预期的。
实施例8:在中度至重度斑状银屑病治疗中用全人IL-12/-23单克隆抗体ABT-874的再治疗应答的维持
在48周、II期、随机化对照试验(其包括12周初始治疗期和响应初始治疗患者的36周再治疗期)中评估ABT-874的功效和安全性。初始12周功效结果和应答维持结果在上文实施例1-5中描述。下述实施例的目的是在中度至重度斑状Ps治疗中ABT-874的皮下注射的这项II期研究的丧失其初始应答的患者中,检查在36周再治疗/随访期过程中的再治疗应答。下述实施例的进一步目的是在中度至重度斑状Ps治疗中检查ABT-874的皮下注射的安全性直到48周。
关于试验的主要包括标准是:(i)具有至少6个月的银屑病临床诊断和在筛选前至少2个月的稳定斑状银屑病的成年人;和(ii)在基线就诊时的中度至重度斑状银屑病(≥10%体表面积累及、银屑病面积和严重程度指数[PASI]得分≥12和至少中等疾病的医生全局评价[PGA])。
关于试验的第一个排除标准是先前暴露于全身性或生物学抗IL-12疗法。第二个排除标准是在基线就诊前不能中断下述疗法:≥2周前的局部银屑病疗法;≥2周前的紫外线(UV)B光线疗法;≥4周前的补骨脂素-UV光线疗法;≥4周前的全身疗法;和≥12周前的生物学疗法。
在基线时,人口统计学和临床特征跨越治疗组是相似的(在上文实施例6的表5中概括)。
具有影响≥10%体表面积和银屑病面积和严重程度指数(PASI)得分≥12的银屑病的成年人随机化到6个臂之一:1)在第0周时一次200-mg给药ABT-874;2)100mg ABT-874每隔一周(eow)进行12周;3)200-mg ABT-874每周进行4周;4)200-mg ABT-874 eow进行12周;5)200-mg ABT-874每周进行12周;或6)安慰剂。初级终点是在第12周时的≥PASI75应答。满足初级终点的患者进入36周再治疗期。用研究药物的治疗中断,并且在12-36周过程中丧失应答(≤PASI 50)的患者接受用在初始12周时间段过程中指定的相同给药方案的再治疗。再治疗持续12周。与安排无关,对于研究的整个持续时间或直至中断监控所有患者。
测量结果包括下述:(i)达到PASI 75的患者百分比;(i)在再治疗后达到PASI 75应答的中值时间;(iii)丧失PASI 75应答的中值时间(iii)在再治疗后具有“清除”或“最低限度”PGA得分的患者百分比。
统计学分析如下执行。通过随机化治疗组执行意向治疗(ITT)分析。对于在用ABT-874再治疗后获得的PASI评估,根据再治疗的第一次给药后的天数对研究就诊指定评估。根据获得的研究就诊呈现达到PASI应答(是/否)的患者比例。所有统计学检验都是双尾(2-tailed)的,具有0.05的显著性值。
在最初入组的180个患者中(30个患者/治疗组),130个(1个安慰剂)进入再治疗期,并且58个(全部ABT-874)进行再治疗。在第12周时达到≥PASI 75和随后在再治疗后12周时再次达到≥PASI75的患者百分比对于每个组如下:分别地,一次200-mg给药,63%与55%比较;100mg eow,93%与94%比较;200mg每周4周,90%与69%比较;200mg eow,93%与75%比较;和200mg每周,90%与83%比较。在再治疗的总共58个患者中,76%在再治疗后12周时达到≥PASI 75。大多数患者能够再次达到PASI 75应答(图7A)。
在再治疗期过程中跨越所有ABT-874剂量组达到PASI 75的中值时间(以天表示)在图7B中描绘。在再治疗过程中达到≥PASI 75的中值时间对于每个组如下:分别地,一次200-mg给药,60-65天;100mg eow,55-60天;200mg每周4周,55-60天;200mg eow,25-35天;和200mg每周,55-60天。
在治疗的最初12周后至丧失PASI 75的中值时间(以天表示)在图7C中描绘。在治疗的最初12周后至丧失PASI 75的中值时间对于每个组如下:分别地,一次200-mg给药,55-60天;100mg eow,110-120天;200mg每周4周,110-120天;200mg eow,160-180天;和200mg每周,180-190天。
在再治疗后在12周时达到“清除”或“最低限度”PGA(例如,0或1的PGA)的患者百分比在图7D中描绘。在再治疗过程中达到0或1的PGA的患者百分比对于每个组如下:分别地,一次200-mg给药,35%-40%;100mg eow,70%-80%;200mg每周4周,60%-65%;200mg eow,60%-70%;和200mg每周,80%-90%。在再治疗的总体患者中,60%-65%在再治疗后达到0或1的PGA。
在至少1个治疗组中直到第48周以递减顺序发生≥5%的不利事件(AEs)是:鼻咽炎、注射部位反应、上呼吸道感染、头痛、高血压和关节痛。直到第48周的治疗引出的不利事件概述显示于上文实施例6的表6中。在任何治疗组中发生率≥5%的治疗引出的不利事件概述显示于上文实施例6的表7中。
前述数据证实ABT-874在中度至重度银屑病治疗中是高度有效的。在应答丧失和再治疗后,大多数患者能够再次达到PASI 75应答。此外,ABT-874看起来具有长期有利的安全性概况。
等同方案
使用不超过常规实验,本领域技术人员将识别或能够确定关于本文描述的本发明具体实施方案的许多等同方案。此种等同方案意欲由下述权利要求包括。