NL1026829C2

NL1026829C2 - Gemodificeerde humane IGF-1R-antilichamen.

Info

Publication number: NL1026829C2
Application number: NL1026829A
Authority: NL
Inventors: Vahe Bedian; Bruce David Cohen
Original assignee: Pfizer Prod Inc
Priority date: 2003-08-13
Filing date: 2004-08-12
Publication date: 2005-07-05
Also published as: WO2005016967A2; WO2005016967A3; RS20060099A; DK1656391T3; EP1656391A2; DE602004029581D1; CN1835975B; KR100825156B1; AR045247A1; MA27988A1; US7575746B2; IL173273A; US20080181891A1; CA2535071A1; US7371378B2; US20050069539A1; TWI294915B; CN1835975A; PA8608801A1; AP2006003510A0

Description

5 GEMODIFICEERDE HUMANE IGF-1R-ANTILICHAMEN

ACHTERGROND VAN DE UITVINDING

Insulineachtige groeifactor (IGF-I) is een polypepti-de van 7,5 kDa dat in hoge concentraties in plasma circu-10 leert en detecteerbaar is in de meeste weefsels. IGF-I stimuleert celdifferentiatie en celproliferatie, en is voor de meeste zoogdierceltypes nodig voor duurzame proliferatie. Deze celtypes zijn onder meer humane diploïde fi-broblasten, epitheelcellen, gladde-spiercellen, T-15 lymfocyten, neurale cellen, myeloïdcellen, chondrocyten, osteoblasten en beenmergstamcellen.

De eerste stap in de transductieroute die leidt tot IGF-I-gestimuleerde celproliferatie of -differentiatie is binding van IGF-I of IGF-II (of insuline in suprafysiolo-20 gische concentraties) aan de IGF-I-receptor. De IGF-I-receptor is opgebouwd uit twee typen subeenheden: een al-fasubeenheid (een eiwit van 130-135 kDa dat volledig ex-tracellulair is en dat betrokken is bij de ligandbinding) en een bètasubeenheid (een transmembraaneiwit van 95 kDa, 25 met transmembraan- en cytoplasmatische domeinen). De IGF-IR behoort tot de familie van tyrosinekinasegroeifactorre-ceptoren (Ullrich et al., Cell 61: 203-212, 1990), en is structureel vergelijkbaar met de insulinereceptor (Ullrich et al., EMBO J. 5: 2503-2512, 1986). De IGF-IR wordt in 30 eerste instantie gesynthetiseerd als een enkelvoudige-keten-proreceptor-polypeptide, dat door middel van glyco-sylering, proteolytische klieving, en covalente binding wordt verwerkt om zo te assembleren tot een volwassen he-terotetrameer van 460 kDa die twee alfasubeenheden en twee 35 bètasubeenheden bevat. De bètasubeenheden bezitten ligand-geactiveerde tyrosinekinaseactiviteit. Deze activiteit speelt een rol in de signaleringsroutes die ligandwerking 10268-29- 2 mediëren, welke autofosforylering van de bètasubeenheid en fosforylering van IGF-IR-substraten omvatten.

Er is een aanzienlijke hoeveelheid aanwijzingen voor een rol van IGF-I en/of IGF-IR bij de handhaving van tu-5 morcellen in vitro en in vivo. IGF-IR-gehaltes zijn verhoogd in tumoren van de long (Kaiser et al., J. Cancer Res. Clin Oncol. 119: 665-668,1993; Moody et al., Life

Sciences 52: 1161-1173, 1993; Macauley et al., Cancer

Res., 50: 2511-2517, 1990), de borst (Pollak et al., Can-10 eer Lett. 38: 223-230, 1987; Foekens et al., Cancer Res. 49: 7002-7009, 1989; Cullen et al., Cancer Res. 49: 7002-7009, 1990; Arteaga et al., J. Clin. Invest. 84: 1418-1423, 1989), de prostaat en de colon (Remaole-Bennet et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 75: 609-616, 1992; Guo et 15 al., Gastroenterol. 102: 1101-1108, 1992). Gedereguleerde expressie van IGFI in prostaatepitheel leidt tot neoplasie in transgene muizen (DiGiovanni et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3455-60, 2000). Daarnaast Lijkt IGF-I een au-tokriene stimulator te zijn van humane gliomen (Sandberg-20 Nordqvist et al., Cancer Res. 53: 2475-2478, 1993), terwijl IGF-I de groei van fibrosarcomen die IGF-IR tot over-expressie brachten stimuleerde (Butler et al., Cancer Res. 58: 3021-27, 1998).Verder hebben individuen met "hoge normale" niveaus aan IGF-I een verhoogd risico op veel voor-25 komende kankers in vergelijking tot individuen met IGF-I-niveaus in het "lage normale" bereik (Rosen et al., Trends Endocrinol. Metab. 10: 136-41, 1999) . Zie voor een overzichtsartikel aangaande de rol die IGF/IGF-I-receptor-wisselwerking speelt bij de groei van een verscheidenheid 30 aan humane tumoren Macaulay, Br. J. Cancer, 65: 311- 320,1992.

Voedselbeperking is de meest effectieve en reproduceerbare interventie voor het vergroten van de levensduur in een verscheidenheid van diersoorten, waaronder zoogdie-35 ren. Het is ook het meest potente breed werkzame kanker-preventieregime in experimentele carcinogenesemodellen. Een biologisch sleutelmechanisme dat ten grondslag ligt 10268-29- 3 aan veel van de gunstige effecten hiervan is de insuline-achtige-groeifactor-l-route (Hursting et al., Annu. Rev. Med. 54:131-52, 2003).

EP0629240B1 heeft betrekking op de omzetting van een 5 antilichaamsequentie, door middel van recombinant-DNA-technologie, in een kiemlijnsequentie, in een poging de immunogeniciteit te verlagen bij toediening aan een patiënt. W002/066058A1 heeft betrekking op antilichamen die zijn gericht op de EGF-receptor (HER1) die op andere wijze 10 zijn gemodificeerd om hun geneigdheid tot het opwekken van een immuunrespons te verlagen.

Gezien de rollen die IGF-I en IGF-IR spelen in ziekten zoals kanker en andere proliferatieve aandoeningen wanneer IGF-I en/of IGF-IR tot overexpressie worden ge-15 bracht, en de rollen die een gebrek aan IGF-I en IGF-IR spelen in aandoeningen wanneer IGF-I en/of IGF-IR tot on-derexpressie worden gebracht, is het wenselijk om antilichamen tegen IGF-IR te genereren die zouden kunnen worden gebruikt om IGF-IR hetzij te remmen of te stimuleren. Der-20 gelijke antilichamen zijn bijvoorbeeld beschreven in WO 02/05359, gepubliceerd op 11 juli 2002. De tekst van deze publicatie, inclusief alle beschreven sequenties wordt bij referentie hier in opgenomen. IGFIR-antilichamen zijn ook beschreven in WO 03/100008, gepubliceerd op 4 december 25 2003, WO 03/106621, gepubliceerd op 24 december 2003, en WO 03/59951, gepubliceerd op 24 juli 2003.

SAMENVATTING VAN DE UITVINDING

De onderhavige uitvinding verschaft een gemodificeerd 30 humaan monoklonaal antilichaam of een antigeenbindend gedeelte daarvan, waarin ten minste één somatisch gemuteerde aminozuursequentie wordt omgezet in een kiemlijnaminozuur-sequentie. Bij voorkeur bevindt de vervangen aminozuurrest zich in een variabel gebied van het antilichaam en meer 35 bij voorkeur bevindt de vervangen aminozuurrest zich in een raamwerkgebied van het variabele gebied.

102 6 $29 5 4

In één aspect heeft de uitvinding betrekking op een humaan monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan dat specifiek bindt aan humane insulineachtige groeifactor-I-receptor (IGF-IR), dat ten minste één gemu-5 teerde aminozuurrest bevat op een gekozen positie die is vervangen door een overeenkomstige kiemlijnaminozuurrest, waarbij het variabele gebied van de lichte keten amino-zuurnummers 23 tot en met 130 van aminozuursequentie SEQ ID NO: 5 bevat.

10 Bij voorkeur bindt het humane antilichaam of anti- geenbindende gedeelte van de onderhavige uitvinding specifiek aan humaan insulineachtige-groeifactor-I-receptor (IGF-IR).

In één uitvoeringsvorm bevat de sequentie van het va-15 riabele gebied van de lichte keten van het antilichaam drie raamwerkmutaties terugleidend naar een aminozuursequentie die wordt gecodeerd door een kiemlijn-A30-gen. In een voorkeursuitvoeringsvorm bevat het variabele gebied van de lichte keten de aminozuurnummers 23 tot en met 130 20 van aminozuursequentie van SEQ ID NO: 5. In een meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm bevat de lichte keten van het humane antilichaam de aminozuurnummers 23 tót en met 236 van SEQ ID NO: 5.

In een andere uitvoeringsvorm van de uitvinding bevat 25 de sequentie van het variabele gebied van een zware keten van het antilichaam twee raamwerkmutaties terugleidend naar de aminozuursequentie die wordt gecodeerd door een kiemlijn-DP-35-gen. In een voorkeursuitvoeringsvorm bevat het variabele gebied van de zware keten de aminozuurnum-30 mers 20 tot en met 144 van SEQ ID NO: 3. In een meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm bevat de zware keten van het humane antilichaam aminozuurnummers 20 tot en met 470 van SEQ ID NO: 3 en bevat de lichte keten aminozuurnummers 23 tot en met 236 van SEQ ID NO: 5.

35 In een andere uitvoeringsvorm mist de zware keten van het antilichaam van de uitvinding een terminaal lysine. In het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op een anti- !1026829* 5 lichaam waarin de zware keten aminozuurnummers 20 tot en met 469 van SEQ ID NO: 3 bevat en de lichte keten aminozuurnummers 23 tot en met 236 van SEQ ID NO: 5 bevat.

De uitvinding heeft ook betrekking op een farmaceu-5 tisch preparaat voor de behandeling van kanker waarbij het farmaceutische preparaat het gemodificeerde humane antili-chaam van de uitvinding bevat in combinatie met een anti-neoplastisch, chemotherapeutisch of antitumor-middel en een farmaceutisch aanvaardbare drager.

10 De uitvinding heeft ook betrekking op een werkwijze voor het behandelen van kanker in een mens met het humane antilichaam, omvattende de stap van toediening aan een mens van een hoeveelheid van het antilichaam die effectief is voor het behandelen van de kanker. In één uitvoerings-15 vorm heeft de uitvinding betrekking op een behandeling omvattende de stap van toediening van een antineoplastisch, antitumor-, antiangiogeen of chemotherapeutisch middel in combinatie met het antilichaam van de onderhavige uitvinding.

20 De uitvinding heeft ook betrekking op een werkwijze voor het behandelen van een patiënt die daaraan behoefte heeft, met het antilichaam, door toediening aan de patiënt van een effectieve hoeveelheid van het antilichaam. In één uitvoeringsvorm heeft de uitvinding betrekking op een be-25 handeling die de stap omvat van toediening van een antineoplastisch, antitumor-, antiangiogeen of chemotherapeutisch middel in combinatie met het antilichaam van de onderhavige uitvinding.

De uitvinding heeft ook betrekking op het gebruik van 30 het humane antilichaam of antigeenbindende gedeelte daarvan voor de bereiding van een geneesmiddel voor het behandelen van kanker bij een mens.

De uitvinding heeft ook betrekking op een geïsoleerd polynucleotide dat een nucleïnezuursequentie bevat die co-35 deert voor een zware keten of antigeenbindend gedeelte daarvan of een lichte keten of antigeenbindend gedeelte daarvan van het antilichaam van de onderhavige uitvinding.

10268-29“ 6

In één uitvoeringsvorm van de uitvinding verschaft de uitvinding ook een werkwijze voor het behandelen van een subject dat daaraan behoefte heeft, met een effectieve hoeveelheid van een nucleïnezuurmolecuul dat codeert voor de 5 zware en/of lichte keten of antigeenbindende gedeelten daarvan van een anti-IGF-IR-antilichaam.

De uitvinding verschaft een vector die het geïsoleerde nucleïnezuurmolecuul bevat en een gastheercel die de vector bevat. De uitvinding omvat verder een gastheercel 10 die een antilichaam produceert dat dezelfde aminozuurse-quenties heeft als de volwassen zware en lichte ketens van 2.12.lfx.

De uitvinding verschaft ook een werkwijze voor het op recombinante wijze produceren en kweken van het door het 15 nucleïnezuurmolecuul gecodeerde antilichaam.

De uitvinding heeft ook betrekking op diagnostische werkwijzen voor het diagnosticeren van de aanwezigheid of locatie van een IGF-IR tot expressie brengend weefsel met behulp van een anti-IGF-IR-antilichaam.

20

KORTE BESCHRIJVING VAN DE TEKENINGEN

Fig. 1 toont de DNA-sequentie die codeert voor de zware keten van antilichaam 2.12.lfx, inclusief de sequentie die codeert voor de signaalsequentie die wordt ge-25 bruikt om het volwassen antilichaam tot expressie te brengen (SEQ ID NO: 1).

Fig. 2 toont de DNA-sequentie die codeert voor de lichte keten van antilichaam 2.12.lfx, inclusief de sequentie die codeert voor de signaalsequentie die wordt ge-30 bruikt om het volwassen antilichaam tot expressie te brengen (SEQ ID NO: 2).

Fig. 3 toont een gelijkschikking van de aminozuurse-quentie van de zware keten van antilichaam 2.12.lfx (SEQ ID NO: 3) met die van kiemlijnsequentie DP-35 (3-11)/D3- 35 3/JH6 (SEQ ID NO: 4). De sequentie van antilichaam 2.12.lfx is weergegeven boven die van de kiemlijnsequentie. De signaalsequenties zijn cursief weergegeven en de I02ea29-ï 7 CDR's zijn onderstreept. Het constante-domein-gebied begint met de aminozuurresten ASTK en komt overeen met ami-nozuurresten beginnend bij 48 in de kiemlijn en loopt tot het einde van de sequentie. De raamwerkmutaties (FR) be-5 vinden zich bij aminozuurresten 21 en 116.

Fig. 4 toont een gelijkschikking van de aminozuurse-quentie van de lichte keten van antilichaam 2.12.1fx (SEQ ID NO: 5) met die van kiemlijnsequentie A30/Jkl (SEQ ID NO: 6). De sequentie van antilichaam 2.12.1fx is weergege-10 ven boven die van de kiemlijnsequentie. De signaalsequen-ties zijn cursief weergegeven en de CDR's zijn onderstreept. Het constante-domein-gebied begint met de aminozuurresten TVAA en komt overeen met aminozuurresten beginnend bij 131 in de kiemlijn en loopt tot het einde van de 15 sequentie. De raamwerkmutaties (FR) zijn de aminozuurresten 43, 125, en 129.

Fig. 5 laat zien dat anti-IGF-IR-antilichaam 2.12.1fx IGF-I-binding aan 3T3-IGF-IR-cellen remt.

Fig. 6A en 6B tonen het vermogen van antilichaam 20 2.12.1fx om IGF-I-gemedieerde activering van IGF-IR te blokkeren, zoals blijkt uit verlaagde receptor-geassocieerde tyrosinefosforylering (Fig. 6A) en het vermogen van antilichaam 2.12.1fx om de neerregulatie van IGF-IR op cellen te induceren (Fig. 6B).

25 Fig. 7 laat zien dat anti-IGF-IR-antilichaam 2.12.1fx het IGF-IR-niveau in 3T3-IGF-IR-tumoren verlaagt.

Fig. 8A en 8B laten zien dat anti-IGF-IR-antilichaam de 3T3-IGF-IR-tumorgroei in vivo remt, alleen (Fig. 8A) of in combinatie met adriamycine (Fig. 8B).

30 Fig. 9 toont de relatie tussen serumniveau van anti- IGF-IR-antilichaam 2.12.1fx en IGF-IR-neerregulatie in de tijd in 3T3-IGF-IR-tumoren.

Fig. 10A en 10B laten zien dat anti-IGF-IR-antilichaam 2.12.1fx de Colo-205-tumorgroei in vivo remt, 35 alleen (Fig. 10A) of in combinatie met 5-fluordesoxyuridine (5FU) (Fig. 10B).

1026029* δ

Fig. 11 toont een farmaceutische evaluatie van een enkele intraveneuze injectie van anti-IGF-IR-antilichaam 2.12.1fx in Cynomolgus apen.

5 GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING

Alle octrooischriften, octrooiaanvragen en ander referenties die hier worden geciteerd worden hierbij in hun geheel hierin opgenomen.

Tenzij hierin anders gedefinieerd hebben wetenschap-10 pelijke en technische termen die worden gebruikt in verband met de onderhavige uitvinding de betekenissen zoals deze gebruikelijk zijn voor de deskundigen in het vakgebied. Verder omvatten, tenzij anderszins vereist door de context, enkelvoudige termen ook meervouden en meer-15 voudstermen ook het enkelvoud. In algemene zin zijn de nomenclaturen die worden gebruikt in verband met, en technieken van, cel- en weefselkweek, moleculaire biologie, immunologie, microbiologie, genetica en eiwit- en nucleï-nezuurchemie en hybridisatie die hierin worden beschreven 20 diegene die welbekend zijn en algemeen gebruikt worden in het vakgebied. De werkwijzen en technieken van de onderhavige uitvinding worden in het algemeen gebruikt volgen conventionele in het vakgebied wekbekende werkwijzen en zoals beschreven in verscheidene algemene en meer speci-25 fieke referenties die worden geciteerd en bediscussieerd in de onderhavige beschrijving, tenzij anders aangegeven. Zie bv. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2e ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) en Ausubel et al., Current Pro-30 tocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), en Harlow en Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), die hierin bij referentie zijn opgenomen. Enzymatische reacties en zuiveringstechnieken worden uitge-35 voerd volgens de specificaties van de fabrikant, zoals gewoonlijk uitgevoerd in het vakgebied, of zoals hierin beschreven. De nomenclaturen die worden gebruikt in verband 1026829- 9 met, en de laboratoriumwerkwijzen en technieken van, analytische chemie, synthetische organische chemie, en medicinale en farmaceutische chemie die hier wordt beschreven zijn degene die welbekend zijn en algemeen gebruikt worden 5 in het vakgebied. Standaardtechnieken worden gebruikt voor chemische syntheses, chemische analyses, farmaceutische bereiding, formulering, en aflevering, en behandeling van patiënten.

De volgende termen hebben tenzij anders aangegeven, 10 de navolgende betekenissen:

De term "polypeptide" omvat natieve of artificiële eiwitten, eiwitfragmenten en polypeptideanalogen van een eiwitsequentie. Een polypeptide kan monomeer of polymeer zijn.

15 Niet-peptide analogen worden algemeen gebruikt in de farmaceutische industrie als geneesmiddelen met eigenschappen die analoog zijn aan die van het templatepeptide. Deze typen niet-peptide-verbindingen worden "peptidemime-tica" of peptidomimetica" genoemd. Fauchere, J. Adv. Drug 20 Res. 515:29 (1986); Veber en Freidinger, TINS p.392 (1985); en Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987), welke hier bij referentie zijn opgenomen. Dergelijke verbindingen zijn dikwijls ontworpen met behulp van gecomputeriseerde moleculaire modellering. Peptidemimetica die 25 structureel vergelijkbaar zijn met therapeutisch bruikbare peptiden kunnen worden gebruikt om een vergelijkbaar therapeutisch of profylactisch effect te produceren. In het algemeen zijn peptidomimetica structureel vergelijkbaar met een paradigmapolypeptide (i.e. een polypeptide dat de 30 gewenste biochemische eigenschap of farmacologische activiteit bezit), zoals een humaan antilichaam, maar hebben één of meer peptidebindingen optioneel vervangen door een koppeling gekozen uit de groep die bestaat uit: —CH2NH—, —CH2S—, —CH2-CH2—, —CH=CH—(cis en trans), —COCH2—, -35 -CH(OH)CH2, en —CH2S0—, door middel van in het vakgebied welbekende werkwijzen. Systematische substitutie van één of meer aminozuren van een consensussequentie, met een D- «026829“ 10 aminozuur van hetzelfde type (bv. D-lysine in plaats van L-lysine) kan ook worden gebruikt om stabielere peptiden te genereren. Daarnaast kunnen vouwingsbeperkte peptiden die een consensussequentie of een nagenoeg identieke con-5 sensussequentievariatie bevatten worden gegenereerd volgens in het vakgebied bekende werkwijzen (Rizo en Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61 :387 (1992), hierin bij referentie opgenomen); bijvoorbeeld door interne cysteïne-resten toe te voegen die in staat zijn intramoleculaire 10 disulfidebruggen te vormen die het peptide cycliseren.

Een "immunoglobuline" is een tetrameer molecuul. In een in de natuur voorkomend immunoglobuline bestaat elke tetrameer uit twee identieke paren van polypeptideketens, waarbij elk paar bestaat uit één "lichte" (ongeveer 25 15 kDa) en één "zware" (ongeveer 50-70 kDa) keten. Het amino-terminale gedeelte van elke keten bevat een variabel gebied van ongeveer 100 tot 110 of meer aminozuren dat primair verantwoordelijk is voor antigeenherkenning. Het car-boxyterminale gedeelte van elke keten definieert een con-20 stat gebied dat primair verantwoordelijk is voor effector-werking. Humane lichte ketens worden geclassificeerd als κ en λ lichte ketens. Zware ketens worden geclassificeerd als μ, Δ, γ, α of ε, en definiëren het isotype van het an-tilichaam als respectievelijk IgM, IgD, IgG, IgA, en IgE. 25 In lichte en zware ketens zijn de variabele en constante gebieden aan elkaar gekoppeld via een "J"-gebied van ongeveer 12 of meer aminozuren, terwijl de zware ketens ook een "D"-gebied bevatten van ongeveer 10 of meer aminozuren. Zie voor een algemeen overzicht Fundamental Immunolo-30 gy Hoofdst. 7 (Paul, W., red., 2e ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (hier bij referentie in zijn geheel opgenomen voor alle doeleinden). De variabele gebieden van elk licht/zwaar-ketenpaar vormen de bindingsplaats van het an-tilichaam zodat een intact immunoglobuline twee bindings-35 plaatsen bezit.

