PT1656391E

PT1656391E - Anticorpos humanos modificados contra igf-ir

Info

Publication number: PT1656391E
Application number: PT04744197T
Authority: PT
Inventors: Bruce David Cohen; Vahe Bedian
Original assignee: Pfizer Prod Inc
Priority date: 2003-08-13
Filing date: 2004-08-03
Publication date: 2010-12-06
Also published as: PE20050339A1; BRPI0413466A; PA8608801A1; NO20060542L; AU2004265152A1; CR8233A; WO2005016967A3; ECSP066359A; WO2005016967A2; EP1656391B1; ZA200601231B; KR20060035796A; IL173273A0; US20080181891A1; DE602004029581D1; ATE484525T1; TWI294915B; NL1026829A1; CA2535071A1; ES2351395T3

Description

ΡΕ1656391 ι DESCRIÇÃO "ANTICORPOS HUMANOS MODIFICADOS CONTRA IGF-IR" O factor de crescimento semelhante a insulina tipo I (IGF-I) é um polipéptido de 7,5 kDa que circula no plasma em concentrações elevadas e é detectável na maioria dos tecidos. IGF-I estimula a diferenciação celular e a proliferação celular e é necessário à maioria dos tipos de células de mamífero para uma proliferação sustentada. Estes tipos celulares incluem, entre outros, fibroblastos diplóides humanos, células epiteliais, células do músculo liso, linfócitos T, células neuronais, células mielóides, condrócitos, osteoblastos e células estaminais da medula óssea. 0 primeiro passo na via de transdução que conduz à proliferação ou diferenciação celular estimulada por IGF-I é a ligação de IGF-I ou IGF-II (ou insulina em concentrações suprafisiológicas) ao receptor de IGF-I. 0 receptor de IGF-I é composto por dois tipos de subunidades: uma subunidade alfa (uma proteína de 130-135 kDa que é totalmente extracelular e funciona na ligação do ligando) e uma subunidade beta (uma proteína transmembranar de 95 kDa, com os domínios transmembranar e citoplasmático). O IGF-IR pertence à família dos receptores do factor de crescimento cinase de tirosina (Ullrich et al., Cell 61:203-212, 1990) 2 ΡΕ1656391 e é estruturalmente semelhante ao receptor da insulina (Ullrich et al., EMBO J. 5:2503-2512, 1986). O IGF-IR foi inicialmente sintetizado como um polipéptido pró-receptor de cadeia simples, o qual é processado por glicosilação, clivagem proteolitica e ligação covalente para montar um heterotetrâmero maduro de 460 kDa compreendendo duas subunidades alfa e duas subunidades beta. As subunidades beta possuem actividade de cinase de tirosina activada por ligando. Esta actividade está implicada nas vias de sinalização que medeiam a acção do ligando, as quais envolvem autofosforilação da subunidade beta e fosforilação dos substratos IGF-IR.

Existe considerável evidência para um papel de IGF-I e/ou IGF-IR na manutenção de células tumorais in vitro e in vivo. Os níveis de IGF-IR são elevados em tumores do pulmão (Kaiser et al., J. Câncer Res. Clin. Oncol. 119: 665-668, 1993; Moody et al., Life Sciences 52: 1161-1173, 1993; Macauley et al., Câncer Res., 50:2511-2517, 1990), da mama (Pollak et al., Câncer Lett. 38: 223-230, 1987 ; Foekens et al., Câncer Res. 49 :7002-7009, 1989 ; Cullen et al., Câncer Res. 49 : 7002-7009, 1990 ;

Arteaga et al., J. Clin. Invest. 84 :1418-1423, 1989), da próstata e do cólon (Remaole-Bennet et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 75 :609-616, 1992; Guo et al.,

Gastroenterol. 102 : 1101-1108, 1992). A expressão desregulada de IGF-I em epitélio da próstata conduz a neoplasia em ratinhos transgénicos (DiGiovanni et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:3455-60). Ainda, IGF-I parece 3 ΡΕ1656391 ser um estimulador autócrino de gliomas humanos (Sandberg-Nordqvist et al., Câncer Res. 53:2475-2478, 1993), por outro lado IGF-I estimula o crescimento de fibrossarcomas que expressam IGF-IR em excesso (Butler et ai., Câncer Res. 58:3021-27, 1998). Ainda, os indivíduos com níveis "normais elevados" de IGF-I possuem um maior risco de cancros comuns comparativamente com os indivíduos com níveis de IGF-I na gama "normal baixa" (Rosen et ai., Trends Endocrinol. Metab. 10: 136-41, 1999). Para uma revisão do papel da interacção IGF-I/receptor de IGF-I no crescimento de uma variedade de tumores humanos, ver Macaulay, Br. J. Câncer, 65:311-320, 1992. A restrição calórica é a intervenção mais eficaz e reprodutível para aumentar o tempo de vida numa variedade de espécies animais, incluindo mamíferos. É igualmente o regime mais potente e de larga actuação na prevenção do cancro em modelos de carcinogénese experimental. Um mecanismo biológico chave, subjacente a muitos dos efeitos benéficos, é a via do factor de crescimento semelhante a insulina tipo 1 (Hursting et al., Annu. Ver. Med. 54:131-52, 2003) . EP0629240BI refere-se à conversão de uma sequência de anticorpo, por tecnologia de DNA recombinante, numa sequência germinal para tentar diminuir a imunogenicidade quando administrado a um doente. W002/066058A1 refere-se a anticorpos dirigidos contra o receptor de EGF (HER1) modificados para reduzir a sua propensão para induzir uma resposta imune. 4 ΡΕ1656391

Face aos papéis de IGF-I e de IGF-IR em distúrbios tais como cancro e outros distúrbios proliferativos, quando IGF-I e/ou IGF-IR são expressos em excesso, e aos papéis que demasiado pouco IGF-I e IGF-IR possuem em distúrbios, quando IGF-I e/ou IGF-IR são expressos em baixa quantidade, é desejável gerar anticorpos contra IGF-RI que possam ser usados para inibir ou estimular igf-ir. Tais anticorpos estão descritos, por exemplo, em WO 02/05359, publicado em 11 de Julho, 2002. Anticorpos contra IGF-IR estão também descritos em wo 03/100008, publicado em 4 de Dezembro, 2003, WO 03/106621, publicado em 24 de Dezembro, 2003 e WO 03/59951, publicado em 24 de Julho, 2003.

SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento proporciona um anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação ao antigénio do mesmo que, especificamente, se liga ao receptor do factor de crescimento semelhante a insulina tipo I (IGF-IR) humano compreendendo pelo menos uma mutação somática contida numa região estrutural de uma região variável do referido anticorpo em que foi substituído um aminoácido por um residuo de aminoácido germinal correspondente, em que a região variável da cadeia leve compreende os aminoácidos números 23 a 130 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO:5.

Numa realização, a sequência da região variável da cadeia leve do anticorpo compreende três mutações 5 ΡΕ1656391 estruturais que reverteram para uma sequência de aminoácidos codificada por um gene A30 germinal. Numa realização preferida, a cadeia leve do anticorpo humano compreende os aminoácidos números 23 a 236 de SEQ ID N0:5.

Numa outra realização do invento, a sequência da região variável de uma cadeia pesada do anticorpo compreende duas mutações estruturais que reverteram para a sequência de aminoácidos codificada por um gene germinal DP-35. Numa realização preferida, a região variável da cadeia pesada compreende os aminoácidos números 20 a 144 de SEQ ID NO:3. Numa realização ainda mais preferida, a cadeia pesada do anticorpo humano compreende os aminoácidos números 20 a 470 de SEQ ID NO:3 e a cadeia leve compreende os aminoácidos números 23 a 236 de SEQ ID NO:5.

Numa outra realização, a cadeia pesada do anticorpo do invento não possui uma lisina terminal. Em particular, o invento está relacionado com um anticorpo em que a cadeia pesada compreende os aminoácidos números 20 a 469 de SEQ ID NO: 3 e a cadeia leve compreende os aminoácidos números 23 a 236 de SEQ ID NO:5. O invento também está relacionado com uma composição farmacêutica para o tratamento de cancro, em que a composição farmacêutica compreende o anticorpo humano modificado do invento em combinação com um agente antineo-plásico, quimioterapêutico ou anti-tumoral e um veiculo farmaceuticamente aceitável. 6 ΡΕ1656391 0 invento também está relacionado com um anticorpo humano, ou porção do mesmo de ligação ao antigénio, do invento para usar no tratamento de cancro num ser humano. Numa realização, o tratamento compreende o passo de administração de um agente anti-neoplásico, anti-tumoral, anti-angiogénico ou agente quimioterapêutico conjuntamente com o anticorpo do presente invento. 0 invento também está relacionado com um polinu-cleótido isolado que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, ou uma cadeia leve, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, do anticorpo do presente invento. Numa realização do invento, este proporciona igualmente um método para o tratamento de um indivíduo necessitado do mesmo com uma quantidade eficaz de uma molécula de ácido nucleico codificador da cadeia pesada e/ou leve, ou porções de ligação ao antigénio das mesmas, de um anticorpo anti-IGF-IR. 0 invento proporciona um vector compreendendo a molécula de ácido nucleico isolada e uma célula hospedeira compreendendo o vector. 0 invento ainda compreende uma célula hospedeira que produz um anticorpo, o qual possui as mesmas sequências de aminoácidos das cadeias pesada e leve maduras de 2.121fx. 0 invento também proporciona um método de 7 ΡΕ1656391 produção pela via recombinante e cultura do anticorpo codificado pela molécula de ácido nucleico. 0 invento também está relacionado com métodos de diagnóstico da presença ou localização de um tecido que expresse IGF-IR usando um anticorpo anti-lGF-lR.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Fig. 1 mostra a sequência de DNA codificadora da cadeia pesada do anticorpo 2.12.1fx, incluindo a sequência codificadora da sequência sinal usada para expressar o anticorpo maduro (SEQ ID N0:1).

Fig. 2 mostra a sequência de DNA codificadora da cadeia leve do anticorpo 2.12.1fx, incluindo a sequência codificadora da sequência sinal usada para expressar o anticorpo maduro (SEQ ID NO:2).

Fig. 3 mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo 2.12.1fx (SEQ ID NO:3) com a da sequência germinal DP-35 (3-11)/D3-3/JH6 (SEQ ID N0:4). A sequência do anticorpo 2.12.1fx está apresentada por cima da sequência germinal. As sequências sinal estão em itálico e as CDRs estão sublinhadas. A região do dominio constante começa com os residuos de aminoácidos ASTK e corresponde aos residuos de aminoácidos que começam em 148 na linha germinal e terminam no final da sequência. As mutações estruturais (FR) são nos residuos de aminoácidos 21 e 116. ΡΕ1656391

Fig. 4 mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo 2.12.1fx (SEQ ID N0:3) com a da sequência germinal A30/Jkl (SEQ ID N0:6). A sequência do anticorpo 2.12.1fx está apresentada por cima da sequência germinal. As sequências sinal estão em itálico e as CDRs estão sublinhadas. A região do domínio constante começa com os resíduos de aminoácidos tvaa e corresponde aos resíduos de aminoácidos que começam em 131 na linha germinal e terminam no final da sequência. As mutações estruturais (FR) são nos resíduos de aminoácidos 43, 125 e 129 .

Fig. 5 mostra que o anticorpo anti-lGF-lR 2.12.1fx inibe a ligação de IGF-1 a células 3T3-IGF-IR.

Figs. 6A e 6B mostram a capacidade do anticorpo 2.12.1fx para bloquear a activação de IGF-IR mediada por IGF-I, conforme demonstrado pelo decréscimo de fosforilação de tirosina associada ao receptor (Fig.6A) e a capacidade do anticorpo 2.12.1fx para induzir a regulação negativa de IGF-IR nas células (Fig. 6B).

Fig. 7 mostra que o anticorpo anti-lGF-lR 2.12.1fx reduz o nível de IGF-IR em tumores 3T3-IGF-IR.

Figs. 8A e 8B mostram que o anticorpo anti-IGF-IR inibe o crescimento de tumores 3T3-IGF-IR in vivo por si só (Fig. 8A) ou em combinação com adriamicina (Fig. 8B). 9 ΡΕ1656391

Fig. 9 mostra a relação entre os níveis séricos do anticorpo anti-IGF-IR 2.12.1fx e a regulação negativa de IGF-IR ao longo do tempo em tumores 3T3-IGF-IR.

Figs. 10A e 10B mostram que o anticorpo anti-IGF-IR 2.12.1fx inibe o crescimento de tumores Colo 205 in vivo sozinho (Fig. 10A) ou em combinação com 5-fluorodesoxi-uridina (5-FU) (Fig. 10B).

Fig. 11 mostra uma avaliação farmacocinética de uma única injecção intravenosa do anticorpo anti-IGF-IR 2.12.1fx em macacos cinomólogos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO A menos que de outra forma seja especificado, os termos científicos e técnicos usados no contexto do presente invento deverão ter os significados normalmente entendidos pelos familiarizados com a matéria. Ainda, a menos que seja ditado pelo contexto, os termos no singular deverão incluir plurais e os termos no plural deverão incluir os singulares. De um modo geral, as nomenclaturas e as técnicas usadas relativamente à cultura de células e tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química de proteínas e ácidos nucleicos e hibridação aqui descritas são as conhecidas e normalmente usadas na área. Os métodos e técnicas do presente invento são, de uma modo geral, realizados de acordo com métodos 10 ΡΕ1656391 convencionais bem conhecidos na área e como descrito em várias referências gerais e mais especificas que são citadas e discutidas ao longo da presente especificação, a menos que de outra forma seja indicado. Ver, e.g., Sambrook et ai., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992) e Harlow e Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). As reacções enzimáticas e técnicas de purificação foram realizadas de acordo com as especificações dos fabricantes, como normalmente efectuado na área ou como aqui descrito. As nomenclaturas e os procedimentos e técnicas laboratoriais usados em quimica analítica, química de síntese orgânica e química médica e farmacêutica aqui descritos são os conhecidos e normalmente usados na área. Foram usadas técnicas convencionais de síntese química, análise química, preparação farmacêutica, formulação e administração e tratamento de doentes.

Os termos que se seguem, a menos que de outra forma seja indicado, deverão ser entendidos como tendo os seguintes significados: O termo "polipéptido" engloba proteínas nativas ou artificiais, fragmentos de proteínas e análogos poli-peptídicos de uma sequência proteica. Um polipéptido pode ser monomérico ou polimérico. 11 ΡΕ1656391

Os análogos não peptídicos são normalmente usados na indústria farmacêutica como fármacos com propriedades análogas às do péptido matriz. Estes tipos de compostos não peptídicos são designados "simulações de péptidos" ou "péptido-simulações". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber e Freidinger TINS p. 392 (1985); e Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987). Tais compostos são muitas vezes desenvolvidos com a ajuda de modelação molecular computarizada. As simulações de péptidos que são estruturalmente semelhantes a péptidos terapeuticamente úteis podem ser usadas para produzir um efeito terapêutico ou profiláctico equivalente. De um modo geral, as péptido-simulações são estruturalmente semelhantes a um polipéptido paradigma (i.e., um polipéptido que possui uma propriedade bioquímica ou actividade farmacológica pretendida), como seja um anticorpo humano, mas possuem uma ou mais ligações peptídicas facultativamente substituídas por uma ligação seleccionada do grupo consistindo em: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2--CH2-, -CH=CH (cis e trans), -COCH2-, -CH(0H)CH2- e -CH2SO-, por métodos conhecidos na área. A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma sequência de consenso com um D-aminoácido do mesmo tipo (e.g., D-lisina em vez de L-lisina) pode também ser usada para gerar péptidos mais estáveis. Ainda, os péptidos restringidos compreendendo uma sequência de consenso ou uma variação da sequência de consenso substancialmente idêntica podem ser gerados por métodos conhecidos na área (Rizo e Gierasch, Ann. Ver. Biochem. 61:387 (1992); por exemplo, através da adição de 12 ΡΕ1656391 resíduos de cisteína internos capazes de formarem pontes dissulfureto intramoleculares que tornam o péptido cíclico.

Uma "imunoglobulina" é uma molécula tetramérica. Numa imunoglobulina natural, cada tetrâmero é composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptidicas, cada um deles tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma "pesada" (cerca de 50-50 kDa). A porção terminal amina de cada cadeia inclui uma região variável de aproximadamente 100 a 110 ou mais aminoácidos essencialmente responsáveis pelo reconhecimento do antigénio. A porção terminal carboxilo de cada cadeia define uma região constante essencialmente responsável pela função efectora. As cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leve κ e λ. As cadeias pesadas são classificadas como μ, Δ, γ, α ou ε e definem o isotipo do anticorpo como igM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro das cadeias leve e pesada, as regiões variáveis e constantes são ligadas por uma região "J" de aproximadamente 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região "D" de aproximadamente 10 ou mais aminoácidos. Ver, de um modo geral, "Fundamental Immunology" Cap. 7 (Paul, W., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)). As regiões variáveis de cada par de cadeias leve/pesada formam o local de ligação ao anticorpo, uma imunoglobulina intacta possuindo, consequentemente, dois locais de ligação.

As cadeias de imunoglobulina apresentam a mesma 13 ΡΕ1656391 estrutura geral de regiões estruturais (FR) relativamente conservadas ligadas por três regiões hipervariáveis, também designadas regiões determinantes de complementaridade ou CDRs. As CDRs das duas cadeias de cada par foram alinhadas pelas regiões estruturais, permitindo a ligação a um epitopo específico. A partir do extremo N até ao extremo C, ambas as cadeias leve e pesada compreendem os domínios FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A atribuição dOS aminoácidos a cada domínio foi de acordo com as definições de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, M.d. (1987 e 1991)) ou Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989).

Um "anticorpo" refere-se a uma imunoglobulina intacta. As porções de ligação ao antigénio podem ser produzidas por técnicas de DNA recombinante ou por hidrólise enzimática ou química de anticorpos intactos. As porções de ligação ao antigénio incluem, inter alia, Fab, Fab', F(ab')2r Fv, dAb e fragmentos das regiões determinantes de complementaridade (CDR), anticorpos de cadeia simples (scFv), anticorpos quiméricos, diacorpos e poli-péptidos que possuem pelo menos uma porção de uma imunoglobulina que seja suficiente para conferir ligação específica de antigénio ao polipéptido.

