TWI294915B - Modified human igf-ir antibodies - Google Patents

Description

1294915 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關經修飾之人類IGF-IR抗體。 【先前技術】 胰島素樣生長因子（IGF-I)為7.5-kDa之多肽，其以高濃度 在血漿中循環且可在大多數組織中偵測到。IGF_;[刺激細胞 分化與細胞增殖，且為大多數哺乳動物的細胞類型所需要 以用於維持增殖。該等細胞類型包括（除了其它以外）人類二 倍體成纖維細胞、上皮細胞、平滑肌細胞、T淋巴細胞、神 經細胞、骨髓細胞、軟骨細胞、成骨細胞與骨髓幹細胞。

在轉導路徑中引起IGF-I刺激細胞增殖或分化之第一個 步驟為IGF-I或IGF-Π (或超生理學濃度之胰島素）與IGF-I 受體的結合。IGF-1受體包含兩種類型的亞單位：α亞單位 (13 (M 3 5 kDa蛋白質，其完全為細胞外的且功能為配位子結 合）及β亞單位（95-kDa跨膜蛋白質，具有跨膜域與細胞質 域）。IGF-IR屬於酪胺酸激酶生長因子受體家族（uurich等人， Cell 61: 203-212，1990)，且結構上類似於胰島素受體 (Ullrich等人，EMBO J. 5: 2503-2512, 1986)。最初將IGF-IR 合成為單鏈前受體（proreceptor)多肽，其係由糖基化、蛋白 水解分裂及共價結合來加工而組合成成熟的460-kDa異構 型四聚體，其包含兩個α亞單位及兩個β亞單位。該（等）β亞 單位擁有配位子活化之酪胺酸激酶活性。此活性牵涉調節 配位子作用之發訊號路徑，其涉及β亞單位的自磷酸化與 IGF-IR基質之磷酸化。 94608.doc 1294915 有重要迹象表明IGF-Ι及/或IGF-IR在維持活體内與活體 外腫瘤細胞上發揮了作用。IGF-IR含量在肺部腫瘤（Kaiser 等人，J· Cancer Res. Clin Oncol. 119: 665-668，1993; Moody 等人，Life Sciences 52: 1161-1173，1993; Macauley等人， Cancer Res·，50: 2511-2517, 1990)、乳腺腫瘤（Poliak等人， Cancer Lett. 38: 223-230，1987; Foekens等人，CancerRes· 49: 7002-7009，1989; Cullen 等人，Cancer Res. 49:

7002-7009，1990; Arteaga 等人，J· Clin. Invest· 84: 1418-1423，1989)、前列腺與結腸腫瘤（Remaole-Bennet 等 人，Je Clin· Endocrinol. Metab. 75: 609-616，1992; Guo等 人，Gastroenterol. 102: 1101-1108，1992)中係升高的。IGF-I 在前列腺上皮中無限制地表現導致轉基因小鼠中瘤的形成 (DiGiovanni等人，Proc. Natl· Acad. Sci· USA 97: 3455-60, 2000)。此外，IGF-I似乎為人類神經膠質瘤的自分泌刺激物 (Sandberg-Nordqvist 等人，Cancer Res. 53: 2475-2478, 1993) ’同時IGF_I刺激過度表現IGF-IR的纖維肉瘤的生長 (Butler等人，Cancer Res· 58: 3021-27，1998)。此外，具有 ”高正常π含量IGF-I的個體與具有”低正常”範圍含量IGF-I 的個體相比患常見癌症的風險增加（Rosen等人，Trends Endocrinol· Metab. 10: 136-41，1999)。回顧 IGF-I/IGF-I受體 之相互作用在各種人類腫瘤的生長中所起的作用，參閱 Macaulay，Br· J. Cancer，65: 3 11-320，1992。 在包括哺乳動物之各種動物種類中熱量限制為延長壽命 最有效的與可重複的干涉。在試驗性癌發生模型中其亦為 94608.doc 月«修(更).正替換頁 I29fH24269號專利申請^ 中文說明書替換頁(96年6 最有力、廣泛起作用 <預防癌症ϋ。_種構成其多種 有益效應基礎的關鍵生物機制為胰島素樣生長因子_丨路徑 (Hursting等人，Anrm· Rev· Med. 54:131-52, 2〇〇3)。 EP 0629240B 1涉及當投藥於病人時藉由重組職技術 將抗體序列轉換為種系序列從而試圖減少免疫原性。 W0 02/066058A1涉及針對EGF受體（HER1)的抗體，另外修 飾該等抗體以減小引發免疫反應的傾向。 ^ 鑒於IGF-I與IGF-IR在該等病症（如癌症及其它過度表現 IGF-I與IGF_IR之增殖性病症）中所起的作用以及⑽巧與 igf-IR在過低表現1(}1^及/或IGF_IR任一者之病症中過= 所起之作用，需要產生針對跡也的抗體，其可用於抑制 或刺激IGF-IR。該等抗體在（例如）公開於2〇〇2年7月η曰的 W0 02/053596中有所描述。該公開案的正文，包括所述之 所有序列以引用的方式倂入本文中。1(}?1]1抗體亦在公開於 2003年12月4日之冒〇 03/100008、公開於2〇〇3年12月24日之 WO 03/106621及公開於2003年7月24日之WO 03/59951中有 所描述。 【發明内容】 本發明提供了經修飾的人類單株抗體或其抗原結合部 分，其中至少一種體細胞突變胺基酸序列係轉換為種系胺 基酸序列。經置換殘基較佳包含於抗體的可變區中且經置 換殘基更佳包含於可變區的骨架區中。 本發明之人類抗體或抗原結合部分較佳特異結合至人類 胰島素樣生長因子I受體（IGF-IR)。 94608-960629.doc 1294915 在一實施例中，抗體輕鏈之可變區序列包含三個回復至 由種系A3 0基因所編碼之胺基酸序列的骨架突變。在一較佳 實施例中’輕鏈的可變區包含胺基酸數目為23至13〇的胺基 酸序列SEQ ID NO: 5。在另一較佳實施例中，人類抗體之 輕鏈包含胺基酸數目為23至236的犯卩ID N〇: 5。 在本發明之另一實施例中，抗體重鏈之可變區序列包含 兩個回復至由種系DP-35基因所編碼之胺基酸序列的骨架 突變。在一較佳實施例中，重鏈之可變區包含胺基酸數目 為20至144的SEQ ID NO: 3。在一更較佳的實施例中，人類 抗體之重鏈包含胺基酸數目為2〇至47〇的SEq id NO: 3且 輕鏈包含胺基酸數目為23至236的SEq ID N〇: 5。 在另一實施例中，本發明之抗體的重鏈缺乏末端離胺 酉文5羊β之’本發明係關於一種抗體，其中重鏈包含胺基 酸數目為20至469的SEQ ID NO: 3且輕鏈含有胺基酸數目 為 23 至 236的 SEQ ID NO: 5。 本發明亦係關於一種治療癌症的醫藥組合物，其中該醫 藥組合物包含本發明之經修飾的人類抗體，其與抗新生 物、化學治療或抗腫瘤試劑及醫藥學上可接受的載劑併用。 本發明亦關於一種以人類抗體治療人類癌症的方法，該 方法包含投予人類治療該癌症有效量之抗體的步驟。在一 貫施例中，本發明係關於一種治療，其包含投予抗新生物、 抗腫瘤、抗血官生成或化學治療試劑及連同本發明之抗體 的步驟。 本發明亦關於一種藉由投予患者有效量之抗體而以抗體 94608.doc 1294915 /σ療而要其之患者的方法。在一實施例中，本發明係關於 種/σ療其包含投予抗新生物、抗腫瘤、抗血管生成或 化學治療試劑及連同本發明之抗體的步驟。 本^明亦關於經分離之多核苷酸，其包含編碼本發明之 抗體的重鍵或其抗原結合部分或輕鏈或其抗原結合部分的 核酸序列。在本發明之一實施例中，本發明亦提供一種用 有效置之編碼抗IGF_IR抗體之重鏈及/或輕鏈或其抗原結 合部分的核酸分子治療需要該治療之受驗者的方法。 本發明提供一種載體，其包含經分離之核酸分子及包含 遠載體之宿主細胞。本發明另外包含一種宿主細胞，其產 生具有與2.12.1 fx之成熟的重鏈及輕鏈相同之胺基酸序列 的抗體。 本發明亦提供一種重組地產生及培養核酸分子所編碼之 抗體的方法。 本發明亦關於使用抗IGF-IR抗體來診斷表現IGF-IR之組 織的存在或位置的診斷方法。 【實施方式】 所有的專利、專利申請案及其它本文所引用之參考文獻 以引用的方式全部倂入本文中。 除非本文另有限定，否則與本發明有關所用的科學及技 術性術語將具有通常為一般技術者所瞭解的含義。此外， 除非上下文需要，否則單數術語將包括複數而複數之術語 將包括單數。一般而言，與如下學科及技術有關所用的命 名法及技術係彼等在此項技術中熟知及常用的：細胞及組 94608.doc -10- 1294915 織培養技術、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及 蛋白質與核酸化學及雜交技術。除非另有指示，否則本發 明之方法及技術通常根據此項技術中所熟知且如本說明書 所引用及討論之各種一般參考文獻與較特定之參考文獻中 所述的習知方法來執行。請參閱，例如，Sambrook等人 Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，N.Y_ (1989)及 Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates (1992)，及 Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，Ν·Υ· (1990)，其全文 以引用的方式倂入本文中。酶的反應與純化技術係根據製 造商的說明書來執行，如此項技術通常所完成或如本文所 述。與如下本文所述之學科有關所用的命名法及實驗室程 序與技術係彼等在此項技術中熟知及常用的：分析化學、 合成有機化學及醫學與藥物化學。標準技術係用於化學合 成，化學分析，藥物製備、調配與傳遞及患者的治療。 除非另有指示，否則下列術語應理解為具有如下含義： 術語’’多肽”涵蓋天然或人工蛋白質、蛋白質片斷及蛋白 質序列的多肽類似物。多肽可為單體或聚合體。

非肽類似物為一般作為具有類似於彼等模板肽之特性的 藥物而用於醫藥工業。該等類型之非肽化合物被稱為’’肽模 擬劑 ’’（’’peptide mimetic s’’ 或,’peptidomimetic s’’）。Fauchere，J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986) ； Veber and Freidinger TINS 94608.doc -11 - 1294915 p.392 (198 5) , ^Evans# A ^ J. Med. Chem. 30:1229 (1987) ^ ’、以引用的方式倂人本文中。常常藉電腦化分子模型來發 展該等化合物。結構類似於治療學上有用之肽的肽模擬劑 可用於產生相當的治療或預防效果。一般而言，藉由此項 技術中沾知的方，肽模擬劑結構上類似於範例多狀（即具 有所要生化特性或藥物學活性的多狀），諸如，人類抗體， 然而其具有-或多個視情況由下列各基所組成的群中選出 鍵來置換的肽鍵：—CH2NH—、__CH2ScH2_cH2—、 CH CH (順式與反式）、__c〇CH2 _、_CH(〇H)CHr 及 —CH2S〇—。用相同類型D-胺基酸來系統取代一或多個一致 序列之胺基^(例如’ D_離胺酸代替L_離胺酸）亦可用於產生 車乂 %、疋的肽。此外’包含一致序列或大體上相同之一致序 列變化的受約束的肽可藉由此項技術中已知的方法而產生 (· and Gieraschd⑽·及ev 价61:387 (1992)，其以 引用的方式倂入本文中)；例如，藉由加入内部半胱胺酸殘 基來產生，言亥等殘基可形成使肽環化之分子内二硫橋。 免疫球蛋白為四聚體分子。在天然發生的免疫球蛋白 中母们四來體包含兩對相同的多肽鏈，每對具有一條，，輕 鍵^約25 kDa)與一條”重鏈”（約5〇-7〇 kDa)。每條鏈的胺基 末而口P刀包括約1〇〇至11〇或更長胺基酸之主要用於抗原識 別的可變區。每條鏈的羧基末端部分界定了主要用於效應 物功爿b的恆疋區。人類的輕鏈分為κ輕鏈與λ輕鏈。重鏈分 為μ、Δ、γ、α或ε且界定抗體的同型各自為IgM、IgD、igG、 IgA及IgE。輕鏈與重鏈中，可變區與恆定區藉由約Μ或更 94608.doc -12- 1294915 長胺基酸之nJn區來接合，重鏈中亦包括約l〇以上胺基酸之 nD”區。通常參閱基礎免疫學/mmwo/ogjz)第7 章（Paul，W·，編輯，第二版· Raven Press，N.Y. (1989))(為達 成所有目的其全文以引用的方式倂入本文中）。每對輕/重鏈 的可變區形成抗體結合位點因此完整的免疫球蛋白具有兩 個結合位點。 免疫球蛋白鏈顯示相同的一般結構：由三個高變區所接 合的相對保守的骨架區（FR)，高變區亦可稱為決定互補區 或CDR。藉由骨架區來比對由每對中的兩條鏈而來的 CDR，使其能夠結合至特異性抗原決定部位。由N末端至C 末端，輕鏈與重鏈都包含功能域FR1、CDR1、FR2、CDR2、 FR3、CDR3與FR4。每個功能域之胺基酸的分配係根據Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health，Bethesda，Md· (1987 and 1991))或 Chothia & Lesk Mo/· 5b/· 196:901-917 (1987); Chothia等 人，iVa⑼re 342:878-883 (1989)中所定義。 n抗體”係指完整的免疫球蛋白。藉由重組DNA技術或完 整抗體的酶或化學切割法可產生抗原結合部分。抗原結合 部分包括Fab、Fab’、F(ab’）2、Fv、dAb與決定互補區（CDR) 片斷、單鏈抗體（scFv)、嵌合抗體、微型雙功能抗體（diabody) 與多肽，其含有足以使特異性抗原結合至多肽的免疫球蛋 白之至少一部分。

Fab片斷為由VL、VH、CL與CH I功能域所組成的單價片 斷；F(ab’）2片斷為包含兩個在鉸鏈區由二硫橋所連接的Fab 94608.doc -13· 129491.5 片斷之二價片斷；Fd片斷係由VH與CH1功能域組成；Fv片 斷係由抗體單臂之VL與VH功能域組成；且dAb片斷（Ward 等人，Nature 341:544-546, 1989)係由VH功能域組成。 單鏈抗體（scFv)為一種如下之抗體，其中VL與VH區經由 合成之連接體配對形成單價分子，該連接體使其能成為單 蛋白質鍵（Bird等人，Science 242:423_426，1988及 Huston等 人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988)。微型 雙功能抗體為二價、雙特異性抗體，其中VH與VL功能域在 單多肽鏈上表現，然而使用太短的連接體而不足以容許同 一條鏈上的兩個功能域之間配對，從而迫使功能域與另一 條鏈上的互補功能域配對並建立兩個抗原結合位點（參 閱，例如，Holliger，P.等人，Proc. Natl· Acad· Sci· USA 90:6444-6448，1993，及 Poljak，R. J·等人，Structure 2:1121-1123，1994)。一或多個CDR可以共價地或非共價地 倂入分子以使其成為免疫黏附素（immunoadhesin)。免疫黏 附素可倂入該（等）CDR中而作為較大多肽鏈之部分，可共價 地將該（等）CDR連接至另一條多肽鏈上或可非共價地倂入 CDR。該（等）CDR允許免疫黏附素特異結合至特定的相關抗 原上。 抗體可具有一或多個結合位點。若有一個以上結合位 點，則該等結合位點可為彼此相同或不同的。例如，天然 發生的免疫球蛋白具有兩個相同的結合位點，單鏈抗體或 Fab片斷具有一個結合位點，而”雙特異性”或”雙功能性”抗 體具有兩個不同的結合位點。 94608.doc -14- 1294915 下之抗體’其（1)與天然相關組 經分離之抗體”為一種如 W包括其它天然相關抗體）無關，該等組分伴隨其天缺離， ⑺不含其它相同種類來源的蛋白質，(3)藉由不同種類來源 々I而表ί見或(4)未在自然中發生。經分離之抗體的實 例包括利用脱删系、經分離之抗體來親和純化的抗igf_ir 抗體由雜父瘤或其它活體外細胞株所合成的抗服_爪抗 體及由轉基因小鼠所衍生的人類抗IGF-IR抗體。 術語，，人類抗體，，包括所有具有一或多個衍生自人類免疫 球蛋白序列之可變與恆定區的抗體。在一較佳實施例中， 所有的可變與恆定功能域都衍生自人類免疫球蛋白序列 (一個完整的人類抗體）。如下所述，該等抗體可以各種方式 來製備。 •’中和抗體”或”抑制性抗體”為一種當過量的抗igimr^ 體減少IGF-IR所結合之IGF-I量至少約20%時抑制IGF-IR結 合至IGF_I的抗體。在一較佳實施例中，抗體減少IGF_IR所 結合之IGF-I量至少40%，較佳60%，更佳8〇%，或亦更佳 8 5%。藉由一般技術者所知的任何手段可量測出結合的減 少，例如，由活體外競爭結合分析法來量測。 活化抗體’’為一種當加入表現IGF-IR的細胞 '組織或器 官中時活化至少約20%IGF-IR的抗體。在一較佳實施例中， 抗體活化IGF-IR活性至少40%，較佳60%，更佳80%，或亦 更佳85%。在一更佳實施例中，在igf_I或IGF-Π存在下加 入活化抗體。在另一實施例中，藉由確定IGF-IR之酪胺酸 自磷酸化的量來量測活化抗體的活性。 94608.doc -15- 1294915 、厂般技術者根據本說明t之教μ難製備抗體的片斷或 類似物。較佳的片斷或類似物之胺基與縣末端發生在鄰 、力ι或的邊界。藉由將核芽酸及/或胺基酸序列的資料 人開的或專有序列資料庫進行比較可識別結構域與功能 域Q較佳地’電腦化比較方法係用於識別發生於其它具有 已知結構及/或功能的蛋白f中的序列圖案（削叫或所預 測之蛋白質構型功能域。識別折疊成為已知三維結構之蛋 白貝序列的方法係已知的。Bowie等人253:164 (1991) 〇 本文所用術語”表面電漿共振”係指一種光學現象，其可 藉由在生物感應器基質内偵測蛋白質濃度的改變而進行即 ^生物特異性相互作用分析，例如使用BIAc〇re系統 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J·) ° 欲知詳情，請參閱 J〇nss〇n，u·等人（1993) Ann· Biol·

