CZ303725B6

Patents

Full documents

Title

Abstract

Claims

All

Any

Exact

Not

Add AND condition

These CPCs and their children

These exact CPCs

Add AND condition

Exact

Exact Batch

Similar

Substructure

Substructure (SMARTS)

Full documents

Claims only

Add AND condition

Application Numbers

Publication Numbers

Either

Add AND condition

Lidské protilátky, které se vází na lidský IL-12 a zpusoby jejich produkce

Abstract

Popisují se lidské protilátky, prednostne rekombinantní lidské protilátky, které se specificky vází na lidský interleukin-12 (hIL-12). Preferované protilátky mají vysokou afinitu pro IL-12 a neutralizují aktivitu hIL-12 in vitro a in vivo. Protilátkou muze být protilátka plné délky nebo její cást vázající se na antigen. Popsané protilátky nebo jejich cásti jsou pouzitelné pro detekci hIL-12 a pro inhibici aktivity hIL-12, napríklad u lidského subjektu trpícího poruchou, pri které je aktivita hIL-12 skodlivá. Také se popisují nukleové kyseliny, vektory a hostitelské bunky exprimující uvedené rekombinantní lidské protilátky a zpusoby syntézy rekombinantních lidských protilátek.

Classifications

C07K16/00

Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies

View 52 more classifications

Landscapes

Health & Medical Sciences

Chemical & Material Sciences

CZ303725B6

Czechia

Download PDF

Find Prior Art

Similar

2000

2001

2007

2010

2011

2012

2013

2014

First worldwide family litigation filed

2000-03-24

Application filed by Abbott Gmbh & Co. Kg

2002-08-14

Publication of CZ20013434A3

2013-04-03

Publication of CZ303725B6

Info: Patent citations (24); Non-patent citations (2); Cited by (166); Legal events; Similar documents; Priority and Related Applications
External links: Espacenet; Global Dossier; Discuss

Description

(57) Anotace:

Popisují se lidské protilátky, přednostně rekombinantní lidské protilátky, které se specificky váží na lidský interleukin-12 (hIL-12). Preferované protilátky mají vysokou afinitu pro IL12 a neutralizují aktivitu hIL-12 in vitro a in vivo. Protilátkou může být protilátka plné délky nebo její část vázající se na škodlivá Také se popisují nukleové kyseliny, vektory a hostitelské buňky exprimující uvedené rekombinantní lidské protilátky a způsoby syntézy rekombinantních lidských protilátek.

Lidské protilátky, které se váží na lidský ÍL-12 a způsoby jejich produkce

Oblast techniky

Vynález se týká lidských protilátek neutralizujících aktivitu lidského interleukinu 12.

Dosavadní stav techniky

Lidský interleukin 12 (IL-12) byl v poslední době charakterizován jako cytokin s výjimečnou strukturou a pleiotropickými účinky (popisuje se v publikaci Kobayashi, et al., (1989) J. Exp. Med. 170: 827 až 845, Seder, et al., (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. 90: 10188 až 10192, Ling, et al., (1995) J. Exp. Med. 154: 116 až 127, Podlaski, et al., (1992) Arch. Biochem. Biophys, 294: 230 až 237). IL-12 má důležitou úlohu v patologii vážných onemocnění, které zahrnují imunitní a zánětlivé odezvy. Shrnutí skutečnosti o IL-12, o jeho biologických aktivitách a o jeho úloze při onemocnění se nachází v publikaci Gately et al., (1998), Ann. Rev. lmmunol. 16: 495 až 521.

Strukturou je IL-12 heterodimerový protein obsahující podjednotku o molekulové hmotnosti 35 000 (p35) a podjednotku o molekulové hmotnosti 40 000 (p40), které jsou spojeny dohromady disulfidovým můstkem (označeno jako „podjednotka p70“). Heterodimerový protein se primárně produkoval buňkami prezentujícími antigen, jako jsou monocyty, makrofágy a dendritické buňky. Tyto typy buněk také vylučují ve vztahu k podjednotce p70 nadbytek podjednotky p40. Podjednotky p40 a p35 nejsou geneticky příbuzné a ani nevykazují biologickou aktivitu, ačkoli homodimer p40 může fungovat jako antagonista IL—12.

Funkčně IL-12 hraje centrální roli při regulaci rovnováhy mezi antigen specifickými pomocnými T buňkami typu 1 (Thl) a typu 2 (Th2). Buňky Thl a Th2 řídí iniciaci a progresi autoimunitních poruch a IL-12 má kritickou úlohu při regulaci diferenciace a maturace lymfocytů Th[. Cytokiny uvolněné buňkami Thl jsou zánětlivé a zahrnují interferon y(IFNy), IL-2 a lymfotoxin (LT). Buňky Th2 vylučují IL—4, IL—5, IL-6, IL-10 a IL-13, aby napomáhaly humorální imunitě, alergickým reakcím a imunosupresi.

V souladu s převahou odezev Thl u autoimunních onemocnění a prozánětlivých aktivit IFNy, IL-12 může hrát důležitou úlohu při patologii spojené s řadou autoimunních a zánětlivých onemocnění, jako je revmatická artritida (RA), roztroušená skleróza (MS) a Crohnova nemoc.

Lidští pacienti trpící MS vykazovali zvýšenou expresi IL-12, což se dokumentovalo množstvím mRNA podjednotky p40 v plakách při akutní MS (popisuje se v publikaci Windhagen et al., (1995), J. Exp. Med. 182: 1985 až 1996). Navíc stimulace ex vivo buněk prezentujících antigen buňkami T, které exprimují CD40-L a které se získaly od pacientů s MS, vede ke zvýšení produkce IL-12 ve srovnání s kontrolními buňkami T, cožje v souladu s pozorováním, že interakce CD40/CD40L je silné indukční činidlo IL-12.

V kloubním mazu pacientů s RA ve srovnání se zdravými kontrolními pacienty bylo detekováno zvýšené množství IL—12p70 (popisuje se v publikaci Morita et al., (1998) Arthritis and Rheumatism. 41: 306 až 314). Profil exprese informační ribonukleové kyseliny (mRNA) cytokinů v kloubím mazu při onemocnění RA identifikoval převážně cytokiny Thl (popisuje se v publikaci Bucht et al., (1996) Clin. Exp. lmmunol. 103: 347 až 367). Také se zdá, že IL-12 hraje rozhodující úlohu v patologii Crohnovy nemoci (CD). Ve střevní sliznici pacientů s tímto onemocněním byla pozorována zvýšená exprese INFy a IL-12 (popisuje se v publikaci Fais et al., (1994) J. Interferon Res. 14: 235 až 238, Parronchi et al., (1997) Am. J. Path. 150: 823 až 832, Monteleone et al., (1997) Gastroenterology. 112: 1169 až 1178 a Berrebi et al., (1998) Am. J. Path 152: 667 až 672). Profil vylučování cytokinů buňkami T slizničního vaziva pacientů s CD je charakteristický převládající odezvou Thl, což zahrnuje značně zvýšené množství IFNv řnonisuie se v mihliCZ 303725 B6 kaci Fuss, et al., (1996) J. Immunol. 157: 1261 až 1270). Avšak sekce tkáně tlustého střeva u pacientů s CD vykazuje velké množství makrofágů exprimujících IL—12 a buněk T exprimujících IFNy (popisuje se v publikaci Parronchi et al., (1997) Am. J. Path. 150: 823 až 832).

Na základě úlohy lidského IL-12 při různých lidských poruchách, byly navrženy terapeutické strategie tak, aby se inhibovala a neutralizovala aktivita IL-12. Zvláště protilátky, které se váží na IL-12, a tak ho neutralizují, se považují za prostředek inhibující aktivitu IL—12. Některé z nejčastějších protilátek byly myší monoklonální protilátky (mAb) vylučované hybridomy připravenými z lymfocytů myší imunizovaných 1L-12 (popisuje se například v přihlášce patentu WO 97/15327 (Strober et al., v publikaci Neurath et al., (1995) J. Exp. Med. 182: 1281 až 1290, Duchmann et al., (1996) J. Immunol. 26: 934 až 938). Použití těchto myších protilátek proti IL12 in vivo je omezeno problémy spojenými s aplikací myších protilátek lidem. Tyto problémy zahrnují krátký poločas v séru, neschopnost spustit jisté lidské efektorové funkce a vyvolání nežádoucí imunitní odezvy proti myším protilátkám u lidí (reakce „lidských anti-myších“ protilátek“ (HAMA)).

V obecném případě úsilí o překonání uvedených problémů spojených s použitím zcela myších protilátek u lidí zahrnuje genetickou manipulaci protilátek, aby byly pro člověka lépe přijatelné. Například se připravily chimérové protilátky, kde se variabilní oblasti řetězců protilátek získaly z myší a konstantní oblasti řetězců protilátek se získaly z lidí (Junghans et al., (1990) Cancer Res. 50: 1495 až 1502, Brown et al., (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. 88: 2663 až 667, Kettleborough et al., (1991) Protein Engineering 4: 773 až 783). Avšak protože tyto chimérické a humanizované protilátky si stále ponechávají některé myší sekvence, mohou stále vyvolat nežádoucí imunní reakci, což je reakce člověka proti chimérickým protilátkám (HAC A), zvláště, když se protilátky aplikují dlouhodobě.

Výhodným činidlem inhibujícím IL—12 v případě myších protilátek nebo jejich derivátů (například chimérické a humanizované protilátky) budou zcela lidské anti—IL—12 protilátky, protože takové činidlo by nemělo vyvolat reakci HAMA, dokonce, když se používá dlouhodobě. Takové protilátky však nebyly zatím v dosavadním stavu techniky popsány a proto je stále potřeba je vytvořit.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje lidské protilátky, které vážou lidský IL-12. Vynález dále popisuje léčbu nebo prevenci akutních nebo chronických onemocnění nebo stavů, jejichž patologie zahrnuje IL—12, použitím lidských protilátek proti IL-12 podle vynálezu.

Podle jednoho aspektu vynález poskytuje izolovanou lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen, které se váže na lidský IL-12 a disociuje z lidského IL-12 s hodnotou rychlostní konstanty k_off 1 x I O ⁴ s ¹ nebo nižší, stanovenou povrchovou plasmovou rezonancí, přičemž uvedená protilátka nebo její část vázající se na antigen vykazuje a) CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 9, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 11 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 13; a b) CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 10, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 12 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 14.

Izolovaná lidská protilátka neutralizuje aktivitu lidského IL-12. Jedním aspektem předloženého řešení je, že poskytuje rekombinantní protilátku nebo její část vázající se na antigen.

Též poskytuje lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen, selektivně mutovanou ve výhodné poloze selektivní mutageneze aminokyselinovým zbytkem, který zvyšuje aktivitu tak, že se váže na lidský IL-12.

Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, se váže na lidský IL—12 a disociuje z lidského IL—12 s rychlostní konstantou K_off0J s”¹ nebo nižší, jak se stanovilo povrchovou plazmonovou rezonancí, nebo která inhibuje proliferace fytohemaglutininových blastů v in vitro testu proliferace fytohemaglutininových blastů (test PHA), přičemž hodnota IC5o je 1 x 10 ⁶M nebo nižší. Výhodněji izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen disociuje z lidského IL—12 s rychlostní konstantou Kofí· 1 x 10”² s ¹ nebo nižší nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA, přičemž hodnota IC50 je 1 x 10”⁷M nebo nižší. Výhodnější je, když izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen disociuje z lidského IL—12 s rychlostní konstantou Koff 1 x 10 ³ s ¹ nebo nižší nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů vin vitro testu PHA s hodnotou IC50 1 x 10 ⁸M nebo nižší. Výhodněji izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen disociuje z lidského IL—12 s rychlostní konstantou Koff 1 x 10”⁴ s ¹ nebo nižší nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA s hodnotou IC50 1 x 10⁹M nebo nižší. Výhodněji izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen disociuje z lidského IL—12 s rychlostní konstantou Koff 1 x 10⁵ s”¹ nebo nižší nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA s hodnotou IC50 1 x 10”^l0M nebo nižší. Ještě výhodněji izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen disociuje z lidského IL—12 s rychlostní konstantou Koff 1 x 10 ⁵ s ¹ nebo nižší nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA s hodnotou 1C_5O 1 x 10^_llM nebo nižší.

V dalším provedení vynález poskytuje izolovanou lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen, která má následující charakteristiky:

a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA, přičemž hodnota lC₅o je 1 x 10 ^ňM nebo nižší,

b) vykazuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1 a

c) vykazuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2.

V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 3 a vykazuje CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 4. V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 5 a vykazuje CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 6. V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 7 a vykazuje variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 8.

V jiném provedení vynález poskytuje izolovanou lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen, která má následující charakteristiky:

a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA, přičemž hodnota IC₅o je 1 x ΙΟ⁹ M nebo nižší,

b) vykazuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 9 a

c) vykazuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 10.

V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 11 a vykazuje CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 12. V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 13 a vykazuje CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 14. V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 15 a vykazuje variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 16.

V jiném provedení vynálezu se popisuje izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která má následující charakteristiky:

a) ínhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA, přičemž hodnota IC₅₀ je 1 x 10 ⁹M nebo nižší,

b) vykazuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 17 a

c) vykazuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 18.

V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje CRD2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 19 a vykazuje CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 20. V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje CDRl těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 21 a vykazuje CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 22. V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 23 a vykazuje variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 24. V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka obsahuje konstantní oblasti IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA a IgE nebo jejich libovolné alelové varianty, jak je popisuje v publikaci Kabat, E. A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, N1H Publication No. 91-3242). Ve výhodnějším provedení vynálezu konstantní oblast těžkého řetězce protilátek je IgGl. V jiném preferovaném provedení vynálezu izolovanou lidskou protilátkou je fragment Fab nebo fragment Ffybfy nebo fragment jediného řetězce Fv.

V jiném provedení vynálezu se popisuje izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která

a) ínhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA, přičemž hodnota IC50 je 1 x 10“⁹M nebo nižší,

b) vykazuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 415, 416, 419, 420,427, 432,439 až 441,443, 445, 447, 448, 457 až 459, 461, 462, 464, 468 a 469 nebo

c) vykazuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z SEQ ID NO: 534, 536, 547 až 563, 566 až 570, 572, 575 a 579.

V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje CRD2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 337, 342, 344, 350, 354, 358 až 360, 367, 377, 381, 384 až 395 a 397 a vykazuje CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 509 až 510, 514 až 517 a 529. V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje CDRl těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 228 až 310, 314 až 315, 326, 328 až 330 a vykazuje CDRl lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 470 až 472,475 až 477, 485, 489 až 491, 494 až 496 a 500. V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 23 a vykazuje variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 24. V preferovaném provedení izolovaná lidská protilátka obsahuje konstantní oblast těžkého řetězce nebo fragment Fab nebo fragment F(ab')₂ nebo fragment jediného řetězce Fv, jak se popisuje shora v textu.

a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA, přičemž hodnota IC₅₀ je 1 x 10 ⁹M nebo nižší,

b) vykazuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 25 a

c) vykazuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 26.

V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje CRD2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 27 a vykazuje CDR 2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 28. V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 29 a vykazuje CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 30. V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající antigen vykazuje variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 31 a vykazuje variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 32. V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka obsahuje konstantní oblast těžkého řetězce nebo fragment Fab nebo fragment F(ab')₂ nebo fragment jediného řetězce Fv, jak se popisuje shora v textu.

V dalším provedení vynález poskytuje izolovanou lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen, která

b) obsahuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 3 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 5 nebo jejich mutant, který obsahuje jednu nebo více substitucí aminokyselin v kontaktní poloze nebo v hypermutační poloze, kde hodnota rychlostní konstanty k_off uvedeného mutantu není vyšší než je desetinásobek hodnoty pro protilátku obsahující CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 3 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 5 a

c) obsahuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 4 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 6 nebo jejich mutant, který obsahuje jednu nebo více substitucí aminokyselin v kontaktní poloze nebo v hypermutační poloze, kde hodnota rychlostní konstanty k_off uvedeného mutantu není vyšší než je desetinásobek hodnoty pro protilátku obsahující CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 4 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 6.

V jiném provedení vynález poskytuje izolovanou lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen, která

b) obsahuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 9, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 11 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 13 nebo jejich mutant, který obsahuje jednu nebo více substitucí aminokyselin v kontaktní poloze nebo v hypermutační poloze, kde hodnota rychlostní konstanty k_Off uvedeného mutantu není vyšší než je desetinásobek hodnoty pro protilátku obsahující CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 9, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 11 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 13 a

c) obsahuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 10, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 12 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 14 nebo jejich mutant, který obsahuje jednu nebo více substitucí aminokyselin v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní poloze nebo v hypermutační poloze, kde hodnota rychlostní konstanty k_off uvedeného mutantu není vyšší než je desetinásobek hodnoty pro protilátku obsahující CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 10, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 12 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 14.

a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA, přičemž hodnota IC₅o je 1 x 10 ⁹M nebo nižší,

b) obsahuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 17, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 19 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 21 nebo jejich mutant, který obsahuje jednu nebo více substitucí aminokyselin v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní poloze nebo v hypermutační poloze, kde hodnota rychlostní konstanty k_off uvedeného mutantu není vyšší než je desetinásobek hodnoty pro protilátku obsahující CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 17, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 19 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 21 a

c) obsahuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 18, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 20 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 22 nebo jejich mutant, který obsahuje jednu nebo více substitucí aminokyselin v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní poloze nebo v hypermutační poloze, kde hodnota rychlostní konstanty k_off uvedeného mutantu není vyšší než je desetinásobek hodnoty pro protilátku obsahující CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 18, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 20 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 22.

Vynález také popisuje molekuly nukleových kyselin kódující protilátky nebo jejich části vázající se na antigen. Výhodná izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 17. Izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilní oblast těžkého řetězce protilátky. V jiném provedení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR2 variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 19. V jiném provedení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR1 variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 21.

V jiném provedení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilní oblast těžkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 23. V jiném provedení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 18. Izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilní oblast lehkého řetězce protilátky. V jiném provedení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR2 variabilní oblasti lehkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 20. V jiném provedení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR1 variabilní oblasti lehkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 22. V jiném provedení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilní oblast lehkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 24.

a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA, přičemž hodnota IC₅₀ je 1 x 10⁹M nebo nižší,

b) obsahuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 25, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 27 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 29 nebo jejich mutant, který obsahuje jednu nebo více substitucí aminokyselin v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní poloze nebo v hypermutační poloze, kde hodnota rychlostní konstanty k<,ff uvedeného mutantu není vyšší než je desetinásobek hodnoty pro protilátku obsahující CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 25, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 27 a CDR1 těžkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 29 a

c) obsahuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 26, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 28 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 30 nebo jejich mutant, který obsahuje jednu nebo více substitucí aminokyselin v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní poloze nebo v hypermutační poloze, kde hodnota rychlostní konstanty k_off uvedeného mutantu není vyšší než je desetinásobek hodnoty pro protilátku obsahující CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 26, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 28 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 30.

Výhodná izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 25. Izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilní oblast těžkého řetězce protilátky. V jiném provedení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR2 variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 27.

V jiném provedení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR1 variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 29. V jiném provedení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilní oblast těžkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 31. V jiném provedení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 26. Izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilní oblast lehkého řetězce protilátky. V jiném provedení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR2 variabilní oblasti lehkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 28. V jiném provedení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR1 variabilní oblasti lehkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 30. V jiném provedení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilní oblast lehkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 32.

V jiném aspektu vynález poskytuje izolovanou lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen, která má následující charakteristiky:

a) váže se na lidský IL—12 a disociuje z lidského IL—12, přičemž rychlostní konstanta má hodnotu 0,1 s ¹ nebo nižší, jak se stanovilo povrchovou plazmonovou rezonancí, nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu proliferace fytohemaglutininových blastů (test PHA), přičemž hodnota IC₅o je 1 x 10 ⁹M nebo nižší,

b) vykazuje variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou z člena embryonální rodiny V_H3, kde variabilní oblast těžkého řetězce vykazuje v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní nebo hypermutační poloze mutaci aminokyselinovým zbytkem, který zvyšuje aktivitu.

c) vykazuje variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou z člena embryonální rodiny VJ, kde variabilní oblast lehkého řetězce vykazuje v preferovaCZ 303725 B6 né poloze selektivní mutageneze, v kontaktní nebo hypermutační poloze mutaci aminokyselinovým zbytkem, který zvyšuje aktivitu.

a) váže se na lidský 1L-12 a disociuje z lidského IL-12, přičemž rychlostní konstanta má hodnotu 0,1 s ¹ nebo nižší, jak se stanovilo povrchovou plazmonovou rezonancí, nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu proliferace fytohemaglutininových blastů (test PHA), přičemž hodnota IC₅₀ je 1 x 10 ⁶M nebo nižší,

b) vykazuje variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 595 až 667, kde variabilní oblast těžkého řetězce vykazuje v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní nebo hypermutační poloze mutaci aminokyselinovým zbytkem, který zvyšuje aktivitu.

c) vykazuje variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 669 až 675, kde variabilní oblast lehkého řetězce vykazuje v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní nebo hypermutační poloze mutaci aminokyselinovým zbytkem, který zvyšuje aktivitu.

Dále vynález popisuje izolovanou lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen, která má následující charakteristiky:

a) váže se na lidský IL-12 a disociuje z lidského IL—12, přičemž rychlostní konstanta má hodnotu 0,1 s ¹ nebo nižší, jak se stanovilo povrchovou plazmonovou rezonancí, nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu proliferace fytohemaglutininových blastů (test PHA), přičemž hodnota IC₅₀ je 1 x 10 ⁶M nebo nižší,

b) vykazuje variabilní oblast těžkého řetězce obsahující embryonální aminokyselinovou sekvenci COS3, kde variabilní oblast těžkého řetězce vykazuje v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní nebo hypermutační poloze mutaci aminokyselinovým zbytkem, který zvyšuje aktivitu,

c) vykazuje variabilní oblast lehkého řetězce obsahující embryonální aminokyselinovou sekvenci DPL8, kde variabilní oblast lehkého řetězce vykazuje v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní nebo hypermutační poloze mutaci aminokyselinovým zbytkem, který zvyšuje aktivitu.

Dále vynález poskytuje izolovanou lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen, která má následující charakteristiky:

a) váže se na lidský IL-12 a disociuje z lidského 1L-12, přičemž rychlostní konstanta má hodnotu 0,1 s¹ nebo nižší, jak se stanovilo povrchovou plazmonovou rezonancí, nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu proliferace fytohemaglutininových blastů (test PHA), přičemž hodnota IC₅₀ je 1 x 10 ⁶M nebo nižší,

b) vykazuje variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou z člena embryonální rodiny V_H3, kde variabilní oblast těžkého řetězce obsahuje CDR2, která je strukturou podobná CDR2 zjiných členů embryonální rodiny V_H3, a CDR1, která je strukturou podobná CDR1 zjiných členů embryonální rodiny V_H3, a kde variabilní oblast těžkého řetězce vykazuje v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní nebo hypermutační poloze mutaci aminokyselinovým zbytkem, který zvyšuje aktivitu.

c) vykazuje variabilní oblast lehkého řetězce obsahující embryonální aminokyselinovou sekvenci vybranou z člena embryonální rodiny VJ, kde variabilní oblast lehkého řetězce obsahuje CDR2, která je strukturou podobná CDR2 zjiných členů embryonální rodiny VJ, a CDR1, která je strukturou podobná CDR1 zjiných členů embryonální rodiny VJ, a kde variabilní oblast lehkého řetězce vykazuje v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní nebo hypermutační poloze mutaci aminokyselinovým zbytkem, který zvyšuje aktivitu.

Ve výhodném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen vykazuje mutaci vCDR3 těžkého řetězce. V jiném výhodném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen vykazuje mutaci v CDR3 lehkého řetězce. Vjíném výhodném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen vykazuje mutaci v CDR2 těžkého řetězce. V jiném výhodném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen vykazuje mutaci v CDR2 lehkého řetězce. V jiném výhodném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen vykazuje mutaci v CDR1 těžkého řetězce. V jiném výhodném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen vykazuje mutaci v CDR1 lehkého řetězce.

V dalším aspektu vynález poskytuje rekombinantní expresívní vektory nesoucí nukleové kyseliny kódující protilátku podle vynálezu a dále zahrnuje hostitelské buňky, do kterých byly takové vektory zavedeny, a způsoby přípravy protilátek podle vynálezu kultivací hostitelských buněk podle vynálezu.

V dalším aspektu vynález poskytuje izolovanou lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen, která neutralizuje aktivitu lidského IL—12 a alespoň jednoho dalšího IL—12 primátů vybraného ze skupiny zahrnující IL—12 paviána, IL—12 kosmana, IL—12 šimpanze, IL—12 cynomolga, a IL—12 makaka, ale která neneutralizuje aktivitu myšího IL—12.

V dalším aspektu vynález poskytuje farmaceutický prostředek obsahující protilátku nebo její část vázající se na antigen podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič.

V dalším aspektu vynález poskytuje prostředek obsahující protilátku nebo její část vázající se na antigen a další činidlo, například terapeutické činidlo.

V dalším aspektu vynález poskytuje způsob inhibující aktivitu lidského IL—12, který zahrnuje kontakt lidského IL—12 s protilátkou podle vynálezu, například J695, tak, že je inhíbována aktivita IL—12.

Dále vynález poskytuje způsob inhibující aktivitu lidského IL—12 v lidském subjektu, který trpí poruchou, při které je aktivita IL—12 škodlivá, a zahrnuje aplikaci protilátky podle vynálezu, například J695, lidskému subjektu tak, že se v lidském subjektu inhibuje aktivita IL—12. Poruchou může například být Crohnova choroba, roztroušená skleróza nebo revmatoidní artritida.

Dále vynález popisuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající antigen, aby se dosáhlo předem stanovené cílové aktivity, který zahrnuje:

a) poskytnutí výchozí protilátky nebo její část vázající se na antigen

b) výběr preferované polohy selektivní mutageneze vybrané ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94,

c) individuální mutace vybrané preferované polohy selektivní mutageneze na alespoň dva odlišné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká první skupina mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,

d) hodnocení aktivity první skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, aby se stanovilo, zda mutace jednotlivé polohy selektivní mutageneze produkuje protilátku nebo její část vázající se na antigen s předem stanovenou cílovou aktivitou nebo částečnou cílovou aktivitou,

e) postupně kombinování jednotlivých mutací, které demonstrovaly, že mají zlepšenou aktivitu, ve výchozí protilátce nebo v její Části vázající se na antigen, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,

f) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich části vázající se na antigen, aby se stanovilo, zda kombinační protilátky nebo jejich části vázající se na antigen mají předem stanovenou cílovou aktivitu nebo částečnou cílovou aktivitu,

g) jestliže výsledkem kroku popsaného v odstavci d) nebo f) není protilátka nebo její část vázající se na antigen s předem stanovenou cílovou aktivitou nebo protilátka pouze s částečnou cílovou aktivitou, další aminokyselinové zbytky vybrané ze skupiny zahrnující H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A a L96 se mutují alespoň ve dvou odlišných aminokyselinových zbytcích, čímž vzniká druhá skupina mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,

h) hodnocení aktivity druhé skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, aby se stanovilo, zda mutace jediného aminokyselinového zbytku vybraného ze skupiny zahrnující H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A a L96 vede ke vzniku protilátky nebo její části vázající se na antigen s předem stanovenou cílovou aktivitou nebo částečnou cílovou aktivitou,

i) postupné kombinování jednotlivých mutací popsaných v odstavci g), které demonstrovaly zlepšenou aktivitu, ve výchozí protilátce nebo v její části vázající se na antigen, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,

j) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich části vázající se na antigen, aby se stanovilo, zda kombinační protilátky nebo jejich části vázající se na antigen mají předem stanovenou cílovou aktivitu nebo částečnou cílovou aktivitu,

k) jestliže výsledkem kroku popsaného v odstavci h) neboj) není protilátka nebo její část vázající se na antigen s předem stanovenou cílovou aktivitou nebo protilátka pouze s částečnou cílovou aktivitou, další aminokyselinové zbytky vybrané ze skupiny zahrnující H33B, H52B a L31A se mutují alespoň ve dvou odlišných aminokyselinových zbytcích, čímž vzniká třetí skupina mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,

l) hodnocení aktivity třetí skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, aby se stanovilo, zda mutace jediného aminokyselinového zbytku vybraného ze skupiny zahrnující H33B, H52B a L31A vedla ke vzniku protilátky nebo její části vázající se na antigen s předem stanovenou cílovou aktivitou nebo částečnou cílovou aktivitou,

m) postupné kombinování jednotlivých mutací popsaných v kroku k), které demonstrovaly zlepšenou aktivitu, ve výchozí protilátce nebo v její části vázající se na antigen, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejích částí vázajících se na antigen,

n) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázající se na antigen, aby se stanovilo, zda kombinační protilátky nebo jejich části vázající se na antigen mají předem stanovenou cílovou aktivitu, čímž se produkuje protilátka nebo její část vázající se na antigen s předem stanovenou cílovou aktivitou.

V dalším aspektu vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její část vázající se na antigen, který zahrnuje:

a) poskytnutí výchozí protilátky nebo její části vázající antigen,

b) výběr preferované polohy selektivní mutageneze kontaktní nebo hypermutační polohy v oblasti určující komplementaritu (CDR) mutace, čímž se identifikuje vybraná preferovaná poloha selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační poloha,

c) individuální mutace uvedené vybrané preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy na alespoň dva odlišné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká první skupina mutovaných protilátek nebo jejích částí vázajících se na antigen,

d) hodnocení aktivity skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen,

e) opakování kroků b) až d) v případě alespoň jedné další kontaktní a hypermutační polohy,

f) postupné kombinování jednotlivých mutací, které demonstrovaly, že mají zlepšenou aktivitu, ve výchozí protilátce nebo v její části vázající se na antigen, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a

g) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich části vázající se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo kjejí části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou vzhledem k výchozí protilátce.

Vjednom provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo části vázající se na antigen, který zahrnuje:

a) poskytnutí rekombinantní výchozí protilátky nebo její části vázající se na antigen, která se získala selekcí v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita není dále zlepšována mutagenezí v uvedeném systému fágového zobrazení,

b) výběr preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci, čímž se identifikuje vybraná konstantní nebo hypermutační poloha,

V preferovaném provedení jsou kontaktní polohy vybrány ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96. V jiném výhodném provedení vynálezu se hypermutační polohy vybraly ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93. Ve výhodnějším provedení vynálezu jsou zbytky pro selektivní mutagenezí vybrány z výhodných poloh selektivní mutageneze ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94. Ve více preferovaném provedení vynálezu jsou kontaktní polohy vybrány ze skupiny zahrnující L50 a L94.

Vjednom provedení vynálezu se popisuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen, který zahrnuje:

a) poskytnutí rekombinantní výchozí protilátky nebo její části vázající se na antigen,

d) hodnocení aktivity skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,

e) hodnocení alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky u skupiny mutovaných protilátek nebo jejích částí vázajících se na antigen, kde vlastnost nebo charakteristika je ta, kterou je nutné u protilátky zachovat, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou a alespoň jednou zachovanou vlastností nebo charakteristikou ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen.

V preferovaném provedení jsou kontaktní polohy vybrány ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonální imunoglobulinu.

V jiném provedení vynálezu jsou hypermutační polohy vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93 a další charakteristika se vybrala z 1) zachování nezkřížené reaktivity sjinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonální imunoglobulinu. Ve výhodnějším provedení vynálezu jsou zbytky pro selektivní mutagenezi vybrány z výhodných poloh selektivní mutageneze ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 a další charakteristika se vybrala z 1) zachování nezkřížené reaktivity sjinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonální imunoglobulinu. Ve výhodnějším provedení vynálezu jsou kontaktní polohy vybrány ze skupiny L50 a L94 a další charakteristika se vybrala z 1) ochrana proti zkřížené reaktivitě sjinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonální imunoglobulinu.

V jiném provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo části vázající se na antigen, který zahrnuje:

a) poskytnutí rekombinantní výchozí protilátky nebo její části vázající se na antigen, která se získala selekcí v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita nemůže být dále zlepšována mutagenezí v uvedeném systému fágového zobrazení,

b) výběr preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci, čímž se identifikuje vybraná výhodná poloha selektivní mutageneze, konstantní nebo hypermutační poloha,

e) hodnocení alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky u skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen, kde vlastnost nebo charakteristika je ta, kterou je nutné zachovat, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou a alespoň jednou zachovanou vlastností nebo charakteristikou ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen,

f) opakování kroků a) až e) v případě alespoň jedné další výhodné polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy,

g) kombinování ve výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen alespoň dvou aminokyselinových zbytků, které individuálně zvyšují aktivitu a které ukázaly, že mají zlepšenou aktivitu a alespoň jednu Zachovalou vlastnost nebo charakteristiku, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a

h) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou vztaženo k výchozí protilátce.

V preferovaném provedení jsou kontaktní polohy vybrány ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity sjinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epítopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonální imunoglobulinu.

V jiném provedení vynálezu jsou hypermutační polohy vybrány ze skupiny zahrnující 1430, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93 a další charakteristika se vybrala z 1) zachování nezkřížené reaktivity sjinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonální imunoglobulinu. Ve výhodnějším provedení vynálezu jsou zbytky pro selektivní mutagenezi vybrány z výhodných poloh selektivní mutageneze ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 a další charakteristika se vybrala z 1) zachování nezkřížené reaktivity sjinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonální imunoglobulinu. Ve výhodnějším provedení vynálezu jsou kontaktní polohy vybrány ze skupiny L50 a L94 a další charakteristika se vybrala z 1) zachování nezkřížené reaktivity sjinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.

b) výběr kontaktní nebo hypermutační polohy v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci, čímž se identifikuje vybraná konstantní nebo hypermutační poloha,

c) individuální mutace uvedené vybrané kontaktní nebo hypermutační polohy na alespoň dva odlišné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká první skupina mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese uvedené skupiny v systému nefágového zobrazení,

V preferovaném provedení vynálezu jsou kontaktní polohy vybrány ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonální imunoglobulinu.

V dalším výhodném provedení vynálezu jsou hypermutační polohy vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93 a další charakteristika se vybrala z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu. Ve výhodnějším provedení vynálezu jsou zbytky pro selektivní mutagenezi vybrány z výhodných poloh selektivní mutageneze ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu. Ve výhodnějším provedení vynálezu jsou kontaktní polohy vybrány ze skupiny obsahující L50 a L94 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonální imunoglobulinu.

V jiném provedení vynálezu se popisuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo části vázající se na antigen, který zahrnuje:

h) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo k její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která vykazuje zlepšenou aktivitu ve vztahu k výchozí protilátce.

V preferovaném provedení jsou kontaktní polohy vybrány ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity sjinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonální imunoglobulinu.

V jiném výhodném provedení vynálezu jsou hypermutační polohy vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93 a další charakteristika se vybrala z 1) zachování nezkřížené reaktivity sjinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu. Ve výhodnějším provedení vynálezu jsou zbytky pro selektivní mutagenezí vybrány z výhodných poloh selektivní mutageneze ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity sjinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu. Ve výhodnějším provedení vynálezu jsou kontaktní polohy vybrány ze skupiny obsahující L50 a L94 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity sjinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonální imunoglobulinu.

a) poskytnutí výchozí protilátky nebo její části vázající se na antigen,

b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci, v poloze jiné než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,

c) individuální mutace uvedené vybrané polohy na alespoň dva odlišné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká skupina mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,

e) hodnocení změn alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky u skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která vykazuje zlepšenou aktivitu a alespoň jednu zachovanou vlastnost nebo charakteristiku ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen.

Další vlastnost nebo charakteristika je výhodně vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodně v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinů.

V jiném provedení vynález poskytuj způsob zlepšení aktivity protilátky nebo části vázající se na antigen, který zahrnuje:

e) opakování kroků b) až d) pro alespoň jednu jinou polohu CDR, kterou není ani poloha vybraná v odstavci b) ani poloha H30, H31, H31 Β, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,

f) kombinování ve výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen alespoň dvou aminokyselinových zbytků, které individuálně zvyšují aktivitu a které ukázaly, že mají zlepšenou aktivitu, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a

g) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen s dvěma aminokyselinovými zbytky zesilujícími aktivitu ve vztahu k výchozí protilátce nebo k její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která vykazuje zlepšenou aktivitu ve vztahu k výchozí protilátce.

c) individuální mutace uvedené vybrané kontaktní nebo hypermutační polohy na alespoň dva odlišné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká skupina mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese uvedené skupiny v systému nefágového zobrazení,

e) hodnocení změn alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky u skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen vykazující zlepšenou aktivitu ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen.

Další vlastnost nebo charakteristika je s výhodou vybrána ze 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodně v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.

V jiném provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen, který zahrnuje:

a) poskytnutí výchozí protilátky nebo její části vázající se na antigen, která se získala selekcí v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita nemůže být dále zlepšována mutagenezí v uvedeném systému fágového zobrazení,

b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci, v polozejiné než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,

c) individuální mutace uvedené vybrané polohy alespoň dvou odlišných aminokyselinových zbytků, čímž vzniká skupina mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese uvedené skupiny v systému nefágového zobrazení,

e) opakování kroků b) až d) pro alespoň jednu jinou polohu CDR, kterou není ani poloha vybraná v odstavci b) ani poloha H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94,

Další vlastnost nebo charakteristika je s výhodou vybrána ze 1) zachování nezkřížené reaktivity sjinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.

b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci, v poloze jiné než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, Hl01, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,

f) opakování kroků b) až d) pro alespoň jednu jinou polohu CDR, kterou není ani poloha vybraná v odstavci b) ani poloha H30, H31, H31 Β, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,

g) kombinování ve výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen alespoň dvou aminokyselinových zbytků, které individuálně zvyšují aktivitu a které ukázaly, že mají zlepšenou aktivitu, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a

h) hodnocení aktivity a zachování alespoň jedné jiné charakteristiky nebo vlastnosti kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen s dvěma aminokyselinovými zbytky zesilujícími aktivitu ve vztahu k výchozí protilátce nebo k její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která vykazuje zlepšenou aktivitu a alespoň jednu zachovanou vlastnost nebo charakteristiku ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen.

V jiném provedení vynález poskytuje způsob zlepšení afinity protilátky nebo části vázající se na antigen, který zahrnuje:

a) poskytnutí výchozí protilátky nebo její části vázající se na antigen, která se získala výběrem v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita se nemůže dále zlepšovat mutagenezi v uvedeném systému fágového zobrazení,

c) individuální mutace uvedené vybrané polohy na alespoň dva odlišné aminokyselinové zbytky, čímž vzniká skupina mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese v systému nefágového zobrazení,

e) hodnocení změn alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky u skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka se zlepšenou aktivitou ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen.

V dalšími provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo části vázající se na antigen, který zahrnuje:

c) individuální mutace uvedené vybrané polohy alespoň dvou odlišných aminokyselinových zbytků, čímž vzniká skupina mutovaných protilátek nebo jejich Částí vázajících se na antigen,

f) opakování kroků b) až e) pro alespoň jednu jinou polohu CDR, kterou není ani poloha vybraná v odstavci b) ani poloha H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,

g) kombinování ve výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen alespoň dvou aminokyselinových zbytků, které individuálně zvyšují aktivitu a které ukázaly, že mají zlepšenou aktivitu, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen s alespoň jednou zachovanou vlastností nebo charakteristikou a

h) hodnocení aktivity a zachování alespoň jedné vlastnosti nebo charakteristiky kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen s dvěma aminokyselinovými zbytky zesilujícími aktivitu ve vztahu k výchozí protilátce nebo kjejí části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která vykazuje zlepšenou aktivitu a alespoň jednu zachovanou vlastnost nebo charakteristiku ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen.

Další vlastnosti nebo charakteristika je s výhodou vybrána ze 1) zachování nezkřížené reaktivity sjinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.

V jiném provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo částí vázající se na antigen bez ovlivnění jiných charakteristik, který zahrnuje:

e) hodnocení změn alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky u skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen vykazující zlepšenou aktivitu a zachovanou jinou charakteristiku nebo vlastnost ve vztahu k výchozí protilátce.

d) hodnocení aktivity a zachování alespoň jedné jiné charakteristiky nebo vlastnosti skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,

f) kombinování ve výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen alespoň dvou aminokyselinových zbytků, které individuálně zvyšují aktivitu a které ukázaly, že mají zlepšenou aktivitu a neovlivňují alespoň jednu jinou charakteristiku nebo vlastnost, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich Částí vázajících se na antigen a

g) hodnocení aktivity a zachování alespoň jedné jiné charakteristiky nebo vlastnosti kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen s dvěma aminokyselinovými zbytky zesilujícími aktivitu ve vztahu k výchozí protilátce nebo k její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její Část vázající se na antigen, která vykazuje zlepšenou aktivitu a alespoň jednu zachovanou vlastnost nebo charakteristiku ve vztahu k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen.

Další vlastnost nebo charakteristika je s výhodou vybrána 1) zachování nezkřížené reaktivity sjinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází ovlivnění navázání volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.

Aby vynález byl srozumitelnější, jsou nejprve definovány určité termíny.

Termín „aminokyselinový zbytek zvyšující (zesilující) aktivitu“ zahrnuje aminokyselinový zbytek, který zlepšuje aktivitu protilátky. Rozumí se, že aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu může nahradit aminokyselinový zbytek v kontaktní, hypermutační poloze nebo ve výhodné poloze selektivní mutageneze a dále v jedné nebo více CDR může být přítomen více než jeden aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu. Aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu zahrnuje aminokyselinový zbytek, který zlepšuje vazebnou specifitu/afinitu protilátky, například anti—lidské IL-12 protilátky vázající se na lidský IL—12. Aminokyselinový zbytek zesilující aktivitu také zahrnuje aminokyselinový zbytek, který zlepšuje neutralizují sílu protilátky, například protilátky proti lidskému IL-12, která inhibuje lidský IL-12.

Termín „protilátka“ zahrnuje molekulu imunoglobulinu, která obsahuje čtyři polypeptidové řetězce, z toho dva těžké řetězce (H) a dva lehké řetězce (L), kteréjsou vnitřně spojeny disulfidovými můstky. Každý těžký řetězec obsahuje variabilní oblast těžkého řetězce (zde je označena zkratkou HCVR nebo VH) a konstantní oblast těžkého řetězce. Konstantní oblast těžkého řetězce zahrnuje tři domény CHI, CH2 a CH3. Každý lehký řetězec obsahuje variabilní oblast lehkého řetězce (zde je označena zkratkou LCVR nebo VL) a konstantní oblast lehkého řetězce. Konstantní oblast lehkého řetězce obsahuje jednu doménu CL. Oblasti VH a VL se mohou dále dělit na hypervariabilní oblasti, které se nazývají oblasti determinující komplementaritu (CDR) a mezi nimi se nachází více konzervativní oblasti, jež se nazývají úseky základní struktury (FR). Každá VH a VL obsahuje tři CDR a čtyři FR uspořádané od N-konce k C-konci v následujícím pořadí: FR1, CDRI, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Termín „část protilátky vázající se na antigen“ (nebo „část protilátky“) zahrnuje fragmenty protilátky, které si uchovávají schopnost specificky se vázat na antigen (například hlL-12). Ukázalo se, že funkce protilátky vázat se na antigen může být uskutečněna fragmenty protilátky plné délky. Příklady vazebných fragmentů zahrnutých v termínu „část protilátky vázající se na antigen“ obsahují (i) fragment Fab, což je monovalentní fragment obsahující domény VL, VH, CL a CHI, (ii) fragment F(ab')₂, což je bivalentní fragment Fab, obsahující dva fragmenty Fab spojené v pantové oblasti disulfidovým můstkem, (iii) fragment Fd obsahující oblasti VH a CHI, (iv) fragment Fv obsahující domény VL a VH jednoho ramene protilátky, (v) fragment dAb (popisuje se v publikaci Ward et al., (1989) Nátuře 341: 544 až 546), který obsahuje oblast VH a (vi) izolovaná oblast určující komplementaritu (CDR).

Navíc, ačkoli dvě oblasti fragmentu Fv, VL a VH, jsou kódovány oddělenými geny, mohou být spojeny za použití metod rekombinace syntetickým linkerem, který jim umožňuje, aby se připravily jako jediný proteinový řetězec, ve kterém se oblasti VL a VH párují za vzniku monovalentních molekul (jsou známy jako jediný řetězec Fv (scFv), popisuje se v publikaci Bird et al., (1988) Science 242: 423 až 426 a Huston et al., (1988) Proč. Nati. Acad. Sci USA 85: 5879 až 5883). Takové jednořetězcové protilátky jsou zahrnuty v pojmu „oblast protilátky vázající se na antigen“. Tento termín zahrnuje také jiné formy jednořetězcových protilátek, jako jsou bivalentní protilátky („diabody“). Jde o bivalentní, bispecifickou protilátku, ve které jsou exprimovány oblasti VH a VL na jednom polypeptidovém řetězci, ale použití linkeru, který je příliš krátký, aby umožnil párování dvou domén na stejném řetězci, nutí domény tvořit páry s komplementárními oblastmi jiného řetězce a vznikají dvě vazebná místa pro antigen (popisuje se například v publikaci Hollinger, P„ et al., (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444 až 6448, Poljak, R. J., et al., (1994) Structure 2: 1121 až 1123). Dále protilátka nebo její část vázající se na antigen může být součástí větších imunoadhesivních molekul vytvořených kovalentním nebo nekovalentním spojením protilátky nebo části protilátky s jedním nebo více odlišných proteinů nebo peptidů. Příklady takových imunoadhesivních molekul zahrnují použití streptavidinové jaderné oblasti za vzniku tetramerové molekuly scFv (popisuje se v publikaci Kupriyanov, S. M. et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6: 93 až 101) a použití cysteinového zbytku, markerového peptidů a C-terminální polyhistidinové značky za vzniku bivalentních a biotinem označených molekul scFv (popisuje se v publikaci Kipriyanov, S. M. et al., (1994) Mol. Immunol. 31: 1047 až 1056). Části protilátek, jako jsou fragmenty Fab a F(ab')₂, se mohou připravit z celých protilátek za použití běžných metod, jako je štěpení celých protilátek papainem nebo pepsinem. Navíc, protilátky, části protilátek a imunoadhezivní molekuly mohou být získány použitím zde popsaných standardních metod rekombinace DNA. Preferované oblasti vázající se na antigen jsou celé oblasti nebo páry celých oblastí.

Termín „zpětná mutace“ znamená způsob, ve kterém jsou některé nebo všechny somaticky mutované aminokyseliny lidské protilátky nahrazeny odpovídajícími embryonálními zbytky z homologní embryonální sekvence protilátek. Sekvence těžkého a lehkého řetězce lidské protilátky podle vynálezu jsou uspořádány v databázi VBASE odděleně od embryonálních sekvencí, aby se identifikovaly sekvence s nejvyšší homologii. Rozdíly v lidské protilátce podle vynálezu je možné vrátit mutací definovaných poloh nukleotidů, které kódují takovou odlišnou aminokyselinu, na embryonální sekvenci. Měla by být zkoumána úloha každé aminokyseliny, která se takto identifikovala jako kandidát zpětné mutace, při přímé nebo nepřímé úloze při navázání na antigen. Libovolná aminokyselina, o které se zjistilo, že po mutaci ovlivňuje libovolnou požadovanou charakteristiku, by neměla být zahrnuta do konečné lidské protilátky, jako například aminokyseliny zesilující aktivitu identifikované přístupem selektivní mutageneze nebudou předmětem zpětné mutace. Aby se minimalizoval počet aminokyselin vystavených zpětné mutaci, ty polohy aminokyselin, o kterých se zjistilo, že se liší od nejbližší embryonální sekvence, ale jsou shodné s odpovídající aminokyselinou v druhé embryonální sekvenci, se mohou zachovat za předpokladu, že druhá embryonální sekvence je shodná a kolineární se sekvencí lidské protilátky podle vynálezu v případě alespoň deseti, s výhodou dvanácti aminokyselin na obou stranách diskutované aminokyseliny. Ke zpětné mutaci může dojít v libovolném stádiu optimalizace protilátky. Je výhodné, aby ke zpětné mutaci došlo přímo před nebo po použití přístupu selektivní mutageneze. Výhodnější je, když ke zpětné mutaci dojde přímo před použitím přístupu selektivní mutageneze.

Slovní spojení „lidský interleukin 12“ (zde se zkracuje jako hIL-12 nebo IL—12) zahrnuje lidský cytokin, kterýje primárně vylučován makrofágy a dendritickými buňkami. Termín zahrnuje heterodimerový protein obsahující podjednotku o molekulové hmotnosti 35 000 (p35) a podjednotku o molekulové hmotnosti 40 000 (p40), které jsou navzájem spojeny disulfidovým můstkem. Heterodimerový protein se označil jako „podjednotka p70“. Struktura lidského IL—12 je popisována dále například v publikaci Kobayashi, et al., (1989) J. Exp. Med. 170: 827 až 845, Seder, et al., (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. 90: 10188 až 10192, Ling, etal., (1995) J. Exp. Med. 154: 116 až 127, Podlaski, et al., (1992) Arch. Biochem. Biophys. 294: 230 až 237. Termín lidský IL—12 zahrnuje rekombinantní lidský IL—12 (rh IL-12), který může být připraven metodami standardní rekombinantní exprese.