Um fragmento Fab é um fragmento monovalente consistindo nos domínios VL, VH, CL e CH 1; um fragmento F(ab')2 é um fragmento bivalente compreendendo dois 14 ΡΕ1656391 fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfureto na região de charneira; um fragmento Fd consiste nos dominios VH e CHI; um fragmento Fv consiste nos dominios VL e VH de um braço simples de um anticorpo; e um fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989) consiste num domínio VH.

Um anticorpo de cadeia simples (scFv) é um anticorpo em que uma região VL e uma região VH são emparelhadas para formar moléculas monovalentes via um adaptador sintético que lhes permite serem produzidas como uma cadeia proteica simples (Bird et al., Science 242:423-426, 1988 e Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883, 1988). Os diacorpos são anticorpos bivalentes bispecíficos em que os domínios VH e VL são expressos numa cadeia poli-peptídica simples, mas usando um elemento de ligação que é demasiado pequeno para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçando assim os domínios para emparelharem com dominios complementares de uma outra cadeia e criando dois locais de ligação ao antigénio (ver e.g., Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448, 1993, e Poljak, R. J., et al., Structure 2:1121-1123, 1994). Uma ou mais CDRs podem ser incorporadas numa molécula, covalentemente ou não covalentemente, para a tornar uma imunoadesina. Uma imunoadesina pode incorporar as CDRs como parte de uma cadeia polipeptidica maior, pode ligar covalentemente as CDRs a uma outra cadeia polipeptidica, ou pode incorporar as CDRs não covalentemente. As CDRs permitem que a imunoadesina se ligue especificamente a um antigénio particular com interesse. 15 ΡΕ1656391

Um anticorpo pode ter um ou mais locais de ligação. Caso exista mais de um local de ligação, os locais de ligação podem ser idênticos um ao outro ou podem ser diferentes. Por exemplo, uma imunoglobulina natural possui dois locais de ligação idênticos, um anticorpo de cadeia simples ou um fragmento Fab possui um local de ligação, enquanto um anticorpo "bispecifico" ou "bifuncional" possui dois locais de ligação diferentes.

Um "anticorpo isolado" é um anticorpo que (1) não está associado a componentes naturalmente associados, incluindo outros anticorpos naturalmente associados, que o acompanham no seu estado nativo, (2) não possui outras proteínas da mesma espécie, (3) é expresso por uma célula de uma espécie diferente ou (4) não ocorre na natureza. Exemplos de anticorpos isolados incluem um anticorpo anti-IGF-IR que foi purificado por afinidade com IGF-IR sendo um anticorpo isolado, um anticorpo anti-IGF-IR que foi sintetizado por um hibridoma ou outra linha celular in vitro e um anticorpo anti-IGF-IR humano derivado de um ratinho transgénico. 0 termo "anticorpo humano" inclui todos os anticorpos que possuem uma ou mais regiões constantes derivadas de sequências de imunoglobulina humana. Numa realização preferida, todos os domínios variáveis e constantes derivam de sequências de imunoglobulina humana (um anticorpo totalmente humano). Estes anticorpos podem ser preparados numa variedade de formas, como descrito abaixo. 16 ΡΕ1656391

Um "anticorpo neutralizante" ou "um anticorpo inibidor" é um anticorpo que inibe a ligação de IGF-IR a IGF-I quando um excesso do anticorpo anti-lGF-lR reduz a quantidade de IGF-I ligado a IGF-IR em pelo menos cerca de 20%. Numa realização preferida, o anticorpo reduz a quantidade de IGF-I ligado a IGF-IR em pelo menos 40%, mais de preferência 60%, mesmo mais de preferência 80%, ou mesmo mais de preferência 85%. A redução da ligação pode ser medida por quaisquer meios conhecidos dos familiarizados com a matéria, por exemplo, conforme medido num ensaio de ligação in vitro.

Um "anticorpo de activação" é um anticorpo que activa IGF-IR em pelo menos cerca de 20% quando adicionado a uma célula, tecido ou organismo que expresse IGF-IR. Numa realização preferida, o anticorpo activa a actividade de IGF-IR em pelo menos 40%, mais de preferência 60%, mesmo mais de preferência 80%, ou mesmo mais de preferência 85%. Numa realização mais preferida, o anticorpo de activação foi adicionado na presença de IGF-I ou IGF-II. Numa outra realização preferida, a actividade do anticorpo de activação foi medida através da determinação da quantidade de autofosforilação de tirosina de IGF-IR.

Fragmentos ou análogos de anticorpos podem ser facilmente preparados pelos familiarizados com a matéria seguindo os ensinamentos desta especificação. Os extremos amina e carboxilo de fragmentos ou análogos ocorrem perto 17 ΡΕ1656391 das fronteiras de domínios funcionais. Os domínios estruturais e funcionais podem ser identificados por comparação dos dados de sequências de nucleótidos e/ou de aminoácidos com sequências de bases de dados públicas ou privadas. De preferência, são usados métodos de comparação computorizados para identificar motivos de sequências ou prever domínios proteicos conformacionais que ocorrem noutras proteínas de estrutura e/ou função conhecida. São conhecidos os métodos para identificar sequências proteicas que adquirem uma estrutura tridimensional conhecida. Bowie et al., Science 253:164 (1991). 0 termo "ressonância de plasmões de superfície", como aqui usado, refere-se a um fenómeno óptico que permite a análise de interacções bio-específicas em tempo real através da detecção de alterações nas concentrações proteicas dentro de uma matriz bio-sensora, por exemplo usando o sistema BlAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.). Para outras descrições, ver

Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al ., (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8 :125-131 ; e Johnnson, B. , et al ., (1991) Anal. Biochem. 198:268-277. 0 termo "K0ff" refere-se à constante de velocidade de dissociação de um anticorpo do complexo anticorpo/an-tigénio. 0 termo "kd" refere-se à constante de dissociação de uma interacção anticorpo-antigénio. 18 ΡΕ1656391

Como aqui usado, os vinte aminoácidos convencionais e as suas abreviaturas seguem a utilização convencional. Ver Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass (1991)). Os estereoisómeros (e.g., D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais tais como aminoácidos a-, a-di-substituidos, N-alquilami-noácidos, ácido láctico e outros aminoácidos não convencionais podem também ser componentes adequados para polipéptidos do presente invento. Exemplos de aminoácidos não convencionais incluem: 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglu-tamato, ε-Ν,N,N-trimetil-lisina, ε-Ν-acetil-lisina, 0-fosfo-serina, N-acetil-serina, N-formilmetionina, 3-metil-histisdina, 5-hidroxi-lisina, s-N-metilarginina e outros aminoácidos semelhantes e iminoácidos (e.g., 4-hidropro-lina). Na notação de polipéptidos aqui usada, a direcção para a esquerda é a direcção terminal amina e a direcção para a direita é a direcção terminal carboxilo, de acordo com a utilização convencional. 0 termo "polinucleótido" como aqui referido significa uma forma polimérica de nucleótidos de pelo menos 10 bases de comprimento, ribonucleótidos ou desoxinucleó-tidos ou uma forma modificada de qualquer um dos tipos de nucleótidos. 0 termo inclui formas de cadeia simples e cadeia dupla do DNA. 0 termo "polinucleótido isolado" como aqui usado 19 ΡΕ1656391 deverá significar um polinucleótido de origem genómica, cDNA ou de origem sintética ou uma combinação das mesmas pelo que, devido à sua origem, o "polinucleótido isolado" (1) não está associado à totalidade ou a uma porção de um polinucleótido no qual o "polinucleótido isolado" é encontrado na natureza, (2) está operacionalmente ligado a um polinucleótido a que não está ligado na natureza ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior. 0 termo "nucleótidos naturais" aqui referido inclui desoxirribonucleótidos e ribonucleótidos. 0 termo "nucleótidos modificados" aqui referido inclui nucleótidos com grupos de açúcar modificados ou substituídos e similares. 0 termo "ligações oligonucleotídicas" aqui referido inclui ligações oligonucleotídicas tais como fosforotioato, fosforoditioato, fósforo-selenoato, fosforodi-selenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosoforoamidato e similares. Ver, e.g., LaPlanche et ai., Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et ai., J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et ai., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et ai., Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et ai., Oligonucleotides and Analogues: A Praticai Approach, pp. 87-108 (f. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et ai. Patente U.S. N° 5151510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Caso se pretenda, um oligonucleótido pode incluir uma marca para detecção.

Sequências "operacionalmente ligadas" incluem 20 ΡΕ1656391 sequências de controlo da expressão que são contíguas com o gene de interesse e sequências de controlo da expressão que actuam em trans ou a uma distância para controlar o gene de interesse. O termo "sequência de controlo da expressão" como aqui usado refere-se às sequências polinucleotídicas que são necessárias para efectuar a expressão e processamento de sequências codificadoras a que estão ligadas. As sequências de controlo da expressão incluem sequências adequadas de iniciação, terminação, promotor e estimulador; sinais eficientes do processamento de RNA tais como sinais de "splicing" e de poliadenilação; as sequências que estabilizam o mRNA citoplasmático; sequências que estimulam a eficiência da tradução (í.e., sequência de consenso Kozak); sequências que estimulam a estabilidade proteica; e quando pretendido, sequências que estimulam a secreção proteica. A natureza de tais sequências de controlo difere dependendo do organismo hospedeiro; nos procariotas, tais sequências de controlo, de um modo geral, incluem sequências de promotor, local de ligação ao ribossoma e sequência de terminação da transcrição; em eucariotas, de um modo geral, tais sequências de controlo incluem promotores e sequências de terminação da transcrição. O termo "sequências de controlo" destina-se a incluir, no mínimo, todos os componentes cuja presença é essencial para a expressão e processamento e pode também incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo sequências líder e sequências parceiras de fusão. O termo "vector", como aqui usado, destina-se a 21 ΡΕ1656391 referir uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar um outro ácido nucleico a que está ligado. Um tipo de vector é um "plasmídeo", o qual se refere a uma ansa de DNA de cadeia dupla circular à qual podem ser ligados segmentos de DNA adicionais. Um outro tipo de vector é um vector virai, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao genoma virai. Determinados vectores são capazes de replicação autónoma numa célula hospedeira na qual são introduzidos (e.g., vectores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vectores epissómicos de mamífero) . Outros vectores (e.g., vectores de mamífero não epissómicos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira quando da introdução na célula hospedeira, e assim se replicam juntamente com o genoma hospedeiro. Mais, determinados vectores são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais são operacionalmente ligados. Tais vectores são aqui referidos como "vectores de expressão recombi-nantes" (ou simplesmente, "vectores de expressão"). Em geral, os vectores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante são muitas vezes na forma de plasmídeos. Na presente especificação, "plasmídeo" e "vector" podem ser usados indiferentemente uma vez que o plasmídeo é a forma de vector mais normalmente usada. No entanto, o invento destina-se a incluir essas outras formas de vectores de expressão, tais como vectores virais (e.g., retrovírus defectivos para a replicação, adenovírus e vírus adeno-associados), as quais possuem funções equivalentes. 0 termo "célula hospedeira recombinante" (ou 22 ΡΕ1656391 simplesmente "célula hospedeira"), como aqui usado, destina-se a referir uma célula na qual um vector de expressão recombinante foi introduzido. Deverá ser entendido que tais termos se destinam a referir não só a célula individual particular como também a progénie de tal célula. Devido a poderem ocorrer determinadas modificações em gerações sucessivas devido a mutação ou influências ambientais, tal progénie pode de facto não ser idêntica à célula parental, mas pode ainda estar incluida dentro do âmbito do termo "célula hospedeira" como aqui usado.

Uma referência a uma sequência de ácido nucleico inclui o seu complemento, a menos que de outra forma seja especificado. Assim, uma referência a uma molécula de ácido nucleico tendo uma sequência particular deverá ser entendida como englobando a sua cadeia complementar, com a sua sequência complementar.

Como aqui usados, os termos "marca" ou "marcado" refere-se à incorporação de uma outra molécula no anticorpo. Numa realização, a marca é uma marca detectável, e.g., incorporação de um aminoácido marcado radioactiva-mente ou ligação a um polipéptido de grupos biotinilados que podem ser detectados pela avidina marcada (e.g., estreptavidina contendo uma marca fluorescente ou activi-dade enzimática que pode ser detectada por métodos ópticos ou colorimétricos). Numa outra realização, a marca ou marcador pode ser um fármaco, e.g., um conjugado de fármaco ou toxina. Vários métodos de marcação de polipéptidos e 23 ΡΕ1656391 glicoproteínas são conhecidos na área e podem ser usados. Exemplos de marcas para polipéptidos incluem os que se seguem mas não lhes estão limitados: isótopos radioactivos ou radionuclidos (e.g., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, mln, 125I, 131l), marcas fluorescentes (e.g., FITC, rodamina, fosfo-retos de lantanideos), marcas enzimáticas (e.g., peroxidase de rábano silvestre, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), marcadores quimioluminescentes, grupos bioti-nilo, epitopos polipeptidicos pré-determinados reconhecidos por um repórter secundário (e.g., pares de sequências de fechos de leucina, locais de ligação a anticorpos secundários, dominios de ligação a metais, marcas de epitopos), agentes magnéticos, tais como quelatos de gadolínio, toxinas tais como toxina da tosse convulsa, taxol, cito-calasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblasti-na, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, di-hidroxi-antracinadiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotesterona, glucocorticóides, procaina, tetracaina, lidocaína, propanolol e puromicina e análogos ou seus homólogos. Nalgumas realizações, as marcas são ligadas por braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir potencial inibição espacial. 0 termo "agente" é aqui usado para indicar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica ou um extracto preparado a partir de materiais biológicos. 0 termo "agente farmacêutico ou fármaco" como aqui usado refere-se a um composto químico ou 24 ΡΕ1656391 composição capaz de induzir um efeito terapêutico pretendido quando adequadamente administrado a um doente. Outros termos químicos aqui usados são-no de acordo com a utilização convencional na área, conforme exemplificado pelo The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)). 0 termo "agente antineoplásico" é aqui usado para referir agentes que possuem a propriedade funcional de inibir desenvolvimento ou progressão de uma neoplasia num ser humano, particularmente uma lesão maligna (cancerosa), como seja um carcinoma, sarcoma, linfoma ou leucemia. A inibição de metástases é frequentemente uma propriedade de agentes antineoplásicos. 0 anticorpo pode ser uma molécula de IgG, IgM, IgE, IgA ou IgD. Numa realização preferida, o anticorpo é uma IgG e é do subtipo igGl, IgG2, lgG3 ou lgG4. Numa realização mais preferida, o anticorpo anti-IGF-IR é da subclasse lgG2. A classe e subclasse de anticorpos anti-IGF-IR podem ser determinadas por qualquer métodos conhecido na área. Em geral, a classe e subclasse de um anticorpo pode ser determinado usando anticorpos que são específicos de uma classe e subclasse particular de anticorpo. Tais anticorpos podem ser adquiridos no comércio. A classe e subclasse podem ser determinadas por ELISA, transferências Western, assim como outras técnicas. Como alternativa, a 25 ΡΕ1656391 classe e subclasse podem ser determinadas por sequenciação da totalidade ou de uma porção dos domínios constantes das cadeias pesadas e/ou leves dos anticorpos, comparação das suas sequências de aminoácidos com sequências de aminoácidos conhecidas de várias classes e subclasses de imunoglobulinas e determinação da classe e subclasse dos anticorpos. 0 invento também proporciona um anticorpo anti-IGF-IR que compreende as sequências variáveis codificadas por um gene κ humano. Numa realização preferida, as sequências variáveis são codificadas pela familia de genes Vk A27, A30 ou 012. Numa realização preferida, as sequências variáveis são codificadas por um gene Vk A30 humano. Numa realização mais preferida, a cadeia leve compreende três mutações estruturais que reverteram para a sequência de aminoácidos codificada pela sequência germinal. SEQ ID N0:1 proporciona a sequência da cadeia pesada de 2.12.1fx. SEQ ID NO:2 proporciona a sequência de DNA da cadeia leve de 2.12.1fx. SEQ ID NO:3 proporciona a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de 2.12.1fx. SEQ ID NO:4 proporciona a sequência de aminoácidos germinal DP-35. SEQ ID NO:5 proporciona a sequência de aminoácidos da cadeia leve de 2.12.1fx e SEQ ID NO:6 proporciona a sequência de aminoácidos germinal A30/JK1. As sequências mostradas são de precursores imaturos dos anticorpos que incluem uma sequência sinal. 26 ΡΕ1656391

Numa realização, o anticorpo anti-lGF-IR compreende sequências da região variável codificada pela familia de genes VH DP-35, DP47, DP-70, DP-71 ou VIV-4/4.35. Numa realização preferida, a sequência da região variável deriva de um gene VH DP-35. Numa realização mais preferida, a cadeia pesada compreende duas mutações estruturais que reverteram para a sequência de aminoácidos codificada pela sequência germinal. São proporcionadas as moléculas de ácido nucleico codificadoras do anticorpo anti-lGF-IR do invento.

Numa realização, a molécula de ácido nucleico codificadora da região variável da cadeia leve deriva do gene Vk A30, A2 7 ou 012. Numa realização preferida, a cadeia leve deriva do gene Vk A30. Numa outra realização preferida, a molécula de ácido nucleico codificadora da cadeia leve compreende a região de ligação derivada de JkI, Jk2 ou Jk4. 0 invento proporciona igualmente uma molécula de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de 2.12.1fx. 0 invento também proporciona uma molécula de ácido nucleico codificadora da região variável da cadeia pesada (VH) que deriva do gene vH DP-35, DP47, DP-71 ou VIV-4/4.35, de preferência do gene VH DP-35. Numa realização preferida, a molécula de ácido nucleico codificadora 27 ΡΕ1656391 de VH compreende a região de ligação derivada de JH6 ou JH5, mais de preferência JH6. 0 invento proporciona igualmente uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de 2.12.lfx. A molécula de ácido nucleico codificadora da totalidade das cadeias pesada e leve de um anticorpo humano ou das suas regiões variáveis pode ser obtida de qualquer fonte que produza um anticorpo humano. Os métodos de isolamento do mRNA codificador de um anticorpo são conhecidos na área. Ver e.g., Sambrook et al. 0 mRNA pode ser usado para produzir cDNA para usar na reacção em cadeia da polimerase (PCR) ou clonagem do cDNA dos genes de anticorpos. Numa realização do invento, as moléculas de ácido nucleico podem ser obtidas a partir de um hibridoma que expressa um anticorpo anti-lGF-lR, como descrito atrás, de preferência um hibridoma que possui como um dos seus parceiros de fusão uma célula de um animal transgénico que expressa genes de imunoglobulina humana, como seja um XENOMOUSE™, animal transgénico não humano e ratinho ou um animal transgénico não humano e não ratinho. Os anticorpos contra IGF-IR podem ser, de um modo geral, anticorpos humanos do invento mas não os específicos de IGF-IR.