Immunoglobulineketens vertonen dezelfde algemene structuur van relatief geconserveerde raamwerkgebieden ,1026829* 11 (FR), die aan elkaar zijn gekoppeld via drie hypervariabe-le gebieden, die ook complementariteitsbepalende gebieden of CDR's worden genoemd. De CDR's van de twee ketens van elk paar worden naast elkaar geschikt door de raamwerkge-5 bieden, wat binding aan een specifieke epitoop mogelijk maakt. Van N-terminus tot C-terminus bevatten zowel de lichte als zware ketens de domeinen FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 en FR4. De toekenning van aminozuren aan elk domein is in overeenstemming met de definities van Kabat, 10 Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 en 1991)), of Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989).

De term "antilichaam" heeft betrekking op een intact 15 immunoglobuline. Antigeenbindende gebieden kunnen worden geproduceerd door middel van recombinant-DNA-technieken of door middel van enzymatische of chemische klieving van intacte antilichamen. Antigeenbindende gebieden zijn onder meer Fab, Fab', F(ab')2/ Fv, dAb, en complementariteitsbe-20 palend-gebiedfragmenten (CDR), enkelvoudige-keten- antilichamen (scFv), chimere antilichamen, dialichamen en polypeptide die ten minste een gedeelte van een immunoglobuline bevatten dat voldoende is om specifieke antigeen-binding aan het polypeptide te verschaffen.

25 Een Fab-fragment is een monovalent fragment dat be staat uit de VL-, VH-, CL- en CH-I-domeinen; een F(ah’)2“ fragment is een bivalent fragment dat twee Fab-fragmenten bevat die zijn gekoppeld door middel van een disulfidebrug in het scharniergebied; een Fd-fragment bestaat uit de VH-30 en CH1- domeinen; een Fv-fragment bestaat uit de VL- en VH-domeinen van een enkelvoudige arm van een antilichaam; en een dAb-fragment (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989) bestaat uit een VH-domein.

Een enkelvoudige-keten-antilichaam (scFv) is een an-35 tilichaam waarin een VL- en een VH-gebied zijn gepaard om zo een monovalent molecuul te vormen, via een synthetische koppelgroep die hen in staat stelt te worden gemaakt als ü026829’ 12

een enkelvoudige eiwitketen (Bird et al., Science 242:423-426, 1988 en Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA

85:5879-5883, 1988). Dialichamen zijn bivalente, specifieke antilichamen waarin VH- en VL-domeinen tot expressie 5 worden gebracht op een enkelvoudige polypeptideketen, maar waarbij een koppelgroep wordt gebruikt die te kort is om paring tussen de twee domeinen van dezelfde keten mogelijk te maken, waardoor de domeinen gedwongen worden te paren met complementaire domeinen van een andere keten en twee 10 antigeenbindingsplaatsen te creëren (zie bv. Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993, en Poljak, R. J., et al., Structure 2:1121-1123, 1994). Één of meer CDR's kunnen hetzij covalent of niet-covalent zijn opgenomen in een molecuul om het een immunoadhesine te ma-15 ken. Een immunoadhesine kan de CDR('s) bevatten als deel van een grotere polypeptideketen, kan de CDR('s) covalent aan een ander polypeptideketen gekoppeld bevatten, of kan de CDR('s) niet-covalent bevatten. De CDR's maken het mogelijk dat het immunoadhesine specifiek bindt aan een be-20 paald gekozen antigeen.

Een antilichaam kan één of meer bindingsplaatsen bezitten. Indien er meer dan één bindingsplaats is, dan kunnen de bindingsplaatsen identiek zijn aan elkaar of verschillend zijn. Een in de natuur voorkomend immunoglobuli-25 ne heeft bijvoorbeeld twee identieke bindingsplaatsen, een enkele-keten-antilichaam of Fab-fragment heeft één bindingsplaats, terwijl een "bispecifiek" of "bifunctioneel” antilichaam twee verschillende bindingsplaatsen heeft.

Een "geïsoleerd antilichaam” is een antilichaam dat 30 (1) niet geassocieerd is met van nature geassocieerde be standdelen, waaronder andere van nature geassocieerde antilichamen, die het vergezellen in zijn natieve toetand, (2) vrij is van andere eiwitten uit dezelfde species, (3) tot expressie wordt gebracht door een cel van een andere 35 species, of (4) niet voorkomt in de natuur. Voorbeelden van geïsoleerde antilichamen zijn onder meer een anti-IGF-IR-antilichaam dat is affiniteitsgezuiverd met behulp van 4026829' 13 IGF-IR, een anti-IGF-IR-antilichaam dat is gesynthetiseerd door een hybridoom- of andere cellijn in vitro, en een humaan anti-IGF-IR-antilichaam dat is verkregen uit een transgene muis.

5 De term "humaan antilichaam" omvat alle antilichamen die één of meer variabele en constante gebieden bevatten die zijn afgeleid van humane immunoglobulinesequenties. In een voorkeursuitvoeringsvorm zijn alle variabele en constante domeinen afgeleid van humane immunoglobulinesequen-10 ties (een volledig humaan antilichaam) . Deze antilichamen kunnen op verscheidene wijzen worden bereid, zoals hieronder beschreven.

Een "neutraliserend antilichaam" of een "remmend an-tilichaam" is een antilichaam dat de binding van IGF-IR 15 aan IGF-I remt wanneer een overmaat van Het anti-IGF-IR-antilichaam de hoeveelheid aan IGF-IR gebonden IGF-I verlaagt met ten minste ongeveer 20%. In een voorkeursuitvoeringsvorm verlaagt het antilichaam de hoeveelheid aan IGF-IR gebonden IGF-I met ten minste 40%, meer bij voorkeur 20 60%, nog meer bij voorkeur 80%, of nog meer bij voorkeur 85%. De bindingsreductie kan op elke in het vakgebied bekende wijze worden gemeten, bijvoorbeeld zoals in een competitief bindingsassay in vitro.

Een "activerend antilichaam" is een antilichaam dat 25 IGF-IR activeert met ten minste ongeveer 20% wanneer het aan een IGR-IR tot expressie brengende cel, weefsel of organisme wordt toegevoegd. In één voorkeursuitvoeringsvorm activeert het antilichaam de IGF-IR-activiteit met ten minste 40%, meer bij voorkeur 60%, nog meer bij voorkeur 30 80%, of nog meer bij voorkeur 85%. In een meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm wordt het activerende antilichaam toegevoegd in aanwezigheid van IGF-I of IGF-II. In een andere voorkeursuitvoeringsvorm wordt de activiteit van het activerende antilichaam gemeten door de hoeveel-35 heid tyrosineautofosforylering van IGF-IR te meten.

Fragmenten of analogen van antilichamen kunnen eenvoudig worden bereid door de vakman die de leringen van de 1026829' 14 onderhavige beschrijving volgt. Voorkeursamino- en -carboxytermini van fragmenten of analogen bevinden zich nabij grenzen van functionele domeinen. Structurele en functionele domeinen kunnen worden geïdentificeerd door 5 vergelijking van de nucleotide- en/of aminozuursequentie-gegevens met publieke of particuliere sequentiedatabanken.

Bij voorkeur worden gecomputeriseerde vergelijkingswerk-wijzen gebruikt om sequentiemotieven of voorspelde eiwit-conformatiedomeinen te identificeren die voorkomen in an- i 10 dere eiwitten met een bekende structuur en/of functie. Werkwijzen om eiwitsequenties te identificeren die vouwen in een bekende driedimensionale structuur, zijn bekend.

Bowie et al., Science 253: 164 (1991).

De term "oppervlakte-plasmonresonantie" heeft zoals 15 hier gebruikt betrekking op een optisch fenomeen dat de analyse van real-time biospecifieke wisselwerkingen mogelijk maakt door middel van detectie van veranderingen in eiwitconcentraties in een biosensormatrix, bijvoorbeeld met behulp van het BIAcore-systeem (Pharmacia Biosensor 20 AB, üppsala, Zweden en Piscataway, N.J.). Zie voor verdere beschrijvingen Jonsson, U., et al., (1993) Ann. Biol.

Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al., (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al., (1995) J. Mol. Recognit.

8:125-131; and Johnnson, B., et al., (1991) Anal. Biochem.

25 198:268-277.

De term "K0ff" heeft betrekking op de snelheidscon-stante voor dissociatie van een antilichaam van het anti-lichaam/antigeen-complex.

De term "Ka" heeft betrekking op de dissociatiecon-30 stante van een gegeven antilichaam-antigeen-wisselwerking

Zoals hier gebruikt volgen de twintig conventionele aminozuren en hun afkortingen het conventionele gebruik.

Zie Immunology - A Synthesis (2e Editie, E.S. Golub en D.R. Gren, Red., Sinauer Associates, Sunderland, Mass.

35 (1991)), die hierin bij referentie is opgenomen. Ste- reoisomeren (bv. D-aminozuren) van de twintig conventionele aminozuren, onnatuurlijke aminozuren zoals α,α- 1026829' 15 gedisubstitueerde aminozuren, N-alkyl-aminozuren, melkzuur, en andere onconventionele aminozuren kunnen ook geschikte bestanddelen zijn voor polypeptiden van de onderhavige uitvinding. Voorbeelden van onconventionele amino-5 zuren zijn onder meer: 4-hydroxyproline, y- carboxyglutamaat, ε-Ν,Ν,Ν-trimethyllysine, ε-Ν- acetyllysine, O-phosphoserine, N-acetylserine, N-formylmethionine, 3-methylhistidine, 5-hydroxylysine, s-N-methylarginine, en andere vergelijkbare aminozuren en imi-10 nozuren (e.g., 4-hydroxyproline). In de hier gebruikte po-lypeptidenotatie is de linkerrichting de aminoterminale richting en de rechterrichting de carboxyterminale richting, in overeenstemming met standaardgebruik en conventie .

15 De term "polynucleotide" betekent zoals hier gebruikt een polymere vorm van nucleotiden met een lengte van ten minste 10 basen, hetzij ribonucleotiden of desoxyribonu-cleotiden of een gemodificeerde vorm van één van deze typen nucleotide. De term omvat zowel enkel- als dubbel-20 strengsvormen van DNA.

De term "geïsoleerd polynucleotide" betekent zoals hier gebruikt een polynucleotide van genomische, cDNA- of synthetische oorsprong of een combinatie daarvan, dat krachtens zijn oorsprong (1) niet is geassocieerd met het 25 geheel of een gedeelte van een polynucleotide waarin het "geïsoleerde polynucleotide" wordt gevonden in de natuur, (2) werkzaam is gekoppeld aan een polynucleotide waaraan het niet gekoppeld is in de natuur, of (3) in de natuur niet voorkomt als deel van een grotere sequentie.

30 De hier gebruikte term "in de natuur voorkomende nu cleotiden" omvat desoxyribonucleotiden en ribonucleotiden. De hier gebruikte term "gemodificeerde nucleotiden" omvat nucleotiden met gemodificeerde of gesubstitueerde suiker-groepen en dergelijke. De hier gebruikte term "oligonucle-35 otidekoppelingen" omvat oligonucleotidekoppelingen zoals fosforothioaat, fosforodithioaat, fosforoselenoaat, fos-forodiselenoaat, fosforoanilothioaat, fosforaniladaat, I026829" 16 fosforoamidaat, en dergelijke. Zie bv. LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stee et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al., Nucl. Acids Resi

16:3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539 5 (1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A

Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, red., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stee et al., Amerikaans octrooischrift 5,151,510; Uhlmann en Peyman, Chemical Reviews 90:543 (1990), welke bij referentie hier-10 in zijn opgenomen. Een oligonucleotide kan indien gewenst een label bevatten voor detectie.

"Werkzaam gekoppelde" sequenties omvatten zowel ex-pressieregulatiesequenties die aaneensluiten aan het gekozen gen als expressieregulatiesequenties die in trans of 15 van een afstand werken om het gekozen gen te reguleren.

Zoals hier gebruikt heeft de term "expressieregulatiese-quentie" betrekking op polynucleotidesequenties die noodzakelijk zijn om de expressie en verwerking van coderende sequenties waaraan zij zijn geligeerd te bewerkstelligen. 20 Expressieregulatiesequenties zijn onder meer geschikte transcriptie-initiatie-, -terminatie-, -promoter-, en -versterkersequenties; efficiënte RNA-verwerkingssignalen zoals uitsplitsings- en polyadenyleringssignalen; sequenties die cytoplasmatisch mRNA stabiliseren; sequenties die 25 de translatie-efficiëntie versterken (i.e., Kozak- consensussequentie); sequenties die de eiwitstabiliteit versterken; en, indien gewenst, sequenties de eiwitsecre-tie versterken. De aard van dergelijke regulatiesequenties verschilt afhankelijk van het gastheerorganisme; in proka-30 ryoten omvatten de regulatiesequenties in het algemeen promoter, ribosoombindingsplaats, en transcriptietermina-tiesequentie; in eukaryoten omvatten dergelijke regulatiesequenties in het algemeen promoters en transcripttermina-tiesequentie. De term "regulatiesequenties" bedoelt mini-35 maal alle bestanddelen te omvatten.waarvan de aanwezigheid essentieel is voor expressie en verwerking, en kan ook andere bestanddelen omvatten waarvan de aanwezigheid voorde- 1026829^ 17 lig is, bijvoorbeeld leidersequenties en fusiepartnerse-quentïes.

Zoals hier gebruikt wordt met de term "vector” een nucleïnezuurmolecuul bedoeld dat in staat is tot het 5 transporteren van een ander nucleïnezuur waaraan het is gekoppeld. Èén type vector is een "plasmide", waarmee een circulaire dubbelstrengs DNA-lus wordt aangeduid waarin andere DNA-segmenten kunnen worden geligeerd. Een ander type vector is een virale vector, waarbij andere DNA-10 segmenten kunnen worden geligeerd in het virale genoom. Bepaalde vectoren zijn in staat tot autonome replicatie in een gastheercel waarin in zij zijn geïntroduceerd (bv. bacteriële vectoren met een bacteriële replicatieoorsprong en episomale zoogdiervectoren). Andere vectoren (bv. niet-15 episomale zoogdiervectoren) kunnen worden geïntegreerd in het genoom van een gastheercel na introductie in de gastheercel, en worden zo tegelijk met het gastheergenoom gerepliceerd. Bovendien zijn bepaalde vectoren in staat de expressie van genen waaraan zij werkzaam zijn gekoppeld te 20 sturen. Dergelijke vectoren worden hier aangeduid als "re-combinante expressievectór" (of eenvoudig "expressievecto-ren"). In het algemeen hebben expressievectoren die bruikbaar zijn in recombinant-DNA-technieken vaak de vorm van plasmiden. In de onderhavige beschrijving kunnen "piasmi-25 de" en "vector" onderling uitwisselbaar worden gebruikt, daar het plasmide de meest gebruikte vorm van vector is. De uitvinding bedoelt echter ook andere vormen van expressievectoren te omvatten zoals virale vectoren (bv. repli-catiedefecte retrovirussen, adenovirussen en adenogeasso-30 cieerde virussen), die een vergelijkbare functie hebben.

Zoals hier gebruikt wordt met de term "recombinante gastheercel" (of eenvoudigweg "gastheercel") een cel aangeduid waarin een recombinante expressievectór is geïntroduceerd. Er zij begrepen dat deze termen niet alleen be-35 trekking hebben op de betreffende cel maar ook op het nageslacht van zo’n cel. Omdat bepaalde modificaties kunnen optreden in opeenvolgende generaties als gevolg van hetzij 1026829*5 18 mutatie of omgevingsinvloeden, hoeft dit nageslacht niet identiek te zijn met de oudercel, maar valt het nog wel binnen de strekking van de term "gastheercel" zoals hier gebruikt.

5 Een referentie naar een nucleïnezuursequentie omvat tenzij anders aangegeven ook het complement ervan. Een referentie van een nucleïnezuurmolecuul met een bepaalde sequentie dient derhalve te worden begrepen ook de complementaire streng ervan, met zijn complementaire sequentie, 10 te omvatten.

Zoals hier. gebruikt hebben de termen "label" of "gelabeld" betrekking op inbouw van een ander molecuul in het antilichaam. In één uitvoeringsvorm is het label een detecteerbare merker, bv. inbouw van een radioactief gela-15 beid aminozuur of aanhechting aan een polypeptide van bio-tinylgroepen die kunnen worden gedetecteerd door middel van gemerkt avidine (bv. streptavidine dat een fluorescente merker bevat of enzymatische activiteit die kan worden gedetecteerd door middel van optische of colorimetrische 20 werkwijzen). In een andere uitvoeringsvorm kan het label of de merker therapeutisch zijn, bv, een geneesmiddelcon-jugaat of een toxine. Verscheidene werkwijzen voor het labelen van polypeptiden en glycoproteïnen zijn in het vakgebied bekend en kunnen worden gebruikt. Voorbeelden van 25 labels voor polypeptiden zijn onder meer: radioisotopen of radionucliden (bv. 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, mIn, 125I, 131I), fluorescente labels (bv. FITC, rhodamine, lantha-nidefosforen), enzymatische labels (bv. mierikswortelper-oxidase, β-galactosidase, luciferase, alkalisch fosfata-30 se), chemiluminescente merkers, biotinylgroepen, vooraf bepaalde polypeptide-epitopen die worden herkend door een secundaire reporter (bv. leucineritspaarsequenties, bin-dingsplaatsen voor secundaire antilichamen, metaalbin-dingsdomeinen, epitooplabels), magnetische middelen zoals 35 gadoliniumchelaten, toxinen zoals pertussistoxine, taxol, cytochalasine B, gramicidine D, ethidiumbromide, emetine, mitomycine, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblasti- t026829a 19 ne, colchicine, doxorubicine, daunorubicine, dihydroxyan-thracinedion, mitoxantrone, mithramycine, actinomycine D, 1-dehydrotestosteron, glucocorticoïden, procaïne, tetraca-ine, lidocaïne, propranolol, en puromycine en analogen of 5 homologen daarvan. In sommige uitvoeringsvormen worden labels vastgehecht via tussenstukken van een zekere lengte om potentiële sterische hindering te verminderen.

De term "middel" wordt hier gebruikt om een chemische verbinding, een mengsel van chemische verbindingen, een 10 biologisch macromolecuul, of een extract dat is gemaakt van biologische materialen aan te duiden. Zoals hier gebruikt heeft de term "farmaceutisch middel of geneesmiddel" betrekking op een chemische verbinding of preparaat dat in staat is een gewenst therapeutisch effect te indu-15 ceren wanneer het op een juiste wijze wordt toegediend aan een patiënt. Andere hier gebruikte chemische termen worden gebruikt volgens conventioneel gebruik in het vakgebied, zoals beschreven in The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., red., McGraw-Hill, San Francisco 20 (1985)), hierin bij referentie opgenomen).

De term "antineoplastisch middel" wordt hier gebruikt om middelen aan te duiden die de functionele eigenschap bezitten van remming van een ontwikkeling of progressie van een neoplasma in een mens, in het bijzonder een malig-25 ne (kanker-) lesie, zoals een carcinoom, sarcoom, lymfoom, of leukemie. Remming van metastase is dikwijls een eigenschap van antineoplastische middelen.

Het antilichaam kan een IgG-, een IgM-, een IgE-, een IgA- of een IgD-molecuul zijn. In een voorkeursuitvoe-30 ringsvorm is het antilichaam een IgG en is een IgGl-, IgG2-, IgG3- of IgG4-subtype. In een meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm behoort het anti-IGF-IR tot subklasse IgG2.

De klasse en subklasse van anti-IGF-IR-antilichamen 35 kan worden bepaald volgens elke in het vakgebied bekende werkwijze. In het algemeen kunnen de klasse en subklasse van een antilichaam worden bepaald met behulp van antili- / 1026829- 20 chamen die specifiek zijn voor een bepaalde klasse en subklasse antilichamen. De antilichamen zijn commercieel verkrijgbaar. De klasse en subklasse kunnen worden bepaald door middel van ELISA, Western-Blot of andere technieken.

5 Anderzijds kunnen de klasse en subklasse worden bepaald door het geheel of een gedeelte van de constante domeinen van de zware en/of lichte ketens van de antilichamen te bepalen, hun aminozuursequenties te vergelijken met de bekende aminozuursequenties van verschillende klassen en 10 subklassen van immunoglobulinen, en de klasse en subklasse van de antilichamen te bepalen.