Termíny „číslování podle Kabata“, „Kabatovy definice“ a „Kabatovo značení“ se zde mohou zaměňovat. Tyto termíny, které jsou v oboru známy, znamenají systém číslování aminokyselinových zbytků, které jsou více variabilní (to znamená hypervariabilní) než jiné aminokyselinové zbytky variabilních oblastí těžkého a lehkého řetězce protilátky nebo její části vázající se na antigen (popisuje se v publikaci Kabat et al., (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190: 382 až 391 a Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, N1H Publication No. 91 - 3242). V případě variabilní oblasti těžkého řetězce hypervariabilní oblast je v rozmezí od polohy aminokyseliny 31 do 35 v případě CDR1, polohy aminokyseliny 50 až 65 v případě CDR2 a polohy aminokyseliny 95 až 102 v případě CDR3. V případě variabilní oblasti lehkého řetězce hypervariabilní oblast je v rozmezí od polohy aminokyseliny 24 do 34 v případě CDR1, polohy aminokyseliny 50 až 56 v případě CDR2 a polohy aminokyseliny 89 až 97 v případě CDR3.

Číslování podle Kabata se zde používá za účelem označení poloh modifikací aminokyselin provedených v protilátkách podle vynálezu. Například protilátka proti IL-12 Y61 může být mutována v poloze 31 CDR1 lehkého řetězce ze šeřinu (S) na kyselinu glutamovou (E) (H31S E) nebo glycin (G) v poloze 94 CDR3 lehkého řetězce může být mutován na tyrozin (Y) (L94G ->

Y).

Termín „lidská protilátka“ zahrnuje protilátku, která má variabilní a konstantní oblast odpovídající embryonálním sekvencím lidského imunoglobulinu, jak se popisuje v publikaci Kabat et al., (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Lidské protilátky podle vynálezu mohou zahrnovat aminokyselinové zbytky, které nejsou kódovány embryonálními sekvencemi lidského imunoglobulinu (například zavedené náhodnou nebo místně řízenou mutagenezí in vitro nebo somatickou mutací in vivo) například v CDR a zvláště vCDR3. Mutace jsou s výhodou zavedeny použitím popsaného „přístupu selektivní mutageneze“. Lidská protilátka může mít alespoň jednu polohu nahrazenou aminokyselinovým zbytkem, například aminokyselinovým zbytkem zesilujícím aktivitu, který není kódován embryonální sekvencí lidského imunoglobulinu. Lidská protilátka může mít až dvacet poloh nahrazených aminokyselinovými zbytky, které nejsou částí embryonální sekvence lidského imunoglobulinu. V jiném provedení vynálezu je nahrazeno až deset, až pět, až tří nebo až dvě polohy. V preferovaném provedení vynálezu tato nahrazení jsou v oblastech CDR, jak se popisuje v detailech dále v textu. Avšak zde používaný termín „lidská protilátka“ nezahrnuje protilátky, ve kterých sekvence CDR získané z embrya jiných savčích druhů, jako je myš, byly transplantovány do sekvencí základní lidské struktury.

Termín „rekombinantní lidská protilátka“ zahrnuje lidské protilátky, které jsou připraveny, exprimovány, vytvořeny nebo izolovány způsoby rekombinace. Jsou to například protilátky exprimované použitím rekombinantního expresívního vektoru transfekovaného do hostitelské buňky (popisuje se dále v textu v sekci II), protilátky izolované z knihovny lidských rekombinantních, kombinačních protilátek (popisuje se dále v textu v sekci II), protilátky izolované ze zvířete (například myš), které je transgenní v případě genů lidského imunoglobulinu (popisuje se například v publikaci Taylor, L. D. et al., (1992), Nucl. Acids Res. 20: 6287 až 6295) nebo protilátky připravené, exprimované, vytvořené nebo izolované libovolnými jinými způsoby, které zahrnují sestřih sekvencí genu lidského imunoglobulinu s jinými skevencemi DNA. Takové rekombinantní lidské protilátky mají variabilní a konstantní oblasti získané z embryonálních sekvencí lidského imunoglobulinu (popisuje se například v publikaci Kabat, E. A. et al„ (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). V jiných provedeních vynálezu však takové rekombinantní lidské protilátky jsou předmětem mutageneze in vitro (nebo v případě, zeje použito zvíře transgenní pro sekvence lidského Ig, jde o somatickou mutagenezí in vivo) a tak aminokyselinové sekvence oblasti VH a VL rekombinantních protilátek jsou sekvence, které, zatímco se získaly z lidských embryonálních sekvencí VH a VL a jsou snimi příbuzné, nemohou přirozeně existovat in vivo v souboru lidských embryonálních protilátek. V jistých provedeních vynálezu jsou však takové rekombinantní protilátky výsledkem přístupu selektivní mutageneze nebo zpětné mutace nebo obou přístupů.

Termín „izolovaná protilátka“ zahrnuje protilátku, která v podstatě neobsahuje jinou protilátku s odlišnými antigenními specifitami (například izolovaná protilátka, která se specificky váže na hIL-2 v podstatě neobsahuje protilátky, které se specificky váží na antigeny jiné než je hlL-12). Izolovaná protilátka, která se specificky váže na hIL-12, se může vázat na molekuly IL—12 zjiných druhů (diskutuje se detailněji dále v textu). Izolovaná protilátka může v podstatě být bez jiného buněčného materiálu a/nebo chemikálií.

Termín „neutralizační protilátka“ (nebo „protilátka, která neutralizovala aktivitu hlL-12“) zahrnuje protilátku, jejíž navázání na hIL-12 vede k inhibici biologické aktivity hIL-12. Tato inhibice biologické aktivity hIL-12 může být hodnocena měřením jednoho nebo více indikátorů biologické aktivity hIL-12, jako je inhibice proliferace lidských fytohemaglutininových blastů v testu proliferace fytohemaglutininových blastů (PHA) nebo inhibice navázání receptoru v testu navázání receptoru lidského 1L-12 (popisuje se v příkladu 3, test indukce interferonu gama). Tyto indikátory biologické aktivity hIL-12 se mohou hodnotit jedním nebo více standardními testy in vivo nebo in vitro, které jsou známy v oboru (popisuje se v příkladu 3).

Termín „aktivita“ zahrnuje aktivity, jako je specifíta/afinita navázání protilátky na antigen, například protilátky proti hlL-12, která se váže na antigen IL—12, a/nebo neutralizační síla protilátky, například protilátky proti hIL-12, jejíž navázání na hIL-12 inhibuje biologickou aktivitu hIL-12, například inhibice proliferace blastů PHA nebo inhibice navázání receptoru v testu navázání receptoru lidského 1L-12 (popisuje se v příkladu 3).

Termín „povrchová plazmonová rezonance“ zahrnuje optický jev, který umožňuje analýzu biospecifických interakcí v reálném čase, detekcí změn koncentrací proteinů v biosensorové matrici, například použitím systému BIAcore (firma Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ). Dále se popisuje v Příkladu 5 a v publikaci Jonsson, U., et al., (1993), Ann. Biol. Clin. 51: 19 až 26, Jonsson, U„ et al., (1991) Biotechniques, 11: 620 až 627, Johnsson, B„ et al., (1995) J. Mol. Recognit. 8: 125 až 131 a Johnnson, B., et al., (1991) Anal. Biochem. 198; 268 až 277.

Termín „K_off“ znamená rychlostní konstantu pro disociaci protilátky z komplexu protilátka/antigen.

Termín „Kd“ zde znamená disociační konstantu určité interakce protilátka-antigen.

Termín „molekula nukleové kyseliny“ zahrnuje molekuly DNA a RNA. Molekula nukleové kyseliny může být jednořetězcová nebo dvouřetězcová, ale výhodná je dvouřetězcová DNA.

Termín „molekula izolované nukleové kyseliny“ zde znamená nukleové kyseliny kódující protilátky nebo části protilátek (například VH, VL, CDR3), které se vážou na hIL-12 (zahrnuty jsou „izolované protilátky“) a zahrnuje molekulu nukleové kyseliny, ve které nukleotidové sekvence kódující protilátku nebo její část neobsahují jiné nukleotidové sekvence kódující protilátku nebo její část, která se váže na antigen jiný než je hIL-12 a kterou mohou jiné sekvence přirozeně lemovat v lidské genomové DNA. Tak například izolovaná nukleová kyselina podle vynálezu kódující oblast VH protilátky anti—IL—12 neobsahuje jiné sekvence kódující jinou oblast VH, která se váže na jiné antigeny než je IL-12. Termín „molekula izolované protilátky“ také zahrnuje sekvence kódující bivalentní, bispecifické protilátky, jako je „diabody“, ve kterých oblasti VH a VL neobsahují jiné sekvence než sekvence bivalentní bispecifické protilátky.

Termín „vektor“ zahrnuje molekulu nukleové kyseliny schopnou přenášet jinou nukleovou kyselinu, na kterou byl navázán. Jedním typem vektoru je plazmid, který představuje smyčku kruhové dvouřetězcové DNA, do které mohly být ligovány segmenty DNA. Jiným typem vektoru je virový vektor, kde se do virového genomu mohly ligovat další segmenty DNA. Jisté vektory jsou schopny autonomní replikace v hostitelské buňce, do kteréjsou zavedeny (například bakteriální vektory, které mají bakteriální původ replikace a epizomální savčí vektory). Jiné vektory (například neepizomální savčí vektory) se mohou po zavedení do hostitelské buňky začlenit do geonomu hostitelské buňky a tím se replikují spolu s hostitelským genomem. Navíc jisté vektory jsou schopny řídit expresi genů, které do nich jsou operativně navázány. Takové vektory se nazývají „rekombinantní expresívní vektory“ (nebo jednoduše „expresívní vektory“). V obecném případě expresívní vektory, které se využívají v metodách rekombinace DNA jsou často ve formě plazmidů. V tomto dokumentu se termíny „vektor“ a „plazmid“ mohou vzájemně zaměňovat, protože plazmid je nejběžněji používaná forma vektoru. Vynález však také zahrnuje jiné formy expresívních vektorů, jako jsou virové vektory (například retroviry s defektní replikací, adenoviry a adenoasociované viry), které vykazují ekvivalentní funkce.

Výraz „rekombinantní hostitelská buňka“ (nebo jednoduše „hostitelská buňka“) zahrnuje buňku, do které byl zaveden rekombinantní expresívní vektor. Rozumí se, že takový termín neznamená pouze určitou buňku, ale také potomstvo takové buňky. Vzhledem ktomu, že se mohou v následujících generacích objevit určité modifikace způsobené buď mutacemi, nebo vlivem prostředí, takové potomstvo nemůže být ve skutečnosti identické s rodičovskou buňkou, ale stále jsou v rozsahu zde použitého termínu „hostitelská buňka“.

Zde používaný termín „modifikace“ znamená změny jedné nebo více aminokyselin v protilátkách nebo v jejích částech vázajících se na antigen. Ke změně může dojít přidáním, substitucí nebo delecí aminokyseliny v jedné nebo ve více polohách. Změna může být provedena použitím známých metod, jako je mutageneze PCR.

Výraz „kontaktní poloha“ zahrnuje polohu aminokyseliny v CDR1, CDR2 nebo CDR3 variabilní oblasti těžkého řetězce nebo lehkého řetězce protilátky, kteráje obsazena aminokyselinou, která je v kontaktu s antigenem v jedné z dvaceti šesti známých struktur komplexu protilátek-antigen. Jestliže aminokyselina CDR v libovolné z 26 známých objasněných struktur protilátkových komplexů přijde do kontaktu s antigenem, pak tato aminokyselin může být považována, že obsadila kontaktní polohu. Kontaktní polohy vykazují vyšší pravděpodobnost být obsazeny aminokyselinou, která přijde do kontaktu s antigenem, než polohy, které nejsou kontaktní. Kontaktní poloha s výhodou je poloha CDR, která obsahuje aminokyselinu, jenž přijde do kontaktu s antigenem ve více než 3 z 26 struktur (> 11,5 %). Nejvýhodnější je, když kontaktní poloha je poloha CDR, která obsahuje aminokyselinu, která přijde do kontaktu s antigenem ve více než 8 až 25 struktur (> 32 %).

Termín „hypermutační poloha“ zahrnuje aminokyselinový zbytek, který obsahuje polohu v oblasti CDR1, CDR2 nebo CDR3 variabilní oblasti těžkého nebo lehkého řetězce protilátky, o které se uvažuje, že má vysokou frekvenci nebo pravděpodobnost somatické hypermutace během afínitní maturace protilátky in vivo. Termín „vysoká frekvence nebo pravděpodobnost somatické hypermutace“ zahrnuje frekvenci nebo pravděpodobnost 5-ti až přibližně 40-ti% šance, že zbytek se podrobí somatické hypermutaci během afínitní maturace protilátky in vivo. Rozumí se, že všechna rozmezí v tomto daném rozmezí jsou součástí vynálezu, například 5 až přibližně 30 %, například 5 až přibližně 15 %, například 15 až přibližně 30 %.

Termín „výhodná (preferovaná) poloha selektivní mutageneze“ zahrnuje aminokyselinový zbytek, který obsazuje polohu v oblasti CDR1, CDR2 nebo CDR3 variabilní oblasti těžkého nebo lehkého řetězce, kterou je možné považovat za kontaktní nebo hypermutační polohu.

Výraz „přístup selektivní mutageneze“ zahrnuje způsob zlepšení aktivity protilátky selekcí a individuální mutací aminokyselin CDR v alespoň jedné výhodné poloze selektivní mutageneze, hypermutační a/nebo kontaktní poloze. Termín „selektivně mutovaná“ lidská protilátka je protilátka, která obsahuje mutaci v poloze vybrané použitím přístupu selektivní mutageneze. V jiném provedení podle vynálezu přístup selektivní mutageneze poskytuje způsob přednostně mutující vybrané jednotlivé aminokyselinové zbytky vCDRl, CDR2 nebo CDR3 variabilní oblasti těžkého řetězce (dále v textu Hl, H2 respektive H3) nebo CDR1, CDR2 nebo CDR3 variabilní oblasti lehkého řetězce (dále v textu se označuje jako LI, L2 respektive L3) protilátky. Aminokyselinové zbytky mohou být vybrány z výhodných poloh selektivní mutageneze, kontaktních poloh nebo hypermutačních poloh. Jednotlivé aminokyseliny se vybraly na základě jejich polohy ve variabilní oblasti těžkého nebo lehkého řetězce. Rozumí se, že hypermutační poloha může být též kontaktní poloha. V provedení vynálezu přístup selektivní mutageneze je „cílený přístup“. Termín „cílený přístup“ zahrnuje způsob výhodného mutování vybraných jednotlivých aminokyselinových zbytků v CDR1, CDR2 nebo CDR3 variabilní oblasti těžkého řetězce nebo CDR1, CDR2 nebo CDR3 variabilní oblasti lehkého řetězce protilátky v cíleném způsobu, například „přístup cílený do skupin“ nebo „přístup cílený do CDR“. V „přístupu cíleném do skupin“ jsou cíleny jednotlivé aminokyselinové zbytky v určitých skupinách na základě selektivních mutací, přičemž tyto skupiny zahrnují skupiny I (zahrnující L3 a H3), II (zahrnující H2 a LI) a III (zahrnující L2 a Hl) a jsou uvedeny v pořadí odpovídajícím preferenci pro cílení. V „přístupu cíleném do CDR“ jednotlivé aminokyselinové zbytky v určitých CDR jsou cíleny na základě selektivních mutací v pořadí podle preference cílení, které jsou následující: H3, L3, H2, LI, Hl a L2. Vybraný aminokyselinový zbytek je mutován, například alespoň na dva jiné aminokyselinové zbytky, a je stanoven účinek mutace na aktivitu protilátky. Aktivita je měřena jako změna ve vazebné specifík/afínitě a/nebo neutralizační síle protilátky. Rozumí se, že přístup selektivní mutageneze může být používán při optimalizaci libovolné protilátky získané z libovolného zdroje, který zahrnuje fágové zobrazení, transgenní zvířata s embryonálními geny lidského IgG, lidské protilátky izolované z lidských buněk B. S výhodou je přístup selektivní mutageneze využíván na protilátkách, které nemohou být optimalizovány dalším použitím technologie fágového zobrazení. Rozumí se, že protilátky z libovolného zdroje zahrnujícího fágové zobrazení, transgenní zvířata s embryonálními geny lidského IgG, lidské protilátky izolované z lidských buněk B mohou být subjektem zpětné mutace před nebo po přístupu selektivní mutageneze.

Termín „aminokyselinový zbytek zvyšující, resp. Zesilující aktivitu“ zahrnuje aminokyselinový zbytek, který zdelšuje aktivitu protilátky. Rozumí se, že aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu může nahradit aminokyselinový zbytek ve výhodné poloze selektivní mutageneze, kontaktní poloze nebo hypermutační poloze a dále v jedné nebo více CDR může být přítomen více jak jeden zbytek zvyšující aktivitu. Aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu zahrnuje aminokyselinový zbytek, který zlepšuje vazebnou specifitu/afinitu protilátky, například protilátky proti lidskému IL—12 vázající se na IL—12. Aminokyselinový zbytek zesilující aktivitu také zahrnuje aminokyselinový zbytek, který zlepšuje neutralizační sílu protilátky, například protilátky proti lidskému IL—12, která inhibuje lidský IL—12.

Různé aspekty vynálezu jsou detailněji popsány v následujících sekcích.

I. Lidské protilátky, které se vážou na lidský IL—12

Tento vynález popisuje izolované lidské protilátky nebo jejich části vázající se na antigen, které se vážou na lidský IL—12. Výhodně lidské protilátky podle vynálezu jsou rekombinační lidské protilátky neutralizující hIL-12. Protilátky podle vynálezu které se vážou na lidský IL—12, mohou být vybrány například testováním jedné nebo více lidských knihoven cDNA V_L a V_Hs hIL-12, jako jsou postupy fágového zobrazení popsané v příkladu 1. Testování knihoven lidské cDNA V], a Vh z počátku identifikovalo série protilátek proti IL—1 ě, ze kterých se pro další vývoj vybrala jedna protilátka nazvaná „Joe 9“ (nebo „Joe 9 divokého typu“). Joe 9 je protilátka proti lidskému IL—12 s relativně nízkou afinitou (například hodnota K_of_f je přibližně 0,1 s'¹), přesto však je použitelná při specifickém navázání a detekci hIL-12. Afinita protilátky Joe 9 se zlepšila provedením mutageneze těžkého a lehkého řetězce CDR, přičemž se produkuje soubor variabilních oblastí lehkého a těžkého řetězce, které se „míchaly a párovaly“ a dále mutovaly, což vede k řadě dalších protilátek proti hIL-12 se zvýšenou afinitou pro hIL-12 (popisuje se v příkladu 1, tabulka č. 2 (doplněk A) a uspořádání sekvence na obrázku č. 1A až D).

Z těchto protilátek lidská protilátka proti hIL-12 označená jako Y61 demonstrovala podstatné zlepšení vazebné afinity (například, hodnota K_off je přibližně 2 x 10'⁴ s’¹). Protilátky proti hIL-12 Y61°se vybraly pro další afinitní maturaci provedenou individuální mutací specifických aminokyselinových zbytků v CDR těžkého a lehkého řetězce. Aminokyselinové zbytky protilátky Y61 se vybraly pro místně specifickou mutaci (přístup selektivní mutace) založenou na aminokyselinovém zbytku, který zabírá preferovanou polohu selektivní mutageneze, kontaktní a/nebo hypermutační polohu. Shrnutí substitucí ve vybraných polohách v CDR těžkého a lehkého řetězce je zobrazeno na obrázku č. 2A až 2H. Preferovaná rekombinantní neutralizační protilátka podle vynálezu, zde uvedená jak J695, je výsledkem substituce z Gly na Tyr v poloze 50 CDR2 lehkého řetězce protilátky Y61 a substituce Gly na Tyr v poloze 94 CDR3 lehkého řetězce protilátky Y61.

Uspořádání aminokyselinové sekvence variabilních oblastí těžkého a lehkého řetězce souboru protilátek proti IL—12 podle vynálezu při vývoji protilátky Joe 9 divokého typu až J695 jsou zobrazena na obrázku č. ÍA až ID. Tato uspořádání sekvencí umožnila identifikaci konvenčních sekvencí preferované variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce protilátek podle vynálezu, které se vážou na hIL—12, stejně jako konvenčních sekvencí CDR3, DR2 a CDR1, při vývoji od protilátky Joe 9 až na J695. Kromě toho analýza mutageneze protilátky Y61 shrnutá na obrázku č. 2A až 2H umožnila identifikaci konvenčních sekvencí variabilních oblastí těžkého a lehkého řetězce, které se vážou na hIL-12, stejně jako konvenčních sekvencí CDR3, CDR2 a CDR1, které vážou hIL-12, při vývoji z Y61 na J695, které obsahují modifikované sekvence protilátky Y61 a ještě si zachovávají dobré vazebné charakteristiky pro hIL-12. Preferované sekvence CDR, VH a VL podle vynálezu (zahrnující konvenční sekvence) jak se identifikovalo sekvenčními identifikátory v přiloženém seznamu sekvencí, jsou shrnuty dále v textu.

SEQ ID NO:	řetězec protilátky	oblast	sekvence
1	konvenční Joe 9 na J695	CDR H3	(H/S)-G-S-(H/Y)-D-(N/T/Y)

2	konvenční Joe 9 až J695	CDR L3	Q-(S/T)-Y-(D/E)-(S/R/K)- (S/G/Y)-(L/F/T/S)- (R/S/T/w/H)-(G/P)-(S/T/A/L)- (R/S/M/T/L)-(V/I/T/M/L)
3	konvenční Joe 9 na J695	CDR H2	F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S- V-K-G
4	konvenční Joe 9 na J695	CDR L2	(G/Y)-N-(D/S)-(Q/N)-R-P-S
5	konvenční Joe 9 na J695	CDR Hl	F-T-F-S-(S/Ε)-Y-G-M-H
6	konvenční Joe 9 na J695	CDR LI	(S/T)-G-(G/S)-(R/S)-S-N-I- (G/V)-(S/A)-(N/G/Y)-(T/D)-V- (K/H)
7	konvenční Joe 9 na J695	VH	(celá sekvence VH, uvedeno v seznamu sekvencí)
8	konvenční Joe 9 na J695	VL	(celá sekvence VL, uvedeno v seznamu sekvencí)
9	konvenční Y61 na J695	CDR H3	H-(G/V/C/H)-(S/T)- (H/T/V/R/I)-(D/S)- (N/K/A/T/S/F/W/H)
10	konvenční Υβΐ na J695	CDR L3	Q-S-Y-(D/S)-(Xaa)- (G/D/Q/L/F/R/H/N/Y)-T-H-P-A- L-L
11	konvenční Y61 na J695	CDR H2	(F/T/Y)-I-(R/A)-Y-(D/S/E/A)- (G/R)-S-(Xaa)-K-(Y/E)-Y-A-D- S-V-K-G
12	konvenční Y61 na J695	CDR L2	(G/Y/S/T/N/Q)-N-D-Q-R-P-S
13	konvenční	CDR Hl	F-T-F-(Xaa)-(Xaa)-(Y/H)-

	Y61 na J695		(G/M/A/N/S)-M-H
14	konvenční Y61 na J695	CDR Ll	S-G-G-R-S-N-I-G- (S/C/R/N/D/T)-(N/M/I)- (T/Y/D/H/K/P)-V-K
15	konvenční Y61 na J695	VH	(celá sekvence VH, uvedeno v seznamu sekvencí)
16	konvenční Y61 na J695	VL	(celá sekvence VL, seznam sekvencí)
17	Y61	CDR H3	H-G-S-H-D-A
18	Y61	CDR L3	Q-S-Y-D-R-G-T-H-P-A-L-L
19	Y61	CDR H2	f-i-r-y-d-g-s-n-k-y-y-a-d-s- V-K-G
20	Y61	CDR L2	G-N-D-Q-R-P-S
21	Y61	CDR Hl	F-T-F-S-S-Y-G-M-H
22	Y61	CDR Ll	S-G-G-R-S-N-I-G-S-N-T-V-K
23	Y61	VH	(celá sekvence VH, uvedeno v seznamu sekvencí)
24	Y61	VL	celá sekvence VL, uvedeno v seznamu sekvencí)
25	J695	CDR H3	H-G-S-H-D-A
26	J695	CDR 13	Q-S-Y-D-R-Y-T-H-P-A-L-L
27	J695	CDR H2	F-I-R-Y-D-G-S-A-K-Y-Y-A-D-S- V-K-G
28	J695	CDR L2	Y-N-D-Q-R-P-S
29	J695	CDR Hl	F-T-F-S-S-Y-G-M-H
30	J695	CDR Ll	S-G-S-R-S-N-I-G-S-A-T-V-K
31	J695	VH	(celá sekvence VH, uvedeno v seznamu sekvencí)
32	J695	VL	(celá sekvence VL, uvedeno v seznamu sekvencí)

Protilátky produkované afínitní maturací protilátky Joe 9 divokého typu byly funkčně charakterizovány povrchovou plazmovou rezonancí, aby se stanovila hodnota Kj a K_of_t·. Produkovala se série protilátek, které vykazují hodnotu K₀fr v rozmezí přibližně 0,1 s'¹ až přibližně 1 χ 10‘⁵ s'¹ a výhodněji hodnoty Koff j^e přibližně 1 χ 10'⁴ s¹ až 1 χ 10'⁵ snebo méně. U protilátek se také in vitro charakterizovala schopnost inhibovat proliferaci fytohemaglutininových blastů (PHA), jak se popisuje v příkladu 3. Produkovaly se série protilátek, jejich hodnota IC50 je v rozmezí přibližně 1 x 10'⁶M až přibližně 1 x 1O‘”M, výhodnější je přibližně 1 x 1O''°M až 1 x 10^_IIM nebo io méně.

Vynález popisuje izolovanou lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen, která se váže na lidský IL—12 a disociuje z lidského IL—12 při hodnotě rychlostní konstanty K._off 0,1 s¹ nebo menší, jak se stanovilo povrchovou plazmovou rezonancí, nebo která inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu proliferace fytohemaglutininových blastů (test PHA) in vitro s hodnotou IC50 je 1 x 10⁶M nebo méně. V preferovaných provedeních podle vynálezu izolovaná protilátka proti lidskému IL—12 nebo její část vázající se antigen disociuje z lidského IL—12 při hodnotě rychlostní konstanty Koff 1 χ 10'² s'¹ nebo menší nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10⁷M nebo méně. Ve více preferovaném provedení izolovaná protilátka proti IL—12 nebo její část vázající se na antigen disociuje z lidského IL—12 při hodnotě rychlostní konstanty Koff 1 χ 10'³ s¹ nebo menší nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10 M nebo menší. Ve výhodnějším provedení vynálezu izolovaná protilátka proti lidskému IL—12 nebo její část vázající se antigen disociuje z lidského IL—12 při hodnotě rychlostní konstanty Koff 1 χ 10⁴ s¹nebo menší nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou 1C5O 1 x 10‘⁹M nebo menší. Ve výhodnějším provedení vynálezu izolovaná protilátka proti lidskému IL—12 nebo její část vázající se antigen disociuje z lidského IL—12 při hodnotě rychlostní konstanty Koff 1 χ 10'⁵ s¹ nebo menší nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC5o 1 x 10'°M nebo menší. Ve výhodnějším provedení vynálezu izolovaná protilátka proti lidskému IL—12 nebo její část vázající se antigen disociuje z lidského IL—12 při hodnotě rychlostní konstanty K_off 1 x 10⁵ s'¹ nebo menší nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC₅₀ 1 x ÍO ^M nebo méně.

Rychlostní konstanta disociace (K_off) protilátky proti IL—12 může být stanovena povrchovou plazmovou rezonancí (popisuje se v příkladu 5). V obecném případě analýza povrchovou plazmovou rezonancí měří vazebné interakce v reálném čase mezi ligandem (rekombinantní lidská IL—12 imobilizovaná na matrici biosenzoru) a analytem (protilátka v roztoku) povrchovou plazmovou rezonancí (SPR) použitím systému BIAcore (firma Pharmacia Biosensor, Pisctaway, NJ). Povrchová plazmová analýza může být také uskutečněna imobilizací analytu (protilátka na matrici biosenzoru) a přítomností ligandu (rekombinantní IL—12 v roztoku). Neutralizační aktivita protilátek IL—12 nebo jejich částí vázajících se na antigen může být hodnocena použitím jednoho nebo více z několika vhodných testů in vitro (popisuje se v příkladu 3).

Je dobře známo z oboru, že CDR těžkého a lehkého řetězce protilátek hrají důležitou úlohu při vazebné specifitě/afinitě protilátky pro antigen. Proto vynález zahrnuje lidské protilátky, které vykazují CDR lehkého a těžkého řetězce protilátky Joe 9, stejně jako protilátky mající CDR, které byly modifikovány za účelem zlepšení vazebné specifity/afinity protilátky. Jak se popisuje v příkladu 1, série modifikací CDR lehkého a těžkého řetězce vede k afínitní maturaci lidských protilátek proti hIL-12. Uspořádání aminokyselinové sekvence variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce sérií lidských protilátek vyskytující se při vývoji od protilátky Joe 9 divokého typu na J695, které se váží na lidský IL—12, jsou zobrazeny na obrázcích 1A až ID. Motivy konvenční sekvence v případě CDR protilátek mohou být stanoveny z uspořádání sekvence (jak je shrnuto v tabulce shora v textu). Například konvenční motiv v případě VH CDR3 při vývoji od protilátky Joe 9 až na J695 obsahuje aminokyselinovou sekvenci: (H/S)-G-S-(H/Y)-D-(N/T/Y) (SEQ ID NO: 1), která zahrnuje aminokyseliny z polohy 95 až 102 konvenční HCVR zobrazené v SEQ ID NO: 7. Konvenční motiv v případě VL CDR3 obsahuje aminokyselinovou sekvenci: Q-(S/T)-Y(D/E)—(S/R/K)—(S/R/K)—(S/G/Y)—(L/F/T/S)—(R/S/T/W/H)—(G/P)—(S/T/A/L)—(R/S/M/T/L— V/I/T/M/L) (SEQ ID NO: 2), která obsahuje aminokyseliny od polohy 89 do 97 konvenční LCVR zobrazené v SEQ ID NO: 8.

Tedy v dalším aspektu vynálezu poskytuje izolovanou lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen, která má následující charakteristiky:

a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC₅o 1 x 10⁶M nebo nižší,

b) má CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvence SEQ ID NO: 1 a

c) má CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2.

V preferovaném provedení vynálezu protilátka dále obsahuje VH CDR3 zahrnující aminokyselinovou sekvenci F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID NO: 3) (která obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 7) a dále obsahuje VL CDR2 zahrnující aminokyselinovou sekvenci (G/Y)-N-(D/S)-(Q/N)-R-P-S (SEQ ID NO: 4) (která obsahuje aminokyseliny od polohy 50 do 56 konvenční LCVR zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 8).

V jiném preferovaném provedení vynálezu protilátka dále obsahuje VH CDR1 zahrnující aminokyselinovou sekvenci F-T-F-S-(S/E)-Y-G-M-H (SEQ ID NO: 5) (která obsahuje aminokyseliny od polohy 27 do 35 konvenční HCVR obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 7) a dále obsahuje VL CDR1 zahrnující aminokyselinovou sekvenci (S/T)—G—(G/S)—(R/S)— S-N-I-(G/V)-(S/AHN-G-Y)-(T/D)-V-(K/H) (SEQ ID NO: 6) (která obsahuje aminokyseliny od polohy 24 do polohy 34 konvenční LCVR obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 8).

V ještě jiném výhodném provedení vynálezu protilátka podle vynálezu obsahuje HCVR zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 7 a LCVR obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 8.

Další konvenční motivy mohou být stanoveny na základě mutační analýzy uskutečněné v případě protilátky Y61, která vede k protilátce J695 (shrnuto na obrázcích 2A až 2H). Jak zobrazovaly grafy uvedené na obrázcích 2A až 2H), jisté zbytky CDR lehkého a těžkého řetězce protilátky Y61 byly podrobeny substituci, aniž se podstatně zhoršily vazebné vlastnosti protilátky na hlL12. Jednotlivé substituce v poloze 30 v CDR HI s dvanácti různými aminokyselinovými zbytky například podstatně neredukují hodnotu rychlostní konstanty disociace K_off protilátky, což ukazuje, že tato poloha nepodléhá substituci různými aminokyselinovými zbytky. Pak na základě mutační analýzy (to znamená polohy v protilátce Y61, která byla podrobena substituci jinými aminokyselinovými zbytky) byly stanoveny konvenční motivy. Konvenční motivy v případě CDCR3 těžkého a lehkého řetězce jsou zobrazeny v SEQ ID NO: 9 a 10, v případě CDR2 těžkého a lehkého řetězce jsou uvedeny v SEQ ID NO: 11 respektive 12 a konvenční motivy CDR1 těžkého a lehkého řetězce jsou zobrazeny v SEQ ID NO: 13 respektive 14. Konvenční motivy v případě oblastí VH a VL jsou zobrazeny v SEQ ID NO: 15 respektive 16.

Obdobně v dalším aspektu vynálezu se charakterizuje izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která má následující charakteristiky:

a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC₅₀ 1 x 10‘⁹M nebo nižší,

b) má CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 9 a

c) má CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 10.

V preferovaném provedení vynálezu protilátka dále obsahuje VH CDR2 zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 11 a dále obsahuje VL CDR2 zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 12.

V jiném výhodném provedení protilátka dále obsahuje VH CDR1 zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 13 a dále obsahuje VL CDR1 zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 14.

V ještě jiném výhodném provedení vynálezu protilátka dále obsahuje HCVR zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 15 a dále obsahuje LCVR zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 16.

Preferovaná protilátka podle vynálezu, kterou je lidská protilátka proti hlL-12 Y61, byla produkována afinitní maturací protilátky Joe 9 divokého typu mutagenezi CDR3 (jak se popisuje v příkladu 3). Protilátka Y61 měla zlepšenou specifitu/vazebnou afinitu, což se stanovilo povrchovou plazmovou rezonancí a neutralizačními testy in vitro. CDR.3 těžkého a lehkého řetězce protilátky Y61 jsou zobrazeny v SEQ ID NO: 17 respektive 18, CDR2 těžkého a lehkého řetězce protilátky Y61 jsou zobrazeny v SEQ ID NO: 19 respektive 20 a CDR1 těžkého a lehkého řetězce protilátky Y61 jsou zobrazeny v SEQ ID NO: 21 respektive 22. VH protilátky Y61 má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 23 a VL protilátky Y61 má aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 24 (tyto sekvence jsou také zobrazeny na obrázcích 1A až ID ve srovnání s protilátkou Joe 9).

a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC₅₀ 1 x 10'⁹M nebo nižší,

b) má CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 17 a

c) má CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 18.

V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se antigen má CDR2 těžkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 19 a CDR2 lehkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 20:

V jiném výhodném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se antigen má CDR1 těžkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 21 a CDR1 lehkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 22.

V ještě jiném výhodném provedení izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se antigen obsahuje variabilní oblast těžkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 23 a variabilní oblast lehkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 24.

V jistých provedeních vynálezu protilátka plné délky obsahuje konstantní oblast těžkého řetězce, jako jsou konstantní oblasti IgGl, lgG2, lgG3, IgG4, IgM, IgA a IgE, a libovolnou allotypickou variantu popsanou v publikaci Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, FIFA Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Konstantní oblast těžkého řetězce protilátky je s výhodou konstantní oblast těžkého řetězce IgGl. V jiném případě částí protilátky může být fragment Fab, fragment F(abS) nebo jednořetězcový fragment Fv.

Modifikace jednotlivých zbytků protilátky Y61 vede k produkci souboru protilátek zobrazených na obrázcích 2A až 2H. Specifita/vazebná afinita každé protilátky se stanovila povrchovou Platonovou rezonancí a/nebo neutralizačními testy in vitro.

a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC₅₀ 1 x 10⁹M nebo nižší,

b) má CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 404 až SEQ ID NO: 469 a

c) má CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 534 až SEQ ID NO: 579.

V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen dále obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 335 až SEQ ID NO: 403 a dále obsahuje CDR2 lehkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 506 až SEQ ID NO: 533.

V jiném výhodném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen dále obsahuje CDR1 těžkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 288 až SEQ ID NO: 334 a dále obsahuje CDR1 lehkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 470 až SEQ ID NO: 505.

V jistých provedeních vynálezu protilátka plné délky obsahuje konstantní oblast těžkého řetězce, jako jsou konstantní oblasti IgGl, lgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA a IgE, a libovolnou allotypickou variantu jak se popisuje v publikaci Kabat, E, A., et al., (1991) Sequences of Protein sof Immunological Interest, FIFA Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Konstantní oblast těžkého řetězce protilátky je s výhodou konstantní oblast těžkého řetězce IgGl. V jiném případě částí protilátky může být fragment Fab, fragment F(abS) nebo jednořetězcový fragment FV.

Zvláště výhodná rekombinantní neutralizační protilátka J695 podle vynálezu byla produkována místně řízenou mutagenezí konstantní a hypermutační aminokyselinových zbytků protilátky Y61 (popisuje se v příkladu 2 v sekci lil dále v textu). Protilátka J695 se liší od protilátky Y61 substitucí Gly za Tyr v poloze 50 CDR2 lehkého řetězce protilátky Y61 a substitucí Gly za Tyr v poloze 94 lehkého řetězce CDR3. CDR3 těžkého a lehkého řetězce protilátky J695 jsou zobrazeny v SEQ ID NO: 25 respektive 26, CDR2 těžkého a lehkého řetězce protilátky J695 jsou zobrazeny v SEQ ID NO: 27 respektive 28 a CDR1 těžkého a lehkého řetězce CDR1 protilátky J695 jsou zobrazeny v SEQ ID NO: 29 respektive 30: VH protilátky J695 má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 31 a VL protilátky J695 má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 32 (tyto sekvence jsou také zobrazeny na obrázcích 1A až 1D ve srovnání s protilátkou Joe 9).

Tedy v dalším aspektu vynálezu se charakterizuje izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která:

a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou 1C_5O 1 x 10'⁹M nebo nižší,

b) má CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 25 a

c) má CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 26.

V preferovaném provedení vynálezu izolovaná liská protilátka nebo její část vázající se na antigen má CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 27 a CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 28.

V jiném výhodném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen dále obsahuje CDR1 těžkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 29 a dále zahrnuje CDR1 lehkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 30.

Ještě v jiném výhodném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se antigen obsahuje variabilní oblast těžkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 31 a variabilní oblast lehkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 32.

V jistých provedeních vynálezu protilátka plné délky obsahuje konstantní oblast těžkého řetězce, jako jsou konstantní oblasti IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA a IgE, a libovolnou allotypickou variantu jak se popisuje v publikaci Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Protein sof Immunological Interest, FIFA Edition, U.s. Department of Health and Human Services, N1H Publication No. 91- 3242). Konstantní oblast těžkého řetězce protilátky je s výhodou konstantní oblast těžkého řetězce IgGl. V jiném případě části protilátky může být fragment Fab, fragment F(ab‘₂) nebo jednořetězcový fragment Fv.

Mohou být provedeny další mutace ve výhodných konvenčních sekvencích CDR3, CDR2 a CDRl protilátek ve vývoji z protilátky Joe 9 na J695 nebo z protilátky Y61 na J695 za vzniku dalších protilátek proti IL—12 podle vynálezu. Takové metody úpravy mohou být uskutečněny použitím standardních postupů v molekulární biologii, jako je mutageneze PCR, cílení jednotlivých kontaktních nebo hypermutačních aminokyselinových zbytků v CDR lehkého a/nebo těžkého řetězce. Dále následuje kinetická a funkční analýza upravených protilátek, jak se popisuje v textu (například neutralizační testy popsané v příkladu 3 a analýza BIAcore, jak se popisuje v příkladu 5).

Obdobně v dalším aspektu vynálezu se charakterizuje izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která:

a) ínhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC₅₀ 1 x 10'⁶M nebo nižší,

b) zahrnuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1 a CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 3 a CDRl těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 5, nebo jejich mutant, který má jednu nebo více substitucí aminokyselin v preferované poloze selektivní mutageneze nebo v hypermutační poloze, přičemž uvedený mutant nemá hodnotu rychlostní konstanty disociace vyšší než je desetinásobek hodnoty v případě protilátky zahrnující CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1 a CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 3 a CDRl těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 5 a

c) zahrnuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 a CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 4 a CDRl lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 6, nebo jejich mutant, který má jednu nebo více substitucí aminokyselin v preferované poloze selektivní mutageneze nebo v hypermutační poloze, přičemž uvedený mutant nemá hodnotu rychlostní konstanty disociace vyšší než je desetinásobek hodnoty v případě protilátky obsahující CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 a CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 4 a CDRl lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 6.

a) obsahuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC₅₀ 1 x 10⁹M nebo nižší,

b) oblast CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 9 a CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 1 a CDRl těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 13 nebo jejich mutant, který má jednu nebo více substitucí aminokyselin v preferované poloze selektivní mutageneze, v konstantní poloze nebo v hypermutační poloze, přičemž uvedený mutant nemá hodnotu rychlostní konstanty disociace vyšší než je desetinásobek hodnoty v případě protilátky obsahující CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 9 a CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 11 a CDRl těžkého obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 13 a

c) obsahuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 10 a CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 12 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 14, nebo jejich mutant, který má jednu nebo více substitucí aminokyselin v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní poloze nebo v hypermutační poloze, přičemž uvedený mutant nemá hodnotu rychlostní konstanty disociace vyšší než je desetinásobek hodnoty v případě protilátky obsahující CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 10 a CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 12 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 14.

Pro odborníka je výhodné, že další mutace v oblastech CDR protilátky podle vynálezu, například u protilátky Y61 nebo 695, mohou být provedeny za vzniku dalších protilátek proti IL-12 podle vynálezu. Takové modifikační metody mohou být provedeny použitím standardních postupů molekulární biologie, jak se popisuje shora v textu. Funkční a kinetická analýza upravených protilátek může být provedena podle popisu v příkladu 3 respektive 5. Úpravy jednotlivých zbytků protilátky Y61, které vedou k identifikaci protilátky J695, jsou zobrazeny na obrázcích 2A až 2H a jsou popsány v příkladu 2.

Tedy v dalším provedení vynálezu se charakterizuje izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která:

a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou IC₅₀ 1 x 10’⁹M nebo nižší,

b) obsahuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 17 a CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 19 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 21, nebo jejich mutant, který má jednu nebo více substitucí aminokyselin v preferované poloze selektivní mutageneze nebo v hypermutační poloze, přičemž uvedený mutant nemá hodnotu rychlostní konstanty disociace vyšší než je desetinásobek hodnoty v případě protilátky obsahující CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 17 a CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 19 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 21 a

c) obsahuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 18 a CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 20 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 22, nebo jejich mutant, který má jednu nebo více substitucí aminokyselin v preferované poloze selektivní mutageneze nebo v hypermutační poloze, přičemž uvedený mutant nemá hodnotu rychlostní konstanty disociace vyšší než je desetinásobek hodnoty v případě protilátky obsahující CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 18 a CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 20 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 22.

V jiném aspektu vynálezu se charakterizuje izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která:

a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro s hodnotou ΙΟ₅₀ 1 x 10'⁹M nebo nižší,

b) obsahuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 25, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 27 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 29, nebo její mutant, který má jednu nebo více substitucí aminokyselin v preferované poloze selektivní mutageneze nebo v hypermutační poloze, přičemž uvedený mutant nemá hodnotu rychlostní konstanty disociace vyšší než je desetinásobek hodnoty v případě protilátky obsahující CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 25, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 27 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 29 a

c) obsahuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 26, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 28 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 30 nebo jejich mutant, který má jednu nebo více substitucí aminokyselin v preferované poloze selektivní mutageneze nebo v hypermutační poloze, přičemž uvedený mutant nemá hodnotu rychlostní konstanty disociace vyšší než je desetinásobek hodnoty v případě protilátky obsahující CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2 6 a CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 28 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 30.

V dalším provedení vynálezu se popisuje izolované lidské protilátky nebo jejich části vázající se na antigen, které neutralizují aktivitu lidského IL-12 a alespoň jednoho dalšího IL-12 primátů vybraného ze skupiny zahrnující IL-12 paviána, IL-12 kosmana, IL-12 šimpanze, IL-12 cynomolga a makaka, ale které neneutralizují aktivitu myšího IL-12.

11. Výtěr rekombinačních lidských protilátek

Rekombinantní lidské protilátky podle vynálezu mohou být izolovány testováním knihovny rekombinačních kombinačních protilátek, upřednostňuje se knihovna scFv zobrazující fága, připravená použitím cDNA lidského VL a VH, která se připravila zmRNA získané z lidských lymfocytů. Metodika přípravy a testování takové knihovny je známa v oboru. Navíc běžně dostupné sady pro vytvoření knihoven zobrazujících fága (například firma Pharmacia, Recombinantn Phage Antigody Systém, kat. č. 27-9400-01 a firma Stratagene, sada pro vyjádření fága SurfZAP™, kat. č. 240612), příklady metod a činidel zvláště využitelných pro použití při přípravě a testování knihoven zobrazujících protilátky mohou být nalezeny například v publikaci Kang et al., přihláška PCT č. WO 92/18619, Winter et al., přihláška PCT WO 92/20791, Breitling et al., přihláška PCT č. WO 93/01288, McCafferty et al, přihláška PCT č. WO 92/01047, Gerrard et al, přihláška PCT č. WO 92/09690, Fuchs et al, (1991) Bio/Technology 9: 1370 až 1372, Hay et al, (1992) Hum. Antibody Hybridomas 3: 81 až 85, Huse et al, (1989) Science 246: 1275 až 1281, McCaffery et al. Nátuře (1990) 348: 552 až 554, Griffths et al, (1993) EMBO J. 12: 725 až 734, Hawkins et al, (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896, Clackson et al, (1991) Nátuře 352, 624 až 628, Gram et al, (1992) NPAS 89: 3576 až 3580, Garrad et al, (1991) Bio/Technology 9: 1373 až 1377, Hoogenboom et al, (1991) Nuc. Acid Res. 19: 4133 až 4137 a Barbas et al, (1991) PNAS 88: 7978 až 7982.

Protilátkové knihovny užívané při této metody jsou s výhodou knihovny scFv připravené z lidské cDNA VL a VH. Protilátkové knihovny scFV se s výhodou testují použitím rekombinačního lidského IL-12 jako antigen za účelem vybrat sekvence lidského těžkého a lehkého řetězce, které vykazují vazebnou aktivitu pro IL-12. Za účelem vybrat protilátky specifické pro podjednotku p35 IL-12 nebo heterodimer p70, bylo provedeno testování v přítomnosti nadbytku volné podjednotky p40. Preference podjednotky mohou být stanoveny například mikro-Friguetovou titrací, jak se popisuje v příkladu 1.

Když jsou vybrány počáteční lidské segmenty VL a VH, jsou provedeny experimenty „smíchání a párování“, aby se vybraly výhodné kombinace párů VL/VH (popisuje se v příkladu 1). V těchto experimentech se testuje schopnost různých párů vybraných segmentů VL a VH vázat se na IL12. Dále, pro další zlepšení afinity a/nebo dosažení nižší hodnoty rychlostní konstanty K_off pro navázání na hIL-12, segmenty VI a VH výhodného páru(ů) VL/VH mohou být výhodně mutovány, s výhodou v oblasti CDR3 VH a/nebo VL, postupem analogickým s postupem somatické mutace in vivo odpovědným za afinitní maturaci protilátek během přirozené imunitní odezvy. Tato afinitní mutace in vitro může být provedena amplifikací oblasti VH a VL použitím PCR primerů komplementárních sVH CDR3 nebo respektive VL CDR3, přičemž primery byly v jistých polohách prodlouženy náhodnou směsí čtyř nukleotidových bází tak, že výsledné proCZ 303725 B6 dukty PCR kódují segmenty VH a VI, ve kterých jsou do oblasti VH a/nebo VL CDR3 zavedeny náhodné mutace. Tyto náhodně mutované segmenty VH a VL mohou být znovu vybrány a může se u nich testovat schopnost vázat se na hIL-12 a mohou být vybrány sekvence, které vykazují vysokou afinitu a nízkou hodnotu K_off v případě navázání na IL-12. Tabulka 2 (dodatek A) popisuje protilátky, které vyjadřovaly změněnou vazebnou spécifitu/afinitu produkovanou jako výsledek afinitní maturace in vitro.

Po selekci, izolaci a testování protilátky proti hIL-12 podle vynálezu z rekombinantní knihovny zobrazující imunoglobulin, nukleová kyseliny kódující vybranou protilátku může být získána zfágové částice (částic) (například zfágového genomu) a může být subklonována do jiných expresívních vektorů standardními postupy rekombinace DNA. Je-li to nutné, nukleová kyselina může být dále manipulována za vzniku jiných forem protilátky podle vynálezu (například navázané na nukleovou kyselinu kódující další domény imunoglobulinu takové, jako jsou další konstantní oblasti). Aby se exprimovala rekombinantní lidská protilátka izolovaná testováním kombinační knihovny, DNA kódující protilátku je klonována do rekombínantního expresívního vektoru a je zavedena do savčích hostitelských buněk, jak se popisuje detailněji v sekci IV dále v textu.

Metody selekce protilátek vázajících se na lidský IL-12 použitím fágové zobrazovací technologie a afinitní maturace vybraných protilátek náhodnou nebo místně řízenou mutagenezi oblastí CDR jsou popsány detailněji v příkladu 1.

Jak se popisuje v příkladu 1, testování cDNA knihovny VL a VH identifikovalo série protilátek proti 1L—12, z nichž byla vybrána pro další vývoj protilátka Joe 9. Porovnání variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky Joe 9 s embryonálními sekvencemi těžkého řetězce vybranými z databáze VBASE odhalilo, že protilátka Joe 9 byla podobná se zárodečnou sekvencí COS-3. COS-3 patří k rodině zárodečných sekvenci V_H3.

