KR20060035796A - 변형된 인간 ｉｇｆ-ｉｒ 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 항체, 예컨대 점라인 잔기로 치환된 하나 이상의 선택된 돌연변이 잔기를 갖는 암치료용의 인간 IGF-I 수용체(IGF-IR)에 관한 것이다. 치환된 잔기는 골격 영역에서 체세포 돌연변이일 수 있다.

Description

변형된 인간 ＩＧＦ-ＩＲ 항체{MODIFIED HUMAN IGF-IR ANTIBODIES}

인슐린-유사 성장인자(IGF-I)는 혈장에서 고농도로 순환하는 7.5-kDa 폴리펩타이드이며 대부분의 조직에서 검출될 수 있다. IGF-I은 세포 분화 및 세포 증식을 자극하며, 또 지속적인 증식을 위해 대부분의 포유동물 세포 유형에 필요하다. 이들 세포 유형은 그 중에서도, 인간의 배수체 섬유아세포, 상피세포, 평활근 세포, T 림프구, 중성 세포, 골수양(myeloid) 세포, 연골세포, 조골세포 및 골수 줄기세포를 포함한다.

IGF-I 자극된 세포 증식 또는 분화를 초래하는 형질도입 경로의 제 1 단계는 IGF-I 또는 IGF-II(또는 생리적 농도 이상의 인슐린)을 IGF-I 수용체(receptor)에 결합시키는 것이다. IGF-I 수용체는 2개 유형의 서브유닛(subunit), 즉 알파 서브유닛(전적으로 세포외(extracellular)에 존재하며 리간드 결합에 작용하는 130-135kDa 단백질) 및 베타 서브유닛[막관통(transmembrane) 도메인 및 세포질 도메인을 갖는 95-kDa 막관통 단백질]으로 구성된다. IGF-IR은 티로신 키나아제 성장인자 수용체 군에 속하며[울리히(Ulrich) 등, Cell 61:203-212, 1990] 또 인슐린 수용체와 구조적으로 유사하다(울리히 등, EMBO J. 5:25-3-2512, 1986). IGF-IR은 처음에는 단일쇄(single chain) 프로수용체(proreceptor) 폴리펩타이드로서 합성된 다음 글라이코실화, 단백질 분해에 의해 가공되며 공유결합되어 2개의 알파 서브유닛과 2개의 베타 서브유닛을 포함하는 성숙한 460-kDa 헤테로테트라머(heterotetramer)를 형성한다. 베타 서브유닛은 리간드-활성화된 티로신 키나아제 활성을 보유한다. 이 활성은 베타 서브유닛의 자가인산화(autophosphorylation) 및 IGF-IR 기질의 인산화를 포함한 리간드 작용을 매개하는 신호전달과정(signaling pathway)에 관여한다.

시험관 및 체내에서의 종양세포의 유지에 있어서의 IGF-I 및/또는 IGF-IR의 역할에 관한 증거는 상당히 존재한다. IGF-IR 양은 폐[카이저(Kaiser) 등, J. Cancer Res. Clin Oncol. 119:665-668, 1993; 무디(Moody) 등, Life Sciences 52: 1161-1173, 1993; 맥콜리(Macauley) 등, Cancer Res., 50: 2511-2517, 1990], 유방[폴락(Pollack) 등, Cancer Lett. 38: 223-230, 1987; 푀켄스(Foekens) 등, Cancer Res. 49: 7002-7009 1989; 쿨렌(Cullen) 등, Cancer Res. 49: 7002-7009, 1990; 아티거(Arteaga) 등, J. Clin. Invest. 84: 1418-1423, 1989], 전립선 및 장[레마올-베넷(Remaole-Bennet) 등, J. Clin. Endocrinol. Metab. 75: 609-616, 1992; 구오(Guo) 등, Gastroenterol. 102: 1101-1108, 1992]의 종양에서 증가한다. 전립선 상피세포에서 IGF-I의 조절해제된(deregulated) 발현은 트랜스제닉 마우스(transgenic mice)에서 신생물형성(neoplasia)을 초래한다[디지오반니(DiGiovanni) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3455-60, 2000]. 또한 IGF-I은 인간의 신경교종의 자가분비 자극제[스탠드버그-노드비스트(Standberg-Nordgvist) 등, Cancer Res. 53: 2475-2478, 1993]인 것으로 보이는 반면에, IGF-I는 IGF-IR를 과잉발현한 섬유육종의 성장을 자극하였다[버틀러(Butler) 등, Cancer Res. 58: 3021-27, 1998]. 또한, IGF-I 양이 고 정상치인 개인은 IGF-I 양이 저 정상치인 개인에 비하여 일반 암의 위험이 더 크다[로젠(Rosen) 등, Trends Endocrinol. Metab. 10: 136-41, 1999]. 다양한 인간 종양의 성장에서 담당하는 IGF-I/IGF-I 수용체 상호작용의 역할에 대해서는 문헌[맥콜리, Br. J. Cancer, 65:311-320, 1992]을 참조한다.

칼로리 제한은 포유동물을 비롯한 다양한 동물 종의 수명 증가에 대한 가장 효과적이고 재현가능한 방해이다. 그것은 또한 발암 모델에서 가장 강력하고, 광범위하게 작용하는 암-예방 치료이기도 하다. 다수의 유효 효과의 기초가 되는 중요한 생물학적 메카니즘은 인슐린-유사 성장인자 1 과정이다[허스팅(Hursting) 등, Annu. Rev. Med. 54:131-52, 2003]이다.

EP0629240B1호는 환자에게 투여될 때 면역원성을 감소시키기 위하여 재조합 DNA 수법에 의해 항체 서열을 점라인(germline) 서열로 전환시키는 것을 언급하고 있다. WO02/066058A1호는 면역반응을 유발하는 경향을 감소시키도록 변형되는 EGF 수용체(HER1)에 관련된 항체를 언급하고 있다.

IGF-I 및 IGF-IR은 IGF-I 및/또는 IGF-IR가 과잉발현될 때, 암 및 기타 증식성 질환과 같은 질환에 존재하는 점에서 및 IGF-I 및/또는 IGF-IR가 저발현될 때, 아주 적은 IGF-I 및 IGF-IR가 질환에 존재하는 점에서, IGF-IR를 억제하거나 자극하기 위해 사용될 수 있었던 IGF-IR에 대한 항체를 생성하는 것이 바람직하다. 이러한 항체는 예컨대 2002년7월 11일 공개된 WO02/05359호에 기재되어 있다. 기재된 모든 서열을 포함한 상기 공개문헌의 내용은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다. IGF1R 항체는 또한 2003년 12월 4일 공개된 WO03/100008호, 2003년 12월 24일 공개된 WO03/106621호 및 2003년 7월 24일 공개된 WO03/59951호에 기재되어 있다.

발명의 개요

본 발명은 하나 이상의 체세포 돌연변이된 아미노산 서열이 점라인 아미노산 서열로 전환된, 변형된 인간 단클론 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다. 바람직하게는 상기 치환된 잔기는 항체의 가변 영역에 함유되어 있고, 보다 바람직하게는 상기 치환된 잔기는 가변 영역의 골격부위(framework region)에 함유되어 있다.

바람직하게는 본 발명의 인간 항체 또는 항원-결합 부분은 인간의 인슐린-유사 성장인자 I 수용체(IGF-IR)에 특이적으로 결합된다.

일개 구체예로서, 항체의 경쇄(light chain)의 가변영역의 서열은 점라인 A30 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열로 복귀(reverted back)된 3개의 골격 돌연변이를 포함한다. 바람직한 구체예로서, 경쇄의 가변영역은 서열번호 5의 아미노산 서열의 아미노산 번호 23 내지 130을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예로서, 인간 항체의 경쇄는 서열번호 5의 아미노산 번호 23 내지 236을 포함한다.

본 발명의 다른 구체예로서, 항체의 중쇄(heavy chain)의 가변영역의 서열은 점라인 DP-35 유전자에 의해 암호화된 아미노산으로 복귀된 2개의 골격 돌연변이를 포함한다. 바람직한 구체예로서, 중쇄의 가변영역은 서열번호 3의 아미노산 번호 20 내지 144를 포함한다. 더욱 더 바람직한 구체예로서, 인간 항체의 중쇄는 서열번호 3의 아미노산 번호 20 내지 470을 포함하고 또 경쇄는 서열번호 5의 아미노산 번호 23 내지 236을 포함한다.

다른 구체예로서, 본 발명의 항체의 중쇄는 말단 리신을 갖고 있지 않다. 특히, 본 발명은 중쇄가 서열번호 3의 아미노산 번호 20 내지 469를 포함하고 또 경쇄가 서열번호 5의 아미노산 번호 23 내지 236을 포함하는 항체에 관한 것이다.

본 발명은 항신생물제(antineoplastic agent), 화학요법제 또는 항종양제 및 약학적으로 허용되는 담체와 함께 본 발명에 따른 변형된 인간 항체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 인간에서 암 치료에 효과적인 양의 항체를 인간에게 투여하는 것을 포함하는 인간의 암을 인간 항체로 치료하는 방법에 관한 것이다. 일개 구체예로서, 본 발명은 본 발명의 항체와 함께 항신생물제, 항종양제, 항혈관형성제 또는 화학요법제를 투여하는 것을 포함하는 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 항체를 투여하는 것에 의해 환자를 항체로 치료하는 방법에 관한 것이다. 일개 구체예로서, 본 발명은 항신생물제, 항종양제, 항혈관형성제 또는 화학요법제를 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체의 중쇄 또는 그의 항원-결합 부분 또는 경쇄 또는 그의 항원-결합 부분을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일개 구체예로서, 본 발명은 항-IGF-IR 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 또는 이들의 항원-결합 부분을 암호화하는 핵산 분자 유효량으로 투여를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 분리된 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 2.12.1fx의 성숙 중쇄 및 경쇄와 동일한 아미노산 서열을 갖는 항체를 생성하는 숙주 세포를 포함한다.

본 발명은 핵산 분자에 의해 암호화되는 항체를 재조합적으로 생산하고 배양하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 항-IGF-IR 항체를 사용하여 IGF-IR 발현 조직의 존재 또는 위치를 진단하는 진단 방법에 관한 것이다.

도 1은 성숙 항체를 발현하기 위해 사용된 시그널 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, 항체 2.12.1fx의 중쇄를 암호화하는 DNA 서열을 도시한다(서열번호: 1).

도 2는 성숙 항체를 발현하기 위해 사용된 시그널 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, 항체 2.12.1fx의 경쇄를 암호화하는 DNA 서열을 도시한다(서열번호: 2).

도 3은 항체 2.12.1fx의 중쇄의 아미노산 서열(서열번호: 3)과 점라인 서열 DP-35(3-11)/D3-3/JH6의 아미노산 서열(서열번호: 4)을 정렬시킨 것을 도시한다. 항체 2.12.1fx의 서열은 밑줄로 표시되어 있다. 시그널 서열은 이탤릭체로 표시되어 있고 CDR은 밑줄로 표시한다. 불변(constant) 도메인 영역은 아미노산 잔기 ASTK로 시작되며, 점라인에서 148번에서 시작해서 서열의 끝까지 연장되는 아미노 산 서열에 상응한다. 골격(FR) 돌연변이는 아미노산 서열 잔기 21-116에 존재한다.

도 4는 항체 2.12.1fx의 경쇄의 아미노산 서열(서열번호: 5)과 점라인 서열 A30/Jk1의 아미노산 서열(서열번호: 6)을 정렬시킨 것을 도시한다. 항체 2.12.1fx의 서열은 점라인 서열 위에 도시한다. 시그널 서열은 이탤릭체로 표시되어 있고 CDR은 밑줄로 표시한다. 불변 도메인 영역은 아미노산 잔기 TVAA로 시작되며, 점라인에서 131번에서 시작해서 서열의 끝까지 연장되는 아미노산 서열에 상응한다. 골격(FR) 돌연변이는 아미노산 서열 잔기 43, 125 및 129에 존재한다.

도 5는 항-IGF-IR 항체 2.12.1fx가 3T-IGF-IR 세포에 IGF-I이 결합되는 것을 억제함을 도시한다.

도 6A 및 도 6B는 수용체-관련 티로신 인산화 감소(도 6A) 및 세포상에서 IGF-IR의 하향 조절을 유도하는 항체 2.12.1fx의 능력(도 6B)으로 예시되는 바와 같이, IGF-IR의 IGF-I 매개된 활성화를 차단하는 항체 2.12.1fx의 능력을 도시한다.

도 7은 항-IGG-IR 항체 2.12.1fx가 3T3-IGF-IR 종양에서 IGF-IR 양을 감소시킴을 도시한다.

도 8A 및 도 8B는 항-IGF-IR 항체가, 체내에서(도 8A) 및 아드리아마이신과 조합된 경우(도 8B)에서, 3T3-IGF-IR 종양 성장을 억제함을 도시한다.

도 9는 3T3-IGF-IR 종양에서 시간에 따른 항-IGF-IR 항체 2.12.1fx 혈청 양과 IGF-IR 하향조절 사이의 관계를 도시한다.

도 10A 및 도 10B는 항-IGF-IR 항체 2.12.1fx가, 체내에서(도 10A) 및 5-플 루오로데옥시유리딘(5-FU)과 조합된 경우(도 10B)에서, 콜로 205 종양 성장을 억제함을 도시한다.

도 11은 필리핀원숭이에서 항-IGF-IR 항체 2.12.1fx의 단일 정맥 주사의 약물대사속도 평가를 도시한다.

본 명세서에 기재된 모든 특허, 특허출원 및 기타 문헌은 모두 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.

다르게 정의하지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학용어 및 기술 용어는 당업자들이 일반적으로 이해하는 의미를 갖는 것으로 한다. 또한, 다르게 정의하지 않는 한, 단수 용어는 복수도 포함하는 것이고 또 복수 용어는 단수 형태도 포함하는 것이다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화(hybridization)와 관련한 명명법 및 수법은 당해 분야에서 잘 공지되어 있고 일반적으로 사용되는 것이다. 본 발명의 방법 및 수법은 다르게 나타내지 않는 한 당해 분야에 잘 공지되고 또 본 명세서를 통하여 인용되고 논의된 다양한 일반 및 특수 문헌에 기재된 통상의 방법에 따라서 일반적으로 실시한다. 예컨대, 본 명세서에 참고문헌으로 포함된 문헌[샘브룩(Sambrook) 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989) 및 오스벨(Ausubel) 등, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992) 및 할로우(Harlow) 및 레인(Lane) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)] 참조. 효소 반응 및 정제 수법은 당해 분야에서 통상적으로 실시되는 바와 같이 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 제조자 지시에 따라서 실시한다. 본 명세서에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의학 및 약학적 화학과 관련된 명칭 및 실험 과정 및 수법은 당업자에게 잘 공지되어 있으며 또 당해 분야에서 통상적으로 사용된다. 화학 합성, 화학 분석, 약학 제제, 배합물, 및 전달 및 환자 치료에 대해서는 표준 수법이 이용된다.

다르게 정의하지 않는 한, 하기 용어는 다음 의미를 갖는 것으로 이해될 것이다.

용어 "폴리펩타이드"는 천연 또는 인공 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의 폴리펩타이드 유사체를 포함한다. 폴리펩타이드는 단량체성 또는 중합성일 수 있다.

비-펩타이드 유사체는 주형 펩타이드의 특성과 유사한 특성을 갖는 약물로서 제약공업에서 일반적으로 사용된다. 비-펩타이드 화합물의 이들 형태를 "펩타이드 모방약" 또는 "펩티도모방약"이라 칭한다. 본 명세서에 참고문헌으로 포함된 문헌[포쳐(Fauchere), J. Adv . Drug Res. 15:29 (1986); 베버(Veber) 및 프라이딩거(Freidinger) TINS p.392 (1985); 및 에반스(Evans) 등, J. Med . Chem . 30:1229 (1987)]. 이러한 화합물은 컴퓨터화된 분자 모델의 도움으로 개발된다. 치료적으로 유용한 펩타이드와 구조적으로 유사한 펩타이드 모방약은 등가의 치료 또는 예방 효과를 얻기 위해 이용될 수 있다. 일반적으로, 펩티도모방약은 인간 항체와 같이 파라다임 폴리펩타이드(즉, 소망하는 생화학적 특성 또는 약리학적 활성을 갖는 폴리펩타이드)와 구조적으로 유사하지만 당해 분야의 공지 방법에 의해 --CH₂NH--, --CH₂S--, --CH₂CH₂--, --CH=CH--(시스 및 트랜스), --COCH₂--, --CH(OH)CH₂-- 및 --CH₂SO--로 구성된 군으로부터 선택된 결합에 의해 경우에 따라 치환된 하나 이상의 펩타이드 결합을 갖는다. 콘센서스(consensus) 서열의 하나 이상의 아미노산을 동일 유형의 D-아미노산으로 조직적으로 치환시키는 방법(예컨대 L-리신 대신 D-리신)은 더 안정한 펩타이드를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 또한, 콘센서스 서열 또는 실질적으로 동일한 콘센서스 서열 변형을 포함하는 억제된 펩타이드는, 당해 분야에 공지된 방법[리조(Rizo) 및 기라쉬(Gierasch) Ann. Rev. Biochem . 61:387 (1992), 본 명세서에 참고문헌으로 포함됨]으로, 예컨대 펩타이드를 환형화시키는 분자내 다이설파이드 브릿지를 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 부가하는 것에 생성될 수 있다.

"면역글로불린"은 사량체(tetramer) 분자이다. 천연 산출 면역글로불린에서, 각 사량체는 2개의 동일 쌍의 폴리펩타이드 사슬로 구성되며, 각 쌍은 1개의 경쇄(약 25kDa) 및 1개의 중쇄(약 50-70kDa)를 갖는다. 각 사슬의 아미노 말단 부분은 항원 인식에 주로 관여하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산으로 된 가변 영역을 포함한다. 각 사슬의 카복시 말단 부분은 이팩터(effector) 작용에 주로 관여하는 불변 영역을 정의한다. 인간 경쇄는 κ 및 λ 경쇄로 분류된다. 중쇄는 μ, Δ, γ, α 또는ε로 분류되며 항체의 아이소타이프를 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 각각 정의한다. 경쇄 및 중쇄에서, 가변 영역 및 불변영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 결합되며, 이때 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로, 문헌[Fundamental Immunology Ch. 7, 폴(Paul, W.) ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)](모든 목적에 대해 전체적으로 참고문헌으로 포함됨) 참조. 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 완전 면역글로불린이 2개의 결합 부위를 갖도록 항체-결합 부위를 형성한다.