Clin· 51.19-26，Jonsson，U.等人（1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson，B·等人（1995) J· Mol. Recognit· 8:125-131 ;及 Johnnson，B·等人（1991) Anal. Biochem. 198:268-277。 術語離n係指抗體自抗體/抗原複合體解離的分離率常 數。 術语’’Κ/係指特定抗體-抗原相互作用的解離常數。 本文所用之二十個習知的胺基酸及其縮寫係依據習知的 用法。參閱 /mm關(9/〇幻；-乂办(第二版，E.S. Golub and D.R. Gren，Eds·，Sinauer Associates, Sunderland，Mass. 94608.doc •16- 1294915 d991))’其以引用的方式倂人本文中。二十個習知胺基酸 的立體異構體（例如’D_胺基酸），非天然胺基酸（諸如，α、α_ 取代月*基&〇、Ν道基胺基酸、乳酸及其它非習知胺基酸 亦可適用於本發明之多肽的組份。非習知胺基酸之實例包 括：4·羥基脯胺酸、丫_羧基穀胺酸、ε-Ν，Ν，Ν-三甲基離胺酸、 ε Ν-乙基離胺酸、〇_二氧磷基絲胺酸、Ν_乙醯基絲胺酸、 甲基甲石，IL胺酸、3_甲基組胺酸、5_羥基離胺酸、s_N_ 曱基精胺酸及其它類似胺基酸與亞胺基酸（例如，4_羥基脯 胺酸）。本文所用的多肽符號中，根據標準用法與慣例，左 手方向為胺基末端方向而右手方向為羧基末端方向。 本文所提及之術語”多核苷酸”意謂一種至少10個鹼基長 度之核苷酸的多聚合形式，核苷酸可為核糖核苷酸或脫氧 核糖核苷酸或任一種核苷酸的經修飾形式。該術語包括單 與雙鏈形式的DNA。 本文所用術語’’經分離之多核苷酸”意謂染色體組、cDNA 或其合成來源或某些組合的多核苷酸，根據其來源該”經分 離之多核苷酸’’（1)與所有或一部分多核苷酸無關，其中，，經 分離之多核苷酸’’在自然中發現，（2)可操作地連接至在自然 中未與其連接的多核苷酸，或（3)未在自然中作為較大序列 的部分而發生。 本文所提及的術語”自然發生的核苷酸”包括脫氧核糖核 普酸與核糖核苦酸。本文所提及之術語”經修飾之核苦酸，， 包括具有經修飾或取代之糖基及其類似物的核苷酸。本文 所提及之術語π券核苦酸鍵π包括諸如，硫代碟酸g旨、二硫 94608.doc -17- 1294915 代填酸酯、砸代鱗酸酯、二叾西代填酸酯、苯胺硫代鱗酸酯 (phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯（phoshoraniladate)、 胺基磷酸鹽與其類似物之寡核苷酸鍵。參閱，例如， LaWanchQ 專 kNucl. Acids Res · 14:9081 {1986、\ Stec 等人 J. dm· C/zem. S%· 106: 6077 (1984); Stein等人iVi/c/· 乂以·心及 16:3209 (1988); Ζοη 等人Drwg 6:539 (1991); Zon 等 k Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein，Ed., Oxford University Press，Oxford England (1991)); Stec 等人 U.S. Patent No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical 90:543 (1990)，其揭示内容以引用的方式倂入本文 中。若需要，寡核苷酸可包括用於偵測的標記。 π可操作地連接"序列包括與相關基因鄰近的表現控制序 列及以反式或一段距離作用來控制相關基因的表現控制序 列。本文所用之術語，，表現控制序列”係指所必需的用於影 響其所綁紮的編碼序列之表現與加工的多核苷酸序列。表 現控制序列包括適當的轉錄起始、終止、啓動子與增強子 序列；有效的RNA加工訊號，諸如，剪接與聚腺苷酸化訊 號；穩定細胞質mRNA的序列；增強轉譯效率的序列（即 Kozak—致性序列）；增強蛋白質穩定性的序列；及當需要 時增強蛋白質分泌的序列。該等控制序列的性質視宿主有 機體而不同；在原核生物中，該等控制序列一般包括啓動 子、核糠體結合位點及轉錄終止序列；在真核生物中，通 常該等控制序列包括啓動子與轉錄終止序列。術語”控制序 94608.doc -18 - 1294915 j匕括以取小值且其存在為表現與加工所必需的所有組 伤，且亦可包括有利地存在的額外組份，例如，前導庠列 與融合配對序列 本文所用術語”載體，，係指核酸分子，其能轉運另一個其 所連接的核酸。—種類型的載體為，，質粒”，其係指環形雙 鏈DNA環，額外腿片斷可綁紫至其上。另—種類型的載 體：病毋載體，其中額外DNA片斷可綁紮至病毒基因組。 特定的載體能夠在其被導人的宿主細胞中進行自主複製 (例广，具有細菌來源複製的、細菌載體及肖離型(—。—) 甫礼動物載體）。其它載體（例如，非游離型哺乳動物載體） 一旦被導入宿主細胞中便可被整合至宿主細胞的基因,且 上，且進而與宿主基因組-同複製。而且，特定載體能夠 控制與其可操作連接的基因的表現。本文中該等載體被稱 為，重組表現載體"（或簡言之，”表現載體”）。通常而言，應 用於重組DNA技術中表現載體通f為質粒的形式。在本言: 明書中，”質粒"與”載體”可交#地使用，因為質粒係最常用 形式的載體。然而，本發明意欲包括其它形式的表現载體， 諸如’病毒載體（例如，複製缺陷逆轉錄病毒、腺病毒與腺 相關病毒），其可發揮同等功能。 本文所用術語，，重組宿主細胞，，（或簡言之，，宿主細胞，，）係 指重組表現載體導入其中的細胞。應瞭解該等術語預期地 不僅係指特殊主體細胞而且指該細胞的後代。因為由於突 變或環境影響使得特^的修飾可在隨後幾代中發生，所以 4後代可此貫際上不與親代細胞一致，然而其依然包括於 94608.doc -19- 1294915 本文所用的術語”宿主細胞”之範蜂中。 除非另有列出，否則對於核酸序列的引用涵蓋了其補 體。因此，應瞭解對於具有特殊序列之核酸分子的引用涵 蓋了其之具有互補序列的互補鏈。 本文所用術語"標記”或"經標記的"係指另一分子倂入抗 體中。在-實施例中，該標記為可谓測的標諸，例如，: 入放射性標記胺基酸或附著可藉由標記的抗生物素蛋白來 偵測的生物素基部分之多肽（例如，含有螢光標諸的抗生物 素蛋白鏈菌素或可藉由光學或比色方法來偵測的酶活 !)在另貝鉍例中，s亥標記或標誌可為治療性的（例如） 藥物結合物（drug e()njugate)或毒素。各種標記多狀及糖蛋 白之方法係此項技術中已知且可使用的。多肽標記之實例 包括（但不限於）如下：放射性同位素或放射性核素（例如， 記（例如，FITC、若丹明（rh〇damine)、鋼系元素碟光體）， 酶標記（例如，辣根過氧化物酶、卜半乳糖苷酶、螢光素酶、 驗性鱗酸酶）’化學發光標鍵、，生物素基，藉由第二指示物 所識別的預定多肽抗原決定部位（例如，自胺酸拉鏈配對序 列、第二抗體的結合位點、金屬結合功能域、抗原決定部 位標簽）’磁性試劑，諸如釓螯合劑，諸如百日咳毒素之圭 素、紫杉醇、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、漠化乙錠了依= 丁（emetine)、絲裂黴素、依託泊普（et〇p〇side)、特諾= (tenoposide)、長春新驗、長春驗、秋水仙素、經道笔t忾 素（doxorubicin)、柔紅黴素（dau_bicin)、二經基炭疽 ^ 94608.doc -20- 1294915 素二酮（dihydroxy anthracin dione)、米托蒽酉昆 (mitoxantrone)、米拉黴素（mithramycin)、放線菌素 (actinomycin)D、1-去氫睾酮、糖皮質激素、普魯卡因 (procaine)、丁卡因（tetracaine)、利多卡因（lidocaine)、普萘 洛爾（propranolol)與嗓吟黴素（puromycin)及其類似物或同 源物。在特定實施例中，藉由不同長度的間隔物臂來附著 標記以減少潛在的位阻。 本文所用術語π試劑π係指化合物、化合物之混合物、生 物大分子或由生物物質所製得的萃取物。本文所用術語'’醫 藥試劑或藥物π係指一種當適當地投藥於患者時能夠誘導 所要治療效果的化合物或組合物。本文中其它化學術語係 根據此項技術中習知的用法來使用，如The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S.5 Ed.? McGraw-Hill, San Francisco (1985))，其以引用的方式倂入本文中）所例示。 本文所用術語π抗新生物試劑π係指具有抑制新生物在人 體中發展或進行之功能特性的試劑，尤其係惡性（癌性）病 變，諸如，癌、肉瘤、淋巴瘤或白血病。抑制轉移為抗新 生物試劑的常見特性。 抗體可為IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。在一較佳實 施例中，抗體為IgG且為IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞型。在 一更佳實施例中，抗IGF-IR抗體為亞類IgG2。 藉由此項技術中已知的任何方法可確定抗IGF-IR抗體之 類與亞類。通常而言，使用對於抗體的特定類與亞類有特 異性的抗體可確定抗體的類與亞類。該等抗體可由市售得 94608.doc -21 - 1294915 到藉由ELISA、西方墨點法（Western B1〇t)及其它技術可 石雀定類與亞類。或者，可藉由如下程序來確定類與亞類： 將抗體之重鏈及/或輕鏈的所有或一部分恆定功能域定 序，將其胺基酸序列與已知的各種免疫球蛋白之類與亞類 的胺基酸序列相比較，及確定抗體的類或亞類。 本發明亦提供包含由人類κ基因所編碼之可變序列的抗 IGF-IR抗體。在一較佳實施例中，可變序列由νκΑ27，Α3〇 或012基因家族來編碼。在一較佳實施例中，可變序列由人 類Vk A30基因來編碼。在一更佳實施例中，輕鏈包含三個 口復至由種糸序列所編碼的胺基酸序列的骨架突變。 SEQ ID NO 1提供 2.12.1fx重鏈之 DNA序列。SEQ ID N0 2 提供2.12.1fx輕鏈之DNA序列。SEQ m N〇 3提供2.i2ifx 重鏈之胺基酸序列。SEQ ID NO 4提供種系]；)；^”之胺基酸 序列。SEQ ID NO 5提供2.12.1fx輕鏈之胺基酸序列及SEQ ID NO 6提供種系A30/Jkl之胺基酸序列。所顯示的該等序 列係關於包括訊號序列之抗體的未成熟前驅體。 在貝施例中，抗IGF-IR抗體包含由人類Vh Dp_35、 DP-47、DP_70、DP-71或νΐν·4/4_35基因家族所編碼的可變 區序列。在一較佳實施例中，可變區序列係衍生自人類Vh DP-35基因。在一更佳實施例中，重鏈包含兩個回復至由種 系序列所編碼之胺基酸序列的骨架突變。 吾人提供本發明之編碼抗IGF_IR抗體的核酸分子。 在一實施例中，編碼輕鏈可變區的核酸分子係衍生自 A30、A27或012 Vk基因。在一較佳實施例中，輕鏈係衍生 94608.doc -22- 1294915 自A30 Vk基因。在另一較佳實施例中，編碼輕鏈的核酸分 子包含衍生自JkI，JK2或JK4的接合區。 本發明亦提供一種包含核酸序列的核酸分子，該序列編 碼2.12_lfx輕鏈之可變區的胺基酸序列。 本發明亦提供一種編碼重鏈可變區（VH)的核酸分子，其 衍生自 DP-3 5、DP-47、DP-71 或 VIV-4/4.3 5 VH基因，較佳 為DP-35 VH基因。在另一較佳實施例中，編碼¥11的核酸分 子包含衍生自JH6或JH5(較佳為][只6)的接合區。本發明亦提 供種核酸分子，其包含編碼2.12.1 fx重鏈可變區之胺基酸 序列的核酸序列。 編碼人類抗體重鏈與輕鏈兩者或其中之一或其可變區的 核酸分子可由產生人類抗體的任何來源而獲得。分離編碼 抗體之mRNA的方法在此項技術中係熟知的。參閱，例如， Sambrook等人。該mRNA可用於產生在聚合酶鏈式反應 (PCR)或抗體基因之cDNA選殖中所使用的cDNA。在本發明 之一貫施例中，可由如上所述表現抗IGF_IR抗體的雜交瘤 獲得核酸分子，較佳為具有表現人類免疫球蛋白基因的轉 基因動物細胞作為其融合夥伴之一的雜交瘤，諸如， XENOMOUSE™、非人類小鼠轉基因動物或非人類、非小 鼠轉基因動物。IGF-1R抗體一般可應用於本發明之人類抗 體而非彼等對IGF-1R特異的抗體。 藉由將編碼重鏈可變功能域或其抗原結合功能域之核酸 刀子與重鏈之恒定功能域融合可建構編碼抗IGF-ir抗體之 整個重鏈的核酸分子。類似地，藉由融合編碼輕鏈可變功 94608.doc -23- 1294915 能域或其抗原結合功能域之核酸分子與輕鏈恆定功能域可 建構編碼抗IGF-IR抗體之輕鏈的核酸分子。編碼VH與VL 鏈的核酸分子可藉由將其分別插入已編碼重鏈恆定區與輕 鏈恆定區的表現載體而轉換為全長的抗體基因，由此VH片 斷可操作地連接至載體内的重鏈恆定區（CH)片斷而VL片 斷可操作地連接至載體内的輕鏈恆定區（CL)片斷。或者， 藉由使用標準分子生物技術而連接（例如，綁紮）編碼VH鏈 的核酸分子至編碼CH鏈的核酸分子使得編碼VH或VL鏈的 核酸分子轉換成為全長的抗體基因。使用編碼VL與CL鏈的 核酸分子可達成相同的目的。人類重鏈與輕鏈恆定區基因 的序列在此項技術中係已知的。參閱，例如，Kabat等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest 5 第 5版’ NIHPubl. No. 91-3 242, 1991。接著，編碼全長重鏈及/或輕 鏈的核酸分子可由細胞來表現，已將其導入該細胞中且分 離抗IGF-IR抗體。 在另一實施例中，編碼抗IGF-IR抗體之重鏈或其抗原結 合功能域，或抗IGF-IR抗體之輕鏈或其抗原結合功能域的 核酸分子可自表現人類免疫球蛋白基因且以1GF-IR抗原來 免疫的非人類、非小鼠動物分離。在其它實施例中’核酸 分子可自抗IGF-IR抗體產生細胞分離’該細胞衍生自非轉 基因動物或衍生自產生抗1^^-爪抗體的人類患者。自抗 IGF-IR抗體產生細胞分離mRNA的方法可藉由標準技術來 分離、使用PCR與庫建構技術來選殖及/或放大且使用標準 協定來篩選以獲得編碼抗IGF_IR重鏈與輕鏈的核酸分子。 94608.doc -24- 1294915 如下所述，核酸分子可用於重組地表現大量抗IGF-IR抗 體。如下進一步敍述，核酸分子亦可用於產生單鏈抗體、 免疫黏附素、微型雙功能抗體、突變抗體及抗體衍生物。 在另一實施例中，本發明之核酸分子可用作特異性抗體 序列的探針或PCR引子。例如，核酸分子探針可用於診斷 方法中，或核酸分子PCR引子可用於放大DNA區，其尤其 用於分離用以產生抗IGF-IR抗體之可變功能域的核酸序 列。在一較佳實施例中，核酸分子為募核苷酸。在一更佳 實施例中，寡核苷酸係由相關抗體之重鏈與輕鏈的高度可 變區而來。 本發明挺供包含本發明之編碼重鏈或其抗原結合部分之 本發明核酸分子之載體。本發明亦提供包含本發明之編碼 輕鏈或其抗原結合部分之本發明核酸分子之載體。本發明 亦提供包含編碼融合蛋白、修飾抗體、抗體片段及其探針 之核酸分子之載體。 為了表現本發明抗體或抗體部分，將如上所述得到的、編 碼部分長度或全長重鏈與輕鏈之DNA插入表現載體中，讀 該等基因可以人工操作性地連接至轉錄與轉譯控制序列 上。表現載體包括質粒、逆轉錄病毒、黏性質粒、yac、 EBV何生之游離基因及其類似物。將抗體基因接合至載體 ^由此载體内的轉錄與轉譯控制序列便可發揮其預 调即抗體基因轉錄與轉譯的功能。選用與所用之表現宿主 細胞相容的表現載體與表現控制序列。抗體輕鏈基 體重鏈基因可插人至個 /、抗 播入至個別的載體中。在一較佳實施例中， 94608.doc -25 - 1294915 是將兩種基因插入至相同的表現載體中。以標準方法將抗 體基因插入至表現載體中（例如，進行抗體基因片斷上與載 體上之互補性限制酵素位點之接合作用，或若沒有限制酵 素位點時，則進行鈍端接合作用）。 適宜的載體為編碼功能性完整人類CH或CL免疫球蛋白 序列的載體’其具有適當之設計限制酵素位點，如此任何 VH或VL序列可谷易插入並表現。在該等載體中，剪接通常 發生在插入J區中的剪接供體位點與人類C區之前的剪接受 體位點之間，且亦發生在人類〇11外顯子内發生的剪接區。 聚腺苷醯化作用與轉錄終止發生在編碼區下游的天然染色 體位點。重組表現載體亦可編碼訊號肽，其可促進源自宿 主細胞之抗體鏈之分泌。該抗體鏈基因可選殖至載體中， 以使訊號肽以順讀方式連接至抗體鏈基因之胺基末端。該 訊號肽可為免疫球蛋白訊號肽或異種訊號肽（即纟源自非 免疫球蛋白蛋白質之訊號肽）。 除了抗體鏈基因之外，本發明之重組表現載體亦載運控 制佰主細胞中抗體鏈基因表現的調節序列。熟悉此項技術 者應瞭解包括調節序列之選擇的表現載體的設計可視如下 α亥等□素而疋·待轉型的宿主細胞的選擇、所要蛋白質的 表現水平等等。較佳的用於_宿主細胞表現之調節序列 包括導向哺乳動物細胞中高水平的蛋白f表現病毒要辛， 諸如，衍生自逆轉錄LTR的啓動子及/或增強子；巨細胞病 毋（CMV)(,f如，CMV啓動子/增強子）；猿病毒⑽（州〇)(諸 如，SV40啓動子/增強子）；腺病毒（例如，腺病毒主要晚期 94608.doc -26 - 1294915 啓動子（AdMLP));多瘤病毒與強哺乳動物啓動子，諸如天 然免疫球蛋白與肌動蛋白啓動子。對病毒調節要素及其序 列的進一步描述參閱（例如）Stinski之美國專利第5,168,062 就、Bel1等人之美國專利第4,510,245號及Schaffner等人之 美國專利第4,968,615號。 除了抗體鏈基因及調節序列之外，本發明之重組表現載 體亦可載運額外序列，諸如，宿主細胞中調節載體複製的 序列（例如，複製起始）與可選擇標誌基因。可選擇標誌基因 促進其中已導入載體的宿主細胞的選擇（例如參閱美國專 利第 4,399,216、4,634,665與5，179,017號）。例如，可選擇標 w基因通常賦予其中已導入載體的宿主細胞對於藥物（諸 如’ G41 8、潮黴素或氨曱嗓呤）的抵抗性。較佳的可選擇標 諸基因包括二氫葉酸還原酶（DHFR)基因（用於dhfr-宿主細 胞以氨曱喋呤選擇/放大）及新黴素磷酸轉移酶（ne〇)基因（用 於G41 8的選擇）。 編碼本發明之抗IGF-IR抗體之重鏈或其抗原結合部分 及/或輕鏈或其抗原結合部分的核酸分子及包含該等核酸 为子的載體可用於轉型適合的宿主細胞。可藉由任何已知 方法轉型以用於將多核苷酸導入宿主細胞中。將異種多核 皆酸導入哺乳動物細胞中的方法在此項技術中係熟知的且 包括葡聚糖介導的轉染、磷酸鈣沈澱、聚凝胺介導的轉染、 原生質體融合、電穿孔、脂質體中多核苷酸的封裝、生物 注射（biolisticinjection)及DNA直接顯微注射至細胞核。此 外，核酸分子可藉由病毒載體導入至哺乳動物細胞中。轉 94608.doc -27- 1294915 型細胞的方法在此項技術中係熟知的。例如參閱美國專利 第 4,399,216、4,912,040、4,740,461 及 4,959,455 號（其專利 以引用的方式倂入本文中）。 作為用於表現的宿主而可得到的哺乳動物細胞株在此項 技術中係熟知的且包括許多由美國菌種保藏中心 (American Type Culture Collecti〇n)(ATCC)所得到的不朽細 胞株。其包括中國倉鼠卵巢（CH〇)細胞、NSO、SP2細胞、 HeLa細胞、小型倉鼠腎（BHK)細胞、猴腎細胞（c〇s)、人類 肝細胞癌細胞（例如，Hep G2)、A549細胞、3T3細胞及大量 其它細胞株。哺乳動物宿主細胞包括人類、小鼠、大鼠、 狗、猴、豬、山羊、牛、馬及倉鼠細胞。特定較佳之細胞 株係藉由確定哪種細胞株具有高表現水平而選出。可使用 的其它細胞株為昆蟲細胞株（諸如Sf9細胞）、兩棲動物細 胞、細菌細胞、植物細胞及真菌細胞。當將編碼重鏈或其 抗原結合部分與輕鏈及/或其抗原結合部分的重組表現載 體導入哺乳動物宿主細胞中時，抗體係藉由將宿主細胞培 養一段日守間直至足以容許抗體在宿主細胞中表現（或較佳 地，容許抗體分泌至宿主細胞生長的培養基中）而產生。使 用標準蛋白質純化方法可將抗體自培養基回收。 此外，可藉由大量已知技術來增強由生產細胞株而來的 本發明之抗體（或由此其它部分）的表現。例如，麩胺醯胺合 成酶基因表現系統（GS系統）為在特定條件下用於增強表現 的常用方法。完全或部分聯繫歐洲專利第〇 2丨6 8 4 6、 0 256 055與0 323 997號及歐洲專利申請案第893〇3964 4號 94608.doc -28- 1294915 對GS系統進行討論。 不同細胞株或在轉基因動物中所表現的抗體可能具有彼 此不同的糖基化作用。然而，本文所提供之核酸分子所編 碼或包含本文所提供之胺基酸序列的所有抗體儘管與抗體 的糖基化作用無關但仍為本發明之部分。 本發明亦提供包含一或多個本發明之核酸分子的轉基因 非人類動物，該等核酸分子可用於產生本發明之抗體。抗 體可在組織或體液中產生且自其回收，諸如，山羊、奶牛、 馬、猪、大鼠、小鼠、兔子、倉鼠或其它哺乳動物的奶、 血液或尿液。例如參閱美國專利第5,827,69〇、5,756,687、 5,750，172及5,741，957號。如上所述，可藉由以IGF_IR或其 一部分來免疫而產生包含人類免疫球蛋白基因座的非人類 轉基因動物。 在另一實施例中，藉由標準轉基因技術將本發明之一或 多個核酸分子導入動物中而產生非人類轉基因動物。參閱 Hogan，前述。用於製造轉基因動物的轉基因細胞可為胚胎 幹細胞或體細胞。轉基因非人類有機體可為嵌合、非嵌合 雜合子及非嵌合純合子。例如參閱Hogan等人，Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2ed·，Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson 等人’ Mose Genetics and

