CN1835975A

CN1835975A - 经修饰的人类igf－1r抗体

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Publication number: CN1835975A
Application number: CNA2004800230991A
Authority: CN
Inventors: B·D·科恩; V·比蒂安
Original assignee: Pfizer Products Inc
Current assignee: Pfizer Products Inc
Priority date: 2003-08-13
Filing date: 2004-08-03
Publication date: 2006-09-20
Anticipated expiration: 2024-08-03
Also published as: IL173273A; GT200400158A; CL2004002035A1; EP1656391B1; NO20060542L; US7371378B2; US20080181891A1; AR045247A1; NL1026829C2; MXPA06001634A; ES2351395T3; ATE484525T1; OA13234A; NL1026829A1; DE602004029581D1; CR8233A; AU2004265152A1; US20050069539A1; KR20060035796A; WO2005016967A2

Abstract

本发明涉及用于治疗癌症的人类抗体(例如，那些针对人类IGF－1受体(IGF－1R)的抗体)，其具有一个或多个经种系残基置换的选定突变残基，置换残基可为构架区中的体细胞突变。

Description

经修饰的人类IGF-1R抗体

发明背景

胰岛素样生长因子(IGF-I)为7.5-kDa的多肽，其以高浓度在血浆中循环且可在大多数组织中检测到。IGF-I刺激细胞分化与细胞增殖，且为大多数哺乳动物的细胞类型所需要以用于维持增殖。这些细胞类型包括(除了其它以外)人类二倍体成纤维细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、T淋巴细胞、神经细胞、骨髓细胞、软骨细胞、成骨细胞与骨髓干细胞。

在转导途径中引起IGF-I刺激的细胞增殖或分化的第一个步骤为IGF-I或IGF-II(或超生理学浓度的胰岛素)与IGF-I受体的结合。IGF-I受体包含两种类型的亚单位：α亚单位(130-135kDa蛋白质，其完全为细胞外的且功能为配体结合)及β亚单位(95-kDa跨膜蛋白质，具有跨膜结构域与细胞质结构域)。IGF-IR属于酪氨酸激酶生长因子受体家族(Ullrich等人，Cell 61：203-212，1990)，且结构上类似于胰岛素受体(Ullrich等人，EMBO J.5：2503-2512，1986)。最初将IGF-IR合成为单链前受体(proreceptor)多肽，其是由糖基化、蛋白水解分裂及共价结合来加工而组合成成熟的460-kDa异四聚体，其包含两个α亚单位及两个β亚单位。该β亚单体有配体活化的酪氨酸激酶活性。此活性牵涉调节配体作用的信号路径，其涉及β亚单位的自磷酸化与IGF-IR基质的磷酸化。

有重要证据表明IGF-I和/或IGF-IR在维持体内与体外肿瘤细胞上的作用。IGF-IR水平在肺部肿瘤(Kaiser等人，J.Cancer Res.ClinOncol.119：665-668，1993；Moody等人，Life Sciences 52：1161-1173，1993；Macauley等人，Cancer Res.，50：2511-2517，1990)、乳腺肿瘤(Pollak等人，Cancer Lett.38：223-230，1987；Foekens等人，Cancer Res.49：7002-7009，1989；Cullen等人，Cancer Res.49：7002-7009，1990；Arteaga等人J.Clin.Invest.84：1418-1423，1989)、前列腺与结肠肿瘤(Remaole-Bennet等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.75：609-616，1992；Guo等人，Gastroenterol.102：1101-1108，1992)中是升高的。IGF-I在前列腺上皮中失控表达导致转基因小鼠中瘤的形成(DiGiovanni等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：3455-60，2000)。此外，IGF-I似乎为人类神经胶质瘤的自分泌刺激物(Sandberg-Nordqvist等人，Cancer Res.53：2475-2478，1993)，同时IGF-I刺激过表达的IGF-IR的纤维肉瘤的生长(Butler等人，Cancer Res.58：3021-27，1998)。此外，具有“高正常”水平IGF-I的个体与具有“低正常”范围水平IGF-I的个体相比患常见癌症的风险增加(Rosen等人，TrendsEndocrinol.Metab.10：136-41，1999)。IGF-I/IGF-I受体的相互作用在各种人类肿瘤的生长中所起的作用的综述，参阅Macaulay，Br.J.Cancer，65：311-320，1992。

在包括哺乳动物的各种动物种类中热量限制为延长寿命最有效的与可重复的干涉。在试验性癌发生模型中其也为最有力、广泛起作用的预防癌症的疗法。一种构成其多种有益效应基础的关键生物学机制为胰岛素样生长因子-1途径(Hursting等人，Annu.Rev.Med.54：131-52，2003)。

EP0629240B1涉及通过重组DNA技术将抗体序列转换为种系序列从而试图当给药于病人时减少免疫原性。WO 02/066058A1涉及针对EGF受体(HER1)的抗体，其被修饰以减小引发免疫反应的倾向。

鉴于IGF-I与IGF-IR在该等病症(如癌症及其它过表达IGF-I与IGF-IR的增殖性病症)中所起的作用以及IGF-I与IGF-IR在过低表达的IGF-I和/或IGF-IR任一者的病症中过少所起的作用，需要产生针对IGF-IR的抗体，其可用于抑制或刺激IGF-IR。该抗体在例如公开于2002年7月11日的WO 02/05359中有所描述。该公开的正文，包括所述的所有序列以引用的方式并入本文中。IGF 1R抗体也在公开于2003年12月4日的WO 03/100008、公开于2003年12月24日的WO 03/106621及公开于2003年7月24日的WO 03/59951中有所描述。

发明简述

本发明提供了经修饰的人类单克隆抗体或其抗原结合部分，其中至少一种体细胞突变氨基酸序列被转换为种系氨基酸序列。经置换的残基优选包含于抗体的可变区中且经置换残基更优选包含于可变区的构架区中。

优选地，本发明的人类抗体或抗原结合部分特异结合至人类胰岛素样生长因子I受体(IGF-IR)。

在一个实施方案中，抗体轻链的可变区序列包含三个回复至由种系A30基因所编码的氨基酸序列的构架突变。在一优选实施方案中，轻链的可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO：5的氨基酸23至130。在另一更优选的实施方案中，人类抗体的轻链包含SEQ ID NO：5的氨基酸23至236。

在本发明的另一实施方案中，抗体重链的可变区序列包含两个回复至由种系DP-35基因所编码的氨基酸序列的构架突变。在一优选实施方案中，重链的可变区包含SEQ ID NO：3的氨基酸20至144。在一更优选的实施方案中，人类抗体的重链包含SEQ ID NO：3的氨基酸20至470且轻链包含SEQ ID NO：5的氨基酸23至236。

在另一实施方案中，本发明的抗体的重链缺乏末端赖氨酸。具体而言，本发明涉及一种抗体，其中重链包含SEQ ID NO：3的氨基酸20至469的且轻链含有SEQ ID NO：5的氨基酸23至236。

本发明也涉及治疗癌症的药物组合物，其中该药物组合物包含本发明的经修饰的人类抗体，其与抗癌剂、化学治疗剂或抗肿瘤剂及医药学上可接受的载体联用。

本发明也涉及以人类抗体治疗人类癌症的方法，该方法包括给予人类治疗该癌症有效量的抗体的步骤。在一实施方案中，本发明涉及一种治疗，其包含给予抗癌剂(anti-neoplastic)、抗肿瘤剂、抗血管生成剂或化学治疗剂及连同本发明的抗体的步骤。

本发明也关于通过给予患者有效量的抗体而以抗体治疗需要其的患者的方法。在一实施方案中，本发明关于一种治疗，其包含给予抗癌、抗肿瘤、抗血管生成或化学治疗剂及连同本发明的抗体的步骤。

本发明也关于经分离的多核苷酸，其包含编码本发明的抗体的重链或其抗原结合部分或轻链或其抗原结合部分的核酸序列。在本发明的一实施方案中，本发明也提供用有效量的编码抗IGF-IR抗体的重链和/或轻链或其抗原结合部分的核酸分子治疗需要该治疗的受试者的方法。

本发明提供载体，其包含经分离的核酸分子及包含该载体的宿主细胞。本发明另外包含一种宿主细胞，其产生具有与2.12.1fx的成熟的重链及轻链相同的氨基酸序列的抗体。

本发明也提供一种重组产生及培养核酸分子所编码的抗体的方法。

本发明也关于使用抗IGF-IR抗体来鉴别表达IGF-IR的组织的存在或位置的鉴别方法。

附图简述

图1显示编码抗体2.12.1fx的重链的DNA序列，包括编码用于表达成熟抗体的信号序列的序列(SEQ ID NO：1)。

图2显示编码抗体2.12.1fx的轻链的DNA序列，包括编码用于表达成熟抗体的信号序列的序列(SEQ ID NO：2)。

图3显示抗体2.12.1fx的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)与种系序列DP-35(3-11)/D3-3/JH6的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)的比对。抗体2.12.1fx的序列如上所示用于种系序列。信号序列为斜体而CDR被标以下划线。恒定功能域区以氨基酸残基ASTK起始且对应于种系中在148起始的氨基酸残基且延伸至序列末端。构架(FR)突变在氨基酸残基的21与116。

图4显示抗体2.12.1fx轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)与种系序列A30/Jk1的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)的比对。抗体2.12.1fx的序列是如上所示用于种系序列。信号序列为斜体而CDR被标以下划线。恒定功能域区以氨基酸残基TVAA起始且对应于种系中在131起始的氨基酸残基并延伸至序列末端。构架(FR)突变位于氨基酸残基43、125与129。

图5显示抗IGF-IR抗体2.12.1fx抑制IGF-I结合至3T3-IGF-IR细胞。

图6A与6B显示如减少的受体相关酪氨酸磷酸化(图6A)所示的抗体2.12.1fx阻断IGF-I介导的IGF-IR活化作用的能力及抗体2.12.1fx诱导下调细胞上的IGF-1R的能力(图6B)。

图7显示抗IGF-IR抗体2.12.1fx降低3T3-IGF-IR肿瘤中IGF-IR的水平。

图8A与8B显示体内单独给予(图8A)或与阿霉素组合给予(图8B)时抗IGF-IR抗体抑制3T3-IGF-IR肿瘤的生长。

图9显示3T3-IGF-IR肿瘤中抗IGF-IR抗体2.12.1fx的血清水平与IGF-IR下调之间随时间的变化关系。

图10A与10B显示体内单独给予(图10A)或与5-氟脱氧尿苷(5-FU)组合给予(图10B)时抗IGF-IR抗体2.12.1fx抑制Colo 205肿瘤的生长。

图11显示猕猴(Cynomolgus monkey)中经静脉内单一注射抗IGF-IR抗体2.12.1fx的药物动力学的评估。

发明详述

所有的专利、专利申请及其它本文所引用的参考文献以引用的方式全部并入本文中。

除非本文另有限定，否则与本发明有关所用的科学及技术性术语将具有通常为本领域一般技术人员所了解的含义。此外，除非上下文需要，否则单数术语将包括复数而复数的术语将包括单数。一般而言，与如下学科及技术有关所用的命名法及技术是那些在本领域中熟知及常用的：细胞及组织培养技术、分了生物学、免疫学、微生物学、遗传学及蛋白质与核酸化学及杂交技术。除非另有指示，否则本发明的方法及技术通常根据本领域中所熟知且如本说明书所引用及讨论的各种一般参考文献以及比较特定的参考文献中所描述的常规方法来进行。请参阅，例如，Sambrook等人Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1989)及Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Associates(1992)，及Harlow and Lane Antibodies：A Laboratory Manual Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)，其全文以引用的方式并入本文中。酶学反应与纯化技术是根据制造商的说明书来进行，如本领域中通常所完成或如本文所述。与如下本文所述的学科有关所用的命名及实验室程序与技术是在本领域中熟知及常用的：分析化学、合成有机化学及医学与药物化学。使用化学合成，化学分析，药物制备、调配与传递及患者的治疗的标准技术。

除非另有指示，否则下列术语应理解为具有如下含义：

术语“多肽”涵盖天然或人工蛋白质、蛋白质片段及蛋白质序列的多肽类似物。多肽可为单体或聚合体。

非肽类似物一般作为具有类似于那些模板肽的特性的药物而用于医药工业。该类型的非肽化合物被称为“肽模拟物”(“peptidemimetics”或“peptidomimetics”)。Fauchere，J.Adv.Drug Res.15：29(1986)；Veber and Freidinger TINS p.392(1 985)；及Evans等人，J.Med.Chem.30：1229(1987)，其以引用的方式并入本文中。常常借电脑化分子模建来开发这些化合物。结构类似于治疗学上有用的肽的肽模拟物可用于产生相当的治疗或预防效果。一般而言，肽模拟物结构上类似于范例多肽(即具有所需的生化特性或药物学活性的多肽)，诸如，人类抗体，然而其具有一个或多个通过本领域中熟知的方法可选地由选自下列的键替换的肽键：-CH₂NH-、-CH₂S-、-CH₂-CH₂-、-CH＝CH-(顺式与反式)、-COCH₂-、-CH(OH)CH₂-及-CH₂SO-。用相同类型D-氨基酸来系统替代一个或多个共有序列的氨基酸(例如，D-赖氨酸代替L-赖氨酸)也可用于产生较稳定的肽。此外，包含共有序列或大体上相同的共有序列变异的限定肽可通过本领域中已知的方法产生(Rizo and Gierasch Ann.Rev.Biochem.61：387(1992)，其以引用的方式并入本文中)；例如，通过加入内部半胱氨酸残基来产生，该残基可形成使肽环化的分子内二硫桥。

“免疫球蛋白”为四聚体分子。在天然发生的免疫球蛋白中，每个四聚体包含相同的两对多肽链，每对具有一条“轻链”(约25kDa)与一条“重链” (约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括约100至110或更长氨基酸的主要用于抗原识别的可变区。每条链的羧基末端部分界定了主要用于效应物功能的恒定区。人类的轻链分为κ轻链与λ轻链。重链分为μ、Δ、γ、α或ε且界定抗体的同种型各自为IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。轻链与重链中，可变区和恒定区借由约12或更长氨基酸的“J”区来接合，重链中也包括约10以上氨基酸的“D”区。通常参阅基础免疫学(Fundamental Immunology)第7章(Paul，W.，编辑，第二版.Raven Press，N.Y.(1989))(为达成所有目的其全文以引用的方式并入本文中)。每对轻/重链的可变区形成抗体结合位点因此完整的免疫球蛋白具有两个结合位点。