Rodina V_H3 je součást zárodečného repertoáru lidského VH, který je rozdělen do sedmi rodin V_H1 až V_h7 založených na homologii nukleotidových sekvencí (popisuje se v publikaci Tomlison et al., (1992) J. mol. Biol., 227, 776 až 798 a Cook et al., (1995) Immunology Today, 16, 237 až 242). Rodina V_H3 obsahuje nejvyšší počet členů a tvoří nejvyšší příspěvek zárodečného repertoátu. V případě libovolné dané sekvence embryonální lidské protilátky V_H3, shoda aminokyselinových sekvencí v celé rodině V_H3 je vysoká (popisuje se například v publikaci Tomlinson et al., (1992) J. Mol. Biool. 227, 776 až 798 a Cook et al., (1995) Immunology Today, 16, 237 až 242). Rozmezí shody aminokyselinové sekvence mezi libovolnými dvěma embryonálními sekvencemi VH rodiny V_H3 kolísá od zbytků 69 až 98 v přibližně 100 zbytků VH (to znamená, že mezi libovolnými dvěma zárodečnými sekvencemi VH je 69 až 98% homologie aminokyselinové sekvence). V případě většiny párů zárodečných sekvencí existuje alespoň 80 nebo více shodných aminokyselinových zbytků (to je alespoň 80% homologie aminokyselinové sekvence). Vysoký stupeň homologie aminokyselinové sekvence mezi členy rodiny V_H3 vede ktomu, že jisté aminokyselinové zbytky jsou přítomny v klíčových místech v CDR a v oblastech kostry řetězce VH. Tyto aminokyselinové zbytky udílí strukturální rysy CDR.

Studie struktur protilátek ukázala, že prostorové uspořádání CDR se může rozdělit do rodin CDR s kanonickými (základními) strukturami založenými na klíčových aminokyselinových zbytcích, které obsazují jisté polohy v CDR a v oblastech kostry. V důsledku toho existují v různých protilátkách podobná lokální prostorová uspořádání CDR, která mají kanonické struktury se shodnými klíčovými aminokyselinovými zbytky (popisuje se v publikaci Chothia et al., (1987) J. mol. Biol. 196, 901 až 917 a Chothia et al., (1989) Nátuře, 343, 877 až 883). V rodině V_H3 existuje konzervace shody aminokyselinových zbytků v klíčových místech kanonické struktury CDR1 a CDR2 (popisuje se v publikaci Chothia et al., (1992), J. Mol. Biol. 227, 799 až 817).

Embryonální gen VH COS-3 je členem rodiny V_H3 a je variantou embryonální alely VH 330(DP-49). COS-3 se liší od aminokyselinových sekvencí VH protilátky Joe 9 pouze v pěti polohách. Vysoký stupeň homologie aminokyselinové sekvence mezi VH protilátky Joe 9 a COS-3 a mezi VH protilátky Joe 9 a jiných členů rodiny V_H3 také udílí vysoký stupeň strukturální homologie CDR (popisuje se v publikaci Chothia et al., (1992), J. Mol. Biol., 227, 799 až 817, Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196, 901 až 917 a Chothia et al., (1989) Nátuře, 342, 877 až 883).

Pro odborníka je výhodné, že na základě vysoké podobnosti aminokyselinové sekvence a kanonické struktury s protilátkou Joe 9, mohou být používány jiní členové rodiny V_H3 za vzniku protilátek, které se vážou na lidský IL-lě. To může být provedeno například selekcí v hodného VL metodami přeskupení řetězců (popisuje se v publikaci Winter et al., (1994) Annual Rev. Immunol. 12, 433 až 55) nebo zavedení CDR z hlodavce nebo jiné lidské protilátky zahrnující CDR z protilátek podle vynálezu do základní struktury rodiny V_H3.

Zárodečný repertoár lidského V lambda je rozdělen do 10-ti rodin založených na homologii nukleotidových sekvencí (popisuje se v publikaci Williams et al., (1996) J. Mol. Biol, 264, 220 a 232). Porovnání variabilní oblasti lehkého řetězce protilátky Joe 9 se zárodečnými sekvencemi lehkého řetězce protilátky Joe 9 se zárodečnými sekvencemi lehkého řetězce vybranými z databáze VBASE ukázalo, že protilátka Joe 9 byla podobná embryonální DPL8 lambda. VL protilátky Joe 9 se liší od sekvence DPL8 pouze ve čtyřech polohách základní struktury a je vysoce homologní se sekvencemi základní struktury jiných členů rodiny ν_λ To může být uskutečněno například selekcí vhodného VH metodami přeskupení řetězců (popisuje se v publikaci Winter et al., (1994) Annual Rev. Immunol., 12, 433 až55 nebo zavedením CDR jiné lidské protilátky nebo protilátky hlodavce, které obsahují CDR z protilátek podle vynálezu, do základní struktury rodiny VJ.

Metody podle vynálezu zahrnují rekombinantní protilátky, které se vážou na hIL-12, obsahující variabilní oblast těžkého řetězce získanou z člena rodiny V_H3 zárodečných sekvencí a variabilní oblast lehkého řetězce získanou z člena rodiny VJ zárodečných sekvencí. Pro odborníka je však výhodné, že sekvence těžkého řetězce libovolného člena rodiny V_H3 může být kombinována se sekvencí lehkého řetězce libovolného člena rodiny VJ.

Pro odborníky bude také výhodné, že v publikaci (například lidská populace) mohou existovat polymorfizmy sekvencí DNA, kterou vedou ke změnám v aminokyselinových sekvencích embrya. Takové genetické polymorfizmy způsobený přirozenou alilickou variantou může existovat mezi jedinci v populaci v zárodečných sekvencích. Takové přirozené alelické varianty mohou v typickém případě vést k 1 až 5% diskrepanci nukleotidové sekvence genu. Libovolné a všechny takové nukleotidové variace a výsledné aminokyselinové polymorfizmy v embryonálních sekvencích, které jsou výsledkem přirozené alelické varianty, patří do rozsahu tohoto vynálezu.

Tedy v jednom aspektu vynálezu se popisuje izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která má následující charakteristiky:

a) váže se na lidský IL-12 a disociuje z lidského IL-12 s hodnotou rychlostní konstanty disociace 0,1 s’¹ nebo nižší, jak se stanovilo povrchovou plazmovou rezonancí, nebo inhibuje proliferaci fýtohemaglutininových blastů v testu PHA in vitro, přičemž hodnota lC₅o je 1 x 10’⁶M nebo nižší,

b) má variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou z člena embryonální rodiny V_H3, kde variabilní oblast těžkého řetězce má mutaci v kontaktní a hypermutační poloze s aminokyselinovým zbytkem zvyšujícím aktivitu,

c) má variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci z člena embryonální rodiny VJ, kde variabilní oblast lehkého řetězce má mutaci v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní poloze nebo hypermutační poloze s aminokyselinovým zbytkem zvyšujícím aktivitu.

V preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen má mutaci v CDR3 těžkého řetězce.

V jiném výhodném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její Část vázající se na antigen má mutaci v CDR2 těžkého řetězce.

V jiném preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen má mutaci v CDR2 lehkého řetězce.

V jiném preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen má mutaci v CDRI těžkého řetězce.

V jiném preferovaném provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka nebo její Část vázající se na antigen má mutaci v CDRI lehkého řetězce.

Pro odborníka je výhodné, že na základě vysoké podobnosti aminokyselinové sekvence mezi členy embryonální rodiny V_H3 nebo mezi lehkými řetězci členů embryonální rodiny V_H3 nebo mezi lehkými řetězci členů embryonální rodiny VJ, uvedené mutace embryonálních sekvencí mohou poskytnout další protilátky, které se vážou na lidský 11-12. Tabulka 1 (dodatek A) ukazuje embryonální sekvence členů rodiny V_H3 a demonstruje podstatnou sekvenční homologii u členů rodiny. V tabulce 1 jsou zobrazeny embryonální sekvence členů rodiny. V tabulce 1 jsou zobrazeny embtyOnální sekvence členů rodiny VJ. Pro porovnání jsou poskytnuty sekvence těžkého a lehkého řetězce protilátky Joe 9. Mutace embryonálních sekvencí členů rodiny V_H3 a VJ mohou být provedeny například ve stejných polohách aminokyselin jako jsou ty provedené v protilátkách podle vynálezu (například mutace v protilátce Joe 9). Úpravy mohou být provedeny použitím standardních technik molekulární biologie, jako je mutageneze PCR, cílení jednotlivých aminokyselinových zbytků do embryonálních sekvencí, pak následuje zde popsaná kinetická a funkční analýza upravených protilátek (například neutralizační testy popsané v příkladu 3 a analýza BIAcore, jak se popisuje v příkladu 5).

Tedy podle jednoho aspektu vynálezu poskytuje izolovanou lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen, která má následující charakteristiky:

a) má variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 595 až 667, kde variabilní oblast těžkého řetězce má mutaci v preferované poloze selektivní mutace, v kontaktní nebo v hypermutační poloze s aminokyselinovým zbytkem zvyšujícím aktivitu,

b) má variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 669 až 675, kde variabilní oblast lehkého řetězce má mutaci v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní poloze nebo hypermutační poloze s aminokyselinovým zbytkem zvyšující aktivitu.

Pro odborníka je výhodné, že na základě vysoké podobnosti aminokyselinové sekvence mezi protilátkou Joe 9 a embryonální sekvencí těžkého řetězce COS-3 a mezi protilátkou Joe 9 a embryonální sekvencí DPL8 lambda, jiné mutace oblastí CDR těchto embryonálních sekvencí mohou poskytovat další protilátky, které se vážou na lidský IL—12. Takové metody modifikace mohou být provedeny použitím standardních technik molekulární biologie, jak se popisuje shora v textu.

a) váže se na lidský IL—12 a disociuje z lidského IL—12 s hodnotou rychlostní konstanty disociace 0,1 s'¹ nebo nižší, jak se stanovilo povrchovou plazmovou rezonancí, nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA, přičemž hodnota IC₅o je 1 x 10'⁶M nebo nižší,

b) má variabilní oblast těžkého řetězce obsahující embryonální aminokyselinovou sekvenci COS-3, kde variabilní oblast těžkého řetězce má mutaci v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní a hypermutační poloze s aminokyselinovým zbytkem zvyšujícím aktivitu,

c) má variabilní oblast lehkého řetězce obsahující embryonální aminokyselinovou sekvenci DPL8, kde variabilní oblast lehkého řetězce má mutaci v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní poloze nebo hypermutační poloze s aminokyselinovým zbytkem zvyšujícím aktivitu.

Tím, že jisté aminokyselinové zbytky obsahují klíčová místa CDR a oblasti základní struktury ve variabilní oblasti lehkého a těžkého řetězce, udělují těmto oblastem strukturální rysy. Zvláště oblasti CDR1 a CDR2 jsou subjektem kanonických strukturálních klasifikací. Protože zde existuje vysoký stupen homologie aminokyselinových sekvencí mezi členy rodiny, jsou tyto kanonické rysy přítomny mezi členy rodiny. Odborník ocení, že modifikace aminokyselinových zbytků, které udílejí kanonické struktury, by měly produkovat další protilátky, které se vážou na IL—12. Modifikace mohou být provedeny použitím standardních technik molekulární biologie, jak se popisuje shora v textu.

a) váže se na lidský 1L-12 a disociuje z lidského IL 12 s hodnotou rychlostní konstanty disociace 0,1 s'¹ nebo nižší, jak se stanovilo povrchovou plazmovou rezonancí, nebo inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů v in vitro testu PHA, přičemž hodnota IC₅₀ je 1 x 10'⁶M nebo nižší,

b) vykazuje variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou z člena embryonální rodiny V_H3, kde variabilní oblast těžkého řetězce obsahuje CDR2, která je strukturálně podobná CDR2 zjiných členů embryonální rodiny V_H3, CDR1, která je strukturálně podobná CDR1 zjiných členů embryonální rodiny V_H3, a kde variabilní oblast těžkého řetězce má mutaci v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní nebo hypermutační poloze mutaci aminokyselinovým zbytkem, která zvyšuje aktivitu,

c) vykazuje variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou z člena embryonální rodiny VJ, kde variabilní oblast lehkého řetězce obsahuje CDR2, která je strukturálně podobná CDR2 zjiných členů embryonální rodiny VJ, a CDR1, která je strukturálně podobná CDR1 zjiných členů embryonální rodiny VJ, a kde variabilní oblast těžkého řetězce má mutaci vykazuje v preferované poloze selektivní mutageneze, v kontaktní nebo hypermutační poloze mutaci aminokyselinovým zbytkem, který zvyšuje aktivitu.

Rekombinantní lidské protilátky podle vynálezu mají variabilní a konstantní oblasti, které jsou homologní s embryonálními selekcemi lidského imunoglobulinu vybranými z databáze VBASE. Mutace v rekombinačních lidských protilátkách (například náhodnou mutagenezí nebo mutagenezí PCR) vedou ke vzniku aminokyselin, které nejsou kódovány embryonálními sekvencemi lidského imunoglobulinu. Také knihovny rekombinačních protilátek, které byly získány z lidských donorů budou obsahovat protilátkou sekvence, které se liší od jejich odpovídajících embryonálních sekvencí, což způsobuje normální postup somatické mutace, který se objevuje během vývoje buňky B. Mělo by se poznamenat, že jestliže „embryonální“ sekvence získané amplifikaci PCR kódují rozdíly v aminokyselinách v oblastech základní struktury ve srovnání s opravdovou embryonální konfigurací (to je rozdíly v amplifíkované sekvenci ve srovnání s opravdovou embryonální sekvencí), může být nutné změnit tyto rozdíly aminokyselin zpět na opravdové embryonální sekvence (to je „zpětná mutace“ zbytků základní struktury v embryonální konfiguraci). Tedy vynález může volitelně zahrnovat krok zpětné mutace. Aby k tomu došlo, aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce kódované embryonální DNA (jak se zjistilo jako příklad v databázi VBASE) jsou nejdříve porovnány s mutovanými aminokyselinovými sekvencemi základní struktury těžkého a lehkého řetězce imunoglobulinu, přičemž se identifikují aminokyselinové zbytky v mutované sekvenci základní struktury imunoglobuíinu, které se liší od nejbližších embryonálních sekvencí. Pak použitím genetického kódu se stanoví, které změny nukleotidů by měly být provedeny a vhodné nukleotidy mutované imunoglobulinové sekvence jsou mutovány nazpět, aby odpovídaly embryonální sekvenci. Mutageneze mutované sekvence základní struktury imunoglobuíinu je provedena standardními způsoby, jako je mutageneze zprostředkovaná PCR (ve které mutované nukleotidy jsou začleněny do primerů PCR tak, že produkt PCR obsahuje mutace) nebo místně řízená mutageneze. Měla by se zkoumat přímá nebo nepřímá úloha každé aminokyseliny identifikované jako kandidát zpětné mutace při navázání na antigen a žádná aminokyselina, která po mutaci ovlivňuje libovolnou požadovanou charakteristiku lidské protilátky by se neměla zahrnout do konečné lidské protilátky, jako například aminokyseliny zvyšující aktivitu identifikované přístupem selektivní mutageneze nebudou subjektem zpětné mutace. Testy pro stanovení charakteristik protilátky, která je výsledkem mutageneze, mohou zahrnovat test ELISA, kompetitivní test elisa, neutralizační tedy in vitro a in vivo a/nebo (popisuje se například v příkladu 3) imunohistochemické rozbory sekcí tkání z různých zdrojů zahrnujících člověka, primáta a/nebo jiné druhy).

Aby se minimalizoval počet aminokyselin vystavených zpětné mutaci, mohou se zachovat ty polohy aminokyselin, u kterých se zjistilo, že se liší od nejbližší embryonální sekvence, ale jsou shodné s odpovídající aminokyselinou ve druhé embryonální sekvenci, přičemž dochází k tomu, že druhá embryonální sekvence je shodná s kolinální se sekvencí lidské protilátky podle vynálezu v případě alespoň deseti, s výhodou dvanácti aminokyselin na obou stranách diskutované aminokyseliny. To bude zaručovat, že libovolný peptidový epitop prezentovaný imunitnímu systému buňkami prezentujícími antigen v subjektu, který je léčen lidskou protilátkou podle vynálezu, nebude cizorodý, ale identický se samo-antigenem, to je imunoglobulinem kódovaným uvedenou druhou embryonální sekvencí. Zpětná mutace se může objevit v libovolném stádiu optimalizace protilátky, přednostně se zpětná mutace objevuje přímo před nebo po použití přístupu selektivní mutageneze. Výhodněji, zpětná mutace se objevuje přímo před použitím přístupem selektivní mutageneze.

III: Modifikace výhodných poloh selektivní mutageneze, kontaktních a/nebo hypermutačních poloh

V typickém případě selekce protilátek se zlepšenými afinitami může být provedena použitím metod fágového zobrazení, jak se popisuje v sekci II shora v textu. To může být dosaženo kombinací náhodných mutací zbytků CDR a vytvořením velkých knihoven, které obsahují protilátky různých sekvencí. Avšak, aby tyto selekční metody fungovaly, reakce protilátka-antigen se musí blížit rovnováze, aby se po určité době umožnilo výhodné navázání protilátky s vyšší afinitou na antigen. Když byly použity metody zobrazující fága, aby se zlepšila afinita vybraných protilátek proti IL-12, nemohou být stanoveny (pravděpodobně v důsledku dalších nespecifických interakcí mezi antigenem a částicí fága), selekční podmínky pro docílení jistého stupně dosažené afinity (to je stupeň afinity protilátky Y6I), které by umožnily dosažení rovnováhy. Proto použitím metod fágového zobrazování nemohly být vybrány protilátky s ještě vyššími afinitami. Takže alespoň pro určité protilátky nebo antigeny, jsou metody fágového zobrazení limitující svou schopností vybrat protilátky s vysoce zlepšenou vazebnou specifitou/afinitou. Aby se obešlo toto omezení, byl nalezen způsob nazvaný přístup selektivní mutageneze, který nevyžaduje fágové zobrazení afínitní maturace protilátek a je předmětem vynálezu. Ačkoli tento přístup selektivní mutageneze byl vyvinut k obejití omezení při použití systému fágového zobrazení, je třeba uvést, že při použití systému fágového zobrazení, je třeba uvést, že tato metoda může být použita také spolu se systémem fágového zobrazení. Navíc přístup selektivní mutageneze může být používán ke zlepšení aktivity libovolné protilátky.

Ke zlepšení aktivity (například afinity nebo neutralizační aktivity) protilátky by bylo ideální mutovat každou polohu CDR v lehkém i těžkém řetězci na každý jiný možný aminokyselinový zbytek. Protože však v protilátce existuje průměr 70 poloh CDR, takový přístup by byl poměrně časově náročný a pracný. Proto způsob podle vynálezu umožňuje zlepšit aktivitu protilátky mutaCZ 303725 B6 cí pouze určitých vybraných zbytků v CDR těžkého a/nebo lehkého řetězce. Navíc způsob podle vynálezu umožňuje zlepšit aktivitu protilátky bez ovlivnění jejich dalších požadovaných vlastností.

Stanovení, které aminokyselinové zbytky variabilní oblasti protilátky jsou v kontaktu s antigenem, není možno přesně předpovědět na základě primární sekvence nebo jejich poloh ve variabilní oblasti. Nicméně srovnání sekvencí z protilátek s různými specifikami provedené Rabatem a spol. identifikovalo oblasti CDR jako místní oblasti uvnitř variabilních oblastí, které se mezi protilátkami významně liší (Kabat et al. (1971) Ann. NY. Add. Sci. 190, str. 382 až 393, Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Protein sof Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242. Strukturní studie ukázaly, že povrch vázající antigen je tvořen aminokyselinovými zbytky přítomnými v CDR. Je známo, že jiné aminokyselinové zbytky mimo CDR mají také strukturní roli nebo se přímo účastní navázání antigenu. Proto mohou být pro každý pár antigen-protilátka významné aminokyselinové zbytky v CDR nebo mimo tuto oblast.

Studie uspořádaní sekvencí popsané v publikaci Tomlison et al., identifikovaly řadu pozic v CDR1 a CDR2 těžkého a lehkého řetězce a v části CDR3 řetězce kappa, což jsou častá místa somatické mutace (Tomlison et al., (1996) J. Mol. Biol 256: 813 až 817). Zvláště polohy H31, H31B, H33, H33B, H52B, H56, H58, L30, L31, L31A, L50, L53, L91, L92, L93 a L94 byly identifikovány jako častá místa pro somatickou mutaci. Tato analýza však vylučuje důležité oblasti CDR3 těžkého řetězce a sekce CDR3 lehkého řetězce, o kterých je známo, že leží v centru vazebného místa protilátky a potenciálně poskytují důležité interakce santigenem. Dále se v publikaci Tomlison et al., (1996) J. Mol. Biol. 256: 813 až 817 se uvádí, že samotná somatická diverzita nezbytně nepředpokládá úlohu specifické aminokyseliny při navázání na antigen a naznačují se konzervované aminokyselinové zbytky, které nekontaktují antigen, a diverzní aminokyselinové zbytky, které nekontaktují antigen. Tento závěr je dále podporován mutačními studiemi úlohy somatických mutací v protilátkou afinitě (Sharon, (1990), PNAS, 87: 4814 až 7). Devatenáct somatických mutací v protilátce proti p-azofenylarsonátu (Ars) s vysokou afinitou bylo současně nahrazeno odpovídajícími embryonálními zbytky, což vytvořilo embryonální verzi protilátek proti Ars, které měly dvěstěkrát nižší aktivitu. Plnou aktivitu protilátky proti Ars bylo možno znovu získat opětným provedením pouze tří z devatenácti somatických mutací, což ukazuje, že mohou být povoleny četné somatické mutace, které nepřispívají k vazebné aktivitě na antigen.

Výsledek je možné zčásti vysvětlit podstatou samotné protilátky diverzity. Nezralé buňky B mohou zpočátku produkovat protilátky s nízkou afinitou, které rozeznávají řadu samo-antigenů nebo antigenů, které nejsou samo-antigeny. Protilátky však mohou projít v průběhu afinitní maturace sekvenčními variacemi, které mohou způsobit samo-reaktivitu. Hypermutace takových protilátek s nízkou afinitou mohou sloužit k eliminaci samo-reaktivity („negativní selekce“) a ke zvýšení afinity pro cizorodý antigen. Proto analýza primárních a strukturálních dat velkého množství protilátek neposkytuje způsob předpovídající buď (1) úlohu somatických hypermutačních míst v postupu afinitní maturace versus v postupu snížení afinity vůči nechtěným antigenům, nebo (2) jak se daná aminokyselina podílí na vlastnostech specifického páru antigen-protilátka.

Jiné pokusy adresované úloze specifických aminokyselinových zbytků při rozeznávání antigenu byly provedeny analýzou řady krystalických struktur komplexů antigen-protilátka (MacCallum et all., (1996) J. Mol. Biol. 262: 732 až 745). Byla naznačena potencionální úloha poloh lokalizovaných v CDR nebo mimo tuto oblast. Polohy v CDR zahrnuté v navázání na antigen ve více než 10 z 26 analyzovaných struktur zahrnovaly H31, H33, H50, H52, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98 a H100 v těžkém řetězci a L30A, L32, L91, L92, L93, E94, L96 v lehkém řetězci. Autoři však poznamenali, že předpoklad kontaktů antigen použitím těchto a jiných strukturálních dat může vést k nadměrnému nebo nedostatečnému předpokladu kontaktních poloh, což vede ke spekulaci, že pro různé antigeny mohou být aplikovány různé strategie.

Pini et al., popisuje náhodné rozdělení více zbytků do sekvencí CDR protilátky ve velké knihovně zobrazující fága za účelem rychle zvýšit protilátkovou afinitu (popisuje se publikace Pinie t al., (1998) J. Biol. Chem. 273: 21769 až 21776). Protilátky s vysokou afinitou diskutované v publikaci Pinie t al., (1998) J. Biol. Chem. 273: 21769 až 21776 měly mutace celkem v osmi polohách, jejich redukční analýza se stává nepraktická, protože se testuje velký počet možných kombinací pro nejmenší počet nutných aminokyselin. Změny poloh jsou absolutně nutné, aby se zlepšila afinita protilátky.

Vedle toho náhodné rozdělení množství zbytků nemusí nezbytně zachovat jiné požadované vlastnosti protilátky. Požadované vlastnosti a charakteristiky protilátky jsou v oboru známy a zahrnují například zachování nezkřížené reaktivity, například sjinými proteiny nebo lidskými tkáněmi a zachování sekvencí protilátek, které jsou blízké sekvencím lidského embryonálního imunoglobulinu, zlepšení neutralizační síly. Jiné požadované vlastnosti nebo charakteristiky zahrnují schopnost uchovat druhy zkřížené reaktivity, schopnost zachovat specifitu epitopu a schopnost zachovat vysokou sílu exprese proteinu v savčích buňkách. Požadované vlastnosti nebo charakteristiky mohou být pozorovány nebo měřeny použitím postupů známých v oboru, které zahrnují, ale nejsou omezeny na test ELISA, kompetitivní ELSIA, neutralizační testy in vitro a in vivo (popisuje se například v příkladu š), imunohistochemické testy tkáňových sekcí z různých zdrojů, které zahrnují člověka, primáta nebo jiné zdroje podle potřeby a studie exprese v savčích buňkách použitím dočasné nebo stabilní exprese.

Navíc způsob popsaný v publikaci Pinie t al., (1998) J. Biol. Chem. 273: 21769 až 21776 může zavést více změn, než je minimální opravdu nutný počet, aby se zlepšila afinita, a může vést ke spuštění tvorby proti-lidských protilátek (HAMA) v lidských subjektech.

Dále, jak se diskutuje jinde, zde pospané fágové zobrazení nebo jiná příbuzná metoda zahrnující zobrazení ribozomu nemusí správně fungovat při dosažení jistých afinit mezi protilátkou a antigenem a podmínky nutné pro dosažení rovnováhy nemusí být nastoleny v náležitém časovém rámci vzhledem dalším interakcím, které zahrnují interakce sjinými fágovými nebo ribozomálními komponenty a antigenem.

Odborník může sbírat zajímavé vědecké informace o původu protilátkou diverzity z obsahu publikací diskutovaných shora v textu. Vynález však poskytuje způsob pro zvýšení protilátkou afinity specifického páru antigen-protilátka, zatímco zachovává jiné relevantní rysy nebo požadované charakteristiky protilátky. To je zvláště důležité, když se zvažuje nutnost propůjčení množství různých charakteristik specifické protilátce včetně navázání na antigen.

Jestliže počáteční protilátka má požadované vlastnosti nebo charakteristiky, které je potřeba zachovat, přístup selektivní mutageneze mže být nejlepší strategie zachování těchto požadovaných vlastností, zatímco se zlepší aktivita protilátky. Například při mutagenezi protilátky Y61 bylo cílem zvýšit afinitu vůči hIL-12 a zlepšit neutralizační potenciál protilátky. Například při mutagenezi protilátky Y61 bylo cílem zvýšit afinitu vůči hIL-12 a zlepšit neutralizační potenciál protilátky, zatímco si zachovává požadované vlastnosti. Požadované vlastnosti protilátky Y61 zachovaly (1) zachování nezkřížené reaktivity sjinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, (2) ochranu správné afinity epitopu, to je rozpoznávání epitopu p40 přednostně v souladu s heterodimerem p70 (p40/p35), čímž se zachovávají vazebné interference od volné rozpustné podjednotky p40 a (3) vytvoření protilátky s aminokyselinovými sekvencemi těžkého a lehkého řetězce, které jsou natolik blízké jejich odpovídajícím sekvencím embryonálního imunoglobulinu, jak je to jen možné.

V jednom provedení vynálezu způsob poskytuje přístup selektivní mutageneze jako strategie zachování požadovaných vlastností nebo charakteristik protilátky, zatímco se zlepšuje afinita a/nebo neutralizační síla. Termín „přístup selektivní mutageneze“ se definuje shora v textu a zahrnuje způsob jednotlivé mutace vybraných aminokyselinových zbytků. Aminokyselinové zbytky, které budou mutovány, se nejdříve vyberou z preferovaných poloh selektivní mutageCZ 303725 B6 neze, pak z kontaktních poloh a pak z hypermutačních poloh. Jednotlivá vybraná poloha může být mutována na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky a je stanoven účinek mutace na požadované vlastnosti protilátky a zlepšení aktivity protilátky.

Přístup selektivní mutageneze zahrnuje kroky:

výběr kandidátských poloh v pořadí 1) preferované polohy selektivní mutageneze, 2) kontaktní polohy, 3) hypermutační polohy a zařazení poloh na základě lokace polohy ve variabilních oblastech těžkého a lehkého řetězce protilátky (CDR3 se preferuje před CDR2 a tato oblast se preferuje před CDR1), jednotlivá mutace kandidátských preferovaných poloh selektivní mutageneze, hypermutačních a/nebo kontaktních poloh za účelem hodnocení na všech možné jiné aminokyselinové zbytky a analýza účinku jednotlivých mutací na aktivitu protilátky za účelem stanovení aminokyselinových zbytků, které zesilují aktivitu protilátky, jestli je to nezbytné, vytvoření postupných kombinací jednotlivých aminokyselinových zbytků zvyšujících aktivitu protilátek, výběr mutovaných protilátek s aminokyselinovými zbytky zvyšujícími aktivitu a hodnocení mutantních protilátek založených na lokaci a shody substitucí aminokyselin s ohledem na jejich imunogenní potenciál. Nejvyšší hodnocení je uděleno mutantním protilátkám, které obsahují aminokyselinovou sekvenci, která je skoro shodná se selekcí variabilní oblasti, která je popsána v embryonální databázi nebo má aminokyselinovou sekvenci, která je porovnatelná s jinými lidskými protilátkami. Nižší hodnocení je dáno mutantním protilátkám obsahujícím aminokyselinovou substituci, která se řídce objevuje v jejich embryonální sekvenci nebo v sekvencích jiných lidských protilátek. Nejnižší hodnocení je dáno mutantním protilátkám s aminokyselinovou substitucí, která se nevyskytuje v embryonální sekvenci nebo v sekvenci jiné lidské protilátky. Jak je uvedeno shora v textu, mutantní protilátky obsahující alespoň jeden aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu lokalizovaných v CDR3 je preferován před CDR2, který je preferován před CDR1. CDR variabilních oblastí těžkého řetězce jsou preferovány před CDR variabilní oblasti lehkého řetězce.

U mutantních protilátek může být také studováno zlepšení aktivity, například v porovnání s jejich rodičovskou protilátkou. Zlepšení aktivity mutantní protilátky může být stanoveno například neutralizačními testy nebo vazebnou specifitou/afinitou analýzou povrchové plazmové rezonance (popisuje se v příkladu 3). Zlepšení aktivity může být s výhodou alespoň 2 až 20krát vyšší ve srovnání s rodičovskou protilátkou. Zlepšení aktivity může být alespoň „X|“ a „x₂“ krát „X|“ a „x₂“ jsou celá čísla zahrnující čísla 2 až 20, zahrnující rozmezí ve stávajícím rozmezí například 2 až 15, například 5 až 10.

Mohou být také studovány mutantní protilátky s aminokyselinovým zbytkem zvyšujícím aktivitu, aby se stanovilo zda byla po mutaci zachována alespoň jedna požadovaná vlastnost. U protilátky proti hIL-12 se například testovaly 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu p40 přednostně v souladu s heterodimerem p70 (p40/p35), čímž se uchovává vazebná interference z volné rozpustné p40 a (3) vytvoření protilátek s aminokyselinovými sekvencemi těžkého a lehkého řetězce, které byly tak blízko svým sekvencím embryonálního imunoglobulinů, jak je to možné, a stanovení, která protilátka bude méně pravděpodobně vyvolávat lidskou imunní odezvu založenou na počtu rozdílů od embryonální sekvence. Stejná pozorování mohou být provedena s protilátkou, která má více jak jeden aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu, například alespoň dva nebo alespoň tři aminokyselinové zbytky zvyšující aktivitu, aby se stanovilo, zda dojde k zachování požadované vlastnosti nebo charakteristiky.

Příklad použití „přístupu selektivní mutageneze“ při mutagenezí protilátky Y61 je popsán dále v textu. Každá s jednotlivých mutací H31S—>E, L50—>Y nebo 94G-^Y zlepšila neutralizační aktivitu protilátky. Když však byly testovány kombinační klony, aktivita kombinovaného klonu H31S^E + 1.50^Y + L95G—»Y nebyla lepší než L50—>Y + L94G^Y(J695). Proto změna embryonálního aminokyselinového zbytku Ser na Glu v poloze 31 CDR1 nebyla nezbytná pro zlepšení aktivity J695 ve srovnání sY61. Přístup selektivní mutageneze proto identifikoval minimální počet změn, které přispívaly ke konečné aktivitě, čímž se redukuje imunogenní potenciál konečné protilátky a zachovávají se požadované vlastnosti protilátky. Izolovaná DNA kódující VH a VL produkovaný přístupem selektivní mutageneze může být přeměněna na geny řetězce protilátky plné délce, na geny fragmentu Fab, jako na gen scFV, jak je popsáno v sekci IV. V případě exprese oblastí VH a VL produkovaných přístupem selektivní mutageneze, expresívní vektory kódující těžký a lehký řetězec mohou být transferovány do různých hostitelských buněk, jak se popisuje v detailech v sekci IV. Preferované hostitelské buňky zahrnují buď hostitelské prokaryontní buňky, například E. coli, nebo eukaryotní hostitelské buňky, například kvasinkové buňky, například 5. cerevisce. Nejvíce preferované eukaryotní hostitelské buňky jsou savčí hostitelské buňky popsané detailněji v sekci IV.

Přístup selektivní mutageneze poskytuje způsob produkující protilátky se zlepšenými aktivitami bez předchozí afinitní maturace protilátky jinými způsoby. Přístup selektivní mutageneze poskytuje způsob produkující protilátky se zlepšenými afinitami, které byly předmětem zpětných mutací. Přístup selektivní mutageneze také poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátek s afinitní maturací.

Odborníkovi bude jasné, že přístup selektivní mutageneze může být používán při standardních postupech manipulace protilátek, kteréjsou známy v oboru. Příklady zahrnují, ale nejsou omezeny na protilátky se zavedeným CDR, chimérou protilátky, fragmenty csFV, fragmenty Fab protilátek plné délky a lidské protilátky z jiných zdrojů, například transgenní myši.

Rychlá mutační analýza protilátek ve velkém měřítku zahrnuje transkripci a translaci in vitro použitím fágové zobrazovací technologie (popisuje se například v publikaci Hanes et al., (1997), Proč. Nati. Acad. Sci. 94: 4937 až 4942, Dali Acqua et al., (1998) Curr. Opin. Struc. Biol. 8: 443 až 450, He et al., (1997) Nucleic. Acid. Res. 25: 5132 až 5134 a patentový dokument US 5 643 768 a US 5 658 754 (Kawasaki). Přístup selektivní mutageneze také poskytuje způsob produkce protilátek se zlepšenými aktivitami, které mohou být vybrány použitím postupů zobrazení ribozomu.

Ve způsobech podle vynálezu protilátky nebo jejich části vázající se na antigen jsou dále upraveny změnami jednotlivých poloh v DR HCVR a/nebo LCVR. Ačkoli tyto úpravy mohou být provedeny v protilátkách vyjádřených fágem, způsob je výhodný v tom, že může být proveden s protilátkami, kteréjsou exprimovány v jiných typech hostitelských systémů, jako jsou bakteriální, kvasinkové nebo savčí buněčné expresívní systémy. Jednotlivé polohy v CDR vybrané na základě své modifikace jsou založeny na polohách, kterou je kontaktní a/nebo hypermutační poloha.

Preferované zde definované kontaktní polohy a hypermutační polohy jsou zobrazeny v tabulce 3 (dodatek A) a jejich modifikace ve shodě s metodou podle vynálezu je popsána detailněji v příkladu 2. Preferované kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96. Preferované hypermutační polohy jsou vybrány ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93. Více preferované aminokyselinové zbytky („preferované polohy selektivní mutageneze“) jsou jak kontaktní, tak hypermutační polohy a jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94. Zvláště preferované kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny zahrnující L50 a L94.

Preferované hypermutační polohy jsou vybrány ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93. Více preferované aminokyselinové zbytky („preferované polohy selektivní mutageneze“) jsou jak kontaktní, tak hypermutační polohy a jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91,

L92, L93, L94. Zvláště preferované kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny zahrnující L50 a L94.

Preferované aminokyselinové zbytky zvyšující aktivitu nahradí aminokyselinové zbytky lokalizované v polohách vybraných ze skupiny obsahující H30, H31, H32B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96. Více preferované aminokyselinové zbytky zvyšují aktivitu nahradí aminokyselinové zbytky lokalizované v polohách vybraných ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94. Zvláště preferované aminokyselinové zbytky zvyšují aktivitu nahradí aminokyselinové zbytky lokalizované v polohách vybraných ze skupiny obsahující L50 a L94.

V obecném případě způsob podle vynálezu zahrnuje výběr určité preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní polohu a/nebo hypermutační polohu v CDR těžkého a lehkého řetězce diskutované původní protilátky nebo její části vázající se na antigen, náhodnou mutaci v této individuální poloze (například genetickými způsoby použitím mutagenního oligonukleotidu za vzniku „mini-knihovny“ upravených protilátek) nebo mutací polohy na specifické požadované aminokyseliny, aby se identifikovaly aminokyselinové zbytky zvyšující aktivitu, expresi a čištění modifikovaných protilátek (například v hostitelském systému, který nezobrazuje fága), měření aktivity modifikovaných protilátek vůči antigenů (například měření rychlostní konstanty k_offanalýzou BIAcore), opakování těchto kroků pro jiné polohy CDR, je-li to nezbytné, a kombinace jednotlivých mutací, o kterých je známo, že zlepšily aktivitu a testování skutečnosti, zda kombinace generují protilátku sještě vyšší aktivitou (například afinitou nebo neutralizační silou) ve srovnání s rodičovskou protilátkou nebo s její částí vázající se na antigen.

Tedy v jednom provedení vynálezu poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen obsahující:

a) poskytnutí původní protilátky nebo její části,

b) výběr v pořadí 1) preferovaná poloha selektivní mutageneze, 2) kontaktní poloha nebo 3) hypermutační poloha pro mutaci v oblasti určující komplementaritu, čímž se identifikuje vybraná poloha selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační poloha,

c) jednotlivé mutace uvedené vybrané preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se tvoří soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,

d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen,

e) je možné opakovat kroky a) až d) v případě alespoň jedné jiné preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní polohy nebo hypermutační polohy,

f) kombinace v původní protilátce nebo její části vázající se na antigen jednotlivých mutací, které mají zvýšenou aktivitu, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a

g) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou ve vztahu k původní protilátce nebo j její části vázající se na antigen. Vybraná protilátka nebo protilátky mají s výhodou zlepšenou aktivitu, aniž ztrácí alespoň jednu požadovanou charakteristiku nebo vlastnost původní protilátky nebo si ji zachovávají, jak se popisuje shora v textu. Požadovaná vlastnost nebo charakteristika může být měřena nebo pozorována odborníkem použitím metody známé v oboru.

Preferované kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96. Preferované hypermutační polohy jsou vybrány ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93. Více výhodné preferované polohy selektivní mutageneze jsou vybrány ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 a L94. Zvláště preferované kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny obsahující L50 a L94.

V jiném provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen zahrnující:

a) poskytnutí původní protilátky nebo její části,

b) výběr preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní polohy nebo hypermutační polohy pro mutaci v oblasti určující komplementaritu (CDR),

d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,

f) kombinace v původní protilátce nebo její části vázající se na antigen dvou jednotlivých aminokyselinových zbytků zvyšujících aktivitu, které prokázaly, že mají zvýšenou aktivitu, za vzniku kombinace protilátek se na antigen a

g) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo kjejí části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se dvěma aminokyselinovými zbytky zvyšujícími aktivitu ve vztahu k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen.

Preferované kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96. Preferované hypermutační polohy jsou vybrány ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93. Více výhodné preferované polohy selektivní mutageneze jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30,H31, H31B, H32, H33, H52, H56 H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 a L94. Zvláště preferované kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny obsahující L50 a L94.

V dalším provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen zahrnující:

a) poskytnutí původní protilátky nebo její části,

d) hodnocení aktivity skupiny mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,

e) je možné opakovat kroky a) až e) v případě alespoň jedné preferované polohy nebo hypermutační polohy,

f) kombinace v původní protilátce nebo její části vázající se na antigen tří jednotlivých aminokyselinových zbytků zvyšujících aktivitu, které prokázaly, že mají zvýšenou aktivitu, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a

g) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen se dvěma aminokyselinovými zbytky zvyšujícími aktivitu vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou ve vztahu k původní protilátce nebo k její části vázající se na antigen.

Aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu s výhodou nahradí aminokyselinové zbytky v polohách vybraných ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91,L92, L93, L94aL96.

Po mutagenezi jednotlivých vybraných poloh, mutované klony mohou být sekvenovány za účelem identifikace, které aminokyselinové zbytky byly zavedeny do vybrané polohy každého klonu. Pro sekvenování může být vybrán malý počet klonů (například přibližně 24), což by statisticky mělo vést k 10 až 15 jednotlivým protilátkám, zatímco může být sekvenován větší počet klonů (například vyšší než 60), aby se zajistilo, že jsou identifikovány protilátky s každou možnou substitucí ve vybrané poloze.

V jednom provedení vynálezu jsou nejdříve vybrány za účelem mutageneze kontaktní a/nebo hypermutační polohy v oblastech CDR3 těžkého a/nebo lehkého řetězce. Avšak v případě protilátek, které už byly afinitně maturovány in vitro náhodnou mutagenezi oblastí CDR3 pomocí selekcí na základě fágového zobrazení, mohou být přednostně nejdříve vybrány kontaktní a/nebo hypermutační polohy v CDRI nebo CDR2 těžkého a/nebo lehkého řetězce.

Ve více preferovaném provedení vynálezu jsou nejdříve pro mutagenezi vybrány preferované polohy selektivní mutageneze v oblastech CDR3 těžkého a/nebo lehkého řetězce. Avšak v případě protilátek, které už byly afinitně maturovány in vitro náhodnou mutagenezi oblastí CDR3 prostřednictvím selekce na základě fágového zobrazení, mohou být přednostně nejdříve vybrány preferované polohy selektivní mutageneze v CDRI nebo CDR2 těžkého a/nebo lehkého řetězce.

V jiném preferovaném provedení vynálezu optimalizace vybrané postupně následujícím způsobem: preferované polohy selektivní mutageneze vybrané ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 jsou mutovány každá nejdříve na alespoň 2 jiné aminokyselinové zbytky (výhodně 5 až 14 jiných aminokyselinových zbytků) a výsledné protilátky jsou charakterizovány zvýšenou afinitou, neutralizační silou (a snad také alespoň jednou jinou Zachovalou charakteristikou a vlastností mimoto diskutovanou). Jestliže mutace jediné preferované polohy selektivní mutageneze vůbec nebo dostatečně nezvyšuje afinitu nebo neutralizační sílu a jestliže dokonce kombinace více aminokyselin zvyšující aktivitu nahrazujících aminokyseliny v preferovaných polohách selektivní mutageneze nevede ke kombinační protilátce, která vykazuje cílovou aktivitu (zahrnující afinitu a/nebo neutralizační sílu), budou vybrány další aminokyselinové zbytky pro selektivní mutagenezi ze skupiny zahrnující H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A a L96 a jsou mutovány na alespoň 2 jiné aminokyseliny (přednostně 5 až 14 jiných aminokyselin) a výsledné protilátky jsou charakterizovány zvýšenou afinitou, neutralizační silou (a snad také alespoň jednou jinou mimoto diskutovanou zachovanou charakteristikou nebo vlastností).

Jestliže mutace jediného aminokyselinového zbytku vybraného ze skupiny H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A a L96 vůbec nebo dostatečně nezvyšuje aktivitu (zahrnující afinitu a/nebo neutralizační sílu) a jestliže dokonce kombinace více aminokyselin zvyšující aktivitu nahrazujících aminokyseliny v těchto polohách nevede ke kombinační protilátce, která vykazuje cílovou aktivitu (zahrnující afinitu a/nebo neutralizační sílu), budou vybrány další aminokyselinové zbytky pro selektivní mutagenezi ze skupiny zahrnující H33B, H52B, L31A a jsou mutovány na alespoň 2 jiné aminokyseliny (přednostně 5 až 14 jiných aminokyselin) a výsledné protilátky jsou charakterizovány zvýšenou afinitou, neutralizační silou (a snad také alespoň jednou jinou mimoto diskutovanou zachovanou charakteristikou nebo vlastností).

CZ 303725 Β6

Mělo by být jasné, že postupný přístup selektivní mutageneze může skončit v libovolném z kroků uvedených shora v textu, ihned jak byla identifikována protilátka s požadovanou aktivitou (zahrnující afinitu a neutralizační sílu). Jestliže mutageneze předem vybraných poloh identifikovala aminokyselinoví zbytky zvyšující aktivitu, ale kombinační protilátka stále nevykazuje cílovou aktivitu (zahrnující afinitu a/nebo neutralizační sílu) a/nebo jestliže identifikované aminokyseliny zvyšující aktivitu také ovlivňují jiné požadované charakteristiky a jsou proto nepřijatelné, zbývající zbytky CDR proto mohou být vystaveny mutagenezí (popisuje se v sekci IV).

Způsob podle vynálezu může být používán ke zlepšení aktivity protilátky nebo části vázající se na antigen, aby se dosáhlo předem stanovené cílové aktivity (například předem stanovená afinita a/nebo neutralizační síla a/nebo požadovaná vlastnost nebo charakteristika).

Tedy vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen, aby se docílilo předem stanovené cílové aktivity, přičemž způsob zahrnuje:

a) poskytnutí původní protilátky nebo její části,

b) výběr preferované polohy selektivní mutageneze, vybrané ze skupiny H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L91, L92, L93, L94

c) jednotlivé mutace uvedené vybrané preferované polohy selektivní mutageneze na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se vytvoří soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,

d) hodnocení aktivity prvního souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, aby se stanovilo zda mutace jedné polohy selektivní mutageneze produkuje protilátku nebo její část vázající antigen s předem stanovenou cílovou aktivitou nebo částečnou cílovou aktivitou,

e) kombinování postupným způsobem v původní protilátce nebo v její části vázající antigen jednotlivých mutací, které prokázaly, že mají zlepšenou aktivitu, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,

f) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen za účelem stanovení jestli kombinační protilátky nebo jejich části vázající se na antigen mají předem stanovenou cílovou aktivitu nebo částečnou cílovou aktivitu

g) jestliže kroky d) nebo f) nevedou ke vzniku protilátky nebo její část vázající se na antigen, které mají předem stanovenou cílovou aktivitu nebo vedou ke vzniku protilátky s pouze částečnou aktivitou, další aminokyselinové zbytky vybrané ze skupiny zahrnující H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A a L96 jsou mutovány na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se tvoří druhý soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,

h) hodnocení aktivity druhého souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen za účelem stanovení, jestli mutace jediného aminokyselinového zbytku vybraného ze skupiny obsahující H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A a L96 vede ke vzniku protilátky nebo její části vázající se na antigen, která má předem stanovenou cílovou aktivitu nebo částečnou aktivitu,

i) kombinování postupným způsobem v původní protilátce nebo v její části vázající antigen jednotlivých mutací popsaných v kroku g), které prokázaly, že mají zlepšenou aktivitu, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,

j) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen za účelem stanovení, jestli kombinační protilátky nebo jejich části vázající se na antigen mají předem stanovenou cílovou aktivitu nebo částečnou cílovou aktivitu,

k) jestliže kroky h) neboj) nevedou ke vzniku protilátky nebo její části vázající se na antigen, které mají předem stanovenou cílovou aktivitu, nebo vedou ke vzniku protilátky s pouze částečnou aktivitou, další aminokyselinové zbytky vybrané ze skupiny zahrnující H33B,

H52B a L31A jsou mutovány na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se tvoří třetí soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,

l) hodnocení aktivity třetího souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen za účelem stanovení, jestli mutace jediného aminokyselinového zbytku vybraného ze skupiny obsahující H33B, H52B a L31A vede ke vzniku protilátky nebo její části vázající se na antigen, která má předem stanovenou cílovou aktivitou nebo částečnou aktivitu,

m) kombinování postupných způsobem v původní protilátce nebo v její části vázající se na antigen jednotlivých mutací kroku k), které prokázaly, že mají zlepšenou aktivitu, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejích částí vázajících se na antigen,

n) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázající se na antigen za účelem stanovení, jestli kombinační protilátky nebo jejich části vázající se na antigen mají předem stanovenou cílovou aktivitu nebo částečnou cílovou aktivitu, čímž se produkuje protilátka nebo její část vázající se na antigen s předem stanovenou cílovou aktivitou.

Může být použita řada metod mutageneze, které zahrnují kompletaci pomocí PCR, mutagenezi podle Kunkela (dut-ung-) a mutagenezi pomocí PCR, mutagenezi podle Kunkela (dut-ung-) a mutagenezi řízenou trifosfátoligonukleotidy (Amersham Sculptor kit).

Pro expresi mutovaných protilátek mohou být použity různé hostitelské expresívní systémy, které zahrnují bakteriální, kvasinkové, bakulovirové a savčí expresívní systémy (stejně jako expresívní systémy zobrazující fága). Příkladem vhodného bakteriálního expresívního vektoru je pUCl 19(Sfi). Jiné protilátkové expresívní systémy jsou známy v oboru a/nebo jsou popsány dále v textu v sekci IV.

