ES2351395T3 - Anticuerpos humanos modificados anti-igf-1r. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo humano monoclonal o una porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al receptor del factor de crecimiento insulinoide I humano (IGF-IR), que comprende al menos una mutación somática contenida en una región de marco estructural de una región variable de dicho anticuerpo que se ha sustituido por un correspondiente residuo de aminoácido de línea germinal, en el que la región variable de la cadena ligera comprende los números de aminoácidos 23 a 130 de la SEC INº 5.

Description

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El factor de crecimiento insulinoide (IGF-I) es un polipéptido de 7,5 kDa que circula en el plasma a elevadas concentraciones y se detecta en la mayoría de los tejidos. El IGF-I estimula la diferenciación celular y la proliferación celular, y la mayoría de los tipos de células de mamíferos lo requieren para una proliferación constante. Estos tipos celulares incluyen, entre otros, fibroblastos diploides humanos, células epiteliales, células de músculo liso, linfocitos T, células nerviosas, mielocitos, condrocitos, osteoblastos y células troncales de la médula espinal.

La primera etapa en la ruta de transducción que da lugar a la proliferación o la diferenciación celular estimulada por IGF-I es la unión de IGF-I o IGF-II (o insulina a concentraciones suprafisiológicas) al receptor de IGF-I. El receptor de IGF-I está compuesto por dos tipos de subunidades: la subunidad alfa (una proteína de 130-135 kDa que es completamente extracelular y participa en la unión del ligando) y una subunidad beta (una proteína transmembrana de 95 kDa, con dominios citoplásmicos y transmembrana). El IGF-IR pertenece a la familia de los receptores de factores de crecimiento tirosina quinasa (Ullrich et al., Cell 61: 203-212, 1990), y es similar estructuralmente al receptor de la insulina (Ullrich et al., EMBO J. 5: 2503-2512, 1986). El IGF-IR se sintetiza inicialmente como un polipéptido prorreceptor de cadena única, que se procesa por glicosilación, proteólisis y unión covalente para configurar un heterotetrámero maduro de 460 kDa que comprende dos subunidades alfa y dos subunidades beta. La(s) subunidad(es) beta posee(n) una actividad tirosina quinasa activada por ligando. Esta actividad está involucrada en las rutas de señalización que median la acción del ligando, lo que implica la autofosforilación de la subunidad beta y la fosforilación de los sustratos de IGF-IR.

Hay evidencias considerables del papel de IGF-I o IGF-IR en el mantenimiento de las células tumorales in vitro e in vivo. Los niveles de IGF-IR están elevados en los tumores de pulmón (Kaiser et al., J. Cancer Res. Clin Oncol. 119: 665-668, 1993; Moody et al., Life Sciences 52: 1161-1173, 1993; Macauley et al., Cancer Res., 50: 2511-2517, 1990), mama (Pollak et al., Cancer Lett. 38: 223-230, 1987; Foekens et al., Cancer Res. 49: 7002-7009, 1989; Cullen et al., Cancer Res. 49: 7002-7009, 1990; Arteaga et al., J. Clin. Invest. 84: 14181423, 1989), próstata y colon (Remaole-Bennet et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 75: 609616, 1992; Guo et al., Gastroenterol. 102: 1101-1108, 1992). La expresión desregulada de IGF-I en el epitelio prostático conduce a una neoplasia en ratones transgénicos (DiGiovanni et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3455-60, 2000). Además, IGF-I parece ser un estimulante autocrino de los gliomas humanos (Sandberg-Nordqvist et al., Cancer Res. 53: 2475-2478, 1993), mientras que IGF-I estimula el crecimiento de los fibrosarcomas que sobreexpresan IGF-IR (Butler et al., Cancer Res. 58: 3021-27, 1998). Por otro lado, las personas con concentraciones «normales elevadas» de IGF-I tienen un riesgo aumentado de cáncer común comparado con personas con concentraciones de IGF-I en el intervalo de «normal bajo» (Rosen et al., Trends Endocrinol. Metab. 10: 136-41, 1999). Para una recapitulación del papel que juega la interacción entre IGF-I y el receptor de IGF-I en el crecimiento de varios tumores humanos, véase Macaulay, Br. J. Cancer, 65: 311-320, 1992.

La restricción calórica es la intervención más eficaz y reproducible para aumentar la esperanza de vida en una variedad de especies animales, incluidos los mamíferos. También es el tratamiento más potente, que actúa ampliamente en la prevención del cáncer en modelos experimentales de carcinogénesis. Un mecanismo biológico clave, causante de muchos de sus efectos beneficiosos, es la ruta del factor de crecimiento insulinoide 1 (Hursting et al., Annu. Rev. Med. 54:131-52, 2003).

El documento EP-0629240B1 se refiere a la conversión de una secuencia de un anticuerpo en una secuencia de la línea germinal, mediante tecnología de ADN recombinante, para intentar disminuir la capacidad inmunógena cuando se administra a un paciente. El documento WO02/066058A1 se refiere a anticuerpos dirigidos frente al receptor del EGF (HER1) que están modificados de otra manera para reducir su propensión a inducir una respuesta inmune.

Considerando las funciones que tienen IGF-I y IGF-IR en trastornos tales como el cáncer y otros trastornos proliferativos cuando se sobreexpresan IGF-I y/o IGF-IR, y las funciones que tienen IGF-I y IGF-IR a bajas concentraciones en trastornos, cuando tanto IGF-I y/o IGF-IR se subexpresan, es deseable generar anticuerpos frente a IGF-IR que se puedan usar tanto para inhibir como para estimular IGF-IR. Tales anticuerpos se describen, por ejemplo, en el documento WO 02/05359, publicado el 11 de julio de 2002. El texto de esta publicación, incluyendo todas las secuencias descritas, se incorpora en la presente memoria como referencia. Los anticuerpos frente al IGF-IR también se describen en los documentos WO 03/100008, publicado el 4 de diciembre de 2003, WO 03/106621, publicado el 24 de diciembre de 2003 y WO 03/59951, publicado el 24 de julio de 2003. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano o una porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al receptor del factor de crecimiento insulinoide I humano (IGF-IR), que comprende al menos una mutación somática contenida en una región variable de dicho anticuerpo que se ha sustituido por un correspondiente residuo de aminoácido de línea germinal, en el que la región variable de la cadena ligera comprende los

números de aminoácidos 23 a 130 de la SEC Nº 5.

En otra realización, la secuencia de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo comprende tres mutaciones de marco conservado que la convierten en una secuencia de aminoácidos codificada por un gen A30 de la línea germinal. En una realización preferida, la región variable de la cadena ligera comprende los aminoácidos 23 a 130 de la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº 5. En una realización aún más preferida, la cadena ligera del anticuerpo humano comprende los aminoácidos 23 a 236 de ID SEC Nº 5.

En una realización de la invención, la secuencia de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo comprende dos mutaciones de marco conservado que la convierten en la secuencia de aminoácidos codificada por un gen DP-35 de la línea germinal. En una realización preferida, la región variable de la cadena pesada comprende los aminoácidos 20 a 144 de ID SEC Nº 3. En una realización aún más preferida, la cadena pesada del anticuerpo humano comprende los aminoácidos 20 a 470 de ID SEC Nº 3 y la cadena ligera comprende los aminoácidos 23 a 236 de ID SEC Nº 5.

En otra realización, la cadena pesada del anticuerpo de la invención carece de una lisina terminal. En concreto, la invención se refiere a un anticuerpo en el que la cadena pesada comprende los aminoácidos 20 a 469 de ID SEC Nº 3 y la cadena ligera comprende los aminoácidos 23 a 236 de ID SEC Nº 5.

La invención se refiere también a una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer, composición farmacéutica que comprende el anticuerpo humano modificado de la invención, en combinación con un agente antineoplásico, un agente quimioterapéutico o un agente antitumoral y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención se refiere también a un anticuerpo humano o una porción de unión a antígeno del mismo de la invención para su uso en el tratamiento del cáncer en seres humanos. En una realización, el tratamiento comprende la administración de un agente antineoplásico, antitumoral, antiangiogenético o quimioterapéutico junto con el anticuerpo de la presente invención.

La invención también se refiere a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que codifica una cadena pesada o una porción de unión a antígeno de ésta o una cadena ligera o una porción de unión a antígeno de ésta del anticuerpo de la presente invención. En una realización de la invención, la invención proporciona también un procedimiento para tratar un individuo en necesidad de ello con una cantidad eficaz de un ácido nucleico que codifica la cadena pesada y/o ligera o las porciones de unión a antígeno de éstas de un anticuerpo anti-IGF-IR.

La invención proporciona un vector que comprende un ácido nucleico aislado y una

célula huésped que comprende el vector. La invención comprende además una célula huésped que produce un anticuerpo que tiene la misma secuencia de aminoácidos que las cadenas pesada y ligera maduras de 2.12.1fx.

La invención también proporciona un procedimiento de producción y cultivo recombinante del anticuerpo codificado por el ácido nucleico.

La invención también se refiere a procedimientos de diagnóstico para detectar la presencia o la localización de un tejido que expresa IGF-IR utilizando un anticuerpo anti-IGFIR.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 muestra la secuencia de ADN que codifica la cadena pesada del anticuerpo 2.12.1fx, incluyendo la secuencia que codifica la secuencia señal utilizada para expresar el anticuerpo maduro (ID SEC Nº 1).

La figura 2 muestra la secuencia de ADN que codifica la cadena ligera del anticuerpo 2.12.1fx, incluyendo la secuencia que codifica la secuencia señal utilizada para expresar el anticuerpo maduro (ID SEC Nº 2).

La figura 3 muestra una alineación entre la secuencia de aminoácido de la cadena pesada del anticuerpo 2.12.1fx (ID SEC Nº 3) y la secuencia de la línea germinal DP-35 (3-11)/D33/JH6 (ID SEC Nº 4). La secuencia del anticuerpo 2.12.1fx se muestra encima de la secuencia de la línea germinal. Las secuencias señal están en cursiva y los CDR están subrayados. La región del dominio constante comienza con los aminoácidos ASTK y corresponde a los aminoácidos que comienzan en el 148 de la línea germinal y se extienden hasta el final de la secuencia. Las mutaciones de marco conservado (FR) están en los aminoácidos 21 y

116.

La figura 4 muestra una alineación entre la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo 2.12.1fx (ID SEC Nº 5) y la secuencia de la línea germinal A30/Jk1 (ID SEC Nº 6). La secuencia del anticuerpo 2.12.1fx se muestra encima de la secuencia de la línea germinal. Las secuencias señal están en cursiva y los CDR están subrayados. La región del dominio constante comienza con los aminoácidos TVAA y corresponde a los aminoácidos que comienzan en el 131 de la línea germinal y se extiende hasta el final de la secuencia. Las mutaciones de marco conservado (FR) son los aminoácidos 43, 125 y 129.

La figura 5 muestra cómo el anticuerpo anti-IGF-IR 2.12.1fx inhibe la unión de IGF-I a células 3T3-IGF-IR. Las figuras 6A y 6B muestran la capacidad del anticuerpo 2.12.1fx para bloquear la activación del IGF-IR mediada por el IGF-I como se ve por el descenso de la fosforilación de

tirosina asociada al receptor (figura 6A) y la capacidad del anticuerpo 2.12.1fx para inducir la regulación por disminución del IGF-1R en las células (figura 6B).

La figura 7 muestra que el anticuerpo anti-IGF-IR 2.12.1fx reduce el nivel de IGF-IR en tumores 3T3-IGF-IR.

Las figuras 8A y 8B muestran que el anticuerpo anti-IGF-IR inhibe el crecimiento tumoral in vivo de 3T3-IGF-IR por sí solo (figura 8A) o en combinación con adriamicina (figura 8B).

La figura 9 muestra la relación entre las concentraciones séricas del anticuerpo anti-IGF-IR 2.12.1fx y la regulación por disminución del IGF-IR a lo largo del tiempo en tumores 3T3-IGF-IR.

Las figuras 10A y 10B muestran que el anticuerpo anti-IGF-IR 2.12.1fx inhibe el crecimiento tumoral in vivo de Colo 205 por sí solo (figura 10A) o en combinación con 5fluorouracilo (5-FU) (figura 10B).

La figura 11 muestra una evaluación farmacocinética de una inyección intravenosa única del anticuerpo anti-IGF-IR 2.12.1fx en macacos de Java.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

A no ser que se defina de otra forma en la presente memoria, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la presente invención tendrán los significados que comprenden normalmente los expertos habituales en la técnica. Por otro lado, a no ser que se requiera de otro modo por el contexto, los términos en singular incluirán términos en plural y los términos en plural incluirán el término en singular. De forma general, las nomenclaturas utilizadas respecto a, y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química e hibridación de proteínas y ácidos nucleicos descritas en la presente memoria se conocen bien y se utilizan habitualmente en la técnica. Los procedimientos y las técnicas de la presente invención se realizan por lo general de acuerdo con procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica y en la forma en que se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y describen a lo largo de la presente memoria descriptiva, a no ser que se indique otra cosa. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), que se incorporan en la presente memoria como referencia. Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan según las especificaciones del fabricante, como se llevan a cabo habitualmente en la técnica o como se describe en la presente memoria. Las nomenclaturas utilizadas respecto a, y los procedimientos y las técnicas de laboratorio de química analítica, química orgánica sintética y química farmacéutica y médica descritas en la presente memoria se conocen bien y se utilizan habitualmente en la técnica. Las técnicas estándar se utilizan para la síntesis química, los análisis químicos, la preparación farmacéutica, la formulación y la administración y el tratamiento de pacientes.

Los siguientes términos, a menos que se indique otra cosa, se entenderán con los siguientes significados:

El término "polipéptido" abarca proteína nativas o artificiales, fragmentos de proteínas y análogos polipeptídicos de una secuencia de proteína. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico.

Los análogos no peptídicos se utilizan habitualmente en la industria farmacéutica como fármacos con propiedades análogas a las del péptido modelo. Estos tipos de compuestos no peptídicos se denominan «miméticos peptídicos» o «peptidomiméticos». Fauchere, J. Adv. Drug Res.15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS pág. 392 (1985); y Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987), los cuales se incorporan en la presente memoria como referencia. Dichos compuestos se desarrollan a menudo con la ayuda de la modelización molecular computarizada. Los miméticos peptídicos que son similares estructuralmente a los péptidos terapéuticamente útiles se pueden usar para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. Por lo general, los peptidomiméticos son similares estructuralmente al polipéptido prototipo (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o una actividad farmacológica deseada), tal como un anticuerpo humano, pero con uno o más enlaces peptídicos reemplazados opcionalmente por un enlace seleccionado del grupo constituido por: –CH2NH–, –CH2S–, –CH2–CH2–, –CH=CH–(cis y trans), –COCH2–, – CH(OH)CH2–, y –CH2SO–, mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso por un Daminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) se puede utilizar también para generar péptidos más estables. Además, los péptidos restringidos que comprenden una secuencia consenso o una variación de secuencias consenso sustancialmente idénticas, se pueden generar mediante procedimientos conocidos en la técnica (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), incorporados en la presente memoria como referencia); por ejemplo, mediante la adición de restos internos de cisteína capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.

Una «inmunoglobulina» es un tetrámero. En una inmunoglobulina natural, cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par con una cadena «ligera» (25 kDa aproximadamente) y una cadena «pesada» (50-70 kDa aproximadamente). El extremo amino de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento del antígeno. El extremo carboxilo de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras κ y λ. Las cadenas pesadas se clasifican en µ, �, γ, α ó ε, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA y IgE, respectivamente. En las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes se unen por una región «J» de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región

«D» de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase, de forma general, Fundamental Immunology cap. 7 (Paul, W., ed., 2ª ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (incorporado íntegramente como referencia para todos los propósitos). Las regiones variables de cada pareja de cadena ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo de manera que una inmunoglobulina intacta tiene dos sitios de unión.

Las cadenas de las inmunoglobulinas exhiben la misma estructura general de regiones de de marco conservado (FR) relativamente conservadas, unidas por tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par se alinean mediante las regiones de de marco conservado, habilitando la unión a un epítopo específico. Desde el extremo amino al extremo carboxilo, tanto las cadenas ligeras como las pesadas contienen los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de los aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989).

Un «anticuerpo» se refiere a una inmunoglobulina intacta. Las porciones de unión a antígeno se pueden producir por técnicas de ADN recombinante o mediante escisión química o enzimática de los anticuerpos intactos. Las porciones de unión a antígeno incluyen, entre otras, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb y fragmentos de la región determinante de complementariedad (CDR), anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos híbridos, dianticuerpos y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir una unión específica del antígeno con el polipéptido.

