CN104884472B - 抗-vegf/dll4双重可变结构域免疫球蛋白及其用途 - Google Patents

抗-vegf/dll4双重可变结构域免疫球蛋白及其用途 Download PDF

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Abstract

本文公开了多价和多特异性结合蛋白，制备所述结合蛋白的方法，以及其在诊断、监测、抑制、预防和/或治疗特征在于异常的DLL4和/或VEGF表达或活性的癌症、肿瘤和/或其他血管发生依赖性疾病中的用途。

Description

抗-VEGF/DLL4双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
本申请根据35 U.S.C. § 119要求2012年11月1日提交的美国临时申请第61/721,072号和2013年3月15日提交的美国临时申请第61/787,927号的优先权权益，此二者的全部内容皆以引用方式并入本文中。
本文公开多价和多特异性结合蛋白、制备该结合蛋白的方法及其在诊断、抑制、预防和/或治疗癌症、肿瘤和/或其他血管发生依赖性疾病中的用途。
经改造的蛋白，例如能够结合两种或更多种抗原的多特异性结合蛋白为本领域所知。可使用细胞融合、化学缀合或重组DNA技术产生此类多特异性结合蛋白。存在多种本领域已知的多特异性结合蛋白结构；然而许多此类结构和方法具有不同缺点。
已使用细胞杂交瘤技术产生双特异性抗体。然而，存在错误配对副产物和使用此技术的产率显著减小意味着需要复杂的纯化程序。还可以通过两种不同mAb的化学缀合来产生双特异性抗体。然而，此方法不能得到均质制剂。
先前使用的其他方法包括使用异质双功能交联剂偶联两个亲本抗体，产生串联单链Fv分子、双抗体、双特异性双抗体、单链双抗体和双-双抗体。然而，这些方法中的每一者皆具有缺点。此外，已描述了多价抗体构建体，其在IgG的重链中包含两个Fab重复单元且能够结合4个抗原分子(参见PCT公开第WO 0177342号和Miller等人(2003) J. Immunol. 170(9): 4854-61)。
已共进化出配体-受体系统以维持特异性。其相互作用会活化用于特定生物活性的特异性信号传递。然而，非配体-受体结合蛋白(例如单特异性抗体、双特异性或多特异性结合蛋白、非竞争性抗体组合或受体的细胞外结构域(ECD)的其他受体结合蛋白)可识别不同于受体配体结合位点的表位。结合至受体的ECD上的这种不同表位可将构形变化转导至细胞内结构域，其可得到新的意外信号传递级联。
美国专利第7,612,181号(其全部内容以引用方式并入本文中)提供能够以高亲和力结合两种或更多种抗原的新结合蛋白家族，其称为双重可变结构域结合蛋白(DVD结合蛋白)或双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-IgTM)。DVD分子是能够同时结合相同分子或两个不同分子上的两个不同表位的四价双重特异性Ig样蛋白。DVD是包含两个融合至二价抗体的N末端的可变结构域的独特结合蛋白。可变结构域可彼此直接融合或经由具有匹配长度和氨基酸组成的合成肽接头连接。可使用完整且有功能的Fc结构域改造DVD，然后允许介导适当效应子功能。因其抗体对的选择灵活性、两个抗原结合结构域的定向和接合其的接头长度，DVD形式可提供新的治疗方式。
尽管本领域提供了多种结构且一些结构具有一定的优点和缺点，但需要特定构建体来制备具有特定性质且结合至特定靶的多价结合蛋白。另外，新的可变结构域序列可进一步改进结合蛋白的性质。具体而言，可证实结合至DLL4和VEGF的经改进DVD是有益的。因此，本文公开使用在美国专利第7,612,181号(其全部内容以引用方式并入本文中)中公开的结合蛋白框架且含有特定第一和第二多肽链(其各自包含形成用于VEGF和DLL4的功能结合位点的第一和第二可变结构域序列(例如列于表2中的那些))的双重可变结构域免疫球蛋白。在一些实施方案中，第一和第二多肽链包含各自含有来自表2中所列序列之一的三个CDR且形成用于VEGF和DLL4的功能结合位点的第一和第二可变结构域序列。
DLL4是涉及经由Notch受体途径进行细胞至细胞信号传递的配体。许多生物过程(例如分化、增殖和体内稳态)需要该细胞至细胞通信。Notch信号传递途径是许多真核生物所利用的一种系统。该途径，尤其是Notch受体对于功能肿瘤血管发生也是至关重要的。因此，抑制Notch受体功能、阻断Notch受体和/或阻断Notch信号传递途径是用于抗癌组合物和疗法的潜在策略。已证实Notch受体的小分子抑制剂通常有毒，这是因为它们阻抑Notch受体在整个机体内的野生型(正常)组织表达。因此，Notch信号传递途径的不同成员应视为潜在治疗靶。Notch受体的血管配体是δ 4或δ样4 (DLL4)。在血管系统中大量表达的DLL4对于血管发育至关重要(Yan等人，Clin.Cancer Res., 13(24): 7243-7246 (2007)；Shutter等人，Genes Dev., 14(11): 1313-1318 (2000)；Gale等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(45): 15949-15954 (2004)；Krebs等人，Genes Dev., 14(11): 1343-1352(2000))。DLL4杂合小鼠因血管发育的重大缺陷而具有胚胎致死性(Gale等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(45): 15949-15954 (2004)；Duarte等人，Genes Dev., 18(20):2474-2478 (2004)；Krebs等人，Genes Dev., 18(20): 2469-2473 (2004))。
可通过VEGF诱导DLL4的表达(Liu等人，Mol.Cell Biol., 23(1): 14- 25(2003)；Lobov等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104(9): 3219-3224 (2007))。VEGF是通过涉及血管发生的细胞产生的信号蛋白。另外，DLL4可部分地经由抑制VEGFR2和诱导VEGR1来负性调控VEGF信号传递(Harrington等人，Microvasc.Res., 75(2): 144-154(2008)；Suchting等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104(9): 3225-3230 (2007))。DLL4与VEGF之间的密切协调对于功能血管发生极为重要，从而使得DLL4和VEGF成为治疗性干预的潜在靶。
除其生理学作用外，DLL4和VEGF也在肿瘤血管中上调(Gale等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(45): 15949-15954 (2004)；Mailhos等人，Differentiation, 69(2-3): 135-144 (2001)；Patel等人，Cancer Res., 65(19): 8690-8697 (2005)；Patel等人，Clin.Cancer Res., 12(16): 4836-4844 (2006)；Noguera-Troise等人，Nature, 444(7122): 1032-1037 (2006))。已展示阻断DLL4会抑制多种模型中的原发性肿瘤生长(Noguera-Troise等人，Nature, 444(7122): 1032-1037 (2006)；Ridgway等人，Nature,444(7122): 1083-1087 (2006)；Scehnet等人，Blood, 109(11): 4753-4760 (2007))。抑制DLL4甚至有效抵抗对抗-VEGF疗法有抗性的肿瘤。因此，DLL4和VEGF的组合抑制可提供增强的抗肿瘤疗法。有趣的是，不同于减小肿瘤血管形成的VEGF抑制，DLL4阻断会增加其中血管异常、不能支持有效血液传输且实际上无功能的肿瘤血管系统密度。因此，VEGF和DLL4的破坏提供了潜在抗癌治疗的不同作用方法。
尽管本领域已知抗体和多种结合构建体，但仍需要结合至VEGF和DLL4的较佳靶向和效率以例如治疗癌症和肿瘤发生。因此，本领域需要能够结合DLL4和VEGF的改进的多价结合蛋白。因此，提供新的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够结合DLL4和VEGF。在一些实施方案中，结合蛋白能够例如以改进的结合亲和力和/或中和效力结合至DLL4和VEGF。
提供能够靶向两种表位的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够结合DLL4和VEGF。在一实施方案中，提供能够以高亲和力结合DLL4和VEGF的表位的结合蛋白。在一实施方案中，结合蛋白包含含有表2中所列出CDR和可变结构域序列的双重可变结构域结合蛋白框架。在一实施方案中，双重可变结构域结合蛋白框架包含在美国专利第7,612,181号(其全部内容以引用方式并入本文中)中公开的框架。
在一实施方案中，提供包含可结合两种不同蛋白(VEGF和DLL4)的两种表位的多肽链的结合蛋白，其中多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，C是恒定结构域，X1代表氨基酸或多肽，X2代表Fc区且n为0或1。在一些实施方案中，结合蛋白中的VD1和VD2是重链可变结构域。在某些实施方案中，VD1和VD2能够结合DLL4的表位和VEGF的表位。在一些实施方案中，C是重链恒定结构域，例如CH1。在某些实施方案中，X1是接头，前提是X1不是CH1。
在多种实施方案中，本文所公开的结合蛋白包含结合DLL4的表位和VEGF的表位的多肽链，其中多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1包含第一重链可变结构域，VD2包含第二重链可变结构域，C包含重链恒定结构域，X1包含接头，且X2包含Fc区。在一实施方案中，X1是接头，前提是其不是CH1。在一实施方案中，VD1和VD2重链可变结构域各自包含三个选自SEQ ID NO: 39、41、43、45、47、49、51或53中的CDR的CDR (即来自那些SEQ ID NO之一的CDR 1-3)，其中VD1和/或VD2重链可变结构域中的至少一个包含三个SEQ ID NO: 39中的CDR。在另一实施方案中，结合蛋白能够结合DLL4和VEGF。在一实施方案中，VD1和VD2重链可变结构域包含SEQ ID NO: 39、41、43、45、47、49、51或53，其中VD1和/或VD2重链可变结构域中的至少一个包含SEQ ID NO: 39。
在多种实施方案中，本文所公开的结合蛋白包含结合DLL4的表位和VEGF的表位的多肽链，其中多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1包含第一轻链可变结构域，VD2包含第二轻链可变结构域，C包含轻链恒定结构域，X1包含接头，且X2不包含Fc区。在一实施方案中，X1是接头，前提是其不是CH1或CL。在一实施方案中，VD1和VD2轻链可变结构域各自包含三个选自SEQ ID NO: 40、42、44、46、48、50、52或54中的CDR的CDR (即来自那些SEQ IDNO之一的CDR 1-3)，其中VD1和/或VD2轻链可变结构域中的至少一个包含SEQ ID NO: 40中的三个CDR。在另一实施方案中，结合蛋白能够结合DLL4和VEGF。在一实施方案中，VD1和VD2轻链可变结构域各自包含SEQ ID NO: 40、42、44、46、48、50、52或54，其中VD1和/或VD2轻链可变结构域中的至少一个包含SEQ ID NO: 40。
在另一实施方案中，公开结合DLL4的表位和VEGF的表位的结合蛋白。在一些实施方案中，结合蛋白包含第一和第二多肽链，其中第一和第二多肽链中的每一个独立地包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，C是恒定结构域，X1是接头，X2是Fc区，且n为0或1，其中第一和第二多肽链上的VD1结构域形成第一功能靶结合位点且第一和第二多肽链上的VD2结构域形成第二功能靶结合位点。在一实施方案中，在n=1时X2包含Fc区，且在n=0时X2不包含Fc区。在一些实施方案中，第一和第二多肽链上的X1序列相同。在其他实施方案中，第一和第二多肽链上的X1序列不同。在一些实施方案中，多肽链中的至少一个上的X1不是CH1结构域和/或CL结构域。在一实施方案中，X1序列是短的(例如6、5、4、3或2个氨基酸)接头。在另一实施方案中，X1序列是长的(例如6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30或更多个氨基酸)接头。在另一实施方案中，两条多肽链中的一条上的X1序列是短的接头且另一多肽链上的X1序列是长的接头。在一实施方案中，VD1和VD2重链可变结构域各自包含三个来自SEQ ID NO: 39、41、43、45、47、49、51或53的CDR (即来自那些SEQ ID NO之一的CDR 1-3)，其中VD1和/或VD2重链可变结构域中的至少一个包含SEQID NO: 39中的三个CDR；且VD1和VD2轻链可变结构域包含三个来自SEQ ID NO: 40、42、44、46、48、50、52或54的CDR (即来自那些SEQ ID NO之一的CDR 1-3)，其中VD1和/或VD2轻链可变结构域中的至少一个包含三个SEQ ID NO: 40中的CDR。在另一实施方案中，结合蛋白能够结合DLL4和VEGF。在一实施方案中，VD1和VD2重链可变结构域包含SEQ ID NO: 39、41、43、45、47、49、51或53，其中VD1和/或VD2重链可变结构域中的至少一个包含SEQ ID NO:39，且VD1和VD2轻链可变结构域包含SEQ ID NO: 40、42、44、46、48、50、52或54，其中VD1和/或VD2轻链可变结构域中的至少一个包含SEQ ID NO: 40。
在多种实施方案中，公开能够结合VEGF和DLL4的结合蛋白。在一些实施方案中，结合蛋白包含第一个和第二多肽链，其中第一和第二多肽链各自独立地包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，C是恒定结构域，X1是接头，X2是Fc区，且n是0或1，其中第一和第二多肽链上的VD1结构域形成第一功能靶结合位点，且第一和第二多肽链上的VD2结构域形成第二功能靶结合位点。在一实施方案中，形成VEGF的功能靶结合位点的可变结构域包含三个来自SEQ ID NO: 41的CDR和三个来自SEQ ID NO: 42的CDR (例如存在于单独链上的来自SEQ ID NO: 41的CDR 1-3和来自SEQ ID NO: 42的CDR1-3，其中每一链上的CDR以指定顺序排列且通过适宜框架序列间隔以形成功能结合位点)。在一实施方案中，形成DLL4的功能靶结合位点的可变结构域包含三个来自SEQ ID NO: 39的CDR和三个来自SEQ ID NO: 40的CDR (例如存在于单独链上的来自SEQ ID NO: 39的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 40的CDR 1-3，其中每一链上的CDR以指定顺序排列且通过适宜框架序列间隔以形成功能结合位点)。在一实施方案中，结合蛋白包含VEGF的功能靶结合位点，其包含三个来自SEQ ID NO: 41的CDR和三个来自SEQ ID NO: 42的CDR (例如来自SEQ IDNO: 41的CDR 1-3和来自SEQ ID NO: 42的CDR 1-3)；和DLL4的功能靶结合位点，其包含三个来自SEQ ID NO: 39的CDR和三个来自SEQ ID NO: 40的CDR (例如来自SEQ ID NO: 39的CDR 1-3和来自SEQ ID NO: 40的CDR 1-3)。在一实施方案中，结合蛋白包含含有SEQ IDNO: 41和SEQ ID NO: 42的VEGF的功能靶结合位点和含有SEQ ID NO: 39和SEQ ID NO: 40的DLL4的功能靶结合位点。在一实施方案中，结合蛋白包含含有SEQ ID NO: 56的第一多肽链和含有SEQ ID NO: 64的第二多肽链。在一实施方案中，结合蛋白包含含有SEQ ID NO:73的第一多肽链和含有SEQ ID NO: 74的第二多肽链。在一些实施方案中，形成DLL4的结合位点的可变结构域包含来自美国申请公开第20110217237号的那些，和/或形成VEGF的结合位点的可变结构域包含来自美国申请公开第20100076178号的那些，其全部内容以引用方式并入本文。在一实施方案中，结合蛋白包含h1A11.1-SL-Av。在一实施方案中，h1A11.1-SL-Av结合蛋白包含来自人IgG1 LALA突变体的Fc区。
适合用作人治疗剂，例如用作抗癌症/抗肿瘤剂的结合蛋白的开发和产生可能需要超出鉴定能够结合至期望的一个靶或多个靶的结合蛋白。例如，候选物可结合其一个靶或多个靶，但是展示降低的抑制或中和其期望靶的能力，可以证明难以稳定地配制，可以展示不期望的药代动力学性质，或可以证明难以在合适的表达系统中产生（例如，在宿主细胞，如CHO中表达）。因此，在开发合适的治疗剂中考虑的因素包括，但不限于，（a）对内部和外部抗原结合结构域的结合动力学（结合速率、解离速率和亲和力），（b）多种生物化学和细胞生物测定中的潜能，（c）相关肿瘤模型中的体内效力，（d）药代动力学和药效动力学性质，（e）可制造性，包括在所选细胞系中的蛋白表达水平、可测量性、翻译后修饰、物理化学性质，如单体百分比、可溶性和稳定性（内在的、冷冻/融化、储存稳定性等），（f）制剂性质，（g）可能的免疫原性风险，和（h）分子的毒理性质。还可以评估结合方式和效价，因为这些可以影响分子的结合性质和细胞潜能。对于一些结合蛋白，可变结构域、恒定结构域和/或接头的氨基酸序列中即使是小的改变也可能影响（正面或负面）这些因素中的一个或多个，所以可以评估因素组合来选择先导候选物。一旦鉴定了先导候选物，进一步进行治疗性质的体内评估，包括评估动物和人个体中的安全性、效力和潜能。
已经出乎意料地发现，包含SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:64，或包含SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74的结合蛋白在例如超过治疗上有用的阈值的结合动力学（例如解离常数）、改进的中和能力、增强的体内效力、优良的配制稳定性、期望的糖基化模式、有利的药代动力学概况和宿主细胞中的有效表达这些方面与包含不同可变结构域和/或接头序列的其他评估结合蛋白相比展示优良的性质组合。所比较的结合蛋白可以包括具有相同可变结构域序列和方向，但具有不同接头的那些，以及具有改变的结合结构域方向和/或其他可变结构域序列（例如亲和力成熟的序列、完全人序列等）的那些。在一些实施方案中，这些优良性质依赖于特定可变结构域序列（例如SEQ ID NOs: 39-42）、内部和外部位置中VEGF和DLL4结合结构域的特定方向（例如SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 64中提供的方向）、特定接头序列（例如，SEQ ID NO: 56中所用的重链可变结构域和短的接头序列和SEQ ID NO: 64中所用的轻链可变结构域和长的接头序列），和/或特定恒定结构域序列（例如，SEQ ID NO: 73和74中所用的恒定结构域序列）的选择。在一些实施方案中，只改变接头序列可以对功能性质具有显著影响。例如，选择SEQ ID NO: 73和74中所用的接头序列（与那些SEQ ID NO中包含的可变和恒定结构域一起）可以提供结合蛋白的人治疗性质出乎意料的改进。例如，表9证明了不同接头序列对体内抗肿瘤效力的影响，如在结肠直肠腺癌和成胶质细胞瘤异种移植物模型中所测量。因此例如，使用SEQ ID NO: 56和64，或SEQ ID NO: 73和74中的序列（包括其中包括的接头序列）可以产生体内抗肿瘤效力出乎意料的提高。
在多种实施方案中，本文公开的结合蛋白展示对VEGF和/或DLL4的期望的结合亲和力、阻断能力和/或中和效力，例如水平粗略地与针对VEGF (例如，AVASTIN®)或DLL4(例如，抗体 h1A11.1)的抗体观察到的那些相当。在一些实施方案中，与包含其他可变结构域序列或接头的DVD-Ig结合蛋白相比，结合蛋白展现对于VEGF和/或DLL4的增加的亲和力、阻断能力和/或中和效力。在一些实施方案中，结合蛋白包含VEGF的功能靶结合位点(包含三个来自SEQ ID NO: 41的CDR和三个来自SEQ ID NO: 42的CDR)和DLL4的功能靶结合位点(包含三个来自SEQ ID NO: 39的CDR和三个来自SEQ ID NO: 40的CDR)；或包含含有SEQ IDNO: 41和SEQ ID NO: 42的VEGF的功能靶结合位点和含有SEQ ID NO: 39和SEQ ID NO: 40的DLL4的功能靶结合位点；或包含SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 64；或包含SEQ ID NO: 73和SEQ ID NO: 74。例如，结合蛋白(例如包含SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 64或包含SEQID NO: 73和SEQ ID NO: 74的结合蛋白)可能够以至多约7.0 × 10-10 M的解离常数(KD)结合至VEGF (如通过表面等离子共振所测量)，和/或以至多约3.8 nM的IC50阻断VEGF活性(如在VEGFR1竞争ELISA中所测量)；和/或能够以至多约1.0 × 10-8 M的解离常数(KD)结合至DLL4 (如通过表面等离子共振所测量)，和/或以至多约1.09 nM的IC50阻断DLL4活性(如在Notch竞争ELISA中所测量)。
在一些实施方案中，与VEGF和DLL4抗体的混合物(例如用于提供用于结合蛋白的可变结构域的亲本抗体)相比，结合蛋白(例如包含SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 64或包含SEQ ID NO: 73和SEQ ID NO: 74的结合蛋白)可展现对于DLL4的增加的中和效力(在还存在VEGF时)。在一些实施方案中，与VEGF和DLL4抗体的混合物(例如用于提供用于结合蛋白的可变结构域的亲本抗体)相比，结合蛋白可展现对于DLL4的中和效力一个数量级的增加(在还存在VEGF时)。例如，表24证明，与VEGF和DLL4抗体的混合物(用于提供用于结合蛋白的可变结构域的亲本抗体)相比，包含SEQ ID NO: 73和SEQ ID NO: 74的结合蛋白可展现对于DLL4的中和效力一个数量级的增加(在还存在至少约1.2 nM VEGF (例如至少约1.2、1.5、2、2.5、5、10、50、150或更高)时)。该DLL4中和效力可以是有益的，因为在治疗肿瘤的体内情况下，VEGF水平在肿瘤附近一般比在循环中普遍更高，允许在肿瘤位点改进的靶向和增强的功能DLL4中和活性。
在多种实施方案中，与用于癌症和/或血管肿瘤的其他治疗相比，结合蛋白（例如，包含SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:64，或包含SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74的结合蛋白）展示改进的性质，例如改进的安全性、增加的稳定性、较高的效力、降低的炎症或免疫应答，或其他有益的体内人治疗性质。适合用于比较的治疗可以包括施用小分子抗癌剂，或针对VEGF (例如，AVASTIN®)和/或DLL4 (例如，抗体h1A11.1)的抗体，或包含其他可变结构域序列和/或接头的DVD-Ig结合蛋白。在一些实施方案中，结合蛋白展示优于目前用于癌症和/或血管化肿瘤的护理治疗标准的改进性质。例如，结合蛋白可展示改进的结合动力学、优良的体内治疗效力、增强的配制稳定性（包括降低的聚集和改进的储存稳定性）、改进的药代动力学、降低的炎症或免疫应答，和/或增强的宿主细胞表达水平。
在一些实施方案中，与抗-VEGF抗体或抗-DLL4抗体与一种或多种抗癌剂的组合相比，或与包含其他可变结构域序列和/或接头的抗DVD-Ig结合蛋白与一种或多种抗癌剂的组合相比，结合蛋白（例如，包含SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:64，或包含SEQ ID NO:73和SEQID NO:74的结合蛋白）与一种或多种抗癌剂的组合展现优良（例如累加和/或超累加）效应。例如，优良结合性质可以是在表27-30和34中鉴定的那些。例如，与未治疗的肿瘤相比，结合蛋白在单独施用或与一种或更多种抗癌剂组合施用后可展示至少约50%或更高（例如，45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150%或更高）的肿瘤生长抑制或肿瘤生长延迟。例如，抗癌剂可为伊立替康(Irinotecan)、FOLFIRI、替莫唑胺(Temozolomide)、吉西他滨(Gemcitabine)、紫杉醇(Paclitaxel)、5-FU和卡培他滨(Capecitabine)中的一种或多种，或用于治疗特定癌症的任何其他小分子或生物制剂。结合蛋白单独或与一种或更多种抗癌剂的组合可用作医药来治疗例如结肠癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌或乳腺癌。
在一实施方案中，双重可变结构域(DVD-Ig)结合蛋白包含如先前段落中所描述的两条第一多肽链和两条第二多肽链(即包含四条多肽链)，其中多肽链中的每一个独立地包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，C是恒定结构域，X1是接头，X2是Fc区，且n为0或1。在一些实施方案中，第一链是重链且与第二链(其是轻链)配对。该DVD-Ig结合蛋白包含4个功能靶结合位点。在一些实施方案中，第一和第二多肽链上的X1接头相同或不同。在一些实施方案中，DVD-Ig结合蛋白包含至少两种能够结合相同或不同蛋白的两种或更多种表位(例如两种、三种或四种)且以任何方向的可变结构域序列(例如VD1和VD2)。在一些实施方案中，独立选择VD1和VD2。在一实施方案中，VD1和VD2重链可变结构域各自包含三个来自SEQ ID NO: 39、41、43、45、47、49、51或53的CDR，其中VD1和/或VD2重链可变结构域中的至少一个包含三个SEQ ID NO: 39中的CDR，且VD1和VD2轻链可变结构域包含三个来自SEQ ID NO: 40、42、44、46、48、50、52或54的CDR，其中VD1和/或VD2轻链可变结构域中的至少一个包含三个SEQ ID NO: 40中的CDR。在另一实施方案中，结合蛋白能够结合DLL4和VEGF。在一实施方案中，VD1和VD2重链可变结构域各自包含SEQID NO: 39、41、43、45、47、49、51或53，其中VD1和/或VD2重链可变结构域中的至少一个包含SEQ ID NO: 39，且VD1和VD2轻链可变结构域各自包含SEQ ID NO: 40、42、44、46、48、50、52或54，其中VD1和/或VD2轻链可变结构域中的至少一个包含SEQ ID NO: 40。
在另一实施方案中，双重可变结构域结合蛋白包含如表2中所展示的重链和轻链序列，其中VD1和/或VD2重链可变结构域中的至少一个包含SEQ ID NO: 39和/或VD1和/或VD2轻链可变结构域中的至少一个包含SEQ ID NO: 40。
在另一实施方案中，重链、轻链、两条链或四条链实施方案中的任一者包含至少一种X1接头(包含选自SEQ ID NO: 1-38的接头)。在一实施方案中，X2是Fc区。在另一实施方案中，X2是变体Fc区。
在再一实施方案中，Fc区(若存在于第一多肽中)是天然序列Fc区或变体序列Fc区。在又一实施方案中，Fc区是来自IgG1的Fc区、来自IgG2的Fc区、来自IgG3的Fc区、来自IgG4的Fc区、来自IgA的Fc区、来自IgM的Fc区、来自IgE的Fc区或来自IgD的Fc区。在某些实施方案中，Fc区是来自人IgG1 LALA突变体的Fc区，所述人IgG1 LALA突变体是提供针对HIV病毒的保护的b12抗体突变体。
提供制备结合两种不同靶蛋白的结合蛋白的方法。在一实施方案中，制备结合蛋白的方法包括以下步骤：a)获得结合第一表位的第一亲本抗体或其抗原结合部分；b)获得结合第二表位的第二亲本抗体或其抗原结合部分；c)制备编码本文所述任何结合蛋白的构建体；和d)表达多肽链，从而产生结合第一和第二表位的结合蛋白。
在本文的任何实施方案中，VD1重链可变结构域(若存在)和轻链可变结构域(若存在)可来自第一亲本抗体或其抗原结合部分；VD2重链可变结构域(若存在)和轻链可变结构域(若存在)可来自第二亲本抗体或其抗原结合部分。第一和第二亲本抗体可相同或不同。
在一实施方案中，第一亲本抗体或其抗原结合部分结合第一抗原，且第二亲本抗体或其抗原结合部分结合第二抗原。在一实施方案中，第一和第二抗原是不同抗原。在另一实施方案中，第一亲本抗体或其抗原结合部分以不同于第二亲本抗体或其抗原结合部分结合第二抗原的效力的效力结合第一抗原。在又一实施方案中，第一亲本抗体或其抗原结合部分以不同于第二亲本抗体或其抗原结合部分结合第二抗原的亲和力的亲和力结合第一抗原。
在另一实施方案中，第一亲本抗体或其抗原结合部分和第二亲本抗体或其抗原结合部分是人抗体、CDR移植抗体、人源化抗体和/或亲和力成熟抗体。
