NO20131482L

NO20131482L - Humane antistoff som binder human IL-12 samt fremgangsmåter ved fremstilling derav

Info

Publication number: NO20131482L
Application number: NO20131482A
Authority: NO
Inventors: Jochen G Salfeld; Zehra Kaymakcalan; Michael White; Subhashis Banerjee; Geertruida M Veldman; Michael Roguska; Michael Paskind; Boris Labkovsky; Paul Sakorafas; Stuart Friedrich; Angela Myles; Amy Venturini; Nicholas W Warne; Angela Widom; John G Elvin; Elaine J Derbyshire; Alexander R Duncan; Sara Carmen; Stephen Smith; Thor Las Holtet
Original assignee: Abbott Gmbh & Co Kg
Priority date: 1999-03-25
Filing date: 2013-11-07
Publication date: 2001-11-26
Also published as: NZ592550A; TW201215619A; PL351842A1; JP2012010702A; EP1175446A1; EP2319870A3; TR200802278T2; IL145134A0; MY142984A; TR200503572T2; HUP0200575A3; AR094125A2; TWI339209B; NO334828B1; TW200738749A; CZ303725B6; TW201300412A; NO2014024I1; HUP0200575A2; CN1351614A

Abstract

Humane antistoffer, fortrinnsvis rekombinante humane antistoffer,som binder spesifikt til humant interleukin-12 (hIL-12) er beskrevet. Foretrukne antistoffer har høy affinitet for hIL-12 og nøytraliserer hIL-12 aktivitet in vitro og in vivo. Et antistoff i den foreliggende oppfinnelsen kan være et fullengde antistoff eller en antigenbindende del derav. Antistoffene, eller antistoffdelene, i oppfinnelsen er egnet for å detektere hIL-12 og for å inhibere hIL-12 aktivitet, f.eks. i et menneske som lider av en forstyrrelse der hIL-12 aktivitet er skadelig. Nukleinsyrer, vektorer og vertsceller for ekspresjon av de rekombinante humane antistoffene i den foreliggende oppfinnelsen, og fremgangsmåter for å syntetisere de rekombinante humane antistoffene, er også omfattet av oppfinnelsen.

Description

Relaterte søknader

Denne søknaden er en ikke-provisorisk søknad som krever prioritet til U.S. provisorisk søknad serienr. 60/126.603, innlevert 25. mars, 1999, der innholdet av denne herved er inkorporert med referanse.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Humant interleukin 12 (IL-12) har nylig blittkarakterisertsom et cytokin med en unik struktur og pleiotropiske ef-fekter (Kobayashi et al., (1989) J. Exp. Med. 170:827-845; Seder et al., (1993) Proe. Nati. Acad. Sei. 90:10188-10192; Ling et al., (1995) J. Exp. Med. 154:116-127; Podlaski et al., (1992) Arch. Biochem. Biophys. 294:230-237). IL-12 spiller en kritisk rolle i patologien assosiert med flere sykdommer som involverer immun- og inflammatoriske responser. En oversikt over IL-12, dets biologiske aktiviteter og dets rolle i sykdom kan bli funnet i Gately et al., (1998) Ann. Rev. Immunol. 16:495-521.

Strukturelt er IL-12 et heterodimert protein som innbefatter en 35 kDa subenhet (p35) og en 40 kDa subenhet (p40) som begge er bundet sammen med en disulfidbro (henvist til som "p70-subenheten"). Det heterodimere proteinet produseres primært av antigenpresenterende celler som monocytter, makrofager og dendrittiske celler. Disse celletypene sekrerer også et overskudd av p40-subenheten i forhold til p70-subenheten. p40- og p35-subenhetene er ikke beslektet genetisk og ingen av dem har blitt rapportert til å ha biologisk aktivitet, selv om p40-homodimeren kan fungere som en IL-12 antagonist.

Funksjonelt spiller IL-12 en sentral rolle i reguleringen av balansen mellom antigenspesifikke T-hjelpercelle type 1 (Thl) og type 2 (Th2) lymfocytter. Thl- og Th2-cellene styrer igangsettingen og progresjonen av autoimmune forstyrrelser, og IL-12 er kritisk i reguleringen av Thl-lymfocyt- ters differensiering og modning. Cytokiner frigjort av Thl-cellene er inflammatoriske og innbefatter interferon y (IFNy), IL-2 og lymfotoksin (LT). Th2-celler sekrerer IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 og IL-13 for å lette humoral immunitet, allergiske reaksjoner og immunsuppresjon.

I overensstemmelse med overvekten av Thl-responser i autoimmune sykdommer og de proinflammatoriske aktivitetene til IFNy, kan IL-12 spille en hovedrolle i patologien assosiert med mange autoimmune- og inflammatoriske sykdommer som revmatoid artritt (RA), multippel sklerose (MS) og Crohns sykdom.

Menneskepasienter med MS har en økning i IL-12 ekspresjon, som er dokumentert med p40-mRNA-nivåer i akutte MS-plakk (Windhagen et al., (1995) J. Exp. Med. 182:1985-1996). I tillegg resulterte ex vivo-stimulering av antigenpresenterende celler med CD40L-uttrykkende T-celler fra MS-pasienter i økt produksjon av IL-12 sammenlignet med kontroll T-celler, som er i overensstemmelse med observasjonen av at CD40/CD40L-interaksjoner er sterke induserere av IL-12.

Forhøyede nivåer av IL-12 p70 har blitt detektert i synovia til RA-pasienter sammenlignet med friske kontroller (Morita et al., (1998) Arthritis and Rheumatism 41:306-314). Cytokin-budbringerribonukleinsyre (mRNA) ekspresjonsprofil i RA-synovia identifiserte hovedsakelig Thl-cytokiner (Bucht et al., (1996) Clin. Exp. Immunol. 103:347-367). IL-12 ser også ut til å spille en kritisk rolle i patologien assosiert med Crohns sykdom (CD). Økt ekspresjon av INFy og IL-12 har blitt observert i tarmslimhinnen hos pasienter med denne sykdommen (Fais et al., (1994) J. Interferon Res. 14:235-238; Parronchi et al., (1997) Am. J. Path. 150:823-832; Monteleone et al., (1997) Gastroenterology 112:1169-1178 og Berrebi et al., (1998) Am. J. Path. 152:667-672). Cytokinsekresjonsprofilen til T-celler fra lamina propria hos CD-pasienter er karakteristisk for en dominerende Thl-respons, som innbefatter svært forhøyede IFNy-nivåer (Fuss et al., (1996) J. Immunol. 157:1261-1270). I tillegg viser snitt av tykktarmsvev fra CD-pasienter rikelig med makrofager som uttrykker IL-12 og IFNy-uttrykkende T-celler (Parronchi et al., (1997) Am. J. Path. 150:823-832).

På grunn av rollen humant IL-12 har i mange humane forstyrrelser, har terapeutiske strategier blitt designet for å inhibere eller motvirke IL-12 aktivitet. Spesielt har antistoffer som binder til, og nøytraliserer, IL-12 blitt søkt etter som en måte for å inhibere IL-12 aktivitet. Noen av de første antistoffene var murine monoklonale antistoffer (mAb'er) sekrert av hybridomer fremstilt fra lymfocytter fra mus immunisert med IL-12 (se f.eks. verdens patent-søknad publikasjon nr. WO 97/15327 til Strober et al.; Neurath et al., (1995) J. Exp. Med. 182:1281-1290; Duchmann et al., (1996) J. Immunol. 26:934-938). Disse murine IL-12 antistoffene har begrenset anvendelse in vivo pga. problem-er assosiert med administrering av museantistoffer til mennesker, slik som kort halveringstid i serum, en manglende evne til å utløse visse humane effektorfunksjoner og igangsetting av en uønsket immunrespons mot museantistoffet i et menneske (den "humane anti-mus antistoff" (HAMA)-reaksjonen).

Generelt har forsøk på å løse problemene assosiert med anvendelse av helt murine antistoffer i mennesker involvert genetisk å gjøre antistoffene mer "menneske-lignende." For eksempel har kimæriske antistoffer, der de variable regionene til antistoffkjedene er avledet fra mus og de konstante regionene til antistoffkjedene er avledet fra menneske, blitt fremstilt (Junghans et al., (1990) Cancer Res. 50:1495-1502; Brown et al., (1991) Proe. Nati. Acad. Sei. 88:2663-2667; Kettleborough et al., (1991) Protein Engineering 4:773-783). Imidlertid, siden disse kimæriske og humaniserte antistoffene fortsatt inneholder noen murine sekvenser, kan de fremdeles utløse en uønsket immunreak-sjon, den humane anti-kimæriske antistoff (HACA)- reaksjonen, spesielt når de blir administrert over lengre tid.

En foretrukket IL-12 inhibitorisk agens, i stedet for murine antistoffer eller derivater derav (f.eks. kimæriske eller humaniserte antistoffer), vil være et fullstendig humant anti-IL-12 antistoff, siden en slik agens ikke vil utløse HAMA-reaksjonen, selv om den blir anvendt over lengre tid. Slike antistoffer har imidlertid ikke blitt beskrevet i faget og er derfor fortsatt ønsket.

Oppsummering av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer humane antistoffer som binder humant IL-12. Oppfinnelsen angår også behandlingen eller forebyggelsen av akutte eller kroniske sykdommer eller tilstander med patologi som involverer IL-12, ved å anvende de humane anti-IL-12 antistoffene i den foreliggende oppfinnelsen.

I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som binder til humant IL-12.

I én utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et selektivt mutert humant IL-12 antistoff, som innbefatter: et humant antistoff, eller antigenbindende del derav, som er selektivt mutert i en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon med en aktivitets-økende aminosyrerest slik at det binder til humant IL-12.

I en foretrukket utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et selektivt mutert humant IL-12 antistoff, som innbefatter: et humant antistoff, eller antigenbindende del derav, som er selektivt mutert i en foretrukket selektiv mutageneseposisjon med en aktivitetsøkende aminosyrerest slik at det binder til humant IL-12.

I en annen foretrukket utførelse er det selektivt muterte humane IL-12 antistoffet, eller antigenbindende del derav, selektivt mutert i mer enn én foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon med en aktivi-tetsøkende aminosyrerest. I en annen foretrukket utførelse er det selektivt muterte humane IL-12 antistoffet, eller antigenbindende del derav, ikke selektivt mutert i mer enn tre foretrukne selektive mutagenese-, kontakt- eller hyper-mutas j onsposis j oner . I en annen foretrukket utførelse er det selektivt muterte humane IL-12 antistoffet, eller antigenbindende del derav, ikke selektivt mutert i mer enn to foretrukne selektive mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjoner. I enda en annen foretrukket utførelse er det selektivt muterte humane IL-12 antistoffet, eller antigenbindende del derav, selektivt mutert slik at et målspe-sifisitetsaffinitetsnivå blir oppnådd, der målnivået er forbedret i forhold til det som er oppnåelig når man selek-terer for et antistoff mot det samme antigenet ved å anvende fagdisplayteknologi. I en annen foretrukket utførelse beholder det selektivt muterte humane IL-12 antistoffet videre minst én fordelaktig egenskap eller særtrekk, f.eks. bevaring av ikke-kryssreaktivitet med andre proteiner eller humane vev, bevaring av epitopegjenkjennelse, produksjon av et antistoff med en sekvens som ligner kimbaneimmunglobulinsekvens.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller antigenbindende del derav, som binder til humant IL-12 og dissosierer fra humant IL-12 med en Kav-hastighetskonstant på 0,1 s<-1>eller mindre, bestemt med overflateplasmonresonans, eller som inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en fytohemagglutinin-blastproliferasjonstest (PHA-test) in vitro med en IC5opå 1 x IO<-6>M eller mindre. Mer foretrukket dissosierer det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, fra humant IL-12 med en Kav-hastighetskonstant på 1

x IO-2 s-1 eller mindre, eller inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC50på 1

x IO<-7>M eller mindre. Mer foretrukket dissosierer det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, fra humant IL-12 med en Kav-hastighetskonstant på 1 x IO-<3>s-<1>eller mindre, eller inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC50på 1 x IO<-8>M eller mindre. Mer foretrukket dissosierer det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, fra humant IL-12 med en Kav-hastighetskonstant på 1 x IO-<4>s-<1>eller mindre, eller inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC50på 1 x IO-9 M eller mindre. Mer foretrukket dissosierer det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, fra humant IL-12 med en Kav-hastighetskonstant på 1 x IO<-5>s<-1>eller mindre, eller inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC5opå 1 x IO<-10>M eller mindre. Enda mer foretrukket dissosierer det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, fra humant IL-12 med en Kav-hastighetskonstant på 1 x IO<-5>s<-1>eller mindre, eller inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC5opå 1 x IO<-11>M eller mindre.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som har følgende karakteristika: a) inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC5opå 1 x IO<-6>M eller mindre; b) har en tung kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:1; og c) har en lett kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:2.

I en foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, en tung kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:3 og en lett kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:4. I en foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, en tung kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:5 og en lett kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:6. I en foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller antigenbindende del derav, en tung kjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:7 og en lett kjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:8.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som har følgende karakteristika: a) inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC50på 1 x IO<-9>M eller mindre; b) har en tung kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:9; og c) har en lett kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:10.

I en foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, en tung kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:11 og en lett kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:12. I en foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, en tung kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:13 og en lett kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:14. I en foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet en tung kjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:15 og en lett kjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:16.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som: a) inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC50på 1 x IO<-9>M eller mindre; b) har en tung kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:17; og c) har en lett kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:18.

I en foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, en tung kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:19 og en lett kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:20. I en foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, en tung kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:21 og en lett kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:22. I en foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, en tung kjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:23 og en lett kjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:24. I en foretrukket utførelse innbefatter det isolerte humane antistoffet en tung kjede konstant region valgt fra gruppen som består av IgGl-, IgG2-, IgG3-, IgG4-, IgM-, IgA- og IgE-konstante regioner, eller enhver allelisk variasjon derav, som er diskutert i Kabat et al. (Kabat, E. A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, femte utgave, U.S. Department of Health and Human Services, NIH publikasjon nr. 91-3242), som er inkludert heri med referanse. I en mer foretrukket utførelse er den konstante regionen på en tung antistoffkjede lik IgGl. I en annen foretrukket utførelse er det isolerte humane antistoffet et Fab-fragment, eller et F (ab')2-fragment eller et enkeltkjedet Fv-fragment.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som a) inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC50på 1 x IO<-9>M eller mindre; b) har en tung kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR:404 -

SEKV ID NR:469; og

c) har en lett kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR:534 -

SEKV ID NR:57 9.

I en foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, en tung kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR:335 - SEKV ID NR:403 og en lett kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR:506 - SEKV ID NR:533. I en foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, en tung kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR:288 - SEKV ID NR:334 og en lett kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR:470 - SEKV ID NR:505. I en foretrukket utførelse innbefatter det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, en tung kjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:23 og en lett kjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:24. I en foretrukket ut-førelse innbefatter det isolerte humane antistoffet en tung kjede konstant region, eller et Fab-fragment, eller et F (ab') 2-fragment eller et enkeltkjedet Fv-fragment, som beskrevet ovenfor.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som:

a) inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC50på 1 x IO<-9>M eller mindre; b) har en tung kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:25; og c) har en lett kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:26.

I en foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, en tung kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:27 og en lett kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:28. I en foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, en tung kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:29 og en lett kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:30. I en foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, en tung kjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:31 og en lett kjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:32. I en foretrukket utførelse innbefatter det isolerte humane antistoffet en tung kjede konstant region, eller et Fab-fragment, eller et F (ab') 2-fragment eller et enkeltkjedet Fv-fragment, som beskrevet ovenfor.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som: a) inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC5opå 1 x IO<-6>M eller mindre; b) innbefatter en tung kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:1, en tung kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:3 og en tung kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:5, eller en mutant derav med én eller flere aminosyresubstitu sjoner i en kontakt- eller hypermutasjonsposisjon, der nevnte mutant har en kav-hastighet som ikke er mer enn 10-fold høyere enn antistoffet som innbefatter en tung kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:1, en tung kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:3 og en tung kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:5; og c) innbefatter en lett kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:2, en lett kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:4 og en lett kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:6, eller en mutant derav med én eller flere aminosyresubstitusjoner i en kontakt- eller hypermutasjonsposisjon, der nevnte mutant har en kav-hastighet som ikke er mer enn 10-fold høyere enn antistoffet innbefattende en lett kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:2, en lett kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:4 og en lett kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:6.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som: a) inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC50på 1 x IO<-9>M eller mindre; b) innbefatter en tung kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:9, en tung kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:11 og en tung kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:13, eller en mutant derav med én eller flere aminosyresubstitusjoner i en kontakt- eller hypermutasjonsposisjon, der nevnte mutant har en kav-hastighet som ikke er mer enn 10-fold høyere enn antistoffet som innbefatter en tung kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:9, en tung kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:11 og en tung kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:13; og

c) innbefatter en lett kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:10, en lett kjede CDR2 som

innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:12 og en lett kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:14, eller en mutant derav med én eller flere aminosyresubstitusjoner i en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon, der nevnte mutant har en kav-hastighet som ikke er mer enn 10-fold høyere enn antistoffet innbefattende en lett kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:10, en lett kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:12 og en lett kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:14.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som: a) inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC50på 1 x IO<-9>M eller mindre; b) innbefatter en tung kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:17, en tung kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:19 og en tung kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:21, eller en mutant derav med én eller flere aminosyresubstitusjoner i en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt-ener hypermutasjonsposisjon, der nevnte mutant har en kav-hastighet som ikke er mer enn 10-fold høyere enn antistoffet som innbefatter en tung kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:17, en tung kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:19 og en tung kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:21; og c) innbefatter en lett kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:18, en lett kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:20 og en lett kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:22, eller en mutant derav med én eller flere aminosyresubstitusjoner i foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon, der nevnte mutant har en kav-hastighet som ikke er mer enn 10-fold høyere enn antistoffet innbefattende en lett kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:18, en lett kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:20 og en lett kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:22.

Oppfinnelsen tilveiebringer også nukleinsyremolekyler som koder for antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i den foreliggende oppfinnelsen. En foretrukket isolert nukleinsyre koder for tung kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:17. Den isolerte nukleinsyren koder for en variabel region på tung antistoffkjede. I en annen utførelse koder den isolerte nukleinsyren for CDR2 i en tung antistoffkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:19. I en annen utfør-else koder den isolerte nukleinsyren for CDR1 i en tung antistoffkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:21. I en annen utførelse koder den isolerte nukleinsyren for en tung antistoffkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:23. I en annen utførelse koder den isolerte nukleinsyren for lett kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:18. Den isolerte nukleinsyren koder for en variabel region på lett antistoffkjede. I en annen utførelse koder den isolerte nukleinsyren for CDR2 i en lett antistoffkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:20. I en annen utførelse koder den isolerte nukleinsyren for CDR1 i en lett antistoffkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:22. I en annen utførelse koder den isolerte nukleinsyren for en lett antistoffkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:24.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som: a) inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC50på 1 x IO<-9>M eller mindre; b) innbefatter en tung kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:25, en tung kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:27 og en tung kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:29, eller en mutant derav med én eller flere aminosyresubstitusjoner i en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt-ener hypermutasjonsposisjon, der nevnte mutant har en kav-hastighet som ikke er mer enn 10-fold høyere enn antistoffet som innbefatter en tung kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:25, en tung kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:27 og en tung kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:29; og c) innbefatter en lett kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:26, en lett kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:28 og en lett kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:30, eller en mutant derav med én eller flere aminosyresubstitusjoner i en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt-ener hypermutasjonsposisjon, der nevnte mutant har en kav-hastighet som ikke er mer enn 10-fold høyere enn antistoffet innbefattende en lett kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:26, en lett kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:28 og en lett kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:30.

En foretrukket isolert nukleinsyre koder for tung kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:25. Den isolerte nukleinsyren koder for en variabel region på tung antistoffkjede. I en annen utførelse koder den isolerte nukleinsyren for CDR2 i en tung antistoffkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:27. I en annen utførelse koder den isolerte nukleinsyren for CDR1 i en tung antistoffkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:29. I en annen utførelse koder den isolerte nukleinsyren for en tung antistoffkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:31. I en annen utførelse koder den isolerte nukleinsyren for lett kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:26. Den isolerte nukleinsyren koder for en variabel region på lett antistoffkjede.

I en annen utførelse koder den isolerte nukleinsyren for CDR2 i en lett antistoffkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:28. I en annen utfør-else koder den isolerte nukleinsyren for CDR1 i en lett antistoffkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:30. I en annen utførelse koder den isolerte nukleinsyren for en lett antistoffkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:32.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som har følgende karakteristika: a) som binder til humant IL-12 og dissosierer fra humant IL-12 med en kav-hastighetskonstant på 0,1 s<-1>eller mindre, bestemt med overflateplasmonresonans, eller som inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro fytohemagglutinin-blastproliferasjonstest (PHA-test) med en IC50på 1 x IO-<6>M eller mindre. b) har en tung kjede variabel region som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra et medlem av VH3-kimbanefami-lien, der den variable regionen på den tunge kjeden har en mutasjon i en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt-ener hypermutasjonsposisjon med en aktivitetsøkende aminosyrerest . c) har en lett kjede variabel region som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra et medlem av V^l-kimbanefami-lien, der den variable regionen på den lette kjeden har en mutasjon i en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt-ener hypermutasjonsposisjon med en aktivitetsøkende aminosyrerest .

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som har følgende karakteristika: a) som binder til humant IL-12 og dissosierer fra humant IL-12 med en kav-hastighetskonstant på 0,1 s<-1>eller mindre, bestemt med overflateplasmonresonans, eller som inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro fytohemagglutinin-blastproliferasjonstest (PHA-test) med en IC50på 1 x 10~<6>M eller mindre.

b) har en tung kjede variabel region som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID

NR:595-667, der den variable regionen på den tunge kjeden har en mutasjon i en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon med en aktivitets-økende aminosyrerest.

c) har en lett kjede variabel region som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID

NR:669-675, der den variable regionen på den lette kjeden har en mutasjon i en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon med en aktivitets-økende aminosyrerest.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som har følgende karakteristika: a) som binder til humant IL-12 og dissosierer fra humant IL-12 med en kav-hastighetskonstant på 0,1 s<-1>eller mindre, bestemt med overflateplasmonresonans, eller som inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro fytohemagglutinin-blastproliferasjonstest (PHA-test) med en IC5opå 1 x IO<-6>M eller mindre.

b) har en tung kjede variabel region som innbefatter COS-3 kimbaneaminosyresekvensen, der den variable regionen på

den tunge kjeden har en mutasjon i en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon med en aktivitetsøkende aminosyrerest.

c) har en lett kjede variabel region som innbefatter DPL8-kimbaneaminosyresekvensen, der den variable regionen

på den lette kjeden har en mutasjon i en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon med en aktivitetsøkende aminosyrerest.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som har følgende karakteristika: a) som binder til humant IL-12 og dissosierer fra humant IL-12 med en kav-hastighetskonstant på 0,1 s<-1>eller mindre, bestemt med overflateplasmonresonans, eller som inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro fytohemagglutinin-blastproliferasjonstest (PHA-test) med en IC50på 1 x IO<-6>M eller mindre. b) har en tung kjede variabel region som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra et medlem av VH3-kimbanefami-lien, der den variable regionen på den tunge kjeden innbefatter en CDR2 som ligner strukturelt på CDR2'er fra andre VH3-kimbanefamiliemedlemmer, og en CDR1 som ligner strukturelt på CDRl'er fra andre VH3-kimbanefamiliemedlemmer, og der den variable regionen på den tunge kjeden har en mutasjon i en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon med en aktivitetsøkende aminosyrerest; c) har en lett kjede variabel region som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra et medlem av V^l-kimbanefami-lien, der den variable regionen på den lette kjeden innbefatter en CDR2 som ligner strukturelt på CDR2'er fra andre V^l-kimbanefamiliemedlemmer, og en CDR1 som ligner strukturelt på CDR1'er fra andre Vxl-kimbanefamiliemedlemmer, og der den variable regionen på den lette kjeden har en mutasjon i en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon med en aktivitetsøkende aminosyrerest .

I en foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller antigenbindende del derav, en mutasjon i tung kjede CDR3. I en annen foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller antigenbindende del derav, en mutasjon i lett kjede CDR3. I en annen utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller antigenbindende del derav, en mutasjon i tung kjede CDR2. I en annen foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller antigenbindende del derav, en mutasjon i lett kjede CDR2. I en annen foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller antigenbindende del derav, en mutasjon i tung kjede CDR1. I en annen foretrukket utfør-else har det isolerte humane antistoffet, eller antigenbindende del derav, en mutasjon i lett kjede CDR1.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen rekombinante ekspresjonsvektorer som bærer de antistoffkodende nuklein-syrene i oppfinnelsen, og vertsceller der slike vektorer har blitt innført er også omfattet av oppfinnelsen, hvilket også gjelder fremgangsmåter for å fremstille antistoffene i den foreliggende oppfinnelsen ved å dyrke vertscellene i oppfinnelsen.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller antigenbindende del derav, som nøy-traliserer aktiviteten til humant IL-12, og minst ett ekstra primat IL-12 valgt fra gruppen som består av bavian IL-12, silkeape IL-12, sjimpanse IL-12, cynomolgus IL-12 og rhesus IL-12, men som ikke nøytraliserer aktiviteten til mus IL-12.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en farmasøy-tisk blanding innbefattende antistoffet, eller en antigenbindende del derav, i den foreliggende oppfinnelsen og en farmasøytisk godkjent bærer.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en blanding innbefattende antistoffet eller en antigenbindende del derav og en ekstra agens, som for eksempel en terapeutisk agens.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å inhibere human IL-12 aktivitet som innbefatter å la humant IL-12 komme i kontakt med antistoffet i den foreliggende oppfinnelsen, f.eks. J695, slik at human IL-12

aktivitet blir inhibert.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å inhibere human IL-12 aktivitet i et menneske som lider av en forstyrrelse der IL-12 aktivitet er skadelig, som innbefatter administrering av antistoffet i den foreliggende oppfinnelsen, f.eks. J695, til mennesket slik at human IL-12 aktivitet i mennesket blir inhibert. Forstyrrelsen kan for eksempel være Crohns sykdom, multippel sklerose eller revmatoid artritt.