免疫球蛋白链显示相同的一般结构：由三个高变区所接合的相对保守的构架区(FR)，高变区也可称为互补决定区或CDR。借由构架区来比对由每对中的两条链的CDR，使其能够结合至特异性表位。由N末端至C末端，轻链与重链都包含功能域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3与FR4。每个功能域的氨基酸的分配符合Kabat Sequences ofProteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.(1987 and 1991))或Chothia & Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Chothia等人，Nature 342：878-883(1989)中的定义。

“抗体”是指完整的免疫球蛋白。通过重组DNA技术或完整抗体的酶或化学切割法可产生抗原结合部分。抗原结合部分包括Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fv、dAb与互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双功能抗体(diabody)与多肽，其含有足以使特异性抗原结合至多肽的免疫球蛋白的至少一部分。

Fab片段为由VL、VH、CL与CHI功能域所组成的单价片段；F(ab′)₂片段为包含两个在铰链区由二硫桥所连接的Fab片段的二价片段；Fd片段是由VH与CH1功能域组成；Fv片段是由抗体单臂的VL与VH功能域组成；且dAb片段(Ward等人，Nature 341：544-546，1989)是由VH功能域组成。

单链抗体(scFv)为如下的抗体，其中VL与VH区经由合成的连接体配对形成单价分子，该连接体使其能成为单蛋白质链(Bird等人，Science 242：423-426，1988及Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883，1988)。双功能抗体为二价、双特异性抗体，其中VH与VL功能域在单多肽链上表达，然而使用太短的连接体而不足以容许同一条链上的两个功能域之间配对，从而迫使功能域与另一条链上的互补功能域配对并形成两个抗原结合位点(参阅，例如，Holliger，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448，1993及Poljak，R.J.等人，Structure 2：1121-1123，1994)。一个或多个CDR可以共价地或非共价地并入分子以使其成为免疫粘附素(immunoadhesin)。免疫粘附素可并入该CDR而作为较大多肽链的部分，可共价地将该CDR连接至另一条多肽链上或可非共价地并入CDR。该CDR允许免疫粘附素特异结合至特定的目的抗原上。

抗体可具有一个或多个结合位点。若有一个以上结合位点，则所述结合位点可为彼此相同或不同的。例如，天然发生的免疫球蛋白具有两个相同的结合位点，单链抗体或Fab片段具有一个结合位点，而“双特异性”或“双功能性”抗体具有两个不同的结合位点。

“经分离的抗体”为一种如下的抗体，其(1)与天然相关组分(包括其它天然相关抗体)无关，该组分伴随其天然态，(2)不含其它相同种类来源的蛋白质，(3)通过不同种类来源的细胞而表达，或(4)未在自然中发生。经分离的抗体实例包括已经利用IGF-IR亲和纯化的抗IGF-IR抗体、由杂交瘤或其它体外细胞株所合成的抗IGF-IR抗体，及由转基因小鼠所衍生的人类抗IGF-IR抗体。

术语“人类抗体”包括所有具有一或多个衍生自人类免疫球蛋白序列的可变区与恒定区的抗体。在一优选实施方案中，所有的可变区与恒定区都衍生自人类免疫球蛋白序列(一个完整的人类抗体)。如下所述，这些抗体可以各种方式来制备。

“中和抗体”或“抑制性抗体”为一种当过量的抗IGF-IR抗体减少IGF-IR所结合的IGF-I量至少约20％时抑制IGF-IR结合至IGF-I的抗体。在一优选实施方案中，抗体减少IGF-IR所结合的IGF-I量至少40％，优选60％，更优选80％，或也更优选85％。借由本领域技术人员所知的任何手段可测量出结合的减少，例如，由体外竞争性结合分析法来测量。

“活化抗体”为一种当加入表达IGF-IR的细胞、组织或器官中时活化至少约2 0％IGF-IR的抗体。在一优选实施方案中，抗体活化IGF-IR活性至少40％，优选60％，更优选80％，或也更优选85％。在一更优选实施方案中，在IGF-I或IGF-II存在下加入活化抗体。在另一优选实施方案中，借由确定IGF-IR的酪氨酸自磷酸化的量来测量活化抗体的活性。

本领域一般技术人员根据本说明书的教导可以容易制备抗体的片段或类似物。优选的片段或类似物的氨基与羧基末端发生在邻近于功能域的边界。通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公开的或专利序列数据库进行比较可识别结构域与功能域。优选地，利用电脑化比较方法识别发生于其它具有已知结构和/或功能的蛋白质中的序列基序(motif)或所预测的蛋白质构型功能域。识别折叠成为已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。Bowie等人Science 253：164(1991)。

本文所用术语“表面胞质共振(surface plasmon resonance)”是指一种光学现象，其可通过在生物感应器基质内检测蛋白质浓度的改变而进行实时生物特异性相互作用分析，例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden and Piscataway，N.J.)。进一步的描述请参阅Jonsson，u.等人(1993)Ann.Biol.Clin.51：19-26；Jonsson，U.等人(1991)Biotechniques 11：620-627；Johnsson，B.等人(1995)J.Mol.Recognit.8：125-131；及Johnnson，B.等人(1991)Anal.Biochem.198：268-277。

术语“K_分离”是指抗体自抗体/抗原复合体解离的分离率常数。

术语“K_d”是指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。

本文所用的二十个常规的氨基酸及其缩写是依据常规的用法。参阅Immunology-A Synthesis(第二版，E.S.Golub and D.R.Gren，Eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。二十个常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)，非天然氨基酸(诸如，α-，α-二取代氨基酸)、N-烷基氨基酸、乳酸及其它非常规氨基酸也可适用于本发明的多肽的组分。非常规氨基酸的实例包括：4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、s-N-甲基精氨酸及其它类似氨基酸与亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。本文所用的多肽符号中，根据标准用法与惯例，左手方向为氨基末端方向而右手方向为羧基末端方向。

本文所提及的术语“多核苷酸”意谓至少10个碱基长度的核苷酸的聚合形式，核苷酸可为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一种核苷酸的经修饰形式。该术语包括单与双链形式的DNA。

本文所用术语“经分离的多核苷酸”意谓基因组、cDNA或其合成来源或其组合的多核苷酸，根据其来源该“经分离的多核苷酸”(1)与所有或一部分“经分离的多核苷酸”在自然中在其中发现的多核苷酸无关，(2)可操作地连接至在自然中未与其连接的多核苷酸，或(3)未在自然中作为较大序列的部分而发生。

本文所提及的术语“自然发生的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸与核糖核苷酸。本文所提及的术语“经修饰的核苷酸”包括具有修饰的或取代的糖基等的核苷酸。本文所提及的术语“寡核苷酸键”包括诸如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate、氨基磷酸盐等寡核苷酸键。参阅，例如，LaPlanche等人Nucl.Acids Res.14：9081(1986)；Stec等人J.Am.Chem.Soc.106：6077(1984)；Stein等人Nucl.Acids Res.16：3209(1988)；Zon等人Anti-Cancer Drug Design6：539(1991)；Zon等人Oligonucleotides and Analogues：APractical Approach，pp.87-108(F.Eckstein，Ed.，OxfordUniversity Press，Oxford England(1991))；Stec等人U.S.PatentNo.5,151,510；Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90：543(1990)，其内容以引用的方式并入本文中。若需要，寡核苷酸可包括用于检测的标记。

“可操作地连接”序列包括与目的基因邻近的表达控制序列及以反式或远距离作用来控制目的基因的表达控制序列。本文所用的术语“表达控制序列”是指实现其所连接的编码序列的表达与加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子与增强子序列；有效的RNA加工信号，诸如，剪接与聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；及当需要时增强蛋白质分泌的序列。该控制序列的性质视宿主有机体而不同；在原核生物中，该控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点及转录终止序列；在真核生物中，通常该控制序列包括启动子与转录终止序列。术语“控制序列”最小包括其存在为表达与加工所必需的所有组分，且也可包括其存在是有利的额外组分，例如，前导序列与融合配偶体序列。

本文所用术语“载体”是指核酸分子，其能转运另一个其所连接的核酸。一种类型的载体为“质粒”，其是指环形双链DNA环，额外DNA片段可连接至其上。另一种类型的载体为病毒载体，其中额外DNA片段可连接至病毒基因组。某些载体能够在其被导入的宿主细胞中进行自主复制(例如，具有细菌来源复制的细菌载体及游离型(episomal)哺乳动物载体)。其它载体(例如，非游离型哺乳动物载体)一旦被导入宿主细胞中便可被整合至宿主细胞的基因组上，且进而与宿主基因组一同复制。而且，某些载体能够引导与其可操作连接的基因的表达。本文中这些载体被称为“重组表达载体” (或简言之， “表达载体”)。通常而言，应用于重组DNA技术中的表达载体通常为质粒的形式。在本说明书中， “质粒”与“载体”可交替地使用，因为质粒是最常用形式的载体。然而，本发明意欲包括其它形式的表达载体，诸如，病毒载体(例如，复制缺陷逆转录病毒、腺病毒与腺相关病毒)，其可发挥同等功能。

本文所用术语“重组宿主细胞” (或简言之“宿主细胞”)是指重组表达载体导入其中的细胞。应了解该术语不仅是指特殊主体细胞而且指该细胞的后代。因为由于突变或环境影响使某些修饰可在随后几代中发生，所以该后代可能实际上不与亲代细胞相同，然而其依然包括于本文所用的术语“宿主细胞”的范畴中。

除非另有列出，否则对于核酸序列的引用涵盖了其互补序列。因此，应了解对于具有特定序列的核酸分子的引用涵盖了其具有互补序列的互补链。

本文所用术语“标记”或“经标记的”是指另一分子掺入抗体中。在一实施方案中，该标记为可检测的标志，例如，掺入放射性标记的氨基酸或附着可借由标记的抗生物素蛋白来检测的生物素基部分的多肽(例如，含有萤光标志的链霉抗生物素蛋白或可借由光学或比色方法来检测的酶活性)。在另一实施方案中，该标记或标志可为治疗性的(例如)药物缀合物(drug conjugate)或毒素。各种标记多肽及糖蛋白的方法是本领域已知且可使用的。用于多肽的标记的实例包括(但不限于)如下：放射性同位素或放射性核素(例如，³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I)，荧光标记(例如，FITC、罗丹明(rhodamine)、镧系元素磷光体)，酶标记(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)，化学发光标志，生物素基，可由第二指示物所识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链配对序列、第二抗体的结合位点、金属结合功能域、表位标签)，磁性试剂，诸如钇螯合物，诸如百日咳毒素的毒素、紫杉醇、细胞松驰素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱(emetine)、丝裂霉素、鬼臼亚乙苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春花新碱、长春花碱、秋水仙素、阿霉素(doxorubicin)、道诺红菌素(daunorubicin)、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放线菌素(actinomycin)D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)与嘌呤霉素(puromycin)及其类似物或同源物。在某些实施方案中，借由不同长度的间隔物臂来附着标记以减少潜在的位阻。

本文所用术语“试剂(剂)”是指化合物、化合物的混合物、生物大分子或由生物物质所制得的提取物。本文所用术语“药物试剂或药物”是指一种当适当地给药于患者时能够诱导所要治疗效果的化合物或组合物。本文中其它化学术语是根据本领域常规用法来使用，如The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(Parker，S.，Ed.，McGraw-Hill，San Francisco(1985))，其以引用的方式并入本文中)所例示。

本文所用术语“抗癌剂”是指具有抑制瘤在人体中发展或进行的功能特性的试剂，尤其是恶性(癌性)病变，诸如，癌、肉瘤、淋巴瘤或白血病。抑制转移为抗癌剂的常见特性。

抗体可为IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。在一优选实施方案中，抗体为IgG且为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型。在一更优选实施方案中，抗IGF-IR抗体为亚类IgG2。

借由本领域中已知的任何方法可确定抗IGF-IR抗体的类与亚类。通常而言，使用对于抗体特定类与亚类特异的抗体可确定抗体的类与亚类。该抗体可由市售得到。借由ELISA、Western印迹及其它技术可确定类与亚类。或者，可借由如下程序来确定类与亚类：将抗体的重链和/或轻链的所有或一部分恒定区测序，将其氨基酸序列与已知的各种免疫球蛋白的类与亚类的氨基酸序列相比较，从而确定抗体的类或亚类。

本发明也提供包含由人类κ基因所编码的可变序列的抗IGF-IR抗体。在一优选实施方案中，可变序列由Vκ A27，A30或O12基因家族来编码。在一优选实施方案中，可变序列由人类Vκ A30基因来编码。在一更优选实施方案中，轻链包含三个回复至由种系序列所编码的氨基酸序列的构架突变。

SEQ ID NO 1提供2.12.1fx重链的DNA序列。SEQ ID NO 2提供2.12.1fx轻链的DNA序列。SEQ ID NO 3提供2.12.1fx重链的氨基酸序列。SEQ ID NO 4提供种系DP-35的氨基酸序列。SEQ ID NO5提供2.12.1fx轻链的氨基酸序列及SEQ ID NO 6提供种系A30/Jk1的氨基酸序列。所显示的序列是包括信号序列的抗体的未成熟前体。

在一实施方案中，抗IGF-IR抗体包含由人类V_HDP-35、DP-47、DP-70、DP-71或VIV-4/4.35基因家族所编码的可变区序列。在一优选实施方案中，可变区序列是衍生自人类V_HDP-35基因。在一更优选实施方案中，重链包含两个回复至由种系序列所编码的氨基酸序列的构架突变。

提供了本发明的编码抗IGF-IR抗体的核酸分子。

在一实施方案中，编码轻链可变区的核酸分子衍生自A30、A27或O12 Vκ基因。在一优选实施方案中，轻链衍生自A30 Vκ基因。在另一优选实施方案中，编码轻链的核酸分子包含衍生自Jκ1，Jκ2或Jκ4的连接区。