Uma molécula de ácido nucleico codificadora da totalidade da cadeia pesada de um anticorpo anti-IGF-IR pode ser construída através da fusão de uma molécula de 28 ΡΕ1656391 ácido nucleico codificadora do dominio variável de uma cadeia pesada ou de um seu domínio de ligação ao antigénio com um dominio constante de uma cadeia pesada. De forma semelhante, uma molécula de ácido nucleico codificadora da cadeia leve de um anticorpo anti-lGF-lR pode ser construída através da fusão de uma molécula de ácido nucleico codificadora do dominio variável de uma cadeia leve ou do seu domínio de ligação ao antigénio com um domínio constante de uma cadeia leve. As moléculas de ácido nucleico codificadoras das cadeias VH e VL podem ser convertidas em genes de anticorpo de tamanho completo através da sua inserção em vectores de expressão já codificadores das regiões constantes das cadeias pesadas e leves, respectiva-mente, de forma que o segmento VH seja operacionalmente ligado aos segmentos da região constante (CH) da cadeia pesada dentro do vector e o segmento VL seja operacionalmente ligado ao segmento da região constante da cadeia leve (CL) dentro do vector. Como alternativa, as moléculas de ácido nucleico codificadoras das cadeias VH ou VL são convertidas em genes de anticorpos de tamanho completo através da ligação, e.g., a molécula de ácido nucleico codificadora de uma cadeia VH a uma molécula de ácido nucleico codificadora de uma cadeia CH usando técnicas convencionais de biologia molecular. 0 mesmo pode ser conseguido usando moléculas de ácido nucleico codificadoras das cadeias VL e CL. As sequências dos genes das regiões constantes das cadeias pesada e leve humanas são conhecidas. Ver, e.g., Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., NIH Publ. N° 91-3242, 29 ΡΕ1656391 1991. Moléculas de ácido nucleico codificadoras das cadeias pesada e/ou leve de tamanho completo podem então ser expressas numa célula na qual foram introduzidas e isolado o anticorpo anti-IGF-IR.

Numa outra realização, uma molécula de ácido nucleico codificadora da cadeia pesada de um anticorpo anti-IGF-IR ou de um seu dominio de ligação ao antigénio ou a cadeia leve de um anticorpo anti-IGF-IR ou de um seu dominio de ligação ao antigénio pode ser isolada a partir de um animal não humano e não ratinho que expresse genes de imunoglobulina humana e que foi imunizado com um antigénio IGF-IR. Numa outra realização, a molécula de ácido nucleico pode ser isolada a partir de uma célula produtora de um anticorpo anti-IGF-IR derivada de um animal não transgénico ou de um doente humano que produza anticorpos anti-IGF-IR. Métodos de isolamento de mRNA a partir de células produtoras de anticorpo anti-IGF-IR podem incluir técnicas convencionais de isolamento, clonagem e/ou amplificação usando técnicas de PCR e de construção de bibliotecas e testados usando protocolos convencionais para se obter moléculas de ácido nucleico codificadoras das cadeias pesada e leve anti-IGF-IR.

As moléculas de ácido nucleico podem ser usadas para expressar, por via recombinante, grandes quantidades de anticorpos anti-IGF-IR, como descrito abaixo. As moléculas de ácido nucleico podem ser igualmente usadas para produzir anticorpos de cadeia simples, imunoadesinas, 30 ΡΕ1656391 diacorpos, anticorpos mutados e derivados de anticorpos, como descrito mais abaixo.

Numa outra realização, as moléculas de ácido nucleico do invento podem ser usadas como sondas ou sequências iniciadoras de PCR para sequências de anticorpos especificas. Por exemplo, uma sonda de molécula de ácido nucleico pode ser usada nos métodos de diagnóstico ou uma molécula de ácido nucleico iniciadora de PCR pode ser usada para amplificar regiões de DNA que poderão ser usadas, inter alia, para isolar sequências de ácido nucleico para usar na produção de dominios variáveis de anticorpos anti-IGF-IR. Numa realização preferida, as moléculas de ácido nucleico são oligonucleótidos. Numa realização mais preferida, os oligonucleótidos são de regiões altamente variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo com interesse. O invento proporciona vectores compreendendo as moléculas de ácido nucleico do invento que codificam a cadeia pesada ou a porção de ligação ao antigénio da mesma. O invento também proporciona vectores compreendendo as moléculas de ácido nucleico do invento que codificam a cadeia leve ou porção da ligação ao antigénio da mesma. O invento também proporciona vectores compreendendo moléculas de ácido nucleico codificadoras de proteínas de fusão, anticorpos modificados, fragmentos de anticorpo e sondas das mesmas.

Para expressar os anticorpos ou porções de 31 ΡΕ1656391 anticorpos do invento, DNAs codificadores de cadeias leve e pesada parciais ou de tamanho completo, obtidos como aqui descrito, são inseridos nos vectores de expressão de forma que os genes sejam operacionalmente ligados a sequências de controlo da transcrição e tradução. Os vectores de expressão incluem plasmideos, retrovirus, cosmideos, YACs, epissomas derivados de EBV e similares. 0 gene do anticorpo é ligado a um vector, de forma que as sequências de controlo da transcrição e tradução dentro do vector sirvam a sua função de regulação da transcrição e tradução do gene do anticorpo a que se destinam. 0 vector de expressão e as sequências de controlo de expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira usada. 0 gene da cadeia leve de anticorpo e o gene da cadeia pesada de anticorpo podem ser inseridos em vectores separados. Numa realização preferida, ambos os genes são inseridos no mesmo vector de expressão. Os genes dos anticorpos são inseridos no vector de expressão por métodos convencionais (e.g., ligação de locais de restrição complementares no fragmento do gene do anticorpo e do vector ou ligação de extremos cerses se não estiverem presentes locais de restrição).

Um vector conveniente é um que codifica uma sequência de imunoglobulina CH ou CK humana completa, com os locais de restrição adequados manipulados de forma que qualquer sequência VH ou VL possa ser facilmente inserida e expressa. Em tais vectores, o "splicing" geralmente ocorre entre o local dador de "splicing" na região J inserida e o local aceitador de "splicing" precedendo a região C humana 32 ΡΕ1656391 e também nas regiões de "splicing" que ocorrem dentro dos exões CH humanos. A poliadenilação e a terminação da transcrição ocorrem nos locais cromossómicos nativos a jusante das regiões codificadoras. 0 vector de expressão recombinante codifica um péptido sinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpo por uma célula hospedeira. 0 gene da cadeia de anticorpo pode ser clonado no vector de forma que o péptido sinal seja ligado em grelha ao extremo amina do gene das cadeias de anticorpo. 0 péptido sinal pode ser um péptido sinal de imunoglobulina ou um péptido sinal heterólogo (í.e., um péptido sinal de uma proteina não imunoglobulina).

Para além dos genes das cadeias de anticorpo, os vectores de expressão recombinantes do invento possuem sequências reguladoras que controlam a expressão dos genes das cadeias de anticorpo numa célula hospedeira. Será apreciado pelos familiarizados com a matéria que a projecção do vector de expressão, incluindo a selecção de sequências reguladoras pode depender de factores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, do nível de expressão da proteína pretendida, etc. As sequências reguladoras preferidas para a expressão das células hospedeiras de mamífero incluem elementos virais que dirigem níveis elevados de expressão proteica em células de mamífero, tais como promotores e/ou estimuladores derivados de LTRs retrovirais, de citomegalovírus (CMVj (tais como o promotor/estimulador de CMV), do Vírus Símio 40 (SV40) (como seja o promotor/estimulador de SV40), de adenovírus, 33 ΡΕ1656391 (e.g., o principal promotor tardio de adenovírus (AdMLP)), polioma e promotores fortes de mamifero tais como promotores de imunoglobulina nativa e de actina. Para mais descrição de elementos reguladores virais e sequências dos mesmos, ver e.g., Pat. U.S. N° 5168062 por Stinski, Pat. U.S. N° 4510245 de Bell et al., e Pat. U.S. N° 4968615 de Schaffner et al.

Para além dos genes das cadeias codificadoras de anticorpos e das sequências reguladoras, os vectores de expressão recombinantes do invento podem transportar sequências adicionais, como sejam as sequências que regulam a replicação do vector em células hospedeiras (e.g., origens de replicação) e genes de marcas seleccionáveis. O gene de marcas seleccionáveis facilita a selecção das células hospedeiras nas quais o vector foi introduzido (ver e.g., Pat. U.S. Nos 4399216, 4634665 e 51790179. Por exemplo, tipicamente o gene da marca seleccionável confere resistência a fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, numa célula hospedeira na qual o vector foi introduzido. Os genes de marcas seleccionáveis preferidos incluem o gene da di-hidrofolato redutase (DHFR) (para usar em células hospedeiras dhfr- com selecção/amplificação com metotrexato) e o gene neo (para selecção com G418).

As moléculas de ácido nucleico codificadoras da cadeia pesada, ou de uma porção de ligação ao antigénio da mesma, e/ou da cadeia leve, ou de uma porção de ligação ao antigénio da mesma, de um anticorpo anti-IGF-IR do invento 34 ΡΕ1656391 e vectores compreendendo estas moléculas de ácido nucleico, podem ser usadas para a transformação de uma célula hospedeira adequada. A transformação pode ser por qualquer método conhecido para a introdução de polinucleótidos numa célula hospedeira. Métodos para a introdução de polinucleótidos heterólogos em células de mamifero são conhecidos na área e incluem transfecção mediada por dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por poli-breno, fusão de protoplastos, electroporação, encapsulação dos polinucleótidos em lipossomas, injecção biolistica e microinjecção directa do dna nos núcleos. Ainda, as moléculas de ácido nucleico podem ser introduzidas em células de mamifero através de vectores virais. Métodos de transformação de células são bem conhecidos na área. Ver e.g., Patentes U.S. Nos 4399216, 4912040, 4740461 e 4959455.

Linhas celulares de mamífero disponíveis como hospedeiros para a expressão são bem conhecidas na área e incluem muitas linhas celulares imortalizadas disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC). Estas incluem, inter alia, células de ovário de cobaio chinês (CHO), células NSO, SP2, células HeLa, células de rim de cobaio bebé (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humanas (e.g., Hep G2), células A549, células 3T3 e uma série de outras linhas celulares. As células hospedeiras de mamífero incluem células humanas, de ratinho, rato, símio, porco, cabra, bovino, cavalo e cobaio. As linhas celulares particularmente preferidas são 35 ΡΕ1656391 seleccionadas através da determinação das linhas celulares que possuem niveis de expressão elevados. Outras linhas celulares que podem ser usadas são as linhas celulares de insecto, tais como células Sf9, células de anfíbio, células bacterianas, células vegetais e células de fungos. Quando os vectores de expressão recombinantes, codificadores da cadeia pesada ou de uma porção de ligação ao antigénio da mesma, da cadeia leve e/ou da porção de ligação ao antigénio da mesma, são introduzidos em células hospedeiras de mamífero são produzidos anticorpos através da cultura das células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais de preferência, secreção do anticorpo no meio de cultura em que as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de cultura usando métodos convencionais de purificação de proteínas.

Ainda, a expressão de anticorpos do invento (ou outras partes dos mesmos) a partir de linhas celulares produtoras pode ser estimulada usando uma série de técnicas conhecidas. Por exemplo, o sistema de expressão do gene da sintetase de glutamina (o sistema GS) é uma abordagem comum para estimular a expressão em determinadas condições. 0 sistema GS está discutido na totalidade ou em parte em relação com as Patentes Europeias Nos 0216846, 0256055 e 0323997 e com o Pedido de Patente Europeia n° 89303964.4. É provável que os anticorpos expressos pelas 36 ΡΕ1656391 diferentes linhas celulares ou em animais transgénicos possuirão glicosilação diferente entre si. No entanto, todos os anticorpos codificados pelas moléculas de ácido nucleico aqui proporcionadas ou compreendendo as sequências de aminoácidos aqui proporcionadas são parte do presente invento, independentemente da glicosilação dos anticorpos. 0 invento proporciona igualmente animais transgénicos não humanos compreendendo uma ou mais moléculas de ácido nucleico do invento que podem ser usadas para produzir anticorpos do invento. Os anticorpos podem ser produzidos e recuperados de tecido ou fluidos corporais, tais como leite, sangue ou urina, de cabras, vacas, cavalos, porcos, ratos, ratinhos, cobaios ou outros mamíferos. Ver, e.g., Patente U.S. Nos 582760, 5756687, 5750172 e 5741957. Como descrito atrás, animais transgénicos não humanos possuidores de loci de imunoglobulinas humanas podem ser produzidos através da imunização com IGF-IR ou com uma porção do mesmo.

Numa outra realização, animais transgénicos não humanos são produzidos através da introdução de uma ou mais moléculas de ácido nucleico do invento no animal através de técnicas trangénicas convencionais. As células transgénicas usadas para a preparação do animal transgénico podem ser células estaminais embrionárias ou células somáticas. Os organismos não humanos transgénicos podem ser quiméricos, heterozigóticos não quiméricos e homozigóticos não quiméricos. Ver, e.g., Hogan et al., Manipulating the Mouse 37 ΡΕ1656391

Embryo: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mouse genetics and transgenics: A Praticai Approach, Oxford University Press (2000); e Pinkert, Transgenic Animal Technology: A laboratory Handbook, Academic Press (1999) . Numa outra realização, os organismos transgénicos não humanos podem ter uma disrupção e uma substituição dirigidas que codificam uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve com interesse. Numa realização preferida, os animais transgénicos compreendem e expressam moléculas de ácido nucleico codificadoras das cadeias pesada e leve que se ligam especificamente a IGF-IR, de preferência IGF-IR humana. Numa outra realização, os animais transgénicos compreendem moléculas de ácido nucleico codificadores de um anticorpo modificado como seja um anticorpo de cadeia simples, um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado. Os anticorpos anti-IGF-IR podem ser preparados em qualquer animal transgénico. Numa realização preferida, os animais não humanos são ratinhos, ratos, carneiros, porcos, cabras, gado bovino ou cavalos. O animal transgénico não humano expressa os referidos polipéptidos no sangue, leite, urina, saliva, lágrimas, muco e outros fluidos corporais.

Anticorpos recombinantes humanos, para além dos anticorpos anti-IGF-IR aqui descritos, podem ser isolados por rastreio de uma biblioteca de anticorpos combinatória recombinante, de preferência uma biblioteca de apresentação fágica scFV, preparada usando cDNAs de VL e VH humanos preparados a partir de mRNA derivado de linfócitos humanos. 38 ΡΕ1656391

Metodologias para a preparação e rastreio de tais bibliotecas são conhecidas na área. Existem estojos ("kits") comerciais para a geração de bibliotecas de apresentação fágica (e.g., o sistema de anticorpos fágicos recombinantes da Pharmacia, n° de catálogo 27-9400-01; e o estojo ("kit") de apresentação fágica SurfZAP™ da

Stratagene, n° de catálogo 240612) . Existem ainda outros métodos e reagentes que podem ser usados na geração e rastreio de bibliotecas fágicas de apresentação de anticorpos (ver e.g., Ladner et al. Pat No. 5223409; kang et al. Publicação PCT N° WO 92/18619; Dower et al.r Publicação PCT N° WO 91/17271; Einter et al., Publicação PCT N° WO 92/20791; Markland et al. Publicação PCT N° WO 92/15679; Breitling et al., Publicação PCT N° WO 93/01288; McCafferty et al. Publicação PCT N° WO 92/01047; Garrard et al., Publicação PCT N° WO 92/09690; Fuchs et al., (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al., (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554;

Griffiths et al. (1993) EMBO J 12 :725-734 ; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clackson et al. (1991)

Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; e Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:7978-7982.

Numa realização preferida, para isolar os anticorpos humanos anti-IGF-IR com as caracteristicas 39 ΡΕ1656391 pretendidas, um anticorpo anti-lGF-lR como aqui descrito é primeiro usado para seleccionar sequências da cadeia pesada e leve humanas tendo actividade de liqação a IGF-IR semelhante, usando os métodos de impressão de epitopos descritos em Hoogenboom et al., Publicação PCT N° WO 93/06213. As bibliotecas de anticorpos usadas neste método são, de preferência, bibliotecas de scFV preparadas e testadas como descrito em McCafferty et al.r Publicação PCT N° WO 92/01047, McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; e Griffiths et al., (1993) EMBO J 12:725-734. As bibliotecas de anticorpos scFv foram testadas usando preferencialmente IGF-IR humano como antigénio.

Uma vez seleccionados os segmentos VL e VH humanos iniciais, foram realizadas experiências de "mistura e emparelhamento", em que diferentes pares de segmentos VL e VH inicialmente seleccionados foram testados relativamente à ligação a IGF-IR, para seleccionar combinações de pares VL/VR preferidos. Ainda, para melhorar a qualidade do anticorpo, os segmentos VL e VH dos pares VL/VH preferidos podem ser mutados ao acaso, de preferência dentro da região CDR3 de VH e/ou VL, num processo análogo ao processo de mutação somática in vivo responsável pela maturação de afinidade dos anticorpos durante uma resposta imune natural. Esta maturação de afinidade in vitro pode ser conseguida através da amplificação das regiões VH e VL usando sequências iniciadoras de PCR complementares da CDR3 de VH ou da CDR3 de VL, respectivamente, sequências iniciadoras essas que foram "pulverizadas" com uma mistura 40 ΡΕ1656391 ao acaso das quatro bases nucleotídicas em determinadas posições, de forma que os produtos de PCR resultantes codifiquem segmentos VH e VL nos quais mutações ao acaso foram introduzidas nas regiões CDR3 de VH e/ou VL. Estes segmentos de VH e de VL mutados ao acaso podem ser testados novamente relativamente à ligação a IGF-IR.