Trailsgcnics. A Pr3,ctic3<l Approach. Oxford University Press (2000), and Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook. Academic Press (1999)。在另一實施 例中，轉基因非人類有機體可具有編碼相關重鏈及/或輕鏈 94608.doc -29- 1294915 的目標破壞與置換。在一較佳實施例中，轉基因動物包含 且表現編碼重鏈與輕鏈的核酸分子’其特定結合至 IGF-IR，較佳為人類IGF-IR。在另一實施例中’轉基因動 物包含編碼經修飾之抗體的核酸分子，諸如單鏈抗體、後 合抗體或人化抗體。抗IGF-IR抗體可在任何轉基因動物中 製造。在一較佳實施例中，非人類動物為小鼠、大鼠、綿 羊、猪、山羊、牛或馬。非人類轉基因動物表現5亥專在血 液、奶、尿、唾液、眼淚及其它體液中的編碼之多肽。 可藉由篩選重組組合抗體庫（較佳地為scFv噬菌體陳列 庫）來分離本文所揭示之除抗IGF-IR抗體之外的重組人類 抗體，該抗體庫係使用由衍生自人類淋巴細胞的mRNA而製 備的人類VL與VH cDNA來製備。製備及篩選該等抗體庫之 方法學在此項技術中係已知的。有市售套組用於產生噬菌 體陳列庫（例如，法瑪西亞（Pharmacia)重組噬菌體抗體系 統，目錄第 27-9400_01號；及 Stratagene SurfZAPTM噬菌體 陳列套組，目錄第240612號）。亦有其它方法及試劑可用於 產生及篩選抗體陳列庫（例如參閱Ladner等人之美國專利第 5,223,409 號；Kang 等人之 PCT 公開案號 WO 92/18619 ; Dower等人之PCT公開案號WO 91/17271 ; Winter等人之PCT 公開案號WO 92/20791; Markland等人之PCT公開案號WO 92/15 679 ; Breitling 等人之 PCT 公開案號 WO 93/01288 ; McCafferty 等人之 PCT公開案號 WO 92/01047 ; Garrard 等人 之 PCT 公開案號 WO 92/09690 ; Fuchs 等人（1991) Bio/ Technology 9:1370-1372 ; Hay 等人（1992) Hum· Antibod· 94608.doc -30- 1294915

Hybridomas 3:81-85 ; Huse等人（1989) Science 246:1275-1281 ; McCafferty等人，Nature (1990) 348:552-554 ; Griffiths等人 (1993) EMBO J 12:725-734 ; Hawkins 等人（1992) J· Mol. Biol· 226:889-896 ; Clackson等人（1991) Nature 352:624-628 ; Gram等人（1992) Proc. Natl. Acad. Sci· USA 89:3576-3580 ; Garrad等人（1991) Bio/Technology 9:1373-1377 ; Hoogenboom 等人（1991) Nuc Acid Res 19:413 3-4137;及 Barbas 等人（1991) Proc. Natl· Acad· Sci· USA 88:7978-7982)。 在一較佳實施例中，為了分離具有所要特徵之人類抗 IGF-IR抗體，使用在Hoogenboom等人之PCT公開案號 WO 93/06213中所述的抗原決定部位印記方法，首先將如本 文所述之人類抗IGF-IR抗體用於選出對IGF-IR具有類似結 合活性的人類重鏈與輕鏈序列。在該方法中所用的抗體庫 較佳為如McCaffeirty等人之PCT公開案號WO 92/01047 ; McCafferty 等人，Nature (1990) 348:552-554 ;及 Griffiths 等人，（1993) EMBO J 12:725_734中所述而製備及篩選的 scFv庫。較佳地使用人類IGF-IR作為抗原來筛選scFv抗體庫。