本发明也提供包含核酸序列的核酸分子，该序列编码2.12.1fx轻链的可变区的氨基酸序列。

本发明也提供编码重链可变区(VH)的核酸分子，其衍生自DP-35、DP-47、DP-71或VIV-4/4.35 VH基因，优选为DP-35 VH基因。在另一较优选实施方案中，编码VH的核酸分子包含衍生自JH6或JH5(优选为JH6)的连接区。本发明也提供核酸分子，其包含编码2.12.1fx重链可变区的氨基酸序列的核酸序列。

编码人类抗体重链与轻链两者或其中之一或其可变区的核酸分子可由产生人类抗体的任何来源而获得。分离编码抗体的mRNA的方法在本领域中是熟知的。参阅，例如，Sambrook等人。该mRNA可用于产生在聚合酶链式反应(PCR)或抗体基因的cDNA克隆中所使用的cDNA。在本发明的一实施方案中，可由如上所述表达抗IGF-IR抗体的杂交瘤获得核酸分子，优选为具有表达人类免疫球蛋白基因的转基因动物细胞作为其融合配偶体之一的杂交瘤，诸如，XENOMOUSE^TM、非人类小鼠转基因动物或非人类、非小鼠转基因动物。IGF-1R抗体一般可应用于本发明的人类抗体而非那些对IGF-1R特异的抗体。

通过将编码重链可变区或其抗原结合功能域的核酸分子与重链的恒定区融合可构建编码抗IGF-IR抗体的完整重链的核酸分子。类似地，借由融合编码轻链可变区或其抗原结合功能域的核酸分子与轻链恒定区可构建编码抗IGF-IR抗体的轻链的核酸分子。编码VH与VL链的核酸分子可通过将其分别插入已编码重链恒定区与轻链恒定区的表达载体而转换为全长的抗体基因，由此VH片段可操作地连接至载体内的重链恒定区(CH)片段而VL片段可操作地连接至载体内的轻链恒定区(CL)片段。或者，通过使用标准分子生物技术而连接(例如，连接)编码VH链的核酸分子至编码CH链的核酸分子使得编码VH或VL链的核酸分子转换成为全长的抗体基因。使用编码VL与CL链的核酸分子可达成相同的目的。人类重链与轻链恒定区基因的序列在本领域中是已知的。参阅，例如，kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，NIH Publ.No.91-3242，1991。接着，编码全长重链和/或轻链的核酸分子可由已经导入所述核酸分子的细胞表达，且分离抗IGF-IR抗体。

在另一实施方案中，编码抗IGF-IR抗体的重链或其抗原结合功能域，或抗IGF-IR抗体的轻链或其抗原结合功能域的核酸分子可自表达人类免疫球蛋白基因且以IGF-IR抗原免疫的非人类、非小鼠动物分离。在其它实施方案中，核酸分子可自抗IGF-IR抗体产生细胞分离，该细胞得自非转基因动物或得自产生抗IGF-IR抗体的人类患者。自抗IGF-IR抗体产生细胞分离mRNA的方法可通过标准技术来分离、使用PCR与文库构建技术来克隆和/或扩增且使用标准方案来筛选以获得编码抗IGF-IR重链与轻链的核酸分子。

如下所述，核酸分子可用于重组表达大量抗IGF-IR抗体。如下进一步叙述，核酸分子也可用于产生单链抗体、免疫粘附素、双功能抗体、突变抗体及抗体衍生物。

在另一实施方案中，本发明的核酸分子可用作特异性抗体序列的探针或PCR引物。例如，核酸分子探针可用于鉴定方法中，或核酸分子PCR引物可用于扩增DNA区，其尤其用于分离用以产生抗IGF-IR抗体的可变区的核酸序列。在一优选实施方案中，核酸分子为寡核苷酸。在一更优选实施方案中，寡核苷酸是由目的抗体的重链与轻链的高度可变区而来。

本发明提供包含编码重链或其抗原结合部分的本发明核酸分子的载体。本发明也提供包含编码轻链或其抗原结合部分的本发明核酸分子的载体。本发明也提供包含编码融合蛋白、修饰的抗体、抗体片段及其探针的核酸分子的载体。

为了表达本发明抗体或抗体部分，将如上所述得到的编码部分长度或全长重链与轻链的DNA插入表达载体中，让该基因可操作性地连接至转录与翻译控制序列上。表达载体包括质粒、逆转录病毒、粘粒、YAC、EBV衍生的游离基因等。将抗体基因连接至载体上，由此载体内的转录与翻译控制序列便可发挥其预期的调节抗体基因转录与翻译的功能。选用与所用的表达宿主细胞相容的表达载体与表达控制序列。抗体轻链基因与抗体重链基因可插入分别的载体中。在一优选实施方案中，是将两种基因插入至同一表达载体中。以标准方法将抗体基因插入至表达载体中(例如，将抗体基因片段上与载体上的互补限制性位点连接，或若没有限制性位点时，则进行平端连接)。

适宜的载体为编码功能性完整人类CH或CL免疫球蛋白序列的载体，其具有适当的设计的限制性位点，如此任何VH或VL序列可容易插入并表达。在该载体中，剪接通常发生在插入J区中的剪接供体位点与人类C区之前的剪接受体位点之间，且也发生在人类CH外显子内发生的剪接区。聚腺苷酰化作用与转录终止发生在编码区下游的天然染色体位点。重组表达载体也可编码信号肽，其可促进自宿主细胞分泌抗体链。该抗体链基因可克隆至载体中，以使信号肽以符合读框的方式连接至抗体链基因的氨基末端。该信号肽可为免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即源自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。

除了抗体链基因之外，本发明的重组表达载体也携带控制宿主细胞中抗体链基因表达的调节序列。本领域技术人员应了解表达载体，包括调节序列的选择，的设计可视如下因素而定：待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等等。优选的用于哺乳宿主细胞表达的调节序列包括引导哺乳动物细胞中高水平的蛋白质表达的病毒元件，诸如，来自逆转录LTR、巨细胞病毒(CMV)(诸如，CMV启动子/增强子)、猿病毒40(SV40)(诸如，SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))的启动子和/或增强子、多瘤病毒与强哺乳动物启动子，诸如天然免疫球蛋白与肌动蛋白启动子。对病毒调节元件及其序列的进一步描述参阅(例如)Stinski的美国专利第5,168,062号、Bell等人的美国专利第4,510,245号及Schaffner等人的美国专利第4,968,615号。

除了抗体链基因及调节序列之外，本发明的重组表达载体也可携带额外序列，诸如，宿主细胞中调节载体复制的序列(例如，复制起始)与可选择的标志基因。可选择的标志基因促进其中已导入载体的宿主细胞的选择(例如参阅美国专利第4,399,216、4,634,665与5,179,017号)。例如，可选择的标志基因通常赋予其中已导入载体的宿主细胞对于药物(诸如，G418、潮霉素或氨甲喋呤)的抗性。优选的可选择的标志基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主细胞以氨甲喋呤选择/放大)及neo基因(用G418的选择)。

编码本发明的抗IGF-IR抗体的重链或其抗原结合部分和/或轻链或其抗原结合部分的核酸分子及包含该核酸分子的载体可用于转化适合的宿主细胞。可通过任何已知方法转化以用于将多核苷酸导入宿主细胞中。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞中的方法在本领域中是熟知的且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、polybrene介导的转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体中多核苷酸的封装、生物注射(biolistic injection)及DNA直接显微注射至细胞核。此外，核酸分子可借由病毒载体导入至哺乳动物细胞中。转化细胞的方法在本领域中是熟知的。例如参阅美国专利第4,399,216、4,912,040、4,740,461及4,959,455号(这些专利以引用的方式并入本文中)。

作为用于表达的宿主而可得到的哺乳动物细胞系在本领域中是熟知的且包括许多可由美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)(ATCC)得到的无限增殖化细胞系。其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼年仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人类肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞、3T3细胞及大量其它细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人类、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马及仓鼠细胞。特别优选的细胞系是通过确定哪种细胞系具有高表达水平而选择的。可使用的其它细胞系为昆虫细胞系(诸如Sf9细胞)、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞及真菌细胞。当将编码重链或其抗原结合部分与轻链和/或其抗原结合部分的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，抗体通过将宿主细胞培养一段时间直至足以容许抗体在宿主细胞中表达(或优选地，容许抗体分泌至宿主细胞生长的培养基中)而产生。使用标准蛋白质纯化方法可将从培养基回收抗体。

此外，可使用大量已知技术来增强生产细胞系的本发明的抗体(或由此其它部分)的表达。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)为在某些条件下用于增强表达的常用方法。欧洲专利第0 216 846、0 256 055与0 323 997号及欧洲专利申请案第89303964.4号对GS系统进行了完全或部分讨论。

不同细胞系或在转基因动物中所表达的抗体可能将具有彼此不同的糖基化。然而，本文所提供的核酸分子所编码或包含本文所提供的氨基酸序列的所有抗体不管抗体的糖基化如何都属于本发明的部分。

本发明也提供包含一种或多种本发明的核酸分子的转基因非人类动物，其可用于产生本发明的抗体。抗体可在组织或体液中产生且自其回收，诸如，山羊、奶牛、马、猪、大鼠、小鼠、免子、仓鼠或其它哺乳动物的乳汁、血液或尿液。例如参阅美国专利第5,827,690、5,756,687、5,750,172及5,741,957号。如上所述，可通过以IGF-IR或其一部分来免疫而产生包含人类免疫球蛋白基因座的非人类转基因动物。

在另一实施方案中，通过标准转基因技术将本发明之一或多个核酸分子导入动物中而产生非人类转基因动物。参阅Hogan，前述。用于制造转基因动物的转基因细胞可为胚胎干细胞或体细胞。转基因非人类生物体可为嵌合、非嵌合杂合子及非嵌合纯合子。例如参阅Hogan等人，Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual 2ed.，Cold Spring Harbor Press(1999)；Jackson等人，Mose Genetics andTransgenics：A Practical Approach.Oxford University Press(2000)；and Pinkert，Transgenic Animal Technology：A LaboratoryHandbook.Academic Press(1999)。在另一实施方案中，转基因非人类生物体可具有编码目的重链和/或轻链的指定的破坏与置换。在一优选实施方案中，转基因动物包含且表达编码重链与轻链的核酸分子，其特异结合至IGF-IR，优选为人类IGF-IR。在另一实施方案中，转基因动物包含编码经修饰的抗体的核酸分子，诸如单链抗体、嵌合抗体或人源化抗体。抗IGF-IR抗体可在任何转基因动物中制备。在一优选实施方案中，非人类动物为小鼠、大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马。非人类转基因动物在血液、乳汁、尿、唾液、眼泪、粘液及其它体液中表达所述的编码的多肽。

可通过筛选重组组合抗体文库来分离本文所揭示的除抗IGF-IR抗体之外的重组人类抗体，优选地为scFv噬菌体展示文库，其是使用由来自人类淋巴细胞的mRNA而制备的人类VL与VH cDNA来制备。制备及筛选该文库的方法学在本领域中是已知的。有市售试剂盒用于产生噬菌体展示文库(例如，法玛西亚(Pharmacia)重组噬菌体抗体系统，目录第27-9400-01号；及Stratagene SurfZAP^TM噬体展示试剂盒，目录第240612号)。也有其它方法及试剂可用于产生及筛选抗体展示文库(例如参阅Ladner等人的美国专利第5,223,409号；Kang等人的PCT公开号WO 92/18619；Dower等人的PCT公开号WO 91/17271；Winter等人的PCT公开号WO 92/20791；Markland等人的PCT公开号WO 92/15679；Breitling等人的PCT公开号WO 93/01288；McCafferty等人的PCT公开号WO 92/01047；Garrard等人的PCT公开号WO92/09690；Fuchs等人(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay等人(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 3：81-85；Huse等人(1989)Science 246：1275-1281；McCafferty等人，Nature(1990)348：552-554；Griffiths等人(1993)EMBO J 12：725-734；Hawkins等人(1992)J.Mol.Biol.226：889-896；Clackson等人(1991)Nature 352-624-628；Gram等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：3576-3580；Garrad等人(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom等人(1991)Nuc Acid Res 19：4133-4137；及Barbas等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7978-7982)。

在一优选实施方案中，为了分离具有所要特征的人类抗IGF-IR抗体，使用在Hoogenboom等人的PCT公开号WO 93/06213中所述的表位印记方法，首先将如本文所述的人类抗IGF-IR抗体用于选出对IGF-IR具有类似结合活性的人类重链与轻链序列。在该方法中所用的抗体文库优选为如McCafferty等人的PCT公开号WO 92/01047；McCafferty等人，Nature(1990)348：552-554；及Griffiths等人，(1993)EMBO J 12：725-734中所述而制备及筛选的scFv文库。优选地使用人类IGF-IR作为抗原来筛选scFv抗体文库。

一旦选出初始人类VL及VH片段，则进行“混合及匹配”实验以选出优选的VL/VH对组合，所述实验针对IGF-IR结合筛选出不同对的最初选的VL及VH片段。此外，为了进一步改善抗体的品质，在类似于自然免疫反应中造成抗体亲和性成熟的体内体细胞突变过程的过程中，优选的VL/VH对的VL及VH片段可被随机地突变，优选在VH和/或VL的CDR3区内。体外亲和性的成熟可通过使用各自与VH CDR3或VL CDR3互补的PCR引物而扩增VH与VL区来完成，其中引物在某些位置“掺入(spiked)”了四个核苷酸碱基的随机混合物，以至于生成的PCR产物编码VH与VL片段，已将随机突变导入至所述片段的VH和/或VL CDR3区。可将该随机突变的VH与VL片段针对结合IGF-IR重新筛选。

由重组免疫球蛋白展示文库筛选及分离本发明的抗IGF-IR抗体之后，可将编码所选抗体的核酸从展示包装(例如，从噬菌体基因组)回收且通过标准重组DNA技术来亚克隆至其它表达载体中。如下所述，若需要，则可进一步操纵该核酸以创造本发明的其它抗体形式。如上所述，为了表达通过筛选组合文库所分离的重组人类抗体，将编码该抗体的DNA克隆至重组表达载体中且导入至哺乳动物宿主细胞中。