Após o rastreio e isolamento de um anticorpo anti-IGF-IR do invento, a partir de uma biblioteca de apresentação de imunoglobulinas recombinantes, pode ser recuperado ácido nucleico codificador do anticorpo selec-cionado a partir da apresentação fágica (e.g., a partir do genoma fágico) e subclonado noutros vectores de expressão através de técnicas de DNA recombinante convencionais. Caso se pretenda, o ácido nucleico pode ainda ser manipulado para criar outras formas de anticorpo do invento, como descrito abaixo. Para expressar um anticorpo humano recombinante isolado através do rastreio de uma biblioteca combinatória, o DNA codificador do anticorpo foi clonado num vector de expressão recombinante e introduzido em células hospedeiras de mamífero, como descrito abaixo. A classe de um anticorpo anti-IGF-IR como descrito atrás pode ser trocada por outra. Num aspecto do invento, uma molécula de ácido nucleico codificadora de VL ou de VH foi isolada, usando métodos conhecidos na área, de forma a não incluir quaisquer sequências de ácido nucleico codificadoras de CL ou CH. A molécula de ácido nucleico codificadora de VL ou VH foi então operacionalmente ligada 41 ΡΕ1656391 a uma sequência de ácido nucleico codificadora de uma CL ou de uma CH de uma classe diferente da molécula de imunoglobulina. Isto pode ser conseguido usando um vector ou molécula de ácido nucleico que compreende uma cadeia CL ou CH, como descrito atrás. Por exemplo, um anticorpo anti— IGF-IR que era originalmente IgM pode ser trocado de classe para uma IgG. Ainda, a troca de classes pode ser usada para converter uma subclasse de IgG noutra, e.g., de igGl para IgG2. Um método preferido para a produção de um anticorpo do invento compreendendo isotipos pretendidos consiste nos passos de isolamento de um ácido nucleico codificador da cadeia pesada de um anticorpo anti-IGF-IR e de um ácido nucleico codificador da cadeia leve de um anticorpo anti-IGF-IR, obtenção a região variável da cadeia pesada, ligação da região variável da cadeia pesada com o dominio constante de uma cadeia pesada do isotipo pretendido, expressão da cadeia leve e da cadeia pesada ligadas numa célula e colheita do anticorpo anti-IGF-IR com o isotipo pretendido.

Pode-se usar as moléculas de ácido nucleico atrás descritas para gerar derivados de anticorpos usando técnicas e métodos conhecidos dos familiarizados com a matéria. De acordo com o invento, um ou mais resíduos de aminoácidos mutados em posições seleccionadas foram então substituídos com um resíduo germinal correspondente.

Numa outra realização, pode ser preparado um anticorpo de fusão ou imunoadesina que compreende a 42 ΡΕ1656391 totalidade ou uma porção de um anticorpo anti-IGF-IR ligado a um outro polipéptido. Numa realização preferida, apenas as regiões variáveis do anticorpo anti-IGF-IR são ligadas ao polipéptido. Numa outra realização preferida, o domínio VH de um anticorpo anti-IGF-IR é ligado a um primeiro polipéptido, enquanto o domínio VL de um anticorpo anti-IGF-IR são ligados a um segundo polipéptido que se associa ao primeiro polipéptido de forma que os domínios VH e VL possam interagir com um outro para formar um local de ligação ao anticorpo. Numa outra realização preferida, o domínio VH é separado do domínio VL por um elemento de ligação de forma que os domínios VH e VL possam interagir um com o outro. 0 anticorpo VH-elemento de ligação-VL é então ligado ao polipéptido com interesse. 0 anticorpo de fusão é útil para dirigir um polipéptido para uma célula ou tecido que expresse IGF-IR. 0 polipéptido pode ser um agente terapêutico, como seja uma toxina, factor de crescimento ou outra proteína reguladora, ou pode ser um agente de diagnóstico, como seja uma enzima que possa ser facilmente visualizada, como seja peroxidase de rábano silvestre. Ainda, podem ser criados anticorpos de fusão em que dois (ou mais) anticorpos de cadeia simples são ligados um ao outro. Isto é útil caso se pretenda criar um anticorpo divalente ou polivalente numa única cadeia polipeptí-dica ou caso se pretenda criar um anticorpo bispecífico.

Para criar um anticorpo de cadeia simples, (scFv) os fragmentos de DNA codificadores de VH e VL são operacionalmente ligados a um outro fragmento codificador 43 ΡΕ1656391 de um elemento de ligação flexível, e.g., codificador da sequência de aminoácidos (GlÍ4-Ser)3, de forma que as sequências VH e VL possam ser expressas como proteína de cadeia simples contígua, com as regiões VL e VH ligadas pelo elemento de ligação flexível (ver e.g., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554). O anticorpo de cadeia simples pode ser monovalente, caso sejam usadas VH e VL simples, bivalente, se forem usadas duas ou mais VH e VL ou polivalente se mais de duas VH e VL forem usadas.

Numa outra realização, outros anticorpos modificados podem ser preparados usando moléculas de ácido nucleico codificadores de anti-IFG-IR. Por exemplo, "corpos kapa" (111 et al., Protein Eng 10:949-57 (1997)), "Minibodies" (Martin et al., EMBO J 13:5303-9 (1994)), "Diacorpos" (Holliger et al., PNAS USA 90 :6444-6448 (1993)) ou "Janusinas" (Traunecker et al., EMBO J 10 :3655-3659 (1991) e Traunecker et al. "Janusin: new molecular design for bispecific reagents" Int J Câncer Sppl 7:51-52 (1992)) podem ser preparados usando técnicas de biologia molecular convencionais seguindo os ensinamentos da especificação.

Um anticorpo ou porção de anticorpo do invento pode ser derivatizado ou ligado a uma outra molécula (e.g., um outro pétido ou proteína). Em geral, os anticorpos ou porções dos mesmos são derivatizados de forma que a ligação 44 ΡΕ1656391 a IGF-IR não seja afectada adversamente pela derivatização ou marcação. Assim, os anticorpos e porções de anticorpos do invento pretendem incluir formas intactas e modificadas dos anticorpos anti-IGF-IR humanos aqui descritos. Por exemplo, um anticorpo ou porção de anticorpo do invento pode ser funcionalmente ligado (por acoplagem quimica, fusão genética, associação não covalente ou outra) a uma ou mais de outras entidades moleculares, como seja um outro anticorpo (e.g., um anticorpo bispecifico ou um diacorpo), um agente de detecção, um agente citotóxico, um agente farmacêutico e/ou uma proteína ou péptido que pode mediar a associação do anticorpo ou porção de anticorpo com uma outra molécula (como seja uma região nuclear de estrepta-vidina ou uma cauda de poli-histidina).

Um tipo de anticorpo derivatizado foi produzido através da ligação cruzada de dois ou mais anticorpos (do mesmo tipo ou de tipos diferentes, e.g., para criar anticorpos bispecíficos). Elementos de ligação cruzada incluem os que são heterobifuncionais, tendo dois grupos distintamente reactivos separados por um espaçador adequado (e.g., éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxi-succinimida) ou homobifuncional (e.g., suberato di-succinimidilo). Tais elementos de ligação podem ser adquiridos à Pierce Chemical Company, Rockford, III.

Um outro tipo de anticorpo derivatizado é um anticorpo marcado. Agentes de detecção úteis com os quais um anticorpo ou porção de anticorpo do invento pode ser 45 ΡΕ1656391 derivatizado, incluem fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, 5-dimetilamina-l-naftalenossul-fonilo, ficoeritrina, lantanídeos fosforosos e similares. Um anticorpo pode também ser marcado com enzimas que sejam úteis na detecção, tais como peroxidase de rábano silvestre, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina, glucose oxidase e similares. Quando um anticorpo é marcado com uma enzima detectável, ele é detectado pela adição de outros reagentes que a enzima usa para produzir um produto de reacção que pode ser identificado. Por exemplo, quando o agente peroxidase de rábano silvestre está presente, a adição de peróxido de hidrogénio e diaminobenzidina conduz a um produto de reacção corado, o qual é detectável. Um anticorpo pode também ser marcado com biotina e detectado através da medição indirecta de avidina ou estreptavidina. Um anticorpo pode ser marcado com um agente magnético, como seja gadolinio. Um anticorpo pode também ser marcado com epitopos polipeptidicos pré-determinados reconhecidos por um repórter secundário (e.g., sequências de fecho de leucinas, locais de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação a metais, caudas de epitopos). Nalgumas realizações, as marcas são ligadas por braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir a potencial inibição espacial.

Um anticorpo anti-IGF-IR pode também ser marcado com um aminoácido marcado radioactivamente. A marca radioactiva pode ser usada para fins de diagnóstico e terapêuticos. Por exemplo, a marca radioactiva pode ser 46 ΡΕ1656391 usada para detectar tumores que expressem IGF-IR por raios X ou outras técnicas de diagnóstico. Ainda, a marca radioactiva pode ser usada terapeuticamente como uma toxina para células cancerosas ou tumores. Exemplos de marcas para polipéptidos incluem os isótopos radioactivos ou radionu-clidos que se seguem mas não lhes estão limitadas - 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, mIn, 125I, 131I.

Um anticorpo anti-IGF-IR pode também ser deriva-tizado com um grupo químico como seja polietilenoglicol (PEG), um grupo metilo ou etilo ou um grupo de açúcar. Estes grupos podem ser úteis para melhorar as caracte-rísticas biológicas do anticorpo, e.g., para aumentar a semi-vida sérica ou para aumentar a ligação aos tecidos. 0 invento também está relacionado com uma composição farmacêutica para o tratamento de uma perturbação hiperproliferativa num animal, a qual compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto do invento e um veículo farmaceuticamente aceitável. Numa realização, a referida composição farmacêutica é para o tratamento de cancro, como seja cancro do cérebro, do pulmão, das células escamosas, da bexiga, gástrico, pancreático, da mama, da cabeça, do pescoço, renal, do rim, do ovário, da próstata, colo-rectal, esofágico, ginecológico ou da tiróide. Os doentes que podem ser tratados com um composto do invento de acordo com métodos deste invento incluem, por exemplo, doentes que foram diagnosticados como tendo múltiplo mieloma, tumor líquido, cancro do fígado, alterações da 47 ΡΕ1656391 tiróide, doença auto-imune mediada pelas células T, alterações endocrinológicas, isquemia, alterações neurode-generativas, cancro do pulmão, cancro ósseo, cancro pancre-ático, cancro da pele, cancro da cabeça e pescoço, melanoma cutâneo ou intra-ocular, cancro uterino, cancro do ovário, cancro rectal, cancro da região anal, cancro do estômago, cancro do cólon, cancro da mama, tumores ginecológicos (e.g. sarcomas uterinos, carcinoma dos tubos de Falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma cervical, carcinoma da vagina ou carcinoma da vulva), doença de Hodgkin, cancro do esófago, cancro do intestino delgado, cancro do sistema endócrino (e.g., cancro da tiróide, paratiróide ou glândulas supra-renais), sarcomas dos tecidos moles, cancro da uretra, cancro do pénis, cancro da próstata, leucemia aguda ou crónica, tumores sólidos da criança, linfomas linfocí-ticos, cancro da bexiga, cancro do rim ou da uretra (e.g., carcinoma das células renais, carcinoma da pélvis renal) ou neoplasias do sistema nervoso central (e.g., linfoma do SNC primário, tumores do eixo espinal, gliomas estaminais do cérebro ou adenomas da pituitária).

Numa outra realização, a referida composição farmacêutica está relacionada com perturbações hiperproli-ferativas não cancerosas tais como, sem limites, restenose após angioplastia e psoriase. Numa outra realização, o invento está relacionado com composições farmacêuticas para o tratamento de um mamífero que requeira a activação de IGF-IR, em que a composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de 48 ΡΕ1656391 activação do invento e de um veículo farmaceuticamente aceitável. Composições farmacêuticas compreendendo anticorpos de activação podem ser usadas para tratar animas que não possuam suficiente IGF-I ou IGF-II ou podem ser usadas para tratar osteoporose, fraqueza ou perturbações em que o mamífero produza demasiado pouca hormona de crescimento ou seja incapaz de responder à hormona de crescimento. 0 anticorpo anti-IGF-IR do invento pode ser incorporado em composições farmacêuticas adequadas para administração a um indivíduo. Tipicamente, a composição farmacêutica compreende um anticorpo do invento e um veículo farmaceuticamente aceitável. Como aqui usado, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes anti-bacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e de retar-dação da absorção e similares que sejam fisiologicamente compatíveis. Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem um ou mais de entre água, soro fisiológico, soro fisiológico tamponado com fosfatos, dextrose, glice-rol, etanol e similares, assim como combinações dos mesmos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis tais como mani-tol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. Substâncias farmaceuticamente aceitáveis tais como substâncias molhantes ou quantidades ínfimas de substâncias auxiliares tais como agentes molhantes ou emulsionantes, preservativos ou tampões, os quais aumentam a vida de prateleira ou eficácia do anticorpo ou porção de anticorpo. 49 ΡΕ1656391

As composições deste invento podem ter uma variedade de formas. Estas incluem, por exemplo, formas de dosagem liquidas, semi-sólidas e sólidas, tais como soluções líquidas (e.g., soluções injectáveis e para infusão), dispersões ou suspensões, comprimidos, pilulas, pós, lipossomas e supositórios. A forma preferida depende do modo de administração e aplicação terapêutica pretendidos. Composições tipicas preferidas são na forma de soluções injectáveis ou para infusão, tais como composições semelhantes às usadas para imunização passiva de seres humanos com outros anticorpos. 0 modo preferido de administração é o parentérico (e.g., intravenosa, subcutânea, intraperito-neal, intramuscular). Numa realização preferida, o anticorpo é administrado por infusão intravenosa ou injecção. Numa outra realização preferida, o anticorpo é administrado por injecção intramuscular ou subcutânea.

As composições terapêuticas, tipicamente, deverão ser estéreis e estáveis nas condições de produção e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, micro-emulsão, dispersão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada a concentrações elevadas de fármaco. Soluções injectáveis estéreis podem ser preparadas através da incorporação do anticorpo anti-IGF-IR na quantidade necessária num solvente adequado com um ingrediente ou combinação de ingredientes enumerados atrás, conforme necessário, seguido de esterilização por filtração. De um modo geral, as dispersões são preparadas através da 50 ΡΕ1656391 incorporação do composto activo num veículo estéril que possui um meio de dispersão básico e dos outros ingredientes necessários de entre os enumerados atrás. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são a secagem sob vácuo e liofilização que dão um pó do ingrediente activo mais qualquer ingrediente adicional pretendido derivado de uma sua solução previamente esterilizada por filtração. A fluidez adequada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de um revestimento como seja lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e pela utilização de tensioactivos. A absorção prolongada de composições injectáveis pode ser conseguida através da inclusão na composição de um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais mono-estearatos e gelatina. O anticorpo do presente invento pode ser administrado por uma variedade de métodos conhecidos na área, ainda que para muitas aplicações terapêuticas, a via/modo de administração seja intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, intravenosa ou infusão. Como será apreciado pelos familiarizados com a matéria, a via e/ou modo de administração variará dependendo dos resultados pretendidos. Numa realização, o anticorpo do presente invento pode ser administrado como uma única dose ou pode ser administrado como múltiplas doses.

Em algumas realizações, o composto activo pode 51 ΡΕ1656391 ser preparado com um veículo que protegerá o composto contra a libertação rápida, como seja uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos e sistemas de libertação microencapsulados. Podem ser usados polímeros biodegradáveis biocompatíveis, tais como acetato de etileno-vinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poli-ortoésteres e ácido polilác-tico. Muitos métodos para a preparação de tais formulações estão patenteados ou são do conhecimento geral. Ver, e.g., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., New York, 1978.

Compostos activos suplementares podem também ser incorporados na composição. Em determinadas realizações, um anticorpo anti-IGF-IR do invento é coformulado com e/ou coadministrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, tais como um agente quimioterapêutico, um agente antineoplásico ou um agente anti-tumoral. Por exemplo, um anticorpo anti-IGF-IR pode ser coformulado e/ou coadministrado com um ou mais agentes terapêuticos. Estes agentes incluem, sem limites, anticorpos que se ligam a outros alvos (e.g., anticorpos que se ligam a um ou mais factores ou citocinas, os seus receptores de superfície celular ou IGF-I), proteinas de ligação a IGF-I, agentes anti-neoplá-sicos, agentes quimioterapêuticos, agentes anti-tumorais, oligonucleótidos complementares da sequência codificante contra IGF-IR ou IGF-I, péptidos análogos que bloqueiam a activação de IGF-IR, IGF-IR solúvel e/ou um ou mais agentes químicos que inibem a produção ou actividade de IGF-I, os 52 ΡΕ1656391 quais são conhecidos na área, e.g., octreotide. Para uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de activação, o anticorpo anti-IGF-IR pode ser formulado com um factor que aumenta a proliferação celular ou previne a apoptose. Tais factores incluem factores de crescimento tais como IGF-I e/ou análogos de IGF-I que activam IGF-IR. Tais terapias de combinação podem requerer dosagens mais pequenas do anticorpo anti-IGF-IR assim como dos agentes co-administrados, evitando assim possíveis toxicidades ou complicações associadas a várias monoterapias. Numa realização, o anticorpo e um ou mais agentes terapêuticos adicionais.

As composições farmacêuticas do invento podem incluir uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou uma "quantidade profilaticamente eficaz" de um anticorpo ou porção de anticorpo do invento. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e durante períodos de tempo necessários para se conseguir o resultado terapêutico pretendido. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou porção de anticorpo pode variar de acordo com factores tais como estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo e da capacidade do anticorpo ou porção do anticorpo para induzir uma resposta pretendida no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é igualmente uma em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo ou porção do anticorpo sejam ultrapassados pelos efeitos terapêuticos benéficos. Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere- 53 ΡΕ1656391 se a uma quantidade eficaz, em dosagens e durante os períodos de tempo necessários, para se conseguir o resultado profilático pretendido. Tipicamente, uma vez que a dose profilática é usada em indivíduos antes da doença ou numa fase precoce da mesma, a quantidade profilaticamente eficaz será inferior à quantidade terapeuticamente eficaz.

Os regimes de dosagem podem ser ajustados para proporcionarem a resposta óptima pretendida (e.g., uma resposta terapêutica ou profilática). Por exemplo, pode ser administrado um único bolus, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. A composição terapêutica compreendendo o anticorpo ou compreendendo uma terapia de combinação compreendendo o anticorpo e um ou mais agentes terapêuticos pode ser formulada para doses simples ou múltiplas. É especialmente vantajoso formular composições parentais na forma unitária de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma unitária de dosagem como aqui é usada refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os mamíferos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto activo calculada para produzir o efeito terapêutico pretendido em associação com o veiculo farmacêutico necessário. A especificação para as formas de dosagem unitárias do invento é ditada e directamente dependente de (a) caracte-risticas únicas do composto activo e do efeito terapêutico 54 ΡΕ1656391 ou profilático particular a ser conseguido e (b) limitações inerentes na área de formulação de tal composto activo para o tratamento da sensibilidade em indivíduos. Uma formulação particularmente útil é 5 mg/ml de anticorpo anti-lGF-lR num tampão de citrato de sódio 20 mM, pH 5,5, NaCl 140 mM e 0,2 mg/ml de polissorbato 80.