Un fragmento Fab es un fragmento monovalente que consta de los dominios VL, VH, CL y CH I; un fragmento F(ab')2 es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro a la región bisagra; un fragmento Fd consta de los dominios VH y CH1; un fragmento Fv consta de los dominios VL y VH de un brazo único de un anticuerpo; y un fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989) consta de un dominio VH.

Un anticuerpo de cadena única (scFv) es un anticuerpo en el que las regiones VL y

VH se aparean para formar moléculas monovalentes a través de un conector sintético que les habilita para formarse como una única cadena proteica. (Bird et al., Science 242:423426, 1988 y Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988). Los dianticuerpos son anticuerpos bivalentes y biespecíficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una única cadena polipeptídica, pero utilizando un conector que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena, y forzando por tanto a los dominios a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígeno (véase por ejemplo, Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993, y Poljak, R. J., et al., Structure 2:1121-1123, 1994). Uno o más CDR se pueden incorporar en una molécula de manera covalente o no covalente para convertirla en una inmunoadhesina. Una inmunoadhesina puede incorporar la(s) CDR como parte de una cadena polipeptídica mayor, puede unir covalentemente la(s) CDR a otra cadena polipeptídica, o puede incorporar la(s) CDR de forma no covalente. Las CDR permiten a la inmunoadhesina unirse específicamente con el antígeno particular de interés.

Un anticuerpo puede tener uno o más sitios de unión. Si hay más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos a otro o pueden ser distintos. Por ejemplo, una inmunoglobulina de origen natural tiene dos sitios de unión idénticos, un anticuerpo monocatenario o un fragmento Fab tienen un sitio de unión, mientras un anticuerpo «biespecífico» o «bifuncional» tiene dos sitios de unión distintos.

Un «anticuerpo aislado» es un anticuerpo que (1) no está asociado con componentes asociados de forma natural, incluidos otros anticuerpos asociados de forma natural, que lo acompañan en su estado nativo, (2) carece de otras proteínas de la misma especie, (3) se expresa por una célula de una especie diferente, ó (4) no aparece en la naturaleza. Los ejemplos de anticuerpos aislados incluyen un anticuerpo anti-IGF-IR que se haya purificado por afinidad utilizando IGF-IR, que es un anticuerpo aislado, un anticuerpo anti-IGF-IR que se ha sintetizado por un hibridoma u otra línea celular in vitro, y un anticuerpo anti-IGF-IR humano procedente de un ratón transgénico.

La expresión «anticuerpo humano» incluye todos los anticuerpos que tienen una o más regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina humana. En una realización preferida, todos los dominios variables y constantes proceden de secuencias de inmunoglobulinas humanas (un anticuerpo completamente humano). Estos anticuerpos se pueden preparar de muchas formas, como se describe a continuación.

Un «anticuerpo neutralizante» o «un anticuerpo inhibidor» es un anticuerpo que inhibe la unión de IGF-IR a IGF-I cuando un exceso del anticuerpo anti-IGF-IR reduce la cantidad de IGF-I unido al IGF-IR en al menos aproximadamente un 20%. En una realización preferida, el anticuerpo reduce la cantidad de IGF-I unido al IGF-IR en al menos 40%, más preferiblemente 60%, aún más preferiblemente 80%, o aún más preferiblemente 85%. El descenso de la unión se puede medir por cualquier medio conocido para el experto habitual en la técnica, por ejemplo, por un ensayo de unión competitiva in vitro.

Un "anticuerpo activador" es un anticuerpo que activa IGF-IR en al menos un aproximadamente 20% cuando se añade a una célula, tejido u organismo que expresa IGF-IR. En una realización preferida, el anticuerpo aumenta la actividad del IGF-IR en al menos 40%, más preferiblemente 60%, aún más preferiblemente 80%, o aún más preferiblemente 85%. En una realización más preferida, el anticuerpo activador se añade en presencia de IGF-I ó IGF-II. En otra realización preferida, la actividad del anticuerpo activador se mide mediante la determinación de la cantidad de autofosforilación en tirosina del IGF-IR.

Los fragmentos o los análogos de los anticuerpos se pueden preparar fácilmente por aquellos expertos habituales en la técnica siguiendo las instrucciones de esta memoria descriptiva. Los extremos amino y carboxilo preferidos de los fragmentos o análogos se encuentran cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios funcionales y estructurales se pueden identificar por comparación de los datos de secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos con las bases de datos de secuencias públicas o privadas. Preferiblemente, se utilizan procedimientos de comparación computarizada para identificar los motivos de secuencia o los dominios de conformación de proteína predichos que se encuentran en otras proteínas de estructura y/o función conocida. Se conocen los procedimientos para identificar las secuencias de proteína que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Bowie et al. Science 253:164 (1991).

La expresión "resonancia de plasmón superficial", como se usa en la presente memoria, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis en tiempo real de las interacciones bioespecíficas mediante la detección de las alteraciones en las concentraciones de proteínas con una matriz de un biosensor, utilizando por ejemplo el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.). Para descripciones adicionales, véase Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; y Johnsson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

El término "Koff " se refiere a la constante de disociación para la disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo / antígeno.

El término "Kd" se refiere a la constante de disociación de una interacción particular anticuerpo-antígeno.

Como se usa en la presente memoria, los veinte aminoácidos convencionales y sus

abreviaturas obedecen al uso convencional. Véase Immunology -A Synthesis (2ª edición, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), que se incorpora en la presente memoria como referencia. Los estereoisómeros (por ejemplo, Daminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, los aminoácidos no naturales tales como los aminoácidos α-, α-disustituidos, los N-alquilaminoácidos, el ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para los polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-N,N,N-trimetil-lisina, ε-N-acetil-lisina, Ofosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-N-metilarginina, y otros aminoácidos similares e iminoácidos (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación polipeptídica usada en la presente memoria, el sentido hacia la izquierda es el sentido amino terminal y el sentido hacia la derecha es el sentido hacia el carboxilo terminal, de acuerdo con la práctica estándar y el consenso.

El término «polinucleótido» como se aplica en la presente memoria se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, tanto de ribonucleótidos como de desoxirribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótidos. El término incluye formas mono-y bicatenarias de ADN.

La expresión «polinucléotido aislado» como se usa en la presente memoria se referirá a un polinucleótido de origen genómico, de ADNc, o un origen sintético o alguna combinación de éstos, que debido a su origen, el «polinucleótido aislado» (1) no se asocia con todas o con una fracción de un polinucleótido en la que el «polinucléotido aislado» se encuentra en la naturaleza, (2) se une de forma operativa a un polinucleótido al que no está unido de forma natural en la naturaleza, o (3) no se encuentra en la naturaleza como parte de una secuencia mayor.

La expresión «nucleótidos naturales» aplicada en la presente memoria incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. La expresión «nucleótidos modificados» aplicado en la presente memoria incluye nucleótidos con grupos glucídicos modificados o sustituidos y similares. La expresión «enlaces de oligonucleótido» aplicado en la presente memoria incluye enlaces de oligonucleótidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato y similares. Véase por ejemplo, LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pág. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. Patente de los Estados Unidos nº 5.151.510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990), cuyos descubrimientos se incorporan por este medio como referencia. Si se desea, un oligonucleótido puede incluir una marcador para su detección.

Las secuencias «enlazadas de forma operativa» incluyen tanto las secuencias de control de la expresión que están contiguas al gen de interés como las secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés. La expresión «secuencia de control de la expresión» como se usa en la presente memoria se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión y el procesado de las secuencias codificantes a las que se unen. Las secuencias de control de la expresión incluyen secuencias apropiadas de iniciación, terminación, promotoras y potenciadoras de la transcripción; señales eficaces de procesamiento del ARN tales como señales de poliadenilación y de corte y empalme; secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; secuencias que aumentan la eficacia de la traducción (es decir, la secuencia consenso Kozak); secuencias que aumentan la estabilidad de la proteína; y cuando se desee, secuencias que aumentan la secreción de proteínas. La naturaleza de dichas secuencias de control es distinta dependiendo del organismo huésped; en los organismos procariotas, tales secuencias de control incluyen por lo general el promotor, el sitio de unión ribosómico y la secuencia de terminación de la trascripción; en los organismos eucariotas, tales secuencias de control incluyen promotores y la secuencia de terminación de la trascripción. Se pretende que la expresión «secuencias de control» incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y puede incluir también componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias guía y secuencias de copartícipes de fusión.

El término «vector», como se usa en la presente memoria, pretende referirse a un ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un «plásmido», que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular al que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que segmentos de ADN adicionales se pueden ligar al genoma vírico. Determinados vectores son capaces de replicarse autónomamente en una célula huésped en la que se han introducido (por ejemplo, vectores bacterianos con un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de mamíferos) se pueden integrar en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped, y por este medio se replican junto con el genoma del huésped. Además, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que se han unido de forma operativa. Tales vectores se refieren en la presente memoria como «vectores de expresión recombinante » (o simplemente, «vectores de expresión»). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están normalmente en forma de plásmido. En la presente memoria descri`ptiva «plásmido» y «vector» se pueden utilizar indistintamente, ya que el plásmido es la forma de vector más usada comúnmente. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vectores de expresión, tales como vectores víricos (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adeno-asociados), que tienen funciones equivalentes.

La expresión «célula huésped recombinante» (o simplemente «célula huésped»), como se usa en la presente memoria, pretende referirse a una célula en la que se introduce un vector de expresión recombinante. Se debería comprender que tales términos pretenden referirse no sólo a la célula particular del estudio sino también a la progenie de dicha célula. Ya que ciertas modificaciones pueden tener lugar en las siguientes generaciones debido tanto a una mutación como a factores medioambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula progenitora, pero está incluida aún dentro del alcance de la expresión «célula huésped», como se usa en la presente memoria.

Una referencia a una secuencia del ácido nucleico abarca su cadena complementaria, a no ser que se especifique otra cosa. Por lo tanto, se debería entender que una referencia a un ácido nucleico con una secuencia particular incluye a su hebra complementaria, con su secuencia complementaria.

Como se usa en la presente memoria, los términos «marcador» o «marcado» se refieren a la incorporación de otra molécula en el anticuerpo. En una realización, el marcador es un trazador detectable, por ejemplo, la incorporación de un aminoácido marcado radiactivamente o la unión a un polipéptido de restos biotinilo que se pueden detectar mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina conteniendo un marcador fluorescente o una actividad enzimática que se puede detectar mediante procedimientos ópticos o colorimétricos). En otra realización, la etiqueta o el marcador puede ser terapéutico, por ejemplo, un conjugado de fármacos o una toxina. En la técnica se conocen diversos procedimientos de marcaje de polipéptidos y glucoproteínas y se pueden utilizar. Los ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a los siguientes: radioisotópos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111ln, 125I, 131I), marcadores fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, luminóforos lantánidos), marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano, β-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopos predeterminados de un polipéptido reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopos), agentes magnéticos, tales como quelatos de gadolinio, toxinas tales como la toxina de Bacillus pertussis, paclitaxel, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y análogos u homólogos de éstos. En algunas realizaciones, los marcadores se anclan mediante un brazo espaciador de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial.

El término «agente» se usa en la presente memoria para designar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto preparado de materiales biológicos. La expresión «fármaco o agente farmacéutico» como se usa en la presente memoria se refiere a un compuesto químico o una composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra adecuadamente a un paciente. Otros términos químicos se utilizan en la presente memoria según la práctica convencional en la técnica, como se muestra en The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)), incorporado en la presente memoria como referencia).

La expresión «agente antineoplásico» se usa en la presente memoria para referirse a agentes que tienen la propiedad funcional de inhibir el desarrollo o la progresión de un neoplasia en un humano, en concreto una lesión maligna (cancerosa), tal como un carcinoma, un sarcoma, un linfoma o leucemia. Con frecuencia, la inhibición de la metástasis es una propiedad de los antineoplásicos.

El anticuerpo puede ser una molécula de IgG, IgM, IgE, IgA o IgD. En una realización preferida, el anticuerpo es una IgG y es un subtipo lgG1, lgG2, lgG3 o lgG4. En una realización más preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR es de la subclase lgG2.

La clase y la subclase de los anticuerpos anti-IGF-IR se pueden determinar por cualquier procedimiento conocido en la técnica. Por lo general, la clase y la subclase de un anticuerpo se pueden determinar utilizando anticuerpos específicos para una clase y subclase particular del anticuerpo. Tales anticuerpos están disponibles comercialmente. La clase y la subclase se pueden determinar por ELISA, transferencia de Western blot así como por otras técnicas. De manera alternativa, la clase y la subclase se pueden determinar por secuenciación de todos o de una parte de los dominios constantes de las cadenas ligeras y/o pesadas de los anticuerpos, comparando sus secuencias de aminoácidos con las secuencias conocidas de aminoácidos de diversas clases y subclases de inmunoglobulinas, y determinando la clase y subclase de los anticuerpos.

La invención también proporciona un anticuerpo anti-IGF-IR que comprende secuencias variables codificadas por un gen humano κ. En una realización preferida, las secuencias variables están codificadas por cualquier familia génica Vκ A27, A30 ó O12. En una realización preferida, las secuencias variables están codificadas por un gen humano Vκ A30. En una realización más preferida, la cadena ligera contiene tres mutaciones de marco conservado que la convierten en una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de la línea germinal.

ID SEC Nº 1 proporciona la secuencia de ADN de la cadena pesada de 2.12.1fx. ID SEC Nº 2 proporciona la secuencia de ADN de la cadena ligera de 2.12.1fx. ID SEC Nº 3 proporciona la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de 2.12.1fx. ID SEC Nº 4 proporciona la secuencia de aminoácidos de la línea germinal DP-35. ID SEC Nº 5 proporciona la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de 2.12.1fx y ID SEC Nº 6 proporciona la secuencia de aminoácidos de la línea germinal A30/Jk1. Las secuencias mostradas son para los precursores inmaduros de los anticuerpos que incluyen una secuencia señal.

En una realización, el anticuerpo anti-IGF-IR comprende secuencias de la región variable codificadas por la familia génica humana VH DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 ó VIV4/4.35. En una realización preferida, la secuencia de la región variable procede de un gen humano VH DP-35. En una realización más preferida, la cadena pesada comprende dos mutaciones de marco conservado que la convierten en la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de la línea germinal.

Se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo anti-IGFIR de la invención.

En una realización, la molécula de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena ligera procede del gen A30, A27 ó O12 VK. En una realización preferida, la cadena ligera procede del gen A30 VK. En otra realización preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera comprende la región de unión procedente de Jκ1,Jκ2óJκ4.

La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende secuencia de molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 2.12.1fx

La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena pesada (VH) que procede del gen DP-35, DP-47, DP-71 ó VIV-4/4.35 VH, preferiblemente el gen DP-35 VH. En otra realización preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica VH comprende la región de unión procedente de JH6 ó JH5, más preferiblemente JH6. La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 2.12.1fx.

La molécula de ácido nucleico que codifica una o ambas de las cadenas ligeras y pesadas

completas de un anticuerpo humano o las regiones variables de éstas se puede obtener a partir de cualquier fuente que produce un anticuerpo humano. Los procedimientos de aislamiento de ARNm que codifica un anticuerpo se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. El ARNm se puede utilizar para producir ADNc para su uso en la reacción en cadena de la polimerasa (siglas en inglés, PCR) o la clonación del ADNc de los genes del anticuerpo. En una realización de la invención, se pueden obtener las moléculas de ácido nucleico a partir de un hibridoma que expresa un anticuerpo anti-IGF-IR, como se describió antes, preferiblemente un hibridoma que tenga como uno de sus copartícipes de fusión una célula de un animal transgénico que exprese genes de inmunoglobulina humana, tales como un XENOMOUSE™, un animal transgénico murino no humano o un animal transgénico no humano, no murino. Los anticuerpos anti-IGF-1R se pueden aplicar generalmente a anticuerpos humanos de la invención aparte de aquellos específicos para IGF1 R.