在另一实施方案中，结合蛋白拥有至少一种由第一亲本抗体或其抗原结合部分或由第二亲本抗体或其抗原结合部分展现的期望性质。或者，第一亲本抗体或其抗原结合部分和第二亲本抗体或其抗原结合部分拥有至少一种由结合蛋白展现的期望性质。在一实施方案中，期望性质是一种或多种抗体参数。在另一实施方案中，抗体参数是抗原特异性、抗原亲和力、效力、生物功能、表位识别、稳定性、溶解性、产生效率、免疫原性、药代动力学、生物可用性、组织交叉反应性或种间类似抗原结合(orthologous antigen binding)。在一实施方案中，结合蛋白是多价的。在另一实施方案中，结合蛋白是多特异性的。本文所述的多价和/或多特异性结合蛋白具有尤其来自治疗角度的期望性质。例如，多价和/或多特异性结合蛋白可(1)快于二价抗体地通过表达抗体所结合抗原的细胞内在化(和/或分解代谢)；(2)为激动剂结合蛋白；和/或(3)诱导表达多价结合蛋白能够结合的抗原的细胞的细胞死亡和/或细胞凋亡。“亲本抗体”提供多价和/或多特异性结合蛋白的至少一种抗原结合特异性，其可为通过表达抗体所结合抗原的细胞内在化(和/或分解代谢)的抗体；和/或可为激动剂、诱导细胞死亡和/或诱导细胞凋亡的抗体，且如本文所述的多价和/或多特异性结合蛋白可在这些性质中的一种或多种中显示改进。另外，亲本抗体可缺乏这些性质中的一种或多种，但可在构建为如本文所述的多价结合蛋白时获取其中的一种或多种。
在另一实施方案中，结合蛋白对于一种或多种靶具有以下结合速率常数(K结合)：至少约102 M-1s-1；至少约103 M-1s-1；至少约104 M-1s-1；至少约105 M-1s-1；或至少约106 M-1s-1，如通过表面等离子共振所测量。在一实施方案中，结合蛋白对于一种或多种靶具有以下结合速率常数(K结合)：约102 M-1s-1至约103 M-1s-1；约103 M-1s-1至约104 M-1s-1；约104 M-1 s-1至约105 M-1s-1；或约105 M-1s-1至约106 M-1s-1，如通过表面等离子共振所测量。
在另一实施方案中，结合蛋白对于一种或多种靶具有以下解离速率常数(K解离)：至多约10-2 s-1；至多约10-3 s-1；至多约10-4 s-1；至多约10-5 s-1；或至多约10-6 s-1，如通过表面等离子共振所测量。在一实施方案中，结合蛋白对于一种或多种靶具有以下解离速率常数(K解离)：约10-2 s-1 至约10-3s-1；约10-3 s-1至约10-4 s-1；约10-4 s-1至约10-5 s-1；或约10-5 s-1至约10-6 s-1，如通过表面等离子共振所测量。
在另一实施方案中，结合蛋白对于一种或多种靶具有以下平衡解离常数(KD)：至多约10-7 M；至多约10-8 M；至多约10-9 M；至多约10-10 M；至多约10-11 M；或至多约10-12 M。在一实施方案中，结合蛋白对于其靶具有以下平衡解离常数(KD)：约10-7 M至约10-8 M；约10-8 M至约10-9 M；约10-9 M至约10-10 M；约10-10 M至约10-11 M；或约10-11 M至约10-12 M。
在一些实施方案中，与抗-DLL4或抗-VEGF抗体相比，抗-DLL4/抗-VEGF结合蛋白展现增加的效力(例如增加的干扰、抑制和/或中和DLL4和/或VEGF活性的能力)。在一些实施方案中，可用于在评估VEGF和/或DLL4活性的任何测定(例如VEGF和/或DLL4结合ELISA测定、BIACORE™测定、DLL4-Notch报道分子测定、VEGF刺激内皮细胞增殖/存活测定或本领域技术人员已知的任何其他测定)中评估结合蛋白的效力。在一些实施方案中，结合蛋白在VEGF存在下展现增加的DLL4效力。
在另一实施方案中，提供缀合物，其包含本文所述的任何结合蛋白且还包含药剂。在一实施方案中，药剂是免疫粘着分子、显像剂、治疗剂或细胞毒性剂。在一实施方案中，显像剂是放射标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记或生物素。在另一实施方案中，放射标记是3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm。在又一实施方案中，治疗剂或细胞毒性剂是抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管发生剂、抗有丝分裂剂、蒽环类、毒素或细胞凋亡剂。在一些实施方案中，药剂是以下中的一种或多种：伊立替康、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、5-FU、替莫唑胺、吉西他滨和紫杉醇。在一实施方案中，药剂是伊立替康。在一实施方案中，药剂是甲酰四氢叶酸。在一实施方案中，药剂是5-FU。在一实施方案中，药剂是伊立替康、甲酰四氢叶酸和5-FU。在一实施方案中，药剂是替莫唑胺。在一实施方案中，药剂是吉西他滨。在一实施方案中，药剂是紫杉醇。
在另一实施方案中，缀合物包含结合蛋白和药物。在一实施方案中，缀合物中的结合蛋白包含第一和第二多肽链，其中第一和第二多肽链中的每一个独立地包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，C是恒定结构域，X1是接头，且X2是Fc区，其中第一和第二多肽链上的VD1结构域形成第一功能靶结合位点且第一和第二多肽链上的VD2结构域形成第二功能靶结合位点，且其中结合蛋白能够结合VEGF和DLL4。在一些实施方案中，VD1和VD2结构域包含来自表2中所公开的任何序列中的CDR或可变结构域序列，其经配对和排列以形成VEGF和DLL4的功能结合位点。在一实施方案中，缀合物中的药物选自有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、免疫调节剂、基因疗法载体、烷化剂、抗血管发生剂、抗代谢物、含硼药剂、化学保护剂、激素、抗激素剂、皮质类固醇、光活性治疗剂、寡核苷酸、放射性核素剂、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和放射增敏剂。在另一实施方案中，药物选自伊沙匹隆(Ixempra)、多拉司他汀10 (dolastatin 10)、多拉司他汀15(dolastatin 15)、奥里斯他汀(auristatin) E、奥里斯他汀PE、单甲基奥里斯他汀D (MMAD或奥里斯他汀D衍生物)、单甲基奥里斯他汀E (MMAE或奥里斯他汀E衍生物)、单甲基奥里斯他汀F (MMAF或奥里斯他汀F衍生物)、奥里斯他汀F苯二胺(AFP)、奥里斯他汀EB (AEB)、奥里斯他汀EFP (AEFP)、5-苯甲酰基戊酸-AE酯(AEVB)、氨甲蝶呤(methotrexate)、柔红霉素(daunorubicin)、长春新碱(vincristine)、美登素(maytansine)、美登醇(maytansinol)、美登醇的C-3酯、安丝菌素(ansamitocin) P1、安丝菌素P2、安丝菌素P3、安丝菌素P4、多西他赛(docetaxel)、紫杉醇、奈米颗粒紫杉醇、硫酸长春地辛(vindesine sulphate)、长春新碱、长春花碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)、放线菌素(actinomycine)、放线菌素D、安曲霉素(anthramycin)、芝加霉素A (chicamycin A)、DC-18、甲基胺茴霉素(mazethramycin)、新斯拉霉素A (neothramycin A)、新斯拉霉素B (neothramycin B)、普斯卡星B (prothracarcin B)、SG2285、西班米星(sibanomicin)、西伯利亚霉素(sibiromycin)、蒽环类、柔红霉素、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、卡奇霉素(calicheamicin)、γ 1 ’、α2’、α3’、N-乙酰基-γ 1 ’、PSAG、θ’ 1 、多卡米星(duocarmycin)、阿多来新(adozelesin)、比折来新(bizelesin)和卡折来新(carzelesin)、博来霉素(bleomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、普卡霉素(plicamycin)、卡介苗(bacillus calmette-guerin) (BCG)、左旋咪唑(levamisole)、癌症疫苗、重组二价人乳头状瘤病毒(HPV)疫苗类型16和18疫苗、重组四价人乳头状瘤病毒(HPV)类型6、11、16和18疫苗、西普鲁塞T (sipuleucel-T)、细胞因子、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、糖蛋白激素(例如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH))、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳激素、肿瘤坏死因子、缪勒管抑制物质、小鼠促性腺激素关联肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、整合素、血小板产生素(TPO)、神经生长因子(例如NGF)、血小板生长因子、转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II、促红血球生成素(EPO)、骨诱导因子、干扰素(例如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ)、集落刺激因子(CSF)、粒细胞-巨噬细胞-C-SF (GM-CSF)和粒细胞-CSF (G-CSF)、白介素(IL) (例如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12)、肿瘤坏死因子及其他多肽因子(包括LIF和kit配体(KL))、集落刺激因子、促红血球生成素(erythropoietin、epoetin)、非格司亭(filgrastim)、沙格司亭(sargramostim)、普美嘉亭(promegapoietin)、奥普瑞白介素(Oprelvekin)、免疫调节性基因治疗剂、编码用于代替与癌症有关的突变或另外功能障碍(例如截短)基因的功能性治疗基因的核酸、编码或另外产生治疗癌症的治疗性蛋白的核酸、磺酸烷基酯、白消安(busulfan)、氮芥(nitrogen mustard)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)和美法仑(melphalan)、亚硝基脲、卡莫司汀(carmustine)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、链佐星(streptozocin)、三嗪和肼、达卡巴嗪(dacarbazine)、丙卡巴肼(procarbazine)、替莫唑胺、乙烯亚胺、噻替派(thiotepa)、地吖醌(diaziquone)、丝裂霉素C、甲胺衍生物、环氧化物、六甲蜜胺(altretamine)、环氧乳醇(dianhydrogalactitol)、二溴卫矛醇(dibromodulcitol)、血管抑制素、ABX EFG、C1-1033、PKI-166、EGF疫苗、EKB-569、GW2016、ICR-62、EMD 55900、CP358、PD153035、AG1478、IMC-C225、OSI-774、厄洛替尼(Erlotinib)、血管抑制素、抑制蛋白、内皮抑制素、BAY 12-9566与氟尿嘧啶(fluorouracil)或多柔比星、血管能抑制素、羧酰胺三唑与紫杉醇、EMD121974、S-24、维他辛(vitaxin)、二甲基氧杂蒽酮乙酸、IM862、白介素-12、白介素-2、NM-3、HuMV833、PTK787、RhuMab、安奇罗然(angiozyme)、IMC-1C11、新伐司他(Neovastat)、马立马司他(marimstat)、普啉司他(prinomastat)、BMS-275291、COL-3、MM1270、SU101、SU6668、SU11248、SU5416与紫杉醇、与吉西他滨和顺铂(cisplatin)、和与伊立替康和顺铂和与放射、替可加兰(tecogalan)、替莫唑胺和PEG干扰素α2b、四硫钼酸盐、TNP-470、沙利度胺(thalidomide)、CC-5013与泰素帝(taxotere)、肿瘤抑素、2-甲氧基雌二醇、VEGF抑制剂(trap)、mTOR抑制剂(地弗罗莫司(deforolimus)、依维莫司(everolimus)和坦罗莫司(temsirolimus))、酪氨酸激酶抑制剂(例如伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、达沙替尼(dasatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、尼罗替尼(nilotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、索拉非尼(sorafenib)、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、叶酸拮抗剂、氨甲蝶呤、4-氨基-叶酸、洛美曲索(lometrexol)、培美曲塞(pemetrexed)、曲美沙特(trimetrexate)、嘧啶拮抗剂、阿扎胞苷(azacitidine)、卡培他滨、阿糖胞苷(cytarabine)、地西他滨(decitabine)、5-氟尿嘧啶、5’-磷酸5-氟-2’-去氧尿苷、三磷酸5-氟尿苷、吉西他滨、氟尿苷(foxuridine)、嘌呤拮抗剂硫唑嘌呤(azathioprine)、克拉屈滨(cladribine)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、氟达拉滨(fludarabine)、喷司他丁(pentostatin)、6-硫鸟嘌呤、腺苷脱氨酶抑制剂、克拉屈滨、氟达拉滨、奈拉滨(Nelarabine)、喷司他丁、波罗非辛(borophycin)、硼替佐米(bortezomib)、化学保护剂、氨磷汀、右雷佐生(dexrazoxane)、美司钠(mesna)、雄激素、雌激素、乙酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate)、孕激素、氨鲁米特(aminoglutethimide)、阿那曲唑(anastrozole)、比卡鲁胺(bicalutamide)、氯烯雌醚(chlorotrianises)、乙酸环丙孕酮(cyproterone acetate)、地加瑞克(degarelix)、依西美坦(exemestane)、氟他胺(flutamide)、氟维司群(fulvestrant)、戈舍瑞林(goserelin)、来曲唑(letrozole)、亮丙瑞林(leuprolide)、利普安(lupron)、乙酸甲羟孕酮、乙酸甲地孕酮(Megestrol acetate)、他莫昔芬(tamoxifen)、曲普瑞林(triptorelin)、天门冬酰胺酶、达卡巴嗪、羟基脲、左旋咪唑、米托坦(mitotane)、普罗巴赞(procarbazane)、维A酸(tretinoin)、糖皮质激素、泼尼松(prednisone)、发色团、染料、反义寡核苷酸(不论天然存在的或使用标准和/或非标准核苷酸合成的，包括RNA干扰(RNAi))、双链RNA (dsRNA)、小干扰RNA (siRNA)、微RNA (miRNA)、适配体、CpG寡核苷酸、核酶(ribozymes)、核酶(angiozyme)、111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、64Cu、67Cu、90Y、I25I、I31I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、I09Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au、211Pb、Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111 1、Sb-119、I-125、Ho-161、Os-189m、Ir-192、Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213、Fm-255、11C、13N、15O、75Br、198Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、I03Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201Tl、225Ac、76Br、I69Yb、紫杉烷(taxane)、顺铂、甲硝唑(metronidazole)、米索硝唑(misonidazole)、去甲基米索硝唑(desmethylmisonidazole)、哌莫硝唑(pimonidazole)、依他硝唑(etanidazole)、尼莫唑(nimorazole)、丝裂霉素C、RSU1069、SR 4233、E09、RB 6145、烟酰胺、5-溴去氧尿苷(BUdR)、5-碘去氧尿苷(IUdR)、溴去氧胞苷、氟去氧尿苷(FUdR)、羟基脲、血卟啉衍生物、Photofrin(r)、苯并卟啉衍生物、NPe6、锡初卟啉(SnET2)、脱镁叶绿甲酯酸-a (pheoborbide a)、细菌叶绿素a、萘酞菁、酞菁、锌酞菁、喜树碱(camptothecin)、伊立替康、拓扑替康(topotecan)、安吖啶(amsacrine)、柔红霉素、多柔比星、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)、玫瑰树碱(ellipticine)、表柔比星、依托泊苷(etoposide)、雷佐生(razoxane)、替尼泊苷(teniposide)、阿昔替尼(Axitinib)、博舒替尼(Bosutinib)、西地尼布(Cediranib)、达沙替尼、厄洛替尼、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、来他替尼(Lestaurtinib)、尼罗替尼、司马沙尼(Semaxanib)、舒尼替尼、凡德他尼(Vandetanib)、相思豆毒素、相思豆毒素A链、α毒素、油桐蛋白(Aleurites fordiiprotein)、鹅膏毒素(amatoxin)、巴豆毒蛋白(crotin)、泻果素(curcin)、戴安辛蛋白(dianthin protein)、白喉毒素、白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、去氧核糖核酸酶(Dnase)、白树毒素(gelonin)、米托洁林(mitogellin)、蒴莲根毒素A链、苦瓜抑制剂(momordica charantia inhibitor)、新霉素(neomycin)、奥克纳斯(onconase)、酚霉素(phenomycin)、美洲商陆蛋白(Phytolaca americana protein) (PAPI、PAPII和PAP-S)、美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein)、假单胞菌内毒素(Pseudomonasendotoxin)、假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、来自绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的外毒素A链、局限毒素(restrictocin)、蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、核糖核酸酶(Rnase)、芦荀抑制剂(sapaonaria officinalis inhibitor)、皂草素(saporin)、α-帚曲菌素、葡萄球菌肠毒素-A (Staphylcoccal enterotoxin-A)、破伤风类毒素、顺铂、卡铂(carboplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin) (乐沙定(Eloxatin)、赛诺菲-安万特(SanofiAventis))、蛋白酶体抑制剂、PS-341、HDAC抑制剂、伏立诺他(vorinostat)、比利诺他(belinostat)、恩替诺他(entinostat)、莫西诺他(mocetinostat)、帕比诺他(panobinostat)、COX-2抑制剂、经取代的脲、热激蛋白抑制剂、格尔德霉素(Geldanamycin)、肾上腺皮质阻抑剂、单端孢霉烯族毒素类(tricothecene)、A12、19D12、Cp751-871、H7C10、αIR3、ScFV/FC、EM/164、马妥珠单抗(Matuzumab)、艾比特思(Erbitux)、维克替比(Vectibix)、mAb 806、尼妥珠单抗(Nimotuxumab)、AVEO、AMG102、5D5 (OA-5d5)、H244G11、Ab 14号(MM 121-14)、赫赛汀(Herceptin)、1B4C3、2D1D12、NVP-AEW541-A、BMS-536,924 (1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吡啶-2-酮)、BMS-554,417、环木脂体(Cycloligan)、TAE226、PQ401、易瑞沙(Iressa)、CI-1033 (PD 183805)、拉帕替尼(GW-572016)、提克比(Tykerb)、塔西法(Tarceva)、PKI-166、PD-158780、EKB-569、酪氨酸磷酸化抑制剂AG 1478(4-(3-氯苯胺基)-6,7-二甲氧基喹唑啉)、PHA665752、ARQ 197、卡培他滨、5-三氟甲基-2’-去氧尿苷、氨甲蝶呤钠、雷替曲塞(Raltitrexed)、培美曲塞、替加氟(Tegafur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(Cytosine Arabinoside) (阿糖胞苷)、5-氮杂胞苷、6-巯基嘌呤(巯基嘌呤、6-MP)、硫唑嘌呤、6-硫鸟嘌呤、喷司他丁、磷酸氟达拉滨(Fludarabine phosphate)、克拉屈滨(2-CdA、2-氯去氧腺苷)、核糖核苷酸还原酶抑制剂、环磷酰胺、环磷酰胺注射剂(Neosar)、异环磷酰胺、噻替派、BCNU→ 1, 3-双(2-氯乙基)-1-亚硝基脲、CCNU→ 1, -(2-氯乙基)-3-环己基-1-亚硝基脲(甲基CCNU)、六甲蜜胺(Hexamethylmelamine)、白消安、丙卡巴肼HCL、达卡巴嗪(DTIC)、苯丁酸氮芥、美法仑、卡铂、奥沙利铂、多柔比星HCL、柠檬酸柔红霉素(daunorubicin citrate)、米托蒽醌HCL (mitoxantrone HCL)、放线菌素D、依托泊苷、拓扑替康HCl、替尼泊苷、伊立替康HCL(CPT-II)、长春新碱、硫酸长春花碱(vinblastinesulfate)、酒石酸长春瑞滨(vinorelbine tartrate)、硫酸长春地辛、紫杉醇、多西他赛、abraxane、伊沙匹隆(ixabepilone)、甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)、苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate)、甲苯磺酸索拉非尼(sorafenib toslate)、单水合尼罗替尼盐酸盐(nilotinib hydrochloride monohydrate)、L-天门冬酰胺酶、α干扰素、阿伐斯丁(Avastin)、IL-2、阿地白介素(Aldesleukin)、普留净(Proleukin)、IL-12、柠檬酸托瑞米芬(Toremifene citrate)、氟维司群、雷洛昔芬HCL (raloxifene HCL)、阿那曲唑(anastrazole)、来曲唑、法屈唑(Fadrozole) (CGS 16949A)、依西美坦、乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、利普安、乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、双羟萘酸曲普瑞林(triptorelin pamoate)、布舍瑞林(buserelin)、那法瑞林(Nafarelin)、西曲瑞克(cetrorelix)、比卡鲁胺、尼鲁米特(nilutamide)、乙酸甲地孕酮、生长抑素类似物、泼尼松龙(prendinsolone)、地塞米松(dexamethasone)、酮康唑(ketoconazole)、西罗莫司(sirolimus)、坦罗莫司(CCI-779)、地弗罗莫司(AP23573)、伊立替康、甲酰四氢叶酸、Folfiri、5-FU、依那普利(Enalapril)、硝苯地平(Nifedipine)、可乐定(Clonidine)、替莫唑胺、吉西他滨、卡培他滨、紫杉醇、瑞格菲尼(Regorafenib)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)和依维莫司(RAD00I)。
在一些实施方案中，公开包含一种或多种如本文所公开的结合蛋白和一种或多种额外药剂(例如化学治疗剂)的组合物。例如，组合物可包含溶液中的一种或多种结合蛋白与一种或多种额外药剂。在一些实施方案中，药剂是以下中的一种或多种：伊立替康、甲酰四氢叶酸、5-FU、替莫唑胺、吉西他滨和紫杉醇。在一实施方案中，药剂是伊立替康。在一实施方案中，药剂是甲酰四氢叶酸。在一实施方案中，药剂是5-FU。在一实施方案中，药剂是伊立替康、甲酰四氢叶酸和5-FU。在一实施方案中，药剂是替莫唑胺。在一实施方案中，药剂是吉西他滨。在一实施方案中，药剂是紫杉醇。
在另一实施方案中，结合蛋白是结晶的结合蛋白且以晶体存在。在一实施方案中，晶体是不含载体的药物控制释放晶体。在另一实施方案中，结晶的结合蛋白具有比结合蛋白的可溶性对应更长的体内半衰期。在又一实施方案中，结晶的结合蛋白保留生物活性。
在另一实施方案中，本文所述的结合蛋白是糖基化的。例如，糖基化模式是人糖基化模式。
还提供编码本文所公开结合蛋白中的任一者的经分离核酸。另一实施方案提供包含本文所公开的经分离核酸的载体，其中载体是pcDNA、pTT (Durocher等人(2002)Nucleic Acids Res. 30(2))、pTT3 (具有额外的多个克隆位点的pTT)、pEFBOS(Mizushima和Nagata (1990) Nucleic Acids Res.18(17))、pBV、pJV、pcDNA3.1 TOPO、pEF6 TOPO、pBOS、pHybE或pBJ。在一实施方案中，载体是公开于美国专利公开第20090239259号中的载体。
在另一方面，使用本文所公开的载体转化宿主细胞。在一实施方案中，宿主细胞是原核细胞(例如大肠杆菌(E. Coli))。在另一实施方案中，宿主细胞是真核细胞(例如原生生物细胞、动物细胞、植物细胞或真菌细胞)。在一实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞(包括但不限于CHO、COS、NS0、SP2、PER.C6)或真菌细胞(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))或昆虫细胞(例如Sf9)。在一实施方案中，在单一重组宿主细胞中产生两种或更多种，例如具有不同特异性的结合蛋白。例如，抗体混合物的表达已称为Oligoclonics™(Merus B. V., The Netherlands)美国专利第7,262,028号和第7,429,486号。
提供产生本文所公开的结合蛋白的方法，其包括在足以产生结合蛋白的条件下于培养基中培养本文所公开的宿主细胞中的任一者。在一实施方案中，通过此方法产生的结合蛋白的50%-75%是双重特异性四价结合蛋白。在另一实施方案中，通过此方法产生的结合蛋白的75%-90%是双重特异性四价结合蛋白。在另一实施方案中，所产生结合蛋白的90%-95%是双重特异性四价结合蛋白。
一个实施方案提供用于释放结合蛋白的组合物，其中所述组合物包含结晶的结合蛋白、成份和至少一种聚合载体。在一实施方案中，聚合载体是聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(酯肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)或PLGA、聚(b-羟基丁酸酯)、聚(己内酯)、聚(二氧杂环己酮)、聚(乙二醇)、聚((羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚[(有机)磷腈]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯啶酮)、马来酸酐-烷基乙烯基醚共聚物、普罗尼克多元醇(pluronic polyol)、白蛋白、海藻酸盐、纤维素、纤维素衍生物、胶原、纤维蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖或其掺合物和共聚物。在一实施方案中，成份是白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇或聚乙二醇。
另一实施方案提供治疗哺乳动物的方法，其包括向哺乳动物施用有效量的本文所公开的组合物的步骤。
提供包含本文所公开的结合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含至少一种用于治疗病症的额外治疗剂。例如，额外药剂可为治疗剂、化学治疗剂；显像剂、细胞毒性剂、血管发生抑制剂、激酶抑制剂(包括但不限于KDR和TIE-2抑制剂)、共刺激分子调节剂(包括但不限于抗-B7.1、抗-B7.2、CTLA4-Ig、抗-CD20)、粘着分子阻断剂(包括但不限于抗-LFA-1抗体、抗-E/L选择素抗体、小分子抑制剂)、抗-细胞因子抗体或其功能片段(包括但不限于抗-IL-18、抗-TNF或抗-IL-6/细胞因子受体抗体)、抗-VEGF mAb；抗-DLL4 mAb；氨甲蝶呤、环孢菌素、雷帕霉素(rapamycin)、FK506、可检测标记或报道分子、TNF拮抗剂、抗风湿剂、肌肉松弛剂、麻醉药品(narcotic)、非类固醇抗炎药(NSAID)、镇痛剂、麻醉剂(anesthetic)、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗微生物剂、抗牛皮癣剂、皮质类固醇、同化类固醇、促红血球生成素、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁剂、抗精神病剂、刺激剂、哮喘医药、β激动剂、吸入类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。在一些实施方案中，额外治疗剂是化学治疗剂。在一些实施方案中，额外药剂是以下中的一种或多种：伊立替康、甲酰四氢叶酸、5-FU、替莫唑胺、吉西他滨和紫杉醇。在一实施方案中，药剂是伊立替康。在一实施方案中，药剂是甲酰四氢叶酸。在一实施方案中，药剂是5-FU。在一实施方案中，药剂是伊立替康、甲酰四氢叶酸和5-FU。在一实施方案中，药剂是替莫唑胺。在一实施方案中，药剂是吉西他滨。在一实施方案中，药剂是紫杉醇。