I et annet aspekt beskriver oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller en antigen bindende del derav, for å oppnå en forhåndsbestemt målaktivitet, som innbefatter: a) tilveiebringe et forelderantistoff en antigenbindende del derav; b) selektere en foretrukket selektiv mutageneseposisjon valgt fra gruppen som består av H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 og L94; c) mutere den selekterte foretrukne selektive mutagenese-posisjonen individuelt til minst to andre aminosyrerester for herved å lage et første panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav; d) evaluere aktiviteten til det første panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, for å bestemme om mutasjon av en enkel selektiv mutageneseposisjon produserer et antistoff, eller antigenbindende del derav, med den forhåndsbestemte målaktiviteten eller en delvis målaktivitet; e) kombinere på en trinnvis måte i forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, individuelle mutasjoner som er vist å ha en forbedret aktivitet, for å danne kombinasjonsantistoffer, eller antigenbindende deler derav; f) evaluere aktiviteten til kombinasjonsantistoffene, eller antigenbindende deler derav, for å bestemme om kombi-nas jonsantistof fene, eller antigenbindende deler derav, har den forhåndsbestemte målaktiviteten eller en delvis målaktivitet; g) hvis trinnene d) eller f) ikke resulterer i et antistoff, eller antigenbindende del derav, med den forhåndsbestemte målaktiviteten, eller resulterer i et antistoff med bare en delvis aktivitet, muteres ekstra aminosyrerester valgt fra gruppen som består av H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A og L96 til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et annet panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav; h) evaluere aktiviteten til det andre panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, for å bestemme om mutasjon av en enkel aminosyrerest valgt fra gruppen som består av H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A og L96 resulterer i et antistoff, eller antigenbindende del derav, som har den forhåndsbestemte målaktiviteten eller en delvis aktivitet; i) kombinere på en trinnvis måte i forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, individuelle mutasjoner i trinn g), som er vist å ha en forbedret aktivitet, for å danne kombinasjonsantistoffer, eller antigenbindende deler derav; j) evaluere aktiviteten til kombinasjonsantistoffene, eller antigenbindende deler derav, for å bestemme om kombi-nas jonsantistof fene, eller antigenbindende deler derav, har den forhåndsbestemte målaktiviteten eller en delvis målaktivitet; k) hvis trinnene h) eller j) ikke resulterer i et antistoff, eller antigenbindende del derav, med den forhåndsbestemte målaktiviteten, eller resulterer i et antistoff med bare en delvis aktivitet, muteres ekstra aminosyrerester valgt fra gruppen som består av H33B, H52B og L31A til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et tredje panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav; 1) evaluere aktiviteten til det tredje panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, for å bestemme om en mutasjon av en enkel aminosyrerest valgt fra gruppen som består av H33B, H52B og L31A resulterte i et antistoff, eller antigenbindende del derav, med den forhåndsbestemte målaktiviteten eller en delvis aktivitet;

m) kombinere på en trinnvis måte i forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, individuell mutasjon av trinn k), som er vist å ha en forbedret aktivitet, for å danne kombinasjonsantistoffer, eller antigenbindende deler derav;

n) evaluere aktiviteten til kombinasjonsantistoffene, eller antigenbindende deler derav, for å bestemme om kombi-nas jonsantistof fene, eller antigenbindende deler derav, har den forhåndsbestemte målaktiviteten for dermed å produsere et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forhåndsbestemt målaktivitet.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter: a) tilveiebringe et forelderantistoff eller antigenbindende del derav; b) selektere en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon og dermed identifisere en selektert foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon; c) mutere nevnte selekterte foretrukne selektive mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav; e) repetere trinnene b) til og med d) for minst én annen kontakt- eller hypermutasjonsposisjon; f) kombinere i forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, individuelle mutasjoner som er vist å ha forbedret aktivitet, for å danne kombinasjonsantistoffer, eller antigenbindende deler derav; og g) evaluere aktiviteten til kombinasjonsantistoffene, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav; inntil et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet.

I én utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter: a) tilveiebringe et rekombinant forelderantistoff eller antigenbindende del derav; som ble fremskaffet med seleksjon i et fagdisplaysystem, men hvis aktivitet ikke er ytterligere forbedret med mutagenese i nevnte fagdisplaysystem; b) selektere en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon og dermed identifisere en selektert kontakt- eller hypermutasjonsposisjon; c) mutere nevnte selekterte foretrukne selektive mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, og uttrykke nevnte panel i et ikke-fagdisplaysystem; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav; e) repetere trinnene b) til og med d) for minst én annen kontakt- eller hypermutasjonsposisjon; f) kombinere i forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, individuelle mutasjoner som er vist å ha forbedret aktivitet, for å danne kombinasjonsantistoffer, eller antigenbindende deler derav; og g) evaluere aktiviteten til kombinasjonsantistoffene, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav; inntil et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet.

I en foretrukket utførelse er kontaktposisjonene valgt fra gruppen som består av H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96. I en annen foretrukket utførelse er hypermutasjonsposisjonene valgt fra gruppen som består av H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 og L93. I en mer foretrukket utførelse er restene for selektiv mutagenese valgt fra de foretrukne selektive mutageneseposisjonene fra gruppen som består av H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 og L94. I en mer foretrukket utførelse er kontaktposisjonene valgt fra gruppen som består av L50 og L94.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter:

a) tilveiebringe et rekombinant forelderantistoff, eller antigenbindende del derav; b) selektere en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon og dermed identifisere en selektert kontakt- eller hypermutasjonsposisjon; c) mutere nevnte selekterte foretrukne selektive mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, og uttrykke nevnte panel i et egnet ekspresjons-system; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivitetsøkende aminosyrerest; e) evaluere panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet,

eller antigenbindende del derav, for minst én annen egenskap eller særtrekk, der egenskapen eller særtrekket er én som trenger å bli bevart i antistoffet;

inntil et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet og minst én bevart egenskap eller særtrekk i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet.

I en foretrukket utførelse er kontaktposisjonene valgt fra gruppen som består av H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96, og den andre egenskapen er valgt fra 1) bevaring av ikke-kryssreaktivitet med andre proteiner eller humane vev, 2) bevaring av epitopegjenkjennelse, dvs. gjenkjenne p40- epitope fortrinnsvis i sammenheng med p70 p40/p35-heterodimeren for å hindre bindingsinterferens fra fri, løselig p40 og/eller 3) lage et antistoff med en sekvens som ligner kimbaneimmunglobulinsekvens. I en annen foretrukket utfør-else er hypermutasjonsposisjonene valgt fra gruppen som består av H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 og L93, og den andre egenskapen er valgt fra 1) bevaring av ikke-kryssreaktivitet med andre proteiner eller humane vev, 2) bevaring av epitopegjenkjennelse, dvs. gjenkjenne p40-epitope fortrinnsvis i sammenheng med p70 p40/p35-heterodimeren for å hindre bindingsinterferens fra fri, løselig p40 og/eller 3) lage et antistoff med en sekvens som ligner kimbaneimmunglobulinsekvens. I en mer foretrukket utførelse er restene for selektiv mutagenese valgt fra de foretrukne selektive mutageneseposisjonene fra gruppen som består av H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 og L94, og den andre egenskapen er valgt fra 1) bevaring av ikke-kryssreaktivitet med andre proteiner eller humane vev, 2) bevaring av epitopegjenkjennelse, dvs. gjenkjenne p40-epitope fortrinnsvis i sammenheng med p70 p40/p35-heterodimeren for å hindre bindingsinterferens fra fri, løselig p40 og/eller 3) lage et antistoff med en sekvens som ligner kimbaneimmunglobulinsekvens. I en mer foretrukket utførelse er kontaktposisjonene valgt fra gruppen som består av L50 og L94, og den andre egenskapen er valgt fra 1) bevaring av ikke-kryssreaktivitet med andre proteiner eller humane vev, 2) bevaring av epitopegjenkjennelse, dvs. gjenkjenne p40-epi-tope fortrinnsvis i sammenheng med p70 p40/p35-heterodimeren for å hindre bindingsinterferens fra fri, løselig p40 og/eller 3) lage et antistoff med en sekvens som ligner kimbaneimmunglobulinsekvens.

I en annen utførelse av den foreliggende oppfinnelsen er det tilveiebragt en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter:

a) tilveiebringe et rekombinant forelderantistoff, eller antigenbindende del derav; som ble fremskaffet med seleksjon i et fagdisplaysystem, men hvis aktivitet ikke kan bli ytterligere forbedret med mutagenese i nevnte fagdisplaysystem; b) selektere en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon og dermed identifisere en selektert foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon; c) mutere nevnte selekterte foretrukne selektive mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, og uttrykke nevnte panel i et ikke-fagdisplaysystem; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivitetsøkende aminosyrerest; e) evaluere panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, for minst én annen egenskap eller særtrekk, der egenskapen eller særtrekket er én som trenger å bli bevart inntil et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet og minst én bevart egenskap eller særtrekk i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet; f) repetere trinnene a) til og med e) i minst én annen foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermu-tas j onsposis j on; g) kombinere i forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, minst to individuelle aktivitetsøkende aminosyrerester vist å ha forbedret aktivitet og minst én bevart egenskap eller særtrekk, for å danne kombinasjonsantistoffer, eller antigenbindende deler derav; og h) evaluere aktiviteten til kombinasjonsantistoffene, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav; inntil et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet og minst én bevart egenskap eller særtrekk i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet.

I en foretrukket utførelse er kontaktposisjonene valgt fra gruppen som består av H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96, og den andre egenskapen er valgt fra 1) bevaring av ikke-kryssreaktivitet med andre proteiner eller humane vev, 2) bevaring av epitopegjenkjennelse, dvs. gjenkjenne p40-epitope fortrinnsvis i sammenheng med p70 p40/p35-heterodimeren for å hindre bindingsinterferens fra fri, løselig p40 og/eller 3) lage et antistoff med en sekvens som ligner kimbaneimmunglobulinsekvens. I en annen foretrukket utfør-else er hypermutasjonsposisjonene valgt fra gruppen som består av H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 og L93, og den andre egenskapen er valgt fra 1) bevaring av ikke-kryssreaktivitet med andre proteiner eller humane vev, 2) bevaring av epitopegjenkjennelse, dvs. gjenkjenne p40-epitope fortrinnsvis i sammenheng med p70 p40/p35-heterodimeren for å hindre bindingsinterferens fra fri, løselig p40 og/eller 3) lage et antistoff med en sekvens som ligner kimbaneimmunglobulinsekvens. I en mer foretrukket utførelse er restene for selektiv mutagenese valgt fra de foretrukne selektive mutageneseposisjonene fra gruppen som består av H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 og L94, og den andre egenskapen er valgt fra 1) bevaring av ikke-kryssreaktivitet med andre proteiner eller humane vev, 2) bevaring av epitopegjenkjennelse, dvs. gjenkjenne p40-epitope fortrinnsvis i sammenheng med p70 p40/p35-heterodimeren for å hindre bindingsinterferens fra fri, løselig p40 og/eller 3) lage et antistoff med en sekvens som ligner kimbaneimmunglobulinsekvens. I en mer foretrukket utførelse er kontaktposisjonene valgt fra gruppen som består av L50 og L94, og den andre egenskapen er valgt fra 1) bevaring av ikke-kryssreaktivitet med andre proteiner eller humane vev, 2) bevaring av epitopegjenkjennelse, dvs. gjenkjenne p40-epi-tope fortrinnsvis i sammenheng med p70 p40/p35-heterodimeren for å hindre bindingsinterferens fra fri, løselig p40 og/eller 3) lage et antistoff med en sekvens som ligner kimbaneimmunglobulinsekvens.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter: a) tilveiebringe et rekombinant forelderantistoff, eller antigenbindende del derav; som ble fremskaffet med seleksjon i et fagdisplaysystem, men hvis aktivitet ikke kan bli ytterligere forbedret med mutagenese i nevnte fagdisplaysystem; b) selektere en kontakt- eller hypermutasjonsposisjon innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon og dermed identifisere en selektert kontakt- eller hypermu-tas jonsposisjon; c) mutere nevnte selekterte kontakt- eller hypermuta-sjonsposis jon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, og uttrykke nevnte panel i et ikke-fagdisplaysystem; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivitetsøkende aminosyrerest; e) evaluere panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet,

eller antigenbindende del derav, for minst én annen egenskap eller særtrekk, der egenskapen eller særtrekket er én som trenger å bli bevart;

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter: a) tilveiebringe et rekombinant forelderantistoff, eller antigenbindende del derav; som ble fremskaffet med seleksjon i et fagdisplaysystem, men hvis aktivitet ikke kan bli ytterligere forbedret med mutagenese i nevnte fagdisplaysystem; b) selektere en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon og dermed identifisere en selektert foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon; c) mutere nevnte selekterte foretrukne selektive mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, og uttrykke nevnte panel i et ikke-fagdisplaysystem; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivitetsøkende aminosyrerest; e) evaluere panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, for minst én annen egenskap eller særtrekk, der egenskapen eller særtrekket er én som trenger å bli bevart; inntil et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet og minst én bevart egenskap eller særtrekk i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet. f) repetere trinnene a) til og med e) for minst én annen foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermuta-sjonsposis jon; g) kombinere i forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, minst to individuelle aktivitetsøkende aminosyrerester vist å ha forbedret aktivitet og minst ett annet bevart særtrekk, for å danne kombinasjonsantistoffer, eller antigenbindende deler derav; og h) evaluere aktiviteten til kombinasjonsantistoffene, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav;

a) tilveiebringe et forelderantistoff eller antigenbindende del derav; b) selektere en aminosyrerest innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon som er forskjellig fra H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96; c) mutere nevnte selekterte posisjon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivitetsøkende aminosyrerest; e) evaluere panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet

eller antigenbindende del derav, for forandringer i minst én annen egenskap eller særtrekk; inntil et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet.

Fortrinnsvis er det andre særtrekket eller egenskapen valgt fra 1) bevaring av ikke-kryssreaktivitet med andre proteiner eller humane vev, 2) bevaring av epitopegjenkjennelse, dvs. gjenkjenne p40-epitope fortrinnsvis i sammenheng med p70 p40/p35-heterodimeren for å hindre bindingsinterferens fra fri, løselig p40 og/eller 3) lage et antistoff med en sekvens som ligner kimbaneimmunglobulinsekvens.

a) tilveiebringe et forelderantistoff eller antigenbindende del derav; b) selektere en aminosyrerest innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon som er forskjellig fra H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96; c) mutere nevnte selekterte posisjon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivitetsøkende aminosyrerest; e) repetere trinnene b) til og med d) for minst én annen CDR-posisjon som verken er posisjonen selektert under b) eller en posisjon i H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96; f) kombinere i forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, minst to individuelle aktivitetsøkende aminosyrerester vist å ha forbedret aktivitet, for å danne kombi-nas jonsantistof fer, eller antigenbindende deler derav; og g) evaluere aktiviteten til kombinasjonsantistoffene, eller antigenbindende deler derav, med to aktivitetsøkende

aminosyrerester i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, inntil et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter: a) tilveiebringe et rekombinant forelderantistoff, eller antigenbindende del derav; som ble fremskaffet med seleksjon i et fagdisplaysystem, men hvis aktivitet ikke kan bli ytterligere forbedret med mutagenese i nevnte fagdisplaysystem; b) selektere en aminosyrerest innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon som er forskjellig fra H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og; c) mutere nevnte selekterte kontakt- eller hypermuta-sjonsposis jon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, og uttrykke nevnte panel i et ikke-fagdisplaysystem; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivitetsøkende aminosyrerest; e) evaluere panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet,

eller antigenbindende del derav, for forandringer i minst én annen egenskap eller særtrekk, inntil et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter: a) tilveiebringe et forelderantistoff, eller antigenbindende del derav, som ble fremskaffet med seleksjon i et fagdisplaysystem, men hvis aktivitet ikke kan bli ytterligere forbedret med mutagenese i nevnte fagdisplaysystem; b) selektere en aminosyrerest innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon som er forskjellig fra H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96; c) mutere nevnte selekterte posisjon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, og uttrykke i et ikke-fagdisplaysystem; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivitetsøkende aminosyrerest; e) repetere trinnene b) til og med d) for minst én annen posisjon innenfor CDR som verken er posisjonen selektert under b) eller en posisjon på H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93 og L94; f) kombinere i forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, minst to individuelle aktivitetsøkende aminosyrerester vist å ha forbedret aktivitet, for å danne kombi-nas jonsantistof fer, eller antigenbindende deler derav; og g) evaluere aktiviteten og annen egenskap eller særtrekk til kombinasjonsantistoffene, eller antigenbindende deler

derav, med to aktivitetsøkende aminosyrerester i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav; inntil et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter: a) tilveiebringe et forelderantistoff eller antigenbindende del derav; b) selektere en aminosyrerest innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon som er forskjellig fra H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96; c) mutere nevnte selekterte posisjon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivitetsøkende aminosyrerest; e) evaluere panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigendel derav, for forandringer i minst én annen egenskap eller særtrekk; f) repetere trinnene b) til og med e) for minst én annen CDR-posisjon som verken er posisjonen selektert under b) eller en posisjon i H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96; g) kombinere i forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, minst to individuelle aktivitetsøkende aminosyrerester vist å ha forbedret aktivitet og som ikke affiserer minst én annen egenskap eller særtrekk for å danne kombinasjonsantistoffer, eller antigenbindende deler derav; og h) evaluere aktiviteten og retensjonen av minst ett annet særtrekk eller egenskap til kombinasjonsantistoffene, eller

antigenbindende deler derav, med to aktivitetsøkende aminosyrerester i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav; inntil et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet og minst én

bevart egenskap eller særtrekk i forhold til forelderanti-stof f et, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bedre affiniteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter:

a) tilveiebringe et forelderantistoff, eller antigenbindende del derav, som ble fremskaffet med seleksjon i et fagdisplaysystem, men hvis aktivitet ikke kan bli ytterligere forbedret med mutagenese i nevnte fagdisplaysystem; b) selektere en aminosyrerest innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon som er forskjellig fra H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96; c) mutere nevnte selekterte posisjon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, og uttrykke i et ikke-fagdisplaysystem; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivitetsøkende aminosyrerest; e) evaluere panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet

eller antigenbindende del derav, for forandringer i minst ett annet særtrekk eller egenskap; inntil et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter: a) tilveiebringe et forelderantistoff eller antigenbindende del derav; b) selektere en aminosyrerest innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon i en posisjon forskjel lig fra H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96; c) mutere nevnte selekterte posisjon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivitetsøkende aminosyrerest; e) evaluere panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigendel derav, for forandringer i minst én annen egenskap eller særtrekk; f) repetere trinnene b) til og med e) for minst én annen CDR-posisjon som verken er posisjonen selektert under b) eller en posisjon i H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96; g) kombinere i forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, minst to individuelle aktivitetsøkende aminosyrerester vist å ha forbedret aktivitet men som ikke affiserer minst én annen egenskap eller særtrekk for å danne kombinasjonsantistoffer, eller antigenbindende deler derav, med minst én bevart egenskap eller særtrekk; og h) evaluere aktiviteten og retensjonen av minst én egenskap eller særtrekk til kombinasjonsantistoffene, eller

antigenbindende deler derav, med to aktivitetsøkende aminosyrerester i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav, inntil et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet og minst én

bevart egenskap eller særtrekk i forhold til forelderanti-stof fet, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, uten å affisere andre karakteristika, som innbefatter: a) tilveiebringe et forelderantistoff eller antigenbindende del derav; b) selektere en aminosyrerest innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon som er forskjellig fra H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96; c) mutere nevnte selekterte posisjon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivitetsøkende aminosyrerest; e) evaluere panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet

eller antigenbindende del derav, for forandringer i minst én annen egenskap eller særtrekk inntil et antistoff, eller

antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet og annet bevart særtrekk eller egenskap i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter: a) tilveiebringe et forelderantistoff, eller antigenbindende del derav, som ble fremskaffet med seleksjon i et fagdisplaysystem, men hvis aktivitet ikke kan bli ytterligere forbedret med mutagenese i nevnte fagdisplaysystem; b) selektere en aminosyrerest innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon som er forskjellig fra H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96; c) mutere nevnte selekterte posisjon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, og uttrykke i et ikke-fagdisplaysystem; d) evaluere aktiviteten og retensjonen av minst ett annet særtrekk eller egenskap til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivitetsøkende aminosyrerest; e) repetere trinnene b) til og med d) for minst én annen CDR-posisjon som verken er posisjonen selektert under b) eller forskjellig fra H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96; f) kombinere i forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, minst to individuelle aktivitetsøkende aminosyrerester vist å ha forbedret aktivitet og som ikke affiserer minst ett annet særtrekk eller egenskap for å danne kombinasjonsantistoffer, eller antigenbindende deler derav; og g) evaluere aktiviteten og retensjonen av minst ett annet særtrekk eller egenskap til kombinasjonsantistoffene, eller

antigenbindende deler derav, med to aktivitetsøkende aminosyrerester i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, inntil et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet og minst ett annet bevart særtrekk eller egenskap i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet.

Kort beskrivelse av figurene

Figurene 1A-1B viser oppstilling av aminosyresekvenser til tung kjede variabel region til en serie med humane antistoffer som binder humant IL-12 sammenlignet med kimbanesekvensene COS-3/JH3 og Dpll8 Lv 1042. Kabat-nummerering er anvendt for å identifisere aminosyreposisjoner. For Joe 9-villtypen er hele sekvensen vist. For de andre antistoffene er bare de aminosyreposisjonene vist som er forskjellig fra Joe 9-villtype. Figurene 1C-1D viser oppstilling av aminosyresekvenser til lett kjede variabel region til en serie med humane anti stoffer som binder humant IL-12. Kabat-nummerering er anvendt for å identifisere aminosyreposisjoner. For Joe 9-villtypen er hele sekvensen vist. For de andre antistoffene er bare de aminosyreposisjonene vist som er forskjellig fra Joe 9-villtype. Figurene 2A-2E viser CDR-posisjonene i den tunge kjeden til Y61-antistoffet som ble mutert med målstyrt mutagenese og de respektive aminosyresubstitusjonene i hver posisjon. Grafene til høyre for tallene viser av-hastighetene for de substituerte antistoffene (sorte søyler) sammenlignet med ikke-mutert Y61 (åpen søyle). Figurene 2F-2H viser CDR-posisjonene i den lette kjeden til Y61-antistoffet som ble mutert med målstyrt mutagenese og de respektive aminosyresubstitusjonene i hver posisjon. Grafene til høyre for tallene viser av-hastighetene for de substituerte antistoffene (sorte søyler) sammenlignet med ikke-mutert Y61 (åpen søyle). Figur 3 viser in vivo- effektiviteten til det humane anti-IL-12 J695-antistoffet på plasmaneopterinnivåer i cynomolgusaper. Figur 4 viser en graf med gjennomsnittlig artritisk resultat versus dager etter immunisering av mus med kollagen, som demonstrerer at behandling med C17.15 signifikant reduserer artrittrelaterte symptomer sammenlignet med behandling med rotte IgG.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

For at den foreliggende oppfinnelsen skal bli enklere å forstå, defineres først visse begreper.

Begrepet "aktivitetsøkende aminosyrerest" inkluderer en aminosyrerest som forbedrer aktiviteten til antistoffet. Det skal bli forstått at den aktivitetsøkende aminosyre resten kan erstatte en aminosyrerest i en kontakt-, hypermutasjons- eller foretrukket selektiv mutageneseposisjon og videre at mer enn én aktivitetsøkende aminosyrerest kan foreligge i én eller flere CDR'er. En aktivitetsøkende aminosyrerest inkluderer en aminosyrerest som forbedrer bindingsspesifisiteten/affiniteten til et antistoff, for eksempel anti-humant IL-12 antistoff som binder til humant IL-12. Den aktivitetsøkende aminosyreresten er også ment å inkludere en aminosyrerest som forbedrer nøytraliserings-evnen til et antistoff, for eksempel det humane IL-12 antistoffet som inhiberer humant IL-12.

Begrepet "antistoff" inkluderer et immunglobulinmolekyl som består av fire polypeptidkjeder, to tunge (H) kjeder og to lette (L) kjeder som er koblet sammen med disulfidbinding-er. Hver tunge kjede består av en tung kjede variabel region (forkortet heri som HCVR eller VH) og en tung kjede konstant region. Den konstante regionen på den tunge kjeden består av tre domener, CH1, CH2 og CH3. Hver lette kjede består av en lett kjede variabel region (forkortet heri som LCVR eller VL) og en lett kjede konstant region. Den konstante regionen på den lette kjeden består av ett domene, CL. VH- og VL-regionene kan videre bli delt inn i hypervariable regioner, kalt komplementbestemmende regioner (CDR'er), satt inn mellom regioner som er mer konserverte, kalt strukturelle regioner (FR). Hver VH og VL er sammensatt av tre CDR'er og fire FR'er, som er arrangert fra ami-noterminal til karboksyterminal i følgende rekkefølge: FRI, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Begrepet "antigenbindende del" av et antistoff (eller "antistoffdel") innbefatter fragmenter av et antistoff som opprettholder evnen til å binde spesifikt til et antigen (f.eks. hlL-12). Det har blitt vist at den antigenbindende funksjonen til et antistoff kan bli utført med fragmenter av et fullengde antistoff. Eksempler på bindende fragmenter som er omfattet i begrepet "antigenbindende del" av et antistoff inkluderer (i) et Fab-fragment, et monovalent fragment som innbefatter VL-, VH-, CL- og CHl-domenene;

(ii) et F (ab')2-fragment, et bivalent fragment innbefattende to Fab-fragmenter koblet sammen med en disulfidbro i hengselregionen; (iii) et Fd-fragment som innbefatter VH-og CHl-domenene; (iv) et Fv-fragment som innbefatter VL- og VH-domenene til en enkel arm av et antistoff, (v) et dAb-fragment (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), som består av et VH-domene; og (vi) en isolert komplementbestemmende region (CDR). Videre, selv om de to domenene i Fv-fragmentet, VL og VH, er kodet av separate gener, kan de bli koblet, ved å anvende rekombinante fremgangsmåter, med en syntetisk linker som muliggjør at de blir laget som en enkel proteinkjede der VL- og VH-regionene kombineres for å danne monovalente molekyler (kjent som enkeltkjedet Fv (scFv): se f.eks. Bird et al., (1988) Science 242:423-426; og Huston et al., (1988) Proe. Nati. Acad. Sei. USA

85:5879-5883). Slike enkeltkjedede antistoffer er også ment å bli omfattet i begrepet "antigenbindende del" av et antistoff. Andre former for enkeltkjedede antistoffer, slik som diastoffer, er også omfattet. Diastoffer er bivalente, bispesifikke antistoffer der VH- og VL-domener er uttrykt på en enkel polypeptidkjede, men som anvender en linker som er for kort til å tillate pardannelse mellom de to domenene på den samme kjeden, og presser dermed domenene til å danne par med komplementære domener på en annen kjede og danne to antigenbindende seter (se f.eks. Holliger, P. et al.,

(1993) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J. et al., (1994) Structure 2:1121-1123). Enda videre kan et antistoff eller antigenbindende del derav være del av et større immunadhesjonsmolekyl, dannet ved kovalent eller ikke-kovalent assosiering av antistoffet eller antigendelen med ett eller flere andre proteiner eller peptider. Eksempler på slike immunadhesjonsmolekyler inkluderer anvendelse av streptavidinkjerneregionen for å lage et tetra-mert scFv-molekyl (Kipriyanov, S. M. et al., (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) og anvendelse av en cysteinrest, et markørpeptid og en C-terminal polyhistidin-markør for å lage bivalente og biotinylerte scFv-molekyler

(Kipriyanov, S. M. et al., (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Antistoffdeler, som Fab- og F (ab')2-fragmenter, kan bli fremstilt fra hele antistoffer ved å anvende konven-sjonelle fremgangsmåter, slik som kutting med henholdsvis papain eller pepsin av hele antistoffer. Videre kan antistoffer, antistoffdeler og immunadhesjonsmolekyler bli fremskaffet ved å anvende standard rekombinante DNA-teknikker, som beskrevet heri. Foretrukne antigenbindende deler er hele domener eller par av hele domener.