De uitvinding verschaft ook een anti-IGF-IR-antilichaam dat variabele sequenties omvat die worden gecodeerd door een humaan κ-gen. In een voorkeursuitvoe-15 ringsvorm worden de variabele sequenties gecodeerd door de VK-A27-, -A30-, of -012-genfamilie. In een voorkeursuit voeringsvorm worden de variabele sequenties gecodeerd door een humaan VK-A30-gen. In een meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm bevat de lichte keten drie raamwerkmuta-20 ties terugleidend naar een aminozuursequentie die wordt gecodeerd door de kiemlijnsequentie. SEQ ID NO: 1 ver schaft de DNA-sequentie van de zware keten van 2.12.1fx. SEQ ID NO: 2 verschaft de DNA-sequentie van de lichte keten van 2.12.1fx. SEQ ID NO: 3 verschaft de aminozuurse-25 quentie van de zware keten van 2.12.1fx. SEQ ID NO: 4 verschaft de aminozuursequentie van kiemlijn DP-35. SEQ ID NO: 5 verschaft de aminozuursequentie van de lichte keten van 2.12.1fx en SEQ ID NO: 6 verschaft de aminozuursequentie van kiemlijn A30/Jkl. De weergegeven sequenties zijn 30 voor de onvolwassen voorlopers van de antilichamen, die een signaalsequentie bevatten.

In één uitvoeringsvorm omvat het anti-IGF-IR-antilichaam variabel-gebied-sequenties die worden gecodeerd door de humane VH DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 of VIV-35 4/4.35 genfamilie. In een voorkeursuitvoeringsvorm is de variabel-gebied-sequentie afgeleid van een humaan VH DP-35-gen. In een meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm 1026829- 21 bevat de zware keten twee raamwerkmutaties terugleidend naar de aminozuursequentie die wordt gecodeerd door de kieralijnsequentie.

Nucleïnezuurmoleculen die coderen voor het anti-IGF-5 IR-antilichaam van de uitvinding worden verschaft.

In één uitvoeringsvorm is het nucleïnezuurmolecuul dat codeert voor het variabele gebied van de lichte keten afgeleid van het A30-, A27- of 012-VK-gen. In een voorkeursuitvoeringsvorm is de lichte keten afgeleid van het 10 A30-VK-gen. In een andere voorkeursuitvoeringsvorm bevat het nucleïnezuurmolecuul dat codeert voor de lichte keten het koppelgebied dat is afgeleid van JkI, Jk2 of Jk4.

De uitvinding verschaft ook een nucleïnezuurmolecuul dat een nucleïnezuursequentie bevat die codeert voor de 15 aminozuursequentie van het variabele gebied van de lichte keten van 2.12.1fx.

De uitvinding verschaft ook een nucleïnezuurmolecuul dat codeert voor het variabele gebeid van de zware keten (VH) die is afgeleid van het DP-35-, DP-47-, DP-71- of 20 VIV-4/4.45-VH-gen, bij voorkeur het DP-35-VH-gen. In een andere voorkeursuitvoeringsvorm bevat het nucleïnezuurmolecuul dat codeert voor het VH het koppelgebied afgeleid van JH6 of JH5, meer bij voorkeur JH6. De uitvinding verschaft ook een nucleïnezuurmolecuul dat een nucleïnezuur-25 sequentie bevat die codeert voor de aminozuursequentie van het variabele gebied van de zware keten van 2.12.1fx.

Het nucleïnezuurmolecuul dat codeert voor één of beide gehele zware en lichte ketens van een humaan antili-chaam of de variabele gebieden daarvan kunnen worden ver-30 kregen uit elke bron die een humaan antilichaam produceert. Werkwijzen voor het isoleren van mRNA dat codeert voor een antilichaam zijn welbekend in het vakgebied. Zie bv. Sambrook et al., Het mRNA kan worden gebruikt om cDNA te produceren dat kan worden gebruikt in de polymeraseket-35 tingreactie (PCR) of cDNA-klonering van antilichaamgenen. In één uitvoeringsvorm van de uitvinding kunnen de nucleïnezuurmoleculen worden verkregen uit een hybridoom dat een 4026629- 22 anti-IGF-IR-antilichaam tot expressie brengen, zoals hierboven beschreven, bij voorkeur een hybridoom die als een van zijn fusiepartners een transgene dierlijke cel heeft die humane immunoglobulinegenen tot expressie brengt, zo-5 als een XENOMOUSE®4, niet-humaan muizen transgeen dier of een niet-humaan, niet-muis transgeen dier. IGF-IR-antilichamen kan in zijn algemeenheid betrekking hebben op humane antilichamen van de uitvinding anders dan die welke specifiek zijn voor IGF-IR.

10 Een nucleïnezuurmolecuul dat codeert voor de gehele zware keten van een anti-IGF-IR-antilichaam kan worden geconstrueerd door een nucleïnezuurmolecuul dat codeert voor het variabele domein van een zware keten of een antigeen-bindend domein daarvan te fuseren met een constant domein 15 van een zware keten. Evenzo kan een nucleïnezuurmolecuul dat codeert voor de lichte keten van een anti-IGF-IR-antilichaam worden geconstrueerd door een nucleïnezuurmolecuul dat codeert voor het variabele domein van een lichte keten of een antigeenbindend domein daarvan te fuseren 20 met een constant domein van een lichte keten. De nucleïne-zuurmoleculen die coderen voor de VH- en VL-keten kunnen worden omgezet tot complete antilichaamgenen door ze te inserteren in expressievectoren die reeds coderen voor constante gebieden van respectievelijk zware ketens en 25 lichte ketens, zodanig dat het VH-segment werkzaam is gekoppeld aan de constant-gebied-segmenten van de zware keten (CH) in de vector en het VL-segment werkzaam is gekoppeld aan de constant-gebied-segmenten van de lichte keten (CL) in de vector. Als alternatief kunnen de nucleïnezuur-30 moleculen die coderen voor de VH- of VL-ketens worden omgezet in complete antilichaamgenen door het nucleïnezuurmolecuul dat codeert voor een VH-keten te koppelen, bv. te ligeren, aan een nucleïnezuurmolecuul dat codeert voor een CH-keten, met behulp van standaard moleculair biologische 35 technieken. Hetzelfde kan worden bewerkstelligd met behulp van nucleïnezuurmoleculen die coderen voor VL- en CL-ketens. De sequenties van genen voor constante gebieden 1028829-! 23 van humane zware en lichte ketens zijn bekend in het vakgebied. Zie bv. Kabat et al., Sequences of Proteins of Im-munological Interest, 5e Ed., NIH Publ. Nr. 91-3242, 1991. Nucleïnezuurmoleculen die coderen voor de complete zware 5 en/of lichte ketens kunnen vervolgens tot expressie worden gebracht vanuit een cel waarin zij zijn geïntroduceerd, en het anti-IGF-IR-antilichaam kan worden geïsoleerd.

In een andere uitvoeringsvorm kan een nucleïnezuurmo-lecuul dat codeert voor de zware keten van een anti-IGF-10 IR-antilichaam of een antigeenbindend domein daarvan, of voor de lichte keten van een anti-IGF-IR-antilichaam of een antigeenbindend domein daarvan, worden geïsoleerd uit een niet-humaan, niet-muis dier dat humane immunoglobuli-negenen tot expressie brengt en dat is geïmmuniseerd met 15 een anti-IGF-IR-antigeen. In een ander uitvoeringsvorm kan het nucleïnezuurmolecuul worden geïsoleerd uit een anti-IGF-IR-antilichaam-producerende cel die afkomstig is van een niet-transgeen dier of van een humane patiënt die an-ti-IGF-IR-antilichamen produceert. Werkwijzen voor het 20 isoleren van mRNA uit de anti-IGF-IR-antilichaam-producerende cellen kan worden geïsoleerd door middel van standaard technieken, gekloneerd en/of geamplificeerd met behulp van PCR- en bibliotheekconstructietechnieken, en worden gescreend met behulp van standaardwerkwijzen om zo 25 nucleïnezuurmoleculen te verkrijgen die coderen voor zware en lichte anti-IGF-IR-ketens.

De nucleïnezuurmoleculen kunnen worden gebruikt om op recombinante wijze grote hoeveelheden anti-IGF-IR-antilichamen tot expressie te brengen, zoals hieronder be-30 schreven. De nucleïnezuurmoleculen kunnen ook worden gebruikt om enkelvoudige-keten-antilichamen, immunoadhesi-nen, dialichamen, gemuteerde antilichamen en antilichaam-derivaten te produceren, zoals hieronder beschreven.

In een andere uitvoeringsvorm kunnen de nucleïnezuur-35 moleculen van de uitvinding worden gebruikt als probes of PCR-primers voor specifieke antilichaamsequenties. Een nu-cleïnezuurmolecuulprobe kan bijvoorbeeld worden gebruikt 1026829- 24 in diagnostische werkwijzen, of een nuclelnezuurmolecuul-PCR-primer kan worden gebruikt om DNA-gebieden te amplifi-ceren die onder andere zouden kunnen worden gebruikt om nucleïnezuursequenties te isoleren die bruikbaar zijn voor 5 het produceren van variabele domeinen van anti-IGF-IR-antilichamen. In een voorkeursuitvoeringsvorm zijn de nu-cleïnezuurmoleculen oligonucleotiden. In een meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm zijn de oligonucleotiden afkomstig van zeer variabele gebieden van de zware en 10 lichte ketens van het betreffende antilichaam.

De uitvinding verschaft vectoren die de nucleïnezuur-moleculen van de uitvinding bevatten die coderen voor de zware keten of het antigeenbindende gedeelte daarvan. De uitvinding verschaft ook vectoren die de nucleïnezuurmole-15 culen van de uitvinding -bevatten die coderen voor de lichte keten of het antigeenbindende gedeelte daarvan. De uitvinding verschaft ook vectoren die nucleïnezuurmoleculen bevatten die coderen voor fusie-eiwitten, gemodificeerde antilichamen, antilichaamfragmenten, en probes daarvan.

20 Om de antilichamen of antilichaamgedeelten van de uitvinding tot expressie te brengen worden DNA's die coderen voor gedeeltelijke of complete lichte en zware ketens, verkregen zoals hierboven beschreven, geïnserteerd in ex-pressievectoren zodanig dat de genen werkzaam zijn gekop-25 peld aan transcriptionele en translationele regulatiese-quenties. Expressievectoren zijn onder meer plasmiden, re-trovirussen, cosmiden, YAC's, EBV-afgeleide episomen, en dergelijke. Het antilichaamgen is zodanig geligeerd in een vector dat transcriptionele en translationele regulatiese-30 quenties in de vector hun bedoelde functie van het reguleren van de transcriptie en translatie van het antilichaamgen kunnen uitoefenen. De expressievector en expressiere-gulatiesequenties worden zodanig gekozen dat zij compatibel zijn met de gebruikte expressiegastheercel. Het gen 35 voor de lichte antilichaamketen en het gen voor de zware antilichaamketen kunnen worden geïnserteerd in verschillende vectoren. In een voorkeursuitvoeringsvorm worden 1026829“ 25 beide genen geïnserteerd in dezelfde expressievector. De antilichaamgenen worden geïnserteerd in de expressievector door middel van standaard werkwijzen (bv. ligatie van complementaire restrictieplaatsen op het antilichaamgen en de 5 vector, of stomp-uiteinde-ligatie indien geen restrictieplaatsen aanwezig zijn).

Een bruikbare vector is een vector die codeert voor een functioneel complete humane CH- of CL-immunoglobulinesequentie, met geschikte restrictieplaatsen 10 die zodaning zijn ontworpen dat elke VH- of VL-sequentie eenvoudig kan worden geïnserteerd en tot expressie gebracht. In dergelijke vectoren vindt gewoonlijk uitsplitsing plaats tussen de uitsplitsingsdonorplaats in de geïn-serteerde J-gebied en de uitsplitsingsacceptorplaats die 15 voorafgaat aan het humane C-gebied, en ook bij de uit-splitsingsgebieden die optreden binnen de humane CH-exonen. Polyadenylering en transcriptieterminatie vinden plaats op natieve chromosomale plaatsen stroomafwaarts van de coderende gebieden. De recombinante expressievector kan 20 ook coderen voor een signaalpeptide dat uitscheiding van de antilichaamketen uit een gastheercel mogelijk maakt. Het signaalpeptide kan een immunoglobulinesignaalpeptide of een heteroloog signaalpeptide zijn (i.e. een signaalpeptide uit een niet-immunoglobuline-eiwit).

25 Naast de antilichaamketengenen bevatten de recombi nante expressievectoren van de uitvinding reguleringsse-quenties die de expressie van de antilichaamketengenen in een gastheercel reguleren. De vakman zal begrijpen dat het ontwerp van de expressievector, inclusief de selectie van 30 reguleringssequenties kan afhangen van factoren zoals de keuze van de te transformeren gastheercel, de gewenste mate van eiwitexpressie, enz. Voorkeursreguleringssequenties voor zoogdiergastheercelexpressie zijn onder meer virale elementen die leiden tot hoge eiwitexpressieniveaus in 35 zoogdiercellen, zoals promoters en/of enhancers die zijn afgeleid van retrovirale LTR's, cytomegalovirus (CMV) (zoals de CMV-promoter/enhancer), Simian Virus 40 (SV40) (zo- 10268292 26 als de SV40-promoter/enhancer), adenovirus, (bv. de majeu-re late promoter van adenovirus (AdMLP)), polyoom en sterke promoters uit zoogdieren zoals natieve immunoglobuline-en actinepromoters. Zie voor een verdere beschrijving van 5 virale reguleringselementen, en sequenties daarvan bv. Amerikaans octrooischrift 5,168,062 door Stinski, Amerikaans octrooischrift 4,510,245 door Bell et al., en Amerikaans octrooischrift 4,968,615 door Schaffner et al.

Naast de antilichaamketengenen en reguleringssequen-10 ties kunnen de recombinante expressievectoren van de uitvinding nog andere sequenties bevatten, zoals sequenties die de replicatie van de vector in gastheercellen reguleren (bv. replicatieoorsprongen) en selecteerbare merkerge-nen. Het selecteerbare merkergen vergemakkelijkt de selec-15 tie van gastheercellen waarin de vector is geïntroduceerd (zie bv. Amerikaanse octrooischriften 4,399,216, 4,634,665 en 5,179,017). Typischerwijs verschaft het selecteerbare merkergen bijvoorbeeld resistentie tegen geneesmiddelen, zoals G418, hygromycine of methotrexaat, aan een gastheer-20 cel waarin de vector is geïntroduceerd. Voorkeur genietende selecteerbare merkergenen zijn onder meer het gen voor dihydrofolaatreductase (DHFR) (te gebruiken in dhfr~-gastheercellen met methotrexaatselectie/amplificatie) en het neo-gen (voor G418-selectie).

25 Nucleïnezuurmoleculen die coderen voor de zware keten of een antigeenbindend gedeelte daarvan en/of de lichte keten of een antigeenbindend gedeelte daarvan, van een an-ti-IGF-IR-antilichaam van de uitvinding en vectoren die deze nucleïnezuurmoleculen bevatten kunnen worden gebruikt 30 voor transformatie van een geschikte gastheercel. Werkwijzen voor de introductie van heterologe polynucleotiden in zoogdiercellen zijn welbekend in het vakgebied en zijn onder meer dextrangemedieerde transfectie, calciumfosfaat-precipitatie, polybreengemedieerde transfectie, proto-35 plastfusie, elektroporatie, inkapseling van het/de polynu-cleotide(n) in liposomen, biolistische injectie en directe micro-injectie van het DNA in celkernen. Daarnaast kunnen 1026829- 27 nucleïnezuurmoleculen in zoogdiercellen worden geïntroduceerd door middel van virale vectoren. Werkwijzen voor het transformeren van cellen zijn welbekend in het vakgebied. Zie bv. Amerikaanse octrooischriften 4,399,216, 4,912,040, 5 4,740,461, en 4,959,455 (welke octrooischriften bij refe rentie hierin worden opgenomen).

Zoogdiercellijnen die beschikbaar zijn als gastheren voor expressie zijn welbekend in het vakgebied en zijn onder meer vele geïmmortaliseerde cellijnen die verkrijgbaar 10 zijn bij de American Type Culture Collection (ATCC) . Dit zijn onder meer Chinese hamsterovariumcellen (CHO), NSO, SP2-cellen, HeLa-cellen, babyhamsterniercelen (BHK), apen-niercellen (COS), humane hepatocellulair-carcinoomcellen (bv. Hep G2), A549-cellen, 3T3-cellen, en een aantal ande-15 re cellijnen. Zoogdiergastheercellen zijn onder meer humane, muizen-, ratten-, honden-, apen-, varkens-, geiten-, runder-, paarden- en hamstercellen. Cellijnen die in het bijzonder de voorkeur hebben worden geselecteerd door middel van bepaling welke cellijnen hoge expressieniveaus 20 vertonen. Andere cellijnen die kunnen worden gebruikt zijn insektencellijnen zoals Sf9-cellen, amfibiecellen, bacte-riecellen, plantencellen en fungale cellen. Wanneer recom-binante expressievectoren die coderen voor de zware keten of het antigeenbindende gedeelte daarvan, de lichte keten 25 en/of het antigeenbindende gedeelte daarvan, zijn geïntroduceerd in zoogdiergastheercellen, worden de antilichamen geproduceerd door de gastheercellen te kweken gedurende een bepaalde tijd die voldoet om expressie van het antili-chaam in de gastheercellen of, meer bij voorkeur, secretie 30 van het antilichaam in het kweekmedium waarin de gastheercellen worden gekweekt, mogelijk te maken. Antilichamen kunnen uit het kweekmedium worden gewonnen met behulp van standaardeiwitzuiveringswerkwijzen.

Verder kan expressie van antilichamen van de uitvin-35 ding (of andere groepen daarvan) door productiecellijnen worden versterkt met behulp van een aantal bekend etech-nieken. Het glutaminesynthetase-genexpressiesysteem (het 102Θ829* 28 GS-systeem) is bijvoorbeeld een gebruikelijke aanpak voor het versterken van expressie onder bepaalde omstandigheden. Het GS-systeem wordt geheel of gedeeltelijk beschreven in de Europese octrooischriften 0 216 846, 0 256 055, 5 en 0 323 997 en Europese octrooiaanvrage 89303964.4.

Het is waarschijnlijk dat antilichamen die tot expressie worden gebracht door verschillende cellijnen of in transgene dieren verschillend geglycosyleerd zullen zijn. Alle antilichamen die worden gecodeerd door de hier be-10 schreven nucleïnezuurmoleculen of die de hier beschreven aminozuursequenties bevatten maken echter deel uit van de onderhavige uitvinding, ongeacht de glycosylering van de antilichamen.

De uitvinding verschaft ook transgene niet-humane 15 dieren die één of meer nucleïnezuurmoleculen van de uitvinding bevatten en die kunnen worden gebruikt om antilichamen van de uitvinding te produceren. Antilichamen kunnen worden geproduceerd in en gewonnen uit weefsel of lichaamsvloeistoffen, zoals melk, bloed of urine, van gei-20 ten, koeien, paarden, varkens, ratten, muizen, konijnen, hamsters of andere zoogdieren Zie bv Amerikaanse octrooischriften 5827,690, 5,756,687, 5,750,172, en 5,741,957.

Zoals hierboven beschreven kunnen niet-humane transgene dieren die humane immunoglobulineloci bevatten worden ge-25 produceerd door immunisatie met IGF-IR of een gedeelte daarvan.

In een andere uitvoeringsvorm worden niet-humane transgene dieren geproduceerd door één of meer nuclelne-zuurmoleculen van de uitvinding in het dier te introduce-30 ren door middel van standaard transgene technieken. Zie

Hogan, supra. De transgene cellen die worden gebruikt voor het maken van het transgene dier kunnen embryonale stamcellen of somatische cellen zijn. De transgene niet-humane organismen kunnen chimere, niet-chimere heterozygoten, en 35 niet-chimere homozygoten zijn. Zie bv.Hogan et al., Mani-pulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2e ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mouse Ge- •1026829? 29 netics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford Uni-versity Press (2000); en Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academie Press (1999). In een andere uitvoeringsvorm kunnen de transgene niet-humane 5 organismen een gerichte disruptie en vervanging bevatten die codeert voor een gekozen zware keten en/of lichte keten. In een voorkeursuitvoeringsvorm bevatten de transgene dieren nucleïnezuurmoleculen die coderen voor zware en lichte ketens die specifiek binden aan IGF-IR, bij voor-10 keur humaan IGF-IR, en brengen deze tot expressie. In een andere uitvoeringsvorm bevatten de transgene dieren nucle-inezuurmoleculen die coderen voor een gemodificeerd anti-lichaam zoals een enkelvoudige-keten-antilichaam, een chi-meer antilichaam of een gehumaniseerd antilichaam. De an-15 ti-IGF-IR-antilichamen kunnen worden gemaakt in elk mogelijk transgeen dier. In een voorkeursuitvoeringsvorm zijn de niet-humane dieren muizen, ratten, schapen, varkens, geiten, runderen of paarden. Het niet-humane transgene dier brengt de door de nucleïnezuurmoleculen gecodeerde 20 polypeptiden tot expressie in bloed, melk, urine, speeksel, tranen, slijm en andere lichaamsvloeistoffen.

Recombinante humane antilichamen naast de hier beschreven anti-IGF-IR-antilichamen kunnen worden geïsoleerd door middel van screening van een recombinante combinatri- 25. ele antilichaambibliotheek, bij voorkeur een scFv-faagdisplaybibliotheek, bereid met gebruikmaking van humane VL-. en VH-cDNA's die zijn bereid uit mRNA dat is verkregen uit humane lymfocyten. Methodologieën voor het bereiden en screenen van dergelijk bibliotheken zijn bekend 30 in het vakgebied. Er zijn commercieel verkrijgbare kits voor het genereren van faagdisplaybibliotheken (bv. het Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, catalogusnr. 27-9400-01; en de Stratagene SurfZAP** faagdisplaykit, catalogusnr. 240612). Er zijn ook andere werkwijzen en rea-35 gentia die kunnen worden gebruikt bij het genereren en screenen van antilichaamdisplaybibliotheken (zie bv. Lad-ner et al., Amerikaans octrooischrift 5,223,409; Kang et 1026829* 30

al., PCT-publicatie nr. WO 92/18619; Dower et al., PCT-publicatie nr. WO 91/17271; Winter et al., PCT-publicatie nr. WO 92/20791; Markland et al., PCT-publicatie nr. WO 92/15679; Breitling et al., PCT-publicatie nr. WO

5 93/01288; McCafferty et al., PCT-publicatie nr. WO

92/01047; Garrard et al., PCT-publicatie nr. WO 92/09690; Fuchs et al., (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al., (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al., (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature 10 (1990) 348:552-554; Griffiths et al., (1993) EMBO J

12:725-734; Hawkins et al., (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clackson et al., (1991) Nature 352:624-628; Gram et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Gar-rad et al., (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom 15 et al., (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; en Barbas et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982.