在多种实施方案中，提供诊断和/或治疗患有可通过靶向VEGF和/或DLL4进行诊断和/或治疗的病症(例如任何血管发生病症或任何与VEGF和/或DLL4的异常表达有关的其他病症)的人个体的方法，其包括向人个体施用本文所公开的结合蛋白，从而抑制人个体中的一种或多种靶的活性且缓解一种或多种症状或完成治疗。本文所提供的结合蛋白可用于诊断和/或治疗患有原发性和转移性癌症的人，所述癌症包含乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、口咽癌、下咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、胆囊癌和胆管癌、小肠癌、泌尿道癌(包括肾癌、膀胱癌和尿道上皮癌)、女性生殖道癌(包括子宫颈癌、子宫癌和卵巢癌以及绒毛膜癌和妊娠滋养细胞疾病)、男性生殖道癌(包括前列腺癌、精囊癌、睾丸癌和生殖细胞肿瘤)、内分泌腺癌(包括甲状腺癌、肾上腺癌和脑垂体腺癌)和皮肤癌以及血管瘤、黑素瘤、肉瘤(包括源自骨和软组织者以及卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)的那些)、脑、神经、眼睛和脑膜的肿瘤(包括星形细胞瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、神经母细胞瘤、神经鞘瘤和脑膜瘤)、源自造血系统恶性肿瘤的肿瘤、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)和非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、造血系统恶性肿瘤、卡波西肉瘤、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多病、恶性黑素瘤、多发性骨髓瘤、副肿瘤综合征/恶性肿瘤的高钙血症或实体瘤。
在一些实施方案中，在患者中治疗癌症的方法包括施用本文所公开的结合蛋白中的一种或多种或其药物组合物。在一实施方案中，癌症是结肠癌。在一实施方案中，癌症是成胶质细胞瘤。在一实施方案中，癌症是胰腺癌。在一实施方案中，癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，治疗癌症的方法(包括施用本文所公开的结合蛋白中的一种或多种或其药物组合物)会减小肿瘤生长或延迟肿瘤生长，其至少约等于抗-VEGF抗体和抗-DLL4抗体的组合的预期累加效应。在一些实施方案中，所述方法会减小肿瘤生长或延迟肿瘤生长，其大于累加的(例如比从抗-VEGF抗体和抗-DLL4抗体的预期效应相加中期望的更大的降低)。
在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括施用本文所公开的结合蛋白中的一种或多种或其药物组合物与一种或多种额外药剂(例如化学治疗剂或生物药剂)的组合。在一些实施方案中，药剂是以下中的一种或多种：瑞格菲尼(STIVAGRA™)、帕妥珠单抗(PERJECTA™)、伊立替康、甲酰四氢叶酸、5-FU、替莫唑胺、吉西他滨和紫杉醇。在一实施方案中，药剂是伊立替康。在一实施方案中，药剂是甲酰四氢叶酸。在一实施方案中，药剂是5-FU。在一实施方案中，药剂是伊立替康、甲酰四氢叶酸和5-FU。在一实施方案中，药剂是替莫唑胺。在一实施方案中，药剂是吉西他滨。在一实施方案中，药剂是紫杉醇。在一些实施方案中，治疗癌症的方法(包括施用本文所公开的结合蛋白中的一种或多种或其药物组合物与一种或多种额外药剂的组合)会减小肿瘤生长或延迟肿瘤生长，其至少等于结合蛋白和额外药剂的组合的预期累加效应。在一些实施方案中，所述方法会减小肿瘤生长或延迟肿瘤生长且大于累加的(例如比从结合蛋白和额外药剂的预期效应相加中期望的更大的降低)。
在一些实施方案中，治疗结肠癌的方法包括施用本文所公开的结合蛋白中的一种或多种或其药物组合物任选地与伊立替康、甲酰四氢叶酸和5-FU中的一种或多种的组合。在一些实施方案中，治疗成胶质细胞瘤的方法包括施用本文所公开的结合蛋白中的一种或多种或其药物组合物任选地与替莫唑胺的组合。在一些实施方案中，治疗胰腺癌的方法包括施用本文所公开的结合蛋白中的一种或多种或其药物组合物任选地与吉西他滨的组合。在一些实施方案中，治疗乳腺癌的方法包括施用本文所公开的结合蛋白中的一种或多种或其药物组合物任选地与紫杉醇的组合。
在多种实施方案中，本文所提供的结合蛋白可与一种或多种抗高血压剂组合施用。一种或多种抗高血压剂可选自利尿剂、肾上腺素能受体拮抗剂、钙通道阻断剂、肾素抑制剂、ACE抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、血管舒张剂和α-2激动剂。例如，药剂可为以下中的一种或多种：可乐定、依那普利；硝苯地平；甲基多巴(methyldopa)、肼屈嗪(hydralazine)、哌唑嗪(prazosin)、利血平(reserpine)、莫索尼定(moxonidine)、胍法辛(guanfacine)、培哚普利(perindopril)/吲达帕胺(indapamide)、洛非西定(lofexidine)和甲酪氨酸(metirosine)。在一些实施方案中，本文所提供的结合蛋白可与一种或多种抗凝血剂组合施用。例如，抗凝血剂可为以下中的一种或多种：华法林(warfarin)、肝素、低分子量肝素、达肝素钠(dalteparin sodium)、阿加曲班(argatroban)、比伐卢定(bivalirudin)、来匹卢定(lepirudin)和葡萄糖。在一些实施方案中，本文所提供的结合蛋白可与一种或多种抗高血压剂和一种或多种抗凝血剂组合施用。
在多种实施方案中，本文所提供的结合蛋白可用于诊断和/或治疗患有黄斑变性(包括湿性形式)、糖尿病性视网膜病变和/或特征在于血管过度生长或水肿的任何其他疾病或病症的人。
在一实施方案中，结合蛋白或其抗原结合部分用于治疗癌症或预防或抑制从本文所述的肿瘤的转移(当单独使用或与放射疗法和/或化学治疗剂组合使用时)。
在一实施方案中，可与本文所提供的结合蛋白组合的化学治疗剂或生物药剂包含下列：13-顺式-视黄酸；2-CdA；2-氯去氧腺苷；5-阿扎胞苷；5-氟尿嘧啶；5-FU；6-巯基嘌呤；6-MP；6-TG；6-硫鸟嘌呤；Abraxane；Accutane®；放线菌素-D；Adriamycin®；Adrucil®；Afinitor®；Agrylin®；Ala-Cort®；阿地白介素；阿来组单抗(Alemtuzumab)；ALIMTA；阿利维A酸(Alitretinoin)；Alkaban-AQ®；Alkeran®；全反式视黄酸；α干扰素；六甲蜜胺；氨甲蝶呤(Amethopterin)；氨磷汀；氨鲁米特；阿那格雷(Anagrelide)；Anandron®；阿那曲唑；阿糖胞嘧啶(Arabinosylcytosine)；Ara-C Aranesp®；Aredia®；Arimidex®；Aromasin®；Arranon®；三氧化二砷；Arzerra™；天门冬酰胺酶；ATRA；Avastin®；阿扎胞苷；BCG；BCNU；苯达莫司汀(Bendamustine)；贝伐珠单抗(Bevacizumab)；贝沙罗汀(Bexarotene)；BEXXAR®；比卡鲁胺；BiCNU；Blenoxane®；博来霉素；硼替佐米；白消安；Busulfex®；C225；甲酰四氢叶酸钙；Campath®；Camptosar®；喜树碱-11；卡培他滨Carac™；卡铂；卡莫司汀；卡莫司汀薄片(Carmustine wafer)；Casodex®；CC-5013；CCI-779；CCNU；CDDP；CeeNU；Cerubidine®；西妥昔单抗(Cetuximab)；苯丁酸氮芥；顺铂；嗜橙菌因子；克拉屈滨；可的松(Cortisone)；Cosmegen®；CPT-11；环磷酰胺；Cytadren®；阿糖胞苷；阿糖胞苷脂质体；Cytosar-U®；Cytoxan®；达卡巴嗪；达克金(Dacogen)；更生霉素(Dactinomycin)；阿法达贝泊汀(Darbepoetin Alfa)；达沙替尼；道诺霉素(Daunomycin)；柔红霉素；柔红霉素盐酸盐；柔红霉素脂质体；DaunoXome®；地卡特隆(Decadron)；地西他滨；Delta-Cortef®；Deltasone®；地尼白介素(Denileukin)；Diftitox；DepoCyt™；地塞米松；乙酸地塞米松(Dexamethasone Acetate)；地塞米松磷酸钠(Dexamethasone SodiumPhosphate)；地克萨松(Dexasone)；右雷佐生；DHAD；DIC；迪奥带斯(Diodex)；多西他赛；Doxil®；多柔比星；多柔比星脂质体；Droxia™；DTIC；DTIC-Dome®；Duralone®；Efudex®；Eligard™；Ellence™；Eloxatin™；Elspar®；Emcyt®；表柔比星；阿法依伯汀(Epoetin Alfa)；艾比特思；厄洛替尼；欧文氏菌属L-天门冬酰胺酶(Erwinia L-asparaginase)；雌莫司汀；氨磷汀(Ethyol) Etopophos®；依托泊苷；磷酸依托泊苷；Eulexin®；依维莫司；Evista®；依西美坦；Fareston®；Faslodex®；Femara®；非格司亭；氟尿苷(Floxuridine)；Fludara®；氟达拉滨；Fluoroplex®；氟尿嘧啶；氟尿嘧啶(乳膏)；氟甲睾酮(Fluoxymesterone)；氟他胺；亚叶酸；FUDR®；氟维司群；吉非替尼；吉西他滨；吉妥单抗奥佐米星(Gemtuzumab ozogamicin)；健择(Gemzar)；Gleevec™；Gliadel®薄片；GM-CSF；戈舍瑞林；粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(G-MCSF)；Halotestin®；Herceptin®；海塞多(Hexadrol)；Hexalen®；六甲蜜胺；HMM；Hycamtin®；Hydrea®；Hydrocort Acetate®；氢化可的松(Hydrocortisone)；氢化可的松磷酸钠(Hydrocortisone Sodium Phosphate)；氢化可的松琥珀酸钠(HydrocortisoneSodium Succinate)；磷酸氢化可的松(Hydrocortone Phosphate)；羟基脲；异贝莫单抗(Ibritumomab)；替坦异贝莫单抗(Ibritumomab Tiuxetan)；Idamycin®；Idarubicin Ifex®；干扰素-α；干扰素-α-2b (PEG缀合物)；异环磷酰胺；白介素-11 (IL-11)；白介素-2(IL-2)；甲磺酸伊马替尼；咪唑羧酰胺(Imidazole Carboxamide)；Intron A®；Iressa®；伊立替康；异维A酸(Isotretinoin)；伊沙匹隆；Ixempra™；KADCYCLA®；Kidrolase (t)Lanacort®；拉帕替尼；L-天门冬酰胺酶；LCR；来那度胺(Lenalidomide)；来曲唑；甲酰四氢叶酸；瘤可宁(Leukeran)；Leukine™；亮丙瑞林；醛基长春碱(Leurocristine)；Leustatin™；脂质体Ara-C；Liquid Pred®；洛莫司汀；L-PAM；L-溶肉瘤素；Lupron®；Lupron Depot®；Matulane®；马克戴斯(Maxidex)；氮芥(Mechlorethamine)；氮芥盐酸盐；Medralone®；Medrol®；Megace®；甲地孕酮；乙酸甲地孕酮；美法仑；巯基嘌呤；美司钠；Mesnex™；氨甲蝶呤（Methotrexate）；氨甲蝶呤钠；甲基泼尼松龙(Methylprednisolone)；Meticorten®；丝裂霉素；丝裂霉素-C；米托蒽醌M-Prednisol®；MTC；MTX；Mustargen®；氮芥(Mustine)；Mutamycin®；Myleran®；Mylocel™；Mylotarg®；Navelbine®；奈拉滨；Neosar®；Neulasta™；Neumega®；Neupogen®；Nexavar®；Nilandron®；尼罗替尼；尼鲁米特；Nipent®；氮芥(Nitrogen Mustard) Novaldex®；Novantrone®；尼普拉特(Nplate)；奥曲肽(Octreotide)；乙酸奥曲肽(Octreotide acetate)；奥法木单抗(Ofatumumab)；Oncospar®；Oncovin®；Ontak®；Onxal™；奥普瑞白介素；Orapred®；Orasone®；奥沙利铂；紫杉醇；结合蛋白的紫杉醇(Paclitaxel Protein-bound)；帕米膦酸盐(Pamidronate)；帕尼单抗(Panitumumab)；Panretin®；Paraplatin®；帕唑帕尼(Pazopanib)；Pediapred®；PEG干扰素；培加帕酶(Pegaspargase)；培非司亭(Pegfilgrastim)；PEG-INTRON™；PEG-L-天门冬酰胺酶；培美曲塞；喷司他丁；苯丙氨酸氮芥(Phenylalanine Mustard)；Platinol®；Platinol-AQ®；泼尼松龙；泼尼松；Prelone®；丙卡巴肼；PROCRIT®；Proleukin®；含有卡莫司汀植入物的普罗非泮20 (Prolifeprospan 20)；Purinethol®；雷洛昔芬(Raloxifene)；Revlimid®；Rheumatrex®；Rituxan®；利妥昔单抗(Rituximab)；Roferon-A®；罗米司亭(Romiplostim)；Rubex®；柔红霉素盐酸盐(Rubidomycin hydrochloride)；Sandostatin®；Sandostatin LAR®；沙格司亭；Solu-Cortef®；Solu-Medrol®；索拉非尼；SPRYCEL™；STI-571；链佐星；SU11248；舒尼替尼；Sutent®；他莫昔芬Tarceva®；Targretin®；Tasigna®；Taxol®；Taxotere®；Temodar®；替莫唑胺坦西莫司；替尼泊苷；TESPA；沙利度胺；Thalomid®；TheraCys®；硫鸟嘌呤；Thioguanine Tabloid®；硫代磷酰胺(Thiophosphoamide)；Thioplex®；噻替派；TICE®；Toposar®；拓扑替康；托瑞米芬；Torisel®；托西莫单抗(Tositumomab)；曲妥珠单抗(Trastuzumab)；Treanda®；维A酸；Trexall™；Trisenox®；TSPA；TYKERB®；VCR；Vectibix™；Velban®；Velcade®；VePesid®；Vesanoid®；Viadur™；Vidaza®；长春花碱；硫酸长春花碱；Vincasar Pfs®；长春新碱；长春瑞滨；酒石酸长春瑞滨；VLB；VM-26；伏立诺他；福退癌(Votrient)；VP-16；Vumon®；Xeloda®；Zanosar®；Zevalin™；Zinecard®；Zoladex®；唑来膦酸(Zoledronic acid)；Zolinza；或Zometa®和/或本文并未具体列出的靶向类似途径的任何其他药剂。
在另一实施方案中，治疗患有病症的患者的方法包括以下步骤：单独施用本文所公开的结合蛋白中的一种或多种，或在施用第二药剂之前、同时或之后施用结合蛋白。在一特定实施方案中，本文所公开的药物组合物是通过以下向患者施用：口服、肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、浓注(bolus)、阴道、直肠、经颊、舌下、鼻内或经皮施用。
在多种实施方案中，提供测定一种或多种抗原或其片段在测试样品中的存在、量或浓度的方法，其中一种或多种抗原或其片段是DLL4和/或VEGF。该方法包括通过免疫测定来测定测试样品的抗原或其片段。免疫测定(i)采用至少一种结合蛋白和至少一种可检测标记，且(ii)包括比较在测试样品中通过可检测标记产生的信号(作为抗原或其片段的存在、量或浓度的直接或间接指示)与在对照或校准品中产生的信号(作为抗原或其片段的存在、量或浓度的直接或间接指示)。校准品任选地是校准品系列的一部分，其中每一校准品在抗原或其片段的浓度上不同于系列中的其他校准品。该方法可包括(i)使测试样品与至少一种捕获剂(其结合至抗原或其片段上的表位)接触以形成包含捕获剂和抗原或其片段的复合物，(ii)使包含捕获剂和抗原或其片段的复合物与至少一种检测剂(其包含可检测标记且结合至抗原或其片段上未由捕获剂结合的表位)接触以形成检测复合物，和(iii)基于通过在(ii)中形成的检测复合物中的可检测标记产生的信号，测定抗原或其片段在测试样品中的存在、量或浓度，其中至少一种捕获剂和/或至少一种检测剂是至少一种结合蛋白。
或者，在一些实施方案中，测定一种或多种抗原或其片段在测试样品中的存在、量或浓度的方法可包括：(i)使测试样品与至少一种捕获剂(其结合至抗原或其片段上的表位)接触以形成包含捕获剂和抗原或其片段的复合物，且同时或依序以任一顺序使测试样品与可检测标记的抗原或其片段(其可与测试样品中的任何抗原或其片段竞争结合至至少一种捕获剂)接触，其中存在于测试样品中的任何抗原或其片段和可检测标记的抗原彼此竞争形成检测复合物，和(ii)基于通过在(i)中形成的检测复合物中的可检测标记产生的信号，测定抗原或其片段在测试样品中的存在、量或浓度，其中至少一种捕获剂是至少一种结合蛋白且其中通过捕获检测复合物中的可检测标记产生的信号与抗原或其片段在测试样品中的量或浓度成反比。
在多种实施方案中，测试样品可来自患者，在该情形下，该方法可进一步包括诊断、预测或评估患者的治疗性/预防性治疗的效力。如果该方法进一步包括评估患者的治疗性/预防性治疗的效力，则该方法任选地进一步包括视需要修改患者的治疗性/预防性治疗以改进效力。该方法可适合用于自动化系统或半自动化系统。因此，本文所述的方法还可用于确定个体是否患有给定疾病、病症或病况或处于发生给定疾病、病症或病况的风险中。具体而言，该方法可包括以下步骤：
(a) 测定一种或多种分析物或其片段在来自个体的测试样品中的浓度或量(例如使用本文所述的方法或本领域已知的方法)；和
(b) 比较如在步骤(a)中测定的分析物或其片段的浓度或量与预定水平，其中若步骤(a)中所测定分析物的浓度或量就预定水平而言有利，则可确定个体并不患有给定疾病、病症或病况或处于给定疾病、病症或病况的风险中。然而，若步骤(a)中所测定分析物的浓度或量就预定水平而言不利，则可确定个体患有给定疾病、病症或病况或处于给定疾病、病症或病况的风险中。
另外，本文提供监测个体中的疾病的进展的方法。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(a) 测定一种或多种分析物在来自个体的测试样品中的浓度或量；
(b) 测定分析物在来自同一个体的后一测试样品中的浓度或量；和
(c) 比较步骤(b)中所测定分析物的浓度或量与步骤(a)中所测定分析物的浓度或量，其中若在步骤(b)中测定的浓度或量与在步骤(a)中测定的浓度或量相比不变或不利，则可确定个体的疾病继续发生、进展或恶化。通过比较，若在步骤(b)中测定的浓度或量与在步骤(a)中测定的浓度或量相比有利，则可确定个体的疾病已停止、消退或改善。
任选地，监测疾病的进展的方法进一步包括比较如在步骤(b)中测定的分析物的浓度或量与例如预定水平。另外，任选地，若比较显示如在步骤(b)中测定的分析物的浓度或量例如就预定水平而言不利地改变，则所述方法包括使用一种或多种药物组合物治疗个体一定时间段。
还提供用于测定测试样品中一种或多种抗原或其片段的存在或浓度的试剂盒，其中一种或多种抗原是DLL4和/或VEGF。该试剂盒包含至少一种如本文所述的结合蛋白(用于分析测试样品的抗原或其片段)和用于测定测试样品的抗原或其片段的说明书。在一实施方案中，至少一种结合蛋白任选地经可检测标记。
附图简述
图1是双重可变结构域(DVD)结合蛋白构建体的示意图示并且显示从两种亲本抗体产生DVD结合蛋白的策略。
详述
提供能够结合两种不同蛋白上的表位的多价和/或多特异性结合蛋白。还提供双重可变结构域结合蛋白(也称为DVD、DVD结合蛋白或双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-IgTM))及其药物组合物以及用于制备该DVD结合蛋白的核酸、重组表达载体和宿主细胞。还提供使用DVD结合蛋白在体外或体内检测特异性抗原的方法。
除非在本文中另有定义，否则本文所用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。在任何潜在模糊的情形下，本文所提供的定义优先于任何词典或非固有定义。除非上下文另外需要，否则单数术语将包括复数形式且复数术语将包含单数。除非另有所述，否则“或(or)”的使用意指“和/或(and/or)”。使用术语“包括(including) ”以及其他形式(例如“包括(includes) ”和“包括(included) ”)不具有限制意义。本文所述的任何范围应理解为包括端点和端点之间的所有值。
本文所用各部分标题仅出于组织目的，而不能解释为限制所述主题。本申请中所引用的所有文件或文件部分(包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和论文)的全部内容出于任何目的明确地以引用方式并入本文中。若以引用方式并入的文件与说明书中所含的公开内容相冲突，则说明书将替代任何冲突材料。
通常，结合本文所述细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法是本领域熟知且常用的那些。除非另外指明，否则本文所提供的方法和技术通常是根据本领域熟知的常规方法且如贯穿本说明书引用并论述的多种一般且更具体的参考文献中所述来实施。除非另外指明，否则酶反应和纯化技术是根据制造商说明书来实施，或如本领域常规完成来实施，或如本文所述来实施。除非另外指明，否则结合本文所述分析化学、合成有机化学和医学与药物化学使用的命名法及其实验室程序和技术是本领域熟知且常用的那些。化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送和患者治疗使用标准技术。
因此，公开内容可更易于理解，所选术语定义于下文中。
术语“抗体”是指免疫球蛋白(Ig)分子，其通常包含四条多肽链、两条重(H)链和两条轻(L)链或其功能片段、突变体、变体或衍生物，其保留Ig分子的表位结合特征。本领域已知此类片段、突变体、变体或衍生物抗体形式。在全长抗体的一实施方案中，每一重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。CH包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每一轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。CL包含单一CL结构域。VH和VL可进一步再分成高度可变区(称为互补决定区(CDR))，其被较为保守的区(称为框架区(FR))间隔开。通常，每一VH和VL由三个CDR和四个FR构成，其自氨基末端至羧基末端按下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。免疫球蛋白分子可为任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG 3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
术语“双特异性抗体”是指在其两个结合臂之一(一个HC/LC对)上结合一种抗原(或表位)且在其第二结合臂(不同的HC/LC对)上结合不同抗原(或表位)的抗体。双特异性抗体具有两个不同抗原结合臂(在特异性和CDR序列两者中均不同)，且对于其所结合的每一抗原而言是单价。双特异性抗体包括通过以下方式产生的那些：细胞杂交瘤技术(Milstein和Cuello (1983) Nature 305(5934): 537-40)、两种不同单克隆抗体的化学缀合(Staerz等人(1985) Nature 314(6012): 628-31)或在Fc区中引入突变的隆凸至孔洞(knob-into-hole)或类似方法(Holliger等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(14): 6444-6448)。
“亲和力成熟”抗体是在其一个或多个CDR中存在一个或多个变化的抗体，所述变化会使抗体对抗原的亲和力相对于不具有那些变化的亲本抗体有所改进。示例性亲和力成熟抗体可对靶抗原具有纳摩尔级或甚至皮摩尔级亲和力。通过本领域已知的程序产生亲和力成熟抗体。Marks等人(1992) BioTechnology 10:779-783描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机诱变描述于以下文献中：Barbas等人(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3809-3813；Schier等人(1995) Gene 169:147-155；Yelton等人(1995) J. Immunol. 155:1994-2004；Jackson等人(1995) J. Immunol. 154(7):3310-9；Hawkins等人(1992) J. Mol. Biol. 226:889-896，且在具有活性增强氨基酸残基的选择性诱变位置、接触或超突变位置处的突变描述于美国专利第6,914,128号中。
术语“CDR移植抗体”是指包含重链和轻链可变区序列的抗体，其中VH和/或VL的一个或多个CDR区的序列经另一抗体的CDR序列代替。例如，两种抗体可来自不同物种，例如具有鼠类重链和轻链可变区的抗体，其中一个或多个鼠类CDR经人CDR序列代替。
术语“人源化抗体”是指来自非人物种的经改变以更“人样(human-like)” (即更类似于人种系序列)的抗体。一类人源化抗体是CDR移植抗体，其中将非人CDR序列引入人VH和VL序列中以代替相应人CDR序列。“人源化抗体”还是如下抗体或其变体、衍生物、类似物或片段：其包含与人抗体FR序列的氨基酸序列具有实质同一性(例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性)的框架区(FR)序列和至少一个与非人CDR的氨基酸序列具有实质同一性(例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性)的CDR。人源化抗体可包含实质上所有的至少一个且通常两个可变结构域(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)，其中所有或实质上所有CDR区的序列皆对应于非人免疫球蛋白(即供体抗体)的那些序列，且所有或实质上所有FR区的序列皆为人免疫球蛋白的那些序列。人源化抗体还可包含来自人抗体的重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在一实施方案中，人源化抗体还包含人免疫球蛋白Fc区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化轻链。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化重链。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有轻链的人源化可变结构域和/或人源化重链的人源化可变结构域。在一些实施方案中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变结构域。在一些实施方案中，人源化抗体含有重链以及至少轻链的可变结构域。
术语“双重可变结构域结合蛋白”和“双重可变结构域免疫球蛋白”是指其两个结合臂中的每一个(例如一个HC/LC对)中具有两个各自能够结合至抗原的可变结构域的结合蛋白(参见PCT公开第WO 02/02773号)。在一实施方案中，每一可变结构域结合不同抗原或表位。在另一实施方案中，每一可变结构域结合相同抗原或表位。在另一实施方案中，双重可变结构域结合蛋白具有两个相同抗原结合臂(具有相同特异性和相同CDR序列)，且对于其结合的每一抗原而言是二价。在一实施方案中，DVD结合蛋白可以是单特异性的(即能够结合一种抗原)或多特异性的(即能够结合两种或更多种抗原)。包含两种重链DVD多肽和两种轻链DVD多肽的DVD结合蛋白称为DVD-IgTM。在一实施方案中，4条链DVD结合蛋白中的每一半包含重链DVD多肽和轻链DVD多肽和两个抗原结合位点。在一实施方案中，每一结合位点包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中每个抗原结合位点总共有6个CDR参与抗原结合。
术语“抗独特型抗体”是指针对另一抗体的抗原结合位点的氨基酸序列产生的抗体。可施用抗独特型抗体以增强针对抗原的免疫反应。
术语“生物活性”是指分子的任一种或多种生物性质(不论天然存在(如在体内所发现)或通过重组方式提供或实现)。生物性质包括但不限于结合受体、诱导细胞增殖、抑制细胞生长、诱导其他细胞因子、诱导细胞凋亡和酶活性。
术语“中和”是指在结合蛋白特异性结合至抗原时抵消抗原的生物活性。在一实施方案中，中和结合蛋白结合至抗原(例如细胞因子)且将其生物活性减小至少约20%、40%、60%、80%、85%或更多。