면역글로불린 사슬은, 3개의 고가변 영역에 의해 결합되며, 소위 상보성 결정 영역 또는 CDR로도 불리는, 비교적 보존되는 골격 영역(FR)과 동일한 일반적 구조를 나타낸다. 각 쌍의 2개 사슬로부터의 CDR은 골격 영역에 의해 정렬되며, 특정 항원결합 부위에 결합을 가능하게 한다. N-말단으로부터 C-말단까지, 양쪽 경쇄 및 중쇄 사슬은 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인에 대해 아미노산을 배정하는 것은 문헌[Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 및 1991)) 또는 코티아(Chothia) & 레스크(Lesk) J. Mol . Biol . 196: 901-917 (1987); 코티아 등, Nature 342: 878-883 (1989)]의 정의에 따른다.

"항체"는 완전 면역글로불린을 지칭한다. 항원-결합 부분은 재조합 DNA 수법에 의해 또는 완전 항체의 효소적 또는 화학적 분해에 의해 생성될 수 있다. 항원-결합 부분은 그 중에서도, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, dAb 및 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일쇄 항체(scFv), 키메라 항체, 특정 항원 결합성을 폴리펩타이드에 부여하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 일부를 함유하는 이량체 및 폴리펩타이드를 포함한다.

Fab 단편은 VL, VH, CL 및 CH I 도메인으로 구성된 1가 단편이고; F(ab')₂ 단편은 힌지 영역에서 다이설파이드 브릿지에 의해 결합된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편이며; Fd 단편은 VH 및 CH1 도메인으로 구성되며; Fv 단편은 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성되며; 또 dAb 단편[워드(Ward) 등, Nature 341: 544-546, 1989]은 VH 도메인으로 구성된다.

단일쇄 항체(scFv)는 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어서, 단일 단백질 사슬로 되게 하는 합성 링커를 통하여 1가 분자를 형성하는 항체이다[버드(Bird) 등, Science 242: 423-426, 1988 및 허스톤(Huston) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883, Z988]. 이량체는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩타이드 사슬 상에서 너무 짧아서 동일 사슬 상의 2개 도메인 사이에 쌍을 형성할 수 없어서 이들 도메인이 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루게 하여 2개의 항원 결합 부위를 생성하는 링커를 이용하여 발현되어 있는 2가의 비특이적 항체이다[예컨대 홀링거(Holliger, P.) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, 1993, 및 폴작(Poljak, R. J.) 등, Structure 2:1121-1123, 1994 참조]. 하나 이상의 CDR은 공유결합적으로 또는 비공유적으로 분자에 혼입되어 이뮤노어드히신(immunoadhesin)으로 되게 한다. 이뮤노어드히신은 대형 폴리펩타이드 사슬의 일부로서 CDR에 혼입되어 CDR를 다른 폴리펩타이드 사슬에 공유결합적으로 결합시키거나 또는 CDR를 비공유적으로 혼입할 수 있다. CDR은 이뮤노어드히신으로 하여금 특정의 소망하는 항체에 특이적으로 결합되게 한다.

항체는 하나 이상의 결합 부위를 가질 수 있다. 하나 이상의 결합 부위가 존재하면, 이들 결합 부위는 서로 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있다. 예컨대, 천연 산출 면역글로불린은 2개의 동일한 결합 부위를 가지며, 단일쇄 항체 또는 Fab 단편은 1개의 결합 부위를 갖는 반면에, "이중특이적" 또는 "이작용성" 항체는 2개의 상이한 결합 부위를 갖는다.

"분리된 항체"는 (1) 다른 천연 산출 항체를 비롯한 천연 산출 성분과 결합되지 않은, 즉 천연 상태로 존재하는 항체, (2) 동일 종과 다른 단백질을 갖지 않는 항체, (3) 상이한 종으로부터 얻은 세포에 의해 발현된 항체, 또는 (4) 천연에서 생기지 않는 항체를 의미한다. 분리된 항체의 예는 IGF-IR을 사용하여 친화성 정제된 항-IGF-IR 항체, 하이브리도마 또는 기타 세포주에 의해 시험관에서 합성된 항-IGF-IR 항체 및 트랜스제닉 마우스로부터 유도된 인간의 항-IGF-IR 항체를 포함한다.

용어 "인간 항체"는 인간의 면역글로불린 서열로부터 유도된 하나 이상의 가변 영역 및 불변영역을 갖는 모든 항체를 포함한다. 바람직한 구체예로서, 가변 영역 및 불변 도메인 전부는 인간의 면역글로불린 서열(전체 인간 항체)로부터 유래된다. 이들 항체는 이하에 기재한 바와 같이 다양한 방식으로 제조할 수 있다.

"중화 항체" 또는 "억제 항체"는 과량의 항-IGF-IR 항체가 IGF-IR에 결합된 IGF-I의 양을 약 20% 이상으로 감소시킬 때 IGF-IR이 IGF-I에 결합되는 것을 억제하는 항체이다. 바람직한 구체예로서, 항체는 IGF-I이 IGF-IR에 결합되는 양을 40% 이상, 더욱 바람직하게는 60%, 더욱 바람직하게는 80%, 더욱 더 바람직하게는 85% 감소시킨다. 결합 감소는 시험관내에서 경쟁적 결합 에세이(assay)로 측정하는 바와 같이 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 사람에게 공지된 방식, 예컨대 시험관 경쟁적 결합 에세이에 의해 측정될 수 있다.

"활성화 항체"는 IGF-IR을 발현하는 세포, 조직 또는 기관에 부가되면 약 20% 이상 IGF-IR를 활성화하는 항체이다. 바람직한 구체예로서, 항체는 IGF-IR 활성을 40% 이상, 보다 바람직하게는 60%, 더욱 바람직하게는 80% 또는 더 더욱 바람직하게는 85% 활성화시킨다. 보다 바람직한 구체예로서, 활성화 항체는 IGF-I 또는 IGF-II 존재하에서 부가된다. 다른 바람직한 구체예로서, 활성화 항체의 활성은 IGF-IR의 티로신 자가인산화 양을 측정하는 것에 의해 결정된다.

항체의 단편 또는 유사체는 본 명세서에 기재된 사항을 따라 당업자들이 용이하게 제조할 수 있다. 단편 또는 유사체의 바람직한 아미노 및 카복시 말단은 작용성 도메인의 경계 근처에서 생긴다. 구조적 및 기능적 도메인은 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열 데이터를, 공개된 또는 특허된 서열 데이터베이스와 대조함으로써 확인할 수 있다. 바람직하게는, 컴퓨터화된 대조 방법을 이용하여 공지 구조 및/또는 작용을 갖는 다른 단백질에서 생기는 서열 모티프 또는 예상된 단백질 구조 도메인을 확인한다. 공지의 3차원 구조에 들어맞는 단백질 서열을 확인하는 방법은 공지되어 있다. 문헌[보위(Bowie) 등, Science 253: 164 (1991)] 참조.

본 명세서에 이용된 것과 같은 용어 "표면 플라스몬 공명"은 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도 변화를, 예컨대 BIAcore 시스템(파마시아 바이오센서 악티엔볼라게트, 스웨덴 웁살라 및 뉴저지주 피스카타웨이)을 이용하여 검출하는 것에 의해 실시간 생체특이적 상호작용을 분석하는 광학 현상을 지칭한다. 더 자세한 것은 예컨대 문헌[존슨(Johnsson, U.) 등, (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; 존슨 등, (1991) Biotechniques 11: 620-627; 존슨 등, (1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131; 및 존슨 등, (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277]을 참조한다.

용어 "K_off"는 항체/항원 복합체로부터 항체를 분리하는 분리율(off rate) 상수를 지칭한다.

용어 "K_d"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 지칭한다.

본 명세서에 이용된 바와 같이, 20개의 통상적인 아미노산 및 그의 약어는 통상의 이용법을 따른다. 본 명세서에 참고문헌으로 포함된 문헌[Immunology - A Synthesis (2nd Edition, 골럽(E.S. Golub) 및 그렌(D. R. Gren) Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))] 참조. 20개의 통상의 아미노산의 입체이성질체(예컨대 D-아미노산), α,α-이치환 아미노산과 같은 비천연 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산 및 기타 비통상적인 아미노산이 본 발명의 폴리펩타이드용으로 적합한 성분일 수 있다. 비통상적인 아미노산의 예는 4-하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, ε-N,N,N-트라이메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-폼일메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시리신, s-N-메틸아르기닌, 및 기타 유사한 아미노산 및 이미노 산(예컨대 4-하이드록시프롤린)을 포함한다. 본 명세서에 사용된 폴리펩타이드 표시에서, 표준 이용 및 협의에 따라, 좌측 방향은 아미노 말단 방향이고 또 우측 방향은 카복시 말단 방향이다.

본 명세서에서 지칭된 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 리보뉴클레오타이드이거나 데옥시리보뉴클레오타이드인 10개 이상의 염기 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태 또는 뉴클레오타이드의 변형 형태를 의미한다. 이 용어는 단일가닥 및 이중가닥 형태의 DNA를 포함한다.

본 명세서에서 이용된 바와 같은 용어 "분리된 폴리뉴클레오타이드"는 게놈, cDNA, 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오타이드 또는 이들의 조합물을 의미할 수 있으며, 그의 기원에 의해 "분리된 폴리뉴클레오타이드"는 (1) "분리된 폴리뉴클레오타이드"가 천연에서 발견되는 폴리뉴클레오타이드 전부 또는 일부와 관련이 없거나, (2) 천연적으로 결합되지 않는 폴린클레오티드에 기능적으로 결합되거나, 또는 (3) 대형 서열의 일부로서 천연에서 생기지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "천연 산출 뉴클레오타이드"는 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "변형된 뉴클레오타이드"는 변형되거나 치환된 당 기를 갖는 뉴클레오타이드를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "올리고뉴클레오타이드 결합"은 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로다이셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포로아닐라데이트, 포스포로아미데이트 등을 포함한다. 예컨대, 본 명세서에 참고문헌으로 포함된 문헌[라플랭키(LaPlanche) 등, Nucl . Acids Res. 14: 9081 (1986); 스텍(Stec) 등, J. Am. Chem . Soc. 106: 6077 (1984); 스타인(Stein) 등, Nucl . Acids Res. 16: 3209 (1988); 존(Zon) 등, Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991); 존 등, Oligonucleotides and Analogues : A practical Approach, pp.87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); 스텍 등, 미국특허 제5,151,510호; 울만(Uhlmann) 및 페이맨(Peyman) Chemical Reviews 90: 543 (1990)] 참조. 올리고뉴클레오타이드는 필요한 경우 검출용 라벨을 포함할 수 있다.

"기능적으로 결합된" 서열은 목적하는 유전자와 인접하는 발현 제어 서열 및 트랜스로 작용하거나 목적하는 유전자를 제어하기 위해 떨어져 있는 발현 제어 서열을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "발현 제어 서열"은 이들이 결찰된 코딩 서열의 발현 및 가공에 영향을 주는데 필요한 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 발현 제어 서열은 적합한 전사 개시, 종료, 프로모터 및 인헨서 서열; 스플라이싱(splicing) 및 폴리아데닐화 시그널과 같은 효과적인 RNA 가공 시그널; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열(즉, Kozak 콘센서스 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 필요한 경우, 단백질 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 이러한 제어 서열의 성질은 숙주 생물에 따라 달라지는데; 원핵생물의 경우, 이러한 제어 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종료 서열을 포함하며; 진핵생물의 경우, 일반적으로 이러한 제어 서열은 프로모터 및 전사 종료 서열을 포함한다. 용어 "제어 서열"은 최소한 그 존재가 발현 및 가공에 필수적인 모든 성분을 포함하는 것으로, 그 존재가 이로운 부가적인 성분, 예컨대 리더 서열 및 융합 파트너 서열도 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된 것과 같은 용어 "벡터"는 결합되어 있는 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 1개 유형은 "플라스미드"로서, 이것은 부가적 DNA 절편이 결찰될 수 있는 환형의 이중쇄 DNA 루프를 지칭한다. 벡터의 다른 유형은 바이러스 벡터로서, 이때 부가적 DNA 절편은 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포(예컨대 세균성 복제 기점을 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터)에서 자동적으로 복제할 수 있다. 다른 벡터(예컨대 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입되면 숙주 세포의 게놈에 통합되므로 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 이들이 기능적으로 결합된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터를 본 명세서에서는 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")라 칭한다. 일반적으로, 재조합 DNA 수법에서 유용한 발현 벡터는 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 형태의 벡터이기 때문에 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 작용을 갖는 바이러스 벡터(예컨대 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스)와 같은 다른 형태의 발현 벡터도 포함하는 것이다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭하는 것이다. 이러한 용어는 특정 검체 세포를 지칭할 뿐만 아니라 그러한 세포의 후대로 지칭한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인하여 후속 세대에서 특정 변형이 생길 수 있기 때문에, 이러한 후대는 실제로 부모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범위에 여전히 포함된다.

핵산에 대한 언급은 다르게 정의하지 않는 한 상보 서열도 포함하는 것이다. 따라서, 특정 서열을 갖는 핵산 분자를 언급하는 것은 그의 상보적인 서열을 갖는 상보적 가닥도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "라벨" 또는 "라벨링된"은 항체에 다른 분자를 혼입시킨 것을 지칭한다. 일개 구체예로서, 라벨은 검출가능한 마커로서, 예컨대 방사성표지된 아미노산의 부착 또는 표시된 애비딘에 의해 검출될 수 있는 바이오티닐 잔기를 폴리펩타이드에 부착하는 것을 포함한다(예컨대 형광 마커를 함유하는 스트렙트애비딘 또는 광학 또는 비색적 방법으로 검출될 수 있는 효소 활성). 다른 구체예로서, 라벨 또는 마커는 치료용, 예컨대 약물 콘쥬게이트 또는 독소일 수 있다. 폴리펩타이드 및 당단백질을 라벨링하는 다양한 방법이 당해 분야에 공지되어 있으며 또 사용되고 있다. 폴리펩타이드용 라벨의 예는 예컨대 방사성동위원소 또는 방사성핵종(raidonuclide)(예컨대 ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I), 형광 라벨(예컨대 FITC, 로다민, 란타니드 인광체), 효소 라벨(예컨대 꽃양배추 퍼옥시다아제, β-갈락토시다아제, 루시페라아제, 알칼리성 포스파타아제), 화학발광 마커, 바이오티닐 기, 이차 리포터(예컨대 로이신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체용 결합 부위, 금속 결합 도메인, 항원결정기 태그)에 의해 인식되는 소정의 폴리펩타이드 항원결정기, 가돌리늄 킬레이트와 같은 자성물질, 백일해 독소와 같은 독소, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 다이하이드록시 안트라신 다이온, 미토크산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀올 및 퓨로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 일부 구체예로서, 라벨은 단백질 입체 장애를 감소시키기 위하여 다양한 길이의 스페이서 암(arm)에 의해 부착된다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "시약"은 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 마크로분자, 또는 생물학적 물질로 제조된 추출물을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "약학적 시약 또는 약물"은 환자에게 적절하게 투여되면 소망하는 치료 효과를 유도할 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 다른 화학 용어는 본 명세서에 참고문헌으로 포함된 문헌[The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985))]에 의해 예시된 바와 같이, 당해 분야에서 통상적인 용법에 따라 사용된다.

본 명세서에서 용어 "항신생물제"는 인간에서 신생물, 특히 악성(암적) 병반, 예컨대 악성종양, 육종, 림프종 또는 백혈병의 발생이나 진행을 억제하는 작용을 갖는 시약을 지칭한다. 전이 억제는 항신생물제의 주된 특성이다.

항체는 IgG, IgM, IgE, IgA 또는 IgD 분자일 수 있다. 바람직한 구체예로서, 항체는 IgG이고 또 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브타입이 있다. 보다 바람직한 구체예로서, 항-IGF-IR 항체는 서브클래스 IgG2이다.

항-IGF-IR 항체의 클래스 및 서브클래스는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 결정할 수 있다. 일반적으로, 항체의 클래스 및 서브클래스는 항체의 특정 클래스 및 서브클래스에 특이적인 항체를 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 항체는 시중에서 구입할 수 있다. 클래스 및 서브클래스는 ELISA, 웨스턴 블럿 뿐만 아니라 다른 수법에 의해 결정될 수 있다. 다르게는, 클래스 및 서브클래스는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 도메인의 전부 또는 일부의 서열결정을 실시하고, 이들의 아미노산 서열을 면역글로불린의 다양한 클래스 및 서브클래스의 공지 아미노산 서열과 대조하여 항체의 클래스 및 서브클래스를 결정하는 것에 의해 결정될 수 있다.

본 발명은 또한 인간의 κ 유전자에 의해 암호화되는 가변 서열을 포함하는 항-IGF-IR 항체를 제공한다. 바람직한 구체예로서, 상기 가변 서열은 V_κ A27, A30 또는 O12 유전자 패밀리에 의해 암호화된다. 바람직한 구체예로서, 가변 서열은 인간의 V_κ A30 유전자에 의해 암호화된다. 보다 바람직한 구체예로서, 경쇄는 점라인 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열로 복귀된 3개의 골격 돌연변이를 포함한다.

서열번호:1은 2.12.1fx의 중쇄의 DNA 서열을 도시한다. 서열번호:2는 2.12.1fx의 경쇄의 DNA 서열을 제공한다. 서열번호:3은 2.12.1fx의 중쇄의 아미노산 서열을 제공한다. 서열번호:4는 점라인 DP-35의 아미노산 서열을 제공한다. 서열번호:5는 2.12.1fx의 경쇄의 아미노산 서열을 제공하며 또 서열번호:6은 점라인 A30/Jk1의 아미노산 서열을 제공한다. 나타낸 서열은 시그널 서열을 포함하는 항체에 미성숙 전구체에 대한 것이다.

일개 구체예로서, 항-IGF-IR 항체는 인간의 V_H DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 또는 VIV-4/4.35 유전자 패밀리에 의해 암호화된 가변 영역 서열을 포함한다. 바람직한 구체예로서, 가변 영역 서열은 인간의 V_H DP-35 유전자로부터 유도된다. 보다 바람직한 구체예로서, 중쇄는 점라인 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열로 복귀된 2개의 골격 돌연변이를 포함한다.

본 발명의 항-IGF-IR 항체를 암호화하는 핵산 분자도 제공된다.

일개 구체예로서, 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 핵산 분자는 A30, A27 또는 O12 V_κ 유전자로부터 유도된다. 바람직한 구체예로서, 경쇄는 A30 Vκ 유전자로부터 유도된다. 다른 바람직한 구체예로서, 경쇄를 암호화하는 핵산 분자는 Jκ1, Jκ2 또는 Jκ4로부터 유도된 결합 영역을 포함한다.