一旦選出初始人類VL及VH片斷，則執行”混合及匹配” 實驗以選出較佳的VL/VH對組合，其中篩選出不同對的最 初選出之VL及VH片斷而用於IGF-IR結合。此外，為了進一 步改良抗體的品質，在類似於自然免疫反應中造成抗體親 和性成熟之活體内體細胞突變過程的過程中，較佳的 VL/VH對之VL及VH片斷可隨機地突變，較佳在VH及/或VL 之CDR3區内。活體外親和性的成熟可藉由使用各自與VH 94608.doc -31- 1294915 CDR3或VL CDR3互補的PCR引子而放大VH與VL區來完 成’其中引子與特定位置四個核苷酸鹼基之隨機混合物一 起’’刺突（spiked)”，以至於生成的PCr產物編碼Vh與VL片 斷’已將隨機突變導入至VH及/或VL CDR3區的該等片斷 中。可將該等隨機突變之VH與VL片斷重新篩選用於結合 IGF-IR。 由重組免疫球蛋白陳列庫篩選及分離本發明之抗IGF_IR 抗體之後’可將編碼選定之抗體的核酸自陳列封裝（例如， 由嗟菌體基因組）回收且藉由標準重組DNA技術來次選殖 至其它表現載體中。如下所述，若需要，則可進一步操縱 該核酸以創造本發明之其它抗體形式。如上所述，為了表 現藉由篩選組合庫所分離的重組人類抗體，將編碼抗體的 DNA選殖至重組表現載體中且導入至哺乳動物宿主細胞 中。 可將如上所述所得到的抗IGF_IR抗體的種類轉換成另一 種。在本發明之一態樣中，使用此項技術中熟知的方法來 分離編碼VL或VH的核酸分子，由此其不包括任何編碼 或CH的核酸序列。接著將編碼vl或VH的核酸分子自不同 類別的免疫球蛋白分子可操作地連接至編碼CL或ch的核 酸序列。如上所述，此可使用包含CL或CH鏈之載體或核酸 分子來達成。例如，可將最初為IgM的抗IGF_IR抗體類別轉 換成為IgG。此外，該類別轉換可用於轉換一種IgG亞類至 另一種，例如，由IgGl轉換為lgG2。用於生產包含所要同 種型之本發明抗體的較佳方法包含如下之步驟：分離編碼 94608.doc -32- 1294915 抗IGF-IR抗體重鏈之核酸與編碼抗IGF-IR抗體輕鏈之核 酸，獲得到重鏈之可變區，綁紮重鏈可變區與所要同種型 重鏈之惺定功能域，在細胞中表現輕鏈與經綁紮之重鏈， 及收集具有所要的同種型之抗IGF-IR抗體。 使用一般技術者已知的技術與方法吾人可使用如上所述 的核酸分子來產生抗體衍生物。根據本發明，一或多種選 定位置之已突變胺基酸殘基接著由相應的種系殘基來置 換。 在另一實施例中，可製造融合抗體或免疫黏附素，其包 含連接至另一種多肽之全部或一部分抗IGF_IR抗體。在一 較佳實施例中，僅抗IGF-IR抗體之可變區連接至多肽。在 另一較佳實施例中，抗IGF-IR抗體之VH功能域連接至第一 多肽’同時抗IGF-IR抗體之VL功能域以一種方式連接至與 第一多肽相關的第二多肽，其中VH與VL功能域可彼此相互 作用以形成抗體結合位點。在另一較佳實施例中，連接體 將VH功能域自VL功能域分離，由此vh與與VL功能域可彼 此相互作用。接著將VH-連接體-VL抗體連接至相關多肽。 融合抗體適用於將多肽導向至IGF-IR-表現細胞或組織。多 肽可為治療性試劑，諸如，毒素、生長因子或其它調節蛋 白，或可為診斷性試劑，諸如可易於顯現的酶，如辣根過 氧化物酶。此外，可創造出其中兩（或多）個單鏈抗體彼此相 互連接的融合抗體。若想要在單一多肽鏈上創造出二價或 多價抗體或者若想要創造出雙特異性抗體，此係有用的。 為了創造單鏈抗體，可將（scFv)VH-與VL-編碼之DNA片 94608.doc -33· 1294915 斷可操作地連接至另一編碼可撓性連接體的片斷，例如， 編碼胺基酸序列（Gly4-Ser)3，因此VH與VL序列可表現為鄰 接的單鏈蛋白，其中可撓性連接體接合VL與VH區（例如參 閱 Bird等人（1988) Science 242:423-426 ; Huston等人（1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 ; McCafferty等 人，Nature (1990) 348: 552-5 54)。若僅使用單一 VH 與 VL， 則單鏈抗體可為單價；若使用兩個VH與VL，則其為二價； 或若使用兩個以上的VH與VL，則其為多價。 在另一實施例中，可使用抗IGF-IR-編碼之核酸分子來製 備其它經修飾抗體。例如，根據本說明書之教示使用標準 分子生物學技術可製備下列：bodieS)”（III等 人，尸⑺化以五10: 949-57 (1997))，，’微型體（Minibodies)’， (Martin等人，EMBO J 13·· 5303-9 (1994))，”微型雙功能抗 體（Diabodies)’’（Holliger 等人，PNAS USA 90: 6444-6448 (1993))，或等人，EMBO J 10: 3655-3659 (1991)及 Traunecker 等人 ’’Janusin: new molecular design for bispecific reagents” Int J Cancer Suppl 7:51-52 (1992)) 〇 本發明之抗體或抗體部分可衍生自或連接至另一分子 (例如，另一種肽或蛋白質）。通常而言，將抗體或其部分進 行衍生使得衍生作用或標記不會不利地影響IGF-IR結合。 相應地，希望本發明之抗體及抗體部分包括完整與經修飾 形式之本文所述的人類抗IGF-IR抗體。例如’本發明之抗 體或抗體部分可功能性地連接（藉由化學偶合、基因融合、 94608.doc -34- 1294915 非共價結合或其它的方式)至一或多個其它分子實體上，諸· 如另一種抗體（例如，雙特異性抗體或微型雙功能抗體）、偵.. 測試劑、細胞毒試劑、醫藥試劑及/或蛋白質或肽，其都可·.' 間接結合抗體或抗體部分與另一分子（諸如，抗生物素蛋白 鏈素核心區或聚組胺酸標簽）。 種類t之衍生抗體係藉由交聯兩個或兩個以上抗體 (相同類型或不同類型’例如用以創造雙特異性抗體）而產 生。適當的交聯劑包括彼等為異種雙官能之交聯劑，其具籲 有兩個由適當的間隔物而分離的明顯反應基（例如，…馬來 蠢 醯亞胺苯甲醯-N_羥基琥珀醯亞胺酯）或包括彼等為同種雙 吕能之交聯劑（例如，辛二酸二琥珀醯亞胺）。該等交聯劑可 由 Pierce Chemical Company，Rockford，III購得。 另一種類型之衍生抗體為經標記抗體。有用的偵測試劑 (本發明之抗體或抗體部分可與其一起衍生而來）包括螢光 化合物，其又包括螢光素、螢光素異硫氰酸酯、若丹明、 5-二甲胺小萘磺醯基氯化物（卿如⑹㈣φ chlcmde)、澡紅蛋白、鑭系元素鱗光體及其類似物。亦可# 以適用於偵測的酶來標記抗體，諸如，辣根過氧化物酶、卜 - 半乳糖芽酶、螢光素酶、驗性餐酶、葡萄糖氧化酶及纟 類似物。當以可偵測酶來標記抗體時，藉由加入酶所使用 以產生可鑒別之反應產物的額外試劑來偵測。例如，當試 · 劑辣根過氧化物酶存在時，過氧化氯及二胺基聯笨胺的力口' 入可導致產生可偵測的著色反應產物。也可用生物素來標 記抗體，且通過間接量測抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈 94608.doc -35- 1294915 菌素之結合來偵測。可用磁性試劑來標記抗體，諸如釓。 也可用預定之多肽抗原決定部位來標記抗體，該等抗原決 定部位可藉由二級指示物（例如，白胺酸拉鏈配對序列、二 級抗體的結合位點、金屬結合功能域、抗原決定部位標簽） 識別。在特定實施例中，藉由不同長度的間隔物臂來附著 標記以減少潛在的位阻。 抗IGF-IR抗體亦可由經放射性標記的胺基酸來標記。該 放射性標記可用於診斷與治療目的。例如，藉由X射線或其 它診斷技術’放射性標記可用於偵表現的腫瘤。 此外，放射性標記可作為毒素而用於治療癌細胞或腫瘤。 用於多肽之標記的實例包括（但不限於）如下放射性同位素 或核素：3H、14C、15N、35S、9〇Y、99Tc、⑴沁、1251、131卜 抗igf-ir抗體亦可用化學基團，諸如，聚乙二醇（pEG)、 甲基或乙基、或碳水化合物基來衍生。該等基團可用於改 良抗體的生物學特徵’例如’增加血清半衰期或增加电 結合。 ▼ 一 一"·，日y且低夕丙症^ 藥組合物’其包含治療有效劑量之本發明化合物與^ 上可接受的載劑。在-實施例中，該醫藥組合物係用方 療癌症，諸如，腦、肺、鱗狀細胞、膀胱、胃、姨腺、 腺、頭部1部、腎（⑽al，kidney)i巢、前列腺、 直腸& c #科或甲狀腺癌。根據本發明之方法可 發明之化合物來治疼的自土 麇的心者包括（例如）已確診患 症的患者··多發性骨髓瘤 随以液體腫瘤、肝癌、胸腺病 94608.doc -36- 1294915 τ-細胞介導自體免疫疾病、内分泌病症（end〇cr〇n〇i〇gical disorder)、局部缺血、神經變性病症、肺癌、骨癌、胰腺 癌、皮膚癌、頭部與頸部癌、皮膚或眼内黑素瘤、子宮癌、 印巢癌、直腸癌、肛門區的癌、胃@、結腸癌、乳腺癌、 婦科腫瘤(例如，子宮肉瘤，管癌、子宮内膜癌、子宮 頸癌、陰道癌或外陰癌）、何傑金（H〇dgkin)氏病、食道癌、 1、腸癌、内分泌系統癌（例如，甲狀腺、甲狀旁腺或腎上腺 癌）权組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、慢性或急 陘白血病、兒童期的實體腫瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱 癌、月癌或輸尿管癌（例如，腎細胞癌、腎盂癌）或中樞神經 系’先新生物（例如，原發性CNS淋巴瘤、脊椎轴腫瘤、腦幹 神經膠質瘤或垂體腺瘤）。 在另貝施例中，該醫藥組合物係關於非癌性高度增殖 性病症，諸如（但不限於）血管成形術後的再狹窄與銀屑病。 在另一實施例中，本發明係關於治療需要激活igf_ir之哺 =動物的醫藥組合物，#中該醫藥組合物包含治療有效劑 ΐ之本發明之活化抗體與醫藥學上可接受的載劑。包含活 化抗體的醫藥組合物可用於治療缺乏足夠或η 的動物’或可用於治療骨質疏鬆、脆弱或哺乳動物分泌極 ν活性生長激素或不能對生長激素做出反應的病症。 本發明之抗IGF-IR抗體可倂入適合投藥於受驗者 組合物中。福a ^ ^ 吊’该醫藥組合物包含本發明之抗體與醫藥 :上可接党的載劑。如本文中所用，，’醫藥學上可接受的載 劑包括任何及所有溶劑、分散介質、塗層、抗細菌與抗真 94608.doc -37- 1294915 菌 物 及其生理上可相容的類似 一或多種水、生理食鹽水、 試劑、等張與吸收延緩試劑 。醫藥學上可接受的栽劑包括 右旋糖、甘油、乙醇及其類似物， 磷酸鹽緩衝生理食鹽水 、/、、、且口在序夕情況下，組合物中最好包括等張試劑， \糖^疋醇，諸如，甘露醇、山梨醇，或氣化鈉。 醫藥學上可接受的物質，諸如濕潤或少量辅助物質，如濕 門d或礼化劑、防腐劑或緩衝劑，其增強了抗體或抗體部 分的存放期或效力。 本毛月之組合物可為各種形式。其包括（例如）液體、半 固f與固體劑型，諸如’液體溶液（例如，可注射與能注入 ^合液）、分散液或懸浮液、錠劑、丸劑、散劑、脂質體及 ，丨車乂仏的形式視意預投藥的模式與治療應用而定。典 型，佳的組合物為可注射或能注人之溶液，諸如，類似於 :用於以其它抗體來使人類被動免疫之組合物。較佳的 技条松式為腸外方式⑽如，靜脈内、皮下、㈣内、肌肉 =)在一較佳實施例中，抗體係藉由靜脈内注入或注射來 在另車乂佳貫施例中，抗體係藉由肌肉内或皮下注 射來投予。 m卜庄 療、且σ物在製造與儲存條件下通常必須為無菌與穩定 式 、口物可凋配為溶液、微型乳液、分散液、脂質體 、〔其：適合於高藥物濃度的有序結構。若需要，則無菌可 〆主射/合液可猎由將所需量的抗IGF-IR抗體與如上所列舉之 成份中的一綠+ # ,. 或其組合倂入適合溶劑中來製備，隨後過濾 殺菌。ϋ當％ + w 、⑥向g，分散液可藉由將活性化合物與所要的上 94608.doc -38- 1294915 =所列舉之其它成份倂人含有基礎分散介質的無菌媒劑中 來製備。在以無菌散劑來製備無菌可注射溶液時，較佳的 製備方法為真空乾燥與; 東結乾燥’其可產出活性成份外加 任何由其先岫無菌過濾溶液而來的額外所要成份之散劑。 在如下條件下可以維持溶液之適當流動性，例如，藉由使 用，層（如I卩磷脂），在為分散液時藉由維持所要的顆粒尺寸 及藉由使用界面活性劑。可藉由在組合物中包括—種延緩 吸收的試劑來達成可注射組合物的延長吸收，例如，單硬 脂酸鹽與明膠。 雖然對於多種治療應用而言本發明之抗體可#由此項技 術中已知的各種方法來投藥，但較佳的投藥路徑/模式為腹 膜内、皮下、肌肉内、靜脈内或注入。熟練的技工將會瞭 解，投藥之路徑及/或模式將視所要的結果而變化。在一實 施例中，本發明之抗體可以單劑量或多劑量來投藥。 在特定實施例中，活性化合物可與載劑一起製備，載劑 將保護化合物避免快速釋放，諸如，受控之釋放調配物， 包括植入物、皮膚貼片及微膠囊傳遞系統。可使用生物可 P牛解與生物相容的聚合物，諸如，乙烯乙酸乙婦共聚物、 聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯與聚乳酸。多種製備 該等調配物的方法已申請了專利或一般為熟悉此項技術者 所瞭解。例如參閱 Sustained and Controlled Release Drug

Delivery Systems, J. R. Robinson, ed.5 Marcel Dekker, Inc., New York，1978。 補充的活性化合物亦可倂入該組合物中。在特定實施例 94608.doc -39- 1294915 中’本發明之抗igf-ir抗體與一或多種額外治療試劑共調 配及/或共投藥，諸如，化學治療試劑、抗新生物試劑或抗 腫瘤試劑。例如，抗IGF_IR抗體可與一或多種額外治療試 劑共調配及/或共投藥。該等試劑包括（但不限於）：結合其 它目標的抗體（例如，結合一或多種生長因子或細胞因子、 其細胞表面受體或的抗體）、IGF_U#合蛋白、抗新生 物試劑、化學治療試劑、抗腫瘤試劑、針對IGF_IR或igf 的反義募核苷酸、阻斷igf-ir激活的肽類似物、可溶的 IGF-IR及/或一或多種抑制IGF·]^生或活化的化學試劑，其 在此項技術中係已知的’如’奥曲狀。對於包 含活化抗體的醫藥組合物而言，該抗IGF-IR抗體可與增加 細胞增殖或避免凋亡的因子一起調配。該等因子包括生長 因子，諸如IGF-Ι及/或激活似物。該等治 療組合物可能需要較低劑量之抗IGIMR抗體以及共投藥試 劑，因此避免與各種單療法相關之可能的毒性或併發症。 在一實施例中，抗體與一或多個額外治療試劑。 本發明之醫藥組合物可包括”治療有效劑量，，或，，預防有 效刈里之本發明之抗體或抗體部分。"治療有效劑量”係指 以某劑量及持續必要時間有效達成所要治療結果的量^ 體或抗體部分之治療有效劑量可根據某些因素而變化，諸 如，個體患病情況、年齡、性別與體重，及抗體或抗體部 分引出個體所要反應的能力。治療有效劑量亦指治療有兴 效果超過抗體或抗體部分之任何毒性或有害效果時的量；; 預防有效劑量π係指以某劑量及持續 必要時間有效達成所 94608.doc -40- 1294915 要預防結果的量。通常，由於預防劑量係用於 ，或患病早期，所《預防有效劑量將會小於治療:二 量。 月 可肩正劍里服法以提供最佳所要反應（例如，治療或預防 2應）。例如’可投予單顆大丸劑，可隨時間投予若干分劑 里或可視治療情況的危急所指示按比例減少或增加劑量。 可將匕3抗體或包含治療組合（該治療組合包含抗體與一 或^種額外治療試劑）之醫藥組合物調配成為單劑量^多 劑量二尤其有利的是將腸外組合物調配成為單位劑型而便 於技藥及達成劑1的均勾性。本文所用單位劑型係指在物 理上離政的單位，其適合作為單位劑量而用於待治療之哺 乳動物受驗者；每個單位含有所計算之預定量的活性化合 物以與所要的醫藥載劑一起產生所要治療效果。對本發明 之單位劑型的說明係藉由下述⑷與⑻來指示且直接視其 而定·（a)活性化合物之獨特特徵與要達成的特定治療或預 防效果，及（b)此項技術中所固有的化合該活性化合物用於 治療個體敏感性之限制。尤其有用的調配物為在2〇 1111^檸 檬酉夂鈉PH 5.5、140 mM NaCl及0.2 mg/ml聚山梨醇酯8〇 之緩衝劑中的5 mg/ml抗IGF-IR抗體。 本發明之抗體或抗體部分之治療或預防有效劑量的例示 性非限制範圍為〇1_1〇〇 mg/kg，較佳〇·5_5〇 mg/kg，更佳 1-20 mg/kg，且亦更佳i_i〇 mg/kg。應注意的是劑量值可視 所需緩解之病症類型及嚴重度而變化。此外應進一步瞭解 對於任何特殊受驗者而言，應隨時間根據個體需要與投予 94608.doc -41 - 1294915 或監督投予組合物之人的職業判斷來調整特定的劑量服 法，且本文所提出的劑量範圍僅為例*,!·生且不希望限制所 主張組合物的料或實務。在—實_中，治療或預防有 效劑量之抗體或其抗原結合部分與一或多種額外治療試劑 一起投予。 在另一態樣中，本發明係關於以每月小於3〇〇 mg的劑量 投予本發明之抗IGF-IR抗體用於治療癌症。 本發明之另-態樣係提供包含抗IGF_IR抗體的套組與包 含該等抗體之醫藥組合物。套組除抗體或醫藥組合物^外 可包括診斷或治療試劑。套組亦包括用於診斷或治療方法 中的A明書。在-較佳實施例中，套組包括抗體或其醫藥 組合物與診斷試劑，其可用於下述方法中。在另一較佳實 施例中，套組包括抗體或其醫藥組合物與一或多種治療試 劑，諸如，額外抗新生物試劑、抗腫瘤試劑或化學治療試 劑，其可用於下述方法中。 本發明亦係關於抑制哺乳動物中異常細胞生長的醫藥組 合物，其包含一定量的本發明之化合物，其與一定量之化 學治療試劑組合，其中一定量之化合物、冑、溶劑化物或 W藥及化學治療試劑-起有效地抑制異常細胞生長。目前 有多種化學治療試劑在此項技術中已知。在一實施例中， 化學治療試劑係由下列各物組成的群中選出··有絲分裂抑 制劑、烧化劑、抗代謝物、插入式抗生素 antibiotics)、生長因子抑制劑、細胞週期抑制劑、酶、拓 撲異構酶抑帝i劑、抗生存齊卜生4勿反應修佛劑、抗激素（例 94608.doc -42- 1294915 如，抗雄激素），及抗血管生成劑。 諸如MMP-2(基質-金屬蛋白酶2)抑制劑、MMP-9(基質-金 屬蛋白酶9)抑制劑及COX-II(環氧化酶Π)抑制劑之抗血管 生成劑可與本發明之化合物聯合使用。有用的COX-Π抑制 劑之實例包括CELEBREXtm(艾力昔布（alec〇xib))、伐地昔 布（valdecoxib)與羅非昔布（rofecoxib)。有用的基質金屬蛋 白酶抑制劑係描述於WO 96/33172(公開於1996年10月24 曰）、WO 96/27583(公開於1996年3月7日）、歐洲專利申請 案第97304971.1號（申請於1997年7月8日）、歐洲專利申請案 弟 99308617.2 號（申請於 1999 年 10 月 29 日）、WO 98/07697 (公開於1998年2月26日）、WO 98/03516(公開於1998年1月 29 日）、WO 98/34918(公開於 1998 年 8 月 13 日）、WO 98/34915 (公開於1998年8月13日）、WO 98/33768(公開於1998年8月6 曰）、WO 98/305 66(公開於1998年7月16曰）、歐洲專利公開 案606,046(公開於1994年7月13日）、歐洲專利公開案 931，788(公開於 1999年 7月 28 日）、WO 90/05719(公開於 1990 年5月31日）、w〇 99/52910 (公開於1999年10月21日）、 WO 99/52889(公開於 1999年 10月 21 日）、WO 99/29667(公開 於1999年6月17曰）、PCT國際申請案號PCT/IB98/01113(申 请於1998年7月21日）、歐洲專利申請案第993 02232.1號（申 请於1999年3月25日）、英國專利申請案第99 12961.1號（申請 於1999年6月3日）、美國臨時申請案第6〇/148，464號（申請於 1999年8月12日）、美國專利5,863,949(頒發於1999年1月26 曰）、美國專利5,861，510(頒發於1999年1月19曰）及歐洲專 94608.doc -43- 1294915 利公開案 780,386(公]^^^1〇〇，/^ 1開於1997年ό月25日）中，所有内 以引用的方式全部倂入士七山 谷 本文中。較佳的ΜΜΡ抑制劑為彼等 未顯示關節痛之ΜΜΡ抑制劑。更佳的為彼等相對於其它基 質-金屬蛋白酶（即’ ΜΜΙΜ、ΜΜρ_3、ΜΜρ_4、ΜΜρ/ ΜΜΡ-6、ΜΜΡ·7、ΜΜΡ_8、MMP_1G、MMP.ll、ΜΜίΜ2 及ΜΜΡ_13)選擇性抑制ΜΜρ-2及/或ΜΜρ_9的ΜΜρ抑制 sJ適用於本务明之mmp抑制劑之一些特定實例為 AG-3340、R〇 32-3 555、RS 13-0830及列舉於下列清單之化 a物· 3-[[4-(4-氟-笨氧基）_苯續醯基]_(丨_羥基胺甲醯基_環 戊基）-胺基]-丙酸；3-外-3-[4-(4_氟_苯氧基）_苯磺醯基胺 基]_8_氧雜-二環[3·2·1]辛烧_3_羧酸經基酸胺；（2R， 3R)l-[4_(2m节氧基）_苯石黃蕴基]_3_經基-3_曱基六 氫。比啶-2-羧酸羥基醯胺；4_[4_(‘氟-苯氧基）_苯磺醯基胺 基]-四氫-哌喃_4_羧酸羥基醯胺；3-[[4-(4-氟-苯氧基）-苯磺 酸基]-(1-羥基胺甲醯基_環丁基）_胺基]_丙酸；4-[4-(4-氯-苯氧基）-苯磺醯基胺基]-四氫-旅喃-4-叛酸經基醯胺； (R) 3-[4-(4-氯-苯氧基）-苯績醯基胺基]-四氫-旅喃-3-叛酸經 基醯胺；（2R，3R)l-[4-(4-氟-2-甲基-苄氧基）-苯磺醯基]-3-羥基-3-甲基-六氫吡啶-2-羧酸羥基醯胺；3-[[4-(4-氟-苯氧 基）-苯磺醯基]-(1-羥基胺甲醯基-1-曱基-乙基）-胺基l·丙 酸；3-[[4-(4-氟-苯氧基）-苯磺醯基]-(4-羥基胺曱醯基-四氫-旅喃-4-基）-胺基]-丙酸；3-外-3-[4-(4-氣-苯氧基）-苯磺醯基 胺基]-8-氧雜-環[3.2.1]辛烷-3-羧酸羥基醯胺；3-内-3-[4-(4-氟-苯氧基）-苯磺醯基胺基]-8-氧雜-環[3·2·1]辛烷-3-羧酸羥 94608.doc •44- 1294915 基醯胺；與（R) 3-[4-(4-氟-苯氧基）-苯磺醯基胺基]-四氫-呋 喃-3-羧酸羥基醯胺；及該等化合物之醫藥學上可接受的鹽 類及溶劑化物。