“特异性”是指结合蛋白选择性结合抗原的能力。
“亲和力”是结合蛋白与抗原之间的相互作用的强度，且通过结合蛋白的CDR的序列以及通过抗原性质(例如其大小、形状和/或电荷)来测定。可选择结合蛋白以获得提供期望治疗端点同时最小化负面副作用的亲和力。可使用本领域技术人员已知的方法来测量亲和力(US 20090311253)。
术语“效力”是指结合蛋白实现期望效应的能力，且是其治疗效能的量度。可使用本领域技术人员已知的方法来评估效力(US 20090311253)。
术语“交叉反应性”是指结合蛋白结合针对其所产生的靶外的靶的能力。通常，结合蛋白以适当高亲和力结合其靶组织/抗原，但对非靶正常组织/抗原显示适当低亲和力。通常选择个别结合蛋白以符合两种准则：(1)抗体结合(如使用本领域已知的染色方法所观察)至适用于已知表达抗体靶的组织，和(2)在来自相同器官的人和毒性物种(例如小鼠和食蟹猴)组织之间的类似染色模式。评估交叉反应性的这些及其他方法为本领域技术人员所知(US 20090311253)。
术语“生物功能”是指结合蛋白的特定体外或体内作用。结合蛋白可靶向若干种类抗原且经由多种作用机制实现期望的治疗结果。结合蛋白可靶向可溶性蛋白、细胞表面抗原和/或细胞外蛋白沉积物。结合蛋白可激动、拮抗或中和其靶的活性。结合蛋白可有助于清除其结合的靶，或可在结合至细胞时导致细胞毒性。可将两种或更多种抗体部分并入到多价形式中以在单一结合蛋白分子中实现一种以上不同功能。用于评估生物功能的体外测定和体内模型为本领域技术人员所知(US 20090311253)。
“稳定的”结合蛋白是在储存时结合蛋白基本上保留其物理稳定性、化学稳定性和/或生物活性的结合蛋白。在体外于多种温度下稳定延长时间段的多价结合蛋白是期望的。稳定结合蛋白和在多种温度下评估其稳定性的方法为本领域技术人员所知(US20090311253)。
术语“溶解性”是指蛋白保持分散于水溶液内的能力。蛋白在水制剂中的溶解性取决于疏水性和亲水性氨基酸残基的合理分布，因而溶解性可与正确折叠的蛋白的产量相关。本领域技术人员能够使用常规HPLC技术和本领域技术人员已知的方法来检测结合蛋白的溶解性的增加或降低(US 20090311253)。
结合蛋白可使用多种宿主细胞产生或可在体外产生，且每次工作的相对产率决定了“产生效率”。影响产生效率的因素包括但不限于宿主细胞类型(原核或真核)、表达载体的选择、核苷酸序列的选择和所采用的方法。用于产生结合蛋白的材料和方法以及产生效率的测量为本领域技术人员所知(US 20090311253)。
术语“免疫原性”意指物质诱导免疫反应的能力。施用治疗性结合蛋白可使得在一定程度上发生免疫反应。可在选择亲本抗体期间分析在多价形式中可诱导免疫原性的潜在要素，且可在将其序列并入多价结合蛋白形式中之前采用减小该风险的步骤以优化亲本抗体。减小抗体和结合蛋白的免疫原性的方法为本领域技术人员所知(US 20090311253)。
术语“标记”和“可检测标记”意指连接至特异性结合对的成员(例如抗体或其分析物)以致使在特异性结合对的成员之间的反应(例如结合)可检测的部分。特异性结合对的经标记成员称为“可检测标记”。因此，术语“经标记结合蛋白”是指具有并入的为结合蛋白提供鉴定的标记的蛋白。在一实施方案中，标记是可产生可通过目测或仪器方式检测的信号的可检测标记物，例如并入经放射标记的氨基酸或连接至具有可通过经标记抗生物素蛋白检测的生物素部分的多肽(例如含有荧光标记物或具有可通过光学或比色方法检测的酶活性的链霉抗生物素蛋白)。用于多肽的标记的实例包括但不限于下列物质：放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm)；色原体、荧光标记(例如FITC、罗丹明(rhodamine)、镧系元素磷光体)、酶标记(例如辣根过氧化物酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；化学发光标记物；生物素基团；由二级报道分子识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)；和磁性剂，例如钆螯合物。通常用于免疫测定的标记的代表性实例包括产生光的部分(例如吖啶鎓化合物)和产生荧光的部分(例如荧光素)。就此而言，所述部分本身可能无法被可检测地标记但可在与另一部分反应后变为可检测。
术语“缀合物”是指化学连接至第二化学部分(例如治疗剂或细胞毒性剂)的结合蛋白(例如抗体或DVD-Ig)。术语“试剂”包括自生物材料制得的化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子或萃取物。治疗剂或细胞毒性剂的实例包括但不限于紫杉醇(taxol)、细胞松弛素B (cytochalasin B)、短杆菌肽D (gramicidin D)、依米丁(emetine)、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光辉霉素(mithramycin)、放线菌素D、1-去氢睾甾酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)、美托洛尔（metoprolol）、阿替洛尔（atenolol）、比索洛尔（bisoprolol）和嘌呤霉素(puromycin)及其类似物或同系物。在用于免疫测定背景中时，缀合物可为用作检测剂的可检测标记抗体或DVD-Ig。
术语“晶体”和“结晶的”是指以晶体形式存在的结合蛋白(例如抗体)或其抗原结合部分。晶体是物质的一种固态形式，其不同于其他形式(例如无定形固态或液晶态)。晶体是由原子、离子、分子(例如诸如抗体等蛋白)或分子总成(例如抗原/抗体复合物)的规则重复三维阵列构成。这些三维阵列是根据该领域所充分理解的特定数学关系来排列。晶体中重复的基本单元或结构单元称为不对称单元。排列中不对称单元依从给定的明确定义的晶体对称性的重复提供晶体的“晶胞”。晶胞通过在全部三维空间中的规则性平移(regulartranslation)的重复会提供晶体。参见Giege, R.和Ducruix, A. Barrett,CRYSTALLIZATION OF NUCLEIC ACIDS AND PROTEINS, A PRACTICAL APPROACH，2nd ea.，第20 1-16页，Oxford University Press, New York, New York, (1999)。
术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一类载体为“质粒”，其是指额外DNA区段可连接至其中的环形双链DNA环。另一类载体为病毒载体，其中额外的DNA区段可连接至病毒基因组中。其他载体包括RNA载体。某些载体能够在将其引入其中的宿主细胞中进行自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞中时整合至该宿主细胞的基因组中，且由此随宿主基因组一同复制。某些载体能够引导与其可操作地连接的基因的表达。本文将此类载体称为“重组表达载体”(或简称为”表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中可用的表达载体经常呈质粒形式。在本说明书中，“质粒”与“载体”可互换使用，这是因为质粒是载体的最常用形式。然而，还包括提供等同功能的表达载体的其他形式，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。pHybE载体群(美国专利申请第61/021,282号)可用于亲本抗体和DVD结合蛋白克隆。V1 (衍生自pJP183；pHybE-hCg1,z,non-aV2)可用于克隆具有野生型恒定区的抗体和DVD重链。V2 (衍生自pJP191；pHybE-hCk V3)可用于克隆具有κ恒定区的抗体和DVD轻链。V3 (衍生自pJP192；pHybE-hCl V2)可用于克隆具有λ恒定区的抗体和DVD轻链。V4 (使用λ信号肽和κ恒定区构造)可用于克隆具有λ-κ杂合V结构域的DVD轻链。V5 (使用κ信号肽和λ恒定区构造)可用于克隆具有κ-λ杂合V结构域的DVD轻链。V7 (衍生自pJP183；pHybE-hCg1,z,non-a V2)可用于克隆具有(234,235 AA)突变体恒定区的抗体和DVD重链。
术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指向其中引入外源DNA的细胞。该术语不仅指特定个体细胞，还指该细胞的子代。因突变或环境影响后续各代中可发生某些改变，故该子代实际上可能与母细胞不同但却仍包括于本文所用术语“宿主细胞”的范围内。在一实施方案中，宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。在一实施方案中，真核细胞包括原生生物、真菌、植物和动物细胞。在另一实施方案中，宿主细胞包括但不限于原核细胞系大肠杆菌；哺乳动物细胞系CHO、HEK 293、COS、NS0、SP2和PER.C6；昆虫细胞系Sf9；和真菌细胞酿酒酵母。
术语“转染”涵盖通常用于将外源核酸(例如DNA)引入宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。
术语“细胞因子”是指通过一种细胞群体释放的作为细胞间介体作用于另一细胞群体上的蛋白。术语“细胞因子”包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白和天然序列细胞因子的生物活性等同物。
术语“生物样品”意指一定量来自生物或以前的生物(living thing or formerlyliving thing)的物质。此类物质包括但不限于血液(例如全血)、血浆、血清、尿、羊水、滑液、内皮细胞、白细胞、单核细胞、其他细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结和脾脏。
术语“组分”是指组合物的要素。就诊断试剂盒而言，例如，组分可为捕获抗体、检测或缀合抗体、对照、校准品、校准品系列、灵敏度实验对象组、容器、缓冲液、稀释剂、盐、酶、酶的辅因子、检测试剂、预处理试剂/溶液、基质(例如呈溶液形式)、终止溶液和可包含于试剂盒中用于测定测试样品的类似物。因此，在一些实施方案中，“组分”可包括如上文中固定至固体支持物(例如通过结合至抗分析物(例如抗多肽)抗体)的多肽或其他分析物。在一些实施方案中，一种或多种组分可呈溶液或冻干形式。
“对照”是指并不包含分析物(“阴性对照”)或包含分析物(“阳性对照”)的组合物。阳性对照可包含已知浓度的分析物。“对照”、“阳性对照”和“校准品”可在本文中互换使用以指包含已知浓度的分析物的组合物。“阳性对照”可用于确立测定性能特征并且是试剂(例如分析物)的完整性的有用指示剂。
“预定截止值”和“预定水平”通常是指用于通过比较测定结果与预定截止值/水平来评估诊断/预后/治疗效能结果的测定截止值，其中预定截止值/水平与多种临床参数(例如疾病严重程度、进展/不进展(nonprogression)/改善等)相关联或有关。尽管本公开内容可提供示例性预定水平，但众所周知，截止值可根据免疫测定的性质(例如所采用抗体等)而有所变化。另外，本领域普通技术人员熟知将本文的公开内容适用于其他免疫测定以基于本公开内容来获得用于那些其他免疫测定的免疫测定特异性截止值。尽管预定截止值/水平的精确值可在测定之间有所变化，但如本文所述的关联(若存在)通常可适用。
本文所述诊断测定中所用的“预处理试剂” (例如裂解、沉淀和/或溶解试剂)是裂解存在于测试样品中的任何细胞和/或溶解任何分析物的试剂。如本文进一步所述，所有试样皆无需预处理。此外，溶解分析物(例如目的多肽)可能需要从存在于样品中的内源性结合蛋白释放分析物。预处理试剂可为均质性(无需分离步骤)或异质性(需要分离步骤)。在一些实施方案中，在使用异质预处理试剂时，在进行测定的下一步骤之前，从测试样品中去除沉淀的分析物结合蛋白。
在本文所述的免疫测定和试剂盒的背景中，“品质对照试剂”包括但不限于校准品、对照和灵敏度实验对象组(panels)。通常使用一种或多种“校准品”或“标准品”以确立校准(标准)曲线，用于内插靶分子(例如抗体或分析物)的浓度。在一些实施方案中，可使用接近预定阳性/阴性截止值的单一校准品。或者，在其他实施方案中，可使用多种校准品(即一种以上校准品或不同量的校准品)来确立“灵敏度实验对象组”或“灵敏度梯度”。
术语“特异性结合配偶体”是指特异性结合对的成员。特异性结合对包含两种经由化学或物理方式彼此特异性结合的不同分子。在多种实施方案中，除抗原和抗体特异性结合外，其他特异性结合对可包括生物素和抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白)、碳水化合物和凝集素、互补核苷酸序列、效应子和受体分子、辅因子和酶、酶抑制剂和酶等。另外，在一些实施方案中，特异性结合对可包括原始特异性结合成员的类似物的成员，例如分析物类似物。免疫反应性特异性结合成员包括抗原、抗原片段和抗体，包括单克隆和多克隆抗体以及其复合物、片段和变体(包括变体的片段)，不论经分离或重组产生。
术语“Fc区”定义免疫球蛋白重链的C端区，其可通过完整抗体经木瓜蛋白酶消化产生。Fc区可为天然序列Fc区或变体Fc区。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定结构域、CH2结构域和CH3结构域，且任选地包含CH4结构域。替代Fc部分中的氨基酸残基以改变抗体效应子功能为本领域所知(例如美国专利第5,648,260号和第5,624,821号)。Fc区调介若干重要效应子功能，例如细胞因子诱导、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性(CDC)，和抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率。在一些情形下，这些效应子功能为治疗性免疫球蛋白所期望，但在其他情形下可能不需要或甚至有害，这取决于治疗目标。
术语结合蛋白的“抗原结合部分”意指结合蛋白(例如抗体)中保留特异性结合至抗原的能力的一个或多个片段。结合蛋白的抗原结合功能可通过全长抗体以及双特异性、双重特异性或多特异性形式的片段来实施。术语结合蛋白的“抗原结合部分”内所涵盖结合片段的实例包含(i) Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii) F(ab')2片段，即包含两个由铰链区的二硫键连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v) dAb片段，其包含单一可变结构域；和(vi)经分离互补决定区(CDR)。另外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是通过单独基因编码，但其可使用重组方法通过合成接头接合，该合成接头使其能够作为VL和VH区配对形成单价分子的蛋白单链(称为单链Fv (scFv))制备。该单链抗体还旨在涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”内。还涵盖单链抗体的其他形式，例如双抗体。此外，单链抗体还包括“线性抗体”，该线性抗体包含与互补轻链多肽一起形成抗原结合区对的串联Fv区段对(VH-CH1-VH-CH1)。
术语“多价结合蛋白”意指包含两个或更多个抗原结合位点的结合蛋白。在一实施方案中，多价结合蛋白经改造具有三个或更多个抗原结合位点，且并非天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”是指能够结合两种或更多种相关或不相关靶的结合蛋白。在一实施方案中，本文所提供的DVD结合蛋白包含两个或更多个抗原结合位点且是四价或多价结合蛋白。
术语“接头”意指一个氨基酸残基或包含两个或更多个通过用于连接两个多肽(例如两个VH或两个VL结构域)的肽键连接的氨基酸残基的多肽。该接头多肽的实例为本领域所熟知(例如参见Holliger等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak等人(1994) Structure 2:1121-1123)。
术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文中可互换使用。本领域识别的这些术语是指编号比抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变区中的其他氨基酸残基可变性更高(即高变)的氨基酸残基的系统(Kabat等人(1971)Ann.NY Acad. Sci. 190:382-391和Kabat等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公开第91-3242号)。对于重链可变区而言，高变区范围为31至35位氨基酸(CDR1)、50至65位氨基酸(CDR2)和95至102位氨基酸(CDR3)。就轻链可变区而言，高变区范围为24至34位氨基酸(CDR1)、50至56位氨基酸(CDR2)和89至97位氨基酸(CDR3)。
术语“CDR”意指免疫球蛋白可变区序列内的互补决定区。对于重链和轻链可变区中的每一者而言，在重链和轻链可变区中的每一者中存在三个CDR，其称为CDR1、CDR2和CDR3。术语“CDR组”是指存在于能够结合抗原的单一可变区中的三个CDR的组。已根据不同系统以不同方式界定这些CDR的准确边界。由Kabat (Kabat等人(1987)和(1991))所述的系统不仅提供适用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，也提供界定三个CDR的精确残基边界。这些CDR可称为Kabat CDR。Chothia和合作者(Chothia和Lesk (1987) J. Mol.Biol. 196:901-917)；Chothia等人(1989) Nature 342:877-883)发现，Kabat CDR内的某些子部分尽管在氨基酸序列层面上具有较大差异但仍采用几乎相同肽骨架构形。这些子部分称为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指定轻链和重链区。这些区可称为Chothia CDR，其具有与Kabat CDR重叠的边界。其他界定与Kabat CDR重叠的CDR的边界已由Padlan (1995) FASEB J. 9:133-139和MacCallum (1996) J. Mol. Biol. 262(5):732-45描述。其他CDR边界定义并不严格遵循本文系统之一，但仍与Kabat CDR重叠，尽管其可根据特定残基或残基组或甚至整个CDR并不显著影响抗原结合的预测或实验发现而进行缩短或延长。本文所用的方法可利用根据任何这些系统界定的CDR，尽管某些实施方案使用Kabat或Chothia界定的CDR。
术语“表位”意指由结合蛋白结合的抗原区，例如能够特异性结合至免疫球蛋白或T细胞受体的区。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团(例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基)，且在某些实施方案中可具有特定三维结构特征和/或特定电荷特征。在一实施方案中，表位包含已知结合至特异性结合配偶体上的互补位点的抗原区(或其片段)的氨基酸残基。抗原片段可含有一种以上表位。在某些实施方案中，在结合蛋白识别蛋白和/或大分子的复杂混合物中的其靶抗原时，结合蛋白特异性结合抗原。若抗体交叉竞争(例如一种抗体防止另一抗体结合至结合蛋白，或抑制对于另一抗体结合至结合蛋白的调整效应)，则结合蛋白“结合至相同表位”。观察和建模表位识别的方法为本领域技术人员所知(US 20090311253)。
“药代动力学”是指药物由有机体吸收、分布、代谢和分泌的过程。在一些实施方案中，为产生具有期望药代动力学概况的多价结合蛋白分子，选择具有类似期望药代动力学特征的亲本单克隆抗体。可例如使用啮齿类动物以本领域技术人员已知的方法来容易地测定所选亲本单克隆抗体的PK概况(US 20090311253)。
“生物可用性”是指在施用后到达其靶的活性药物量。生物可用性是若干先前所述性质(包含稳定性、溶解性、免疫原性和药代动力学)的函数，且可使用本领域技术人员已知的方法进行评估(US 20090311253)。
术语“表面等离子共振”意指使得可通过使用例如BIAcore®系统(BIAcoreInternational AB, GE Healthcare公司，Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)检测生物传感器基质内的蛋白浓度变化来分析即时生物特异性相互作用的光学现象。关于进一步说明，参见Jönsson等人(1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26。术语“K结合”意指结合蛋白(例如抗体或DVD)结合至抗原以形成结合复合物(例如DVD/抗原复合物)的结合速率常数。术语“K结合”还意指“结合速率常数”或“ka”，如在本文中所互换使用。此值指示结合蛋白至其靶抗原的结合速率或结合蛋白(例如抗体)与抗原之间的复合物形成速率。这还通过以下方程式来展示：
抗体(“Ab”) +抗原(“Ag”) → Ab-Ag。
术语“K解离”意指结合蛋白(例如抗体或DVD)从结合的复合物(例如DVD/抗原复合物)针对解离的解离速率常数或“解离速率常数”，如本领域所知。该值指示结合蛋白(例如抗体)从其靶抗原的解离速率或Ab-Ag复合物随时间分离成游离抗体和抗原，如通过以下方程式所展示：
Ab + Ag ←Ab-Ag。
术语“KD”是指“平衡解离常数”意指于平衡下在滴定测量中获得的值，或通过解离速率常数(K解离)除以结合速率常数(K结合)获得的值。使用结合速率常数、解离速率常数和平衡解离常数代表结合蛋白(例如抗体或DVD)与抗原的结合亲和力。测定结合和解离速率常数的方法已为本领域熟知。使用基于荧光的技术可提供高灵敏度且在平衡下检验生理缓冲液中的样品的能力。可使用其他实验方法和仪器(例如BIAcore®(生物分子相互作用分析)测定(例如可自BIAcore International AB, a GE Healthcare公司，Uppsala, Sweden获得的仪器)。另外，还可使用KinExA®(动态排除分析(Kinetic Exclusion Assay))测定，其可自Sapidyne Instruments (Boise, Idaho)获得。
术语“变体”意指与给定多肽在氨基酸序列方面因氨基酸的添加(例如插入)、缺失或保守取代而有所不同但保留给定多肽的生物活性(例如变体VEGF抗体可与抗-VEGF抗体竞争结合至VEGF)的多肽。氨基酸的保守取代(即使用具有类似性质(例如亲水性和/或带电区的程度或分布)的不同氨基酸代替氨基酸)在本领域中视为通常涉及微小变化。如本领域所理解，这些微小变化可部分地通过考虑氨基酸的亲疏水性指数来进行鉴定(例如参见Kyte等人(1982) J. Mol. Biol. 157: 105-132)。在一个方面中，取代亲疏水性指数为±2的氨基酸。还可使用氨基酸的亲水性来公开产生保留生物功能的蛋白的取代。考虑肽背景中氨基酸的亲水性允许计算该肽的最大局部平均亲水性，此是已报导与抗原性和免疫原性充分相关的有用量度(例如参见美国专利第4,554,101号)。如本领域所理解，具有类似亲水性值的氨基酸的取代可产生保留生物活性(例如免疫原性)的肽。在一个方面中，使用彼此的亲水性值在± 2内的氨基酸来实施取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值受该氨基酸的特定侧链影响。与观察一致，应理解，与生物功能相容的氨基酸取代取决于氨基酸的相对类似性和尤其那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小及其他性质所公开。术语“变体”还包括以不同方式进行处理(例如通过蛋白水解、磷酸化或其他翻译后修饰)但仍保留生物活性和/或抗原反应性(例如结合至VEGF和/或DLL4的能力)的多肽或其片段。除非另有定义，否则术语“变体”涵盖变体片段。变体可与野生型序列具有99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%或75%的同一性。
I. 结合蛋白的产生
提供能够结合两种不同抗原的结合蛋白及其制备方法。可使用多种技术产生结合蛋白。还提供产生结合蛋白的表达载体、宿主细胞和方法。
A. 亲本单克隆抗体的产生
可自亲本抗体(Ab) (包含能够结合目的抗原的多克隆Ab和单克隆Ab (mAb))获得DVD结合蛋白的可变结构域。这些抗体可为天然存在或可通过重组技术产生。本领域普通技术人员熟知许多产生抗体的方法，包括但不限于使用杂交瘤技术、挑选淋巴细胞抗体方法(SLAM)、使用噬菌体、酵母、或RNA蛋白融合显示或其他文库、对至少包含一些人免疫球蛋白基因座的非人动物实施免疫和制备嵌合、CDR移植和人源化抗体。例如参见美国专利公开第20090311253 A1号。还可使用亲和力成熟技术来制备可变结构域。
B. 选择亲本单克隆抗体的准则
提供包括选择具有DVD结合蛋白分子中的至少一种或多种期望性质的亲本抗体的一实施方案。在一实施方案中，期望性质是一种或多种抗体参数，例如抗原特异性、抗原亲和力、效力、生物功能、表位识别、稳定性、溶解性、产生效率、免疫原性、药代动力学、生物可用性、组织交叉反应性或种间类似抗原结合。例如参见美国专利公开第20090311253号。
C. 结合蛋白分子
在多种实施方案中，结合蛋白可经设计以便来自两种不同亲本单克隆抗体的两个不同轻链可变结构域(VL)以串联方式直接连接或经由接头通过重组DNA技术连接，随后是轻链恒定结构域CL。类似地，重链包含两个以串联方式直接连接或经由接头连接的不同重链可变结构域(VH)，随后是恒定结构域CH1和Fc区(图1)。
在多种实施方案中，可使用重组DNA技术自通过本文所述的任一方法产生的亲本抗体来获得可变结构域。在一实施方案中，可变结构域是鼠类重链或轻链可变结构域。在另一实施方案中，可变结构域是CDR移植或人源化可变重链或轻链结构域。在一实施方案中，可变结构域是人重链或轻链可变结构域。
在多种实施方案中，接头序列可为单一氨基酸或多肽序列。在一实施方案中，基于若干Fab分子的晶体结构分析来选择接头序列。在Fab或抗体分子结构中的可变结构域与CH1/CL恒定结构域之间存在天然柔性连接。此天然连接通常包含大约10-12个氨基酸残基，这些氨基酸残基是由来自V结构域的C末端的4-6个残基和来自CL/CH1结构域的N末端的4-6个残基所提供。在一些实施方案中，分别使用CL或CH1的N末端的5-6个氨基酸残基或11-12个氨基酸残基作为轻链和重链中的接头来产生DVD结合蛋白。CL或CH1结构域的N末端残基、尤其前5-6个氨基酸残基可采用并无强二级结构的环构形，且由此可用作两个可变结构域之间的柔性接头。CL或CH1结构域的N末端残基是可变结构域的天然延伸，这是因为它们是Ig序列的一部分，且由此其使用在较大程度上最小化潜在地源于接头和接点的任何免疫原性。
在多种实施方案中，本文所公开的结合蛋白包含至少一种包含SEQ ID NO: 1-38中的一种或多种的接头(表1)。在一实施方案中，X2是Fc区。在另一实施方案中，X2是变体Fc区。
表1：接头序列的列表
Figure 770245DEST_PATH_IMAGE001
其他接头序列可包含任一衍生自CL/CH1结构域的任一长度的序列，但并非CL/CH1结构域的所有残基；例如CL/CH1结构域的前5-12个氨基酸残基。在另一实例中，轻链接头可选自Cκ或Cλ；且重链接头可衍生自任一同种型的CH1，包括Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε和Cµ。接头序列还可衍生自其他蛋白，例如Ig样蛋白(例如TCR、FcR、KIR)；基于G/S的序列(例如G4S重复)；衍生自铰链区的序列；和来自其他蛋白的其他天然序列。其他接头序列可包括任一包含G/S重复的任一长度的序列(例如包含GGGS基序的重复的序列)或任一其他肽接头。
在一实施方案中，使用重组DNA技术将恒定结构域连接至两个连接可变结构域。在一实施方案中，将包含连接的重链可变结构域的序列连接至重链恒定结构域且将包含连接的轻链可变结构域的序列连接至轻链恒定结构域。在一实施方案中，恒定结构域分别是人重链恒定结构域和人轻链恒定结构域。在一实施方案中，将DVD重链进一步连接至Fc区。Fc区可为天然序列Fc区或变体Fc区。在另一实施方案中，Fc区是人Fc区。在另一实施方案中，Fc区包括来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的Fc区。
在一实施方案中，公开抗体或其功能抗原结合片段，其包含具有用于表2中所列出靶抗原中的一者的功能结合位点的抗体，且包含选自表2中所列出对的配对VH和VL区，或包含那些VH和VL区的CDR区。例如，抗体可包含来自表2的形成用于DLL4的功能结合位点的VH和VL区。在一实施方案中，功能抗原结合片段保留足以结合靶抗原的可变结构域区(例如取自表2中的配对VH和VL序列获取的CDR区)。功能抗原结合片段可包括人源化、完全人、骆驼化、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变、回复突变或CDR移植抗体或Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb、VHH (还称为纳米抗体(nanobody))或其他保留抗原结合功能的抗体片段(包括双特异性或多特异性抗体)。
在一实施方案中，公开包含选自表2中的那些可变结构域的可变结构域的结合蛋白。在一实施方案中，如上所述，结合蛋白包含第一链和第二链和两个功能结合位点，且其中结合蛋白的第一链和第二链形成两个用于表2中所列出靶抗原中的一种或多种的功能结合位点。在一实施方案中，每一功能结合位点包含选自表2中所列出对的配对VH和VL序列(例如形成用于DLL4的结合位点的配对VH和VL序列)，或包含那些VH和VL区的CDR区。在一些实施方案中，第一链包含选自表2的第一VH序列和第二VH序列，或含有来自那些VH序列的CDR序列，且第二链包含选自表2的第一VL序列和第二VL序列，或含有的来自那些VL序列CDR序列。在其他实施方案中，第一结合位点或第二结合位点的VH-VL排列跨越(flippedacross)两条链，从而每一链包含来自一个结合位点的VH结构域和来自另一结合位点的VL结构域，同时保留两个功能结合位点。