본 발명은 또한 2.12.1fx의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명은 또한 DP-35, DP-47, DP-71 또는 VIV-4/4.35 VH 유전자, 바람직하게는 DP-35 VH 유전자로부터 유도된 중쇄의 가변 영역(VH)을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 다른 바람직한 구체예로서, VH를 암호화하는 핵산 분자는 JH6 또는 JH5, 보다 바람직하게는 JH6으로부터 유도된 결합 영역을 포함한다. 본 발명은 또한 2.12.1fx의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

인간 항체의 전체 중쇄 및 경쇄중의 하나 또는 전부 또는 그의 가변 영역을 암호화하는 핵산 분자는 인간 항체를 생산하는 공급원으로부터 얻을 수 있다. 항체를 암호화하는 mRNA를 분리하는 방법은 당분야에 잘 공지되어 있다. 예컨대 상기 샘브룩 등의 문헌 참조. 항체 유전자의 중합효소 연쇄반응(PCR) 또는 cDNA 클로닝에 사용하기 위한 cDNA를 생성하기 위해 mRNA가 사용될 수 있다. 본 발명의 일개 구체예로서, 핵산 분자는 상기 기재한 바와 같이 항-IGF-IR 항체를 발현하는 하이브리도마, 바람직하게는 XENOMOUSE^TM, 비-인간 마우스 트랜스제닉 동물 또는 비-인간, 비-마우스 트랜스제닉 동물과 같은, 인간 면역글로블린 유전자를 발현하는 트랜스제닉 동물 세포를 융합 파트너중의 하나로 갖는 하이브리도마로부터 얻을 수 있다. IGF-IR 항체는 IGF-IR에 특이적인 것 이외에도 본 발명의 인간 항체에 일반적으로 적용될 수 있다.

항-IGF-IR 항체의 중쇄 전부를 암호화하는 핵산 분자는 항체의 중쇄의 가변 도메인 또는 항원-결합 도메인을 암호화하는 핵산 분자를 중쇄의 불변 도메인과 융합시키는 것에 의해 작성될 수 있다. 유사하게, 항-IGF-IR 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산 분자는 항체의 경쇄의 가변 도메인 또는 항원-결합 도메인을 암호화하는 핵산 분자를 경쇄의 불변 도메인과 융합시키는 것에 의해 작성될 수 있다. VH 및 VL 사슬을 암호화하는 핵산 분자는 이들을 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 암호화하는 발현 벡터에 삽입하여 VH 절편이 벡터내의 중쇄 불변 영역(CH) 절편에 능적으로 결합되고 VL 절편이 벡터내 경쇄 불변 영역(CL) 절편에 기능적으로 결합되도록 함으로써 전체 길이의 항체 유전자로 전환될 수 있다. 다르게는, VH 또는 VL 사슬을 암호화하는 핵산 분자는 VH 사슬을 암호화하는 핵산 분자를, 표준 분자 생물학적 수법을 이용하여 CH 사슬을 암호화하는 핵산 분자에 결찰시키는 것에 의해 결합시켜 전체 길이 항체 유전자로 전환된다. VL 및 CL 사슬을 암호화하는 핵산 분자를 사용하여 동일한 것을 달성할 수 있다. 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당분야에 공지되어 있다. 예컨대 문헌[캐벗(Kabat) 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., NIH Publ. No. 91-3242, 1991] 참조. 전체 길이의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자는 이들이 도입되어 항-IGF-IR 항체가 분리된 세포로부터 발현될 수 있다.

다른 구체예로서, 항-IGF-IR 항체의 중쇄 또는 그의 항원-결합 도메인, 또는 항-IGF-IR 항체의 경쇄 또는 그의 항원-결합 도메인을 암호화하는 핵산은 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 비-인간, 비-마우스 동물로부터 분리될 수 있으며 또 IGF-IR 항원으로 면역화되었다. 다른 구체예로서, 상기 핵산 분자는 비-트랜스제닉 동물 또는 항-IGF-IR 항체를 생산하는 인간 환자로부터 유도된 항-IGF-IR 항체-생산 세포로부터 분리될 수 있다. 항-IGF-IR 항체 생산 세포로부터 mRNA는 표준 수법에 의해 분리되고, PCR 및 라이브러리 작성 수법을 이용하여 클로닝 및/또는 증폭되고 또 표준 수순을 이용하여 스크리닝하여 항-IGF-IR 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 얻는다.

상기 핵산 분자는 이하에 기재한 다량의 항-IGF-IR 항체를 재조합적으로 발현하기 위해 사용될 수 있다. 이들 핵산 분자는 이하에 기재한 바와 같은 단일쇄 항체, 면역접착물질, 이량체, 돌연변이된 항체 및 항체 유도체를 생성하기 위해 사용될 수 있다.

다른 구체예로서, 본 발명의 핵산 분자는 특정 항체 서열에 대한 프로브(probe) 또는 PCR 프라이머로서 사용될 수 있다. 예컨대, 핵산 분자 프로브는 진단 방법에 사용될 수 있거나, 또는 핵산 분자 PCR 프라이머는 항-IGF-IR 항체의 가변 도메인을 생성하는데 사용하기 위한 핵산 서열을 분리하기 위해 사용될 수 있었던 DNA 영역을 증폭하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 구체예로서, 핵산 분자는 올리고뉴클레오타이드이다. 보다 바람직한 구체예로서, 올리고뉴클레오타이드는 목적하는 항체의 중쇄 및 경쇄의 고 가변 영역으로부터 얻는다.

본 발명은 중쇄 또는 그의 항원-결합 부분을 암호화하는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 경쇄 또는 그의 항원-결합 부분을 암호화하는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 융합 단백질, 변형 항체, 항체 단편, 및 그의 프로브를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 항체 또는 항체 부분을 발현하기 위하여, 상기 기재한 바와 같이 얻은 일부 또는 전체 길이의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA를, 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 기능적으로 결합되도록 발현 벡터에 삽입한다. 발현 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스, 코스미드, YAC, EBV 유도된 에피솜 등을 포함한다. 항체 유전자는 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 목적한 기능을 발휘하도록 벡터에 결찰된다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 양립할 수 있도록 선택한다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별개 벡터에 삽입될 수 있다. 바람직한 구체예로서, 양쪽 유전자는 동일 발현 벡터에 삽입된다. 항체 유전자를 표준 방법(예컨대 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적 제한 부위의 결찰, 또는 제한 부위가 존재하지 않을 경우 비점착성 말단(blunt end) 결찰)에 의해 발현 벡터로 삽입한다.

기능적으로 완전한 인간 CH 또는 CL 면역글로불린 서열을 암호화하고 또 VH 또는 VL 서열을 용이하게 삽입시키고 발현시키도록 처리된 적합한 제한부위를 갖는 벡터가 편리한 벡터이다. 이러한 벡터에서, 스플라이싱은 삽입된 J 영역 내의 스플라이스 공여체 부위와 인간 C 영역 전의 스플라이스 수용체 부위 사이, 및 인간 CH 엑손 내에서 생기는 스플라이스 영역에서 흔히 생긴다. 폴리아데닐화 및 전사 종료는 코딩 영역 하류의 천연의 염색체 부위에서 생긴다. 재조합 발현 벡터는 또한 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 촉진시키는 시그널 펩타이드를 암호화할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 시그널 펩타이드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 프레임 내에서 연결되도록 벡터에 클로닝될 수 있다. 시그널 펩타이드는 면역글로불린 시그널 펩타이드 또는 비상동성 시그널 펩타이드(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터 얻은 시그널 펩타이드)일 수 있다.

항체 사슬 유전자 이외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 갖는다. 당업자들이라면 조절 서열의 선택을 비롯한 발현 벡터의 디자인은 형질전환시키려는 숙주 세포의 선택, 소망하는 단백질의 발현 정도 등과 같은 인자에 따라 달라짐을 알고 있을 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 단백질의 고발현을 지시하는 바이러스성 요소, 예컨대 레트로바이러스 LTR로부터 유도된 프로모터 및/또는 인헨서, 사이토메갈로바이러스(CMV)(CMV 프로모터/인헨서와 같은), 시미안 바이러스 40(SV40)(SV40 프로모터/인헨서와 같은), 아데노바이러스(예컨대 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)), 폴리오마 및 천연 면역글로불린과 액틴 프로모터와 같은 강한 포유동물 프로모터를 포함한다. 바이러스성 조절 요소 및 그의 서열의 더 자세한 기재는 예컨대 스틴스키에게 허여된 미국특허 제5,168,062호, 벨 등에 허여된 미국특허 제4,510,245호, 및 샤프너 등에 허여된 미국특허 제4,968,615호를 참조한다.

항체 사슬 유전자 및 조절 서열 이외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예컨대 복제 기점) 및 선택성 마커 유전자와 같은 부가적 서열을 가질 수 있다. 선택성 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 촉진시킨다(예컨대 미국특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호 참조). 예컨대, 전형적으로 선택성 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 대하여, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약제에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선택성 마커 유전자는 다이하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭성을 갖는 dhfr-숙주 세포에서 사용) 및 네오 유전자(G418 선택)를 포함한다.

본 발명의 항-IGF-IR 항체의 중쇄 및 그의 항원-결합 부분 및/또는 경쇄 또는 그의 항원-결합 부분을 암호화하는 핵산 분자, 및 이들 핵산 분자를 포함하는 벡터는 적합한 숙주 세포를 형질변환시키기 위해 사용될 수 있다. 형질전환은 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하기 위한 공지 방법일 수 있다. 비상동 폴리뉴클레오타이드를 포유동물 세포에 도입하기 위한 방법은 당분야에 잘 공지되어 있고 덱스트란-매개 형질감염, 인산칼슘 침강, 폴리브렌-매개 형질감염, 프로토플라스트 융합, 엘렉트로포레이션, 폴리뉴클레오타이드를 리포좀으로 캡슐화, 바이오리스틱(biolistic) 주입 및 DNA를 핵에 직접 미량주입하는 것을 포함한다. 또한 핵산 분자는 바이러스성 벡터에 의해 포유동물 세포에 도입될 수 있다. 세포를 형질전환하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 예컨대 미국특허 제4,399,216호, 제4,912,040호, 제4,740,461호 및 제4,959,455호 참조(이들 특허는 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다).

발현용 숙주로서 유용한 포유동물 세포주는 당해 분야에 잘 공지되어 있고 또 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection: ATCC)으로부터 입수할 수 있는 다수의 영구 세포주를 포함한다. 이들은 그중에서도 CHO(차이니즈 햄스터 난소) 세포, NSO, SP2 세포, HeLa 세포, BHK(어린 햄스터 신장) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포 악성종양 세포(예컨대 Hep G2), A549 세포, 3T3 세포 및 다수의 다른 세포주를 포함한다. 포유동물 숙주 세포는 인간, 마우스, 쥐, 개, 원숭이, 돼지, 염소, 소, 말 및 햄스터 세포를 포함한다. 특히 바람직한 세포주는 어떤 세포주가 고발현량을 갖는지를 측정함으로써 선택한다. 사용될 수 있는 다른 세포주는 Sf9 세포와 같은 곤충 세포주, 양서류 세포, 세균 세포, 식물 세포 및 진균 세포이다. 중쇄 또는 그의 항원-결합 부분, 경쇄 및/또는 그의 항원-결합 부분을 암호화하는 재조합 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포에 도입하면, 숙주 세포에서 항체를 발현하거나, 또는 더욱 바람직하게는, 숙주 세포가 생장하고 있는 배지에 항체를 분비하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체가 생산될 수 있다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 배지로부터 회수될 수 있다.

또한 생산 세포주로부터 본 발명의 항체(또는 그로부터의 다른 잔기)를 발현하는 것은 다수의 공지 수법을 이용하여 향상될 수 있다. 예컨대, 글루타민 합성효소 유전자 발현 시스템(GS 시스템)은 특정 조건하에서 발현을 향상시키기 위한 일반적 방법이다. GS 시스템은 유럽 특허 제0 216 846호, 제0 256 055호 및 제0 323 997호 및 유럽 특허 출원 제89303964.4호와 관련하여 전체적으로 또는 부분적으로 논의된다.

상이한 세포주에 의해 또는 트랜스제닉 동물에서 발현된 항체는 서로 상이한 글라이코실화를 가질 것이다. 그러나, 여기서 제공된 핵산 분자에 의해 암호화되거나, 또는 여기서 제공된 아미노산 서열을 포함하는 모든 항체는 항체의 글라이코실화에 상관없이 본 발명의 일부를 이룬다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있는 본 발명의 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 트랜스제닉 비-인간 동물을 제공한다. 항체는 염소, 젖소, 말, 돼지, 쥐, 마우스, 토끼, 햄스터 또는 기타 포유동물의 젖, 혈액 또는 소변과 같은 체액이나 조직에서 생산되어 그로부터 회수될 수 있다. 예컨대 미국특허 제5,827,690호, 제5,756,687호, 제5,750,172호 및 제5,741,957호 참조. 상기 기재한 바와 같이, 인간 면역글로불린 자리를 포함하는 비-인간 트랜스제닉 동물은 IGF-IR 또는 그의 일부로 면역화함으로써 생산될 수 있다.

다른 구체예로서, 비-인간 트랜스제닉 동물은 표준 트랜스제닉 수법에 의해 동물에 본 발명의 하나 이상의 핵산 분자를 도입함으로써 생산한다. 예컨대 상기 호건의 문헌 참조. 트랜스제닉 동물을 제조하기 위해 사용된 트랜스제닉 세포는 배아 줄기 세포 또는 체세포일 수 있다. 트랜스제닉 비-인간 생물은 키메라, 비키메라 이형접합체 및 비키메라 동형접합체일 수 있다. 예컨대 문헌[호건(Hogan) 등, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2ed., Cold Spring Harbor Press (1999); 잭슨(Jackson) 등, Mose Genetics and Transgenics : A Practical Approach, Oxford University Press (2000); 및 핀커트(Pinkert), Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999)]. 다른 구체예로서, 트랜스제닉 비-인간 생물은 목적하는 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 표적 파괴 및 치환을 가질 수 있다. 바람직한 구체예로서, 트랜스제닉 동물은 IGF-IR, 바람직하게는 인간 IGF-IR에 특이적으로 결합되는 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 포함하고 발현한다. 다른 구체예로서, 트랜스제닉 동물은 단일쇄 항체, 키메라 항체 또는 인간화된 항체와 같은 변형 항체를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 항-IGF-IR 항체는 트랜스제닉 동물에서 제조될 수 있다. 바람직한 구체예로서, 비-인간 동물은 마우스, 쥐, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말이다. 비-인간 트랜스제닉 동물은 혈액, 젖, 소변, 침, 눈물, 점액 및 기타 체액에서 상기 암호화된 폴리펩타이드를 발현한다.

상기 기재한 항-IGF-I 항체 이외에 재조합 인간 항체는 재조합 항체 라이브러리, 바람직하게는 인간 림프구로부터 유도된 mRNA로부터 제조된 인간 VL 및 VH cDNA를 사용하여 제조한 scFv 파아지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝함으로써 분리할 수 있다. 이러한 라이브러리를 제조하고 스크리닝하기 위한 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 파아지 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위한 시판되는 키트가 존재한다(예컨대, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, 카탈로그 번호 27-9400-01; 및 Stratagene SurfZAP^TM 파아지 디스플레이 키트, 카탈로그 번호 240612). 항체 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위해 사용될 수 있는 다른 방법과 시약이 존재한다[예컨대 랜드너(Ladner) 등, 미국특허 제5,223,409호; 강(Kang) 등., PCT 공개 WO 92/18619호; 다우어(Dower) 등, PCT 공개 WO 91/17271호; 윈터(Winter) 등, PCT 공개 WO92/20791호; 마크랜드(Markland) 등, PCT 공개 WO 92/15679호; 브라이틀링(Breitling) 등, PCT 공개 WO 93/01288호; 맥카퍼티(McCafferty) 등, PCT 공개 WO 92/01047호; 개러드(Garrard) 등, PCT 공개 WO 92/09690호; 푸흐스(Fuchs) 등, (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; 헤이(Hay) 등 (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85; 휴즈(Huse) 등 (1989) Science 246: 1275-1281; 맥카퍼티 등, Nature (1990) 348: 552-554; 그리프쓰(Griffths) 등 (1993) EMBO J 12: 725-734; 호킨스(Hawkins) 등 (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896; 클랙슨(Clackson) 등 (1991) Nature 352: 624-628; 그램(Gram) 등 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580; 개러드 등 (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; 후겐블룸(Hoogenboom) 등 (1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137; 및 바바스(Barbas) 등 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982 참조].

바람직한 구체예로서, 소망하는 특징을 갖는 인간 항-IGF-IR 항체를 분리하기 위하여, PCT 공개 WO 93/06213호(후겐블룸 등)에 기재된 항원결정기 임프린팅 방법을 이용하여 상기 기재한 바와 같은 인간 항-IGF-IR 항체를 먼저 사용하여 IGF-IR에 대하여 유사한 결합 활성을 갖는 인간 중쇄 및 경쇄 서열을 선택할 수 있다. 상기 방법에 사용된 항체 라이브러리는 문헌[맥카퍼티 등, PCT 공개 WO 92/01047호, 맥카퍼티 등, Nature (1990) 348: 552-554; 및 그리프쓰 등 (1993) EMBO J 12: 725-734]에 기재된 바와 같이 제조되고 스크리닝된 scFv 라이브러리이다. scFv 항체 라이브러리는 바람직하게는 인간 IGF-IR를 항원으로 사용하여 스크리닝된다.

초기 인간 VL 및 VH 절편을 선택하면, 초기 선택된 VL 및 VH 절편의 상이한 쌍이 IGF-IR 결합에 대해 스크리닝되는 "혼합 및 매치" 실험을 실시하여 바람직한 VL/VH 쌍 조합을 선택한다. 부가적으로, 항체의 품질을 더욱 향상시키기 위하여, 바람직한 VL/VH 쌍의 VL 및 VH 절편은, 천연 면역 반응 동안 항체의 친화성 성숙에 관여하는 생체내 체세포 돌연변이 과정과 유사한 과정으로 VH 및/또는 VL의 CDR3 영역내에서 랜덤(random) 돌연변이될 수 있다. 이러한 시험관 친화성 성숙은, VH CDR3 또는 VL CDR3에 각각 상보적이고 특정 위치에서 4개의 뉴클레오타이드 염기의 임의 혼합물로 "스파이크"된 PCR 프라이머를 사용하여 VH 및 VL 영역을 증폭시킴으로써, 생성한 PCR 생성물이, 랜덤 돌연변이가 VH 및/또는 VL CDR3 영역에 도입된 VH 및 VL 절편을 암호화하도록 함으로써 달성할 수 있다. 이들 랜덤 돌연변이된 VH 및 VL 절편은 IGF-IR에 대한 결합으로 재스크리닝될 수 있다.