Begrepet "tilbakemutasjon" henviser til en prosess der noen eller alle de somatisk muterte aminosyrene i et humant antistoff er byttet ut med de korresponderende kimbanerest-ene fra en homolog kimbaneantistoffsekvens. Sekvensene til tung og lett kjede til det humane antistoffet i den foreliggende oppfinnelsen sammenlignes separat med kimbanesekvensene i VBASE-databasen for å identifisere sekvensene med størst homologi. Forskjeller i det humane antistoffet i den foreliggende oppfinnelsen er ført tilbake til kimbanesekvensen ved å mutere definerte nukleotidposisjoner som koder for en slik ulik aminosyre. Rollen hver aminosyre har som dermed er identifisert som kandidat for tilbakemutasjon bør bli undersøkt for en direkte eller indirekte rolle i antigenbinding, og enhver aminosyre som etter mutasjon affiserer enhver fordelaktig egenskap hos det humane antistoffet skal ikke bli inkludert i det endelige humane antistoffet; som et eksempel vil ikke aktivitetsøkende aminosyrer identifisert med den selektive mutagenesefremgangsmåten bli utsatt for tilbakemutasjon. For å begrense antallet aminosyrer som er utsatt for tilbakemutasjon, kan de aminosyreposisjonene som er funnet å være forskjellige fra den mest lignende kimbanesekvensen, men identisk med den korresponderende aminosyren i en annen kimbanesekvens, forbli uforandret, gitt at den andre kimbanesekvensen er identisk og kolineær med sekvensen til det humane antistoffet i den foreliggende oppfinnelsen i minst 10, fortrinnsvis 12

aminosyrer, på begge sider av den aktuelle aminosyren. Tilbakemutasjon kan forekomme på ethvert stadium av antistoff-

optimalisering; fortrinnsvis forekommer tilbakemutasjon direkte før eller etter den selektive mutagenesefremgangsmåten. Mer foretrukket forekommer tilbakemutasjon direkte før den selektive mutagenesefremgangsmåten.

Uttrykket "humant interleukin 12" (forkortet heri som hlL-12 eller IL-12), slik det er anvendt heri, innbefatter et humant cytokin som primært sekreres av makrofager og dendrittiske celler. Begrepet innbefatter et heterodimert protein som består av en 35 kD subenhet (p35) og en 40 kD subenhet (p4 0) som begge er bundet sammen med en disulfidbro. Det heterodimere proteinet henvises til som en "p70-subenhet." Strukturen til humant IL-12 er videre beskrevet i for eksempel Kobayashi et al., (1989) J. Exp. Med. 170:827-845; Seder et al., (1993) Proe. Nati. Acad. Sei. 90:10188-10192; Ling et al., (1995) J. Exp. Med. 154:116-127; Podlaski et al., (1992) Arch. Biochem. Biophys. 294:230-237. Begrepet humant IL-12 er ment å innbefatte rekombinant humant IL-12 (rh IL-12), som kan bli fremstilt med standard rekombinante ekspresjonsfremgangsmåter. Begrepet "Kabat-nummerering," "Kabat-definisjoner" og "Kabat-merking" anvendes om hverandre heri. Disse begrepene, som er kjent i faget, henviser til et system for å nummerere aminosyrerester som er mer variable (dvs. hypervariable) enn andre aminosyrerester i de variable regionene til tung og lett antistoffkjede, eller en antigenbindende del derav (Kabat et al., (1971) Ann. NY Acad. Sei. 190:382-391, og Kabat, E. A. et al.,

(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. utgave, U.S. Department of Health and Human Services, NIH publikasjon nr. 91-3242). For den variable regionen på den tunge kjeden strekker den hypervariable regionen seg fra aminosyreposisjon 31 til 35 for CDR1, aminosyreposisjon 50 til 65 for CDR2 og aminosyreposisjon 95 til 102 for CDR3. For den variable regionen på den lette kjeden strekker den hypervariable regionen seg fra aminosyreposisjon 24 til 34 for CDR1, aminosyreposisjon 50 til 56 for CDR2 og aminosyreposisjon 89 til 97 for CDR3. Kabat-nummereringen er anvendt heri for å indikere posisjonene til aminosyremodifiseringer laget i antistoffer i den foreliggende oppfinnelsen. For eksempel kan Y61 anti-IL-12 antistoffet være mutert fra serin (S) til glutamin-syre (E) i posisjon 31 i tung kjede CDR1 (H31S -» E) , eller glysin (G) kan være mutert til tyrosin (Y) i posisjon 94 i lett kjede CDR3 (L94G Y) .

Begrepet "humant antistoff" innbefatter antistoffer som har variable og konstante regioner som korresponderer til humane kimbaneimmunglobulinsekvenser, som beskrevet av Kabat et al. (se Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. utgave, U.S. Department of Health and Human Services, NIH publikasjon nr. 91-3242). De humane antistoffene i den foreliggende oppfinnelsen kan innbefatte aminosyrerester som ikke er kodet av humane kimbaneimmunglobulinsekvenser (f.eks. mutasjoner introdusert med randomisert eller setespesifikk mutagenese in vitro eller med somatisk mutasjon in vivo), for eksempel i CDR'ene og spesielt CDR3. Mutasjonene introduseres fortrinnsvis ved å anvende den "selektive mutagenesefremgangsmåten" beskrevet heri. Det humane antistoffet kan ha minst én posisjon byttet ut med en aminosyrerest, f.eks. en akti-vitetsøkende aminosyrerest som ikke er kodet av den humane kimbaneimmunglobulinsekvensen. Det humane antistoffet kan ha opp til tjue posisjoner byttet ut med aminosyrerester som ikke er del av den humane kimbaneimmunglobulinsekvensen. I andre utførelser er opp til ti, opp til fem, opp til tre eller opp til to posisjoner byttet ut. I en foretrukket utførelse er disse utskiftningene i CDR-regionene, som beskrevet i detalj nedenfor. Imidlertid er ikke begrepet "humant antistoff," slik det er anvendt heri, ment å innbefatte antistoffer der CDR-sekvenser avledet fra kimbanecel-ler i annen pattedyrart, som en mus, har blitt overført på humane struktursekvenser.

Uttrykket "rekombinant humant antistoff" innbefatter humane antistoffer som er fremstilt, uttrykt, laget eller isolert med rekombinante fremgangsmåter, slik som antistoffer uttrykt ved å anvende en rekombinant ekspresjonsvektor transfektert inn i en vertscelle (beskrevet videre i Del II, nedenfor), antistoffer isolert fra et rekombinant, kombinatorisk humant antistoffbibliotek (beskrevet videre i Del III, nedenfor), antistoffer isolert fra et dyr (f.eks. en mus) som er transgent for humane immunglobulingener (se f.eks. Taylor, L. D. et al., (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) eller antistoffer fremstilt, uttrykt, laget eller isolert med enhver annen fremgangsmåte som involverer spleising av humane immunglobulingensekvenser til andre DNA-sekvenser. Slike rekombinante humane antistoffer har variable og konstante regioner avledet fra humane kimbaneimmunglobulinsekvenser (se Kabat, E. A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. utgave, U.S. Department of Health and Human Services, NIH publikasjon nr. 91-3242). I bestemte utførelser utsettes imidlertid slike rekombinante humane antistoffer for mutagenese in vitro (eller, når et dyr som er transgent for humane Ig-sekvenser blir anvendt, somatisk mutagenese in vivo) og dermed er aminosyresekvensene til VH- og VL-regionene til de rekombinante antistoffene sekvenser som, selv om de er avledet fra og relatert til humane VH- og VL-kimbanesekvenser, ikke kan forekomme naturlig i det humane antistof fkimbanerepertoaret in vivo. I bestemte utførelser er imidlertid slike rekombinante antistoffer resultatet av selektiv mutagenesefremgangsmåte, eller tilbakemutasjon eller begge deler.

Et "isolert antistoff" innbefatter et antistoff som er vesentlig fri for andre antistoffer som har ulike antigene spesifisiteter (f.eks. et isolert antistoff som binder hlL-12 spesifikt er vesentlig fri for antistoffer som binder spesifikt andre antigener enn hlL-12). Et isolert antistoff som binder hlL-12 spesifikt kan binde IL-12 molekyler fra andre arter (diskutert i mer detalj nedenfor). I tillegg kan et isolert antistoff være vesentlig fri for annet cellulært materiale og/eller kjemikalier.

Et "nøytraliserende antistoff" (eller et "antistoff som nøytraliserte hlL-12 aktivitet") innbefatter et antistoff hvis binding til hlL-12 resulterer i inhibisjon av den biologiske aktiviteten til hlL-12. Denne inhibisjonen av den biologiske aktiviteten til hlL-12 kan bli vurdert ved å måle én eller flere indikatorer på hlL-12 biologisk aktivitet, slik som inhibisjon av human fytohemagglutinin-blast-proliferasjon i en fytohemagglutinin-blastproliferasjonstest (PHA) eller inhibisjon av reseptorbinding i en human IL-12 reseptorbindingstest (se Eksempel 3 - Interferon-gamma-induksjonstest). Disse indikatorene på hlL-12 biologisk aktivitet kan bli vurdert med én eller flere standard in vitro- eller in vivo-tester kjent i faget (se Eksempel 3) .

Begrepet "aktivitet" innbefatter aktiviteter slik som bind-ingsspesifisiteten/affiniteten til et antistoff for et antigen, for eksempel et anti-hIL-12 antistoff som binder til et IL-12 antigen, og/eller den nøytraliserende evnen et antistoff har, for eksempel et anti-hIL-12 antistoff der binding til hlL-12 inhiberer den biologiske aktiviteten til hlL-12, f.eks. inhibisjon av PHA-blastproliferasjon eller inhibisjon av reseptorbinding i en human IL-12 reseptorbindingstest (se Eksempel 3).

Uttrykket "overflateplasmonresonans" omfatter et optisk fenomen som muliggjør analysen av "real-time" biospesifikke interaksjoner ved deteksjon av forandringer i proteinkonsentrasjoner i en biosensormatriks, for eksempel ved å anvende BIAcore-systemet (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sverige og Piscataway, NJ). For ytterligere beskrivelser, se Eksempel 5 og Jonsson, U. et al., (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U. et al., (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B. et al., (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; og Johnnson, B. et al., (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

Begrepet "Kav," slik det er anvendt heri, er ment å henvise til av-hastighetskonstanten for dissosiering av et antistoff fra antistoff/antigen-komplekset.

Begrepet "Kd," slik det er anvendt heri, er ment å henvise til dissosieringskonstanten av en spesiell antistoff /antigen- in teraksj on .

Uttrykket "nukleinsyremolekyl" innbefatter DNA-molekyler og RNA-molekyler. Et nukleinsyremolekyl kan være enkeltkjedet eller dobbeltkjedet, men er fortrinnsvis dobbeltkjedet DNA.

Uttrykket "isolert nukleinsyremolekyl," slik det er anvendt heri med henvisning til nukleinsyrer som koder for antistoffer eller antistoffdeler (f.eks. VH, VL, CDR3) som binder hlL-12 innbefattende "isolerte antistoffer," inkluderer et nukleinsyremolekyl der nukleotidsekvensene som koder for antistoffet eller antistoffdelen er fri for andre nukleotidsekvenser som koder for antistoffer eller antistoffdeler som binder andre antigener enn hlL-12, der andre sekvenser naturlig kan flankere nukleinsyren i humant genomisk DNA. Derfor inneholder for eksempel en isolert nukleinsyre i den foreliggende oppfinnelsen, som koder for en VH-region til et anti-IL-12 antistoff, ingen andre sekvenser som koder for andre VH-regioner som binder andre antigener enn IL-12. Uttrykket "isolert nukleinsyremolekyl" er også ment å inkludere sekvenser som koder for bivalente, bispesifikke antistoffer, som diastoffer, der VH- og VL-regioner ikke inneholder andre sekvenser enn sekvensene til diastoffet.

Begrepet "vektor" innbefatter et nukleinsyremolekyl som er i stand til å transportere en annen nukleinsyre som den har blitt koblet til. Én vektortype er et "plasmid" som henviser til en sirkulær dobbeltkjedet DNA-løkke som ekstra DNA-segmenter kan bli ligert inn i. En annen type vektor er en viral vektor, der ekstra DNA-segmenter kan bli ligert inn i det virale genomet. Bestemte vektorer kan replikere autonomt i en vertscelle som de er ført inn i (f.eks. bak-terielle vektorer med et bakterielt replikasjonsstartsted og episomale pattedyrvektorer). Andre vektorer (f.eks. ikke-episomale pattedyrvektorer) kan bli integrert i genomet til en vertscelle ved overføring inn i vertscellen og replikeres dermed sammen med vertsgenomet. Videre er bestemte vektorer i stand til å styre ekspresjonen av gener som de er funksjonelt koblet til. Slike vektorer henvises til heri som "rekombinante ekspresjonsvektorer" (eller ganske enkelt, "ekspresjonsvektorer"). Generelt er ekspresjonsvektorer for anvendelse i rekombinante DNA-teknikker ofte i form av plasmider. I den foreliggende spesifiseringen kan "plasmid" og "vektor" bli anvendt om hverandre etter som plasmidet er den mest anvendte vektorformen. Imidlertid er oppfinnelsen ment å innbefatte andre former for ekspresjonsvektorer, slik som virale vektorer (f.eks. replika-sjonsdefekte retrovirus, adenovirus og adenoassosierte virus), som har ekvivalente funksjoner.

Uttrykket "rekombinant vertscelle" (eller ganske enkelt "vertscelle") innbefatter en celle der en rekombinant ekspresjonsvektor har blitt introdusert. Det skal bli forstått at slike begreper ikke er ment å bare henvise til den bestemte cellen, men til avkommet av en slik celle. Fordi visse modifiseringer kan forekomme i følgende generasjoner enten pga. mutasjon eller miljøpåvirkning, kan slikt avkom faktisk ikke være identisk med foreldercellen, men er fortsatt innbefattet innen omfanget av begrepet "vertscelle," slik det er anvendt heri.

Begrepet "modifisere," slik det er anvendt heri, er ment å henvise til å forandre én eller flere aminosyrer i antistoffene eller antigenbindende deler derav. Forandringen kan bli gjort ved å tilsette, substituere eller fjerne en aminosyre i én eller flere posisjoner. Forandringen kan bli laget ved å anvende kjente teknikker, slik som PCR-mutagenese.

Uttrykket "kontaktposisjon" innbefatter en aminosyreposisjon i CDR1, CDR2 eller CDR3 i den variable regionen på den tunge antistoffkjeden eller den variable regionen på den lette antistoffkjeden som er okkupert av en aminosyre som kommer i kontakt med antigen i én av de tjueseks kjente antistoff/antigen-strukturene. Hvis en CDR-aminosyre i noen av de 26 kjente strukturene til antistoff/antigen-kompleks-er kommer i kontakt med antigenet, kan denne aminosyren bli betraktet som at den okkuperer en kontaktposisjon. Kontakt-posis joner har en høyere sannsynlighet for å være okkupert av en aminosyre med kontaktantigen enn ikke-kontaktposisjoner. Fortrinnsvis er en kontaktposisjon en CDR-posisjon som inneholder en aminosyre som kommer i kontakt med antigen i mer enn 3 av de 26 strukturene (> 11,5 %) . Mest foretrukket er en kontaktposisjon en CDR-posisjon som inneholder en aminosyre som kommer i kontakt med antigen i mer enn 8 av de 25 strukturene (> 32 %).

Begrepet "hypermutasjonsposisjon" innbefatter en aminosyrerest som okkuperer posisjon i CDR1-, CDR2- eller CDR3-regionen til den variable regionen på den tunge antistoffkjeden eller den variable regionen på den lette antistoffkjeden som er vurdert til å ha en høy frekvens eller sannsynlighet for somatisk hypermutasjon i løpet av in vivo-affinitetsmodning av antistoffet. "Høy frekvens eller sannsynlighet for somatisk hypermutasjon" omfatter frekvenser eller sannsynligheter på en 5 til ca. 40 % mulighet for at resten vil gjennomgå somatisk hypermutasjon i løpet av in vivo- affinitetsmodning av antistoffet. Det skal bli forstått at alle verdier innenfor dette nevnte området også er ment å være en del av denne oppfinnelsen, f.eks. 5 til ca. 30 %, f.eks. 5 til ca. 15 %, f.eks. 15 til ca. 30 %.

Begrepet "foretrukket selektiv mutageneseposisjon" innbefatter en aminosyrerest som okkuperer en posisjon i CDR1-, CDR2- eller CDR3-regionen til den variable regionen på den tunge kjeden eller den variable regionen på den lette kjeden som kan bli betraktet å være både en kontakt- og en hypermutasjonsposisjon.

Uttrykket "selektiv mutagenesefremgangsmåte" innbefatter en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff ved å selektere og individuelt mutere CDR-aminosyrer i minst én foretrukket selektiv mutagenese-, hypermutasjons- og/eller kontaktposisjon. Et "selektivt mutert" humant antistoff er et antistoff som inneholder en mutasjon i en posisjon selektert ved å anvende en selektiv mutagenesefremgangsmåte.

I en annen utførelse er den selektive mutagenesefremgangsmåten ment å tilveiebringe en fremgangsmåte for å fortrinnsvis mutere selekterte individuelle aminosyrerester i CDR1, CDR2 eller CDR3 i den variable regionen på den tunge kjeden (heretter henholdsvis Hl, H2 og H3) eller CDR1, CDR2 eller CDR3 i den variable regionen på den lette kjeden (heretter henvist til som henholdsvis LI, L2 og L3) til et antistoff. Aminosyrerester kan bli valgt fra foretrukne selektive mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjoner. Individuelle aminosyrer blir selektert basert på deres posisjon i den variable regionen på lett eller tung kjede. Det skal bli forstått at en hypermutasjonsposisjon også kan være en kontaktposisjon. I en utførelse er den selektive mutagenesefremgangsmåten en "målstyring." Uttrykket "målstyring" er ment å innbefatte en fremgangsmåte for å fortrinnsvis mutere selekterte individuelle aminosyrerester i CDR1, CDR2 eller CDR3 i den variable regionen på den tunge kjeden eller CDR1, CDR2 eller CDR3 i den variable regionen på den lette kjeden til et antistoff på en målstyrt måte, f.eks. en "gruppevis målstyring" eller "CDR-målstyring." I "den gruppevise målstyringen," blir individuelle aminosyrerester i bestemte grupper målstyrt for selektive mutasjoner som inkluderer gruppe I (innbefattende L3 og H3), II (innbefattende H2 og LI) og III (innbefattende L2 og Hl), der gruppene er nevnt i foretrukket rekke-følge for målstyring. I "CDR-målstyringen" blir individuelle aminosyrerester i bestemte CDR'er målstyrt for selektive mutasjoner med følgende foretrukne rekkefølge for mål styring: H3, L3, H2, LI, Hl og L2. Den selekterte aminosyreresten muteres f.eks. til minst to andre aminosyrerester og effekten av mutasjonen på aktiviteten til antistoffet bestemmes. Aktivitet måles som en forandring i bindingsspe-sifisiteten/affiniteten til antistoffet og/eller den nøy-traliserende evnen antistoffet har. Det skal bli forstått at den selektive mutagenesefremgangsmåten kan bli anvendt for optimaliseringen av ethvert antistoff avledet fra enhver kilde som innbefatter fagdisplay, transgene dyr med humane IgG-kimbanegener og humane antistoffer isolert fra humane B-celler. Fortrinnsvis anvendes den selektive muta-genesef remgangsmåten på antistoffer som kan ikke bli optimalisert videre ved å anvende fagdisplayteknologi. Det skal bli forstått at antistoffer fra enhver kilde, som innbefatter fagdisplay, transgene dyr med humane IgG-kimbanegener, humane antistoffer isolert fra humane B-celler, kan bli utsatt for tilbakemutasjon før eller etter den selektive mutagenesefremgangsmåten.

Begrepet "aktivitetsøkende aminosyrerest" innbefatter en aminosyrerest som forbedrer aktiviteten til antistoffet. Det skal bli forstått at den aktivitetsøkende aminosyreresten kan erstatte en aminosyrerest i en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon, og videre kan mer enn én aktivitetsøkende aminosyrerest foreligge i én eller flere CDR'er. En aktivitetsøkende aminosyrerest innbefatter en aminosyrerest som forbedrer bindingsspesifisiteten/affiniteten til et antistoff, for eksempel anti-humant IL-12 antistoff som binder til humant IL-12. Den aktivitetsøkende aminosyreresten er også ment å innbefatte en aminosyrerest som forbedrer nøytraliserings-evnen til et antistoff, for eksempel det humane IL-12 antistoffet som inhiberer humant IL-12.

Ulike aspekter i den foreliggende oppfinnelsen er beskrevet i mer detalj i følgende seksjoner.

I. Humane antistoffer som binder humant IL-12

Denne oppfinnelsen tilveiebringer isolerte humane antistoffer, eller antigenbindende deler derav, som binder til humant IL-12. Fortrinnsvis er de humane antistoffene i den foreliggende oppfinnelsen rekombinante, nøytraliserende humane anti-hIL-12 antistoffer. Antistoffer i den foreliggende oppfinnelsen som binder til humant IL-12 kan bli selektert for eksempel ved å screene ett eller flere humane VLog VH cDNA-biblioteker med hlL-12, slik som med fagdis-playteknikker som er beskrevet i Eksempel 1. Screening av humane VLog VH cDNA-biblioteker identifiserte først en serie med anti-IL-12 antistoffer der ett antistoff, henvist til heri som "Joe 9" (eller "Joe 9-villtype"), ble selektert for videre utvikling. Joe 9 er et humant IL-12 antistoff med relativt lav affinitet (f.eks. en Kav på ca. 0,1 s_1) , likevel er det egnet for spesifikk binding og deteksjon av hlL-12. Affiniteten til Joe 9-antistoffet ble forbedret med å utføre mutagenese på tung og lett kjede CDR'ene, som resulterte i et panel med lett og tung kjede variable regioner som ble "blandet og matchet" og videre mutert, som førte til mange ekstra anti-hIL-12 antistoffer med økt affinitet for hlL-12 (se Eksempel 1, Tabell 2 (Appendiks A) og sekvenssammenligningene i Figurene 1A-D).

Av disse antistoffene demonstrerte det humane anti-hIL-12 antistoffet henvist til heri som Y61 en signifikant økning i bindingsaffinitet (f.eks. en Kavpå ca. 2 x 10<-4>s-1) . Y61 anti-hIL-12 antistoffet ble selektert for videre affinitetsmodning ved å individuelt mutere spesifikke aminosyrerester i CDR'ene på tung og lett kjede. Aminosyrerester i Y61 ble selektert for setespesifikk mutasjon (selektiv mutagenesefremgangsmåte) basert på aminosyreresten som okkuperer en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt-og/eller hypermutasjonsposisjon. En oppsummering av substitusjonene i selekterte posisjoner i CDR'ene til tung og lett kjede er vist i Figurene 2A-2H. Et foretrukket rekombinant nøytraliserende antistoff i den foreliggende oppfinnelsen, henvist til heri som J695, resulterte fra en Gly-til Tyr-substitusjon i posisjon 50 i lett kjede CDR2 i Y61 og en Gly- til Tyr-substitusjon i posisjon 94 i lett kjede CDR3 i Y61.

Aminosyresekvenssammenligninger av de variable regionene til tung og lett kjede til et panel med anti-IL-12 antistoffer i den foreliggende oppfinnelsen, på linjen fra Joe 9-villtype til J695, er vist i Figurene 1A-1D. Disse sekvenssammenligningene muliggjorde identifiseringen av konsensussekvenser for foretrukne variable regioner til tung og lett kjede til antistoffer i oppfinnelsen som binder hlL-12, så vel som konsensussekvenser for CDR3, CDR2 og CDR1, på linjen fra Joe 9 til J695. I tillegg muliggjorde Y61-mutageneseanalysen oppsummert i Figurene 2A-2H identifiseringen av konsensussekvenser for variable regioner til tung og lett kjede som binder hlL-12, så vel som konsensussekvenser for CDR3, CDR2 og CDR1 som binder hlL-12 på linjen fra Y61 til J695, som omfatter sekvenser med modifiseringer fra Y61 som fortsatt opprettholder gode hlL-12 bindingskarakteristika. Foretrukne CDR-, VH- og VL-sekvenser i den foreliggende oppfinnelsen (som inkluderer konsensussekvenser), som er identifisert med sekvensidenti-fiserere i den vedlagte sekvenslisten, er oppsummert nedenfor . Antistoffer produsert fra affinitetsmodning av Joe 9-villtype blekarakterisertfunksjonelt med overflateplasmonresonansanalyse for å bestemme Kdog Kav-hastigheten. En serie med antistoffer ble produsert som hadde en Kav-hastighet i området på ca. 0,1 s" 1 til ca. 1 x 10-<5>s"<1>, og mer foretrukket en Kav på ca. lx IO<-4>s<_1>til 1 x IO-<5>s<-1>eller mindre. Antistoffer ble ogsåkarakterisertin vitro for deres evne til å inhibere fytohemagglutinin (PHA) blastproliferasjon, som beskrevet i Eksempel 3. En serie med antistoffer ble laget som hadde en IC5o-verdi i området på ca. 1 x IO-<6>M til ca. 1 x 10"<11>M, mer foretrukket ca. 1 x 10<-10>M til 1 x 10<-11>M eller mindre. Derfor, i ett aspekt, tilveiebringer oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller antigenbindende del derav, som binder til humant IL-12 og dissosierer fra humant IL-12 med en Kav-hastighetskonstant på 0,1 s<-1>eller mindre, bestemt med overflateplasmonresonans, eller som inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro fytohemagglutinin-blastproliferasjonstest (PHA-test) med en IC5opå 1 x IO-6 M eller mindre. I foretrukne utførelser dissosierer det isolerte humane IL-12 antistoffet, eller en antigen bindende del derav, fra humant IL-12 med en Kav-hastighets-konstant på 1 x IO<-2>s<-1>eller mindre, eller inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC50på 1 x IO<-7>M eller mindre. I mer foretrukne utfør-elser dissosierer det isolerte humane IL-12 antistoffet, eller en antigenbindende del derav, fra humant IL-12 med en Kav-hastighetskonstant på 1 x IO<-3>s<_1>eller mindre, eller inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in

vitro PHA-test med en IC50på 1 x IO<-8>M eller mindre. I mer foretrukne utførelser dissosierer det isolerte humane IL-12 antistoffet, eller en antigenbindende del derav, fra humant IL-12 med en Kav-hastighetskonstant på 1 x IO<-4>s<-1>eller mindre, eller inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC50på 1 x IO<-9>M eller mindre. I mer foretrukne utførelser dissosierer det isolerte humane IL-12 antistoffet, eller en antigenbindende del derav, fra humant IL-12 med en Kav-hastighetskonstant på 1 x IO<-5>s<-1>eller mindre, eller inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC5opå 1 x IO<-10>M eller mindre. I til og med mer foretrukne utførelser dissosierer det isolerte humane IL-12 antistoffet, eller en antigenbindende del derav, fra humant IL-12 med en Kav-hastighetskonstant på 1 x IO<-5>s<-1>eller mindre, eller inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC50på 1 x IO<-11>M eller mindre.