在一实施方案中，两个重链DVD多肽和两个轻链DVD多肽组合形成DVD结合蛋白。表2列出可用于治疗疾病的示例性抗体的VH和VL区的氨基酸序列。在一实施方案中，提供以任一方向包含表2中所列出VH和/或VL区中的至少两者的DVD，其中VH和/或VL序列中的至少一个是SEQ ID NO: 39或SEQ ID NO: 40。在一些实施方案中，独立选择VD1和VD2。下文所提供的VH和VL结构域序列包含互补决定区(CDR)和框架序列。在一些实施方案中，这些CDR和/或框架序列中的一种或多种由其他来自本领域已知结合至相同抗原的结合蛋白的CDR和/或框架序列代替且并不损失功能。
表2：用于产生结合蛋白(包括多价结合蛋白)的抗-DLL4和抗-VEGF抗体的VH和VL区的氨基酸序列的列表
(CDR序列呈粗体)
Figure 687385DEST_PATH_IMAGE002
Figure 185232DEST_PATH_IMAGE003
在一些实施方案中，提供包含选自SEQ ID NO: 55-63的VH区的DVD结合蛋白。在某些实施方案中，DVD结合蛋白包含选自SEQ ID NO: 64-73的VL区。在一些实施方案中，DVD结合蛋白包含选自SEQ ID NO: 55-63和74的VH区和选自SEQ ID NO: 64-73的VL区。这些VH和VL结构域的氨基酸序列展示于下表3中。
表3：针对DLL4和VEGF的表位的DVD结合蛋白
(接头序列加下划线；CDR序列呈粗体)
Figure 49282DEST_PATH_IMAGE004
Figure 863655DEST_PATH_IMAGE005
Figure 154959DEST_PATH_IMAGE006
Figure 421992DEST_PATH_IMAGE007
表3a：针对DLL4和VEGF的表位的全长结合蛋白
Figure 89734DEST_PATH_IMAGE008
表3a提供针对VEGF和DLL4的结合蛋白的全长重链和轻链序列。接头序列加下划线，而CDR和恒定区序列呈粗体。
能够结合特定靶的特异性DVD结合蛋白及其制备方法的详细描述提供于下文实施例部分中。
D. 结合蛋白的产生
本文所提供的结合蛋白可通过本领域已知多种技术中的任一者产生。例如，可以在宿主细胞中表达结合蛋白，其中通过标准技术将编码DVD重链和DVD轻链的表达载体转染至宿主细胞中。在一些实施方案中，在原核宿主细胞中表达本文所提供的DVD结合蛋白。在其他实施方案中，在真核细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中表达DVD结合蛋白。
在重组表达DVD蛋白的示例性系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码DVD重链和DVD轻链的重组表达载体引入DHFR-CHO细胞中。在重组表达载体内，DVD重链和轻链基因各自可操作地连接至CMV增强子/AdMLP启动子调控元件以驱动高水平的基因转录。重组表达载体还携载DHFR基因，其允许对已使用氨甲蝶呤选择/扩增经载体转染的CHO细胞进行选择。对所选宿主细胞进行培养以允许表达DVD重链和轻链并自培养基回收完整DVD蛋白。使用标准分子生物学技术来制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞并自培养基回收DVD蛋白。在多种实施方案中，本文还提供通过以下方式来合成DVD蛋白的方法：在适宜培养基中培养宿主细胞直至合成DVD蛋白为止。在一些实施方案中，该方法可进一步包括自培养基分离DVD蛋白。
DVD结合蛋白的特征在于可以类似于常规抗体的方式来产生和纯化。在一些实施方案中，产生DVD结合蛋白会得到具有期望双重特异性活性的均质单一主产物，且无需恒定区的序列修饰或化学修饰。其他产生“双特异性”、“多特异性”和“多特异性多价”全长结合蛋白的先前所述方法可导致细胞内或分泌产生组装的无活性的、单特异性、多特异性、多价、全长结合蛋白和具有不同结合位点的组合的多价全长结合蛋白的混合物。
在一些实施方案中，本文所提供的DVD蛋白的设计得到双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链，其在宿主细胞中表达之后主要组装成期望的“双重特异性多价全长结合蛋白”。
在一些实施方案中，至少50%、至少75%或至少90% (或其间的任一百分比)的表达和组装的双重可变结构域免疫球蛋白分子是期望的双重特异性四价蛋白，且因而拥有增强的商业用途。因此，在某些实施方案中，提供在单一细胞中表达双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链的方法，其得到“双重特异性四价全长结合蛋白”的单一主要产物。
在多种实施方案中，提供在单一细胞中表达双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链的方法，其得到“双重特异性四价全长结合蛋白”的“主要产物”，其中“主要产物”占所有组装蛋白(包含双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链)的大于50%，例如大于75%或大于90% (或其间的任一百分比)。
II. 结合蛋白的用途
考虑到其结合至一种、两种或更多种抗原的能力，在某些实施方案中，可使用本文所提供的结合蛋白以使用常规免疫测定(例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)或组织免疫组织化学)来检测样品(例如生物样品，例如血清或血浆)中的抗原。在一些实施方案中，使用可检测物质直接或间接标记结合蛋白以促进结合或未结合抗体的检测。适宜可检测物质包括多种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。适宜酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适宜辅基复合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适宜荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白。发光材料的实例是鲁米诺(luminol)且适宜放射性材料的实例包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm。
在多种实施方案中，本文所提供的结合蛋白能够在体外和/或体内中和其抗原靶的活性。因此，在某些实施方案中，可使用结合蛋白例如在含有抗原的细胞培养物、人个体或其他具有结合蛋白交叉反应的抗原的哺乳动物个体中抑制抗原活性。在另一实施方案中，提供减小患有其中抗原有害的疾病或病症的人或非人动物个体中的抗原活性的方法。在多种实施方案中，可将本文所提供的结合蛋白施用人或非人动物个体以用于诊断或治疗性目的(例如检测或治疗疾病，例如特征在于异常VEGF和/或DLL4表达的疾病)。
如本文中所使用，术语“其中抗原活性有害的病症”意欲包括如下疾病和/或其他病症：其中已展示抗原在患有该病症的个体中的存在是或怀疑是造成该病症病理生理学的原因和/或导致该病症恶化的因素。因此，其中抗原活性有害的病症是预计减小抗原活性以缓解病症的症状和/或进展的病症。这些病症可通过例如抗原在患有病症的个体的生物流体中的浓度有所增加(例如抗原在个体的血清、血浆、滑液等中的浓度有所增加)而证明。可使用本文所提供结合蛋白治疗的病症的非限制性实例包括那些论述于下文和关于包含结合蛋白的药物组合物的部分中的病症。
在多种实施方案中，DVD结合蛋白可用作治疗剂来增加至有害抗原的结合和/或同时阻断两种不同抗原靶(DLL4和/或VEGF)以增强效能/安全性和/或增加患者覆盖率。
另外，在一些实施方案中，本文所提供的DVD结合蛋白可用于组织特异性递送(例如靶向组织标记物和/或用于增强的局部PK的疾病介体，由此提供较高效能和/或较低毒性)，包括细胞内递送(例如将DVD靶向细胞内分子)。在一些实施方案中，DVD结合蛋白还可用作载体蛋白以经由结合至该抗原的非中和表位来将该抗原递送至特定位置且还增加抗原的半衰期。另外，在某些实施方案中，DVD结合蛋白可经设计以物理方式连接至植入患者中的医学装置或靶向这些医学装置(参见Burke等人(2006) Advanced Drug Deliv. Rev.58(3): 437-446；Hildebrand等人(2006) Surface and Coatings Technol.200(22-23):6318-6324；Drug/ device combinations for local drug therapies and infectionprophylaxis, Wu (2006) Biomaterials 27(11):2450-2467；Mediation of thecytokine network in the implantation of orthopedic devices, Marques (2005)Biodegradable Systems in Tissue Engineer. Regen. Med. 377-397)。
A. 结合蛋白在多种疾病中的用途
在多种实施方案中，本文所提供的结合蛋白可用作治疗分子来治疗多种疾病或病症，例如与DLL4和/或VEGF的有害表达或表达程度有关的疾病或病症。在一些实施方案中，可施用一种或多种结合蛋白以诊断、治疗或增强抗肿瘤疗法和/或可有益于治疗原发性和/或转移性癌症。在多种实施方案中，可施用一种或多种结合蛋白以诊断、治疗或增强治疗肿瘤学病况。在其他实施方案中，可施用一种或多种结合蛋白以诊断、治疗或增强该治疗特征在于异常血管发生的任一其他疾病或病症(例如全身性自身免疫和炎性病症、伤口愈合)。在多种实施方案中，施用一种或多种结合蛋白会使得结合至VEGF和/或DLL4，其可中和或另外减小患有特征在于过多VEGF和/或DLL4水平的病况的患者中的VEGF和/或DLL4的水平。
在并不限制公开内容下，提供关于某些疾病病况的其他信息。
1. 肿瘤学病症
单克隆抗体疗法已展现为用于癌症的重要治疗方式(von Mehren等人(2003)Annu. Rev. Med. 54:343-69)。与单特异性疗法相比，使用如本文所公开的双重特异性抗体(其靶向两种单独致癌介体)很可能提供额外益处。
在多种实施方案中，可使用本文所提供的组合物和方法诊断和/或治疗的肿瘤学疾病包括但不限于原发性或转移性癌症、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、腺癌、口咽癌、下咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、小肠癌、泌尿道癌(包括肾癌、膀胱癌和尿道上皮癌)、女性生殖道癌(包括子宫颈癌、子宫癌和卵巢癌以及绒毛膜癌和妊娠滋养细胞疾病)、男性生殖道癌(包括前列腺癌、精囊癌、睾丸癌和生殖细胞肿瘤)、内分泌腺癌(包括甲状腺癌、肾上腺癌和脑垂体腺癌)、皮肤癌、血管瘤、黑素瘤、肉瘤(包括那些源自骨和软组织者以及卡波西肉瘤)、脑、神经、眼睛和脑膜的肿瘤(包括星形细胞瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、神经母细胞瘤、神经鞘瘤和脑膜瘤)、源自造血系统恶性肿瘤的实体瘤(例如白血病和淋巴瘤(何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤))、胃癌、膀胱癌、前列腺癌、直肠癌、造血系统恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、无β脂蛋白血症、手足发绀、急性和慢性寄生或感染过程、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、结肠直肠癌、毛细胞白血病、何杰金氏病、卡波西肉瘤、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多病、恶性黑素瘤、多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴瘤、胰腺癌、副肿瘤综合征/恶性肿瘤的高钙血症、肉瘤、实体瘤或特征在于异常DLL4或VEGF活性的任何其他血管发生非依赖性或依赖性疾病。
在多种实施方案中，在单独使用或与放射疗法和/或其他化学治疗剂组合使用时，使用结合DLL4和/或VEG的DVD结合蛋白或其抗原结合部分来诊断和/或治疗癌症和/或预防转移。
2. 黄斑变性
在多种实施方案中，可使用本文所提供的组合物和方法来治疗黄斑变性，包括新生血管性(湿性)黄斑变性。黄斑变性是导致在视野中心因视网膜损害而损失视力的医学病况。新生血管性(湿性)黄斑变性源自异常血液血管生长，异常血液血管生长最终在黄斑下方引起血液和蛋白泄漏，其可导致光受体发生不可逆损害。
在多种实施方案中，在单独使用或与其他治疗剂组合使用时，使用结合DLL4和/或VEGF的DVD或其抗原结合部分来诊断和/或治疗黄斑变性。
3. 糖尿病和糖尿病性视网膜病变
1型糖尿病是源自胰脏中产生胰岛素的β细胞的自身免疫破坏的糖尿病形式。胰岛素的后续缺乏使得血糖和尿糖有所增加。糖尿病性视网膜病变涉及损害视网膜且呈糖尿病并发症。
糖尿病性视网膜病变是视网膜血管系统的较小变化的结果，这些较小变化源于高血糖症诱导的周细胞死亡和血管壁的弱化。随着疾病进展，严重的非增殖性糖尿病性视网膜病变进入其中血管增殖的晚期。若不予以治疗，则新血管可发生出血，使视力变模糊，且进一步损害视网膜。纤维血管增殖还可导致视网膜脱离。增殖血管还可生长至眼睛的前房且导致新生血管性青光眼。
据信，VEGF和DLL4信号传递在介导糖尿病性内皮功能障碍和血管病变(包括涉及糖尿病性肾病变和视网膜病变的发病机制)中发挥重要作用。J. Exp. Med. 209(5):1011-28 (2012)；Nephrol. Dial. Transplant. 18 (8): 1427-1430 (2003)；PNAS 109(27): E1868-77 (2012)；美国专利申请第20110189176号(Skokos等人)。因此，VEGF和DLL4可代表使用本公开内容的DVD诊断和/或治疗糖尿病和/或糖尿病性视网膜病变的潜在靶(例如鉴定患者中的血清水平和/或改变VEGF和/或DLL4的水平)。在多种实施方案中，在单独使用或与其他治疗剂组合使用时，使用结合DLL4和/或VEGF的DVD或其抗原结合部分来诊断和/或治疗1型糖尿病和/或糖尿病性视网膜病变。
4. 动脉粥样硬化
据信，VEGF和DLL4涉及动脉粥硬化的进展。Circulation 98(20):2108-16(1998)；PNAS 109(27): E1868-77 (2012)。具体而言，VEGF表达已展示于人冠状动脉中的动脉粥样硬化病变中，从而表明VEGF在人冠状动脉粥硬化的进展以及阻塞性冠状动脉疾病的再通过程中的作用。类似地，使用中和性抗-DLL4抗体抑制DLL4信号传递已展示会减弱动脉粥硬化的发生和减小斑块钙化。因此，VEGF和DLL4水平可代表用于使用本公开内容的DVD来诊断和/或治疗动脉粥硬化的潜在靶(例如以鉴定患者中的血清水平和/或改变VEGF和/或DLL4的水平)。在多种实施方案中，在单独使用或与其他治疗剂组合使用时，使用结合DLL4和/或VEGF的DVD或其抗原结合部分来诊断和/或治疗动脉粥硬化。
III. 药物组合物
在多种实施方案中，本文提供药物组合物，其包含一种或多种单独或与预防剂、治疗剂和/或药学上可接受的载体组合的结合蛋白。在多种实施方案中，本文所公开药物组合物的用途的非限制性实例包括诊断、检测和/或监测病症，预防、治疗、管控和/或改善病症或其一种或多种症状，和/或研究。药物组合物的制剂(单独或与预防剂、治疗剂和/或药学上可接受的载体组合) 为本领域技术人员所知(美国专利公开第20090311253 A1号)。
在多种实施方案中，药物制剂包含一种或多种氨基酸，一种或多种多糖和/或聚山梨醇酯，和以约0.1-100 mg/ml，包括终点(例如0.1-10、1-10、.01-50、1-50、1-100、10-100、25-100、25-50或50-100 mg/ml)的浓度存在的结合蛋白，其中制剂的pH在5.0-7.0之间，包括终点(例如约5.0-6.0、5.5-6.0、5.0-6.5、5.5-6.5或6.0-7.0的pH)。在一些实施方案中，结合蛋白包含第一和第二多肽链，其中第一和第二多肽链中的每一个独立地包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，C是恒定结构域，X1是接头，且X2是Fc区，并且n是0或1，其中第一和第二多肽链上的VD1结构域形成第一功能靶结合位点且第一和第二多肽链上的VD2结构域形成第二功能靶结合位点。在一实施方案中，结合蛋白包含含有SEQ ID NO: 56的第一多肽链和含有SEQ ID NO: 64的第二多肽链。在一实施方案中，结合蛋白包含含有SEQ ID NO: 73的第一多肽链和含有SEQ ID NO: 74的第二多肽链。在一实施方案中，制剂中的至少一个氨基酸是组氨酸并且以约10-20 mM、10-15mM、15-20mM或约15mM的浓度存在。在一实施方案中，制剂中的至少一种多糖是蔗糖并且以约0-8.0% 重量/体积(w/v)的浓度存在。在一实施方案中，制剂中的聚山梨醇酯是聚山梨醇酯80并且以约0-0.06% w/v的浓度存在。在一实施方案中，制剂中的至少一个氨基酸是精氨酸并且以约0-1.5% w/v (例如0.5-1.5、1.0-1.5或0.5-1.0 w/v)的浓度存在。在一实施方案中，结合蛋白以约0.1-100 mg/ml, (例如约1-100 mg/ml、或约1-15 mg/ml、或约1-7.5 mg/ml、或约2.5-7.5 mg/ml、或约5-7.5 mg/ml、或约25-100 mg/ml、或约20-60 mg/ml、或约25-50mg/ml、或约25 mg/ml、或约50 mg/ml、或约0.1-60 mg/ml, 、或约0.1-25 mg/ml、或约1.0-60 mg/ml、或约0.5-60 mg/ml、或约0.1-2.0 mg/ml、或约0.5-2.0 mg/ml、或约1-5 mg/ml、或约1-7.5 mg/ml、或约1-15 mg/ml、或约0.5 mg/ml、或约1.0 mg/m)的浓度存在于制剂中。
在多种实施方案中，药物制剂是含水制剂、冻干制剂、或冻干的且再水合的制剂。在一实施方案中，水合的溶液是葡萄糖和/或盐水（例如，浓度约为5% w/v的葡萄糖和/或浓度约为0.9% w/v的盐水）。在一实施方案中，药物制剂包含约15 mM组氨酸、约0.03% (w/v)聚山梨醇酯80、约4% (w/v)蔗糖，和约0.1-25 mg/ml的结合蛋白，或约1-15 mg/ml的结合蛋白，并且其pH约为6，其中所述结合蛋白包含SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 64或SEQ ID NO:73和SEQ ID NO: 74。在一实施方案中，结合蛋白包含h1A11.1-SL-Av。在一实施方案中，h1A11.1-SL-Av结合蛋白包含来自人IgG1 LALA突变体的Fc区。在一实施方案中，所述制剂还包含至少一种额外的试剂。
在多种实施方案中，使用含有约25 mg/ml结合蛋白（例如包含SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 64或SEQ ID NO: 73和SEQ ID NO: 74的结合蛋白）、约15 mM组氨酸、0.03%聚山梨醇酯80 (重量/体积w/v)、4.0%蔗糖(w/v)和约pH6.0的制剂。在一些实施方案中，所述制剂不包含精氨酸。在一些实施方案中，与包含其他组分或浓度的其他制剂相比，该制剂展示出乎意料的改进的冷冻-融化稳定性、液体制剂稳定性和/或冻干制剂稳定性。
在一些实施方案中，上文讨论且含有包含SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 64，或包含SEQ ID NO: 73和SEQ ID NO: 74的结合蛋白的制剂在制剂稳定性上展示出出乎意料的改进。例如，当在5℃储存时，制剂避免不希望的胶凝或高水平聚集物的形成。在一些实施方案中，所述制剂在储存(5℃)和加速(40℃)条件下均是稳定的。
施用本文所提供预防剂或治疗剂的方法包括但不限于口服施用、肠胃外施用(例如皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下施用)、硬膜外施用、瘤内施用、粘膜施用(例如鼻内和口服途径)和经肺施用(例如使用吸入器或喷雾器施用的气溶胶化化合物)。本领域技术人员可获得和已知用于特定施用途径的药物组合物的制剂和多种施用方法所需的材料和技术(美国专利公开第20090311253 A1号)。
在多种实施方案中，可对剂量方案加以调节以提供最佳期望反应(例如治疗或预防反应)。例如，可施用单次浓注剂，可经一段时间施用数个分份剂量或可根据治疗状况紧急程度所指示按比例减小或增加剂量。在一些实施方案中，以剂量单位形式配制肠胃外组合物以便于施用且使剂量均匀。术语“剂量单位形式”是指适于作为单一剂量用于待治疗的哺乳动物个体的物理上分散的单位；每一单位含有经计算可产生与所需药物载体相关的期望治疗效应的预定量活性化合物。
本文所提供结合蛋白的治疗或预防有效量的示例性非限制性范围为约0.1-100mg/kg (例如约0.1-0.5 mg/kg、0.1-1 mg/kg、0.1-10 mg/kg、0.1-20 mg/kg、0.1-50 mg/kg、0.1-75 mg/kg、1-10 mg/kg、1-15 mg/kg、1-7.5 mg/kg、1.25-15 mg/kg、1.25-7.5 mg/kg、2.5-7.5 mg/kg、2.5-15 mg/kg、5-15 mg/kg、5-7.5 mg/kg、1-20 mg/kg、1-50 mg/kg、7-75 mg/kg、1-100 mg/kg、5-10 mg/kg、5-15 mg/kg、5-20 mg/kg、5-25 mg/kg、5-50 mg/kg、5-75 mg/kg、10-20 mg/kg、10-50 mg/kg、10-75 mg/kg或10-100 mg/kg或其间的任一浓度)。在一些实施方案中，结合蛋白以治疗有效浓度存在于药物组合物中，例如浓度为约0.1-100 mg/ml (例如约0.1-0.5 mg/ml、0.1-1 mg/ml、0.1-10 mg/ml、0.1-20 mg/ml、0.1-50 mg/ml、0.1-75 mg/ml、1-10 mg/ml、1-20 mg/ml、1-50 mg/ml、1-75 mg/ml、1-100 mg/ml、5-10 mg/ml、5-15 mg/ml、5-20 mg/ml、5-25 mg/ml、5-50 mg/ml、5-75 mg/ml、10-20mg/ml、10-50 mg/ml、10-75 mg/ml或10-100 mg/ml或其间的任一浓度)。应注意，剂量值可随待缓解病况的类型和/或严重程度而有所变化。应进一步理解：对于任一特定个体而言，可根据个体需要和/或施用组合物或监督组合物施用的个人的专业判断随时间调整具体给药方案，且本文所述的剂量范围仅为举例说明性且并非意欲限制所要求保护的组合物的范围或实践。
IV. 组合疗法
在多种实施方案中，本文所提供的结合蛋白还可单独施用或与一种或多种用于治疗疾病或病症(例如与DLL4和/或VEGF的有害表达或表达水平有关的疾病或病症)的其他治疗剂组合施用。在一些实施方案中，可组合施用一种或多种结合蛋白与一种或多种治疗剂以诊断、治疗或增强抗肿瘤疗法和/或治疗原发性和/或转移性癌症。在多种实施方案中，可组合施用一种或多种结合蛋白与一种或多种治疗剂以诊断、治疗或增强治疗肿瘤学病况。在其他实施方案中，可组合施用一种或多种结合蛋白与一种或多种治疗剂以诊断、治疗或增强治疗特征在于异常血管发生的任何其他疾病或病症(例如全身性自身免疫和炎性病症、伤口愈合)。在多种实施方案中，组合施用一种或多种结合蛋白与一种或多种治疗剂导致中和患有特征在于过多VEGF和/或DLL4水平的病况的患者中的VEGF和/或DLL4或另外减小VEGF和/或DLL4水平，以及由于施用结合蛋白和/或一种或多种治疗剂产生的其他治疗性变化。
在多种实施方案中，由技术人员为其预期目的来选择一种或多种额外药剂。例如，额外药剂可为本领域识别为可用于治疗癌症的治疗剂。组合疗法还可包含一种以上额外药剂，例如两种、三种、四种、五种或更多种额外药剂。
在多种实施方案中，组合疗法药剂包括但不限于抗血管发生剂、抗肿瘤剂、放射疗法、化学疗法(例如DNA烷化剂)、顺铂、卡铂、抗微管蛋白剂、紫杉醇、多西他赛、紫杉醇、多柔比星、吉西他滨、健择、蒽环类、阿霉素(adriamycin)、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸、伊立替康、受体酪氨酸激酶抑制剂(例如厄洛替尼、吉非替尼)和siRNA。
本文所提供的结合蛋白可组合的化学治疗剂的非限制性实例包括下列物质：13-顺式-视黄酸、2-CdA、2-氯去氧腺苷、5-阿扎胞苷、5-氟尿嘧啶、5-FU、6-巯基嘌呤、6-MP、6-TG、6-硫鸟嘌呤、Abraxane、Accutane®、放线菌素-D、Adriamycin®、Adrucil®、Afinitor®、Agrylin®、Ala-Cort®、阿地白介素、阿来组单抗、ALIMTA、阿利维A酸、Alkaban-AQ®、Alkeran®、全反式视黄酸、α干扰素、六甲蜜胺、氨甲蝶呤(Amethopterin)、氨磷汀、氨鲁米特、阿那格雷、Anandron®、阿那曲唑、阿糖胞嘧啶、Ara-C Aranesp®、Aredia®、Arimidex®、Aromasin®、Arranon®、三氧化二砷、Arzerra™、天门冬酰胺酶、ATRA、Avastin®、阿扎胞苷、BCG、BCNU、苯达莫司汀、贝伐珠单抗、贝沙罗汀、BEXXAR®、比卡鲁胺、BiCNU、Blenoxane®、博来霉素、硼替佐米、白消安、Busulfex®、C225、甲酰四氢叶酸钙、Campath®、Camptosar®、喜树碱-11、卡培他滨、Carac™、卡铂、卡莫司汀、卡莫司汀薄片、Casodex®、CC-5013、CCI-779、CCNU、CDDP、CeeNU、Cerubidine®、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、嗜橙菌因子、克拉屈滨、可的松、Cosmegen®、CPT-11、环磷酰胺、Cytadren®、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、Cytosar-U®、Cytoxan®、达卡巴嗪、达克金、更生霉素、阿法达贝泊汀、达沙替尼、道诺霉素、柔红霉素、柔红霉素盐酸盐、柔红霉素脂质体、DaunoXome®、地卡特隆、地西他滨、Delta-Cortef®、Deltasone®、地尼白介素、Diftitox、DepoCyt™、地塞米松、乙酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、地克萨松、右雷佐生、DHAD、DIC、迪奥带斯、多西他赛、Doxil®、多柔比星、多柔比星脂质体、Droxia™、DTIC、DTIC-Dome®、Duralone®、Efudex®、Eligard™、Ellence™、Eloxatin™、Elspar®、Emcyt®、表柔比星、阿法依伯汀、艾比特思、厄洛替尼、欧文氏菌属L-天门冬酰胺酶、雌莫司汀、氨磷汀、Etopophos®、依托泊苷、磷酸依托泊苷、Eulexin®、依维莫司、Evista®、依西美坦、Fareston®、Faslodex®、Femara®、非格司亭、氟尿苷、Fludara®、氟达拉滨、Fluoroplex®、氟尿嘧啶、氟尿嘧啶(乳膏)、氟甲睾酮、氟他胺、亚叶酸、FUDR®、氟维司群、吉非替尼、吉西他滨、吉妥单抗奥佐米星、健择、Gleevec™、Gliadel®薄片、GM-CSF、戈舍瑞林、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(G-MCSF)、Halotestin®、Herceptin®、海塞多、Hexalen®、六甲蜜胺、HMM、Hycamtin®、Hydrea®、Hydrocort Acetate®、氢化可的松、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、磷酸氢化可的松、羟基脲、异贝莫单抗、替坦异贝莫单抗、Idamycin®、Idarubicin Ifex®、干扰素-α、干扰素-α-2b (PEG缀合物)、异环磷酰胺、白介素-11 (IL-11)、白介素-2 (IL-2)、甲磺酸伊马替尼、咪唑羧酰胺、Intron A®、Iressa®、伊立替康、异维A酸、伊沙匹隆、Ixempra™、KADCYCLA®、Kidrolase (t) Lanacort®、拉帕替尼、L-天门冬酰胺酶、LCR、来那度胺、来曲唑、甲酰四氢叶酸、瘤可宁、Leukine™、亮丙瑞林、醛基长春碱、Leustatin™、脂质体Ara-C、Liquid Pred®、洛莫司汀、L-PAM、L-溶肉瘤素、Lupron®、Lupron Depot®、Matulane®、马克戴斯、氮芥(Mechlorethamine)、氮芥盐酸盐、Medralone®、Medrol®、Megace®、甲地孕酮、乙酸甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、美司钠、Mesnex™、氨甲蝶呤（Methotrexate）、氨甲蝶呤钠、甲基泼尼松龙、Meticorten®、丝裂霉素、丝裂霉素-C、米托蒽醌M-Prednisol®、MTC、MTX、Mustargen®、氮芥、Mutamycin®、Myleran®、Mylocel™、Mylotarg®、Navelbine®、奈拉滨、Neosar®、Neulasta™、Neumega®、Neupogen®、Nexavar®、Nilandron®、尼罗替尼、尼鲁米特、Nipent®、氮芥(NitrogenMustard) Novaldex®、Novantrone®、尼普拉特、奥曲肽、乙酸奥曲肽、奥法木单抗、Oncospar®、Oncovin®、Ontak®、Onxal™、奥普瑞白介素、Orapred®、Orasone®、奥沙利铂、紫杉醇、结合蛋白的紫杉醇、帕米膦酸盐、帕尼单抗、Panretin®、Paraplatin®、帕唑帕尼、Pediapred®、PEG干扰素、培加帕酶、培非司亭、PEG-INTRON™、PEG-L-天门冬酰胺酶、培美曲塞、喷司他丁、苯丙氨酸氮芥、Platinol®、Platinol-AQ®、泼尼松龙、泼尼松、Prelone®、丙卡巴肼、PROCRIT®、Proleukin®、含有卡莫司汀植入物的普罗非泮20、Purinethol®、雷洛昔芬、Revlimid®、Rheumatrex®、Rituxan®、利妥昔单抗、Roferon-A®、罗米司亭、Rubex®、柔红霉素盐酸盐、Sandostatin®、Sandostatin LAR®、沙格司亭、Solu-Cortef®、Solu-Medrol®、索拉非尼、SPRYCEL™、STI-571、链佐星、SU11248、舒尼替尼、Sutent®、他莫昔芬Tarceva®、Targretin®、Tasigna®、Taxol®、Taxotere®、Temodar®、替莫唑胺坦罗莫司、替尼泊苷、TESPA、沙利度胺、Thalomid®、TheraCys®、硫鸟嘌呤、Thioguanine Tabloid®、硫代磷酰胺、Thioplex®、噻替派、TICE®、Toposar®、拓扑替康、托瑞米芬、Torisel®、托西莫单抗、曲妥珠单抗、Treanda®、维A酸、Trexall™、Trisenox®、TSPA、TYKERB®、VCR、Vectibix™、Velban®、Velcade®、VePesid®、Vesanoid®、Viadur™、Vidaza®、长春花碱、硫酸长春花碱、Vincasar Pfs®、长春新碱、长春瑞滨、酒石酸长春瑞滨、VLB、VM-26、伏立诺他、福退癌、VP-16、Vumon®、Xeloda®、Zanosar®、Zevalin™、Zinecard®、Zoladex®、唑来膦酸、Zolinza或Zometa®。