Um exemplo de uma gama não limitante para uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpo ou porção de anticorpo do invento é 0,1-100 mg/Kg, mais de preferência 0,5-50 mg/Kg, mais de preferência 1-20 mg/Kg e mesmo mais de preferência 1-10 mg/Kg. Deve-se notar que os valores de dosagem podem variar com o tipo e gravidade da condição a ser aliviada. Deve-se ainda entender que para qualquer indivíduo particular, regimes de dosagem específicos deverão ser ajustados ao longo do tempo de acordo com as necessidades individuais e a avaliação profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições, e que a gama de dosagem aqui estabelecida é apenas exemplificativa e não se destina a limitar o âmbito ou prática da composição reivindicada. Numa realização, a quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpo, ou porção de ligação ao antigénio do mesmo, é administrada juntamente com um ou mais agentes terapêuticos adicionais.

Num outro aspecto, o invento está relacionado com um anticorpo anti-IGF-IR do invento para usar no tratamento de cancro numa dose inferior a 300 mg por mês. 55 ΡΕ1656391

Um outro aspecto do presente invento proporciona estojos ("kits") compreendendo os anticorpos anti-IGF-IR e composições farmacêuticas compreendendo estes anticorpos. Um estojo ("kit") pode incluir, para além do anticorpo ou composição farmacêutica, agentes de diagnóstico ou terapêuticos. Um estojo ("kit") pode também incluir instruções para usar num método de diagnóstico ou terapêutico. Numa realização preferida, o estojo ("kit") inclui o anticorpo ou uma composição farmacêutica do mesmo e um agente de diagnóstico que pode ser usado num método descrito abaixo. Numa outra realização preferida, o estojo ("kit") inclui o anticorpo ou uma composição farmacêutica do mesmo e um ou mais agentes terapêuticos, tais como um agente antineoplásico adicional, um agente anti-tumoral ou um agente quimioterapêutico, que pode ser usado num método descrito abaixo. 0 invento também está relacionado com composições farmacêuticas para inibição do crescimento anormal de células num mamifero, o qual compreende uma quantidade de um composto do invento em combinação com uma quantidade de uma agente quimioterapêutico, em que as quantidades do composto, sal, solvato ou pró-droga e do agente quimioterapêutico são, em conjunto, eficazes na inibição do crescimento celular anormal. Actualmente são conhecidos muitos agentes quimioterapêuticos. Numa realização, os agentes quimioterapêuticos são seleccionados do grupo consistindo em inibidores mitóticos, agentes de alquilação, antimeta- 56 ΡΕ1656391 bolitos, antibióticos intercalantes, inibidores de factores de crescimento, enzimas, inibidores da topoisomerase, agentes anti-sobrevivência, modificadores da resposta biológica, anti-hormonas, e.g. agentes anti-androgénios e anti-angiogénese.

Os agentes anti-angiogénese, tais como inibidores de MMP-2 (matriz-metaloproteinase 2), inibidores de MMP-9 (matriz-metaloproteinase 9) e inibidores de COX-II (ciclo-oxigenase II), podem ser usados em conjunto com um composto do invento. Exemplos de inibidores de COX-ii úteis incluem CELEBREX™ (alecoxibe), valdecoxibe e rofecoxibe. Exemplos de inibidores de matriz-metaloproteinases úteis estão descritos em WO 96/33172 (publicado em 24 de Outubro, 1996) , WO 96/27583 (publicado em 7 de Março, 1996), Pedido de Patente Europeia N° 97304971.1 (pedido em 8 de Julho, 1997) , Pedido de Patente Europeia N° 99308617.2 (pedido em 29 de Outubro, 1999), WO 98/07697 (publicado em 26 de Fevereiro, 1998), WO 98/03516 (publicado em 29 de Janeiro, 1998) , WO 98/34918 (publicado em 13 de Agosto, 1998), WO 98/34915 (publicado em 13 de Agosto, 1998), WO 98/33768 (publicado em 6 de Agosto, 1998), WO 98/30566 (publicado em 16 de Julho, 1998), Pedido de Patente Europeia 606 046 (publicado em 13 de Julho, 1994), Publicação de Patente Europeia 931788 (publicado em 28 de Julho, 1999), WO 90/05719 (publicado em 31 de Maio, 1990), WO 99/52910 (publicado em 21 de Outubro, 1999), WO 99/52889 (publicado em 21 de Outubro, 1999), WO 99/29667 (publicado em 17 de Junho, 1999), Pedido de Patente Internacional PCT N° 57 ΡΕ1656391 PCT/IB98/01113 (pedido em 21 de Julho, 1998), Pedido de Patente Europeia N° 99302232.1 (pedido em 25 de Março, 1999), pedido de patente britânica número 9912961.1 (pedido em 3 de Junho, 1999), Pedido de Patente Provisória dos Estados Unidos N° 60/148464 (pedido em 12 de Agosto, 1999), Patente dos Estados Unidos 5863949 (concedida em 26 de Janeiro, 1999), Patente dos Estados Unidos 5861510 (concedida em 19 de Janeiro, 1999) e Publicação de Patente Europeia 780386 (publicada em 25 de Junho, 1997). inibidores de mmp preferidos são os que não demonstram artralgia. Mais preferidos, são os que selectivamente inibem MMP-2 e/ou MMP-9 relativamente a outras matriz-metaloproteinases (i.e. MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 e MMP-13). Alguns exemplos específicos de inibidores de MMP úteis no presente invento são AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830 e os compostos enumerados na seguinte lista: ácido 3—[[4—(4— fluoro-fenoxi)-benzenossulfonil]-(1-hidroxicarbamoil-ciclopentil)-amino]-propiónico; hidroxamida do ácido 3-exo-3-[4-(4-fluoro-fenoxi)-benzenossulfonilamino]-8-oxa-bici-clo[3.2.1]octano-3-carboxílico; hidroxiamida do ácido (2R,3R) 1-[4-(2-cloro-4-fluoro-benziloxi)-benzeno-sulfo- nil]-3-hidroxi-3-metil-piperidina-2-carboxílico; hidroxiamida do ácido 4-[4-(4-fluoro-fenoxi)-benzenossulfonilamino]-tetra-hidropirano-4-carboxílico; ácido 3—[[4—(4 — fluro-fenoxi)-benzenossulfonil]-(1-hidroxicarbamoil-ciclo-butil)-amino]-propiónico; hidroxiamida do ácido 4—[4—(4— cloro-fenoxi)-benzenossulfonilamino]-tetra-hidro-piran-4- 58 ΡΕ1656391 carboxílico; hidroxamida do ácido (R) 3-[4-(4-cloro- fenoxi)-benzenossulfonilamino]-tetra-hidro-pirano-3-carbo-xílico; hidroxamida do ácido (2R, 3R) 1-[4-(4-fluoro-2- metil-benziloxi)-benzenossulfonil]-3-hidroxi-3-metil-piperidina-2-carboxílico; ácido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi)-benzenossulfonil]-(1-hidroxicarbamoil-l-metil-etil-)-amino]-propiónico; ácido 3-[ [4-(4-fluoro-fenoxi)-benzenossulfonil] -(4-hidroxicarbamoil-tetra-hidro-pirano-4-il)-amino]-propiónico; hidroxiamida do ácido 3-exo-3-[4-(4-cloro-fenoxi)-benzenossulfonilamino]-8-oxa-iciclo[3.2.1]-octano-3-carboxílico; hidroxiamida do ácido 3-endo-3-[4-(4-fluoro-fenoxi)benzenossulfonilamino]-8-oxa-iciclo[3.2.1]— octano-3-carboxilico; e hidroxiamida do ácido (R) 3—[4— (4 — fluoro-fenoxi)-benzenossulfonilamino]tetra-hidro-furano-3-carboxílico; e os sais farmaceuticamente aceitáveis e solvatos dos referidos compostos.

Um composto do invento pode também ser usado com inibidores da transdução de sinal, como sejam os agentes que podem inibir respostas a EGF-IR (receptor do factor de crescimento epidérmico), tais como anticorpos contra EGF-R, anticorpos contra EGF e moléculas que são inibidores de EGF-R; inibidores de VEGF (factor do crescimento do endo-télio vascular), tais como receptores de CEGF e moléculas que podem inibir VEGF; e inibidores dos receptores de erbB2, tais como moléculas orgânicas ou anticorpos que se ligam ao receptor de erbB2, por exemplo, HERCEPTIN™ (Genentech, Inc.). Os inibidores de EGF-R estão descritos, por exemplo, em WO 95/19970 (publicado em 27 de Julho, 59 ΡΕ1656391 1995), WO 98/14451 (publicado em 9 de Abril, 1998), WO 98/02434 (publicado em 22 de Janeiro, 1998) e Patente dos Estados Unidos 5747498 (concedida em 5 de Maio, 1998) e tais substâncias podem ser usadas no presente invento como aqui descrito. Os agentes inibidores de EGFR incluem, mas não estão limitados aos anticorpos monoclonais C225 e anti-EGFR 22Mab (ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200 (Merck KgaA), MDX-447/H-477 (Medarex Inc. e Merck KgaA) e os compostos ZD-1834, ZD-1838 e ZD-1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI-166/CGP-75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), leflunomida (Pharmacia/Sugen), CI-1033 (Warner Lambert Parke Davis), CI-1033/PD 183805 (Warner Lambert Parke Davis), CL-387785 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehrin-ger Mannheim GmbH/Roche), Naamidina A (Bristol Myers Squibb), RC-3940-II (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co.), VRCTC-310 (Ventech Research), toxina de fusão com EGF (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperial Câncer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Câncer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Câncer Center), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) e Vacina de EGF-R (York Medical/Centro de Imunologia Molecular (CIM)). Estes e outros agentes inibidores de EGF-R podem ser usados no presente invento.

Inibidores de VEGF, por exemplo SU-5416 e SU-6668 (Sugen Inc.), SH-268 (Schering) e NX-1838 (NeXstar) podem também ser combinados com o composto do presente invento. 60 ΡΕ1656391

Os inibidores de VEGF estão descritos, por exemplo, em WO 99/24440 (publicado em 20 de Maio, 1999), Pedido de Patente Internacional PCT PCT/IB99/00797 (pedido em 3 de Maio, 1999), em WO 95/21613 (publicado em 17 de Agosto, 1995), WO 99/61422 (publicado em 2 de Dezembro, 1999), Patente dos Estados Unidos 5834504 (concedida em 10 de Novembro, 1998), WO 98/50356 (publicado em 12 de Novembro, 1998), Patente dos Estados Unidos 588113 (concedida em 16 de Março, 1999), Patente dos Estados Unidos 5886020 (concedida em 23 de

Março, 1999), Patente dos Estados Unidos 5792783 (concedida em 11 de Agosto, 1998), WO 99/10349 (publicado em 4 de Março, 1999), WO 97/32856 (publicado em 12 de Setembro,

1997) , WO 97/22596 (publicado em 26 de Junho, 1997), WO 98/54093 (publicado em 3 de Dezembro, 1998), WO 98/02438 (publicado em 22 de Janeiro, 1998), WO 99/16755 (publicado em 8 de Abril, 1999) e WO 98/02437 (publicado em 22 de Janeiro, 1998). Outros exemplos de alguns inibidores específicos de VEGF úteis no presente invento são IM862 (Cytran Inc.); e angiozima, uma ribozima sintética da Ribozyme e Chiron. Estes e outros inibidores de VEGF podem ser usados no presente invento como aqui descrito.

Inibidores do receptor de ErbB2, tais como GW- 282974 (Glaxo Wellcome pic), e os anticorpos monoclonais AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc.) e 2B-1 (Chiron), podem ainda ser combinados com o composto do invento, por exemplo os indicados em WO 98/02434 (publicado em 22 de Janeiro,

1998) , WO 99/35146 (publicado em 15 de Julho, 1999), WO 99/35132 (publicado em 15 de Julho, 1999), WO 98/02437 61 ΡΕ1656391 (publicado em 22 de Janeiro, 1998), WO 97/13760 (publicado em 17 de Abril, 1997), WO 95/19970 (publicado em 27 de Julho, 1995), Patente dos Estados Unidos 5587458 (concedida em 24 de Dezembro, 1996) e Patente dos Estados Unidos 5877305 (concedidao em 2 de Março, 1999). Os inibidores do receptor ErbB2 úteis no presente invento estão também descritos no Pedido de Patente Provisória dos Estados Unidos N° 60/117341, pedido em 27 de Janeiro, 1999 e no Pedido de Patente dos Estados Unidos N° 60/117346, pedido em 27 de Janeiro, 1999. Os compostos inibidores do receptor de erbB2 e as substâncias descritas nos pedidos de patente PCT, patentes U.S. e pedidos provisórios U.S. atrás referidos, assim como outros compostos e substâncias que inibem o receptor erbB2, podem ser usados com o composto do presente invento de acordo com o presente invento. O anticorpo do invento pode também ser usado com os anticorpos CTLA-4, tais como os descritos na patente dos Estados Unidos 6682736, incluindo um anticorpo tendo a sequência do anticorpo 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 ou 12.9.1.1. O anticorpo pode também ser usado com os anticorpos CD40, como os descritos em W003040170 publicado em 15 de Maio, 2003, incluindo um tendo a sequência do anticorpo 3.1.1, 3.1. 1H-A78T, 3.1. 1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 ou 24.2. 62 ΡΕ1656391

Os anticorpos podem também ser combinados com agentes anti-integrina, tais como anticorpos anti-integrina.

Alguns exemplos específicos de agentes que podem ser combinados com anticorpo incluem os seguintes:

Os agentes de alquilação mostarda azotada, N-óxido, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalano, busulfanmi-tobronitol, carboquona, tiotepa, ranimustina, nimustina e temozolomida;

Os antimetabolitos metotrexato, 6-mercaptopurina, ribósido, mercaptopurina, 5-FU, tegafur; doxifluridina, carmofur, citarabina, ocfosfato, enocitabina, S-l, gemci-tabina, fludarabina e capecitabina;

Os antibióticos actinomicina D, doxorrubicina, daunorrubicina, neocarzinostatina, bleomicina, peplomicina, mitomicina C, aclarubicina, pirarubicina, epirubicina, zinostatina, estimalamer e idarrubicina;

Os agentes anti-tumorais derivados de plantas vincristina, vinblastina, vindechina, etopósido, sobuzo-xano, docetaxel, paclitaxel e vinorelbina;

Os compostos coordenados com platina cisplatina, carboplatina, nedaplatina e oxaliplatina; 63 ΡΕ1656391

Derivados de camptotecina irinotecano, topotecano e camptotecina;

Inibidor das cinases de tirosina gefitiniba;

Agentes anti-CD20 ritoximab, tositumomab e ibri-tumomab tiucetano;

Interferões, interferão alfa, interferão alfa-2a, interferão alfa-2b, interferão beta, interferão gama-la e interferão gama-nl;

Modificadores das respostas biológicas crestina, lentinano, sizofirano, picibanilo e ubenimex; e outros agentes antitumorais mitoxantrona, 1-asparaginase, procar-bazina, dacarbazina, hidroxicarbamida, pentostatina e tretinoina.

Ainda, o anticorpo do invento pode ser combinado com os agentes anti-cancro exemestano, edotecarina (J-107088) e SU11248. O anticorpo anti-lGF-IR pode ser usado para detectar igf-ir numa amostra biológica in vitro ou in vivo. O anticorpo anti-IGF-IR pode ser usado num imunoensaio convencional, incluindo, sem limites, um ELISA, um RIA, FACS, imuno-histoquimica de tecidos, transferências Western ou imunoprecipitação. O anticorpo anti-IGF-IR do invento pode ser usado para detectar IGF-IR em seres humanos. Numa 64 ΡΕ1656391 outra realização, o anticorpo anti-IGF-IR pode ser usado para detectar IGF-IR dos primatas do Velho Mundo ,tais como macacos cinomólogos e rhesus, dos chimpanzés e dos macacos. 0 invento proporciona um método para a detecção de anti-IGF-IR numa amostra biológica compreendendo o contacto de uma amostra biológica com um anticorpo anti-IGF-IR do invento e detecção do anticorpo ligado a anti-IGF-IR para detectar o IGF-IR na amostra biológica. Numa realização, o anticorpo anti-IGF-IR foi marcado directamente com uma marca detectável. Numa outra realização, o anticorpo anti-IGF-IR (o primeiro anticorpo) não é marcado e é marcado um segundo anticorpo ou outra molécula que se pode ligar ao anticorpo anti-GF-IR. Como é conhecido dos familiarizados com a matéria, um segundo anticorpo é escolhido de forma a ser capaz de se ligar especificamente a espécies e classes específicas do primeiro anticorpo. Por exemplo, se o anticorpo anti-IGF-IR for um IgG humano, então o anticorpo secundário pode ser um anti-IgG humana. Outras moléculas que se podem ligar a anticorpos incluem, sem limites, Proteína A e Proteína G, ambas comercializadas, e.g., pela Pierce Chemical Co.

Marcas adequadas para o anticorpo primário ou secundário foram descritas supra e incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, agentes magnéticos e materiais radioactivos. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, β-galactosidase ou acetil-colinesterase; exemplos de complexos de grupos prostéticos 65 ΡΕ1656391 adequados incluem streptavidina e avidina/biotna; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferoma, fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceina, cloreto de dansilo ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; um exemplo de um agente magnético inclui gadolí-nio; e exemplos de material radioactivo adequado incluem 125I, 135I, 35S ou 3H.

Numa realização alternativa, IGF-IR pode ser testado numa amostra biológica através de um imunoensaio de competição usando padrões de IGF-IR marcados com uma substância detectável e um anticorpo anti-IGF-IR não marcado. Neste ensaio, a amostra biológica, os padrões de IGF-IR marcados e o anticorpo anti-IGF-IR foram combinados e foi determinada a quantidade do padrão IGF-IR marcado ligado ao anticorpo não marcado. A quantidade de IGF-IR na amostra biológica foi inversamente proporcional à quantidade de padrão IGF-IR marcado ligado ao anticorpo anti-IGF-IR.