In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt, om humane an-ti-IGF-IR-antilichamen met de gewenste eigenschappen te isoleren, een anti-IGF-IR-antilichaam zoals hierin be-20 schreven eerst gebruikt om sequenties van humane zware en lichte ketens met een vergelijkbare bindingsactiviteit ten opzichte van IGF-IR te selecteren, met gebruikmaking van de epitoopinprentingswerkwijzen beschreven in Hoogenboom et al., PCT-publicatie nr. WO/93/06213. De in deze werk-25 wijze gebruikte antilichaambibliotheken zijn bij voorkeur scFv-bibliotheken die zijn bereid en gescreend zoals beschreven in McCafferty et al., PCT-publicatie nr. WO 92/01047, McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; en Griffiths et al., (1993) EMBO J 12:725-734. De scFv-30 antilichaambibliotheken worden bij voorkeur gescreend met humaan IGF-IR als antigeen.

Nadat initiële humane VL- en VH-segmenten zijn geselecteerd worden "meng en paar"-experimenten waarin verschillende paren van de initieel geselecteerde VL- en VH-35 segmenten worden gescreend op IGF-IR-binding uitgevoerd om voorkeurs-VL/VH-paarcombinaties te selecteren. Daarnaast kunnen, om de kwaliteit van het antilichaam verder te ver- 1026829- 31 beteren de VL- en VH-segmenten van het/de voorkeurs-VL/VH-pa(a)r(en) random worden gemuteerd, bij voorkeur in het CDR3-gebied van VH en/of VL, in een proces dat analoog is aan het somatisch mutatieproces in vivo dat verantwoorde-5 lijk is voor affiniteitsrijping van antilichamen tijdens een natuurlijke immuunrespons. Deze in vitro- affiniteitsrijping kan worden bewerkstelligd door VH- en VL-gebieden te amplificeren met behulp van PCR-primers die complementair zijn aan respectievelijk het VH-CDR3 of het 10 VL-CDR3, en die zijn "gespiked" met een random mengsel van de vier nucleotidebasen op bepaalde plaatsen, zodat de resulterende PCR-producten coderen voor VL- en VH-sgmenten waarin random mutaties zijn geïntroduceerd in de CDR3- gebieden van VH en/of VL. Deze random gemuteerde VH- en VL-15 segmenten kunnen worden herscreend op binding aan IGF-IR.

Na screening en isolatie van een anti-IGF-IR-antilichaam van de uitvinding uit een recombinante immu-noglobulinedisplaybibliotheek, kunnen nucleïnezuren die coderen voor het geselecteerde antilichaam worden gewonnen 20 uit de displayverpakking (bv. uit het faaggenoom) en worden gesubkloneerd in andre expressievectoren door middel van standaard recombinant-DNA-technieken. Indien gewenst kan het nucleïnezuur verdér worden gemanipuleerd om andere antilichaamvormen van de uitvinding te creëren, zoals 25 hieronder beschreven. Om een recombinant humaan antilichaam dat is geïsoleerd door middel van screening van een combinatoriële bibliotheek tot expressie te brengen, wordt het DNA dat codeert voor het antilichaam gekloneerd in een recombinante expressievector en geïntroduceerd in zoog-30 diergastheercellen, zoals hierboven beschreven.

De klasse van een zoals hierboven beschreven verkregen anti-IGF-IR-antilichaam kan worden omgezet naar een andere. In één aspect van de uitvinding wordt een nucleï-nezuurmolecuul dat codeert voor VL of VH geïsoleerd met 35 behulp van in het vakgebied welbekende werkwijzen, zodanig dat het geen nucleïnezuren bevat die coderen voor CL of CH. Het nucleïnezuurmolecülen die coderen voor VL of VH

1023829- 32 worden vervolgens werkzaam gekoppeld aan een nucleïnezuur-seqqentie die codeert voor een CL of CH van een andere klasse van immunoglobulinemoleculen. Dit kan worden bewerkstelligd met behulp van een vector of nucleïnezuurmo-5 lecuul dat een CL- of CH-keten bevat, zoals hierboven beschreven. Een anti-IGF-IR-antilichaam dat oorspronkelijk IgM was kan bijvoorbeeld worden omgezet naar een IgG. Verder kan de klasseomzetting worden gebruikt om één IgG-subklasse om te zetten naar een andere, bv. van IgGl naar 10 IgG2. Een voorkeurswerkwijze voor het produceren van een antilichaam van de uitvinding dat een gewenst isotype heeft, omvat de stappen van het isoleren van een nucleïne-zuur dat codeert voor de zware keten van een anti-IGF-IR-antilichaam en een nucleïnezuur dat codeert voor de lichte 15 keten van een anti-IGF-IR-antilichaam, het verkrijgen van het variabele gebied van de zware keten, het ligeren van het variabele gebied van de zware keten met het constante domein van een zware keten van het gewenste isotype, het tot expressie brengen van de lichte keten en de geligeerde 20 zware keten in een cel, en het winnen van het anti-IGF-IR-antilichaam met het gewenste isotype.

De hierboven beschreven nuclelnezuurmoleculen kunnen worden gebruikt om antilichaamderivaten te genereren met behulp van in het vakgebied bekende technieken en werkwij-25 zen. Volgens de uitvinding worden dan één of meer gemuteerde aminozuurresten op (een) uitgekozen positie(s) vervangen door een overeenkomstige kiemlijnrest.

In een andere uitvoeringsvorm kan een fusieantili-chaam of immunoadhesine worden gemaakt dat het geheel of 30 een gedeelte van een anti-IGF-IR-antilichaam bevat, gekoppeld aan een ander polypeptide. In een voorkeursuitvoeringsvorm worden alleen de variabele gebeiden van het an-ti-IGF-IR-antilichaam gekoppeld aan het polypeptide. In een andere voorkeursuitvoeringsvorm wordt het VH-domein 35 van een anti-IGF-IR-antilichaam gekoppeld aan een eerste polypeptide, terwijl het VL-domein van een anti-IGF-IR-antilichaam wordt gekoppeld aan een tweede polypeptide dat 1026829- 33 met het eerste polypeptide op een zodanige wijze een binding aangaat dat de VH- en VL-domeinen wisselwerking kunnen hebben met elkaar om een antilichaambindingsplaats te vormen. In een andere voorkeursuitvoeringsvorm is het VH-5 domein van het VL-domein gescheiden door middel van een koppelgroep, zodanig dat de VH- en VL-domeinen wisselwerking kunnen hebben met elkaar. Het VH-koppelgroep-L-antilichaam wordt vervolgens gekoppeld aan het gekozen polypeptide. Het fusieantilichaam is bruikbaar om een poly-10 peptide naar een IGF-IR tot expressie brengende cel of weefsel te sturen. Het polypeptide kan een therapeutisch middel zijn, zoals een toxine, groeifactor of ander regu-leringseiwit, of kan een diagnostisch middel zijn, zoals een enzym dat eenvoudig kan worden gevisualideerd, zoals 15 mierikswortelperoxidase. Daarnaast kunnen fusie-antilichamen worden gecreëerd waarin twee (of meer) enkel-voudige-keten-antilichamen aan elkaar zijn gekoppeld. Dit is nuttig indien men een divalet of polyvalent antilichaam wil creëren op een enkelvoudige polypeptideketen, of in-20 dien men een bispecifiek antilichaam wil creëren.

Om een enkelvoudige-keten-antilichaam (scFv) te creëren worden de voor VH en VL coderende DNA-fragmenten weer-zaam gekoppeld aan een ander fragment dat codeert voor een flexibele koppelgroep, bv. voor de aminozuursequentie 25 (Gly4-Ser)3, zodat de VL- en VH-sequenties tot expressie kunnen worden gebracht als een aaneensluitend enkelvoudi-ge-keten-eiwit, waarbij de VL- en VH-gebieden aan elkaar zijn gekoppeld via de flexibele koppelgroep (zie bv. Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al., (1988) 30 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554). Het enkelvoudige-keten- antilichaam kan monovalent zijn, indien slechts één VH en VL worden gebruikt, bivalent, indien twee VH en VL worden gebruikt, of polyvalent, indien meer dan twee VH en VL 35 worden gebruikt.

In een andere uitvoeringsvorm kunnen andere gemodificeerde antilichamen worden bereid met behulp van voor an- 1026829- 34 ti-IGF-IR coderende nucleïnezuurmoleculen. Bijvoorbeeld kunnen "Kappa-lichamen" (111 et al., Protein Eng 10: 949-57 (1997)), "Minilichamen" (Martin et al., EMBO J 13:

5303-9 (1994)), "Dialichamen" (Holliger et al., PNAS USA

5 90: 6444-6448 (1993)), of "Janusinen" (Traunecker et al., EMBO J 10: 3655-3659 (1991) en Traunecker et al. "Janusin: new molecular design for bispecific reagents" Int J Cancer Suppl 7:51-52 (1992) worden bereid met behulp van stan daard moleculair biologische technieken volgens de lerin-10 gen van de beschrijving.

Een antilichaam of antilichaamgedeelte van de uitvinding kan worden gederivatiseerd of gekoppeld aan een ander molecuul (bv. een ander petide of eiwit). In het algemeen wordt het antilichaam of gedeelte daarvan zodanig gederi-15 vatiseerd dat de IGF-IR-binding niet nadelig wordt beïnvloedt door de derivatisering of labeling. Dienovereenkomstig omvatten de antilichamen en antilichaamgedeelten van de uitvinding zowel intacte en gemodificeerde vormen van de hierin beschreven humane anti-IGF-IR-antilichamen. Een 20 antilichaam of antilichaam gedeelte van de uitvinding kan bijvoorbeeld functioneel worden gekoppeld (door middel van chemische koppeling, genetische fusie, niet-covalente associatie of anderszins) aan één of meer andere moleculaire entiteiten, zoals een ander antilichaam (bv. een bispeci-25 fiek antilichaam of een dialichaam), een detectiemiddel, een cytotoxisch middel, een farmaceutisch middel, en/of een eiwit of peptide dat associatie van het antilichaam of antilichaamgedeelte met een ander molecuul (zoals een streptavidinekern of een polyhistidinelabel) kan mediëren. 30 Één type van gederivatiseerde antilichamen kan worden geproduceerd door twee of meer antilichamen (van hetzelfde type of van verschillende typen, bv. om bispecifieke antilichamen te creëren) aan elkaar te koppelen. Geschikte koppelgroepen zijn onder meer diegene die heterobifunctio-35 neel zijn, die twee verschillende soorten reactieve groepen bezitten die van elkaar worden gescheiden door een geschikte tussengroep (bv. m-maleimidobenzoyl-N- 1026829-i 35 hydroxysuccinimide-ester) of homobifunctioneel (bv., di-succinimidylsuberaat). Dergelijke koppelgroep zijn verkrijgbaar bij Pierce Chemical Company, Rockford, 111.

Een ander type van gederivatiseerde antilichamen is 5 een gelabeld antilichaam. Bruikbare detectiemiddelen waarmee een antilichaam of antilichaamgedeelte van de uitvinding kan worden gederivatiseerd zijn onder meer fluorescente verbindingen, zoals fluoresceïne, fluoresceïne-isothiocyanaat, rhodamine, 5-dimethylamine-l- 10 naftaleensulfonylchloride,- fycoerythrine, lanthanidefosfo-ren en dergelijke. Een antilichaam kan ook worden gelabeld met enzymen die bruikbaar zijn voor detectie, zoals mie-rikswortelperoxidase, β-galactosidase, luciferase, alkalisch fosfatase, glucose-oxidase en dergelijke. Wanneer 15 een antilichaam is gelabeld met een detecteerbaar enzym, wordt het gedetecteerd door aanvullende reagentia toe te voegen die het enzym gebruikt om een reactieproduct te produceren dat kan worden waargenomen. Wanneer bijvoorbeeld mierikswortelperoxidase aanwezig is, leidt de toe-20 voeging van waterstofperoxide en diaminobenzidine tot een gekleurd reactieproduct dat detecteerbaar is. een antilichaam kan ook worden gelabeld met biotine en worden gedetecteerd door middel van indirecte meting van avidien- of streptavidinebinding. Een antilichaam kan ook worden gela-25 beid met een vooraf bepaalde polypeptide-epitoop die wordt herkend door een secundaire reporter (bv. leucineritspaar-sequenties, bindingsplaatsen voor secudaire antilichamen, metaalbindingsdomeinen, epitooplabels). In sommige uitvoeringsvormen worden labels vastgehecht via tussengroeparmen 30 . van een zekere lengte om potentiële sterische hindering te verminderen.

Een anti-IGF-IR-antilichaam kan ook worden gelabeld met een radioactief gelabeld aminozuur. Het radioactieve label kan worden gebruikt voor zowel diagnostische als 35 therapeutische doeleinden. Het radioactieve label kan bijvoorbeeld worden gebruikt om IGF-IR tot expressie brengende tumoren te detecteren door middel van Röntgen- of ande- 4026629- 36 re diagnostische technieken. Voorbeelden van labels voor polypeptide zijn onder meer 3H, 14C, 1SN, 35S, 90Y, 99Tc, mIn, 125I, 131I.

Een anti-IGF-IR-antilichaam kan ook worden gederiva-5 tiseerd met een chemische groep zoals polyethyleenglycol (PEG), een methyl- of ethylgroep, of een koolhydraatgroep. Deze groepen kunnen bruikbaar zijn om de biologische eigenschappen van het antilichaam te verbeteren, bv. om de serumhalfwaardetijd te verhogen of de weefselbinding te 10 verhogen.

De uitvinding heeft ook betrekking op een farmaceutisch preparaat voor de behandeling van een hyperprolife-ratieve aandoening in een zoogdier, die een therapeutisch werkzame hoeveelheid van een verbinding van de uitvinding 15 en een farmaceutisch aanvaardbare drager bevat. In één uitvoeringsvorm is het farmaceutische preparaat bedoeld voor de behandeling van kanker zoals hersen-, long-, squa-meuze-cel-, blaas-, maag-, pancreas-, borst-, hoofd-, hals-, nier-, ovarium-, prostaat-, colorectale-, slokdarm-20 , gynaecologische of thyroïdkanker. Patiënten die kunnen worden behandeld met een verbinding van de uitvinding volgens de werkwijzen van de uitvinding zijn bijvoorbeeld onder meer patiënten waarbij multipel myeloom, liquide tumor, leverkanker, een thymusaandoening, T-cel-gemedieerde 25 autoimmuunziekte, een endocrinologische aandoening, ische-mie, een neurodegeneratieve aandoening, longkanker, bot-kanker, pancreaskanker, huidkanker, kanker van het hoofd en de hals, cutaan of intraoculair melanoom, baarmoeder-kanker, ovariumkanker, rectale kanker, kanker van het ana-30 le gebied, maagkanker, colonkanker, borstkanker, gynaecologische tumoren (bv. baarmoedersarcomen, carcinoom van de fallopische buizen, carcinoom van het endometrium, carcinoom van de cervix, carcinoom van de vagina of carcinoom van de vulva), de ziekte van Hodgkin, kanker van de slok-35 darm, kanker van de dunne darm, kanker van het endocriene systeem (bv. kanker van de thyrold-, parathyroïd- of adre-nale klieren), sarcoom van zachte weefsels, kanker van de 1026829- 37 urethra, kanker van de penis, prostaatkanker, chronische of acute leukemie, vaste tumoren van kinderen, lymfocyt-lymfomen, kanker van de blaas, kanker van de lever of ureter, (bv. niercelcarcinoom, carcinoom van het nierbekken), 5 of neoplasma's van het centrale zenuwstelsel (bv. primair CNS-lymfoom, ruggenmergtumoren, hersenstamgliomen of pitu-itaire adenomen) zijn vastgesteld.

In een andere uitvoeringsvorm heeft het farmaceutische preparaat betrekking op niet-kwaadaardige hyperproli-10 feratie-aandoeningen zoals, zonder beperking, restenose na angioplastiek en psoriasis. In een andere uitvoeringsvorm heeft de uitvinding betrekking op farmaceutische preparaten voor de behandeling van een zoogdier dat activering van IGF-IR behoeft, waarbij het farmaceutisch preparaat 15 een therapeutisch werkzame hoeveelheid van een activerend antilichaam van de uitvinding en een farmaceutisch aanvaardbare drager bevat. Farmaceutische preparaten die activerende antilichamen bevatten kunnen worden gebruikt om dieren te behandelen die en gebrek hebben aan IGF-I of 20 IGF-II, of kunnen worden gebruikt om osteoporose, fragiliteit of aandoeningen waarbij het zoogdier e weinig actief groeihormoon uitscheidt of niet in staat is te reageren op groeihormoon.

Het anti-IGF-IR-antilichaam van de uitvinding kan 25 worden opgenomen in farmaceutische preparaten die geschikt zijn voor toediening aan een subject. Typischerwijs bevat het farmaceutische preparaat een antilichaam van de uitvinding en een farmaceutisch aanvaardbare drager. Zoals hier gebruikt omvat "farmaceutisch aanvaardbare drager" 30 alle mogelijke oplosmiddelen, dispersiemedia, deklagen, antibacteriële en antifungale middelen, isotonie- en ab-sorptievertragende middelen, en dergelijke, die fysiologisch compatibel zijn. Voorbeelden van farmaceutisch aanvaardbare dragers zijn onder meer water, zoutoplossing, 35 fosfaatgebufferde zoutoplossing, dextrose, glycerol, ethanol en dergelijke, evenals combinaties daarvan. In veel gevallen zal het de voorkeur verdienen isotoniemiddelen, 1026829- 38 bijvoorbeeld suikers, polyalcoholen, zoals mannitol, sor-bitol, of natriumchloride op te nemen in het preparaat. Farmaceutisch aanvaardbare stoffen zoals bevochtigingsmid-delen of kleine hoeveelheden hulpstoffen zoals bevochti-5 gings- of emulgeermiddelen, conserveringsmiddelen of buffers, die de houdbaarheid of effectiviteit van het antili-chaam of antilichaamgedeelte vergroten.

De preparaten van de onderhavige uitvinding kunnen verscheidene vormen hebben. Deze zijn bijvoorbeeld vloei-10 bare, semi-vaste en vaste doseringsvormen, zoals vloeibare oplossingen (bv. injecteerbare en infusie-oplossingen), dispersies of suspensies, tabletten, pillen, poeders, li-posomen en zetpillen. De voorkeursvorm hangt af van de beoogde toedieningswijze en therapeutische toepassing. Typi-15 sche voorkeurspreparaten hebben de vorm van injecteerbare of infusieoplossingen, zoals preparaten die vergelijkbaar zijn met die welke worden gebruikt voor passieve immunisa-tie van mensen met andere antilichamen. De voorkeurstoe-dieningswijze is parenteraal (bv. intraveneus, subcutaan, 20 intraperitoneaal, intramusculair). In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt het antilichaam toegediend door middel van intraveneuze infusie of injectie. In een andere voorkeursuitvoeringsvorm wordt het antilichaam toegediend via in-tramusculaire of subcutane injectie.

25 Therapeutische preparaten dienen gewoonlijk steriel en stabiel te zijn onder de omstandigheden van vervaardiging en opslag. Het preparaat kan worden geformuleerd als een oplossing, micro-emulsie, dispersie, liposoom, of andere geordende structuur die geschikt is voor hoge genees-30 middelconcentraties. Steriele injecteerbare oplossingen kunnen worden bereid door het anti-IGF-IR-antilichaam in de gewenste hoeveelheid op te nemen in een geschikt oplosmiddel met naar behoefte één of meer van de hierboven opgenoemde ingrediënten, gevolgd door filtersterilisatie. In 35 het algemeen worden dispersies bereid door de actieve verbinding op te nemen in een steriel vehikel dat een basis-dispersiemedium bevat en de vereiste andere ingrediënten 1026829- 39 van de hierboven opgenoemde. In het geval van steriele poeders voor de bereiding van steriele injecteerbare oplossingen zijn de voorkeurswerkwijzen van bereiding vacu-umdrogen en vriesdrogen, wat een poeder oplevert van de 5 actieve ingrediënt en eventuele andere gewenste ingrediënten, van een tevoren steriel gefiltreerde oplossing daarvan. De juiste fluïditeit van een oplossing kan bijvoorbeeld worden gehandhaafd door het gebruik van een deklaag zoals lecithine, door de handhaving van de vereiste deel-10 tjesgrootte in het geval van dispersie en door het gebruik van surfactanten. Vertraagde absorptie van injecteerbare preparaten kan worden bewerkstelligd door in het preparaat een middel op te nemen dat absorptie vertraagd, bijvoorbeeld monostearaatzouten en gelatine.