Una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada completa de un anticuerpo anti-IGF-IR se puede construir por fusión de una molécula de ácido nucleico que codifica el dominio variable de una cadena pesada o un dominio de unión a antígeno de ésta, con un dominio constante de un cadena pesada. Del mismo modo, una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-IGF-IR se puede construir por fusión de una molécula de ácido nucleico que codifica el dominio variable de una cadena ligera

o un dominio de unión a antígeno de ésta, con un dominio constante de una cadena ligera. Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican la cadena VH y VL se pueden convertir en genes del anticuerpo de longitud completa por su inserción en vectores de expresión que ya codifican las regiones constantes de la cadena pesada y de la cadena ligera, respectivamente, de manera que el segmento VH se une operativamente al segmento o segmentos de la región constante de la cadena pesada (CH) en el vector y el segmento VL se une operativamente al segmento de la región constante de la cadena ligera (CL) en el vector. De modo alternativo, las moléculas de ácidos nucleicos que codifican las cadenas VH o VL se convierten en genes del anticuerpo de longitud completa, por unión, por ejemplo, por ligación de la molécula de ácido nucleico que codifica una cadena VH con una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena CH, utilizando técnicas estándar de biología molecular. Se puede lograr lo mismo utilizando moléculas de ácidos nucleicos que codifican las cadenas VL y CL. Las secuencias de los genes de las regiones constantes de la cadena ligera y pesada humanas se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed., NIH Publ. nº 91-3242, 1991. Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesadas y/o ligeras en su longitud total, se pueden expresar después a partir de una célula en la que se han introducido y aislarse el anticuerpo anti-IGF-IR.

En otra realización, se puede aislar una molécula de ácido nucleico que codifica tanto la cadena pesada de un anticuerpo anti-IGF-IR, o un dominio de unión a antígeno de ésta, o la cadena ligera de un anticuerpo anti-IGF-IR o un dominio de unión a antígeno de ésta, a partir de un animal no humano y no murino que expresa los genes de la inmunoglobulina humana y se ha inmunizado con un antígeno del IGF-IR. En otra realización, la molécula de ácido nucleico se puede aislar a partir de una célula que produce el anticuerpo anti-IGF-IR, procedente de un animal no transgénico o a partir de un paciente humano que produce anticuerpos anti-IGF-IR. El ARNm se puede aislar de las células que producen el anticuerpo anti-IGF-IR por técnicas estándar, clonar y/o amplificar utilizando PCR y técnicas de construcción de genotecas, y seleccionar utilizando protocolos estándar para obtener moléculas de ácidos nucleicos que codifican las cadenas ligeras y pesadas anti-IGF-IR.

Las moléculas de ácidos nucleicos se pueden utilizar para expresar, de forma recombinante, grandes cantidades de anticuerpos anti-IGF-IR, como se describe a continuación. Las moléculas de ácidos nucleicos se pueden utilizar también para producir anticuerpos monocatenarios, inmunoadhesinas, dianticuerpos, anticuerpos mutados y derivados de anticuerpos, como se describe además a continuación.

En otra realización, las moléculas de ácidos nucleicos de la invención se pueden utilizar como sondas o cebadores en la PCR para secuencias específicas de anticuerpo. Por ejemplo, se puede utilizar una sonda de una molécula de ácido nucleico en procedimientos de diagnóstico o se puede utilizar un cebador para PCR de una molécula de ácido nucleico para amplificar las regiones de ADN que se pueden utilizar, entre otras cosas, para aislar secuencias de ácidos nucleicos para su uso en la producción de dominios variables de anticuerpos anti-IGF-IR. En una realización preferida, las moléculas de ácidos nucleicos son oligonucleótidos. En una realización más preferida, los oligonucleótidos provienen de regiones altamente variables de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo de interés.

La invención proporciona vectores que comprenden las moléculas de ácidos nucleicos de la invención que codifican la cadena pesada o la porción de unión a antígeno de ésta. La invención también proporciona vectores que comprenden las moléculas de ácidos nucleicos de la invención que codifican la cadena ligera o la porción de unión a antígeno de ésta. La invención también proporciona vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión, anticuerpos modificados, fragmentos de anticuerpos y sondas de éstos.

Para expresar los anticuerpos, o los fragmentos del anticuerpo de la invención, los

ADN que codifican las cadenas ligeras y pesadas parcialmente o en su totalidad, obtenidas como se describió antes, se insertan en vectores de expresión de manera que los genes se unen operativamente a las secuencias de control transcripcional y de la traducción. Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, cósmidos, YAC, episomas derivados del EBV y similares. El gen del anticuerpo se une al vector de manera que las secuencias de control transcripcional y de la traducción dentro del vector ejercen su función pretendida de regular la trascripción y la traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se seleccionan para ser compatibles con la célula huésped de expresión utilizada. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo se pueden insertar en distintos vectores. En una realización preferida, ambos genes se insertan dentro del mismo vector de expresión. Los genes de los anticuerpos se insertan en el vector de expresión mediante procedimientos estándar (por ejemplo, por ligación de los sitios de restricción complementarios en el fragmento del gen del anticuerpo y el vector, o por ligación de los extremos romos, si no existen sitios de restricción).

Un vector conveniente es aquél que codifica una secuencia funcionalmente completa de una CH o una CL de una inmunoglobulina humana, con sitios de restricción adecuados diseñados de manera que cualquier secuencia de VH o VL se puede insertar y expresar fácilmente. En tales vectores, el corte y empalme sucede normalmente entre el sitio de corte y empalme 5' (donador) en la región insertada J y el sitio de corte y empalme 3' (aceptor) que precede a la región C humana, y también en las regiones de corte y empalme que tienen lugar en los exones de CH humana. La poliadenilación y la terminación de la trascripción tienen lugar en los sitios cromosómicos nativos por debajo de las regiones codificantes. El vector de expresión recombinante puede codificar también un péptido señal que facilite la secreción de la cadena del anticuerpo desde una célula huésped. El gen de la cadena del anticuerpo se puede clonar en el vector de manera que el péptido señal se una en fase al extremo amino del gen de la cadena del anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína que no sea una inmunoglobulina).

Además de los genes de cadenas del anticuerpo, los vectores de expresión recombinante de la invención portan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de las cadenas del anticuerpo en una célula huésped. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluida la selección de las secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformar, el nivel deseado de expresión de la proteína, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión en una célula huésped de un mamífero incluyen elementos víricos que dirigen la expresión de altas concentraciones de proteína en células de mamíferos, tales como promotores y/o intensificadores derivados de LTR retrovíricos, citomegalovirus (CMV) (tales como el promotor/intensificador CMV), virus de simios tipo 40 (SV40) (tal como el promotor/intensificador SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor principal tardío del adenovirus (AdMLP)), los promotores del polioma y promotores fuertes de mamíferos, tales como los promotores de la inmunoglobulina nativa y de actina. Para una mayor descripción de los elementos reguladores víricos y las secuencias de éstos, véanse por ejemplo, la patente de los Estados Unidos nº 5.168.062 de Stinski, la patente de los Estados Unidos nº

4.510.245 de Bell et al. y la patente de los Estados Unidos nº 4.968.615 de Schaffner et al.

Además de los genes de las cadenas del anticuerpo y las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinante pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en las células huésped (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de las células huésped en las que se ha introducido el vector (véase por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos nº 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017). Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de la dihidrofolato-reductasa (DHFR) (para su uso en células huésped dhfr-con selección/amplificación con metotrexato) y el gen neo (para la selección con G418).

Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican la cadena pesada o una porción de unión a antígeno de ésta y/o la cadena ligera o una porción de unión a antígeno de ésta de un anticuerpo anti-IGF-IR de la invención, y los vectores que comprenden estas moléculas de ácidos nucleicos, se pueden utilizar para la transformación de una célula huésped apropiada. La transformación se puede realizar por cualquier procedimiento conocido para introducir polinucleótidos en una célula huésped. Los procedimientos para introducir polinucleótidos heterólogos en células de mamíferos se conocen bien en la técnica e incluyen la transfección mediada por dextrano, la precipitación con fosfato de calcio, la transfección mediada por polibreno, la fusión de protoplastos, la electroporación, la encapsulación de polinucléotido(s) en liposomas, la inyección por bombardeo con partículas y la microinyección directa del ADN en el núcleo. Además, las moléculas de ácidos nucleicos se pueden introducir en células de mamíferos por vectores víricos. Los procedimientos para transformar células se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos nº 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461, y 4.959.455

Las líneas celulares disponibles de mamíferos como huésped para la expresión se conocen bien en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC). Éstas incluyen, entre otras, las células de ovario del hámster chino (CHO), células NSO, células SP2, células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células del carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células A549, células 3T3 y otras líneas celulares. Las células huésped de mamíferos incluyen células de humano, ratón, rata, perro, mono, cerdo, cabra, bovinos, caballo y hámster. Las líneas celulares de preferencia particular se seleccionan por la determinación de las líneas celulares que tengan altos niveles de expresión. Otras líneas celulares que se pueden utilizar son líneas celulares de insectos, tales como las células Sf9, células de anfibios, bacterias, células vegetales y células fúngicas. Cuando los vectores de expresión recombinante codifican la cadena pesada o la porción de unión a antígeno de ésta, la cadena ligera y/o la porción de unión a antígeno de ésta, se introducen en células huésped de mamíferos, los anticuerpos se producen por cultivo de las células huésped durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped, o más preferiblemente, la secreción del anticuerpo al medio de cultivo en el que han crecido las células huésped. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo utilizando procedimientos estándar de purificación de proteínas.

Por otro lado, se puede aumentar la expresión de los anticuerpos de la invención (u otro restos de estos) a partir de la producción en líneas celulares, utilizando varias técnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de expresión del gen de la glutamina-sintetasa (el sistema GS) es una aproximación habitual para incrementar la expresión en determinadas condiciones. El sistema GS se describe en todo o en parte, respecto a las patentes europeas nº 0 216 846, 0 256 055 y 0 323 997 y la solicitud de la patente europea nº 89303964.4.

Es probable que los anticuerpos expresados por diferentes líneas celulares o en animales transgénicos tengan una glucosilación diferente unos de otros. Sin embargo, todos los anticuerpos codificados por las moléculas de ácidos nucleicos proporcionadas en la presente memoria, o que comprenden las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la presente memoria forman parte de la presente invención, independientemente de la glucosilación de los anticuerpos.

La invención también proporciona animales transgénicos no humanos que comprenden una o más moléculas de ácidos nucleicos de la invención que se pueden usar para producir anticuerpos de la invención. Los anticuerpos se pueden producir y recuperar de tejidos o fluidos corporales, tales como leche, sangre u orina, de cabras, vacas, caballos, cerdos, ratas, ratones, conejos, hámsteres u otros mamíferos. Véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos nº 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172 y 5.741.957. Como se ha descrito antes, los animales transgénicos no humanos que comprenden los locus de la inmunoglobulina humana se pueden producir por inmunización con IGF-IR o un fragmento de éste.

En otra realización, se generan animales transgénicos no humanos por introducción de una o más moléculas de ácidos nucleicos de la invención al animal, mediante técnicas transgénicas estándar. Véase Hogan, supra. Las células transgénicas utilizadas para generar el animal transgénico pueden ser células troncales embrionarias o células somáticas. Los organismos transgénicos no humanos pueden ser híbridos, heterocigotos no híbridos y homocigotos no híbridos. Véase, por ejemplo, Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach. Oxford University Press (2000); y Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999). En otra realización, los organismos transgénicos no humanos pueden tener una ruptura localizada y una sustitución que codifique una cadena pesada y/o una cadena ligera de interés. En una realización preferida, los animales transgénicos comprenden y expresan moléculas de ácidos nucleicos que codifican cadenas ligeras y pesadas que se unen específicamente al IGF-IR, preferiblemente al IGF-IR humano. En otra realización, los animales transgénicos comprenden moléculas de ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo modificado tal como un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo híbrido o un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos anti-IGF-IR se pueden generar en cualquier animal transgénico. En una realización preferida, los animales no humanos son ratones, ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado vacuno o caballos. El animal transgénico no humano expresa dichos polipéptidos codificados en la sangre, la leche, la orina, la saliva, las lágrimas, la mucosidad y otros fluidos corporales.

Los anticuerpos recombinantes humanos, además de los anticuerpos anti-IGF-IR descritos en la presente memoria, se pueden aislar por detección sistemática en una biblioteca de anticuerpos combinatorios recombinantes, preferiblemente una biblioteca de scFv de despliegue en bacteriófagos, preparados utilizando ADNc humano de VL y VH procedentes del ARNm de linfocitos humanos. En la técnica se conocen las metodologías para la preparación y la detección sistemática de dichas bibliotecas. Existen equipos de reactivos disponibles comercialmente para generar bibliotecas de despliegue en bacteriófagos (por ejemplo, el Recombinant Phage Antibody System de Pharmacia, nº en catálogo 27-9400-01; y el equipo de reactivos para despliegue en bacteriófagos SurfZAP™ de Stratagene, nº en catálogo 240612). Existen también otros procedimientos y reactivos que se pueden utilizar en la generación y detección sistemática de las bibliotecas de despliegue en anticuerpo (véase, por ejemplo, Ladner et al. Patente de los Estados Unidos nº 5.223.409; Kang et al. Publicación PCT nº WO 92/18619; Dower et al. Publicación PCT nº WO 91/17271; Winter et al. Publicación PCT nº WO 92/20791; Markland et al. Publicación PCT nº WO 92/15679; Breitling et al. Publicación PCT nº WO 93/01288; McCafferty et al. Publicación PCT nº WO 92/01047; Garrard et al. Publicación PCT nº WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; y Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982.

En una realización preferida, para aislar anticuerpos humanos anti-IGF-IR con las características deseadas, primero se utiliza un anticuerpo humano anti-IGF-IR como se describe en la presente memoria, para seleccionar las secuencias de cadena ligera y pesada humanas con una actividad de unión similar hacia el IGF-IR, utilizando procedimientos de impronta de epítopo descritos en Hoogenboom et al., Publicación PCT nº WO 93/06213. Las bibliotecas de anticuerpos utilizadas en este procedimiento son preferiblemente bibliotecas de scFv preparadas y detectadas sistemáticamente como se describe en McCafferty et al., Publicación PCT nº WO 92/01047, McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; y Griffiths et al., (1993) EMBO J 12:725-734. Las bibliotecas de anticuerpos scFv se detectan sistemáticamente utilizando preferiblemente IGF-IR humano como antígeno.

Una vez que se seleccionan los segmentos de VL y VH humana iniciales, se realizan experimentos «de mezcla y emparejamiento», en los que diferentes pares de los segmentos VL y VH inicialmente seleccionados se identifican sistemáticamente para la unión con IGF-IR, para seleccionar las combinaciones preferidas de los pares VL/VH. Además, para mejorar más aún la calidad del anticuerpo, los segmentos VL y VH del par o los pares VL/VH preferidos se pueden mutar al azar, preferiblemente dentro de la región CDR3 de VH y/o VL, en un procedimiento análogo al procedimiento de mutación somática in vivo responsable de la maduración de la afinidad de los anticuerpos durante una respuesta inmune natural. Esta maduración de la afinidad in vitro se puede realizar por la amplificación de las regiones VL y VH, utilizando los cebadores para PCR complementarios al CDR3 de VH o el CDR3 de VL respectivamente, dichos cebadores se han «atravesado» con una mezcla aleatoria de las cuatro bases de nucleótidos en posiciones determinadas, de manera que los productos resultantes de PCR codifican los segmentos VL y VH en los que se han introducido mutaciones aleatorias dentro de las regiones CDR3 de VL y/o VH. Estos segmentos VL y VH mutados aleatoriamente se pueden identificar sistemáticamente de nuevo para la unión al IGFIR.

Tras la identificación sistemática y el aislamiento de un anticuerpo anti-IGF-IR de la invención a partir de una biblioteca de despliegue de inmunoglobulinas recombinantes, los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo seleccionado se pueden recuperar del recipiente de despliegue (por ejemplo, del genoma del bacteriófago) y subclonar en otros vectores de expresión mediante tecnología del ADN recombinante. Si se desea, el ácido nucleico se puede manipular además para crear otras formas del anticuerpo de la invención, como se describe a continuación. Para expresar un anticuerpo humano recombinante aislado por detección sistemática de una biblioteca combinatoria, el ADN que codifica el anticuerpo se clona en un vector de expresión recombinante y se introduce en células huésped de mamíferos, como se ha descrito antes.