Pode-se usar os imunoensaios descritos atrás para uma série de fins. Numa realização, o anticorpo anti-IGF-IR pode ser usado para detectar IGF-IR em células em cultura. Numa realização preferida, o anticorpo anti-IGF-IR pode ser usado para determinar o nível de fosforilação de tirosina, autofosforilação de tirosina de IGF-IR e/ou a quantidade de IGF-IR na superfície celular após tratamento das células com vários compostos. Este método pode ser usado para 66 ΡΕ1656391 testar compostos que podem ser usados para activar ou inibir IGF-IR. Neste método, uma amostra de células é tratada com um composto a testar durante um período de tempo, enquanto uma outra amostra é deixada sem tratamento. Se a autofosforilação da tirosina for medida, as células são lisadas e a fosforilação da tirosina do IGF-IR é medido usando um imunoensaio descrito atrás ou como descrito anteriormente usando um ELISA. Se for medido o nível total de IGF-IR, as células são lisadas e o nível de IGF-IR total é medido usando um dos imunoensaios atrás descritos.

Um imunoensaio preferido para a determinação da fosforilação da tirosina de IGF-IR é um ELISA ou uma transferência Western. Se for medido apenas o nível de IGF-IR na superfície celular, as células não são lisadas e os níveis de IGF-IR na superfície celular são medidos usando um dos imunoensaios descritos atrás. Um imunoensaio preferido para determinação dos níveis de IGF-IR na superfície celular inclui os passos de marcação das proteínas da superfície celular com uma marca detectável, como seja biotina ou 125I, imunoprecipitação do IGF-IR com um anticorpo anti-IGF-IR e depois detecção do IGF-IR marcado. Um outro imunoensaio preferido para determinação da localização de IGF-IR, e.g., níveis na superfície celular, é através da utilização de imuno-histoquímica. Os métodos tais como ELISA, RIA, transferências Western, imuno-histoquímica, marcação da superfície celular de proteínas integrais da membrana e imunoprecipitação são conhecidos na área. Ver, e.g., Harlow e Lane, supra. A 67 ΡΕ1656391 escala dos imunoensaios pode ainda ser aumentada para testar um elevado número de compostos para a activação ou inibição de IGF-IR. 0 anticorpo anti-lGF-lR do invento pode também ser usado para determinar os niveis de IGF-IR num tecido ou em células derivadas do tecido. Numa realização preferida, o tecido era um tecido doente. Numa realização mais preferida, o tecido é um tumor ou uma biopsia do mesmo. Numa realização preferida do método, um tecido ou uma biopsia do mesmo foi removido de um doente. 0 tecido ou biopsia foi então usado num imunoensaio para determinar, e.g., niveis de IGF-IR, niveis de IGF-IR na superfície celular, níveis de fosforilação de tirosina de IGF-IR ou localização de IGF-IR pelos métodos descritos atrás. 0 método pode ser usado para determinar se um tumor expressa IGF-IR num nível elevado. 0 método de diagnóstico atrás descrito pode ser usado para determinar se um tumor expressa níveis elevados de IGF-IR, o que pode indicar que o tumor responderá bem ao tratamento com um anticorpo anti-IGF-IR. 0 método de diagnóstico pode também ser usado para determinar se um tumor é potencialmente canceroso, se expressa níveis elevados de IGF-IR, ou benigno, se expressa níveis baixos de IGF-IR. Ainda, o método de diagnóstico pode também ser usado para determinar se o tratamento com anticorpo anti-IGF-IR (ver abaixo) faz com que um tumor expresse níveis mais baixos de IGF-IR e/ou expresse níveis mais baixos de 68 ΡΕ1656391 autofosforilação de tirosina e assim pode ser usado para determinar se o tratamento tem êxito. De um modo geral, um método para determinar se um anticorpo anti-IGF-IR diminui a fosforilação de tirosina compreende os passos de medição do nivel de fosforilação de tirosina numa célula ou tecido de interesse, incubação da célula ou tecido com um anticorpo anti-IGF-IR ou uma porção do mesmo de ligação ao antigénio, depois nova medição do nivel de fosforilação de tirosina na célula ou tecido. A fosforilação de tirosina de IGF-IR ou de uma ou mais outras proteínas pode ser medida. 0 método de diagnóstico pode também ser usado para determinar se um tecido ou célula não expressa níveis suficientemente elevados de IGF-IR ou níveis suficientemente elevados de IGF-IR activado, o que pode ser o caso para indivíduos com nanismo, osteoporose ou diabetes. Um diagnóstico de que os níveis de IGF-IR ou de IGF-IR activo são demasiado baixos poderá ser usado no tratamento com anticorpos activadores anti-IGF-IR, IGF-I ou outros agentes terapêuticos para aumentar os níveis ou actividade de IGF-IR.

Com base na capacidade do anticorpo do presente invento para regular negativamente IGF-IR nos linfócitos periféricos, pode ser empregue uma "estratégia de biomar-cador" para monitorizar a expressão de IGF-IR em células circulantes de tumor e/ou normais dos doentes tratados com o anticorpo do invento. Podem ser usados outros anticorpos, tais como os anticorpos descritos em WO 02/05359, publicado em 11 de Julho de 2002. Estas células podem incluir mas não 69 ΡΕ1656391 estão limitadas a células CD19+ e podem também incluir todas as células brancas do sangue tais como monócitos, granulócitos e linfócitos. 0 anticorpo do presente invento pode também ser usado in vivo para localizar tecidos e órgãos que expressam IGF-IR. Numa realização preferida, o anticorpo anti-IGF-IR pode ser usado para localizar tumores que expressam IGF-IR. 0 método compreende os passos de administração de um anticorpo anti-IGF-IR ou de uma composição farmacêutica do mesmo a um doente necessitado de tal teste de diagnóstico e sujeição do doente a análise de imagiologia determinando a localização dos tecidos que expressam IGF-IR. A análise de imagiologia é conhecida no campo médico e inclui, sem limites, a análise por raios X, a imagiologia de ressonância magnética (MRI) ou a tomografia computarizada (CE) . Numa outra realização do método, é obtida uma biopsia a partir do doente para determinar se o tecido com interesse expressa IGF-IR em vez de submeter o doente a análise de imagiologia. Numa realização preferida, o anticorpo anti-IGF-IR pode ser marcado com um agente detectável que pode ser visualizado num doente. Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado com um agente contrastante, como seja bário, o qual pode ser usado para análise por raios X ou um agente de contraste magnético, como seja quelato de gadolinio, o qual pode ser usado para MRI ou CE. Outros agentes de marcação incluem, sem limites, isótopos radioactivos, tais como 99Tc. Numa outra realização, o anticorpo anti-IGF-IR não será marcado e será 70 ΡΕ1656391 visualizado através da administração de um segundo anticorpo ou outra molécula que é detectável e que pode ligar-se ao anticorpo anti-IGF-IR.

Numa outra realização, o invento proporciona um anticorpo anti-IGF-IR para usar na inibição da actividade de IGF-IR num doente necessitado. O anticorpo do presente invento pode ser usado para fins terapêuticos. Numa outra realização preferida, o IGF-IR é humano e o doente é um doente humano. Como alternativa, o doente pode ser um mamifero que expressa um IGF-IR com o qual o anticorpo anti-IGF-IR reage de forma cruzada. O anticorpo pode ser administrado a um mamífero não humano expressando um IGF-IR com o qual o anticorpo dá reacção cruzada (i.e. um primata ou um macaco cinomólogo ou rhesus) para fins veterinários ou como um modelo animal da doença humana. Tais modelos animais podem ser úteis para avaliação da eficácia terapêutica de anticorpos deste invento.

Numa realização preferida, um anticorpo anti-IGF-IR pode ser administrado a um doente que possui um tumor que expressa IGF-IR. Um tumor pode ser um tumor sólido ou pode ser um tumor não sólido, como seja um linfoma. Numa realização mais preferida, um anticorpo anti-IGF-IR pode ser administrado a um doente que tem um tumor que expressa IGF-IR e é canceroso. Numa realização ainda mais preferida, o anticorpo anti-IGF-IR é administrado a um doente que possui um tumor do pulmão, mama, próstata ou cólon. Numa realização altamente preferida, a administração faz com que 71 ΡΕ1656391 o tumor não aumente de peso ou volume ou decresça de peso ou volume. Numa outra realização, a administração faz com que o IGF-IR no tumor seja internalizado. Numa realização preferida, o anticorpo é 2.12.1fx ou compreende uma cadeia pesada, cadeia leve ou região de ligação ao antigénio do mesmo.

Numa outra realização preferida, um anticorpo anti-IGF-IR pode ser administrado a um doente que expressa inadequadamente niveis elevados de IGF-I, por exemplo uma perturbação na qual a actividade de IGF-IR é prejudicial. Como aqui é usado, o termo "uma perturbação em que a actividade de IGF-IR é prejudicial" destina-se a incluir doenças e outras perturbações em que a presença de niveis elevados de IGF-IR num indivíduo que sofra de uma perturbação que se demonstrou ser ou supostamente é responsável pela patofisiologia da perturbação ou é um factor que contribui para piorar a perturbação. Assim, uma perturbação em que níveis elevados de actividade IGF-IR é prejudicial é uma perturbação em que se espera que a inibição da actividade de IGF-IR alivie os sintomas e/ou progressão da perturbação. Tais perturbações podem ser evidenciadas, por exemplo, através de um aumento nos níveis de IGF-IR na superfície celular ou de um aumento da autofosforilação de tirosina de IGF-IR nas células ou tecidos afectados de um indivíduo que sofra da perturbação. 0 aumento dos níveis de igf-ir pode ser detectado, por exemplo, usando um anticorpo anti-IGF-IR como descrito atrás. 72 ΡΕ1656391

Num aspecto, o anticorpo anti-IGF-IR é usado para tratar estados não cancerosos em que níveis elevados de IGF-I e/ou IGF-IR tem sido associado ao estado ou doença não cancerosa. Numa realização, a utilização compreende o passo de administração de um anticorpo anti-IGF-IR a um doente que tenha um estado patológico não canceroso causado ou exacerbado por níveis elevados de IGF-I e/ou níveis ou actividade de IGF-IR. Numa realização preferida, o estado patológico não canceroso é acromegália, gigantismo, psoríase, aterosclerose, restenose do músculo liso dos vasos sanguíneos ou proliferação microvascular inadequada, como a encontrada numa complicação de diabetes, especialmente do olho. Numa realização mais preferida, um anticorpo anti-IGF-IR retarda a progressão do estado patológico não canceroso. Numa realização mais preferida, o anticorpo anti-IGF-IR pára ou inverte, pelo menos em parte, o estado patológico não canceroso.

Sabe-se na área que a expressão elevada de IGF-I pode conduzir a uma variedade de cancros comuns. Numa realização preferida, o anticorpo anti-IGF-IR é administrado a um doente com cancro da próstata, glioma ou fibros-sarcoma. Numa realização mais preferida, a utilização faz com que o cancro pare de proliferar anormalmente ou que não aumente de peso ou volume ou que diminua de peso ou volume.

Numa realização, a referida utilização está relacionada com o tratamento de cancro como seja o cancro 73 ΡΕ1656391 do cérebro, das células escamosas, da bexiga, gástrico, pancreático, da mama, da cabeça, do pescoço, do esófago, da próstata, colo-rectal, do pulmão, renal, do rim, do ovário, ginecológico ou da tiróide. Os doentes que podem ser tratados com um composto do invento de acordo com o invento incluem, por exemplo, doentes que foram diagnosticados como tendo mieloma múltiplo, tumor líquido, cancro do fígado, perturbações da tiróide, doença auto-imune mediada pelas células T, perturbações endocrinológicas, isquémia, perturbações neurodegenerativas, cancro do pulmão, cancro dos osso, cancro pancreático, cancro da pele, cancro da cabeça e pescoço, melanoma cutâneo ou intra-ocular, cancro uterino, cancro do ovário, cancro rectal, cancro da região anal, cancro do estômago, cancro do cólon, cancro da mama, tumores ginecológicos (e.g., sarcomas uterinos, carcinoma das trompas de Falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma cervical, carcinoma da vagina ou carcinoma da vulva), doença de Hodgkin, cancro do esófago, cancro do intestino delgado, cancro do sistema endócrino (e.g., cancro da tiróide, paratiróide ou das glândulas supra-renais), sarcomas dos tecidos moles, cancro da uretra, cancro do pénis, cancro da próstata, leucemia crónica ou aguda, tumores sólidos da infância, linfomas linfocíticos, cancro da bexiga, cancro do rim ou da uretra (e.g., carcinoma das células renais, carcinoma da pélvis renal) ou neoplasias do sistema nervoso central (e.g., linfoma primário do SNC, tumores do eixo espinal, gliomas estaminais do cérebro ou adenomas da pituitária). 74 ΡΕ1656391

0 anticorpo pode ser administrado uma vez mas, mais preferencialmente, é administrado múltiplas vezes. 0 anticorpo pode ser administrado entre três vezes ao dia e uma vez de seis em seis meses. A administração pode ser num esquema como três vezes ao dia, duas vezes ao dia, uma vez ao dia, uma vez de dois em dois dias, uma vez de três em três dias, uma vez por semana, uma vez de duas em duas semanas, uma vez mensalmente, uma vez cada dois meses, uma vez cada três meses e uma vez cada seis meses. 0 anticorpo pode ser administrado através da via oral, mucosal, bucal, intranasal, inalável, intravenosa, subcutânea, intramuscular, parentérica, intratumoral ou tópica. 0 anticorpo pode ser administrado num local distante do local do tumor. 0 anticorpo pode também ser administrado continuamente através de uma minibomba. 0 anticorpo pode ser administrado uma vez, pelo menos duas vezes ou pelo menos durante um periodo de tempo até a condição estar tratada, paliada ou curada. 0 anticorpo, de um modo geral, será administrado até o tumor ainda estar presente, desde que o anticorpo faça com que o tumor ou cancro pare de crescer ou diminua de peso ou volume. 0 anticorpo, de um modo geral, será administrado como parte de uma composição farmacêutica como descrito supra. A dosagem do anticorpo será, de um modo geral, na gama de 0,1-100 mg/Kg, mais de preferência 0,5-50 mg/Kg, mais de preferência 1-20 mg/Kg e mesmo mais de preferência 1-10 mg/kg. A concentração sérica do anticorpo pode ser medida por qualquer método conhecido na área. O 75 ΡΕ1656391 anticorpo pode também ser administrado profilaticamente de forma a prevenir que um cancro ou tumor ocorra. Isto pode ser especialmente útil em doentes que possuem um nivel "normal elevado" de IGF-I devido a estes doentes possuírem um risco mais elevado de desenvolver cancros comuns. Ver Rosen et al., supra.

Num outro aspecto, o anticorpo anti-IGF-IR pode ser coadministrado com outros agentes terapêuticos, tais como fármacos ou moléculas anti-neoplásicos, a um doente que tenha uma perturbação hiperproliferativa, como seja um cancro ou um tumor. Num aspecto, o invento está relacionado com um anticorpo do invento para usar no tratamento da perturbação hiperproliferativa num mamífero compreendendo a administração ao referido mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto do invento em combinação com um agente anti-tumoral seleccionado do grupo consistindo em inibidores mitóticos, agentes de alquilação, anti-metabolitos, agentes intercalantes, inibidores dos factores de crescimento, inibidores do ciclo celular, enzimas, inibidores da topoisomerase, modificadores da resposta biológica, anti-hormonas, inibidores de cinases, inibidores de metaloproteases da matriz, fármacos genéticos e anti-androgénios, mas não lhes estando limitados. Numa realização mais preferida, o anticorpo pode ser administrado com um agente antineoplásico, como seja adriamicina ou taxol. Numa outra realização preferida, a terapia com o anticorpo ou de combinação é administrada juntamente com 76 ΡΕ1656391 radioterapia, quimioterapia, terapia fotodinâmica, cirurgia ou outra imunoterapia. Numa outra realização preferida, o anticorpo será administrado com um outro anticorpo. Por exemplo, o anticorpo anti-lGF-lR pode ser administrado com um anticorpo ou outro agente conhecido por inibir tumores ou a proliferação de células cancerosas, e.g., um anticorpo ou agente que inibe o receptor erbB2, EGF-R, CD20 ou VEGF. A coadministração do anticorpo com um agente terapêutico adicional (terapia de combinação) engloba a administração de uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-IGF-IR e o agente terapêutico adicional e a administração de duas ou mais composições farmacêuticas, uma compreendendo o anticorpo anti-IGF-IR e uma ou mais das outras compreendendo um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Ainda, apesar da coadministração ou terapia de combinação, de um modo geral, significar que o anticorpo e os agentes terapêuticos adicionais são administrados em simutâneo, também abrange casos em que o anticorpo e agentes terapêuticos adicionais são administrados em alturas diferentes. Por exemplo, o anticorpo pode ser administrado um vez cada três dias, enquanto o agente terapêutico adicional é administrado uma vez por dia. Como alternativa, o anticorpo pode ser administrado antes ou após o tratamento da perturbação com o agente terapêutico adicional, por exemplo após um doente ter falhado a terapia com o agente adicional. De forma semelhante, a administração do anticorpo anti-IGF-IR pode ser realizada antes ou após a radioterapia, terapia fotodinâmica ou cirurgia. 77 ΡΕ1656391 0 anticorpo e um ou mais agentes terapêuticos adicionais (a terapia de combinação) podem ser administrados uma vez, duas vezes ou pelo menos durante o período de tempo necessário para a condição ser tratada, paliada ou curada. De preferência, a terapia de combinação é administrada múltiplas vezes. A terapia de combinação pode ser administrada entre três vezes ao dia e uma vez de seis em seis meses. A administração pode ser num esquema como o de três vezes ao dia, duas vezes ao dia, uma vez ao dia, uma vez cada dois dias, uma vez cada três dias, uma vez por semana, uma vez cada duas semanas, uma vez por mês, uma vez cada dois meses, uma vez cada três meses e uma vez cada seis meses ou pode ser administrada continuamente com uma minibomba. A terapia de combinação pode ser administrada por via oral, mucosal, bucal, intranasal, inalável, intravenosa, subcutânea, intramuscular, parentérica, intratumo-ral ou tópica. A terapia de combinação pode ser administrada num local distante do local do tumor. A terapia de combinação, de um modo geral, será administrada enquanto o tumor estiver presente, desde que o anticorpo cause a paragem do crescimento do tumor ou cancro ou a diminuição do seu peso ou volume.