在一实施方案中，本文所提供的结合蛋白与以下中的一种或多种组合使用：替莫唑胺®、伊立替康、甲酰四氢叶酸、5-FU、吉西他滨和紫杉醇。在一实施方案中，结合蛋白h1A11.1-SL-Av与以下中的一种或多种组合使用：替莫唑胺®、伊立替康、甲酰四氢叶酸、5-FU、吉西他滨和紫杉醇。
在多种实施方案中，本文所提供的结合蛋白还可与诸如以下药剂组合：氨甲蝶呤、6-MP、硫唑嘌呤柳氮磺吡啶(azathioprine sulphasalazine)、美沙拉秦(mesalazine)、奥沙拉秦氯喹(olsalazine chloroquinine)/羟氯喹(hydroxychloroquine)、青霉胺(pencillamine)、金硫代苹果酸盐(aurothiomalate)(肌内和口服)、硫唑嘌呤、秋水仙碱(cochicine)、皮质类固醇(口服、吸入和局部注射)、β-2肾上腺素受体激动剂(沙丁胺醇(salbutamol)、特布他林(terbutaline)、沙美特罗(salmeteral))、黄嘌呤(茶碱(theophylline)、胺茶碱(aminophylline))、色甘酸盐(cromoglycate)、奈多罗米(nedocromil)、酮替芬(ketotifen)、异丙托铵(ipratropium)、氧托品(oxitropium)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸吗乙酯(mycophenolate mofetil)、来氟米特(leflunomide)、NSAID (例如布洛芬(ibuprofen))、皮质类固醇(例如泼尼松龙)、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗血栓形成剂、补体抑制剂、肾上腺素能药剂、由诸如TNF-α或IL-1等促发炎细胞因子干扰信号传递的药剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转化酶抑制剂、TNF-α转化酶(TACE)抑制剂、T细胞信号传递抑制剂(例如激酶抑制剂)、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转化酶抑制剂、可溶性细胞因子受体或其衍生物(例如可溶性p55或p75 TNF受体或衍生物p75TNFRIgG (EnbrelTM)或p55TNFRIgG (来那西普(Lenercept))、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)、抗炎性细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)、塞来考昔(celecoxib)、叶酸、硫酸羟氯喹(hydroxychloroquine sulfate)、罗非考昔(rofecoxib)、依那西普(etanercept)、英夫利昔单抗(infliximab)、萘普生(naproxen)、伐地考昔(valdecoxib)、柳氮磺吡啶、甲基泼尼松龙、美洛昔康(meloxicam)、乙酸甲基泼尼松龙、硫代苹果酸金钠、阿司匹林(aspirin)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、萘磺酸丙氧吩(propoxyphenenapsylate)/apap、叶酸盐、萘丁美酮(nabumetone)、双氯芬酸(diclofenac)、吡罗昔康(piroxicam)、依托度酸(etodolac)、双氯芬酸钠、奥沙普秦(oxaprozin)、盐酸羟可待酮(oxycodone hcl)、重酒石酸二氢可待因酮(hydrocodone bitartrate)/apap、双氯芬酸钠/米索前列醇(misoprostol)、芬太尼(fentanyl)、阿那白滞素(anakinra)、人重组物、盐酸曲马多(tramadol hcl)、双水杨酯(salsalate)、舒林酸(sulindac)、维生素b12(cyanocobalamin)/fa/吡哆素(pyridoxine)、对乙酰胺基酚(acetaminophen)、阿仑膦酸钠(alendronate sodium)、泼尼松龙、硫酸吗啡(morphine sulfate)、利多卡因盐酸盐(lidocaine hydrochloride)、吲哚美辛(indomethacin)、硫酸盐葡糖胺(glucosaminesulf)/软骨素(chondroitin)、盐酸阿米替林(amitriptyline hcl)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、盐酸羟可待酮/对乙酰胺基酚、盐酸奥洛他定(olopatadine hcl)、米索前列醇(misoprostol)、萘普生钠、奥美拉唑(omeprazole)、环磷酰胺、利妥昔单抗、IL-1TRAP、MRA、CTLA4-IG、IL-18 BP、抗-IL-18、抗-IL15、BIRB-796、SCIO-469、VX-702、AMG-548、VX-740、罗氟司特(Roflumilast)、IC-485、CDC-801或美索普拉(Mesopram)。在一些实施方案中，组合可包含氨甲蝶呤或来氟米特和环孢菌素。
在一些实施方案中，本文所提供的药物组合物可包含“治疗有效量”或“预防有效量”的本文所提供的结合蛋白。“治疗有效量”是指可在所需时间段内以所需剂量有效实现期望治疗结果的量。结合蛋白的治疗有效量可由本领域技术人员确定且可随诸如以下因素变化：个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及结合蛋白于该个体中引发期望反应的能力。治疗有效量还为其中抗体或抗体结合部分的治疗有益效应大于其任何毒性或有害效应的量。“预防有效量”是指在所需时间段内以所需剂量有效实现期望预防结果的量。通常，因预防剂量是在患病之前或患病早期用于个体中，故预防有效量将小于治疗有效量。
V. 诊断
本文的公开内容还提供诊断应用，包括但不限于使用一种或多种结合蛋白的诊断测定方法、含有一种或多种结合蛋白的诊断试剂盒和用于自动化和/或半自动化系统中的方法和试剂盒。在一些实施方案中，方法和试剂盒可用于检测、监测和/或治疗个体的疾病或病症。
A. 测定方法
在多种实施方案中，提供方法以用于使用至少一种结合蛋白测定至少一种分析物或其片段在测试样品中的存在、量和/或浓度。示例性测定包括但不限于免疫测定和/或采用质谱的方法。
例如，本公开内容所提供的免疫测定尤其可包括夹心式免疫测定、放射性免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、竞争性抑制免疫测定、荧光偏振免疫测定(FPIA)、酶多联免疫测定技术(EMIT)、生物发光共振能量转移(BRET)和均质化学发光测定。
在一些实施方案中，提供测定一种或多种抗原或其片段在测试样品中的存在、量或浓度的方法，其中一种或多种抗原或其片段是DLL4和/或VEGF。该方法包括通过免疫测定来测定测试样品的抗原或其片段。免疫测定(i)采用至少一种结合蛋白和至少一种可检测标记，且(ii)包括比较在测试样品中通过可检测标记产生的信号(作为抗原或其片段的存在、量或浓度的直接或间接指示)与在对照或校准品中产生的信号(作为抗原或其片段的存在、量或浓度的直接或间接指示)。校准品任选地是校准品系列的一部分，其中每一校准品与系列中的其他校准品在抗原或其片段的浓度方面不同。该方法可包括(i)使测试样品与至少一种捕获剂(其结合至抗原或其片段上的表位)接触以形成包含捕获剂和抗原或其片段的复合物，(ii)使包含捕获剂和抗原或其片段的复合物与至少一种检测剂(其包含可检测标记且结合至抗原或其片段上未由捕获剂结合的表位)接触以形成检测复合物，和(iii)基于通过在(ii)中形成的检测复合物中的可检测标记产生的信号，测定抗原或其片段在测试样品中的存在、量或浓度，其中至少一种捕获剂和/或至少一种检测剂是至少一种结合蛋白。
或者，在一些实施方案中，测定一种或多种抗原或其片段在测试样品中的存在、量或浓度的方法可包括：(i)使测试样品与至少一种捕获剂(其结合至抗原或其片段上的表位)接触以形成包含捕获剂和抗原或其片段的复合物，且同时或依序以任一顺序使测试样品与可检测标记的抗原或其片段(其可与测试样品中的任一抗原或其片段竞争结合至至少一种捕获剂)接触，其中存在于测试样品中的任一抗原或其片段和可检测标记的抗原彼此竞争形成检测复合物，和(ii)基于通过在(i)中形成的检测复合物中的可检测标记产生的信号，测定抗原或其片段在测试样品中的存在、量或浓度，其中至少一种捕获剂是至少一种结合蛋白且其中通过捕获检测复合物中的可检测标记产生的信号与抗原或其片段在测试样品中的量或浓度成反比。
在多种实施方案中，测试样品可来自患者，在该情形下，该方法可进一步包括诊断、预测或评估患者的治疗性/预防性治疗的效能。若该方法进一步包括评估患者的治疗性/预防性治疗的效能，则该方法任选地进一步包括视需要修改患者的治疗性/预防性治疗以改进效能。该方法可适用于自动化系统或半自动化系统。因此，本文所述的方法还可用于确定个体是否患有给定疾病、病症或病况或处于发生给定疾病、病症或病况的风险中。具体而言，此方法可包括以下步骤：
(a)测定一种或多种分析物或其片段在来自个体的测试样品中的浓度或量(例如使用本文所述的方法或本领域已知的方法)；和(b)比较如在步骤(a)中测定的分析物或其片段的浓度或量与预定水平，其中若步骤(a)中所测定分析物的浓度或量就预定水平而言有利，则可确定个体并不患有给定疾病、病症或病况或处于给定疾病、病症或病况的风险中。然而，若步骤(a)中所测定分析物的浓度或量就预定水平而言不利，则可确定个体患有给定疾病、病症或病况或处于给定疾病、病症或病况的风险中。
另外，本文提供监测个体中的疾病的进展的方法。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(a) 测定一种或多种分析物在来自个体的测试样品中的浓度或量；
(b) 测定分析物在来自同一个体的后一测试样品中的浓度或量；和
(c) 比较步骤(b)中所测定分析物的浓度或量与步骤(a)中所测定分析物的浓度或量，其中若在步骤(b)中测定的浓度或量与在步骤(a)中测定的浓度或量相比时不变或是不利的，则可确定个体的疾病已继续发生、进展或恶化。通过比较，若如步骤(b)中测定的浓度或量与如步骤(a)中测定的浓度或量相比时有利，则可确定个体的疾病已停止、消退或改善。
任选地，监测疾病的进展的方法进一步包括比较如在步骤(b)中测定的分析物的浓度或量与例如预定水平。另外，任选地，若比较显示如在步骤(b)中测定的分析物的浓度或量例如就预定水平而言不利地改变，则所述方法包括使用一种或多种药物组合物治疗个体一定时间段。
在一些实施方案中，使用诸如化学发光标记(吖啶鎓化合物)的可检测标记检测分析物或其片段在样品中的存在、量或浓度。在一些实施方案中，可使用本领域技术人员已知的常规技术来检测所产生的化学发光信号。基于所产生信号的强度，可定量分析物在样品中的量或浓度。具体而言，在一些实施方案中，分析物在样品中的量可与所产生信号的强度成比例。在某些实施方案中，可通过比较所产生光的量与分析物的标准曲线或通过与参考标准品或校准品进行比较来定量所存在分析物的量。可使用已知浓度分析物的连续稀释液或溶液通过质谱、重量分析方法及其他本领域已知技术来产生标准曲线。
通常可使用任一本领域已知形式(例如但不限于夹心形式)来实施分析物免疫测定。例如，在免疫测定中，可使用一种或多种结合蛋白捕获测试样品中的分析物(或其片段)(这些结合蛋白通常称为“捕获”结合蛋白)，且可使用一种或多种结合蛋白与可检测(即可定量的)标记结合成夹心(这些结合蛋白通常称为“检测”结合蛋白、“缀合物(conjugate)”或“缀合物(conjugates)”)。因此，在示例性夹心免疫测定形式的背景中，如本文所述的DVD(或其片段、变体或变体片段)可用作捕获结合蛋白、检测结合蛋白或用作二者。例如，具有可结合第一分析物上表位的第一结构域(或其片段)和可结合第二分析物上表位的第二结构域(或其片段)的DVD可用作捕获和/或检测结合蛋白来检测和任选地定量一种或多种分析物(例如DLL4和/或VEGF)。在进一步的实例中，采用在夹心测定内具有差别亲和力的DVD可提供亲合力优点。在如本文所述免疫测定的背景中，通常可有益地或期望在DVD结构内并入一种或多种接头。在存在时，最佳地，接头应具有足够长度和结构柔性以使得能够由内部结构域结合一个表位以及由外部结构域结合另一表位。就此而言，若DVD可结合两种不同分析物且一种分析物大于另一分析物，则期望地，由外部结构域结合较大分析物。
在多种实施方案中，可使测试的样品(例如怀疑含有分析物或其片段的样品)与至少一种捕获结合蛋白和至少一种检测结合蛋白同时或依序且以任一顺序接触。例如，可首先使测试样品与至少一种捕获结合蛋白接触且然后(依序)与至少一种检测结合蛋白接触。或者，可首先使测试样品与至少一种检测结合蛋白接触且然后(依序)与至少一种捕获结合蛋白接触。在又一替代方式中，可使测试样品同时与捕获结合蛋白和检测结合蛋白接触。在多种实施方案中，可使用包含一种或多种本文所公开DVD的竞争性抑制免疫测定来检测一种或多种分析物或其片段(例如DLL4和/或VEGF)的存在、量或浓度。
在多种实施方案中，可使可检测标记直接或经由偶联剂结合至结合蛋白。可使用的一偶联剂实例是EDAC (1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐)，其可商购自Sigma-Aldrich, St. Louis, MO。可使用的其他偶联剂为本领域所知。使可检测标记结合至结合蛋白的方法为本领域所知。
在多种实施方案中，可使用本领域已知的技术来定量在检测测定中结合至包含分析物和DVD的复合物的标记的存在或量。例如，若使用酶标记，则可使经标记复合物与标记底物反应，所述底物产生可定量反应(例如显色)。若标记是放射性标记，则可使用适当方式(例如闪烁计数器)来定量标记。若标记是荧光标记，则可通过刺激标记且检测荧光信号来定量标记。若标记是化学发光标记，则可通过以目测方式或通过使用发光计、x射线胶片、高速照相软片、CCD照相机等检测所发射光来定量标记。在一些实施方案中，一旦已经定量了复合物中的标记的量后，可通过适当方式(例如通过使用利用已知浓度分析物或其片段的连续稀释液产生的标准曲线或通过任一其他校准品)测定测试样品中的分析物或其片段的浓度。
在一实施方案中，使用化学发光微粒免疫测定，特定而言是采用ARCHITECT®自动化分析仪(Abbott Laboratories，Abbott Park, IL)。
在一些实施方案中，本公开内容提供采用质谱的方法且包括但不限于MALDI (基质辅助的激光解吸/电离)和SELDI (表面增强的激光解吸/电离)。
使用免疫测定和质谱收集、处置、处理和分析生物测试样品的方法为本领域技术人员熟知且提供用于实践本公开内容(US 2009-0311253 A1)。
B. 试剂盒
在多种实施方案中，还提供用于测定测试样品的至少一种分析物或其片段在测试样品中的存在、量和/或浓度的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒包含至少一种用于测定测试样品的分析物或其片段的组分和关于测定测试样品的分析物或其片段的说明书。至少一种用于测定测试样品的分析物或其片段的组分可包括含有如本文所公开结合蛋白和/或其片段、变体或变体片段的组合物。在一些实施方案中，任选地将组分固定于固相上。
任选地，在一些实施方案中，该试剂盒可包含校准品或对照，其可包含经分离或纯化的分析物。在某些实施方案中，该试剂盒可包含至少一种用于通过免疫测定和/或质谱测定测试样品的分析物的组分。可任选地使用任一本领域已知可检测标记来标记试剂盒组分(包括分析物、结合蛋白和/或抗分析物结合蛋白或其片段)(US 2009-0311253 A1)。
C. 自动化
在多种实施方案中，测定至少一种分析物在测试样品中的存在、量和/或浓度的试剂盒(或其组分)和方法可适用于多种自动化和半自动化系统(如例如美国专利第5,089,424号和第5,006,309号中所述和例如由Abbott Laboratories (Abbott Park, IL)作为ARCHITECT®市售)。
可与结合蛋白一起使用的其他自动化或半自动化平台包括但不限于AxSYM®、IMx® (例如参见美国专利第5,294,404号)、PRISM®、EIA (珠粒)和Quantum™ II (皆来自Abbott Laboratories)以及其他本领域已知平台。另外，测定、试剂盒和试剂盒组分可以其他形式用于例如电化学和/或其他手持式或现场快速测定系统上。例如，本公开内容适用于实施夹心免疫测定的商业化Abbott Point of Care (i-STAT®, Abbott Laboratories)电化学免疫测定系统。免疫传感器及其在单用测试装置中的制造和操作方法描述于例如美国专利第5,063,081号、第7,419,821号和第7,682,833号和美国公开第20040018577号、第20060160164号和第US 20090311253号中。
本领域技术人员将易于明了，本文所述方法的其他适宜修改和改变显而易见且可使用适宜等效形式作出，而并不背离本文所公开实施方案的范围。现在已详细描述某些实施方案后，通过参照下列实施例将更明确地理解所述实施方案，包括这些实施例仅出于阐释目并不旨在限制的目的。
实施例
实施例1：抗-DLL4/抗-VEGF DVD分子的构建
使用来自人源化抗-DLL4 mAb (h1A11.1)和抗-VEGF mAb (Av)的可变结构域序列来设计抗-DLL4/抗-VEGF DVD分子的VH和VL结构域。使用两步骤PCR来合成可变区。使用克隆载体的同源性侧翼区和每一DVD可变对之间的接头区来设计引物。实施细菌转化以鉴定阳性克隆且收获构建体并纯化以用于使用本领域已知的标准方案来哺乳动物转化。
将重链和轻链的可变结构域分别框架内(in-frame)克隆入突变体人IgG1 (L234,235A)重链和κ轻链恒定区以产生抗-DLL4/抗-VEGF DVD分子(表4)。
表4. 抗-DLL4/抗-VEGF DVD构建体
Figure 758612DEST_PATH_IMAGE009
实施例2：抗-DLL4/抗-VEGF DVD构建体的亲和力测定
使用BIACORE测定(Biacore, Inc, Piscataway, NJ)评估DVDs结合至经纯化的重组DLL4细胞外结构域(ECD)或VEGF165，如在25℃于Biacore 2000、Biacore 3000或BiacoreT100 (GE Healthcare, Piscataway, NJ)上进行的基于表面等离子共振的测量所测定。对于DLL4结合动力测量而言，测定缓冲液是HBS-EPB：10mM Hepes (pH 7.5)、150 mM NaCl、3mM EDTA、0.005% Tween 20、0.1 mg/ml BSA (Sigma A7906)。对于VEGF结合动力测量而言，测定缓冲液是HBS-EP+(3N01B)：10 mM Hepes (pH 7.5)、300 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05%Tween 20、0.1 mg/ml BSA (Sigma A7906)。例如，使用标准胺偶联试剂盒根据制造商说明书和程序以25 μg/ml将稀释于10 mM乙酸钠(pH 4.5)中的大约9000 RU山羊抗-人Fc特异性多克隆抗体(Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL)直接固定于CM5研究级生物传感器芯片上。使用乙醇胺阻断生物传感器表面上的未反应部分。对于动力分析而言，使用Scrubber 2 (BioLogic软件)、Biacore Biaevaluation 4.0.1软件或Biacore T100评估软件将衍生自1:1 Langmuir结合模型的速率方程式同时拟合至多个抗原注射(使用整体拟合分析)。经纯化的抗体稀释于运行缓冲液中以捕获于山羊抗-人Fc反应表面上。待捕获作为配体的抗体(1 ug/ml)以10 ul/min的流速注射于反应基质上。在测定期间，所有测量仅参照捕捉表面(即并无捕获抗体)。在80 ul/min的连续流速下测定结合和解离速率常数K结合(M-1s-1)和K解离(s-1)。速率常数是以1.23 – 900 nM范围的不同抗原浓度以3倍稀释系列通过实施动力学结合测量来衍生，且包括仅缓冲液的注射(待用于双重参照)。然后由动力学速率常数通过下式：KD=K解离/K结合计算抗体与靶抗原之间反应的平衡解离常数KD (M)。结合是以时间函数记录，并计算动力学速率常数。在此测定中，可测量结合速率快如106 M-1s-1且解离速率慢如10-6 s-1。抗-DLL4/抗-VEGF DVDs的抗原结合亲和力概述于表5和6中。
表5. 抗-DLL4/抗-VEGF DVD结合蛋白的Biacore动力学
Figure 470085DEST_PATH_IMAGE010
N/A：不适用。
表6. h1A11.1-SL-Av DVD的额外Biacore动力学
Figure 224415DEST_PATH_IMAGE011
实施例3：抗-DLL4/抗-VEGF DVD分子的体外表征
实施例3.1：如通过流式细胞术(FACS)所测定的DLL4结合活性
自组织培养烧瓶收获过表达全长DLL4的稳定HEK293G细胞系，洗涤4次且再悬浮于含有1%牛血清白蛋白和1 mM CaCl2的磷酸盐缓冲盐水(PBS) (FACS缓冲液)中。将1.5 ×105个细胞与多种浓度的DVD结合蛋白在冰上于FACS缓冲液中一起孵育60分钟。将细胞洗涤两次且添加50 uL R-藻红蛋白缀合的抗-大鼠IgG F(ab’)2片段(FACS缓冲液中的1:200稀释) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA,目录编号：112-116-072)。在冰上孵育(4℃，60分钟)后，将细胞洗涤三次并再悬浮于FACS缓冲液中。使用Becton DickinsonFACSCalibur-HTS (Becton Dickinson, San Jose, CA)来测量荧光。使用Graphpad Prism软件来分析数据且将EC50值报告为实现至表达DLL4的细胞的最大抗体结合的50%的抗体浓度。
实施例3.2：如通过Notch-1与可溶性DLL4细胞外结构域的相互作用的抑制所测定的抗-DLL4/抗-VEGF DVD蛋白的DLL4封闭活性
使用16 nM人Notch-1 (R&D Systems 3647-TK号，100 µl/孔于D-PBS中)包被96孔Nunc-Immuno板(439454号，用于huDLL4 ELISA)和96孔Costar板(9018号，用于muDLL4ELISA)且在4℃下孵育过夜。然后使用洗涤缓冲液(PBS, 0.05% Tween-20)将板洗涤3次且使用200 µl/孔封闭缓冲液(D-PBS, 1% BSA, 1 mM CaCl2, 0.05% Tween-20)在25℃下封闭1小时。在封闭的同时，将生物素标记的DLL4细胞外结构域(14 nM)与抗体(30 pM-66 nM，于封闭缓冲液中的3倍连续稀释液)在25℃和振荡下混合1小时。在封闭之后洗涤测定板，且将其与DLL4/抗体混合物一起孵育(100 µl/孔，1小时，在25℃和振荡下)。再次洗涤板且经1小时在25℃和振荡下添加100 µl/孔的HRP缀合的链霉抗生物素蛋白(Fitzgerald 65R-S104PHRPx号，以1:5,000稀释于封闭缓冲液中)。在最终洗涤之后，使用100 µl/孔底物(TMBSigma T8665号)使板显色，且使用100 µl/孔的1 N HCl来停止反应，且在450 nm下读取吸光度。使用Graphpad Prism软件来分析数据且将IC50值报告为实现DLL4至Notch1的结合减小50%所需的抗体浓度。
实施例3.3：如使用Notch报道分子测定通过DLL4依赖性Notch活化的抑制所测定的抗-DLL4/抗-VEGF DVD蛋白的DLL4封闭活性
使用表达通过Notch反应性启动子驱动的荧光素酶的经改造EA.hy926细胞(7,000个细胞/孔)将96孔黑色透明底部组织培养板接种过夜。将自200 nM连续稀释的抗体与等体积含有表达全长DLL4的HEK293G细胞(5,000个细胞/孔)的溶液混合15分钟。将293G/DLL4细胞与EA.hy926 Notch报道分子细胞在测试抗体存在下一起共培养24 hr。使用Promega底物(Promega E2940号)来分析荧光素酶活性。使用Graphpad Prism软件来分析数据且将IC50值报告为实现DLL4诱导的Notch活化减小50%所需的抗体浓度。
实施例3.4：如通过捕获ELISA所测定的抗-DLL4/抗-VEGF DVD蛋白的VEGF结合活性
将ELISA板(Nunc, MaxiSorp, Rochester, NY)与抗-人Fc抗体(5 µg/ml于PBS中，Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)一起在4℃下孵育过夜。将板在洗涤缓冲液(含有0.05% Tween 20的PBS)中洗涤三次，且在25℃下于封闭缓冲液(含有1% BSA的PBS)中封闭1小时。在25℃下孵育1小时之前将孔洗涤三次，且将每一抗体或DVD连续稀释于含有0.1% BSA的PBS中。将孔洗涤三次，且将生物素化VEGF (2 nM)添加至板中并在25℃下孵育1小时。将孔洗涤三次，然后在25℃下与链霉抗生物素蛋白-HRP (KPL 474-3000号，Gaithersburg, MD)一起孵育1小时。将孔洗涤三次，且每孔添加100 µl ULTRA-TMB ELISA(Pierce, Rockford, IL)。在显色后，使用1M HCl停止反应且测量450 nM下的吸光度。
实施例3.5：如通过VEGF与VEGFR1的相互作用的抑制所测定的抗-DLL4/抗-VEGFDVD蛋白的VEGF封闭活性
将ELISA板(Nunc, MaxiSorp, Rochester, NY)与100 µl含有重组VEGFR1细胞外结构域-Fc融合蛋白的PBS (5 µg/ml, R&D systems, Minneapolis, MN)一起在4℃下孵育过夜。将板在洗涤缓冲液(含有0.05% Tween 20的PBS)中洗涤三次，且在25℃下于封闭缓冲液(含有1% BSA的PBS)中封闭1小时。将每一抗体和DVD连续稀释于含有0.1% BSA的PBS中且与50 µl 2 nM生物素化VEGF在25℃下一起孵育1小时。然后将抗体和生物素化VEGF或DVD和生物素化VEGF (100 µl)的混合物添加至VEGFR1-Fc包被的孔中且在25℃下孵育10分钟。将孔洗涤三次，然后与100 µl链霉抗生物素蛋白-HRP (KPL 474-3000号，Gaithersburg, MD)在25℃下一起孵育1小时。将孔洗涤三次，且每孔添加100 µl ULTRA-TMB ELISA (Pierce,Rockford, IL)。在显色后，使用1M HCl停止反应且测量450 nM下的吸光度。
实施例3.6：如通过VEGF刺激的内皮细胞增殖/存活的抑制所测定的抗-DLL4/抗-VEGF DVD蛋白的VEGF封闭活性
在平铺以用于测定之前，将TIME (ATCC)或HUVEC (2-6代)内皮细胞维持于补充有EGM-2 SingleQuots (Lonza-Clonetics, Walkersville, MD, CC-4176号)的EBM-2(Lonza-Clonetics, Walkersville, MD)中。在不存在生长因子下，以10,000个细胞/孔将细胞平铺于胶原包被的黑色96孔板上的100 µl含有0.1% FBS的EMB-2中。次日，在不存在生长因子下，用0.1% FBS替换培养基。次日，用100 µl EMB-2 (不含生长因子或血清)替换培养基且孵育4小时，然后添加VEGF和抗体或DVD。将抗-VEGF单克隆抗体或DVD连续稀释于含有0.1% BSA的EMB-2中且与重组人VEGF165 (50 ng/ml) 在25℃下以50 µl一起预孵育1小时。然后将抗体和VEGF或DVD和VEGF的混合物添加至细胞(50 µl)中，且将板在37℃下于增湿、5% CO2气氛中孵育72小时。通过使用ATPlite试剂盒(Perkin Elmer, Waltham, MA)根据制造商说明书评估ATP水平来间接测量细胞存活/增殖。