La clase de anticuerpo anti-IGF-IR obtenida como se ha descrito antes se puede cambiar por otro. En un aspecto de la invención, una molécula de ácido nucleico que codifica el VL o VH se aísla utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica de manera que no incluye ninguna secuencia de ácido nucleico que codifique la CL o CH. La molécula de ácido nucleico que codifica la VL o VH se une operativamente después a una secuencia de ácido nucleico que codifica una CL o CH de una diferente clase de inmunoglobulina. Esto se puede conseguir utilizando un vector o una molécula de ácido nucleico que comprenda una cadena CL o CH, como se ha descrito antes. Por ejemplo, un anticuerpo anti-IGF-IR que era originalmente IgM se puede cambiar a la clase IgG. Además, el cambio de clase se puede utilizar para convertir una subclase IgG por otra, por ejemplo, de lgG1 a lgG2. Un procedimiento preferido para producir un anticuerpo de la invención que comprende los isotipos deseados, comprende las etapas de aislamiento de un ácido nucleico que codifica la cadena pesada de una anticuerpo anti-IGF-IR y un ácido nucleico que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-IGF-IR, obtención de la región variable de la cadena pesada, ligación de la región variable de la cadena pesada con el dominio constante de una cadena pesada del isotipo deseado, expresión de la cadena ligera y la cadena pesada ligada en una célula, y la recuperación del anticuerpo anti-IGF-IR con el isotipo deseado.

Se pueden usar las moléculas de ácidos nucleicos descritas anteriormente para generar los derivados del anticuerpo usando técnicas y procedimientos conocidos para algún experto habitual en la técnica. Según la invención, uno o más restos de aminoácidos mutados en posición(es) seleccionada(s) se reemplazan después con un resto correspondiente de la línea germinal.

En otra realización, se puede generar un anticuerpo de fusión o una immunoadhesina

que comprenda todo o una parte de un anticuerpo anti-IGF-IR unido a otro polipéptido. En una realización preferida, sólo las regiones variables del anticuerpo anti-IGF-IR se unen al polipéptido. En otra realización preferida, el dominio VH de un anticuerpo anti-IGF-IR se une a un primer polipéptido, mientras el dominio VL de un anticuerpo anti-IGF-IR se une a un segundo polipéptido que se asocia con el primer polipéptido de manera que los dominios VH y VL pueden interaccionar con otro para formar un sitio de unión al anticuerpo. En otra realización preferida, el dominio VH se separa del dominio VL mediante un conector de manera que los dominios VH y VL pueden interaccionar con otro. El anticuerpo VH-conector-VL se une entonces al polipéptido de interés. El anticuerpo de fusión es útil para dirigir un polipéptido hacia una célula o tejido que exprese IGF-IR. El polipéptido puede ser una agente terapéutico, tal como un toxina, un factor de crecimiento u otra proteína reguladora, o puede ser una agente de diagnóstico, tal como una enzima que se pueda visualizar fácilmente, tal como la peroxidasa de rábano. Además, los anticuerpos de fusión se pueden generar donde dos (o más) anticuerpos se unen a cada uno de los demás. Este es útil si alguien desea generar un anticuerpo bivalente o polivalente en una única cadena polipeptídica, o si alguien desea generar un anticuerpo biespecífico.

Para generar un anticuerpo monocatenario (scFv) los fragmentos de ADN que codifican VH y VL se unen operativamente a otro fragmento que codifica un conector flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4 -Ser)3, de manera que las secuencias VH y VL se pueden expresar como una proteína monocatenaria contigua, con las regiones VL y VH unidas por el conector flexible (véase por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554). El anticuerpo monocatenario puede ser monovalente, si sólo se utiliza una única VH y VL, bivalente, si se utilizan dos VH y VL, o polivalente, si se utilizan más de dos VH yVL.

En otra realización, otros anticuerpos modificados se pueden preparar utilizando moléculas de ácidos nucleicos que codifican anti-IGF-IR. Por ejemplo, «Cuerpos Kappa» (III et al., Protein Eng 10: 949-57 (1997)), «Minicuerpos» (Martin et al., EMBO J 13: 5303-9 (1994)), «Dianticuerpos» (Holliger et al., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993)), ó «Janusins» (Traunecker et al., EMBO J 10: 3655-3659 (1991) y Traunecker et al. «Janusin: new molecular design for bispecific reagents» Int J Cancer Suppl 7:51-52 (1992)) se pueden preparar utilizando técnicas estándar de biología molecular, siguiendo las instrucciones de la memoria descriptiva.

Un anticuerpo o una fracción de anticuerpo de la invención se puede derivatizar o unir a otra molécula (por ejemplo otro péptido o proteína). Por lo general, los anticuerpos o una fracción de éstos se derivatizan de manera que la unión al IGF-IR no está afectada desfavorablemente por la derivatización o el marcaje. Por lo tanto, los anticuerpos y las fracciones de los anticuerpos de la invención pretenden incluir las formas intactas como las formas modificadas de los anticuerpos humanos anti-IGF-IR descritos en la presente memoria. Por ejemplo, un anticuerpo o una fracción de un anticuerpo de la invención puede estar unido funcionalmente (por acoplamiento químico, fusión génica, asociación no covalente u otras) a una o más distintas entidades moleculares distintas, tales como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un dianticuerpo), un agente de detección, un agente citotóxico, un agente farmacéutico o una proteína o péptido que puede mediar en la asociación del anticuerpo o una fracción de un anticuerpo con otra molécula (tal como una región central de estreptavidina o una etiqueta de polihistidina).

Un tipo de anticuerpo derivatizado se produce por el entrecruzamiento de dos o más anticuerpos (del mismo tipo o tipos diferentes, por ejemplo, para generar anticuerpos biespecíficos). Los entrecruzadores incluyen aquellos que son heterobifuncionales, con dos grupos reactivos claramente separados por un espaciador apropiado (por ejemplo, el éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) u homobifuncionales (por ejemplo, el suberato de disuccinimidilo). Tales conectores está disponibles en Pierce Chemical Company, Rockford, III.

Otro tipo de anticuerpo derivatizado es un anticuerpo marcado. Los agentes de detección útiles con los que un anticuerpo o una fracción de un anticuerpo de la invención se pueden derivatizar incluyen compuestos fluorescentes, incluyendo la fluoresceína, el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina, el cloruro de 5-dimetilamina-1-naftalensulfonilo, la ficoeritrina, los luminóforos lantánidos y similares. Un anticuerpo puede estar marcado también con enzimas que son útiles para la detección, tal como la peroxidasa de rábano, la β-galactosidasa, la luciferasa, la fosfatasa alcalina, la glucosa-oxidasa y similares. Cuando se marca un anticuerpo con una enzima detectable, se detecta mediante la adición de reactivos adicionales que utiliza la enzima para producir un producto de reacción que se pueda percibir. Por ejemplo, cuando la peroxidasa de rábano está presente, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina da lugar a un producto de reacción coloreado, que es detectable. Un anticuerpo se puede marcar también con biotina, y detectarse mediante la medida indirecta de la unión de avidina o estreptavidina. Un anticuerpo se puede marcar con un agente magnético, tal como el gadolinio. Un anticuerpo se puede marcar también con epítopos predeterminados de un polipéptido reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopos). En algunas realizaciones, los marcadores se unen mediante brazos espaciadores de distintas longitudes para reducir el impedimento estérico

potencial.

Un anticuerpo anti-IGF-IR se puede marcar también con un aminoácido marcado radiactivamente. El marcaje radiactivo se puede utilizar para intenciones de diagnóstico y terapéuticas. Por ejemplo, el marcaje radiactivo se puede utilizar para detectar los tumores que expresan IGF-IR mediante rayos X u otras técnicas de diagnóstico. Además, el marcaje radiactivo se puede utilizar terapéuticamente como toxina para células cancerosas o tumores. Los ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a los siguientes radioisótopos o radionúclidos: 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111ln, 1251,131I.

Un anticuerpo anti-IGF-IR se puede derivatizar tambiéncon un grupo químico tal como un polietilenglicol (PEG), un grupo metilo o etilo, o un grupo de hidrato de carbono. Estos grupos pueden ser útiles para mejorar las características biológicas del anticuerpo, por ejemplo, para aumentar la semivida sérica o para aumentar la unión al tejido.

La invención también se refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo en un mamífero que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización, dicha composición farmacéutica es para el tratamiento del cáncer tal como el cáncer cerebral, de pulmón, de células escamosas, de vejiga, gástrico, pancreático, de mama, de cabeza, de cuello, renal, de riñón, de ovario, de próstata, colorrectal, esofágico, ginecológico o de tiroides. Los pacientes que se pueden tratar con un compuesto de la invención según los procedimientos de esta invención incluyen, por ejemplo, pacientes a los que se les ha diagnosticado un mieloma múltiple, una neoplasia hematológica, cáncer hepático, un trastorno del timo, una enfermedad autoinmune mediada por linfocitos T, un trastorno endocrinológico, isquemia, un trastorno neurodegenerativo, cáncer de pulmón, cáncer óseo, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza y cuello, un melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de mama, tumores ginecológicos (por ejemplo, sarcomas uterinos, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina o carcinoma de la vulva), linfoma de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino (por ejemplo, cáncer del tiroides, paratiroides o las glándulas suprarrenales), sarcomas de tejidos blandos, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, leucemia crónica o aguda, tumores sólidos infantiles, linfomas linfocíticos, cáncer de vejiga, cáncer de riñón o uréter (por ejemplo, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal), o neoplasias del sistema nervioso central (por ejemplo, linfoma del SNC primario, tumores de la médula espinal, gliomas del tronco encefálico

o adenomas hipofisarios).

En otra realización, dicha composición farmacéutica se refiere a trastornos hiperproliferativos no cancerosos tales como, sin limitación, la restenosis tras una angioplastia y la soriasis. En otra realización, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas para el tratamiento de un mamífero que precisa la activación de IGF-IR, en la que la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo activador de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos activadores se pueden utilizar para tratar animales que carecen de suficiente IGF-I o IGF-II, o se pueden utilizar para tratar la osteoporosis, la debilidad o los trastornos en el que el mamífero secreta muy poca somatotropina activa o es incapaz de responder a la somatotropina.

El anticuerpo anti-IGF-IR de la invención se puede incorporar en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a un sujeto. Típicamente, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente memoria, «vehículo farmacéuticamente aceptable» incluye cualquier y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, antibacterianos y antifúngicos, retardantes isotónicos y de absorción y similares que son compatibles fisiológicamente. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de: agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de éstos. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como el manitol, el sorbitol, el cloruro sódico. Sustancias farmacéuticamente aceptables tales como agentes humectantes o pequeñas cantidades de sustancias auxiliares tales como humectantes o emulsionantes, conservantes o soluciones tamponadoras, que aumentan la vida útil de almacenamiento o la eficacia del anticuerpo o la fracción del anticuerpo.

Las composiciones de esta invención puede estar en una variedad de formas. Éstas incluyen, por ejemplo, formas farmacéuticas sólidas, semisólidas y líquidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo pretendido de administración y de aplicación terapéutica. Las composiciones típicas preferidas están en la forma de soluciones inyectables o infusibles, tales como composiciones similares a las utilizadas para la inmunización pasiva de humanos con otros anticuerpos. El modo preferido de administración es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). En una realización preferida, el anticuerpo se administra mediante infusión intravenosa o inyección. En otra realización preferida, el anticuerpo se administra mediante inyección intramuscular o subcutánea.

Las composiciones terapéuticas deben ser típicamente estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura organizada adecuada para una concentración elevada de fármaco. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar por incorporación del anticuerpo anti-IGF-IR en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o un conjunto de los componentes enumerados antes, como se desee, seguido de esterilización por filtración. Por lo general, las dispersiones se preparan por incorporación del principio activo en un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básico y el resto de componentes requeridos, a partir de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación son el secado al vacío y la liofilización, que proporcionan un polvo de un principio activo más cualquier componente adicional deseado, a partir de una disolución de éste previamente esterilizada por filtración. La fluidez adecuada de una solución se puede mantener, por ejemplo, mediante el empleo de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el empleo de tensioactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables se puede efectuar incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, sales monoestearato y gelatina.

El anticuerpo de la presente invención se puede administrar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, el modo/vía preferido de administración es intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intravenosa o por infusión. Como apreciará el experto, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. En una realización, el anticuerpo de la presente invención se puede administrar como una monodosis o se puede administrar como múltiples dosis.

En determinadas realizaciones, el principio activo se puede preparar con un vehículo que protegerá el compuesto frente a la liberación acelerada, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como el etileno vinil acetato, los polianhídridos, el ácido poliglicólico, el colágeno, los poliortoésteres y el ácido poliláctico. Muchos procedimientos para la preparación de tales formulaciones están patentados o por lo general se conocen por aquellos expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Los principios activos suplementarios se pueden incorporan también en la composición.

En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-IGF-IR de la invención se coformula y/o se coadministra con uno o más agentes terapéuticos adicionales, tales como un agente quimioterapéutico, un agente antineoplásico o un agente antitumoral. Por ejemplo, un anticuerpo anti-IGF-IR se puede coformular y/o coadministrar con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Estos agentes incluyen, sin limitación, anticuerpos que se unen a otros objetivos (por ejemplo, anticuerpos que se unen a uno o más factores de crecimientos o citocinas, a sus receptores de superficie celular o a IGF-I), proteínas que se unen a IGF-I, antineoplásicos, agentes quimioterapéuticos, antitumorales, oligonucleótidos complementarios frente a IGF-IR o IGF-I, análogos peptídicos que bloquean la activación de IGF-IR, IGF-IR soluble, y/o uno o más agentes químicos que inhiben la producción o la actividad de IGF-I, que se conocen en la técnica, por ejemplo, la octreotida. Para una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo activador, el anticuerpo anti-IGF-IR se puede formular con un factor que aumenta la proliferación celular o previene la apoptosis. Tales factores incluyen factores de crecimiento tales como el IGF-I, y/o análogos de IGF-I que activan al IGF-IR. Tales terapias de combinación pueden requerir dosis menores del anticuerpo anti-IGF-IR así como de agentes coadministrados, por lo que se evitan posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias. En una realización, el anticuerpo y uno o más agentes terapéuticos adicionales.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una «cantidad terapéuticamente eficaz» o una «cantidad profilácticamente eficaz» de un anticuerpo o de una fracción de un anticuerpo de la invención. Una «cantidad terapéuticamente eficaz» se refiere a una cantidad eficaz, a unas dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el efecto terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo

o una fracción del anticuerpo puede oscilar según factores tales como la patología, la edad, el sexo y el peso de la persona, y la capacidad del anticuerpo o de una fracción de un anticuerpo para inducir una respuesta deseada en la persona. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también aquella en la que los efectos terapéuticamente beneficiosos superan en valor a cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo o de la fracción del anticuerpo. Una «cantidad profilácticamente eficaz» se refiere a una cantidad eficaz, a unas dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el efecto profiláctico deseado. Típicamente, toda vez que se utilice una dosis profiláctica en pacientes antes de o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.

Las pautas de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, se puede administrar una inyección intravenosa rápida única, se pueden administrar varias dosis separadas en el tiempo o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente como indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Se puede formular una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o que comprende una terapia de combinación que comprende el anticuerpo y uno o más agentes terapéuticos adicionales, mediante dosis únicas o múltiples. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosis unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma de unidad de dosificación como se usa en la presente memoria se refiere a unidades físicamente separadas adecuadas como dosis unitarias para los mamíferos a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada del principio activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico necesitado. La especificación para las formas de unidad de dosificación de la invención están fijadas por y dependen directamente de (a) las características concretas del principio activo y el efecto terapéutico o profiláctico particular a conseguir, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de la composición de tal principio activo para el tratamiento de la sensibilidad en pacientes. Una formulación particularmente útil es el anticuerpo anti-IGF-IR a 5 mg/ml en un tampón de citrato sódico 20 mM, pH 5,5, NaCI 140mM y polisorbato 80 a 0,2 mg/ml.

Un intervalo no limitante a modo de ejemplo para una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un anticuerpo o una fracción de un anticuerpo de la invención es 0,1-100 mg/kg, más preferiblemente 0,5-50 mg/kg, más preferiblemente 1-20 mg/kg, y aún más preferiblemente 1-10 mg/kg. Se apreciará que los valores de dosificación pueden oscilar con el tipo y la gravedad de la dolencia a aliviar. Se debe remarcar que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y la gravedad de la afección que se vaya a tratar. Se comprenderá además que para cualquier sujeto concreto, las pautas específicas de dosificación se deben ajustar en el tiempo de acuerdo con las necesidades individuales y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de dosificación planteados en la presente memoria sirven como ejemplos y no pretenden limitar el alcance o la práctica de la composición reivindicada. En una realización, la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un anticuerpo o una fracción de éste de unión a antígeno se administra junto con uno o más agentes terapéuticos adicionales.

En otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo anti-IGF-IR de la invención para uso en el tratamiento del cáncer en una dosis menor de 300 mg al mes.