Ainda numa outra realização, o anticorpo anti-IGF-IR é marcado com uma marca radioactiva, uma imunotoxina ou uma toxina, ou é uma proteína de fusão compreendendo um péptido tóxico. 0 anticorpo anti-lGF-lR ou proteina de 78 ΡΕ1656391 fusão com o anticorpo anti-IGF-IR dirige a marca radio-activa, a imunotoxina, a toxina ou o péptido tóxico para a célula do tumor ou do cancro que expressa IGF-IR. Numa realização preferida, a marca radioactiva, a imunotoxina, a toxina ou o péptido tóxico é internalizado após o anticorpo anti-IGF-IR se ligar ao IGF-IR na superfície da célula do tumor ou do cancro.

Num outro aspecto, o anticorpo anti-IGF-IR pode ser usado terapeuticamente para induzir apoptose de células específicas num doente necessitado. Em muitos casos, as células alvo de apoptose são células de cancro ou de tumor. Assim, numa realização preferida, o invento proporciona um método de indução de apoptose através da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-IGF-IR a um doente necessitado. Numa realização preferida, o anticorpo é 2.12.1fx ou compreende uma cadeia pesada, uma cadeia leve ou uma porção de ligação ao antigénio das mesmas. Num outro aspecto, o invento proporciona administração de um anticorpo anti-IGF-IR a um doente necessitado do mesmo. Numa realização, o anticorpo de activação ou composição farmacêutica é administrado a um doente necessitado numa quantidade eficaz para aumentar a actividade de IGF-IR. Numa realização mais preferida, o anticorpo de activação é capaz de restaurar a actividade de IGF-IR normal. Numa outra realização preferida, o anticorpo de activação pode ser administrado a um doente que possui uma estatura baixa, neuropatia, um decréscimo na massa 79 ΡΕ1656391 muscular ou osteoporose. Numa outra realização preferida, o anticorpo de activação pode ser administrado com um ou mais de outros factores que aumentam a proliferação celular, inibem a apoptose ou aumentam a actividade de IGF-IR. Tais factores incluem factores de crescimento tais como IGF-I e/ou análogos de IGF-I que activam IGF-IR. Numa realização preferida, o anticorpo é 2.12.1fx ou compreende uma cadeia pesada, uma cadeia leve ou uma porção de ligação ao antigénio do mesmo.

As moléculas de ácido nucleico do presente invento podem ser administradas a um doente necessitado através de terapia génica. A terapia pode ser in vivo ou ex vivo. Numa realização preferida, as moléculas de ácido nucleico codificadoras de uma cadeia pesada e de uma cadeia leve são administradas a um doente. Numa realização mais preferida, as moléculas de ácido nucleico são administradas de forma a serem estavelmente integradas no cromossoma das células B devido a estas células serem especializadas na produção de anticorpos. Numa realização preferida, os precursores das células B são transfectados ou infectados ex vivo e retransplantados num doente necessitado. Numa outra realização, os precursores das células B ou outras células são infectados in vivo usando um virus que se sabe infectar o tipo de células com interesse. Os vectores tipicamente usados para terapia génica incluem lipossomas, plasmideos ou vectores virais, tais como retrovirus, adenovirus e virus adeno-associados. Após infecção in vivo 80 ΡΕ1656391 ou ex vivo, os níveis de expressão de anticorpo podem ser monitorizadas colhendo uma amostra do doente tratado e usando qualquer imunoensaio conhecido na área e aqui discutido.

Numa realização preferida, o uso de terapia génica compreende os passos de administração de uma quantidade eficaz de uma molécula de ácido nucleico isolada codificadora da cadeia pesada ou da porção de ligação ao antigénio da mesma do anticorpo humano ou porção do mesmo e expressão da molécula de ácido nucleico. Numa outra realização, o uso de terapia génica compreende os passos de administração de uma quantidade eficaz de uma molécula de ácido nucleico isolada codificadora da cadeia leve ou da porção de ligação ao antigénio da mesma do anticorpo humano ou porção do mesmo e expressão da molécula de ácido nucleico. Num método mais preferido, o uso da terapia génica compreende os passos de administração de uma quantidade eficaz de uma molécula de ácido nucleico isolada codificadora da cadeia pesada ou da porção de ligação ao antigénio da mesma do anticorpo humano ou porção deste e de uma quantidade eficaz de uma molécula de ácido nucleico isolado codificadora da cadeia leve ou da porção de ligação ao antigénio da mesma do anticorpo humano ou porção deste e expressão das moléculas de ácido nucleico. O uso da terapia génica compreende o passo de administração de um outro agente anti-cancro, como seja taxol, tamoxifeno, 5-FU, adriamicina ou CP-358,774. 81 ΡΕ1656391

Nos. ID das sequências do pedido de patente: SEQ ID NO 1: Sequência de DNA codificadora da cadeia pesada do anticorpo 2.12.1fx incluindo a sequência codificadora da sequência sinal usada para expressar o anticorpo maduro. SEQ ID NO 2: Sequência de dna codificadora da cadeia leve do anticorpo 2.12.1fx incluindo a sequência codificadora da sequência sinal usada para expressar o anticorpo maduro. SEQ ID NO 3: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo 2.12.1fx. SEQ ID NO 4: Sequência de aminoácidos germinal DP-35. SEQ ID NO 5: Sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo 2.12.1fx. SEQ ID NO 6: Sequência de aminoácidos germinal A30/JK1.

De forma que este invento seja melhor compreendido, são descritos os exemplos que se seguem. Estes exemplos são apenas para fins ilustrativos e não devem ser pensados de forma alguma como limitativos do âmbito do invento. 82 ΡΕ1656391

EXEMPLO 1: Geração de hibridoma produtor do anticorpo anti-IGF-IR 0 anticorpo do invento foi preparado, selecci- onado e testado como se segue: XENOMICE™ de oito a dez semanas de idade foram imunizados intraperitonealmente ou nas patas traseiras com o dominio extracelular de IGF-IR humano (10 μρ/άοΒΘ/^ΟίηΙιο) ou com células 3T3-IGF-IR ou 300.19-IGF-IR, as quais são duas linhas celulares transfectadas que expressam IGF-IR humano nas suas membranas plasmáticas (10 x 106 células/dose/ratinho). Esta dose foi repetida cinco a sete vezes ao longo de um período de três a oito semanas. Quatro dias antes da fusão, os ratinhos receberam uma injecção final do domínio extracelular de IGF-IR humano em PBS. Os linfócitos do baço e dos nódulos linfáticos de ratinhos imunizados foram fundidos com a linha celular de mieloma não secretor P3-X63-Ag8.653 e foram sujeitos a selecção com HAT como anteriormente descrito (Galfre and Milstein, Methods Enymol. 73:3-46, 1981). Um hibridoma, 2.12.1, produtor dos anticorpos monoclonais específicos de IGF-IR foi seleccionado para posterior estudo e depositado na American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, em 12 de Dezembro, 2000 com o número de depósito que se segue: 83 ΡΕ1656391

Hibridoma Depósito N° 2.12.1 PTA-2792

Este hibridoma, e outros produtores de anticorpos específicos de IGF-1R estão descritos em WO 02/05359, publicado em 11 de Julho, 2002.

Duas mutações estruturais na cadeia pesada e três mutações estruturais na cadeia leve do anticorpo 2.12.1 foram corrigidas para a da linha germinal para produzir o anticorpo 2.12.1fx.

Toas as alterações para fazer as mutações 2.12.1fx foram feitas usando QuickChange Site-Directed Mutagenesis estojo ("kit") (Stratagene™) através da preparação de um plasmideo com o local alvo da mutação através de desnaturação do plasmideo e emparelhamento das sequências iniciadoras oligonucleotidicas contendo a mutação pretendida. A actividade de não deslocamento da cadeia da DNA-polimerase Pfu Turbo foi usada para prolongar e incorporar as sequências iniciadoras mutagénicas resultando em cadeias circulares com um corte de cadeia simples. A digestão da matriz de DNA parental metilado não mutado com Dpnl foi seguida através da transformação de dsDNA circular com um corte de cadeia simples em células XLlB supercompetentes. Após transformação, as células XLlB supercompetentes repararam os cortes de cadeia simples no plasmideo mutado. Os plasmideos contendo mutações foram seleccionados e a sequência verificada. 84 ΡΕ1656391 A Fig. 1 mostra a sequência de DNA codificadora da cadeia pesada do anticorpo 2.12.1fx, incluindo a sequência codificadora da sequência sinal usada para expressar o anticorpo maduro (SEQ ID N0:1). A Fig. 2 mostra a sequência de DNA codificadora da cadeia leve do anticorpo 2.12.1fx, incluindo a sequência codificadora da sequência sinal usada para expressar o anticorpo maduro (SEQ ID N0:2). A Fig. 3 mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo 2.12.1fx (SEQ ID NO:3) com a da sequência germinal DP-35 (3-11)/D3-3/JH6 (SEQ ID N0:4). A sequência do anticorpo 2.12.1fx está apresentada por cima da sequência germinal. As sequências sinal estão em itálico e as CDRs estão sublinhadas. A região do domínio constante começa com os resíduos de aminoácidos ASTK e corresponde aos resíduos de aminoácidos que começam em 148 na sequência germinal e se prolongam até ao fim da sequência. As mutações estruturais (FR) são os resíduos de aminoácidos 21 e 116. A Fig. 4 mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo 2.12.1fx (SEQ ID N0:5) com a da sequência germinal A30/JK1 (SEQ ID N0:6). A sequência do anticorpo 2.12.1fx está apresentada por cima da sequência germinal. As sequências sinal estão em itálico e as CDRs estão sublinhadas. A região dos domínios constantes começa com os resíduos de aminoácidos TVAA e corresponde aos resíduos de aminoácidos começando em 131 na sequência germinal e prolonga-se até ao fim da sequência. As mutações estruturais (FR) estão nos resíduos de aminoácidos 43, 125 e 129. 85 ΡΕ1656391 EXEMPLO II: Bloqueio da ligação de IGF-I/IGF-IR mediado por anticorpo

As experiências de ELISA foram realizadas para quantificar a capacidade do anticorpo do invento para inibir a ligação de IGF-I a IGF-IR num ensaio baseado em células. Células NIH-3T3 transfectadas com IGF-IR (5xl04/ml) foram semeadas em 100 μΐ de meio DMEM com elevado teor de glucose suplementado com L-glutamina (0,29 mg/ml), 10% de FBS inactivado pelo calor e geneticina, penicilina e estreptomicina, 500 μρ/ιηΐ de cada, em placas de 96 alvéolos com fundo em U. As placas foram incubadas a 37°C, 5% C02 durante a noite para permitir que as células adiram. O meio foi decantado das placas e substituído com 100 μΐ de meio fresco por alvéolo. Para testar, o anticorpo foi diluído em meio de ensaio (meio DMEM com elevado teor de glucose suplementado com L-glutamina (0,29 mg/ml), 10% de FBS inactivado pelo calor, 200 μg/ml de BSA e geneticina, penicilina e estreptomicina, 500 μρ/ιηΐ de cada) para a concentração final pretendida. Todas as amostras foram realizadas em triplicado. As placas foram incubadas a 37°C durante dez minutos. O [125I]-IGF-I foi diluído para uma concentração de 1 μΟί/ηιΙ em meio de ensaio e adicionado 50 μΐ por alvéolo da placa. Como controlo da radioacti- vidade de fundo, IGF-I frio foi adicionado para uma concentração final de 100 ng/ml. As placas foram incubadas durante 10 minutos a 37°C e o meio decantado por absorção suave com toalhas de papel e duas lavagens com meio de 86 ΡΕ1656391 ensaio. As células foram Usadas pela adição de 50 μΐ de NaOH 0,1N, 0,1% de SDS e as placas foram agitadas durante cinco minutos à temperatura ambiente. As amostras foram transferidas para uma placa de cintilação, adicionou-se 150 μΐ de OptiPhase Supermix e o sinal foi lido usando um contador Wallace MicroBeta. A tabela I e a Figura 5 mostram os resultados desta experiência realizada com o anticorpo deste invento. Esta experiência demonstrou que o anticorpo do invento especifícamente inibe a ligaçao de [ I]-IGF-I a células que expressam em excesso IGF-IR.

Tabela i

Anticorpo Monoclonal IC50 2.12.lfx 0,14 pg/ml

EXEMPLO III: Inibição mediada por anticorpo da fosforilação de IGF-IR induzida por IGF-I

As experiências de ELISA foram realizadas de forma a determinar se o anticorpo deste invento foi capaz de bloquear a activação de IGF-IR mediada por IGF-I. A activação de IGF-IR mediada por IGF-I foi detectada pelo decréscimo da fosforilação de tirosina associada ao receptor. 87 ΡΕ1656391

Preparação de placas de ELISA

As placas de captura de ELISA foram preparadas pela adição de 100 μΐ de tampão de bloqueio (3% de albumina sérica bovina [BSA] em soro fisiológico tamponado com Tris [TBS] ) a cada alvéolo de uma placa de 96 alvéolos (Pierce) revestida com ReactiBind Protein G (Pierce). As placas foram incubadas com agitação durante 30 minutos à temperatura ambiente. O anticorpo de coelho de larga especificidade anti-IGF-IR SC-713 (Santa Cruz) foi diluído em tampão de bloqueio para uma concentração de 5 μg/ml. 100 μΐ de anticorpo diluído foram adicionados a cada alvéolo. As placas foram incubadas com agitação durante 60-90 minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas cinco vezes com tampão de lavagem (TBS + 0,1% Tween 20) e o tampão restante foi seco sobre toalhas de papel. Não se deixou que estas placas secassem antes da adição do lisado.

Preparação do lisado a partir de células que expressam IGF-IR

As células NIH-3T3 transfectadas com IGF-IR (5xl04/ml) foram colocadas em 100 μΐ de meio de crescimento (meio DMEM com elevado teor de glucose suplementado com L-glutamina (0,29 mg/ml), 10% de FBS inactivado pelo calor e geneticina, penicilina e estreptomicina, 500 pg/ml de cada) em placas de 96 alvéolos de fundo em U. As placas foram incubadas a 37°C, 5% CO2 durante a noite para permitir que 88 ΡΕ1656391 as células se ligassem. 0 meio foi decantado das placas e substituído com 100 μΐ de meio de crescimento fresco por alvéolo. Para testar, os potenciais anticorpos anti-IGF-IR foram diluídos até cinco vezes relativamente à concentração final pretendida em meio de crescimento e 25 μΐ foram adicionados a cada alvéolo. Todas as amostras foram realizadas em triplicado. As placas foram incubadas a 37°C durante uma hora. As células foram estimuladas com 25 μΐ/alvéolo de IGF-1 a 600 ng/ml (preparado em meio de crescimento) e incubadas à temperatura ambiente durante 10 minutos. O meio foi decantado por inversão das placas e secagem rápida sobre folhas de papel. As células aderentes foram lisadas pela adição de 50 μΐ de tampão de lise (HEPES 50 mM, pH 7,4, EDTA 10 mM, NaCl 150 mM, MgCl2 1,5 mM, NaV04 1,6 mM, 1% Triton X-100, 1% glicerol) e suplementado imediatamente antes de usar com um comprimido de inibidores de proteases sem EDTA [Roche Molecular Sciences] por 50 ml) . As células foram agitadas durante 5 minutos à temperatura ambiente. Adicionou-se 200 μΐ de tampão de diluição (HEPES 50 mM, pH 7,4, NaV04 1,6 mM) a cada alvéolo e misturou-se por pipetagem. Transferiu-se 100 μΐ de lisado de cada alvéolo da placa de ELISA de captura preparada como descrito atrás e incubada com agitação suave durante duas horas à temperatura ambiente. ELISA com anticorpos anti-fosfotirosina (pTYR) O lisado celular foi removido através da inversão 89 ΡΕ1656391 das placas, lavagem das placas cinco vezes com tampão de lavagem e remoção do excesso de líquido sobre toalhas de papel. Adicionou-se 100 μΐ por alvéolo de anticorpo específico de pTYR (HRP-PY54) e diluiu-se em tampão de bloqueio para uma concentração de 0,2 μρ/πιΐ. As células foram incubadas por agitação das placas durante 30 minutos à temperatura ambiente. As placas foram então lavadas cinco vezes com tampão de lavagem e secas sobre toalhas de papel. A ligação do anticorpo HRP-PY54 foi detectada pela adição de 100 μΐ por alvéolo da solução de TMB substrato da peroxidase (Kirkegaard & Perry) e incubação com agitação para revelação da cor (aproximadamente 2-10 minutos) . A reacção de revelação da cor foi parada pela adição de 100 μΐ por alvéolo de solução de paragem de TMB (Kirkegaard & Perry). As placas foram agitadas durante 10 segundo à temperatura ambiente para misturar a solução e quantificadas à DChsonm· A Tabela II e a Figura 6A mostram os resultados desta experiência com o anticorpo do invento. Os resultado desta experiência demonstram a capacidade do anticorpo deste invento para bloquear a activação de igf-ir mediada por IGF-I como se mostra pelo decréscimo da fosforilação de tirosina associada ao receptor. Ainda, estes resultados podem ser usados para quantificar a potência relativa do anticorpo deste invento. ΡΕ1656391 90

Tabela II

Anticorpo monoclonal IC50 ^g/ml) 2.12.lfx 0, 42 EXEMPLO IV: Reactividade cruzada entre espécies do anticorpo do invento

Para determinar a reactividade cruzada entre espécies do anticorpo do invento, foram realizadas várias experiências incluindo imunoprecipitação, bloqueio da fosforilação de receptor mediado por anticorpos induzido por IGF-I e análise por FACS.

Para efectuar as experiências de imunoprecipitação, as células foram semeadas em meio DMEM com elevado teor de glucose com L-glutamina (0,29 mg/ml), 10% FBS inactivado pelo calor e geneticina, penicilina e estrepto-micina, 500 μg/ml de cada, até 50% de confluência em frascos T25. Adicionou-se 100 μΐ de um anticorpo do invento em solução salina tamponada de Hank (HBSS; Gibco BRL) numa concentração de 1 μρ/ιηΐ. As placas foram incubadas durante 30 minutos a 37°C numa estufa e depois as células estimuladas com IGF-I a 100 ng/ml durante 10 minutos à temperatura ambiente. As células foram lisadas em tampão RIPA (Harlow and Lane, supra) e imunoprecipitado o IGF-IR com 2 μρ do anticorpo anti-IGF-IR SC-713 de especificidade larga (Santa Cruz) mais esferas de proteina A agarose durante 1 hora a 4°C. As esferas foram sedimentadas e 91 ΡΕ1656391 lavadas três vezes com PBS/T (PBS + 0,1% Tween-20) e depois fervidas em 40 μΐ de tampão de Laemmli contendo 5% βΜΕ.