15 Het antilichaam van de onderhavige uitvinding kan worden toegediend volgens een verscheidenheid aan in het vakgebied bekende werkwijzen, hoewel voor vele therapeutische toepassingen de voorkeursroute/toedieningswijze in-traperitoneaal, subcutaan, intramusculair, intraveneus, of 20 infusie is. Zoals de vakman zal begrijpen, zal de route en/of wijze van toediening variëren afhankelijk van de gewenste resultaten. In één uitvoeringsvorm kan het antilichaam van de onderhavige uitvinding worden toegediend als een enkelvoudige dosis of kan worden toegediend als meer-25 dere doses.

In bepaalde uitvoeringsvormen kan de actieve verbinding worden bereid met een drager die de verbinding beschermt tegen snel vrijkomen, zoals een vertraagde-afgifte-formulering, waaronder implantaten, transdermale 30 pleisters, en micro-ingekapselde afleveringssystemen. Bio-degradeerbare biocompatibele biopolymeren kunnen worden gebruikt, zoals ethyleenvinylacetaat, polyanhydriden, po-lyglycolzuur, collageen, polyorthoesters, en polymelkzuur. veel werkwijzen voor de bereiding van dergelijk formule-35 ringen zijn geoctrooieerd of in algemene zin bekend aan de vakman, zie bijvoorbeeld Sustained and Controlled Release 102 6829-: 40

Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, red., Marcel Dekker, Ine., New York, 1978.

Supplementaire actieve verbindingen kunnen ook worden opgenomen in het preparaat. In bepaalde uitvoeringsvormen 5 wordt een anti-IGF-IR-antilichaam van de uitvinding geco-formuleerd met en/of tezamen toegediend met één of meer andere therapeutische middelen, zoals chemotherapeutische, antineoplastische of antitumor-middelen. Een anti-IGF-IR-antilichaam kan bijvoorbeeld worden gecoformuleerd en/of 10 tezamen toegediend met één of meer andere therapeutische middelen. Deze middelen zijn onder meer antilichamen die binden aan andere doelwitten (bv. antilichamen die binden aan één of meer groeifactoren of cytokinen, hun celopper-vlakreceptoren of IGF-I), IGF-I-bindende eiwitten, antine-15 oplastische middelen, chemotherapeutische middelen, anti-tumormiddelen, antisens-oligonucleotiden tegen IGF-IR of IGF-I, peptideanalogen die IGF-IR-activering blokkeren, oplosbaar IGF-IR, en/of één of meer chemische middelen die IGF-IR productie of -activiteit blokkeren, die in het vak-20 gebied bekend zijn, bv. octreotide. Voor een farmaceutisch preparaat dat een activerend antilichaam bevat kan het an-ti-IGF-IR-antilichaam worden geformuleerd met een factor die celproliferatie verhoogt of apoptose voorkomt. Dergelijke factoren zijn onder meer groeifactoren zoals IGF-I, 25 en/of analogen van IGF-I die IGF-IR activeren. Dergelijke combinatietherapieën kunnen lagere doseringen van zowel het anti-IGF-IR-antilichaam als de er mee samen toegediende middelen vereisen, om zo mogelijke toxiciteiten of complicaties met betrekking tot de verschillende monothera-30 pieën te vermijden. In één uitvoeringsvorm het antilichaam en één of meer andere therapeutische middelen.

De farmaceutische preparaten van de uitvinding kunnen een "therapeutisch werkzame hoeveelheid" of een "profylactisch werkzame hoeveelheid" van een antilichaam of antili-35 chaamgedeelte van de uitvinding bevatten. Een "therapeu tisch werkzame hoeveelheid" heeft betrekking op een hoeveelheid die, bij de noodzakelijke doseringen en tijds- 1026829- 41 duur, voldoet om het gewenste therapeutische resultaat te bewerkstelligen. Een therapeutisch werkzame hoeveelheid van het antilichaam of antilichaamgedeelte kan variëren afhankelijk van factoren zoals de ziektetoestand, leef-5 tijd, geslacht, en gewicht van het individu, en het vermogen van het antilichaam of antilichaamgedeelte om een gewenste respons in het individu op te wekken. Een therapeutisch werkzame hoeveelheid is ook een hoeveelheid waarbij eventuele toxische of schadelijke effecten van het antili-ï 10 chaam of antilichaamgedeelte geringer zijn dan de therapeutisch heilzame effecten. Een "profylactisch werkzame hoeveelheid" heeft betrekking op een hoeveelheid die, bij de noodzakelijke doseringen en tijdsduur, voldoet om het gewenste profylactische resultaat te bewerkstelligen. Ge-15 woonlijk zal de profylactisch werkzame hoeveelheid, aangezien een profylactische dosis wordt gebruikt in individuen vóór of in een vroeg stadium van een ziekte, geringer zijn dan de therapeutisch werkzame hoeveelheid.

Doseringsregimes kunnen worden aangepast om de opti-20 male gewenste respons (bv. een therapeutische of profylactische respons) te verschaffen. Bijvoorbeeld kan een enkelvoudige bolus worden toegediend, of kunnen verscheidene gedeelde doses worden toegediend in de tijd, of kan de dosis proportioneel worden verlaagd of verhoogd afhankelijk 25 van de eisen van de therapeutische toestand. Een farmaceutisch preparaat dat het antilichaam bevat of dat een com-binatietherapie bevat die het antilichaam en één of meer andere therapeutische middelen omvat kan worden geformuleerd voor enkelvoudige of meervoudige doses. Het is met 30 name voordelig om parenterale preparaten te formuleren in eenheidsdoseringsvorm, voor eenvoudige toediening en uniformiteit van de dosering. Zoals hier gebruikt heeft eenheidsdoseringsvorm betrekking op fysisch discrete eenheden die geschikt zijn als eenheidsdoses voor de te behandelen 35 zoogdiersubjecten; waarbij elke eenheid een vooraf bepaalde hoeveelheid actieve verbinding bevat die is berekend om het gewenste therapeutische effect te produceren in asso- 1026829- 42 ciatie met de vereiste farmaceutische drager. De specificatie voor de eenheidsdoseringsvormen van de uitvinding worden gedicteerd door en zijn direct afhankelijk van (a) de eigenschappen van de actieve verbinding en het te be-5 werkstelligen therapeutische of profylactische effect, en (b) de beperkingen die inherent zijn in het vakgebied van i het mengen van een dergelijke actieve verbinding voor de behandeling van gevoeligheid in individuen. Een met name bruikbare formulering is 5 mg/ml anti-IGF-IR-antilichaam 10 in een buffer bestaande uit 20 mM natriumcitraat, pH 5,5, 140 mM NaCl, en 0,2 mg/ml polysorbaat 80.

Een niet-beperkend voorbeeld van een bereik voor een therapeutisch of profylactisch werkzame hoeveelheid van een antilichaam of antilichaamgedeelte van de uitvinding 15 is 0,1-100 mg/kg, meer bij voorkeur 0,5-50 mg/kg, meer bij voorkeur 1-20 mg/kg en nog meer bij voorkeur 1-10 mg/kg.

Er zij opgemerkt dat doseringswaarden kunnen afhangen van het type en de ernst van de te behandelen aandoening.

Voorts zij begrepen dat voor een bepaald subject de speci-20 fieke doseringsregimes dienen te worden aangepast in de tijd afhankelijk van de individuele behoefte en de professionele beoordeling van de persoon die de toediening van de preparaten uitvoert of daarover beslist, en dat de hier weergegeven doseringsbereiken slechts voorbeelden zijn en 25 niet bedoeld zijn om de strekking of uitvoering van het beschreven preparaat te beperken. In één uitvoeringsvorm wordt de therapeutisch of profylactisch werkzame hoeveelheid van een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan toegediend tezamen met één of meer andere therapeuti-30 sche middelen.

In een ander aspect heeft de uitvinding betrekking op toediening van een anti-IGF-IR-antilichaam van de uitvinding voor de behandeling van kanker in een dosis van minder dan 300 mg per maand.

35 Een ander aspect van de onderhavige uitvinding ver schaft kits die de anti-IGF-IR-antilichamen bevatten en de farmaceutisch preparaten die deze antilichamen bevatten.

1026829*5 43

Een kit kan naast het antilichaam of het farmaceutische preparaat diagnostische of therapeutische middelen bevatten. Een kit kan ook instructies gebruiken voor gebruik in een diagnostische of therapeutische werkwijze. In een 5 voorkeursuitvoeringsvorm bevat de kit het antilichaam of een farmaceutisch preparaat daarvan en een diagnostisch middel dat kan worden gebruikt in een hieronder beschreven werkwijze. In een andere voorkeursuitvoeringsvorm bevat de kit het antilichaam of een farmaceutisch preparaat daarvan 10 en één of meer therapeutische middelen, zoals een aanvullend antineoplastisch middel, antitumormiddel of chemothe-rapeutisch middel, dat kan worden gebruikt in een hieronder beschreven werkwijze.

De uitvinding heeft ook betrekking op farmaceutische 15 preparaten voor het remmen van abnormale celgroei in een zoogdier, die een hoeveelheid van een verbinding van de uitvinding bevatten in combinatie met een hoeveelheid van een chemotherapeutisch middel, waarbij de hoeveelheden van de verbinding, zout, solvaat of voorloper, en van het che-20 motherapeutische middel tezamen werkzaam zijn voor het remmen van abnormale celgroei. Vele chemotherapeutische middelen zijn momenteel bekend in het vakgebied. In één uitvoeringsvorm worden de chemotherapeutische middelen gekozen uit de groep bestaande uit mitoseremmers, alkye-25 ringsmiddelen, antimetabolieten, intercalerende antibiotica, groeifactorremmers, celcyclusremmers, enzymen, topoiso-meraseremmers, anti-overlevingsmiddelen, biologische-respons-modificatoren, antihormonen, bv. antiandrogenen, en anti-angiogenese-middelen.

30 Antiangiogenesemiddelen, zoals MMP-2- (matrix- metalloproteïnase 2) remmers, MMP-9- (matrix-metalloproteïnase 9) remmers, en COX-II- (cyclooxygenase II) remmers, kunnen worden gebruikt tezamen met een verbinding van de uitvinding. Voorbeelden van bruikbare COX-35 II-remmers zijn onder meer CELEBREX™ (alecoxib), valde-coxib, en rofecoxib. Voorbeelden van bruikbare matrixme-talloproteïnaseremmers worden beschreven in WO 96/33172 1026829* 44 (gepubliceerd op 24 oktober 1996), WO 96/27583 (gepubliceerd op 7 maart 1996), Europese octrooiaanvrage nr.

97304971.1 (ingediend op 8 juli 1997), Europese octrooiaanvrage nr. 99308617.2 (ingediend op 29 oktober 1999), WO 5 98/07697 (gepubliceerd op 26 februari 1998), WO 98/03516 (gepubliceerd op 29 januari 1998), WO 98/34918 (gepubliceerd op 13 augustus 1998), WO 98/34915 (gepubliceerd op 13 augustus 1998), WO 98/33768 (gepubliceerd op 6 augustus 1998) , WO 98/30566 (gepubliceerd op 16 juli 1998), Euro-10 pees octrooischrift 606,046 (gepubliceerd op 13 juli 1994), Europees octrooischrift 931,788 (gepubliceerd op 28 julil999), WO 90/05719 (gepubliceerd op 31 mei 1990), WO 99/52910 (gepubliceerd op 21 oktober 1999), WO 99/52889 (gepubliceerd op 21 oktober 1999), WO 99/29667 (gepubli-15 ceerd op 17 juni 1999), PCT internationale octrooiaanvrage nr. PCT/1B98/01113 (ingediend op 21 juli 1998), Europese octrooiaanvrage nr. 99302232.1 (ingediend op 25 maart 1999) , Britse octrooiaanvrage nr. 9912961.1 (ingediend op 3 juni 1999), Amerikaanse octrooiaanvrage nr. 60/148,464 20 (ingediend op 12 augustus 1999), Amerikaans octrooischrift 5,863,949 (verleend op 26 januari 1999), Amerikaans octrooischrift 5,861,510 (verleend op 19 januari 1999), en Europees octrooischrift 780,386 (gepubliceerd op 25 juni 1997), welke hier alle in hun geheel bij referentie zijn 25 opgenomen. Voorkeurs-MMP-remmers zijn diegene die geen ar-tralgie vertonen. Meer de voorkeur hebben diegene die selectief MMP-2 en/of MMP-9 remmen ten opzichte van de andere matrixmetalloproteïnasen (i.e. MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12, enMMP-30 13) . Enkele specifieke voorbeelden van MMP-remmers die bruikbaar zijn in de onderhavige uitvinding zijn AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830,en de in de volgende lijst opgenoemde verbindingen: 3-[[4-(4-fluorfenoxy)- benzeensulfonyl]-(1-hydroxycarbamoyl-cyclopentyl)-amino]-35 propionzuur; 3-exo-3-[4-(4-fluorfenoxy)- benzeensulfonylamino]-8-oxa-bicyclo[3.2.1]octaan-3-carbonzuur-hydroxyamide; (2R,3R)-1-(4-(2-chloor-4-fluor- 1026829*5 45 benzyloxy)-benzeensulfonyl]-3-hydroxy-3-methyl-piperidine-2-carbonzuur-hydroxyamide; -4-[4-(4-fluorfenoxy)- benzeensulfonylamino]-tetrahydropyran-4-carbonzuur-hydroxyamide; 3-[[4-(4-fluorfenoxy)-benzeensulfonyl]- (1- 5 hydroxycarbamoyl-cyclobutyl)-amino]-propionzuur; 4—[4— (4— chloorfenoxy)-benzeensulfonylamino]-tetrahydropyran-4-carbonzuur-hydroxyamide; (R) 3-[4-(4-chloorfenoxy)- benzeensulfonylamino]-tetrahydropyran-3-carbonzuur-hydroxyamide; (2R,3R)-1-[4-(4-fluor-2-methyl-benzyfoxy) - 10 benzeensulfonyl]-3-hydroxy-3-methyl-piperidine-2- carbonzuur-hydroxyamide; 3-[[4-(4-fluorfenoxy)- benzeensulfonyl]-(1-hydroxycarbamoyl-l-methyl-ethyl)-amino]-propionzuur; 3-[[4-(4-fluorfenoxy)- benzeensulfonyl]-(4-hydroxycarbamoyl-tetrahydropyran-4-15 yl)-amino]-propionzuur; 3-exo-3-[4-(4-chloorfenoxy)- benzeensulfonylamino]-8-oxa-bicyclo[3.2.1]octaan-3-carbonzuur-hydroxyamide; 3-endo-3-[4-(4-fluorfenoxy)- benzeensulfonylamino]-8-oxa-bicyclo[3.2.1]octaan-3-carbonzuur-hydroxyamide; en (R)-3-[4-(4-fluorfenoxy)-20 benzeensulfonylamino]-tetrahydrofuran-3-carbonzuur- hydroxyamide; en farmaceutisch aanvaardbare zouten en sol-vaten van deze verbindingen.

Een verbinding van de uitvinding kan ook worden gebruikt met signaaltransductieremmers, zoals middelen die 25 EGF-R- (epidermale-groeifactorreceptor) responsen kunnen remmen, zoals EGF-R-antilichamen, EGF-antilichamen, en moleculen die EGF-R-remmers zijn; VEGF- (vasculaire endothe-liale groeifactor) remmers, zoals VEGF-receptoren en moleculen die VEGF kunnen remmen; en erbB2-receptorremmers, 30 zoals organische moleculen of antilichamen die binden aan de erbB2-receptor, bijvoorbeeld HERCEPTIN’* (Genentech, Ine.). EGF-R-remmers worden beschreven in bijvoorbeeld WO 95/19970 (gepubliceerd op 27 juli 1995), WO 98/14451 (gepubliceerd op 9 april 1998), WO 98/02434 (gepubliceerd op 35 22 januari 1998), en Amerikaans octrooischrift 5,747,498 (verleend op 5 mei 1998), en dergelijke verbindingen kunnen worden gebruik in de onderhavige uitvinding zoals hier 1026829- 46 beschreven. EGF-R-remmers zijn onder meer C225 en anti-EGFR 22Mab (ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abge-nix/Cell Genesys), EMD-7200 (Merck KgaA), EMD-5590 (Merck KgaA), MDX-447/H-477 (Medarex Ine. en Merck KgaA), en de 5 verbindingen ZD-1834, ZD-1838 en ZD-1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI-166/CGP-75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), leflunomide (Pharma-cia/Sugen), CI-1033 (Warner Lambert Parke Davis), CI- 1033/PD 183,805 (Warner Lambert Parke Davis), CL-387,785 10 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), Naamidine A (Bristol Myers Squibb), RC-3940-11 (Pharmacia) , BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck &

Co.), VRCTC-310 (Ventech Research), EGF fusion toxin (Se-ragen Ine.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperi-15 al Cancer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Cancer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Cancer Center), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) en EGF-R Vaccine (York Medical/Centro de Immunologia Molecular (CIM)). Deze en andere EGF-R-remmende middelen kunnen wor-20 den gebruikt in de onderhavige uitvinding.

VEGF-remmers, bijvoorbeeld SU-5416 en SU-6668 (Sugen Ine.), SH-268 (Schering), en NX-1838 (NeXstar) Kunnen ook worden gecombineerd met de verbinding van de onderhavige uitvinding. VEGF-remmers worden beschreven in bijvoorbeeld 25 WO 99/24440 (gepubliceerd op 20 mei 1999), PCT internationale octrooiaanvrage PCT/IB99/00797 (ingediend op 3 mei 1999), in WO 95/21613 (gepubliceerd op 17 augustus 1995), WO 99/61422 (gepubliceerd op 2 december 1999), Amerikaans octrooischrift 5,834,504 (verleend op 10 november 1998), 30 WO 98/50356 (gepubliceerd op 12 november 1998), Amerikaans octrooischrift 5,883,113 (verleend op 16 maart 1999), Amerikaans octrooischrift 5,886,020 (verleend op 23 maart 1999), Amerikaans octrooischrift 5,792,783 (verleend op 11 augustus 1998), WO 99/10349 (gepubliceerd op4 maart 1999), 35 WO 97/32856 (gepubliceerd op 12 september 1997), WO 97/22596 (gepubliceerd op 26 juni 1997), WO 98/54093 (gepubliceerd op 3 december 1998), WO 98/02438 (gepubliceerd 10268293 47 op 22 januari 1998), WO 99/16755 (gepubliceerd op 8 april 1999), en WO 98/02437 (gepubliceerd op 22 januari 1998), welke hier alle in hun geheel bij referentie zijn opgenomen. Andere voorbeelden van specifieke VEGF-remmers die 5 bruikbaar zijn in de onderhavige uitvinding zijn IM862 (Cytran Ine.); en angiozym, een synthetisch ribozym van Ribozyme en Chiron. Deze en andere VEGF-remmers kunnen worden gebruikt in de onderhavige 'uitvinding zoals hier beschreven.

10 ErbB2-receptorremmers zoals GW-282974 (Glaxo Wellcome pic) , en de monoklonale antilichamen AR-209 (Aronex Phar-maceuticals Ine.) en 2B-1 (Chiron), kunnen ook worden gecombineerd met de verbinding van de uitvinding, bijvoorbeeld degene die worden genoemd in WO 98/02434 (gepubli-15 ceerd op 22 januari 1998), WO 99/35146 (gepubliceerd op 15 juli 1999), WO 99/35132 (gepubliceerd op 15 juli 1999), WO 98/02437 (gepubliceerd op 22 januari 1998), WO 97/13760 (gepubliceerd op 17 april 1997), WO 95/19970 (gepubliceerd op 27 juli 1995), Amerikaans octrooischrift 5,587,458 20 (verleend op 24 december 1996), en Amerikaans octrooischrift 5,877,305 (verleend op 2 maart 1999), welke hier alle in hun geheel bij referentie zijn opgenomen. ErbB2-receptorremmers die bruikbaar zijn in de onderhavige uitvinding worden ook beschreven in Amerikaanse octrooiaan-25 vrage nr. 60/117,341, ingediend op 27 januari 1999, en in Amerikaanse octrooiaanvrage nr. 60/117,346, ingediend op 27 januari 1999, welke hier beide in hun geheel bij referentie zijn opgenomen. De in de bovengenoemde PCT-octrooiaanvragen, Amerikaanse octrooischriften en Ameri-30 kaanse octrooiaanvragen beschreven erbB2- remmerverbindingen en stoffen, evenals andere verbindingen en stoffen die de erbB2-receptor remmen, kunnen worden gebruikt met de verbinding van de onderhavige uitvinding in overeenstemming met de onderhavige uitvinding.

35 Het antilichaam van de uitvinding kan ook worden ge bruikt met CTLA-4-antilichamen, zoals degene beschreven in Amerikaans octrooischrift 6,682,736, waaronder een antili- 1026829- 48 chaam met de sequentie 3.1.1, 4.1.1,4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, of 12.9.1.1. Het antilichaam kan ook worden gebruikt met CD40-antilichamen, zoals degene beschreven in W003040170 5 gepubliceerd op 15 mei 2003, waaronder een antilichaam met de sequentie van antilichaam 3.1. 1,3. 1.1H-A78T, 3.1. 1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1 H-D16E, 23.29.1 of 24.2.