可将如上所述所得到的抗IGF-IR抗体的种类转换成另一种。在本发明的一个方面，使用本领域中熟知的方法来分离编码VL或VH的核酸分子，由此其不包括任何编码CL或CH的核酸序列。接着将编码VL或VH的核酸分子与编码来自不同种类的免疫球蛋白分子的CL或CH的核酸分子可操作地连接。这可以使用包含CL或CH链的载体或核酸分子来达成。例如，可将最初为IgM的抗IGF-IR抗体种类转换为IgG。此外，该种类转换可用于转换一种IgG亚类至另一种，例如，由IgG1转换为IgG2。用于生产包含所需同种型的本发明抗体的优选方法包含如下的步骤：分离编码抗IGF-IR抗体重链的核酸与编码抗IGF-IR抗体轻链的核酸，获得到重链的可变区，连接该重链可变区与所需同种型重链的恒定区，在细胞中表达轻链与连接的重链，及收集具有所需的同种型的抗IGF-IR抗体。

使用本领域技术人员已知的技术与方法可使用如上所述的核酸分子来产生抗体衍生物。根据本发明，一种或多种选定位置的突变的氨基酸残基接着由相应的种系残基来置换。

在另一实施方案中，可制备融合抗体或免疫粘附素，其包含连接至另一种多肽的全部或一部分抗IGF-IR抗体。在一优选实施方案中，仅抗IGF-IR抗体的可变区连接至多肽。在另一优选实施方案中，抗IGF-IR抗体的VH功能域连接至第一多肽，同时抗IGF-IR抗体的VL功能域以一种方式连接至与第一多肽相关的第二多肽，其中VH与VL功能域可彼此相互作用以形成抗体结合位点。在另一优选实施方案中，接头将VH功能域自VL功能域分开，由此VH与与VL功能域可彼此相互作用。接着将VH-接头-VL抗体连接至目的多肽。融合抗体适用于将多肽导向至IGF-IR-表达细胞或组织。多肽可为治疗性试剂，诸如，毒素、生长因子或其它调节蛋白，或可为诊断性试剂，诸如可易于显现的酶，如辣根过氧化物酶。此外，可创造出其中两(或多)个单链抗体彼此相互连接的融合抗体。若想要在单一多肽链上创造出二价或多价抗体或者若想要创造出双特异性抗体，此是有用的。

为了创造单链抗体(scFv)，可将VH-与VL-编码DNA片段可操作地连接至另一编码挠性接头的片段，例如，编码氨基酸序列(Gly₄-Ser)3的片段，因此VH与VL序列可表现为邻接的单链蛋白，其中挠性接头连接VL与VH区(例如参阅Bird等人(1988)Science 242：423-426；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等人，Nature(1990)348：552-554)。若仅使用单一VH与VL，则单链抗体可为单价；若使用两个VH与VL，则其为二价；若使用两个以上的VH与VL，则其为多价。

在另一实施方案中，可使用抗IGF-IR-编码的核酸分子来制备其它经修饰抗体。例如，根据本说明书的教导使用标准分子生物学技术可制备下列：“κ体(Kappa bodies)”(III等人，Protein Eng 10：949-57(1997))，“体(Minibodies)”(Martin等人，EMBO J 13：5303-9(1994))，“微型双功能抗体(Diabodies)”(Holliger等人，PNAS USA 90：6444-6448(1993))，或“Janusins”(Traunecker等人，EMBO J 10：3655-3659(1991)及Traunecker等人“Janusin：new molecular design for bispecific reagents”Int J CancerSuppl 7：51-52(1992))。

本发明的抗体或抗体部分可衍生或连接至另一分子(例如，另一种肽或蛋白质)。通常而言，将抗体或其部分进行衍生使得衍生作用或标记不会不利地影响IGF-IR结合。相应地，本发明的抗体及抗体部分包括完整与经修饰形式的本文所述的人类抗IGF-IR抗体。例如，本发明的抗体或抗体部分可功能性地连接(借由化学偶联、基因融合、非共价结合或其它的方式)至一或多个其它分子实体上，诸如另一种抗体(例如，双特异性抗体或双功能抗体)、检测试剂、细胞毒试剂、医药试剂和/或蛋白质或肽，其都可介导抗体或抗体部分与另一分子(诸如，链霉抗生物素蛋白核心区或聚组胺酸标签)的结合。

一种类型的衍生抗体是借由交联两个或两个以上抗体(相同类型或不同类型，例如以创造双特异性抗体)而产生。适当的交联剂包括那些为异种双官能的交联剂，其具有两个由适当的间隔物而分离的明显不同的反应基团(例如，m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或包括那些为同种双官能的交联剂(例如，二琥珀酰亚胺辛二酸酯)。该交联剂可由Pierce Chemical Company，Rockford，III购得。

另一种类型的衍生抗体为经标记抗体。有用的检测剂(本发明的抗体或抗体部分可用其衍生的)包括荧光化合物，其又包括荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰基氯化物(napthalenesulfonyl chloride)、藻红蛋白、镧系元素磷光体等。也可以用适用于检测的酶来标记抗体，诸如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。当以可检测的酶来标记抗体时，借由加入酶所使用以产生可鉴别的反应产物的额外试剂来检测。例如，当试剂辣根过氧化物酶存在时，过氧化氢及二胺基联苯胺的加入可导致产生可检测的着色反应产物。也可用生物素来标记抗体，且通过间接量测抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的结合来检测。可用磁性试剂来标记抗体，诸如钇。也可用预定的多肽表位来标记抗体，该表位可借由二级指示物(例如，亮氨酸拉链配对序列、二级抗体的结合位点、金属结合功能域、表位标签)识别。在一些实施方案中，借由不同长度的间隔物臂来附着标记以减少潜在的位阻。

抗IGF-IR抗体也可由经放射性标记的氨基酸来标记。该放射性标记可用于诊断与治疗目的。例如，借由x射线或其它诊断技术，放射性标记可用于检测IGF-IR-表达的肿瘤。此外，放射性标记可作为毒素而用于治疗癌细胞或肿瘤。用于多肽的标记的实例包括(但不限于)如下放射性同位素或核素：³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I。

抗IGF-IR抗体也可用化学基团，诸如，聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基、或碳水化合物基团来衍生。这些基团可用于改善抗体的生物学特征，例如，增长血清半衰期或增加组织结合。

本发明也涉及治疗哺乳动物高度增殖性病症的药物组合物，其包含治疗有效剂量的本发明化合物与医药学上可接受的载体。在一实施方案中，该药物组合物是用于治疗癌症，诸如，脑、肺、鳞状细胞、膀胱、胃、胰腺、乳腺、头部、颈部、肾(renal，kidney)、卵巢、前列腺、结肠直肠、食道、妇科或甲状腺癌。根据本发明的方法可用本发明的化合物来治疗的患者包括(例如)已诊断患有下列病症的患者：多发性骨髓瘤、液体肿瘤、肝癌、胸腺病症、T-细胞介导自体免疫疾病、内分泌病症(endocronological disorder)、局部缺血、神经变性病症、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部与颈部癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区的癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、妇科肿瘤(例如，子宫肉瘤、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌或外阴癌)、何杰金(Hodgkin)氏病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌(例如，甲状腺、甲状旁腺或肾上腺癌)、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、儿童期的实体肿瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌(例如，肾细胞癌、肾盂癌)或中枢神经系统癌(例如，原发性CNS淋巴瘤、脊椎轴肿瘤、脑干神经胶质瘤或垂体腺瘤)。

在另一实施方案中，该药物组合物涉及非癌性高度增殖性病症，诸如(但不限于)血管成形术后的再狭窄与银屑病。在另一实施方案中，本发明涉及治疗需要激活IGF-IR的哺乳动物的药物组合物，其中该药物组合物包含治疗有效剂量的本发明的活化抗体与医药学上可接受的载体。包含活化抗体的药物组合物可用于治疗缺乏足够IGF-I或IGF-II的动物，或可用于治疗骨质疏松、脆弱或哺乳动物分泌极少活性生长激素或不能对生长激素做出反应的病症。

本发明的抗IGF-IR抗体可并入适合给药于受验者的药物组合物中。通常，该药物组合物包含本发明的抗体与医药学上可接受的载体。如本文中所用， “医药学上可接受的载体”包括任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌与抗真菌试剂、等渗剂与吸收延缓试剂及其生理上可相容的类似物。医药学上可接受的载体包括一或多种水、生理盐水、磷酸盐缓冲生理盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及它们的组合。在许多情况下，组合物中优选包括等渗试剂，例如，糖、多元醇，诸如，甘露醇、山梨醇，或氯化钠。医药学上可接受的物质，诸如湿润或少量辅助物质，如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增强了抗体或抗体部分的存放期或效力。

本发明的组合物可为各种形式。其包括(例如)液体、半固体与固体剂型，诸如，液体溶液(例如，可注射和能输注的溶液)、分散液或悬浮液、锭剂、丸剂、散剂、脂质体及栓剂。优选的形式视意预给药的模式与治疗应用而定。典型优选的组合物为可注射或能输注的溶液，诸如，类似于那些用于以其它抗体来使人类被动免疫的组合物，优选的给药模式为肠外方式(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)。在一优选实施方案中，抗体是借由静脉内输注或注射来给予。在另一优选实施方案中，抗体是借由肌肉内或皮下注射来给予。

治疗组合物在制造与储存条件下通常必须为无菌与稳定的。该组合物可调配为溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高药物浓度的有序结构。若需要，则无菌可注射溶液可借由将所需量的抗IGF-IR抗体与如上所列举的成份中的一种或其组合并入适合溶剂中来制备，随后过滤杀菌。通常而言，分散液可借由将活性化合物与所要的上述所列举的其它成份并入含有基础分散介质的无菌媒剂中来制备。在以无菌散剂来制备无菌可注射溶液时，优选的制备方法为真空干燥与冷冻干燥，其可产出活性成份外加任何由其先前无菌过滤溶液而来的额外所要成份的散剂。在如下条件下可以维持溶液的适当流动性，例如，借由使用包衣(如卵磷脂)，在为分散液时借由维持所要的颗粒尺寸及借由使用表面活性剂。可借由在组合物中包括一种延缓吸收的试剂来实现可注射组合物的延长吸收，例如，单硬脂酸盐与明胶。

虽然对于多种治疗应用而言本发明的抗体可借由领域中已知的多种方法来给药，但优选的给药路径/模式为腹膜内、皮下、肌肉内、静脉内或输注。本领域技术人员将会了解，给药的路径和/或模式将视所要的结果而变化。在一实施方案中，本发明的抗体可以单剂量或多剂量来给药。

在某些实施方案中，活性化合物可与载体一起制备，载体将保护化合物避免快速释放，诸如，受控的释放制剂，包括植入物、皮肤贴片及微胶囊传递系统。可使用生物可降解与生物相容的聚合物，诸如，乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯与聚乳酸。多种制备所述制剂的方法已申请了专利或一般为本领域技术人员所了解。例如参阅Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

补充的活性化合物也可并入该组合物中。在某些实施方案中，本发明的抗IGF-IR抗体与一或多种额外治疗剂共配制和/或共投药，诸如，化学治疗剂、抗癌剂或抗肿瘤剂。例如，抗IGF-IR抗体可与一或多种额外治疗剂共配制和/或共给药。这些试剂包括(但不限于)：结合其它目标的抗体(例如，结合一或多种生长因子或细胞因子、其细胞表面受体或IGF-I的抗体)、IGF-I结合蛋白、抗癌剂、化学治疗剂、抗肿瘤剂、针对IGF-IR或IGF-I的反义寡核苷酸、阻断IGF-IR激活的肽类似物、可溶的IGF-IR和/或一或多种抑制IGF-I产生或活性的化学试剂，在本领域中是已知的，如，奥曲肽(octreotide)。对于包含活化抗体的药物组合物而言，该抗IGF-IR抗体可与增加细胞增殖或避免凋亡的因子一起调配。这类因子包括生长因子，诸如IGF-I和/或激活IGF-IR的IGF-I类似物。这类组合治疗可能需要较低剂量的抗IGF-IR抗体以及共给药试剂，因此避免与各种单疗法相关的可能的毒性或并发症。在一实施方案中，抗体与一或多个额外治疗试剂。

本发明的药物组合物可包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体或抗体部分。“治疗有效量”是指以某剂量及持续必要时间有效实现所要治疗结果的量。抗体或抗体部分的治疗有效量可根据某些因素而变化，诸如，个体患病情况、年龄、性别与体重，及抗体或抗体部分引发个体所需反应的能力。治疗有效量也指治疗有益效果超过抗体或抗体部分的任何毒性或有害效果时的量。“预防有效量”是指以某剂量及持续必要时间有效实现所要预防结果的量。通常，由于预防剂量是用于受验者患病之前或患病早期，所以预防有效量将会小于治疗有效量。

可调整用药方案以提供最佳所需反应(例如，治疗或预防反应)。例如，可给予单颗大丸剂，可随时间给予若干分剂量或可视治疗情况的危急所指示按比例减少或增加剂量。可将包含抗体或包含治疗组合(该治疗组合包含抗体与一或多种额外治疗试剂)的药物组合物调配成为单剂量或多剂量。尤其有利的是将肠外组合物调配成为单位剂型而便于给药及达成剂量的均匀性。本文所用单位剂型是指在物理上离散的单位，其适合作为单位剂量而用于待治疗的哺乳动物受验者；每个单位含有所计算的预定量的活性化合物以与所要的药物载体一起产生所要的治疗效果。对本发明对单位剂型的说明是藉由下述(a)与(b)来指示且直接视其而定：(a)活性化合物的独特特征与要实现的特定治疗或预防效果，及(b)本领域中所固有的复合该活性化合物用于治疗个体敏感性的限制。尤其有用的制剂为在20mM柠檬酸钠、pH5.5、140mM NaCl及0.2mg/ml聚山梨醇酯80的缓冲剂中的5mg/ml抗IGF-IR抗体。

本发明的抗体或抗体部分的治疗或预防有效量的例示性非限制范围为0.1-100mg/kg，比较优选0.5-50mg/kg，更优选1-20mg/kg，且亦更优选1-10mg/kg。应注意的是剂量值可视所需缓解的病症类型及严重度而变化。此外应进一步了解对于任何特殊受验者而言，应随时间根据个体需要与给予或监督给予组合物的人的职业判断来调整特定的用药方案，且本文所提出的剂量范围为例示性且不希望限制所要求保护的组合物的范围或实践。在一实施方案中，治疗或预防有效量的抗体或其抗原结合部分与一或多种额外治疗剂一起给予。