Dissosieringshastighetskonstanten (Kav) til et IL-12 antistoff kan bli bestemt med overflateplasmonresonans (se Eksempel 5). Generelt måler overflateplasmonresonansanalyse "real-time" bindingsinteraksjoner mellom ligand (rekombinant humant IL-12 immobilisert på en biosensormatriks) og analytt (antistoffer i løsning) med overflateplasmonresonans (SPR) ved å anvende BIAcore-systemet (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Overflateplasmonanalyse kan også bli utført ved å immobilisere analytten (antistoffer på en biosensormatriks) og presentere liganden (rekombinant IL-12 i løsning). Nøytraliserende aktivitet til IL-12 antistoffer, eller antigenbindende deler derav, kan bli vurdert ved å anvende én eller flere egnede in vitro- tester (se Eksempel 3).

Det er velkjent i faget at CDR'er til tung og lett antistoffkjede spiller en viktig rolle i bindingsspesifisitet-en/af f initeten til et antistoff for et antigen. Derfor innbefatter oppfinnelsen humane antistoffer med lett og tung kjede CDR'er av Joe 9, så vel som andre antistoffer som har CDR'er som har blitt modifisert for å bedre bind-ingsspesif isiteten/af f initeten til antistoffet. Som vist i Eksempel 1 resulterer en serie med modifiseringer til lett og tung kjede CDR'er i affinitetsmodning av humane anti-hIL-12 antistoffer. Sammenligninger av aminosyresekvensene til tung og lett kjede variabel region til en serie med humane antistoffer som spenner fra Joe 9-villtype til J695 som binder humant IL-12, er vist i Figurene 1A-1D. Konsen-sussekvensmotiver for CDR'ene i antistoffer kan bli bestemt fra sekvensoppstillingen (som er oppsummert i tabellen ovenfor). For eksempel innbefatter et konsensusmotiv for VH CDR3 til linjen fra Joe 9 til J695 aminosyresekvensen: (H/S)-G-S-(H/Y)-D-(N/T/Y) (SEKV ID NR:1), som omfatter aminosyrer fra posisjon 95 til 102 i konsensus HCVR vist i SEKV ID NR:7. Et konsensusmotiv for VL CDR3 omfatter aminosyresekvensen: Q-(S/T)-Y-(D/E)-(S/R/K)-(S/G/Y)-(L/F/T/S)-(R/S/T/W/H)-(G/P)-(S/T/A/L)-(R/S/M/T/L-V/I/T/M/L) (SEKV ID NR:2), som omfatter aminosyrer fra posisjon 89 til 97 i konsensus LCVR vist i SEKV ID NR:8.

Derfor, i et annet aspekt, tilveiebringer oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som har følgende karakteristika: a) inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC50på 1 x IO<-6>M eller mindre; b) har en tung kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:1; og c) har en lett kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:2.

I en foretrukket utførelse omfatter antistoffet videre en VH CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen: F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V-K-G (SEKV ID NR:3) (som omfatter aminosyrer fra posisjon 50 til 65 i konsensus HCVR innbefattende aminosyresekvensen SEKV ID NR:7) og videre innbefatter en VL CDR2 innbefattende aminosyresekvensen: (G/Y)-N-(D/S)-(Q/N)-R-P-S (SEKV ID NR:4) (som omfatter aminosyrer fra posisjon 50 til 56 i konsensus LCVR innbefattende aminosyresekvensen SEKV ID NR:8).

I en annen foretrukket utførelse innbefatter antistoffet videre en VH CDR1 innbefattende aminosyresekvensen: F-T-F-S-(S/E)-Y-G-M-H (SEKV ID NR:5) (som omfatter aminosyrer fra posisjon 27 til 35 i konsensus HCVR innbefattende aminosyresekvensen SEKV ID NR:7) og videre innbefatter en VL

CDR1 innbefattende aminosyresekvensen: (S/T)-G-(G/S)-(R/S)-S-N-I-(G/V)-(S/A)-(N/G/Y)-(T/D)-V-(K/H) (SEKV ID NR:6) (som

omfatter aminosyrer fra posisjon 24 til 34 i konsensus LCVR innbefattende aminosyresekvensen SEKV ID NR:8).

I enda en annen foretrukket utførelse omfatter antistoffet i den foreliggende oppfinnelsen en HCVR innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:7 og en LCVR som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:8.

Ytterligere konsensusmotiver kan bli bestemt basert på mutasjonsanalysen utført på Y61 som førte til J695-antistoffet (oppsummert i Figurene 2A-2H). Som vist med grafene i Figurene 2A-2H, var bestemte rester i CDR'ene på tung og lett kjede til Y61 mottakelige for substitusjon uten å svekke hlL-12 bindingsegenskapene til antistoffet signifikant. For eksempel reduserte ikke individuelle substitusjoner i posisjon 30 i CDR Hl med tolv ulike aminosyrerester signifikant Kav-hastigheten til antistoffet, hvilket indikerer at denne posisjonen er mottakelig for substitu sjon med mange ulike aminosyrerester. Basert på mutasjonsanalysen (dvs. posisjoner i Y61 som var mottakelige for substitusjon med andre aminosyrerester) ble konsensusmotiver derfor bestemt. Konsensusmotivene for tung og lett kjede CDR3'ene er vist i henholdsvis SEKV ID NR:9 og 10, konsensusmotiver for tung og lett kjede CDR2'ene er vist i henholdsvis SEKV ID NR:11 og 12, og konsensusmotiver for tung og lett kjede CDRl'ene er vist i henholdsvis SEKV ID NR:13 og 14. Konsensusmotiver for VH- og VL-regionene er vist i henholdsvis SEKV ID NR:15 og 16.

Derfor, i ett aspekt, beskriver oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som har følgende karakteristika: a) inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC50på 1 x IO<-9>M eller mindre; b) har en tung kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:9; og c) har en lett kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:10.

I en foretrukket utførelse omfatter antistoffet videre en VH CDR2 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:11 og innbefatter videre en VL CDR2 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:12.

I en annen foretrukket utførelse innbefatter antistoffet videre en VH CDR1 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:13 og innbefatter videre en VL CDR1 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:14.

I enda en annen foretrukket utførelse innbefatter antistoffet i den foreliggende oppfinnelsen en HCVR innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:15 og en LCVR som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:16.

Et foretrukket antistoff i den foreliggende oppfinnelsen, det humane anti-hIL-12 antistoffet Y61, ble produsert ved affinitetsmodning av Joe 9-villtype med PCR-mutagenese av CDR3 (som beskrevet i Eksempel 1). Y61 hadde en forbedret spesifisitet/bindingsaffinitet bestemt med overflateplasmonresonans og med in vitro-nøytraliseringstester. Tung og lett kjede CDR3'ene til Y61 er vist i henholdsvis SEKV ID NR:17 og 18, tung og lett kjede CDR2'ene til Y61 er vist i henholdsvis SEKV ID NR:19 og 20, og tung og lett kjede CDRl'ene til Y61 er vist i henholdsvis SEKV ID NR:21 og 22. VH til Y61 har aminosyresekvensen i SEKV ID NR:23 og VL til Y61 har aminosyresekvensen i SEKV ID NR:24 (disse sekvensene er også vist i Figurene 1A-1D, sammenlignet med Joe 9).

Derfor, i et annet aspekt, beskriver oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som: a) inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC5opå 1 x IO<-9>M eller mindre; b) har en tung kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:17; og c) har en lett kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:18.

I en foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, en tung kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:19 og en lett kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:20.

I en annen foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, en tung kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:21 og en lett kjede CDR1 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:22.

I enda en annen foretrukket utførelse innbefatter det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, en tung kjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:23 og en lett kjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:24.

I bestemte utførelser innbefatter fullengdeantistoffet en tung kjede konstant region, slik som IgGl-, IgG2-, IgG3-, IgG4-, IgM-, IgA- og IgE-konstant region, og enhver allotypisk variant deri, som beskrevet i Kabat (Kabat, E. A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. utgave, U.S. Department of Health and Human Services, NIH publikasjon nr. 91-3242). Fortrinnsvis er antistoffets konstante region på den tunge kjeden en IgGl tung kjede konstant region. Alternativt kan antistoffdelen være et Fab-fragment, en F (ab' 2) -fragment eller et enkeltkjedet Fv-fragment.

Modifiseringer av individuelle rester i Y61 førte til pro-duksjonen av et panel med antistoffer vist i Figurene 2A-2H. Spesifisiteten/bindingsaffiniteten til hvert antistoff ble bestemt med overflateplasmonresonans og/eller med in vitro- nøytraliseringstester.

Derfor, i et annet aspekt, beskriver oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som: a) inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC50på 1 x IO<-9>M eller mindre; b) har en tung kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR:404 -

SEKV ID NR:469; og

SEKV ID NR:57 9.

I foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, en tung kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR:335 - SEKV ID NR:403 og en lett kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR:506 - SEKV ID NR:533.

I en annen foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, en tung kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR:288 - SEKV ID NR:334 og en lett kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR:470 - SEKV ID NR:505.

I enda en annen foretrukket utførelse innbefatter det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, en tung kjede variabel region innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:23 og en lett kjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:24.

I bestemte utførelser innbefatter fullengdeantistoffet en tung kjede konstant region, slik som IgGl-, IgG2-, IgG3-, IgG4-, IgM-, IgA- og IgE-konstant region, og enhver allotypisk variant deri, som beskrevet i Kabat (Kabat, E. A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. utgave, U.S. Department of Health and Human Services, NIH publikasjon nr. 91-3242). Fortrinnsvis er antistoffets konstante region på den tunge kjeden en IgGl tung kjede konstant region. Alternativt kan antistoffdelen være et Fab-fragment, et F (ab' 2) -fragment eller et enkeltkjedet Fv-fragment.

Et spesielt foretrukket rekombinant, nøytraliserende antistoff i den foreliggende oppfinnelsen, J695, ble produsert med målstyrt mutagenese av kontakt- og hypermutasjonsaminosyrerester til antistoff Y61 (se Eksempel 2 og Del III nedenfor) . J695 er forskjellig fra Y61 med en Gly- til Tyr-substitusjon i Y61 i posisjon 50 i lett kjede CDR2 og med en Gly- til Tyr-substitusjon i posisjon 94 i lett kjede CDR3. Tung og lett kjede CDR3'ene til J695 er vist i henholdsvis SEKV ID NR:25 og 26, tung og lett kjede CDR2'ene til J695 er vist i henholdsvis SEKV ID NR:27 og 28, og tung og lett kjede CDRl'ene til J695 er vist i henholdsvis SEKV ID NR:29 og 30. VH til J695 har aminosyresekvensen i SEKV ID NR:31 og VL til J695 har aminosyresekvensen i SEKV ID NR:32 (disse sekvensene er også vist i Figurene 1A-1D, sammenlignet med Joe 9).

Derfor, i et annet aspekt, beskriver oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som: a) inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC50på 1 x IO<-9>M eller mindre; b) har en tung kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:25; og c) har en lett kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:26.

I en foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, en tung kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:27 og en lett kjede CDR2 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:28.

I en annen foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, en tung kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:29 og en lett kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:30.

I enda en annen foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller en antigenbindende del derav, en tung kjede variabel region som innbefatter aminosyre sekvensen i SEKV ID NR:31 og en lett kjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:32.

Ytterligere mutasjoner i de foretrukne konsensussekvensene for CDR3, CDR2 og CDR1 til antistoffer på linjen fra Joe 9 til J695, eller fra linjen Y61 til J695, kan bli laget for å tilveiebringe ekstra anti-IL-12 antistoffer i den foreliggende oppfinnelsen. Slike modifiseringsfremgangsmåter kan bli utført ved å anvende standard molekylærbiologiteknikker, som PCR-mutagenese, rettet mot individuelle kontakt- eller hypermutasjonsaminosyrerester i CDR'ene på lett- og/eller tung kjede, etterfulgt av kinetisk og funksjonell analyse av de modifiserte antistoffene som er beskrevet heri (f.eks. nøytraliseringstester beskrevet i Eksempel 3, og BIAcore-analyse, som beskrevet i Eksempel 5) .

Derfor, i et annet aspekt, beskriver oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som: a) inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC50på 1 x IO-6 M eller mindre; b) innbefatter en tung kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:1, en tung kjede CDR2 som innbe fatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:3 og en tung kjede CDR1 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:5, eller en mutant derav med én eller flere aminosyresubstitusjoner i en foretrukket selektiv mutagenese- eller hypermu-tas j onsposis j on, der nevnte mutant har en kav-hastighet som ikke er mer enn 10-fold høyere enn antistoffet innbefattende en tung kjede CDR3 som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:1, en tung kjede CDR2 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:3 og en tung kjede CDR1 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:5; og c) innbefatter en lett kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:2, en lett kjede CDR2 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:4, og en lett kjede CDR1 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:6, eller en mutant derav med én eller flere aminosyresubstitusjoner i en foretrukket selektiv mutagenese- eller hypermutasjons-posis jon, der nevnte mutant har en kav-hastighet som ikke er mer enn 10-fold høyere enn antistoffet som innbefatter en lett kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:2, en lett kjede CDR2 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:4 og en lett kjede CDR1 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:6.

I et annet aspekt beskriver oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som: a) inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC50på 1 x IO<-9>M eller mindre; b) innbefatter en tung kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:9, en tung kjede CDR2 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:11 og en tung kjede CDR1 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:13, eller en mutant derav med én eller flere aminosyresubstitusjoner i en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt-ener hypermutasjonsposisjon, der nevnte mutant har en kav-hastighet som ikke er mer enn 10-fold høyere enn antistof fet som innbefatter en tung kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:9, en tung kjede CDR2 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:11 og en tung kjede CDR1 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:13; og c) innbefatter en lett kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:10, en lett kjede CDR2 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:12 og en lett kjede CDR1 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:14, eller en mutant derav med én eller flere aminosyresubstitusjoner i en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt-ener hypermutasjonsposisjon, der nevnte mutant har en kav-hastighet som ikke er mer enn 10-fold høyere enn antistoffet som innbefatter en lett kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:10, en lett kjede CDR2 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:12 og en lett kjede CDR1 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:14.

En vanlig erfaren fagmann vil også forstå at ekstra mutasjoner i CDR-regionene til et antistoff i den foreliggende oppfinnelsen, for eksempel i Y61 eller i J695, kan bli laget for å tilveiebringe ekstra anti-IL-12 antistoffer i oppfinnelsen. Slike modifiseringsfremgangsmåter kan bli utført ved å anvende standard molekylærbiologiteknikker, som beskrevet ovenfor. Den funksjonelle og kinetiske analysen av de modifiserte antistoffene kan bli utført som beskrevet i henholdsvis Eksempel 3 og Eksempel 5. Modifiseringer av individuelle rester i Y61 som førte til identifiseringen av J695 er vist i Figurene 2A-2H og er beskrevet i Eksempel 2.

Derfor, i et annet aspekt, beskriver oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som: a) inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC50på 1 x IO<-9>M eller mindre; b) innbefatter en tung kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:17, en tung kjede CDR2 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:19 og en tung kjede CDR1 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:21, eller en mutant derav med én eller flere aminosyresubstitusjoner i en foretrukket selektiv mutagenese- eller hypermu-tas jonsposisjon, der nevnte mutant har en kav-hastighet som ikke er mer enn 10-fold høyere enn antistoffet som innbefatter en tung kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:17, en tung kjede CDR2 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:19 og en tung kjede CDR1 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:21; og c) innbefatter en lett kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:18, en lett kjede CDR2 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:20 og en lett kjede CDR1 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:22,

eller en mutant derav med én eller flere aminosyresubstitusjoner i en foretrukket selektiv mutagenese- eller hypermu-tas j onsposis j on, der nevnte mutant har en kav-hastighet som ikke er mer enn 10-fold høyere enn antistoffet som innbefatter en lett kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:18, en lett kjede CDR2 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:20 og en lett kjede CDR1 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:22.

I et annet aspekt beskriver oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som: a) inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro PHA-test med en IC5opå 1 x IO<-9>M eller mindre; b) innbefatter en tung kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:25, en tung kjede CDR2 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:27 og en tung kjede CDR1 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:29, eller en mutant derav med én eller flere aminosyresubstitusjoner i en foretrukket selektiv mutagenese- eller hypermu tasjonsposisjon, der nevnte mutant har en kav-hastighet som ikke er mer enn 10-fold høyere enn antistoffet som innbefatter en tung kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:25, en tung kjede CDR2 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:27 og en tung kjede CDR1 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:29; og c) innbefatter en lett kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:26, en lett kjede CDR2 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:28 og en lett kjede CDR1 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:30,

eller en mutant derav med én eller flere aminosyresubstitusjoner i en foretrukket selektiv mutagenese- eller hypermu-tas j onsposis j on, der nevnte mutant har en kav-hastighet som ikke er mer enn 10-fold høyere enn antistoffet som innbefatter en lett kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:26, en lett kjede CDR2 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:28 og en lett kjede CDR1 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:30.

I ytterligere en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen isolerte humane antistoffer, eller antigenbindende deler derav, som nøytraliserer aktiviteten til humant IL-12, og minst ett ekstra primat IL-12 valgt fra gruppen som består av bavian IL-12, silkeape IL-12, sjimpanse IL-12, cynomolgus IL-12 og rhesus IL-12, men som ikke nøytraliser-er aktiviteten til mus IL-12.

II. Seleksjon av rekombinante humane antistoffer

Rekombinante humane antistoffer i den foreliggende oppfinnelsen kan bli isolert ved å screene et rekombinant kombinatorisk antistoffbibliotek, fortrinnsvis et scFv-fagdisplaybibliotek, laget ved å anvende humane VL- og VH-cDNA'er fremstilt fra mRNA avledet fra humane lymfocytter. Metodo-logi for å fremstille og screene slike biblioteker er kjent i faget. I tillegg til kommersielt tilgjengelige testsett for generering av fagdisplaybiblioteker (f.eks. Pharmacia sitt "Recombinant Phage Antibody System," katalog nr. 27-9400-01; og Stratagene SurfZAP™-fagdisplaytestsett, katalog nr. 240612), kan eksempler på fremgangsmåter og reagenser som er spesielt egnet for anvendelse i generering og screening av antistoffdisplaybiblioteker bli funnet i for eksempel Kang et al., PCT publikasjon nr. WO 92/18619; Winter et al., PCT publikasjon nr. WO 92/20791; Breitling et al., PCT publikasjon nr. WO 93/01288; McCafferty et al., PCT publikasjon nr. WO 92/01047; Garrard et al., PCT publikasjon nr. WO 92/09690; Fuchs et al., (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al., (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al., (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al., (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins et al., (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clackson et al.,

(1991) Nature 352:624-628; Gram et al., (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al., (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al., (1991) Nuc. Acid Res. 19:4133-4137; og Barbas et al., (1991) PNAS 88:7978-7982.

Antistoffbibliotekene som er anvendt i denne fremgangsmåten er fortrinnsvis scFv-biblioteker fremstilt fra humane VL-og VH-cDNA'er. scFv-antistoffbibliotekene blir fortrinnsvis screenet ved å anvende rekombinant humant IL-12 som antigenet for å selektere sekvenser til human tung og lett kjede som har en bindingsaktivitet mot IL-12. For å selektere for antistoffer spesifikke for p35-subenheten til IL-12 eller p70-heterodimeren, ble screeningstester utført i nærvær av overskudd av fri p4 0-subenhet. Subenhetpreferans-er kan bli bestemt for eksempel med mikro-Friguet-titrer-ing, som beskrevet i Eksempel 1.

Når først humane VL- og VH-segmenter er selektert utføres "blande og matche"-eksperimenter, der ulike par av de selekterte VL- og VH-segmentene blir screenet for IL-12 binding, for å selektere foretrukne VL/VH-parkombinasjoner (se Eksempel 1). I tillegg for å videre bedre affiniteten og/eller senke av-hastighetskonstanten for hlL-12 binding, kan VL- og VH-segmentene til det foretrukne VL/VH-paret(ene) bli randomisert mutert, fortrinnsvis i CDR3-regionen til VH og/eller VL, i en prosess som er analog med den in vivo-somatiske mutasjonsprosessen ansvarlig for affinitetsmodning av antistoffer i løpet av en naturlig immunrespons. Denne affinitetsmodningen in vitro kan bli oppnådd med amplifisering av VH- og VL-regioner ved å anvende PCR-primere som er komplementære med henholdsvis VH CDR3 eller VL CDR3, der primerne har blitt "ladet" med en randomisert blanding av de fire nukleotidbasene i bestemte posisjoner, slik at de resulterende PCR-produktene koder for VH- og VL-segmenter der randomiserte mutasjoner har blitt introdusert i VH og/eller VL CDR3-regionene. Disse randomisert muterte VH- og VL-segmentene kan bli selektert og screenet på nytt for binding til hlL-12, og sekvenser som har høy affinitet og en lav av-hastighet for IL-12 binding kan bli selektert. Tabell 2 (se Appendiks A) viser antistoffer som hadde forandret bindingsspesifisi-tet/affinitet produsert som et resultat av in vitro- affinitetsmodning.

Etter seleksjon, isolering og screening av et anti-hIL-12 antistoff i den foreliggende oppfinnelsen fra et rekombinant immunglobulindisplaybibliotek, kan nukleinsyre som koder for det selekterte antistoffet bli høstet fra fagpartikkelen(e) (f.eks. fra faggenomet) og subklonet inn i andre ekspresjonsvektorer med standard rekombinante DNA-teknikker. Hvis ønsket, kan nukleinsyren videre bli manipulert for å lage andre antistofformer i den foreliggende oppfinnelsen (f.eks. koblet til nukleinsyre som koder for ekstra immunglobulindomener, slik som ekstra konstante regioner) . For å uttrykke et rekombinant humant antistoff isolert ved screening av et kombinatorisk bibliotek, klones DNA'et som koder for antistoffet inn i en rekombinant ekspresjonsvektor og introduseres i en pattedyrvertscelle, som beskrevet i mer detalj i Del IV nedenfor.

Fremgangsmåter for å selektere humane IL-12 bindende antistoffer med fagddisplayteknologi og affinitetsmodning av selekterte antistoffer med randomisert eller målstyrt mutagenese av CDR-regioner er beskrevet i mer detalj i Eksempel 1.

Som beskrevet i Eksempel 1, identifiserte screening av humane VL og VH cDNA-biblioteker en serie med anti-IL-12 antistoffer, der Joe 9-antistoffet ble selektert for videre utvikling. En sammenligning av den variable regionen på den tunge kjeden til Joe 9 med kimbanesekvensene til tunge kjeder valgt fra VBASE-databasen, avslørte at Joe 9 lignet på COS-3 kimbanesekvensen. COS-3 tilhører VH3-kimbane-sekvensfamilien.

VH3-familien er del av det humane VH-kimbanerepertoaret som er delt inn i sju familier, VH1-VH7, basert på nukleotidsekvenshomologi (Tomlinson et al., (1992) J. Mol. Biol., 227, 776-798 og Cook et al., (1995) Immunology Today, 16, 237-242) . VH3-familien har flest medlemmer og har det største bidraget til kimbanerepertoaret. For enhver gitt human VH3-kimbaneantistoffsekvens, er aminosyresekvenslikheten i hele VH3-familien høy (se f.eks. Tomlinson et al.,

(1992) J. Mol. Biol., 227, 776-798 og Cook et al., (1995) Immunology Today, 16, 237-242). Området med aminosyre-sekvenslikhet mellom to hvilke som helst VH-kimbanesekvenser i VH3-familien varierer fra 69-98 rester av ca. 100 VH-rester, (dvs. 69-98 % aminosyresekvenshomologi mellom to hvilke som helst VH-kimbanesekvenser). For de fleste kim-banesekvenspar er det minst 80 eller flere identiske aminosyrerester (dvs. minst 80 % aminosyresekvenshomologi). Den høye graden av aminosyresekvenshomologi mellom VH3-familiemedlemmene resulterer i at bestemte aminosyrerester foreligger i nøkkelseter i CDR- og strukturregionene til VH-kjeden. Disse aminosyrerestene gir strukturelle egenskaper til CDR'ene. Studier av antistoffstrukturer har vist at CDR-konformasjoner kan bli delt inn i familier med kanoniske CDR-strukturer basert på nøkkelaminosyrerestene som okkuperer bestemte posisjoner i CDR- og strukturregionene. Det er derfor lignende lokale CDR-konformasjoner i ulike antistoffer som har kanoniske strukturer med identiske nøkkelamino-syrerester (Chotia et al., (1987) J. Mol. Biol., 196, 901-917 og Chotia et al., (1989) Nature, 342, 877-883). I VH3-familien er det en bevaring av aminosyrerestlikhet i nøk-kelsetene for de CDR1- og CDR2-kanoniske strukturene (Chotia et al., (1992) J. Mol. Biol., 227, 799-817).

COS-3 VH-kimbanegenet er et medlem av VH3-familien og er en variant av 3-30 (DP-49) VH-kimbaneallelet. COS-3 er forskjellig fra Joe 9 VH-aminosyresekvenser i bare 5 posisjoner. Den høye graden av aminosyresekvenshomologi mellom Joe 9 VH og COS-3 og mellom Joe 9 VH og de andre VH3-familiemedlemmene gir også en høy grad av CDR strukturell homologi (Chotia et al. (1992) J. Mol. Biol., 227, 799-817; Chotia et al., (1987) J. Mol. Biol., 196, 901-917 og Chotia et al., (1989) Nature, 342, 877-883).

Basert på den høye aminosyresekvenslikheten og kanoniske strukturelle likheten til Joe 9, vil den erfarne fagmann forstå at også andre VH3-familiemedlemmer kan bli anvendt for å generere antistoffer som binder til humant IL-12. Dette kan for eksempel bli utført ved å selektere en egnet VL med kjedeutskiftingsteknikker (Winter et al., (1994) Annual Rev. Immunol., 12, 433-55) eller ved å føre CDR'er fra et gnager- eller annet humant antistoff, som innbefatter CDR'er fra antistoffer i den foreliggende oppfinnelsen, over på en VH3-familiestruktur.

Det humane V-lambdakimbanerepertoaret er delt inn i 10 familier basert på nukleotidsekvenshomologi (Williams et al., (1996) J. Mol. Biol., 264, 220-232). En sammenligning av den variable regionen på den lette kjeden til Joe 9 med kimbanesekvenser til lett kjede valgt fra VBASE-databasen, avslørte at Joe 9 lignet på DPL8-kimbanelambda. Joe 9 VL er forskjellig fra DPL8-sekvens i bare fire strukturposisjoner og er svært homolog med struktursekvenser til de andre Vxl-familiemedlemmene. Basert på den høye aminosyresekvenshomo-logien og kanoniske strukturelle likheten til Joe 9, kan også andre Vxl-familiemedlemmer bli anvendt for å generere antistoffer som binder til humant IL-12. Dette kan for eksempel bli utført ved å selektere en egnet VH med kjedeutskiftingsteknikker (Winter et al., supra) eller ved å føre CDR'er fra et gnager- eller annet humant antistoff, innbefattende CDR'er fra antistoffer i den foreliggende oppfinnelsen, over på en Vxl-familiestruktur.