Modifikované protilátky nebo jejich části vázající se na antigen produkované metodou podle vynálezu mohou být identifikovány bez spoléhání se na metody fágového zobrazení, které se používají při selekci. Podobně, způsob podle vynálezu je zvláště výhodný při zlepšení aktivity rekombinantní původní protilátky nebo její části vázající se na antigen, ale jejíž aktivita nemůže být dále zlepšena mutagenezi v systému fágového zobrazení.

Tedy v jiném provedení vynález poskytuje způsob zlepšení afinity protilátky nebo její části vázající se na antigen zahrnující:

a) poskytnutí výchozí protilátky nebo její části, která byla získána selekcí v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita nemůže být dále zlepšena mutagenezi v uvedeném systému fágového zobrazení,

b) výběr preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní polohy nebo hypermutační polohy pro mutaci v oblasti určující komplementaritu (CDR), čímž se identifikuje vybraná kontaktní nebo hypermutační poloha,

e) je možné opakovat kroky b) až d) v případě alespoň jedné jiné preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní polohy nebo hypermutační polohy,

f) kombinování v původní protilátce nebo její části vázající se na antigen jednotlivých mutací, které ukázaly, že vykazují zlepšenou aktivitu za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a

g) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vztaženo k původní protilátce nebo k její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou ve vztahu k původní protilátce nebo k její části vázající se na antigen.

Pomocí dostupných metod není možné nebo je extrémně pracné získat protilátku se zvýšenou vazebnou afinitou a neutralizační silou, přičemž si zachovává jiné vlastnosti nebo charakteristiky protilátek, jak se diskutuje shora v textu. Způsob podle vynálezu však může snadno identifikovat takové protilátky. Protilátky vystavené způsobu podle vynálezu mohou pocházet z libovolného zdroje.

Proto v dalším provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen obsahující:

a) poskytnutí původní protilátky nebo její části vázající se na antigen,

d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebojejich částí vázajících se na antigen ve vztahu k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,

e) v souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vztaženo k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen se hodnotí alespoň jedna jiná vlastnost nebo charakteristika, přičemž vlastnost nebo charakteristika je ta, kterou je nutné v protilátce zachovat, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou a alespoň jednou zachovanou vlastností nebo charakteristickou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázajících se na antigen.

V preferovaném provedení vynálezu kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, Hl01, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu,

V jiném preferovaném provedení vynálezu jsou hypermutační polohy vybrány ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.

Ve více preferovaném provedení vynálezu zbytky vhodné pro selektivní mutagenezí jsou vybrány ze skupiny obsahujících H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 a L94 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity sjinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.

Ve více preferovaném provedení vynálezu zvláště preferované kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny obsahující L50 a L94 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity sjinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.

Kdyby tedy měla být afinita protilátky vůči specifickému antigenu zlepšena, ale způsob fágového zobrazení (nebo příbuzný systém zahrnující zobrazení ribozomu) není déle aplikovatelný a měly by být zachovány jiné požadované vlastnosti nebo charakteristiky, může být použita metoda podle vynálezu.

Tedy v dalším provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen, který zahrnuje:

a) poskytnutí rekombinantní původní protilátky nebo její části, která byla získána selekcí v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita nemůže být dále zlepšena mutagenezí v uvedeném systému fágového zobrazení,

b) výběr preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy pro mutaci v oblasti určující komplementaritu (CDR), čímž se identifikuje vybraná poloha selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační poloha,

c) jednotlivé mutace uvedené vybrané preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy alespoň na dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se tvoří soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese uvedeného souboru v systému nefágového zobrazení,

f) je možné opakovat kroky a) až e) v případě alespoň jedné jiné preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní polohy nebo hypermutační polohy,

g) kombinování v původní protilátce nebo její části vázající se na antigen alespoň dvou jednotlivých aminokyselinových zbytků zvyšujících aktivitu, které ukázaly, že vykazují zlepšenou aktivitu a alespoň jednu zachovanou vlastnost nebo charakteristiku, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a

h) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou vztaženo k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen.

V preferovaném provedení vynálezu kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, Η101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity sjinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.

V jiném preferovaném provedení vynálezu jsou hypermutační polohy vybrány ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.

Ve více preferovaném provedení zbytky vhodné pro selektivní mutagenezí jsou vybrány ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L34, L50, L91, L92, L93 a L94 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.

Ve více preferovaném provedení vynálezu jsou kontaktní polohy vybrány ze skupiny obsahující L50 a L94 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.

V dalším provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen, který zahrnuje:

V preferovaném provedení vynálezu kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity sjinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.

V dalším preferovaném provedení vynálezu jsou hypermutační polohy vybrány ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.

Ve více preferovaném provedení vynálezu jsou zbytky pro selektivní mutagenezi vybrány skupiny sestávající z H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L9 i, L93, L94 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.

Ve více preferovaném provedení vynálezu jsou konstantní polohy vybrány ze skupiny obsahující L50 a L94 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.

V jiném provedení vynálezu poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen, který zahrnuje:

b) výběr preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy pro mutaci v oblasti určující komplementaritu (CDR), čímž se identifikuje vybraná kontaktní nebo hypermutační poloha,

c) jednotlivé mutace uvedených vybraných preferovaných poloh selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy alespoň na dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se tvoří soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese uvedeného souboru v systému nefágového zobrazení,

e) v souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen se hodnotí alespoň jedna jiná vlastnost nebo charakteristika, přičemž vlastnost nebo charakteristika je ta, kterou je nutné v protilátce zachovat, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou a alespoň jednou zachovanou vlastností nebo charakteristickou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázajících se na antigen,

g) kombinování v původní protilátce nebo její části vázající se na antigen alespoň dvou jednotlivých aminokyselinových zbytků zvyšujících aktivitu, které ukázaly, že vykazují zlepšenou aktivitu a alespoň jednu zachovanou jinou charakteristiku za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a

h) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou a alespoň jednou zachovanou vlastností nebo charakteristikou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen.

V preferovaném provedení vynálezu kontaktní polohy jsou vybrány ze skupiny zahrnující H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, Η101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity sjinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.

V jiném preferovaném provedení vynálezu jsou hypermutační polohy vybrány ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity sjinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferencí volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.

Ve více preferovaném provedení vynálezu zbytky vhodné pro selektivní mutagenezi jsou vybrány ze skupiny obsahující H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L31, L32, L50, L91, L92, L93 a L94 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity sjinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 s výhodou v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferencí volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.

Ve více preferovaném provedení vynálezu jsou kontaktní polohy vybrány ze skupiny obsahující L50 a L94 a další charakteristika je vybrána z 1) zachování nezkřížené reaktivity sjinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislostí s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.

IV. Modifikace jiných zbytků CDR

Všechny zbytky CDR v daném páru protilátka-antigen identifikované libovolným způsobem jsou nutné jako aminokyselinové zbytky zvyšující aktivitu a/nebo jsou nutné přímo nebo nepřímo při navázání na antigen a/nebo při zachování jiných požadovaných vlastností nebo charakteristik protilátky. Takové zbytky CDR jsou označovány jako „preferované polohy selektivní mutageneze“. Mělo by být poznamenáno, že při specifických okolnostech, tyto preferované zbytky selektivní mutageneze mohou být identifikovány také jinými způsoby, které zahrnují společnou krystalizaci protilátky a antigenu a molekulární modelování.

Jestliže jsou preferované pokusy identifikovat aminokyseliny zvyšující aktivitu zaměřující se na preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní a hypermutační polohy popsané shora v textu vyčerpány nebo jestliže jsou nutná další zlepšení, mohou být modifikovány zbývající zbytky CDR, jak se popisuje dále v textu. Mělo by být jasné, že protilátka by mohla už být jasné, že protilátka by mohla už být modifikována v libovolné jedné nebo více kontaktních nebo hypermutačních polohách v souladu s provedeními vynálezu diskutovanými shora v textu, ale může být nutné další zlepšení. Proto vjiném provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen zahrnující:

c) jednotlivé mutace uvedené vybrané polohy například na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se vytvoří mutovaná protilátka nebo soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,

d) hodnocení aktivity mutované protilátky nebo souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,

e) u mutovaných protilátek a souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen se hodnotí změny alespoň jedné vlastnosti nebo charakteristiky, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající na antigen.

Přednostně se jiná charakteristika nebo vlastnost vybrala z 1) zachování nezkřížené reaktivity sjinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, který předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.

Jestliže mutageneze jediného zbytku není dostatečná, mohou být zahrnuty jiné zbytky, proto se vjiném provedení vynálezu poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen, který zahrnuje:

c) jednotlivé mutace uvedené vybrané polohy například na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, Čímž se vytvoří mutované protilátky nebo soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,

d) hodnocení aktivity souboru mutovaných protilátek nebo jejich Částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,

f) kombinování v původní protilátce nebo její části vázající se na antigen alespoň dvou aminokyselinových zbytků, které individuálně zvyšují aktivitu a které ukázaly, že mají zlepšenou aktivitu, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a

g) hodnocení aktivity kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen se dvěma aminokyselinovými zbytky zesilující aktivitu ve vztahu k původní protilátce nebo k její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část, která se váže na antigen, se zlepšenou aktivitou vzhledem k výchozí protilátce nebo její části vázající se na antigen.

Jestliže jsou preferované pokusy identifikovat aminokyseliny zvyšující aktivitu zaměřující se na kontaktní nebo hypermutační polohy popsané shora v textu vyčerpány nebo jestliže jsou nutná další zlepšení a diskutovaná protilátka nemůže být dále optimalizována mutagenezí a metodami fágového zobrazení (nebo příbuzným zobrazením ribozomu), mohou být modifikovány zbývající zbytky CDR, jak se popisuje dále v textu. Mělo by být jasné, že protilátka by mohla už být modifikována v libovolné jedné nebo více preferovaných polohách selektivní mutageneze, v kontaktních nebo hypermutačních polohách v souladu s provedeními vynálezu diskutovanými shora v textu, ale může být nutné další zlepšení.

Proto v dalším provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen zahrnující:

a) poskytnutí rekombinantní původní protilátky nebo její části vázající se na antigen, která se získala výběrem v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita nemůže být dále zlepšena mutagenezí v uvedeném systému fágového zobrazení,

b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci, v polozejiné než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96

c) jednotlivé mutace uvedené vybrané kontaktní nebo hypermutační polohy na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se vytvoří soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese uvedeného souboru v systému nefágového zobrazení,

e) u souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen se hodnotí změny alespoň jedné vlastnosti nebo charakteristiky, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající na antigen.

Přednostně se jiná charakteristika nebo vlastnost vybrala z 1) zachování nezkřížené reaktivity sjinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, což předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.

Jestliže jediná mutageneze není dostatečná, aby zvýšila afinitu protilátky, mohou být do mutageneze zahrnuty jiné zbytky. Proto v jiném provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen, který zahrnuje:

a) poskytnutí původní protilátky nebo její části vázající se na antigen, která se získala selekcí v systému fágového zobrazení, ale jejíž aktivita nemůže být dále zlepšena mutagenezí v uvedeném systému fágového zobrazení,

b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci, v polozejiné než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58,

H95, H96, H97, H98, Η101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,

c) jednotlivé mutace uvedené vybrané polohy na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se vytvoří soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, a exprese v systému nefágového zobrazení,

e) opakování kroků b) až d) pro alespoň jednu jinou polohu CDR, kterou není ani poloha vybraná v odstavci b) ani poloha H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, HI01, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94,

f) kombinování v původní protilátce nebo její části vázající se na antigen alespoň dvou aminokyselinových zbytků individuálně zvyšujících aktivitu, které ukázaly, že mají zlepšenou aktivitu, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a

g) hodnocení aktivity kombinačních protilátek a jiných vlastností nebo charakteristik kombinačních protilátek nebo jejich částí vázající se na antigen s dvěma aminokyselinovými zbytky zesilujícími aktivitu ve vztahu k původní protilátce nebo k její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou, což se vztahuje k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen.

Přednostně se jiná charakteristika nebo vlastnost vybrala z 1) zachování nezkřížené reaktivity s jinými proteiny nebo lidskými tkáněmi, 2) zachování rozpoznání epitopu, to je rozpoznání epitopu podjednotky p40 výhodně v souvislosti s heterodimerem p70 p40/p35, což předchází vazebné interferenci volné rozpustné podjednotky p40 a/nebo 3) produkce protilátky se sekvencí blízkou sekvenci embryonálního imunoglobulinu.

Preferované pokusy identifikovat aminokyseliny zvyšující aktivitu zaměřující se na preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní nebo hypermutační polohy popsané shora v textu mohou být vyčerpány nebo mohou být nutná další zlepšení aje důležitá zachovat jiné vlastnosti nebo charakteristiky protilátky.

Proto v dalším provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen, bez ovlivnění jiných charakteristik, který zahrnuje:

c) jednotlivé mutace uvedené vybrané polohy na alespoň dva jiné aminokyselinové zbytky, čímž se vytvoří soubor mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen,

e) u souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen se hodnotí změny alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky, vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou a zachovanou jednou vlastností nebo charakteristikou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající na antigen.

Jestliže mutageneze jediného zbytku není dostatečná, mohou být zahrnuty jiné zbytky, proto se vjiném provedení vynález popisuje metoda zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen, který zahrnuje:

b) výběr aminokyselinového zbytku v oblasti určující komplementaritu (CDR) pro mutaci, v polozejiné než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, Η101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,

e) u souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen, vzhledem původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, se hodnotí změny alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky,

g) kombinování v původní protilátce nebo její části vázající se na antigen alespoň dvou aminokyselinových zbytků, které individuálně zvyšují aktivitu a které ukázaly, že mají zlepšenou aktivitu a neovlivňují alespoň jednu jinou vlastnost nebo charakteristiku, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a

h) hodnocení aktivity a zachování alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen s dvěma aminokyselinovými zbytky zesilujícími aktivitu ve vztahu k původní protilátce nebo k její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část, která se váže na antigen, se zlepšenou aktivitou a alespoň jednou zachovanou jinou vlastností nebo charakteristikou vztaženo k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen.

Mutageneze preferovaného polohy selektivní mutageneze, kontaktních a hypermutačních zbytků nemusí dostatečně zvýšit afinitu protilátky a mutageneze a způsob zobrazující fága (nebo příbuzná metoda zobrazující ribozom) nemusí být dále použitelné a měla by být zachována alespoň jedna charakteristika nebo vlastnost protilátky.

Proto v dalším provedení vynález poskytuje způsob zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen, který zahrnuje:

e) u souboru mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen se hodnotí změny alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající na antigen.

Jestliže mutageneze jediného zbytku není dostatečná, mohou být zahrnuty jiné zbytky, proto v jiném provedení vynález poskytuje metodu zlepšení aktivity protilátky nebo její části vázající se na antigen, který zahrnuje:

d) hodnocení aktivity a zachování alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky panelu mutovaných protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen, čímž se identifikuje aminokyselinový zbytek zvyšující aktivitu,

e) opakování kroků b) až d) pro alespoň jednu jinou polohu CDR, kterou není ani poloha vybraná v odstavci b) ani poloha H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, Hl01, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,

f) kombinování v původní protilátce nebo její části vázající se na antigen alespoň dvou aminokyselinových zbytků, které individuálně zvyšují aktivitu a které ukázaly, že mají zlepšenou aktivitu a neovlivňují alespoň jednu jinou vlastnost nebo charakteristiku, za vzniku kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen a

g) hodnocení aktivity a zachování alespoň jedné jiné vlastnosti nebo charakteristiky kombinačních protilátek nebo jejich částí vázajících se na antigen s dvěma aminokyselinovými zbytky zesilujícími aktivitu vztaženo k původní protilátce nebo k její části vázající se na antigen, dokud se nezíská protilátka nebo její část vázající se na antigen se zlepšenou aktivitou a alespoň jednou zachovanou jinou vlastností nebo charakteristikou vzhledem k původní protilátce nebo její části vázající se na antigen.

V. Exprese protilátek

Protilátka nebo část protilátky podle vynálezu může být připravena rekombinantní expresí genů lehkého a těžkého řetězce imunoglobulinů v hostitelské buňce. Aby došlo k expresi rekombinantní protilátky, hostitelská buňka se transfekovala jedním nebo více rekombinantními expresívními vektory, které nesou fragmenty DNA kódující imunoglobulinový lehký a těžký řetězec protilátky tak, že lehký a těžký řetězec je exprimován v hostitelské buňce a přednostně se vylučuje do média, ve kterém jsou kultivovány hostitelské buňky a ze kterého jsou protilátky získávány. Aby se získaly geny těžkého a lehkého řetězce protilátky, jsou používány standardní metody rekombinace DNA, přičemž se tyto geny začlení do rekombinantních expresívních vektorů a vektory se zavedou do hostitelských buněk, jak se popisuje v publikaci Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausbel, F. M. et al., (eds.) Current Protocola in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) a v patentu US 4 816 397 (Boss et al.,).

Aby se získal fragment DNA kódující variabilní oblast těžkého řetězce protilátky Joe 9 wt nebo protilátky příbuzné Joe 9 wt, testovaly se a mutovaly se protilátky specifické pro lidský IL-12 pocházející z lidské knihovny, jak se popisuje v sekci II. Když jsou získány fragmenty DNA kódující segmenty VH a VL protilátky Joe 9 wt nebo protilátky příbuzné protilátce Joe 9 wt, mutageneze těchto sekvencí je provedena standardními metodami, jako je místně řízená mutageneze (mutageneze zprostředkovaná PCR, ve které jsou mutované nukleotidy začleněny do primerů PCR tak, že produkt PCR obsahuje mutace) nebo jinými metodami místně řízené mutageneze. Protilátky proti lidskému IL-12, které vyjadřovaly potřebný stupeň aktivity a vazebné specifity/afinity, jako je například J695, byly dále manipulovány standardními metodami rekombinace DNA, například se variabilní oblasti genů přemění na geny řetězců protilátky plné délky, na geny fragmentů Fab nebo na gen scFv. Při těchto manipulacích DNA kódující fragment VL nebo VH je operativně spojený s jiným fragmentem DNA, který kóduje jiný protein, jako je konstantní oblast protilátky nebo flexibilní spojka. Termín „operativně spojený“ používaný v tomto kontextu znamená, že dva fragmenty DNA jsou spojeny tak, že aminokyselinové sekvence kódované dvěma fragmenty DNA zůstávají v rámci.

Izolovaná DNA kódující oblast VH může být přeměněna na gen těžkého řetězce plné délky operativním spojením DNA kódující VH kjiné molekule DNA kódující konstantní oblasti těžkého řetězce (CH1, CH2 a CH3). V oboru jsou známy sekvence genů konstantní oblasti lidského těžkého řetězce (popisuje se například v publikaci Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication č. 91-3242) a fragmenty DNA obsahující tyto oblasti mohou být získány standardními amplifikaci PCR. Konstantní oblast těžkého řetězce může být konstantní oblast IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM nebo IgD a libovolná alotypická varianta, jak se popisuje v publikaci Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication č. 91-3242), ale nejvýhodnější je konstantní oblast IgGl nebo IgG4. V případě genu těžkého řetězce fragmentu Fab DNA kódující VH může být operativně spojena sjinou molekulou DNA, která kóduje pouze konstantní oblast CH1 těžkého řetězce.

Izolovaná DNA kódující oblast VL může být přeměněna na gen lehkého řetězce plné délky (stejnéjako gen lehkého řetězce fragmentu Fab) operativním spojením DNA kódující VL sjinou molekulou DNA, která kóduje konstantní oblast lehkého řetězce CL. Sekvence genů konstantní oblasti lidského lehkého řetězce jsou známy v oboru (popisuje se například v publikaci Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication č. 91-3242) a fragmenty DNA obsahující tyto oblasti mohou být získány standardními amplifikaci pomocí PCR. Konstantní oblast lehkého řetězce může být konstantní oblast kappa nebo lambda, ale nejvýhodnější je konstantní oblast lambda.

Aby se vytvořil gen scFv, fragmenty DNA kódující VH a VL jsou operativně spojeny s jiným fragmentem kódujícím flexibilní spojku, například kódující aminokyselinovou sekvenci (Gly₄— Ser₃) tak, že sekvence VH a VL mohou být exprimovány jako kontinuální jednořetězcový protein s oblastmi VL a VH spojenými flexibilní spojkou (popisuje se například v publikaci Bird et al., (1988) Science 242: 423 až 426, Huston et al., (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5879 až 5883, McCafferty et al., Nátuře (1990) 348: 552 až 554).

Aby se exprimovaly protilátky nebo části protilátek podle vynálezu, DNA kódující lehké a těžké řetězce částečné nebo plné délky získané způsobem popsaným shora v textu, jsou začleněny do expresívních vektorů tak, že geny jsou operativně spojeny se sekvencemi, které řídí transkripci a translaci. V tomto kontextu termín „operativně spojený“ znamená, že gen protilátky je ligován do vektoru tak, že sekvence řídící transkripci a translaci ve vektoru plní svou funkci regulace transkripce a translace genu protilátky. Expresivní vektor a sekvence řídící expresi jsou vybrány tak, aby byly kompatibilní s užívanou expresivní hostitelskou buňkou. Gen lehkého a těžkého řetězce protilátky může být začleněn do nezávislého vektoru nebo ve více typickém případě se oba geny začlenily do stejného expresívního vektoru. Geny protilátky jsou začleněny do expresívního vektoru standardními metodami (například ligací komplementárních restrikčních míst ve fragmentu genu protilátky nebo vektoru nebo ligací tupých konců, jestliže není přítomné žádné restrikční místo). Před začleněním sekvencí lehkého nebo těžkého řetězce protilátky J695 nebo protilátky příbuzné J695, expresivní vektor může už nést sekvence konstantní oblasti protilátky. Jeden přístup konverze sekvencí VH a VL protilátky J695 nebo protilátky příbuzné protilátce J695 na geny protilátky plné délky je jejich začlenění do expresívních vektorů, které už kódují konstantní oblasti těžkého a lehkého řetězce, respektive tak, že segment VH je operativně spojen se segmentem(y) CH ve vektoru a segment VL je operativně spojen se segmentem CL ve vektoru. Navíc nebo v jiném případě rekombinantní expresivní vektor může kódovat signální peptid, který umožňuje vylučování řetězce protilátky z hostitelské buňky. Gen řetězce protilátky může být klonován do vektoru tak, že signální peptid je spojen v rámci s N-koncem genu řetězce protilátky. Signální peptid může být signální peptid imunoglobulinu nebo heterologní signální peptid (to je signální peptid z proteinu, který není imunoglobulin).

Vedle genů řetězce protilátky rekombinantní expresivní vektory podle vynálezu nesou regulační sekvence, které řídí expresi genů řetězce protilátky v hostitelské buňce. Termín „regulační sekvence“ zahrnuje promotory, zesilovače a jiné elementy řídící expresi (například polyadenylační signály), které řídí transkripci nebo translaci genů řetězce protilátky. Takové regulační sekvence jsou popsány například v publikaci Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academie Press, San Diego, CA (1990). Pro odborníka je přínosné, když provedení expresívního vektoru zahrnující selekci regulačních sekvencí může záviset na takových faktorech jako je volba hostitelské buňky, která bude transformován, síla exprese požadovaného proteinu atd.. Preferované regulační sekvence exprese savčí hostitelské buňky zahrnují virové elementy, které řídí vysokou sílu exprese proteinu v savčích buňkách tak, jako promotory a/nebo zesilovače získané z cytomegaloviru (CMV) (jako je promotor/zesilovač CMV), opičího viru 40 (SV40) (jako je promotor/zesilovač CMV), opičího viru 40 (SV40) (jako je promotor/zesilovač SV40), adenoviru (například adenovirový hlavní pozdní promotor (AdMPL)) a polyoma. Popis virových regulačních elementů a sekvencí se uvádí v patentových dokumentech patent US 5 168 062 (Stinski), patent 4 510 254 (Bell et al.) a patent US 4 968 615 (Schaffner et al.,), patent US 5 464 758 (Bujard et al.,) a patent US 5 654 168 (Bujard et al.,).

Vedle genů řetězce protilátky a regulačních sekvencí rekombinantní expresivní vektory podle vynálezu mohou nést další sekvence, jako jsou sekvence, které regulují replikaci vektoru v hostitelských buňkách (např. počátek replikace) a selektovatelné markerové geny. Selektovatelný markerový gen umožňuje selekci hostitelských buněk, do kterých byl zaveden vektor (popisuje se například v dokumentech patent US 4 399 216, US 4 634 665 a US 5 179 017 (Axel et al.). V typickém případě například selektovatelný markerový gen poskytuje hostitelské buňce, do které byl vektor zaveden, rezistenci na léky, jako je G418, hygromycin nebo methotrexát. Preferované selektovatelné markerové geny zahrnují gen dihydrofolátové reduktázy (DHFR) (pro pouCZ 303725 B6 žití v hostitelských buňkách dhfr s se selekcí na methotrexátu/amplifikací) a gen neo (v případě selekce pomocí G418).

Aby se dosáhlo exprese lehkého a těžkého řetězce, expresívní vektor(y) kódující těžký a lehký řetězec je transfekován do hostitelské buňky standardními postupy. Různé formy termínu „transfekce“ zahrnují široký sortiment postupů běžně užívaných pro zavedení exogenní DNA do prokaryontní nebo eukaryontní hostitelské buňky, například elektroporací, srážením fosforečnanem vápenatým, transfekci dextranem-DEAE a podobně. Ačkoli je teoreticky možné exprimovat protilátky podle vynálezu buď v prokaryontních, nebo eukaryontních hostitelských buňkách, nejvíce je preferována exprese protilátek v eukaryontních buňkách a nejvýhodněji v savčích hostitelských buňkách, protože takové eukaryontní buňky a zvláště savčí buňky s větší pravděpodobností ve srovnání s prokaryontními buňkami tvoří a vylučují správě sbalenou a imunologicky aktivní protilátku. Preferované savčí hostitelské buňky vhodné pro expresi rekombinantních protilátek podle vynálezu zahrnují buňky vaječníků čínských křečků (buňky CHO) (zahrnující buňky dhfr-CHO popsané v publikaci Urlaub and Chasin, (1980) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77: 4216 až 4220, užívané se selekčním markérem DHFR, například jak se popisuje v publikaci Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601 až 621), buňky myelomu NS0, buňky COS a SP2. Když rekombinantní expresívní vektory kódující geny protilátek jsou zavedeny do savčích hostitelských buněk, protilátky jsou produkovány kultivací hostitelských buněk po časový úsek, který je dostatečný, aby umožnil expresi protilátky v hostitelských buňkách nebo výhodněji, vylučování protilátky do kultivačního média, ve kterém jsou kultivovány hostitelské buňky. Protilátky mohou být získány z kultivačního média za použití standardních metod čištění proteinu.

Hostitelské buňky mohou být také užívány k produkci částí intaktních protilátek, jako jsou fragmenty Fab nebo molekuly scFV. Rozumí se, že varianty shora popsaného postupu jsou obsahem vynálezu. Může být například nutné transfekovat hostitelskou buňku DNA kódující buď lehký, nebo těžký řetězec (ale nikoliv oba řetězce) protilátky podle vynálezu. Technologie rekombinace DNA může také být používána k odstranění části nebo celé DNA kódující buď lehký, nebo těžký řetězec nebo oba, která není nutná při navázání na hIL-12. Molekuly exprimované z takových zkrácených molekul DNA jsou také zahrnuty protilátkami podle vynálezu. Navíc mohou být produkovány bifunkční protilátky, ve kterých jeden těžký a jeden lehký řetězec je protilátka podle vynálezu a další těžký a lehký řetězec je specifický pro antigen jiný než hIL-12, prokřížením protilátky podle vynálezu s druhou protilátkou standardními metodami chemického zesítění.

V preferovaném systému pro expresi rekombinantní protilátky nebo její části vázající se na antigen podle vynálezu, je rekombinantní expresívní vektor kódující těžký a lehký řetězec protilátky zaveden do buněk dhfr CHO transfekci zprostředkovanou fosforečnanem vápenatým. V rekombinantním expresívním vektoru jsou geny těžkého a lehkého řetězce protilátky každý operativně spojen s regulačními elementy zesilovače/promotoru (získané například z SV40, CMV, adenoviru a podobně, jako je zesilovač CMV/promotorový regulační element AdMPL nebo zesilovač SV40/promotorový regulační element AdMLP), aby došlo k vysokému stupni transkripce genů. Rekombinantní expresívní vektor také nese gen DHFR, který umožňuje selekci buněk CHO, které byly transfekovány vektorem za použití methotrexátové selekce/amplifíkace. Vybrané transformované hostitelské buňky jsou kultivovány, aby se umožnila exprese těžkého a lehkého řetězce protilátky a z kultivačního média je získávána intaktní protilátka. Pro přípravu rekombinantního expresívního vektoru, transfekovaných hostitelských buněk, při výběru transformantů, při kultivaci hostitelských buněk a získání protilátky z kultivačního média jsou používány standardní metody molekulární biologie. Protilátky nebo jejich části vázající se na antigen podle vynálezu mohou být exprimovány ve zvířeti (například v myši), které je transgenní v případě genů lidského imunoglobuíinu (popisuje se například v publikaci Taylor L. D. et al., (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287 až 6295). Rostlinné buňky mohou být také modifikovány za vzniku transgenních rostlin, které exprimují protilátku nebo její část vázající se na antigen podle vynálezu.

Na základě předchozího textu vynález popisuje směs nukleové kyseliny, vektoru a hostitelské buňky, která může být použita při expresi rekombinantní protilátky a části protilátek podle vynáCZ 303725 B6 lezu. Vynález s výhodou charakterizuje izolované nukleové kyseliny, které kódují CDR protilátky J695 nebo variabilní oblast celého těžkého a/nebo lehkého řetězce protilátky J695. Podobně v jednom provedení vynálezu se charakterizuje izolovaná nukleová kyselina kódující variabilní oblast těžkého řetězce protilátky, která kóduje CDR3 těžkého řetězce protilátky J695 obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 25. Přednostně nukleová kyselina kódující variabilní oblast těžkého řetězce protilátky dále kóduje CDR2 těžkého řetězce protilátky J695, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 27. Výhodnější je, když nukleová kyselina kódující variabilní oblast těžkého řetězce protilátky dále kóduje CDR2 těžkého řetězce protilátky J695, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 29. Dokonce výhodnější je, když izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilní oblast těžkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 31 (celá oblast VH protilátky J695).

Vjiných provedeních vynálezu se charakterizuje izolovaná nukleová kyselina kódující variabilní oblast lehkého řetězce protilátky, která kóduje CDR3 lehkého řetězce protilátky J695 obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 26. Výhodnější je, když nukleová kyselina kódující variabilní oblast lehkého řetězce protilátky dále kóduje CDR2 lehkého řetězce protilátky J695, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 28. Výhodnější je, když nukleová kyselina kódující variabilní oblast lehkého řetězce protilátky díle kóduje CDRI lehkého řetězce která obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 30. Dokonce výhodnější je, když izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilní oblast lehkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 32 (celá oblast VH protilátky J695).

Vynález také poskytuje rekombinantní expresivní vektory kódující těžký a lehký řetězec protilátky. V jednom provedení vynálezu se například popisuje rekombinantní expresivní vektor kódující:

a) těžký řetězec protilátky, který má variabilní oblast obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 31 a

b) lehký řetězec protilátky, který má variabilní oblast obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 32.

Vynález také poskytuje hostitelské buňky, do kterých byly zavedeny rekombinantní expresivní vektory podle vynálezu. Hostitelskou buňkou je s výhodou savčí hostitelská buňka, výhodnější je, když hostitelskou buňkou je buňka CHO, NS0 nebo COS. Vynález dále poskytuje způsob syntézy rekombinantní lidské protilátky podle vynálezu kultivací hostitelské buňky podle vynálezu ve vhodném kultivačním médiu, dokud není syntetizována rekombinantní lidská protilátka podle vynálezu. Způsob může dále zahrnovat izolaci rekombinantní lidské protilátky z kultivačního média.

VI. Farmaceutické prostředky a farmaceutická aplikace

Protilátky a části protilátek podle vynálezu mohou být začleněny do farmaceutických prostředků vhodných pro aplikaci subjektu. V typickém případě farmaceutický prostředek obsahuje protilátku nebo její část vázající se na antigen a farmaceuticky přijatelný nosič. V tomto vynálezu termín „farmaceuticky použitelný nosič“ zahrnuje libovolná a všechna rozpouštědla, disperzní média, potahová činidla, antibakteriální a fungicidní činidla, izotonická činidla a činidla zpožďující absorpci a podobně, která jsou fyziologicky kompatibilní. Příklady farmaceuticky přijatelných nosičů zahrnují jeden nebo více činidel ze skupiny obsahující vodu, fyziologický roztok fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem, dextrózu, glycerol, ethanol a podobně, stejně jako jejich kombinace. V mnoha případech bude výhodné, když prostředek zahrnuje izotonická činidla například cukry, polyalkoholy, jako je manitol, sorbitol nebo chlorid sodný. Farmaceuticky přijatelné nosiče mohou dále obsahovat malé množství pomocných látek, jako je smáčecí nebo emulgační činidlo, konzervační činidlo nebo pufry, které prodlužují možnou dobu skladování nebo účinnost protilátky nebo její Části.

Protilátky nebo jejich části podle vynálezu mohou být začleněny do farmaceutického prostředku vhodného pro parenterální aplikaci. Přednostně protilátka nebo její části budou připravovány jako roztok obsahující 0,1 až 250 mg/ml protilátky vhodný pro zavedení injekcí. Roztok vhodný pro aplikaci injekcí může být obsažen buď v kapalné, nebo lyofilizované dávkové formě ve zkumavce, ampuli nebo předem naplněné injekční stříkačce z bílého nebo ambrového skla. Pufrem může být L-histidin (1 až 50mM, v optimálním případě 5 až lOmM s hodnotou pH 5,0 až 7,0 (v optimálním případě hodnota pH je 6,0). Jiné vhodné pufry zahrnují, ale nejsou omezeny na sukcinát sodný, citrát sodný, fosforečnan sodný nebo fosforečnan vápenatý. Chlorid sodný může být používán k modifikaci toxicity roztoku v koncentraci 0 až 300mM (v případě kapalné dávkové formy je optimální hodnota koncentrace 150mM). Ochranná činidla proti poškození při hlubokém zmrazení mohou být zahrnuty v lyofilizované dávkové formě, v principu jde o 0 až 10 % sacharózy (v optimálním případě 0,5 až 1,0 %). Jiná vhodná ochranná činidla proti poškození při hlubokém zmrazení zahrnují trehalózu a laktózu. V lyofilizované dávkové formě mohou být obsažena objemová činidla, hlavně 1 až 10 % manitolu (v optimálním případě 2 až 4%). Jak v kapalné tak lyofilizované dávkové formě mohou být používány stabilizační činidla, hlavně 1 až 50mM L-methionin (v optimálním případě 5 až lOmM). Jiná vhodná objemová činidla zahrnují glycin, arginin a mohou být obsaženy jako 0 až 0,05% polysorbát-80 (v optimálním případě 0,005 až 0,01%). Další povrchově aktivní činidla zahrnují, ale nejsou omezena na polysorbát 20 a BR1J.

V preferovaném provedení vynálezu farmaceutický prostředek zahrnuje protilátku v dávce přibližně 0,01 až 10 mg/kg. Výhodnější dávky protilátky zahrnují 1 mg/kg aplikovaný ob týden nebo 0,3 mg/kg aplikovaný jednou týdně.

Prostředky podle vynálezu mohou být v různých formách. Tyto formy zahrnují například kapalné, semi-pevné a pevné dávkové formy, jako jsou kapalné roztoky (například roztoky vhodné pro zavedení injekcí a infúzí), disperze nebo suspenze, tablety, pilulky, prášky, lipozomy a čípky. Výhodná forma závisí na módu aplikace a na terapeutické aplikaci. Typické výhodné prostředky jsou ve formě roztoků vhodných pro zavedení injekcí a infúzí, jako jsou prostředky podobné těm používaných v případě pasivní imunizace lidí sjinými protilátkami. Výhodný mód aplikace je parenterální (například intravenózní, subkutánní, intraperitoneální, intramuskulámí).

V preferovaném provedení vynálezu je protilátka aplikována intravenózní infúzí nebo injekcí.

V jiném preferovaném provedení vynálezu je protilátka aplikována intramuskulámí nebo subkutánní injekcí.

Terapeutické prostředky musí být v typickém případě za výrobních a skladovacích podmínek sterilní a stabilní. Prostředek může tvořit roztok, mikroemulzí, disperzi, lipozom nebo jinou uspořádanou strukturu vhodnou pro léky s vysokou koncentrací. Sterilní roztoky vhodné pro zavedení injekcí mohou být připraveny začleněním aktivní látky (to je protilátky nebo její části) v požadovaném množství ve vhodném rozpouštědle, je-li potřeba, dohromady s jednou z ingrediencí uvedených shora v textu nebo s jejich kombinací. Pak následuje sterilizace filtrací. V obecném případě jsou disperze připraveny začleněním aktivní sloučeniny do sterilního vehikula, které obsahuje bazické disperzní médium a požadované jiné ingredience z těch vyjmenovaných shora v textu. V případě sterilních, lyofilizovaných prášků pro přípravu sterilních roztoků vhodných pro aplikaci injekcí jsou preferované metody přípravy sušení ve vakuu a sušení rozprašováním, přičemž vzniká prášek aktivní ingredience plus libovolná další požadovaná ingredience z jejich roztoků, které byly před tím sterilizovány filtrací. Správná tekutost roztoku může být udržována například použitím potahů, jako je lecitin, v případě disperze udržováním požadované velikosti částic a použitím povrchově aktivních činidel. Prolongovaná absorpce prostředků vhodných pro zavedení injekcí může být uskutečněna, když se do prostředku zahrne činidlo, které zpožďuje absorpci například monostearátové sole a želatina.

Protilátky a části protilátek podle vynálezu mohou být aplikovány různými metodami známými v oboru, ačkoli v případě řady terapeutických aplikací je výhodnou cestou/modem aplikace subkutánní a intravenózní injekce nebo infúze. Pro odborníka je výhodné, aby způsob a/nebo mód aplikace byl různý v závislosti na požadovaných výsledcích, V jistých provedeních vynálezu může být aktivní látka připravena s nosičem, který bude chránit sloučenin oproti rychlému uvolnění, jako je formulace s řízeným uvolňováním, zahrnující implantáty, transdermální náplasti a mikrokapsulámí zaváděcí systémy. Mohou být použity biologicky rozložitelné a biologicky kompatibilní polymery, jako je ethylen-vinylacetát, polyanhydridy, polyglykolová kyselina, kolagen, polyortoestery a kyselina polymléčná. Rada metod přípravy takových formulací je chráněná patentem nebo je obecně známa v oboru (popisuje se například v publikaci Soustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, lne. New York, 1978.

V jistých provedeních vynálezu protilátka nebo její část podle vynálezu může být aplikována orálně, například s inertním ředidlem nebo s přizpůsobitelným poživatelným nosičem. Látka (a jiné ingredience, je-li to nutné) mohou také být uzavřeny v tvrdé nebo měkké želatinové duté kapsli, lisovány do tablet nebo přidány přímo do jídla subjektu. V případě orální aplikace látky mohou být začleněny s excipienty a mohou být používány ve formě poživatelných tablet, bukálních tablet, pastilek, kapslí, elixírů, suspenzí, sirupů, oplatek a podobně. Aby se látka podle vynálezu aplikovala jinou než parenterální aplikací, může být nezbytné potáhnout jí materiálem, který brání její deaktivaci nebo látku s tímto materiálem aplikovat dohromady.

Do prostředků nohou také být začleněny doplňkové aktivní sloučeniny. V jistých provedeních vynálezu je protilátka nebo její část podle vynálezu připravena společně sjedním nebo svíce terapeutickými činidly nebo se s nimi dohromady aplikuje. Uvedená činidla jsou použitelná při léčbě poruch, kde je aktivita IL—12 škodlivá. Například protilátka proti hIL-12 nebo její část podle vynálezu může být připravena společně s jednou nebo více dalších protilátek, které se vážou najiné cíle, neboje snimi společně aplikována (například protilátky, které se vážou na jiné cytokiny nebo které se vážou na molekuly na buněčném povrchu). Navíc jedna nebo více protilátek podle vynálezu může být použita v kombinaci s dvěma nebo více cizorodými terapeutickými činidly. Takové kombinační terapie mohou s výhodou využívat nižší dávky aplikovaných terapeutických činidel, tak předejít možné toxicitě nebo komplikacím spojených s různými jednotlivými terapiemi. Pro odborníka bude výhodné, že když jsou používány protilátky podle vynálezu jako část kombinační terapie, může být požadována nižší dávka, než když se subjektu aplikuje samotná protilátka (použitím kombinační terapie je možno například dosáhnout synergického terapeutického účinku, což pak umožňuje použití nižší dávky protilátky k dosažení požadovaného terapeutického efektu).

Interleukin 12 má kritickou roli v patologii spojené s různými onemocněními zahrnujícími imunitní a zánětlivé elementy. Tato onemocnění zahrnují, ale nejsou omezena na revmatoidní artritidu, osteoartritidu, chronickou artritidu u mladistvých, Lymskou artritidu, psoriatickou artritidu, reaktivní artritidu, systémový lupus erythematosus, Crohnovu chorobu, ulcerativní kolitidu, zánětlivé onemocnění střeva, inzulín dependentní cukrovku, tyreoiditidu, astma, alergická onemocnění, psoriázu, dermatitidu skleroderma, atopickou dermatitidu, onemocnění hostitele versus transplantát, odmítnutí transplantovaného orgánu, akutní a chronické imunitní onemocnění spojené s transplantací orgánu, sarkoidózu, aterosklerózu, diseminovanou intravaskulární koagulaci, Kawasakiho onemocnění, exoftalmickou strumu, nefrotický syndrom, chronický únavový syndrom, Wegenerovou granulomatózu, Henochovu-Schoenleinovou purpuru, mikroskopickou vaskulitidu ledvin, chronickou aktivní hepatitidu, uveitidu, septický šok, syndrom toxického šoku, sepsi, kachexii, infekční onemocnění, parazitická onemocnění, syndrom získané imunitní nedostatečnosti, akutní myelitis transversa, Huntingtonovu choreu, Parkinsonovu chorobu, Alzheimerovu chorobu, mrtvici, primární biliární cirhózu, hemolytickou anémii, zhoubné bujení, selhání srdce, infarkt myokardu, Addisonovu chorobu, sporadickou polyglandulární deficienci typu I a polyglandulární deficienci typu II, Schmidtův syndrom, syndrom (akutního) stiženého dýchání u dospělých, alopecii, alopecii aerata, seronegativní artropatii, artropatii, Reiterovu chorobu, lupénkovou artropatii, artropatii při ulcerativní kolitidě, enteropatickou synovitidu, artropatii nebo spondyloartropatii spojenou s chlamydiemi, yersiniemi a salmonelou, ateromatózu, arteriosklerózu, atopickou alergii, autoimunitní bulózní onemocnění, pemfigus vulgaris, lištoCZ 303725 B6 vitý pemfigus, pemfigoid, lineární onemocnění IgA, autoimunitní hemolytickou anémii, Coombs-pozitivní hemolytickou anemii, získanou pemiciózní anémii, juvenilní perniciózní anémii, myalgickou encefalitidu/“Royal Free Disease“, chronickou mukokutánní kandidózu, gigantocelulární arteritidu, primární sklerotizující hepatitidu, kryptogenní autoimunitní hepatitidu, onemocnění spojená s AIDS, hepatitidu C, běžnou smíšenou imunonedostatečnost (běžnou variabilní hypogamaglobulinemii), dilatační kardiomyopatii, neplodnost u žen, nefunkčnost vaječníků, předčasnou nefunkčnost vaječníků, fibrotické onemocnění plic, kryptogenní fibrotizující alveolitidu, post-zánětlivé intersticiální onemocnění plic, intersticiální zápal plic, intersticiální onemocnění plic spojené s onemocněním pojivové tkáně, onemocnění plic spojené se smíšeným onemocněním konektivní tkáně, intesticiální onemocnění plic spojené se systémovou sklerózou, intersticiální onemocnění plic spojené s revmatoidní artritidou, onemocnění plic spojené se systémovým lupus erythematosus, onemocnění plic spojené s dermatomyositidou/polymyositidou, onemocnění plic spojené se Sjogrenovou chorobou, onemocnění plic spojené s ankylozující spondylitidou, vaskulitické difusní onemocnění plic, onemocnění plic spojené s hemosiderózou, intestícíální onemocnění plic vyvolané léky, radiační fibrózu, obliterující bronchiolitidu, chronický eosinofilní zápal plic, lymfocytární infiltrační onemocnění plic, postinfekční intersticiální onemocnění plic, dnavou artritidu, autoimunitní hepatitidu, autoimunitní hepatitidu typu I (klasickou autoimunitní nebo lupoidní hepatitidu), autoimunitní hepatitidu typu 2 (anti-LKM protilátkovou hepatitidu), autoimunitně zprostředkovanou hypoglykémii, rezistenci na inzulín typ B s acanthosis nigricans, hypoparatyreózu, akutní imunitní onemocnění spojené s transplantací orgánu, chronické imunitní onemocnění spojené s transplantací orgánu, osteoartrózou, primární sklerotizující cholangitidu, idiopatickou leukopenii, autoimunitní neutropenii, renální onemocnění jinak nespecifikovaná, glomerulonefritidy, mikroskopickou vaskulitidu ledvin, lymskou borreliózu, diskoidní lupus erythematosus, idiopatickou nebo jinak nespecifikovanou mužskou neplodnost, spermatickou autoimunitu, roztroušenou sklerózu (všechny subtypy), inzulín dependentní diabetes mellitus, sympatický oční zánět, plicní hypertenzi sekundární při onemocnění pojivové tkáně, syndrom Goodpasture, nodózní polyarteritidu projevující se v plicích, akutní revmatickou horečku, revmatickou spondylitidu, Stillovu chorobu, systémovou sklerózu, Takayasuovu chorobu/arteritidu, autoimunitní thrombocytopenii, idiopatickou thrombocytopenii, autoimunitní onemocnění štítné žlázy, hypertyreózu, autoimunitní hypotyreózu se strumou (Hashimotova choroba), atrofickou autoimunitní hypotyreózu, primární myxedém, fakogenní uveitidu, primární vaskulitidu a vitiligo. Lidské protilátky a jejich části podle vynálezu mohou být používány k léčbě autoimunitních onemocnění, zvláště těch, která jsou spojena se zánětem, která zahrnují revmatoidní spondylitidu, alergii, autoimunitní diabetes, autoimunitní uveitidu.

Protilátky podle vynálezu nebojejich části vázající se na antigen se přednostně používají k léčbě revmatoidní artritidy, Crohnovy choroby, roztroušené sklerózy, inzulín dependentní cukrovky a lupénky, jak se popisuje detailněji v sekci VIL

Lidská protilátka nebo její část podle vynálezu může být také aplikována sjedním nebo více dalšími terapeutickými činidly použitelnými při léčbě autoimunitních a zánětlivých onemocnění.

Protilátky podle vynálezu nebojejich části vázající se na antigen mohou být používány při léčbě takových onemocnění samotné nebo v kombinaci. Mělo by být zřejmé, že protilátky podle vynálezu nebojejich části vázající na antigen mohou být používány samotné nebo v kombinaci s dalším činidlem, například terapeutickým činidlem. Uvedené další činidlo je vybráno odborníkem pro jeho určený účel. Další činidlo může být například terapeutické činidlo, které je známé v oboru jako použitelné při léčbě onemocnění nebo stavu protilátkou podle vynálezu. Dalším činidlem může být také činidlo, které propůjčuje terapeutickému prostředku příznivou charakteristickou vlastnost, například činidlo, které ovlivňuje viskozitu prostředku.

Dále by mělo být zřejmé, že kombinace, kteréjsou zahrnuty ve vynálezu, jsou ty kombinace použitelné pro jejich určený účel. Činidla popsaná dále v textu jsou ilustrativní a nejsou omezena. Kombinace, které jsou součástí vynálezu mohou být protilátky podle vynálezu a alespoň jedno další činidlo vybrané ze seznamů dále v textu. Kombinace mohou také zahrnovat více než jedno další činidlo, například dvě nebo tři další činidla, jestliže kombinace je taková, že vytvořený prostředek může provádět jeho funkci.

Preferované kombinace jsou nesteroidní protizánětlivé léky, které jsou známy jako NSA1DS, které zahrnují léky jako je ibuprofen. Jiné preferované kombinace jsou kortikosteroidy zahrnující prednisolon, dobře známé vedlejší účinky při použití steroidů mohou být redukovány nebo dokonce eliminovány snížením nutné dávky steroidů, když se pacient léčí steroidem v kombinaci s protilátkou proti IL—12 podle vynálezu. Neomezující příklady terapeutických činidel pro revmatoidní artritidu, se kterými protilátka nebo její část podle vynálezu může být kombinována, zahrnuje následující: proti zánětlivý lékjy) potlačující cytokiny (CSAID), protilátky proti jiným lidským cytokinům nebo antagonisty jiných lidských cytokinů nebo růstových faktorů, například TNF, LT, IL—1, IL-2, IL-6, IL-7, 1L-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF a PDGF. Protilátky podle vynálezu nebo jejich části vázající se na antigen mohou být kombinovány s protilátkami vůči molekulám na buněčném povrchu, jako CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80(B7.1), CD86(B7.2), CD90 nebo jejich ligandy zahrnující CDl54(gp39 nebo CD40L).