재조합 면역글로불린 디스플레이 라이브러리로부터 본 발명의 항-IGF-IR 항체를 스크리닝하고 분리한 다음, 선발된 항체를 암호화하는 핵산을 상기 디스플레이 팩케이지(예컨대 파아지 게놈으로부터)로부터 회수하여 표준 재조합 DNA 수법에 의해 다른 발현 벡터에 서브클로닝할 수 있다. 필요한 경우, 핵산은 더욱 조작되어 이하에 기재한 바와 같은 본 발명의 다른 형태의 항체를 생성할 수 있다. 조합적 라이브러리의 스크리닝에 의해 분리된 재조합 인간 항체를 발현하기 위하여, 상기 항체를 암호화하는 DNA를, 상기 기재한 바와 같이, 재조합 발현 벡터에 클로닝한 다음 포유동물 숙주 세포에 도입할 수 있다.

상술한 바와 같은 항-IGF-IR 항체의 클래스는 서로 바뀔 수 있다. 본 발명의 구체예로서, VL 또는 VH를 암호화하는 핵산 분자는 CL 또는 CH를 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않도록 당해 분야에 잘 공지된 방법을 이용하여 분리한다. VL 또는 VH를 암호화하는 핵산 분자는 상이한 클래스의 면역글로불린 분자로부터 CL 또는 CH를 암호화하는 핵산 서열에 기능적으로 결합된다. 이것은 상술한 바와 같이 CL 또는 CH를 포함하는 벡터 또는 핵산 분자를 사용하여 달성할 수 있다. 예컨대, 원래 IgM이었던 항-IGF-IR 항체는 IgG 클래스로 바뀔 수 있다. 또한, 클래스 변경은 1개의 IgG 서브클래스를 다른 서브클래스로 전환하기 위해, 예컨대 IgG1에서 IgG2로 전환하기 위해 이용될 수 있다. 소망하는 아이소타입을 포함하는 본 발명의 항체를 생성하기 위한 바람직한 방법은 항-IGF-IR 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산 및 항-IGF-IR 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산을 분리하는 단계, 중쇄의 가변 영역을 얻는 단계, 중쇄의 가변영역을 소망하는 아이소타입의 중쇄의 불변 도메인과 결찰시키는 단계, 경쇄 및 결찰된 중쇄를 세포에서 발현시키는 단계 및 소망하는 아이소타입을 갖는 항체를 수집하는 단계를 포함한다.

당업자들은 당업자에게 공지된 수법 및 방법을 이용하여 항체 유도체를 생성하기 위해 상술한 핵산 분자를 사용할 수 있다. 본 발명에 따르면, 선택 위치에서 하나 이상의 돌연변이된 아미노산 잔기는 상응하는 점라인 잔기로 치환될 수 있다.

다른 구체예로서, 다른 폴리펩타이드에 결합된 항-IGF-IR 항체의 전부 또는 일부를 포함하는 융합 항체 또는 이뮤노어드히신을 제조할 수 있다. 바람직한 구체예로서, 항-IGF-IR 항체의 가변 영역만이 폴리펩타이드에 결합된다. 다른 바람직한 구체예로서, 항-IGF-IR 항체의 VH 도메인은 제 1 폴리펩타이드에 결합되는 반면에, 항-IGF-IR 항체의 VL 도메인은 제 2 폴리펩타이드에 결합되며 이것이 VH 및 VL 도메인이 서로 작용하여 항체-결합 부위를 형성하도록 제 1 폴리펩타이드와 결합한다. 다른 바람직한 구체예로서, VH 도메인은 VH 및 VL 도메인이 서로 작용할 수 있도록 링커에 의해 VL 도메인으로부터 분리된다. VH-링커-VL 항체는 목적하는 폴리펩타이드에 결합된다. 융합 항체는 폴리펩타이드를 항-IGF-IR-발현성 세포 또는 조직으로 인도하는데 유용하다. 폴리펩타이드는 독소, 성장인자 또는 다른 조절 단백질과 같은 치료제일 수 있거나, 또는 꽃양배추 퍼옥시다아제와 같은 쉽게 가시화될 수 있는 효소와 같은 진단제일 수 있다. 또한, 융합 항체는 2개(이상)의 단일쇄 항체가 서로 결합되어 생성될 수 있다. 이것은 단일 폴리펩타이드 위에 2가 또는 다가 항체를 창제하려는 경우, 또는 이중특이성(bispecific) 항체를 창제하려는 경우 유용하다.

단일쇄 항체를 생성하기 위해, (scFv) VH- 및 VL-암호화 DNA 단편을, 유연성 링커를 암호화하는, 예컨대 아미노산 서열(Gly₄-Ser)₃ 를 암호화하는 다른 단편에 기능적으로 결합시켜서 VH 및 VL 서열이 유연성 링커에 의해 결합된 구성적 단일쇄 단백질로서 VH 및VL 서열이 발현될 수 있게 한다[예컨대, 버드 등 (1988) Science 242: 423-426; 허스톤 등 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; 맥카퍼티 등, Nature (1990) 348: 552-554]. 단일쇄 항체는 단일 VH 및 VL 만이 사용된 경우 1가일 수 있고, 2개의 VH 및 VL이 사용된 경우 2가일 수 있거나, 또는 둘 이상의 VH 및 VL이 사용된 경우 다가일 수 있다.

다른 구체예로서, 다른 변형된 항체는 항-IGF-IR-암호화 핵산 분자를 사용하여 제조할 수 있다. 예컨대 "Kappa bodies"[III 등, Protein Eng 10: 949-57 (1997)], "Minibodies"[마틴(Martin) 등, EMBO J 13: 5303-9 (1994)], "Diabodies" [홀링거 등, PNAS USA 90: 6444-6448 (1993)], 또는 "Janusins"[트라우네커(Traunecker) 등, EMBO J 10: 3655-3659 (1991) 및 트라우네커 등, "Janusin: New molecular design for bispecific reagents" Int J Cancer Suppl 7: 51-52 (1992)]는 본 명세서에 지시된 사항을 따라 표준 분자 생물학적 수법을 이용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 항체 또는 항체 부분은 다른 분자(예컨대 다른 펩타이드 또는 단백질)로 변형(derivatize)되거나 결합될 수 있다. 일반적으로, 항체 또는 그의 부분은 유도화 또는 라벨링에 의해 항-IGF-IR 결합력이 손상되지 않을 정도로 변형된다. 따라서, 본 발명의 항체 및 항체 부분은 본 명세서에 기재된 완전한 형태 및 변형태의 양쪽 인간 항-IGF-IR 항체를 포함한다. 예컨대 본 발명의 항체 또는 항체 부분은 다른 항체(예컨대 이중특이성 항체 또는 이량체(diabody)), 검출제, 약학제(pharmaceutical agent), 및/또는 항체 또는 항체 부분과 다른 분자(스트렙타애비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)와의 결합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩타이드와 같은 하나 이상의 다른 분자 성분에 기능적으로 결합될 수 있다(화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 결합 등에 의해).

변형된(derivatized) 항체의 1개 유형은 둘 이상의 항체(동일 유형 또는 예컨대 이중특이성 항체를 생성하기 위한 상이한 유형)를 교차결합시키는 것에 의해 생성할 수 있다. 적합한 크로스링커(crosslinker)는 적합한 스페이서(예컨대 m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스터)에 의해 분리된 2개의 분명한 반응성 기를 갖는 헤테로이중기능성 또는 동종이중기능성(예컨대 다이석신이미딜 수베레이트)를 포함한다. 이러한 링커는 Pierce Chemical Company, Rockford, III으로부터 구입할 수 있다.

다른 유형의 변형된 항체는 라벨링된 항체이다. 본 발명의 항체 또는 항체 부분을 변형할 수 있는 유용한 검출제는 플루오레세인과 같은 형광 화합물, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트, 로다민, 5-다이메틸아민-1-나프탈렌설폰일 클로라이드, 피코에리트신, 란타나이드 인 등을 포함한다. 항체는 꽃양배추 퍼옥시다아제, β-갈락토시다아제, 루시페라아제, 알칼리성 포스파타아제, 글루코오스 옥시다아제 등과 같은 검출에 유용한 효소에 의해 라벨링될 수 있다. 항체가 검출성 효소에 의해 라벨링되면, 이것은 효소를 이용하여 인식될 수 있는 반응 생성물을 생산하는 부가적 시약을 부가함으로써 검출한다. 예컨대, 꽃양배추 퍼옥시다아제가 존재하면, 과산화수소 및 디아미노벤지딘의 부가는 비색 반응생성물을 초래하므로 검출될 수 있다. 어떤 항체는 바이오틴에 의해 라벨링될 수 있고, 이것은 애비딘 또는 스트렙트애비딘을 간접 측정하는 것에 의해 검출할 수 있다. 어떤 항체는 가돌리늄과 같은 자성물질로 라벨링될 수 있다. 어떤 항체는 또한 2차 리포터(예컨대 로이신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 항원결정부위 태그)에 의해 인식되는 소정의 폴리펩타이드 항원결정기에 의해 라벨링될 수 있다. 일부 구체예로서, 라벨은 입체 장애를 감소시키기 위하여 다양한 길이의 스페이서 암(arm)에 의해 부착된다.

항-IGF-IR 항체는 방사성라벨링된 아미노산으로 라벨링될 수 있다. 방사능라벨은 진단 목적 및 치료 목적으로 이용될 수 있다. 예컨대, 방사성라벨은 X-선 또는 기타 진단 수법에 의해 IGF-IR-발현성 종양을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 또한 방사성라벨은 암 세포 또는 종양에 대한 독소로서 치료적으로 사용될 수 있다. 폴리펩타이드에 대한 라벨의 예는 방사성동위원소 또는 방사성핵종(³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I)을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.

항-IGF-IR 항체는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 메틸 또는 에틸 기, 또는 탄화수소 기와 같은 화학 기에 의해 변형될 수 있다. 이들 기는 혈청 수명을 증가시키거나 또는 조직 결합력을 증가시키는 등의 항체의 생물학적 특성을 향상시키는데 유용하다.

본 발명은 또한 치료유효량의 본 발명의 화합물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 포유동물에서 고 증식성 질환을 치료하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다. 일개 구체예로서, 상기 약학 조성물은 뇌암, 폐암, 편평상피암, 방광암, 위암, 췌장암, 유방암, 머리암, 목암, 신장암(renal and kidney cancer), 난소암, 전립선암, 결장암, 식도암, 부인과암 또는 갑상선암과 같은 암을 치료하기 위한 것이다. 본 발명에 따른 방법으로 본 발명의 화합물을 사용하여 치료될 수 있는 환자는 예컨대 다중 골수종, 액암, 간암, 흉선 질환, T-세포 매개 자가면역 질환, 내분비계 질환, 허혈증, 신경퇴행 질환, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피하 또는 안구흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 영역의 암, 위암, 장암, 유방암, 부인과 종양(예컨대 자궁 육종, 나팔관 악성종양, 자궁내막의 악성종양, 자궁경부의 악성종양, 질의 악성종양 또는 외음부암), 호크킨 질환, 식도암, 소장암, 내분비계 암(예컨대 갑상선, 부갑상선 또는 부신), 연조직의 육종, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 어린이의 고형암, 림프구성 림프종, 방광암, 신장 또는 세포 악성종양, 신우암 또는 중앙신경계의 신생물 형성(예컨대 일차 CNS 림프종, 척추 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선암)에 걸린 것으로 진단된 환자를 포함한다.

다른 구체예로서, 상기 약학 조성물은 혈관성형술후 재발협착(restenosis) 및 건선과 같은 비-암, 고 증식성 질환에 관련된 것이다. 다른 구체예로서, 본 발명은 약학 조성물이 치료유효량의 본 발명의 활성화 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, IGF-IR의 활성화를 필요로 하는 포유동물을 치료하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다. 활성화 항체를 포함하는 약학 조성물은 충분한 IGF-I 또는 IGF-II를 갖고 있지 않은 동물을 치료하기 위해 사용되거나, 또는 골다공증, 약함 또는 포유동물이 활성 성장 호르몬을 너무 적게 분비하거나 성장 호르몬에 반응할 수 없는 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 항-IGF-IR 항체는 환자에 투여하기에 적합한 약학 조성물에 혼입될 수 있다. 전형적으로, 약학 조성물은 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "약학적으로 허용되는 담체"는 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수지연제 등의 생리학적으로 허용되는 것을 포함한다. 약학적으로 허용되는 담체의 예는 물, 염수, 인산염 완충 염수, 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올 등과 같은 것중 하나 이상뿐만 아니라 이들의 조합물을 포함한다. 많은 경우, 당과 같은 등장제, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알코올 또는 염화 나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직하다. 습윤제 또는 유화제와 같은 습윤 또는 소량의 보조 성분, 보존제 또는 완충액과 같은 약학적으로 허용되는 물질은 항체 또는 항체 부분의 저장수명 또는 효능을 향상시킨다.

본 발명의 조성물은 다양한 형태로 사용될 수 있다. 이들은 액체 용액(예컨대 주사용액 또는 주입용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환약, 산제, 리포좀 및 좌약과 같은 예컨대 액체, 반고체 및 고체 투여 형태를 포함한다. 바람직한 형태는 투여 및 치료를 위한 목적하는 형태에 따라 달라진다. 전형적인 바람직한 조성물은 주사액 또는 주입액 형태, 예컨대 사람을 다른 항체에 의해 수동 면역화하기 위해 사용되는 것과 유사한 조성물이다. 바람직한 투여 형태는 비경구 형태(예컨대 정맥, 피하, 복강내, 근육내)이다. 바람직한 구체예로서, 항체는 정맥 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 다른 바람직한 구체예는 항체는 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.

치료 조성물은 전형적으로 멸균되어야 하고 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 한다. 이 조성물은 용액, 마이크로유화액, 분산액, 리포좀 또는 고 약제 농도에 적합한 다른 주문된 구조로서 제제화될 수 있다. 멸균 주사액은 필요량의 항-IGF-IR 항체를 상기 열거한 성분 중의 하나 또는 그 조합물과 함께 적합한 용매에 혼입시킨 다음 열로 멸균시키는 것에 의해 제조할 수 있다. 일반적으로 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 배지를 함유하는 멸균 부형제 및 상기 열거한 성분중 다른 필요한 성분에 혼입시키는 것에 의해 제조한다. 멸균 주사액을 제조하기 위한 멸균 산제의 경우, 바람직한 제조방법은 진공 건조 및 냉동 건조법으로서, 이에 의해 활성성분 + 전술한 멸균 여과액으로부터 부가적인 소망하는 성분의 산제를 얻을 수 있다. 용액의 적합한 유동성은 레시틴과 같은 코팅을 이용하는 것에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기를 유지하는 것에 의해, 또 계면활성제를 사용하는 것에 의해 유지할 수 있다. 주사 조성물의 연장된 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 물질, 예컨대 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시키는 것에 의해 달성될 수 있다.

본 발명의 항체는 당분야에 공지된 다수의 방법에 의해 투여될 수 있지만, 많은 치료 적용의 경우, 바람직한 투여 경로/형태는 복강내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 정맥내 투여 또는 흡입이다. 당업자에게 주지된 바와 같이, 투여 경로 및/또는 형태는 소망하는 결과에 따라 달라질 수 있다. 일개 구체예로서, 본 발명의 항체는 단일 투여량으로 투여되거나 또는 복수 투여로 투여될 수 있다.

특정 구체예로서, 활성 화합물은 신속한 방출로부터 화합물을 보호하는 담체, 예컨대 이식물, 피부 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템과 같은 제어 방출 제제를 사용하여 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리글라이콜산, 콜라겐, 폴리오르쏘에스터, 및 폴리악틱산과 같은 생분해성, 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제제를 제조하기 위한 다수의 방법이 특허허여되거나 당업자에게 공지되어 있다. 예컨대 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978] 참조.

보충적 활성 화합물이 조성물에 혼입될 수 있다. 특정 구체예로서, 본 발명의 항-IGF-IR 항체는 화학요법제, 항신생물제, 또는 항암제와 같은 하나 이상의 부가적인 치료제와 함께 공동제제화되고/되거나 공동투여된다. 예컨대, 항-IGF-IR 항체는 하나 이상의 치료제와 함께 공동제제화되고/되거나 공동투여된다. 이들 물질은 다른 표적에 결합되는 항체(예컨대 하나 이상의 성장인자 또는 사이토카인, 이들의 세포 표면 수용체 또는 IGF-I에 결합되는 항체), IGF-I 결합 단백질, 항신생물제, 화학요법제, 항종양제, IGF-IR 또는 IGF-I에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드, IGF-IR 활성을 차단하는 펩타이드 유사체, 용해성 IGF-IR 및/또는 IGF-I 생산 또는 활성을 억제하는, 당해 분야에 옥트레오타이드로 공지된 하나 이상의 화학제를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 활성화 항체를 포함하는 약학 조성물의 경우, 항-IGF-IR 항체는 세포 증식을 증가시키거나 세포자살을 방지하는 인자를 갖도록 제제화될 수 있다. 이러한 인자는 IGF-I과 같은 성장인자, 및/또는 IGF-IR을 활성화하는 IGF-I의 유사체를 포함한다. 이러한 조합 요법은 더 낮은 투여량의 항-IGF-IR 항체뿐만 아니라 공동투여된 물질을 필요로 할 수 있으므로, 다양한 단일요법과 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있다. 일개 구체예로서, 항체 및 하나 이상의 부가적 치료제를 사용할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 "치료유효량" 또는 "예방유효량"의 본 발명의 항체 또는 항체 부분을 포함할 수 있다. "치료유효량"은 투여량 및 필요한 시간 동안 소망하는 치료 효과를 달성하는데 효과적인 양을 지칭한다. 치료유효량의 항체 또는 항체 부분은 개인의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 인자, 및 개인에서 소망하는 반응을 유발하는 항체 또는 항체 부분의 능력에 따라서 달라질 수 있다. 치료 유효량은 항체 또는 항체 부분의 독성 또는 결정적 효과가 치료적으로 유리한 효과에 의해 압도될 때의 양이다. "예방유효량"은 투여량 및 필요한 시간 동안 소망하는 예방 효과를 얻는데 효과적인 양을 지칭한다. 전형적으로, 질병에 걸리기 전 또는 질병의 초기 단계에 환자에게 예방 투여량이 사용되기 때문에, 예방유효량은 치료유효량보다 적을 것이다.