Fremgangsmåtene i den foreliggende oppfinnelsen er ment å innbefatte rekombinante antistoffer som binder til hlL-12, som innbefatter en tung kjede variabel region avledet fra et medlem av VH3-kimbanesekvensfamilien og en lett kjede variabel region avledet fra et medlem av Vxl-kimbane-sekvensfamilien. Videre vil den erfarne fagmann forstå at ethvert medlem av VH3-tungkjedesekvensfamilien kan bli kombinert med ethvert medlem av Vxl-lettkjedesekvensfamilien.

Fagfolk vil også forstå at DNA-sekvenspolymorfismer som fører til forandringer i kimbaneaminosyresekvensene kan forekomme i en populasjon (f.eks. den humane populasjonen). Slik genetisk polymorfisme i kimbanesekvensene kan forekomme blant individer i en populasjon pga. naturlig allelisk variasjon. Slike naturlige alleliske variasjoner kan vanligvis resultere i 1-5 % varians i nukleotidsekvensen til et gen. En hvilken som helst og alle slike nukleotid-variasjoner og resulterende aminosyrepolymorfismer i kimbanesekvenser som er resultatet av naturlig allelisk variasjon er ment å være innen omfanget av den foreliggende oppfinnelsen.

Derfor, i ett aspekt, beskriver oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som har følgende karakteristika:

a) som binder til humant IL-12 og dissosierer fra humant IL-12 med en kav-hastighetskonstant på 0,1 s<-1>eller mindre, bestemt med overflateplasmonresonans, eller som inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro fytohemagglutinin-blastproliferasjonstest (PHA-test) med en IC50på 1 x IO<-6>M eller mindre. b) har en tung kjede variabel region som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra et medlem av VH3-kimbanefami-lien, der den variable regionen på den tunge kjeden har en mutasjon i en kontakt- eller hypermutasjonsposisjon med en aktivitetsøkende aminosyrerest. c) har en lett kjede variabel region som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra et medlem av V^l-kimbanefami-lien, der den variable regionen på den lette kjeden har en mutasjon i en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt-ener hypermutasjonsposisjon med en aktivitetsøkende aminosyrerest .

I en foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller antigenbinding, mutasjon i tung kjede CDR3.

I en annen foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller antigenbinding, mutasjon i lett kjede CDR3.

I en annen foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller antigenbinding, mutasjon i tung kjede CDR2.

I en annen foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller antigenbinding, mutasjon i lett kjede CDR2.

I en annen foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller antigenbinding, mutasjon i tung kjede CDR1.

I en annen foretrukket utførelse har det isolerte humane antistoffet, eller antigenbinding, mutasjon i lett kjede CDR1.

Basert på den høye aminosyresekvenslikheten mellom medlemmer av VH3-kimbanefamilien, eller mellom medlemmer av lett kjede Vxl-kimbanefamilien, vil en vanlig erfaren fagmann forstå at mutasjoner i kimbanesekvenser kan tilveiebringe ekstra antistoffer som binder til humant IL-12. Tabell 1 (se Appendiks A) viser kimbanesekvensene til VH3-familiemedlemmene og viser den signifikante sekvenshomologien mellom familiemedlemmene. I Tabell 1 er kimbanesekvensene til VjJ.-familiemedlemmer også vist. Sekvensene til tung og lett kjede til Joe 9 er gitt som en sammenligning. Mutasjoner i kimbanesekvensene til VH3- eller V^l-familiemedlemmer kan for eksempel bli laget i de samme aminosyreposisjonene som de laget i antistoffene i den foreliggende oppfinnelsen (f.eks. mutasjoner i Joe 9). Modifiseringene kan bli utført ved å anvende standard molekylærbiologiteknikker, slik som PCR-mutagenese, rettet mot individuelle aminosyrerester i kimbanesekvensene, etterfulgt av kinetisk og funksjonell analyse av de modifiserte antistoffene som er beskrevet heri (f.eks. nøytraliseringstester beskrevet i Eksempel 3 og BIAcore-analyse, som beskrevet i Eksempel 5).

Derfor, i ett aspekt, beskriver oppfinnelsen isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som har følgende karakteristika: a) har en tung kjede variabel region som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR:595-667, der den variable regionen på den tunge kjeden har en mutasjon i en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon med en aktivitetsøkende aminosyrerest.

b) har en lett kjede variabel region som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID

NR:669-675, der den variable regionen på den lette kjeden har en mutasjon i en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon med en aktivitetsøkende aminosyrerest.

Basert på den høye aminosyresekvenslikheten mellom Joe 9 og COS-3 tung kjede kimbanesekvens og mellom Joe 9 og DPL8-lambdakimbanesekvens, vil en vanlig erfaren fagmann forstå at andre mutasjoner i CDR-regionene til disse kimbanesekvensene kan gi ekstra antistoffer som binder til humant IL-12. Slike modifiseringsfremgangsmåter kan bli utført ved å anvende standard molekylærbiologiteknikker, som beskrevet ovenfor.

Derfor, i ett aspekt, beskriver oppfinnelsen isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som har følgende karakteristika: a) som binder til humant IL-12 og dissosierer fra humant IL-12 med en kav-hastighetskonstant på 0,1 s<-1>eller mindre, bestemt med overflateplasmonresonans, eller som inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro fytohemagglutinin-blastproliferasjonstest (PHA-test) med en IC5opå 1 x IO<-6>M eller mindre.

På grunn av at bestemte aminosyrerester opptar nøkkelseter i CDR- og strukturregionene i den variable regionen til lett og tung kjede, har disse regionene strukturelle egenskaper. Spesielt er CDR2- og CDRl-regionene utsatt for kanoniske strukturelle klassifiseringer. Siden det er en høy grad av aminosyresekvenshomologi mellom familiemedlemmer, foreligger disse kanoniske egenskapene mellom familiemedlemmer. Den erfarne fagmann vil forstå at modifiseringer på aminosyrerestene som tilveiebringer disse kanoniske strukturene vil resultere i ekstra antistoffer som binder til IL-12. Modifiseringene kan bli utført ved å anvende standard molekylærbiologiteknikker, som beskrevet ovenfor.

Derfor, i et annet aspekt, beskriver oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller en antigenbindende del derav, som har følgende karakteristika: a) som binder til humant IL-12 og dissosierer fra humant IL-12 med en kav-hastighetskonstant på 0,1 s<-1>eller mindre, bestemt med overflateplasmonresonans, eller som inhiberer fytohemagglutinin-blastproliferasjon i en in vitro fytohemagglutinin-blastproliferasjonstest (PHA-test) med en IC5opå 1 x IO-<6>M eller mindre. b) har en tung kjede variabel region som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra et medlem av VH3-kimbanefami-lien, der den variable regionen på den tunge kjeden innbefatter en CDR2 som ligner strukturelt på CDR2'er fra andre VH3-kimbanefamiliemedlemmer, og en CDR1 som ligner strukturelt på CDRl'er fra andre VH3-kimbanefamiliemedlemmer, og der den variable regionen på den tunge kjeden har en mutasjon i en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon med en aktivitetsøkende aminosyrerest; c) har en lett kjede variabel region som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra et medlem av V^l-kimbanefami-lien, der den variable regionen på den lette kjeden innbe fatter en CDR2 som ligner strukturelt på CDR2'er fra andre V^l-kimbanefamiliemedlemmer, og en CDR1 som ligner strukturelt på CDR1'er fra andre Vxl-kimbanefamiliemedlemmer, og der den variable regionen på den lette kjeden har en mutasjon i en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon med en aktivitetsøkende aminosyrerest .

Rekombinante humane antistoffer i den foreliggende oppfinnelsen har variable og konstante regioner som er homologe med humane kimbaneimmunglobulinsekvenser valgt fra VBASE-databasen. Mutasjoner i de rekombinante humane antistoffene

(f.eks. med randomisert mutagenese eller PCR-mutagenese)

resulterer i aminosyrer som ikke er kodet av humane kimbaneimmunglobulinsekvenser. Også biblioteker med rekombinante antistoffer som ble avledet fra humane donorer vil inneholde antistoffsekvenser som er forskjellige fra deres tilsvarende kimbanesekvenser pga. den normale somatiske mutasjonsprosessen som forekommer i løpet av B-celleutvik-ling. Det bør bli nevnt at hvis "kimbane"-sekvensene fremskaffet med PCR-amplifisering koder for aminosyreforskjel-ler i strukturregionene fra den ekte kimbanekonfigurasjonen (dvs. forskjeller i den amplifiserte sekvensen sammenlignet med den ekte kimbanesekvensen), kan det være fordelaktig å forandre disse aminosyreforskjellene tilbake til de ekte kimbanesekvensene (dvs. "tilbakemutasjon" av strukturrester til kimbanekonfigurasjonen). Derfor kan den foreliggende oppfinnelsen eventuelt innbefatte et tilbakemutasjonstrinn. For å gjøre dette, blir aminosyresekvensene til tung og lett kjede kodet av kimbanen (funnet som eksempel i VBASE-database) først sammenlignet med strukturaminosyresekvens-ene til mutert tung og lett immunglobulinkjede for å identifisere aminosyrerester i den muterte immunglobulinstruk-tursekvensen som er forskjellig fra de mest lignende kimbanesekvensene. Deretter muteres de egnede nukleotidene til den muterte immunglobulinsekvensen tilbake for å korrespon-dere med kimbanesekvensen ved å anvende den genetiske koden for å bestemme hvilke nukleotidforandringer som bør bli

gjort. Mutagenese av den muterte immunglobulinstruktur-sekvensen utføres med standard fremgangsmåter, slik som PCR-mediert mutagenese (der de muterte nukleotidene er inkorporert i PCR-primerne slik at PCR-produktet inneholder mutasjonene) eller målstyrt mutagenese. Den rollen hver aminosyre, som er identifisert som kandidat for tilbakemutasjon, har bør bli undersøkt for en direkte eller indirekte rolle i antigenbinding, og enhver aminosyre som etter mutasjon blir funnet til å affisere enhver fordelaktig egenskap i det humane antistoffet skal ikke bli inkludert i det endelige humane antistoffet; som et eksempel vil ikke aktivitetsøkende aminosyrer identifisert med den selektive mutagenesefremgangsmåten bli utsatt for tilbakemutasjon. Tester for å bestemme karakteristikaene til antistoffet som resulterer fra mutagenese kan innbefatte ELISA, kompetitiv ELISA, in vitro og in vivo-nøytraliseringstester og/eller (se f.eks. Eksempel 3) immunhistokjemi med vevssnitt fra ulike kilder (innbefattende menneske, primat og/eller andre arter).

For å begrense antallet aminosyrer som blir utsatt for tilbakemutasjon kan de aminosyreposisjonene som er funnet å være forskjellige fra den mest lignende kimbanesekvensen, men identisk med den korresponderende aminosyren i en annen kimbanesekvens, forbli uforandret, gitt at den andre kimbanesekvensen er identisk og kolineær med sekvensen til det humane antistoffet i den foreliggende oppfinnelsen i minst 10, fortrinnsvis 12 aminosyrer, på begge sider av den aktuelle aminosyren. Dette vil føre til at enhver peptidepitope som blir presentert til immunsystemet med profesjonelle antigenpresenterende celler i et individ behandlet med det humane antistoffet i oppfinnelsen ikke vil være fremmed, men identisk med et selv-antigen, dvs. immunglobulinet kodet av den andre kimbanesekvensen. Tilbakemutasjon kan forekomme på ethvert stadium av antistoffoptimalisering; fortrinnsvis skjer tilbakemutasjon direkte før eller etter den selektive mutagenesefremgangsmåten. Mer foretrukket forekommer tilbakemutasjon direkte før den selektive muta-genesef remgangsmåten . III. Modifiseringer til foretrukne selektive mutagenese-, kontakt- og/eller hypermutasjonsposisjoner.

Normalt kan seleksjon av antistoffer med forbedrede affiniteter bli utført ved å anvende fagdisplayfremgangsmåter, som beskrevet i Del II ovenfor. Dette kan bli oppnådd ved å randomisert mutere kombinasjoner av CDR-rester og generere store biblioteker inneholdende antistoffer med ulike sekvenser. For at disse seleksjonsfremgangsmåtene imidlertid skal fungere, må antistoff/antigen-reaksjonen tendere mot likevekt for å muliggjøre, over tid, binding av antistoffer med høyere affinitet til antigenet. Seleksjonsbetingelser som ville muliggjøre etablering av likevekt kunne ikke bli bestemt (trolig pga. ekstra uspesifikke interaksjoner mellom antigenet og fagpartikkelen) når fagdisplayfremgangsmåter ble anvendt for å bedre affiniteten til selekterte anti-IL-12 antistoffer, for å oppnå et bestemt affinitetsnivå (dvs. det til antistoff Y61). Derfor kunne ikke antistoffer med til og med høyere affiniteter bli selektert med fagdisplayfremgangsmåter. Således, i hvert fall for visse antistoffer eller antigener, har fagdisplayfremgangsmåter begrenset evne til å selektere antistoffer med en sterkt forbedret bindingsspesifisitet/affinitet. Derfor ble en metode kalt selektiv mutagenesefremgangsmåte, som ikke forutsetter fagdisplayaffinitetsmodning av antistoffer, etablert for å overvinne denne begrensningen og er tilveiebragt i oppfinnelsen. Selv om denne selektive muta-genesef remgangsmåten ble utviklet for å overvinne begrens-ninger ved anvendelse av fagdisplaysystemet, bør det bli nevnt at denne fremgangsmåten også kan bli anvendt med fagdisplaysystemet. Videre kan den selektive mutagenesefremgangsmåten bli anvendt for å bedre aktiviteten til ethvert antistoff.

For å bedre aktiviteten (f.eks. affinitet eller nøytrali-serende aktivitet) til et antistoff, vil man ideelt ønske å mutere hver CDR-posisjon i både de tunge og lette kjedene til enhver mulig aminosyrerest. Siden det imidlertid er gjennomsnittlig 70 CDR-posisjoner i et antistoff, vil en slik tilnærmingsmåte være veldig tid- og arbeidskrevende. Derfor muliggjør fremgangsmåten i den foreliggende oppfinnelsen at man kan bedre aktiviteten til antistoffet ved å bare mutere bestemte selekterte rester i CDR'ene til tung og/eller lett kjede. Videre muliggjør fremgangsmåten i den foreliggende oppfinnelsen forbedring i antistoffets aktivitet uten å affisere andre fordelaktige egenskaper i antistoffet .

Bestemmelse av hvilke aminosyrerester i en variabel region til et antistoff som er i kontakt med et antigen kan ikke bli bestemt nøyaktig basert på primærsekvens eller deres posisjoner i den variable regionen. Ikke desto mindre har sammenligninger av sekvenser fra antistoffer med ulike spesifisiteter, utført av Kabat et al., identifisert CDR'ene som lokale regioner i de variable regionene som er signifikant forskjellige mellom antistoffer (Kabat et al., (1971) Ann. NY Acad. Sei. 190:382-393, Kabat, E. A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. utgave, U.S. Department of Health and Human Services, NIH publikasjon nr. 91-3242). Strukturelle studier har vist at anti-genbindingsoverflaten dannes av aminosyrerester i CDR'ene. Andre aminosyrerester utenfor CDR'en er også kjent for å spille strukturelle roller eller være direkte involvert i antigenbinding. Derfor, for hvert antigen/antistoff-par, kan aminosyrerester i og utenfor CDR'ene være viktige.

Sekvenssammenligningsstudiene til Tomlison et al. identifiserte flere posisjoner i tung og lett kjede CDR1 og CDR2, og i en del av kappa kjede CDR3, som er frekvente seter for somatisk mutasjon (Tomlison et al., (1996) J. Mol. Biol. 256:813-817). Spesielt ble posisjonene H31, H31B, H33, H33B, H52B, H56, H58, L30, L31, L31A, L50, L53, L91, L92, L93 og L94 identifisert som frekvente seter for somatisk mutasjon. Denne analysen utelukker imidlertid de viktige CDR3-regionene på tung kjede og deler av lett kjede CDR3 som er kjent for å ligge i senteret av et antistoffbind-ingssete og potensielt sørger for viktige interaksjoner med et antigen. Videre antyder Tomlison et al. at somatisk mangfold alene ikke nødvendigvis forutsier en rolle til en spesifikk aminosyre i antigenbinding, og foreslår konserverte aminosyrerester som kommer i kontakt med antigenet og flere aminosyrerester som ikke kommer i kontakt med antigenet. Denne konklusjonen er videre støttet av mutasjons-studier på rollen somatiske mutasjoner har for antistoffaffinitet (Sharon, (1990), PNAS, 87:4814-7). Nitten somatiske mutasjoner i et anti-p-azofenylarsonat (Ars) høyaffi-nitetsantistoff ble byttet ut samtidig med deres tilsvarende kimbanerester og genererte en kimbaneutgave av anti-Ars antistoffet som hadde et 200-fold tap i aktivitet. Den totale affiniteten til anti-Ars antistoffet kunne bli gjenopprettet ved å gjeninnsette bare tre av de nitten somatiske mutasjonene, hvilket demonstrerer at mange somatiske mutasjoner kan bli tillatt fordi de ikke bidrar til antigenbindingsaktivitet.

Resultatet kan delvis bli forklart med antistoffmangfoldet. Umodne B-celler kan først produsere antistoffer med lav affinitet som gjenkjenner flere selv- eller ikke-selv antigener. Videre kan antistoffer gjennomgå sekvensvariasjoner i løpet av affinitetsmodning som kan forårsake selv-reaktivitet. Hypermutasjon av slike antistoffer med lav affinitet kan avskaffe selv-reaktivitet ("negativ seleksjon") og øke affinitet for det fremmede antigenet. Derfor gir ikke analysen av primære og strukturelle data av et stort antall antistoffer en fremgangsmåte for å enten forutse (1) rollen til somatiske hypermutasjonsseter i affinitetsmodningspro-sessen versus prosessen for å redusere affinitet mot uønskede antigener, eller (2) hvordan en gitt aminosyre bidrar til egenskapene til et spesifikt antigen/antistoff-par.

Andre forsøk på å adressere rollen spesifikke aminosyrerester har i gjenkjennelse av antigen ble gjort ved å analysere flere krystallstrukturer til antigen/antistoff-kom-plekser (MacCallum et al., (1996) J. Mol. Biol. 262:732-745). Den potensielle rollen til posisjoner lokalisert i og utenfor CDR'ene ble indikert. Posisjoner i CDR'er involvert i antigenbinding i mer enn 10 av 26 analyserte strukturer innbefattet H31, H33, H50, H52, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98 og H100 i den tunge kjeden og L30A, L32, L91, L92, L93, L94 og L96 i den lette kjeden. Imidlertid regi-strerte forfatterne at forutsigelse av antigenkontakt ved å anvende disse og andre strukturelle data kan over- og underforutsi kontaktposisjoner, som fører til spekulasjonen om at en annen strategi må bli anvendt for ulike antigener.

Pini et al. beskriver randomisering av flere rester i CDR-antistoffsekvenser i et stort fagdisplaybibliotek for å øke antistoffaffinitet raskt (Pini et al., (1998) J. Biol Chem. 273:21769-21776). Imidlertid hadde høyaffinitetsantistoff-ene diskutert av Pini et al. mutasjoner i totalt åtte posisjoner, og en reduksjonsanalyse av hvilke forandringer som er absolutt nødvendige for å bedre affinitet til antistoffet blir upraktisk pga. det store antallet mulige kombinasjoner som skal bli testet for det minste antallet aminosyrer som er nødvendig.

Videre trenger ikke randomisering av flere rester nødven-digvis bevare andre ønskede egenskaper til antistoffet. Ønskede egenskaper eller karakteristika til et antistoff er kjent i faget og innbefatter for eksempel bevaring av ikke-kryssreaktivitet, f.eks. med andre proteiner eller humane vev, og bevaring av antistoffsekvenser som ligner humane kimbaneimmunglobulinsekvenser forbedring av nøytraliser-ingsevne. Andre fordelaktige egenskaper eller karakteristika innbefatter evnen til å bevare kryssreaktivitet mellom arter, evnen til å bevare epitopespesifisitet og evnen til å bevare høye proteinekspresjonsnivåer i pattedyrceller. De fordelaktige egenskapene eller karakteristikaene kan bli observert eller målt ved å anvende kjente teknikker i faget som innbefatter, men ikke er begrenset til, ELISA, kompetitiv ELISA, in vitro- og in vivo-nøytraliseringstester (se f.eks. Eksempel 3), immunhistokjemi med vevssnitt fra ulike kilder som innbefatter menneske, primat eller andre kilder etter behov, og studier for ekspresjon i pattedyrceller ved å anvende transient ekspresjon eller stabil ekspresjon.

I tillegg kan fremgangsmåten til Pini et al. introdusere flere forandringer enn det minste antallet som faktisk er nødvendig for å bedre affinitet og kan føre til antistoffene som utløser anti-human-antistoff (HAMA) -dannelse i mennesker. Videre, som diskutert annensteds, behøver ikke fagdisplay som er demonstrert heri eller annen relatert fremgangsmåte, innbefattende ribosomdisplay, fungere til-fredsstillende for å oppnå bestemte affiniteter mellom antistoff og antigen, og betingelsene som er nødvendige for å nå likevekt behøver ikke bli oppnådd i en fornuftig tidsramme pga. ekstra interaksjoner som inkluderer interaksjoner med andre fag- eller ribosomkomponenter og antigenet .

Den vanlig erfarne fagmann kan samle inn interessant viten-skapelig informasjon på opprinnelsen av antistoffmangfold fra beskrivelsene av referansene diskutert ovenfor. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer imidlertid en fremgangsmåte for å øke antistoffaffinitet til et spesifikt antigen/antistoff-par, mens andre relevante egenskaper eller fordelaktige karakteristika til antistoffet blir bevart. Dette er spesielt viktig når man vurderer ønskelig-heten av å tildele en mengde ulike karakteristika til et spesifikt antistoff innbefattende antigenbinding.

Hvis startantistoffet har fordelaktige egenskaper eller karakteristika som trenger å bli bevart, kan en selektiv mutagenesefremgangsmåte være den beste strategien for å bevare disse fordelaktige egenskapene mens man bedrer aktiviteten til antistoffet. I mutagenesen av Y61 var for ek sempel målet å øke affinitet for hlL-12 og å bedre nøytra-liseringsevnen til antistoffet mens man bevarte ønskede egenskaper. Ønskede egenskaper til Y61 inkluderte (1) bevaring av ikke-kryssreaktivitet med andre proteiner eller humane vev, (2) bevaring av klar epitopespesifisitet, dvs. gjenkjenne en p40-epitope fortrinnsvis i sammenheng med p70 (p40/p35)-heterodimeren og dermed hindre bindingsinterferens fra fri, løselig p40; og (3) dannelse av et antistoff med aminosyresekvenser til tung og lett kjede som lignet mest mulig på deres respektive kimbaneimmunglobulinsekvenser.

I én utførelse tilveiebringer fremgangsmåten i oppfinnelsen en selektiv mutagenesefremgangsmåte som en strategi for å bevare de ønskede egenskapene eller karakteristikane til antistoffet mens man forbedrer affiniteten og/eller nøy-traliseringsevnen. Begrepet "selektiv mutagenesefremgangsmåte" er som definert ovenfor og inkluderer en fremgangsmåte for å mutere selekterte aminosyrerester individuelt. Aminosyrerestene som skal bli mutert kan først bli valgt fra foretrukne selektive mutageneseposisjoner, deretter fra kontaktposisjoner og deretter fra hypermutasjonsposisjoner. Den individuelt selekterte posisjonen kan bli mutert til minst to andre aminosyrerester og effekten av mutasjonen både på de ønskede egenskapene til antistoffet og forbedring i antistoffaktivitet blir bestemt.

Den selektive mutagenesefremgangsmåten innbefatter trinnene : selektere mulige posisjoner i rekkefølgen 1) foretrukne selektive mutageneseposisjoner; 2) kontaktposisjoner; 3) hypermutasjonsposisjoner og rangere posisjonene basert på lokaliseringen av posisjonen i de variable regionene til tung og lett antistoffkjede (CDR3 foretrukket i forhold til CDR2 foretrukket i forhold til CDR1);

mutere kandidatforetrukne selektive mutagenese-, hypermutasjons- og/eller kontaktposisjoner individuelt i rangeringsrekkefølgen til alle mulige andre aminosyrerester

og analysere effekten av de individuelle mutasjonene på aktiviteten til antistoffet for å bestemme aktivitetsøkende aminosyrerester;

om nødvendig lage trinnvise kombinasjoner av de individuelle aktivitetsøkende aminosyrerestene og analysere effekten av de ulike kombinasjonene på aktiviteten til antistoffene; selektere mutante antistoffer med aktivitets-økende aminosyrerester og rangere de mutante antistoffene basert på lokaliseringen og identiteten til aminosyresub-stitusj onene med hensyn til deres immunogene potensial. Høyest rangering gis til mutante antistoffer innbefattende en aminosyresekvens som er nesten identisk med en sekvens til en variabel region som er beskrevet i en kimbanedata-base eller har en aminosyresekvens som er sammenlignbar med andre humane antistoffer. Lavere rangering gis til mutante antistoffer inneholdende en aminosyresubstitusjon som sjel-dent forekommer i enten kimbanesekvenser eller sekvensene til andre humane antistoffer. Den laveste rangeringen gis til mutante antistoffer med en aminosyresubstitusjon som ikke har blitt observert i en kimbanesekvens eller sekvensen til et annet humant antistoff. Som fremlagt ovenfor, er mutante antistoffer innbefattende minst én aktivitetsøkende aminosyrerest lokalisert i CDR3 foretrukket i forhold til CDR2 som er foretrukket i forhold til CDR1. CDR'ene i de variable regionene til tung kjede er foretrukket i forhold til de i lett kjede variabel region.

De mutante antistoffene kan også bli studert for bedring i aktivitet, f.eks. når de blir sammenlignet med deres tilsvarende forelderantistoff. Aktivitetsforbedringen hos det mutante antistoffet kan for eksempel bli bestemt med nøytraliseringstester eller bindingsspesifisitet/affinitet med overflateplasmonresonansanalyse (se Eksempel 3). Fortrinnsvis kan aktivitetsforbedringen være minst 2-20 fold høyere enn forelderantistoffet. Forbedringen i aktivitet kan være minst "xi" til "x2"-fold høyere enn forelderantistoffet, der "xi" og "x2" er hele tall mellom og innbefat tende 2 til 20, som inkluderer områder innenfor det gitte området, f.eks. 2-15, f.eks. 5-10.