Preferované kombinace terapeutických činidel mohou interferovat v různých bodech v autoimunitní a následné zánětlivé kaskádě, preferované příklady zahrnují TNF antagonisty podobné chimérovým, humanizovaným nebo lidským TNF protilátkám D2E7, (patentová přihláška US sériové číslo 08/599 226, podaná 9.2.1996), cA2 (Remicade™), CDP 571, fragmenty anti-TNF protilátek (například CDP870) a rozpustné receptory TNF p55 nebo p75, jejich deriváty, (p75TNFRlgG(Enbrel™) nebo p55TNFRlgG(Lenercept), rozpustný receptor IL—13 (sIL-13) a také inhibitory enzymu přeměny TNFa (TÁCE), podobně inhibitory IL—1 (například inhibitory enzymu přeměňující interleukin IL—1 (například inhibitory enzymu přeměňující interleukin 1, jako je Vx740, nebo IL-1RA atd.) mohou být ze stejného důvodu efektivní. Jiné preferované kombinace zahrnují interleukin 11, anti-P7 a p-selektinový glykoproteinový ligand (PSGL). Ještě jiná preferovaná kombinace jsou jiní klíčový hráči autoimunitní odezvy, která může působit paralelně, v závislosti nebo ve shodě s funkcí IL-12, zvláště preferované jsou antagonisté IL-18 zahrnující protilátky proti IL—18 nebo rozpustné receptory IL—18 nebo proteiny vázající se na IL18. Ukázalo se, že IL-12 a IL-18 mají překrývající se, ale odlišné funkce a nejúčinnější může být kombinace antagonistů vůči IL-12 a IL-18. Ještě jiná preferovaná kombinace jsou anti-CD4 inhibitory. Ještě jiné preferované kombinace jsou anti-CD4 inhibitory. Ještě jiné preferované kombinace zahrnují antagonisty ko-stimulační dráhy CD80(B7.1) nebo protilátky zahrnující CD86(B7.2), rozpustné receptory nebo antagonistické ligandy.

Protilátky podle vynálezu nebo jejich části vázající se na antigen mohou také být kombinovány s antigeny, jako je methotrexát, 6-MP, sulfasalazin azathioprinu, mesalazin, chlorochinin olsalazinu/hydroxychlorochin, penicilinamin, aurothiomalát (intramuskulámí a orální), azathioprin, kachicin, kortikosteroidy (orální, inhalované a lokální injekce), agonisté beta-2 adrenoreceptoru (salbutamol, terbutalin, salmeteral), xanthiny (theofýlin, aminofýlin), kromoglykát, nedokromil, ketotifen, ipratropium a oxitropium, cyklosporin, FK.506, rapamycin, mykofenolát, mofetilu, leflunomid, NSAID například ibuprofen, kortikosteroidy, jako je prednisolon, inhibitory fosfodiesterázy, agonisté adenosinu, antithrombotická činidla, inhibitory komplementu, adrenergická činidla, činidla, která interferují se signalizací pro-zánětlivých cytokinů, jako je TNFa nebo IL—1 (například IRÁK, NIK, IKK, p38 nebo inhibitory kinázy MAP), inhibitory enzymu přeměňujícího IL—1 β (například Vx740), anti-P7, p-selektinový glykoproteinový ligand (PSGL), inhibitory enzymu přeměňujícího TNFa, inhibitory signalizace buněk T, jako jsou inhibitory kinázy, inhibitory metaloproteinázy, sulfasalazin, azathioprin, 6-merkaptopuriny, inhibitory enzymu přeměňujícího angiotenzin, rozpustné receptory cytokinů ajejich deriváty (například rozpustné receptory TNF p55 nebo p75 a deriváty p75TNFRIgG (Enbrel™) a p55TNFRIgG (Lenercept), sIL-lRI, sIL-lRII, sIL-6R, rozpustný receptor IL—13 (sIL-13)) a protizánětlivé cytokiny (například IL-4, IL—10, IL—11, IL—13 a TGFP). Preferované kombinace zahrnují methotrexát nebo leflunomid a v případě mírné nebo silné revmatické artritidy cyklosporin.

Nelimitující příklady terapeutických činidel syndromu zánětlivého střeva, se kterými může být protilátka nebo její část podle vynálezu kombinována, zahrnují následující: budenosid, epidermální růstový faktor, kortikosteroidy, cyklosporin, sulfasalazin, aminosalicylát, 6-merkaptopurin, azathioprin, metronidazol, inhibitory lipoxygenázy, mesalamin, olsalazin, belsalazid, antioxidanty, inhibitory thromboxanu, antagonisty reeeptoru IL-1, monoklonální protilátky proti 1L1β, monoklonální protilátky proti IL—6, růstové faktory, inhibitory elastázy, sloučeniny pyridinyl-imidazolu, protilátky proti jiným lidským cytokinům nebo růstovým faktorům nebo antagonisté jiných lidských cytokinů nebo růstových faktorů, například TNF, LT, IL-1, IL-2, IL—6, IL7, IL—8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF a PDGF. Protilátky podle vynálezu nebo jejich části vázající se na antigen mohou být kombinovány s protilátkami proti molekulám na buněčném povrchu, jako CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 nebo jiné ligandy. Protilátky podle vynálezu nebo jejich části vázající se na antigen mohou také být kombinovány s činidly, jako je methotrexát,, cyklosporin, FK506, rapamycin, mykofenolát, mofetilu, leflunomid, NSA1D, například ibuprofren, kortikosteroidy, jak prednisolon, inhibitory fosfodiesterázy, agonisté adenosinu, antithrombotická činidla, inhibitory komplementu, adrenergická činidla, činidla, která interferují se signalizací prozánětlivých cytokinů, jako je TNFa nebo IL-1 (například inhibitory kinas IRÁK, NIK, IKK, p38 nebo MAP), inhibitory enzymu přeměňující IL—1 β (například Vx740), anti-P7, p-selektinový glykoproteinový ligand (PSGL), inhibitory enzymy přeměňujícího TNFa, inhibitory signalizace T-buňky, jako jsou inhibitory kinázy, metaloproteinázové inhibitory, sulfasalazin, azathioprin, 6-merkaptopuriny, inhibitory enzymu přeměňující angiotensin, rozpustné receptory cytokinů a jejich deriváty (například rozpustné receptory p55 nebo p75, sIL—1RI, sIL-1 RII, sIL-6R, rozpustný receptor IL13 (sIL-13)) a protizánětlivé cytokiny (například IL—4, IL-10, IL-11, IL—13 a ΤϋΡβ).

Preferované příklady terapeutických činidel pro Crohnovu nemoc, ve kterých může být protilátka nebo její část vázající se na antigen kombinována, zahrnují následující: antagonisty TNF, například protilátky proti TNF, D2E7 (patentová přihláška sériové číslo 08/599 226, podáno 9.2.1996), cA2 (Remicade™), CDP 571, fragmenty protilátek proti TNF, (například CDP870), konstrukty TNFR-Ig(p75TNFRIgG(Enbrel™) a p55TNFRIgG (Lenercept)), anti-P7, p-selektinový glykoproteinový ligand (PSGL), rozpustný receptor IL-13 (sIL-13) a inhibitory PDE4. Protilátky podle vynálezu nebo jejich části vázající se na antigen mohou být kombinovány s kortikosteroidy například budenosid a dexametason. Protilátky podle vynálezu nebo jejich části vázající se na antigen mohou také být kombinovány s činidly, jako je sulfasalazin, 5-aminosalicylová kyselina a olsalazin a činidla, která interferují se syntézou nebo působení pro-zánětlivých cytokinů jako IL-1, například inhibitory enzymu přeměňující IL—1 β (např. VX740) a ILlra. Protilátky podle vynálezu nebo její část vázající antigen může také být užívána s inhibitory signalizace T buněk například inhibitory tyrozinové kinázy 6-merkaptopuriny. Protilátky podle vynálezu nebo jejich části vázající se na antigen mohou být kombinovány s IL—11.

Nelimitující příklady terapeutických činidel v případě roztroušené sklerózy, se kterými může být kombinována protilátka nebo její část, zahrnující: kortikosteroidy, prednisolon, methylprednisolon, azathioprin, cyklofosfamid, cyklosporin, methotrexát, 4-aminopyridin, tizanidin, interferonβ 1 a (Avonex, Biogen), interferon-filb (Betaseron, Chiron/Berlex), Copolymer 1 (Cop-1, Copaxone, Teva Pharmaceutical Industries, lne.), hyperbarický kyslík, intravenózní imunoglobulin, klabribin, protilátky proti jiným lidským cytokinům a růstovým faktorům nebo antagonisty jiných lidských cytokinů nebo růstových faktorů například TNF, LT, IL-1, IL—2, IL—6, IL—7, IL—8, IL15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF a PDGF. Protilátky podle vynálezu nebo jejich části vázající se na antigen mohou být kombinovány s protilátkami k molekulám na buněčném povrchu, jako CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 nebo jiné ligandy. Protilátky podle vynálezu nebo jejich části vázající se na antigen mohou také být kombinovány s činidly, jako methotrexát, cyklosporin, FK506, rapamycin, mykofenolát mofetilu, leflunomid, NSAID například ibuprofren, kortikosteroidy, jak prednisolon, inhibitory fosfodiesterázy, agonisté adenosinu, antithrombotická činidla, inhibitory komplementu, adrenergická činidla, činidla, která interferují se signalizací prozánětlivých cytokinů, jako je TNFa nebo

IL—1 (například inhibitory kinas IRÁK, NIK, IKK, p38 nebo inhibitory kinázy MAP), inhibitory enzymu přeměňující IL—1 β (například Vx740), anti-P7, p-selektinový glykoproteinový ligand (PSGL). Inhibitory TÁCE, inhibitory signalizace T-buňky jako inhibitory kinázy, inhibitory metaloproteinázy, sulfasalazin, azathioprin, 6-merkaptopuriny, inhibitory enzymu přeměňující angiotensin, rozpustné cytokinové receptory ajeho deriváty (například rozpustné receptory TNF p55 nebo p75, sIL-lRl, sIL-lRII, sIL-6R, rozpustný receptor IL—13 (sIL-13)) a protizánětlivé cytokiny (například IL-4, IL—10, IL—11, IL-13 a TGF3).

Preferované příklady terapeutických činidel pro roztroušenou sklerózu, ve kterých může být protilátka nebo její část vázající se na antigen kombinována, aby zahrnovaly interferon-β, například ΙΕΝβΙ a IFNpib, kopaxon, kortikosteroidy, inhibitory IL—1, inhibitory TNF a protilátky proti Iigandu CD40 a CD80.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu mohou zahrnovat „terapeuticky účinné množství“ nebo „profylakticky účinné množství“ protilátky nebo její části podle vynálezu. Termín „terapeuticky účinné množství“ znamená množství účinné při dávkách a po časové úseky nezbytné pro dosažení požadovaného terapeutického výsledku. Terapeuticky účinné množství protilátky nebo její části může kolísat v souladu s faktory, jako je stádium onemocnění, věk, pohlaví a hmotnost jednotlivce a schopnost protilátky nebo její části vyvolat u jedince požadovanou odezvu. Terapeuticky účinné množství je také to, při kterém libovolné toxické nebo škodlivé účinky protilátky nebo její části jsou vyváženy terapeuticky prospěšnými účinky. Termín „profylakticky účinné množství“ znamená množství účinné při dávkách a v časových úsecích nezbytných pro dosažení požadovaného profylaktického výsledku. V typickém případě je proto profylakticky účinné množství užíváno u subjektů před onemocněním nebo vjeho časné fázi. Profylakticky účinné množství bude menší než terapeuticky účinné množství.

Dávkové režimy mohou být upraveny tak, aby se dosáhlo optimální požadované odezvy (například terapeutická a profylaktická odezva). Může být aplikována například jedna tableta, v časových úsecích se může aplikovat několik rozdělených dávek nebo dávka může proporcionálně redukována nebo zvýšena podle naléhavosti terapeutické situace. Za účelem jednoduchosti aplikace a jednotnosti dávky je zvláště výhodné vytvořit parenterální prostředky v jednotkové dávkové formě. Jednotková dávková forma zde znamená fyzikálně diskrétní jednotky vhodné jako unitární dávky pro savčí léčené subjekty; každá jednotka obsahující předem stanovené množství aktivní sloučeniny vypočítané tak, aby produkovala požadovaný terapeutický účinek ve spojení požadovaným farmaceutickým nosičem. Specifikace pro jednotkové dávkové formy podle vynálezu jsou předepsány (a) jedinečnými charakteristikami aktivní látky a určitým terapeutickým nebo profylaktickým účinkem, kterého se má dosáhnout a (b) omezení vlastní oboru přípravy směsí jako je aktivní látka pro léčbu citlivosti u jedinců, a nebo na těchto faktorech přímo závisí.

Příkladem neomezujícího rozmezí pro terapeuticky nebo profylakticky účinné množství protilátky nebo její části podle vynálezu je 0,01 až 20 mg/kg, výhodnější je 1 až 10 mg/kg, dokonce ještě výhodnější je 0,3 až 1 mg/kg. Je nutné poznamenat, že hodnoty dávek mohou kolísat s typem a vážností stavu, který se má zmírnit. Je nutné vědět, že v případě libovolného určitého subjektu by se měly upravit specifické dávkové režimy v průběhu Času v souladu s individuální potřebou a profesionálním úsudkem osoby, která aplikuje nebo dohlíží na aplikaci prostředků a že zde uvedená dávková rozmezí jsou pouze příkladem a neomezují rozsah nebo praktické použití nárokovaného prostředku.

Vil. Použití protilátek podle vynálezu

Na základě jejich schopností vázat se na hIL-12, protilátky proti hlL - l 2 nebo jejich části podle vynálezu mohou být použity k detekci hIL-12 (například v biologickém vzorku, jako je sérum nebo plazma) použitím běžných testů, jako je test ELISA, radioimunologický test (RIA) nebo imunohistochemický test tkáně. Vynález popisuje způsob detekce hIL-12 v biologickém vzorku, který zahrnuje kontakt biologického vzorku s protilátkou nebo sjeho částí podle vynálezu a detekci jejich protilátky (nebo části protilátky) vázané na hlL-12 nebo nevázané protilátky (nebo části protilátky), čímž se detekuje hlL-12 v biologickém vzorku. Protilátka je značena přímo nebo nepřímo detekovatelnou látkou, která umožňuje detekci vázané nebo nevázané protilátky. Vhodné detekovatelné látky zahrnují různé enzymy, protetické skupiny, fluorescenční materiály, luminiscenční materiály a radioaktivní materiály. Příklady vhodných enzymů zahrnují křenovou peroxidázu, alkalickou fosfatázu, β-galaktozidázu nebo acetylcholinesterázu, příklady vhodných prostetických skupinových komplexů zahrnují streptavidin/biotin a avidin/biotin, příklady vhodných fluorescenčních materiálů zahrnují umbeliferon, fluorescein, isothiokyanát fluoresceinu, rodamin, dichlorotriazinylamin fluoresceinu, dansylchlorid nebo fykoerytrin, příklad luminiscenčního materiálu zahrnuje luminol a příklady vhodného radioaktivního materiálu zahrnuje ^l25I, ¹³¹I, ³⁵S nebo ³H.

Vedle značení protilátky může být v biologických tekutinách přítomnost hlL-12 testována kompetitivním imunotestem, který využívá standardů rhIL-12 značených detekovatelnou látkou a nedetekovatelnou protilátkou proti hlL-12. V tomto testu jsou kombinovány biologický vzorek, značené standardy rHIL-12 a protilátka proti hIL—12 aje stanoveno množství značeného standardu rhIL-12 vázaného na neznačenou protilátku. Množství hlL-12 v biologickém vzorkuje nepřímo úměrný množství značené standardní rhIL-12 vázané na protilátku proti hlL-12.

Protilátky Y61 a J695 podle vynálezu mohou být také používány k detekci IL—12 z druhů jiných než je člověk, zvláště IL—12 z primátů. Například protilátka Y61 může být používána k detekci IL—12 u opice cynomolgus a makak. Protilátka J695 může být používána k detekci IL—12 u opice cynomulgus, makak a pavián. Žádná protilátka však nereaguje zkříženě s myším nebo krysím IL12 (popisuje se v příkladu 3 podsekce F).

Protilátky a části protilátek podle vynálezu jsou schopné neutralizovat aktivitu hlL-12 in vitro (popisuje se v příkladu 3) a in vivo (popisuje se v příkladu 4). Podobně protilátky a části protilátek podle vynálezu mohou být používány k inhibici aktivity IL-12, například v buněčné kultuře obsahující hlL-12, v lidských subjektech nebo v jiných savčích subjektech, které obsahují IL—12, s nímž protilátka podle vynálezu zkříženě reaguje (například primáti, jako je pavián, cynomulgus a makak). V preferovaném provedení vynálezu se popisuje izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která neutralizuje aktivitu lidské IL—12 a alespoň jednoho dalšího 1L12 z primáta vybraného ze skupiny zahrnující IL—12 paviána, kosmana, šimpanze, cynomolga a makaka, ale který neneutralizuje aktivitu myšího IL—12. Výhodně je, když IL—12 je lidské IL—12. Aby se inhibovala aktivita hlL-12 v kultuře, může být do kultivačního média kultury buněk obsahující hlL-12 nebo kde se předpokládá, že obsahuje hlL-12 přidána protilátka nebo část protilátky podle vynálezu.

V jiném provedení podle vynálezu se popisuje metoda inhibice aktivity IL—12 v subjektu, který trpí poruchou, při které aktivita IL—12 je škodlivá. 1L-12 byl zahrnut od patofyziologie širokého rozmezí poruch (popisuje se v publikaci Windhagen et al., (1995) J. Exp. Med. 182: 1985 až 1996, Morita et al., (1998) Arthritis and Rheumatism 41: 306 až 314, Bucht et al., (1996) Clin. Exp. Immunol. 103: 347 až 367, Fais et al., (1994). Interferon Res. 14: 235 až 238, Parronchi et al., (1997) Am. J. Path. 150: 823 až 832, Monteleone et al., (1997) Gastroenterology 112: 1169 až 1178 and Berrebi et al., (1998) Am. J. Path 152: 667 až 672, Parronchi et al. (1997) Am. J. Path. 150: 823 až 832). Vynález poskytuje způsoby inhibice aktivity IL—12 v subjektu, který trpí takovou poruchou, přičemž způsob obsahuje aplikaci protilátky nebo části protilátky podle vynálezu subjektu tak, že je aktivita IL—12 v subjektu inhibována. Upřednostňuje se, když IL—12 je lidský IL—12 a subjekt je lidský subjekt. V jiném případě subjektem může být savec exprimující IL—12, se kterým protilátka podle vynálezu zkříženě reaguje. Subjektem může dále být savec, do kterého byl zaveden hlL-12 (například aplikaci hlL-12 nebo expresí transgenu hlL-12). Protilátka podle vynálezu může být aplikována lidskému subjektu pro terapeutické účely (jak se diskutuje dále v textu). Protilátka podle vynálezu však může být aplikována savci, který není člověk a který exprimuje IL—12, se kterým protilátka zkříženě reaguje, což se využívá pro veterinární účely nebo jako zvířecí model lidského onemocnění. S ohledem na posledně uvedené takové zvířecí modely mohou být použitelné pro hodnocení terapeutické účinnosti protilátek podle vynálezu (například testování dávek a časové průběhy aplikace).

Zde používaný termín „porucha“, kde aktivita IL-12 je škodlivá“ zahrnuje onemocnění a jiné poruchy, ve kterých se ukázalo, že přítomnost IL-12 u subjektu trpícím poruchou, odpovídá za patofyziologii poruchy neboje faktorem, který přispívá ke zhoršení poruchy. Tedy porucha, kde aktivita IL-12 je škodlivá, je poruchou, u které se očekává, že inhibice aktivity IL-12 zmírní symptomy a/nebo postup poruchy. Takové poruchy mohou být prokázány například zvýšením koncentrace IL-12 v biologické tekutině subjektu, který trpí poruchou (například zvýšením koncentrace IL-12 v séru, plazmě, synoviální tekutině atd. subjektu), která může být detekována například použitím protilátky proti IL-12, jak se popisuje shora v textu. Existuje řada příkladů poruch, kde aktivita IL-12 je škodlivá. V jednom provedení vynálezu protilátky nebo její části vázající se na antigen mohou být použity při terapii, kdy se léčí zde popsané onemocnění nebo poruchy. Vjiném provedení vynálezu protilátky nebo její části vázající se na antigen mohou být použity při výrobě léku pro léčbu zde popsaných onemocnění nebo poruch. Použití protilátek a částí protilátek podle vynálezu při léčbě několika neomezujících specifických poruch je diskutováno dále v textu:

A. Revmatoidní artritida:

Interleukin-12 se podílí na důležité úloze při zánětlivých onemocněních, jako je revmatoidní artritida. V kloubním mazu pacientů trpících revmatoidní artritidou byla detekována indukovatelná mRNA IL- 12p40 a ukázalo se, že IL-12 je přítomen v synoviálních tekutinách u pacientů trpících revmatoidní artritidou (popisuje se například v publikaci Morita et al., (1998) Arthritis and Revmatism 41: 306 až 314). Zjistilo se, že buňky pozitivní na IL-12 jsou přítomny v povrchové vrstvě kloubní mazotvorné blány zasažené revmatoidní artritidou. Lidské protilátky a části lidských protilátek podle vynálezu mohou být používány k léčbě například revmatoidní artritidy, Lymské artritidy, revmatoidní spondylitidy, osteoartritidy a dnavé artritidy. V typickém případě protilátka nebo její část je aplikována systémově, ačkoli při jistých poruchách může být výhodné aplikovat protilátku nebo část protilátky lokálně. Protilátka nebo její část podle vynálezu může být také aplikována s jedním nebo více dalších terapeutických činidel použitelných při léčbě autoimunitního onemocnění.

V myším modelu pro revmatoidní artritidu vyvolanou kolagenem (CIA) léčba myší monoklonálními protilátkami proti IL-12 (krysí monoklonální protilátka proti myšímu IL—12 Cl7.15) před vznikem artritidy zcela potlačila vznik onemocnění a omezila jeho výskyt a vážnost. Léčba monoklonální protilátkou proti IL-12 časně po vzniku artritidy omezila vážnost onemocnění, ale pozdější léčba myší monoklonálními protilátkami proti IL-12 po vzniku onemocnění měla minimální účinek na vážnost onemocnění.

B. Crohnova choroba

Interleukin-12 také má důležitou úlohu při zánětlivé onemocnění střev, Crohnově chorobě. L pacientů trpících Crohnovou chorobou se objevuje ve střevní sliznici zvýšená exprese IFN-γ a IL-12 (popisuje se například v publikaci Fais et al., (1994) J. Interferon res. 14: 235 až 238, Parronchi et al., (1997) Am. J. Pathol. 150: 823 až 832, Monteleone et al., (1997) Gastroenterology 112: 1169 až 1178, Berrebi et al., (1998) Am. J. Pathol. 152: 667 až 672). Lkázalo se, že protilátky proti IL-12 potlačují onemocnění v myších modelech kolitidy, například kolitida u myší vyřazených pomocí IL-12 indukovaná TNBS a v poslední době i myší vyřazených IL—10. Tedy, při léčbě zánětlivých onemocnění střev mohou být použity protilátky nebo jejich části podle vynálezu.

C. Roztroušená skleróza

Interleukin—12 působí při roztroušené skleróze jako klíčový mediátor. V lézích u pacientů s roztroušenou sklerózou může být demonstrována exprese índukovatelné mRNA IL—12p40 nebo samotného IL-12 (popisuje se v publikaci Windhagen et al., (1995) J. Exp. Med. 182: 1985 až 1996, Drulovec et al., (1997) J. Neurol. Sci. 147: 145 až 150). U chronických progresivních pacientů trpících roztroušenou sklerózou se zvýšilo množství cirkulujícího IL-12. Výzkum buněk T a buněk prezentujících antigen (APC) pocházejících od pacientů s roztroušenou sklerózou ukázal samopokraČující série imunitních reakcí jako základ progresivní roztroušené sklerózy vedoucí k imunitní odezvě typu Thi. Zvýšené vylučování IFN-γ u buněk T vedoucí ke zvýšené produkci IL-12 buňkami APC, což má za následek pokračování cyklu vedoucího k chronickému stádiu imunitní aktivace typu Thi a k onemocnění (Balashov et al., (1997) Proč. Nati. Acad. Sci. 94: 599 až 603). Úloha IL-12 při roztroušené skleróze se zkoumala za použití myších a krysích experimentálních modelů alergické encefalomyelitidy (EAE). Předchozí léčba monoklonální protilátkou proti IL-12 v modelu recidivující-ustupující EAE roztroušené sklerózy u myší oddálila paralýzu a redukovala klinické skóre. Léčba monoklonální protilátkou proti IL-12 při vrcholu paralýzy nebo během následného období remise redukovala klinické skóre. Tedy protilátky nebo jejich části vázající se na antigen podle vynálezu mohou sloužit ke zmírnění symptomů spojených s roztroušenou sklerózou u lidí.

D. Inzulín dependentní cukrovka

Interleukin—12 byl implikován jako důležitý mediátor inzulín dependentní cukrovky (IDDM). IDDM byl vyvolán u myší NOD aplikací IL-12 a v adoptivním transferovém modelu IDDM působily protilátky proti IL-12 jako ochrana. Pacienti při časné fázi onemocnění IDDM mají často zkušenost s tzv. obdobím „honeymoon“, během kterého je udržována funkce některých zbylých ostrůvkových buněk. Tyto zbylé ostrůvkové buňky produkují inzulín a regulují množství glukózy lépe než aplikovaný inzulín. Léčba těchto pacientů během časné fáze s protilátkou IL-12 může bránit dalšímu poškození ostrůvkových buněk, čímž se udržuje endogenní zdroj inzulínu.

D. Lupénka (psoriáza)

Interleukin—12 působí jako klíčový mediátor lupénky. Lupénka zahrnuje akutní a chronické kožní léze, které jsou spojeny s profilem exprese cytokinů typ THI (Hamid et ak, 1996) J. Allergy Clin. Immunol. 1: 225 až 231, Turka et al., 1995 Mol. Med. 1: 690 až 699). Ve vzorcích kůže nemocného člověka byla detekována mRNA IL-12p35 a p40. Tedy, protilátky ajejich části vázající se na antigen podle vynálezu mohou zmírnit chronické kožní poruchy takové lupénky.

Vynálezje dále ilustrován následujícími příklady, které by neměly být v žádném případě chápány jako omezující. Obsahy všech citovaných referencí, které zahrnují citace literatury, zmiňované pacienty a zveřejněné patentové přihlášky, které jsou citovány v této přihlášce jsou tímto způsobem úmyslně začleněny pomocí citace. Dále je zřejmé, že obsahy všech přiřazených tabulek (uvedeno v dodatku A) jsou začleněny do textu citací.

Tabulka č. 1: Aminokyselinové sekvence rodiny embryonálního VH3, které se číslují podle Kabata σι o

o b

Λί

4-1 'Π5 r-l

-a

4-1

O α

4-1

O c

a , i <«£<-< X < X * Γ , , , , ji «j muuuuuovvvjuvíuvuuuU^zVVv «χχχχχκχχχχχχχχ**^*'*·^_lpj.4.-lpa‘-‘-^L-¹-‘.....

_κχ<Χ<>><<<ΧΧ<<<ΧΧΧ>Χ<<<^.

UVUUWUUUUUUUUVVVUUOVU'. <<χχχχχχχχχχχχ^’-' — -

‘•“ΐΗί-Ηνιΐί'^ΐΛΐιμΡί-.ι-^Ηη'Τ'^ •iZXXXXXXXXXXXXxXz XX • tttfcttfcttKttttUfctttttt_KX_KXttťt«.ttttfctttttt - -- '«ClV1ClC1tt<VlttXVtClClV»C>C»Wt<XVtC'V'X’<‘XX*'^<rt‘^rt<rt’³ - ’· ·· V« VI V, Cl VI vi Vt uQOOQXXXXXOQOOOÓOXXXZZXZZXZZXXXXXZXXXXxx ₌ «j. _^ ^ (OwuuQOQOOOQOOOOoOnOOQUOOOOQOQOQÚlOOCOooSaQooQÍ Á , tt«tttttttttte.tt«.tttttte;a.a.tttt='*X«‘*^<**^e;a-^K'^e;it*^flLťtťlt*^;Xtt«a.«

- α. α. e.

«« fc « -t *t o υ o t< fc tt fc 41 > > >

U 4Λ Vt Cl <1 tt tt < 4« tt X tt ),>>.>. 14 LI UJ UJ HH h H 14b μ || » M >.

i« vt ct ct Μ X X X IK X X tt til fc tt K tu X X z v : x tt ec ta a, «:

oouuuueo XttttttXtttttt >>>>>>>> χ o o α o X < X X X u- «n ct >· o o

0 O XXX

O O 0 U o O tt

K tt tt tt tt tt tt >>>>>>>

I O- Q. Ifl VI ω ΙΛ : χ x tt X

OUU tt tt tt > > > H 0 Vl a u a fc.tt&ttfcfcttfcfcttttttfc.

UOUUUUOOOOOUO ttttfctttttttttttttttttttt >>>>>>>>>>>>

XXQQQXOQZXrx

Cl VI O 4Λ V! Cl Cl o ci ct tt tt tt Vt X Cl «i O 0 «· > > li X J II U U 0 J J 4« 0 O 41 tt tt Cl O 0 «·. σ ♦ «XX ii σ o 1« tt tt u> > Η X X >- O 01 O X O X 4tt tt cl Cl tt tt

O O O O α o t* ♦4- <- >- >- Λ Λ

Ό O O O tn ci

U U Cl Cl O <J

O O O X Z X

K tt tt tt tt «V >-lOUJ>«>tttt

O 0 Cl > > > -J -J X WWW u j _j ouu tt tt tt ouu σ σ ·. xxx o a o e: a: a: > > > xxx ci ct > > x x u u u u o o tt tt o o tt tt X X σ σ χ < > s. X X

I >· tt Η H 4- i fc. O Cl i ct -Ol

4- O U X X X . >- >*

1- «5 Cl Cl J O O > α o • Cl χ i u Cl • ci ct ct «i

0 0 OUU o u o χ χ ct o

I Q O Q » 4- tt < “ >» >· >- L b. tt tt tt xxx Cl VI Cl OUU O O O

I Cl '

O O X X >- >· >- Jtt K X X Cl ci O O α a > > Ct Cl O O

X x

H >· 4- >» tt tt

X X i ct d vi ct ct

O U O u tt K χ *.

> > > >

0 VI VI !

Q Q O Q

X tt tt tt >· U μ >,

X tt 4- 4- tt χ X X Cl VI χ χ ct Cl O O Cl Ct o O O O O u α O Z X o o *- > Cl Cl > >. Ct Ct Cl Vt Cl VI

Q U

X a.

O O o < tt 4Cl o I ~ ~ Ct > >

ceccecťt>-ttuuu<^xx<xxx«<>>

>>>>>>><<>

C1C1UUOUUOU!

> >

x x :

CJ U i U -J , O O I tt tt u O ' tt tt X X o o tt tt > >

>>>>>>>

xxx LI u u u u -i o o o tt tt tt ouu tt tt ct xxx σ σ o χ χ tt

XXX

X X o o tt tt > > X X o o tt tt o o tt tt

0 0 0 0 ·>>>>>

: X X X X X

I LI Cl U UJ CJ

I u u u «1 u

I o o o o u : tt tt tt tt tt

I O o o o o > tt tt tt H tt :<<<<< >0X000 : χ tt tt tt tt ·><>>> : χ χ χ χ x vt vt u o tt tt o u tt tt tt X o o tt tt > > X X ct Ct Cl ct > * > > X >· >» >· u u u u _> J u u u o u o tt tt tt tt o 0 o 0 tt tt tt tt X X X X o o o o tt tt tt tt > > > > χ χ χ x ct X X > > > xxx www U U -1 ouu tt tt tt OUU tt tt tt xxx o o o tt tt tt > > > xxx

X X X X > > > > χ χ χ x W W w u J □ U J o o o u tt tt tt K O O 0 O tt tt tt tt X X X X o o o o tt tt tt tt > > > > X X X x

X X x vt ct > > > > >

X X X L. y.

U U U U U •J -j U -J J o u o o o tt tt tt tt tt o O O u o

A· tt tt o. cu

X X X X X o O σ o o tt tt tt tt c > > > > >

X X X X X

X X X ct cl > > > > >

X x X X X

UJ U u U 1*4

U -J J _J ^4 o o o o u tt tt tt tt tt o o o o o tt tt tt H tt

X X tt < tt o o o o o tt tt. tt tt tt > > > > >

X X X X X

(ϋ +J rO

Ό f0 y;

Φ I—i

Ή •ΓΊ i—i to

Ή >u

M 4

<- v.

ii c

< <

u >

u υ

H H

£ £

>»

>·

>-«

M W

>- £

b·

>·

H U

> >

<< 4

£ £

«! 1Č

£ b

♦-«

t<<QQQC>OOaoOQQQQQQOQOOQQOQOQQO

Ci£MMUUUMblMUblbCUMMMMMMUMUU(4MMUM »<4£££<<<<<<<<££££Ο££££££££<££ >ι££££<;<;ν:*:κ«:<:κ:£££££££££»-ι*:££«:££ lí< 4444444444444444444444444444 i7i«innr)«irtr>v)«Tr3nntn<oeTr)v)nnnr>nnr)»in«r)« ro ω

<u Z

Z z

Z Z

Z z

tt X

X X

<t O

o o

σ o

a a

O o

«4 4

u u

U‘

»4

u u

♦j

•4

u u

•J u

»1 £

>« >-

X·

>· >*

>-«

>·

h·

H ►-

H >-

H 4

»-5 ·μ3

u u

«J

u u

U U

«4

u £

Η H

X H

Η »-

« b

L·

z z z z z z z X tc £ H £ £

ZZUZZZZZX £££££££££ zzzzzzzzzzzzzzz

QQQQQQQQQQQQQQq

O) τ

4-1 λ;

< Z Z Z Z z t tc £ £ k tc

’< VI

«σ

υ Z

»j o

υ at

ΐϊίζα.ε.ιι.&χκΚΧιί&α.α.ίίΖΒ.ε.ΐ'ΐΒ.ζ.ιζκ&ί'χ i«0tn000000tn000000Vt000000000Vt00 lÍ-UikUkikkikiÍMU.

íítfttttitíCCCCCtCíC bt Cm bt ba Ur b.

£ Λ ct t£. £ t£

Η<-«ΗΗΙ-·ΡΗΗΗΙ-Η £££££££££££ ££££££££θ££ ο

Ή C ι—ι '(Ο £ ο οι

Τι -Ρ .Ό ε

Xt £

Φ υ

£ φ

Φ m

'Φ > ο £ Ή I—I φ ' φ 4*τ 44 Ο £ Η ηΌ ι—i Ή -Ρ Ο Τ α

sa >

-Ρ £

-π \Γ-ί £

'ίθ £

Ρ ο

ο τ

i O (J	o		o	o	e	0	0	0	0	0	0	0	0	0 0	0	0 0	0	0 0 0	0	0	0	0
4 £ £	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£ £	£	£ £	£	X £ £	£	£	£	£
i > >	>	>	>	>	>	>	>	>	>	>	>	>	>	£ >	>	> >	>	> > >	>	X	>	>
í tn «	tn	cn	cn	ei	cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn	tn	cn	cn cn	cn	en tn	cn	0 0 0	0	0	0	»
O O	Ct	O	a	a	Q	Ω	Ct	O	o	o	a	Ω	O	a o	a	O O	□	a o a	Q	a	a	o
» £ «<	<	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£ £	£	£ £	£	£ £ £	>	£	>	£
b b	b	b	£	£	£	£	£	£	£	£	£		£	£ £	£	£ £	£	£ £ £	£	£	b	H
b >»	>	b	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£ £	£	£ £	b	£00	b	0	£	£
£ £	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£ ♦-!		w w	1-,	Η £ H	£	H	£	£
Z Z	Z	Z	Z	2	X	Z	Z	Z	Z	Z	Z	X	Z	X H	£	£ £	£	0 0 0	bl	0	bl	X
tn vt	tn	tn	en	cn	cn	tn	tn	cn	tn	cn	cn	cn	cn	cn tn	tn	cn cn	cn	0 0 0	0	0	0	0
O O	o	o	O	O	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0 cn	tn	vt cn	VI	0 0 0	0	0	0	0
O Q	a	a	a	a	Q	O	a	O	a	o	O	O	O	o cn	cn	ri tn	cn	F< Q O	Q	O	a	Q
>- >-	>-	>-	£	£	£	b	£	£	£	£	£	£	£	£ cn	vt	vt et	tn	• 0 0	0	0	O	H
tn ví	tn	n	tn	cn	«η	Z	cn	£	tn	Z	X	tn	cn	X tn	cn	• vt	0	• Z 2	£	X	£	£
			_w			»-<								»-» »-*	»-<	•H t-4	M	0 ‘ · ►4 M 1-t	M		t-t	£
> >	>	>	>	>	>	>	>	£	>	>	>	>	>	> £	tn	n tn	£	£ £ £	Z	£	Z	£
< <	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£ tn	V»	tn tn	tn	0 0 0	£	0	£	£
> >	>	>	>	>	>	>	>	>	>	>	>	>	>	> >	>	> >	>	> > >	>	>	>	>
Z Z	Z	Z	Z	Z	Z	Z	Z	Z	Z	Z	Z	Z	Z	X z	X	z z	z	Z Z Z	Z	Z	Z	Z
w w	«4	U	u	U	U	«4	M	u	U	<4	<4	(4	u	W M	14	14 (4	(4	M ► >	M	>	M	M
u u	U	u	u	u	«4	U	»4	u	•4	U	U	U	u	U J	u	U U	4	A« 4 4	4	4	4	4
o o	O	o	o	o	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0 0	0	0 0	0	0 0 0	0	0	0	0
£ £	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£ £	£	£ £	£	£ £ £	£	K	£	£
O o	υ	O	O	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0 0	0	0 0	0	0 0 0	0	0	0	0
£ K	a«	c«	£	£	£	£	£	£	O.	£	£	£	cu	e< a»	flu	cu o-	At	At £ At	£	At	At	At
£ <	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£ £	£	£ £	£	£ £ £	£	£	£	<<
σ σ	σ	a	σ	σ	σ	σ	σ	O	O	O	O	O	O	σ σ	σ	σ σ	σ	£ O O	σ	O	σ	a
£ £	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	a:	£	£	£ £	£	£ £	£	£ £ £	£	£	£	£
> >	>	>	>	>	>	>	>	>	>	>	>	>	>	> >	>	> >	>	> > >	>	>	>	>
X Z	Z	z	Z	Z	Z	Z	Z	Z	Z	Z	z	Z	Z	z z	z	z z	Z	z z Z	Z	Z	Z	X
z z	Z	s	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	Z z	z	z z	Z	XXX	0	X	0	c
Z X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X X	X	X X	X	4 X X	X	X	X	X
w o	o	o	o	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0 tn	cn	V) 0	0	> Z X	z	Z	X	O
> b	>·	X	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	b b	£	£ £	£	£ >« >	£	>·	£	£
tn n	cn	tn	«Π	cn	«η	«	cn	cn	cn	«η	cn	tn	cn	tn cn	Vt	et et	tn	0 0 0	0	0	0	0
vi n	Wl	tn	tn	cn	cn	cn	cn	cn	en	<n	cn	tn	cn	vt tn	«1	et vt	tn	0 0 0	0	0	0	0
£ u	u.	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	u u	u.	t*w Ui	u	£ £ b«	£	£	£	£
Η H	+»	H	t-	£	£	£	£	£	H	£	f-	£	£	<-* (-	H	£ H	£	£ Η P	H			H
£ £	£	£	£	£	£	£	£	Cm	£	£	£	£	£	u u,	£	u u.	U	Cm £ £	£	£	£	£
O O	O	U	O	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0 0	0	0 0	0	0 0 0	0	0	0	0
tn tn	tn	tn	tn	tn	cn	cn	cn	Vt	cn	cn	VI	cn	cn	cn vt	»n	cn cn	0	0 0 0	0	0	0	0
£ £	£	£	£		£	£	£	£	£	£	£	£	£	< £	£	£ £	£	£ £ £	£	£	£	£
< <	£	£	£		£	£	£	£	£	£	£	£	£	£ £	£	£ £	£	£ £ £	£	£	£	£
o υ	a	<J	O	u	U	0	O	O	a	V	O	υ	CJ	O 0	U	0 V	0	V O 0	U	O	O	υ
tn tn	tn	tn	tn	tn	cn	Vt	cn	Vt	cn	cn	cn	cn	Vt	tn tn	vt	Vt vt	Vt	0 0 0	0	OT	0	0
u u	,4	U	r-J	U	•4	»4	•4	U	u	U	•4	«4	.4	U	4	4 4	4	£44	4	4	4	4
£ £	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£	£ £	£	£ £	£	£ £ £	£	£	£	£
£ U	U	u	u	U	u	U	u	«J		U	U	•4	•4	«4 U	U	4 4	4	4 4 4	4	4	4	4
«i tn	tn	tn	cn	tn	cn	tn	vt	tn	«	«t	tn	cn	tn	cn tn	Vi	vt tn	VI	0 0 0	0	0	0	0
£ £	£	£	£	£	£	£	£	0	£	£	£	£	£	£ 0	0	0 0	0	0 0 0	0	0	0	£
e e	O	O	(J	0	0	0	a	0	0	0	0	0	0	0 0	0	0 0	0	0 0 0	0	0	0	0
£ β.	cu	£	O.	£	£	£	cu	o-	£	«·	£	<U	£	cu a.	£	A> a.	cu	At At At	At	A·	A.	At
o σ	O	σ	σ	O	σ	O	O	σ	σ	σ	a	σ	σ	σ o	£	£ £	σ	o o σ	O	O	Q	a
> >	>	>	>	>	>	>	>	>	>	>	>	>	>	> >	>	> >	>	> > >	>	►	>
> >	>	>	>	>	>	>	>	>	>	>	>	>	>	> -J	•4	4 4	4	4 4 4	4	4	4	►
o o	O	o	o	0	e	0	O	o	0	0	0	a	u	0 0	0	0 0	0	0 0 0	0	0	0	o
o o	u	o	o	0	0	0	0	0	0	0	0	0	u	0 0	0	0 0	0	0 0 0	0	0	0	0
o o	o	o	u	0	e	0	0	0	0	0	0	0	o	0 0	0	0 0	0	0 0 0	0	0	0	o
tn tn	tn	tn	cn	cn	«η	cn	cn	cn	VI	cn	cn	cn	cn	cn vt	tn	cn cn	0	0 0 0	0	0	0	«
u u	(4	u	£	u	Μ	U	W	u	U	u	U	(4	U	(4 C4	bl	u U	(4	<4 bl bl	bl	U	bl	σ
> >	>	>	>	>	>	>	>	>	>	>	>	>	>	> >	>	> >	>	> > >	>	>	>	>
4 u	•4	►4	u	<4	<4		u	•4	U	u	»4	U	U	4 «4	u	4 4	4	4 4 4	4	4	4	4
o σ	O	σ	σ	O	O	σ	σ	O	σ	σ	σ	σ	σ	O O	σ	O O	σ	o σ o	O	O	O	σ
> >	>	>	>	>		►			>	>	>	>	>	> >	>	> >	>	o > >		>	>	>
σ σ	σ	σ	σ	σ	O	o	o	O	o	σ	o	o	σ	o u	u	[4 U	u	UMU	u	14	U	σ

< >υ ίθ φ 44 4—) γΉ Γϋ 3 Ό £3 Ο <3 Q Η rc

-P rC

Ό fC %

I-1

Ή •o

I-1 ω

>0 ω

n < o o _<uvtXxvixxri* jj J ÍL J J *4 U U h _Hr)nvir»0fcfc» oiOXQQOXfcfc ,, ροοααοα »1 x x X X X X w X < X <♦ 0 u X •«αυυυυυου »»>-.>·>-ΧΧ>-ΧΧ •«xxxxxxfcfc _IM< < o o

X X VI ____:e

X 4ť < *1 « x X u α a '0 p

o +j

η	Ο Q	O	O	G P	C	P
«	X X	X	X	X X	<	X
li	tu u	u	<4	M tJ	U	w
41	G O	Q	O	O O	O	0
li	0 W	U	u	tu u	M	H
	X A.	«Ο	10	Vi Vi	X	X
»♦	o x	O	a:	o o	0	σ
	j u	-4	u	u u	•u	>
II	0 0	0	0	0 0	0	u
• 4	X X	40	Vi	fc X	X	X

4C
Ή	σι
C	Φ
rp	0
'03	•ο
C
0
>1	44
Ρ	Ρ
Ό	'(C
ε	r—!
φ	•Η
	4-1
>1 G -Η	0 Ρ CL
Ό 0 Μ	Ρ1 >

Φ υ

c ω

Φ m

4->

4C tC

N 'Φ >

O c

Φ o

C <0 c

O, o

Q, < >O (C (1) 44

-P i—i f0 3

Ό Ό

O fC

Q H

	400XXXXXX
	I -			·.	»-	-
t	X	X	V	v	v	v	40 «1
»i X	X	X	X	X	X	X	X
«4 V	v	v	v	v	v	v	fc
tt X	X	X	X	X	X	X	F<
41 0	0	0	0	tí	0	0	tí
	<0	fc	(Π	VI	m	«Ί	to	n
<4 X	X	X	X	X	X	X	X
4	Vi	CO	tn	<0	M	<0	(0	o
li	0	0	0	0	0	0- 0	tí
I	fc	n	(O	<0	40	n	VI	«3
4j	U	X	u.	u	u	u.	U	fc
11	tú	cú		X	Λ	0	X	2
	O	a	o	o	O	O	a	a
1«	Aa	fc	A>	Q>	10	X	X	fc
14	w	w	>	>	>	>	>	F
11	0	0	0	0	0	0	0	tí
11	Vi	40	V)	40	IO	VI	V)	«I
11	Aa	fc	A.	A.	X	X	X	fc
14	et	OS	OS	OS	u	X	X	X
11	X	X	σ	0	u	2	X	O
11	X	X	X	Z	o	VI	VI	μ
1(	X	X	X	X	o	X	X	X
14	o	w	Vi	cc	X	0	0	tí
4«	X	x	X	X	X	X	X	X
14	»-4	C4	»-4			w	w	X
«1	J	rj	u	u	u	u	X	u
«4	u	♦J	u	0	u	►J	J
41	X	X	X	X	X	X	X	£
<4	A«	fc	0-	A.	X	X	X	*5
<1	X	X	X	X	X	X	X	X
41	X	X	X	X	X	X	X	X
41	0	0	0	0	0	0	0	o
4«	X	fc	A.	X	X	X	X	X
1«	u	u	U	«u	«4	u	*4	u
M	σ	Cl	σ	o	0	0	a	y
11	o	0	o	0	0	0	0	a
14	X	X	X		X	X	X	X
11	X	X	X	X	X	X	X	k
14	n	VI	X	X	X	X	X
M	>	>	>	>	>	>	>	>
Π	<	•	•	«	X	>	a
It	X	X	X	X	•	X	X	X
14	Z	X	X	X	X	0	0	X
11	2	2	40	co	2	X	X	«
11	0	0	0	0	0	0	0	tí
\|1<	w	X	M	»-«	w	♦M	w	H
114	X	Q	X	X	Z	X	X	X
114	10	40	4Λ	<0	(0	<0	Vi	o
»1	Vi	VI	<n	40	<0	(0	Vi	X
1«	fc	40	to	40	co	CO	(0	tí
n	0	0	O	0	0	o	0	tí
14	tn	VI	<0	VI	<0	X	X	fc
11	0	0	0	O	0	u	0	tí
n	fc	Vi	40	to	«0	(0	«0	fc
<«	»-a	+*	»~l	»-»	♦-·	►w	·-<	X
1«	X	X	X	X	X	X	X	μ
1«	>	>	>	>	>	>	>	>
11	X	X	X	X	X	X	X	X
14	o	o	o	o	0	0	0	0
11	0	0	0	0	X	0	0	tí
14	fc	fc	A«	X	X	X	X	Ai
II	X	X	X	X	X	X	X	X
It	X	X	0	0	u	0	0	tí
u	n	40	40	«0	4«	<0	co	fc
14	>	>	X	X	>	>	>	>
1	<4	VI	co	VI	(O	V)	<0	»
1	fc	fc	A.	X	X	X	X	fc
1	o.	fc	A.	X	X	X	X	fc
4	0	0	O	0	0	0	0	0
1	X	X	X	X	X	X	X	X
4	U	u	u	u	_1	J	>	u
>	>	>	>	>	>	>	>
1	10	40	40	V)	<0	V)	40	X
t	O	0	0	0	o	0	0	fc
	«1	W	04	«*1	T-4	<n	β	£
u	►4	U	u	u	u		u	—
>	fc	ÚM	ix	X	X	X	X	2
	o	Q	0	Q	Q	a	a	s
a	XI	U	u	Cr		«4	•
a	rl	»-<	«-<		«4		*4
Cf
	«a	4Λ	o	»-4	C4	CO	•v	Wl
o	WJ	W>	r*-		r>	c-	c*·	c~
fc	w>	w>	WJ	w>	WJ		WJ	WJ

I o

\£>

σ\ σ>

¢1 ε

Tabulka

CM c >u

Tabulka

ω ρ

Ο ο

Dodatek < >υ ω Λί i—i

X! ω H

CL 303725 B6

	>0
44	rC
Φ	44
+J	1-i
(C	2
Ό	£2
0	<C
Q	H

cz 303725 B6

Tg.3R3M-92

u) o

o t

OJ o

o < Σ i

α.

ΙΛ

O) (J JJ ·-<

I ω

o o

uO o

O w o CO X n O U m

W3 CO <N|<N

H fcX X o u u

P o

O >.