10 De antilichamen kunnen ook worden gecombineerd met anti-integrinemiddelen zoals anti-integrine-antilichamen.

Enige specifieke voorbeelden van middelen waarmee het antilichaam kan worden gecombineerd zijn de navolgende: de alkyleringsmiddelen stikstofmosterd-N-oxide, cy-15 clofosfamide, ifosfamide, melphalan, busulfanmitobronitol, carboquone, thiotepa, ranimustine, nimustine, en temozolo-mide; de antimetabolieten methotrexaat, 6-mercaptopurine, riboside, mercaptopurine, 5-FU, tegafur, doxifluridine, 20 carmofur, cytarabine, cytarabine, ocfosfate, enocitabine, S-l, gemcitabine, fludarabine, en capecitabine; de antibiotica actinomycine D, doxorubicine, daunoru-bicine, neocarzinostatine, bleomycine, peplomycine, mit-omycine C, aclarubicine, pirarubicine, epirubicine, zino-25 statine, stimalamer, en idarubicine; de plantaardige antitumormiddelen vincristine, vin-blastine, vindeshine, etoposide, sobuzoxane, docetaxel, paclitaxel, en vinorelbine; de platinacomplexen cisplatin, carboplatin, nedapla-30 tin, en oxaliplatin; camptothecinederivaten irinotecan, topotecan en camp-tothecine; tyrosinekinaseremmer gefitinib; anti-CD20-middelen rituximab, tositumomab, en ibritu-35 momab tiuxetan; 1020829- 49 interferonen interferon alfa, interferon alfa-2a, in-terferon alfa-2b, interferon bèta, interferon gamma-la en interferon gamma-nl; biologische-respons-modificeerders krestin, lentinan, 5 sizofiran, picibanil en ubenimex; en andere antitumormid-delen raitoxantrone, I-asparaginase, procarbazine, dacarba-zine, hydroxycarbamide, pentostatine, en tretinoïne.

Daarnaast kan het antilichaam van de uitvinding worden gecombineerd met de antikankermiddelen exemestane, 10 edotecarin (J-107088), en SU11248.

Het anti-IGF-IR-antilichaam kan worden gebruikt om IGF-IR te detecteren in een biologisch monster in vitro of in vivo. Het anti-IGF-IR-antilichaam kan worden gebruikt in een conventioneel innuunassay zoals onder meer een 15 ELISA, een RIA, FACS, weefselimmunohistochemie, Western-blot of immunoprecipitatie. Het anti-IGF-IR-antilichaam van de uitvinding kan worden gebruikt om IGF-IR uit mensen te detecteren. In een andere uitvoeringsvorm kan het anti-IGF-IR-antilichaam worden gebruikt om IGF-IR uit primaten 20 van de Oude Wereld, zoals cynomolgus en resusapen, chimpansees en apen, te detecteren. De uitvinding verschaft een werkwijze voor het detecteren van anti-IGF-IR in een biologisch monster, omvattende het in contact brengen van een biologisch monster met een anti-IGF-IR-antilichaam van 25 de uitvinding en het detecteren van het aan het anti-IGF-IR gebonden antilichaam, om het IGF-IR in het biologische monster te detecteren. In één uitvoeringsvorm is het anti-IGF-IR-antilichaam rechtstreeks gelabeld met een detecteerbaar label. In een ander uitvoeringsvorm is het anti-30 IGF-IR-antilichaam (het eerste antilichaam) ongelabeld en is een tweede antilichaam of ander molecuul dat kan binden aan het anti-IGF-IR-antilichaam gelabeld. Zoals welbekend in het vakgebied wordt een tweede antilichaam gekozen dat in staat is specifiek te binden aan de specifieke species 35 en klasse van het eerste antilichaam. Indien het anti-IGF-IR-antilichaam bijvoorbeeld een humaan IgG is dan kan het secundaire antilichaam een anti-humaan-IgG zijn. Andere 1023829·; 50 moleculen die kunnen binden aan antilichamen zijn onder meer Eiwit A en Eiwit G, die beide commercieel verkrijgbaar zijn, bv. bij Pierce Chemical Co.

Geschikte labels voor het antilichaam of secundaire 5 zijn supra beschreven, en zijn onder meer verscheidene enzymen, prosthetische groepen, fluorescente materialen, luminescente materialen, magnetische middelen en radioactieve materialen. Voorbeelden van geschikte enzymen zijn onder meer mierikswortelperoxidase, alkalisch fosfatase, β-10 galactosidase of acetylcholinesterase; voorbeelden van geschikte prostetische-groep-complexen zijn onder meer streptavidine/biotine en avidine/biotine; voorbeelden van geschikte fluorescente materialen zijn onder meer umbelli-feron, fluoresceïne, fluoresceïneisothiocyanaat, rhodami-15 ne, dichloortriazinylaminefluoresceine, danzylchloride of fycoerythrine; een voorbeeld van een luminescent materiaal is luminol; een voorbeeld van een magnetisch middel is ga-dolinium,· en voorbeelden van geschikte radioactieve materialen zijn onder meer 125I, 131I, 35S of 3H.

20 In een andere uitvoeringsvorm kan IGF-IR worden geas- sayd in een biologisch monster door middel van een compe-titie-immuunassay met gebruikmaking van IGF-IR-standaarden gelabeld met een detecteerbare stof en een ongelabeld an-ti-IGF-IR-antilichaam. In dit assay worden het biologische 25 monster, de gelabelde IGF-IR-standaarden en het anti-IGF-IR-antilichaam samengevoegd en de hoeveelheid gelabelde IGF-IR-standaard die is gebonden aan het ongelabelde antilichaam wordt bepaald. De hoeveelheid IGF-IR in het biologische monster is omgekeerd evenredig met de hoeveelheid 30 gelabelde IGF-IR-standaard die is gebonden aan het anti-IGF-IR-antilichaam.

De hierboven beschreven immuunassays kunnen worden gebruikt voor verscheidene doeleinden. In één uitvoeringsvorm kan het anti-IGF-IR-antilichaam worden gebruikt om 35 IGF-IR te detecteren in cellen in celkweek. In een voorkeursuitvoeringsvorm kan het anti-IGF-IR-antilichaam worden gebruikt om het niveau aan tyrosine fosforylering, ty- 1026829- 51 rosineautofosforylering van IGF-IR, en/of de hoeveelheid IGF-IR op het celoppervlak na behandeling van de cellen met verschillende verbindingen te bepalen. Deze werkwijze kan worden gebruikt om verbindingen te etsten die kunnen 5 worden gebruikt om IGF-IR te activeren of te remmen. In deze werkwijze wordt één monster van cellen gedurende een bepaalde tijd behandeld met een testverbinding, terwijl een ander monster onbehandeld wordt gelaten. In tyrosine-autofosforylering dient te worden gemeten, worden de cel-10 len gelyseerd en wordt tyrosinefosforylering van de IGF-IR gemeten met gebruikmaking van een hierboven beschreven im-muunassay of zoals eerder beschreven met behulp van een ELISA. Indien het totale gehalte aan IGF-IR dient te worden gemeten, worden de cellen gelyseerd en wordt het tota-15 le IGF-IR-gehalte gemeten met behulp van één van de hierboven beschreven immuunassays.

Een voorkeursimmuunassay voor het bepalen van IGF-IR-tyrosinefosforylering of voor het meten van totale IGF-IR-gehaltes is een ELISA of Western-blot. Indien alleen het 20 celoppervlakgehalte aan IGF-IR gemeten dient te worden, dan worden de cellen niet gelyseerd, en worden de celop-pervlakgehaltes aan IGF-IR gemeten met behulp van één van de hierboven beschreven immuunassays. Een voorkeursimmuunassay voor het bepalen van celoppervlakgehaltes van 25 IGF-IR omvat de stappen van het labelen van de celopper-vlakeiwitten met een detecteerbaar label, zoals biotine of 125I, het immuunprecipiteren van het IGF-IR met een anti-IGF-IR-antilichaam en vervolgens het detecteren van het gelabelde IGF-IR. Een andere voorkeursimmuunassay voor het 30 bepalen van de lokalisatie van IGF-IR, bv. celoppervlakgehaltes, is met behulp van immunohistochemie. Werkwijzen zoals ELISA, RIA, Western-blot, immunohistochemie, celop-pervlaklabeling an integrale membraaneiwitten en immuun-precipitatie zijn welbekend in het vakgebied. Zie bv. Har-35 low en Lane, supra. Daarnaast kunnen de immuunassays worden opgeschaald voor hoge-doorzet-screening teneinde een 1026829- 52 groot aantal verbindingen te testen op hetzij activatie of remming van IGF-IR.

Het anti-IGF-IR-antilichaam van de uitvinding kan ook worden gebruikt om de gehaltes aan IGF-IR te bepalen in 5 een weefsel of in uit het weefsel afkomstige cellen. In een voorkeursuitvoeringsvorm is het weefsel een door een ziekte aangetast weefsel. In een meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm is het weefsel een tumor of een bi-opt daarvan. In een voorkeursuitvoeringsvorm van de werk-10 wijze wordt een weefsel of biopt daarvan verwijderd uit een patiënt. Het weefsel of biopt wordt vervolgens gebruikt in een immuunassay om bv. IGF-IR-gehaltes, celop-pervlakgehaltes aan IGF-IR, tyrosinefosforyleringsniveaus van IGF-IR of lokalisatie van IGF-IR te bepalen volgens de 15 hierboven bediscussieerde werkwijzen. De werkwijze kan worden gebruikt om te bepalen of een tumor IGF-IR tot expressie brengt in een hoge mate.

De hierboven beschreven diagnostische werkwijze kan worden gebruikt om te bepalen of een tumor hoge niveaus 20 aan IGF-IR tot expressie brengt, wat erop kan duiden dat de tumor goed zal reageren op behandeling met anti-IGF-IR-antilichaam. De diagnostische werkwijze kan ook worden gebruikt om te bepalen of een tumor potentieel kwaadaardig is, indien het hoge niveaus aan IGF-IR tot expressie 25 brengt, of goedaardig, indien het lage niveaus aan IGF-IR tot expressie brengt. Verder kan de diagnostische werkwijze ook worden gebruikt om te bepalen of behandeling met anti-IGF-IR-antilichaam (zie heronder) er toe leidt dat een tumor lagere niveaus aan IGF-IR tot expressie brengt 30 en/of lagere niveaus aan tyrosineautfosforylering tot expressie brengt, en kan derhalve worden gebruikt om te bepalen of de behandeling succesvol is. In het algemeen omvat een werkwijze om te bepalen of een anti-IGF-IR-antilichaam de tyrosinefosforylering verlaagt de stappen 35 van het meten van het niveau aan tyrosinefosforylering in een gekozen cel of weefsel, het incuberen van de cel of het weefsel met een anti-IGF-IR-antilichaam of antigeen- 102Θ829- 53 bindend gedeelte daarvan, en vervolgens het opnieuw meten van het niveau aan tyrosinefosforylering in een cel of weefsel. De tyrosinefosforylering van IGF-IR of van een ander eiwit(ten) kan worden gemeten. De diagnostische 5 werkwijze kan ook worden gebruikt om te bepalen of een weefsel of cel onvoldoend hoge niveaus aan IGF-IR of onvoldoend hoge niveaus aan geactiveerd IGF-IR tot expressie brengt, wat het geval kan zijn bij individuen met dwerg-groei, osteoporose of diabetes. Een diagnose dat niveaus 10 aan IGF-IR of actief IGF-IR te laag zijn zou kunnen worden gebruikt voor de behandeling met geactiveerde anti-IGF-IR-antilichamen, IGF-I of andere therapeutische middelen voor het verhogen van IGF-IR-niveaus of -activiteit.

Gebaseerd op het vermogen van het antilichaam van de 15 onderhavige uitvinding om IGF-IR te neerreguleren op perifere lymfocyten, kan een "biomerkerstrategie" worden gebruikt om de expressie van IGF-IR op circulerende tumor-en/of normale cellen van patiënten die zijn behandeld met het antilichaam van de uitvinding te volgen. Andere anti-20 lichamen, zoals de antilichamen beschreven in WO 02/05359, gepubliceerd op 11 juli 2002, kunnen ook worden gebruikt. Deze cellen kunnen onder meer CD19+-cellen zijn, en kunnen ook alle witte bloedcellen omvatten zoals monocyten, gra-nulocyten en lymfocyten.

25 Het antilichaam van de onderhavige uitvinding kan ook in vivo worden gebruikt om weefsels en organen te lokaliseren die IGF-IR tot expressie brengen. In een voorkeursuitvoeringsvorm kan het anti-IGF-IR-antilichaam worden gebruikt om IGF-IR tot expressie brengende tumoren te loka-30 liseren. De werkwijze omvat de stappen van het toedienen van een anti-IGF-IR-antilichaam of een farmaceutisch preparaat daarvan aan een patiënt die behoefte heeft aan een dergelijke diagnostische test en het onderwerpen van de patiënt aan beeldvormingsanalyse om de lokatie van IGF-IR 35 tot expressie brengende weefsels te bepalen. Beeldvormingsanalyse is welbekend in het medische vakgebied en omvat onder meer, Röntgenanalyse, magnetische-resonantie- 1026829- 54 beeldvorming (MRI) of computertomografie (CE). In een ander uitvoeringsvorm van de werkwijze wordt een biopt uit de patiënt verkregen om te bepalen of het gekozen weefsel IGF-IR tot expressie brengt, in plaats van de patiënt te 5 onderwerpen aan beeldvormingsanalyse. In een voorkeursuitvoeringsvorm kan het anti-IGF-IR-antilichaam worden gelabeld met een detecteerbaar middel dat kan worden gebruikt voor beeldvormingsanalyse in een patiënt. Het antilichaam kan voorbeeld worden gelabeld met een contrastmiddel, zo-10 als barium, dat kan worden gebruikt voor Röntgenanalyse, of een magnetisch contrastmiddel zoals gadoliniumchelaat, dat kan worden gebruikt voor MRI of CE. Andere labelings-middelen zijn onder meer radioisotopen,zoals 99Tc. In een andere uitvoeringsvorm kan het anti-IGF-IR-antilichaam on-15 gelabeld zijn en worden gebruikt voor beeldvormigsanalyse door middel van toediening van een tweede antilichaam of ander molecuul dat detecteerbaar is en dat kan binden aan het anti-IGF-IR-antilichaam.

In een andere uitvoeringsvorm verschaft de uitvinding 20 een werkwijze voor het remmen van IGF-IR-activiteit door toediening van een anti-IGF-IR-antilichaam van de uitvinding aan een patiënt die daaraan behoefte heeft. Het antilichaam van de onderhavige uitvinding kan therapeutisch worden gebruikt. In een andere voorkeursuitvoeringsvorm is 25 het IGF-IR humaan en is de patiënt een humane patiënt. Anderzijds kan de patiënt een zoogdier zijn dat een iGF-IR tot expressie brengt waarmee het anti-IGF-IR-antilichaam reageert. Het antilichaam kan worden toegediend aan een niet-humaan zoogdier dat een IGF-IR tot expressie brengt 30 waarmee het antilichaam reageert (i.e. een primaat, of een cynomolgus- of resusaap.) voor veterinaire doeleinden of als een diermodel van menselijke ziekte. Dergelijke dier-modellen kunnen bruikbaar zijn voor het evalueren van de therapeutisch werking van antilichamen van de onderhavige 35 uitvinding.

In een voorkeursuitvoeringsvorm kan een anti-IGF-IR-antilichaam worden toegediend aan een patiënt die een IGF- 1026829- 55 IR tot expressie brengende tumor heeft. Een tumor kan een vaste tumor zijn of een niet-vaste tumor zoals een lym-foom. In een meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm, kan een anti-IGF-IR-antilichaam worden toegediend aan een 5 patiënt die een IGF-IR tot expressie brengende tumor heeft die kwaadaardig is. In een nog meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm wordt het antilichaam toegediend aan een patiënt die een tumor van de long, borst, prostaat of co-lon heeft. In een zeer de voorkeur genietende uitvoerings-10 vorm leidt de werkwijze ertoe dat de tumor niet toeneemt in gewicht of volume of zelfs afneemt in gewicht of volume. In een andere uitvoeringsvorm leidt de werkwijze ertoe dat het IGF-IR op de tumor wordt geïnternaliseerd. In een voorkeursuitvoeringsvorm is het antilichaam 2.12.1fx, of 15 bevat een zware keten, lichte keten of antigeenbindend gebied daarvan.

In een andere voorkeursuitvoeringsvorm kan een anti-IGF-IR-antilichaam worden toegediend aan een patiënt die onaanvaardbaar hoge niveaus aan IGF-I tot expressie 20 brengt, bijvoorbeeld een stoornis waarin IGF-IR-activiteit schadelijk is. Zoals hier gebruikt worden met de term "een stoornis waarin IGF-IR-activiteit schadelijk is" ziekten en andere aandoeningen bedoeld waarin de aanwezigheid van hoge niveaus aan IGF-IR in een subject dat aan de aandoe-25 ning leidt, hetzij verantwoordelijk voor de pathofysiolo-gie van de aandoening, of een factor die bijdraagt aan een verergering van de aandoening, is gebleken of wordt vermoed te zijn. Bijgevolg is een aandoening waarbij hoge niveau aan IGF-IR-activiteit schadelijk zijn, een aandoening 30 waarbij remming van IGF-IR-activiteit naar verwachting de symptomen en/of progressie van de aandoening verlicht. Dergelijke aandoeningen kunnen worden aangetoond aan de hand van bijvoorbeeld een toename in de niveaus van IGF-IR op het celoppervlak of in toegenomen tyrosineautofosfory-35 lering van IGF-IR in de aangedane cellen of weefsels van een individu dat leidt aan de aandoening. De toename in IGF-IR-niveaus kan bijvoorbeeld worden gedetecteerd met 1028829- 56 behulp van een anti-IGF-IR-antilichaam zoals hierboven beschreven.

In één aspect wordt het anti-IGF-IR-antilichaam gebruikt om niet-kwaadaardige toestanden te behandelen waar-5 in hoge niveaus aan IGF-I en/of IGF-IR zijn geassocieerd met de niet-kwaadaardige toestand of ziekte. In één uitvoeringsvorm omvat de werkwijze de stap van toediening van een anti-IGF-IR-antilichaam aan een patiënt die een niet-kwaadaardige pathologische toestand heeft die wordt ver-10 oorzaakt of verergerd door hoge niveaus aan IGF-I en/of IGF-IR-niveaus of -activiteit. In een voorkeursuitvoeringsvorm is de niet-kwaadaardige pathologische toestand ! acromegalie, gigantisme, psoriasis, atherosclerose, glad-de-spier-restenose van bloedcellen of onaanvaardbare mi-15 crovasculaire proliferatie, zoals wordt gevonden als een complicatie van diabetes, speciaal van het oog. In een meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm vertraagt het anti-IGF-IR-antilichaam de voortgang van de niet-kwaadaardige pathologische toestand. In een meer de voor-20 keur genietende uitvoeringsvorm stopt het anti-IGF-IR-antilichaam de niet-kwaadaardige pathologische toestand of doet deze, ten minste gedeeltelijk, teniet.

Het is in het vakgebied bekend dat expressie van IGF-I in een hoog niveau kan leiden tot een verscheidenheid 25 van veelvoorkomende kankers. In een meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm wordt het anti-IGF-IR-antilichaam toegediend aan een patiënt met prostaatkanker, glioom of fibrosarcoom. In een nog meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm leidt de werkwijze ertoe dat de kanker stopt 30 met abnormale proliferatie, of niet meer toeneemt in gewicht of volume of afneemt in gewicht of volume.

In één uitvoeringsvorm heeft de werkwijze betrekking op de behandeling van kanker zoals hersen-, squameuze-cel-, blaas-, maag-, pancreas-, borst-, hoofd-, hals-, slok-35 darm-, prostaat-, colorectale-, long-, nier-, ovarium-, gynaecologische of thyroïdkanker. Patiënten die kunnen worden behandeld met een verbinding van de uitvinding vol- 1026829- 57 gens de werkwijzen van de onderhavige uitvinding zijn onder meer patiënten waarbij de diagnose multipel myeloom, liquide tumor, leverkanker, thymusaandoening, T-cel-gemedieerde autoimmuunziekte, endocrinologische aandoe-5 ning, ischemie, neurodegeneratieve aandoening, longkanker, botkanker, pancreaskanker, huidkanker, kanker van het hoofd en de hals, cutaan of intraoculair melanoom, baar-moederkanker, ovariumkanker, rectale kanker, kanker van het anale gebied, maagkanker, colonkanker, borstkanker, 10 gynaecologische tumoren (bv. baarmoedersarcomen, carcinoom van de fallopische buizen, carcinoom van het endometrium, carcinoom van de cervix, carcinoom van de vagina of carcinoom van de vulva) ? de ziekte van Hodgkin, kanker van de slokdarm, kanker van de dunne darm, kanker van het endo-15 criene systeem (bv. kanker van de thyroïd-, parathyroïd-of adrenale klieren), sarcoom van zachte weefsels, kanker van de urethra, kanker van de penis, prostaatkanker, chronische of acute leukemie, vaste tumoren van kinderen, lym-focytlymfomen, kanker van de blaas, kanker van de lever of 20 ureter, (bv. niercelcarcinoom, carcinoom van het nierbek-ken), of neoplasma's van het centrale zenuwstelsel (bv. primair CNS-lymfoom, ruggenmergtumoren, hersenstamgliomen of pitultaire adenomen) is gesteld.