De mutante antistoffene med den aktivitetsøkende aminosyreresten kan også bli studert for å bestemme om minst én annen fordelaktig egenskap har blitt bevart etter mutasjon. For eksempel teste anti-hIL-12 antistoffer for (1) bevaring av ikke-kryssreaktivitet med andre proteiner eller humane vev, (2) bevaring av epitopegjenkjennelse, dvs. gjenkjenne en p40-epitope fortrinnsvis i sammenheng med p70 (p40/p35)-heterodimeren, og dermed hindre bindingsinterferens fra fri, løselig p40; og (3) dannelse av antistoffer med aminosyresekvenser til tung og lett kjede som lignet mest mulig på deres respektive kimbaneimmunglobulinsekvenser, og bestemme hvilket som minst sannsynlig vil utløse en human immunrespons basert på antall ulikheter med kimbanesekvensen. De samme observasjonene kan bli gjort for et antistoff som har mer enn én aktivitetsøkende aminosyrerest, f.eks. minst to eller minst tre aktivitetsøkende aminosyrerester, for å bestemme om retensjon av den fordelaktige egenskapen eller særtrekket har skjedd.

Et eksempel på anvendelse av en "selektiv mutagenesefremgangsmåte" i mutagenesen av Y61 er beskrevet nedenfor. Hver av de individuelle mutasjonene H31S-Æ, L50-»Y eller L94G-»Y forbedret antistoffets nøytraliserende aktivitet. Når imidlertid kombinasjonskloner ble testet, var ikke aktiviteten til den kombinerte klonen H31S-Æ + L50->Y + L94G->Y bedre enn L50-»Y + L94G-»Y (J695) . Derfor var forandring av kimbaneaminosyreresten Ser til Glu i posisjon 31 i CDR1 unødvendig for den forbedrede aktiviteten til J695 i forhold til Y61. Den selektive mutagenesefremgangsmåten identifiserte derfor det minimale antallet forandringer som bidro til den endelige aktiviteten og reduserte dermed det immunogene potensialet til det endelige antistoffet og bevarte andre ønskede egenskaper til antistoffet.

Isolert DNA som koder for VH og VL produsert med den selekterte mutagenesefremgangsmåten kan bli omdannet til fullengde antistoffkjedegener, til Fab-fragmentgener som til et scFV-gen, som beskrevet i Del IV. For ekspresjon av VH-og VL-regioner produsert med den selekterte mutagenesefremgangsmåten, kan ekspresjonsvektorer som koder for den tunge og lette kjeden bli transfektert inn i mange vertsceller, som beskrevet i detalj i Del IV. Foretrukne vertsceller innbefatter enten prokaryote vertsceller, som for eksempel E. coli, eller eukaryote vertsceller, som for eksempel gjærceller, f.eks. S. cerevisae. De mest foretrukne eukaryote vertscellene er pattedyrvertsceller, beskrevet i detalj i Del IV.

Den selektive mutagenesefremgangsmåten tilveiebringer en fremgangsmåte for å fremstille antistoffer med forbedrede aktiviteter uten at antistoffet på annen måte blir affinitetsmodnet på forhånd. Den selektive mutagenesefremgangsmåten tilveiebringer en fremgangsmåte for å fremstille antistoffer med forbedrede affiniteter som har blitt utsatt for tilbakemutasjoner. Den selektive mutagenesefremgangsmåten tilveiebringer også en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til affinitetsmodnede antistoffer.

Den erfarne fagmann vil se at den selektive mutagenesefremgangsmåten kan bli anvendt i standard antistoffmanipuler-ingsteknikker kjent i faget. Eksempler innbefatter, men er ikke begrenset til, antistoffer med CDR overført fra andre antistoffer, kimæriske antistoffer, scFV-fragmenter, Fab-fragmenter av fullengde antistoffer og humane antistoffer fra andre kilder, f.eks. transgene mus.

Hurtig storskala mutasjonsanalyse av antistoffer innbefatter in vitro-transkripsjon og -translasjon ved å anvende ribosomdisplayteknologi (se f.eks. Hanes et al., (1997) Proe. Nati. Acad. Sei. 94:4937-4942; Dall Acqua et al.,

(1998) Curr. Opin. Struc. Biol. 8:443-450; He et al.,

(1997) Nucleic Acid Res. 25:5132-5134) og U.S. patent nr.

5.643.768 og 5.658.754 til Kawasaki. Den selektive mutage-nesef remgangsmåten tilveiebringer også en fremgangsmåte for å fremstille antistoffer med forbedrede aktiviteter som kan bli selektert ved å anvende ribosomale displayteknikker.

I fremgangsmåtene i den foreliggende oppfinnelsen blir antistoffer, eller antigenbindende deler derav, videre modifisert ved å forandre individuelle posisjoner i CDR'ene i HCVR og/eller LCVR. Selv om disse modifiseringene kan bli laget i antistoffer vist på (bakterio)fager, er fremgangsmåten fordelaktig ved at den kan bli utført med antistoffer som er uttrykt i andre vertssystemer, slik som bakterie-, gjær- eller pattedyrcelleekspresjonssystemer. De individuelle posisjonene i CDR'ene selektert for modifisering er basert på posisjonene som er en kontakt- og/eller hypermu-tas j onsposis j on .

Foretrukne kontakt- og hypermutasjonsposisjoner, slik de er definert heri, er vist i Tabell 3 (se Appendiks A) og deres modifisering i samsvar med fremgangsmåten i den foreliggende oppfinnelsen er beskrevet i detalj i Eksempel 2. Foretrukne kontaktposisjoner er valgt fra gruppen som består av H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96. Foretrukne hypermutasjonsposisjoner er valgt fra gruppen som består av H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 og L93. Mer foretrukne aminosyrerester (henvist til som "foretrukne selektive mutageneseposisjoner") er både kontakt- og hypermutasjonsposisjoner og er valgt fra gruppen som består av H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 og L94. Spesielt foretrukne kontaktposisjoner er valgt fra gruppen som består av L50 og L94. Foretrukne aktivitetsøkende aminosyrerester erstatter aminosyrerester lokalisert i posisjoner valgt fra gruppen bestående av H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96. Mer foretrukne aktivitetsøkende aminosyrerester erstatter aminosyrerester lokalisert i posisjonene H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 og L94. Spesielt foretrukne aktivitetsøkende aminosyrerester erstatter aminosyrerester lokalisert i posisjoner valgt fra gruppen som består av L50 og L94.

Generelt involverer fremgangsmåten i den foreliggende oppfinnelsen å selektere en spesielt foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- og/eller hypermutasjonsposisjon i en CDR på den tunge eller lette kjeden til et forelderantistoff av interesse, eller antigenbindende del derav, muta-genisere den individuelle posisjonen randomisert (f.eks. med genetiske fremgangsmåter ved anvendelse av et mutagent oligonukleotid for å generere et "minibibliotek" med modifiserte antistoffer) eller mutere en posisjon til spesifikke ønskede aminosyrer, for å identifisere aktivitets-økende aminosyrerester som blir uttrykt, og rense de modifiserte antistoffene (f.eks. i et ikke-fagdisplayverts-system), måle aktiviteten til de modifiserte antistoffene for antigen (f.eks. ved å måle kav-hastigheter med BIAcore-analyse), repetere disse trinnene om nødvendig for andre CDR-posisjoner og kombinere individuelle mutasjoner som har forbedret aktivitet og teste om kombinasjonen(e) genererer et antistoff med enda større aktivitet (f.eks. affinitet eller nøytraliseringsevne) enn forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav.

Derfor, i én utførelse, tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter: a) tilveiebringe et forelderantistoff eller antigenbindende del derav; b) selektere i rekkefølge en 1) foretrukket selektiv mutageneseposisjon, 2) kontaktposisjon eller 3) hypermuta-sjonsposis jon innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon og dermed identifisere en selektert foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermuta-sjonsposis jon; c) mutere nevnte selekterte foretrukne selektive mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav; e) eventuelt repetere trinnene a) til og med d) for minst én annen foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon; f) kombinere i forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, individuelle mutasjoner som er vist å ha forbedret aktivitet, for å danne kombinasjonsantistoffer, eller antigenbindende deler derav; og g) evaluere aktiviteten til kombinasjonsantistoffene, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav;

inntil et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet. Fortrinnsvis har det selekterte antistoffet eller antistoffene en forbedret aktivitet uten tap eller med retensjon av minst ett fordelaktig særtrekk eller egenskap til forelderantistoffet, som beskrevet ovenfor. Det fordelaktige særtrekket eller egenskapen kan bli målt eller observert av den vanlige erfarne fagmann ved å anvende kjente teknikker i faget.

Foretrukne kontaktposisjoner er valgt fra gruppen som består av H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96. Foretrukne hypermutasjonsposisjoner er valgt fra gruppen som består av H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 og L93. Mer foretrukne selektive mutageneseposisjoner er valgt fra gruppen som består av H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 og L94. Spesielt foretrukne kontaktposisjoner er valgt fra gruppen som består av L50 og L94.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter: a) tilveiebringe et forelderantistoff eller antigenbindende del derav; b) selektere en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon; c) mutere nevnte selekterte foretrukne selektive mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon individuelt

til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav;

d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til

forelderantistoffet eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivitetsøkende aminosyrerest;

e) eventuelt repetere trinnene a) til og med d) for minst én annen foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller

hypermutasjonsposisjon;

f) kombinere i forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, to individuelle aktivitetsøkende aminosyrerester

vist å ha forbedret aktivitet, for å danne kombinasjonsantistoffer, eller antigenbindende deler derav; og

g) evaluere aktiviteten til kombinasjonsantistoffene, eller antigenbindende deler derav, med to aktivitetsøkende

aminosyrerester i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav;

inntil et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter: a) tilveiebringe et forelderantistoff eller antigenbindende del derav; b) selektere en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon; c) mutere nevnte selekterte foretrukne selektive mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivitetsøkende aminosyrerest; e) eventuelt repetere trinnene a) til og med d) for minst én annen foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon; f) kombinere i forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, tre individuelle aktivitetsøkende aminosyrerester vist å ha forbedret aktivitet, for å danne kombinasjonsantistoffer, eller antigenbindende deler derav; og g) evaluere aktiviteten til kombinasjonsantistoffene, eller antigenbindende deler derav, med to aktivitetsøkende

Fortrinnsvis erstatter den aktivitetsøkende aminosyreresten aminosyrerester lokalisert i posisjoner valgt fra gruppen som består av H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96.

Etter mutagenese av individuelle selekterte posisjoner kan muterte kloner bli sekvensert for å identifisere hvilke aminosyrerester som har blitt introdusert i den selekterte posisjonen i hver klon. Et lite antall kloner (f.eks. ca.

24) kan bli selektert for sekvensering, som statistisk burde gi 10-15 unike antistoffer, mens større antall kloner (f.eks. mer enn 60) kan bli sekvensert for å sikre at antistoffer med enhver mulige substitusjon i den selekterte posisjonen blir identifisert.

I én utførelse selekteres først kontakt- og/eller hypermutasjonsposisjoner i CDR3-regionene på de tunge og/eller lette kjedene for mutagenese. Imidlertid, for antistoffer som allerede har blitt affinitetsmodnet in vitro med randomisert mutagenese av CDR3-regionene via fagdisplayseleksjon, kan det være fordelaktig å først selektere kontakt-og/eller hypermutasjonsposisjoner i CDR1 eller CDR2 på den tunge og/eller lette kjeden.

I en mer foretrukket utførelse selekteres først foretrukne selektive mutageneseposisjoner i CDR3-regionene på de tunge og/eller lette kjedene for mutagenese. Imidlertid, for antistoffer som allerede har blitt affinitetsmodnet in vitro med randomisert mutagenese av CDR3-regionene via fagdisplayseleksjon, kan det være fordelaktig å først selektere foretrukne selektive mutageneseposisjoner i CDR1 eller CDR2 på den tunge og/eller lette kjeden.

I en annen foretrukket utførelse gjøres optimaliseringen av et selektert antistoff med den selektive mutagenesefremgangsmåten sekvensielt som følger: foretrukne selektive mutageneseposisjoner valgt fra gruppen som består av H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 og L94 muteres først til minst 2 andre aminosyrer hver (fortrinnsvis 5-14 andre aminosyrer) og de resulterende antistoffene karakteriseres for økt affinitet, nøytraliseringsevne (og muligvis også for minst ett annet bevart særtrekk eller egenskap diskutert annensteds). Hvis en mutasjon av en enkel foretrukket selektiv mutageneseposisjon ikke øker affiniteten eller nøytraliseringsevnen i det hele tatt eller tilstrekkelig, og hvis til og med kombinasjonen av flere aktivitetsøkende aminosyrer som erstatter aminosyrer i foretrukne selektive mutageneseposisjoner ikke resulterer i et kombinasjonsantistoff som oppfyller målaktiviteten (inkludert affinitet og/eller nøytraliser-ingsevne), vil ekstra aminosyrerester bli selektert for selektiv mutagenese fra gruppen bestående av H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A og L96 muteres til minst 2 andre aminosyrer hver (fortrinnsvis 5-14 andre aminosyrer) og de resulterende antistoffene karakteriseres for økt affinitet, nøytraliseringsevne (og muligvis også for minst ett annet bevart særtrekk eller egenskap diskutert annensteds) .

Hvis en mutasjon av en enkel aminosyrerest valgt fra gruppen som består av H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A og L96 ikke øker aktiviteten (inkludert affinitet og/eller nøytraliseringsevne) i det hele tatt eller ikke tilstrekkelig, og hvis til og med kombinasjonen av flere aktivitetsøkende aminosyrer som erstatter aminosyrer i de posisjonene ikke resulterer i et kombinasjonsantistoff med målaktiviteten (innbefattende affinitet og/eller målnøytra-liseringsevne), vil ekstra aminosyrerester bli selektert for selektiv mutagenese fra gruppen som består av H33B, H52B, L31A og muteres til minst 2 andre aminosyrer hver (fortrinnsvis 5-14 andre aminosyrer) og de resulterende antistoffene karakteriseres for økt affinitet, nøytraliser-ingsevne (og muligvis også for minst ett annet bevart særtrekk eller egenskap diskutert annensteds).

Det skal bli forstått at den sekvensielle selektive muta-genesef remgangsmåten kan slutte på ethvert av trinnene beskrevet ovenfor så fort som et antistoff med den ønskede aktiviteten (inkludert affinitet og nøytraliseringsevne) har blitt identifisert. Hvis mutagenese av de forhånds-selekterte posisjonene har identifisert aktivitetsøkende aminosyrerester, men kombinasjonsantistoffet fortsatt ikke har målaktiviteten (inkludert affinitet og nøytraliserings-evne) og/eller hvis de identifiserte aktivitetsøkende aminosyrene også affiserer andre ønskede karakteristika og derfor ikke er godkjente, kan de gjenværende CDR-restene bli utsatt for mutagenese (se Del IV).

Fremgangsmåten i den foreliggende oppfinnelsen kan bli anvendt for å bedre aktivitet til et antistoff, eller antigenbindende del derav, for å oppnå en forhåndsbestemt målaktivitet (f.eks. en forhåndsbestemt affinitet og/eller nøytraliseringsevne, og/eller en ønsket egenskap eller særtrekk) .

Derfor tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, for å oppnå en forhåndsbestemt målaktivitet, som innbefatter: a) tilveiebringe et forelderantistoff en antigenbindende del derav; b) selektere en foretrukket selektiv mutageneseposisjon valgt fra gruppen som innbefatter H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 og L94; c) mutere den selekterte foretrukne selektive mutagenese-posisjonen individuelt til minst to andre aminosyrerester for å herved lage et første panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav; d) evaluere aktiviteten til det første panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, for å bestemme om mutasjon av en enkel selektiv mutageneseposisjon produserer et antistoff, eller antigenbindende del derav, med den forhåndsbestemte målaktiviteten eller en delvis målaktivitet; e) kombinere på en trinnvis måte i forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, individuelle mutasjoner som er vist å ha en forbedret aktivitet, for å danne kombi-nas jonsantistof fer, eller antigenbindende deler derav; f) evaluere aktiviteten til kombinasjonsantistoffene, eller antigenbindende deler derav, for å bestemme om kombi-nas jonsantistof fene, eller antigenbindende deler derav, har den forhåndsbestemte målaktiviteten eller en delvis målaktivitet; g) hvis trinnene d) eller f) ikke resulterer i et antistoff, eller antigenbindende del derav, med den forhåndsbestemte målaktiviteten eller resulterer i et antistoff med bare en delvis aktivitet, muteres ekstra aminosyrerester valgt fra gruppen som består av H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A og L96 til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et annet panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav; h) evaluere aktiviteten til det andre panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, for å

bestemme om mutasjon av en enkel aminosyrerest valgt fra gruppen som består av H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A og L96 resulterer i et antistoff, eller antigenbindende del derav, som har den forhåndsbestemte målaktiviteten eller en delvis aktivitet;

i) kombinere på en trinnvis måte i forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, individuelle mutasjoner i trinn g) som er vist å ha en forbedret aktivitet, for å danne kombinasjonsantistoffer, eller antigenbindende deler derav;

j) evaluere aktiviteten til kombinasjonsantistoffene, eller antigenbindende deler derav, for å bestemme om kombi-nas jonsantistof fene, eller antigenbindende deler derav, har den forhåndsbestemte målaktiviteten eller en delvis målaktivitet;

k) hvis trinnene h) eller j) ikke resulterer i et antistoff, eller antigenbindende del derav, med den forhåndsbestemte målaktiviteten eller resulterer i et antistoff med

bare en delvis aktivitet, muteres ekstra aminosyrerester valgt fra gruppen som består av H33B, H52B og L31A til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et tredje panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav; 1) evaluere aktiviteten til det tredje panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, for å bestemme om en mutasjon av en enkel aminosyrerest valgt fra gruppen som består av H33B, H52B og L31A resulterte i et antistoff, eller antigenbindende del derav, med den forhåndsbestemte målaktiviteten eller en delvis aktivitet;

m) kombinere på en trinnvis måte i forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, individuell mutasjon av trinn k) som er vist å ha en forbedret aktivitet, for å danne kombinasjonsantistoffer, eller antigenbindende deler, derav;

Flere mutagenesefremgangsmåter kan bli anvendt, innbefattende sammensetning ved hjelp av PCR, Kunkel (dut-ung-) og tiofosfat (Amersham "Sculptor"-testsett) oligonukleotid-styrt mutagenese.

En rekke vertsekspresjonssystemer kan bli anvendt for å uttrykke de muterte antistoffene, som innbefatter bakteri-elle-, gjær-, baculovirale- og pattedyrekspresjonssystemer (så vel som fagdisplayekspresjonssystemer). Et eksempel på en egnet bakteriell ekspresjonsvektor er pUC119 (Sfi). Andre antistoffekspresjonssystemer er kjent i faget og/eller er beskrevet nedenfor i Del IV.

De modifiserte antistoffene, eller antigenbindende delene derav, produsert med fremgangsmåten i den foreliggende oppfinnelsen kan bli identifisert uten å være avhengig av fagdisplayfremgangsmåter for seleksjon. Derfor er fremgangsmåten i den foreliggende oppfinnelsen spesielt fordelaktig for å bedre aktiviteten til et rekombinant forelderantistoff, eller antigenbindende del derav, som ble fremskaffet med seleksjon i et fagdisplaysystem, men hvis aktivitet ikke kan bli ytterligere forbedret med mutagenese i fagdisplaysystemet.

Derfor tilveiebringer oppfinnelsen i en annen utførelse en fremgangsmåte for å bedre affiniteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter: a) tilveiebringe et rekombinant forelderantistoff, eller antigenbindende del derav; som ble fremskaffet med seleksjon i et fagdisplaysystem, men hvis aktivitet ikke kan bli ytterligere forbedret med mutagenese i nevnte fagdisplaysystem; b) selektere en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon og dermed identifisere en selektert kontakt- eller hypermutasjonsposisjon; c) mutere nevnte selekterte foretrukne selektive mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, og uttrykke nevnte panel i et ikke-fagdisplaysystem; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav; e) eventuelt repetere trinnene b) til og med d) for minst én annen foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon; f) kombinere i forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, individuelle mutasjoner som er vist å ha forbedret aktivitet, for å danne kombinasjonsantistoffer, eller antigenbindende deler derav; og g) evaluere aktiviteten til kombinasjonsantistoffene, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav;

Med tilgjengelige fremgangsmåter er det ikke mulig eller det er ekstremt møysommelig å avlede et antistoff med økt bindingsaffinitet og nøytraliseringsevne og samtidig bevare andre egenskaper eller karakteristika til antistoffene, som diskutert ovenfor. Fremgangsmåten i denne oppfinnelsen kan imidlertid enkelt identifisere slike antistoffer. Antistoffene som er utsatt for fremgangsmåten i denne oppfinnelsen kan komme fra enhver kilde.

Derfor tilveiebringer oppfinnelsen i en annen utførelse en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter: a) tilveiebringe et rekombinant forelderantistoff, eller antigenbindende del derav; b) selektere en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon og dermed identifisere en selektert foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon; c) mutere nevnte selekterte foretrukne selektive mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, og uttrykke nevnte panel i et egnet ekspresjons-system; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivitetsøkende aminosyrerest; e) evaluere panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet

I en foretrukket utførelse er kontaktposisjonene valgt fra gruppen som består av H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96, og den andre egenskapen er valgt fra 1) bevaring av ikke-kryssreaktivitet med andre proteiner eller humane vev, 2) bevaring av epitopegjenkjennelse, dvs. gjenkjenne p40-epitope fortrinnsvis i sammenheng med p70 p40/p35-heterodimeren for å hindre bindingsinterferens fra fri, løselig p40 og/eller 3) lage et antistoff med en sekvens som ligner kimbaneimmunglobulinsekvens.

I en annen foretrukket utførelse er hypermutasjonsposisjonene valgt fra gruppen som består av H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 og L93, og den andre egenskapen er valgt fra 1) bevaring av ikke-kryssreaktivitet med andre proteiner eller humane vev, 2) bevaring av epitopegjenkjennelse, dvs. gjenkjenne p40-epitope fortrinnsvis i sammenheng med p70 p40/p35-heterodimeren for å hindre bindingsinterferens fra fri, løselig p40 og/eller 3) lage et antistoff med en sekvens som ligner kimbaneimmunglobulinsekvens .

I en mer foretrukket utførelse er restene for selektiv mutagenese valgt fra de foretrukne selektive mutageneseposisjonene fra gruppen som består av H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 og L94, og den andre egenskapen er valgt fra 1) bevaring av ikke-kryssreaktivitet med andre proteiner eller humane vev, 2) bevaring av epitopegjenkjennelse, dvs. gjenkjenne p40-epi-tope fortrinnsvis i sammenheng med p70 p40/p35-heterodimeren for å hindre bindingsinterferens fra fri, løselig p40 og/eller 3) lage et antistoff med en sekvens som ligner kimbaneimmunglobulinsekvens.

I en mer foretrukket utførelse er kontaktposisjonene valgt fra gruppen som består av L50 og L94, og den andre egenskapen er valgt fra 1) bevaring av ikke-kryssreaktivitet med andre proteiner eller humane vev, 2) bevaring av epitopegjenkjennelse, dvs. gjenkjenne p40-epitope fortrinnsvis i sammenheng med p70 p40/p35-heterodimeren for å hindre bind ingsinterferens fra fri, løselig p40 og/eller 3) lage et antistoff med en sekvens som ligner kimbaneimmunglobulinsekvens .

Hvis derfor affiniteten til et antistoff for et spesifikt antigen skal bli forbedret, men der fagdisplay (eller relatert system innbefattende ribosomdisplay) -fremgangsmåten ikke lenger er egnet og andre fordelaktige egenskaper eller karakteristika skal bli bevart, kan fremgangsmåten i den foreliggende oppfinnelsen bli anvendt. Derfor tilveiebringer oppfinnelsen i en annen utførelse en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter:

a) tilveiebringe et rekombinant forelderantistoff, eller antigenbindende del derav; som ble fremskaffet med seleksjon i et fagdisplaysystem, men hvis aktivitet ikke kan bli ytterligere forbedret med mutagenese i nevnte fagdisplaysystem; b) selektere en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon og dermed identifisere en selektert foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon; c) mutere nevnte selekterte foretrukne selektive mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, og uttrykke nevnte panel i et ikke-fagdisplaysystem; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivitetsøkende aminosyrerest; e) evaluere panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav, for minst én annen egenskap eller særtrekk, der egenskapen eller særtrekket er én som trenger å bli bevart, inntil et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet og minst én bevart egenskap eller særtrekk i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet. f) eventuelt repetere trinnene a) til og med e) for minst én annen foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon; g) kombinere i forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, minst to individuelle aktivitetsøkende aminosyrerester vist å ha forbedret aktivitet og minst én bevart egenskap eller særtrekk, for å danne kombinasjonsantistoffer, eller antigenbindende deler derav; og h) evaluere aktiviteten til kombinasjonsantistoffene, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav;

inntil et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet og minst én annen bevart egenskap eller særtrekk i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet.

I en mer foretrukket utførelse er kontaktposisjonene valgt fra gruppen som består av L50 og L94, og den andre egenskapen er valgt fra 1) bevaring av ikke-kryssreaktivitet med andre proteiner eller humane vev, 2) bevaring av epitopegjenkjennelse, dvs. gjenkjenne p40-epitope fortrinnsvis i sammenheng med p70 p40/p35-heterodimeren for å hindre bindingsinterferens fra fri, løselig p40 og/eller 3) lage et antistoff med en sekvens som ligner kimbaneimmunglobulinsekvens .

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter: a) tilveiebringe et rekombinant forelderantistoff, eller antigenbindende del derav; som ble fremskaffet med seleksjon i et fagdisplaysystem, men hvis aktivitet ikke kan bli ytterligere forbedret med mutagenese i nevnte fagdisplaysystem; b) selektere en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon og dermed identifisere en selektert kontakt- eller hypermutasjonsposisjon; c) mutere nevnte selekterte foretrukne selektive mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, og uttrykke nevnte panel i et ikke-fagdisplaysystem; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivitetsøkende aminosyrerest; e) evaluere panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet

eller antigenbindende del derav, for minst én annen egenskap eller særtrekk, der egenskapen eller særtrekket er én som trenger å bli bevart, inntil et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet og minst én bevart egenskap eller særtrekk i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter: a) tilveiebringe et rekombinant forelderantistoff, eller antigenbindende del derav; som ble fremskaffet med seleksjon i et fagdisplaysystem, men hvis aktivitet ikke kan bli ytterligere forbedret med mutagenese i nevnte fagdisplaysystem; b) selektere en foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon og dermed identifisere en selektert kontakt- eller hypermutasjonsposisjon; c) mutere nevnte selekterte foretrukne selektive mutageneseposisjoner, kontakt- eller hypermutasjonsposisjon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, og uttrykke nevnte panel i et ikke-fagdisplaysystem; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivitetsøkende aminosyrerest; e) evaluere panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet

eller antigenbindende del derav, for minst én annen egenskap eller særtrekk, der egenskapen eller særtrekket er én som trenger å bli bevart, inntil et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet og minst

én bevart karakteristikk i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet.

f) eventuelt repetere trinnene a) til og med e) i minst én annen foretrukket selektiv mutagenese-, kontakt- eller

hypermutasjonsposisjon; g) kombinere i forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, minst to individuelle aktivitetsøkende aminosyrerester vist å ha forbedret aktivitet og i hvert fall ett annet bevart særtrekk, for å danne kombinasjonsantistoffer, eller antigenbindende deler derav; og h) evaluere aktiviteten til kombinasjonsantistoffene, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav;

IV. Modifiseringer av andre CDR-rester

Alle CDR-rester i et gitt antistoff/antigen-par som er identifisert med enhver måte til å være nødvendige som aktivitetsøkende aminosyrerester og/eller nødvendig direkte eller indirekte for binding til antigenet og/eller for å bevare andre fordelaktige egenskaper eller karakteristika til antistoffet. Slike CDR-rester henvises til som "foretrukne selektive mutageneseposisjoner." Det bør bli nevnt at foretrukne selektive mutageneserester i bestemte tilfeller også kan bli identifisert med andre fremgangsmåter, innbefattende krystallisering av antistoff og antigen sammen og molekylær modellering.