在另一方面，本发明是涉及以每月小于300mg的剂量给予本发明的抗IGF-IR抗体用于治疗癌症。

本发明的另一方面提供试剂盒，包含抗IGF-IR抗体与包含这些抗体的药物组合物。试剂盒除抗体或药物组合物之外可包括诊断或治疗剂。套组也包括用于诊断或治疗方法中的说明书。在一优选实施方案中，试剂盒包括抗体或其药物组合物与诊断试剂，其可用于下述方法中。在另一优选实施方案中，试剂盒包括抗体或其药物组合物与一或多种治疗试剂，诸如，额外抗癌剂、抗肿瘤剂或化学治疗剂，其可用于下述方法中。

本发明也涉及抑制哺乳动物中异常细胞生长的药物组合物，其包含一定量的本发明的化合物，其与一定量的化学治疗剂组合，其中一定量的化合物、盐、溶剂化物或前药及化学治疗剂一起有效地抑制异常细胞生长。目前有多种化学治疗剂在本领域中已知。在一实施方案中，化学治疗剂是由下列各物组成的群中选出：有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢物、嵌入抗生素(intercalating antibiotics)、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、抗生存剂、生物反应修饰剂、抗激素(例如，抗雄激素)，及抗血管生成剂。

诸如MMP-2(基质-金属蛋白酶2)抑制剂、MMP-9(基质-金属蛋白酶9)抑制剂及COX-II(环氧化酶II)抑制剂的抗血管生成剂可与本发明的化合物联合使用。有用的COX-II抑制剂的实例包括CELEBREX^TM(艾力昔布(alecoxib))、伐他昔布(valdecoxib)与罗非昔布(rofecoxib)。有用的基质金属蛋白酶抑制剂描述于WO96/33172(公开于1996年10月24日)、WO96/27583(公开于1996年3月7日)、欧洲专利申请第97304971.1号(申请于1997年7月8日)、欧洲专利申请第99308617.2号(申请于1999年10月29日)、WO98/07697(公开于1998年2月26日)、WO98/03516(公开于1998年1月29日)、WO98/34918(公开于1998年8月13日)、WO98/34915(公开于1998年8月13日)、WO98/33768(公开于1998年8月6日)、WO98/30566(公开于1998年7月16日)、欧洲专利公开606,046(公开于1994年7月13日)、欧洲专利公开931,788(公开于1999年7月28日)、WO90/05719(公开于1990年5月31日)、WO99/52910(公开于1999年10月21日)、WO99/52889(公开于1999年10月21日)、WO99/29667(公开于1999年6月17日)、PCT国际申请号PCT/IB98/01113(申请于1998年7月21日)、欧洲专利申请99302232.1(申请于1999年3月25日)、英国专利申请第9912961.1号(申请于1999年6月3日)、美国临时申请案第60/148,464号(申请于1999年8月12日)、美国专利5,863,949(颁发于1999年1月26日)、美国专利5,861,510(颁发于1999年1月19日)及欧洲专利公开780,386(公开于1997年6月25日)中，所有内容以引用的方式全部并入本文中。优选的MMP抑制剂为那些未显示关节痛的MMP抑制剂。更优选的为那些相对于其它基质-金属蛋白酶(即，MMP-1、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-11、MMP-12及MMP-13)选择性抑制MMP-2及/或MMP-9的MMP抑制剂。适用于本发明的MMP抑制剂的一些特定实例为AG-3340、RO32-3555、RS13-0830及列举于下列清单的化合物：3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基]-(1-羟基氨甲酰基-环戊基)-氨基]-丙酸；3-外-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基氨基]-8-氧杂-二环[3.2.1]辛烷-3-羧酸羟基酰胺；(2R，3R)1-[4-(2-氯-4-氟-苄氧基)-苯磺酰基]-3-羟基-3-甲基-哌啶-2-羧酸羟基酰胺；4-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基氨基]-四氢-吡喃-4-羧酸羟基酰胺；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基]-(1-羟基氨甲酰基-环丁基)-氨基]-丙酸；4-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰基氨基]-四氢-吡喃-4-羧酸羟基酰胺；(R)3-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰基氨基]-四氢-吡喃-3-羧酸羟基酰胺；(2R，3R)1-[4-(4-氟-2-甲基-苄氧基)-苯磺酰基]-3-羟基-3-甲基-哌啶-2-羧酸羟基酰胺；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基]-(1-羟基氨甲酰基-1-甲基-乙基)-氨基]-丙酸；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基]-(4-羟基氨甲酰基-四氢-吡喃-4-基)-氨基]-丙酸；3-外-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基氨基]-8-氧杂-二环[3.2.1]辛烷-3-羧酸羟基酰胺；3-内-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基氨基]-8-氧杂-二环[3.2.1]辛烷-3-羧酸羟基酰胺；与(R)3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基氨基]-四氢-呋喃-3-羧酸羟基酰胺；及所述化合物的医药上可接受的盐类及溶剂化物。

本发明的化合物也可与信号转导抑制剂一起使用，诸如可抑制EGF-R(表皮生长因子受体)反应的试剂，如EGF-R抗体、EGF抗体及EGF-R抑制剂分子；VEGF(血管内皮生长因子)抑制剂，如VEGF受体及可抑制VEGF的分子；及erbB2受体抑制剂，如结合至erbB2受体的有机分子或抗体，例如HERCEPTIN^TM(Genentech，Inc.)。EGF-R抑制剂描述于例如WO95/19970(公开于1995年7月27日)、WO98/14451(公开于1998年4月9日)、WO98/02434(公开于1998年1月22日)、及美国专利5,747,498(颁发于1998年5月5日)中，且如本文所述的这些物质可用于本发明中。EGFR-抑制剂包括(但不限于)单克隆抗体C225与抗-EGFR 22Mab(ImClone Systems Incorporated)、ABX-EGF(Abgenix/Cell Genesys)、EMD-7200(Merck KgaA)、EMD-5590(Merck KgaA)、MDX-447/H-477(Medarex Inc.及Merck KgaA)，及化合物ZD-1834、ZD-1838与ZD-1839(AstraZeneca)、PKI-166(Novartis)、PKI-166/CGP-75166(Novartis)、PTK 787(Novartis)、CP 701(Cephalon)、leflunomide(Pharmacia/Sugen)、CI-1033(Warner Lambert Parke Davis)、CI-1033/PD183，805(WarnerLambert Parke Davis)、CL-387，785(Wyeth-Ayerst)、BBR-1611(Boehringer Mannheim GmbH/Roche)、Naamidine A(Bristol MyersSquibb)、RC-3940-II(Pharmacia)、BIBX-1382(BoehringerIngelheim)、OLX-103(Merck & Co.)、VRCTC-310(Ventech Research)、EGF融合毒素(Seragen Inc.)、DAB-389(Seragen/Lilgand)、ZM-252808(Imperial Cancer Research Fund)、RG-50864(INSERM)、LFM-A12(Parker Hughes Cancer Center)、WHI-P97(Parker Hughes CancerCenter)、GW-282974(Glaxo)、KT-8391(Kyowa Hakko)及EGF-R疫苗(York Medical/Centro de Immunologia Molecular(CIM))。这些与其它EGF-R-抑制剂可用于本发明中。

例如SU-5416与SU-6668(Sugen Inc.)、SH-268(Schering)及NX-1838(NeXstar)的VEGF抑制剂也可与本发明的化合物组合。VEGF抑制剂描述于例如WO99/24440(公开于1999年5月20日)、PCT国际申请PCT/IB99/00797(申请于1999年5月3日)、WO95/21613(公开于1995年8月17日)、WO99/61422(公开于1999年12月2日)、美国专利5,834,504(颁发于1998年11月10日)、WO98/50356(公开于1998年11月12日)、美国专利5,883,113(颁发于1999年3月16日)、美国专利5,886,020(颁发于1999年3月23日)、美国专利5,792,783(颁发于1998年8月11日)、WO99/10349(公开于1999年3月4日)、WO97/32856(公开于1997年9月12日)、WO97/22596(公开于1997年6月26日)、WO98/54093(公开于1998年12月3日)、WO98/02438(公开于1998年1月22日)、WO99/16755(公开于1999年4月8日)及WO98/02437(公开于1998年1月22日)中，所有内容以引用的方式全部并入本文中。适用于本发明的某些特定VEGF抑制剂的其它实例为IM862(Cytran Inc.)；及angiozyme，一种可由Ribozyme与Chiron购得的合成核酶。如本文所述的这些及其它VEGF抑制剂可用于本发明中。

此外，诸如GW-282974(Glaxo Wellcome plc)及单克隆抗体AR-209(Aronex Pharmaceuticals Inc.)及 2B-1(Chiron)的ErbB2受体抑制剂可与本发明的化合物组合，例如，那些描述于WO98/02434(公开于1998年1月22日)、WO99/35146(公开于1999年7月15日)、WO99/35132(公开于1999年7月15日)、WO98/02437(公开于1998年1月22日)、WO97/13760(公开于1997年4月17日)、WO95/19970(公开于1995年7月27日)、美国专利5,587,458(颁发于1996年12月24日)及美国专利5,877,305(颁发于1999年3月2日)中，所有内容以引用的方式并入本文中。适用于本发明的ErbB2受体抑制剂也于1999年1月27日申请的美国临时申请第60/117,341号，及于1999年1月27日申请的美国临时申请案第60/117,346号中有所描述，两者以引用的方式全部并入本文中。根据本发明，如先前PCT申请、美国专利及美国临时申请中所述的erbB2受体抑制剂化合物与物质以及其它抑制erbB2受体的化合物与物质可与本发明的化合物一起使用。

本发明的抗体也可与CTLA-4抗体一起使用，如那些在美国专利6,682,736中所述的抗体，包括具有如下抗体序列的抗体：3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1或12.9.1.1。该抗体也可与CD40抗体一起使用，如在公开于2003年5月15日的WO03040170中所述的抗体，包括具有如下抗体序列的抗体：3.1.1、3.1.1H-A78T、3.1.1H-A78T-V88A-V97A、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、22.1.1H-C109A、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1H-D16E、23.29.1或24.2。

该抗体也可与抗整联蛋白试剂组合，诸如，抗整联蛋白抗体。

可与抗体组合的试剂的某些特定实例包括如下：

烷化剂：氮芥N-氧化物、环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥(melphalan)、白消安二溴甘露醇(busulfanmitobronitol)、卡巴醌(carboquone)、塞替派(thiotepa)、雷诺氮芥(ranimustine)、尼莫司汀(nimustine)及替莫唑胺(temozolomide)；

抗代谢物：氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、核苷、巯基嘌呤、5-FU、替加氟(tegafur)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、奥佛非特(ocfosfate)、依诺他滨(enocitabine)、S-1、吉西他滨(gemcitabine)、氟达拉滨(fludarabine)及卡培他滨(capecitabine)；

抗生素：放线菌素D、阿霉素、道诺红菌素、新制癌菌素、博莱霉素、派来霉素(peplomycin)、丝裂霉素C、阿克拉霉素、吡柔比星(pirarubicin)、表阿比星(epirubicin)、净司他丁(zinostatin)、替美(stimalamer)及伊达比星(idarubicin)；

植物衍生的抗肿瘤试剂：长春花新碱、长春花碱、vindeshine、鬼臼亚乙苷、索布佐生(sobuzoxane)、多西他赛(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)及温诺平(vinorelbine)；

铂配位化合物：顺铂(cisplatin)、卡波铂(carboplatin)、奈达铂(nedaplatin)及奥沙利铂(oxaliplatin)；

喜数碱(camptothecin)衍生物：依诺替康(irinotecan)、拓扑替康(topotecan)及campthotecin；

酪氨酸激酶抑制剂：吉非替尼(gefitinib)；

抗-CD20试剂：美罗华(rituximab)、妥司莫(tositumomab)及替坦异贝莫单抗(ibritumomab tiuxetan)；

干扰素：α干扰素、α-2a干扰素、α-2b干扰素、β干扰素、γ-1a干扰素及γ-n1干扰素；

生物反应修饰剂：云芝多糖(krestin)、蘑菇多糖(lentinan)、西佐糖(sizofiran)、溶链菌制剂(picibanil)及乌苯美司(ubenimex)；及

其它抗肿瘤试剂：米托蒽醌(mitoxantrone)、1-天门冬酰胺酶、丙卡巴肼(procarbazine)、达卡巴肼(dacarbazine)、羟基脲、喷司他丁(pentostatin)及维甲酸。

此外，本发明的抗体可与抗癌剂依西美坦(exemestane)、依特卡林(edotecarin)(J-107088)与SU11248组合。

抗IGF-IR抗体可以用于检测体内或体外的生物样本中的IGF-IR。抗IGF-IR抗体可用于常规免疫分析中，包括(但不限于)：ELISA、RIA、FACS、组织免疫组织化学法、western印迹法或免疫沉淀法。本发明抗IGF-IR抗体可用于检测来自人类的IGF-IR。在另一实施方案中，抗IGF-IR抗体可用于检测来自旧大陆灵长类动物的IGF-IR，诸如，猕猴与恒河猴、黑猩猩与猿。本发明提供检测生物样本中抗IGF-IR的方法，其包括用本发明的抗IGF-IR抗体与生物样本接触，及检测结合至抗IGF-IR的结合的抗体，由此来检测生物样本中的IGF-IR。在一实施方案中，抗IGF-IR抗体直接以可检测的标记进行标记。在另一实施方案中，抗IGF-IR抗体(第一抗体)未经标记，而是标记可结合至抗IGF-IR抗体上的第二抗体或其它分子。为本领域技术人员所熟知，选择能专一性结合至特定种类与类型的第一抗体的第二抗体。例如，若抗IGF-IR抗体为人类IgG，则第二抗体可为抗-人类-IgG。其它可结合至抗体的分子包括(但不限于)：蛋白A与蛋白G，两者都可自(例如)Pierce Chemical Co.购得。

用于抗体或第二抗体的适合的标记已在前述内容中有所揭示，且包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、磁性试剂与放射性材料。适合酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基复合体的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素与抗生物素蛋白/生物素；适合的荧光材料的实例包括伞花内酯、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪基胺(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺(luminol)；磁性试剂的实例包括钆；而适合的放射性材料的实例包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。