如通过上述测定所表征的抗-DLL4/抗-VEGF DVD的体外活性概述于表7中。
表7. 抗-DLL4/抗-VEGF DVD的体外表征
Figure 430268DEST_PATH_IMAGE012
实施例4：抗-DLL4/抗-VEGF DVD的体内药代动力学结果
在食蟹猴(对于每一剂量组，n=2)和CD1小鼠(对于每一剂量组，n=6)中于浓注静脉内施用后评估h1A11.1-SL-Av DVD的药代动力学性质。CD1小鼠和食蟹猴中的h1A11.1-SL-Av DVD药代动力学概况是传统单克隆抗体的特性(表8)。
表8：在浓注静脉内施用之后的h1A11.1-SL-Av DVD的平均PK参数
Figure 953653DEST_PATH_IMAGE013
剂量：mg/kg；AUC：自0至无穷大时间的浓度曲线下面积(d*ug/mL)；Cmax：在给药后的第一观察浓度(ug/mL)；Vss：分布体积(mL/kg)；CL：清除率(mL/天/kg)；T1/2：终末半衰期(天)；MRT：自0至无穷大的平均滞留时间(天)。
实施例5：抗-DLL4/抗-VEGF DVD的体内抗肿瘤的效能
首先针对雌性无胸腺裸小鼠中的HT-29人结肠直肠腺癌异种移植物肿瘤评估抗-DLL4/抗-VEGF DVD对于肿瘤生长的效应。简言之，将2 × 106个细胞经皮下接种至右后侧中。使肿瘤建立25天，此时使用电子卡尺测量且使用公式：L × W2/2来测定肿瘤体积。将小鼠分配至治疗组中(n=10只/组)，从而每一小组在开始疗法之前具有214 mm3的相等平均肿瘤体积。经4周每周经腹膜内向动物给药，且在实验的持续时间内每周两次测量肿瘤体积。结果展示于表9中。
随后针对雌性SCID小鼠中的U87-MG人成胶质细胞瘤异种移植物肿瘤评估抗-DLL4/抗-VEGF DVD对于肿瘤生长的效应。简言之，将3 × 106个细胞经皮下接种至右后侧中。使肿瘤建立17天，此时使用电子卡尺测量且使用公式：L × W2/2来测定肿瘤体积。将小鼠分配至治疗组中(n=10只/组)，从而每一小组在开始疗法之前具有221 mm3的相等平均肿瘤体积。经4周每周经腹膜内向动物给药，且在实验的持续时间内每周两次测量肿瘤体积。结果展示于表9中。
表9. 抗-DLL4/抗-VEGF DVD在HT-29结肠直肠腺癌和U87-MG成胶质细胞瘤异种移植物模型中的效能
Figure 852339DEST_PATH_IMAGE014
表9注释(key)：a.%TGI =肿瘤生长抑制百分比= 100 – (T/C × 100)，其中T =治疗组的平均肿瘤体积且C =治疗对照组的平均肿瘤体积。基于大小匹配测量之后第29天。P值(如由星号所指示)是衍生自治疗组对治疗对照组的司徒登氏T检验(Student’s T test)比较。b.%TGD =肿瘤生长延迟百分比= (T – C)/C × 100，其中T =治疗组的中值时间至端点且C=治疗对照组的中值时间至端点。基于1000 mm3的端点。P值(如由星号所指示)是衍生自治疗组对治疗对照组的卡-梅氏对数秩(Kaplan Meier log-rank)比较。c. %TGI =肿瘤生长抑制百分比= 100 – (T/C × 100)，其中T =治疗组的平均肿瘤体积且C =治疗对照组的平均肿瘤体积。基于大小匹配测量之后第24天。P值(如由星号所指示)是衍生自治疗组对治疗对照组的司徒登氏T检验比较(* p < 0.01，** p < 0.001，*** p < 0.0001)。
实施例6：抗-DLL4/抗-VEGF DVD的体内组合效能
针对雌性SCID小鼠中的U87-MG人成胶质细胞瘤异种移植物肿瘤评估抗-DLL4/抗-VEGF DVD与化学疗法的组合对于肿瘤生长的效应。简言之，将3 × 106个细胞经皮下接种至右后侧中。使肿瘤建立22天，此时使用电子卡尺测量且使用公式：L × W2/2来测定肿瘤体积。将小鼠分配至治疗组中(n=10只/组)，从而每一小组在开始疗法之前具有207 mm3的相等平均肿瘤体积。经腹膜内向动物给药单一剂量的替莫唑胺®和/或4个周剂量的抗-DLL4/抗-VEGF DVD，且在实验的持续时间内每周两次测量肿瘤体积。结果展示于表10中。
表10. 抗-DLL4/抗-VEGF DVD和替莫唑胺在U87-MG成胶质细胞瘤异种移植物模型中的组合效能
Figure 93965DEST_PATH_IMAGE015
表10注释：a. %TGI =肿瘤生长抑制百分比= 100 – (T/C × 100)，其中T =治疗组的平均肿瘤体积且C =治疗对照组的平均肿瘤体积。基于大小匹配测量之后第19天。P值(如由星号所指示)是衍生自治疗组对治疗对照组的司徒登氏T检验比较。b. %TGD =肿瘤生长延迟百分比= (T – C)/C × 100，其中T =治疗组的中值时间至端点且C=治疗对照组的中值时间至端点。基于1000 mm3的端点。P值(如由星号所指示)是衍生自治疗组对治疗对照组的卡-梅氏对数秩比较(* p < 0.01，** p < 0.001，*** p < 0.0001)。
实施例7：抗-DLL4/抗-VEGF DVD的预配制表征
在下文所列出的制剂和蛋白浓度中评估抗-DLL4/抗-VEGF DVD (h1A11.1-SL-Av)的储存稳定性(5℃)和加速的稳定性(40℃)。通过尺寸排阻层析(SE-HPLC)评估稳定性且定量聚集物%、单体%、片段%和所回收全部物质。总而言之，制剂覆盖5至7的pH范围和1.0 mg/ml至118 mg/ml的蛋白浓度范围。
在5℃和40℃温度和50 mg/ml、30 mg/ml和10 mg/ml的蛋白浓度下，制剂为：15 mM乙酸盐，pH 5；15 mM磷酸盐，pH 7；30 mM乙酸盐，80 mg/ml蔗糖，0.02% Tween 80，pH 5；30mM组氨酸，80 mg/ml蔗糖，0.02% Tween 80，pH 6；PBS (磷酸盐缓冲盐水)。所有制剂皆含有0.02%叠氮化钠以防止在储存期间的微生物生长。在5℃和40℃温度和60 mg/ml、50 mg/ml、30 mg/ml和10 mg/ml的蛋白浓度下，制剂为15 mM组氨酸pH 6 (还含有0.02%叠氮化钠以防止在储存期间的微生物生长)。在5℃和118 mg/ml的蛋白浓度下，制剂为15 mM组氨酸pH 6(还含有0.02%叠氮化钠以防止在储存期间的微生物生长)。在40℃和1.0 mg/ml的蛋白浓度下，制剂为10 mM柠檬酸盐+ 10 mM磷酸盐(pH 5、pH 6、pH 7)。过滤含有蛋白的制剂以去除可能的微生物。
通过使制剂中的蛋白经受4个冷冻(在-80℃下，至少20小时)和融化(在30℃水浴中)的循环来实施冷冻-融化稳定性测试。测试冷冻-融化稳定性的制剂列出于下文中。通过SE-HPLC评估稳定性且定量聚集物%、单体%、片段%和所回收全部物质。制剂为15 mM组氨酸pH 6，在60 mg/ml蛋白下(还含有0.02%叠氮化钠以防止微生物生长)和10 mM柠檬酸盐+ 10mM磷酸盐，在pH 5、pH 6、pH 7和1.0 mg/ml蛋白下(过滤以去除可能的微生物)。
最后，在10 mM柠檬酸盐+ 10 mM磷酸盐缓冲液中于pH 5、pH 6、pH 7和1.0 mg/ml蛋白下对蛋白实施差示扫描量热法以测量热稳定性。定量每一蛋白结构域的解折叠起始温度和解折叠的中点温度(Tm)。
基于表11和12中的数据，h1A11.1-SL-Av满足对于DVD-Ig稳定性的预配制标准。
表11：h1A11.1-SL-Av在不同浓度和不同缓冲液、赋形剂和pH下的40℃下加速的稳定性
Figure 837930DEST_PATH_IMAGE016
缓冲液注释(所以缓冲液皆含有0.02%叠氮化钠以防止微生物生长)：
ace = 15 mM乙酸盐pH 5；his = 15 mM组氨酸pH 6；phos = 15 mM磷酸盐pH 7
ace-suc-tw = 30 mM乙酸盐、80 mg/ml蔗糖、0.02% Tw80
his-suc-tw = 30 mM组氨酸、80 mg/ml蔗糖、0.02% Tw80
PBS =磷酸盐缓冲盐水。
表12. h1A11.1-SL-Av在不同浓度和不同缓冲液、赋形剂和pH下的5℃下储存稳定性(缓冲液注释与表11中相同)
Figure 481401DEST_PATH_IMAGE017
Figure 816567DEST_PATH_IMAGE018
表13. h1A11.1-SL-Av在不同浓度和不同缓冲液和pH下的5℃下储存稳定性、40℃下加速的稳定性、和冷冻-融化稳定性
Figure 263598DEST_PATH_IMAGE019
注释：
FT =冷冻融化
FT2 =在两个冷冻和融化循环之后分析；在-80℃下冷冻且在30℃水浴中融化
FT4 =在4个冷冻和融化循环之后分析；在-80℃下冷冻且在30℃水浴中融化
cit-phos = 10 mM柠檬酸盐+ 10 mM磷酸盐
his = 15 mM组氨酸+ 0.02%叠氮化钠(叠氮化物用于防止微生物生长)。
表14. h1A11.1-SL-Av在1 mg/ml下于10 mM柠檬酸盐+ 10 mM磷酸盐中在不同pH下的差示扫描量热法数据
Figure 342412DEST_PATH_IMAGE020
实施例8：抗-DLL4/抗-VEGF DVD的制剂选择
材料和方法。在表15中所列出的6种制剂中评估抗-DLL4/抗-VEGF DVD-Igh1A11.1-SL-Av蛋白的稳定性。所有制剂皆是在15 mM组氨酸缓冲液中制备。制剂F1至F4在50 mg/mL蛋白浓度下制备。在这些制剂中，pH范围为5.5至6.0，聚山梨醇酯80浓度范围为0至0.05% w/v，蔗糖浓度范围为0至7.5% w/v，且精氨酸浓度范围为0至1% w/v。制剂F4是在15 mM组氨酸缓冲液中于pH 6.0下且无任何稳定剂下制备且用作50 mg/mL液体制剂稳定性评估的研究对照。此外，在25 mg/mL蛋白浓度和pH 6.0下制备两种制剂(制剂F5和F6)。这两种制剂中的聚山梨醇酯80和蔗糖的组成略有不同；聚山梨醇酯80的浓度范围为0.025% w/v至0.03% w/v且蔗糖的浓度范围为3.8% w/v至4% w/v。制剂F1至F5使用来自早期制备过程的材料，而F6制剂是使用来自更优化过程的材料配制。制剂F5和F6的组成极为类似，但在二者之间观察到稳定性差异。因组合物是自不同过程制备，故此可为所观察稳定性差异的原因。
表15. 制剂组成描述
Figure 309231DEST_PATH_IMAGE021
在上述制剂中，选择15 mM组氨酸缓冲液，这是因为其提供适当缓冲能力以维持目标制剂pH。针对冷冻-融化应激(冷冻保护剂)和冻干过程诱导的应激(冻干保护剂)来评估作为稳定剂的蔗糖。添加聚山梨醇酯80 (表面活性剂)和精氨酸以潜在地针对聚集物和微粒形成来稳定制剂。
在冷冻/融化期间且在-80℃、5℃、25℃和40℃下通过宽范围的一组分析测定来评估液体制剂的稳定性，所述分析测定包括可见外观、聚集物% (通过尺寸排阻层析(SE-HPLC))、电荷异质性(通过阳离子交换层析(CEX-HPLC))、片段化(通过还原性SDS毛细管电泳CE-SDS))和亚可见颗粒(通过微流成像(MFI))或不透光度(HIAC)。这些结果提供于表16-19中。
Figure 80878DEST_PATH_IMAGE022
Figure 500358DEST_PATH_IMAGE023
Figure 382864DEST_PATH_IMAGE024
Figure 204189DEST_PATH_IMAGE025
Figure 146737DEST_PATH_IMAGE026
Figure 302781DEST_PATH_IMAGE027
冻干制剂稳定性测试。还在冻干制剂之后评估含有结合蛋白h1A11.1-SL-Av的所选制剂的稳定性。评估所有含蔗糖制剂(F1、F2、F3、F5和F6)的冻干药物产物稳定性。在55℃下储存2周之后评估稳定性。通过宽范围的一组分析测定来测试稳定性，所述分析测定包括可见外观(在重构之前和之后)、重构时间、聚集物%(通过尺寸排阻层析(SE-HPLC))、电荷异质性(通过阳离子交换层析(CEX-HPLC))、片段化(通过还原性SDS毛细管电泳(CE-SDS))、亚可见颗粒(通过微流成像(MFI))或不透光度(HIAC)和水含量(通过卡尔-费希尔滴定(KarlFischer titration))。
冻干制剂稳定性测试结果提供于表20中。所有评估制剂的重构时间大约为1分钟至2分钟。所有制剂在55℃应激储存条件下均观察到由SEC的聚集和由CEX的碱性区%中的略微增加。在所有其他测量的产物稳定性特性中观察到最小变化。
Figure 723398DEST_PATH_IMAGE028
还在12个月时段内评估制剂F6 (冻干的，200结合蛋白h1A11.1-SL-Av/小瓶)制剂F6的稳定性。制剂在测试时段内是稳定的。
剂量溶液稳定性测试。以静脉内施用(IV)测试抗-DLL4/抗-VEGF结合蛋白。在施用之前，使用注射用无菌水(SWFI)重构冻干药物产物。随后，在适于IV输注的溶液中稀释重构产物。基于所施用的临床剂量来确定剂量溶液稀释至的最终浓度。
实施研究以评估经稀释抗-DLL4/抗-VEGF结合蛋白h1A11.1-SL-Av在处于含有两种常用IV稀释剂0.9%盐水和5%葡萄糖(D5W)中的一者的剂量溶液中时的稳定性。所评估的蛋白浓度为0.5 mg/mL和1 mg/mL。为评估剂量溶液稳定性和与输注组件的相容性，制备每一测试条件下的剂量溶液且在RT/RL下储存于IV袋(n=2)中6小时，且随后，使用常用输注施用组件(包括在线过滤器)实施模拟输注研究。在IV袋中制备剂量溶液之后(T0)，自袋中直接抽取测试样品。此外，测试在30分钟输注过程结束时收集的样品。通过一组分析测定(包括可见外观、聚集物%(通过尺寸排阻层析(SE-HPLC))和亚可见颗粒(通过不透光度(HIAC))测试样品。
剂量溶液稳定性研究结果提供于表21中。起始材料中的聚集物水平为0.7%。在盐水中制备剂量溶液之后，观察到指示在盐水中稀释时(T0)和在输注结束时聚集物水平有所增加的明显趋势。此外，这些样品中的亚可见颗粒计数高。与之相比，在5%葡萄糖(D5W)中制备的剂量溶液展示始终较低的聚集物水平%和关于微粒的可接受稳定性趋势。
表21. 临床使用中稳定性结果
Figure 664809DEST_PATH_IMAGE029
EFVP：基本上不含可见颗粒。
实施例9：延长的预配制表征
对抗-DLL4/抗-VEGF DVD实施延长的预配制表征以探究不同制剂条件如何影响DVD的稳定性。h1A11.1-SL-Av数据呈现于表22和23中。在下文所列出的制剂和蛋白浓度中评估DVD的储存稳定性(5℃)和加速的稳定性(40℃)。通过尺寸排阻层析(SE-HPLC)评估稳定性且定量聚集物%、单体%、片段%和所回收全部物质。总而言之，制剂覆盖5至7的pH范围和10 mg/ml至50 mg/ml的蛋白浓度范围。
在5℃和40℃温度和50 mg/ml、30 mg/ml和10 mg/ml的浓度下，评估下列制剂：15mM乙酸盐pH 5、15 mM组氨酸pH 6、15 mM磷酸盐pH 7、30 mM乙酸盐、80 mg/ml蔗糖、0.02%Tween 80 pH 5、30 mM组氨酸、80 mg/ml蔗糖、0.02% Tween 80 pH 6和PBS (磷酸盐缓冲盐水)。所有制剂均含有0.02%叠氮化钠以防止在储存期间的微生物生长。
基于表22和23的数据，h1A11.1-LS-Av满足用于DVD-Ig稳定性的预配制标准。
表22. h1A11.1-LS-Av的40℃下加速的稳定性
Figure 778259DEST_PATH_IMAGE030
缓冲液注释 (所有缓冲液均含有0.02%叠氮化钠以防止微生物生长)：ace = 15mM乙酸盐pH 5；his = 15 mM组氨酸pH 6；phos = 15 mM磷酸盐pH 7；ace-suc-tw = 30 mM乙酸盐、80 mg/ml蔗糖、0.02% Tween 80；his-suc-tw = 30 mM组氨酸、80 mg/ml蔗糖、0.02% Tween 80；PBS =磷酸盐缓冲盐水。
表23. h1A11.1-LS-Av的5℃下储存稳定性
Figure 172331DEST_PATH_IMAGE031
表23的缓冲液注释与表22中相同。
实施例10：在DLL4细胞测定中VEGF对于抗-DLL4/抗-VEGF DVD的中和活性的效应
为评估VEGF结合是否影响抗-DLL4/抗-VEGF DVD的DLL4中和效力，在如实施例3.3中所述的DLL4-Notch报道分子测定中包括VEGF。简言之，将表达人DLL4的HEK293G细胞与EA.hy926 Notch报道分子细胞在h1A11.1-SL-Av DVD或抗-DLL4 mAb (h1A11.1)和抗-VEGFmAb (Av)的混合物(自300 nM连续稀释)存在下一起共培养24 hr。还包括重组人VEGF165(VEGF的生理学相关人剪接同种型)或阴性对照蛋白(BSG2)。通过评估IC50值(实现DLL4诱导的Notch活化减小50%所需的抗体浓度)来测定DLL4中和效力。如表24中所展示，6 nM或150nM VEGF的存在大大增加了h1A11.1-SL-Av DVD的DLL4中和效力。该增加的效力对于抗-DLL4/抗-VEGF DVD而言是独特的，这是因为亲本mAb混合物在包括或不包括VEGF下展现类似效力。
表24. VEGF增强抗-DLL4/抗-VEGF DVD的DLL4效力但并不增强抗-DLL4/抗-VEGF混合物的DLL4效力
Figure 396639DEST_PATH_IMAGE032
在另一实验中，还在DLL4中和细胞测定中评估h1A11.1-SL-Av DVD的单价Fab片段。与DVD Ig相反，单价DVD Fab具有较弱DLL4中和效力。VEGF的存在改进了DVD-Fab的效力，但未达到如使用DVD-Ig所看到的程度(表25)。
表25. VEGF对于抗-DLL4/抗-VEGF DVD Ig和DVD Fab的DLL4中和效力的效应
Figure 926977DEST_PATH_IMAGE033
*不能测得精确IC50，这是因为不能完全中和DLL4
在另一实验中，连续向下滴定VEGF浓度且应用至上述DLL4-Notch报道分子测定。如表26中所展示，在低至1.2 nM的浓度下，VEGF可增强h1A11.1-SL-Av DVD的DLL4中和活性。
表26. VEGF增强抗-DLL4/抗-VEGF DVD的DLL4中和效力
Figure 211328DEST_PATH_IMAGE034
实施例11：DLL4-VEGF DVD-Ig的体内组合效能
针对雌性SCID小鼠中的SW-48人结肠异种移植物肿瘤评估抗-DLL4-VEGF DVD-Ig与化学疗法的组合对于肿瘤生长的效应。简言之，将5 × 106个细胞经皮下接种至右后侧中。使肿瘤建立13天，此时使用电子卡尺测量且使用公式：L × W2/2来测定肿瘤体积。将小鼠分配至治疗组中(n=10只/组)，从而每一小组在开始疗法之前具有211 mm3的相等平均肿瘤体积。以表27中的剂量和时间表向动物给药伊立替康、抗-VEGF mAb和/或抗-DLL4-VEGFDVD-Ig。在实验的持续时间内每周两次测量肿瘤体积。结果展示于表27中。
表27. 抗-DLL4-VEGF DVD-Ig和伊立替康在SW-48结肠异种移植物模型中的组合效能
Figure 341964DEST_PATH_IMAGE035
表27注释：a.%TGI =肿瘤生长抑制百分比= 100 – (T/C × 100)，其中T =治疗组的平均肿瘤体积且C =治疗对照组的平均肿瘤体积。基于大小匹配测量之后第18天。P值(如由星号所指示)是衍生自治疗组对治疗对照组的司徒登氏T检验比较。b.%TGD =肿瘤生长延迟百分比= (T – C)/C × 100，其中T =治疗组的中值时间至端点且C=治疗对照组的中值时间至端点。基于1000 mm3的端点。P值(如由星号所指示)是衍生自治疗组对治疗对照组的卡-梅氏对数秩比较：* p < 0.05，** p < 0.001，*** p < 0.0001。“q3d × 4”指示在4个循环(即4个剂量)中每3天进行施用，而“q7d × 4”指示在4个循环中每7天进行施用。
还针对雌性SCID小鼠中的HCT-116人结肠异种移植物肿瘤评估抗-DLL4-VEGFDVD-Ig与化学疗法的组合对于肿瘤生长的效应。简言之，将5 × 106个细胞经皮下接种至右后侧中。使肿瘤建立14天，此时使用电子卡尺测量且使用公式：L × W2/2来测定肿瘤体积。将小鼠分配至治疗组中(n=9只/组)，从而每一小组在开始疗法之前具有192 mm3的相等平均肿瘤体积。以表28中的剂量和时间表向动物给药5-FU、甲酰四氢叶酸、伊立替康、抗-VEGF mAb和/或抗-DLL4-VEGF DVD-Ig。在实验的持续时间内每周两次测量肿瘤体积。结果展示于表28中。
表28. 抗-DLL4-VEGF DVD-Ig和Folfiri在HCT-116结肠异种移植物模型中的组合效能
Figure 369963DEST_PATH_IMAGE036
表28注释：a.%TGI =肿瘤生长抑制百分比= 100 – (T/C × 100)，其中T =治疗组的平均肿瘤体积且C =治疗对照组的平均肿瘤体积。基于大小匹配测量之后第26天。P值(如由星号所指示)是衍生自治疗组对治疗对照组的司徒登氏T检验比较：* p < 0.05，** p <0.001，*** p < 0.0001。“q7d × 3”指示在3个循环(即3个剂量)中每7天进行施用，而“q7d× 4”指示在4个循环中每7天进行施用。
针对雌性SCID小鼠中的HT-29人结肠异种移植物肿瘤评估抗-DLL4-VEGF DVD-Ig与化学疗法的组合对于肿瘤生长的效应。简言之，将2 × 106个细胞经皮下接种至右后侧中。使肿瘤建立25天，此时使用电子卡尺测量且使用公式：L × W2/2来测定肿瘤体积。将小鼠分配至治疗组中(n=10只/组)，从而每一小组在开始疗法之前具有209 mm3的相等平均肿瘤体积。以表29中的剂量和时间表向动物给药伊立替康和/或抗-DLL4-VEGF DVD-Ig。在实验的持续时间内每周两次测量肿瘤体积。结果展示于表29中。
表29. 抗-DLL4-VEGF DVD-Ig和伊立替康在HT-29结肠异种移植物模型中的组合效能
Figure 20387DEST_PATH_IMAGE037
表29注释。 a.%TGI =肿瘤生长抑制百分比= 100 – (T/C × 100)，其中T =治疗组的平均肿瘤体积且C =治疗对照组的平均肿瘤体积。基于大小匹配测量之后第20天。P值(如由星号所指示)是衍生自治疗组对治疗对照组的司徒登氏T检验比较。b.%TGD =肿瘤生长延迟百分比= (T – C)/C × 100，其中T =治疗组的中值时间至端点且C=治疗对照组的中值时间至端点。基于1000 mm3的端点。P值(如由星号所指示)是衍生自治疗组对治疗对照组的卡-梅氏对数秩比较：* p < 0.05，** p < 0.001，*** p < 0.0001。“q3d × 4”指示在4个循环(即4个剂量)中每3天进行施用，而“q7d × 4”指示在4个循环中每7天进行施用。
针对雌性SCID小鼠中的U87-MG人成胶质细胞瘤异种移植物肿瘤评估抗-DLL4-VEGF DVD-Ig与化学疗法的组合对于肿瘤生长的效应。简言之，将3 × 106个细胞经皮下接种至右后侧中。使肿瘤建立13天，此时使用电子卡尺测量且使用公式：L × W2/2来测定肿瘤体积。将小鼠分配至治疗组中(n=10只/组)，从而每一小组在开始疗法之前具有207 mm3的相等平均肿瘤体积。以表30中的剂量和时间表向动物给药替莫唑胺、抗-VEGF mAb和/或抗-DLL4-VEGF DVD-Ig。在实验的持续时间内每周两次测量肿瘤体积。结果展示于表30中。
表30. 抗-DLL4-VEGF DVD-Ig和替莫唑胺在U87-MG成胶质细胞瘤异种移植物模型中的组合效能
Figure 210060DEST_PATH_IMAGE038
表30注释。 a.%TGI =肿瘤生长抑制百分比= 100 – (T/C × 100)，其中T =治疗组的平均肿瘤体积且C =治疗对照组的平均肿瘤体积。基于大小匹配测量之后第19天。P值(如由星号所指示)是衍生自治疗组对治疗对照组的司徒登氏T检验比较。b.%TGD =肿瘤生长延迟百分比= (T – C)/C × 100，其中T =治疗组的中值时间至端点且C=治疗对照组的中值时间至端点。基于1000 mm3的端点。P值(如由星号所指示)是衍生自治疗组对治疗对照组的卡-梅氏对数秩比较：* p < 0.05，** p < 0.001，*** p < 0.0001。
针对雌性NSG小鼠中的PA0123患者来源的人胰脏异种移植物肿瘤评估抗-DLL4-VEGF DVD-Ig与化学疗法的组合对于肿瘤生长的效应。简言之，将冷冻肿瘤片段经皮下移植至右后侧中。使肿瘤建立28天，此时使用电子卡尺测量且使用公式：L × W2/2来测定肿瘤体积。将小鼠分配至治疗组中(n=7只/组)，从而每一小组在开始疗法之前具有193 mm3的相等平均肿瘤体积。以表31中的剂量和时间表向动物给药吉西他滨和/或抗-DLL4-VEGF DVD-Ig。在实验的持续时间内每周两次测量肿瘤体积。结果展示于表31中。
表31. 抗-DLL4-VEGF DVD-Ig和吉西他滨在PA0123患者来源的胰脏异种移植物模型中的组合效能
Figure 109883DEST_PATH_IMAGE039
表31注释。 a.%TGI =肿瘤生长抑制百分比= 100 – (T/C × 100)，其中T =治疗组的平均肿瘤体积且C =治疗对照组的平均肿瘤体积。基于大小匹配测量之后第38天。P值(如由星号所指示)是衍生自治疗组对治疗对照组的司徒登氏T检验比较。b.%TGD =肿瘤生长延迟百分比= (T – C)/C × 100，其中T =治疗组的中值时间至端点且C=治疗对照组的中值时间至端点。基于1000 mm3的端点。P值(如由星号所指示)是衍生自治疗组对治疗对照组的卡-梅氏对数秩比较：* p < 0.05，** p < 0.001，*** p < 0.0001。
针对雌性SCID小鼠中的MDA-MB-231-luc人乳房异种移植物肿瘤评估抗-DLL4-VEGF DVD-Ig与化学疗法的组合对于肿瘤生长的效应。简言之，将2 × 106个细胞移植至乳房脂肪垫中。使肿瘤建立13天，此时使用电子卡尺测量且使用公式：L × W2/2来测定肿瘤体积。将小鼠分配至治疗组中(n=10只/组)，从而每一小组在开始疗法之前具有150 mm3的相等平均肿瘤体积。以表32中的剂量和时间表向动物给药紫杉醇和/或抗-DLL4-VEGF DVD-Ig。在实验的持续时间内每周两次测量肿瘤体积。另外，获取生物发光影像以监测和追踪癌细胞至肺和/或淋巴结的自发性转移。结果展示于表32中。
表32. 抗-DLL4-VEGF DVD-Ig和紫杉醇在MDA-MB-231-luc乳房异种移植物模型中的组合效能
Figure 144835DEST_PATH_IMAGE040
表32注释。 a.%TGI =肿瘤生长抑制百分比= 100 – (T/C × 100)，其中T =治疗组的平均肿瘤体积且C =治疗对照组的平均肿瘤体积。基于大小匹配测量之后第15天。P值(如由星号所指示)是衍生自治疗组对治疗对照组的司徒登氏T检验比较。b.%TGD =肿瘤生长延迟百分比= (T – C)/C × 100，其中T =治疗组的中值时间至端点且C=治疗对照组的中值时间至端点。基于1000 mm3的端点。P值(如由星号所指示)是衍生自治疗组对治疗对照组的卡-梅氏对数秩比较。c.转移发生率% =基于生物发光成像动物在肺和/或淋巴结中具有可检测信号的动物的百分比。治疗对照组具有100%。基于大小匹配测量之后的第22天。P值(如由星号所指示)是衍生自治疗组对治疗对照组的司徒登氏T检验比较：* p < 0.05，**p < 0.001，*** p < 0.0001。
针对雌性SCID小鼠中的SUM149PT人乳房异种移植物肿瘤评估抗-DLL4-VEGF DVD-Ig与化学疗法的组合对于肿瘤生长的效应。简言之，将1 × 106个细胞经皮下接种至右后侧中。使肿瘤建立28天，此时使用电子卡尺测量且使用公式：L × W2/2来测定肿瘤体积。将小鼠分配至治疗组中(n=9只/组)，从而每一小组在开始疗法之前具有183 mm3的相等平均肿瘤体积。以表33中的剂量和时间表向动物给药紫杉醇和/或抗-DLL4-VEGF DVD-Ig。在实验的持续时间内每周两次测量肿瘤体积。结果展示于表33中。
表33. 抗-DLL4-VEGF DVD-Ig和紫杉醇在SUM149PT乳房异种移植物模型中的组合效能
Figure 446503DEST_PATH_IMAGE041
表33注释。 a.%TGI =肿瘤生长抑制百分比= 100 – (T/C × 100)，其中T =治疗组的平均肿瘤体积且C =治疗对照组的平均肿瘤体积。 基于大小匹配测量之后第22天。P值(如由星号所指示)是衍生自治疗组对治疗对照组的司徒登氏T检验比较。b.%TGD =肿瘤生长延迟百分比= (T – C)/C × 100，其中T =治疗组的中值时间至端点且C=治疗对照组的中值时间至端点。基于1000 mm3的端点。P值(如由星号所指示)是衍生自治疗组对治疗对照组的卡-梅氏对数秩比较：* p < 0.05，** p < 0.001，*** p < 0.0001。
针对雌性SCID小鼠中的SUM149PT人乳房异种移植物肿瘤评估抗-DLL4-VEGF DVD-Ig与化学疗法的组合对于肿瘤生长的效应。简言之，将1 × 106个细胞经皮下接种至右后侧中。使肿瘤建立25天，此时使用电子卡尺测量且使用公式：L × W2/2来测定肿瘤体积。将小鼠分配至治疗组中(n=10只/组)，从而每一小组在开始疗法之前具有228 mm3的相等平均肿瘤体积。以表34中的剂量和时间表向动物给药紫杉醇、抗-VEGF mAb和/或抗-DLL4-VEGFDVD-Ig。在实验的持续时间内每周两次测量肿瘤体积。结果展示于表34中。
表34. 抗-DLL4-VEGF DVD-Ig和紫杉醇在SUM149PT乳房异种移植物模型中的组合效能
Figure 275919DEST_PATH_IMAGE042
表34注释：a.%TGI =肿瘤生长抑制百分比= 100 – (T/C × 100)，其中T =治疗组的平均肿瘤体积且C =治疗对照组的平均肿瘤体积。基于大小匹配测量之后第18天。 P值(如由星号所指示)是衍生自治疗组对治疗对照组的司徒登氏T检验比较：* p < 0.05，** p< 0.001，*** p < 0.0001。