Hvis de foretrukne forsøkene på å identifisere aktivitets-økende aminosyrer som fokuserer på de foretrukne selektive mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjonene beskrevet ovenfor er brukt opp, eller hvis ekstra forbedringer er nødvendig, kan de gjenværende CDR-restene bli modifisert som beskrevet nedenfor. Det skal bli forstått at antistoffet allerede kan være modifisert i en hvilken som helst eller flere kontakt- eller hypermutasjonsposisjoner i henhold til utførelsene diskutert ovenfor, men kan kreve ytterligere forbedringer. Derfor tilveiebringer oppfinnelsen i en annen utførelse en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter: a) tilveiebringe et forelderantistoff eller antigenbindende del derav; b) selektere en aminosyrerest innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon som er forskjellig fra H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96; c) mutere nevnte selekterte posisjon individuelt f.eks. til minst to andre aminosyrerester, for dermed å lage et

mutert antistoff eller et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav;

d) evaluere aktiviteten til det muterte antistoffet eller panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende

deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivi-tetsøkende aminosyrerest;

e) evaluere det muterte antistoffet eller panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i

forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav, for forandringer i minst én annen egenskap eller særtrekk, inntil et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet.

Hvis mutagenese av en enkel rest ikke er tilstrekkelig, kan andre rester bli inkludert; derfor, i en annen utførelse, tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter: a) tilveiebringe et forelderantistoff eller antigenbindende del derav; b) selektere en aminosyrerest innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon som er forskjellig fra H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96; c) mutere nevnte selekterte posisjon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivitetsøkende aminosyrerest; e) repetere trinnene b) til og med d) for minst én annen CDR-posisjon som verken er posisjonen selektert under b) eller en posisjon i H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96; f) kombinere i forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, minst to individuelle aktivitetsøkende aminosyrerester vist å ha forbedret aktivitet, for å danne kom-binas j onsantistof f er, eller antigenbindende deler derav; og g) evaluere aktiviteten til kombinasjonsantistoffene, eller antigenbindende deler derav, med to aktivitetsøkende

aminosyrerester i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav, inntil et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet.

Hvis de foretrukne forsøkene på å identifisere aktivitets-økende aminosyrer som fokuserer på kontakt- eller hypermu-tas j onsposis j onene beskrevet ovenfor er brukt opp, eller hvis ekstra forbedringer er nødvendig og det aktuelle antistoffet ikke kan bli ytterligere optimalisert med mutagenese- og fagdisplay- (eller relatert ribosomdisplay) fremgangsmåter, kan de gjenværende CDR-restene bli modifisert som beskrevet nedenfor. Det skal bli forstått at antistoffet allerede kan være modifisert i en hvilken som helst eller flere foretrukne selektive mutagenese-, kontakt-ener hypermutasjonsposisjoner i henhold til utførelsene diskutert ovenfor, men kan trenge ytterligere forbedringer. Derfor tilveiebringer oppfinnelsen i en annen utførelse en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter: a) tilveiebringe et rekombinant forelderantistoff, eller antigenbindende del derav; som ble fremskaffet med seleksjon i et fagdisplaysystem, men hvis aktivitet ikke kan bli ytterligere forbedret med mutagenese i nevnte fagdisplaysystem; b) selektere en aminosyrerest innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon som er forskjellig fra H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og; c) mutere nevnte selekterte kontakt- eller hypermuta-sjonsposis jon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, og uttrykke nevnte panel i et ikke-fagdisplaysystem; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivitetsøkende aminosyrerest; e) evaluere panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet

Hvis en enkel mutagenese ikke er tilstrekkelig for å øke affiniteten til antistoffet, kan andre rester bli inkludert i mutagenesen. Derfor tilveiebringer oppfinnelsen i en annen utførelse en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter : a) tilveiebringe et forelderantistoff, eller antigenbindende del derav, som ble fremskaffet med seleksjon i et fagdisplaysystem, men hvis aktivitet ikke kan bli ytterligere forbedret med mutagenese i nevnte fagdisplaysystem; b) selektere en aminosyrerest innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon som er forskjellig fra H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96; c) mutere nevnte selekterte posisjon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, og uttrykke i et ikke-fagdisplaysystem; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivitetsøkende aminosyrerest; e) repetere trinnene b) til og med d) for minst én annen posisjon som verken er posisjonen selektert under b) eller en posisjon i H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93 og L94; g) kombinere i forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, minst to individuelle aktivitetsøkende aminosyrerester vist å ha forbedret aktivitet, for å danne kom-binas jonsantistoffer, eller antigenbindende deler derav; og h) evaluere aktiviteten og annen egenskap eller særtrekk til kombinasjonsantistoffene, eller antigenbindende deler

derav, med to aktivitetsøkende aminosyrerester i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav; inntil et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet.

De foretrukne forsøkene på å identifisere aktivitetsøkende aminosyrer som fokuserer på de foretrukne selektive mutagenese-, kontakt- eller hypermutasjonsposisjonene som er beskrevet kan bli brukt opp, eller ekstra forbedringer kan være nødvendig, og det er viktig å bevare andre egenskaper eller karakteristika til antistoffet.

Derfor tilveiebringer oppfinnelsen i en annen utførelse en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, uten å affisere andre karakteristika, som innbefatter: a) tilveiebringe et forelderantistoff eller antigenbindende del derav; b) selektere en aminosyrerest innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon som er forskjellig fra H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96; c) mutere nevnte selekterte posisjon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivitetsøkende aminosyrerest; e) evaluere panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet

eller antigenbindende del derav, for forandringer i minst én annen egenskap eller særtrekk, inntil et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet og annen bevart egenskap eller særtrekk i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet.

Hvis mutagenese av en enkel rest ikke er tilstrekkelig, kan andre rester bli inkludert; derfor, i en annen utførelse, tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter: a) tilveiebringe et forelderantistoff eller antigenbindende del derav; b) selektere en aminosyrerest innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon som er forskjellig fra H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96; c) mutere nevnte selekterte posisjon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivitetsøkende aminosyrerest; e) evaluere panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigendel derav, for forandringer i minst ett annet særtrekk eller egenskap; e) repetere trinnene b) til og med e) for minst én annen CDR-posisjon som verken er posisjonen selektert under b) eller en posisjon i H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96; f) kombinere i forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, minst to individuelle aktivitetsøkende aminosyrerester vist å ha forbedret aktivitet og som ikke affiserer minst én annen egenskap eller særtrekk, for å danne kombinasjonsantistoffer, eller antigenbindende deler derav; og g) evaluere aktiviteten og retensjonen av minst én annen

egenskap eller særtrekk til kombinasjonsantistoffene, eller

antigenbindende deler derav, med to aktivitetsøkende aminosyrerester i forhold til forelderantistoffet eller antigen-

bindende del derav, inntil et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet og minst én annen bevart egenskap eller særtrekk i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet.

Mutagenese av de foretrukne selektive mutageneseposisjons-, kontakt- og hypermutasjonsrestene trenger ikke å ha økt affiniteten til antistoffet tilstrekkelig, mutagenese- og fagdisplayfremgangsmåten (eller relatert ribosomdisplay-fremgangsmåte) trenger ikke lenger å være egnet, og minst ett annet særtrekk eller egenskap til antistoffet skal bli bevart.

Derfor tilveiebringer oppfinnelsen i en annen utførelse en fremgangsmåte for å bedre affiniteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter: a) tilveiebringe et forelderantistoff, eller antigenbindende del derav, som ble fremskaffet med seleksjon i et fagdisplaysystem, men hvis aktivitet ikke kan bli ytterligere forbedret med mutagenese i nevnte fagdisplaysystem; b) selektere en aminosyrerest innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon som er forskjellig fra H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96; c) mutere nevnte selekterte posisjon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, og uttrykke i et ikke-fagdisplaysystem; d) evaluere aktiviteten til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivitetsøkende aminosyrerest; e) evaluere panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet

Hvis mutagenese av en enkel rest ikke er tilstrekkelig, kan andre rester bli inkludert; derfor, i en annen utførelse, tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bedre aktiviteten til et antistoff, eller antigenbindende del derav, som innbefatter: a) tilveiebringe et forelderantistoff, eller antigenbindende del derav, som ble fremskaffet med seleksjon i et fagdisplaysystem, men hvis aktivitet ikke kan bli ytterligere forbedret med mutagenese i nevnte fagdisplaysystem; b) selektere en aminosyrerest innenfor en komplementbestemmende region (CDR) for mutasjon som er forskjellig fra H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96; c) mutere nevnte selekterte posisjon individuelt til minst to andre aminosyrerester for dermed å lage et panel med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, og uttrykke i et ikke-fagdisplaysystem; d) evaluere aktiviteten og retensjonen av minst én annen egenskap eller særtrekk til panelet med muterte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav, og dermed identifisere en aktivitetsøkende aminosyrerest; e) repetere trinnene b) til og med d) for minst én annen CDR-posisjon som verken er posisjonen selektert under b) eller en posisjon i H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 og L96; f) kombinere i forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, minst to individuelle aktivitetsøkende aminosyrerester vist å ha forbedret aktivitet og som ikke affiserer minst én annen egenskap eller særtrekk, for å danne kombinasjonsantistoffer, eller antigenbindende deler derav; og g) evaluere aktiviteten og retensjonen av minst én egenskap eller særtrekk til kombinasjonsantistoffene, eller

antigenbindende deler derav, med to aktivitetsøkende aminosyrerester i forhold til forelderantistoffet eller antigenbindende del derav, inntil et antistoff, eller antigenbindende del derav, med en forbedret aktivitet og minst ett

annet bevart særtrekk eller egenskap i forhold til forelderantistoffet, eller antigenbindende del derav, er fremskaffet.

V. Ekspresjon av antistoffer

Et antistoff, eller antistoffdel, i den foreliggende oppfinnelsen kan bli fremstilt med rekombinant ekspresjon av gener til lett og tung immunglobulinkjede i en vertscelle. For å uttrykke et antistoff rekombinant, trans-fekteres en vertscelle med én eller flere rekombinante ekspresjonsvektorer som inneholder DNA-fragmenter som koder for de lette og tunge immunglobulinkjedene til antistoffet, slik at de lette og tunge kjedene uttrykkes i vertscellen og, fortrinnsvis, sekreres inn i mediet der vertscellene blir kultivert, hvorfra antistoffene kan bli høstet. Standard rekombinante DNA-metodologier anvendes for å oppnå gener til tung og lett antistoffkjede, inkorporere disse genene i rekombinante ekspresjonsvektorer og introdusere vektorene inn i vertsceller, slik som de som er beskrevet i Sambrook, Fritsch og Maniatis (red.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, andre utgave, Cold Spring Harbor, N.Y.,

(1989), Ausubel, F. M. et al., (red.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) og i U.S. patent nr. 4.816.397 av Boss et al.

For å oppnå et DNA-fragment som koder for den variable regionen på den tunge kjeden til Joe 9-villtype eller et Joe 9-villtyperelatert antistoff, ble antistoffer spesifikke for humant IL-12 screenet fra humane biblioteker og mutert, som beskrevet i Del II. Når DNA-fragmenter som koder for Joe 9-villtype eller Joe 9-villtyperelaterte VH- og VL-segmenter er fremskaffet, utføres mutagenese av disse sekvensene med standard fremgangsmåter, som PCR-målstyrt mutagenese (PCR-mediert mutagenese der de muterte nukleotidene inkorporeres i PCR-primerne slik at PCR-produktet inneholder mutasjonene) eller andre målstyrte mutagenesefremgangsmåter. Humane IL-12 antistoffer som hadde et aktivi-tetsnivå og bindingsspesifisitet/affinitet som var fordelaktig, for eksempel J695, ble videre manipulert med standard rekombinante DNA-teknikker, for eksempel for å omdanne genene til den variable regionen til fullengde antistoffkjedegener, til Fab-fragmentgener eller til et scFv-gen. I disse manipuleringene er et VL- eller VH-kodende DNA-fragment funksjonelt koblet til et annet DNA-fragment som koder for et annet protein, slik som en konstant region til et antistoff eller en fleksibel linker. Begrepet "funksjonelt koblet," slik det er anvendt i denne sammenhengen, betyr at de to DNA-fragmentene er koblet slik at aminosyresekvensene kodet av de to DNA-fragmentene forblir i fase.

Det isolerte DNA'et som koder for VH-regionen kan bli omdannet til et gen til fullengde tung kjede ved å koble det VH-kodende DNA'et funksjonelt til et annet DNA-molekyl som koder for konstante regioner på tung kjede (CH1, CH2 og CH3). Gensekvensene til konstante regioner på human tung kjede er kjent i faget (se f.eks. Kabat, E. A. et al.,

(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. utgave, U.S. Department of Health and Human Services, NIH publikasjon nr. 91-3242) og DNA-fragmenter inneholdende disse regionene kan bli fremskaffet med standard PCR-amplifisering. Den konstante regionen på tung kjede kan være en IgGl-, IgG2-, IgG3-, IgG4-, IgA-, IgE-, IgM- eller IgD-konstant region og enhver allotypisk variant deri, som beskrevet av Kabat (Kabat, E. A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. utgave, U.S. Department of Health and Human Services, NIH publikasjon nr. 91-3242), men er mest foretrukket en IgGl- eller IgG4-konstant region. For et gen til den tunge kjeden til Fab-fragment, kan det VH-kodende DNA'et være funksjonelt koblet til et annet DNA-molekyl som bare koder for den konstante regionen CH1 på den tunge kjeden.

Det isolerte DNA'et som koder for VL-regionen kan bli omdannet til et gen til fullengde lett kjede (så vel som et gen til Fab lett kjede) ved å koble det VL-kodende DNA'et funksjonelt til et annet DNA-molekyl som koder for den konstante regionen på lett kjede, CL. Gensekvensene til konstante regioner på humane lette kjeder er kjent i faget (se f.eks. Kabat, E. A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. utgave, U.S. Department of Health and Human Services, NIH publikasjon nr. 91-3242) og DNA-fragmenter inneholdende disse regionene kan bli fremskaffet med standard PCR-amplifisering. Den konstante regionen på den lette kjeden kan være en kappa- eller lambda-konstant region, men er mest foretrukket en lambda-konstant region.

For å lage et scFv-gen, blir de VH— og VL-kodende DNA-fragmentene funksjonelt koblet til et annet fragment som koder for en fleksibel linker, som f.eks. koder for aminosyresekvensen (Gly4-Ser)3, slik at VH- og VL-sekvensene kan bli uttrykt som et sammenhengende enkeltkjedet protein med VL-og VH-regionene koblet med den fleksible linkeren (se f.eks. Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Huston et al., (1988) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 34 8:552-554).

For å uttrykke antistoffene, eller antistoffdelene i oppfinnelsen, blir DNA'er som koder for deler av eller hele lette og tunge kjeder fremskaffet, som beskrevet ovenfor, og satt inn i ekspresjonsvektorer slik at genene blir funksjonelt koblet til transkripsjons- og translasjonskon-trollsekvenser. I denne sammenhengen betyr begrepet "funksjonelt koblet" at et antistoffgen er ligert inn i en vektor slik at transkripsjons- og translasjonskontroll-sekvenser i vektoren har deres tiltenkte funksjon for å regulere transkripsjonen og translasjonen av antistoff-genet. Ekspresjonsvektoren og ekspresjonskontrollsekvensene er valgt å være kompatible med ekspresjonsvertscellen som er anvendt. Genet til lett antistoffkjede og genet til tung antistoffkjede kan bli satt inn i separate vektorer, eller mer vanlig settes begge gener inn i den samme ekspresjonsvektoren. Antistoffgenene settes inn i ekspresjonsvektoren med standard fremgangsmåter (f.eks. ligering av komplementære restriksjonsseter på antistoffgenfragmentet og vektoren, eller rettendeligering hvis ingen restriksjonsseter foreligger). Før innsetning av sekvensene til de J695 eller J695-relaterte lette eller tunge kjedene, kan ekspresjonsvektoren allerede bære sekvenser til konstant region på antistoffet. En fremgangsmåte for å omdanne de J695 eller J695-relaterte VH- og VL-sekvensene til fullengde antistoffgener er for eksempel å sette dem inn i ekspresjonsvektorer som allerede koder for konstante regioner til henholdsvis tung og lett kjede, slik at VH-segmentet er funksjonelt koblet til CH-segmentet(ene) i vektoren og VL- segmentet er funksjonelt koblet til CL-segmentet(ene) i vektoren. I tillegg, eller alternativt, kan den rekombinante ekspresjonsvektoren kode for et signalpeptid som letter sekresjon av antistoffkjeden fra en vertscelle. Antistoffkjedegenet kan bli klonet inn i vektoren slik at signalpeptidet kobles i fase til aminoterminalen til antistof f kjedegenet . Signalpeptidet kan være et immunglobulin-signalpeptid eller et heterologt signalpeptid (dvs. et signalpeptid fra et ikke-immunglobulinprotein).

I tillegg til antistoffkjedegenene, inneholder de rekombinante ekspresjonsvektorene i oppfinnelsen regulatoriske sekvenser som kontrollerer ekspresjonen av antistoffkjedegenene i en vertscelle. Begrepet "regulatorisk sekvens" er ment å innbefatte promotere, enhansere og andre ekspre-sjonskontrollelementer (f.eks. polyadenyleringssignaler) som kontrollerer transkripsjonen eller translasjonen av antistoffkjedegenene. Slike regulatoriske sekvenser er for eksempel beskrevet i Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA

(1990). Det vil bli forstått av fagfolk at designen til ekspresjonsvektoren, innbefattende valget av regulatoriske sekvenser, kan være avhengig av faktorer som valget av vertscellen som skal bli transformert, ønsket proteineks-presjonsnivå, osv. Foretrukne regulatoriske sekvenser for pattedyrvertscelleekspresjon innbefatter virale elementer som styrer høye proteinekspresjonsnivåer i pattedyrceller, slik som promotere og/eller enhansere avledet fra cytomega-lovirus (CMV) (som CMV-promoteren/enhanseren), Simian-virus 40 (SV40) (slik som SV40 promoteren/enhanseren), adenovirus (f.eks. adenovirus sen hovedpromoter (AdMLP)) og polyoma. For videre beskrivelse av virale regulatoriske elementer og sekvenser derav, se f.eks. U.S. patent nr. 5.168.062 av Stinski, U.S. patent nr. 4.510.245 av Bell et al., og U.S. patent nr. 4.968.615 av Schaffner et al., U.S. patent nr. 5.464.758 av Bujard et al. og U.S. patent nr. 5.654.168 av Bujard et al. I tillegg til antistoffkjedegenene og de regulatoriske sekvensene, kan de rekombinante ekspresjonsvektorene i den foreliggende oppfinnelsen inneholde ekstra sekvenser, slik som sekvenser som regulerer replikasjon av vektoren i vertsceller (f.eks. replikasjonsstart) og selekterbare markørgener. Det selekterbare markørgenet letter seleksjon av vertsceller som vektoren har blitt introdusert i (se f.eks. U.S. patent nr. 4.399.216, 4.634.665 og 5.179.017, alle av Axel et al.). Vanligvis gir for eksempel det selekterbare markørgenet resistens for legemidler, slik som G418, hygromycin eller metotrexat, på en vertscelle som vektoren har blitt introdusert i. Foretrukne selekterbare markørgener innbefatter dihydrofolatreduktase (DHFR) -genet (til anvendelse i dhfr<->vertsceller med metotrexat-seleksjon/amplifisering) og neo-genet (for G418-seleksjon).

For ekspresjon av de lette og tunge kjedene, blir ekspresjonsvektoren (e) som koder for de tunge og lette kjedene transfektert inn i en vertscelle med standard teknikker. De ulike formene av begrepet "transfeksjon" er ment å omfatte et bredt spekter av teknikker mye anvendt for introduksjon av eksogent DNA inn i en prokaryot eller eukaryot vertscelle, f.eks. elektroporering, kalsium-fosfat utfel-ling, DEAE-dekstrantransfeksjon og lignende. Selv om det teoretisk er mulig å uttrykke antistoffene i den foreliggende oppfinnelsen i enten prokaryote eller eukaryote vertsceller, er ekspresjon av antistoffer i eukaryote celler, og mest foretrukket pattedyrvertsceller, det mest foretrukne, fordi slike eukaryote celler, og spesielt pattedyrceller, mer sannsynlig enn prokaryote celler vil sette sammen og sekrere et korrekt foldet og immunologisk aktivt antistoff. Foretrukne pattedyrvertsceller for å uttrykke de rekombinante antistoffene i den foreliggende oppfinnelsen innbefatter kinesiske hamstereggstokkceller (CHO-celler) (inkludert dhfr" CHO-celler, beskrevet i Urlaub og Chasin, (1980) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77:4216-4220, anvendt med en DHFR selekterbar markør, f.eks. som beskrevet i R. J. Kaufman og P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), NSO-myelomceller, COS-celler og SP2-celler. Når rekombinante ekspresjonsvektorer som koder for antistoffgener introduseres inn i pattedyrvertsceller, produseres antistoffene ved å dyrke vertscellene for en tidsperiode som er tilstrekkelig for å muliggjøre ekspresjon av antistoffet i vertscellene eller, mer foretrukket, sekresjon av antistoffet inn i kulturmediet der vertscellene dyrkes. Antistoffer kan bli høstet fra kulturmediet ved å anvende standard proteinrensingsfremgangsmåter.

Vertsceller kan også bli anvendt for å produsere deler av intakte antistoffer, slik som Fab-fragmenter eller scFv-molekyler. Det vil bli forstått at variasjoner i fremgangsmåten ovenfor er innen omfanget av den foreliggende oppfinnelsen. For eksempel kan det være fordelaktig å transfektere en vertscelle med DNA som koder for enten den lette eller tunge kjeden (men ikke begge) til et antistoff i den foreliggende oppfinnelsen. Rekombinant DNA-teknologi kan også bli anvendt for å fjerne noe av eller hele DNA'et som koder for én av eller begge de lette og tunge kjedene som ikke er nødvendig for binding til hlL-12. Molekylene som blir uttrykt fra slike forkortede DNA-molekyler er også omfattet med antistoffene i den foreliggende oppfinnelsen. I tillegg kan bifunksjonelle antistoffer bli produsert, der én tung og én lett kjede er et antistoff i oppfinnelsen og den andre tunge og lette kjeden er spesifikke for et annet antigen enn hlL-12 ved å kryssbinde et antistoff i oppfinnelsen til et annet antistoff med standard kjemiske kryss-bindingsfremgangsmåter.

I et foretrukket system for rekombinant ekspresjon av et antistoff, eller antigenbindende del derav, i den foreliggende oppfinnelsen, blir en rekombinant ekspresjonsvektor som koder for både tung og lett antistoffkjede introdusert inn i dhfr<->CHO-celler med kalsiumfosfat-mediert transfeksjon. I den rekombinante ekspresjonsvektoren er hvert av genene til tung og lett antistoffkjede funksjonelt koblet til enhanser/promoter regulatoriske elementer (f.eks. av ledet fra SV40, CMV, adenovirus og lignende, slik som et CMV-enhanser/AdMLP-promoter regulatorisk element eller et SV40-enhanser/AdMLP-promoter regulatorisk element) for å oppnå høye gentranskripsjonsnivåer. Den rekombinante ekspresjonsvektoren har også et DHFR-gen, som muliggjør seleksjon av CHO-celler som har blitt transfektert med vektoren ved å anvende metotrexat-seleksjon/amplifisering. De selekterte transformerte vertscellene kultiveres for å mulig-gjøre ekspresjon av de tunge og lette antistoffkjedene, og intakt antistoff høstes fra kulturmediet. Standard molekylærbiologiteknikker anvendes for å fremstille den rekombinante ekspresjonsvektoren, transfektere vertscellene, selektere for transformanter, kultivere vertscellene og høste antistoffet fra kulturmediet. Antistoffer eller antigenbindende deler derav i den foreliggende oppfinnelsen kan bli uttrykt i et dyr (f.eks. en mus) som er transgent for humane immunglobulingener (se f.eks. Taylor, L. D. et al., (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295). Planteceller kan også bli modifisert for å lage transgene planter som uttrykker antistoffet eller antigenbindende del derav i oppfinnelsen.

I lys av det foregående vedrører et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelsen sammensetninger av nukleinsyre, vektor og vertscelle som kan bli anvendt for rekombinant ekspresjon av antistoffene og antistoffdelene i oppfinnelsen. Fortrinnsvis beskriver oppfinnelsen isolerte nukleinsyrer som koder for CDR'er i J695, eller hele den variable regionen på tung og/eller lett kjede til J695. I én utfør-else beskriver oppfinnelsen derfor en isolert nukleinsyre som koder for en tung antistoffkjede variabel region som koder for J695 tung kjede CDR3 innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:25. Fortrinnsvis koder nukleinsyren, som koder for den variable regionen til tung antistoffkjede, videre for en J695 tung kjede CDR2, innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:27. Mer foretrukket koder nukleinsyren, som koder for den variable regionen til tung antistoffkjede, videre for en J695 tung kjede CDR1, innbe fattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:29. Enda mer foretrukket koder den isolerte nukleinsyren for en tung antistoffkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:31 (hele VH-regionen til J695).

I andre utførelser beskriver oppfinnelsen en isolert nukleinsyre, som koder for en lett antistoffkjede variabel region, som koder for J695 lett kjede CDR3, innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:26. Fortrinnsvis koder nukleinsyren, som koder for den variable regionen til lett antistoffkjede, videre for en J695 lett kjede CDR2, som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:28. Mer foretrukket koder nukleinsyren, som koder for den variable regionen til lett antistoffkjede, videre for en J695 lett kjede CDR1, innbefattende aminosyresekvensen i SEKV ID NR:30. Enda mer foretrukket koder den isolerte nukleinsyren for en lett antistoffkjede variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:32 (hele VL-regionen til J695).

Oppfinnelsen tilveiebringer også rekombinante ekspresjonsvektorer som koder for både en tung og en lett antistoffkjede. For eksempel tilveiebringer oppfinnelsen i én utfør-else en rekombinant ekspresjonsvektor som koder for: a) en tung antistoffkjede med en variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:31; og b) en lett antistoffkjede med en variabel region som innbefatter aminosyresekvensen i SEKV ID NR:32.