Het antilichaam kan eenmaal worden toegediend, maar 25 wordt bij voorkeur meermaals toegediend. Het antilichaam kan driemaal daags tot eenmaal elke zes maanden worden toegediend. De toediening kan volgens een schema verlopen zoals driemaal daags, tweemaal daags, eenmaal daags, eenmaal per twee dagen, eenmaal per drie dagen, eenmaal per 30 week, eenmaal per twee weken, eenmaal per maand, eenmaal per twee maanden, eenmaal per drie maanden en een maal per zes maanden. Het antilichaam kan worden toegediend via een orale, mucosale, buccale, intranasale, inhaleerbare, intraveneuze, subcutane, intramusculaire, parenterale, in-35 tratumorale of topicale route. Het antilichaam kan worden toegediend op een plaats die op een afstand ligt van de plaats van de tumor. Het antilichaam kan ook continu wor- 1026829- 58 den toegediend via een rainipomp. Het antilichaam kan eenmaal, ten minste tweemaal, of tenminste net zolang tot de aandoening is behandeld, verlicht of genezen, worden toegediend. Het antilichaam zal in het algemeen zolang worden 5 toegediend zolang de tumor aanwezig is, mits het antilichaam ertoe leidt dat de tumor of kanker stopt met groeien of in gewicht of volume verkleint. Het antilichaam zal in het algemeen worden toegediend als deel van een farmaceutisch preparaat zoals supra beschreven. De dosering van 10 het antilichaam zal in het algemeen liggen tussen 0,1-100 mg/kg, meer bij voorkeur 0,5-50 mg/kg, meer bij voorkeur 1-20 mg/kg en nog meer bij voorkeur 1-10 mg/kg. De serum-concentratie van het antilichaam kan worden gemeten volgens elke in het vakgebied bekende werkwijze. Het antili-15 chaam kan ook profylactisch worden toegediend teneinde het optreden van een kanker of tumor te voorkómen. Dit kan met name nuttig zijn bij patiënten die een "hoog normaal" niveau aan IGF-I hebben, omdat is gebleken dat deze patiënten een hoger risico lopen op het ontwikkelen van veel-20 voorkomende kankers. Zie Rosen et al., supra.

In een ander aspect kan het anti-IGF-IR-antilichaam worden toegediend tezamen met andere therapeutische middelen, zoals antineoplastische geneesmiddelen of moleculen, aan een patiënt die een hyperproliferatieve aandoening 25 heeft, zoals kanker of een tumor. In één speet heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor de behandeling van de hyperproliferatieve aandoening in een zoogdier, omvattende het toedienen aan het zoogdier van een therapeutisch werkzame hoeveelheid van een verbinding van de uit-30 vinding in combinatie met een antitumormiddel gekozen uit de groep bestaande uit onder meer mitoseremmers, alkyle-ringsmiddelen, antimetabolieten, intercalerende middelen, groeifactorremmers, celcyclusremmers, enzymen, topoisome-raseremmers, biologische-respons-modificatoren, antihormo-35 nen, kinaseremmers, matrixmetalloproteaseremmers, genetische therapeutica en antiandrogenen. In een meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm kan het antilichaam worden 1026829- 59 toegediend met een antineoplastisch middel zoals adriamy-cine of taxol. In een ander voorkeursuitvoeringsvorm wordt het antilichaam of de combinatietherapie toegediend naast radiotherapie, chemotherapie, fotodynamische therapie, 5 chirurgie, of ander immuuntherapie. In nog een ander voor-. keursuitvoeringsvorm kan het antilichaam worden toegediend met een ander antilichaam. Het anti-IGF-IR-antilichaam kan worden toegediend met een antilichaam of ander middel waarvan bekend is dat het tumor- of kankercelproliferatie 10 remt, bv. een antilichaam of middel dat de erbB2-receptor, EGF-R, CD20 of VEGF remt. Toediening van het antilichaam tezamen met een ander therapeutisch middel (combinatietherapie) omvat toediening van een farmaceutisch preparaat dat het anti-IGF-IR-antilichaam en het andere thera-15 peutische middel bavat en toediening van twee of meer afzonderlijke farmaceutische preparaten, waarbij er één het anti-IGF-IR-antilichaam bevat en de andere het/de andere therapeutische middel(en) bevat(ten). Voorts omvat gezamenlijke toediening of combinatietherapie, hoewel het ge-20 woonlijk inhoudt dat het antilichaam en andere therapeutische middelen gelijktijdig worden toegediend, omvat het ook gevallen waarbij het antilichaam en de andere therapeutische middelen op verschillende tijdstippen worden toegediend. Het antilichaam kan bijvoorbeeld eenmaal per 25 drie dagen worden toegediend, terwijl het andere therapeutische middel eenmaal daags wordt toegediend. Ook kan het antilichaam voorafgaand aan of volgend op behandeling van de aandoening met het andere therapeutische middel worden toegediend. Evenzo kan toediening van het anti-IGF-IR-30 antilichaam worden uitgevoerd voorafgaand aan of volgend op radiotherapie, fotodynamische therapie, of chirurgie.

Het antilichaam en één of meer andere therapeutische middelen (de combinatietherapie) kan eenmaal, tweemaal, of net zolang totdat de aandoening is behandeld, verlicht, of 35 genezen, worden toegediend. Bij voorkeur wordt de combinatietherapie meermaals toegediend. De combinatietherapie kan driemaal daags tot eenmaal per zes maanden worden toe- '1026829- 60 gediend. De toediening kan volgens een schema verlopen zoals driemaal daags, tweemaal daags, eenmaal daags, eenmaal elke twee dagen, eenmaal elke drie dagen, eenmaal per week, eenmaal per twee weken, eenmaal per maand, eenmaal 5 per twee maanden, eenmaal per drie maanden en eenmaal per zes maanden of continu via een minipomp. De combinatiethe-rapie kan worden toegediend via een orale, mucosale, buc-cale, intranasale, inhaleerbare, intraveneuze, subcutane, intramusculaire, parenterale, intratumorale of topicale 10 route. De combinatietherapie kan worden toegediend op een plaats die op een afstand ligt van de plaats van de tumor. Het antilichaam zal in het algemeen zolang worden toegediend zolang de tumor aanwezig is, mits het antilichaam ertoe leidt dat de tumor of kanker stopt met groeien of in 15 gewicht of volume verkleint.

In nog een andere uitvoeringsvorm wordt het anti-IGF-IR-antilichaam gelabeld met een radioactief label, een im-munotoxine of een toxine, of is het een fusie-eiwit ddat een toxisch peptide bevat. Het anti-IGF-IR-antilichaam of 20 anti-IGF-IR-antilichaamfusie-eiwit leidt het radioactieve label, immunotoxine, toxine of toxische peptide naar de IGF-IR tot expressie brengende tumor of kankercel. In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt het radioactieve label, im-munotoxine, toxine of toxische peptide geïnternaliseerd 25 nadat het anti-IGF-IR-antilichaam bindt aan het IGF-IR op het oppervlak van de tumor of kankercel.

In een ander aspect kan het anti-IGF-IR-antilichaam therapeutisch worden gebruikt om apoptose van specifieke cellen te induceren in een patiënt die daaraan behoefte 30 heeft. In veel gevallen zijn de voor apoptose geviseerde cellen kwaadaardige of tumorcellen. In een voorkeursuitvoeringsvorm verschaft de uitvinding derhalve een werkwijze voor het induceren van apoptose door middel van toediening van een therapeutisch werkzame hoeveelheid van een 35 anti-IGF-IR-antilichaam aan een patiënt die daaraan behoefte heeft, In een voorkeursuitvoeringsvorm is het anti- 102Θ829- 61 lichaam 2.12.1fx, of bevat een zware keten, lichte keten of antigeenbindend gebied daarvan.

In een ander aspect verschaft de uitvinding een werkwijze voor het toedienen van een activerend anti-IGF-IR-5 antilichaam aan een patiënt die daaraan behoefte heeft. In één uitvoeringsvorm wordt het activerende antilichaam of farmaceutische preparaat toegediend aan een patiënt die daaraan behoefte heeft in een hoeveelheid die effectief is om de IGF-IR-activiteit te verhogen. In een meer de voor-10 keur genietende uitvoeringsvorm is het activerende antilichaam in staat om normale IGF-IR-activiteit te herstellen. In een andere voorkeursuitvoeringsvorm kan het activerende antilichaam worden toegediend aan een patiënt met een klein postuur, neuropathie, een afname in spiergewicht of 15 osteoporose. In een andere voorkeursuitvoeringsvorm kan het activerende antilichaam worden toegediend met één of meer factoren die celproliferatie verhogen, apoptose voorkómen of IGF-IR-activiteit verhogen. Dergelijke factoren zijn onder meer groeifactoren zoals IGF-I, en/of analogen 20 van IGF-I die IGF-IR activeren. In een voorkeursuitvoeringsvorm is het antilichaam 2.12.1fx, of bevat een zware keten, lichte keten of antigeenbindend gedeelte daarvan.

De nucleïnezuurmoleculen van de onderhavige uitvinding kunnen worden toegediend aan een patiënt die daaraan 25 behoefte heeft via gentherapie. De therapie kan hetzij in vivo of ex vivo zijn. In een voorkeursuitvoeringsvorm worden nucleïnezuurmoleculen die coderen voor zowel een zware keten en een lichte keten toegediend aan een patiënt. In een meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm worden de 30 nucleïnezuurmoleculen zodanig toegediend dat zij stabiel worden geïntegreerd in het chromosoom van B-cellen omdat deze cellen zijn gespecialiseerd voor het produceren van antilichamen. In een voorkeursuitvoeringsvorm worden voor-loper-B-cellen getransfecteerd of geïnfecteerd ex vivo en 35 geretranplanteerd in een patiënt die daaraan behoefte heeft. In een andere uitvoeringsvorm worden voorloper-B-cellen of andere cellen in vivo geïnfecteerd met behulp 1026829- 62 van een virus waarvan bekend is dat dit het gekozen celtype infecteert. Typische vectoren die worden gebruikt voor gentherapie zijn onder meer liposomen, plasmiden, of virale vectoren, zoals retrovirussen, adenovirussen en adeno-5 geassocieerde virussen. Na infectie, hetzij in vivo of ex vivo, kunnen de niveuas van antilichaamexpressie worden gevolgd door een monster te nemen uit de behandelde patiënt en een in het vakgebied bekend immuunassay te gebruiken zoals hier bediscussieerd.

10 In een voorkeursuitvoeringsvorm omvat de gentherapie- werkwijze de stappen van het toedienen van een werkzame hoeveelheid van een geïsoleerd nucleïnezuurmolecuul dat codeert voor de zware keten of een antigeenbindend gedeelte daarvan van het humane antilichaam of gedeelte daarvan, 15 en het tot expressie brengen van het nucleïnezuurmolecuul. In een andere uitvoeringsvorm omvat de gentherapiewerkwij-ze de stappen van het toedienen van een werkzame hoeveelheid van een geïsoleerd nucleïnezuurmolecuul dat codeert voor de lichte keten of een antigeenbindend gedeelte daar-20 van van het.humane antilichaam of gedeelte daarvan, en het tot expressie brengen van het nucleïnezuurmolecuul. In een 'meer de voorkeur genietende voorkeursuitvoeringsvorm omvat de gentherapiewerkwijze de stappen van het toedienen van een werkzame hoeveelheid van een geïsoleerd nucleïnezuur-25 molecuul dat codeert voor de zware keten of een antigeenbindend gedeelte daarvan van het humane antilichaam of gedeelte daarvan en een werkzame hoeveelheid van een geïsoleerd nucleïnezuurmolecuul dat codeert voor de lichte keten of een antigeenbindend gedeelte daarvan van het humane 30 antilichaam of gedeelte daarvan, en het tot expressie brengen van de nucleïnezuurmoleculen. De gentherapiewerkwij ze kan ook de stap omvatten van het toedienen van een ander antikankermiddel, zoals taxol, tamoxifen, 5-FU, adriamycine of CP-358,774.

35 »026829- 63

Sequentie-lD-nrs. van de aanvrage: SEQ ID NO: 1: DNA-sequentie die codeert voor de zware keten van antilichaam 2.12.1fx inclusief de sequentie die codeert voor de signaalsequentie die wordt gebruikt om het 5 volwassen antilichaam tot expressie te brengen.

SEQ ID NO: 2: DNA-sequentie die codeert voor de lichte keten van antilichaam 2.12.1fx inclusief de sequentie die codeert voor de signaalsequentie die wordt gebruikt om het volwassen antilichaam tot expressie te brengen.

10 SEQ ID NO: 3: Aminozuursequentie van de zware keten van antilichaam 2.12.1fx.

SEQ ID NO: 4: Aminozuursequentie van kiemlijn DP-35.

SEQ ID NO: 5: Aminozuursequentie van de lichte keten van antilichaam 2.12.1fx.

15 SEQ ID NO: 6: Aminozuursequentie van kiemlijn A30/Jkl.

Voor een beter begrip van de onderhavige uitvinding worden de volgende voorbeelden beschreven. Deze voorbeelden dienen slechts ter illustratie en dienen niet te wor-20 den opgevat als op enigerlei wijze beperkend voor de strekking van de uitvinding.

VOORBEELD I: Genererinq van hybridoom dat anti-IGF-IR-antilichaam produceert 25 Het antilichaam van de uitvinding werd als volgt be reid, geselecteerd en geassayd:

Acht tot tien weken oude XENOMICE** werden intraperi-toneaal of in hun achtervoetzolen geïmmuniseerd met hetzij het extracellulaire domein van humaan IGF-IR (10 30 pg/dosis/muis), of met 3T3-IGF-IR of 300.19-IGF-IR-cellen, wat twee getransfecteerde cellijnen zijn die humaan IGF-IR tot expressie brengen op hun plasmamembranen (10 x 106 cel-len/dosis/muis) . Deze dosis werd vijf tot zeven maal herhaald in een periode van drie tot acht weken. Vier dagen 35 vóór infusie ontvingen de muizen een laatste injectie van het ectracellulaire domein van humaan IGF-IR in PBS. Milten lymfeknooplymfocyten uit geïmmuniseerde muizen worden 1026829- 64 gefuseerd met de niet-secretoire myeloom-P3-X63-Ag8.653-cellijn en werden onderworpen aan HAT-selectie zoals eerder beschreven (Galfre en Milstein, Methods Enzymol. 73:3-46/ 1981). Een hybridoom, 2.12.1/ dat monoklonale antili-5 chamen met specificiteit voor IGF-IR produceerde, werd geselecteerd voor verder onderzoek en gedeponeerd in de American Type Culture Collection (ATCC), 10801 üniversity

Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, op 12 december 2000, met het volgende depotnummer: 10 Hybridoom Depotnummer 2.12.1 PTA-2792

Dit hybridoom en andere die antilichamen produceerden met specificiteit voor IGF-IR, worden beschreven in WO 02/05359, gepubliceerd op 11 juli 2002. De tekst van deze 15 publicatie, inclusief alle beschreven sequenties, wordt hierbij bij referentie opgenomen.

Twee raamwerkmutaties in de zware keten en drie raam-werkmutaties in de lichte keten van antilichaam 2.12.1 werden teruggecorrigeerd naar kiemlijn wat het antilichaam 20 2.12.1fx. opleverde.

Alle veranderingen om 2.12.lfx-mutaties te maken werden uitgevoerd met behulp van de QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene**) door een plasmide te bereiden met een doelwitplaats voor mutatie door het plasmide 25 te denatureren en te hybridiseren met de oligonucleotide-primers die de gewenste mutatie bevatten. De niet-streng-vervangende-werking van Pfu-Turbo-DNA-polymerase werd gebruikt om de mutagene primers te verlengen en in te bouwen, resulterend in halfgeknipte circulaire strengen. Di-30 gestie van de gemethyleerde, niet-gemuteerde ouder-DNA-template met Dpnl werd gevolgd door transformatie van de het circulaire, halfgeknipte dsDNA in supercompetente XLlBlue-cellen. Na transformatie repareerden de supercompetente XLlBlue-cellen de halfknipplaatsen in het gemu-35 teerde plasmide. DE plasmiden die mutaties bevatten werden geselecteerd en de sequentie werd geverifieerd.

10268294 65

Fig. 1 toont de DNA-sequentie die codeert voor de zware keten van antilichaam 2.12.1fx inclusief de sequentie die codeert voor de signaalsequentie die wordt gebruikt om het volwassen antilichaam tot expressie te bren-5 gen (SEQ ID NO: 1) . Fig. 2 toont de DNA-sequentie die codeert voor de lichte keten van antilichaam 2.12.1fx inclusief de sequentie die codeert voor de signaalsequentie die wordt gebruikt om het volwassen antilichaam tot expressie te brengen (SEQ ID NO: 2) . Fig. 3 toont een gelijkschik-10 king van de aminozuursequentie van de zware keten van antilichaam 2.12.1fx (SEQ ID NO: 3) met die van kiemlijnse-quentie DP35 (3-11)/D3-3/JH6 (SEQ ID NO: 4). De sequentie van antilichaam 2.12.1fx is weergegeven boven die van de kiemlijnsequentie. De signaalsequenties zijn cursief weer-15 gegeven en de CDR's zijn onderstreept. Het constante- domein-gebied begint met de aminozuurresten ASTK en komt overeen met aminozuurresten beginnend bij 48 in de kiem-lijn en loopt tot het einde van de sequentie. De raamwerk-mutaties (FR) bevinden zich bij aminozuurresten 21 en 116. 20 Fig. 4 toont een gelijkschikking van de aminozuursequentie van de lichte keten van antilichaam 2.12.1fx (SEQ ID NO: 5) met die van kiemlijnsequentie A30/Jkl (SEQ ID NO: 6) . De sequentie van antilichaam 2.12.1fx is weergegeven boven die van de kiemlijnsequentie. De signaalsequenties zijn 25 cursief weergegeven en de CDR's zijn onderstreept. Het constante-domein-gebied begint met de aminozuurresten TVAA en komt overeen met aminozuurresten beginnend bij 131 in de kiemlijn en loopt tot het einde van de sequentie. De raamwerkmutaties (FR) zijn de aminozuurresten 43, 125, en 30 129.

VOORBEELD II: Antilichaam gemedieerde blokkering van IGF-I/IGF-IR-bindinq ELISA-experimenten werden uitgevoerd om het vermogen 35 van het antilichaam van de uitvinding tot het remmen van IGF-I-binding aan IGF-IR te kwantificeren in een celassay. IGF-IR-getransfecteerde NIH-3T3-cellen (5xl04/ml) werden 1023829- 66 uitgeplaat in 100 μΐ DMEM-medium met veel glucose, aangevuld met L-glutamine (0,29 mg/ml), 10% hitte-geïnactiveerd FBS, en 500 pg/ml geneticine, penicilline en streptomycine in 96-puts-U-bodemplaten. De platen werden overnachts ge-5 incubeerd bij 37eC, 5% C02 zodat de cellen konden hechten. Het medium werd gedecanteerd uit de platen en vervangen door 100 μΐ vers medium per putje. Voor het testen werd het antilichaam verdund in assaymedium (DMEM-medium met veel glucose, aangevuld met L-glutamine (0,29 mg/ml), 10% 10 hittegeïnactiveerde FBS, en 500 pg/ml geneticine, penicilline en streptomycine) tot de gewenste eindconcentratie. Alle monsters werden in drievoud uitgevoerd. De platen werden tien minuten geïncubeerd bij 37 °C. Het [125I]-IGF-I werd verdund tot een concentratie van 1 pCi/ml in assayme-15 dium 50 μΐ werd toegevoerd per putje. Als controle voor achetrgrondradioactiviteit werd koude IGF-I toegevoegd tot een eindconcentratie van 100 ng/ml. De platen werden 10 minuten geïncubeerd bij 37°C en het medium werd gedecanteerd door voorzichtig deppen op papieren doekjes en twee-20 maal wassen met assaymedium. De cellen werden gelyseerd door 50 μΐ 0,1 N NaOH, 0,1% SDS toe te voegen en de platen werden vijf minuten bij kamertemperatuur geschud. De monsters werden overgebracht op een scintillatieplaat, 150 μΐ OptiPhase Supermix werd toegevoegd en het signaal werd ge-25 meten met behulp van een Wallace Micro-Bèta-teller.

Tabel I en Figuur 5 tonen de resultaten van dit experiment dat werd uitgevoerd met het antilichaam van de onderhavige uitvinding. Dit experiment liet zien dat het antilichaam van de uitvinding specifiek de binding van 30 [125I] -IGF-I aan cellen die IGF-IR tot expressie brengen remt.

_Tabel I

Monoklonaal antilichaam__IC50_ _2.12. lfx__0,4 pg/ml_ •1026829- 67 VOORBEELD III: Antilichaamgemedieerde remming van

IGF-I-qeïnduceerde fosforylerinq van IGF-IR

ELISA-experimenten werden uitgevoerd om te bepalen of het antilichaam van de onderhavige uitvinding in staat was 5 IGF-I-gemedieerde activering van IGF-IR te blokkeren. IGF-I-gemedieerde activering van IGF-IR werd gedetecteerd aan de hand van verlaagde receptorgeassocieerde tyrosinefos-forylering.

ELISA-plaatbereiding 10 ELISA-vangplaten werden bereid door 100 μΐ blokke- ringsbuffer (3% runderserumalbumine [BSA] in Tris-gebufferde zoutoplossing [TBS]) toe te voegen aan elk putje van ReactiBind Eiwit-G-bedekte 96-putsplaten (Pierce). De platen werden 30 minuten bij kamertemperatuur geïncu- 15 beerd onder schudden. Het pan-specifieke konijnen-SC-713-anti-IGF-IR-antilichaam(Santa Cruz) werd verdund in blok-keringsbuffer tot een concentratie van 5 pg/ml. 100 μΐ verdund antilichaam werd toegevoegd aan elk putje. De platen werden 60-90 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd 20 onder schudden. De platen werden vijfmaal gewassen met wasbuffer (TBS + 0,1% Tween 20) en de achterblijvende buffer werd weggedept op papieren doekjes. Deze platen kregen niet de gelegenheid uit te drogen voorafgaand aan de additie van lysaat.