本發明之組合物亦可與訊號轉導抑制劑一起使用，諸如 可抑制EGF-R(表皮生長因子受體）反應的試劑，如EGF-R抗 體、EGF抗體及EGF-R抑制劑分子；VEGF(血管内皮生長因 子）抑制劑，如VEGF受體及可抑制VEGF的分子；及erbB2 受體抑制劑，如結合至erbB2受體的有機分子或抗體，例如 HERCEPTIN™(Genentech，Inc·)。舉例而言，EGF_R抑制劑 描述於 W0 95/19970(公開於 1995年 7月 27 日）、WO 98/14451 (公開於1998年4月9曰）、WO 98/02434 (公開於1998年1月22 曰）、及美國專利5,747,498(頒發於1998年5月5日）中，且如 本文所述之該等物質可用於本發明中。EGFR-抑制劑包括 (但不限於）單株抗體C225與抗-EGFR 22Mab (ImClone Systems Incorporated)、ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys)、 EMD-7200 (Merck KgaA)、EMD_5590 (Merck KgaA)、 MDX-447/H-477 (Medarex Inc.及 Merck KgaA)，及化合物 ZD-1834、ZD-1838 與 ZD-1839 (AstraZeneca)、PKI-166 (Novartis)、PKI-166/CGP-75166 (Novartis)、PTK 787 (Novartis)、CP 701 (Cephalon)、leflunomide (Pharmacia/ Sugen)、CI-1033 (Warner Lambert Parke Davis)、CI-1033/PD 183,805 (Warner Lambert Parke Davis)、CL-387,785 (Wyeth-Ayerst) - BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/ Roche)、Naamidine A (Bristol Myers Squibb)、RC-3940-II 94608.doc -45- 1294915 (Pharmacia)、BIBX-1382(Boehringer Ingelheim)、OLX-103 (Merck & Co.)、VRCTC-310 (Ventech Research)、EGF融合 毒素（Seragen Inc·)、DAB-389 (Seragen/Lilgand)、ZM-252808 (Imperial Cancer Research Fund)、RG_50864 (INSERM)、 LFM-A12 (Parker Hughes Cancer Center) " WHI-P97 (Parker

Hughes Cancer Center)、GW-282974 (Glaxo)、KT-8391

(Kyowa Hakko)及 EGF_R 疫苗（York Medical/Centro de Immunologia Molecular (CIM))。該等與其它 EGF-R-抑制劑 可用於本發明中。 例如 SU-5416與 SU-6668(Sugen Inc·)、SH-268 (Schering) 及NX-183 8(NeXstar)之VEGF抑制劑亦可與本發明之化合 物組合。舉例而言，VEGF抑制劑描述於WO 99/24440(公開 於1999年5月20曰）、PCT國際申請案PCT/IB99/00797(申請 於1999年5月3日）、WO 95/21613(公開於1995年8月17日）、 WO 99/61422(公開於1999年12月2日）、美國專利5,834,504 (頒發於1998年11月10日）、WO 98/50356(公開於1998年11 月12日）、美國專利5,883，113(頒發於1999年3月16曰）、美國 專利5,886,020(頒發於1999年3月23日）、美國專利5,792,783 (頒發於1998年8月11日）、WO 99/10349(公開於1999年3月4 曰）、WO 97/32856(公開於 1997年 9 月 12 曰）、WO 97/22596(公 開於1997年6月26曰）、WO 98/54093(公開於1998年12月3 曰）、WO 98/02438(公開於 1998年 1 月 22 曰）、WO 99/16755(公 開於1999年4月8日）及WO 98/02437(公開於1998年1月22曰） 中，所有内容以引用的方式全部倂入本文中。適用於本發 94608.doc -46- 1294915 明之某些特定VEGF抑制劑的其它實例為IM862(Cytran Inc·);及核酶分子（angiozyme)，一 種可由 Ribozyme與 Chiron 購得之合成核糖酶。如本文所述之該等及其它VEGF抑制劑 可用於本發明中。 此外，諸如GW-282974(Glaxo Wellcome pic)及單株抗體 AR_209(Aronex Pharmaceuticals Inc·)及 2B-l(Chiron)之

ErbB2受體抑制劑可與本發明之化合物組合，例如，彼等描 述於 WO 98/02434(公開於 1998年 1 月 22 日）、WO 99/35146 (公開於1999年7月15日）、WO 99/35132(公開於1999年7月 15 日）、WO 98/02437(公開於 1998年 1 月 22 日）、WO 97/13760 (公開於1997年4月17日）、WO 95/19970(公開於1995年7月 27曰）、美國專利5,587,458(頒發於1996年12月24日）及美國 專利5,877,305(頒發於1999年3月2日）中，所有内容以引用 的方式倂入本文中。適用於本發明之ErbB2受體抑制劑亦可 於1999年1月27曰申請之美國臨時申請案第6〇/117,341號， 及於1999年1月27曰申請之美國臨時申請案第6〇/117,346號 中有所描述，兩者以引用的方式全部倂入本文中。根據本 發明，如先前PCT申請案、美國專利及美國臨時申請案中 所述之erbB2受體抑制劑化合物與物質以及其它抑制 受體之化合物與物質可與本發明之化合物一起使用。 體一起使用，如彼等在美 包括具有如下抗體序列的 本發明之抗體亦可與CTLA-4抗 國專利6,682,736中所述的抗體， 4.14·3 、 6·1·1 、 抗體·· 3.1.1、4.1.1、4.8.1、4·1〇·2、4 13 12·3·1.1或12.9.1.1。該抗體亦可與 94608.doc -47- 1294915 CD40抗體一起使用，如在公開於2003年5月15日之WO 03040170 中所述之抗體，包括具有如下抗體序列之抗體：3.1.1、 3.1.1H-A78T、3丄 1H-A78T-V88A-V97A、7·1·2、10.8.3、 15·1·1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、22.1.1H-C109A、23.5.1、 23.25.1、23·28·1、23.28.1H-D16E、23.29.1 或 24·2。 該等抗體亦可與抗整聯蛋白試劑組合，諸如，抗整聯蛋 白抗體。 可與抗體組合之試劑的某些特定實例包括如下： 烷化劑：氮芥Ν-氧化物、環磷醯胺、異環磷醯胺、苯丙胺 酸氮芬(melphalan)、白消安二漠甘露醇（busulfanmitobronitol)、 卡巴S昆（carboquone)、硫替派（thiotepa)、雷諾氮芥 (ranimustine)、尼莫司 丁（nimustine)及替莫峻胺（temozolomide); 抗代謝物：氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、核苷、巯基嘌呤、 5-FU、替加 (tegafur)、去氧氟尿苦（doxifluridine)、卡莫 氣（carmofur)、阿糖胞普（cytarabine)、奥佛非特（ocfosfate)、 依諾他濱（enocitabine)、S -1、吉西他濱（gemcitabine)、氟達 拉濱（fludarabine)及卡培他濱（capecitabine); 抗生素：放線菌素D、羥道諾紅黴素、柔紅黴素、新制癌 菌素、博萊黴素、皮歐黴素（peplomycin)、絲裂黴素C、阿 克拉黴素、°比柔比星（pirarubicin)、表阿比星（epirubicin)、 淨司他丁、（zinostatin)、替美（stimalamer)及伊達比星 (idarubicin)； 植物衍生之抗腫瘤試劑：長春新驗、長春驗、vindeshine、 依託泊苦、索布佐生（sobuzoxane)、多西他賽（docetaxel)、 94608.doc -48- 1294915 太平洋紫杉醇（paclitaxel)及溫諾平（vinorelbine); 翻配位化合物：順# (cisplatin)、卡波翻（carboplatin)、 奈達麵（nedaplatin)及奧沙利顧（oxaliplatin); 喜數鹼衍生物··依諾替康（irinotecan)、拓撲替康 (topotecan)及 campthotecin ; 酪胺酸激酶抑制劑：吉非替尼（gefitinib); 抗-CD20試劑：美羅華（rituximab)、妥司莫（tositumomab) 及替坦異貝莫單抗（ibritumomab tiuxetan); 干擾素：α干擾素、a-2a干擾素、a-2b干擾素、β干擾素、 γ-la干擾素及γ-ηΐ干擾素； 生物反應修飾劑··雲芝多糖（krestin)、蘑菇多糖、西佐糖 (sizofiran)、溶鏈菌製劑（picibanil)及烏苯美司（ubenimex);及 其它抗腫瘤試劑：米托蒽S昆（mitoxantrone)、1-天門冬醯 胺酶、丙卡巴肼（procarbazine)、達卡巴肼（dacarbazine)、經 基脈、喷司他丁（pentostatin)及維曱酸。 此外，本發明之抗體可與抗癌試劑依西美坦 (exemestane)、依特卡林（6(1〇16。81411)(了-107088)與81111248 組合。 抗IGF-IR抗體可以偵測活體内或活體外之生物樣本中之 IGF-IR。抗IGF-IR抗體可用於習知的免疫分析中，包括（但 不限於）：ELISA、RIA、FACS、組織免疫組織化學法、西 方墨點法或免疫沈澱法。本發明抗IGF-IR抗體可用於偵測 來自人類的IGF-IR。在另一實施例中，抗IGF-IR抗體可用 於偵測來自舊大陸靈長類動物的IGF-IR，諸如，獼猴與恆 94608.doc -49- 1294915 河猴、黑猩猩與猿。本發明提供一種偵測生物樣本中抗 IGF-IR之方法，其包含以本發明之抗IGF_IR抗體與生物樣 本反應，及偵測結合至抗IGF_IR之經結合抗體，由此來偵 測生物樣本中的IGF-IR。在一實施例中，抗IGF_IR抗體直 接以可偵測之標記進行標記。在另一實施例中，抗igf_ir 抗體（第一抗體）未經標記，而是標記可結合至抗j G F _ j R抗體 上之第二抗體或其它分子。為熟悉此項技術者所熟知的 是，選擇能專一性結合至特定種類與類型之第一抗體的第 二抗體。例如，若抗IGF_IR抗體為人類IgG，則第二抗體可 為抗-人類-IgG。其它可結合至抗體的分子包括（但不限 於）·蛋白A與蛋白G，兩者都可自（例如）Pierce chemical Co. 購得。 用於抗體或第二抗體之適合的標記已在前述内容中有所 揭示，且包括各種酶、辅基、螢光材料、發光材料、磁性 试劑與放射性材料。適合酶之實例包括辣根過氧化物酶、 鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；適合的辅基 複5體之貝例包括抗生物素蛋白鏈菌素/生物素與抗生物 素蛋白/生物素；適合的螢光材料之實例包括傘花内酯、螢 光素、螢光素異硫氰酸酯、若丹明、二氯三口井胺 (diehlGn)triaZinyiamine)螢光素、丹磺醯氯或藻紅蛋白；發 光材料之灵例包括魯米諾（luminol);磁性試劑之實例包括 釓；而適合的放射性材料之實例包括uq、m〗、35§或4。 在一替代實施例中，可藉由利用以可偵測物質來標記的 IGF-IR標準物與未標記之抗IGF_IR抗體的競爭性免疫分析 94608.doc -50- 1294915 來檢定生物樣本中的IGF-IR。在此檢定中，將生物樣本、 經標記之IGF-IR標準物與抗IGF-IR抗體組合在一起且確定 結合至未標記抗體的經標記IGF-IR標準物的量。生物樣本 中IGF-IR的量反比於結合至抗IGF-IR抗體之經標記之 IGF-IR標準物的量。 吾人可使用如上所揭示的免疫分析來達成多種目的。在 一實施例中，抗IGF-IR抗體可用於偵測細胞培養物中細胞 中的IGF-IR。在一較佳實施例中，抗IGF_IR抗體可用於確 定在以各種化合物來治療細胞之後IGF-IR酪胺酸填酸化、 酿胺酸自鱗酸化的含量，及/或細胞表面IGF-IR的量。該方 法可用於測試可用於激活或抑制IGF-IR的化合物。在此方 法中，以測試化合物來處理一細胞樣本持續一段時間同時 另一樣本未經處理。若要量測酪胺酸自磷酸化作用，則將 細胞溶解且使用上述免疫分析或如前述使用ELISA來量測 IGF-IR的酪胺酸磷酸化作用。若要量測IGF-IR的總含量， 則將細胞溶解且使用一種上述免疫分析法來量測IGF-IR總 含量。 用於確定IGF-IR酪胺酸磷酸化或用於量測IGF-IR總含量 之較佳的免疫分析法為ELISA或西方墨點法。若僅要量測 IGF-IR之細胞表面含量’則將細胞溶解’且使用一種上述 免疫分析法來量測IGF-IR之細胞表面含量。用於確定 IGF-IR之細胞表面含量之較佳的免疫分析法包括以下步 驟：用諸如，生物素或1251之可偵測標記來標記細胞表面蛋 白質，用抗IGF-IR抗體來免疫沈澱IGF-IR且接著偵測經標 94608.doc -51 · 1294915 記之IGF-IR。用於確定IGF-IR定位（例如，細胞表面含量） 之另一較佳免疫分析法為使用免疫組織化學法。以下方法 係在此項技術中所熟知的，諸如，ELIS A、RIA、西方墨點 法、免疫組織化學法、整合性膜蛋白之細胞表面標記法及 免疫沈澱法。例如參閱Harlow and Lane，君遂。此外，為 了測試較大數量之用於激活或抑制IGF-IR的化合物，可按 比例增加免疫分析用於高產量篩選。 本發明之抗IGF-IR抗體亦可用於確定組織或自組織所衍 生之細胞中的IGF-IR含量。在一較佳實施例中，該組織為 病變組織。在一更佳實施例中，該組織為腫瘤或其活組織 檢查物。在一較佳實施例中，組織或其活組織檢查物係切 除自患者。接著將該組織或活組織檢查物用於免疫分析以 藉由如上討論的方法來確定（例如）IGF-IR含量、IGF-IR之細 胞表面含量、IGF-IR酪胺酸磷酸化含量或IGF-IR的定位。 該方法可用於確定腫瘤是否表現高含量之IGF-IR。 上述診斷方法可用於確定腫瘤是否表現高含量的 IGF-IR，其可指示腫瘤對用抗IGF-IR抗體之治療反應良 好。該診斷方法亦可用於確定：若腫瘤表現高含量之 IGF-IR，則其是否為潛在的癌性，或若表現低含量之 IGF-IR，則其是否為良性的。此外，該診斷方法亦可用於 確定抗IGF-IR抗體之治療是否會造成腫瘤表現較低含量的 IGF-IR及/或表現較低含量的酪胺酸自磷酸化，且因此可用 於確定治療成功與否。通常而言，確定抗IGF-IR抗體是否 降低酪胺酸磷酸化的方法包含以下步驟：量測相關細胞或 94608.doc -52- 1294殳124269號專利申請案厂务―__ 中文說明書替換頁(％年6月）| 丁月曰修(更)正替後買 組織中酪胺酸磷酸化含量，用抗IGF-IR抗體或其抗原結合 部分培育細胞或組織，接著重新量測細胞或組織中酪胺酸 磷酸化的含量。可量測IGF_IR4另一種（幾種）蛋白質的酪胺 酸磷酸化。該診斷方法亦可用於確定組織或細胞是否表現 足夠南含量的IGF-IR或足夠高含量之經活化IGF_IR，該方 法可在患有侏儒症、骨質疏鬆症或糖尿病之個體的情況下 使用。IGF-IR或活性IGF_IR含量極低之診斷可用於以活化 抗IGF-IR抗體、IGF-I或其它治療試劑來治療從而增加 IGF-IR含量或增強其活性。 基於本發明之抗體向下調節周圍淋巴細胞中IGF_IR的能 力，π生物標誌策略”可用於監控IGF_IR在以本發明之抗體 所治療的患者之循環腫瘤細胞及/或正常細胞上的表現。亦 可使用如公開於2002年7月11日之WO 02/053596中所述的 其它抗體。該等細胞可包括（但不限於）CD19 +細胞，且亦可 包括所有白血細胞，諸如，單核細胞、粒細胞與淋巴細胞。 本發明之抗體亦可用於活體内定位表現IGF_IR的組織與 器官。在一較佳實施例中，抗IGF-IR抗體可用於定位表現 IGF-IR的腫瘤。該方法包含以下步驟：投予需要該診斷測 試之患者抗IGF-IR抗體或其醫藥組合物及對患者進行圖像 分析以確定表現IGF_IR之組織的定位。圖像分析在醫學技 術中係熟知的，其包括（但不限於）χ光分析、核磁共振成像 (MRI)或電腦斷層攝影法（CE)。在該方法之另一實施例中， 活組織檢查物係自患者獲得以確定相關組織是否表現 IGF-IR而非使患者進行圖像分析。在一較佳實施例中，用 94608-960629.doc -53- 1294915 可在患者身上成像之可偵測試劑來標記抗IGF-IR抗體。例 如，抗體可以對照試劑來標記，如鋇，其可用於义光分析； 或磁性對照试劑來標記’如I螯合物，其可用於MR〗或ce。 其匕^ §己试劑包括（但不限於）放射性同位素，如"tc。在另 一實施例中，抗IGF-IR抗體未經標記且藉由投予可偵測且 可結合抗IGF-IR抗體的第二抗體或其它分子而成像。 在另一實施例中，本發明提供一種藉由投予需要其之患 者本發明之抗IGF_IR抗體而抑制iGF_ir活性的方法。本發 明之抗體可用於治療之用。在另一較佳實施例中，IGF—IR 為人類的且患者為人類患者。或者，患者可為表現IGF_IR 的哺乳動物，抗IGF-IR抗體與該lGF_IR交叉反應。抗體可 才又予表現與抗體交叉反應之IGF-IR的非人類哺乳動物 (即’莖長類動物或獼猴或恆河猴）從而用於獸醫目的或作為 人類疾病的動物模型。該等動物模型可適用於評估本發明 之抗體的治療功效。 在一較佳實施例中，抗IGF_IR抗體可投予表現IGF_IR之 腫瘤患者。腫瘤可為實體瘤或可為非實體瘤，如淋巴瘤。 在一更佳實施例中，抗IGF-IR抗體可投予表現IGF_IR之癌 性腫瘤患者。在一亦更佳實施例中，抗IGF-IR抗體可投予 心有肺部、乳腺、前列腺或結腸腫瘤的患者。在一高度較 、 】中 °亥方法造成腫瘤的重量或體積不增加或重量 或版積減小。在另一實施例中，該方法造成腫瘤中的igf_ir 匕在車父佳貫施例中，該抗體為2 · 12 · 1 fx，或包含重鏈、 輕鏈或其抗原結合區。 94608.doc -54- 1294915 抗IGF_IR抗體可投予表現不適當