투약 계획은 소망하는 최적 반응(예컨대 치료반응 또는 예방 반응)을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 예컨대, 단일 볼러스(bolus)를 투여하거나, 몇 회 나누어진 투여량을 시간을 두고 투약하거나 또는 치료 상태의 절박성에 따라서 비례적으로 감소하거나 증가될 수 있다. 항체를 포함하거나 또는 항체 및 하나 이상의 부가적 치료제를 포함하는 조합 요법을 포함하는 약학 조성물은 단일 또는 복수회 투여용으로 제제화될 수 있다. 투여량의 투약 용이성 및 균일성을 위하여 투여 단위 형태로 비경구적 조성물을 제제화하는 것이 유리하다. 본 명세서에 사용된 것과 같은 투여 단위 형태는 처리시킬 포유동물 검체에 대해 단일한 투여량으로 적합한 물리적으로 불연속적인 단위를 지칭하며; 소정 양의 활성 화합물을 함유하는 각 단위는 소망하는 약학적 담체와 결합되면 소망하는 치료 효과를 내는 것으로 산출된다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 자세한 것은 (a) 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성하려는 특정 치료 효과 또는 예방효과, 및 (b) 개체에서 감수성 처리를 위한 활성 화합물을 배합하는 것과 관련한 당해 분야 고유의 제한 사항에 따라 달라질 것이다. 특정의 유용한 제제는 20mM 시트르산나트륨, pH 5.5, 140mM NaCl 및 0.2mg/ml 폴리솔베이트 80의 완충액중의 5mg/ml 항-IGF-IR 항체이다.

본 발명의 항체 또는 항체 부분의 치료유효량 또는 예방유효량의 예시적, 비제한적 범위는 0.1-100mg/kg, 보다 바람직하게는 0.5-50mg/kg, 보다 바람직하게는 1-20mg/kg, 더욱 바람직하게는 1-10mg/kg이다. 투여량은 경감시키려는 상태의 유형 및 심각도에 따라 달라질 것이다.

특정 검체의 경우, 특정 투약 계획을 개인의 필요와 조성물의 투여를 관리하거나 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라서 시간에 따라 조정해야하며, 또 본 명세서에 기재된 투약 범위는 예시적인 것일 뿐 청구된 조성물의 범위나 실시를 한정하려는 것이 아님을 이해해야한다. 일개 구체예로서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 치료유효량 또는 예방유효량을 하나 이상의 부가적인 치료제와 함께 투여한다.

다른 구체예로서, 본 발명은 1개월당 300mg 미만의 투여량으로 암을 치료하기 위한 본 발명의 항-IGF-IR 항체의 투약에 관한 것이다.

본 발명의 다른 구체예는 항-IGF-IR 항체 및 이들 항체를 포함하는 약학 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 항체 또는 약학 조성물 이외에, 진단제 또는 치료제를 포함할 수 있다. 키트는 또한 진단 또는 치료 방법에 사용하기 위한 지시사항을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예로서, 키트는 항체 또는 그의 약학 조성물 및 이하에 기재한 방법에 사용될 수 있는 진단제를 포함한다. 다른 바람직한 구체예로서, 키트는 항체 또는 그의 약학 조성물 및 하나 이상의 치료제, 예컨대 이하에 기재한 방법에 사용될 수 있는 부가적 항신생물제, 항종양제 또는 화학요법제를 포함한다.

본 발명은 또한 화학요법제와 조합된 본 발명의 화합물을 포함하되, 상기 화합물, 염, 용매화물 또는 전구약물 및 화학요법제의 양이 합쳐져서 비정상 세포 성장을 억제하는데 효과적인, 포유동물에서 비정상적인 세포 성장을 억제하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다. 다수의 화학요법제가 당해 분야에 현재 공지되어 있다. 일개 구체예로서, 화학요법제는 유사분열 억제제, 알킬화제, 대사방지제, 삽입성(intercalating) 항생물질, 성장인자 억제제, 세포 주기 억제제, 효소, 토포아이소머라제 억제제, 항생존제, 생물학적 반응 변형제, 항호르몬제, 예컨대 항안드로겐 및 항혈관형성제로 구성된 군으로부터 선택된다.

MMP-2(매트릭스-금속성 단백질분해효소 2(metalloproetinase 2)) 억제제, MMP-9(매트릭스-금속성단백질분해효소 9) 억제제 및 COX-II(사이클로옥시게나아제 II) 억제제와 같은 항혈관형성제가 본 발명의 화합물과 조합되어 사용될 수 있다. 유용한 COX-II 억제제의 예는 CELEBREX^TM(알레콕시브), 발데콕시브 및 로페콕시브를 포함한다. 유용한 매트릭스 금속성단백질분해효소 억제제의 예는 WO 96/33172호(1996년 10월 24일 공개), WO 96/27583호(1996년 3월 7일 공개), 유럽특허출원 제9730497.1호(1997년 7월 8일 출원), 유럽특허출원 제99308617.2호(1992년 10월 29일 출원), WO 98/07697호(1998년 2월 26일 공개), WO 98/03516호(1998년 1월 29일 공개), WO 98/34918호(1998년 8월 13일 공개), WO 98/34915호(1998년 8월 13일 공개), WO 98/33768호(1998년 8월 6일 공개), WO 98/30566호(1998년 7월 16일 공개), 유럽특허 공개 제606,046호(1994년 7월 13일 공개), 유럽특허 공개 제931,788호(1999년 7월 28일 공개), WO 90/05719호(1990년 3월 31일 공개), WO 99/52910호(1999년 10월 21일 공개), WO 99/52889호(1999년 10월 21일 공개), WO 99/29667호(1999년 6월 17일 공개), PCT 국제출원 PCT/IB98/01113호(1998년 7월 21일 출원), 유럽특허출원 제99302232.1호(1999년 3월 25일 출원), 영국 특허출원 제9912961.1호(1999년 6월3일 출원), 미국 특허 가출원 제60/148,464호(1999년 8월 12일 출원), 미국특허 제5,863,949호(1999년 1월 26일 공고), 미국특허 제5,861,510호(1999년 1월 19일 공고), 및 유럽 특허공개 제780,386호(1997년 6월 25일 공개)에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 모두 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다. 바람직한 MMP 억제제는 관절통을 나타내지 않는 것이다. 보다 바람직한 것은 다른 매트릭스-금속성단백질분해효소(즉, MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 및 MMP-13)에 대하여 MMP-2 및/또는 MMP-9를 선택적으로 억제하는 것이다. 본 발명에 유용한 MMP 억제제의 특정 예는 AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830 및 이하 목록에 개시된 화합물이다: 3-[[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설폰일]-(1-하이드록시카밤오일-사이클로펜틸)-아미노]-프로피온산; 3-엑소-3-[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설폰일아미노]-8-옥사-바이사이클로[3.2.1]옥탄-3-카복시산 하이드록시아마이드; (2R, 3R) 1-[4-(2-클로로-4-플루오로-벤질옥시)-벤젠설폰일]-3-하이드록시-3-메틸-피페리딘-2-카복시산 하이드록시아마이드; 4-[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설폰일아미노]-테트라하이드로피란-4-카복시산 하이드록시아마이드; 3-[[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설폰일]-(1-하이드록시카밤오일-사이클로뷰틸)-아미노]-프로피온산; 4-[4-(4-클로로-페녹시)-벤젠설폰일아미노]-테트라하이드로-피란-4-카복시산 하이드록시아마이드; (R) 3-[4-(4- 클로로-페녹시)-벤젠설폰일아미노]-테트라하이드로-피란-3-카복시산 하이드록시아마이드; (2R, 3R) 1-[4-(4-플루오로-2-메틸-벤질옥시)-벤젠설폰일]-3-하이드록시-3-메틸-피페리딘-2-카복시산 하이드록시아마이드; 3-[[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설폰일]-(1-하이드록시카밤오일-1-메틸-에틸)-아미노]-프로피온산; 3-[[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설폰일]-(4-하이드록시카밤오일-테트라하이드로-피란-4-일)-아미노]-프로피온산; 3-엑소-3-[4-(4-클로로-페녹시)-벤젠설폰일아미노]-8-옥사-바이사이클로[3.2.1]옥탄-3-카복시산 하이드록시아마이드; 3-엔도-3-[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설폰일아미노]-8-옥사바이사이클로[3.2.1]옥탄-3-카복시산 하이드록시아마이드; 및 (R) 3-[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설폰일아미노]-테트라하이드로-퓨란-3-카복시산 하이드록시아마이드; 및 상기 화합물의 약학적으로 허용되는 염 및 용매화물.

본 발명의 화합물은 EGF-R 항체, EGF 항체 및 EGF-R 억제제인 분자와 같은 EGF-R(표피성장인자 수용체) 반응을 억제할 수 있는 물질과 같은 신호전달 억제제; VEGF(혈관내피세포 성장인자) 억제제, 예컨대 VEGF 수용체 및 VEGF를 억제할 수 있는 분자; 및 erbB2 수용체 억제제, 예컨대 erbB2 수용체에 결합되는 유기 분자 또는 항체, 예컨대 HERCEPTIN^TM (Genentech, Inc.)와 함께 사용될 수 있다. EGF-R 억제제는 예컨대 WO 95/19970호(1995년 7월 27일 공개), WO 98/14451호(1998년 4월 9일 공개), WO 98/02434호(1998년 1월 22일 공개), 및 미국특허 제5,747,498호(1998년 5월 5일 공고)에 기재되어 있으며, 이들 물질은 본 명세서에 기재된 바와 같이 본 발명에서 사용될 수 있다. EGFR-억제제는 단클론 항체 C225 및 항-EGFR 22Mab(ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF(Abgenix/cell Genesys), EMD-7200(Merck KgaA), EMD-5590(Merck KgaA), MDX-447/H-477(Medarex Inc. 및 Merck KgaA) 및 화합물 ZD-1834, ZD-1838 및 ZD-1839(AstraZneca), PKI-166(Novartis), PKI-166/CGP-75166(Novartis), PTK 787(Novartis), CP 701(Cephalon), 레플루노미드(leflunomide)(Pharmacia/Sugen), CI-1033(Warner Lambert Parke Davis), CI-1033/PD 183,805(Warner Lambert Parke Davis), CL-387,785(Wyeth-Ayerst), BBR-1611(Boehringer Mannheim GmbH/Roche), Naamidine A(Bristol Myers Squibb), RC-3940-II(Pharmacia), BIBX-1382(Boehringer Ingelheim), OLX-103(Merck & Co.), VRCTC-310(Ventech Research), EGF 융합 독소(Seragen Inc.), DAB-389(Seragen/Lilgand), ZM-252808(Imperial Cancer Research Fund), RG-50864(INSERM), LFM-A12(Parker Hughes Cancer Center), WHI-P97(Parker Hughes Cancer Center), GW-282974(Glaxo), KT-8391(Kyowa Hakko) 및 EGF-R 백신(York Medical/Centro de Immunologia Molecular (CIM))를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 이들 및 기타 EGF-R 억제제는 본 발명에 사용될 수 있다.

VEGF 억제제, 예컨대 SU-5416 및 SU-6668(Sugen Inc.), SH-268(Schering) 및 NX-1838(NeXstar)도 또한 본 발명의 화합물과 조합되어 사용될 수 있다. VEGF 억제제는 예컨대 WO 99/24440호(1999년 5월 20일 공개), PCT 국제특허출원 PCT/IB99/00797호(1999년 5월 3일 출원), WO 95/21613호(1995년 8월 17일 공개), WO 99/61422호(1999년 12월 2일 공개), 미국특허 제5,834,504호(1998년 11월 10일 공고), WO 98/50356호(1998년 11월 12일 공개), 미국특허 제5,883,113호(1999년 3월 16일 공고), 미국특허 제5,886,020호(1999년 3월 23일 공고), 제미국특허 5,792,783호(1998년 8월 11일 공고), WO 99/10349호(1999년 3월 4일 공개), WO 97/32856호(1997년 9월 12일 공개), WO 97/22596호(1997년 6월 26일 공개), WO98/54093호(1998년 12월 3일 공개), WO 98/02438호(1998년 1월 22일 공개), WO 99/16755호(1999년 4월 8일 공개) 및 WO 98/02437호(1998년 1월 22일 공개)에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 모두 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다. 본 발명에 유용한 특정 VEGF 억제제의 다른 예는 IM862(Cytran Inc.); 및 리보자임(Ribozyme) 및 치론(Chiron)으로부터 얻은 합성 리보자임인 안기오자임(angiozyme) 이다. 이들 및 기타 VEGF 억제제는 본 명세서에 기재된 바와 같이 본 발명에 사용될 수 있다.

GW-282974(Glaxo Wellcome plc) 및 단클론 항체 AR-209(Aronex Pharmaceuticals Inc.) 및 2B-1(Chiron)과 같은 ErbB2 수용체 억제제는 본 발명의 화합물과 함께 조합될 수 있고, 예컨대 WO 98/02434호(1998년 1월 22일 공개), WO 99/35146호(1999년 7월 15일 공개), WO 99/35132호(1999년 7월 15일 공개), WO 98/02437호(1998년 1월 22일 공개), WO 97/13760호(1997년 4월 17일 공개), WO 95/19970호(1995년 7월 27일 공개), 미국특허 제5,587,458호(1996년 12월 24일 공고), 및 미국특허 제5,877,305호(1999년 3월 2일 공고)에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다. 본 발명에 유용한 ErbB2 수용체 억제제는 미국 특허 가출원 제60/117,341호(1999년 1월 27일 출원) 및 미국 특허 가출원 제60/117,346호(1999년 1월 27일 출원)에 기재되어 있으며, 이들은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다. 상기 PCT 출원, 미국특허, 및 미국 가출원에 기재된 erbB2 수용체 억제제 화합물 및 물질 뿐만 아니라 erbB2 수용체를 억제하는 다른 화합물 및 물질은 본 발명에 따라 본 발명의 화합물과 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 항체는 항체가 항체 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 또는 12.9.1.1의 서열을 갖는 것을 포함한, 미국특허 제6,682,736호에 기재된 것과 같은 CTLA-4 항체와 함께 사용될 수 있다. 상기 항체는 또한 예컨대 항체 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A787-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 또는 24.2의 서열을 갖는 것을 포함한, 2003년 5월 1일 공개된 WO 03040170호에 기재된 항체와 같은 CD40 항체와 함께 사용될 수 있다.

항체는 항-인테그린 항체와 같은 항-인테그린제와 함께 사용될 수 있다.

항체가 조합될 수 있는 특정 물질의 예는 다음과 같다:

알킬화제 질소 머스타드 N-옥사이드, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란, 부술판미토브로니톨, 카르보쿠온, 티오테파, 라니무스틴, 니무스틴, 및 테모졸로미드;

항대사물질 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 리보사이드, 머캅토퓨린, 5-FU, 테가푸르, 독시플루리딘, 카르모푸르, 사이타라빈, 사이타라빈, 옥포스페이트, 에노시타빈, S-1, 겜시타빈, 플루다라빈 및 카페시타빈;

항생물질 액티노마이신 D, 독소루빈, 다우노루비신, 네오카르비노스타틴, 블레오마이신, 페플로마이신, 미토마이신 C, 아클라루비신, 피라루비신, 에피루비신, 지노스타틴, 스티말라머 및 이다루비신;

식물-유래 항종양제 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데스신, 에토포시드, 소부조산, 도데탁셀, 파클리탁셀 및 비노렐빈;

백금-배위 화합물 시스플라틴, 카르보플라틴, 네다플라틴 및 옥살리플라틴;

캄프토테신 유도체 이리노테칸, 토포테칸 및 캄프토테신;

티로신 키나아제 억제제 제피티니브;

항-CD20제 리투시마브, 토시투모마브 및 이브리투모마브 티우세탄;

인터페론 인터페론 알파, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 인터페론 베타, 인터페론 감마-1a 및 인터페론 감마-n1;

생물학적 반응 변형제 크레스틴, 렌티난, 시조피란, 피시바닐 및 우베니멕스; 및

기타 항종양제 미토크산트론, 1-아스파라기나아제, 프로카바진, 다카바진, 하이드록시카바미드, 넨토스타틴, 및 트레티노인.

또한, 본 발명의 항체는 항암제 엑세메스탄, 에도테카린(J-107088) 및 SU11248과 조합될 수 있다.

항-IGF-IR 항체는 시험관 또는 생체내에서 생물학적 샘플에서 IGF-IR을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 항-IGF-IR 항체는 ELISA, RIA, FACS, 조직 면역조직화학, 웨스턴 블럿 또는 면역침강을 비롯한 통상의 면역에세이에 사용될 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다. 본 발명의 항-IGF-IR 항체는 인간으로부터 IGF-IR을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 다른 구체예로서, 항-IGF-IR 항체는 필리핀원숭이 및 붉은털원숭이, 침팬지 및 유인원과 같은 고대의 영장류로부터 IGF-IR을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 생물학적 샘플을 본 발명의 항-IGF-IR 항체와 접촉시킨 다음, 항-IGF-IR에 결합된 결합 항체를 검출하여 생물학적 샘플에 있는 IGF-IR를 검출하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플에서 항-IGF-IR을 검출하는 방법을 제공한다. 일개 구체예로서, 항-IGF-IR 항체는 검출가능한 라벨로 직접적으로 라벨링될 수 있다. 다른 구체예로서, 항-IGF-IR 항체(제 1 항체)는 라벨링되지 않고 또 항-IGF-IR 항체를 결합할 수 있는 제 2 항체 또는 기타 분자가 라벨링된다. 당업자에게 잘 공지되어 있는 바와 같이, 제 2 항체는 특정 종 및 제 1 항체의 클래스에 특이적으로 결합될 수 있는 것을 선택한다. 예컨대, 항-IGF-IR 항체가 인간 IgG이면, 제 2 항체는 항-인간-IgG일 수 있다. 항체에 결합될 수 있는 다른 분자는, 비제한적으로, 단백질 A 및 단백질 G이며, 이들은 모두 예컨대 Pierce Chemical Co.로부터 구입할 수 있다.