Otro aspecto de la presente invención proporciona kits que comprenden los

anticuerpos anti-IGF-IR y las composiciones farmacéuticas que comprenden estos anticuerpos. Un kit puede incluir agentes de diagnóstico o terapéuticos, además del anticuerpo o la composición farmacéutica. Un kit puede incluir también las instrucciones para su uso en un procedimiento diagnóstico o terapéutico. En una realización preferida, el kit incluye el anticuerpo o una composición farmacéutica de éste y un agente de diagnóstico que se pueda usar en un procedimiento descrito a continuación. En otra realización preferida, el kit incluye el anticuerpo o una composición farmacéutica de éste y uno o más agentes terapéuticos, tales como un agente antineoplásico adicional, un agente antitumoral o un agente quimioterapéutico, que se pueda utilizar en un procedimiento descrito a continuación.

Esta invención se refiere también a composiciones farmacéuticas para inhibir el crecimiento celular anómalo en un mamífero que comprende una cantidad de un compuesto de la invención en combinación con una cantidad de un agente quimioterapéutico, en el que las cantidades del compuesto, la sal, el solvato o el profármaco y del agente quimioterapéutico son eficaces juntas en la inhibición del crecimiento celular anómalo. Muchos agentes quimioterapéuticos se conocen actualmente en la técnica. En una realización, los agentes quimioterapéuticos se seleccionan del grupo constituido por inhibidores de la mitosis, compuestos alquilantes, antimetabolitos, antibióticos intercalantes, inhibidores de factores de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de la topoisomerasa, compuestos antisupervivencia, modificadores de la respuesta biológica, antihormonas, por ejemplo anti-andrógenos y antiangiogénicos.

Los antiangiogénicos, tales como los inhibidores de la MMP-2 (metaloproteinasa de matriz 2), inhibidores de la MMP-9 (metaloproteinasa de matriz 9), y inhibidores de la COX-II (ciclooxigenasa II), se pueden usar junto con un compuesto de la invención. Entre los ejemplos de inhibidores útiles de COX-II se incluyen CELEBREX™ (alecoxib), valdecoxib y rofecoxib. Los ejemplos de inhibidores útiles de las metaloproteinasas de matriz se describen en los documentos WO 96/33172 (publicada el 24 de octubre de 1996), WO 96/27583 (publicada el 7 de marzo de 1996), solicitud de Patente Europea nº 97304971.1 (presentada el 8 de julio de 1997), solicitud de Patente Europea nº 99308617.2 (presentada el 29 de octubre de 1999), WO 98/07697 (publicada el 26 de febrero de 1998), WO 98/03516 (publicada el 29 de enero de 1998), WO 98/34918 (publicada el 13 de agosto de 1998), WO 98/34915 (publicada el 13 de agosto de 1998), WO 98/33768 (publicada el 6 de agosto de 1998), WO 98/30566 (publicada el 16 de julio de 1998), Publicación de Patente Europea

606.046 (publicada el 13 de julio de 1994), Publicación de Patente Europea 931.788 (publicada el 28 de julio de 1999), WO 90/05719 (publicada el 31 de mayo de 1990), WO 99/52910 (publicada el 21 de octubre de 1999), WO 99/52889 (publicada el 21 de octubre de 1999), WO 99/29667 (publicada el 17 de junio de 1999), Solicitud Internacional PCT nº PCT/IB98/01113 (presentada el 21 de julio de 1998), solicitud de Patente Europea nº 99302232.1 (presentada el 25 de marzo de 1999), solicitud de patente de Gran Bretaña número 9912961.1 (presentada el 3 de junio de 1999), Solicitud provisional de los Estados Unidos nº 60/148.464 (presentada el 12 de agosto de 1999), Patente de los Estados Unidos

5.863.949 (presentada el 26 de enero de 1999), Patente de los Estados Unidos 5.861.510 (presentada el 19 de enero de 1999), y la publicación de Patente Europea 780.386 (publicada el 25 de junio de 1997). Los inhibidores de MMP preferidos son aquellos que no presentan dolor articular. Los inhibidores más preferidos son aquellos que inhiben selectivamente la MMP2 y/o la MMP-9 frente a las otras metaloproteinasas de matriz (es decir MMP-1, MMP-3, MMP4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 y MMP-13). Algunos ejemplos específicos de inhibidores de MMP útiles en la presente invención son AG3340, RO 32-3555, RS 13-0830 y los compuestos enumerados en la siguiente lista: ácido 3[[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonil]-(1-hidroxicarbamoil-ciclopentil)-amino]-propiónico; hidroxiamida del ácido 3-exo-3-[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-8-oxabiciclo[3.2.1]octano-3-carboxílico; hidroxiamida del ácido (2R, 3R) 1-[4-(2-cloro-4-fluorobenciloxi)-bencenosulfonil]-3-hidroxi-3-metil-piperidin-2-carboxílico; hidroxiamida del ácido 4-[4(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-tetrahidro-piran-4-carboxílico; ácido 3-[[4-(4-fluorofenoxi)-bencenosulfonil]-(1-hidroxicarbamoil-ciclobutil)-amino]-propiónico; hidroxiamida del ácido 4-[4-(4-cloro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-tetrahidro-piran-4-carboxílico; hidroxiamida del ácido (R) 3-[4-(4-cloro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-tetrahidro-piran-3-carboxílico; hidroxiamida del ácido (2R, 3R)1-[4-(4-fluoro-2-metil-benciloxi)-bencenosulfonil]-3-hidroxi-3metil-piperidin-2-carboxílico; ácido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonil]-(1-hidroxicarbamoil-1metil-etil)-amino]-propiónico ; ácido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonil]-(4-hidroxicarbamoiltetrahidro-piran-4-il)-amino]-propiónico; hidroxiamida del ácido 3-exo-3-[4-(4-cloro-fenoxi)bencenosulfonilamino]-8-oxa-biciclo[3.2.1]octano-3-carboxílico; hidroxiamida del ácido 3endo-3-[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-8-oxa-biciclo[3.2.1]octano-3-carboxílico; y hidroxiamida del ácido (R) 3-[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-tetrahidro-furan-3carboxílico; y las sales y los solvatos farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos.

Un compuesto de la invención se puede utilizar también con inhibidores de la transducción de señales, tales como agentes que pueden inhibir las respuestas del EGF-R (receptor del factor de crecimiento epidérmico), tales como anticuerpos anti-EGF-R, anticuerpos anti-EGF y moléculas inhibidoras del EGF-R; inhibidores del VEGF (factor de crecimiento del endotelio vascular), tales como receptores del VEGF y moléculas que puedan inhibir el VEGF; y los inhibidores de receptor erbB2, tales como las moléculas orgánicas o los anticuerpos que se unen al receptor erbB2, por ejemplo, HERCEPTIN™ (Genentech, Inc.). Los inhibidores de EGF-R se describen por ejemplo en los documentos WO 95/19970 (publicada el 27 de julio de 1995), WO 98/14451 (publicada el 9 de abril de 1998), WO 98/02434 (publicada el 22 de enero de 1998), y Patente de los Estados Unidos 5.747.498 (presentada el 5 de mayo de 1998), y dichas sustancias se pueden utilizar en la presente invención como se describe en la presente memoria. Los agentes que inhiben el EGFR incluyen, pero no se limitan a los anticuerpos monoclonales C225 y anti-EGFR 22Mab (ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200 (Merck KgaA), EMD-5590 (Merck KgaA), MDX-447/H-477 (Medarex Inc. and Merck KgaA), y los compuestos ZD-1834, ZD-1838 y ZD-1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI-166/CGP75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), leflunomida (Pharmacia/Sugen), CI1033 (Warner Lambert Parke Davis), CI-1033/PD 183.805 (Warner Lambert Parke Davis), CL

387.785 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), Naamidina A (Bristol Myers Squibb), RC-3940-II (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), OLX103 (Merck & Co.), VRCTC-310 (Ventech Research), toxina de fusión EGF (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperial Cancer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Cancer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Cancer Center), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) y la vacuna contra el EGF-R (York Medical/Centro de Immunología Molecular (CIM)). Éstos y otros agentes que inhiben el EGF-R se pueden utilizar en la presente invención.

Los inhibidores de VEGF, por ejemplo SU-5416 y SU-6668 (Sugen Inc.), SH-268 (Schering), y NX-1838 (NeXstar) se pueden combinar también con el compuesto de la presente invención. Los inhibidores de VEGF se describen, por ejemplo en el documento WO 99/24440 (publicado el 20 de mayo de 1999), la Solicitud Internacional PCT PCT/IB99/00797 (presentada el 3 de mayo de 1999), el documento WO 95/21613 (publicado el 17 de agosto de 1995), el documento WO 99/61422 (publicado el 2 de diciembre de 1999), la Patente de los Estados Unidos 5.834.504 (presentada el 10 de noviembre de 1998), WO 98/50356 (publicado el 12 de noviembre de 1998), la Patente de los Estados Unidos 5.883.113 (presentada el 16 de marzo de 1999), la Patente de los Estados Unidos 5.886.020 (presentada el 23 de marzo de 1999), la Patente de los Estados Unidos 5.792.783 (presentada el 11 de agosto de 1998), el documento WO 99/10349 (publicado el 4 de marzo de 1999), el documento WO 97/32856 (publicado el 12 de septiembre de 1997), WO 97/22596 (publicado el 26 de junio de 1997), el documento WO 98/54093 (publicado el 3 de diciembre de 1998), el documento WO 98/02438 (publicado el 22 de enero de 1998), el documento WO 99/16755 (publicado el 8 de abril de 1999), y el documento WO 98/02437 (publicado el 22 de enero de 1998), incorporados todos en la presente memoria íntegramente como referencia. Otros ejemplos de algunos inhibidores específicos de VEGF útiles en la presente invención son el IM862 (Cytran Inc.); y la angiozima, una ribozima sintética de Ribozyme y Chiron. Estos y otros inhibidores de VEGF se pueden utilizar en la presente invención como se describe en la presente memoria.

Los inhibidores del receptor erbB2, tales como el GW-282974 (Glaxo Wellcome plc), y los anticuerpos monoclonales AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc.) y 2B-1 (Chiron), se pueden combinar además con el compuesto de la invención, por ejemplo, aquellos indicados en el documento WO 98/02434 (publicado el 22 de enero de 1998), el documento WO 99/35146 (publicado el 15 de julio de 1999), el documento WO 99/35132 (publicado el 15 de julio de 1999), el documento WO 98/02437 (publicado el 22 de enero de 1998), el documento WO 97/13760 (publicado el 17 de abril de 1997), el documento WO 95/19970 (publicado el 27 de julio de 1995), la Patente de los Estados Unidos 5.587.458 (expedida el 24 de diciembre de 1996) y la Patente de los Estados Unidos 5.877.305 (expedida el 2 de marzo de 1999), que se incorporan todos por este medio en la presente memoria íntegramente como referencia. Los inhibidores del receptor erbB2 útiles en la presente invención se describen también en la Solicitud Provisional de los Estados Unidos nº 60/117.341, presentada el 27 de enero de 1999, y en la Solicitud Provisional de los Estados Unidos nº 60/117.346, presentada el 27 de enero de 1999, incorporadas ambas íntegramente en la presente memoria como referencia. Los compuestos y las sustancias inhibidores del receptor erbB2 descritos en las solicitudes PCT, patentes de los Estados Unidos, y solicitudes provisionales de los Estados Unidos mencionadas anteriormente, así como otros compuestos y sustancias que inhiben el receptor erbB2, se pueden utilizar con el compuesto de la presente invención según la presente memoria.

El anticuerpo de la invención se puede usar también con un anticuerpo anti-CTLA-4, tales como los descritos en la patente de los Estados Unidos 6.682.736, que incluye un anticuerpo con la secuencia del anticuerpo 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 ó 12.9.1.1. El anticuerpo se puede utilizar también con anticuerpos anti-CD40, tales como los descritos en el documento WO 03040170 publicado el 15 de mayo de 2003, que incluye uno con la secuencia del anticuerpo 3.1. 1,3. 1.1H-A78T,

3.1. 1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A,

23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 ó 24.2. Los anticuerpos también se pueden combinar con sustancias anti-integrina, tales como

anticuerpos anti-integrina.

Algunos ejemplos de agentes específicos con los que se puede combinar el anticuerpo incluyen los siguientes:

Agentes alquilantes: N-óxido de una mostaza nitrogenada, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalan, busulfanmitobronitol, carboquona, tiotepa, ranimustina, nimustina y temozolomida;

Agentes antimetabolitos: metotrexato, 6-mercaptopurina, ribósido, mercaptopurina, 5fluorouracilo, tegafur, doxifluridina, carmofur, citarabina, citarabina, ocfosfato, enocitabina, S-1, gemcitabina, fludarabina y capecitabina;

Agentes antibióticos: actinomicina D, doxorubicina, daunorubicina, neocarzinostatina, bleomicina, peplomicina, mitomicina C, aclarubicina, pirarubicina, epirubicina, zinostatina estimalámero y idarubicina;

antitumorales vegetales: vincristina, vinblastina, vindeshina, etopósido, sobuzoxano, docetaxel, paclitaxel y vinorelbina;

los compuestos coordinados con platino: cisplatino, carboplatino, nedaplatino y oxaliplatino;

derivados de la camptotecina: irinotecán, topotecán y camptotecina;

el inhibidor de la tirosina quinasa gefitinib;

agentes anti-CD20: rituximab, tositumomab y ibritumomab tiuxetán;

interferones: interferón alfa, interferón α-2a, interferón α-2b, interferón β, interferón γ-1a and interferón γ-n1;

modificadores de la respuesta biológica: krestina, lentinan, sizofiran, picibanil y ubenimex; y

otros agentes antitumorales: mitoxantrona, l-asparaginasa, procarbazina, dacarbazina, hidroxicarbamida, pentostatina y tretinoína.

Además, el anticuerpo de la invención se puede combinar con los antineoplásicos exemestano, edotecarina (J-107088) y SU11248.

El anticuerpo anti-IGF-IR se puede usar para detectar IGF-IR en una muestra biológica in vitro o in vivo. El anticuerpo anti-IGF-IR se puede usar en un inmunoensayo convencional, incluyendo, sin limitación, un ELISA, un RIA, citometría de flujo, inmunohistoquímica de tejido, inmunotransferencia o inmunoprecipitación. El anticuerpo anti-IGF-IR de la invención se puede utilizar para detectar IGF-IR de humanos. En otra realización, el anticuerpo anti-IGF-IR se puede usar para detectar IGF-IR en primates del Viejo Mundo tales como los macacos de Java y de la India, chimpancés y monos. La invención proporciona un procedimiento para detectar un anticuerpo anti-IGF-IR en una muestra biológica que comprende el contacto de una muestra biológica con un anticuerpo anti-IGF-IR de la invención y la detección del anticuerpo unido al anti-IGF-IR, para detectar el IGF-IR en la muestra biológica. En una realización, el anticuerpo anti-IGF-IR está marcado directamente con un marcador detectable. En otra realización, el anticuerpo anti-IGF-IR (el primer anticuerpo) no está marcado y un segundo anticuerpo u otra molécula que se puede unir al anticuerpo anti-IGF-IR está marcado. Como se conoce bien para alguien experto en la técnica, se selecciona un segundo anticuerpo que sea capaz de unirse específicamente a una clase y especie específica del primer anticuerpo. Por ejemplo, si el anticuerpo anti-IGF-IR es una IgG humana, entonces el anticuerpo secundario puede ser un anti-lgG humana. Otras moléculas que se pueden unir a los anticuerpos incluyen, sin limitación, la proteína A y la proteína G, ambas disponibles comercialmente, por ejemplo, en Pierce Chemical Co.

Los marcadores adecuados para el anticuerpo o el secundario se han descrito anteriormente, e incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, agentes magnéticos y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen la peroxidasa de rábano, la fosfatasa alcalina, β-galactosidasa

o la acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina-fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye el luminol; un ejemplo de un agente magnético incluye el gadolinio; y los ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 35S ó 3H.

En una realización alternativa, IGF-IR se puede ensayar en una muestra biológica por un inmunoensayo competitivo utilizando muestras estándar de IGF-IR marcados con un agente detectable y un anticuerpo anti-IGF-IR no marcado. En esta prueba, la muestra biológica, las muestras estándar de IGF-IR marcado y el anticuerpo anti-IGF-IR se combinan y se determina la cantidad de la muestra estándar de IGF-IR marcado unida al anticuerpo no marcado. La cantidad de IGF-IR en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad de la muestra estándar de IGF-IR marcado unida al anticuerpo anti-IGF-IR.