之症狀及/或發展的病 症。该等病症可藉由（例如）細胞表面IGF_IR含量的增加或患 病受驗者之受感染細胞或組織中增加的igf_ir酪胺酸自磷

在另一較佳實施例中，抗IGF 高含量之IGF-I，例如，IG 酉夂化來也貝。可使用（例如）上述抗igf_ir抗體來偵測igF_ir 含量的增加。 _ 在一態樣中，抗IGF-IR抗體係用於治療非癌性病況，其 中IGF-I及/或lGF-IR的高含量與非癌性病況或疾病有關。在 一實施例中，該方法包含投予具有非癌性病理狀況之患者 抗IGF-IR抗體的步驟，IGF-I及^IGF-IR之高含量或活性造 成或惡化該病理狀況。在一較佳實施例中，非癌性病理狀 況為肢端肥大症、巨人症、銀屑病、動脈粥樣硬化、金管 平滑肌之再狹窄或不適當的微血管增生，如發現於糖尿病 之併發症中，尤其係眼睛的微血管增生。在一更佳實施例 中，抗IGF-IR抗體減緩非癌性病理狀況的發展。在一更佳 實施例中，抗IGF-IR抗體停止或至少部分逆轉非癌性病理 狀況。 在此項技術中已知IGF-I的高含量表現可導致各種常見 癌症。在一更佳實施例中，投予患有前列腺癌、神經膠質 94608.doc -55- 12949Γ5 瘤或纖維肉瘤的患者抗IGF-IR抗體。在一亦更佳實施例 中，該方法造成癌症異常增殖的停止，或腫瘤之重量或體 積之不增加或重量或體積的減小。 在一實施例中，該方法係關於如下癌症的治療，諸如， 月®、鱗狀細胞、膀胱、胃、胰腺、乳腺、頭、頸、食管、 則列腺、結腸直腸、肺、腎（renal，kidney)、卵巢、婦科或 甲狀腺癌。根據本發明之方法，可以本發明之化合物來治 療的患者包括（例如）已確診患有如下病症的患者··多發性骨 月遇瘤、液體腫瘤、肝癌、胸腺病症、丁_細胞介導的自身免 疫性疾病、内分泌病症、局部缺血、神經變性病症、肺癌、 骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭部與頸部癌、纟膚或眼内黑素 瘤、子宮癌、印巢癌、直腸癌、肛門區的癌、胃癌、結腸 癌、乳腺癌、婦科腫瘤(例如，子宮肉瘤、輸卵管癌、子宮 内膜癌子呂頒癌、陰道癌或外陰癌）、何傑金氏病、食道 癌、小腸癌、内分泌I统癌（例如，甲狀腺、甲狀旁腺或腎 以癌）、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、慢性 或〜ϋ白血病、兒童期的實體腫瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、 膀脱癌、腎癌或輸尿管癌（例如’腎細胞癌、腎盂癌）或中樞 神&系統新生物（例如，原發性⑽淋巴瘤、脊椎軸腫瘤、 腦幹神經膠質瘤或垂體腺瘤）。 :一錢㈣抗體，但較佳地投予多次。該抗體可由每 々又T人至母’、個月投予-次。可按日程表投藥，諸如， 母天一一人、母天兩次、每天-次、每兩天-次、每三天一 次、每週一次、卷；、ra 母兩週一次、每月一次、每兩個月一次、 94608.doc -56- 129491，5 每三個月一次及每六個月 — 内、吸入、靜脈内、皮下、肌肉内、腸外、腫瘤内或局部 之路徑來投予抗體。該抗體可投予至遠離腫瘤位置的部 位。亦可經由小型泵連續投予抗體。抗體可投予一次、至 少兩次或至少一段時間直至病症得以治療、減輕或治癒。 若该抗體造成腫瘤或癌症停止生長或重量或體積減小，則 通常只要腫瘤存在就將投予該抗體。該抗體一般將作為部 分如前所述之醫藥組合物而投予。抗體的劑量通常在 〇·1_100 mg/kg 之範圍内，較佳 〇·5_5〇 mg/kg，更佳 l_20mg/kg，及亦更佳。可藉由任何此項技術中 已知的方法來量測抗體的血清濃度。為了預防癌症或腫瘤 的發生亦可預防性地投予該抗體。此尤其適用於具有"高正 吊合ΐ之IGF-I的患者，由於該等患者已顯示出具有患常見 癌症之較高的危險率。參閱R〇sen等人，咸遂。 在^ 一態樣中，抗IGF_IR抗體可與其它治療試劑（如抗新 生物樂物或分子)一起共同投予患有高度增殖性病症(如癌 症或腫瘤）的患者。在—態樣中，本發明係關於—種治療嚼 乳動物之高度增殖性病症的方法，其包含投予該嗜乳動物 :療有效劑量之本發明化合物，其與由下列各物組成之群 中選出的抗腫瘤試劑併用(但不限於):有絲分裂抑制劑、燒 化劑、抗代謝物、插入南丨、 ” 生長因子抑制劑、細胞週期抑 Μ、S#、拓撲異構酶抑制劑 利d 生物反應修飾劑、抗激素、 抑制劑、基質金屬蛋 酉母抑制劑、遺傳學治療劑與抗 康激素。在一更佳實施例中 τ 遠抗體可與抗新生物試劑一 94608.doc -57- 1294915 起投予，如阿黴素或紫杉酚。在另一較佳實施例中，該抗 體或治療組合可與放射療法、化學療法、光動力療法、外 科或其它免疫療法一起施予患者。在另一亦較佳實施例 中抗體將與另一抗體一起投予。例如，抗IGF-IR抗體可 與已知的抑制腫瘤或癌症細胞增殖之抗體或其它試劑一起 投予，如抑制erbB2受體、EGF-R、CD2〇或VEGF^抗體或 試劑。 抗體與額外治療試劑（組合療法）的共同投予涵蓋投予包 含抗IGF-IR抗體與額外治療試劑的醫藥組合物及投予兩種 或兩種以上分離的醫藥組合物，其中之一包含抗igf_ir抗 體而另一種包含額外治療試劑。此外，雖然共同投藥或組 合療法通常意謂抗體與額外治療試劑彼此同時投予，但其 亦涵蓋抗體與額外治療試劑不同時投予的情況。例如，抗 體可以每二天投予一次，而額外治療試劑可以每天投予一 次。或者，抗體可在以額外治療試劑來治療病症之前或之 後投予，例如在以額外試劑未能治療患者之後。類似地， 抗IGF-IR抗體的投予可在放射療法、光動力療法或外科之 前或之後進行。 抗體與一或多種額外治療試劑（組合療法）可投予一次、 兩人或至J 一段時間直至病症得以治療、減輕或治癒。較 佳地，該組合療法可投予多次。組合療法乂 亇； 母大二次至 母六個月一次來投予。投藥可按計劃進行，諸如，每天一 -人、每天兩次、每天一次、每兩天一次、每二 、 可—大一次、每 週一次、每兩週一次、每月一次、每兩個月一 — n -人、母三個 94608.doc -58 - 12949Γ5 月一次及每六個月一次，或可經由小型泵連續投藥。組合 療法可經口、黏膜、口腔、鼻内、吸入、靜脈内、皮下、 肌肉内、腸外、腫瘤内或局部路徑來投予。組合療法可投 予遠離腫瘤位置的部位。若抗體造成腫瘤或癌症停止生長 或重量或體積減小，則通常只要腫瘤存在就將投予組合療 法。 在一更進一步之實施例中，以放射性標記、免疫毒素或 毋素來標記抗IGF-IR抗體，或該IGF-IR抗體為包含毒性肽 的融合蛋白。抗沁^!^抗體或抗IGF_IR抗體融合蛋白將放 射性標記、免疫毒素、毒素或毒性肽導向至表現igf—IR2 腫瘤或癌細胞。在一較佳實施例中，在抗IGF-IR抗體結合 至腫瘤或癌細胞表面的IGF-IR之後，放射性標記、免疫毒 素、毒素或毒性肽進行内在化。 在另一態樣中，抗IGF-IR抗體可用於治療學上誘導需要 治療之患者中特定細胞的凋亡。在多種情況下，凋亡的細 胞為癌性或腫瘤細胞。因此，在一較佳實施例中，本發明 提供一種藉由投予需要治療之患者治療有效劑量之抗 IGF-IR抗體而誘導凋亡的方法。在一較佳實施例中，該抗 體為2.12.1 fx ’或包含重鏈、輕鏈或其抗原結合區。 在另一態樣中，本發明提供一種投予需要治療之患者活 化之抗IGF-IR抗體的方法。在一實施例中，投予需要治療 之μ者有效畺之活化抗體或醫藥組合物以增加的活 性。在一更佳實施例中，活化抗體能夠儲存正常的igf_ir 活性。在另一較佳實施例中，可將活化抗體投予患有身材 94608.doc -59- 1294915 矮小、神經病、肌肉質量減少或骨質疏鬆之患者。在另一 較佳實施例中，活化抗體可與一或多種可增加細胞增殖、 避免祠亡或增加IGF-IR活性之其它因子一起投予。該等因 子包括生長因子，諸如1〇17_1及/或激活IGF_IR的…卜以員似 物。在一較佳實施例中，抗體為2·12·1ίχ，或包含重鏈、輕 鏈或其抗原結合部分。 t由基因療法可投予需要治療之患者本發明的核酸分 子。該療法可在活體内或活體外進行。在一較佳實施例中， 可將編碼重鏈與輕鏈的核酸分子投予患者。在一更佳實施 例中’投予核酸分子使得其可穩定地與B細胞之染色體成為 體’因為該等細胞專門用於產生抗體。在一較佳實施例 中’轉染或在活體外感染前驅體B細胞且將其重新移植至需 要之患者。在另一實施例中，使用已知的用於感染相關細 胞*員型之病毒在活體内感染前驅體B細胞或其它細胞。用於 基因療法的典型載體包括脂質體、質粒或病毒載體，諸如， 逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒。在活體内或活體外感 染之後’可藉由自所治療之患者取得樣本及使用任何此項 技術中所知及本文所討論的免疫分析來監控抗體表現的含 量。 在一車父佳實施例中，基因療法包含如下步驟：投予有效 ΐ之編碼人類抗體或其部分之重鏈或其抗原結合部分的經 为離核酸分子及表現該核酸分子。在另一實施例中，基因 療法包含如下步驟：投予有效量之編碼人類抗體或其部分 之輕鏈或其抗原結合部分的經分離核酸分子及表現該核酸 94608.doc -60- 1294915 分子。在一更佳實施例中，基因療法包含如下步驟：投予 有效ΐ之編碼人類抗體或其部分之重鏈或其抗原結合部分 的級分離核酸分子及有效量之編碼人類抗體或其部分之輕 鏈或其抗原結合部分的經分離核酸分子及表現該等核酸分 子。基因療法亦可包含投予另一種抗癌試劑的步驟，諸如， 紫杉S分、他莫西芬、5-FU、阿黴素或CP-358,774。 本申請案之序列ID號： SEQIDNOl:編碼抗體2·12·lfX重鏈的DNA序列，包括 編碼用於表現成熟抗體之訊號序列的序列。 SEQIDN0 2:編碼抗體2·12.1fx輕鏈的DNA序列，包括 編碼用於表現成熟抗體之訊號序列的序列。 SEQ ID NO 3 :抗體2.12.1 fx重鏈之胺基酸序列。 SEQ ID NO 4 :種系DP-3 5之胺基酸序列。 SEQ ID NO 5 : 2.12.1fx抗體輕鏈之胺基酸序列。 SEQ ID NO 6 :種系A3 0/Jkl之胺基酸序列。 為了更好的理解本發明，吾人陳述如下實例。該等實例 僅用於說明而非以任何方式限制本發明之範轉。 實例I :產生抗IGF_IR抗體之雜交瘤的傳代 如下製備、選擇及檢定本發明之抗體： 將8至10週大的XEN〇MICETM在腹膜内或在其後腳底以 人類IGF-IR的細胞外功能域（1〇畔/劑/小鼠）或以 3T3-IGF_IR或300.19-IGF-IR細胞來免疫，後兩種細胞為在 其原生質膜上表現人類IGF-IR的兩種轉染細胞株（10x1 〇6個 細胞/劑/小鼠）。在3至8週的時間内重複該劑量5至7次。融 94608.doc -61 - n— ............ 膽(更>正替換.買 1294餐|^124269號專利申請案 中文說明書替換頁(96年6月） 合前4天，小鼠接受PBS中人類IGF-IR之細胞外功能域的最 終注射。來自經免疫小鼠之脾與淋巴結淋巴細胞與非分泌 性骨髓瘤P3-X63-Ag8.653細胞株融合且如前所述經受HAT 選擇（Galfre and Milstein, methods Enzymol. 73:3-46, 1981)。選擇產生特異於IGF-IR之單株抗體的雜交瘤2.12.1 以用於經一步的研究且將其保存於美國菌種保藏中心 (ATCC)5 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209，on December 12，2000，其保存號如下： 雜交瘤 保存號 2.12.1 PTA-2792 此雜交瘤與其它產生特異於IGF-1R之抗體的雜交瘤描述 於2002年7月11日公開的WO 02/053 596中。此公開案的内容 (包括所述的所有序列）以引用的方式倂入本文中。 將抗體2.12.1重鏈中兩個骨架的突變及輕鏈中三個骨架 的突變都校正回為種系以產生抗體2.12.1 fx。 所有製造2.12.1 fx突變的變化係藉由使用快變化位點-導 向突變發生套組（Stratagene™)而製備具有突變之目標位點 的質粒、將質粒變性及將含有所要突變的寡核苷酸引子退 火來完成。Pfu Turbo DNA聚合酶之非鏈置換作用係用於延 伸及倂入誘變的引子從而導致有切口的環形鏈。用Dpnl消 化甲基化、非突變之親代DNA模板之後，將環形有切口的 dsDNA轉型為XL1藍（Blue)超能力細胞。轉型完成後，XL1 藍超能力細胞修復突變質粒中的切口。選擇含有突變的質 粒且核實該等序列。 94608-960629.doc -62- 1294915 圖1顯示編碼抗體2.12.lfx重鏈的DNA序列，包括編碼用 於表現成熟抗體之訊號序列的序列（SEQ ID NO: 1)。圖2顯 示編碼抗體2.12. lfx輕鏈的DNA序列，包括編碼用於表現成 熟抗體之訊號序列的序列（SEQ ID NO: 2)。圖3顯示抗體 2.12.lfx重鏈的胺基酸序列（SEQ ID NO: 3)與種系序列 DP_35(3-ll)/D3-3/JH6的胺基酸序列（SEQ ID NO: 4)的比 對。抗體2.12.1 fx之序列係如上所示用於種系序列。訊號序 列為斜體而CDR被標以下劃線。恆定功能域區以胺基酸殘 基ASTK起始且對應於種系中在148起始的胺基酸殘基並延 伸至序列末端。骨架（FR)突變係位於胺基酸殘基21與116。 圖4顯示抗體2.12.1fx輕鏈的胺基酸序列（SEQ ID NO: 5)與 種系序列A30/Jkl的胺基酸序列（SEQ ID NO: 6)的比對。抗 體2.12.1 fx之序列係如上所示用於種系序列。訊號序列為斜 體且將CDR標以下劃線。恆定功能域區以胺基酸殘基TVAA 起始且對應於種系中在13 1起始的胺基酸殘基並延伸至序 列末端。骨架（FR)突變係位於胺基酸殘基43、125與129。 實例Π :抗體介導阻滯IGF-I/IGF-IR結合 執行ELIS A實驗以在基於細胞的檢定中定量本發明之抗 體抑制IGF-I結合至IGF-IR的能力。在96孔U底培養盤中將 IGF-IR轉染之NIH-3T3細胞（5xl04/ml)置於補充有L-麩胺醯 胺（0.29 mg/ml)、10%熱鈍化FBS及500 pg/ml每一新黴素 (geneticin)、青黴素及鏈黴素的100 μΐ DMEM高葡萄糖介質 中。在37°C、5% C02環境中隔夜培育該等培養盤以使得細 胞附著。將介質由培養盤中傾析且每孔以1 00 μΐ新鮮介質來 94608.doc -63- 12949Γ5 置換。為進行測試，在檢定介質（補充有L-麩胺醯胺 (0.29 mg/ml)、10%熱鈍化 FBS、200 gg/ml BSA及 500 pg/ml 每一新黴素（geneticin)、青黴素及鏈黴素的DMEM高葡萄糖 介質）中稀釋抗體至所需要的最終濃度。將所有樣本重複執 行三次。在37°C下將培養盤培育10分鐘。在檢定介質中將 [125I]-IGF_I稀釋至濃度為1 pCi/ml且在培養盤每個孔中加 入50 μΐ該稀釋物。作為背景放射性的對照物，將冷IGF-I 加入至最終濃度100 ng/ml。在37°C下將培養盤培育10分鐘 且藉由緩緩吸入紙巾中及以檢定介質洗滌兩次來傾析介 質。藉由加入50 μΐ 0.1 NNaOH、0·1% SDS來溶解細胞且在 室溫下將培養盤振盪5分鐘。將樣本轉移至閃爍培養盤，加 入 150 μΐ OptiPhase Supermix 且使用 Wallace Micro-Beta counter來辨認訊號。 表I與圖5顯示以本發明之抗體所執行之實驗的結果。該 實驗表明本發明之抗體特異地抑制[125I]-IGF-I結合至過度 表現IGF-IR的細胞。