항체 또는 제 2 항체에 적합한 라벨은 상기 기재한 바와 같고, 또 다양한 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질, 자성 물질 및 방사성활성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 꽃양배추 퍼옥시다아제, 알칼리성 포스파타아제, β-갈락토시다아제 또는 아세틸콜린에스터라아제를 포함하며; 적합한 보결분자단 복합체의 예는 스트렙트애비딘/바이오틴 및 애비딘/바이오틴을 포함하며; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트, 로다민, 다이클로로트라이아진일아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리쓰린을 포함하며; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하며; 자성물질의 예는 가돌리늄을 포함하며; 적합한 방사성활성 물질의 예는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S 또는 ³H를 포함한다.

다른 구체예로서, IGF-IR은 검출가능한 물질로 라벨링된 IGF-IR 표준 및 라벨링되지 않은 항-IGF-IR 항체를 사용하는 경쟁 면역에세이에 의해 생물학적 샘플에서 분석될 수 있다. 이 분석에서, 생물학적 샘플, 라벨링된 IGF-IR 표준 및 항-IGF-IR 항체를 합치고 라벨링되지 않은 항체에 결합된 라벨링된 IGF-IR 표준의 양을 측정한다. 생물학적 샘플중의 IGF-IR의 양은 항-IGF-IR 항체에 결합된 라벨링된 IGF-I 표준의 양에 반비례한다.

상기 기재한 면역에세이는 수많은 목적을 위해 사용될 수 있다. 일개 구체예로서, 항-IGF-IR 항체는 세포 배양액중에서 세포 중의 IGF-IR을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 구체예로서, 항-IGF-IR은 티로신 인산화 정도, IGF-IR의 티로신 자가인산화 정도 및/또는 세포를 다양한 화합물로 처리한 후 세포 표면 상에서 IGF-IR의 양을 측정하기 위하여 사용될 수 있다. 이 방법은 IGF-IR을 활성화하거나 억제하기 위해 사용될 수 있는 화합물을 시험하기 위해 사용될 수 있다. 이 방법에서, 세포의 1개 샘플을 시험 화합물과 일정 시간 동안 처리시키면서, 다른 샘플은 미처리 상태로 둔다. 티로신 자가인산화를 측정하려면, 상기 세포를 용해시키고 상기 기재한 면역에세이 또는 ELISA를 이용한 전술한 방법을 이용하여 IGF-IR의 티로신 인산화를 측정한다. IGF-IR의 총 양을 측정하려면, 세포를 용해시키고, 상기 기재한 바와 같은 면역에세이중의 하나를 이용하여 총 IGF-IR 양을 측정한다.

IGF-IR 티로신 인산화를 측정하거나 또는 총 IGF-IR 양을 측정하기 위한 바람직한 면역에세이는 ELISA 또는 웨스턴 블럿이다. IGF-IR의 세포 표면 정도를 측정하려면, 세포는 용해시키지 않고 상기 기재한 면역에세이중의 하나를 이용하여 IGF-IR의 세포 표면 정도를 측정한다. IGF-IR의 세포 표면 정도를 측정하기 위한 바람직한 면역에세이는 세포 표면 단백질을 바이오틴 또는 ¹²⁵I와 같은 검출가능한 라벨로 라벨링하고, IGF-IR을 항-IGF-IR 항체로써 면역침강시킨 다음 라벨링된 IGF-IR을 검출하는 단계를 포함한다. IGF-IR의 존재, 예컨대 세포 표면 정도를 측정하기 위한 다른 바람직한 면역에세이는 면역조직화학법을 이용하는 것이다. ELISA, RIA, 웨스턴 블럿, 면역조직화학법, 내부 막 단백질의 세포 표면 라벨링 및 면역침강법과 같은 방법은 당분야에 잘 공지되어 있다. 예컨대, 할로우 및 레인의 상기 문헌 참조. 또한 면역에세이는 IGF-IR의 활성화 또는 억제를 위한 다수의 화합물을 시험하기 위해 고 처리량 스크리닝이 되도록 규모를 늘릴 수 있다.

본 발명의 항-IGF-IR 항체는 또한 조직에서 또는 조직으로부터 얻은 세포에서 IGF-IR의 양을 측정하기 위하여 사용될 수 있다. 바람직한 구체예로서, 조직은 병든 조직이다. 보다 바람직한 구체예로서, 조직은 종양 또는 그의 생검(biopsy)이다. 상기 방법의 바람직한 구체예로서, 조직 또는 그의 생검은 환자로부터 절개해낸다. 조직 또는 생검은 예컨대 IGF-IR 양, IGF-IR의 세포 표면 양, IGF-IR의 티로신 인산화 정도 또는 IGF-IR의 위치를 상술한 방법으로 결정하는 면역에세이에 사용된다. 상기 방법은 종양이 다량의 IGF-IR을 발현하는지를 측정하기 위해 사용될 수 있다.

상술한 진단 방법은, 종양이 항-IGF-IR 항체 치료에 잘 반응하는지의 지표일 수 있는, 종양이 다량의 IGF-IR을 발현하는지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이 진단 방법은 또한 종양이 다량의 IGF-IR을 발현한 경우 종양이 악성종양이고, 또는 종양이 소량의 IGF-IR을 발현하는 경우 양성이라고 결정하기 위해 사용될 수 있다. 또한 상기 진단 방법은 항-IGF-IR 항체(이하 참조)를 사용한 치료에 의해 종양이 소량의 IGF-IR을 발현하게 하는지 및/또는 낮은 정도의 티로신 자가인산화를 유발하는지 결정하기 위해 사용될 수 있고, 따라서 상기 치료가 성공적인지 여부도 결정하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 항-IGF-IR 항체가 티로신 인산화를 감소시키는지 결정하기 위한 방법은 목적하는 세포 또는 조직에서 티로신 인산화 정도를 측정하고, 세포 또는 조직을 항-IGF-IR 항체 또는 그의 항원-결합 부분과 함께 배양한 다음 세포 또는 조직에서 티로신 인산화 정도를 다시 측정하는 단계를 포함한다. IGF-IR 또는 다른 단백질의 티로신 인산화도 측정될 수 있다. 이 진단 방법은 조직 또는 세포가 다량의 IGF-IR 또는 충분히 다량의 활성화된 IGF-IR을 발현하지 않는지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있으며, 이것은 왜소발육증, 골다공증 또는 당뇨병에 걸린 환자의 경우일 수 있다. IGF-IR 또는 활성 IGF-IR의 양이 너무 낮은 진단은 항-IGF-IR 항체, IGF-I 또는 IGF-IR 양 또는 활성을 증가시키기 위한 다른 치료제를 이용한 치료에 이용될 수 있었다.

말초 림프구 상에서 IGF-IR를 하향 조절하는 본 발명의 항체능을 기본으로 하여, 본 발명의 항체로 치료된 환자로부터 얻은 순환성 종양 및/또는 정상 세포 상에서 IGF-IR의 발현을 모니터링하기 위해 "바이오마커 전략"을 이용할 수 있다. WO 02/05359호(2002년 7월 11일 공개)에 기재된 항체와 같은 다른 항체도 사용될 수 있다. 이들 세포는 CD19+ 세포를 포함하지만, 이들로 한정되지 않으며, 단구, 과립구 및 림프구와 같은 모든 백혈구 세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 항체는 IGF-IR을 발현하는 조직 및 기관의 생체내 위치를 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 바람직한 구체예로서, 항-IGF-IR 항체는 IGF-IR 발현 종양의 위치를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 항-IGF-IR 항체 또는 그의 약학 조성물을 그의 진단 시험을 필요로 하는 환자에게 투여하고 그 환자를 이미지 분석처리시켜 IGF-IR 발현 조직의 위치를 결정하는 단계를 포함한다. 이미지 분석은 의학 분야에 잘 공지되어 있으며, 비제한적으로, x-선 분석, 자기공명 영상법(MRI) 또는 컴퓨터 토모그래피(CE)를 포함한다. 본 방법의 다른 구체예로서, 환자를 영상 분석처리시키기보다는, 관심을 두고 있는 조직이 IGF-IR을 발현하는지 여부를 측정하기 위해 환자로부터 생검을 채취한다. 바람직한 구체예로서, 항-IGF-IR 항체는 환자에서 영상화될 수 있는 검출제로 라벨링될 수 있다. 예컨대, 항체는 x-선 분석에 사용될 수 있는 바륨과 같은 대조제 또는 MRI 또는 CE에 사용될 수 있는 가돌리늄 킬레이트와 같은 자성 대조제에 의해 라벨링될 수 있다. 다른 라벨링제는 비제한적으로, ⁹⁹Tc와 같은 방사성동위원소를 포함한다. 다른 구체예로서, 항-IGF-IR 항체는 라벨링되지 않고 검출될 수 있고 항-IGF-IR 항체를 결합시킬 수 있는 제 2 항체 또는 다른 분자를 투여함으로써 영상화된다.

다른 구체예로서, 본 발명은 본 발명의 항-IGF-IR 항체를, 그를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 IGF-IR 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항체는 치료적으로 사용될 수 있다. 다른 바람직한 구체예로서, IGF-IR은 사람의 것이고 환자는 인간 환자이다. 다르게는, 환자는 항-IGF-IR 항체와 교차반응하는 IGF-IR을 발현하는 포유동물일 수 있다. 항체는, 수의과 목적으로 또는 인간 질병의 동물 모델로서, 항체가 교차반응하는 IGF-IR을 발현하는 비-인간 포유동물(즉, 영장류, 또는 필리핀원숭이 또는 붉은털 원숭이)에게 투여될 수 있다. 이러한 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료 효능을 평가하는데 유용할 수 있다.

바람직한 구체예로서, 항-IGF-IR 항체는 IGF-IR 발현 종양을 갖는 환자에게 투여될 수 있다. 종양은 고형종양일 수 있거나 또는 비고형 종양, 예컨대 림프종일 수 있다. 더욱 바람직한 구체예로서, 항-IGF-IR 항체는 암인 IGF-IR 발현 종양을 갖는 환자에게 투여될 수 있다. 더욱 더 바람직한 구체예로서, 항-IGF-IR 항체는 폐암, 유방암, 전립선암 또는 직장암을 갖는 환자에게 투여된다. 아주 바람직한 구체예로서, 상기 방법은 종양이 그 중량이나 체적을 증가하지 않게 하거나 또는 중량 또는 체적을 감소시킨다. 다른 구체예로서, 상기 방법은 내재화될 종양 상에서 IGF-IR을 유발한다. 바람직한 구체예로서, 항체는 2.12.1fx이거나, 또는 중쇄, 경쇄 또는 그의 항원-결합 영역을 포함한다.

다른 바람직한 구체예로서, 항-IGF-IR 항체는 부적절하게 다량의 IGF-I을 발현하는, 예컨대 IGF-IR 활성이 위험한 질환에 걸린 환자에게 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "IGF-IR 활성이 위험한 질환"은 질병에 걸린 환자에서 다량의 IGF-IR의 존재가 질병의 병인학에 관련되거나 관련될 것으로 보이는 질병 및 기타 질환을 포함한다. 따라서, 다량의 IGF-IR 활성이 위험한 질환은 IGF-IR 활성의 억제가 그 질환의 증상 및/또는 진행을 경감시킬 것으로 예상되는 질환이다. 이러한 질환은 세포 표면 상에서 IGF-IR의 양을 증가시키는 것에 의해 또는 그 질환에 걸린 환자의 감염 세포 또는 조직에서 증가된 IGF-IR의 티로신 자가인산화에 의해 입증될 수 있다. IGF-IR 양의 증가는 예컨대 상기 기재한 바와 같은 항-IGF-IR 항체를 사용하여 검출될 수 있다.

일례로서, 항-IGF-IR 항체는 다량의 IGF-I 및/또는 IGF-IR이 비-암 상태 또는 질환과 관련이 있는 비-암 상태를 치료하기 위해 사용된다. 일개 구체예로서, 상기 방법은 다량의 IGF-I 및/또는 IGF-IR 양 또는 활성에 의해 유발되거나 악화된 비-암 병리 상태를 갖는 환자에게 항-IGF-IR 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예로서, 비-암 병리 상태는 선단거대증, 거인증, 건선, 아테롬성동맥경화증, 혈관의 평활근 재발협착 또는 당뇨병의 합병증으로서 특히 눈에서 발견되는 경우와 같은 부적절한 미세혈관 증식이다. 더욱 바람직한 구체예로서, 항-IGF-IR 항체는 비-암 병리상태의 진행을 나타낸다. 더욱 바람직한 구체예로서, 항-IGF-IR 항체는 적어도 부분적으로 비-암 병리 상태를 중지 또는 반전시킨다.

IGF-I의 다량 발현이 다수의 일반 암을 초래할 수 있다는 것은 당해 분야에 공지되어 있다. 더욱 바람직한 구체예로서, 항-IGF-IR 항체는 전립선암, 신경교종 또는 섬유육종에 걸린 환자에 투여된다. 더욱 더 바람직한 구체예로서, 상기 방법은 암이 비정상적으로 증식되지 않게 하거나, 또는 중량 또는 체적을 증가시키지 않거나 또는 중량 또는 체적을 감소시킨다.

일개 구체예로서, 상기 방법은 뇌암, 편평상피암, 방광암, 위암, 췌장암, 유방암, 머리암, 목암, 식도암, 전립선암, 결장암, 폐암, 신장암, 난소암, 부인과암 또는 갑상선암과 같은 암의 치료에도 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라 본 발명의 화합물로 치료될 수 있는 환자는 다중 골수종, 액암, 간암, 흉선 질환, T-세포 매개 자가면역 질환, 내분비계 질환, 허혈증, 신경퇴행 질환, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피하 또는 안구흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 영역의 암, 위암, 장암, 유방암, 부인과 종양(예컨대 자궁 육종, 나팔관 악성종양, 자궁내막의 악성종양, 자궁경부의 악성종양, 질의 악성종양 또는 외음부암), 호크킨 질환, 식도암, 소장암, 내분비계 암(예컨대 갑상선, 부갑상선 또는 부신), 연조직의 육종, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 어린이의 고형암, 림프구성 림프종, 방광암, 신장 또는 세포 악성종양, 신우암 또는 중추신경계의 신생물형성(예컨대 일차 CNS 림프종, 척추 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선암)에 걸린 것으로 진단된 환자를 포함한다.

항체는 1회 투여될 수 있고, 더욱 바람직하게는 다수회 투여될 수 있다. 항체는 3회/1일 내지 1회/6개월로 투여될 수 있다. 이러한 투여는 3회/1일, 2회/1일, 1회/1일, 1회/2일, 1회/3일, 1회/1주, 1회/2주, 1회/1개월, 1회/2개월, 1회/3개월 및 1회/6개월의 스케쥴일 수 있다. 항체는 경구, 점막, 구강, 경비, 흡입성, 정맥내, 피하, 근육내, 비경구, 종양내 또는 국소 경로를 통하여 투여될 수 있다. 항체는 종양 부위로부터 떨어진 부위에서 투여될 수 있다. 항체는 또한 미니펌프를 통하여 연속적으로 투여될 수 있다. 항체는 1회, 적어도 2회 또는 적어도 상태가 처치, 완화 또는 치료되는 기간 동안 투여될 수 있다. 항체는 일반적으로 항체가 종양 또는 암이 중량이나 체적의 성장을 중지시키거나 감소시키는 한 종양이 존재하는 동안 투여될 것이다. 항체는 일반적으로 상기 기재한 약학 조성물의 일부로서 투여될 것이다. 항체의 투여량은 일반적으로 0.1 내지 100mg/kg, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 50mg/kg, 더욱 바람직하게는 1 내지 20mg/kg, 더욱 더 바람직하게는 1 내지 10mg/kg 범위일 것이다. 항체의 혈청 농도는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 항체는 암 또는 종양이 발생하지 않도록 하기 위해 예방적으로 투여될 수 있다. 이것은 보통 이상의 IGF-I을 갖는 환자가 일반 암을 발병할 우려가 더 높기 때문에 이들 환자에서 특히 유용하다. 로젠 등의 상기 문헌 참조.

다른 요지로서, 항-IGF-IR 항체는 항신생물 약제 또는 분자와 같은 다른 치료제와 함께 암 또는 종양과 같은 고 증식성 질병에 걸린 환자에게 공동투여될 수 있다. 일개 구체예로서, 본 발명은 비제한적으로, 유사분열 억제제, 알킬화제, 항대사물질, 삽입성 물질, 성장인자 억제제, 세포 주기 억제제, 효소, 토포아이소머라제 억제제, 생물학적 반응 조절제, 항호르몬, 키나아제 억제제, 매트릭스 금속성단백질분해효소 억제제, 유전자 치료제 및 항안드로겐으로 구성된 군으로부터 선택된 항종양제와 조합된 본 발명의 치료유효량의 화합물을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 포유동물에서 고증식성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 더욱 바람직한 구체예로서, 항체는 아드리아마이신 또는 탁솔과 같은 항신생물제와 함께 투여될 수 있다. 다른 바람직한 구체예로서, 항체 또는 조합 요법은 방사성요법, 화학요법, 광다이나믹 요법, 수술 또는 기타 면역요법과 함께 투여될 수 있다. 다른 바람직한 구체예로서, 항체는 다른 항체와 함께 투여될 수 있다. 예컨대, 항-IGF-IR 항체는 종양 또는 암 세포 증식을 억제하는 것으로 알려진 항체 또는 기타 시약, 예컨대 erbB2 수용체, EGF-R, CD20 또는 VEGF를 억제하는 항체 또는 시약과 함께 투여될 수 있다.

항체와 부가적 치료제를 공동투여(조합 요법)하는 것은 항-IGF-IR 항체 및 부가적 치료제를 포함하는 약학 조성물을 투여하고 또 항-IGF-IR 항체를 포함하는 1개 조성물 및 부가적 치료제를 포함하는 다른 1개 조성물로 이루어진 2개의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 또한, 공동투여 또는 조합 요법은 일반적으로 항체 및 부가적 치료제가 서로 동시에 부가되는 것을 의미하고, 항체 및 부가적 치료제가 상이한 시간에 투여되는 경우도 포함한다. 예컨대, 항체는 1회/3일로 투여될 수 있는 반면에, 부가적 치료제는 1회/1일로 투여된다. 다르게는, 항체는 부가적 치료제로 질환을 치료하기 전 또는 후에, 예컨대 환자가 부가적 시약에 의한 요법에 실패한 후에 투여될 수 있다. 유사하게, 항-IGF-IR 항체의 투여는 방사성요법, 포토다이나믹 요법 또는 수술하기 전 또는 후에 실시할 수 있다.