Se pueden usar los inmunoensayos descritos antes para varios propósitos. En una realización, el anticuerpo anti-IGF-IR se puede utilizar para detectar IGF-IR en células en un cultivo celular. En una realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR se puede utilizar para determinar el nivel de fosforilación en tirosina, autofosforilación en tirosina del IGF-IR, y/o la cantidad de IGF-IR sobre la superficie celular después del tratamiento de las células con diversos compuestos. Este procedimiento se puede utilizar para compuestos de ensayo que se pueden utilizar para activar o inhibir IGF-IR. En este procedimiento, se trata una muestra de células con un compuesto de ensayo durante un periodo de tiempo mientras otra muestra se deja sin tratar. Si se va a medir la autofosforilación en tirosina, las células se lisan y se mide la fosforilación en tirosina de IGF-IR utilizando un inmunoensayo descrito antes o como se ha descrito previamente utilizando un ELISA. Si se va a medir la concentración total de IGF-IR, las células se lisan y se mide la concentración total de IGF-IR utilizando uno de los inmunoensayos descritos antes.

Un inmunoensayo preferido para determinar la fosforilación en tirosina de IGF-IR o para medir las concentraciones totales de IGF-IR es un ELISA o una transferencia de western. Si sólo se va a medir el nivel de IGF-IR en la superficie celular, las células no se lisan y se miden los niveles de IGF-IR en la superficie celular utilizando uno de los inmunoensayo descritos antes. Un inmunoensayo preferido para determinar los niveles de IGF-IR en la superficie celular incluye las etapas de marcaje de proteínas de la superficie celular con un marcador detectable, tal como biotina o 125I, la inmunoprecipitación del IGF-IR con un anticuerpo anti-IGFIR y la detección posterior del IGF-IR marcado. Otro inmunoensayo preferido para la determinación de la localización de IGF-IR, por ejemplo, las concentraciones en la superficie celular, se realiza mediante inmunohistoquímica. Los procedimientos tales como ELISA, RIA, inmunotransferencia, inmunohistoquímica, marcaje de la superficie celular de proteínas integrales de membrana e inmunoprecipitación se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow and Lane, supra. Además, los inmunoensayos se pueden escalar para una detección sistemática de elevado rendimiento con el fin de analizar un gran número de compuestos para la activación o para la inhibición de IGF-IR.

El anticuerpo anti-IGF-IR de la invención se puede usar también para determinar los niveles de IGF-IR en un tejido o en células procedentes de un tejido. En una realización preferida, el tejido es un tejido enfermo. En una realización más preferida, el tejido es un tumor o una biopsia de éste. En una realización preferida del procedimiento, un tejido o una biopsia de éste se extraen de un paciente. El tejido o la biopsia se utilizan después en un inmunoensayo para determinar, por ejemplo, los niveles de IGF-IR, los niveles de IGF-IR en la superficie celular, los niveles de fosforilación en tirosina de IGF-IR o la localización de IGF-IR mediante los procedimientos discutidos anteriormente. El procedimiento se puede usar para determinar si un tumor expresa IGF-IR a niveles elevados.

El procedimiento de diagnóstico descrito antes se puede utilizar para determinar si un tumor expresa elevadas concentraciones de IGF-IR, que puede ser indicativo de que el tumor responderá bien al tratamiento con el anticuerpo anti-IGF-IR anticuerpo. El procedimiento de diagnóstico se puede utilizar también para determinar si un tumor es potencialmente canceroso, si expresa niveles elevados de IGF-IR o si es benigno, si expresa concentraciones bajas de IGF-IR. Por otro lado, el procedimiento de diagnóstico se puede utilizar también para determinar si el tratamiento con el anticuerpo anti-IGF-IR (véase a continuación) está induciendo a un tumor a expresar concentraciones menores de IGF-IR y/o a expresar niveles menores de autofosforilación en tirosina, y por esto, se puede utilizar para determinar si el tratamiento tiene éxito. Por lo general, un procedimiento para determinar si un anticuerpo anti-IGF-IR disminuye la fosforilación en tirosina comprende las etapas de medida del nivel de fosforilación en tirosina en una célula o un tejido de interés, la incubación de la célula o el tejido con un anticuerpo anti-IGF-IR o una porción de unión a antígeno de éste, y la posterior medida de nuevo del nivel de fosforilación en tirosina en la célula o el tejido. Se puede medir la fosforilación en tirosina de IGF-IR o de otra(s) proteína(s). El procedimiento de diagnóstico se puede emplear también para determinar si un tejido o una célula no están expresando concentraciones lo suficientemente elevadas de IGF-IR o concentraciones lo suficientemente elevadas de IGF-IR activado, como puede ser el caso de pacientes con enanismo, osteoporosis o diabetes. Un diagnóstico en el que los niveles de IGF-IR o de IGF-IR activo son demasiado bajas se podría utilizar para el tratamiento con anticuerpos activadores anti-IGF-IR, IGF-I u otros agentes terapéuticos para aumentar las concentraciones o la actividad de IGF-IR.

Teniendo en cuenta la capacidad del anticuerpo de la presente invención para disminuir el IGF-1R en linfocitos periféricos, se puede utilizar una «estrategia de marcador biológico» para controlar la expresión de IGF-1R en células circulantes normales y/o tumorales de pacientes tratados con el anticuerpo de la invención. También se pueden utilizar otros anticuerpos, tales como los anticuerpos descritos en el documento WO 02/05359, publicado el 11 de julio de 2002. Estas células pueden incluir, pero no están limitadas a, células CD19+, y pueden incluir también a todos los leucocitos tales como los monocitos, los granulocitos y los linfocitos.

El anticuerpo de la presente invención se puede utilizar también in vivo para localizar los tejidos y órganos que expresan IGF-IR. En una realización preferida, el anticuerpo anti-IGFIR se puede utilizar para localizar tumores que expresan IGF-IR. El procedimiento comprende las etapas de administración de un anticuerpo anti-IGF-IR o de una composición farmacéutica de éste a un paciente en necesidad de tal prueba diagnóstica y someter al paciente a un análisis por formación de imagen para determinar la localización de los tejidos que expresan IGF-IR. Los análisis por formación de imagen se conocen bien en la técnica médica, e incluyen, sin limitación, el análisis por rayos X, la formación de imágenes por resonancia magnética (IRM) o la tomografía computarizada (TC). En otra realización del procedimiento, se obtiene una biopsia de un paciente para determinar si el tejido de interés expresa IGF-IR en lugar de someter al paciente a un análisis por formación de imagen. En una realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR puede marcarse con un compuesto detectable que se pueda analizar por imagen en un paciente. Por ejemplo, el anticuerpo se puede marcar con un compuesto de contraste, tal como el bario, que se pueda usar por análisis de rayos X, o un agente magnético de contraste, tal como un quelato de gadolinio, que se pueda utilizar para IRM o TC. Otros agentes de marcaje incluyen sin limitación, radioisótopos, tal como el 99Tc. En otra realización, el anticuerpo anti-IGF-IR no se marcará y se analizará por formación de imagen mediante la administración de un segundo anticuerpo u otra molécula que sea detectable y que se pueda unir al anticuerpo anti-IGF-IR.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para inhibir la actividad de IGF-IR por la administración de un anticuerpo anti-IGF-IR de la invención a un paciente en necesidad de ello. El anticuerpo de la presente invención se puede utilizar de forma terapéutica. En otra realización preferida, el IGF-IR es humano y el paciente es un paciente humano. De forma alternativa, el paciente puede ser un mamífero que expresa un IGF-IR con el que reacciona de forma cruzada el anticuerpo anti-IGF-IR. El anticuerpo se puede administrar a un mamífero no humano que exprese un IGF-IR con el que reaccione de forma cruzada el anticuerpo (es decir un primate, o un macaco de Java o de la India) para propósitos veterinarios o como modelo animal de una enfermedad humana. Tales modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de los anticuerpos de esta invención.

En una realización preferida, un anticuerpo anti-IGF-IR se puede administrar a un paciente que tiene un tumor que expresa IGF-IR. Un tumor puede ser un tumor sólido o puede ser un tumor no sólido, tal como un linfoma. En una realización más preferida, un anticuerpo anti-IGF-IR se puede administrar a un paciente que tiene un tumor que expresa IGF-IR y que es canceroso. En una realización aún más preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR se administra a un paciente que tiene un tumor de pulmón, mama, próstata o colon. En una realización sumamente preferida, el procedimiento hace que el tumor no aumente en peso o volumen o disminuya en peso o volumen. En otra realización, el procedimiento permite que el IGF-IR se interiorice en el tumor. En una realización preferida, el anticuerpo es 2.12.1fx, o comprende una cadena pesada, una cadena ligera o una región de unión a antígeno de éste.

En otra realización preferida, un anticuerpo anti-IGF-IR se puede administrar a un paciente que expresa de forma inadecuada niveles elevados de IGF-I, por ejemplo un trastorno en el que la actividad de IGF-IR es nociva. Como se usa en la presente memoria, la expresión «un trastorno en el que la actividad de IGF-IR es nociva» pretende incluir enfermedades y otros trastornos en los que la presencia de niveles elevados de IGF-IR en un paciente que sufre el trastorno han mostrado ser y/o se sospecha que sean responsables de la patofisiología del trastorno o sean un factor que contribuye a un agravamiento del trastorno. Por lo tanto, un trastorno en el que unos niveles elevados de actividad de IGF-IR son nocivos, es un trastorno en el que se espera que la inhibición de la actividad de IGF-IR alivie los síntomas o la progresión del trastorno. Tales trastornos se pueden evidenciar, por ejemplo, por un aumento en los niveles de IGF-IR sobre la superficie celular o en una autofosforilación en tirosina aumentada de IGF-IR en células o tejidos afectados de un paciente que padece el trastorno. El aumento en los niveles de IGF-IR se puede detectar, por ejemplo, utilizando un anticuerpo anti-IGF-IR como se describe antes.

En un aspecto, el anticuerpo anti-IGF-IR se usa para tratar estados no neoplásicos en los que los altos niveles de IGF-I y/o IGF-IR están asociadas con el estado o la enfermedad no cancerosa. En una realización, el procedimiento comprende la etapa de administración de un anticuerpo anti-IGF-IR a un paciente que sufre un estado patológico no canceroso originado o agravado por niveles elevados de IGF-I y/o de niveles elevados o actividad elevada de IGFIR. En una realización preferida, el estado patológico no canceroso es acromegalia, gigantismo, soriasis, aterosclerosis, restenosis del músculo liso de los vasos sanguíneos o una proliferación microvascular inadecuada, tal como la encontrada como complicación de la diabetes, especialmente del ojo. En una realización más preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR ralentiza el progreso del estado patológico no canceroso. En una realización más preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR detiene o revierte, al menos en parte, el estado patológico no canceroso.

Se conoce en la técnica que un nivel elevado de expresión de IGF-I puede dar lugar a una variedad de cánceres comunes. En una realización más preferida, el anticuerpo antiIGF-IR se administra a un paciente con cáncer de próstata, glioma o fibrosarcoma. En una realización aún más preferida, el procedimiento provoca la detención de la proliferación anómala del cáncer, o que no aumente en peso o volumen o que disminuya en peso o volumen.

En una realización, dicho procedimiento se refiere al tratamiento de cánceres tales como el cáncer cerebral, de células escamosas, de vejiga, gástrico, pancreático, de mama, de cabeza, de cuello, esofágico, de próstata, colorrectal, de pulmón, renal, de riñón, de ovario, ginecológico o de tiroides. Los pacientes que se pueden tratar con un compuesto de la invención según los procedimientos de esta invención incluyen, por ejemplo, pacientes a los que se les ha diagnosticado un mieloma múltiple, un tumor líquido, cáncer hepático, un trastorno del timo, una enfermedad autoinmune mediada por linfocitos T, un trastorno endocrinológico, isquemia, un trastorno neurodegenerativo, cáncer de pulmón, cáncer óseo, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza y cuello, un melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de mama, tumores ginecológicos (por ejemplo, sarcomas uterinos, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina o carcinoma de la vulva), linfoma de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino (por ejemplo, cáncer del tiroides, paratiroides o las glándulas suprarrenales), sarcomas de tejidos blandos, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, leucemia crónica o aguda, tumores sólidos infantiles, linfomas linfocíticos, cáncer de vejiga, cáncer de riñón o uréter (por ejemplo, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal), o neoplasias del sistema nervioso central (por ejemplo, linfoma del SNC primario, tumores de la médula espinal, gliomas del tronco encefálico o adenomas hipofisarios).

El anticuerpo se puede administrar de una vez, pero más preferiblemente se administra varias veces. El anticuerpo se puede administrar desde tres veces al día a una vez cada seis meses. La administración puede ser a tiempos tales como de tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses y una vez cada seis meses. El anticuerpo se puede administrar por vía oral, mucosal, bucal, intranasal, inhalable, intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral, intratumoral o tópica. El anticuerpo se puede administrar en un lugar alejado de la localización del tumor. El anticuerpo se puede administrar también continuamente por medio de una minibomba. El anticuerpo se puede administrar una vez, al menos dos veces o durante al menos el periodo de tiempo hasta que la dolencia se trate, se mitigue o se cure. El anticuerpo se administrará por lo general durante el tiempo en que esté presente el tumor, de manera que el anticuerpo provoque que el tumor o el cáncer deje de crecer o disminuya en peso o volumen. El anticuerpo se administrará por lo general como parte de una composición farmacéutica como se ha descrito antes. La dosificación del anticuerpo estará generalmente en el intervalo de 0,1100 mg/kg, más preferiblemente 0,5-50 mg/kg, más preferiblemente 1-20 mg/kg, y aún más preferiblemente 1-10 mg/kg. La concentración sérica del anticuerpo se puede medir por cualquier procedimiento conocido en la técnica. El anticuerpo se puede administrar también profilácticamente con el fin de prevenir que aparezca un cáncer o un tumor. Esto puede ser especialmente útil en pacientes con un nivel «normal alto» de IGF-I, ya que estos pacientes han mostrado tener un riesgo mayor a desarrollar cánceres comunes. Véase Rosen et al., supra.

En otro aspecto, el anticuerpo anti-IGF-IR se puede coadministrar con otros agentes terapéuticos, tales como fármacos o moléculas antineoplásicas, a un paciente que tenga un trastorno hiperproliferativo, tal como un cáncer o un tumor. En un aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para el tratamiento del trastorno hiperproliferativo en un mamífero que comprende la administración a dicho mamífero de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención junto con un antitumoral seleccionado del grupo constituido por, pero no limitado a, inhibidores de la mitosis, agentes alquilantes, antimetabolitos, agentes intercalantes, inhibidores de factores de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de la topoisomerasa, modificadores de la respuesta biológica, anti-hormonas, inhibidores de quinasas, inhibidores de las metaloproteasas de matriz, agentes terapéuticos genéticos y anti-andrógenos. En una realización más preferida, el anticuerpo se puede administrar con un agente antineoplásico, tal como la adriamicina o el paclitaxel. En otra realización preferida, el anticuerpo o la terapia de combinación se administran junto con radioterapia, quimioterapia, terapia fotodinámica, intervención quirúrgica u otra inmunoterapia. En otra realización más preferida, el anticuerpo se administrará con otro anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo anti-IGF-IR se puede administrar con un anticuerpo u otro agente que se conozca por inhibir la proliferación celular en un tumor o un cáncer, por ejemplo, un anticuerpo o un agente que inhiba el receptor erbB2, el EGF-R, el CD20 o el VEGF.

La coadministración del anticuerpo con un agente terapéutico adicional (terapia de combinación) abarca la administración de una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-IGF-IR y el agente terapéutico adicional y la administración de dos o más composiciones farmacéuticas por separado, comprendiendo una el anticuerpo anti-IGF-IR y la(s) otra(s) el/los agente(s) terapéutico(s) adicional(es). Además, aunque por lo general la coadministración o la terapia de combinación se refieren a que el anticuerpo y los agentes terapéuticos adicionales se administran a la vez, también incluye casos en los que el anticuerpo y los agentes terapéuticos adicionales se administran a diferentes tiempos. Por ejemplo, el anticuerpo se puede administrar una vez cada tres días, mientras que el agente terapéutico adicional se administra una vez al día. De manera alternativa, el anticuerpo se puede administrar antes o después del tratamiento del trastorno con el agente terapéutico adicional, por ejemplo después de que haya fallado el tratamiento con un agente adicional en un paciente. Igualmente, la administración del anticuerpo anti-IGF-IR se puede realizar antes

o después de radioterapia, terapia fotodinámica o una intervención quirúrgica.