CO σ

CO <X5 (N z

X o

X (J u

u <

X ><

Q ><

to σ

u u

X fc>·

Q ><

<0 σ

uu r*~ co

X (O o

ΓΊ

X co

O	o
o	*n
«0	U
J
	CN
cw	U

	X
X	o
□	u
u	•

	CN
<	>u
	tú
1)	Λί
-U	1—1
(Ώ	J
Ό	Ό
0	(ΰ
Q	Η

{

UJ o

rn q> x ►+ i

>* o «ΖΊ u » CT\ u

>— >o uO vO _J CA

C\i t—i

X I—I o

šT

Cl, >Ί

X +J

X tu •r*l

Cl, '<D r-f í>

X >1 x

-Η

X ω

o £

Ή >M &

X •H >

•ri

X <3

N •H i—I p

Z < >U

X 3 (V X X H 3 3 X X O 3 Q H

O O wT νΛ ..

υ < O X' v cui G. >' I ··

4-6 O

Crt o

o\ o

O <

ω o

o ω

O jo

O O 04 m ·♦ O »—<

O f£ ”· X Ct CU ίξ o

o i

ω o

o o

i ω

c o

σ' o

o un rf CL X °* CU ~ o u r* w Ct a>

p _

X <7>

I ω

o o

o w

o ιΠ o

I w

o <n i

ω o

o o

cr cn

VHD58/VLDPL11, VHDP77/VLDPK31, VHDP47/VL a VHDP77/VLDPK31, přičemž každý z nich rozpoznal podjednotku p40 IL-12.

Testování knihovny BMDL použitím IL-12 p70 generovalo tři různé klonotypy. Zjistilo se, že dva z nich jsou zkříženě reagující klony. Dominantní klon byl sekvenován a obsahoval VHDP35/VLDP. Tento klon rozeznává podjednotku p40 IL-12. Testování knihovny scFv použitím IL—12p70 neprodukuje specifické protilátky proti IL-12.

Za účelem identifikovat protilátky proti IL-12, které se přednostně váží na heterodimer p70 nebo podjednotku p35 IL-12, spíše než na podjednotku p40, byly použity kombinované knihovny scFv 1 + 2 a BMDL. Aby se vybraly protilátky proti IL—12, které rozeznávají heterodimer p70 nebo podjednotku p35, fágové knihovny byly předem inkubovány a vybrány v přítomnosti volného p40. Sekvenování izolovaných klonů ukázalo devět různých linií protilátek. Preferenční podjednotky byly dále analyzovány mikro-Friguetovou titrací. Supematant obsahující scFv byl titrován IL-12 značeným biotinem v testu ELISA a stanovila se hodnota ED₅₀. Koncentrace scFv produkující 50 % ED byla předem inkubována se zvýšenou koncentrací volné podjednotky p70 nebo p40 (inhibitory). Byl měřen pokles signálu v testu ELISA na destičkách potažených IL-12 značeným biotinem a hodnoty se vynesly proti koncentraci volné podjednotky p70 nebo p40. Jestliže se titrace v případě obou podjednotek překrývá, pak scFv se váže na obě podjednotky p40 a p70. Libovolná odchylka od překryvu udává stupeň preference podjednotky p70 před p40.

B. Afínitní maturace linie protilátek specifických pro IL-12 (Joe 9)

U klonů byla testována jejich schopnost inhibovat navázání IL-12 na svůj receptor v testu navázání IL-12 na svůj receptor (označil se RBA) a schopnost inhibovat proliferaci lidských blastových buněk stimulovaných PHA vyvolanou IL—12 (test PHA), jak se popisuje v příkladu 3. Klon Joe 9 vykazoval v testu RBA a PHA nejnižší hodnotu IC₅₀. Tato hodnota v obou testech je 1 x 10 ^ĎM. Navíc variabilní oblast (VH) těžkého řetězce protilátky Joe 9 měla ve srovnání s nejbližší embryonální sekvencí COS-3 nejmenší počet změn, což se zjistilo z databáze VBASE. Tabulka č. 1 (uvádí se v dodatku A) zobrazuje embryonální sekvence rodiny V_H3, jejíž členem je sekvence COS-3, stejně jako členy embryonálních sekvencí rodiny VZl. Proto pro afínitní maturaci byla vybrána protilátka Joe 9. Aminokyselinové sekvence VH a VL protilátky Joe 9 divokého typu (Joe 9 wt) jsou zobrazeny na obrázku č. 1A až ID.

Za účelem zvýšit afinitu protilátky Joe 9 byly provedeny různé mutace oblasti 3 stanovující komplementaritu (CDR3) těžkého i lehkého řetězce. Použitím místně řízené PCR mutageneze s degenerovanými oligonukleotidy specifickými pro CDR3 těžkého řetězce (označených jako „H3“) nebo lehkého řetězce (označených jak „L3“) se vytvořily varianty CDR3 s průměrným počtem substitucí tří bází v každém CDR3 (označuje se jako „spike“). Mutageneze PCR CDR3 těžkého řetězce byla provedena použitím degenerovaného oligonukleotidu těžkého řetězce, který obsahuje náhodnou směs všech čtyř nukleotidů

5’TGTCCCTTGGCCCCA(G)(T)(A)(G)(T)(C)(A)(T)(A)(G)(C)(T)(C)(C)(C)(A)(C)(T) GGTCGTACAGTAATA 3’ (SEQ ID NO: 580) a oligonukleotidu pUC Reverse Tag

GAC ACC TCG ATC AGC GGA TAA CAA TTTCAC ACA GG (SEQ ID NO: 581) za vzniku souboru mutantů CDR3 těžkého řetězce. Původní lehký řetězec byl amplifikován použitím reverzního oligonukleotidu protilátky Joe 9 (5' TGG GGC CAA GGG ACA 3' (SEQ ID NO: 582) a dflteteseq 24 + 21 oligonukleotidu (5 - ATT CGT CCT ATA CCG TTC TAC TTT GTC GTC TTT CCA GAC GTT AGT -3' (SEQ ID NO: 583).

Komplementarita mezi dvěma produkty PCR byla používána k průběhu tepelné hybridizace dvou fragmentů v reakci PCR a rekombinační knihovna scFv plné délky byla amplifikována s pUC Reverse Tag (SEQ ID NO: 581) a fdTag 5'-ATT CGT OCT ATA CCG TTC-3' (SEQ ID NO: 581) a díTag 5'-ATT CGT CCT ATA CCG TTC-3' (SEQ ID NO: 584). Mutageneze PCR lehkého řetězce byla provedena použitím oligonukleotidu lehkého řetězce obsahujícího směs všech čtyř nukleotidů

5'GGTCCCAGTTCCGAAGACCCTCGAACC(C)(C)(T)(C)(A)(G)(G) (C) (T) (G) (C) (T) (G) (T) (C)ATATGACTGGCAGTAATAGTCAGC3' (SEQ ID NO: 585) a reverzního oligonukleotidu protilátky Joe 9 5' TGG GGC CAA GGG ACA 3' (SEQ ID NO: 586) za vzniku souboru mutantu CDR3 lehkého řetězce. Výchozí těžký řetězec se amplifikoval s pUC Reverse Tag (SEQ ID NO: 581) a oligonukleotidu HuJH3FOR 5-TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC3' (SEQ ID NO: 587). Komplementarita mezi dvěma produkty PCR byla použita k průběhu teplotní hybridizace dvou fragmentů v reakci PCR a rekombinovaná knihovna scFv plné délky byla amplifikována s Reverse Tag GAC ACC TCG ATC AGC G (SEQ ID NO: 588) a s oligonukleotidem HuJ7 2-3 FOR NOT 5'GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC 3' (SEQ ID NO: 589).

Mutanti CDR3 těžkého řetězce byli vybráni použitím lnM IL—12 značeného biotinem a promývali se po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti v PBS, který obsahuje volný IL—12 nebo podjednotku p40 v koncentraci 7nM. Klony se analyzovaly fágovým testem ELISA a ty, které se váží na IL—12, byly testovány v kinetických vazebných studiích BIAcore použitím čipu s IL—12 s nízkou hustotou (popisuje se v příkladu 5 v postupu analýzy BIAcore). V obecném případě analýza BIAcore měří vazebné interakce v reálném čase mezi ligandem (rekombinantní lidský IL—12 imobilizovaný na biosensorové matrici) a analytem (protilátkou v roztoku) povrchovou plazmonovou rezonancí (SPR) použitím systému BIAcore (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Systém využívá optické vlastnosti SPR k detekci změn v koncentracích proteinu v dextranové biosensorové matrici. Proteiny jsou kovalentně vázány na dextranovou matrici ve známé koncentraci. Protilátky jsou zavedeny injekcí přes dextranovou matrici a specifické navázání mezi protilátkami zavedenými injekcí a mobilizovaným ligandem vede ke zvýšené koncentraci matricového proteinu a výsledné změně v signálu SPR. Tyto změny v signálu SPR jsou zaznamenávány jako jednotky rezonance (RU) a jsou vyjádřeny s ohledem na čas na ose Y sensogramu. Aby se stanovily hodnoty k_of, k_on, asociační konstanta (Ka) a disociační konstanta (Kd), byl používán software hodnotící kinetiku BIAcore (verze 2.1). Klony, které demonstrovaly zlepšení rychlostní konstanty k_off, byly analyzovány neutralizačními testy, které zahrnovaly inhibici protilátkou proti IL—12 vázající se na svůj receptor (test RBA), inhibici proliferace vyvolané IL12 v lidských blastových buňkách stimulovaných PEIA (test PHA) a inhibici produkce interferonu gamma vyvolanou IL—12 lidskými blastovými buňkami (test IFN gamma). Souhrn disociačních konstant a/nebo hodnot IC₅₀ z neutralizačních testů klonů 70-1 až 70-13 s přidaným CDR3 těžkého řetězce je prezentován v tabulce č. 2 (popisuje se v dodatku A). Klon 70-1 vykazoval rychlostní konstantu k_off lepší než původní klon Joe9 a vykazoval nejnižší hodnotu IC₅₀ 2,0 x 10 M. Proto byl klon 70-1 vybrán pro konverzi na úplný IgGl.

Mutanti s CDR3 lehkého řetězce byli vybráni použitím lmM IL—12 značeného biotinem a promyli se PBS, který obsahuje 7nM volnou podjednotku p40. Klony se testovaly ve fágovém testu ELISA a ty, které se vázaly na IL—12, byly testovány vazebnou analýzou BIAcore použitím čipů s IL—12 s nízkou hustotou. Klony, které vykazovaly hodnotu k_off lepší než původní klon Joe 9, byly testovány v neutralizačních testech, které měřily buď inhibici navázání na receptor IL—12, nebo inhibici proliferace PHA blastových buněk. Souhrn hodnot disociačních rychlostí a/nebo hodnot IC₅₀ z neutralizačních testů mutantních klonů CDR3 lehkého řetězce 78-34 až 79-1 je prezentován v tabulce č. 2 (popisuje se v dodatku A).

Založeno na hodnotě rychlostní konstanty k_off, klony 78-34 a 78-35 vykazovaly zlepšenou hodnotu k_off ve srovnání s původní protilátkou Joe9. Oba tyto klony byly vybrány pro kombinační analýzu s mutanty těžkého řetězce.

C. Kombinační klony

Klony s mutovaným lehkým a těžkým řetězcem, které vykazovaly nej lepší vazebné charakteristiky byly používány při kombinaci a kompletaci scFv. Mutantní klony se zlepšenými účinnými charakteristikami byly kombinovány přesahující extenzí pomocí PCR a prodlužováním mutovaných segmentů VH a VL, jak se popisuje shora v textu. Klony 101-14 až 26-1 zobrazené v tabulce č. 2 (popisuje se v dodatku A) byly produkovány z kombinace mutantu těžkého řetězce (70-2, 70-13 a 70-1) s mutanty lehkého řetězce (78-34, 78-35 a 79-1). Hodnoty rychlostní konstanty koff a/nebo IC₅o získané z neutralizačních testů pro tyto klony jsou prezentovány v tabulce č. 2.

Vazebná analýza BIAcore identifikovala klon 101-11 produkovaný z kombinace mutantního klonu CDR3 těžkého řetězce 70-1 s mutantním klonem CDR3 lehkého řetězce 78-34 mající disociační konstantu (k_off) 0,0045 s '. Hodnota disociační konstanty byla podstatně zlepšena ve srovnání s hodnotou disociaěních konstant samotného mutovaného klonu CDR3 lehkého řetězce 7834 (0,0164 s '). Navíc, klon 101-11 vykazoval podstatné zlepšení v neutralizačních testech. Tedy klon 101-11 byl vybrán pro afinitní maturaci, jak se popisuje dále v textu.

D. Afinitní maturace klonu 101-11

Další afinitní maturace klonu 101-11 zahrnovala opakované cykly PCR mutageneze obou CDR3 těžkého a lehkého řetězce 101-11 použitím přidaných oligonukleotidových primerů. Klony byly vybrány pomocí snižujících se koncentrací IL—12 značeného biotinem (bio—IL—12). Vazebné charakteristiky mutovaných klonů byly odhadnuty vazebnou analýzou BÍAcore a RBA, PHA neutralizačními testy. Hodnoty rychlostní konstanty k_off a/nebo IC₅₀ v případě klonů 136-9 až 170-25 jsou přítomny v tabulce č. 2 (uvedeno v dodatku A). Klon 103-14 demonstroval zlepšenou hodnotu IC₅₀ v testu navázání na receptor a PHA blastovém testu. Klon 103-14 také demonstroval nízkou hodnotu rychlostní konstanty k_off a podobně byl vybrán pro další afinitní maturaci.

E. Vytvoření a výběr náhodných knihoven klonu 103-14 CDR3 lehkého řetězce

CDR3 lehkého řetězce klonu 103-14 (QSYDRGFTGSMV (SEQ ID NO: 590)) byl systematicky náhodně rozdělen do 3 segmentů použitím 3 různých knihoven, jak je uvedeno dále v textu, kde symbol Xje kódován náhodným kodonem sekvence NNS, přičemž symbol Aje libovolný nukleotid a symbol S je buď deoxycytozin, nebo deoxyguanidin.

L3.1 = XXXXXXFTGSMV (SEQ ID NO: 591)'

L3.2 = QSYXXXXXXSMV (SEQ ID NO: 592)

L3.3 = QSYDRGXXXXXX (SEQ ID NO: 593)

Byla provedena náhodná mutageneze všech tří CDR lehkého řetězce (označených jako L3.1, L3.2 a L3.3) klonu 103-14. CDR3 těžkého řetězce (označený H3) klonu 103-14 nebyl mutován. Byly zkonstruovány čtyři náhodné knihovny založené na klonu 103-14 (H3 a L3.1, L3.2 a L3.3) a byly vystaveny mnoha různým selekčním podmínkám, které zahrnovaly použití limitující koncentrace antigenu a přítomnost nebo absenci nadbytku volného antigenu (p40 a p70). Výstupy z výběrů (klony 73—Β1 až 99—G11) byly testovány primárně analýzou BÍAcore a v případě nutnosti testem RBA a jsou zobrazeny v tabulce č. 2 (zobrazeno v dodatku A).

Náhodná mutageneze CDR lehkého řetězce 103-14 vytvořila klon Y61, který vykazoval podstatné zlepšení hodnoty IC₅o ve srovnání s původním klonem 103-14. Klon Y61 byl vybrán pro získání celého IgGl. Celý Y61—IgGl měl hodnotu IC₅₀ přibližně 130pM stanovenou testem

PHA. Hodnota IC₅o nebyla ovlivněna 50-ti násobným molárním nadbytkem volného p40, což demonstruje, že volný p40 nereaguje zkříženě s Y61 protilátkou proti IL-12, čím snižuje navázání protilátky na heterodimer. Sekvence plné délky variabilní oblasti těžkého řetězce a variabilní oblasti lehkého řetězce Y61 jsou zobrazeny dále v textu.

Peptidová sekvence variabilní oblasti těžkého řetězce Y61

CDRH1

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASFTFS SYGMH WVRQAPGKGLEWVA

CDR H2

FIRYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCKT

CDR H3

HGSHDN WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 23)

Peptidová sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce Y61

CDR LI

QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISC SGGRSNIGSNTVK WYQQLPGTAPKLLl Y

CDR L2

GNDQRPS GVPDRFSGSKSGTSASLA1TGLQAEDEADYYC

CDR L3

QSYDRGTHPALL FGTGTKVTVLG (SEQ ID NO:24)

Zbytky CDR jsou označeny podle definic Kabata.

Příklad 2: Mutace Y61 v hypermutačních a kontaktních polohách

V typickém případě selekce rekombinantních protilátek se zlepšenými afinitami mohou být provedeny použitím metod vyjadřujících fága. To je docíleno náhodně mutujícími kombinacemi zbytků CDR za vzniku velkých knihoven, které obsahují jednořetězcové protilátky různých sekvencí. V typickém případě protilátky se zlepšenými afinitami jsou vybrány na základě jejich schopnosti dosáhnout rovnováhy v reakci protilátka-antigen. Když se však exprimovala na povrchu fága Y61 scFV a inkubovala se s IL-12, nemohly být nalezeny selekční podmínky, které by nechaly systém dosáhnout normální rovnováhy protilátka-antigen. scFV-fág zůstal navázaný na IL-12, což pravděpodobně způsobila nespecifická interakce, protože čištěná Y61 scFv vykazovala normální disociační kinetiky. Poněvadž nemohly být využity obvyklé metody fága vyjadřující afinitní mutace na Y61 (to je vytvoření knihovny a selekce mutagenezi více zbytků CDR), byla vyvinuta nová strategie, při které byly mutovány jednotlivé polohy CDR.

Tato strategie zahrnuje selekci poloh CDR vhodných pro mutaci a je založena na identifikaci a selekci aminokyselin, které jsou preferované polohy selektivní mutageneze, kontaktní poloh a/nebo hypermutační polohy. Kontaktní polohy jsou definovány jako zbytky, které mají vysokou pravděpodobnost kontaktu s antigenem, když antigen interaguje s protilátkou, zatímco hypermutační polohy jsou definovány jako zbytky, o nichž se uvažuje, že mají vysokou pravděpodobnost somatické hypermutace během afinitní maturace protilátky in vivo. Preferované polohy selektivní mutageneze jsou polohy CDR, které jsou jak kontaktní, tak hypermutační polohy. Protilátka Y61 byla už optimalizována v oblastech CDR3 použitím postupu popsaném v příkladu 1, proto bylo obtížné dále zlepšit oblast, která leží ve středu vazebného místa protilátky použitím selekčních metod vyjádření fága. Větší zlepšení aktivity byla získána mutací potencionálních kontaktních poloh vně oblastí CDR3 buď odstraněním škodlivého kontaktu antigen-protilátka, nebo vytvořením nového kontaktu.

Aminokyselinové zbytky protilátky Y61, které byly považovány za kontaktní body s antigenem a ty polohy CDR, které jsou místa somatických hypermutací během afinitní maturace in vivo, jsou zobrazeny v tabulce č. 3 (zobrazeno v dodatku A). V případě afinitní maturace Y61 bylo vybráno pro mutagenezí PCR 15 zbytků vně CDR3, tři zbytky ve smyčce L3 a 5 zbytků ve smyčce H3.

Gen Y61 scFv byl klonován za účelem mutageneze do plazmidového vektoru pUCl 19(Sfi). Oligonukleotidy byly navrženy a syntetizovány s náhodnými kodony, aby se mutovala každá vybraná poloha. Po PCR mutagenezí byl sekvenován malý počet klonů (přibližně 24) a exprimoval se v hostitelské buňce, například v bakteriální, kvasinkové nebo savčí hostitelské buňce. Čistila se exprimovaná protilátka a k_off se měřila použitím systému BIAcore. Tento postup se opakoval v případě jiných poloh CDR. Jednotlivé mutace, které mají zlepšenou neutralizační aktivitu byly kombinovány za vzniku protilátky s ještě větší neutralizační silou.

Polohy CDR protilátky Y61, které byly mutovány za účelem zlepšit neutralizační sílu a aminokyselinové substituce v každé poloze jsou zobrazeny na obrázcích 2A až 2H. Hodnoty konstanty rychlosti disociace jsou dány, jak se stanovilo analýzou BIAcore. Tyto hodnoty konstanty rychlosti disociace jsou také zobrazeny v histogramech na pravé straně každé tabulky.

Výsledky těchto substitucí v polohách H30, H32, H33, H50, H53, H54, H58, H95, H97, H101, L50, L92, L93 demonstrovaly, že všechny zkoumané substituce aminokyselin vedly k protilátkám s menšími hodnotami konstanty rychlosti disociace než jsou hodnoty protilátky Y61. V polohách H52, L32 a L50 byla zjištěna pouze jedna substituce aminokyseliny, aby se zlepšila hodnota konstanty rychlosti disociace protilátky Y61, všechny jiné změny nepříznivě ovlivňovaly aktivitu. V případě L50 jediná změna Gly -» Tyr podstatně (5 až 1 Okřát) zlepšila neutralizační sílu protilátky Y61. Výsledky demonstrovaly důležitost těchto poloh vzhledem k aktivitě protilátky Y61 a naznačují, že ve většině případů fágového zobrazení bylo možné vybrat optimální zbytky. Bylo zjištěno, že několik substitucí v polohách H31, H56, L30 a L94 zlepšilo hodnotu konstanty rychlosti disociace protilátky Y61, což naznačuje, že tyto polohy byly také důležité pro navázání antigenu, ačkoli přístup zobrazení fága neumožňoval selekcí optimálních zbytků.

Selektivní mutace kontaktních a hypermutačních poloh protilátky Y61 identifikovala aminokyselinový zbytek L50 v CDR2 lehkého řetězce a zbytek L94 CDR3 lehkého řetězce, které zlepšily neutralizační schopnost protilátky Y61. Kombinace těchto mutací produkovala aditivní účinek generující protilátku J695, která vykazovala podstatné zvýšení neutralizační schopnosti. Sekvence plné délky variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce protilátky Y61 je zobrazena dále v textu.

Peptidová sekvence variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky J695

CDRH1 qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfs sygmh wvrqapgkglewva

CDR H2

FIRYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCKT

CDR H3

HGSHDN WGQGTMVTVSS (SEQ IDNO: 31)

Peptidová sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce protilátky J695

CDR Ll

QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISC SGSRSNIGSNTVK WYQQLPGTAPKLLIY

CDR L2

YNDQRPS GVPDRFSGSKSGTSASLA1TGLQAEDEADYYC

CDR L3

QSYDRYTHPALL FGTGTKVTVLG (SEQ ID NO: 32)

Zbytky CDR jsou označeny podle definic Kabata.

Shrnutí uspořádání sekvence variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce zobrazující postup 5 vývoje klonů, které byly na dráze vývoje z protilátky Joe9 na protilátku J695 je zobrazeno na obrázcích 1A až ID. Číslování CDR a zbytků je podle Kabata.

Příklad 3: Funkční aktivita protilátek proti hIL-12 io

Aby se testovala funkční aktivita lidských protilátek proti lidskému IL—12 podle vynálezu, protilátky byly používány v několika testech, které měří schopnost protilátky inhibovat aktivitu IL—12.

A. Příprava lidských lymfoblastů aktivovaných PHA

Lidské jednojademé buňky periferní krve (OBMC) byly izolovány z leukopaku získaného ze 15 zdravého dárce centrifugaci s gradientem směsi fikol-Hypaque po dobu 45 minut při rychlosti

500 ot./min., jak se popisuje v publikaci Current Protocols in ímmunology, Unit 7.1 PBMC. PBMC na rozhraní vodného roztoku krve a média pro separaci lymfocytů byly sebrány a za účelem odstranění částic směsi fikol-Paque se třikrát promyly fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem (PBS) a centrifugovaly po dobu 15 minut při 1 500 ot./min.

PBMC byly pak aktivovány za vzniku lymfoblastů, jak se popisuje v publikaci Current Protocols in Immunology, Unit 6.16. Promyté PBMC byly resuspendovány v úplném médiu RPMI v koncentraci 0,5 až 1 x 10⁶ buněk/ml (médium RPMI 1640, 10% fetální bovinní sérum (FBS), 100 U/ml, penicilinu, 100gg/ml streptomycinu), doplněného 0,2% (objem/objem) PHA-P (Difco, Detroit, MI) a kultivovaly se po dobu 4 dní při teplotě 37 °C v atmosféře 5% CO2. Po čtyřech dnech byly buněčné kultury rozděleny v poměru 1:1 do objemu úplného média RPMI plus 0,2% (objem/objem) PHA-P a 50 U/ml rekombínantního lidského IL-2. Rekombinantní lidský IL—2 byl produkován transfekcí expresívního vektoru, který nese cDNA lidského IL—2 do buněk COS (popisuje se v publikaci Kaufman et al., (1991) Nuecleic Acids Res. 19, 4484 až 4490) a čistil se, jak se popisuje v dokumentu PCT/US96/01382. Buněčné kultury byly pak inkubovány po další jeden až tři dny. Sklidily se blastové buňky, dvakrát se promyly úplným médiem RPMI a zamrazily se v 95 % FBS, 5 % DMSO v koncentraci 10x10⁶ buněk/ml.

Za účelem použití v testu navázání IL-12 na svůj receptor (popisuje se v sekci Β) PHA blastové buňky se sesbíraly po jednodenní kultivaci v přítomnosti IL-2, zatímco PHA blastové buňky, které budou používané v PHA blastovém proliferačním testu (popisuje se v sekci C) a testu indukce interferonu gamma (popisuje se v sekci D) byly sesbírány po třídenní kultivaci v přítomnosti IL-2.

B. Test navázání IL-12 na svůj receptor

Analyzovala se schopnost protilátek proti IL-12 inhibovat navázání radioaktivně značeného IL12 na receptory IL-12 na PHA blastech následujícím způsobem. Různé koncentrace protilátky proti IL-12 byly předem inkubovány po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C s 50 až ΙΟΟρΜ IhIL-12 (hlL-12 značený jódem byl připraven použitím značící metody Bolton-Hunter se specifickou aktivitou 20 až 40 mCi/mg, od firmy NEN-Dupont) ve vazebném pufru (RPMI 1640, 5% FBS, 25mM Hepes pH 7,4). PHA blastové buňky izolované jak se popisuje shora v textu, byly jednou promyty a resuspendovány ve vazebném pufru s hustotou buněk 2x10⁷ buněk/ml. PHA blasty (v množství lxlO⁶ buněk) byly přidány k protilátkové směsi ¹²⁵I—hIL—12 a ínkubovaly se po dobu dvou hodin při teplotě místnosti. Buněčná vazebná radioaktivita se oddělila od volného ^l25I-hIL-12 centrifugací testované směsi po dobu 30 vteřin při teplotě místnosti, roztok se odsál a zbytek se promyl 0,1 ml vazebného pufru, pak následuje centrifugace při teplotě 4 °C po dobu 4 minuty při 10 000 x g. V buněčném peletu se testovala buněčná vazebná radioaktivita použitím počítače gamma. Celkové navázání bylo stanoveno v nepřítomnosti protilátky a nespecifické navázání bylo stanoveno inkluzí 25nM neznačeného IL-12 v testu. Inkubace byla provedena ve dvojím provedení.

V testu navázání IL-12 na svůj receptor se použily lidské protilátky proti IL-12 Y61 a J695, přičemž obě protilátky demonstrovaly srovnatelnou inhibici navázání IL—12 na receptor. Protilátka Y61 inhibovala navázání IL-12 na receptor s hodnotou IC50 přibližně 1,6 x 10M, zatímco protilátka J695 měla hodnotu IC₅₀ přibližně 1,1 x 10”^!lM.

C. Test prolíferace lidských PHA blastů

U protilátek proti IL—12 byla hodnocena jejich schopnost inhibovat proliferaci PHA blastů (přičemž prolíferace je stimulována IL-12). Sériové ředění protilátky proti IL—12 byla předem inkubovány po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C, v atmosféře 5% CO₂ s 230 pg/ml hIL-12 ve 100 ml úplného média RPMI na mikrotitrační destičce (dno ve tvaru U, 96 prohlubní, Costar, Cambridge, MA). PHA blastové buňky izolované jak se popisuje shora v textu byly jednou promyty a resuspendovaly v úplném médiu RPMI s hustotou buněk 3x10⁵ buněk/ml. PHA blasty (objem 100 ml, množství 3 x 10⁴ buněk) byly přidány do směsi protilátka/hlL-12, vše se inkubovalo po dobu tří dní při teplotě 37 °C v 5% atmosféře CO₂ a značilo se po dobu 4 až 6 hodin s 0,5 mCi/jamku (3H)-thymidinu (Amersham, Arlington Heights, IL). Obsahy kultur byly zachyceny na filtrech ze skleněných vláken podle způsobu pomocí zařízení pro sesbírání buněk (Tomtec, Orange, CT) a začlenění (^sH)-thymidinu do buněčné DNA bylo měřeno počítačem v scintilačním roztoku. Všechny vzorky se testovaly dvojmo.

Výsledky neutralizace v přítomnosti různých koncentrací p70:p40 (to je poměr heterodimeru IL12 k volné podjednotce p40) jsou zobrazeny v tabulce 4 (popisuje se v dodatku A).

Analýza lidské protilátky proti IL-12 v testu proliferace PHA blastů demonstrovala, že protilátka inhibovala proliferaci PHA blastů s hodnotou IC₅o přibližně 1,8 x 10”^l0M v přítomnosti samotné podjednotky p70 IL-12 bez nadbytku podjednotky p40 (poměr p70:p40 je 1:0). V přítomnosti 50-ti násobného nadbytku volné podjednotky p40 (poměr p70:p40 je 1 : 50) protilátka Y61 inhibovala proliferaci PHA blastů s hodnotou IC₅₀ přibližně 1,8 x 10'°M. Tento výsledek demonstruje, že schopnost protilátky Y61 inhibovat proliferaci blastů není oslabena přítomností nadbytku podjednotky p40.

Lidská protilátka proti IL-12 J695 inhibovala proliferaci PHA blastů s hodnotou IC₅₀ přibližně

I, 0 x 10 ¹ 'Μ v přítomnosti podjednotky p70 a p40 v poměru 1:0. V přítomnosti podjednotek p70 a p40 v poměru 1:50 tato protilátka inhibuje proliferaci PHA blastů s hodnotou IC₅₀ přibližně

5,8 ± 2,8 x 10“¹² M (n=2), což demonstruje, že nadbytek podjednotky p40 měl na protilátku pouze slabý inhibiční účinek. Celkově výsledky demonstrují zlepšenou neutralizační aktivitu protilátky J695 ve srovnání s protilátkou Y61, což způsobily mutace v L50 a L94.

D. Test indukce interferonu gamma

Schopnost protilátek proti IL-12 inhibovat produkci IFNy PHA blasty (jejichž produkce je stimulována IL-12) byla analyzována následujícím způsobem. Různé koncentrace protilátky proti IL-12 byly předem inkubovány po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C, v atmosféře 5% CO₂ s 200 až 400 pg/ml hIL-12 ve 100 ml úplného média RPMI v mikrotitrační destičce (dno ve tvaru U, 96 prohlubní, Costar). PHA blastové buňky izolované, jak se popisuje shora v textu, byly jednou promyty a resuspendovány se v úplném médiu RPMI s buněčnou hustotou 1 x 10⁷ buněk/ml. PHA blasty (objem 100 μί, množství 1 x 10⁶ buněk) byly přidány do směsi proti látka/h IL-12 a inkubovaly se po dobu 18 hodin při teplotě místnosti a v atmosféře 5% CO₂. Po inkubaci se z každé jamky odebralo 150 μί supernatantů bez buněk a testem ELISA bylo měřeno množství lidského produkovaného IFNy (test ELISA pro stanovení endogenního interferonu gama, Endogen, Cambridge, MA). Každý supematant se testoval ve dvou provedeních.

Analýza lidské protilátky proti hIL-12 Y61 v tomto testu demonstrovala, že protilátka Y61 inhibovala produkci lidského IFNy s hodnotou IC₅₀ přibližně 1,6 x 10¹⁰M, zatímco lidská protilátka proti IL-12 J695 inhibovala produkci lidského IFNy s hodnotou IC₅o přibližně 5,0 ± 2,3 x 10 ^l2M (n = 3). Výsledek demonstruje podstatné zlepšení afinity protilátky J695 jako výsledek modifikací v L50 a L94.

E. Indukce IL—12, který není lidský, z izolovaných PBMC

Aby se testovala zkřížená reaktivita lidských protilátek proti hIL-12 s IL-12 z jiných druhů, IL12, který nepochází z člověka, byl produkován následujícím postupem. PBMC byly separovány z čerstvé krve ošetřené heparinem centrifugací s hustotním gradientem, jak se popisuje shora v textu za použití sady Lymphoprep (Nycomed, Oslo, Norsko) v případě PBMC opice cynomolgus, paviána a psa, v případě PBMC psa se použije sada Accu-paque (Accurate Chemical and Sci. Corp., Westbury, NY) nebo v případě krysích PBMC se použije sada Lympholyte-rat (Accurate Chemical and Sci. Corp., Westbury, NY).

PBMC byly pak indukovány za vzniku IL-12, jak se popisuje v publikaci D'Andrea et al., (1992)

J. Exp. Med. 176, 1387 až 1398, Villinger et al., (1995) J. lmmunol. 155, 3945 až 3954, Buettner et al., (1998) Cytokine 10, 241 až 248). Promyté PBMC byly resuspendovány v koncentraci 1 x 10⁶ buněk/ml úplného média RPMI doplněném 0,0075 % (hmotn./objem) SAC (Pansorbin, Calbiochem-Boehring Co., La Jolla, CA) nebo 1 až 5 mg/ml ConA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) plus 0,0075 % SAC a inkubovalo se po dobu 18 hodin při teplotě 37 °C v atmosféře 5% CO₂. Médium bez buněk a SAC se shromáždilo centrifugací a filtrací přes filtr s póry 0,2 nm.

IL—12 z opice makak byl získán jako rekombinantní IL—12 makaka z instituce Emory University School of Medicine, Atlanta, GA.

F. Proliferační test s myšími buňkami 2D6

Klon 2D6 myších T buněk proliferuje jako odezva na myší IL-2, IL 4, IL—7 a IL—12 (Maruo et al., (1997) J. Leukocyte Biol. 61, 346 až 352). Podstatná proliferace byla také detekována jako odezva na supernatanty s krysími PBMC, které obsahují krysí IL—12. Buňky nevykazují odezvu na IL-12 pocházejí ze psa, opice cynomolgus, paviána a člověka. Myší buňky 2D6 byly propagovány v úplném médiu RPMI doplněném 50mM beta-merkaptoethanolem (βΜΕ) a 30 ng/ml myšího IL-12. Jeden den před testem byl myší IL—12 vymyt a buňky se inkubovaly přes noc io v úplném médiu RPMI plus βΜΕ.

Sériová ředění protilátky proti IL-12 byla předem inkubována po dobu 1 h při teplotě 37 °C v atmosféře 5% CO₂ se 40 pg/ml myšího IL—12 ve 100 ml RPMI úplného média plus βΜΕ v mikrotitrační destičce (dno ve tvaru U, 96 jamek, Costar). Buňky 2D6 byly jednou promyty a resuspendovaly se v úplném médiu RPMI obsahujícím βΜΕ s hustotou buněk 1 x 10⁵ buněk/ml. Buňky 2D6 (objem 100 μΐ, množství 1 x 10⁴ buněk) byly přidány do směsi protilátka/hlL—12, inkubovaly se po dobu 3 dní při teplotě 37 °C v atmosféře 5% CO₂ a značily se po dobu 4 až 6 hodin s 0,5 mCi na jamku pomocí (3H)-thymidinu. Obsahy kultury byly sklizeny a intenzita radiace se stanovila počítačem v scintilačním roztoku. Všechny vzorky se testovaly dvojmo.

G. Zkřížená reaktivita protilátky J695 s IL-12, který nepochází z člověka, mezi druhy

Zkřížená reaktivita protilátky J695 s IL-12, který nepochází z člověka, mezi druhy byla analyzována použitím PBMC izolovaných z několika druhů, mezi kterými není člověk. Přítomnost aktivity IL-12, který nepochází z člověka, v PBMC supematantech z krysy, psa, opice cynomolgus a paviána, byla potvrzena použitím několika biotestů popsaných shora v textu, jako je proliferační test myších 2D6, proliferační test lidských PHA blastů a test indukce interferonu-gama blokováním odezev indukovaných nelidskými PBMC králičími a/nebo ovčími polyklonálními protilátkami s myším a/nebo lidským IL—12. Zkřížená reaktivita lidských protilátek proti hlL-12 Y61 a J695 s nelidským IL-12 v PBMC supematantech nebo s čištěným IL-12 myši a makaka byla pak odhadnuta v některém biotestu/ech) stanovením koncentrace protilátky J695, při které byla pozorována 50% inhibice odezvy. Výsledky zkřížené reaktivity mezi druhy jsou shrnuty do tabulky č. 5. Výsledky demonstrují, že každá protilátka Y61 a J695 je schopná rozeznávat IL—12 z opic (například IL—12 cynomolga a makaka v případě protilátky Y61 a cynomolga, makaka a paviána v případě protilátky J695) a že protilátka J695 je přibližně 35krát méně aktivní v případě psího IL—12. Ani protilátka Y61 ani J695 nereagují zkříženě s myším nebo krysím IL—12.

H. Specifita protilátky J695 vůči lidskému cytokinů

Specifita protilátky J695 byla testována v kompetitivním testu ELISA, ve kterém se u souboru lidských cytokinů testovala jejich schopnost interferovat s navázáním rozpustné J695 na mobilizovaný lidský IL-12. Soubor lidských cytokinů zahrnoval IL-1 a a IL—1 β (Genzyme, Boston, MA), IL-2 (Endogen), IL—4, IL—10, IL-17, IFN-gama a TGF-βΙ (R&D, Minneapolis, MN) IL40 8 (Calbiochem), PDGF, IGF—1 a IGF—II (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN), TNFa a lymfotoxin, IL—6, rozpustný receptor IL—6, IL-11, IL-12p70, IL—12p40, M-CSF a LIF. EBI-3, což je protein příbuzný IL—12p40, který je indukován infekcí virem Epstein-Barrové v B lymfocytech (popisuje se v publikaci Devergne et al., (1996) J. Virol. 70, 1143 až 1153), byl exprimován jako chiméra lidského IgG-Fc (EBI-3/Fc), Byla také testována jednořetězcová DNA (Sigma) lososího spermatu.

Tabulka č. 5: Data zkřížené reaktivity mezi druhy

	i— i dl H ‘>1 dí tO TJ •d —1	I čištěný 1				O rd X o lA	□ o rd X Γ- rd	ó rd X o lA
	<0
	u

	•d
	>						7			7
	«3	ct					O			o
	U						rd			rd
		tn
	CN						X			X
	t—	t
	í						o			tA
	dl	OJ					X			X
	H	cu					CN			i—(


	<0
	ac						7	7		7
	m						o	O		o
	fc						rd	rd		rd
		c
	CN	>φ					X	X		X
	rd	P
	1	«η					o	o		O
	dl	Ή					X	X		X
	H	>υ					rd	rd		rd
	CN						0	o
	rd							I		,
	1	α					O	O		O
	dl	3					rd	rd		rd
	w	to					X	X		X
	0	ο
	C	X					CN	CN		o
	>	□4					x	X		X
	Λ4	ct					rd	CN		rd
s	CN									3
o	rd	Cu								O
Ifí	1	3
u	dl	tn
H	H	O								X
	Ή	>:								tn
	tn	CU								X
	Λ	ct								rn
										Ή
										ta
										3
	CN									N
	rd									•d
	1	•								rd
	dl	ct			o					«3
	M	3			rd					d
		cn								P
	<d				X					3
	CO	f)								Φ
	>1				o					3
	w	04			X					Φ	«d
	*	ct			LO					c	U
								Ή		Ή
								TA		TA
								3		3
								N		N
	CN				o					•<d
	rd			7	7			rd		rd
	1			o	o			Φ		flj
	dl			r-t	rd			d		d
	H	c						P		P
		KU		X	X			3		3
	Ή	P						Φ		Φ
	’t0	xn		o	m			c		c
		-d		X	x			0)	*d	Φ	-d
	£	O		ω	rd			c	u	c	u
								CN		tN
				CN				rd		rd
				i—l			(N	u		>3
				dl			rd	H		w
				H			P	3		3
		«TJ		75			H	dl		Č
		43		ε	t		3	a		0
		•d		č	Ή	(N	JŽ
		<+d		{	O	rd	a	>,		'>1
	Ό	Ή		<d	Ή	dl	1	Až		Ať
	ϋ		«	rd	H		to		to
	Λ4	Φ		>,	<0	3	KO	TJ		TJ
	p	Ct		u	d	tl	>
	Ή	CO		λ:	AC	a	ε	rd		rd
	•d
	P
	0
	d
	Ci			ď>	CA		CN
		>			O
		ω			01		LO			tn
		N		r*	ΓΑ			rd		<Λ
		<0		r-t	O		00	LO		LO
		c		u	Ct		υ	>·		7)

Mikrotitrační destičky pro imunologický test ELISA s plochým dnem (96 prohlubní, pro vysoké navázání, Costar) byly potaženy přes noc při teplotě 4 °C s 0,1 ml lidského IL-12 (2 pg/ml) v 0,lM uhličitanovém potahovacím pufru (4 objemy 0,lM NaHCO₃ plus 8,5 objemů 0,lM NaHCOs)). Destičky byly promývány dvakrát PBS, který obsahuje 0,05% Tween 20 (PBS-T), blokovány 200 μΐ bovinního sérového albuminu o koncentraci 1 mg/ml (BSA, Sigma) v PBS-T po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti a opět se promyly dvakrát PBS-T. Byly přidány vzorky (objem 100 μΐ) obsahující protilátky proti IL-12 J695 (100 ng/ml) a každý cytokin (v koncentraci 2nM) v PBS-T obsahující 50 pg/ml BSA (PBS-T/BSA) a inkubovaly se po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Plotny byly promyty čtyřikrát a inkubovaly se po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti se 100 μΐ myšího anti-lidského lambda-HRP (1:500 v PBS-T/BSA, Southern Biotech. Ass. lne., Birmingham, AL). Destičky byly promyty čtyřikrát a vyvíjely se pomocí ABTS (Kirkegaard & Perry Lab., Gaithersburg, MD) po dobu 20 až 30 minut ve tmě. Hodnoty OD při vlnové délce 450 nm byly odečítány použitím čtecího zařízení (Molecular Devices, Menlo Park, CA). Procento navázání bylo stanoveno ve vztahu k navázání protilátky J695 na destičku potaženou IL-12 v nepřítomnosti libovolného rozpustného cytokinů.

Výsledky demonstrovaly, že navázání protilátky J695 na imobilizovaný lidský IL-12 bylo blokováno pouze lidským IL—I2p70 a v menším rozsahu lidským IL—12p40 a nikoliv libovolnými jinými testovanými cytokiny.

I. Navázání na novou molekulu IL-12

Byl popsán alternativní heterodimer IL-12, ve kterém podjednotka p35 je nahrazena novou molekulou p 19. Molekula pl9 byla identifikována použitím vyhledávání homologie 3D v případě členů rodiny IL—6/IL—12 a je syntetizována aktivovanými dendritickými buňkami. Molekula pl 9 se váže na podjednotku p40 za vzniku dimeru pl9/p40, který měl aktivitu podobnou IL-12, ale při indukci IFNy není tak silný jako heterodimer p35/p40. Předpokládá se, že protilátky, které rozeznávají samotnou podjednotku p40, ale přednostně v souvislosti s molekulou p70 (například protilátka J695 a Y61, popisuje se v příkladu 3H) také neutralizují obě molekuly p35/p40 a molekuly pl9/p40.

Příklad 4: Aktivita protilátek proti hIL-12 in vivo

Účinky in vivo protilátek proti IL-12 na odezvy vyvolané IL-12 byly testovány v modelu, kterým je upravený model použitý ke studiu účinku lidského IL-12 na periferní hematologii u opice cynomolgus (popisuje se v publikaci Bree et al., (1994) Biochem. Biophys. Res. Comm. 204: 1150 až 1157. V těchto předchozích studiích aplikace lidského IL-12 v koncentraci 1 pg/kg/den po dobu pěti dní vedla ke snížení počtu bílých krvinek (WBC). Po 24 hodinách zvláště v podsouborech lymfocytů a monocytů. Snížení počtu červených krvinek bylo pozorováno po 72 hodinách, Množství plazmového neopterinu, což je markér pro aktivaci monocytů při odezvě na IFNγ, začíná růst po 24 hodinách a nejvyšší bylo po 72 hodinách.

V první studii s lidskými protilátkami proti hIL-12, bylo sedativy zklidněno 15 zdravých opic cynomolgus s průměrnou tělesnou hmotností 5 kg a rozdělilo se do 5 skupin (n = 3). Skupině 1 se provedla intravenózně aplikace (IV) 10 mg/kg lidského intravenózního imunoglobulinu (IVIG, Miles, Eckhart, IN, čištěný použitím sefarózy s proteinem A). Skupině 2 se provedla intravenózní aplikace 1 mg/kg protilátky C8.6.2 (neutralizační myší monoklonální protilátka proti lidskému IL-12). Skupině 3 se provedla intravenózní aplikace 10 mg/kg protilátky C8.6.2. Skupině 4 se provedla intravenózní aplikace 1 mg/kg protilátky Y61 (lidské protilátky proti IL-12, izolovala se z upraveného média vhodného pro buňky CHO). Skupině 5 se aplikovalo intravenózně 10 mg/kg protilátky Y61.

Jednu hodinu po aplikaci protilátky všechna zvířata obdržela jedinou podkožní injekci (SC) lidského IL-12 (1 pg/kg). Krevní vzorky byly odebrány v následujících časech: základní čas, 8, 24, 48, 96 a 216 hodin a analyzoval se celkový počet 1 krevních buněk pomocí rozdílů a chemickou analýzou séra. Byl také měřen sérový lidský IL-12, protilátka C8,6.2, protilátka Y61, opičí IFNgama, opičí IL—10, opičí IL-6 a množství neopterinu v plazmě.

Zvířata ošetřená IL-12 plus kontrolní protilátkou IVIG (skupina 1) vykazovala řadu očekávaných hemato logických změn, které zahrnují snížení WBC, červených krvinek, počtu lymfocytů a monocytů. Tato snížení nebylo možné vidět nebo bylo méně výrazné u zvířat ošetřených buď protilátkou C8.6.2, nebo Y61 při koncentraci 1 nebo 10 mg/kg (skupina 2 až 5).

Vzorky séra a plazmy byly analyzovány testem ELISA specifickým pro opičí IFN-gama a opičí IL—10 (Biosource International, Camarillo, CA), opičí IL-6 (Endogen) a plazmový neopterin (ICN Pharmaceuticals, Orangeburg, NY). IFN-gama, IL—10 nebo IL—6 nebyly detekovány u žádného ze zvířat ošetřených IL-12, která zahrnují kontrolní zvířata ošetřená IL—12 plus IVIG. To bylo pravděpodobně způsobeno nízkým stupněm expozice IL-12 (pouze jedna dávka v koncentraci 1 pg/kg). Přesto množství neopterinu v plazmě se zvýšilo u zvířat ošetřených IL12 plus IVIG přibližně třikrát, ale neměnilo se u zvířat ošetřených protilátkou C8.6.2 nebo Y61, které zahrnují zvířata ošetřená nižší dávkou protilátky Y61 (1 mg/kg), což indikuje, že protilátka Y61 byla účinná in vivo při blokování této citlivé odezvy na IL-12.

Při druhé studii byly studovány aktivity in vivo a farmakodynamiky (PD) protilátky J695 u opic cynomolgus aplikací exogenního rhIL-12 a stanovilo se, zda protilátka J695 by mohla blokovat nebo redukovat odezvu, která je v normálním případě spojena s aplikací rhIL-12. Samcům opic cynomolgus (3 ve skupině) byla aplikována jediná dávka protilátky J695 v koncentraci 0,05, 0,3 nebo 1,0 mg/kg nebo 1 mg/kg intravenózního imunoglobulinu (IVIG) jako bolusová intravenózní (IV) injekce do safenozní žíly nebo podkožně (SC) do kůže na zádech. Jednu hodinu po aplikaci protilátky J695 nebo IVIG, obdržela všechna zvířata jedinou dávku 1/mg/kg rhIL-12 (SC) aplikovanou do kůže na zádech. Vzorky krve se odebraly z femorální žíly až 29 dní po aplikaci protilátky J695. Z každého vzorku krve se získalo sérum a testem ELISA se testovala přítomnost IL12, J695, IFN-γ a protilátky proti J695. Neopterin se testoval pomocí HPLC s reverzní fází.

Množství neopterinu normalizované s ohledem na množství neopterinu, které se naměřilo před aplikací protilátky J695 nebo rhIL-12, je uvedeno na obrázku č. 3. Aby se porovnalo snížení množství neopterinu mezi skupinami, byla vypočítána v případě každého zvířete oblast pod křivkou (AUG) normalizovaná pro množství neopterinu (tabulka č. 6). Vystavení neopterinu (AUC) bylo potlačeno způsobem závislým na dávce mezi přibližně 71 a 93 % ve skupinách IV a mezi 71 a 100 % ve skupinách SC, vztaženo ke kontrolní skupině IVIG. Tyto výsledky naznačují, že dávka protilátky HJ695 nezbytná pro 50% inhibici neopterinové odezvy (ED₅₀) byla nižší než 0,05 mg/kg, když se aplikovala buď IV, nebo SC cestou.

Tabulka 6: Na dávce závislé potlačení neopterinu indukovatelného IL-12 protilátkou J695 u opic cynomolgus.