항체 및 하나 이상의 부가적 치료제(조합 요법)는 1회, 2회 또는 상태가 처치, 경감 또는 치료되는 기간 동안 투여될 수 있다. 바람직하게는, 조합 요법은 다수회 투여된다. 조합 요법은 3회/1일 내지 1회/6개월로 투여될 수 있다. 상기 투여는 3회/1일, 2회/1일, 1회/1일, 1회/2일, 1회/3일, 1회/1주, 1회/2주, 1회/1개월, 1회/2개월, 1회/3개월 및 1회/6개월과 같은 스케쥴일 수 있거나, 미니펌프를 통하여 연속적으로 투여될 수 있다. 조합 요법은 경구, 점막, 구강, 경비, 흡입성, 정맥내, 피하, 근육내, 비경구적, 종양내 또는 국소 경로를 통하여 투여될 수 있다. 조합 요법은 종양 부위로부터 떨어진 부위에서 투여될 수 있다. 조합 요법은 일반적으로 항체가 종양이나 암이 중량 또는 체적 증가를 중지시키거나 중량 또는 체적을 감소시키는 한 종양이 존재하는 동안 투여될 수 있다.

다른 구체예로서, 항-IGF-IR 항체는 방사성라벨, 면역독소 또는 독소로 라벨링되거나, 또는 독성 펩타이드를 포함하는 융합 단백질이다. 항-IGF-IR 항체 또는 항-IGF-IR 항체 융합 단백질은 방사성라벨, 면역독소, 독소 또는 독성 펩타이드를 IGF-IR 발현 종양 또는 암 세포로 유도한다. 바람직한 구체예로서, 방사성라벨, 면역독소, 독소 또는 독성 펩타이드는 항-IGF-IR 항체가 종양이나 암 세포의 표면 상에 있는 IGF-IR에 결합된 후 내재화된다.

일개 요지로서, 항-IGF-IR 항체는 필요로 하는 환자에서 특정 세포의 세포자살을 유도하기 위해 치료적으로 사용될 수 있다. 많은 경우에서, 세포자살을 목표로 하는 세포는 암 또는 종양 세포이다. 따라서, 바람직한 구체예로서, 본 발명은 치료유효량의 항-IGF-IR 항체를, 필요로 하는 환자에게 투여하는 것에 의해 세포자살을 유도하는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예로서, 항체는 2.12.1fx이거나, 또는 중쇄, 경쇄 또는 그의 항원-결합 영역을 포함한다.

다른 요지로서, 본 발명은 활성화 항-IGF-IR 항체를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 투여방법을 제공한다. 일개 구체예로서, 활성화 항체 또는 약학 조성물은 IGF-IR 활성을 증가시키는데 효과적인 양으로 그를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 더욱 바람직한 구체예로서, 활성화 항체는 정상 IGF-IR 활성을 회복할 수 있다. 다른 바람직한 구체예로서, 활성화 항체는 키가 작은 환자, 신경장애, 근육량 감소 또는 건선이 있는 환자에게 투여될 수 있다. 다른 바람직한 구체예로서, 활성화 항체는 세포 증식을 증가시키고, 세포자살을 예방하거나 IGF-IR 활성을 증가시키는 하나 이상의 다른 인자와 함께 투여될 수 있다. 이러한 인자는 IGF-I 및/또는 IGF-IR을 활성화하는 IGF-I의 유사체와 같은 성장인자를 포함한다. 바람직한 구체예로서, 항체는 2.12.1fx이거나, 또는 중쇄, 경쇄 또는 그의 항원-결합 부분을 포함한다.

본 발명의 핵산 분자는 유전자 요법을 통하여 환자에게 투여될 수 있다. 이 요법은 생체내에서 또는 시험관에서 실시될 수 있다. 바람직한 구체예로서, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산 분자는 환자에게 투여된다. 더욱 바람직한 구체예로서, 핵산 분자는 이들이 B 세포의 염색체에 안정하게 통합되도록 투여되며, 이는 이들 세포가 항체를 생산하도록 특화되기 때문이다. 바람직한 구체예로서, 전구체 B 세포는 시험관에서 형질감염 또는 감염되고 환자에게 재이식된다. 다른 구체예로서, 전구체 B 세포 또는 다른 세포는 목적하는 세포 유형을 감염시키는 것으로 공지된 바이러스를 사용하여 생체내에서 감염된다. 유전자 요법에 사용되는 전형적인 벡터는 리포좀, 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-결합 바이러스를 포함한다. 생체내 또는 시험관에서 감염후, 항체 발현양은 처리된 환자로부터 얻은 샘플을 취하고 당해 분야에 공지되고 본 명세서에 논의된 면역에세이를 이용하여 모니터링될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 유전자요법은 인간 항체 또는 그의 부분의 중쇄 또는 그의 항원-결합 부분을 암호화하는 분리된 핵산 분자 유효량을 투여하고 상기 핵산 분자를 발현시키는 단계를 포함한다. 다른 구체예로서, 유전자요법 방법은 인간 항체 또는 그의 부분의 경쇄 또는 그의 항원-결합 부분을 암호화하는 분리된 핵산 분자 유효량을 투여하고 상기 핵산 분자를 발현시키는 단계를 포함한다. 더욱 바람직한 방법으로서, 유전자 요법 방법은 인간 항체 또는 그의 부분의 중쇄 또는 그의 항원-결합 부분을 암호화하는 분리된 핵산 분자 유효량 및 인간 항체 또는 그의 부분의 경쇄 또는 그의 항원-결합 부분을 암호화하는 분리된 핵산 분자 유효량을 투여하고 상기 핵산 분자를 발현시키는 단계를 포함한다. 유전자 요법 방법은 탁솔, 타목시펜, 5-FU, 아드리아마이신 또는 CP-358,774와 같은 다른 항암제를 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 출원에서의 서열번호:

서열번호 1: 성숙 항체를 발현하기 위해 사용된 시그널 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 항체 2.12.1fx의 중쇄를 암호화하는 DNA 서열.

서열번호 2: 성숙 항체를 발현하기 위해 사용된 시그널 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 항체 2.12.1fx의 경쇄를 암호화하는 DNA 서열.

서열번호 3: 항체 2.12.1fx의 중쇄의 아미노산 서열.

서열번호 4: 점라인 DP-35의 아미노산 서열.

서열번호 5: 항체 2.12.1fx의 경쇄의 아미노산 서열.

서열번호 6: 점라인 A30/Jk1의 아미노산 서열.

본 발명을 더욱 잘 이해할 수 있도록, 하기 실시예를 기재한다. 이들 실시예는 예시를 위한 것이므로 어떠한 의미로든 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

실시예 1: 항- IGF - IR 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성

본 발명의 항체는 다음과 같이 제조하고, 선택하며 또 분석하였다:

인간 IGF-IR의 세포외 도메인(10㎍/투여량/마우스) 또는 혈장 막 상에서 인간 IGF-IR을 발현하는 2개의 형질감염된 세포주인 3T3-IG-IR 또는 300.19-IGF-IR 세포(10 x 10⁶ 세포/투여량/마우스)를 복강내 또는 후방 발바닥에 투여하여 8 내지 10주령 XENOMICE^TM를 면역화시켰다. 상기와 같은 투여를 3 내지 8주간에 걸쳐 5 내지 7회 반복하였다. 융합 4일 전에, PBS중의 인간 IGF-IR의 세포외 도메인 최종 주사를 마우스에 주사하였다. 면역화된 마우스로부터 얻은 비장 및 림프절 림프구를 비-분비성 골수종 P3-X63-Ag3.653 세포주와 함께 융합시키고 상기 기재한 바와 같이 HAT 선택처리시켰다[갈프리(Galfre) 및 미스타인(Mistein), Methods Enzymol. 73: 3-46, 1981]. 다음 연구를 위해 IGF-IR에 특이적인 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마, 2.12.1을 선택하고 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection: ATCC)(미국 버지니아주 20110-2209, 마나사스 유니버시티 블루바드 10801 소재)에 2000년 12월 12일자로 다음 기탁 번호로 기탁하였다:

하이브리도마 기탁번호

2.12.1 PTA-2792

이 하이브리도마 및 IGF-IR에 특이적인 항체를 생성하는 다른 하이브리도마는 2002년 7월 11일 공개된 WO 02/05359에 기재되어 있다. 기재된 모든 서열을 비롯한 상기 공개문헌의 내용은 모두 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.

항체 2.12.1의 중쇄에서 2개의 골격 돌연변이 및 경쇄에서 3개의 골격 돌연변이는 점라인으로 복귀시켜서 항체 2.12.1fx를 생성하였다.

2.12.1fx를 제조하기 위한 모든 변경은 QuikChange Site-Directed Muatagenesis Kit(Stratagene^TM)를 이용하고 플라스미드를 변성시키는 것에 돌연변이용 표적 부위를 갖는 플라스미드를 제조하고 소망하는 돌연변이를 함유하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 어닐링하는 것에 의해 실시하였다. Pfu Turbo DNA 중합효소의 비-가닥 치환 작용을 이용하여 닉(nicked) 환형 가닥을 생성하는 돌연변이성 프라이머를 연장시키고 혼입하였다. 메틸화된, 비돌연변이 비경구적 DNA 주형을 DpnI으로 분해한 다음 환형의 닉 dsDNA를 XL1-Blue 초감수성(supercompetent) 세포를 형질전환시켰다. 형질전환 후, XL1-Blue 초감수성 세포는 돌연변이된 플라스미드에서 닉(nick)을 수선하였다. 돌연변이를 함유하는 플라스미드를 선택하고 서열을 확인하였다.

도 1은 성숙 항체를 발현하기 위해 사용된 시그널 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, 항체 2.12.1fx의 중쇄를 암호화하는 DNA 서열을 도시한다(서열번호: 1). 도 2는 성숙 항체를 발현하기 위해 사용된 시그널 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, 항체 2.12.1fx의 경쇄를 암호화하는 DNA 서열을 도시한다(서열번호: 2). 도 3은 항체 2.12.1fx의 중쇄의 아미노산 서열(서열번호:3)과 점라인 서열 DP-35(3-11)/D3-3/JH6의 아미노산 서열(서열번호: 4)을 정렬한 것을 도시한다. 항체 2.12.1fx의 서열은 밑줄로 표시되어 있다. 시그널 서열은 이탤릭체로 표시되어 있 고 CDR은 밑줄로 표시한다. 불변(constant) 도메인 영역은 아미노산 잔기 ASTK로 시작되며, 점라인에서 148번에서 시작해서 서열의 끝까지 연장되는 아미노산 서열에 상응한다. 골격(FR) 돌연변이는 아미노산 서열 잔기 21-116에 존재한다. 도 4는 항체 2.12.1fx의 경쇄의 아미노산 서열(서열번호:5)과 점라인 서열 A30/Jk1의 아미노산 서열(서열번호: 6)을 정렬한 것을 도시한다. 항체 2.12.1fx의 서열은 점라인 서열 위에 도시한다. 시그널 서열은 이탤릭체로 표시되어 있고 CDR은 밑줄로 표시한다. 불변 도메인 영역은 아미노산 잔기 TVAA로 시작되며, 점라인에서 131번에서 시작해서 서열의 끝까지 연장되는 아미노산 서열에 상응한다. 골격(FR) 돌연변이는 아미노산 서열 잔기 43, 125 및 129에 존재한다.

실시예 II : IGF -I/ IGF - IR 결합의 항체- 매개된 차단

본 발명의 항체가 IGF-I의 IGF-IR에 대한 결합을 억제하는 능력을 정량하기 위해 세포 기제 분석으로 ELISA 실험을 실시하였다. L-글루타민(0.29mg/ml), 10% 열변성된 FBS 및 각각 500㎍/ml의 제네티신, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충되고 96웰 U-바닥 플레이트에 들어있는 100㎕의 DMEM 고 글루코오스 배지에, IGF-IR-형질감염된 NIH-3T3 세포(5x10⁴/ml)를 플레이팅하였다. 이 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 하룻밤동안 배양하여 세포를 부착시켰다. 플레이트로부터 배지를 따라내고 웰당 100㎕의 신선한 배지로 교체하였다. 시험하기 위해, 분석배지(L-글루타민(0.29mg/ml), 10% 열변성된 FBS, 200㎍/ml BSA 및 각각 500㎍/ml의 제네티신, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 고 글루코오스 배지)에 항체를 희석시켜 소 망하는 최종 농도를 얻었다. 모든 샘플은 3회 반복하였다. 플레이트를 37℃에서 10분간 배양하였다. [¹²⁵I]-IGF-I를 분석 배지 중에 1μCi/ml 농도로 희석시키고 플레이트 웰당 50㎕를 부가하였다. 방사성활성의 바탕값에 대한 대조용으로서 냉각 IGF-I를 최종농도 100ng/ml로 부가하였다. 플레이트를 37℃에서 10분간 배양하고 배지를 종이타월위에 가볍게 찍어서 따라내고 분석 배지로 2회 세척하였다. 50㎕의 0.1N NaOH, 0.1% SDS를 부가함으로써 세포를 용균시키고 플레이트를 실온에서 5분간 진탕시켰다. 샘플을 섬광계수기로 옮기고, 150㎕ OptiPhase Supermix를 부가한 다음 Wallace MicroBeta 계수기를 이용하여 시그널을 판독하였다.

하기 표 I 및 도 5는 본 발명의 항체로 실시한 실험 결과를 도시한다. 이 시험은 IGF-IR을 발현하는 세포에 [¹²⁵I]-IGF-I가 결합되는 것을 본 발명의 항체가 특이적으로 억제함을 보여준다.

실시예 III : IGF - IR 의 IGF -I-유도된 인산화의 항체- 매개된 억제

본 발명의 항체가 IGF-IR의 IGF-I-매개 활성화를 차단할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 ELISA 실험을 실시하였다. IGF-IR의 IGF-I-매개 활성화는 감소된 수용체-결합 티로신 인산화에 의해 검출되었다.

ELISA 플레이트 제조

ReactiBind Protein G-피복된 96-웰 플레이트(Pierce)의 각 웰에 100㎕ 차단 완충액(트리스-완충 염수[TBS]중의 3% 소혈청 알부민[BSA])을 부가함으로써 ELISA 포획 플레이트를 제조하였다. 이 플레이트를 실온에서 30분간 진탕시킴으로써 배양하였다. 토끼 팬(pan)-특이적 SC-713 항-IGF-IR 항체(Santa Cruz)를 차단 완충액에서 5㎍/ml 농도로 희석시켰다. 각 웰에 100㎕ 희석 항체를 부가하였다. 이 플레이트를 실온에서 60 내지 90분간 진탕하면서 배양하였다. 이 플레이트를 세척 완충액(TBS + 0.1% Tween 20)으로 5회 세척하고 잔류하는 완충액을 종이 타월로 찍어서 따라내었다. 이들 플레이트는 용균물을 부가하기 전에는 완전히 건조되지 않게 하였다.

IGF - IR 발현 세포로부터 용균물의 제조

IGF-IR 형질감염된 NIH-3T3 세포(5x10⁴/ml)를, 96-웰 U-바닥 플레이트에서 100㎕ 성장배지(L-글루타민(0.29mg/ml), 10% 열변성된 FBS 및 각각 500㎍/ml의 제네티신, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 고 글루코오스 배지)에 위치시켰다. 이 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 하룻밤동안 배양하여 세포를 부착시켰다. 배지를 플레이트로부터 따라내고 웰당 100㎕의 신선한 배지로 교체하였다. 시험하기 위해, 항-IGF-IR 항체를 성장배지에 소망하는 최종 농도로 5배 희석시키고 웰당 25㎕ 를 부가하였다. 모든 샘플은 3회 반복하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 600ng/ml IGF-I(성장 배지에서 제조)의 25㎕/웰로 세포를 자극시키고 실온에서 10분간 배양하였다. 플레이트를 기울여서 종이 타월로 찍어서 배지를 따라내었다. 50㎕ 용균 완충액(50mM HEPES, pH 7.4, 10mM EDTA, 150mM NaCl, 1.5mM MgCl₂, 1.6mM NaVO₄, 1% 트리톤 X-100, 1% 글라이세롤)을 부가함으로써 부착 세포를 용균시키고, 사용하기 바로 전에 50ml당 무-EDTA 프로테아제 억제제 타블렛(Roche Molecular Science) 1개를 보충시켰다. 세포를 실온에서 5분간 진탕시켰다. 각 웰에 200㎕ 희석 완충액(50mM HEPES, pH 7.4, 1.6mM NaVO₄)을 부가하고 피펫으로 혼합하였다. 100㎕ 용균물을 각 웰에서부터 상기 기재한 바와 같이 제조된 ELISA 포획 플레이트의 각 웰로 옮기고 실온에서 가볍게 진탕하면서 2시간동안 배양하였다.

항- 포스포티로신 ( pTYR ) 항체를 사용한 ELISA

플레이트를 기울여서 세포 용균물을 제거하고, 플레이트를 세척 완충액으로 5회 세척한 다음 과잉의 액체를 종이 타월로 찍어 제거하였다. 웰당 100㎕의 pTYR-특이적 항체(HRP-PY54)를 부가하고 차단 완충액에서 0.2㎍/ml 농도로 희석시켰다. 플레이트를 실온에서 30분간 진탕시켜 세포를 배양하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 5회 세척하고 종이 타월로 닦았다.

웰당 100㎕의 TMB 퍼옥시다아제 기질 용액(Kirkegaard & Perry)을 부가하고 발색이 생길 때까지 진탕(약 2-10분)하여 HRP-PY54 항체의 결합을 검출하였다. 웰당 100㎕의 TMB 중지 용액(Kirkegaard & Perry)을 부가함으로써 발색 반응을 중지시켰다. 플레이트를 실온에서 10초간 진탕시켜 용액을 혼합하고 OD_450nm에서 정량 측정하였다.

하기 표 II 및 도 6A는 본 발명의 항체를 사용한 실험 결과를 나타낸다. 이 실험의 결과는 감소된 수용체-결합 티로신 인산화에 의해 드러나는 바와 같이 IGF-IR의 IGF-I 매개 활성화를 차단하는 본 발명의 항체의 능력을 나타낸다. 또한 이들 결과는 본 발명의 항체의 상대적 능력을 정량하기 위해 사용될 수 있다.

실시예 IV : 본 발명의 항체의 종 교차반응성

본 발명의 항체의 종 교차반응성을 측정하기 위하여, 면역침강법, IGF-I-유도된 수용체 인산화의 항체-매개된 차단 및 FACS 분석을 비롯한 몇 가지 실험을 실시하였다.