As amostras preparadas como descrito atrás foram então analisadas por transferência Western. 12 μΐ de cada amostra foram aplicados por pista em géis Novex™ de gradiente de 4-10% corridos com tampão MES IX (Novex™) . Os géis foram corridos a 150V durante 1 hora ou a 200V durante aproximadamente 30 minutos. O gel foi transferido para uma membrana em tampão de transferência Novex™ com 10% de metanol, durante a noite a 100 mA ou durante 1-1,5 horas a 250 mA. A membrana foi deixada secar completamente e bloqueada à temperatura ambiente com TBS (soro fisiológico tamponado com Tris, pH 8,0) contendo Superblock (Pierce Chemical Co.) . O anticorpo de transferência contra IGF-IR SC713 (Santa Cruz) ou um anticorpo contra fosfotirosina foi adicionado para detectar IGF-IR ou fosfo-IGF-IR imunopre-cipitado, respectivamente.

Esta experiência foi realizada com o anticorpo do invento em células de uma variedade de animais. O anticorpo foi capaz de se ligar a IGF-IR humano, mas não ao canino ou de ratinho. Estas experiências indicam que os anticorpos são altamente específicos.

Determinação da afinidade cruzada entre espécies dos anticorpos do invento A análise por FACS foi realizada para determinar 92 ΡΕ1656391 a afinidade do anticorpo do invento para IGF-IR de outros animais, particularmente de macacos do velho mundo atrás descritos. Aliquotas de células humanas e de macaco (cinomólogo) (5xl05) foram incubadas durante 1 hora em gelo com concentrações crescentes de anticorpos anti-IGF-IR biotinilados do invento. As amostras foram incubadas durante 30 minutos em gelo com RPE (ficoeritrina) conjugada com estreptavidina. A ligação foi medida por citometria de fluxo e analisada com os histogramas de intensidade de fluorescência (FI2-H) versus número de células (Contagens) usando o programa CellQuest. A ligação (Kd) foi calculada para cada anticorpo a partir de gráficos de intensidade média de fluorescência versus concentração de anticorpo. Na maioria das experiências, a ligação foi medida em células humanas MCF-7 em cultura e em células de cultura de tecidos cinomólogos. A depleção do anticorpo foi controlada através da medição da ligação ao longo de uma gama de concentrações de células. A análise de FACS atrás referida foi realizada para testar a capacidade do anticorpo do invento para se ligar a células humanas e cinomólogas. Observou-se metade da ligação máxima (Kd) de 0,1 pg/ml para todas as linhas celulares testadas.

EXEMPLO V: Regulação negativa do receptor de IGF-I

Para investigar se o anticorpo do invento poderá induzir a regulação negativa de IGF-IR em células, células 93 ΡΕ1656391 MCF7 foram semeadas em meio DMEM/F12 suplementado com L-glutamina (0,29 mg/ml), 10% de FBS inactivado pelo calor, penicilina e estreptomicina até 50% da confluência em frascos T75. O anticorpo do invento foi adicionado às células numa concentração final de 1 μg/ml. As placas foram incubadas durante algumas horas a 37°C numa estufa e depois lisadas em HEPES 50 mM, pH 7,4, RDTA 10 mM, NaCl 150 mM,

MgC12 1,5 mM, Nav04 1,6 mM, 1% Triton X-100, 1% de glicerol. O nivel de IGF-IR total nos extractos celulares foi determinado por análise de transferência Western usando o anticorpo SC-713 anti-lGF-iR pan-especifico (Santa Cruz) . Ver Fig. 6B. O tratamento das células MCF7 com o anticorpo do invento resultou em 60-70 por cento de regulação negativa de IGF-IR com 1-2 horas. EXEMPLO VI: Efeitos do anticorpo do invento sobre IGF-IR in vivo

Foi realizada uma experiência para determinar se os efeitos do anticorpo do invento sobre IGF-IR como descrito nos exemplos anteriores poderá ocorrer in vivo. Os tumores foram induzidos em ratinhos atimicos de acordo com métodos publicados (V.A. Pollack et al., "Inhibition of epidermal growth factor receptor-associated tyrosine phosphorylation in human carcinomas with CP-358,774: Dynamics of receptor inhibition in situ and antitumor effects in athymic mice," J. Pharmacol. Exp. Ther. 291:739-748 (1999) . Resumidamente, células NIH-3T3 transfectadas com IGF-IR (5xl06) foram injectadas subcutaneamente em 94 ΡΕ1656391 ratinhos atímicos com 3-4 semanas de idade (nu/nu) com 0,2 ml da preparação Matrigel. Os ratinhos foram então injec-tados com um anticorpo do invento intraperitonealmente após formação de tumores estabelecidos (i.e. com aproximadamente 400 mm3) .

Após 24 horas, os tumores foram extraídos, homogeneizados e determinado o nível de IGF-IR. Para determinar os níveis de IGF-IR, o anticorpo SC-713 foi diluído em tampão de bloqueio para uma concentração final de μρ/ιηΐ e 100 μΐ foi adicionado a cada alvéolo de uma placa revestida com cabra anti-coelho (GAR) Reactin-Bind (Pierce). As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora com agitação e depois lavadas cinco vezes com tampão de lavagem. As amostras de tumor foram pesadas. 12,5 μΐ de extracto de tumor foram diluídos com tampão de lise para um volume final de 100 μΐ. Uma amostra de 100 μΐ foi adicionada a cada alvéolo de uma placa de 96 alvéolos. As placas foram incubadas à temperatura ambiente com agitação durante 1-2 horas e depois lavadas cinco vezes com tampão de lavagem. 100 μΐ de HRP-PY54 ou do anticorpo anti-IGF-IR biotinilado em tampão de bloqueio foram adicionados a cada alvéolo e incubados à temperatura ambiente com agitação durante 30 minutos. As placas foram lavadas cinco vezes com tampão de lavagem e reveladas. As placas foram reveladas por hibridação com HRP-PY54 através da adição de 100 μΐ do substrato de microalvéolos tmb por alvéolo e a paragem do aparecimento de cor foi feita pela adição de 100 μΐ de H2SO4 0,9M. O sinal foi quantificado por agitação 95 ΡΕ1656391 durante 10 segundos e medição da D06oonm· O sinal foi normalizado relativamente à proteina total. As placas testadas com o anticorpo anti-IGF-IR foram reveladas pela adição de 100 μΐ de estreptavidina-HRP, diluida em tampão de bloqueio, a cada alvéolo, incubação à temperatura ambiente com agitação durante 30 minutos e depois continuando como descrito para HRP-PY54.

Observou-se que a injecção intraperitoneal do anticorpo do invento, resultou na inibição da actividade de IGF-IR conforme medido por um decréscimo da proteina IGF-IR (Figura 7). Ainda, esta inibição foi dependente da dose de anticorpo injectado (Figura 7). Estes dados demonstram que o anticorpo do invento é capaz de ter como alvo IGF-IR in vivo numa forma semelhante à observada in vitro.

EXEMPLO VII: Inibição do crescimento (TGI) de tumores das células 3T3/IGF-IR

Protocols O anticorpo do invento foi testado para determinar se funcionaria para inibir o crescimento de tumores. Os tumores foram induzidos como descrito atrás (Exemplo VI) e quando estabelecidos, formaram-se tumores palpáveis (i.e. 250 mm3, dentro de 6-9 dias). Os ratinhos foram tratados com uma única dose de 0,20 ml de anticorpo por injecção intraperitoneal. O tamanho dos tumores foi medido com craveira em dois diâmetros cada três dias e o volume calculado usando a fórmula (comprimento x [largura]2/2 usando métodos estabelecidos por Geran, et al., 96 ΡΕ1656391 for screening Chemical agents and natural productas against animal tumors and other biological Systems," Câncer Chemother. Rep. 3:1-104.

Após a análise com o anticorpo do invento observou-se que um único tratamento com anticorpo por si só inibiu o crescimento de tumores induzidos por células NIH-3T3 transfectadas com IGF-IR (Figura 8A) . Ainda, em estudos de combinação com uma única dose de 7,5 mg/Kg de adriami-cina administrada intravenosamente, observou-se que a administração de uma única dose do anticorpo aumentou a eficácia de adriamicina, um conhecido inibidor do crescimento de tumores. A combinação de adriamicina com o anticorpo do invento demonstrou um atraso do crescimento de 7 dias versus tratamento com o anticorpo ou adriamicina sozinha (Figura 8B). EXEMPLO VIII: Relação dos níveis de anticorpo com a regulação negativa de IGF-IR.

Foram induzidos tumores em ratinhos labro como descrito no Exemplo VI. Os ratinhos foram então tratados com 125 pg do anticorpo por injecção intraperitoneal, como descrito no Exemplo VI. Os tumores foram extraídos e os níveis de IGF-IR foram medidos por ELISA. A Figura 9 mostra os níveis séricos de anticorpo e os níveis de receptor IGF-IR ao longo do tempo. A experiência demonstra que a IGF-IR é regulada negativamente pelo anticorpo e que o grau de 97 ΡΕ1656391 inibição de IGF-IR é proporcional à dose relativamente à concentração sérica do anticorpo. EXEMPLO IX: Inibigão do crescimento de tumores das células colo-rectais

Os tumores foram induzidos em ratinhos labro como descrito no Exemplo VI, excepto quando usadas células Colo 205 (ATCC CCL 222) . As células Colo 205 são células de adenocarcinoma colo-rectal humano. Os ratinhos com tumores subcutâneos estabelecidos de aproximadamente 250 mm3 foram tratados com várias quantidades do anticorpo (i.p.) ou com 100 mg/Kg de 5-fluorodesoxiuridina (5-FU, i.v.), quer como agentes isolados quer em combinação, como descrito no Exemplo VII. A Figura 10A e a Figura 10B mostram o tamanho do tumor relativamente a vários tratamentos ao longo do tempo. A experiência demonstra que o tratamento com um anticorpo anti-IGF-IR administrado uma vez inibe o crescimento de células do cancro colo-rectal humano quando administradas como um único agente e estimula a eficácia de 5-FU, um conhecido inibidor de tumores. EXEMPLO X: Farmacocinética de anticorpos anti-IGF-IR in vivo

Para avaliar as farmacocinéticas dos anticorpos anti-IGF-IR, macacos cinomólogos foram injectados intravenosamente com 5 mg/kg do anticorpo num tampão acetato. O soro foi colhido dos macacos em várias alturas e as 98 ΡΕ1656391 concentrações de anticorpos nos macacos foram determinadas durante um período de até dez semanas. Para quantificar os níveis de anticorpos séricos funcionais, o domínio extrace-lular de IGF-IR humano (IGF-I-sR, R&D Systems, Catalog# 391GR) foi ligado a placas de 96 alvéolos. 0 soro dos macacos (diluído entre 1:100 e 1:15000) foi adicionado às placas do ensaio de forma que cada amostra estivesse na gama linear da curva padrão e incubado em condições nas quais o anticorpo anti-IGF-IR se ligaria a IGF-I-sR. Após lavagem das placas, um anticorpo marcado anti-IgG humano foi adicionado às placas e incubado em condições nas quais o anticorpo anti-IgG humano se ligaria ao anticorpo anti-IGF-IR. As placas foram então lavadas e reveladas e uma curva padrão controlo e um ajustamento por regressão linear usado para quantificar a quantidade de anticorpos anti-IGF-IR. A Figura 11 mostra a concentração do anticorpo no soro ao longo do tempo. A experiência demonstra que a semi-vida (tl/2) do anticorpo anti-IGF-IR é 6.1 dias e tem um volume de distribuição (Vdss) de 0,54 (L/kg). LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Pfizer Products Inc <120> ANTICORPOS HUMANOS MODIFICADOS CONTRA IGF-lR <130> PC25231A <160> 6 <170> Patentln versão 3.2

<210> 1 <211> 1413 <212> DNA <213> 2.12.1 FX 99 ΡΕ1656391 < 4 Ο Ο > 1 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctt gttgctatta taaaaggtgt ccagtgtcag eu gtgcagctgg tggagtccgg gggaggcttg gtcaagcctg gagggtcect gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgac tactatatga gctggatccg ccâggctcca 180 gggaaggggc tggaatgggt ttcatacatt agtagtagtg gtagtaccag agactacgca 240 gactctgtga agggccgatt caccatctcc agggacaacg ecaagaaete actgtatetg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggácãcg gccgtgtatt actgtgtgag agatggagtg 360 gaaactactt tttáctacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaceacggte 420 accgtctcct cagtttccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg 4S0 ageacetccg agagcacagc ggccttgggc tgcctggtca aggactactt ccecgaaeeg 540 gtgacogtgi cgtggaaetc aggcgctctg aceagcggcg tgcacacctt cecagctgtc 600 cta.cagt.cct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcaaettc 660 ggcacccaga cctacacctg caacgtagat cacaagccca gcaâcaccaa ggtggacaag 720 acagttgagc gcaaatgttg tgtcgagtgc ccaccgtgcc cagcaccacc tgtggcagga 780 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaçcc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840 gaggtcacgt. gcgtggtggt ggacgtgagc eacgâagace ccgaggtcca gttcaactgg 900 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc asgacaaage çaçgggagga gcagttcaac 960 agcacgttcc gtgtggtcag cgtccteaçc gttgtgcacc aggactggct gaacggcaag 1020 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080 aaaaccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140 atgaceaaga accaggtcsg cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1200 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccàc acctcccatg 1260 ctggactccg açggctcctt cttectctae agcaagctca ccgtggacas gagcaggtgg 1320 cagcagggga aegtcttcte atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccaetacacg 1380 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413

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Tyr Gly Met Asp val Trp Gly Gin Gly Thr Thr val Thr val ser ser 130 135 140 Ala ser Thr tys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro cys ser Arg 145 150 155 160 Ser Thr ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 165 170 175 Phe Pro Glu Pro val Thr val Ser Trp Asr» Ser Gly Ala Leu Thr Ser ISO 185 190 Gly vai HÍS Thr Phe pro Al a val Leu Gin ser ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Vai Val Thr Val pro ser ser ARO phe Gly Thr Gl n Thr 210 215 220 Tyr 225 Thr Cys ASF! Val Asp 230 HÍS Lys Pro Ser Asn 235 Thr Lys val Asp Lys 240 Thr Vai Clu Arg tys 245 cys cys val Gl U cys Pro Pro cys pro Ala pro 250 255 Pro Val Ala Glv Pro Ser Val Phe Leu Phe pro Pro Lys Pro Lys Asp 260 265 270 Thr Leu wet lie Ser Arg Thr Pm Glu Val Thr cys val Val Val Asp 275 280 2S5 val Ser Hl 5 cl u Asp Pro Glu Val Gin phe Asn Trp Tyr val ASP Gly 290 295 300 Vai Gl u val His Asn Ala Lys Thr Lys pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn 305 310 315 320 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val HÍS Gin Asp Trp 325 330 335 Leu ASrt Gly Lys 340 Glu Tyr lys Cys tys val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 345 3SO Ala Pro Ile Glu lys Thr ile ser Lys Thr lys Gly Gin Pro Arg Glu 355 360 365 Pro Gin val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys ASFI 370 375 3S0 Gin Val ser Leu Thr cys Leu val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp ile 102 ΡΕ1656391 385 390 395 400

Ala Vai Gltt Trp G1u Ser Asn Gly Gin pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 405 410 415 Thr Pro Pro Net Leu ASp ser ASP Gly ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430 Leu Thr vai ASp l.ys ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe ser Cys 435 440 445 Ser Vai Met Hts olu Ala Leu Nls ASO Hls Tyr Thr Gin Lys ser Leu 450 455 460

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Ser Pr o vai Thr Lys ser Phe Asn Arg 61y 61u Cys 225 230 235

Lisboa, 26 de Novembro de 2010

Claims

ΡΕ1656391 ι REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo monoclonal humano, ou porção de ligação ao antigénio do mesmo, que se liga especificamente ao receptor do factor de crescimento humano semelhante a insulina tipo 1 (IGF-1R) compreendendo pelo menos uma mutação somática contida numa região estrutural de uma região variável do referido anticorpo, a qual consiste na substituição pelo correspondente resíduo de aminoácido germinal, em que a região variável da cadeia leve compreende os aminoácidos números 23 a 130 de SEQ ID NO:5.
2. O anticorpo humano ou porção de ligação ao antigénio do mesmo de acordo com a reivindicação 1, em que a cadeia leve compreende os aminoácidos números 23 a 236 de SEQ ID NO:5.
3. O anticorpo humano ou porção de ligação ao antigénio do mesmo de acordo com a reivindicação 1, em que a região variável da cadeia pesada compreende os aminoácidos números 20 a 144 de SEQ ID NO:3.
4. O anticorpo humano ou porção de ligação ao antigénio do mesmo de acordo com a reivindicação 3, em que a cadeia pesada compreende os aminoácidos números 20 a 470 de SEQ ID NO:3 e a cadeia leve compreende os aminoácidos números 23 a 236 de SEQ ID NO:5. 2 ΡΕ1656391 5. 0 anticorpo humano ou porção de ligação ao antigénio do mesmo de acordo com a reivindicação 3, em que a cadeia pesada do referido anticorpo consiste nos aminoácidos números 20 a 470 de SEQ ID NO:3 e a cadeia leve consiste nos aminoácidos números 23 a 236 de SEQ ID NO:5.
6. Uma composição farmacêutica para o tratamento de cancro compreendendo o anticorpo ou porção de ligação ao antigénio do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5 e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
7. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, compreendendo ainda um agente antineoplá-sico, quimioterapêutico ou anti-tumoral.
8. Um anticorpo humano ou porção de ligação ao antigénio do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5 para usar no tratamento de cancro num ser humano.
9. Utilização de um anticorpo humano ou porção de ligação ao antigénio do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5 na produção de um medicamento para o tratamento de cancro num ser humano.
10. Um polinucleótido isolado que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada ou porção de ligação ao antigénio da mesma ou uma cadeia 3 ΡΕ1656391 leve ou porção de ligação ao antigénio da mesma de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5.
11. Um vector compreendendo a molécula de ácido nucleico isolada da reivindicação 10.
12. Uma célula hospedeira compreendendo o vector da reivindicação 11.
13. Um método de produção de um anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antigénio do mesmo compreendendo a cultura da célula hospedeira da reivindicação 12 e recuperação do referido anticorpo. Lisboa, 26 de Novembro de 2010