El anticuerpo y uno o más agentes terapéuticos adicionales (terapia de combinación) se pueden administrar una vez, dos veces o al menos el periodo de tiempo hasta que la dolencia se trate, se mitigue o se cure. Preferiblemente, la terapia de combinación se administra varias veces. La terapia de combinación se puede administrar desde tres veces al día a una vez cada seis meses. La administración puede ser a tiempos tales como tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses y una vez cada seis meses, o se puede administrar continuamente por medio de una minibomba. La terapia de combinación se puede administrar por vía oral, mucosal, bucal, intranasal, inhalable, intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral, intratumoral o tópica. La terapia de combinación se puede administrar en un lugar alejado de la localización del tumor. La terapia de combinación se administrará por lo general durante el tiempo en que esté presente el tumor, siempre que el anticuerpo provoque que el tumor o el cáncer deje de crecer o disminuya en peso o volumen.

En una realización adicional más, el anticuerpo anti-IGF-IR se marca con un marcador radiactivo, una inmunotoxina o una toxina, o es una proteína de fusión que comprende un péptido tóxico. El anticuerpo anti-IGF-IR o la proteína de fusión con el anticuerpo anti-IGF-IR dirige el marcador radiactivo, la inmunotoxina, la toxina o el péptido tóxico a la célula cancerosa

o tumoral que expresa IGF-IR. En una realización preferida, el marcador radiactivo, la inmunotoxina, la toxina o el péptido tóxico se interiorizan después de que el anticuerpo antiIGF-IR se una al IGF-IR en la superficie de la célula cancerosa o tumoral.

En otro aspecto, el anticuerpo anti-IGF-IR se puede utilizar terapéuticamente para inducir la apoptosis de células específicas en un paciente en necesidad de ello. En muchos casos, las células señaladas para apoptosis son células cancerosas o tumorales. Con esto, en una realización preferida, la invención proporciona un procedimiento de inducción de apoptosis mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-IGF-IR a un paciente en necesidad de ello. En una realización preferida, el anticuerpo es 2.12.1fx, o comprende una cadena pesada, una cadena ligera o la región de unión a antígeno de éste. En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento de administración de un anticuerpo activador anti-IGF-IR a un paciente en necesidad de ello. En una realización, el anticuerpo activador o la composición farmacéutica se administran a un paciente en necesidad de ello en una cantidad eficaz para aumentar la actividad de IGFIR. En una realización más preferida, el anticuerpo activador es capaz de recuperar la actividad normal del IGF-IR. En otra realización preferida, el anticuerpo activador se puede administrar a un paciente que tenga una estatura pequeña, una neuropatía, un descenso de la masa muscular u osteoporosis. En otra realización preferida, el anticuerpo activador se puede administrar con uno o más factores que aumentan la proliferación celular, previenen la apoptosis o aumentan la actividad del IGF-IR. Tales factores incluyen factores de crecimiento tales como el IGF-I, y/o análogos del IGF-I que activan al IGF-IR. En una realización preferida, el anticuerpo es 2.12.1fx, o comprende una cadena pesada, una cadena ligera o una porción de unión a antígeno del mismo.

Las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención se pueden administrar a un paciente en necesidad de ello mediante la terapia génica. El tratamiento puede ser in vivo o ex vivo. En una realización preferida, las moléculas de ácidos nucleicos que codifican tanto una cadena pesada como una cadena ligera se administran a un paciente. En una realización más preferida, las moléculas de ácidos nucleicos se administran de manera que se integren de forma estable en el cromosoma de los linfocitos B, ya que estas células están especializadas para producir anticuerpos. En una realización preferida, se transfectan o infectan ex vivo linfocitos B precursores y se retransplantan en un paciente con necesidad de ello. En otra realización, se infectan in vivo linfocitos B precursores u otras células utilizando un virus conocido para infectar el tipo celular de interés. Los vectores típicos utilizados para terapia génica incluyen liposomas, plásmidos o vectores víricos, tales como retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados. Después de la infección in vivo o ex vivo, los niveles de expresión del anticuerpo se pueden controlar tomando una muestra de un paciente tratado y utilizando cualquier inmunoensayo conocido en la técnica y comentado en la presente memoria.

En una realización preferida, el procedimiento de terapia génica comprende las etapas de administración de una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico aislado que codifica la cadena pesada o la porción de unión a antígeno de ésta del anticuerpo humano o la porción de éste y expresar la molécula de ácido nucleico. En otra realización, el procedimiento de terapia génica comprende las etapas de administración de una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico aislado que codifica la cadena ligera o la porción de unión a antígeno de ésta del anticuerpo humano o la porción de éste y expresar la molécula de ácido nucleico. En un procedimiento más preferido, el procedimiento de terapia génica comprende las etapas de administración de una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico aislado que codifica la cadena pesada o la porción de unión a antígeno de ésta del anticuerpo humano o la porción de éste y una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico aislado que codifica la cadena ligera o la porción de unión a antígeno de ésta del anticuerpo humano o la porción de éste y expresar las moléculas de ácido nucleico. El procedimiento de terapia génica puede comprender también la etapa de administración de otro agente anticáncer, tal como el paclitaxel, el tamoxifeno, el 5-fluorouracilo, la adriamicina o el CP-358.774.

Los números ID de las secuencias de la solicitud son:

ID SEC Nº 1: secuencia de ADN que codifica la cadena pesada del

anticuerpo 2.12.1fx incluyendo la secuencia que codifica la secuencia señal utilizada

para expresar el anticuerpo maduro.

ID SEC Nº 2: secuencia de ADN que codifica la cadena ligera del anticuerpo

2.12.1fx incluyendo la secuencia que codifica la secuencia señal utilizada para expresar

el anticuerpo maduro.

ID SEC Nº 3: secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo

2.12.1fx.

ID SEC Nº 4: secuencia de aminoácidos de la línea germinal DP-35.

ID SEC Nº 5: secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo

2.12.1fx.

ID SEC Nº 6: secuencia de aminoácidos de la línea germinal A30/Jk1.

Con el fin de que esta invención se pueda comprender mejor, se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos sirven sólo para propósitos ilustrativos y no se tienen que interpretar como limitantes del alcance de la invención de ningún modo.

EJEMPLO I: Generación del hibridoma que produce el anticuerpo anti-IGF-IR

El anticuerpo de la invención se preparó, se seleccionó y se analizó como sigue:

Se inmunizaron ratones XENOMICE™ de ocho a diez semanas de edad por vía intraperitoneal o en sus almohadillas de las patas traseras tanto con el dominio extracelular del IGF-IR humano (10 µg/dosis/ratón), o con células 3T3-IGF-IR ó 300.19-IGF-IR, que son dos líneas celulares transfectadas que expresan IGF-IR humano en sus membranas plasmáticas (10 x 106 células/ dosis/ratón). Esta dosis se repitió de cinco a siete veces durante un periodo de tres a ocho semanas. Cuatro días antes de la fusión, los ratones recibieron una última inyección del dominio extracelular del IGF-IR humano en PBS. Los linfocitos de los ganglios linfáticos y del bazo procedentes de los ratones inmunizados se fusionaron con la línea celular del mieloma no secretor P3-X63-Ag8.653 y se sometieron a la selección en medio HAT como se ha descrito antes (Galfre and Milstein, Meteds Enzymol. 73:3-46, 1981). Se seleccionó un hibridoma, 2.12.1, que producía anticuerpos monoclonales específicos para IGF-IR para su posterior estudio y se depositó en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, el 12 de diciembre de 2000 con el siguiente número de depósito:

Hibridoma Depósito nº

2.12.1 PTA-2792

Este hibridoma, y otros que producen anticuerpos específicos para IGF-IR se describen el

documento WO 02/05359, publicado el 11 de julio de 2002. El texto de esta publicación, incluyendo todas las secuencias descritas, se incorpora por la presente como referencia.

Dos mutaciones de marco conservado de la cadena pesada y tres mutaciones de marco conservado de la cadena ligera del anticuerpo 2.12.1 se corrigieron hacia la línea germinal para producir el anticuerpo 2.12.1fx.

Todos los cambios para generar las mutaciones 2.12.1fx se realizaron utilizando el equipo de reactivos para mutagénesis dirigida QuikChange (Stratagene™) preparando un plásmido con un sitio diana para la mutación por desnaturalización del plásmido e hibridación con los cebadores oligonucleótidos que contienen la mutación deseada. La actividad no desplazante de hebra de la ADN polimerasa Pfu Turbo se empleó para ampliar e incorporar los cebadores mutágenos dando lugar a hebras circulares melladas. La digestión del ADN molde parental metilado y no mutado con DpnI siguió con la transformación con el ADN bicatenario circular y mellado en células supercompetentes XL1Blue. Tras la transformación, las células supercompetentes XL1Blue repararon la mella en el plásmido mutado. Los plásmidos que contenían las mutaciones se seleccionaron y se verificó la secuencia.

La figura 1 muestra la secuencia de ADN que codifica la cadena pesada del anticuerpo 2.12.1fx, incluyendo la secuencia que codifica la secuencia señal utilizada para expresar el anticuerpo maduro (ID SEC Nº 1). La figura 2 muestra la secuencia de ADN que codifica la cadena ligera del anticuerpo 2.12.1fx, incluyendo la secuencia que codifica la secuencia señal utilizada para expresar el anticuerpo maduro (ID SEC Nº 2). La figura 3 muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo 2.12.1fx (ID SEC Nº 3) con la correspondiente secuencia de la línea germinal DP-35 (3-11)/D3-3/JH6 (ID SEC Nº 4). La secuencia del anticuerpo 2.12.1fx se muestra encima de la secuencia de la línea germinal. Las secuencias señal están en cursiva y los CDR están subrayados. La región del dominio constante comienza con los aminoácidos ASTK y corresponde a los aminoácidos que comienzan en el 148 en la línea germinal y se extienden hasta el final de la secuencia. Las mutaciones de marco conservado (FR) son los aminoácidos 21 y 116. La figura 4 muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo 2.12.1fx (ID SEC Nº 5) con la correspondiente secuencia de la línea germinal A30/Jk1 (ID SEC Nº 6). La secuencia del anticuerpo 2.12.1fx se muestra encima de la secuencia de la línea germinal. Las secuencias señal están en cursiva y los CDR están subrayados. La región del dominio constante comienza con los aminoácidos TVAA y corresponde a los aminoácidos que comienzan en el 131 en la línea germinal y se extienden hasta el final de la secuencia. Las mutaciones de marco conservado (FR) están en los aminoácidos 43, 125 y 129.

5

10

15

20

25

30

46

EJEMPLO II: Bloqueo de la unión IGF-I/IGF-IR mediado por anticuerpos

Los experimentos de ELISA se realizaron para determinar cuantitativamente la capacidad del anticuerpo de la invención para inhibir la unión del IGF-I al IGF-IR en un análisis celular. Se cultivaron células NIH-3T3 transfectadas con IGF-IR (5x104/ml) en placas con 100 µl de medio DMEM rico en glucosa enriquecido con L-glutamina (0,29 mg/ml), SFB al 10% inactivado con calor, y 500 µg/ml de geneticina, penicilina y estreptomicina cada una en placas de 96 pocillos con fondo en U. Las placas se incubaron a 37°C y CO2 al 5% durante toda la noche para dejar a las células que se adhieran. El medio se decantó de las placas y se reemplazó con 100 µl por pocillo de medio recién preparado. Para ensayo, se diluyó el anticuerpo en medio de ensayo (medio DMEM rico en glucosa enriquecido con L-glutamina, SFB al 10% inactivado con calor, 200 µg/ml BSA y 500 µg/ml de geneticina, penicilina y estreptomicina cada una) hasta la concentración final deseada. Todas las muestras se realizaron por triplicado. Las placas se incubaron a 37 °C durante diez minutos. El [125I]-IGF-I se diluyó hasta una concentración de 1 µCi/ml en medio de ensayo y se añadió 50 µl por pocillo de la placa. Como control de la radioactividad de fondo, se añadió IGF-I no marcado hasta una concentración final de 100 ng/ml. Las placas se incubaron durante 10 minutos a 37 °C y el medio se decantó por transferencia cuidadosa sobre toallas de papel y lavado doble con medio de ensayo. Las células se lisaron por adición de 50 µl de NaOH 0,1 N, SDS al 0,1% y las placas se agitaron durante cinco minutos a temperatura ambiente. Las muestras se transfirieron a una placa de centelleo, se añadió 150 µl de OptiPhase Supermix y la señal se leyó utilizando un contador Wallace Micro-Beta.

La tabla I y la figura 5 muestran los resultados de este experimento realizado con el anticuerpo de esta invención. Este experimento demostró que el anticuerpo de la invención inhibía específicamente la unión de [125I]-IGF-I a las células que sobreexpresan IGF-IR.

Tabla I

Anticuerpo monoclonal

CI50

2.12.1fx

0,4 µg/ml

EJEMPLO III: Inhibición mediada por anticuerpos de la fosforilación de IGF-IR inducida por IGF-l

Los experimentos de ELISA se realizaron con el fin de determinar si el anticuerpo de esta invención era capaz de bloquear la activación de IGF-IR mediada por IGF-I. La activación de IGF-IR mediada por IGF-I se detectó por una disminución de la fosforilación de tirosina asociada al receptor.

Preparación de las placas de ELISA

Las placas de ELISA de captura se prepararon por adición de 100 µl de tampón de bloqueo (albúmina sérica bovina al 3% [BSA] en solución salina tamponada con Tris [TBS]) a cada pocillo de placas de 96 pocillos recubiertas con proteína G ReactiBind (Pierce). Las placas se incubaron por agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo anti-IGF-IR SC-713 panespecífico de conejo (Santa Cruz) se diluyó en tampón de bloqueo a una concentración de 5 µg/ml. A cada pocillo se añadieron 100 µl del anticuerpo diluido. Las placas se incubaron con agitación durante 60-90 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron cinco veces con tampón de lavado (TBS + 0,1% Tween 20) y el tampón restante se retiró por transferencia sobre toallas de papel. No se dejó que estas placas se secaran antes de la adición del lisado.

Preparación del lisado de las células que expresan IGF-IR

Las células NIH-3T3 transfectadas con IGF-IR (5x104/ml) se pusieron en 100 µl de medio de crecimiento (medio DMEM rico en glucosa enriquecido con L-glutamina (0,29 mg/ml), SFB al 10% inactivado con calor y 500 µg/ml de geneticina, penicilina y estreptomicina cada una) en placas de 96 pocillos con fondo en U. Las placas se incubaron a 37 ºC, CO2 al 5% durante la noche para dejar que las células se adhieran. El medio se decantó de las placas y se reemplazó con 100 µl por pocillo de medio de crecimiento recién preparado. Para ensayo, los anticuerpos potenciales anti-IGF-IR se diluyeron hasta cinco veces la concentración final deseada en medio de cultivo y se añadieron 25 µl por pocillo. Todas las muestras se realizaron por triplicado. Las placas se incubaron a 37°C durante una hora. Las células se estimularon con 25 µl/pocillo de IGF-1 600 ng/ml (preparado en medio de cultivo) y se incubó a temperatura ambiente for 10 minutos. El medio se decantó por inversión de las placas y por transferencia cuidadosa sobre toallas de papel. Las células adheridas se lisaron por la adición de 50 µl de tampón de lisis (HEPES 50 mM, pH 7,4, EDTA 10 mM, NaCI 150 mM, MgCI2 1,5 mM, NaVO4 1,6 mM, Triton X-100 al 1%, glicerol al 1%) y se enriqueció inmediatamente antes de su uso con un comprimido de un inhibidor de proteasas sin EDTA [Roche Molecular Sciences] por 50 ml). Las células se agitaron durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 200 µl de tampón de dilución (HEPES 50 mM, pH 7,4, NaVO4 1,6 mM) a cada pocillo y se mezcló pipeteando. Se transfirieron 100 µl de lisado de cada pocillo a cada pocillo de la placa de captura ELISA como se ha descrito antes y se incubó con agitación suave durante dos horas a temperatura ambiente.

ELISA con anticuerpos anti-fosfotirosina (pTYR)

5

10

15

20

25

30

48

El lisado celular se retiró por inversión de las placas, lavando las placas cinco veces con tampón de lavado y transfiriendo el exceso de líquido sobre toallas de papel. Se añadieron 100 µl por pocillo del anticuerpo específico de pTyr (HRP-PY54) y se diluyó en tampón de bloqueo hasta una concentración de 0,2 µg/ml. Las células se incubaron por agitación de las placas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron después cinco veces con el tampón de lavado y se transfirieron sobre toallas de papel.