Způsob dávkování	dávka J695	dávka IVIG	AUC	% snížení AUC
IVIG nebo J695 a	ímg/kg)	(mg/kg)	normalizovaného	neopterinu ve
rhIL-12			množství	srovnání
			neopterinu	s kontrolou

jediná IV injekce následována o jednu hodinu později dávkou 1 pg/kg lidského IL-12 podaného SC	-	1,0	1 145 + 845	0
;,os	-	502 ± 135	71,3
L?	-	199 ± 316	92,7
:,o	-	1 480 + 604	0
jediná injekce SC následována o hodinu později dávkou 1 μς/kg lidského IL-12 podaného SC	-	1,0	1 480 ± 604	0
:,05	-	426 ± 108	71,2
:,2	-	395 ± 45,9	73,3
1, 0	-	0 ± 109	100

Léčba protilátkou J695 také zabránila změnám nebo redukovala změny v hematologii, které jsou normálně spojeny s aplikací rhIL-12 (leukopenie a thrombocytopenie). 24 hodin po aplikaci rhIL-12 byly sníženy počty lymfocytů o přibližně 50 % v porovnání se základními hodnotami v kontrolních skupinách ošetřených IV a SC IVIG. Aplikace protilátky J695 buď cestou SC, nebo IV v celkovém množství tří dávek předešla této redukci s tím výsledkem, že počty lymfocytů po 24 hodinách přibližně odpovídají základním hodnotám. 48 hodin po aplikaci IL—12 počty červených krvinek ve skupinách ošetřených IV a SV IVIG byly sníženy o přibližně 25 % ve srovnání se základními hodnotami.

Příkladem dávkového rozvrhu cíleného k udržení sérového množství nad 90 % účinného množství by mělo být 1 mg/kg IV a SC dáno přibližně ob týden nebo 0,3 mg/kg podáno přibližně každý týden, přičemž se předpokládá, že během opakovaných dávek dochází k slabé akumulaci. Tato studie ukazuje, že aplikace protilátky opicím v takové dávce je bezpečná. V nezávislé studii toxicity bylo dále zjištěno, že pro opice může být bezpečná až dávka protilátky 100 mg/kg.

Protilátka J695 byla také účinná při prevenci produkce IFN-gama u myší ošetřených chimérickým IL—12, molekulou, která kombinuje myší podjednotku p35 s lidskou podjednotkou p40 IL12. Na rozdíl od lidského IL—12, který není u myší biologicky aktivní, tento chimérický IL—12 si zachovává u myši biologickou funkci, což zahrnuje indukcí IFN-gama. Navíc lidská podjednotka p40 umožňuje molekule, aby byla vázána a neutralizována protilátkou J695. Samicím myší C3H/HeJ (10 myší v experimentální skupině) byl aplikován chimérický IL—12 v pěti denních dávkách i.p. v den 0,1, 2, 3 a 4, přičemž dávka obsahuje 0,05 mg/kg. 30 minut před aplikací injekcí IL—12 byla aplikována v den 0, 2 a 4 protilátka J695 v dávce 0,05, 0,01, 0,002, 0,0004, 0,00008 a 0,000016 mg/kg i.p.. Kontrolní hulgGly byl aplikován IP v dávce 0,05 mg/kg v den 0, 2 a 4. Myším se odebraly krevní vzorky v den 5 a testem ELISA bylo stanoveno množství IFNgama v séru. Výsledky demonstrovaly, že protilátka J695 způsobila inhibici produkce IFN-gama závislé na dávce s hodnotou ED₅₀ přibližně 0,001 mg/kg. Tyto výsledky dohromady demonstrují, že protilátka J695 je potencionální inhibitor aktivity IL—12 in vivo.

Příklad 5: Kinetická analýza navázání lidských protilátek na rekombinantní lidský IL—12 (rhIL-12)

Vazebné interakce v reálném čase mezi značeným ligandem (lidská protilátka J695 proti rhIL— 12, zachycená na biosenzorové matrici) a analytem (rhlL-12 v roztoku) byly měřeny povrchovou plazmonovou rezonancí (SPR) použitím systému BÍAcore (Biacore AB, Uppsala, Švédsko). Systém využívá optických vlastností SPR k detekci změn v koncentraci proteinu na dextranové biosenzorové matrici. Proteiny jsou kovalentně vázány na dextranovou matrici ve známých koncentracích. Protilátky jsou zavedeny injekcí přes dextranovou matrici a specifické navázání injekcí zavedených protilátek a imobilizovaného ligandu vede ke zvýšení koncentrace proteinu a k výsledné změně v signálu SPR. Tyto změny v signálu SPR jsou zaznamenávány jako jednotky rezonance (RU) a jsou vyjádřeny s ohledem na čas vynesený na osu Y sensogramu. Aby se umožnila imobilizace kozího anti-lidského IgG/Southem Biotechnology Associates, kat. č. 2040-01, Birmingham, AL) na biosenzorové matrici, kozí anti-lidské IgG jsou kovalentně spojeny přes volné aminoskupiny s dextranovou matricí pomocí prvních aktivačních karboxylových skupin na matrici se lOOmM N-hydroxysukcinimidern (NHS) a 400mM N-ethyl-N'-(3-dime10 thylaminopropylj-karbodiimidhydrochloridem (EDC). Jako další se přes aktivovanou matrici injekcí zavede kozí anti-lidský IgG. Přes aktivovaný biosenzor je injekcí zavedeno 35 mikrolitrů kozího anti-lidského IgG (25 μg/ml) ředěného v acetátu sodném pH 4,5 a volné aminy proteinu jsou vázány přímo na aktivované karboxylové skupiny. Nezreagované estery vázané na matrici EDC jsou deaktivovány injekcí IM ethanolaminu. Standardní kity spojování aminů byly běžně dostupné (Biacore AB, kat. č. BR-1000-50, Uppsala, Švédsko).

Protilátka J695 byla ředěna v pufru HBS (Biacore AB, kat. č. BR-1001-88, Uppsala, Švédsko), aby byla zachycena na matrici přes kozí proti-lidský IgG. Aby se stanovila kapacita protilátek specifických pro rhIL-12 vázat se na imobiiizovaný kozí anti-lidský IgG, provedl se vazebný test následujícím způsobem. Alikvoty protilátky J695 (25 pg/ml), alikvoty o objemu 25 mikrolitrů) byly zavedeny injekcí přes dextranovou matrici spojenou s kozími polyklonálními protilátkami proti lidskému IgG s průtokovou rychlostí 5 mikrolitrů za minutu. Před injekcí proteinu a bezprostředně po ní protekl samotný pufr HBS každou volnou buňkou. Množství vázaného komplexu IgGl J695 reprezentuje čistý rozdíl signálu mezi základní hodnotou a hodnotou v bodě odpoví25 dajícímu přibližně 30 vteřinám po dokončení zavedení protilátky J695 injekcí (přibližně 1200 RU). Měřilo se přímé navázání protilátky specifické pro rhILl 2 na rozpustný rhILl 2. Cytokiny byly ředěny v pufru používaném pro provedení HBS a alikvoty o objemu 50 μΐ byly injekcí zavedeny přes matrice s imobilizovaným proteinem s průtokovou rychlostí 5 mikrolitrů za minutu. Používané koncentrace rhIL-12, byly 10, 20, 25, 30, 40, 50, 80, 100, 150 a 200 nM. Před injekcí rhIL-12 a bezprostředně po ní, samotný pufr HBS protekl každou volnou buňkou. Aby se reprezentovala vazebná hodnota určitého vzorku, byl stanoven čistý rozdíl základního signálu a signálu po zavedení cytokinů injekcí. Před aplikací dalšího vzorku objekcí byly biosenzorové matrice regenerovány použitím lOOmM HCI. Aby se stanovila konstanta rychlosti disociace a konstanta rychlosti asociace byl použit software pro hodnocení kinetiky BIAcore (verze 2.1).

Reprezentativní výsledky navázání protilátky získané z CHO na rhIL-12 ve srovnání s protilátkou J695 získanou z buněk COS jsou uvedeny v tabulce č. 7.

Tabulka 7: Navázání protilátky J695 získané z buněk CHO a COS na rhIL-12

	ríiIL 12. nM	rhILI2v^ar.ýRv_s	Ab.va/aný RU's	rhlL12/AB
CHO	200	1112	1613	1,48
CHO	150	1033	1525	1.45
CHO	100	994	1490	1.43
CHO	80	955	1457	1.40
CHO	50	912	1434	1.36
CHO	40	877	1413	1.33
CHO	25	818	1398	1.25
CHO	20	773	1382	1.20
CHO	10	627	1371	0.98
-í:.-o j	rhll. 12 r.M	rhll. 12/ázaný RU's	Ab,vázaný RlJ's	rhIL12'AB
COS	200	1172	1690	1 49
cos	150	1084	1586	1.46
cos	100	1024	1524	1.44
cos	80	985	1489	1 42
cos	50	932	1457	1.37
cos	40	894	1431	1.34
cos	25	8 33	1409	1.27
cos	20	783	1394	I.2Ó
cos	10	642	1377	l 00

Za použití technologie BIAcore byly kvantitativně analyzovány molekulové kinetické interakce mezi značnou protilátkou J695 a rozpustným rhIL-12. Provedlo se několik nezávislých experi5 mentů a výsledky byly analyzovány dostupným softwarem BlAcore pro matematickou analýzu, aby se získaly kinetické rychlostí konstanty, jak je zobrazeno v tabulce č. 8.

Tabulka 8: Zdánlivá kinetická rychlost a afínitní konstanty protilátky J695 pro rhlL-12

protilátka	zdroj	k_on , průměrná hodnota	k_Off (s ¹) , průměrná hodnota	Kd(M) průměrná hodnota
J695	CHO	3,52E+5	4,72E-5	l,34E-10
J695	COS	3,40E+5	2,61E-5	9,74E-11

Existoval zde malý rozdíl mezi vypočítanou zdánlivou konstantou (Kd) v případě interakce mezi io protilátkou J695 získané z CHO (Kd = 1,34 ^l0M ') a protilátkou J695 získanou z COS (Kd = 9,74 x 10 M '). Domnělá disociační konstanta (Kd) mezi protilátkou J695 a rhILl2 byla odhadnuta z pozorovaných rychlostních konstant podle vzorce Kd = k₀fAon·

Aby se stanovila zdánlivá asociační a disociační rychlostní konstanta pro interakci mezi protilát15 kou J695 a rhIL-12, provedlo se několik vazebných reakcí za použití fixovaného množství protilátky J695 (2 pg/ml) a různé koncentrace rhIL-12. Senzogramy vazebných interakcí mezi značeCZ 303725 B6 ným J695 a rozpustným rhIL-12 vykazovaly, že obě formy protilátky byly velmi podobné pro asociační a disociační fázi.

Za účelem dalšího hodnocení kapacity značené monoklonální protilátky IgGl J695 vázat rozpustný rekombinantní cytokin byla použita přímá metoda BIAcore. Při této metodě kozí anti— lidský IgG (25 pg/ml) spojený se senzorovým povrchem karboxymethyldextranu byl potažen IgGl J695 (2 pg/ml) a pak byl přidán rekombinantní cytokin. Když se rozpustný rhIL-12 zavedl injekcí přes biosensorový povrch spojený slgGl J695 získaným z CHO nebo COS, vzrostla v roztoku síla signálu v souladu se zvýšením koncentrace cytokinů. V případě rmIL-12 (R&D Systems, kat. č. 419-ML, Minneapolis, MN) nebo rhIL-12 v libovolné testované koncentraci až do 1 000 nM nedošlo kžádnému navázání. Tyto výsledky podporují závěr, že protilátky IgGl J695 rozeznávají odlišnou determinantu na rhIL-12.

Tabulka č. 9 ukazuje výsledky experimentálního použití BIAcore, aby demonstrovala navázání lidské protilátky IgGl J695 pouze na rozpustný rhIL-12 a nikoli najiné rekombinantní cytokiny.

Tabulka 9: Epitop mapující protilátku J695 použitím technologie BIAcore

	značený ligand COS J695	značený ligand CHO J695
rozpustný analyt
rek. lidský IL12	pozitivní	pozitivní
rek. myší IL12	negativní	negativní

Příklad 6: Další studie afinity protilátky J695 pro IL-12

Molekulární kinetické interakce mezi protilátkou J695 a lidským IL-12 byly kvantitativně analyzovány použitím technologie plazmonové rezonance BIAcore a byly odvozeny zdánlivé kinetické rychlostní konstanty.

Technologie BlAcore byla používána k měření navázání rozpustného IL-12 protilátku J695 vázané na pevné fázi. Kozí anti-lidská protilátka IgG byla imobilizována na biosenzorové čipy, pak fixované množství protilátky J695 bylo zavedeno injekcí a zachyceno na povrchu. Byly aplikovány různé koncentrace rhIL-12 a bylo měřeno navázání IL-12 v různých koncentracích na protilátku J695 jako funkce času. Byla vypočtena zdánlivá asociační a disociační rychlostní konstanta, přičemž se předpokládá disociační kinetika nultého řádu a asociační kinetika prvního řádu, stejně jako jednoduchá interakce jedna ku jedné mezi protilátkou J695 a IL-12. Uskutečnily se tři nezávislé experimenty a zobrazené hodnoty jsou průměry hodnot získaných ve třech experimentech. Z těchto měření byly získány zdánlivé disociační (kj) a asociační (k_a) rychlostní konstanty a použily se k výpočtu hodnoty K_d pro interakci (popisuje se v tabulce č. 10). Výsledky indikovaly, že protilátka J695 vykazovala vysokou afinitu pro rhIL-12.

Tabulka 10: Kinetické parametry interakce mezi protilátkou J695 a lidským IL-12

kinetický parametr	hodnota
kd	3,71 + 0,40 χ 10'⁵ s“¹
k_a	3,81 ± 0,48 χ 10’⁵ M^_1s^_1
K_d	9,74 x 10~ⁿM (14 ng/ml)

Příklad 7: Charakteristiky a neutralizační aktivita krysí monoklonální protilátky Cl7.15 proti myšímu interleukinu-12

Aby se odhadla relevantnost studií léčby IL-12 zánětlivých a autoimunitních onemocnění použitím monoklonálních protilátek specifických pro myší IL-12 v myších modelech s podobnými přístupy u lidského onemocnění, testovala se interakce krysí monoklonální protilátky proti myším interleukinu-12 C17.15 s myším IL-12. Byla odhadnuta schopnost protilátky C17.C15 neutralizovat aktivitu myšího IL-12 v testu proliferace PHA blastů a blokovat navázání myšího IL-12 na buněčné povrchové receptory, stejně jako kinetiky vazebné interakce C17.15-myší IL-12.

V testu proliferace lidských PHA blastů (popisuje se v příkladu 3) sériová ředění Cl7.15 nebo krysího IgG2a (kontrolní protilátka) byly předem inkubovány s 230 pg/ml myšího IL-12 po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C. Blastové buňky stimulované PHA byly přidány ke směsi protilátky IL-12 a inkubovaly se po dobu tří dní při teplotě 37 °C. Buňky byly následně značeny po dobu 6 hodin s [Hj-thymidinem v intenzitě 1 pCi/jamku. Kultury byly shromážděny a byl měřen začleněný [³H]-thymidin. Pozadí nespecifické proliferace bylo měřeno v nepřítomnosti přidaného myšího IL-12. Všechny vzorky byly testovány dvojmo. Hodnoty IC₅₀ (M) protilátky Cl7.15 v případě rekombinantního myšího IL-12 v tomto testu byly 1,4 x 10 srovnáno s hodnotou IC₅₀

5,8 x 10 ¹² pozorovanou pro protilátku J695 vytvořenou proti rekombinantnímu lidskému IL-12 za stejných podmínek (popisuje se v tabulce č. 11).

Tabulka 11: Porovnání vlastností monoklonální protilátky J695 proti lidskému IL-12 a krysí monoklonální protilátky Cl7.15 proti myšímu IL-12

protilátka	epitop	biomolekulární interakční test	test navázání na receptor	test PHA blastů
		k_a	kd ís“¹)	Kd ÍM)	IC₅₀ (MJ	IC_5D (M)
J695	Hu p4 0	3,81 X 10⁵	3,71 X 10’	9,74 x IO¹¹	1,1 x 10-^1Ί	5,8 x 10’¹²
C17.15	Mu p4O	3,80 x 10¹	1,84 x 10“’	4,80 X 10“	1,5 x 10^iu	1,4 x 10ⁿ

Také byla měřena schopnost protilátky Cl7.15 inhibovat navázání myšího IL-12 na buněčné receptory. Sériová ředění protilátky Cl 7.15 byla předem inkubována po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C s 100 pm [^l25I]—myšího IL-12 ve vazebném pufru. Ke směsi protilátka/[^l25I]—myší IL—12 byly přidány buňky 2D6 (v množství 2 x 10⁶) a směs se inkubovala po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Na buňky vázaná radioaktivita se oddělila od volného [^l25I]-IL-12 a byla stanovena zbývající radioaktivita vázaná na buňky. Bylo stanoveno celkové navázáni značeného myšího IL-12 na receptory na buňkách 2D6 v nepřítomnosti protilátky a v testu bylo stanoveno nespecifické navázání inkluzí 25nM neznačeného myšího IL-12. Specifické navázání bylo vypočteno jako celkové navázání mínus nespecifické navázání. Inkubace byly provedeny dvojmo. Výsledky ukazovaly, že protilátka Cl7.15 vykazuje pro inhibici navázání myšího IL-12 na buněčné receptory hodnotu IC₅₀ 1,5 x 10 'M.

Afinita protilátky Cl7.15 pro rekombinantní myší IL-12 byla odhadnuta analýzou biomolekulárních interakcí. Kozí protilátka proti krysímu IgG byla imobilizována na biosenzorových čipech, pak následovala injekce fixního množství protilátky 07.15, což vede k navázání protilátky Cl7.15 na povrch čipu. Různé koncentrace rekombinantního myšího IL-12 byly aplikovány na povrchu vázanou protilátku Cl7.15 a bylo měřeno navázání myšího IL-12 na imobilizovanou protilátku Cl7.15 jako funkce času. Byly vypočítány zdánlivé disociační a asociační rychlostní konstanty, přičemž se předpokládá disociační kinetika nultého řádu a asociační kinetika prvního řádu, stejně jako jednoduchá interakce jedna ku jedné mezi imobilizovanou protilátkou Cl 7.15 a myším IL—12. Z těchto měření byly vypočteny zdánlivé disociační (k_d) a asociační (k_a) konstanty. Tyto výsledky byly použity pro výpočet hodnoty K_d v případě interakce. V případě interakce rekombinantního myšího IL—12 - C17.15 byla pozorována hodnota k_a 3,8 x 10⁵ M^s”¹, kd 1,84 x 10 ⁴s ¹ a Kd4,8 x 10 '°.

Pozorované aktivity protilátky Cl7.15 při neutralizaci aktivity myšího IL-12 a navázání na buněčné povrchové receptory stejně jako kinetiky navázání protilátky Cl7.15 na myší IL-12 korelují s podobnými měření v případě interakce J695-rhIL-12. To indikuje, že módy působení krysí protilátky C17.15 proti myšímu IL—12 a protilátky J695 proti lidskému IL—12 jsou skoro shodné, co se týče hodnot k_a, k_d, K_d, IC₅₀ a testu s PHA blasty. Proto protilátka Cl7.15 byla použita jako homologní protilátka v případě protilátky J695 v myších modelech zánětlivého a autoimunitního onemocnění pro studium vzniku a postupu onemocnění u těchto modelových zvířat (popisuje se v příkladu 8)Příklad 8: Léčba autoimunních a zánětlivých onemocnění u myší aplikací α-myší IL-12 protilátky

A. Potlačení artritidy vyvolané kolagenem u myší pomocí protilátky C17.15 proti a-IL-12

Byla demonstrována korelace mezi množstvím IL-12 a revmatickou artritidou (RA). Bylo například detekováno zvýšené množství IL—12p70 v kloubním mazu pacientů trpících revmatickou artritidou ve srovnání se zdravými kontrolami (popisuje se v publikaci Morita et al., (1998) Arthritis and Rheumatism. 41: 306 až 315). Proto byla hodnocena schopnost protilátky C.17.15, což je krysí protilátka proti myšímu IL-12, potlačit artritidu vyvolanou kolagenem.

Samci myší DBA/1 (10 myší ve skupině) byli imunizováni kolagenem typu II v den 0 a ošetřili se protilátkou Cl7.15 nebo kontrolním krysím IgG v koncentraci 10 mg/kg intraperitoneálně ob den ode dne -1 (jeden den před imunizací kolagenem) až do dne 12. U zvířat byl klinicky sledován vývoj artritidy pacek až do dne 90. Artritida byla rozdělena do stupňů: symbol 0 znamená normální stav, symbol 1 znamená artritida lokalizovaná v jednom kloubu, symbol 2 znamená, že je zahrnut více jak jeden kloub, ale nikoli celá packa, symbol 3 znamená, že je zahrnuta celá packa, symbol 4 označuje deformaci packy, symbol 5 označuje ankylózu zahrnutých kloubů. Artritické skóre u myši byl součet artritických stupňů pro každou jednotlivou packu dané myši (maximální hodnota je 20). Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM v každé skupině.

Výsledky, jak jsou zobrazeny na obrázku č. 4, indikují, že artritické skóre byla měřitelné u myší ošetřených protilátkou Cl7.15 pouze po dni 50 po léčbě a tak maximum průměrné hodnoty artritického skóre získaného u myší ošetřených protilátkou Cl7.15 bylo alespoň 5 krát nižší než maximum měřené u myší ošetřených IgG. To demonstrovalo, že krysí protilátka Cl7.15 proti myšímu IL—12 zabránila u myší vývoji artritidy vyvolané kolagenem.

B. Potlačení kolitidy u myší krysí protilátkou C17.15 proti cc-myšímu IL-12

Ukázalo se, že IL—12 má úlohu při vývoji/patologii kolitidy. Dále se ukázalo, že například protilátky proti IL-12 potlačují onemocnění v myších modelech kolitidy, například kolitidy vyvolané TNBS u myší postižených účinkem IL—12 (popisuje se v publikaci Simpson et al., (1998) J. Exp. Med. 187(8): 1225 až 34). Podobně se ukázalo, že protilátky proti IL—12 potlačují vznik kolitidy u myší postižených účinkem IL—10. Ve dvou studiích byla hodnocena schopnost krysí protilátky proti myšímu IL-12 Cl7.15 potlačit TNBS kolitidu u myší (popisuje se v publikaci Davidson et al., (1998) J. Immunol. 161 (6): 3143 až 9).

V první studii byla kolitida vyvolána u myší SJL, které neobsahují antigen, aplikací 150 μΐ 50% roztoku ethanolu, který obsahuje 2,0 mg TNBS zavedeného dětským umbilikálním arteriálním katétrem do konečníku. Kontrolní zvířata byla ošetřena pouze 150 μΐ 50% roztoku ethanolu.

Ocasní žilou byla aplikována intravenózně v den 11 jediná dávka 0,75, 0,5, 0,25, nebo 0,1 mg protilátky Cl7.15 nebo 0,75 kontrolního krysího IgG2a a hodnotil se terapeutický účinek léčby vážením zvířat v den 11 a 17 a histologickým vyšetřením v den 17. Tělesná hmotnost myší ošetřených protilátkou Cl7.15 vzrostla během 48 hodin léčby protilátkou a normalizovala se v den 6 po léčbě. Účinek léčby s protilátkou Cl7.15 byl potvrzen histologicky. Dále bylo provedeno hodnocení vylučování IFN-γ buňkami T CD4⁺ ze sleziny a tlustého střeva ošetřených myší, stejně jako množství IL—12 z makrofágů získaných ze sleziny a tlustého střeva pocházejících z ošetřených myší (popisuje se v tabulce č. 12).

Při druhé studii bylo optimalizované dávkování a myši se ošetřily celkovou dávkou 0,1 nebo 0,5 mg protilátky Cl7.15 nebo respektive 0,1 mg kontrolního lgG2a rozdělených do dnů 12 a 14. Zjistilo se, že aplikace protilátky Cl 7.15 v jediné dávce, kdy se aplikovalo jedné myší 0,1 nebo 0,5 mg, vedlo pouze k částečnému zlepšení kolitidy vyvolané TNBS a nevedlo k podstatné redukci produkce IFN-γ v buňkách T CD4^T in vitro, ale výsledkem bylo podstatné snížení vylučování IL-12 ve srovnání s neléčenými kontrolami. Byla pozorována odezva, když se jedné myši v jediné dávce aplikovalo 0,5 mg nebo více. Když se vzala nejnižší dávka testované protilátky a aplikovala se ve dvou rozdělených injekcích (v den 12 a 14) zlepšil se dávkovači režim, což indikuje, že vícenásobné nízké dávky mohou být více účinné ve srovnání s jednou bolusovou dávkou. Získaná data jsou zobrazena v tabulce č. 12.

Tabulka 12: Monoklonální protilátka Cl7.15 proti myšímu IL-12 potlačuje prokázanou kolitidu u myší

vyvolání onemocnění v den 0	léčba den 11	hmotnost (	4)	IFN-γ' vyluč. buňkami CD4⁺ (U/ml)	IL-12 vyluč. makrofágy sleziny (pg/ml)
		den 11	den 17
TNBS + ethanol	kontrol IgG2a 0.75 mg	16,0	15,26	3 326	300
TNBS+ ethanol	C17.15 0,75 mg	16,0	20,21	1 732	0
TNBS+ ethanol	C17.15 0,5 mg	16,36	19, 94	1 723	0
TNBS + ethanol	C17.15 0,25 mg	16,28	17,7	3 618	7
TNBS+ ethanol	C17.15 mg	16,2	17, 98	3 489	22
kontrol. ethanol		20,76	21,16	1 135	0

Aplikace monoklonální protilátky Cl7.15 proti IL—12 ve dvou rozdělených dávkách v intervalu jednoho dne, přičemž celková dávka je 0,1 mg/myš nebo 0,05 mg/myš, vedla k úplnému zvratu kolitidy, jak se hodnotilo na základě celkového stavu a makroskopického vzhledu tlustého střeva. Navíc tento dávkový rozvrh vedl k podstatné negativní regulaci produkce IFN-γ T buněk slizničního vaziva a produkce IL-12 makrofágů, tak, že později byly produkce porovnatelné s množstvím identifikovaným u myší ošetřených kontrolním roztokem ethanolu, u kterých nedošlo ke vzniku TNBS-kolitidy. Tak aplikace protilátky Cl7.15 v myších modelech vhodných pro TNBS kolitidu zvrátila postup onemocnění v závislosti na dávce.

C. Potlačení experimentální autoimunitní encefalomyelitidy (EAE) u myší protilátkami proti a-IL-12

Běžně se věří, že IL-12 má úlohu při patogenezi roztroušené sklerózy (MS). Ukázalo se, že indukovatelná mRNA IL-12 p40 byla exprimována v akutních plakách pacientů trpících roztroušenou sklerózou, ale nikoli v zánětlivých mozkových infarktových lézích (popisuje se v publikaci Windhagen, A et al., (1995) J. Exp. Med. 182: 1985 až 1996). Buňky T z pacientů trpících roztroušenou sklerózou (ale nikoliv kontrolní T buňky) stimulují produkci IL-12 v buňkách prezentujících antigen přes neregulovanou expresi CD40L (popisuje se v publikaci Balashov, K. E. et al., (1997) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94: 599 až 603). Pacienti trpící roztroušenou sklerózou vykazují zvýšenou sekreci IFN-γ, která může být blokována in vitro protilátkami proti a-IL-12 (popisuje se v publikaci Balashov, K. E. et al., (1997) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94: 599 až 603). U pacientů trpících roztroušenou sklerózou, nikoliv však jinými neurologickými nemocemi, je detekováno zvýšené množství sérového IL—12 (popisuje se v publikaci Nicoletti, F. et al., (1996) J. Neuroimmunol. 70: 87 až 90). Ukázalo se, že zvýšená produkce IL-12 koreluje s aktivitou onemocnění u pacientů s MS (popisuje se v publikaci Cormabella, M. et al., (1998) J. Clin. Invest. 102: 671 až 678). Byla studována úloha IL-12 v patogenezi myšího modelu roztroušené sklerózy, experimentální autoimunitní encefalomyelitidy (EAE) (popisuje se v publikaci Leonard, J. P. et al., (1995) J. Exp. Med. 181: 281 až 386, Banerhee S. et al., (1998) Arthritis Rheum. (1998) 41: S33, a Segal, Β. M. et al., (1998) Arthritis Rheum. (1998) 41: S33, a Segal, B. M. et al., (1998) J. Exp. Med. 187: 537 až 546). Je známo, že onemocnění v tomto modelu bylo indukováno T buňkami podsouboru ΤΗ,. Proto se hodnotila schopnost protilátek proti a-IL-12 předcházet vzniku akutní EAE,

Zjistilo se, že protilátky proti a-IL-12 budou schopny inhibovat vznik akutní EAE, aby se potlačilo onemocnění po jeho vzniku, a snížit vážnost recidivy u myší imunizovaných autoantigenem, kterým je myelinový základní protein (popisuje se v publikaci Banerjee, S. et al., (1998) Arthritis Rheum. (1998) 41: S33). Výhodné účinky léčby myší protilátkou proti a-IL-12 přetrvávaly více jak dva měsíce po ukončení léčby. Také se ukázalo, že protilátky proti IL—12 potlačují onemocnění u myší, které jsou recipienty encefalitogenních buněk T adoptivním přenosem (popisuje se v publikaci Leonard, J. P. et al., (1995) J. Exp. Med. 181: 281 až 386).

Příklad 9: Klinická farmakologie protilátky J695

V rekombinantní studii se 64 zdravým mužům aplikovala stoupající dávka protilátky J695 nebo placebo. Měření fragmentu komplementu C3a před aplikací dávky a 15 minut po aplikaci nedemonstrovalo aktivaci systému komplementu. U subjektů, kde byly pozorovány symptomy konkurenční infekce vzrostlo pouze množství CRp a fibrinogenu.

Všechny subjekty přežily a obecná tolerovatelnost protilátky J695 byla velmi dobrá. Ani v jednom případě nemusela být léčba zastavena na základě nežádoucích jevů (AE). Nejběžněji pozorované AE byly bolest hlavy a běžná rýma/bronchitida, žádný z těchto příznaků nebyl zařazen do kategorie vážných příznaků.

Jeden ze studovaných subjektů 33 let starý svobodný muž trpěl na začátku studie onemocněním psoriasis guttata. Podle náhodného navržení studie tento subjekt měl šanci dostat 5mg/kg protilátky J695 SC aplikací. Deset dní před aplikací protilátky subjekt vykazoval pouze malé diskrétní papulární léze na pažích a dolních končetinách. V době aplikace protilátky subjekt vykazoval zvýšené začervenání, zvýšenou tloušťku erytematózních plaků a zvýšenou hyperkaratózu. Jeden týden po aplikaci protilátky J695 subjekt hlásil zlepšení stavu kůže zahrnující zeslabeni lézí a snížení odlupování kůže. Krátce po druhé aplikaci protilátky J695 (5 mg/kg IV) kůže subjektu byla zcela bez lupénkových lézí, aniž by došlo k jakékoli lokální léčbě. Erytematózní plaky pokryté bílými šupinami se znovu objevily v souladu s očekávaným vymizením protilátky J695 po druhé aplikaci protilátky.

Příklad 10: Porovnání protilátky J695 produkované dvěmi buněčnými liniemi CHO

Za účelem dosažení rekombinantní exprese protilátky J695 je rekombinantní expresívní vektor kódující těžký a lehký řetězec protilátky zaveden do buněk dhfr- CHO (Urlaub, G. and Chasin,

L. A. (1980) Proč. Nati. Acad. Sci. UA 77: 4216 až 4220) transfekcí zprostředkovanou fosforečnanem vápenatým. V rekombinantním expresívním vektoru je každý gen těžkého a lehkého řetězce protilátky spojen s regulačními elementy zesilovačem/promotorem (například získanými z SV40, CMV, adenoviru a podobně, jako je regulační element CMV zesilovač/AdMLP promotor nebo regulační element SV40 zesilovac/AdMLP promotor), aby řídily silnou transkripci genů. Rekombinantní expresívní vektor také nese gen DHFR, který umožňuje selekci buněk CHO, které byly transfekovány vektorem použitím methotrexátové selekce/amplifikace.

Stopadesát mikrogramů expresívního vektoru kódujícího peptidové sekvence lidské protilátky J695 bylo rozpuštěno v 2,7 ml vody v kónické zkumavce o objemu 50 ml. Bylo přidáno 300 μΐ 2,5M CaCl? a tato směs DNA byla přidána po kapkách do 3 ml 2 x koncentrovaného fyziologického roztoku upraveného pufrem HEPES v kónické zkumavce o objemu 50 ml. Po zamíchání na vortexu po dobu 5 vteřin a inkubaci při teplotě místnosti po dobu 20 minut na každou plotnu se nanesl 1 ml směsi (stále v médiu F12) a plotny byly inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 4 hodin. Kapalina se odsála a do každé plotny byly přidány 2 ml 10% DMSO v médiu F12. Sok způsobený DMSO pokračoval po dobu jedné minuty, pak se DMSO naředil přidáním 5 ml PBS na každou plotnu. Plotny byly dvakrát promyty v PBS a pak následovalo přidání 10 ml MEM alfa doplněného H/T a 5% FBS (selekce pro buňky exprimuj ící DHFR) a inkubace přes noc při teplotě 37 °C. Buňky byly přeneseny na destičky s 96 jamkami s hustotou 100 buněk v jedné jamce a plotny byly inkubovány při teplotě 37 °C v atmosféře 5% CO₂ po dobu dvou týdnů, přičemž médium bylo vyměňováno jednou týdně.

Pět dní po poslední výměně média byly supernatanty kultur ředěny v poměru 1:50 a byly testovány použitím testu ELISA specifickým pro řetězec lidského IgG gama. Klony, které poskytují nej vyšší signál v testu ELISA byly přeneseny z destiček 96 prohlubněmi na destičky s 12 jamkami, kde v jedné jamce bylo 1,5 ml média alfa MEM a 5% dialyzované sérum. Po třech dnech byl proveden jiný test ELISA specifický pro řetězec lidského IgG gama a 12 klonů snejvyšší aktivitou bylo rozděleno do média alfa MEM s 5% dialyzovaným sérem a 20nM MTX. Buněčná linie 031898218 rostla v přítomnosti 20nM MTX, aniž došlo k zjevnému odumírání buněk nebo ke snížení růstové rychlosti a produkovala ve třídenním testu 1,8 pg/ml hlgG. Kultury T-25 linie 031898218 rostoucí v médiu, které obsahuje MTX, produkovaly v průměru 11,9 pg/ml protilátky J695. Linie označená ALP9003 byla přizpůsobena růstu v suspenzi za podmínek bez séra, kde produkovala 7,5 pg protilátky J695 v případě jedné buňky za 24 hodin.

Buňky ALP903 po počáteční selekci v kultivačním médiu alfa MEM/5% FBS/20nM MTX byly opět pasážovány v 20nM MTX. Buňky byly kultivovány při selekci lOOnM MTX a pak následovalo dvakrát pasážování v 500nM MTX v průběhu dalších 30-ti dní. V tuto dobu kultura produkovala 32 pg/ml protilátky J695 za 24 hodin. Kultura byla subklonována v limitujícím ředění. Subklon 218-22 produkoval ve dvou dnech 16,5 pg/ml protilátky J695 na plotně s 96 jamkami a

50,3 pg/ml na plotně s 12 jamkami. Klon 218-22 byl kultivován v kultivačním médiu alfa MEM/5% dialyzované FBS/500 nM MTX po dobu 38 dní, pak následovala adaptace na kultivaci v kultivačním médiu bez séra, jak se popisuje shora v textu. Průměrná buněčná specifická produktivita suspenze kultury bez séra označené ALP 905 byla 58 pg/buňku za 24 hodin.

První buněčná linie používaná k produkci protilátky J695 (ALP 903) vykazovala nižší výtěžky protilátky ve srovnání s druhou buněčnou linií ALP 905. Aby bylo jisté, že protilátka J695 produkovaná ALP 905 byla funkčně shodná s protilátkou produkovanou ALP 903, u obou protilátek byla hodnocena IL-12 afinita, schopnost blokovat navázání IL-12 na buněčné receptory, schopnost inhibovat indukci IFN-γ pomocí IL-12 a schopnost inhibovat proliferaci PHA blastů zprostředkovanou IL-12.

Afinita protilátky J695 z buněk ALP 903 a ALP 905 pro IL-12 byla stanovena měřením kinetických rychlostních konstant navázání IL-12 studiemi povrchové plazmové rezonance (analýzy BIAcore). Konstanta rychlosti disociace (k_d) a asociace (k_a) protilátky z buněčné linie ALP 903 a ALP905 pro navázání n hil-12 byly stanoveny ve třech experimentech (jak se popisuje v příkladu 3). Afinita (K_d) navázání IL-12 byla vypočítána dělením konstanty k_d a k_a. Hodnota K_d byla vypočítána pro každý jednotlivý experiment a pak se vypočítal průměr hodnot. Výsledky ukázaly, že stanovené kinetické parametry a afinita navázání na rhIL-12 byly velmi podobné pro protilátku J695 z obou buněčných linií ALP 903 a ALP 905: vypočtená hodnota K_d byla 1,19 ± 0,22 x 10'¹⁰M v případě ALP 203 a 1,49 ± 0,47 x 10^l0M v případě ALP 905 (uvedeno v tabulce č. 13).

Byla hodnocena schopnost protilátky J695 získané z ALP 903 a ALP 905 blokovat navázání hil12 a receptory IL-12 na lidských T-lymfoblastech aktivovaných PHA (popisuje se v příkladu 3). Každý vzorek protilátky J695 byl testován při počáteční koncentraci 1 x 10'⁸ s desetinásobným sériovým ředěním. Protilátka byla předem inkubována po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C s 50pm [^,25I]—lidským IL-12 ve vazebném pufru. PHA blastové buňky byly přidány do směsi protilátka/[¹²⁵I]—lidský IL-12 a vše se inkubovalo po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Radioaktivita vázaná na buňce byla oddělena od volné [^l25I]—IL—12 centrifugací a promývacími kroky a vypočítalo se procento inhibice. Hodnoty IC₅₀ v případě protilátky J695 byly stanoveny z inhibičních křivek použitím křivky odpovídající čtyřem parametrům a byly potvrzeny dvěma nezávislými experimenty. Inkubace byly proveden ve dvou provedeních. Výsledky pro oba druhy protilátek J695 byly velmi podobné (popisuje se v tabulce č. 13).

Byla hodnocena schopnost protilátky J695 z buněk ALP Í03 a ALP 905 inhibovat produkci IFNgama vyvolanou rhILl-12 lidskými lymfoblasty aktivovanými PHA in vitro. Sériová ředění protilátky J695 byly předem inkubovány s 200 pg/ml rhIL-12 po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C. Byly přidány PHA lymfoblasty a byly inkubovány po dobu 18 hodin při teplotě 37 °C. Po inkubaci byl izolován supematant bez buněk a testem ELISA se stanovilo množství IFN-gama. Hodnoty IC₅₀ získané z inhibiěních křivek byly vyneseny do grafů proti koncentraci protilátky použitím křivky odpovídající 4 parametrům. Výsledky demonstrují, že schopnost obou protilátek inhibovat produkci IFN-gama je velmi podobá.

K měření neutralizační kapacity ALP 903 a ALP 905 pro rhIL-12 byl použit test proliferace PHA blastů in vitro. Sériová ředění protilátky J695 každého typu byly předem inkubovány s 230 pg/ml lidského IL-12 po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C. Byly přidány další PHA blastové buňky a inkubovaly se po dobu tří dní při teplotě 37 °C. Buňky byly pak značeny po dobu 6 hodin s 1 yCi/prohlubeň [³H]-thymidinem. Kultury byly shromážděny a měřila se začlenění [³H]-thymidinu. V nepřítomnosti rhIL-12 byla měřena nespecifická proliferace (pozadí). Bylo zjištěno, že hodnoty IC₅₀ pro protilátku J695 produkovanou buňkami ALP Í03 a ALP Í05 jsou velmi podobné ajsou uvedeny v tabulce č. 13.

Aktivita protilátek J695 produkovaných buňkami ALP 903 a ALP 905 při neutralizaci aktivity rhIL-12 při blokování navázání IL-12 na receptory buněčného povrchu a navázání na rhIL-12 se podstatně neliší a tak protilátky produkované těmito různými buněčnými typy byly ekvivalentní.

Tabulka 13: Porovnání vlastností protilátky J9695 šarže ALP 903 a ALP 905

protilátka	k, (KV¹)	k„ (s^-1)	K_d (M)	RB test ICso	PHA blastový test ICso (M)	IFN-γ test
XCso	(M)
J695 ALP 903	3,75 x 10^{5 *}	4, 46 X 10“^b	1, 19 x IO’¹⁰	3,4 x IO'¹¹	5,5 x 1Ο'^Ή	5,8	x 10'¹²
J695 ALP 905	3,91 x IO⁴	5,59 X IO”⁵	1,49 X 10‘¹⁰	3,0 X IO’¹¹	4,4 x 10'¹²	4,3	x 10'¹²

Ekvivalenty

Odborníci v oboru rozpoznávají nebo budou schopni určit použitím ne víc než rutinního experimentu řadu ekvivalentů zde popsaných specifických provedení vynálezu. Takové ekvivalenty jsou zahrnuty v následujících nárocích.

Claims (79)

Hide Dependent

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen, která se váže na lidský IL12 a disociuje z lidského IL-12 s hodnotou rychlostní konstanty k_off 1 x 10⁴ s¹ nebo nižší, stanovenou povrchovou plasmovou rezonancí, kde uvedená protilátka nebo její část vázající se na antigen (a) vykazuje CDR.3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 9, CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 11 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 13; a (b) vykazuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 10, CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 12 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 14.
2. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 1 nebo její část vázající se na antigen, kde protilátka neutralizuje aktivitu lidského IL-12.
3. Izolovaná lidská protilátka podle kteréhokoliv z nároků 1 nebo 2, kterou je rekombinantní protilátka nebo její část vázající se na antigen.
4. Izolovaná lidská protilátka podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 nebo její část vázající se na antigen, která inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů in vitro v testu proliferace fytohemaglutininových blastů-test PHA, s hodnotou IC₅₀1 x 10'⁷M nebo nižší.
5. Izolovaná lidská protilátka podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 nebo její část vázající se na antigen, která inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů in vitro v testu PHA s hodnotou

1C₅₀1 x 10'⁸M nebo nižší.
6. Izolovaná lidská protilátka podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 nebo její část vázající se na antigen, která inhibuje proliferaci fýtohemaglutininových blastů in vitro v testu PHA s hodnotou IC₅₀1 x 10'⁹M nebo nižší.
7. Izolovaná lidská protilátka podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 nebo její část vázající se na antigen, která inhibuje proliferaci fýtohemaglutininových blastů in vitro v testu PHA s hodnotou IC501 x 10^IOM nebo nižší.
8. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 1 nebo její část vázající se na antigen, která inhibuje proliferaci fýtohemaglutininových blastů in vitro v testu PHA s hodnotou IC₅₀ 1 x 10'⁶M nebo nižší.
9. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 1 nebo její část vázající se na antigen, která vykazuje variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 15 a variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 16:
10. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 1 nebo její část vázající se na antigen, která

a) inhibuje proliferaci fýtohemaglutininových blastů in vitro v testu PHA s hodnotou IC₅₀ 1 x 10'⁹M nebo nižší,

b) vykazuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 17 a

c) vykazuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 18.
11. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 10 nebo její část vázající se na antigen, která dále vykazuje CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 19 a CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 20.
12. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 10 nebo její část vázající se na antigen, která dále vykazuje CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 21 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 22.
13. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 1 nebo její část vázající se na antigen, vykazující variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 23 a variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 24.
14. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 13 nebo její část vázající se na antigen, obsahující konstantní oblast těžkého řetězce vybranou ze skupiny sestávající z konstantní oblasti IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA a IgE.
15. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 14 nebo její část vázající se na antigen, kde konstantní oblast těžkého řetězce protilátky je IgGl.
16. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 13 nebo její část vázající se na antigen, kterou je fragment Fab.
17. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 13 nebo její část vázající se na antigen, kterou je fragment F(ab‘)₂.
18. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 13 nebo její část vázající se na antigen, kterou je jednořetězcový fragment Fv.
19. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 1 nebo její část vázající se na antigen, která

a) inhibuje proliferaci fýtohemaglutininových blastů in vitro v testu PHA s hodnotou IC₅₀ 1 x 10'⁹M nebo nižší.

b) vykazuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z SEQ ID NO: 415, 416, 419, 420, 427, 432, 439-441, 443, 445, 447, 448, 457—459, 461,462, 464, 468 a 469 nebo

c) vykazuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z SEQ ID NO: 534, 536, 547-563, 566-570, 572, 575 a 579.
20. Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen podle nároku 19, která dále vykazuje CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z SEQ ID NO: 337, 342, 344, 350, 354, 358-360, 367, 377, 381, 384-395 a 397 nebo CDR2 lehkého řetězce zahrnující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z SEQ ID NO: 509-510, 514-517 a 529.
21. Izolovaná lidská protilátka nebo její část vázající se na antigen podle nároku 19, která dále vykazuje CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z SEQ ID NO: 288-310, 314-315, 326, 328-330 nebo CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z SEQ ID NO: 470—472, 475— 477,485,489—491,494 496 a 500.
22. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 1 nebo její část vázající se na antigen, která

a) inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů in vitro v testu PHA s hodnotou IC₅₀ 1 x 10'⁹M nebo nižší,

b) vykazuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 25 a

c) vykazuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 26.
23. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 22 nebo její část vázající se na antigen, která dále vykazuje CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 27 a CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 28.
24. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 22 nebo její část vázající se na antigen, která dále vykazuje CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 29 a CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 30.
25. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 22 nebo její část vázající se na antigen, která inhibuje proliferaci fytohemaglutininových blastů in vitro v testu PHA s hodnotou IC₅₀ 1 x 10'¹⁰M nebo nižší.
26. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 1 nebo její část vázající se na antigen, která vykazuje variabilní oblast těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 31 a variabilní oblast lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 32.
27. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 26 nebo její část vázající se na antigen, obsahující konstantní oblast těžkého řetězce vybranou ze skupiny sestávající z konstantní oblasti IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA a IgE.
28. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 27 nebo její část vázající se na antigen, kde konstantní oblast těžkého řetězce protilátky je IgGl.
29. Část izolované lidské protilátky podle nároku 26, kterou je fragment Fab.
30. Část izolované lidské protilátky podle nároku 26, kterou je fragment F(ab‘)2·
31. Část izolované lidské protilátky podle nároku 26, kterou je jednořetězcový fragment Fv.
32. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 1 nebo její část vázající se na antigen, která

a) vykazuje CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 25 a

b) vykazuje CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 26.
33. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 32 nebo její část vázající se na antigen, která dále vykazuje CDR2 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 28 a CDR2 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 27.
34. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 32 nebo její část vázající se na antigen, která dále vykazuje CDR1 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 30 a CDR1 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 29:
35. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že zahrnuje izolovanou lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen podle kteréhokoli z nároků 1 až 34 a farmaceuticky přijatelný nosič.
36. Farmaceutický prostředek podle nároku 35, vyznačující se tím, že zahrnuje protilátku nebo její část vázající se na antigen v koncentraci 0,1 až 250 mg/ml.
37. Prostředek pro inhibici aktivity lidského IL-12, vy z n a č uj íc í se tím, že zahrnuje izolovanou lidskou protilátku nebo její část vázající se na antigen podle kteréhokoliv z nároků 1 až 34 a další činidlo.
38. Prostředek podle nároku 37, vyznačující se tím, že dalším činidlem je terapeutické činidlo.
39. Prostředek podle nároku 38, vyznačující se tím, že terapeutické činidlo je vybráno ze skupiny sestávající zbudenozidu, epidermálního růstového faktoru, kortikosteroidů, cyklosporinu, sulfasalazinu, aminosalicylátů, 6-merkaptopurinu, azathioprinu, metronidazolu, inhibitorů lipoxygenázy, mesalaminu, olsalazinu, balsalazidu, antioxidantů, inhibitorů thromboxanu, antagonistů receptorů IL-1, monoklonálních protilátek proti IL—1 β, monoklonálních protilátek proti IL-6, růstového faktoru, inhibitorů elastázy, sloučenin pyridinylimidazolu, protilátek nebo agonistů TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, 1L-18, EMAP-11, GMCSF, FGF a PDGF, protilátek proti CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 nebo jejich ligandům, methotrexátu, cyklosporinu FK506, rapamycinu, mykofenolát mofeltilu, leflunomidu, NSAID, ibuprofenu, kortikosteroidů, prednisolonu, inhibitorů fosfodiesterázy, agonisty adenosinu, antithrombotických činidel, inhibitoru komplementu, adrenergik, inhibitoru kináz IRÁK, NIK, IKK, p38, MAP, inhibitoru enzymu konvertuj íc ího IL—1 β, inhibitoru enzymu konvertujícího TNFa, inhibitoru signalizace T-buňky, inhibitoru metaloproteinázy, inhibitoru enzymu konvertuj ícího angiotensin, rozpustných receptorů cytokinů, rozpustného receptorů p55 TNF, rozpustného receptorů p75 TNF, sIL-lRI, sIL-lRII, sIL-6R, protizánětlivých cytokinů, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 a TGFp.
40. Prostředek podle nároku 38, vyznačující se tím, že terapeutické činidlo je vybráno ze skupiny sestávající z protilátek proti TNF a jejich protilátkových fragmentů, konstruktů TNFR-Ig, inhibitorů TÁCE, inhibitorů PDE4, kortikosteroidů, budenozidu, dexamethazonu, sulfasalazinu, kyseliny 5-aminosalicylové, olsalazinu, inhibitoru enzymu konvertuj ícího IL—1 β, IL—1 ra, inhibitoru tyrozinové kinázy, 6-merkaptopurinů a IL-11.
41. Prostředek podle nároku 38, vyznačující se tím, že terapeutické činidlo je vybráno ze skupiny sestávající z kortikosteroidů, prednisolonu, methylprednisolonu, azathioprinu, cyklofosfamidu, cyklosporinu, methotrexátu, 4-aminopyridinu, tizanidinu, intcrferonu-pia, interferonu-plb, kopolymeru 1, hyperbarického kyslíku, intravenózního imunoglobulinu, klabribinu, protilátek nebo agonistů k TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL—7, IL—8, IL-15, IL-16, IL—18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, PDGF, protilátky proti CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30,

CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 nebo jejich ligandům, methotrexátu, cyklosporinu, FK506, rapamycinu, mykofenolát mofetilu, leflunomidu, NSAID, ibuprofenu, kortikosteroidů, prednisolonu, inhibitoru fosfodiesterázy, agonisty adenosinu, antithrombotických činidel, inhibitoru komplementu, adrenergik, inhibitorů kináz IRÁK, NIK, IKK, p38 nebo MAP, inhibitorů enzymu konvertujícího IL—1 β, inhibitorů TÁCE, inhibitorů signalizace T-buňky, inhibitorů kinázy, inhibitorů metaloproteinázy, sulfasalazinu, 6-merkaptopurinů, inhibitorů enzymu konvertujícího angiotensin, rozpustných receptorů cytokinů, rozpustného receptoru p55 TNF, rozpustného receptoru p75 TNF, sIL-lRl, sIL-lRII, sIL-6R, sIL—13R, anti-P7s, glykoproteinového ligandu p-selektinu (PSGL), protizánětlivých cytokinů, IL—4, IL—10, IL—13 a TGFp.
42. Způsob inhibice aktivity lidského IL-12 in vitro, vyznačující se tím, že zahrnuje kontaktování lidského IL-12 s izolovanou lidskou protilátkou podle kteréhokoliv z nároků 1 až 34 nebo její částí vázající se na antigen tak, že je inhibována aktivita lidského IL-12.
43. Použití izolované lidské protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 34 nebo její části vázající se na antigen pro výrobu léčiva pro inhibici aktivity lidského IL-12 u lidského subjektu, kde subjekt trpí poruchou vybranou ze skupiny sestávající z revmatoidní artritidy, osteoartritidy, chronické artritidy u mladistvých, lymské artritidy, psoriatické artritidy, reaktivní artritidy, spondyloartropatie, ankylozující spondylitidy, systémového lupus erythemotosusu, Crohnovy choroby, ulcerativní kolitidy, zánětlivého onemocnění střev, roztroušené sklerózy, diabetů se závislostí na inzulínu, astma, alergického onemocnění, psoriázy, dermatitidy sklerodermy, zánětu štítné žlázy, onemocnění transplantát versus hostitel, odmítnutí transplantovaného orgánu, akutního a chronického imunitního onemocnění spojeného s transplantací orgánu, sarkoidózy, aterosklerózy, diseminované intravaskulární koagulace, Kawasakiho choroby, exoftalmické strumy, nefrotického syndromu, chronického únavového syndromu, nodózní polyarteritidy, Wegenerova granulomatózy, Henoch-Schoenleinovy purpury, mikroskopické vaskulitidy ledvin, chronické aktivní hepatitidy, Sjogrenova syndromu, uveitidy, sepse, septického šoku, syndromu toxického šoku, syndromu (akutního) ztíženého dýchání u dospělých, kachexie, infekčního onemocnění, parazitického onemocnění, syndromu získaného imunitní nedostatečností, akutního myelitis transvers, těžké myastenie, Hungtingtonovy chorey, Parkinsonovy choroby, Alzheimeerovy choroby, mrtvice, primární biliární cirhózy, fibrotického onemocnění plic, hemolytické anémii, zhoubného bujení, selhání srdce a infarktu myokardu.
44. Použití podle nároku 43, kde poruchou je Crohnova choroba.
45. Použití podle nároku 43, kde poruchou je roztroušená skleróza.
46. Použití podle nároku 43, kde poruchou je revmatoidní artritida.
47. Použití podle nároku 43, kde poruchou je psoriáza.
48. Použití podle nároku 43, kde poruchou je psoriatická artritida.
49. Použití izolované lidské protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 34 nebo její části vázající se na antigen pro výrobu prostředku pro detekování lidského IL-12.
50. Způsob detekce lidského IL-12, vyznačující se tím, že zahrnuje kontakt in vitro lidského IL-12 s protilátkou nebo její částí vázající se na antigen podle kteréhokoliv z nároků 1 až 34 tak, že je detekován lidský IL-12.
51. Způsob podle nároku 50, vyznačující se tím, že lidský IL-12 je detekován v biologickém vzorku pro diagnostické účely.
52. Použití protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 34 nebo její části vázající se na antigen pro přípravu léčiva k léčení poruchy, při které je aktivita lidského IL-12 škodlivá, kde porucha je vybraná ze skupiny sestávající z revmatoidní artritidy, osteoartritidy, chronické artritidy u mladistvých, lymské artritidy, psoriatické artritidy, reaktivní artritidy, spondyloartropatie, ankylozující spondylitidy, systémového lupus erythematosusu, Crohnovy choroby, ulcerativní kolitidy, zánětlivého onemocnění střev, roztroušené sklerózy, diabetů se závislostí na inzulínu, astma, alergického onemocnění, psoriázy, dermatitidy sklerodermy, zánětu štítné žlázy, onemocnění transplantát versus hostitel, odmítnutí transplantovaného orgánu, akutního a chronického imunitního onemocnění spojeného s transplantací orgánu, sarkoidózy, aterosklerózy, diseminované intravaskulámí koagulace, Kawasakiho choroby, exoftalmické strumy, nefrotického syndromu, chronického únavového syndromu, nodózní polyarteritidy, Wegenerova granulomatózy, HenochSchoenleinovy purpury, mikroskopické vaskulitidy ledvin, chronické aktivní hepatitidy, Sjogrenova syndromu, uveitidy, sepse, septického Šoku, syndromu toxického šoku, syndromu (akutního) ztíženého dýchání u dospělých, kachexie, infekčního onemocnění, parazitického onemocnění, syndromu získaného imunitní nedostatečností, akutního myelitis transvers, těžké myastenie, Hugtingtonovy chorey, Parkinsonovy choroby, Alzheimerovy choroby, mrtvice, primární biliární cirhózy, fibrotického onemocnění plic, hemolytické anémii, zhoubného bujení, selhání srdce a infarktu myokardu.
53. Použití podle nároku 52, kde poruchou je Crohnova choroba.
54. Použití podle nároku 52, kde poruchou je roztroušená skleróza.
55. Použití podle nároku 52, kde poruchou je revmatoidní artritida.
56. Použití podle nároku 52, kde poruchou je psoriáza.
57. Použití podle nároku 52, kde poruchou je psoriatická artritida.
58 Izolovaná nukleová kyselina kódující CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 17, kde nukleová kyselina kóduje variabilní oblast těžkého řetězce protilátky podle nároku 1.
59. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 58, kde CDR2 variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 19.
60. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 58, kde CDR1 variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 21.
61. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 60, která kóduje variabilní oblast těžkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 23.
62. Izolovaná nukleová kyselina kódující CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 18, kde nukleová kyselina kóduje variabilní oblast lehkého řetězce protilátky podle nároku 1.
63. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 62, kde CDR2 variabilní oblasti lehkého řetězce protilátky obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 20.
64. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 62, kde CDR1 variabilní oblasti lehkého řetězce protilátky obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 22.
65. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 64, která kóduje variabilní oblast lehkého řetězce protilátky, obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 24.
66. Izolovaná nukleová kyselina kódující CDR3 těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 25, kde nukleová kyselina kóduje variabilní oblast těžkého řetězce protilátky podle nároku 1.
67. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 66, kde CDR2 variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 27.
68. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 66, kde CDR1 variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 29.
69. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 68, která kóduje variabilní oblast těžkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 31.
70. Izolovaná nukleová kyselina kódující CDR3 lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 26, kde nukleová kyselina kóduje variabilní oblast lehkého řetězce protilátky podle nároku 1.
71. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 70, kde CDR2 variabilní oblasti lehkého řetězce protilátky obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 28.
72. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 70, kde CDR1 variabilní oblasti lehkého řetězce protilátky obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 30.
73. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 72, která kóduje variabilní oblast lehkého řetězce protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 32.
74. Rekombinantní expresní vektor zahrnující izolovanou nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 58 až 73.
75. Hostitelská buňka, do které byl zavedený rekombinantní expresivní vektor podle nároku 74.
76. Rekombinantní expresní vektor podle nároku 74 kódující:

a) těžký řetězec protilátky mající variabilní oblast obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 31 a

b) lehký řetězec protilátky mající variabilní oblast obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 32.
77. Hostitelská buňka podle nároku 75, do které byl zavedený rekombinantní expresivní vektor podle nároku 76.
78 Způsob syntézy lidské protilátky, která se váže na lidský IL-12, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelské buňky podle nároku 77 v kultivačním médiu, dokud není buňkou syntetizována lidská protilátka, která se váže na lidský IL-12.
79. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 1 nebo její část vázající se na antigen, kde protilátkou je neutralizující protilátka.

Patent Citations (24)

Publication number Priority date Publication date Assignee Title

WO1997015327A1

* 1995-10-25 1997-05-01 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of treating established colitis using antibodies against il-12

EP1175446A1

* 1999-03-25 2002-01-30 Knoll GmbH Human antibodies that bind human il-12 and methods for producing

Family To Family Citations

US4399216A

1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials

US5179017A

1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials

US4634665A

1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials

US4510245A

1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system

GB8308235D0

1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides

US5168062A

1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence

US4968615A

1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus

ATE168416T1

1989-10-05 1998-08-15 Optein Inc Zellfreie synthese und isolierung von genen und polypeptiden

WO1992020791A1

1990-07-10 1992-11-26 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs

GB9015198D0

1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance

ATE164395T1

1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften

DK1471142T3

1991-04-10 2009-03-09 Scripps Research Inst Heterodimere receptor-biblioteker under anvendelse af fagemider

WO1994004679A1

* 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies

DE4122599C2

1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern

US5734014A

* 1992-08-11 1998-03-31 Tsumura & Co. Elafin derivative

US5464758A

1993-06-14 1995-11-07 Gossen; Manfred Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters

US5654168A

1994-07-01 1997-08-05 Basf Aktiengesellschaft Tetracycline-inducible transcriptional activator and tetracycline-regulated transcription units

EP0659766A1

* 1993-11-23 1995-06-28 Schering-Plough Human monoclonal antibodies against human cytokines and methods of making and using such antibodies

ZA95960B

* 1994-03-14 1995-10-10 Genetics Inst Use of interleukin-12 antagonists in the treatment of autoimmune diseases

EP1978033A3

* 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice

DK0936923T3

* 1996-11-15 2004-04-26 Kennedy Inst Of Rheumatology Undertrykkelse af TNFalpha og IL-12 ved terapi

US9601381B2

2013-12-05 2017-03-21 Stmicroelectronics (Crolles 2) Sas Method for the formation of a finFET device with epitaxially grown source-drain regions having a reduced leakage path

* Cited by examiner, † Cited by third party

Non-Patent Citations (2)

Title

Carter a kol. (1997) Hybridoma 16, 363-369 *

Neurath a kol. (1995) J. Exp. Med. 182, 1281-1290 *

* Cited by examiner, † Cited by third party

Cited By (166)

Publication number Priority date Publication date Assignee Title

Family To Family Citations

CN101333256A

* 1999-03-25 2008-12-31 艾博特股份有限两合公司结合人il-12的人抗体及其生产方法

US7883704B2

* 1999-03-25 2011-02-08 Abbott Gmbh & Co. Kg Methods for inhibiting the activity of the P40 subunit of human IL-12

US6914128B1

1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing

AR027404A1

2000-02-10 2003-03-26 Abbott Gmbh & Co Kg Anticuerpos que ligan la interleucina-18 humana y metodos de preparacion y uso.

KR20080074231A

2000-06-29 2008-08-12 아보트 러보러터리즈 이중 특이성 항체 및 이의 제조 및 사용 방법

US6902734B2

2000-08-07 2005-06-07 Centocor, Inc. Anti-IL-12 antibodies and compositions thereof

CA2433800C

2001-01-05 2016-09-13 Pfizer Inc. Antibodies to insulin-like growth factor i receptor

EP3254687A1

2001-10-04 2017-12-13 Genetics Institute LLC Methods and compositions for modulating interleukin-21 receptor activity

NZ532896A

2001-11-08 2007-08-31 Pdl Biopharma Inc Stable liquid pharmaceutical formulation of IGG antibodies including daclizumab and fontolizumab

EP1494710A4

* 2002-03-26 2007-03-21 Centocor Inc DIABETES-RELEVANT IMMUNOGLOBULIN-BASED PROTEINS, COMPOSITIONS, PROCESSES AND USES

AU2003220557A1

* 2002-03-26 2003-10-13 Centocor, Inc. Multiple sclerosis-related immunoglobulin derived proteins, compositions, methods and uses

US20040033228A1

2002-08-16 2004-02-19 Hans-Juergen Krause Formulation of human antibodies for treating TNF-alpha associated disorders

DK1576011T3

2002-10-30 2009-11-30 Genentech Inc Inhibering af IL-17 produktion

KR101103218B1

2002-11-08 2012-01-05 아블린쓰 엔.브이. 종양 괴사 인자-알파에 대한 단일 도메인 항체 및 그 용도

US9320792B2

2002-11-08 2016-04-26 Ablynx N.V. Pulmonary administration of immunoglobulin single variable domains and constructs thereof

DE10303974A1

2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung

AU2012202845B2

* 2003-02-10 2014-09-04 Biogen Ma Inc. Immunoglobulin formulation and method of preparation thereof

EP2236154B1

2003-02-10 2018-05-30 Biogen MA Inc. Immunoglobulin formulation and method of preparation thereof

RU2005131852A

2003-03-14 2006-04-20 Уайт (Us) Антитела против человеческого рецептора il-21 и их применение

JP4638870B2

2003-08-13 2011-02-23 ファイザー・プロダクツ・インク修飾ヒトｉｇｆ−１ｒ抗体

FR2859725B1

2003-09-16 2006-03-10 Neovacs Procede a haut rendement pour l'obtention d'anticorps humains neutralisant l'activite biologique d'une cytokine humaine

US20050100965A1

2003-11-12 2005-05-12 Tariq Ghayur IL-18 binding proteins

DE10353175A1

* 2003-11-14 2005-06-16 Müller-Hermelink, Hans Konrad, Prof. Dr. Humaner monoklonaler Antikörper mit fettsenkender Wirkung

EP1531162A1

2003-11-14 2005-05-18 Heinz Vollmers Adenocarcinoma specific antibody SAM-6, and uses thereof

BRPI0508761A

* 2004-03-31 2007-08-14 Genentech Inc anticorpo humanizado, composição que compreende um anticorpo humanizado, ácido nucléico isolado, vetor, célula hospedeira, processo de produção de anticorpo humanizado, método de tratamento de disfunção tgf-beta, método de detecção de tgf-beta, artigo industrializado e método de tratamento de cáncer

ME00226B

2004-07-15 2011-02-10 Medarex Llc Humana anti-ngf neutrališuća antitijela kao selektivni inhibitori ngf signalne kaskade

JP2008506681A

2004-07-16 2008-03-06 ファイザー・プロダクツ・インク抗ｉｇｆ−１ｒ抗体を用いる非血液性の悪性腫瘍の併用療法

SG158150A1

2004-12-21 2010-01-29 Centocor Inc Anti-il-12 antibodies, epitopes, compositions, methods and uses

HUE042689T2

2005-02-08 2019-07-29 Genzyme Corp TGFbéta elleni antitestek

EP1849011A2

2005-02-14 2007-10-31 University of Pittsburgh of the Commonwealth System of Higher Education Use of il-17f in diagnosis and therapy of airway inflammation

WO2006088833A2

2005-02-14 2006-08-24 Wyeth Interleukin-17f antibodies and other il-17f signaling antagonists and uses therefor

GT200600148A

2005-04-14 2006-11-22 Metodos para el tratamiento y la prevencion de fibrosis

KR20080028895A

* 2005-06-30 2008-04-02 아보트 러보러터리즈 Ｉｌ-12/ｐ40 결합 단백질

NZ625807A

2005-07-18 2015-11-27 Amgen Inc Human anti-b7rp1 neutralizing antibodies

RU2515108C2

2005-08-19 2014-05-10 Эббви Инк Иммуноглобулин с двойными вариабельными доменами и его применения

US7612181B2

2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof

EP2500353A3

2005-08-19 2012-10-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof

EP1928905B1

2005-09-30 2015-04-15 AbbVie Deutschland GmbH & Co KG Bindungsdomänen von proteinen der repulsive guidance molecule (rgm) proteinfamilie und funktionale fragmente davon sowie deren verwendung

PT2289909E

2005-11-30 2015-02-10 Abbvie Inc Método de rastreio, processo de purificação de globulómeros a-beta não difundíveis, anticorpos selectivos contra os referidos globulómeros a-beta não difundíveis e processo para o fabrico dos referidos anticorpos

ES2453941T5

2005-11-30 2017-05-31 Abbvie Inc. Anticuerpos monoclonales contra la proteína beta amiloide y usos de los mismos

TWI417301B

2006-02-21 2013-12-01 Wyeth Corp 對抗人類介白素-２２（ｉｌ-２２）之抗體及其用途

TW200744634A

2006-02-21 2007-12-16 Wyeth Corp Methods of using antibodies against human IL-22

JP2010502224A

2006-09-08 2010-01-28 アボット・ラボラトリーズインターロイキン１３結合タンパク質

US8455626B2

2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies

US8324350B2

2006-12-29 2012-12-04 Abbott Laboratories Dual-specific IL-1α/IL-1β antibodies

CA2675233A1

* 2007-01-16 2008-07-24 Abbott Laboratories Methods for treating psoriasis

WO2008104386A2

2007-02-27 2008-09-04 Abbott Gmbh & Co. Kg Method for the treatment of amyloidoses

CN101679507A

2007-03-29 2010-03-24 艾博特公司结晶抗人类il-12抗体

WO2009005673A1

* 2007-06-28 2009-01-08 Schering Corporation Anti-igf1r

US20090181027A1

* 2007-09-28 2009-07-16 Paul Dal Monte Anti-IL-12/23p40 Antibodies, Epitopes, Formulations, Compositions, Methods and Uses

EP2050764A1

* 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof

JP2011504740A

2007-11-27 2011-02-17 アブリンクスエン．ヴェー．ヘテロ二量体サイトカイン及び／又はこれらの受容体に指向性を有するアミノ酸配列、並びにこれを含むポリペプチド

US8962803B2

2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof

NZ602511A

2008-03-18 2014-03-28 Abbvie Inc Methods for treating psoriasis

WO2009134776A2

2008-04-29 2009-11-05 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof

CN104628855A

2008-05-05 2015-05-20 诺维莫尼公司抗il-17a/il-17f交叉反应性抗体及其使用方法

BRPI0911758A8

2008-05-09 2017-10-10 Abbott Lab Anticorpos para receptor de produtos finais de glicação avançada (rage) e utilizações dos mesmos

EP3705135A1

* 2008-05-30 2020-09-09 XBiotech, Inc Il-1 alpha abs and methods of use

CN102112494A

2008-06-03 2011-06-29 雅培制药有限公司双重可变结构域免疫球蛋白及其用途

EP3002299A1

2008-06-03 2016-04-06 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof

EP2321422A4

2008-07-08 2013-06-19 Abbvie Inc PROSTAGLANDINE E2 VARIABLE DOUBLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND USES THEREOF

EP2310049A4

2008-07-08 2013-06-26 Abbvie Inc PROSTAGLANDIN E2 BINDING PROTEINS AND USES THEREOF

KR101593285B1

2008-10-29 2016-02-11 아블린쓰 엔.브이. 단일 도메인 항원 결합 분자의 제형

WO2010056550A1

2008-10-29 2010-05-20 Wyeth Llc Methods for purification of single domain antigen binding molecules

NZ606283A

* 2008-11-28 2014-08-29 Abbvie Inc Stable antibody compositions and methods for stabilizing same

US8030026B2

* 2009-02-24 2011-10-04 Abbott Laboratories Antibodies to troponin I and methods of use thereof

AR075798A1

2009-03-05 2011-04-27 Abbott Lab Proteinas de union a il-17 (interleuquina 17)

US8137671B2

2009-05-05 2012-03-20 Genentech, Inc. Anti-IL-17F antibodies

TWI465250B

2009-08-29 2014-12-21 Abbvie Inc 治療用之ｄｌｌ４結合蛋白質

KR20120060877A

2009-09-01 2012-06-12 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도

SG179135A1

* 2009-09-14 2012-05-30 Abbott Lab Methods for treating psoriasis

PE20121531A1

2009-10-15 2012-12-22 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual

UY32979A

2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas

WO2011053707A1

2009-10-31 2011-05-05 Abbott Laboratories Antibodies to receptor for advanced glycation end products (rage) and uses thereof

WO2011051466A1

2009-11-02 2011-05-05 Novartis Ag Anti-idiotypic fibronectin-based binding molecules and uses thereof

EP2510001B1

2009-12-08 2015-12-02 AbbVie Deutschland GmbH & Co KG Monoclonal antibodies against the rgm a protein for use in the treatment of retinal nerve fiber layer degeneration

JP5785873B2

* 2009-12-09 2015-09-30 田辺三菱製薬株式会社Ｔ細胞活性化阻害剤、これを含有する医薬組成物およびｔ細胞活性化阻害物質のスクリーニング方法

UA112743C2

2010-03-02 2016-10-25 Еббві Інк. Терапевтичний dll4-зв'язувальний білок

CA2796339C

2010-04-15 2020-03-31 Abbott Laboratories Amyloid-beta binding proteins

AU2011252883B2

2010-05-14 2015-09-10 Abbvie Inc. IL-1 binding proteins

WO2012006500A2

2010-07-08 2012-01-12 Abbott Laboratories Monoclonal antibodies against hepatitis c virus core protein

UY33492A

2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas

WO2012018790A2

* 2010-08-03 2012-02-09 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof

CN105348387B

2010-08-14 2020-08-25 Abbvie 公司 β淀粉样蛋白结合蛋白

LT3333188T

2010-08-19 2022-06-10 Zoetis Belgium S.A. Anti-ngf antikūnai ir jų panaudojimas

JP2013539364A

2010-08-26 2013-10-24 アッヴィ・インコーポレイテッド二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用

JP2013544762A

2010-09-17 2013-12-19 バクスター、インターナショナル、インコーポレイテッド弱酸性〜中性のｐＨにおける、塩化ナトリウムを有する水性製剤を介した免疫グロブリンおよび他のタンパク質の安定化

KR20130133247A

2010-12-21 2013-12-06 애브비 인코포레이티드 Ｉｌ-1-알파 및 -베타 이특이적 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도

TW201307388A

2010-12-21 2013-02-16 Abbott Lab Ｉｌ－１結合蛋白

EP2734236A4

2011-07-13 2015-04-15 Abbvie Inc METHOD AND COMPOSITIONS FOR TREATING ASTHMA WITH ANTI-IL-13 ANTIBODIES

UY34411A

2011-10-24 2013-05-31 Abbvie Inc Inmunoenlazantes dirigidos contra esclerostina

JP6336397B2

2011-12-14 2018-06-06 アッヴィ・ドイチュラント・ゲー・エム・ベー・ハー・ウント・コー・カー・ゲー鉄関連障害を診断および治療するための組成物および方法

CN107459576A

2011-12-14 2017-12-12 艾伯维德国有限责任两合公司用于诊断和治疗铁相关病症的组合物和方法

WO2013102042A2

2011-12-30 2013-07-04 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against il-13 and/or il-17

PL2807192T3

2012-01-27 2019-02-28 Abbvie Deutschland Kompozycja oraz sposób diagnostyki i leczenia chorób związanych ze zwyrodnieniem neurytów

US8945553B2

2012-05-22 2015-02-03 Bristol-Myers Squibb Company Bispecific antibodies to IL-23 and IL-17A/F

CA2875783C

2012-06-06 2018-12-11 Zoetis Llc Caninized anti-ngf antibodies and methods thereof

AR091755A1

2012-07-12 2015-02-25 Abbvie Inc Proteinas de union a il-1

EA201791717A1

2012-09-07 2018-03-30 Кохерус Байосайенсис, Инк. Стабильные водные составы адалимумаба

EP2914625A2

2012-11-01 2015-09-09 AbbVie Inc. Anti-vegf/dll4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof

US9550986B2

2012-12-21 2017-01-24 Abbvie Inc. High-throughput antibody humanization

KR102068222B1

2013-02-20 2020-01-21 삼성디스플레이 주식회사 증착용 마스크 제조방법

US9458246B2

2013-03-13 2016-10-04 Amgen Inc. Proteins specific for BAFF and B7RP1

PH12022550138A1

2013-03-13 2023-03-06 Amgen Inc Proteins specific for baff and b7rp1 and uses thereof

CN105209616A

2013-03-14 2015-12-30 雅培制药有限公司用于改进的抗体检测的hcv ns3重组抗原及其突变体

JP6739329B2

2013-03-14 2020-08-12 アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＨｃｖコア脂質結合ドメインモノクローナル抗体

MX362075B

2013-03-14 2019-01-07 Abbott Lab Ensayo de combinación de antígeno-anticuerpo del virus de la hepatitis c (vhc) y métodos y composiciones para usarlo.

US9469686B2

2013-03-15 2016-10-18 Abbott Laboratories Anti-GP73 monoclonal antibodies and methods of obtaining the same

WO2014144280A2

2013-03-15 2014-09-18 Abbvie Inc. DUAL SPECIFIC BINDING PROTEINS DIRECTED AGAINST IL-1β AND / OR IL-17

CN103275222B

* 2013-05-15 2014-04-16 中山康方生物医药有限公司一种阻断白介素12 p40功能的单克隆抗体及其编码基因和应用

EP3003372B1

2013-06-07 2019-10-09 Duke University Inhibitors of complement factor h

JP6159419B2

* 2013-12-26 2017-07-05 田辺三菱製薬株式会社ヒト抗ｉｌ−３３中和モノクローナル抗体

EP3662903A3

* 2014-10-03 2020-10-14 Novartis AG Combination therapies

AU2015332151A1

* 2014-10-18 2017-04-27 Pfizer Inc. Anti-IL-7R antibody compositions

AR102417A1

2014-11-05 2017-03-01 Lilly Co Eli Anticuerpos biespecíficos anti-tnf- / anti-il-23

WO2016094881A2

2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins

AR103173A1

2014-12-22 2017-04-19 Novarits Ag Productos farmacéuticos y composiciones líquidas estables de anticuerpos il-17

KR20240056663A

2015-05-29 2024-04-30 애브비 인코포레이티드 항-ｃｄ40 항체 및 그의 용도

TW201710286A

2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白

US11229702B1

2015-10-28 2022-01-25 Coherus Biosciences, Inc. High concentration formulations of adalimumab

CR20180365A

2015-12-16 2018-09-28 Amgen Inc PROTEÍNAS DE UNIÓN AL ANTÍGENO BISPECÍFICO DE ANTI-TL1A/ANTI-TNF-a Y SUS USOS

CN105825196B

* 2016-03-28 2020-01-31 联想(北京)有限公司一种信息处理方法和电子设备

AU2017241776B2

2016-03-29 2024-06-20 Janssen Biotech, Inc. Treating psoriasis with increased interval dosing of anti-IL12 and/or -23 antibody

WO2017184880A1

2016-04-20 2017-10-26 Coherus Biosciences, Inc. A method of filling a container with no headspace

EP3515936A1

* 2016-09-23 2019-07-31 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific antibody molecules comprising lambda and kappa light chains

CN110249226B

2016-10-03 2023-08-25 雅培实验室评估患者样品中gfap状态的改进方法

MA47106A

2016-12-21 2019-10-30 Amgen Inc Formulations d'anticorps anti-tnf alpha

US11016092B2

2017-03-23 2021-05-25 Abbott Laboratories Methods for aiding in the diagnosis and determination of the extent of traumatic brain injury in a human subject using the early biomarker ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1

WO2018191531A1

2017-04-15 2018-10-18 Abbott Laboratories Methods for aiding in the hyperacute diagnosis and determination of traumatic brain injury in a human subject using early biomarkers

JP7080899B2

2017-04-28 2022-06-06 アボット・ラボラトリーズ同じヒト対象に由来する少なくとも２つの試料に対して早期バイオマーカーを使用する、外傷性脳損傷の超急性の診断及び決定の一助となるための方法

US10865238B1

2017-05-05 2020-12-15 Duke University Complement factor H antibodies

EP3631465A1

2017-05-25 2020-04-08 Abbott Laboratories Methods for aiding in the determination of whether to perform imaging on a human subject who has sustained or may have sustained an injury to the head using early biomarkers

BR112019025387A2

2017-05-30 2020-07-07 Abbott Laboratories métodos para auxiliar no diagnóstico e avaliação de uma lesão traumática cerebral branda em um indivíduo humano com o uso de troponina cardíaca i e biomarcadores precoces

US11169159B2

2017-07-03 2021-11-09 Abbott Laboratories Methods for measuring ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 levels in blood

CN115920041A

2017-08-31 2023-04-07 田边三菱制药株式会社含有il-33拮抗剂的子宫内膜异位症治疗剂

TW201922780A

* 2017-09-25 2019-06-16 美商健生生物科技公司以抗ｉｌ１２／ｉｌ２３抗體治療狼瘡之安全且有效之方法

JP7344801B2

2017-12-09 2023-09-14 アボット・ラボラトリーズグリア原線維性酸性タンパク質（ｇｆａｐ）及び／又はユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼｌ１（ｕｃｈ－ｌ１）を使用する、整形外科損傷を負っており、軽度外傷性脳損傷（ｔｂｉ）などの頭部への損傷を負ったか又は負った可能性がある対象についての診断及び査定の一助となるための方法

EP3721234A1

2017-12-09 2020-10-14 Abbott Laboratories Methods for aiding in diagnosing and evaluating a traumatic brain injury in a human subject using a combination of gfap and uch-l1

JP2021506794A

* 2017-12-13 2021-02-22 ザリサーチファウンデイションフォーザステイトユニバーシティーオブニューヨーク疼痛を治療し、疼痛感受性を増大させるためのペプチド及び他の薬剤

JP2021517461A

2018-03-12 2021-07-26 ゾエティス・サービシーズ・エルエルシー抗ｎｇｆ抗体およびその方法

EP3793521A4

2018-05-18 2022-02-23 Janssen Biotech, Inc. SAFE AND EFFECTIVE METHOD OF TREATING LUPUS WITH AN ANTI-IL12/IL23 ANTIBODY

KR20210064315A

2018-09-24 2021-06-02 얀센 바이오테크 인코포레이티드 항-il12/il23 항체로 궤양성 결장염을 치료하는 안전하고 효과적인 방법

CN111057719B

* 2018-10-17 2022-11-11 南京大学一种高效的小鼠骨髓来源巨噬细胞的转染方法及其应用

AU2020279987A1

2019-05-23 2021-11-18 Janssen Biotech, Inc. Method of treating inflammatory bowel disease with a combination therapy of antibodies to IL-23 and TNF alpha

CN110204736A

* 2019-06-07 2019-09-06 河南师范大学一步合成不同形貌Pb-MOF金属有机骨架的方法

EP4100435A1

2020-02-05 2022-12-14 Larimar Therapeutics, Inc. Tat peptide binding proteins and uses thereof

CN111471655B

* 2020-03-19 2023-07-07 湖州正熙医学检验实验室有限公司抗人il12/23稳转细胞株及其构建方法和应用

WO2021231798A1

2020-05-13 2021-11-18 Disc Medicine, Inc. Anti-hemojuvelin (hjv) antibodies for treating myelofibrosis

CA3183927A1

2020-05-21 2021-11-25 Janssen Biotech, Inc. Method of treating inflammatory bowel disease with a combination therapy of antibodies to il-23 and tnf alpha

WO2022031804A1

2020-08-04 2022-02-10 Abbott Laboratories Improved methods and kits for detecting sars-cov-2 protein in a sample

WO2023102384A1

2021-11-30 2023-06-08 Abbott Laboratories Use of one or more biomarkers to determine traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography scan that is negative for a tbi

US20220170948A1

2020-12-01 2022-06-02 Abbott Laboratories Use of one or more biomarkers to determine traumatic brain injury (tbi) in a human subject having received a head computerized tomography scan that is negative for a tbi

WO2022147147A1

2020-12-30 2022-07-07 Abbott Laboratories Methods for determining sars-cov-2 antigen and anti-sars-cov-2 antibody in a sample

US20220381796A1

2021-05-18 2022-12-01 Abbott Laboratories Methods of evaluating brain injury in a pediatric subject

EP4356129A1

2021-06-14 2024-04-24 Abbott Laboratories Methods of diagnosing or aiding in diagnosis of brain injury caused by acoustic energy, electromagnetic energy, an over pressurization wave, and/or blast wind

CN113321729B

* 2021-07-01 2022-08-30 东大生物技术(苏州)有限公司一组il-12单克隆抗体及其医药用途

CN118715440A

2021-08-31 2024-09-27 雅培实验室诊断脑损伤的方法和系统

EP4396587A1

2021-08-31 2024-07-10 Abbott Laboratories Methods and systems of diagnosing brain injury

WO2023056268A1

2021-09-30 2023-04-06 Abbott Laboratories Methods and systems of diagnosing brain injury

JP2025503439A

2021-12-17 2025-02-04 アボット・ラボラトリーズ血液試料におけるｕｃｈ－ｌ１、ｇｆａｐ及び他のバイオマーカーを決定するためのシステム及び方法

CN119256227A

2022-02-04 2025-01-03 雅培实验室用于检测样品中泛素羧基末端水解酶l1和/或胶质纤维酸性蛋白的存在或测量其量的侧向流方法、测定和装置

KR20230171660A

2022-06-14 2023-12-21 오상민 공기 살균 정화기

EP4548100A1

2022-06-29 2025-05-07 Abbott Laboratories Magnetic point-of-care systems and assays for determining gfap in biological samples

AU2023342055A1

2022-09-15 2025-03-13 Abbott Laboratories Biomarkers and methods for differentiating between mild and supermild traumatic brain injury

WO2024211475A1

2023-04-04 2024-10-10 Abbott Laboratories Use of biomarkers to determine whether a subject has sustained, may have sustained or is suspected of sustaining a subacute acquired brain injury (abi)

WO2024226969A1

2023-04-28 2024-10-31 Abbott Point Of Care Inc. Improved assays, cartridges, and kits for detection of biomarkers, including brain injury biomarkers

* Cited by examiner, † Cited by third party, ‡ Family to family citation

Priority And Related Applications

Applications Claiming Priority (1)

Application Filing date Title

US12660399P 1999-03-25

Legal Events

Date Code Title Description

2016-10-19 MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20160324

Concepts

Download

Name Image Sections Count Query match

binding

title,claims,abstract,description 596 0.000

binding

title,claims,abstract,description 594 0.000

Homo sapiens

title,claims,abstract,description 364 0.000

method

title,claims,abstract,description 124 0.000

Interleukin-12

title,claims,description 131 0.000

Interleukin-12

title,claims,description 131 0.000

process

title,description 4 0.000

antigen

claims,abstract,description 565 0.000

antigens

claims,abstract,description 559 0.000

antigens

claims,abstract,description 559 0.000

effects

claims,abstract,description 332 0.000

nucleic acids

claims,abstract,description 67 0.000

nucleic acids

claims,abstract,description 67 0.000

nucleic acids

claims,abstract,description 67 0.000

in vitro

claims,abstract,description 62 0.000

inhibitory effect

claims,abstract,description 13 0.000

detrimental effect

claims,abstract,description 4 0.000

synthesizing effect

claims,abstract,description 4 0.000

alpha amino acid group

claims,description 336 0.000

Cerebellar degeneration-related antigen 1

claims,description 102 0.000

cell

claims,description 67 0.000

Immunoglobulin

claims,description 65 0.000

immunoglobulin

claims,description 65 0.000

Phytohemagglutinins

claims,description 53 0.000

phytohemagglutinin

claims,description 53 0.000

proliferation

claims,description 52 0.000

assay

claims,description 48 0.000

expression vector

claims,description 36 0.000

diseases, disorders, signs and symptoms

claims,description 35 0.000

fragment

claims,description 30 0.000

neutralizing effect

claims,description 28 0.000

recombinant expression

claims,description 24 0.000

mixture

claims,description 22 0.000

chemical substances by application

claims,description 19 0.000

drug

claims,description 18 0.000

disorder

claims,description 17 0.000

disease

claims,description 16 0.000

Immunoglobulin Fab Fragments

claims,description 14 0.000

Crohn disease

claims,description 13 0.000

rheumatoid arthritis

claims,description 13 0.000

Cytokines

claims,description 12 0.000

Cytokines

claims,description 12 0.000

Immunoglobulin Fab Fragments

claims,description 12 0.000

Lung disease

claims,description 12 0.000

therapeutic agent

claims,description 12 0.000

acute effect

claims,description 11 0.000

multiple sclerosis

claims,description 11 0.000

surface plasmon resonance spectroscopy

claims,description 9 0.000

manufacturing process

claims,description 8 0.000

organ

claims,description 8 0.000

pharmaceutical composition

claims,description 8 0.000

growth medium

claims,description 7 0.000

Immunoglobulin Variable Region

claims,description 6 0.000

Immunoglobulin Variable Region

claims,description 6 0.000

L-methotrexate

claims,description 6 0.000

T-lymphocyte

claims,description 6 0.000

corticosteroid

claims,description 6 0.000

corticosteroids

claims,description 6 0.000

drug carrier

claims,description 6 0.000

ligand

claims,description 6 0.000

methotrexate

claims,description 6 0.000

syndromic disease

claims,description 6 0.000

Interleukin-2 receptor subunit alpha

claims,description 5 0.000

Interleukin-6

claims,description 5 0.000

Interleukin-6

claims,description 5 0.000

Psoriasis

claims,description 5 0.000

Psoriatic Arthritis

claims,description 5 0.000

Psoriatic arthropathy

claims,description 5 0.000

adrenergic

claims,description 5 0.000

chronic effect

claims,description 5 0.000

Ankylosing Spondylitis

claims,description 4 0.000

CD40 gene

claims,description 4 0.000

Chronic Fatigue Syndrome

claims,description 4 0.000

Colitis ulcerative

claims,description 4 0.000

Early activation antigen CD69

claims,description 4 0.000

Homo sapiens Early activation antigen CD69

claims,description 4 0.000

Homo sapiens Tumor necrosis factor

claims,description 4 0.000

Immunoglobulin Fragments

claims,description 4 0.000

Immunoglobulin Fragments

claims,description 4 0.000

Interleukin-1

claims,description 4 0.000

Interleukin-1

claims,description 4 0.000

Interleukin-2

claims,description 4 0.000

Interleukin-2

claims,description 4 0.000

Lyme disease

claims,description 4 0.000

Neoplasm

claims,description 4 0.000

Renal vasculitis

claims,description 4 0.000

Sepsis

claims,description 4 0.000

Septic Shock

claims,description 4 0.000

Spondylarthropathies

claims,description 4 0.000

Tumor necrosis factor

claims,description 4 0.000

Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5

claims,description 4 0.000

Ulcerative Colitis

claims,description 4 0.000

Uveitis

claims,description 4 0.000

arthritis

claims,description 4 0.000

cancer

claims,description 4 0.000

culturing

claims,description 4 0.000

osteoarthritis

claims,description 4 0.000

prednisolone

claims,description 4 0.000

prednisolone

claims,description 4 0.000

preparation method

claims,description 4 0.000

reactive arthritis

claims,description 4 0.000

spondyloarthropathy

claims,description 4 0.000

Arthritis reactive

claims,description 3 0.000

Atherosclerosis

claims,description 3 0.000

Biliary Liver Cirrhosis

claims,description 3 0.000

Biliary cirrhosis primary

claims,description 3 0.000

CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit

claims,description 3 0.000

CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit

claims,description 3 0.000

Chronic Hepatitis

claims,description 3 0.000

Communicable disease

claims,description 3 0.000

FGF gene

claims,description 3 0.000

Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

claims,description 3 0.000

Granulomatosis with polyangiitis

claims,description 3 0.000

Henoch-Schoenlein purpura

claims,description 3 0.000

Henoch-Schonlein purpura

claims,description 3 0.000

Hepatitis chronic active

claims,description 3 0.000

Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein

claims,description 3 0.000

Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha

claims,description 3 0.000

Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C

claims,description 3 0.000

Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4

claims,description 3 0.000

Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain

claims,description 3 0.000

Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28

claims,description 3 0.000

Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80

claims,description 3 0.000

Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein

claims,description 3 0.000

Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8

claims,description 3 0.000

Ibuprofen

claims,description 3 0.000

IgA Vasculitis

claims,description 3 0.000

Inflammatory bowel disease

claims,description 3 0.000

Interleukin-10

claims,description 3 0.000

Interleukin-10

claims,description 3 0.000

Interleukin-13

claims,description 3 0.000

Interleukin-13

claims,description 3 0.000

Interleukin-15

claims,description 3 0.000

Interleukin-15

claims,description 3 0.000

Interleukin-16

claims,description 3 0.000

Interleukin-16

claims,description 3 0.000

Interleukin-18

claims,description 3 0.000

Interleukin-18

claims,description 3 0.000

Interleukin-4

claims,description 3 0.000

Interleukin-4

claims,description 3 0.000

Interleukin-7

claims,description 3 0.000

Interleukin-7

claims,description 3 0.000

Interleukin-8

claims,description 3 0.000

Interleukin-8

claims,description 3 0.000

Parkinson disease

claims,description 3 0.000

Primary biliary cholangitis

claims,description 3 0.000

Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C

claims,description 3 0.000

Sjogren Syndrome

claims,description 3 0.000

Stroke

claims,description 3 0.000

T-cell surface glycoprotein CD4

claims,description 3 0.000

T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain

claims,description 3 0.000

T-cell-specific surface glycoprotein CD28

claims,description 3 0.000

T-lymphocyte activation antigen CD80

claims,description 3 0.000

Thy-1 membrane glycoprotein

claims,description 3 0.000

Transplant rejections

claims,description 3 0.000

Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8

claims,description 3 0.000

anemia

claims,description 3 0.000

deficiency

claims,description 3 0.000

disseminated intravascular coagulation

claims,description 3 0.000

fibrotic effect

claims,description 3 0.000

ibuprofen

claims,description 3 0.000

immune system

claims,description 3 0.000

immunoglobulin a vasculitis

claims,description 3 0.000

infectious disease

claims,description 3 0.000

intravenous administration

claims,description 3 0.000

malignancy

claims,description 3 0.000

myalgic encephalomeyelitis/chronic fatigue syndrome

claims,description 3 0.000

myocardial infarction

claims,description 3 0.000

non-steroidal anti-inflammatory drug

claims,description 3 0.000

sarcoidosis

claims,description 3 0.000

systemic lupus erythematosus

claims,description 3 0.000

Alzheimer disease

claims,description 2 0.000

Cachexia

claims,description 2 0.000

Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor

claims,description 2 0.000

Heart failures

claims,description 2 0.000

Kawasaki disease

claims,description 2 0.000

Toxic shock syndrome

claims,description 2 0.000

Toxic shock syndrome

claims,description 2 0.000

growth factor

claims,description 2 0.000

hemolytic effect

claims,description 2 0.000

member 1 small inducible cytokine subfamily E

claims,description 2 0.000

mucocutaneous lymph node syndrome

claims,description 2 0.000

septic shock

claims,description 2 0.000

inhibitor

claims 7 0.000

diabetes mellitus

claims 6 0.000

Cyclosporin A

claims 4 0.000

Cyclosporine

claims 4 0.000

ciclosporin

claims 4 0.000

cyclosporin

claims 4 0.000

mercaptopurine

claims 4 0.000

ACE inhibitor

claims 3 0.000

Caspase-1

claims 3 0.000

Caspase-1

claims 3 0.000

Cyclosporin A

claims 3 0.000

Jacareubin

claims 3 0.000

sulfasalazine

claims 3 0.000

sulfasalazine

claims 3 0.000

sulfasalazine

claims 3 0.000

Basedow disease

claims 2 0.000

Chorea

claims 2 0.000

Graves Disease

claims 2 0.000

Graves' disease

claims 2 0.000

Interleukin-1 receptor type 1, soluble form

claims 2 0.000

Interleukin-1 receptor type 1, soluble form

claims 2 0.000

Interleukin-1 receptor type 2, soluble form

claims 2 0.000

Interleukin-1 receptor type 2, soluble form

claims 2 0.000

Interleukin-11

claims 2 0.000

Interleukin-11

claims 2 0.000

Muscular weakness

claims 2 0.000

Myelitis

claims 2 0.000

Nephrotic syndrome

claims 2 0.000

OC1=CC=C(C=C1C(=O)O[Na])\N=N\C1=CC=C(C=C1)C(=O)NCCC(=O)O[Na]

claims 2 0.000

Parasitic disease

claims 2 0.000

Tacrolimus

claims 2 0.000

Transforming Growth Factor beta

claims 2 0.000

Transforming Growth Factor beta

claims 2 0.000

Tumor Necrosis Factor Receptor

claims 2 0.000

agonist

claims 2 0.000

angiotensin-converting-enzyme inhibitor

claims 2 0.000

anti-inflammatory effect

claims 2 0.000

azathioprine

claims 2 0.000

azathioprine

claims 2 0.000

choreatic disease

claims 2 0.000

cytokine receptors

claims 2 0.000

cytokine receptors

claims 2 0.000

kinase inhibitor

claims 2 0.000

leflunomide

claims 2 0.000

leflunomide

claims 2 0.000

metalloproteinase inhibitor

claims 2 0.000

myasthenia

claims 2 0.000

non-steroidal anti-inflammatory agent

claims 2 0.000

phosphodiesterase inhibitor

claims 2 0.000

phosphotransferase inhibitor

claims 2 0.000

purinergic P1 receptor agonist

claims 2 0.000

rapamycin

claims 2 0.000

signaling

claims 2 0.000

sirolimus

claims 2 0.000

sirolimus

claims 2 0.000

tacrolimus

claims 2 0.000

thyroiditis

claims 2 0.000

tumor necrosis factor receptor

claims 2 0.000

2-(1h-imidazol-2-yl)pyridine

claims 1 0.000

2-aminooxybenzoic acid

claims 1 0.000

4-aminopyridine

claims 1 0.000

6alpha-methylprednisolone

claims 1 0.000

ADAM17

claims 1 0.000

Angiotensin-converting enzyme inhibitor

claims 1 0.000

Bradykinin-potentiating and C-type natriuretic peptides

claims 1 0.000

Complement inhibitor

claims 1 0.000

Cyclophosphamide

claims 1 0.000

Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 17

claims 1 0.000

Epidermal growth factor

claims 1 0.000

Epidermal growth factor

claims 1 0.000

Glycoproteins

claims 1 0.000

Glycoproteins

claims 1 0.000

Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

claims 1 0.000

I kappa b kinase inhibitor

claims 1 0.000

Interleukin-1 receptor

claims 1 0.000

Interleukin-1 receptor

claims 1 0.000

Lipoxygenase Inhibitor

claims 1 0.000

Metalloproteinase inhibitor

claims 1 0.000

P38 inhibitor

claims 1 0.000

Phosphodiesterase 4 inhibitor

claims 1 0.000

Phosphodiesterase inhibitor

claims 1 0.000

adrenalinergic effect

claims 1 0.000

anticoagulant agent

claims 1 0.000

antioxidant agent

claims 1 0.000

antithrombotic agent

claims 1 0.000

atomic oxygen

claims 1 0.000

biological sample

claims 1 0.000

cardiac stimulant phosphodiesterase inhibitors

claims 1 0.000

complement inhibitor

claims 1 0.000

copolymer

claims 1 0.000

cyclophosphamide

claims 1 0.000

dexamethasone

claims 1 0.000

dexamethasone

claims 1 0.000

elastase inhibitor

claims 1 0.000

epidermal growth factor

claims 1 0.000

fampridine

claims 1 0.000

hemolytic anemia

claims 1 0.000

lupus erythematosus

claims 1 0.000

mercaptopurine

claims 1 0.000

mesalamine

claims 1 0.000

mesalazine

claims 1 0.000

metalloproteinase inhibitor

claims 1 0.000

methylprednisolone

claims 1 0.000

metronidazole

claims 1 0.000

metronidazole

claims 1 0.000

micophenolic acid

claims 1 0.000

mitogen activated protein kinase inhibitor

claims 1 0.000

mycophenolate

claims 1 0.000

mycophenolate mofetil

claims 1 0.000

mycophenolate mofetil

claims 1 0.000

mycophenolic acid

claims 1 0.000

olsalazine

claims 1 0.000

olsalazine

claims 1 0.000

oxygen

claims 1 0.000

oxygen

claims 1 0.000

phosphodiesterase IV inhibitor

claims 1 0.000

receptor antagonist

claims 1 0.000

receptor antagonist

claims 1 0.000

respiratory gaseous exchange

claims 1 0.000

shock

claims 1 0.000

systemic effect

claims 1 0.000

thromboxane

claims 1 0.000

tizanidine

claims 1 0.000

tizanidine

claims 1 0.000

tumor necrosis factor alpha converting enzyme inhibitor

claims 1 0.000

tyrosine kinase inhibitor

claims 1 0.000

tyrosine kinase inhibitor

claims 1 0.000

tyrosine kinase inhibitor derivatives

claims 1 0.000

uroanthelone

claims 1 0.000

human interleukin-12

abstract,description 44 0.000

vector

abstract,description 27 0.000

in vivo

abstract,description 11 0.000

Show all concepts from the description section

Data provided by IFI CLAIMS Patent Services