25 Bereiding van lysaat uit IGF-IR tot expressie bren gende cellen

De IGF-IR-getransfecteerde NIH-3T3-cellen (5xl04/ml) werden overgebracht in 100 μΐ groeimedium (DMEM-medium met veel glucose, aangevuld met L-glutamine (0,29 mg/ml), 10% 30 hitte-geïnactiveerd FBS, en 500 pg/ml geneticine, penicilline en streptomycine) in 96-puts-ü-bodemplaten. De platen werden overnachts geïncubeerd bij 37°C, 5% CO2 zodat de cellen konden hechten. Het medium werd gedecanteerd uit de platen en vervangen door 100 μΐ vers medium per putje.

35 Voor het testen werd het antilichaam verdund ot vijfmaal de gewenste eindconcentratie in groeimedium en 25 μΐ werd toegevoegd per putje. Alle monsters werden in drievoud 1028829- 68

uitgevoerd. De platen werden één uur gelncubeerd bij 37°C. De cellen werden gestimuleerd met 25 μΐ/putje aan 600 ng/ml IGF-I (bereid in groeimedium) en 10 minuten gelncu-beerd bij kamertemperatuur. Het medium werd gedecanteerd 5 door de platen om te keren en voorzichtig te deppen op papieren doekjes. De aangehechte cellen werden gelyseerd door toevoeging van 50 μΐ lysebuffer (50 mM HEPES, pH

7,4,10 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1,6 mM NaV04, 1% Triton X-100, 1% glycerol) en onmiddellijk voorafgaand aan 10 gebruik aangevuld met één EDTA-vrij proteaseremmertablet [Roche Molecular Sciences] per 50 ml) . De cellen werden 5 minuten bij kamertemperatuur geschud. 200 μΐ verdunnings-buffer (50 mM HEPES, pH 7,4, 1,6 mM NaV04) werd toegevoegd aan elk putje en gemengd door middel van pipetteren. 100 15 μΐ lysaat werd overgebracht vanuit elk putje naar elk putje van de zoals hierboven beschreven bereide ELISA-vangplaat en twee uur bij kamertemperatuur gelncubeerd onder voorzichtig schudden.

ELISA met antifosfotyrosine- (pTYR) antilichamen 20 Het cellysaat werd verwijderd door de platen om te keren, vijfmaal te wassen met wasbuffer en achtergebleven vloeistof weg te deppen op papieren doekjes. 100 μΐ per putje aan pTYR-specifiek antilichaam (HRP-PY54) werd toe-gevóegd en verdund in blokkeringsbuffer tot een concentra-25 tie van 0,2 pg/ml. De cellen werden 30 minuten bij kamertemperatuur gelncubeerd door de platen te schudden. De platen werden vervolgens vijfmaal gewassen met wasbuffer en gedept op papieren doekjes.

Binding van het HRP-PY54-antilichaam werd gedetec-30 teerd door 100 μΐ per putje aan TMB-peroxidasesubstraatoplossing (Kirkegaard & Perry) toe te voegen en onder schudden te incuberen terwijl de kleur zich ontwikkelde (ongeveer 2-10 minuten). De kleurontwik-kelingsreactie werd gestopt door 10 μΐ TMB-stopoplossing 35 (Kirkegaard & Perry) per putje toe te voegen. De platen werden 10 seconden bij kamertemperatuur geschud om de op- 1026829* 69 lossing te mengen en de verkleuring werd bepaald door meting van de OD bij 450 nm.

Tabel II en Figuur 6A tonen de resultaten van dit exp met het antilichaam van de uitvinding, e resultaten van 5 dit experiment laten het vermogen zien van het antilichaam van de onderhavige uitvinding om IGF-I-gemedieerde activering van IGF-IR te blokkeren zoals blijkt uit verlaagde receptorgeassocieerde tyrosinefosforylering. Verder kunnen deze resultaten worden gebruikt om de relatieve potentie 10 van het antilichaam van de onderhavige uitvinding te kwantificeren.

_Tabel II_

Monoklonaal antilichaam__IC50 (pg/ml)_ 2.12.lfx 0,42 VOORBEELD IV: Species-kruisreactiviteit van het anti-15 lichaam van de uitvinding

Teneinde de species-kruisreactiviteit van het antilichaam van de uitvinding te bepalen werden verscheidene experimenten uitgevoerd waaronder immuunprecipitatie, anti-lichaamgemedieerde blokkering van IGF-I-geïnduceerde re-20 ceptorfosforyelring en FACS-analyse.

Om immuunprecipitatie-experimenten uit te voeren werden cellen uitgeplaat in DMEM-medium met veel glucose, aangevuld met L-glutamine (0,29 mg/ml), 10% hitte- geïnactiveerd FBS, en 500 pg/ml geneticine, penicilline en 25 streptomycine, tot 50% confluentie in T25-flessen. 100 μΐ van een antilichaam van de uitvinding in Hank's gebufferde zoutoplossing (HBSS); Gibco BRL) in een concentratie van 1 pg/ml werd toegevoegd. De platen werden 30 minuten bij 37°C geïncubeerd in een incubator en vervolgens werden de 30 cellen gestimuleerd met IGF-I bij 100 ng/ml gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. De cellen werden gelyseerd in RIPA-buffer (Harlo en Lane, supra) en het IGF-IR geïm-muunprecipiteerd met 2 |ig pan-specifiek SC-713-anti-IGF-IR-antilichaam (Santa Cruz) plus eiwit-A-agarosekorrels 35 gedurende 1 uur bij 4°C. De korrels werden gepelleteerd en 11023829- 70 driemaal gewassen met PBS/T (PBS + 0,1% Tween 20) en vervolgens opgekookt in 40 μΐ Laemmli-buffer met 5% βΜΕ.

De zoals hierboven beschreven bereide monsters werden vervolgens geanalyseerd door middel van Western-blot. 12 5 μΐ van elk monster werd opgebracht per laan op 4-10% gradiënt Novex^-gelen ontwikkeld met IX MES-buffer (Novex**) . Gelen werden ontwikkeld bij 150 V gedurende 1 uur of bij 200 V gedurende ongeveer 30 minuten. De gel werd overgebracht op een membraan in Novex**-overdrachtsbuffer met 10% 10 methanol, hetzij overnachte bij 100 mA of gedurende 1-1,5 uur bij 250 mA. DE membraan kreeg de gelegenheid volledig te drogen en werd bij kamertemperatuur geblokkeerd met TBS (Tris-gebufferde zoutoplossing, pH 8,0) met Superblock (Pierce Chemical Co.) Het IGF-IR-blot-antilichaam SC713 15 (Santa Cruz) of een fosfotyrosineantilichaam werd toegevoegd om respectievelijk immuungeprecipiteerd IGF-IR of fosfo-IGF-IR te detecteren.

Dit experiment werd uitgevoerd met het antilichaam van de uitvinding op cellen uit een verscheidenheid aan 20 dieren. Het antilichaam was in staat humaan IGF-IR te binden, maar niet dat van honden of muizen. Deze experimenten geven aan dat de antilichamen zeer specifiek zijn.

Bepaling van kruis-soort-affiniteit van antilichamen van de uitvinding 25 FACS-analyse werd uitgevoerd om.de affiniteit van het antilichamen van de uitvinding te bepalen voor IGF-IR uit andere dieren, in het bijzonder de hierboven beschreven apen van de oude wereld. Hoeveelheden humane en apencellen (cynomolgus) (5xl04) werden 1 uur geincubeerd op ijs met 30 toenemende concentraties gebiotinyleerde anti-IGF-IR-antilichamen van de uitvinding. De monsters werden 30 minuten op ijs geincubeerd met streptavidine-geconjugeerd RPE (fycoerythrine). Binding werd gemeten door middel van doorstroomcytometrie en geanalyseerd aan de hand van his-35 togrammen van fluorescentie-intensiteit (F12-H) versus ce-laantal (Telling) met behulp van CellQuest-programmatuur. Binding (Ka) werd berekend voor elk antilichaam uit grafie- 1026829? 71 ken van gemiddelde fluorescentie-intensiteit versus anti-lichaamconcentratie. In de meeste experimenten werd binding gemeten in gekweekte humane MCF-7-cellen en cyno-molgus-weefselkweekcellen. Depletie van het antilichaam 5 werd gecontroleerd door binding te meten bij verschillende celconcentraties.

De hierboven genoemde FACS-analyse werd uitgevoerd om het vermogen van het antilichaam van de uitvinding om te binden aan humane en cynomolguscellen te testen. Een half-10 maximale binding (Ka) van 0,1 ug/ml voor alle geteste cellijnen werd waargenomen.

VOORBEELD V; IGF-I-receptor-neerrequlatie

Om te onderzoeken of het antilichaam van de uitvin-15 ding de neerregulatie van IGF-1R op het oppervlak van cellen kon induceren, werden MCF7-cellen uitgeplaat in DMEM/F12-medium aangevuld met L-glutamine (0,29 mg/ml), 10% hitte-geïnactiveerd FBS, penicilline en streptomycine tot 50% confluentie in T75-flessen. Het antilichaam van de 20 uitvinding werd aan de cellen toegevoegd in een eindcon-centratie van 1 mg/ml. De platen werden gedurende het aangegeven aantal uren geïncubeerd bij 37°C in een incubator en vervolgens gelyseerd in 50 mM HEPES, pH 7,4, 10 mM

EDTA, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1,6 mM NaVO*, 1% Triton X-25 100, 1% glycerol. Het gehalte aan totaal IGF-1R in de ce- lextracten werd bepaald door middel van Western-blotanalyse met behulp van het pan-specifieke SC713-anti-IGF-IR-antilichaam (Santa Cruz). Zie Fig. 6B. Behandeling van de MCF7-cellen met het antilichaam van de uitvinding 30 resulteerde in 60-70 procent neerregulering van IGF-1R in 1-2 uur.

VOORBEELD VI: Effecten van het antilichaam van de uitvinding op IGF-IR in vivo 35 Een experiment werd uitgevoerd om te bepalen of de effecten van het antilichaam van de uitvinding op IGF-IR zoals beschreven in de voorgaande voorbeelden zou optreden 1026829a 72 in vivo. Tumoren werden geïnduceerd in athymische muizen volgens gepubliceerde werkwijzen (V.A. Pollack et al., "Inhibition of epidermal growth factor receptor-associated tyrosine phosphorylation in human carcinomas with CP-5 358,774: Dynamics of receptor inhibition in situ and anti- tumor effects in athymic mice," J. Pharmacol. Exp. Ther. 291 :739-748 (1999). Kort gezegd werden IGF-IR- getransfecteerde NIH-3T3-cellen (5xl06) subcutaan geïnjecteerd in 3-4 weken oude athymische (nu/nu) muizen met 0,2 10 ml Matrigelpreparaat. De muizen werden vervolgens intrape-ritoneaal geïnjecteerd met een antilichaam van de uitvinding nadat duidelijke (i.e. ongeveer 400 mm3) tumoren waren gevormd.

Na 24 uur werden de tumoren verwijderd, gehomogeni-15 seerd, en werd het gehalte aan IGF-IR bepaald. Om IGF-IR-gehalten te bepalen werd het SC-713-antilichaam verdund in Blokkeringsbuffer tot een eindconcentratie van pg/ml en 100 μΐ werd toegevoegd aan elk putje van een ReactiBind met Goat anti-rabbit (GAR) bedekte plaat (Pierce). De pla-20 ten werden geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 1 uur onder schudden en vervolgens vijfmaal gewassen met wasbuffer. De tumormonsters werden gewogen. 12,5 μΐ tumor-extract werd verdund met lysebuffer tot een eindvolume van 100 μΐ. Een monster van 100 μΐ werd toegevoegd aan elk 25 putje van een 96-putsplaat. De platen werden 1- uur bij kamertemperatuur geïncubeerd onder schudden en vervolgens vijfmaal gewassen met Wasbuffer. 100 μΐ HRP-PY54 of gebio-tinyleerd anti-IGF-IR-antilichaam in Blokkeringsbuffer werd toegevoegd aan elk putje en 30 minuten bij kamertem-30 peratuur geïncubeerd onder schudden. De platen werden vijfmaal gewassen met wasbuffer en werden ontwikkeld. De platen werden ontwikkeld door reactie met HRP-PY54 door toevoeging van 100 μΐ van het TMB-microputsubstraat per putje en de kleurontwikkeling werd gestopt door toevoeging 35 van 100 μΐ 0,9 M H2SO4. Het signaal werd gekwantificeerd door 10 seconden te scudden en de ODisonm te meten. Het signaal werd genormaliseerd naar totaal eiwit. Platen die 1026829- 73 werden getest met anti-IGFIR-antilichaam werden ontwikkeld door 100 μΐ in Blokkeringsbuffer verdunde streptavidine-HRP toe te voegen aan elk putje, 30 minuten te incuberen bij kamertemperatuur onder schudden en vervolgens verder 5 te gaan zoals beschreven voor HRP-PY54.

Er werd waargenomen dat intraperitoneale injectie van het antilichaam van de uitvinding resulteerde in remming van IGF-IR-activiteit, zoals gemeten door een verlaging van IGF-IR-eiwit (Figuur 7) . Verder was deze remming ge-10 voelig voor de geïnjecteerde dosis antilichaam (Figuur 7). Deze gegevens tonen aan dat het antilichaam van de uitvinding in staat is het IGF-IR in vivo te viseren op een wijze zoals waargenomen in vitro.

15 VOORBEELD VII; Groeiremming (TGI) van 3T3/IGF-IR- celtumoren

Het antilichaam van de uitvinding werd getest om te bepalen of het kon dienen om tumorgroei te remmen. Tumoren werden geïnduceerd zoals hierboven beschreven (Voorbeeld 20 VI) en indien het aansloeg vormden zich voelbare tumoren (i.e. 250 mm3, binnen 6-9 dagen). De muizen werden behandeld met een enkelvoudige dosis van 0,20 ml antilichaam door middel van intraperitoneale injectie. De tumorgrootte werd elke derde dag gemeten met een Vernier-diktemeter 25 over twee diameters en het volume werd berekend met behulp van de formule (lengte x [breedte]2)/2 volgens werkwijzen opgesteld door Geran, et al., "Protocols for screening Chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems," Cancer Chemother. Rep. 3:1-30 104.

Na de analyse met het antilichaam van de uitvinding werd waargenomen dat een enkelvoudige behandeling met alleen het antilichaam de groei van IGF-IR-getransfecteerde NIH-3T3-celgeïnduceerde tumoren remde (Figuur 8A) . Verder 35 werd in combinatiestudies met een enkelvoudige dosis van 7,5 mg/kg intraveneus toegediende adriamycine waargenomen dat toediening van een enkelvoudige dosis van het antili- '1026829“ 74 chaam de effectiviteit van adriamycine, een bekende remmer van tumorgroei, verhoogde. DE combinatie van adriamycine met het antilichaam van de uitvinding gaf een groeivertraging te zien van 7 dagen ten opzichte van behandeling met 5 alleen het antilichaam of adriamycine (Figuur 8B).

VOORBEELD VIII; Verband tussen antilichaamqehaltes en IGF-IR-neerregulatie

Tumoren werden geïnduceerd in naakte muizen zoals be-10 schreven in Voorbeeld VI. De muizen werden vervolgens behandeld met 125 pg antilichaam door middel van intraperi-toneale injectie, zoals beschreven in Voorbeeld VI. De tumoren werden verwijderd en IGF-IR-gehaltes werden gemeten met behulp van ELISA. Figuur 9 toont de serum- 15 antilichaamgehaltes en IGF-IR-receptorgehaltes in de tijd. Het experiment toont aan dat de IGF-IR wordt neergereguleerd door het antilichaam en dat de mate van IGF-IR-remming dosisproportioneel is met de serumconcentratie van het antilichaam.

20 VOORBEELD IX: Groeiremming van colorectale celtumoren

Tumoren werden geïnduceerd in naakte muizen zoals beschreven in Voorbeeld VI, behalve dat Colo-205-cellen (ATCC CCL 222) werden gebruikt. Colo-225-cellen zijn huma-25 ne colorectale adenocarcinoomcellen. Muizen met gevestigde subcutane tumoren van ongeveer 250 mm3 werden behandeld met verschillende hoeveelheden van het antilichaam (i.p.) of met 100 mg/kg 5-fluordesoxyuridine (5-FU, i.v.), hetzij als afzonderlijke middelen of in combinatie, zoals be-30 schreven in Voorbeeld VII. Figuur 10A en Figuur 10B tonen de tumorgrootte in relatie tot de verschillende behandelingen in de tijd. Het experiment toont aan dat behandeling met een éénmaal toegediend anti-IGF-IR-antilichaam de groei van humane colorectale kankercellen remt indien 35 toegdiend als afzonderlijk middel, en de effectiviteit van 5-FU, een bekende tumorremmer, verhoogt.

1023829? 75 VOORBEELD X: Farmacokinetiek van anti-IGF-IR- antilichamen in vivo

Om de farmacokinetiek van de anti-IGF-IR-antilichamen te evalueren werden cynomolgusapen intraveneus geïnjec-5 teerd met 5 mg/kg van het antilichaam in een acetaatbuf-fer. Serum werd op verschillende tijdstippen afgenomen en anti-IGF-IR-antilichaamconcentratiues in de apen werden gedurende een periode tot aan tien weken bepaald. Om functionele serumantilichaamgehaltes te bepalen werd het ex-10 tracellualire domein van humaan IGF-IR (IGF-I-sRr R&D Systems, Catalogusnr. 391GR) gebonden aan 96-putsplaten. Apenserum (verdund tussen 1:100 en 1:15000) werd toegevoegd aan de assayplaten zodat elk monster binnen het lineaire gebied van de standaardcurve zou liggen, en geïncu-15 beerd onder omstandigheden waarbij alle anti-IGF-IR-antilichaam zou binden aan IGF-I-sR). Na wassen van de platen, werd een gelabeld anti-humaan-IgG-antilichaam aan de platen toegevoegd en werd geïncubeerd onder omstandigheden waarin het anti-humaan-IgG-antilichaam zou binden 20 aan het anti-IGF-IR-antilichaam. De platen werden vervolgens gewassen en ontwikkeld, en een controlestandaardcurve en lineaire regressiefit werd gebruikt om de hoeveelheid anti-IGF-IR-antilichamen te kwantificeren. Figuur 11 toont de concentratie aan antilichaam in serum in de tijd. Het 25 experiment toont aan dat de halfwaardetijd (ti/2) van het anti-IGF-IR-antilichaam 6,1 dagen bedraagt en een volume-verdeling (Vdss) heeft van 0,054 (L/kg) .

Alle in deze specificatie aangehaalde publicaties en octrooiaanvragen worden hierin bij referentie opgenomen 30 alsof elke afzonderlijke publicatie of octrooiaanvrage specifiek en afzonderlijk was aangeduid als zijnde bij referentie opgenomen. Hoewel de onderhavige uitvinding in enig detail is beschreven bij wijze van illustratie en voorbeeld, terwille van een duidelijk begrip, zal het de 35 vakman in het licht van de leringen van de onderhavige uitvinding duidelijk zijn dat daaraan bepaalde veranderingen en modificaties kunnen worden uitgevoerd zonder af te 1026829τ 76 wijken van de geest of strekking van de bijgevoegde conclusies.

10268294

Claims

1. Humaan monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan dat specifiek bindt aan humane insuline-achtige groeifactor-I-receptor (IGF-IR), dat ten minste 10 één gemuteerde aminozuurrest bevat op een gekozen positie die is vervangen door een overeenkomstige kiemlijnamino-zuurrest, waarbij het variabele gebied van de lichte keten aminozuurnummers 23 tot en met 130 van aminozuursequentie SEQ ID NO: 5 bevat. 15

2. Humaan antilichaam volgens of antigeenbindend gedeelte daarvan conclusie 1, waarbij de lichte keten aminozuurnummers 23 tot en met 236 van SEQ ID NO: 5 bevat.

3. Humaan antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan volgens conclusie 1, waarbij het variabele gebied van de zware keten aminozuurnummers 20 tot en met 144 van aminozuursequentie SEQ ID NO: 3 bevat.

4. Humaan antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan volgens conclusie 1, waarbij de zware keten aminozuurnummers 20 tot en met 470 van SEQ ID NO: 3 bevat.

5. Humaan antilichaam of antigeenbindend gedeelte 30 daarvan volgens conclusie 4, waarbij de zware keten be staat uit aminozuurnummers 20 tot en met 470 van SEQ ID NO: 3 en de lichte keten bestaat uit aminozuurnummers 23 tot en met 236 van SEQ ID NO: 5.

5 -CONCLUSIES-

6. Farmaceutisch preparaat voor de behandeling van kanker, dat het antilichaam of antigeenbindende gedeelte 1026829- daarvan volgens één van de conclusies 1-5 en een farmaceutisch aanvaardbare drager bevat.

7. Farmaceutisch preparaat volgens conclusie 6, dat 5 verder een antineoplastisch, chemotherapeutisch of antiti- mormiddel bevat.

8. Gebruik van een humaan antilichaam of antigeenbin-dende gedeelte daarvan volgens één van de conclusies 1-5, 10 voor de bereiding van een geneesmiddel voor het behandelen van kanker bij een mens.

9. Geïsoleerd polynucleotide dat een nucleïnezuurse-quentie bevat die codeert voor een zware keten of anti- 15 geenbindend gedeelte daarvan of een lichte keten of anti-geenbindend gedeelte daarvan van een antilichaam volgens één van de conclusies 1-5.

10. Vector omvattende het geïsoleerde nucleïnezuurmo-20 lecuul van conclusie 9.

11. Gastheercel omvattende de vector van conclusie 10.

12. Werkwijze voor het produceren van een monoklonaal antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan omvattende het kweken van de gastheercel van conclusie 11 en het winnen van het antilichaam. 30 -o-o-o- 1026829-