在一替代实施方案中，可通过利用以可检测的物质标记的IGF-IR标准物与未标记的抗IGF-IR抗体的竞争性免疫分析来检定生物样本中的IGF-IR。在此检定中，将生物样本、经标记的IGF-IR标准物与抗IGF-IR抗体组合在一起且确定结合至未标记抗体的经标记IGF-IR标准物的量。生物样本中IGF-IR的量反比于结合至抗IGF-IR抗体的经标记的IGF-IR标准物的量。

可使用如上所揭示的免疫分析来达成多种目的。在一实施方案中，抗IGF-IR抗体可用于检测细胞培养物中的细胞中的IGF-IR。在一优选实施方案中，抗IGF-IR抗体可用于确定在以各种化合物来治疗细胞之后IGF-IR酪氨酸磷酸化、酪氨酸自磷酸化的水平，及/或细胞表面IGF-IR的量。该方法可用于测试可用于激活或抑制IGF-IR的化合物。在此方法中，以测试化合物来处理一细胞样本一段时间同时另一样本未经处理。若要测量酪氨酸自磷酸化作用，则将细胞溶解解且使用上述免疫分析或如前述使用ELISA来测量IGF-IR的酪氨酸磷酸化作用。若要测量IGF-IR的总水平，则将细胞溶解且使用一种上述免疫分析法来测量IGF-IR总含量。

用于确定IGF-IR酪氨酸磷酸化或用于测量总IGF-IR水平的优选的免疫分析法为ELISA或western印迹法。若仅要测量IGF-IR的细胞表面水平，则不将细胞溶解，且使用一种上述免疫分析法来测量IGF-IR的细胞表面水平。用于确定IGF-IR的细胞表面水平的优选的免疫分析法包括以下步骤：用诸如，生物素或¹²⁵I的可检测标记来标记细胞表面蛋白质，用抗IGF-IR抗体来免疫沉淀IGF-IR并接着检测经标记的IGF-IR。用于确定IGF-IR定位(例如，细胞表面水平)的另一优选免疫分析法为使用免疫组织化学法。以下方法是在本领域中所熟知的，诸如，ELISA、RIA、Western印迹法、免疫组织化学法、整合性膜蛋白的细胞表面标记法及免疫沉淀法。例如参阅Harlow andLane，前述。此外，为了测试较大数量的用于激活或抑制IGF-IR的化合物，可按比例放大免疫分析用于高通量筛选。

本发明的抗IGF-IR抗体也可用于确定组织或自组织所衍生的细胞中的IGF-IR水平。在一优选实施方案中，该组织为病变组织。在一更优选实施方案中，该组织为肿瘤或其活组织检查物。在一优选实施方案中，组织或其活组织检查物是切除自患者。接着将该组织或活组织检查物用于免疫分析以通过如上讨论的方法来确定(例如)IGF-IR水平、IGF-IR的细胞表面水平、IGF-IR酪氨酸磷酸化水平或IGF-IR的定位。该方法可用于确定肿瘤是否表达高水平的IGF-IR。

上述诊断方法可用于确定肿瘤是否表达高水平的IGF-IR，其可指示肿瘤对于抗IGF-IR抗体的治疗反应良好。该诊断方法也可用于确定：若肿瘤表达高水平的IGF-IR，则其是否为潜在的癌性，或若表达低水平的IGF-IR，则其是否为良性的。此外，该诊断方法也可用于确定抗IGF-IR抗体的治疗是否会造成肿瘤表达较低水平的IGF-IR及/或表达较低水平的酪氨酸自磷酸化，且因此可用于确定治疗成功与否。通常而言，确定抗IGF-IR抗体是否降低酪氨酸磷酸化的方法包含以下步骤：测量目的细胞或组织中酪氨酸磷酸化水平，用抗IGF-IR抗体或其抗原结合部分温育细胞或组织，接着测量细胞或组织中酪氨酸磷酸化的水平。可测量IGF-IR或另一种(几种)蛋白质的酪氨酸磷酸化。该诊断方法也可用于确定组织或细胞是否表达足够高水平的IGF-IR或足够高水平的经活化IGF-IR，在患有侏儒症、骨质疏松症或糖尿病的个体中存在此类情形。IGF-IR或活性IGF-IR含量极低的诊断可用于以活化抗IGF-IR抗体、IGF-I或其它治疗试剂来治疗从而增加IGF-IR水平或增强其活性。

基于本发明的抗体下调周围淋巴细胞中IGF-1R的能力，“生物标记策略”可用于监控IGF-1R在以本发明的抗体所治疗的患者的循环肿瘤细胞及/或正常细胞上的表达。也可使用如公开于2002年7月11日的WO02/05359中所述的其它抗体。这些细胞可包括(但不限于)CD19+细胞，且也可包括所有白细胞，诸如，单核细胞、粒细胞与淋巴细胞。

本发明抗体亦可用于体内定位表达IGF-IR的组织与器官。在一优选实施方案中，抗IGF-IR抗体可用于定位表达IGF-IR的肿瘤。该方法包括以下步骤：给予需要该诊断测试的患者抗IGF-IR抗体或其药物组合物及对患者进行图像分析以确定表达IGF-IR的组织的定位。图像分析在药学领域中是熟知的，其包括(但不限于)x光分析、核磁共振成像(MRI)或计算机断层(CE)。在该方法的另一实施方案中，自患者获得活组织检查物以确定目的组织是否表达IGF-IR而非使患者进行图像分析。在一优选实施方案中，用可在患者身上成像的可检测试剂来标记抗IGF-IR抗体。例如，抗体可以造影剂(contrast agent)来标记，如钡，其可用于x光分析；或磁性造影剂来标记，如钆螯合物，其可用于MRI或CE。其它标记试剂包括(但不限于)放射性同位素，如⁹⁹Tc。在另一实施方案中，抗IGF-IR抗体未经标记且通过给予可检测且可结合抗IGF-IR抗体的第二抗体或其它分子而成像。

在另一实施方案中，本发明提供通过给予需要其的患者本发明的抗IGF-IR抗体而抑制IGF-IR活性的方法。本发明的抗体可用于治疗。在另一优选实施方案中，IGF-IR为人类的且患者为人类患者。或者，患者可为表达IGF-IR的哺乳动物，抗IGF-IR抗体与该IGF-IR交叉反应。抗体可给予表达与抗体交叉反应的IGF-IR的非人类哺乳动物(即，灵长类动物或猕猴或恒河猴)从而用于兽医目的或作为人类疾病的动物模型。该等动物模型可适用于评估本发明的抗体的治疗功效。

在一优选实施方案中，抗IGF-IR抗体可给予具有表达IGF-IR的肿瘤患者。肿瘤可为实体瘤或可为非实体瘤，如淋巴瘤。在一更优选实施方案中，抗IGF-IR抗体可给予具有表达IGF-IR的癌性肿瘤患者。在一亦更优选实施方案中，抗IGF-IR抗体可给予患有肺部、乳腺、前列腺或结肠肿瘤的患者。在一高度优选实施方案中，该方法造成肿瘤的重量或体积不增加或重量或体积减小。在另一实施方案中，该方法造成肿瘤上的IGF-IR内化。在一优选实施方案中，该抗体为2.12.1fx，或包含重链、轻链或其抗原结合区。

在另一优选实施方案中，抗IGF-IR抗体可给予表达不适当高水平的IGF-I，例如，IGF-IR活性为有害的病症的患者。本文所用术语“IGF-IR活性为有害的病症”包括的疾病或其它病症中患病的受验者中高水平IGF-IR的存在已显示或怀疑为该病症的病理生理学的原因或为促使该病症恶化的因素。因而，高水平IGF-IR活性为有害的病症为一种其中预期IGF-IR活性的抑制会缓解病症的症状及/或发展的病症。该病症可通过(例如)细胞表面IGF-IR水平的增加或患病受验者之受感染细胞或组织中增加的IGF-IR酪胺酸自磷酸化来证实。可使用(例如)上述抗IGF-IR抗体来检测IGF-IR水平的增加。

一方面，抗IGF-IR抗体用于治疗非癌性病况，其中IGF-I及/或IGF-IR的高水平与非癌性病况或疾病有关。在一实施方案中，该方法包括给予具有非癌性病理状况的患者抗IGF-IR抗体的步骤，IGF-I及/或IGF-IR的高水平或活性造成或恶化该病理状况。在一优选实施方案中，非癌性病理状况为肢端肥大症、巨人症、银屑病、动脉粥样硬化、血管平滑肌的再狭窄或不适当的微血管增生，如发现于糖尿病的并发症中，尤其是眼睛的微血管增生。在一更优选实施方案中，抗IGF-IR抗体减缓非癌性病理状况的发展。在一更优选实施方案中，抗IGF-IR抗体至少部分停止或逆转非癌性病理状况。

在本领域中已知IGF-I的高水平表达可导致各种常见癌症。在一更优选实施方案中，给予患有前列腺癌、神经胶质瘤或纤维肉瘤的患者抗IGF-IR抗体。在一更优选实施方案中，该方法造成癌症异常增殖的停止，或肿瘤的重量或体积之不增加或重量或体积的减小。

在一实施方案中，该方法涉及如下癌症的治疗，诸如，脑、鳞状细胞、膀胱、胃、胰腺、乳腺、头、颈、食管、前列腺、结肠直肠、肺、肾(renal，kidney)、卵巢、妇科或甲状腺癌。根据本发明的方法，可以本发明的化合物来治疗的患者包括(例如)已诊断患有如下病症的患者：多发性骨髓瘤、液体肿瘤、肝癌、胸腺病症、T-细胞介导的自身免疫性疾病、内分泌病症、局部缺血、神经变性病症、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部与头部癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区的癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、妇科肿瘤(例如，子宫肉瘤、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌或外阴癌)、何杰金氏病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌(例如，甲状腺、甲状旁腺或肾上腺癌)、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、儿童期的实体肿瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌(例如，肾细胞癌、肾盂癌)或中枢神经系统癌(例如，原发性CNS淋巴瘤、脊椎轴肿瘤、脑干神经胶质瘤或垂体腺瘤)。

可一次给予该抗体，但较优选地多次给予。该抗体可由每天给予三次至每六个月给予一次。可按日程表投药，诸如，每天三次，每天两次、每天一次、每两天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次及每六个月一次。可经口、粘膜、口腔、鼻内、吸入、静脉内、皮下、肌肉内、肠外、肿瘤内或局部的路径来给予抗体。该抗体可在远离肿瘤位置的部位给予。也可经由小型泵连续给予抗体。抗体可给予一次、至少两次或至少一段时间直至病症得以治疗、减轻或治愈。若该抗体造成肿瘤或癌症停止生长或重量或体积减小，则通常只要肿瘤存在就将给予该抗体。该抗体一般将作为如前所述的药物组合物的部分而给予。抗体的剂量通常在0.1-100mg/kg的范围内，较优选0.5-50mg/kg，更优选1-20mg/kg，及也更优选1-10mg/kg。可通过任何本领域中已知的方法来测量抗体的血清浓度。为了预防癌症或肿瘤的发生也可预防性地给予该抗体。此尤其适用于具有“高正常”水平的IGF-I的患者，由于这些患者已显示出具有患常见癌症的较高的危险率。参阅Rosen等人，前述。

另一方面，抗IGF-IR抗体可与其它治疗剂(如抗癌药物或分子)一起共同给予患有高度增殖性病症(如癌症或肿瘤)的患者。一方面，本发明涉及治疗哺乳动物的高度增殖性病症的方法，其包括给予该哺乳动物治疗有效量的本发明化合物，其与由下列各物组成的群中选出的抗肿瘤试剂并用(但不限于)：有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢物、嵌入剂、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、生物反应修饰剂、抗激素、激酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、遗传学治疗剂与抗雄激素。在一优选实施方案中，该抗体可与抗癌剂一起给予，如阿霉素或紫杉醇。在另一优选实施方案中，该抗体或治疗组合可与放射疗法、化学疗法、光动力疗法、外科手术或其它免疫疗法一起施予患者。在另一亦优选实施方案中，抗体将与另一抗体一起给予。例如，抗IGF-IR抗体可与已知的抑制肿瘤或癌症细胞增殖的抗体或其它试剂一起给予，如抑制erbB2受体、EGF-R、CD20或VEGF的抗体或试剂。

抗体与额外治疗试剂(组合疗法)的共同投予包括给予包含抗IGF-IR抗体与额外治疗试剂的药物组合物及给予两种或两种以上分离的药物组合物，其中之一包含抗IGF-IR抗体而另一种包含额外治疗试剂。此外，虽然共同给药或组合疗法通常意谓抗体与额外治疗试剂彼此同时给予，但其也包括抗体与额外治疗试剂不同时给予的情况。例如，抗体可以每三天给予一次，而额外治疗试剂可以每天给予一次。或者，抗体可在以额外治疗试剂来治疗病症之前或之后给予，例如在以额外试剂未能治疗患者之后。类似地，抗IGF-IR抗体的给予可在放射疗法、光动力疗法或外科手术之前或之后进行。

抗体与一或多种额外治疗试剂(组合疗法)可给予一次、两次或至少一段时间直至病症得以治疗、减轻或治愈。优选地，该组合疗法可给予多次。组合疗法可由每天三次至每六个月一次来给予。给药可按时间表进行，诸如，每天三次、每天两次、每天一次、每两天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次及每六个月一次，或可经由小型泵连续给药。组合疗法可经口、粘膜、口腔、鼻内、吸入、静脉内、皮下、肌肉内、肠外、肿瘤内或局部路径来给予。组合疗法可在远离肿瘤位置的部位给予。若抗体造成肿瘤或癌症停止生长或重量或体积减小，则通常只要肿瘤存在就将给予组合疗法。

在一更进一步的实施方案中，以放射性标记、免疫毒素或毒素来标记抗IGF-IR抗体，或该IGF-IR抗体为包含毒性肽的融合蛋白。抗IGF-IR抗体或抗IGF-IR抗体融合蛋白将放射性标记、免疫毒素、毒素或毒性肽导向至表达IGF-IR的肿瘤或癌细胞。在一优选实施方案中，在抗IGF-IR抗体结合至钟瘤或癌细胞表面的IGF-IR之后，放射性标记、免疫毒素、毒素或毒性肽进行内在化。