表I 單株抗體 IC50 2.12.1fx 0.4 pg/ml 實例ΠΙ :抗體介導抑制IGF-I誘導之IGF-IR磷酸化 為確定本發明之抗體是否能阻滯IGF-I介導之IGF-IR的 活化作用而執行ELIS A實驗。藉由與減少之受體相關之酪 胺酸磷酸化來偵測IGF-I介導的IGF-IR活化作用。 ELISA培養盤的製備 94608.doc -64 - 1294915 藉由在經反應結合蛋白G塗覆之96孔培養盤（Pierce)之每 孔中加入100 μΐ阻滯緩衝液（Tris缓衝之鹽水[TBS]中之3% 胎牛血清白蛋白[BSA])來製備ELISA俘獲培養盤。將該等培 養盤在室溫下振盪培育30分鐘。在阻滯緩衝液中將兔子全 特異性SC-713抗IGF-IR抗體（Santa Cruz)稀釋至5 pg/ml的 濃度。在每孔中加入100 μΐ經稀釋抗體。將該等培養盤在室 溫下振盪培育60-90分鐘。用洗滌缓衝液（TBS + 0.1% Tween 20)將該等培養盤洗滌5次且將殘留的緩衝液吸入紙巾中。 不容許在加入溶解產物之前來乾燥該等培養盤。 自表現IGF-1R之細胞製備溶解產物 在96孔U型底培養盤中將經IGF-IR轉染之NIH-3T3細胞 (5xl04/ml)置於100 μΐ生長介質（補充有L-麩胺醯胺 (0.29 mg/ml)、10%熱鈍化 FBS 及 500 pg/ml每一新黴素 (geneticin)、·青黴素及鏈黴素的DMEM高葡萄糖介質）中。 在37°C、5% C02環境中隔夜培育該等培養盤以使得細胞附 著。將介質自培養盤傾析且每孔以100 μΐ新鮮生長介質來置 換。為進行測試，在生長介質中將潛在的抗IGF-IR抗體稀 釋5次直至所要的最終濃度且在每孔中加入25 μΐ該稀釋 物。將所有樣本重複執行三次。在37°C下將該等培養盤培 育1小時。每孔25 μΐ之600 ng/ml IGF-1 (在生長介質中製備） 來刺激細胞且在室溫下培育10分鐘。藉由顛倒轉培養盤及 緩緩吸入紙巾中來傾析介質。藉由加入50 μΐ溶解緩衝液（50 mM HEPES、pH 7.4、10 mM EDTA、150 mM NaC卜 1.5 mM MgCl2、1.6 mMNaV04、1% Triton X-100、1%甘油）來溶解 94608.doc -65- 1294915 黏附細胞且在使用之前每50 ml立即補充一顆不含EDTA的 蛋白酶抑制劑錠劑[Roche Molecular Sciences]。室溫下振盡 細胞5分鐘。每孔加入200 μΐ稀釋緩衝液（50 mMHEPES、pH 7·4、1.6 mM NaV04)且藉由移液操作來混合。將100 μΐ溶解 產物自每一孔轉移至如上所述所製備的ELISΑ俘獲培養盤 的每一孔且在室溫下緩緩振盪培育2小時。

以抗磷酸酪胺酸(pTYR)抗體來進行ELIS A 藉由顛倒培養盤、以洗條緩衝液將培養盤洗蘇5次及將過 多的液體吸入紙巾中來移除細胞溶解產物。每孔加入100 μΐ 之pTYR特異性抗體（HRP-PY54)且在阻滯緩衝液中將其稀 釋至0.2 pg/ml的濃度。藉由室溫下振盪培養盤30分鐘來培 育細胞。接著以洗滌緩衝液將培養盤洗滌5次且吸入紙巾 中〇 當發生顯色時藉由每孔加入100 μΐ TMB過氧化物酶受質 溶液（Kirkegaard & Perry)及振盪培育來偵測HRP-PY54抗體 的結合（約2-10分鐘）。藉由每孔加入100 μΐ TMB中止溶液 (Kirkegaard & Perry)來停止顯色反應。在室溫下將培養盤 振盪10秒鐘以混合溶液且藉由OD45()nm之量測來定量。 表Π及圖6 A顯示以本發明之抗體來進行此實驗的結果。 該等實驗結果表明如減少之受體相關的酪胺酸磷酸化所示 本發明之抗體阻滯IGF-I介導之IGF-IR活化作用的能力。此 外，該等結果可用於量化本發明之抗體的相對效能。 94608.doc •66- 1294915 表π 單株抗體 IC50(pg/ml) 2.12.lfx 0.42 實例IV :本發明之抗體的物質交叉反應性 為確定本發明之抗體的物質交叉反應性，執行若干實 驗，包括免疫沈澱法、抗體介導阻滯IGF-I誘導之受體磷酸 化及FACS分析。 為執行免疫沈澱實驗，將細胞置於T25燒瓶中之補充有L-麩胺醯胺（0.29 mg/ml)、10%熱鈍化FBS及500 pg/ml每一新 黴素、青黴素及鏈黴素的DMEM高葡萄糖介質中直至50% 融合。將100 μΐ本發明之抗體加入到1 pg/ml濃度之漢克 (Hank)氏緩衝鹽水溶液（HBSS; Gibco BRL)中。在37°C的培 育器中將該等培養盤培育30分鐘且接著在室溫下以 100 ng/ml之IGF-I來刺激細胞10分鐘。在RIPA缓衝液 (Harlow and Lane，前述）中溶解細胞且在4°C時以2 pg全特 異性SC-713抗IGF-IR抗體（Santa Cruz)加上蛋白A瓊脂糖小 球來免疫沈澱IGF-IR 1小時。將該等小球製成丸粒且以 PBS/T (PBS + 0.1% Tween-20)洗滌三次且接著在40 μΐ含有 5% βΜΕ的Laemmli緩衝液中煮沸。