면역침강 실험을 실시하기 위하여, T25 플라스크에서 L-글루타민(0.29mg/ml), 10% 열변성된 FBS 및 각각 500㎍/ml의 제네티신, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 고 글루코오스 배지에 세포를 플레이팅하였다. Hank's 완충 염수 용액(HBSS; Gibco BRL)중의 본 발명의 항체 100㎕를 1㎍/ml 농도로 부가하였다. 플레이트를 배양기 중, 37℃에서 30분간 배양한 다음 100ng/ml의 IGF-I과 함께 실온에서 10분간 세포를 자극시켰다. 세포를 RIPA 완충액(할로우 및 레인의 상기 문헌 참조)에서 용균시키고 IGF-IR을 2㎍ 팬(pan)-특이적 SC-713 항-IGF-IR 항체(Santa Cruz) + 단백질 A 아가로오스 비이드로 4℃에서 1시간 동안 면역침강시켰다. 비이드를 펠릿화하고 PBS/T(PBS + 0.1% Tween-20)로 3회 세척한 다음 5% βME를 함유하는 40㎕ Laemmli 완충액에서 끓였다.

상기 기재된 바와 같이 제조한 샘플을 웨스턴 블럿으로 분석하였다. 레인당 12㎕의 각 샘플을 로딩하여 4-10% 구배 Novex^TM 겔상에서 1 X MES 완충액(Novex^TM)을 흘려주었다. 겔은 150V에서 1시간 또는 200V에서 약 30분간 흐르게 하였다. 겔을 Novex^TM 전달 완충액과 10% 메탄올 중의 멤브레인으로 옮기고 100mA에서 철야로 또는 250mA에서 1-1.5시간 두었다. 이 막을 완전히 건조시키고 Superblock(Pierce Chemical Co.)를 함유하는 TBS(트리스-완충 염수 pH 8.0)로 실온에서 차단하였다. IGF-IR 블로팅 항체 SC713(Santa Cruz) 또는 포스포티로신 항체를 부가하여 면역침강된 IGF-IR 또는 포스포-IGF-IR을 검출하였다.

이 실험은 다양한 동물로부터 얻은 세포상에서 본 발명의 항체를 사용하여 실시하였다. 항체는 인간의 것은 결합시킬 수 있었지만 개 또는 마우스 IGF-IR을 결합하지 않았다. 이들 시험은 항체가 상당히 특이성을 가짐을 나타낸다.

본 발명의 항체의 교차 종 친화성의 결정

FACS 분석은 다른 동물, 특히 상기 기재한 바와 같은 고대 원숭이로부터 얻은 IGF-IR에 대한 본 발명의 항체의 친화성을 측정하기 위해 실시하였다. 등분의 인간 및 원숭이 세포(필리핀원숭이)(5x10⁵)를 얼음상에서 증가된 농도의 본 발명의 바이오틴일화된 항-IGF-IR 항체와 1시간 동안 배양하였다. 샘플을 얼음상에서 스트렙트애비딘-콘쥬게이트된 RPE(피코에리쓰린)와 함께 30분간 배양하였다. 유동세포분석법으로 결합을 측정하고 CellQuest 소프트웨어를 이용하여 세포수(계수기)에 대한 형광 세기(F12-H)의 히스토그램으로 분석하였다. 결합(K_d)은 항체 농도에 대한 형광세기를 의미하는 그래프로부터 각 항체에 대해 산출하였다. 대부분의 실험에서, 결합은 배양된 인간 MCF-7 세포 및 필리핀원숭이 조직 배양 세포에서 측정하였다. 항체의 고갈은 세포 농도 범위에 걸쳐 결합을 측정함으로써 제어하였다.

상술한 FACS 분석은 인간 및 필리핀원숭이 세포를 결합하는 본 발명의 항체의 능력을 시험하기 위하여 실시하였다. 시험한 모든 세포에 대하여 0.1㎍/ml의 반 최대 결합(K_d)이 관찰되었다.

실시예 V: IGF -I 수용체 하향조절

본 발명의 항체가 세포에서 IGF-IR의 하향조절을 유도하였는지 여부를 조사하기 위하여, L-글루타민(0.29mg/ml), 10% 열변성된 FBS 및 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F-12에 MCF7 세포를 플레이팅하여 T75 플라스크에 50% 콘플루언스에 도달시켰다. 본 발명의 항체를 1㎍/ml 농도로 세포에 부가하였다. 플레이트를 배양기 중, 37℃에서 지정 시간 동안 배양한 다음 50mM HEPES, pH 7.4, 10mM EDTA, 150mM NaCl, 1.5mM MgCl₂, 1.6mM NaVO₄, 1% Triton X-100, 1% 글리세롤에 용균시켰다. 세포 추출물 내의 전체 IGF-IR의 양은 팬-특이적 SC-713 항-IGF-IR 항체(Santa Cruz)를 사용한 웨스턴 블럿 분석법으로 측정하였다. 도 6B 참조. MCF7 세포를 본 발명의 항체로 처리하면 1 내지 2 시간 동안 IGF-IR을 60 내지 70% 하향 조절하였다.

실시예 VI : 생체에서 IGF - IR 에 대한 본 발명의 항체의 효과

상기 실시예에서 기재한 바와 같은 IGF-IR에 대한 본 발명의 항체의 효과가 생체내에서 생기는지 여부를 측정하기 위하여 실험을 실시하였다. 공개된 방법에 따라 면역체계가 없는(athymic) 마우스에 종양을 도입하였다[폴락(V.A. Pollack) 등, "Inhibition of epidermal growth factor receptor-associated tyrosine phosphorylation in human carcinomas with CP0-358,774: Dynamics of receptor inhibition in situ and antitumor effects in athymic mice," J. Pharmacol . Exp . Ther. 291: 739-748 (1999)]. 간단히, IGF-IR-형질감염된 NIH-3T3 세포(5x10⁶)를 0.2ml의 마트리겔 제제와 함께 3-4주령의 면역체계가 없는(nu/nu) 마우스에 피하 주사하였다. (약 400mm³) 종양이 형성된 후 본 발명의 항체를 마우스에 주사하였다.

24시간 후, 종양을 추출하고, 균질화한 다음 IGF-IR의 양을 측정하였다. IGF-IR 양을 측정하기 위하여, SC-713 항체를 차단 완충액에 최종 농도 ㎍/ml로 희석시키고 각 웰에 100㎕의 Reacti-Bind Goat 항-토끼(GAR) 피복된 플레이트(Pierce)를 부가하였다. 이 플레이트를 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 배양한 다음 세척 완충액으로 5회 세척하였다. 종양 샘플의 중량을 측정하였다. 12.5㎕ 종양 추출물을 용균 완충액을 사용하여 최종 부피 100㎕로 희석하였다. 100㎕의 샘플을 96개 웰 플레이트의 각 웰에 부가하였다. 플레이트를 실온에서 진탕하면서 1-2시간 동안 배양한 다음 세척 배양액으로 5회 세척하였다. 차단 완충액중의 100㎕의 HRP-PY54 또는 비오티닐화된 항-IGF-IR 항체를 각 웰에 부가하고 실온에서 진탕하면서 30분간 배양하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 5회 세척하고 전개시켰다. 웰당 100㎕ TMB 마이크로웰 기질을 부가함으로써 HRP-PY54에 의해 프로빙하여 플레이트를 전개시키고 100㎕ 0.9M H₂SO₄를 부가하여 전개를 중지시켰다. 10초간 전개함으로써 시그널을 정량하고 OD_450nm를 측정하였다. 이 시그널은 전체 단백질로 표준화하였다. 항-IGF-IR 항체로 프로빙된 플레이트는, 차단 완충액에 희석된 100㎕ 스트렙트애비딘-HRP를 각 웰에 부가하고, 실온에서 30분간 진탕하면서 배양한 다음 HRP-PY54에 대해 기재한 바와 같이 계속함으로써 전개시켰다.

본 발명의 항체의 복강 주사는 IGF-IR 단백질의 감소에 의해 측정되는 바와 같이 IGF-IR 활성의 억제를 초래함이 밝혀졌다(도 7). 또한 이러한 억제는 주사된 항체의 투여량에 반응한 것이었다(도 7). 이들 데이터는 본 발명의 항체가 시험관에서 관찰된 것과 같은 방식으로 생체내에서 IGF-IR을 표적으로 할 수 있음을 보여준다.

실시예 VII : 3 T3 / IGF - IR 세포 종양의 성장억제( TGI )

본 발명의 항체가 종양 성장을 억제하는지 여부를 결정하기 위해 본 발명의 항체를 시험하였다. 종양을 상기 기재(실시예 VI)한 바와 같이 도입하고 명백한 종양이 형성되었다(즉, 250mm³, 6-9일내). 복강 주사에 의해 0.20ml 투여량의 항체를 1회 투여하여 마우스를 처리하였다. 종양 크기는 3일 마다 2개 직경에 걸쳐 베르니어 칼리퍼스로 측정하였고 체적은 문헌[게런(Geran) 등 "Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems," Cancer Chemother .Rep. 3:1-104]에 확립된 방법을 이용하여 식 (길이 x [폭]²)/2로부터 산출하였다.

본 발명의 항체를 사용한 분석에 이어, 항체만으로 1회 처리는 IGF-IR 형질감염된 NIH-3T3 세포 유도 종양의 성장을 억제함이 밝혀졌다(도 8A). 또한, 7.5 mg/kg 정맥 투여된 아드리아마이신의 1회 투여와 조합한 연구에서, 항체의 1회 투여량의 투여는, 종양 성장의 공지 억제제인 아드리아마이신의 효과를 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 항체와 아드리아마이신의 조합은 항체 단독 또는 아드리아마이신 단독 처리한 경우에 비하여 7일의 성장 지연을 나타내었다(도 8B).

실시예 VIII : IGF - IR 하향 조절에 대한 항체 양의 관계

실시예 VI에 기재한 바와 같은 누드 마우스에 종양을 도입하였다. 실시예 VI에 기재된 바와 같이 복강 주사에 의해 125㎍ 항체를 마우스에 처리하였다. 종양을 추출하고 ELISA에 의해 IGF-IR 양을 측정하였다. 도 9는 시간 경과에 따른 혈청 항체 양과 IGF-IR 수용체 양을 나타낸다. 실험은 IGF-IR은 항체에 의해 하향 조절되고 IGF-IR 억제 정도는 항체의 혈청 농도와 투여량 비례함을 나타낸다.

실시예 IX : 직장 세포 종양의 성장 억제

Colo 205 세포(ATCC CCL 222)를 사용한 이외는 실시예 VI에 기재된 바와 같이 누드 마우스에 종양을 도입하였다. Colo 250 세포는 인간 직장 선암 세포이다. 약 250mm³의 피하 종양을 갖는 마우스에 다양한 양의 항체를 투여(복강)하거나 또는 100mg/kg 5-플루오로데옥시우리딘 (5-FU, 정맥 투여)으로 실시예 VII에 기재된 바와 같이 단일 약제 또는 조합물로 처리하였다. 도 10A 및 도 10B는 시간 경과에 따른 다양한 처리에 관한 종양 크기를 도시한다. 이 실험은 항-IGF-IR 항체를 사용한 1회 치료는 단일약제로 제공될 때 인간 직장 암 세포 성장을 억제하고 공지된 종양 억제제인 5-FU의 효과를 향상시킴을 보여주었다.

실시예 X: 생체내에서 항- IGF - IR 항체의 약물대사속도

항-IGF-IR 항체의 약물대사속도를 평가하기 위하여, 필리핀원숭이에 아세테이트 완충액중의 5mg/kg 항체를 정맥 주사하였다. 상기 원숭이로부터 다양한 시점에서 혈청을 수집하고 원숭이에서 항-IGF-IR 항체 농도는 10주간에 걸쳐 측정하였다. 혈청 항체 양을 정량하기 위하여, 인간 IGF-IR의 세포외 도메인(IGF-I-sR, R&D Systems, Catalog #391GR)을 96-웰 플레이트에 결합시켰다. 원숭이 혈청(1:100 내지 1:15,000으로 희석)을 상기 분석 플레이트에 부가하고 각 샘플이 표준 곡선의 선형 범위에서 있도록 하고 항-IGF-IR 항체가 IGF-I-sR에 결합되는 조건하에서 배양하였다. 플레이트를 세척한 후, 라벨링된 항-인간 IgG 항체를 플레이트에 부가하고 항-인간 IgG 항체가 항-IGF-IR 항체에 결합될 조건하에서 배양하였다. 이 플레이트를 세척하고 전개한 다음 항-IGF-IR 항체 양을 정량하기 위하여 대조용 표준 곡선 및 선형 억제 피트를 이용하였다. 도 11은 시간 경과에 따른 혈청에서의 항체 농도를 도시한다. 이 실험은 항-IGF-IR 항체의 반감기(t_{1 /2})가 6.1일이고 체적 분포(Vd_ss)가 0.54 (L/kg)임을 나타낸다.

본 명세서에서 인용된 모든 문헌 및 특허출원은 개별 문헌 또는 특허출원이 참고문헌으로 특이적으로 또 개별적으로 지시된 것처럼 참고문헌에 포함된다. 상술한 방법은 예시적 목적으로 자세히 기재하고 실시예는 분명한 이해를 위하여 제안되었지만, 첨부된 특허청구범위의 정신 또는 범위에서 벗어나지 않는 한 본 발명의 내용으로부터 특정 변경과 변형이 가능함은 당업자라면 잘 알고 있을 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Products Inc <120> MODIFIED HUMAN IGF-1R ANTIBODIES <130> PC25231A <160> 6 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1413 <212> DNA <213> 2.12.1 FX <400> 1 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctt gttgctatta taaaaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtccgg gggaggcttg gtcaagcctg gagggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgac tactatatga gctggatccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggaatgggt ttcatacatt agtagtagtg gtagtaccag agactacgca 240 gactctgtga agggccgatt caccatctcc agggacaacg ccaagaactc actgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgtgag agatggagtg 360 gaaactactt tttactacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 420 accgtctcct cagcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg 480 agcacctccg agagcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 540 gtgacggtgt cgtggaactc aggcgctctg accagcggcg tgcacacctt cccagctgtc 600 ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcaacttc 660 ggcacccaga cctacacctg caacgtagat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 720 acagttgagc gcaaatgttg tgtcgagtgc ccaccgtgcc cagcaccacc tgtggcagga 780 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840 gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcca gttcaactgg 900 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cacgggagga gcagttcaac 960 agcacgttcc gtgtggtcag cgtcctcacc gttgtgcacc aggactggct gaacggcaag 1020 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080 aaaaccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1200 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac acctcccatg 1260 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413 <210> 2 <211> 728 <212> DNA <213> 2.12.1 FX <400> 2 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctggtt cccaggtgcc 60 aggtgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 120 gtcaccatca cttgccgggc aagtcaggac attagacgtg atttaggctg gtatcagcag 180 aaaccaggga aagctcctaa gcgcctgatc tatgctgcat cccgtttaca aagtggggtc 240 ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg acagaattca ctctcacaat cagcagcctg 300 cagcctgaag attttgcaac ttattactgt ctacagcata ataattatcc tcggacgttc 360 ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 420 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 540 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta gtgacccggg 720 aacgaccg 728 <210> 3 <211> 470 <212> PRT <213> 2.12.1 FX <400> 3 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Ile Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Arg Asp Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Val Glu Thr Thr Phe Tyr Tyr Tyr Tyr 115 120 125 Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 145 150 155 160 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 165 170 175 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 180 185 190 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 210 215 220 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 225 230 235 240 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 260 265 270 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 275 280 285 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 290 295 300 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 305 310 315 320 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 325 330 335 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 340 345 350 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 355 360 365 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 370 375 380 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 385 390 395 400 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 405 410 415 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 435 440 445 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 450 455 460 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 4 <211> 473 <212> PRT <213> 2.12.1 <400> 4 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Ile Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Arg Phe Leu Glu Trp Leu Leu Tyr Tyr 115 120 125 Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 130 135 140 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 145 150 155 160 Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 165 170 175 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 180 185 190 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 195 200 205 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly 210 215 220 Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 225 230 235 240 Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys 245 250 255 Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 260 265 270 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 275 280 285 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 290 295 300 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 305 310 315 320 Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His 325 330 335 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 340 345 350 Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 355 360 365 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 370 375 380 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 385 390 395 400 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 405 410 415 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 420 425 430 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 435 440 445 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 450 455 460 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 5 <211> 236 <212> PRT <213> 2.12.1 FX <400> 5 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Asp Ile Arg Arg Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln 100 105 110 His Asn Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 6 <211> 236 <212> PRT <213> 2.12.1 <400> 6 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln 100 105 110 His Asn Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235

Claims (15)

1. 선택 위치에서 상응하는 점라인 아미노산 잔기로 치환된 하나 이상의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함하는, 인간의 단클론 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 치환된 잔기가 상기 항체의 가변 영역의 골격 부위(framework region)에 함유된 체세포 돌연변이인 인간의 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
3. 제 2 항에 있어서,

   인간의 인슐린-유사 성장인자 I 수용체(IGF-IR)에 특이적으로 결합되는 인간의 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
4. 제 3 항에 있어서,

   경쇄(light chain)의 가변영역이 서열번호: 5의 아미노산 서열의 아미노산 번호 23 내지 130을 포함하는 인간의 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
5. 제 4 항에 있어서,

   경쇄가 서열번호: 5의 아미노산 번호 23 내지 236을 포함하는 인간의 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
6. 제 4 항에 있어서,

   중쇄(heavy chain)의 가변영역이 서열번호: 3의 아미노산 번호 20 내지 144를 포함하는 인간의 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
7. 제 6 항에 있어서,

   중쇄가 서열번호: 3의 아미노산 번호 20 내지 470을 포함하고, 경쇄가 서열번호: 5의 아미노산 번호 23 내지 236을 포함하는 인간의 항체.
8. 제 6 항에 있어서,

   상기 항체의 중쇄가 서열번호: 3의 아미노산 번호 20 내지 470으로 이루어지고, 경쇄가 서열번호: 5의 아미노산 번호 23 내지 236으로 이루어지는 인간의 항체.
9. 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 부분 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암을 치료하기 위한 약학 조성물.
10. 제 9 항에 있어서,

    항신생물제, 화학요법제 또는 항종양제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
11. 암 치료에 효과적인 양의 항체를 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 제 1 항 내 지 제 8 항중 어느 한 항에 따른 인간 항체 또는 그의 항원-결합 부분으로 인간의 암을 치료하는 방법.
12. 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 따른 항체의 중쇄 또는 그의 항원-결합 부분, 또는 경쇄 또는 그의 항원-결합 부분을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
13. 제 12 항에 따른 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
14. 제 13 항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
15. 제 14 항에 따른 숙주 세포를 배양하고 항체를 회수함을 포함하는, 단클론 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 생성시키는 방법.

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