另一方面，抗IGF-IR抗体可用于治疗诱导需要治疗的患者中特定细胞的凋亡。在多种情况下，靶向凋亡的细胞为癌性或肿瘤细胞。因此，在一优选实施方案中，本发明提供通过给予需要治疗的患者治疗有效量的抗IGF-IR抗体而诱导凋亡的方法。在一优选实施方案中，该抗体为2.12.1fx，或包含重链、轻链或其抗原结合区。

在另一方面，本发明提供给予需要治疗的患者活化的抗IGF-IR抗体的方法。在一实施方案中，给予需要治疗的患者有效量的活化抗体或药物组合物以增加IGF-IR的活性。在一更优选实施方案中，活化抗体能够储存正常的IGF-IR活性。在另一优选实施方案中，可将活化抗体给予患有身材矮小、神经病、肌肉质量减少或骨质疏松的患者。在另一优选实施方案中，活化抗体可与一或多种可增加细胞增殖、避免凋亡或增加IGF-IR活性之其它因子一起给予。该类因子包括生长因子，诸如IGF-I及/或激活IGF-IR的IGF-I类似物。在一优选实施方案中，抗体为2.12.1fx，或包含重链、轻链或其抗原结合部分。

经由基因疗法可给予需要治疗的患者本发明的核酸分子。该疗法可在体内或体外进行。在一优选实施方案中，可将编码重链与轻链的核酸分子给予患者。在一更优选实施方案中，给予核酸分子使得其可稳定地整合入B细胞的染色体，因为这些细胞专门用于产生抗体。在一优选实施方案中，转染或在离体感染前体B细胞且将其重新移植至需要的患者。在另一实施方案中，使用已知的用于感染目的细胞类型的病毒感染前体B细胞或其它细胞。用于基因疗法的典型载体包括脂质体、质粒或病毒载体，诸如，逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒。在体内或体外感染之后，可通过自所治疗的患者取得样本及使用任何本领域中已知及本文所讨论的免疫分析来监控抗体表达的水平。

在一优选实施方案中，基因疗法包括如下步骤：给予有效量的编码人类抗体或其部分的重链或其抗原结合部分的经分离的核酸分子及表达该核酸分子。在另一实施方案中，基因疗法包括如下步骤：给予有效量的编码人类抗体或其部分的轻链或其抗原结合部分的经分离的核酸分子及表达该核酸分子。在一更优选的方法中，基因疗法包括如下步骤：给予有效量的编码人类抗体或其部分的重链或其抗原结合部分的经分离的核酸分子及有效量的编码人类抗体或其部分的轻链或其抗原结合部分的经分离的核酸分子及表达这些核酸分子。基因疗法也可括给予另一种抗癌试剂的步骤，诸如，紫杉醇、他莫西芬、5-FU、阿霉素或CP-358,774。

本申请案的序列ID号：

SEQ ID NO 1：编码抗体2.12.1fx重链的DNA序列，包括编码用于表达成熟抗体的信号序列的序列。

SEQ ID NO 2：编码抗体2.12.1fx轻链的DNA序列，包括编码用于表达成熟抗体的信号序列的序列。

SEQ ID NO 3：抗体2.12.1fx重链的氨基酸序列。

SEQ ID NO 4：种系DP-35的氨基酸序列。

SEQ ID NO 5：2.12.1fx抗体轻链的氨基酸序列。

SEQ ID NO 6：种系A30/JK1的氨基酸序列。

为了更好的理解本发明，陈述了如下实施例。这些实施例仅用于说明而非以任何方式限制本发明的范畴。

实施例I：产生抗IGF-IR抗体的杂交瘤的产生

如下制备、选择及检定本发明的抗体：

将8至10周大的XENOMICE^TM在腹膜内或在其后脚底以人类IGF-IR的细胞外功能域(10μg/剂/小鼠)或以3T3-IGF-IR或300.19-IGF-IR细胞来免疫，后两种细胞为在其原生质膜上表达人类IGF-IR的两种转染细胞系(10×10⁶个细胞/剂/小鼠)。在3至8周的时间内重复该剂量5至7次。融合前4天，小鼠接受PBS中人类IGF-IR的细胞外功能域的最终注射。来自经免疫小鼠的脾与淋巴结淋巴细胞与非分泌性骨髓瘤P3-X63-Ag8.653细胞系融合且如前所述进行HAT选择(Galfreand Milstein，methods Enzymol.73：3-46，1981)。选择产生特异于IGF-IR的单克隆抗体的杂交瘤2.12.1以用于经一步的研究且将其于2000年12月12日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，VA20110-2209，其保藏号如下：

杂交瘤保藏号

2.12.1 PTA-2792

此杂交瘤与其它产生特异于IGF-1R的抗体的杂交瘤描述于2002年7月11日公开的WO02/05359中。此公开的内容(包括所述的所有序列)以引用的方式并入本文中。

将抗体2.12.1重链中两个构架突变及轻链中三个构架突变都校正回为种系以产生抗体2.12.1fx。

所有制造2.12.1fx 突变的变化是使用QuikChangeSite-Directed Mutagenesis试剂盒(Stratagene^TM)而制备，通过制备具有突变的靶位点的质粒、将该质粒变性及将含有所要突变的寡核苷酸引物退火来完成。Pfu Turbo DNA聚合酶的非链置换作用用于延伸及掺入诱变的引物从而导致有切口的环形链。用Dpnl消化甲基化、非突变的亲代DNA模板之后，将环形有切口的dsDNA转化进入XLl Blue超能力细胞。转化完成后，XLl Blue超能力细胞修复突变质粒中的切口。选择含有突变的质粒且核实核酸序列。

图1显示编码抗体2.12.1fx重链的DNA序列，包括编码用于表达成熟抗体的信号序列的序列(SEQ ID NO：1)。图2显示编码抗体2.12.1fx轻链的DNA序列，包括编码用于表达成熟抗体的信号序列的序列(SEQ ID NO：2)。图3显示抗体2.12.1fx重链的氨基酸序列(SEQID NO：3)与种系序列DP-35(3-11)/D3-3/JH6的氨基酸序列(SEQID NO：4)的比对。抗体2.12.1fx的序列是如上所示用于种系序列。信号序列为斜体而CDR被标以下划线。恒定功能域区以氨基酸残基ASTK起始且对应于种系中在148起始的氨基酸残基并延伸至序列末端。构架(FR)突变是位于氨基酸残基21与116。图4显示抗体2.12.1fx轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)与种系序列A30/Jk1的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)的比对。抗体2.12.1fx的序列是如上所示用于种系序列。信号序列为斜体且将CDR标以下划线。恒定功能域区以氨基酸残基TVAA起始且对应于种系中在131起始的氨基酸残基并延伸至序列末端。构架(FR)突变是位于氨基酸残基43、125与129。

实施例II：抗体介导的对IGF-I/IGF-IR结合的阻滞

进行ELISA实验以在基于细胞的检定中定量本发明的抗体抑制IGF-I结合至IGF-IR的能力。在96孔u底培养板中将IGF-IR转染的NIH-3T3细胞(5×10⁴/ml)置于补充有L-谷氨酰胺(0.29mg/ml)、10％热失活FBS及遗传霉素、青霉素和链霉素各500μg/ml的100μl DMEM高葡萄糖培养基中。在37℃、5％CO₂中过夜温育该培养板以使得细胞附着。将培养基由培养板中倾析且每孔以100μl新鲜培养基来置换。为进行测试，在检定培养基(补充有L-谷氨酰胺、10％热失活FBS、200μg/ml BSA及500μg/ml每一遗传霉素(geneticin)、青霉素及链霉素的DMEM高葡萄糖培养基)中稀释抗体至所需要的最终浓度。将所有样本重复执行三次。在37℃下将培养板温育10分钟。在检定培养基中将[¹²⁵I]-IGF-I稀释至浓度为1μCi/ml且在培养板每个孔中加入50μl该稀释。作为背景放射性的对照物，将冷IGF-I加入至最终浓度100ng/ml。在37℃下将培养板温育10分钟且通过缓缓吸入纸巾中倾析培养基及以检定培养基洗涤两次。加入50μl 0.1N NaOH、0.1％SDS来溶解细胞且在室温下将培养板振荡5分钟。将样本转移至闪烁培养板，加入150μl OptiPhase Supermix且使用Wallace Micro-Betacounter来读取信号。

表I与图5显示以本发明的抗体所进行的该实验的结果。该实验表明本发明的抗体特异地抑制[¹²⁵I]-IGF-I结合至过度表达IGF-IR的细胞。

表I

单克隆抗体	IC₅₀
单克隆抗体	IC₅₀	2.12.1fx	0.4μg/ml

实施例III：抗体介导的抑制IGF-I诱导的IGF-IR磷酸化

为确定本发明的抗体是否能阻断IGF-I介导的IGF-IR的活化作用而进行ELISA实验。通过减少的受体相关的酪氨酸磷酸化来检测IGF-I介导的IGF-IR活化作用。

ELISA培养板的制备

通过在经ReactiBind蛋白G包被的96孔培养板(Pierce)的每孔中加入100μl阻断缓冲液(Tris缓冲盐水[TBS]中的3％牛血清白蛋白[BSA])来制备ELISA捕获培养板。将该培养板在室温下振荡培育30分钟。在阻断缓冲液中将兔子全特异性SC-713抗IGF-IR抗体(Santa Cruz)稀释至5μg/ml的浓度。在每孔中加入100μl经稀释的抗体。将该培养板在室温下振荡培育60-90分钟。用洗涤缓冲液(TBS+0.1％Tween20)将该培养板洗涤5次且将残留的缓冲液吸入纸巾中。不容许在加入裂解物之前干燥该培养板。

自表达IGF-IR的细胞制备裂解物

在96孔U型底培养板中将经IGF-IR转染的NIH-3T3细胞(5×10⁴/ml)置于100μl生长培养基(补充有L-谷氨酰胺(0.29mg/ml)、10％热失活FBS及500μg/ml每一遗传霉素(geneticin)、青霉素及链霉素的DMEM高葡萄糖培养基)中。在37℃、5％CO₂下过夜培养该培养板以使得细胞附着。将培养基自培养板倾析且每孔以100μl新鲜生长培养基来置换。为进行测试，在生长培养基中将潜在的抗IGF-IR抗体稀释5次直至所要的最终浓度且在每孔中加入25μl该稀释物。将所有样本重复执行三次。在37℃下将该培养板温育1小时。每孔25μl的600ng/ml IGF-1(在生长培养基中制备)来刺激细胞且在室温下温育10分钟。通过颠倒培养板及缓缓吸入纸巾中来倾析培养基。加入50μl溶解缓冲液(50mM HEPES、pH7.4、10mM EDTA、150mM NaCl、1.5mM MgCl₂、1.6mM NaVO₄、1％ Triton X-100、1％甘油)来溶解粘附细胞且在使用之前每50ml立即补充一颗不含EDTA的蛋白酶抑制剂片[Roche Molecular Sciences]。室温下振荡细胞5分钟。每孔加入200μl稀释缓冲液(50mM HEPES、pH7.4、1.6mM NaVO₄)且通过移液操作来混合。将100μl裂解物自每一孔转移至如此所述所制备的ELISA捕获培养板的每一孔且在室温下缓缓振荡培养2小时。

以抗磷酸酪氨酸(pTYR)抗体来进行ELISA

颠倒培养板、以洗涤缓冲液将培养盘洗涤5次及将过多的液体吸入纸巾中来移除细胞裂解物。每孔加入100μl pTYR特异性抗体(HRP-PY54)且在阻断缓冲液中将其稀释至0.2μg/ml的浓度。室温下振荡培养板30分钟来培养细胞。接着以洗涤缓冲液将培养板洗涤5次且吸入纸巾中。

每孔加入100μl TMB过氧化物酶底物溶液(Kirkegaard & Perry)及振荡培育以至产生颜色来检测HRP-PY54抗体的结合(约2-10分钟)。每孔加入100μl TMB中止溶液(Kirkegaard & Perry)来停止显色反应。在室温下将培养板振荡10秒钟以混合溶液且通过OD_450nm的测量来定量。

表II及图6A显示以本发明的抗体来进行此实验的结果。该实验结果表明如减少的受体相关的酪氨酸磷酸化所示本发明的抗体阻断IGF-I介导的IGF-IR活化作用的能力。此外，该结果可用于量化本发明的抗体的相对效能。

表II

单克隆抗体	IC₅₀(μg/ml)
单克隆抗体	IC₅₀(μg/ml)	2.12.1fx	0.42

实施例IV：本发明的抗体的物种交叉反应性

为确定本发明的抗体的物种交叉反应性，进行若干实验，包括免疫沉淀法、抗体介导阻断IGF-I诱导的受体磷酸化及FACS分析。

为进行免疫沉淀实验，将细胞置于T25烧瓶中的补充有L-谷氨酰胺(0.29mg/ml)、10％热失活FBS及500μg/ml每一遗传霉素、青霉素及链霉素的DMEM高葡萄糖培养基中直至50％汇合。加入100μl本发明的抗体(1μg/ml浓度，汉克氏缓冲盐水溶液(HBSS；Gibco BRL)中)。在37℃的培育器中将该培养板培育30分钟且接着在室温下以100ng/ml的IGF-I来刺激细胞10分钟。在RIPA缓冲液(Harlow andLane，前述)中溶解细胞且在4℃时以2μg全特异性SC-713抗IGF-IR抗体(Santa Cruz)加上蛋白A琼脂糖小球来免疫沉淀IGF-IR1小时。将该小球沉淀且以PBS/T(PBS+0.1％Tween-20)洗涤三次且接着在40μl含有5％βME的Laemmli缓冲液中煮沸。

随后对如上述所制备的样本用western印迹法进行分析。将每个样本以每条泳道12μl荷载于4-10％梯度的Novex^TM凝胶上，且以1XMES的缓冲液(Novex^TM)来运行。凝胶以150V进行1小时或200V进行约30分钟。将凝胶转移至一膜上，该膜在含有10％甲醇的Novex^TM转移缓冲液中，以100mA过夜或以250mA持续1-1.5小时。该膜完全干燥且在室温下以含有Superblock(Pierce Chemical Co.)的TBS(Tris缓冲盐水pH8.0)来封闭。加入IGF-IR印迹抗体SC713(Santa Cruz)或磷酸酪氨酸抗体以分别地检测免疫沉淀的IGF-IR或磷酸-IGF-IR。