隨後對如上述所製備的樣本用西方墨點法進行分析。將 每個樣本以每條帶12 μΐ裝載於4-10%梯度之Novex™凝膠 上，且以1XMES之緩衝液（NovexTM)來流動。凝膠以150V 流動1小時或200 V流動約30分鐘。將凝膠轉移至一薄膜， 該薄膜在含有10%曱醇之Novex™轉移緩衝液中，以100 mA 94608.doc -67- 1294915 · 隔夜或以250 mA持續1-1.5小時。讓薄膜完全乾燥且在室溫 下以含有 Superblock (Pierce Chemical Co.)的 TBS(Tris缓衝 鹽水pH 8.0)來阻滯。加入IGF-IR轉潰抗體SC713(Santa Cruz) 或磷酸酪胺酸抗體以分別地偵測免疫沈殿之IGF_IR或磷酸 -IGF-1R 〇 用本發明之抗體對各種動物細胞來執行此實驗。抗體能 夠結合人類之IGF-IR，但不能結合犬與小鼠之iGF_IR。該 等實驗說明抗體具有高度特異性。 確定本發明之抗體的交叉物質親和性 執行FACS分析以確定本發明之抗體對於其它動物之 IGF-IR的親和性，尤其係對於如上所述舊大陸猴。在冰上 以增加濃度之本發明生物素化抗IGF-IR抗體來將人類及猴 子細胞（獼猴）之等分試樣（5 χίο5)培育1小時。在冰上以經抗 生物素蛋白鏈菌素結合之RPE(藻紅蛋白）將樣本培育3〇分 鐘。藉由流式血細胞計數來量測結合且使用CeiiQuest軟體 以螢光強度（FI2-H)對細胞數量（計數）的直方圖來分析結 合。由平均螢光強度對抗體濃度的圖表來計算每個抗體的 結合（Kd)。在大多數實驗中，在培養的人類mcf-入細胞與獼 猴組織培養細胞中量測結合。藉由量測一定細胞濃度範圍 的結合來控制抗體的消耗。 執行所述FACS分析以測試本發明之抗體結合人類與獼 無、、、田I的爿b力。可觀察到所有被測試細胞株之〇 ^的 半最大結合（Kd)。 實例V : IGF-I受體之下降調節 94608.doc -68- 12949ϊ5 為調查本發明之抗體是否可誘導細胞上之IGF-IR的下降 調節，將MCF7細胞置於補充有L-麵胺醯胺（0.29 mg/ml)、 10%熱鈍化FBS、青黴素及鏈黴素的DMEM/F12介質中至 T75燒瓶中發生50%融合。向細胞中加入本發明之抗體直至 最終濃度1 pg/ml。在37°C培育器中將培養盤培育持續指定 的小時且接著在 50 mM HEPES、pH 7.4、10 mM EDTA、 150 mM NaCH、1.5 mM MgCl2、1.6 mM NaV04、1 % Triton X-100、1 %甘油中溶解。使用全特異性8(：-713抗10?_111 抗體（Santa Cruz)藉由西方墨點法分析來確定細胞萃取物中 總IGF-IR的含量。參閱圖6B。以本發明之抗體來處理MCF7 細胞導致1_2小時之内IGF-IR之60-70%的下降調節。 實例VI :本發明之抗體對於活體内IGF-IR的效應 執行實驗以確定本發明的抗體對於如先前實例中所述之 IGF-IR的效應是否可在活體内發生。根據公開的方法（V.A. Pollack 等人，"Inhibition of epidermal growth factor receptor-associated tyrosine phosphorylation in human carcinomas with CP-358,774: Dynamics of receptor inhibition in situ and antitumor effects in athymic mice，n J. Pharmacol· Exp. Ther· 291:739-748 (1999))在無胸腺的小鼠 中誘導腫瘤。簡言之，將IGF-IR轉染之NIH-3T3細胞（5χ10ό) 與0.2 ml Matrigel製劑經皮下注射入3-4週齡的無胸腺 (㈣/㈣）小鼠中。在建立所形成的腫瘤（即，約400 mm3)後接 著將本發明之抗體經腹膜内注射入小鼠中。 24小時後，將腫瘤進行萃取、均勻化，並確定IGF-IR的 94608.doc -69- 1294915 含量。為確定IGF-IR的含量，在阻滯緩衝液中將SC-713抗 體稀釋至一最終濃度pg/ml且在反應結合塗層抗兔（GAR)塗 ’ 覆之培養盤（Pierce)的每孔中加入1 〇〇 μ!。在室溫下培育培 〆 養盤1小時伴隨振盪且接著以洗滌緩衝液洗滌5次。稱重腫 瘤樣本。以溶解緩衝液稀釋12·5 μ1腫瘤萃取物至最終體積 · 100 μΐ。在96孔培養盤之每孔中加入100 μι的樣本。室溫下 培育培養盤1- 2小時伴隨振盪且接著以洗滌缓衝液洗滌5 β 次。每孔中加入阻滯緩衝液中的100 μ1 HRp_pY544生物素 _ 化抗IGF-IR抗體且在室溫下培育振盪3〇分鐘。以洗滌緩衝 籲 液洗滌培養盤5次並顯影。藉由每孔加入丨〇〇 μ1 TMB微孔受 質以HRP-PY54探測從而顯影培養盤且顯色隨著加入1〇〇 y 〇·9 Μ Ηβ〇4而停止。藉由振盪丨〇秒鐘及量測〇D45〇u來定量 訊號。將訊號標準化為總蛋白質。藉由以下程序來顯影以 抗IGF-1R抗體所探測的培養盤：向每孔中加入1〇〇 μΐ在阻滯 緩衝液中所稀釋的抗生物素蛋白鏈菌素-HRp，室温下振盪 培育30分鐘及接著如HRP-PY54所述繼續。 麵 據觀察腹膜内注射本發明之抗體導致IGF_IR活性的抑鲁、 制，如IGF-IR蛋白的減少所量測到的（圖7)。此外，該抑制 · 對所注射之抗體的劑量有反應（圖7)。該等數據證實本發明 之抗體能夠以在活體外所觀察到的方式而在活體内針對 IGF-IR 〇 實例YU · 3T3/IGF_IR細胞腫瘤的生長抑制（TGI) 測試本發明之抗體以確定其是否能抑制腫瘤的生長。如 上所述來誘導腫瘤（實例VI)且當建立後形成可觸知的腫瘤 94608.doc -70- 1294915 (即，6_9天内達到250 mm3)。以單一0.20 ml劑量之抗體經 腹膜内注射來處理小鼠。使用Geran等人所建立的方法， "Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems，” Cancer Chemother. Rep. 3:1-104，藉由遊標卡尺 跨越兩條直徑每三天量測腫瘤尺寸且使用式（長度x [寬 度]2)/2來計算體積。 在分析了本發明之抗體後可觀察到僅用抗體單一處理抑 制經IGF-IR轉染之NIH-3T3細胞誘導腫瘤的生長（圖8A)。此 外，在用單一劑量7.5 mg/kg靜脈内供給之阿黴素的組合研 究中，可觀察到投予單一劑量抗體會增強阿黴素（一種已知 的腫瘤生長抑制劑）的效力。阿黴素與本發明之抗體的組合 表明與僅用抗體或阿黴素治療相對其腫瘤生長延遲了 7天 (圖 8B)。 實例Μ :抗體含量與IGF-IR下降調節的關係 如實例VI中所述在裸小鼠中誘導腫瘤。接著如實例VI中 所述以125 pg抗體經腹膜内注射來處理小鼠。萃取腫瘤且 藉由ELISA量測IGF-IR含量。圖9顯示了血清抗體含量與 IGF-IR受體含量隨時間的變化。實驗證實抗體向下調節 IGF-IR且IGF-IR抑制的程度與抗體的血清濃度成劑量比 例。 實例IX :結腸直腸細胞腫瘤的生長抑制 除了使用Colo 205細月包（ATCC CCL 222)之夕卜，士口實{列VI 中所述在裸小鼠中誘導腫瘤。Colo 205細胞為人類結腸直 94608.doc -71 - 1294915 腸腺癌細胞。如實例Υϋ中所述，將各種量之抗體或以 100 mg/kg 5-氟脫氧尿苷（5_FU，i.v·)以單一試劑或組合形式 來處理已建立約250 mm3之皮下腫瘤的小鼠。圖1〇A與圖 10B顯示腫瘤尺寸相對於各種處理隨時間的變化關係。該實 驗表明：當提供作為單一試劑時，抗IGF-IR抗體之給予一 次的處理抑制人類結腸直腸癌細胞的生長且增強5_fu(一 種已知的腫瘤抑制劑）之效力。 實例X ··活體内抗IGF-IR抗體的藥物動力學 為評估抗IGF-IR抗體的藥物動力學，將醋酸鹽緩衝液中 5 mg/kg之抗體靜脈内注射獼猴。在各個時間點收集獼猴的 血清且在多至十週的時期内確定猴子中抗IGF_IR抗體的濃 度。為定量功能性血清抗體含量，將人類 R&D系統，Catalog#391GR)之細胞外功能域結合至96孔培 養盤。在檢疋培養盤中加入猴子血清（在1:1⑼與115,⑼〇之 間稀釋），由此每個樣本將在標準曲線的線性範圍内且在任 何抗IGF-IR抗體將結合至IGF-I_sR的條件丁培育樣本。洗滌 培養盤之後，將經標記之抗人類IgG抗體加入至培養盤中且 在抗人類IgG抗體將結合至抗IGF_IR抗體的條件下培育。接 著洗滌培養盤並顯影，且對照物標準曲線與線性回歸擬合 用於疋I抗IGF-IR抗體的量。圖丨丨顯示血清中抗體濃度隨 時間的變化。該實驗表明··抗IGF_IR抗體的半衰期為 6·1天且其具有〇·〇54 (L/kg)的體積分布（vdss)。 本說明書中所引用的所有公開案與專利申請案係以引用 的方式倂入本文中，該引用如同已特定地及個別地將各個 94608.doc •72- 1294915 公開案或專射請案以引用的方式倂人—般。雖然出於清 楚與明晰的目的已藉由說明與實例的方式相當詳細地敍2 了先前發明，但一般技術者將易於瞭解：根據本發明的教 示可在不脫離附加之專利申請範圍的精神與範疇情況下對 其作出特定的修改與改良。 【圖式簡單說明】 圖1顯示編碼抗體2· 12.1 fx之重鏈的DNA序列，包括編碼 用於表現成熟抗體（SEQ ID NO: 1)之訊號序列的序列。 圖2顯示編碼抗體2· 12· lfx之輕鏈的DNA序列，包括編碼 用於表現成熟抗體（SEQ ID NO: 2)之訊號序列的序列。 圖3顯示抗體2.12· lfx之重鏈的胺基酸序列（SEQ ID NO: 3) 與種系序列DP_35 (3-ll)/D3-3/JH6之胺基酸序列（SEq ID NO: 4)的比對。抗體2.12· lfx的序列如上所示用於種系序 列。訊號序列為斜體而CDR被標以下劃線。恆定功能域區 以胺基酸殘基ASTK起始且對應於種系中在148起始的胺基 酸殘基且延伸至序列末端。骨架（FR)突變在胺基酸殘基的 21與116 。 圖4顯示抗體2.12.1fx輕鏈的胺基酸序列（SEQ ID NO: 5) 與種系序列A30/Jkl之胺基酸序列（SEQ ID NO: 6)的比對。 抗體2 _ 12 · 1 fx之序列係如上所示用於種系序列。訊號序列為 斜體而CDR被標以下劃線。恆定功能域區以胺基酸殘基 TVAA起始且對應於種系中在131起始的胺基酸殘基並延伸 至序列末端。骨架（FR)突變位於胺基酸殘基43、125與129。 圖5顯示抗IGF-IR抗體2.12.1fx抑制IGF-I結合至 94608.doc -73- 1294915 3T3-IGF-IR細胞。 圖6A與6B顯示由減少之受體相關酪胺酸填酸化（圖6A) 所示的抗體2.12.：^义阻滞1〇?_1介導之1〇?_111活化作用的能 力及抗體2.12_lfx誘導下降調節細胞上之IGF-IR的能力（圖 6B) 〇 圖7顯示抗IGF-IR抗體2.12.1fx降低3T3-IGF-IR腫瘤中 IGF-IR的含量。 圖8A與8B顯示活體内單獨投予（圖8A)或與阿黴素組合 投予（圖8B)時抗IGF-IR抗體抑制3T3-IGF-IR腫瘤的生長。 圖9顯示3T3-IGF-IR腫瘤中抗IGF-IR抗體2.12.1fx之血清 含量與IGF-IR下降調節之間隨時間的變化關係。 圖10A與10B顯示活體内單獨投予（圖10A)或與5-氟脫氧 尿苷（5-FU)組合投予（圖10B)時抗IGF-IR抗體2.12.1fx抑制 Colo 205腫瘤的生長。 圖11顯示獼猴中經靜脈内單一注射抗IGF-IR抗體 2.12.1fx之藥物動力學的評估。 94608.doc 74- 1294915 序列表 <110>美商輝瑞產品公司

<12〇>經修飾之人類IGF-IR抗體 <130> PC25231A <140〉 093124269 <141> 2004-08-12 <160> 6 <170> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 1413

<212> DNA <213> 2.12.1 FX <400> 1 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctt gttgctatta taaaaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtccgg gggaggcttg gtcaagcctg gagggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgac tactatatga gctggatccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggaatgggt ttcatacatt agtagtagtg gtagtaccag agactacgca 240 gactctgtga agggccgatt caccatctcc agggacaacg ccaagaactc actgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgtgag agatggagtg 360 gaaactactt tttactacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 420 accgtctcct cagcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg 480 agcacctccg agagcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 540 gtgacggtgt cgtggaactc aggcgctctg accagcggcg tgcacacctt cccagctgtc 600 ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcaacttc 660 ggcacccaga cctacacctg caacgtagat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 720 acagttgagc gcaaatgttg tgtcgagtgc ccaccgtgcc cagcaccacc tgtggcagga 780 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840 gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcca gttcaactgg 900 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cacgggagga gcagttcaac 960 agcacgttcc gtgtggtcag cgtcctcacc gttgtgcacc aggactggct gaacggcaag 1020 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080 aaaaccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1200 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac acctcccatg 1260 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413 <210> 2 94608.doc 1294915 <211> 728

<212> DNA <213> 2.12.1 FX <400> 2 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctggtt cccaggtgcc 60 agQtgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 120 gtcaccatca cttgccgggc aagtcaggac attagacgtg atttaggctg gtatcagcag 180 aaaccaggga aagctcctaa gcgcctgatc tatgctgcat cccgtttaca aagtggggtc 240 ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg acagaattca ctctcacaat cagcagcctg 300 cagcctgaag attttgcaac ttattactgt ctacagcata ataattatcc tcggacgttc 360 ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 420 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 540 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta gtgacccggg 720 aacgaccg 728 <210> 3 <211> 470

<212> PRT <213> 2.12.1 FX <400> 3

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Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45

Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Trp val ser Tyr lie ser Ser ser Gly Ser Thr Arg Asp Tyr Ala 65 70 75 80

Asp ser val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95

Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Val Glu Thr Thr Phe Tyr Tyr Tyr Tyr 94608.doc -2- 1294915 115 120 125

Tyr Gly Met Asp val Trp Gly Gin Gly Thr rhr val Thr Val Ser Ser

Ala ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 145 150 155 160

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly cys Leu val Lys Asp Tyr 165 170 175

Phe Pro Glu pro Val Thr val ser Trp Asn ser Gly Ala Leu Thr Ser 180 185 190

Gly val His Thr Phe Pro Ala val Leu Gin Ser ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205

Leu Ser Ser Val val Thr val Pro Ser ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 210 215 220

Tyr Thr Cys Asn val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys val Asp Lys 225 230 235 240

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys val Glu Cys Pro Pro cys Pro Ala Pro 245 250 255

Pro Val Ala Gly Pro Ser val Phe Leu Phe Pro pro Lys Pro Lys Asp 260 265 270

Thr Leu Met He ser Arg Thr pro Glu val Thr Cys val val val Asp 275 280 285 val ser His Glu Asp Pro Glu val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 290 295 300 val Glu va! His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Ar§ Glu Glu Gin Phe Asn

Ser Thr Phe Arg val val ser val Leu Thr val Va! His dn As? Trp

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 340 345 350

Ala Pro lie Glu Lys Thr He Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu 355 360 365 pro Gin val Tyr Thr Leu Pro Pro ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 370 B75 380

Gin val ser Leu Thr cys Leu val Lys Gly Phe Tyr Pro ser Asp lie 94608.doc 1294915 385 390 395 400

Ala val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys thr 405 410 415

Thr Pro pro Met Leu Asp ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430

Leu Thr val Asp Lys ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn val Phe Ser Cys 435 440 445

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 450 455 460 ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 4 <211> 473 <212> PRT <213> 2·12·1 <400> 4

Met Glu Phe Gly Leu ser Trp val Phe Leu val Ala lie He Lys Gly 15 10 15 val Gin cys Gin val Gin Leu val Glu ser Gly Gly Gly Leu val Lys 20 25 30

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Tyr Tyr Cys Ala Arg val Leu Arg Phe Leu Glu Trp Leu Leu Tyr Tyr 115 120 125

Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp val Trp Gly Gin Gly Thr Thr val Thr 130 135 140

Se「Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 145 150 155 160 94608.doc -4- 1294915 cys Ser Arg ser Thr ser Glu ser Thr Ala Ala Leu Gly cys Leu Val 165 170 175

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Ser Thr Tyr ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys val Tyr Ala Cys Glu val Thr His Gin Gly Leu Ser 210 215 220 ser pro val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 94608.doc

Claims (1)

129銳心269號專利专4 jl» ίΛ 丄‘ 本 ι· 一種專一性地結合至人類胰島素樣生長因子1受體 (IGF-IR)之人類單株抗體或其抗原結合部分，該抗體可變 區之骨架區包含至少H對應種系胺基酸殘基置換 之體細胞突變胺基酸殘基，其中輕鏈之可變區包含胺基 酸序列SEQ ID NO: 5之胺基酸編號23至13〇且重鏈之可變 區包含SEQ ID NO·· 3之胺基酸編號2〇至144。 2 ·如印求項1之人類抗體或其抗原結合部分，其中該輕鏈包 含SEQ ID NO: 5之胺基酸編號23至23 6。 3.如請求項1之人類抗體或其抗原結合部分，其中該重鏈包 含SEQ ID NO: 3之胺基酸編號2〇至47〇，而該輕鏈包含 SEQ ID NO: 5之胺基酸編號23至236。 4·如請求項1之人類抗體或其抗原結合部分，其中該抗體之 該重鏈係由SEQIDNO: 3之胺基酸編號2〇至47〇組成，而 該輕鏈係由SEQ ID NO: 5之胺基酸編號23至236組成。 5·如請求項1-4中任一項之人類抗體或其抗原結合部分，其 係用於治療人類癌症。 一種用於治療癌症的醫藥組合物，其包含如請求項中 任一項之抗體或其抗原結合部分及醫藥學上可接受的載 劑。 1 ·如請求項6之醫藥組合物，其進一步包含抗贅生物、化學 治療劑或抗腫瘤藥劑。 8· 一種經分離多核苷酸，其包含編碼如請求項丨-4中任一項 之抗體之重鏈或其抗原結合部分或輕鏈或其抗原結合部 94608-960629.doc 1294915 分之核酸序列。 9. 一種載體，其包含如請求項8之經分離多核苷酸。 10. —種宿主細胞，其包含如請求項9之載體。 11. 一種製備單株抗體或其抗原結合部分之方法，其包含培 養如請求項10之宿主細胞及回收該抗體。 94608-960629.doc 129491.5 七、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（5 )圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： (無元件符號說明） 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無） 94608.doc