进一步针对雌性SCID小鼠中的HCT-116人结肠异种移植物肿瘤评估抗-DLL4-VEGFDVD-Ig与化学疗法的组合对于肿瘤生长的效应。简言之，将5 × 106个细胞经皮下接种至右后侧中。使肿瘤建立16天，此时使用电子卡尺测量且使用公式：L × W2/2来测定肿瘤体积。将小鼠分配至治疗组中(n=9只/组)，从而每一小组在开始疗法之前具有198 mm3的相等平均肿瘤体积。以表35中的剂量和时间表向动物给药5-FU、卡培他滨和/或抗-DLL4-VEGFDVD-Ig。在实验的持续时间内每周两次测量肿瘤体积。结果展示于表35中。
表35. 抗-DLL4-VEGF DVD-Ig和5-FU或抗-DLL4-VEGF DVD-Ig和卡培他滨在HCT-116结肠异种移植物模型中的组合效能。
Figure 663038DEST_PATH_IMAGE043
表35注释：a.%TGI =肿瘤生长抑制百分比= 100 – (T/C × 100)，其中T =治疗组的平均肿瘤体积且C =治疗对照组的平均肿瘤体积。基于大小匹配测量之后第21天。P值(如由星号所指示)是衍生自治疗组对治疗对照组的司徒登氏T检验比较：* p < 0.05，** p <0.01，*** p < 0.001。
实施例12：h1A11.1-SL-Av DVD的跨物种细胞效力
在基于细胞的测定中使用固定的重组DLL4细胞外结构域(ECD)在物种间比较h1A11.1-SL-Av DVD针对DLL4的跨物种中和效力。利用该测定来比较h1A11.1-SL-Av DVD针对衍生自人、大鼠、小鼠和食蟹猴物种的相同浓度DLL4的活性。
使用100 µL/孔稀释于PBS中的DLL4-ECD (11 nM) (Invitrogen，14190号)或使用100 µL/孔11 nM BSA作为对照(Sigma，A9576号)预包被具有透明底部孔的黑色96孔组织培养板(Costar，3904号)。密封测定板且在4℃下孵育18小时。次日，将h1A11.1-SL-AV DVD连续稀释于含有10% FBS的测定培养基DMEM (Invitrogen，11995号)中。使用测定培养基将预包被的测定板冲洗一次，然后添加50 µL/孔经连续稀释的h1A11.1-SL-Av DVD溶液。然后将测定板在25℃下孵育30分钟。在此孵育期间，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA (Invitrogen，25200号)自培养烧瓶分离表达对照海肾荧光素酶和由Notch反应性启动子驱动的萤火虫荧光素酶的EA.hy926细胞，以3 × 105个细胞/mL再悬浮于测定培养基中，且然后以25 µL细胞/孔直接添加至测定板中。然后将测定板在37℃和5% CO2下孵育24小时。根据供应商方案(Dual-Glo荧光素酶测定系统，Promega，E2940号)实施萤火虫和海肾荧光素酶测定。在板读取仪(Victor, Perkin Elmer，1420-051号)上读取发光，且将所产生数据归一化至海肾荧光素酶发光信号。
如表36中所展示，h1A11.1-SL-Av DVD以相当的效力抑制人和食蟹猴DLL4活性。h1A11.1-SL-Av DVD还抑制小鼠DLL4，尽管相比于人DLL4具有低约3倍的活性。h1A11.1-SL-Av DVD在细胞测定中并不抑制大鼠DLL4活性。
在VEGF刺激的NIH3T3/VEGFR-2细胞增殖和活力测定中评估h1A11.1-SL-AV DVD针对VEGF的跨物种中和效力。
将用全长人VEGFR-2的cDNA稳定转染的NIH3T3细胞用于VEGF刺激的增殖和存活测定。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA (Invitrogen，25200号)自培养烧瓶分离NIH3T3/VEGFR-2稳定细胞系的汇合培养物，且以1.33 × 105个细胞/mL再悬浮于测定培养基：含有0.1% BSA(Sigma，A9576号)的DMEM (Invitrogen，11995号)中。以10,000个细胞/孔于75 µL总体积中将细胞接种至具有透明底部的黑色96孔组织培养测定板(Costar，3904号)中，且在37℃和5% CO2下孵育24小时。次日，使用测定培养基稀释重组VEGF蛋白和h1A11.1-SL-AV DVD，混合于96孔聚丙烯板中且在25℃下孵育30分钟。然后以25 µL/孔将VEGF和h1A11.1-SL-AVDVD混合物(cocktails)(4 ×)添加至测定板上的细胞中。然后将含有经处理细胞的测定板在37℃和5% CO2下孵育。72小时后，根据供应商方案(ATPlite 1step, Perkin Elmer，6016739号)实施活力测定。在板读取仪(Victor, Perkin Elmer，1420-051号)上读取发光。
如表36中所展示，与人VEGF相比，h1A11.1-SL-AV DVD以类似效力中和食蟹猴VEGF活性。h1A11.1-SL-AV DVD在细胞测定中不抑制小鼠或大鼠VEGF。
表36：h1A11.1-SL-AV DVD的跨物种细胞效力
Figure 762667DEST_PATH_IMAGE044
表36注释：a.来自DLL4细胞测定的值是来自4个独立实验的平均值±标准偏差。来自VEGF细胞测定的值是来自三个独立实验的平均值±标准偏差。
实施例13：筛选漏斗(Screening Funnel)和先导候选物选择
选择先导DVD-Ig候选物可需要以下的数个循环：分子改造、产生数百个可能的候选物分子，随后在筛选漏斗中测试，其可包括一组测定用于鉴定具有治疗药剂所需性质的DVD-Ig分子，所有均没有关于可变结构域序列或将提供最佳功能性质的其他结构的指导。通常，这些性质包括但不限于对以下的评估：(a) 对内部和外部抗原结合结构域的结合动力学（结合速率、解离速率和亲和力），（b）多种生物化学和细胞生物测定中的效能，（c）相关肿瘤模型中的体内效力，（d）药代动力学和药效动力学性质，（e）可制造性，包括在所选细胞系中的蛋白表达水平、可扩大性(scalability)、翻译后修饰、物理化学性质，如单体百分比、可溶性和稳定性（内在的、冷冻/融化、储存稳定性等），（f）制剂性质，（g）可能的免疫原性风险，和（h）分子的毒理性质。还可以评估结合方式和效价，因为这些可以影响分子的结合性质和细胞潜能。为每一个所评估的参数设定阈水平，并且注意对每一个参数展示优良水平的结合蛋白。从数百个分子的初始筛选中，在当鉴定先导候选物用于进一步评估时考虑的其他因素中，经常出现仅一个或没有具有满足所有所列出参数的性质的分子。一旦鉴定了先导候选物，进一步检查治疗性质的体内评估，包括评估动物和人个体中的安全性、效力和效能。
实施例14：抗-DLL4 /抗-VEGF DVD-Ig先导候选物选择
本发明人已经构建并评估了大约100个抗-DLL4/抗-VEGF DVD-Ig分子，包括使用表2中所列出的VEGF和DLL4序列，以及那些可变结构域的CDR移植的且亲和力成熟的版本和额外的人源化的和完全人可变结构域序列的构建体。通过PROfusion mRNA展示技术，随后通过使用酵母展示技术的亲和力成熟衍生完全人亲本抗DLL4 mAb。CDR再移植的亲本抗体基于抗-DLL4 mAb E9.71，数个人源化抗-DLL4 mAb基于h1A11.1和h38H12.11制备，并且还产生数个亲和力成熟的h1A11抗体。本发明人还评估了DVD-Ig结合蛋白中的许多不同接头序列。不同接头的使用产生很大程度上不同的性质，甚至是在具有相同可变结构域序列的结合蛋白之间。
在所产生的大概100个DVD-Ig分子中，它们中的10个因在通过瞬时转染的HEK293细胞中没有达到期望的表达水平而被排除在外，22个不展示结合至DLL4的期望的阈水平，19个不展示结合至VEGF的期望的阈水平，数个展示次优翻译后修饰，包括O-连接的糖基化。数个DVD-Ig因展示低于限定阈值之下的结合亲和力而被排除在外。DVD-Ig内部位置上的抗原结合结构域可以展示抗原结合亲和力和效能的降低水平。例如，其中VEGF结合结构域置于外部位置和DLL4结合结构域置于内部位置的h1A11/Av系列的所有DVD-Ig分子均展示降低的DLL4结合亲和力。因此不选择这些DVD-Ig用于进一步的研究。在相反方向上（即，VEGF结合结构域位于内部位置而DLL4结合结构域位于外部位置），发现h1A11.1-SL-Av的VEGF结合亲和力出乎意料的好，甚至是对使用相同可变结构域和方向但是具有其他接头序列的结合蛋白，如h1A11.1-SS-Av（两条重链和轻链上的VD1和VD2结构域之间的短接头）。
另外，在h1A11上实施亲和力成熟以产生当以单克隆抗体形式时具有非常高亲和力和稳定性的抗-DLL4亲本抗体，但是以DVD-Ig形式时，这些构建体不展示对h1A11.1-SL-Av观察到的稳定性水平，不管所用的接头或结合结构域的方向如何。类似地，Av (抗-VEGF)可变结构域的亲和力成熟再次产生稳定的亲本单克隆抗体，其展示降低的稳定性水平，而不管接头和方向操作如何。此外，即使其中其产生对单克隆抗体的优良结合动力学，亲和力成熟也可能不预测后续DVD-Ig的活性。例如，当h1A11.1被其亲和力成熟的变体替代时，这些新DVD-Ig分子在肿瘤模型中展示降低的稳定性，更短的体内半衰期，和减少的抗肿瘤活性。此外，含有亲和力成熟的h1A11和/或Av可变结构域的DVD-Ig分子在5℃储存期间也展示胶凝或形成高水平聚集物的增加趋势。当在相似条件下储存时，对包含原始亲本抗体可变结构域（即，来自非亲和力成熟的抗体的可变结构域）的DVD-Ig分子，特别是对DVD-Igh1A11.1-SL-Av没有观察到这种不期望的胶凝和聚集。
这指示当选择临床候选物时单独的抗原结合亲和力不是要考虑的唯一因素，且的确结合亲和力可能不预测其他结合蛋白性质，如稳定性、配制稳定性、物理化学性质、体内抗肿瘤效力和/或药代动力学性质，其对甚至轻微的结构修饰敏感。例如，h1A11.1-LS-Av、h1A11.1-LL-Av和h1A11.1-SL-Av DVD-Ig分子的VEGF和DLL4中和效力是广泛可比较的（表7），但是h1A11.1-SL-Av展示最高水平的肿瘤生长抑制效力（表9）。此外，对于保留结合亲和力和细胞效力的DVD-Ig分子，它们中的一些展示较少有利的物理化学性质。例如，尽管h1A11.1-LL-Av与治疗先导物h1A11.1-SL-Av非常相似，但是在两个构建体中连接两个可变结构域的接头之间的差异导致对h1A11.1-LL-Av的更少的有利物理化学性质。这证明例如对DVD-Ig中的两个可变结构域之间的接头即使小的改变也可以对所评估的治疗性质具有显著的影响。
基于某些期望特征的存在，如在上文所述测定中所测量，在小鼠模型中进一步测试大概100个或更多个DVD-Ig分子中的17个用于抗肿瘤活性和药代动力学性质。与其他测试的结合蛋白相比，DVD-Ig h1A11.1-SL-Av展示出乎意料的优良肿瘤抑制效力和药代动力学性质。因此，评估筛选漏斗中所用的排除标准，DVD-Ig h1A11.1-SL-Av在所测量的每一参数中最终出现为结合蛋白展示有利的（即高于阈值）性质。因此选择结合蛋白用于进一步的评估和研究。
实施例15：与早期VEGF/DLL4 DVD-Ig的比较
尽管h1A11.1-SL-Av不直接与美国专利申请公开第20100076178号（参见该申请中的表5）中发表的96个先前的VEGF/DLL4 DVD-Ig分子比较，但是可以进行间接比较。例如，h1A11.1-SL-Av展示与参考抗VEGF mAb Av的相当的VEGF结合活性（参见表5）。相反，在美国专利申请公开第20100076178号中测试的96个VEGF/DLL4 DVD-Ig分子的至少三分之二具有比参考抗VEGF mAb AB014更弱的VEGF结合活性。（AB014含有与抗体Av中相同的可变结构域序列）。因此，h1A11.1-SL-Av看起来展示相比于早期申请中所测试的大多数DVD-Ig构建体的改进的结合动力学。
前述实施例旨在进行阐释且不以任何方式限制本公开内容。所公开装置和方法的其他实施方案在本领域技术人员在考虑本说明书和实践本文所公开的装置和方法时将是显而易见的。
通过引用并入
在整个本申请中可能引用的所有引用的参考(包含参考文献、专利、专利申请和网站)的内容以其整体出于任何目的通过引用明确地并入本文中，如其中所引用的参考。除非另外指明，否则公开内容将采用本领域熟知的免疫学、分子生物学和细胞生物学的常规技术。
本公开内容还通过引用以其整体并入分子生物学和药物递送领域中熟知的技术。这些技术包括但不限于下列出版物中所述的技术：
Ausubel等人(编辑)，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley&Sons, NY (1993)；
Ausubel, F.M.等人编辑，SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (第4版，1999) John Wiley & Sons, NY. (ISBN 0-471-32938-X)；
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等同方案
本公开内容可以其他具体形式来实施，而不背离其精神或基本特征。因此，应在所有方面将前述实施方案视为阐释性而非限制本公开内容。因此，本公开内容的范围是由随附的权利要求而非由以上说明书来表示，且因此旨在出现在权利要求的等同方案的含义和范围内的所有变化均涵盖于本文。
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Claims (83)

1.一种包含第一和第二多肽链的结合蛋白，所述第一和第二多肽链各自独立地包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中
VD1是第一可变结构域；
VD2是第二可变结构域；
C是恒定结构域；
X1是接头；
X2是Fc区；
n为0或1，
其中所述第一和第二多肽链上的VD1结构域形成第一功能靶结合位点且所述第一和第二多肽链上的VD2结构域形成第二功能靶结合位点，且其中所述结合蛋白能够结合DLL4和VEGF，其中所述结合蛋白的第一多肽链包含SEQ ID NO: 56，且所述结合蛋白的第二多肽链包含SEQ ID NO: 64。
2.权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含第一VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中
VD1是第一重链可变结构域；
VD2是第二重链可变结构域；
C是重链恒定结构域；
X1是接头；
X2是Fc区；
n为0或1，且
其中所述结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含第二VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中
VD1是第一轻链可变结构域；
VD2是第二轻链可变结构域；
C是轻链恒定结构域；
X1是接头；
对于(X1)n而言，n为0或1；
对于(X2)n而言，n为0，
其中所述第一和第二多肽链上的VD1结构域形成第一功能靶结合位点且所述第一和第二多肽链上的VD2结构域形成第二功能靶结合位点。
3.权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含两条第一多肽链和两条第二多肽链以及四个功能靶结合位点。
4.权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白的Fc区是来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的Fc区。
5.权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白的第一多肽链包含SEQ ID NO: 74，且所述结合蛋白的第二多肽链包含SEQ ID NO: 73。
6.权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含SEQ ID NO: 74和/或SEQ ID NO: 73的恒定区。
7.权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白的第一和第二多肽链由SEQ ID NOs: 74和73组成。
8.权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够：
(a) 如通过表面等离子共振所测定的，以至多7.0 x 10-10 M的解离常数(KD)结合至VEGF，和/或如在VEGFR1竞争ELISA中所测定的，以至多3.8 nM的IC50阻断VEGF活性；和/或
(b) 如通过表面等离子共振所测定的，以至多1.0 x 10-8 M的解离常数(KD)结合至DLL4，和/或如在Notch竞争ELISA中所测定的，以至多1.09 nM的IC50阻断DLL4活性。
9.一种结合蛋白缀合物，其包含权利要求1的结合蛋白，所述结合蛋白缀合物进一步包含药剂，其中所述药剂是免疫粘着分子、显像剂或治疗剂。
10.一种结合蛋白缀合物，其包含权利要求1的结合蛋白，所述结合蛋白缀合物进一步包含药剂，其中所述药剂是细胞毒性剂。
11.权利要求9的结合蛋白缀合物，其中所述显像剂是放射标记、酶、发光标记、磁性标记或生物素。
12.权利要求9的结合蛋白缀合物，其中所述显像剂是荧光标记。
13.权利要求9的结合蛋白缀合物，其中所述显像剂是生物发光标记。
14.权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白是结晶的结合蛋白。
15.一种经分离的核酸，其编码权利要求1的结合蛋白。
16.一种载体，其包含权利要求15的经分离的核酸。
17.权利要求16的载体，其中所述载体选自：pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pcDNA3.1 TOPO、pEF6、pHybE、TOPO和pBJ。
18.一种宿主细胞，其包含权利要求16的载体。
19.权利要求18的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。
20.权利要求19的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)。
21.权利要求18的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。
22.权利要求21的宿主细胞，其中所述真核细胞选自：原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。
23.权利要求21的宿主细胞，其中所述真核细胞是选自以下的动物细胞：哺乳动物细胞、禽类细胞和昆虫细胞。
24.权利要求23的宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞是CHO细胞。
25.权利要求23的宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞是COS细胞。
26.权利要求22的宿主细胞，其中所述真菌细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
27.权利要求23的宿主细胞，其中所述昆虫细胞是Sf9细胞。
28.一种产生结合蛋白的方法，其包括将权利要求18的宿主细胞在培养基中于足以产生所述结合蛋白的条件下培养。
29.药物组合物，其包含权利要求1的结合蛋白和至少一种额外药剂。
30.权利要求29的药物组合物，其中所述额外药剂包含以下中的至少一种：显像剂和治疗剂。
31.权利要求29的药物组合物，其中所述额外药剂包含以下中的至少一种：可检测标记、毒素、抗微生物剂、细胞凋亡剂、化学治疗剂、细胞因子、麻醉药品、免疫抑制剂、细胞因子拮抗剂和肝素。
32.权利要求29的药物组合物，其中所述额外药剂包含以下中的至少一种：发光标记、细胞毒性剂、抗有丝分裂剂和低分子量肝素。
33.权利要求29的药物组合物，其中所述额外药剂包含以下中的至少一种：荧光标记、生长因子、免疫球蛋白、哮喘药、抗高血压剂、α-2激动剂和抗凝血剂。
34.权利要求29的药物组合物，其中所述额外药剂包含以下中的至少一种：免疫粘着分子、放射标记、酶、生物发光标记、磁性标记、生物素、抗代谢物、烷化剂、蒽环类、血管发生抑制剂、激酶抑制剂、共刺激分子调节剂、粘着分子阻断剂、抗-细胞因子抗体或其功能片段、氨甲蝶呤、环孢菌素、雷帕霉素、FK506、TNF拮抗剂、抗风湿剂、肌肉松弛剂、非类固醇抗炎药(NSAID)、镇痛剂、镇静剂、局部麻醉剂、抗牛皮癣剂、皮质类固醇、同化类固醇、促红血球生成素、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗精神病剂、β激动剂、肾上腺素、利尿剂、肾上腺素能受体拮抗剂、钙通道阻断剂、肾素抑制剂、ACE抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、血管舒张剂、可乐定、甲基多巴、肼屈嗪、哌唑嗪、利血平、莫索尼定、胍法辛、培哚普利/吲达帕胺、洛非西定、甲酪氨酸、华法林、达肝素、阿加曲班、比伐卢定、来匹卢定和葡萄糖。
35.权利要求29的药物组合物，其中所述额外药剂包含抗抑郁剂。
36.权利要求29的药物组合物，其中所述额外药剂包含以下中的至少一种：KDR抑制剂、TIE-2抑制剂、抗-B7.1抗体、抗-B7.2抗体、CTLA4-Ig、抗-CD20抗体、抗-LFA-1抗体、抗-E/L选择素抗体、抗-VEGF单克隆抗体、抗-DLL4单克隆抗体、抗-IL-18抗体、抗-TNF抗体和抗-IL-6抗体。
37.权利要求29的药物组合物，其中所述额外药剂包含以下中的一种或多种：抗血管生成剂、抗-CTLA4抗体、钙通道阻断剂、ACE抑制剂、FOLFIRI、紫杉醇、卡铂、doxil、拓扑替康和顺铂。
38.权利要求1的结合蛋白或权利要求29的药物组合物在制造用于在个体中治疗特征在于异常的DLL4和/或VEGF表达或活性的疾病的药物中的用途。
39.权利要求38的用途，其中所述特征在于异常的DLL4和/或VEGF表达或活性的疾病是特征在于血管过度生长或水肿的疾病。
40.权利要求38的用途，其中所述药物进一步包含至少一种额外药剂用于治疗特征在于异常的DLL4和/或VEGF表达或活性的疾病。
41.权利要求40的用途，其中所述特征在于异常的DLL4和/或VEGF表达或活性的疾病是特征在于血管过度生长或水肿的疾病。
42.权利要求40或41的用途，其中所述至少一种额外药剂包含以下中的一种或多种：伊立替康、甲酰四氢叶酸、5-FU、替莫唑胺、卡培他滨、吉西他滨和紫杉醇。
43.权利要求40或41的用途，其中所述至少一种额外药剂包含化学治疗剂。
44.权利要求40或41的用途，其中所述至少一种额外药剂包含细胞毒性剂。
45.权利要求40或41的用途，其中所述至少一种额外药剂包含以下中的一种或多种：抗血管生成剂、抗-CTLA4抗体、钙通道阻断剂、ACE抑制剂、FOLFIRI、紫杉醇、卡铂、doxil、拓扑替康和顺铂。
46.权利要求38的用途，其中所述疾病是结肠直肠癌、卵巢癌、子宫颈癌、乳腺癌、肺癌或胰腺癌。
47.权利要求38的用途，其中所述疾病是原发性或转移性癌症、妊娠滋养细胞疾病、恶性组织细胞增多病、副肿瘤综合征、黄斑变性、1型糖尿病、糖尿病性视网膜病变或动脉粥样硬化。
48.权利要求38的用途，其中所述疾病是白血病或实体瘤。
49.权利要求38的用途，其中所述疾病是血液系统恶性肿瘤、或恶性肿瘤的高钙血症。
50.权利要求38的用途，其中所述疾病是肺癌、口咽癌、泌尿道癌、女性生殖道癌、男性生殖道癌、内分泌腺癌、黑素瘤、肉瘤、脑膜肿瘤、神经肿瘤、淋巴瘤或结肠直肠癌。
51.权利要求38的用途，其中所述疾病是B细胞淋巴瘤。
52.权利要求38的用途，其中所述疾病是脑肿瘤、眼睛肿瘤、神经瘤、急性白血病或恶性淋巴瘤。
53.权利要求38的用途，其中所述疾病是乳腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、腺癌、下咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、小肠癌、肾癌、膀胱癌、尿道上皮癌、子宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、绒毛膜癌、前列腺癌、精囊癌、睾丸癌、生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、肾上腺癌、脑垂体癌、皮肤癌、血管瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、卡波西肉瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、源自血液系统恶性肿瘤的实体瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、直肠癌、无β脂蛋白血症、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、伯基特氏淋巴瘤、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病、恶性黑素瘤或多发性骨髓瘤。
54.权利要求38的用途，其中所述疾病是结肠癌和/或所述药物进一步包含伊立替康、甲酰四氢叶酸、替莫唑胺、吉西他滨、紫杉醇、卡培他滨和5-FU中的一种或多种。
55.权利要求38的用途，其中所述疾病是成胶质细胞瘤和/或所述药物进一步包含替莫唑胺。
56.权利要求38的用途，其中所述疾病是胰腺癌和/或所述药物进一步包含吉西他滨。
57.权利要求38的用途，其中所述疾病是乳腺癌和/或所述药物进一步包含紫杉醇。
58.权利要求38的用途，其中所述药物进一步包含：
一种或多种氨基酸，
一种或多种多糖和/或聚山梨醇酯，和
浓度为0.1-100 mg/ml的结合蛋白，
其中所述药物组合物pH为 5.0-7.0。
59.权利要求58的用途，其中所述一种或多种氨基酸包含组氨酸并且以10-20 mM的浓度存在。
60.权利要求58的用途，其中所述一种或多种多糖包含蔗糖并且以0-8.0% 重量/体积(w/v)的浓度存在。
61.权利要求58的用途，其中所述聚山梨醇酯是聚山梨醇酯80并且浓度为0-0.06% w/v。
62.权利要求58的用途，其中所述一种或多种氨基酸包含精氨酸并且以0-1.5% w/v的浓度存在。
63.权利要求58的用途，其中所述结合蛋白以0.1- 25 mg/ml的浓度存在。
64.权利要求58的用途，其中所述组合物包含15 mM组氨酸、0.03% w/v聚山梨醇酯80、4% w/v蔗糖和1-25 mg/ml所述结合蛋白且pH为6。
65.至少一种结合蛋白在制备用于通过免疫测定检测VEGF或DLL4中的至少一种或其片段在测试样品中的存在的方法中的试剂盒中的用途，
其中所述免疫测定包括使所述测试样品与所述至少一种结合蛋白和至少一种可检测标记接触，其中所述至少一种结合蛋白是权利要求1的结合蛋白。
66.权利要求65的用途，其中所述至少一种可检测标记是放射标记、酶、发光标记、磁性标记或生物素。
67.权利要求65的用途，其中所述至少一种可检测标记是荧光标记。
68.权利要求65的用途，其中所述至少一种可检测标记是生物发光标记。
69.权利要求65的用途，其中所述至少一种可检测标记在所述至少一种结合蛋白上。
70.权利要求65的用途，其进一步包括：
(i)使所述测试样品与所述至少一种结合蛋白接触，其中所述结合蛋白结合至所述测试样品中VEGF或DLL4或其片段上的表位以形成第一复合物；
(ii)使所述第一复合物与至少一种可检测标记接触以形成第二复合物，其中所述可检测标记结合至所述结合蛋白或结合至所述测试样品中VEGF或DLL4或其片段上未由所述结合蛋白结合的表位；和
(iii)基于由所述第二复合物中的可检测标记产生的信号检测所述测试样品中VEGF或DLL4或其片段的存在，其中所述VEGF或DLL4或其片段的存在与由所述可检测标记产生的信号直接相关。
71.权利要求65的用途，其中所述测试样品来自患者，且所述方法进一步包括诊断、预测或评估所述患者的治疗性或预防性治疗的效能，且
其中如果所述方法进一步包括评估所述患者的治疗性或预防性治疗的效能，则所述方法任选地进一步包括视需要修改所述患者的治疗性或预防性治疗以改进效能。
72.权利要求65的用途，其中所述方法适合用于自动化系统或半自动化系统。
73.权利要求65的用途，其中所述方法测定DLL4和VEGF在样品中的浓度。
74.权利要求65的用途，其中所述方法测定DLL4和VEGF在样品中的量。
75.一种试剂盒，其用于测定测试样品的DLL4、VEGF或二者的存在或浓度，所述试剂盒包含
(a)用于测定所述测试样品的VEGF和/或DLL4或其片段的说明书；和
(b)至少一种结合蛋白，其是权利要求1的结合蛋白。
76.一种试剂盒，其用于测定测试样品的DLL4、VEGF或二者的量，所述试剂盒包含
(a)用于测定所述测试样品的VEGF和/或DLL4或其片段的说明书；和
(b)至少一种结合蛋白，其是权利要求1的结合蛋白。
77.权利要求29的药物组合物，其进一步包含：
一种或多种氨基酸，
一种或多种多糖和/或聚山梨醇酯，和
结合蛋白，其浓度为0.1-100 mg/ml，
其中所述药物组合物在5.0-7.0的pH。
78.权利要求77的药物组合物，其中所述一种或多种氨基酸包括组氨酸且以10-20 mM的浓度存在。
79.权利要求77的药物组合物，其中所述一种或多种多糖包括蔗糖且以0-8.0%重量/体积(w/v)的浓度存在。
80.权利要求77的药物组合物，其中所述聚山梨醇酯是聚山梨醇酯80且浓度为0-0.06%w/v。
81.权利要求77的药物组合物，其中所述一种或多种氨基酸包括精氨酸且以0-1.5% w/v的浓度存在。
82.权利要求77的药物组合物，其中所述结合蛋白以0.1-25 mg/ml的浓度存在。
83.权利要求77的药物组合物，其中所述组合物包含15 mM组氨酸、0.03% w/v 聚山梨醇酯80、4% w/v蔗糖和1-25 mg/ml的所述结合蛋白，并且pH是6。
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