La unión del anticuerpo HRP-PY54 se detectó por la adición de 100 µl por pocillo de la solución con sustrato de la peroxidasa TMB (Kirkegaard & Perry) e incubación con agitación mientras aparecía el color (aproximadamente 2-10 minutos). La reacción de aparición del color se paró por la adición de 100 µl por pocillo de solución de parada TMB (Kirkegaard & Perry). Las placas se agitaron durante 10 segundos a temperatura ambiente para mezclar la solución y se cuantificó por medida a DO450nm.

La tabla II y la figura 6A muestran los resultados de este experimento con el anticuerpo de la invención. Los resultados de este experimento demuestran que la capacidad del anticuerpo de esta invención para bloquear la activación de IGF-IR mediada por IGF-I como muestra el descenso de la fosforilación de tirosina asociada al receptor. Además, estos resultados se pueden utilizar para cuantificar la potencia relativa del anticuerpo de esta invención.

Tabla II

Anticuerpo monoclonal

CI50 (µg/ml)

2.12.1fx

0,42

EJEMPLO IV: Reactividad cruzada entre especies del anticuerpo de la invención

Con el fin de determinar la reactividad cruzada entre especies del anticuerpo de la invención, se realizaron varios experimentos que incluyen la inmunoprecipitación, el bloqueo mediado por anticuerpo de la fosforilación inducida por IGF-I del receptor y el análisis por citometría de flujo (FACS).

Para realizar los experimentos de inmunoprecipitación, las células se cultivaron en placas en medio DMEM rico en glucosa enriquecido con L-glutamina (0,29 mg/ml), SFB al 10% inactivado con calor, y 500 µg/ml de geneticina, penicilina y estreptomicina cada una hasta el 50% de confluencia en matraces T25. Se añadió 100 µl de un anticuerpo de la invención en solución salina tamponada de Hank (HBSS; Gibco BRL) a una concentración de 1 µg/ml. Las placas se incubaron durante 30 minutos a 37°C en una incubadora y después se estimularon las células con IGF-I a 100 ng/ml durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se lisaron en tampón RIPA (Harlow and Lane, supra) y se inmunoprecipitó el IGF-IR con 2 µg de anticuerpo anti-IGF-IR SC-713 panespecífico (Santa Cruz) con perlas de agarosaproteína A durante 1 hora a 4 °C. Las perlas se agragaron y se lavó tres veces con PBS/T (PBS + 0,1% Tween-20) y se hirvió a continuación en 40 µl de tampón de Laemmli con βME al 5%.

Las muestras preparadas como se ha descrito antes se analizaron después por inmunotransferencia. Se cargaron 12 µl de cada muestra por carril en geles Novex™ con un gradiente del 4-10% procesados con tampón MES 1X (Novex™). Los geles se procesaron a 150 V durante 1 hora o a 200 V durante aproximadamente 30 minutos. El gel se transfirió a una membrana en tampón de transferencia Novex™ con metanol al 10% bien a 100 mA durante la noche o durante 1-1,5 horas a 250 mA. Se dejó que la membrana se secase completamente y se bloqueó a temperatura ambiente con TBS (solución salina tamponada con Tris, a pH 8,0) conteniendo Superblock (Pierce Chemical Co.). Se añadió el anticuerpo SC713 (SantaCruz) de transferencia de IGF-IR o un anticuerpo fosfotirosina para detectar el IGF-IR inmunoprecipitado o el fosfo-IGF-1R, respectivamente.

Este experimento se realizó con el anticuerpo de la invención en células de varios animales. El anticuerpo fue capaz de unirse al IGF-IR humano, pero no al canino y murino. Estos experimentos indican que los anticuerpos son muy específicos.

Determinación de la afinidad de especies cruzadas de los anticuerpos de la invención

El análisis por citometría de flujo se realizó para determinar la afinidad del anticuerpo de la invención para el IGF-IR de otros animales, particularmente los monos del Viejo Mundo descritos antes. Se incubaron cantidades iguales de células humanas y de macacos de Java (5x105) durante 1 hora en hielo con concentraciones crecientes de anticuerpos anti-IGF-IR biotinilados de la invención. Las muestras se incubaron durante 30 minutos en hielo con RPE (ficoeritrina) conjugada con estreptavidina. La unión se midió mediante citometría de flujo y se analizó con los histogramas de la intensidad de fluorescencia (FI2-H) frente al número de células (cuentas) utilizando el programa informático CellQuest. La unión (Kd) se calculó para cada anticuerpo a partir de gráficas de intensidad de fluorescencia media frente a concentración de anticuerpo. En la mayoría de los experimentos, la unión se midió en células MCF-7 humanas cultivadas y células cultivadas de tejidos de macaco de Java. La disminución del anticuerpo se controló por medida de la unión a lo largo de un intervalo de concentraciones celulares.

El análisis por citometría de flujo (FACS) mencionado antes se realizó para analizar la capacidad del anticuerpo de la invención para unirse a células humanas y de macacos de Java. Se observó una unión semimáxima (Kd) de 0,1 µg/ml para todas las líneas celulares ensayadas.

EJEMPLO V: Regulación por disminución del receptor de IGF-I

Para investigar si el anticuerpo de la invención podía inducir el descenso de IGF-1R en las células, se cultivaron en placas células MCF7 en medio DMEM/F12 enriquecido con Lglutamina (0,29 mg/ml), SFB al 10% inactivado con calor, penicilina y estreptomicina a una confluencia del 50% en matraces T75. El anticuerpo de la invención se añadió a las células a una concentración final de 1 µg/ml. Las placas se incubaron durante horas especificadas a 37 ºC en una incubadora y se lisaron entonces en HEPES 50 mM, pH 7,4, EDTA 10 mM, NaCI 150 mM, MgCI2 1,5 mM, NaVO4 1,6 mM, Triton X-100 al 1%, glicerol al 1%. El nivel de IGF-IR total en los extractos celulares se determina mediante análisis de inmunotransferencia utilizando el anticuerpo anti-IGF-IR SC-713 panespecífico (Santa Cruz). Véase la figura 6B. El tratamiento de las células MCF7 con el anticuerpo de la invención produjo un 60-70 por ciento de descenso de IGF-1R en 1-2 horas.

EJEMPLO VI: Efectos in vivo del anticuerpo de la invención sobre el IGF-IR

Se realizó un experimento para determinar si ocurrirían in vivo los efectos del anticuerpo de la invención sobre IGF-IR como se ha descrito en los ejemplos anteriores. Los tumores se indujeron en ratones sin timo de acuerdo con los procedimientos publicados (V.A. Pollack et al., "Inhibition of epidermal growth factor receptor-associated tyrosine phosphorylation in human carcinomas with CP-358,774: Dynamics of receptor inhibición in situ and antitumor effects in athymic mice," J. Pharmacol. Exp. Ther. 291:739-748 (1999). Poco tiempo después, las células NIH-3T3 transfectadas con IGF-IR (5x106) se inyectaron por vía subcutánea en ratones atímicos (nu/nu) de 3-4 semanas de edad con 0,2 ml de una preparación de Matrigel. A continuación se inyectó a los ratones por vía intraperitoneal un anticuerpo de la invención después de que se formaran tumores asentados (es decir, de aproximadamente 400 mm3).

Después de 24 horas, se extrajeron los tumores, se homogeneizaron y se determinó el nivel de IGF-IR. Para determinar los niveles de IGF-IR, se diluyó el anticuerpo SC-713 en tampón de bloqueo hasta una concentración final de µg/ml y se añadieron 100 µl a cada pocillo de una placa Reacti-Bind (Pierce) recubierta con anticuerpo anti-conejo de cabra (GAR). Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación y después se lavaron cinco veces con tampón de lavado. Las muestras tumorales se pesaron. Se diluyó 12,5 µl del extracto tumoral con tampón de lisis hasta un volumen final de 100 µl. Se añadió una muestra de 100 µl a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Las placas se incubaron a temperatura ambiente con agitación durante 1-2 horas y luego se lavaron cinco veces con tampón de lavado. A cada pocillo se añadieron 100 µl de HRP-PY54 o del anticuerpo anti-IGFIR biotinilado en tampón de bloqueo y se incubó a temperatura ambiente con agitación durante 30 minutos. Las placas se lavaron cinco veces con tampón de lavado y se revelaron. Las placas se revelaron por ensayo con HRP-PY54 por la adición de 100 µl del sustrato TMB Microwell por pocillo y el revelado de color se detuvo con la adición de 100 µl de H2SO4 0,9 M. La señal se cuantificó por agitación durante 10 segundos y medición de la densidad óptica a 450 nm. La señal se normalizó para la proteína total. Las placas ensayadas con el anticuerpo anti-IGF1R se revelaron por la adición a cada pocillo de 100 µl de estreptavidina-HRP diluido en tampón de bloqueo, incubando a temperatura ambiente con agitación durante 30 minutos y luego se continuó como se describe para HRP-PY54.

Se observó que la inyección intraperitoneal del anticuerpo de la invención produjo la inhibición de la actividad IGF-IR medida por un descenso de la proteína IGF-IR (Figura 7). Además, esta inhibición era dependiente de la dosis inyectada de anticuerpo (Figura 7). Estos datos demuestran que el anticuerpo de la invención es capaz de dirigir el IGF-IR in vivo de la manera observada in vitro.

EJEMPLO VII: Inhibición del crecimiento de tumores (ICT) inducidos por células 3T3/IGF-IR

El anticuerpo de la invención se ensayó para determinar si funcionaría para inhibir el crecimiento tumoral. Los tumores se indujeron como se ha descrito antes (Ejemplo VI) y cuando se estableció, se formaron tumores palpables (es decir, de 250 mm3, en 6-9 días). Los ratones se trataron con una única dosis de 0,20 ml de anticuerpo mediante inyección intraperitoneal. El tamaño del tumor se midió por un calibrador Vernier a través de dos diámetros cada tercer día y el volumen se calculó aplicando la fórmula (longitud x [anchura]2)/2 utilizando los procedimientos establecidos por Geran, et al., "Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems," Cancer Chemother. Rep. 3:1-104.

Tras el análisis con el anticuerpo de la invención se observó que el tratamiento único con anticuerpo inhibía de por sí el crecimiento de los tumores inducidos por células NIH-3T3 transfectadas con IGF-IR (Figura 8A). Además, en estudios de combinación con una dosis única de 7,5 mg/kg de adriamicina administrada por vía intravenosa, se observó que la administración de una monodosis del anticuerpo aumentaba la eficacia de la adriamicina, un conocido inhibidor del crecimiento tumoral. La combinación de adriamicina con el anticuerpo de la invención demostró una detención del crecimiento de 7 días comparado con el tratamiento con el anticuerpo o con la adriamicina sola (Figura 8B).

EJEMPLO VIII: Relación entre los niveles del anticuerpo y la disminución del IGF-IR

Se indujeron tumores en ratones atímicos como se describe en el ejemplo VI. Los ratones se trataron entonces con 125 µg del anticuerpo por inyección intraperitoneal, como se describe en el ejemplo VI. Los tumores se extrajeron y se midieron los niveles de IGF-IR por ELISA. La figura 9 muestra los niveles séricos del anticuerpo y los niveles del receptor IGFIR con el tiempo. El experimento demuestra que el IGF-IR se regula por disminución por el anticuerpo y que el grado de inhibición del IGF-IR es proporcional a la dosis respecto a la concentración sérica del anticuerpo.

EJEMPLO IX: Inhibición del crecimiento de células de tumores colorrectales

Se indujeron tumores en ratones atímicos como se describe en el ejemplo VI excepto que se utilizaron células Colo 205 (ATCC CCL 222). Las células Colo 205 son células de adenocarcinoma colorrectal humano. Los ratones con tumores subcutáneos definidos de aproximadamente 250 mm3 se trataron con diversas cantidades del anticuerpo (i.p.) o con 100 mg/kg de 5-fluorodesoxiuridina (5-FU, i.v.), tanto como agentes solos o combinados, como se describe en el ejemplo VII. La figura 10A y la figura 10B muestran el tamaño del tumor respecto a los diversos tratamientos a lo largo del tiempo. El experimento demuestra que el tratamiento con un anticuerpo anti-IGF-IR administrado una sola vez, inhibe el crecimiento celular del cáncer colorrectal humano cuando se administra como agente único y aumenta la eficacia del 5-FU, un conocido inhibidor tumoral.

EJEMPLO X: Farmacocinética in vivo de los anticuerpos anti-IGF-IR

Para evaluar la farmacocinética de los anticuerpos anti-IGF-IR, se inyectaron 5 mg/kg del anticuerpo en un tampón acetato a macacos de Java por vía intravenosa. Se recogió el suero de los macacos a diversos tiempos y se determinaron las concentraciones del anticuerpo anti-IGF-IR en los macacos durante un periodo de hasta diez semanas. Para determinar cuantitativamente los niveles séricos funcionales del anticuerpo, se unió el dominio extracelular del IGF-IR humano (IGF-l-sR, R&D Systems, nº en catálogo 391GR) a placas de 96 pocillos. Se añadió suero de mono (diluido entre 1:100 y 1:15.000) a las placas de ensayo de manera que cada muestra estuviera dentro del intervalo lineal de la curva patrón y se incubó a condiciones en las que cualquier anticuerpo anti-IGF-IR se uniese al IGF-l-sR. Después de lavar las placas, se añadió a las placas un anticuerpo marcado anti-IgG humana y se incubó en condiciones en las que el anticuerpo anti-IgG humana se uniría al anticuerpo anti-IGF-IR. Las placas se lavaron después y se revelaron, y se usó una curva patrón de control y una alineación por regresión lineal para cuantificar la cantidad de anticuerpos antiIGF-IR. La figura 11 muestra la concentración sérica del anticuerpo a lo largo del tiempo. El experimento demuestra que la semivida (t1/2) del anticuerpo anti-IGF-IR es de 6,1 días y tiene un distribución de volumen (Vdss) de 0,054 (l/kg).

5 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Pfizer Products Inc. 10 <120> Anticuerpos humanos modificados anti IGF-1R

<130> PC25231 A

<140> 6 15

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 1413 20 <212> ADN

<213> 2.12.1 FX

<400> 1 25

30

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<210> 2

<211> 728 5 <212> ADN

<213> 2.12.1 FX

<400> 2

10

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Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un anticuerpo humano monoclonal o una porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al receptor del factor de crecimiento insulinoide I humano (IGF-IR), que comprende al menos una mutación somática contenida en una región de marco estructural de una región variable de dicho anticuerpo que se ha sustituido por un correspondiente residuo de aminoácido de línea germinal, en el que la región variable de la cadena ligera comprende los números de aminoácidos 23 a 130 de la SEC INº 5.

2. 2.

   El anticuerpo humano o una porción de unión a antígeno de éste de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la región variable de la cadena ligera comprende los aminoácidos 23 a 236 de ID SEC Nº 5.

3. 3.

   El anticuerpo humano o una porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la región variable de la cadena pesada comprende los aminoácidos 20 a 144 de ID SEC Nº 3.

4. 4.

   El anticuerpo humano o una porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 3 en el que la cadena pesada comprende los aminoácidos 20 a 470 de ID SEC Nº 3 y la cadena ligera comprende los aminoácidos 23 a 236 de ID SEC Nº 5.

5. 5.

   El anticuerpo humano o una porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 3 en el que la cadena pesada de dicho anticuerpo está constituida por los aminoácidos 20 a 470 de ID SEC Nº 3 y la cadena ligera está constituida por los aminoácidos 23 a 236 de ID SEC Nº 5.

6. 6.

   El anticuerpo humano o porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, estando el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que deriva o está unido a otra molécula.

7. 7.

   El anticuerpo humano o porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, estando el anticuerpo o porción de unión a antígeno está unido a otra proteína o péptido.

8. 8. Una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer que comprende el anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. 9.

   La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8 que comprende además un agente antineoplásico, quimioterapéutico o antitumoral.

10. 10.

    Un anticuerpo humano o porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para usar en el tratamiento del cáncer en un ser humano.

11. 11.

    El uso de un anticuerpo humano o porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer en un ser humano.

12. 12.

    . Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de un ácido nucleico que codifica una cadena pesada o una porción de unión a antígeno de ésta o una cadena ligera o una porción de unión a antígeno de ésta de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

13. 13.

    Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 12.

14. 14. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 13.
15. 15. Un procedimiento de producción de un anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígeno del mismo que comprende el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 14 y la recuperación de dicho anticuerpo.