用本发明的抗体对各种动物细胞来进行此实验。抗体能够结合人类的IGF-IR，但不能结合犬与小鼠的IGF-IR。这些实验说明抗体具有高度特异性。

确定本发明的抗体的交叉物种亲和性

进行FACS分析以确定本发明的抗体对于其它动物的IGF-IR的亲和性，尤其是对于如上所术旧大陆猴。在冰上以增加浓度之本发明生物素化抗IGF-IR抗体来将人类及猴子细胞(猕猴)的等分试样(5×10⁵)培育1小时。在冰上以经链霉抗生物素蛋白缀合的RPE(藻红蛋白)将样本培育30分钟。通过流式细胞仪来测量结合且使用CellQuest软件以荧光强度(FI2-H)对细胞数量(计数)的直方图来分析结合。由平均荧光强度对抗体浓度的图表来计算每个抗体的结合(K_d)。在大多数实验中，在培养的人类MCF-7细胞与猕猴组织培养细胞中测量结合。通过测量一定细胞浓度范围的结合来控制抗体的消耗。

进行前述FACS分析以测试本发明的抗体结合人类与猕猴细胞的能力。观察到所有被测试细胞系的0.1μg/ml的半最大结合(K_d)。

实施例V：IGF-I受体下调作用

为研究本发明的抗体是否可诱导细胞上的IGF-1R的下调，将MCF7细胞置于T75烧瓶中补充有L-谷氨酰胺(0.29mg/ml)、10％热失活FBS、青霉素及链霉素的DMEM/F12培养基中至发生50％汇合。向细胞中加入本发明的抗体直至最终浓度1μg/ml。在37℃培育器中将培养板培育持续指定的小时且接着在50mM HEPES、pH7.4、10mM EDTA、150mM NaCl、1.5mM MgCl₂、1.6 mM NaVO₄、1％Triton X-100、1％甘油中溶解。使用全特异性SC-713抗IGF-IR抗体(Santa Cruz)通过western印迹法分析来确定细胞提取物中总IGF-1R的水平。参阅图6B。以本发明的抗体来处理MCF7细胞导致1-2小时的IGF-1R的60-70％的下调。

实施例VI：本发明的抗体对于活体内IGF-IR的效应

进行实验以确定本发明的抗体对于如先前实施例中所述的IGF-IR的效应是否可以体内发生。根据公开的方法(V.A.Pollack等人，“Inhibition of epidermal growth factorreceptor-associated tyrosine phosphorylation in humancarcinomas with CP-358，774：Dynamics of receptor inhibition insitu and antitumor effects in athymic mice，”J.Pharmacol.Exp.Ther.291：739-748(1999))在无胸腺的小鼠中诱导肿瘤。简言之，将IGF-IR转染的NIH-3T3细胞(5×10⁶)与0.2mlMatrigel制剂经皮下注射入3-4周龄的无胸腺(nu/nu)小鼠中。在建立的肿瘤(即，约400mm³)形成后接着将本发明的抗体经腹膜内注射入小鼠中。

24小时后，将肿瘤进行提取、均匀化、并确定IGF-IR的水平。为确定IGF-IR的水平，在阻断缓冲液中将SC-713抗体稀释至一最终浓度μg/ml且在Reacti-Bind包被抗兔(GAR)包被的培养板(Pierce)的每孔中加入100μl。在室温下培育培养板1小时伴随振荡且接着以洗涤缓冲液洗涤5次。称重肿瘤样本。以溶解缓冲液稀释12.5μl肿瘤提取物至最终体积100μl。在96孔培养板的每孔中加入100μl的样本。室温下培育板1-2小时伴随振荡且接着以洗涤缓冲液洗涤5次。每孔中加入100μl阻断缓冲液中的HRP-PY54或生物素化抗IGF-IR抗体且在室温下培育振荡30分钟。以洗涤缓冲液洗涤培养板5次并显色。每孔加入100μl TMB微孔底物以HRP-PY54探测从而显色培养板且显色随着加入100μl 0.9M H₂SO₄而停止。振荡10秒钟及测量OD_450nm来定量信号。将信号标准化为总蛋白质。通过以下程序来显色以抗IGF-1R抗体所探测的培养板：向每孔中加入100μl在阻断缓冲液中所稀释的链霉抗生物素蛋白-HRP，室温下振荡培育30分钟及接着如HRP-PY54所述继续。

观察到腹膜内注射本发明的抗体导致IGF-IR活性的抑制，如通过IGF-IR蛋白的减少所测量到的(图7)。此外，该抑制对所注射的抗体的剂量有反应(图7)。这些数据证实本发明的抗体能够以在体外所观察到的方式而在体内靶向IGF-IR。

实施例VII：3T3/IGF-IR细胞肿瘤的生长抑制(TGI)

测试本发明的的抗体以确定其是否能抑制肿瘤的生长。如上所述来诱导肿瘤(实施例VI)且当建立后形成可触知的肿瘤(即，6-9天内达到250mm³)。以单一0.20ml剂量的抗体经腹膜内注射来处理小鼠。使用Geran等人所建立的方法，“Protocols for screeningchemical agents and natural products against animal tumors andother biological systems，”Cancer Chemother.Rep.3：1-104，用游标卡尺跨越两条直径每三天量测肿瘤大且使用式(长度×[宽度]2)/2来计算体积。

在分析了本发明的抗体后可观察到仅用抗体单一处理抑制经IGF-IR转染之NIH-3T3细胞诱导肿瘤的生长(图8A)。此外，在用单一剂量7.5mg/kg静脉内供给的阿霉素的组合研究中，可观察到给予单一剂量抗体会增强阿霉素(一种已知的肿瘤生长抑制剂)的效力。阿霉素与本发明的抗体的组合表明相对于仅用抗体或阿霉素处理其肿瘤生长延迟了7天(图8B)。

实施例VIII：抗体水平与IGF-IR下调的关系

如实施例VI中所述在裸小鼠中诱导肿瘤。接着如实施例VI中所述以125μg抗体经腹膜内注射来处理小鼠。提取肿瘤且通过ELISA测量IGF-IR水平。图9显示了血清抗体水平与IGF-IR受体水平随时间的变化。实验证实抗体下调IGF-IR且IGF-IR抑制的程度与抗体的血清浓度成剂量比例。

实施例IX：结肠直肠细胞肿瘤的生长抑制

除了使用Colo 205细胞(ATCC CCL 222)以外，如实施例VI中所述在裸小鼠中诱导肿瘤。Colo 205细胞为人类结肠直肠腺癌细胞。如实施例VII中所述，用各种量的抗体(i.p.)或用100mg/kg 5-氟脱氧尿苷(5-FU，i.v.)以单一试剂或组合形式来处理已建立约250mm³的皮下肿瘤的小鼠。图10A与图10B显示肿瘤大小与各种处理随时间的变化关系。该实验表明：当以单一试剂提供时，抗IGF-IR抗体的给予一次的处理抑制人类结肠直肠癌细胞的生长且增强5-FU(一种已知的肿瘤抑制剂)的效力。

实例X：体内抗IGF-IR抗体的药物动力学

为评估抗IGF-IR抗体的药物动力学，将5mg/kg醋酸盐缓冲液中的抗体静脉内注射猕猴。在各个时间点收集猕猴的血清且在多至十周的时间内确定猴子中抗IGF-IR抗体的浓度。为定量功能性血清抗体水平，将人类IGF-IR(IGF-I-sR，R&D系统，Catalog#391GR)的细胞外功能域结合至96孔培养板。在检定培养板中加入猴子血清(1∶100至1∶15,000稀释)，由此每个样本将在标准曲线的线性范围内且在任何抗IGF-IR抗体将结合至IGF-I-sR的条件下培养样本。洗涤培养板之后，将经标记的抗人类IgG抗体加入至培养板中且在抗人类IgG抗体将结合至抗IGF-IR抗体的条件下培育。接着洗涤培养板并显色，且对照标准曲线与线性回归拟合用于定量抗IGF-IR抗体的量。图11显示血清中抗体浓度随时间的变化。该实验表明：抗IGF-IR抗体的半衰期(t_1/2)为6.1天且其具有0.054(L/kg)的体积分布(Vdss)。

本说明书中所引用的所有公开与专利申请是以引用的方式并入本文中，该引用如同已特定地及个别地将各个公开或专利申请以引用的方式并入。虽然出于清楚与明晰的目的已通过说明与实施例的方式相当详细地叙述了先前发明，但本领域人员将易于了解根据本发明的教导可在不脱离附加的权利要求书的范围的精神与范畴情况下对其作出特定的修改与修饰。

序列表

<110>Pfizer Products Inc

<120>经修饰的人IGF-IR抗体

<130>PC25231A

<160>6

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1413

<212>DNA

<213>2.12.1 FX

<400>1

atggagtttg ggctgagctg ggttttcctt gttgctatta taaaaggtgt ccagtgtcag 60

gtgcagctgg tggagtccgg gggaggcttg gtcaagcctg gagggtccct gagactctcc 120

tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgac tactatatga gctggatccg ccaggctcca 180

gggaaggggc tggaatgggt ttcatacatt agtagtagtg gtagtaccag agactacgca 240

gactctgtga agggccgatt caccatctcc agggacaacg ccaagaactc actgtatctg 300

caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgtgag agatggagtg 360

gaaactactt tttactacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 420

accgtctcct cagcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg 480

agcacctccg agagcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 540

gtgacggtgt cgtggaactc aggcgctctg accagcggcg tgcacacctt cccagctgtc 600

ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcaacttc 660

ggcacccaga cctacacctg caacgtagat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 720

acagttgagc gcaaatgttg tgtcgagtgc ccaccgtgcc cagcaccacc tgtggcagga 780

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840

gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcca gttcaactgg 900

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cacgggagga gcagttcaac 960

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gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080

aaaaccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140

atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1200

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac acctcccatg 1260

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413

<210>2

<211>728

<212>DNA

<213>2.12.1 FX

<400>2

atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctggtt cccaggtgcc 60

aggtgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 120

gtcaccatca cttgccgggc aagtcaggac attagacgtg atttaggctg gtatcagcag 180

aaaccaggga aagctcctaa gcgcctgatc tatgctgcat cccgtttaca aagtggggtc 240

ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg acagaattca ctctcacaat cagcagcctg 300

cagcctgaag attttgcaac ttattactgt ctacagcata ataattatcc tcggacgttc 360

ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 420

ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480

ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 540

tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600

ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660

cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta gtgacccggg 720

aacgaccg 728

<210>3

<211>470

<212>PRT

<213>2.12.1 FX

<400>3

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Ile Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Arg Asp Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

Ser Leu Tyr Leu Gln Mer Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asn Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Val Glu Thr Thr Phe Tyr Tyr Tyr Tyr

115 120 125

Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

145 150 155 160

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asn Tyr

165 170 175

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180 185 190

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

195 200 205

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

210 215 220

Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asn Lys

225 230 235 240

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

245 250 255

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

260 265 270

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

275 280 285

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

290 295 300

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

305 310 315 320

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

325 330 335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lvs Gly Leu Pro

340 345 350

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

355 360 365

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

370 375 380

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

385 390 395 400

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

405 410 415

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

420 425 430

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

435 440 445

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

450 455 460

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210>4

<211>473

<212>PRT

<213>2.12.1

<400>4

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Ile Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Arg Phe Leu Glu Trp Leu Leu Tyr Tyr

115 120 125

Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

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Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

145 150 155 160

Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

165 170 175

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

180 185 190

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

195 200 205

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly

210 215 220

Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

225 230 235 240

Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys

245 250 255

Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

260 265 270

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

275 280 285

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Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

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Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His

325 330 335

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

340 345 350

Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln

355 360 365

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

370 375 380

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

385 390 395 400

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

405 410 415

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

420 425 430

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435 440 445

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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210>5

<211>236

<212>PRT

<213>2.12.1 FX

<400>5

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

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65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr

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Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln

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His Asn Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu le

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Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

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Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

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Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

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Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

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Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210>6

<211>236

<212>PRT

<213>2.12.1

<400>6

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

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Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr

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Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

130 135 140

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

145 150 155 160

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

165 170 175

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

180 185 190

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

195 200 205

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

210 215 220

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

Claims

1.一种人类单克隆抗体或其抗原结合部分，其在选定位置上包含至少一个经对应种系氨基酸残基置换的突变氨基酸残基。

2.权利要求1的人类抗体或其抗原结合部分，其中该经置换残基是包含于该抗体可变区的构架区的体细胞突变。

3.权利要求2的人类抗体或抗原结合部分，其中该人类抗体或其抗原结合部分可特异性地结合至人类胰岛素样生长因子1受体(IGF-IR)。

4.权利要求3的人类抗体或其抗原结合部分，其中轻链的可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO：5的氨基酸编号23至130。

5.权利要求4的人类抗体，其中该轻链包含SEQ ID NO：5的氨基酸编号23至236。

6.权利要求4的人类抗体或其抗原结合部分，其中重链的可变区包含SEQ ID NO：3的氨基酸编号20至144。

7.权利要求6的人类抗体，其中该重链包含SEQ ID NO：3的氨基酸编号20至470，而该轻链包含SEQ ID NO：5的氨基酸编号23至236。

8.权利要求6的人类抗体，其中该抗体的重链是由SEQ ID NO：3的氨基酸编号20至470组成，而该轻链是由SEQ ID NO：5的氨基酸编号23至236组成。

9.一种用于治疗癌症的药物组合物，其包含权利要求1-8中任一项的抗体或其抗原结合部分及医药学上可接受的载体。

10.权利要求9的药物组合物，其进一步包含抗癌剂、化学治疗剂或抗肿瘤剂。

11.用权利要求1-8中任一项的人类抗体或其抗原结合部分治疗人类癌症的方法，其包括向人类施用治疗所述癌症有效量的所述抗体的步骤。

12.一种经分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1-8中任一项的抗体的重链或其抗原结合部分或轻链或其抗原结合部分的核酸序列。

13.一种载体，其包含权利要求12的经分离的核酸分子。

14.一种宿主细胞，其包含权利要求13的载体。

15.一种制备单克隆抗体或其抗原结合部分的方法，其包括培养权利要求14的宿主细胞及回收该抗体。