Oppfinnelsen tilveiebringer også vertsceller, der én eller flere av de rekombinante ekspresjonsvektorene i oppfinnelsen har blitt introdusert. Fortrinnsvis er vertscellen en pattedyrvertscelle, mer foretrukket er vertscellen en CHO-celle, en NSO-celle eller en COS-celle. Enda videre tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å syntetisere et rekombinant humant antistoff i den foreliggende oppfinn- eisen ved å dyrke en vertscelle i oppfinnelsen i et egnet kulturmedium inntil et rekombinant humant antistoff i oppfinnelsen er syntetisert. Fremgangsmåten kan videre innbefatte å isolere det rekombinante humane antistoffet fra kulturmediet.

VI. Farmasøytiske sammensetninger og farmasøytisk administrering

Antistoffene og antistoffdelene i den foreliggende oppfinnelsen kan bli inkorporert i farmasøytiske blandinger egnet for administrering til et individ. Normalt innbefatter den farmasøytiske blandingen et antistoff eller antistoffdel i oppfinnelsen og en farmasøytisk godkjent bærer. Slik det er anvendt heri, inkluderer "farmasøytisk godkjent bærer" enhver og alle løsningsmidler, dispersjonsmedier, belegg, antibakterielle- og antisopp-agenser, isotone og absorp-sjonsforsinkende agenser og lignende som er fysiologisk kompatible. Eksempler på farmasøytisk godkjente bærere innbefatter én eller flere av vann, saltvann, fosfatbufret saltvann, dekstrose, glyserol, etanol og lignende, så vel som kombinasjoner derav. I mange tilfeller vil det være fordelaktig å inkludere isotone agenser, for eksempel suk-ker, polyalkoholer som mannitol, sorbitol eller natriumklorid i blandingen. Farmasøytisk godkjente bærere kan videre innbefatte mindre mengder av hjelpesubstanser som fuktende eller emulgerende midler, konserveringsmidler eller buffere, som øker holdbarheten eller effektiviteten til antistoffet eller antistoffdelen.

Antistoffene og antistoffdelene i den foreliggende oppfinnelsen kan bli inkorporert i en farmasøytisk blanding egnet for parenteral administrering. Fortrinnsvis vil antistoffet eller antistoffdelene bli fremstilt som en injiserbar løs-ning inneholdende 0,1-250 mg/ml antistoff. Den injiserbare løsningen kan være sammensatt av enten en flytende eller frysetørket doseform i et flint- eller rav-rør, ampulle eller forhåndsfylt sprøyte. Bufferen kan være L-histidin

(1-50 mM), optimalt 5-10 mM, ved pH 5,0 til 7,0 (optimalt pH 6,0). Andre egnede buffere innbefatter, men er ikke begrenset til, natriumsuksinat, natriumsitrat, natriumfosfat eller kaliumfosfat. Natriumklorid kan bli anvendt for å modifisere toksisiteten til løsningen ved en konsentrasjon på 0-300 mM (optimalt 150 mM for en flytende doseform). Midler som gir beskyttelse under frysing kan være inkludert for en frysetørket doseform, først og fremst 0-10 % sukrose (optimalt 0,5-1,0 %). Andre egnede midler som gir beskyttelse under frysing innbefatter trenhalose og laktose. Agenser som bidrar til å gi volum kan bli inkludert for en frysetørket doseform, først og fremst 1-10 % mannitol (optimalt 2-4 %). Stabilisatorer kan bli anvendt i både flytende og frysetørkede doseformer, først og fremst 1-50 mM L-Metionin (optimalt 5-10 mM). Andre egnede agenser som bidrar til å gi volum innbefatter glysin, arginin, kan bli inkludert som 0-0,05 % polysorbat-80 (optimalt 0,005-0,01 %). Ytterligere overflateaktive agenser innbefatter, men er ikke begrenset til, polysorbat 20 og BRIJ overflateaktive agenser.

I en foretrukket utførelse innbefatter den farmasøytiske blandingen antistoffet ved en dose på ca. 0,01 mg/kg - 10 mg/kg. Mer foretrukne doser av antistoffet innbefatter 1 mg/kg administrert annen hver uke eller 0,3 mg/kg administrert ukentlig.

Blandingene i den foreliggende oppfinnelsen kan være i mange former. Disse innbefatter for eksempel flytende-, halvfaste- og faste doseformer, slik som væskeløsninger (f.eks. injiserbare og usmeltelige løsninger), dispersjoner eller suspensjoner, tabletter, piller, pulvere, liposomer og stikkpiller. Den foretrukne formen er avhengig av den tenkte administreringsmåten og terapeutiske anvendelsen. Typisk foretrukne blandinger er i form av injiserbare eller usmeltelige løsninger, slik som blandinger som ligner på de anvendt for passiv immunisering av mennesker med andre antistoffer. Den foretrukne administreringsmåten er paren teral (f.eks. intravenøs, subkutan, intraperitoneal og in-tr amu sku lær) . I en foretrukket utførelse administreres antistoffet med intravenøs infusjon eller injeksjon. I en annen foretrukket utførelse administreres antistoffet med intramuskulær eller subkutan injeksjon.

Terapeutiske blandinger må vanligvis være sterile og sta-bile under produksjon og lagring. Blandingen kan bli formulert som en løsning, mikroemulsjon, dispersjon, liposom eller annen ordnet struktur egnet for høy legemiddelkonsen-trasjon. Sterile, injiserbare løsninger kan bli fremstilt ved å inkorporere den aktive forbindelsen (dvs. antistoff eller antistoffdel) i den nødvendige mengden i et passende løsningsmiddel med én eller en kombinasjon av bestanddeler spesifisert ovenfor, etter behov, etterfulgt av steril filtrering. Generelt fremstilles dispersjoner ved å inkorporere den aktive forbindelsen i et sterilt bindemiddel som inneholder et basisk dispersjonsmedium og de andre nød-vendige bestanddelene fra de spesifisert ovenfor. Med hensyn til sterile, frysetørkede pulvere for fremstillingen av sterile, injiserbare løsninger, er de foretrukne fremstill-ingsfremgangsmåtene vakuum- og spraytørking som gir et pul-ver med den aktive bestanddelen samt enhver ekstra ønsket bestanddel fra en tidligere sterilfiltrert løsning derav. Den passende flytende tilstanden til en løsning kan for eksempel bli opprettholdt ved anvendelse av et "dekkemid-del" som lecitin, ved opprettholdelse av den nødvendige partikkelstørrelsen i tilfelle dispersjon og ved anvendelse av overflateaktive agenser. Forlenget absorpsjon av injiserbare blandinger kan komme i stand ved å inkludere en agens som forsinker absorpsjon, som for eksempel monostea-ratsalter og gelatin, i blandingen.

Antistoffene og antistoffdelene i den foreliggende oppfinnelsen kan bli administrert med mange fremgangsmåter kjent i faget, selv om den foretrukne administreringsmåten for mange terapeutiske anvendelser er subkutan injeksjon, in-travenøs injeksjon eller infusjon. Som vil bli forstått av den erfarne fagmann, vil administreringsmåten variere avhengig av de ønskede resultatene. I bestemte utførelser kan den aktive forbindelsen bli fremstilt med en bærer som vil beskytte forbindelsen mot rask frigjøring, slik som en kontrollert frigjøringsformulering, som innbefatter implan-tater, transdermale plastre og mikroinnkapslede avlever-ingssystemer. Biodegraderbare, biokompatible polymerer kan bli anvendt, som etylenvinylacetat, polyanhydrider, poly-glykolsyre, kollagen, polyortoestere og polymelkesyre. Mange fremgangsmåter for fremstillingen av slike formuler-inger er patenterte eller generelt kjent for fagfolk. Se f.eks. "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems," J. R. Robinson, red., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

I bestemte utførelser kan et antistoff eller antistoffdel i den foreliggende oppfinnelsen bli administrert oralt, for eksempel med et inert fortynningsmiddel eller en fordøye-lig, spiselig bærer. Forbindelsen (og andre bestanddeler, om ønsket) kan også bli innkapslet i gelatinkapsel med hardt eller mykt skall, sammenpresset til tabletter eller inkorporert direkte i individets diett. For oral terapeutisk administrering kan forbindelsene bli inkorporert med bindemidler og anvendt i form av svelgbare tabletter, buk-kale tabletter, pastiller, kapsler, eliksirer, suspensjoner, siruper, kjeks ("wafers") og lignende. For å administrere en forbindelse i den foreliggende oppfinnelsen med annet enn parenteral administrering, kan det være nødvendig å dekke forbindelsen med, eller administrere forbindelsen sammen med, et materiale som hindrer dens inaktivering.

Supplementerende aktive forbindelser kan også bli inkorporert i blandingene. I bestemte utførelser er et antistoff eller antistoffdel i den foreliggende oppfinnelsen formulert sammen med og/eller administrert sammen med én eller flere ekstra terapeutiske agenser som er egnet til behandling av forstyrrelser der IL-12 aktivitet er skadelig. For eksempel kan et anti-hIL-12 antistoff eller antistoffdel i den foreliggende oppfinnelsen bli formulert sammen og/eller administrert sammen med ett eller flere ekstra antistoffer som binder andre mål (f.eks. antistoffer som binder andre cytokiner eller som binder celleoverflatemolekyler). Videre kan ett eller flere antistoffer i den foreliggende oppfinnelsen bli anvendt i kombinasjon med to eller flere av de foregående terapeutiske agensene. Slike kombinasjonstera-pier kan fordelaktig anvende lavere doser av de admini-strerte terapeutiske agensene, og unngår dermed mulig tok-sisitet eller komplikasjoner assosiert med de ulike monoterapiene. Når antistoffene i den foreliggende oppfinnelsen anvendes som del av en kombinasjonsterapi, vil det bli forstått av den erfarne praktiserende legen at en lavere antistoffdose kan være fordelaktig enn når antistoffet administreres alene til et individ (f.eks. kan en syner-gistisk terapeutisk effekt bli oppnådd gjennom anvendelsen av kombinasjonsterapi som, i sin tur, muliggjør anvendelse av en lavere dose av antistoffet for å oppnå den ønskede terapeutiske effekten).

Interleukin 12 spiller en kritisk rolle i patologien assosiert med mange sykdommer som involverer immun- og inflammatoriske elementer. Disse sykdommene innbefatter, men er ikke begrenset til, revmatoid artritt, osteoartritt, juvenil kronisk artritt, Lyme-artritt, psoriasisartritt, reaktiv artritt, spondylartropati, systemisk lupus erythematosus, Crohns sykdom, ulcerøs kolitt, inflammatorisk tarmsykdom, insulinavhengig diabetes mellitus, tyroeiditt, astma, allergiske sykdommer, psoriasis, sklerodermatitt, atopisk dermatitt, transplantat-mot-vert-reaksjon, organtransplan-tatavstøting, akutt eller kronisk immunsykdom assosiert med organtransplantasjon, sarkoidose, aterosklerose, dissemi-nert intravaskulær koagulasjon, Kawasakis sykdom, Graves sykdom, nefrotisk syndrom, kronisk tretthetssyndrom, Wegeners granulomatose, Henoch-Schonleins purpura, mikroskopisk vaskulitt i nyrene, kronisk aktiv hepatitt, uveitt, septisk sjokk, toksisk sjokksyndrom, septisk syndrom, kakeksi, infeksjonssykdommer, parasittsykdommer, ervervet immunsviktsyndrom, akutt transversen myelitt, Huntingtons chorea, Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, slag, primær biliær cirrhose, hemolytisk anemi, maligniteter, hjertelam-melse, myokardinfarkt, Addisons sykdom, sporadisk, polyglandulær defekt type I og polyglandulær defekt type II, Schmidts syndrom, akutt lungesviktsyndrom, alopesi, alopesi areata, seronegativ artropati, artropati, Reiters sykdom, psoriasisartropati, ulcerøs kolisk artropati, enteropatisk synovitt, klamydia, yersinia- og salmonella-assosiert artropati, spondylartropati, ateromatøs sykdom/arteriosklerose, atopisk allergi, autoimmun bulløs sykdom, pemfigus vulgaris, pemfigus foliaceus, pemfigoid, lineær IgA-sykdom, autoimmun hemolytisk anemi, Coombs positive hemolytiske anemi, ervervet pernisiøs anemi, juvenil pernisiøs anemi, myalgisk encefalitt/Royal Free-sykdom, kronisk mukokutan kandidose, kjempecellearteritt, primærsklerosehepatitt, kryptogen autoimmun hepatitt, ervervet immunsviktsyndrom, ervervet immunsviktsrelaterte sykdommer, hepatitt C, vanlig variert immunsvikt (vanlig variabel hypogammaglobulinemi), dilaterende kardiomyopati, infertilitet hos kvinner, eggstokksvikt, prematur eggstokksvikt, fibrotisk lungesykdom, kryptogen fibrosealveolitt, post-inflammatorisk interstitiell lungesykdom, interstitiell pneumoni, bindevevssykdomsassosiert interstitiell lungesykdom, blandet bindevevssykdomsassosiert lungesykdom, systemisk skleroseassosiert interstitiell lungesykdom, revmatoid artrittassosiert interstitiell lungesykdom, systemisk lupus erythematosus-assosiert lungesykdom, derma-tomyositt/polymyositt-assosiert lungesykdom, Sjogrens syk-domsassosierte lungesykdom, ankyloserende spondylitt-assosiert lungesykdom, vaskulittisk diffus lungesykdom, hemo-siderose-assosiert lungesykdom, legemiddelindusert interstitiell lungesykdom, strålefibrose, oblitererende bronkio-litt, kronisk eosinofil lungebetennelse, lymfocyttisk infiltrativ lungesykdom, postinfeksiøs interstitiell lungesykdom, giktartritt, autoimmun hepatitt, type-1 autoimmun hepatitt (klassisk autoimmun eller lupoid hepatitt), type-2 autoimmun hepatitt (anti-LKM antistoffhepatitt), autoimmun- mediert hypoglykemi, type B insulinresistens med svart akantose, hypoparatyreoidisme, akutt immunsykdom assosiert med organtransplantasjon, kronisk immunsykdom assosiert med organtransplantasjon, osteoartrose, primærsklerosekolan-gitt, idiopatisk levkopeni, autoimmun nøytropeni, renal sykdom NOS, glomerulonefritt, mikroskopisk vasulitt av nyrene, Lyme-sykdom, lupus erythematosus discoides, idiopatisk mannlig infertilitet eller NOS, sædcelleautoimmunitet, multippel sklerose (alle undertyper), insulinavhengig diabetes mellitus, sympatisk oftalmi, lungehypertensjon sekundært til bindevevssykdom, Goodpastures syndrom, pulmo-nal manifestasjon av polyarteritt nodosa, akutt revmatisk feber, revmatoid spondylitt, Stills sykdom, systemisk sklerose, Takayasus sykdom/arteritt, autoimmun trombocytopeni, idiopatisk trombocytopeni, autoimmun skjoldbrusksykdom, hypertyreoidisme, struma autoimmun hypotyreoidisme (Hashimotos struma), atrofisk autoimmun hypotyreoidisme, primært myksødem, fakogen uveitt, primært vaskulitt og vitiligo. De humane antistoffene og antistoffdelene i den foreliggende oppfinnelsen kan bli anvendt for å behandle autoimmune sykdommer, spesielt de som er assosiert med inflammasjon, innbefattende revmatoid spondylitt, allergi, autoimmun diabetes og autoimmun uveitt.

Fortrinnsvis anvendes antistoffene i den foreliggende oppfinnelsen, eller antigenbindende deler derav, til behandling av revmatoid artritt, Crohns sykdom, multippel sklerose, insulinavhengig diabetes mellitus og psoriasis, som beskrevet i mer detalj i Del VII.

Et humant antistoff, eller antistoffdel, i den foreliggende oppfinnelsen kan også bli administrert med én eller flere ekstra terapeutiske agenser som er egnet til behandlingen av autoimmune- og inflammatoriske sykdommer.

Antistoffer i den foreliggende oppfinnelsen, eller antigenbindende deler derav, kan bli anvendt alene eller i kombinasjon for å behandle slike sykdommer. Det skal bli for stått at antistoffene i den foreliggende oppfinnelsen, eller antigenbindende del derav, kan bli anvendt alene eller i kombinasjon med en ekstra agens, f.eks. en terapeutisk agens, der nevnte ekstra agens er selektert av den erfarne fagmann for dens tenkte formål. For eksempel kan den ekstra agensen være en terapeutisk agens kjent i faget som egnet for behandling av sykdommen eller tilstanden som blir behandlet med antistoffet i den foreliggende oppfinnelsen. Den ekstra agensen kan også være en agens som gir den terapeutiske blandingen en fordelaktig egenskap, f.eks. en agens som påvirker viskositeten til blandingen.

Det skal videre bli forstått at kombinasjonene som skal bli inkludert i den foreliggende oppfinnelsen er de kombinasjonene som er egnet for deres tilsiktede formål. Agensene beskrevet nedenfor er illustrative for formålene og er ikke ment å være begrensende. Kombinasjonene som er en del av denne oppfinnelsen kan være antistoffene i den foreliggende oppfinnelsen og minst én ekstra agens valgt fra listene nedenfor. Kombinasjonen kan også innbefatte mer enn én ekstra agens, f.eks. to eller tre ekstra agenser hvis kombinasjonen er slik at den lagde blandingen kan ha dens tilsiktede funksjon.

Foretrukne kombinasjoner er ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler, som også er henvist til som NSAID'er, som innbefatter legemidler som ibuprofen. Andre foretrukne kombinasjoner er kortikosteroider innbefattende prednisolon; de velkjente bivirkningene av steroidbruk kan bli redusert eller til og med eliminert ved å gradvis redusere steroid-dosen som er nødvendig når pasienter behandles i kombinasjon med anti-IL-12 antistoffene i denne oppfinnelsen. Ikke-begrensende eksempler på terapeutiske agenser for revmatoid artritt som et antistoff, eller antistoffdel, i den foreliggende oppfinnelsen kan bli kombinert med innbefatter følgende: cytokinsuppressive antiinflammatoriske legemidler (CSAID'er); antistoffer til eller antagonister av andre humane cytokiner eller vekstfaktorer, for eksempel TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF og PDGF. Antistoffer i den foreliggende oppfinnelsen, eller antigenbindende deler derav, kan bli kombinert med antistoffer til celleoverflatemolekyler som CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90 eller deres ligander innbefattende CD154 (gp39 eller CD40L).

Foretrukne kombinasjoner av terapeutiske agenser kan interferere på ulike punkter i den autoimmune- og påfølgende inflammatoriske kaskaden; foretrukne eksempler innbefatter TNF-antagonister som kimæriske, humaniserte eller humane TNF-antistoffer, D2E7, (U.S. søknad serienr. 08/599.226, innlevert 9. februar, 1996), cA2 (Remicade™), CDP 571, anti-TNF antistoffragmenter (f.eks. CDP870) og løselige p55 eller p75 TNF-reseptorer, derivater derav, (p75TNFRIgG (Enbrel™) eller p55TNFRIgG (Lenercept), løselig IL-13 reseptor (sIL-13) og også TNFa-omdannende enzym (TACE) -inhibitorer; på liknende måte kan IL-1 inhibitorer (f.eks. interleukin-l-omdannende enzyminhibitorer, som Vx740, eller IL-1RA osv.) være effektive av samme grunn. Andre foretrukne kombinasjoner innbefatter Interleukin 11, anti-P7s og p-selektinglykoproteinligand (PSGL). Ytterligere en annen foretrukket kombinasjon er andre nøkkelspillere i den autoimmune responsen som kan virke parallelt med, avhengig av eller sammen med IL-12 funksjon; spesielt foretrukket er IL-18 antagonister innbefattende IL-18 antistoffer eller løselige IL-18 reseptorer, eller IL-18 bindingsproteiner. Det har blitt vist at IL-12 og IL-18 har overlappende, men forskjellige, funksjoner og en kombinasjon av antagonister til begge to kan være mest effektiv. Ytterligere en annen foretrukket kombinasjon er ikke-depleterende anti-CD4 inhibitorer. Enda andre foretrukne kombinasjoner innbefatter antagonister av den samstimulatoriske signalveien CD80 (B7.1) eller CD86 (B7.2) som inkluderer antistoffer, løselige reseptorer eller antagonistiske ligander. Antistoffene i den foreliggende oppfinnelsen, eller antigenbindende deler derav, kan også bli kombinert med agenser, som metotrexat, 6-MP, azatioprinsulfasalazin, mesala-zin, olsalazinklorokinin/hydroksyklorokin, pencillamin, aurotiomalat (intramuskulær og oral), azatioprin, kokicin, kortikosteroider (oralt, inhalert og lokal injeksjon), beta-2 adrenoreseptoragonister (salbutamol, terbutalin, salmeteral), xantiner (teofyllin, aminofyllin), kromo-glykat, nedokromil, ketotifen, ipratropium og oksitropium, syklosporin, FK506, rapamycin, mykofenolatmofetil, leflunomid, NSAID'er, for eksempel ibuprofen, kortikosteroider som prednisolon, fosfodiesteraseinhibitorer, adensosinagonister, antitrombotiske agenser, komplementinhibitorer, adrenerge agenser, agenser som interfererer med signalisering av proinflammatoriske cytokiner som TNFa eller IL-1 (f.eks. IRAK, NIK, IKK, p38 eller MAP-kinaseinhibitorer), IL-ip omdannende enzyminhibitorer (f.eks. Vx740), anti-P7s, p-selektinglykoproteinligand (PSGL), TNFa-omdannende enzym (TACE) -inhibitorer, inhibitorer av T-cellesignalisering slik som kinaseinhibitorer, metalloproteinaseinhibitorer, sulfasalazin, azatioprin, 6-merkaptopuriner, angiotensinomdannende enzyminhibitorer, løselige cytokinreseptorer og derivater derav (f.eks. løselige p55 eller p75 TNF-reseptorer og derivatene p75TNFRIgG (Enbrel™) og p55TNFRIgG (Lenercept), sIL-lRI, sIL-lRII, sIL-6R, løselig IL-13 reseptor (sIL-13)) og antiinflammatoriske cytokiner (f.eks. IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 og TGFP). Foretrukne kombinasjoner innbefatter metotrexat eller leflunomid, mens de innbefatter syklosporin i moderate eller alvorlige tilfeller med revmatoid artritt.

Ikke-begrensende eksempler på terapeutiske agenser for inflammatorisk tarmsykdom, som et antistoff eller antistoffdel i den foreliggende oppfinnelsen kan bli kombinert med, innbefatter følgende: budenosid; epidermal vekstfaktor; kortikosteroider; syklosporin, sulfasalazin; aminosalisylater; 6-merkaptopurin; azatioprin; metronidazol; lipoksy-genaseinhibitorer; mesalamin; olsalazin; balsalazid; anti- oksidanter; tromboksaninhibitorer; IL-1 reseptorantagonist-er; anti-IL-ip monoklonale antistoffer; anti-IL-6 monoklonale antistoffer; vekstfaktorer; elastaseinhibitorer; pyridinyl-imidazol forbindelser; antistoffer til eller antagonister av andre humane cytokiner eller vekstfaktorer, for eksempel TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF og PDGF. Antistoffer i den foreliggende oppfinnelsen, eller antigenbindende deler derav, kan bli kombinert med antistoffer til celleoverflatemolekyler som CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 eller deres ligander. Antistoffene i den foreliggende oppfinnelsen, eller antigenbindende deler derav, kan også bli kombinert med agenser, som metotrexat, syklosporin, FK506, rapamycin, mykofenolatmofetil, leflunomid, NSAID'er, for eksempel ibuprofen, kortikosteroider som prednisolon, fosfodiesteraseinhibitorer, adenosinagonister, antitrombotiske agenser, komplementinhibitorer, adrenerge agenser, agenser som interfererer med signalisering av proinflammatoriske cytokiner som TNFa eller IL-1 (f.eks.

IRAK, NIK, IKK, p38 eller MAP-kinaseinhibitorer), IL-ip omdannende enzyminhibitorer (f.eks. Vx740), anti-P7s, p-selektinglykoproteinligand (PSGL), TNFa-omdannende enzym-inhibitorer, inhibitorer av T-cellesignalisering slik som kinaseinhibitorer, metalloproteinaseinhibitorer, sulfasalazin, azatioprin, 6-merkaptopuriner, angiotensinomdannende enzyminhibitorer, løselige cytokinreseptorer og derivater derav (f.eks. løselige p55 eller p75 TNF-reseptorer, sIL-1RI, sIL-lRII, SIL-6R, løselig IL-13 reseptor (sIL-13)) og antiinflammatoriske cytokiner (f.eks. IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 og TGFp).

Foretrukne eksempler på terapeutiske agenser for Crohns sykdom, som et antistoff eller en antigenbindende del kan bli kombinert med, innbefatter følgende: TNF-antagonister, for eksempel anti-TNF antistoffer, D2E7 (U.S. søknad serienr. 08/599.226, innlevert 9. februar, 1996), cA2 (Remicade™), CDP 571, anti-TNF antistoffragmenter (f.eks. CDP870), TNFR-Ig konstruksjoner (p75TNFRIgG (Enbrel™) og p55TNFRIgG (Lenercept)), anti-P7s, p-selektinglykoproteinligand (PSGL), løselig IL-13 reseptor (sIL-13) og PDE4-inhibitorer. Antistoffer i den foreliggende oppfinnelsen, eller antigenbindende deler derav, kan bli kombinert med kortikosteroider, for eksempel budenosid og deksametason. Antistoffer i den foreliggende oppfinnelsen, eller antigenbindende deler derav, kan også bli kombinert med agenser som sulfasalazin, 5-aminosalisylsyre og olsalazin, og agenser som interfererer med syntese eller funksjon av proinflammatoriske cytokiner som IL-1, for eksempel IL-ip omdannende enzyminhibitorer (f.eks. Vx740) og IL-lra. Antistoffer i den foreliggende oppfinnelsen, eller antigenbindende del derav, kan også bli anvendt med inhibitorer av T-cellesignalisering, for eksempel tyrosinkinaseinhibitorer 6-merkaptopuriner. Antistoffer i den foreliggende oppfinnelsen, eller antigenbindende deler derav, kan bli kombinert med IL-11.

Ikke-begrensende eksempler på terapeutiske agenser for multippel sklerose, som et antistoff eller antistoffdel i den foreliggende oppfinnelsen kan bli kombinert med, innbefatter følgende: kortikosteroider; prednisolon; metylprednisolon; azatioprin; syklofosfamid; syklosporin; metotrexat; 4-aminopyridin; tizanidin; interferon-pia (Avonex; Biogen); interferon-pib (Betaseron; Chiron/Berlex); kopolymer 1 (Cop-1; kopakson; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); hyperbart oksygen; intravenøst immunglobulin; klabribin; antistoffer til eller antagonister av andre humane cytokiner eller vekstfaktorer, for eksempel TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF og PDGF. Antistoffer i den foreliggende oppfinnelsen, eller antigenbindende deler derav, kan bli kombinert med antistoffer til celleoverflatemolekyler som CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86 og CD90 eller deres ligander. Antistoffene i den foreliggende oppfinnelsen, eller antigenbindende deler derav, kan også bli kombinert med agenser som metotrexat, syklosporin, FK506, rapamycin, mykofenolatmofetil, leflunomid, NSAID'er, for eksempel ibuprofen, kortikosteroider som prednisolon, fosfodiesteraseinhibitorer, adensosinagonister, antitrombotiske agenser, komplementinhibitorer, adrenerge agenser, agenser som interfererer med signalisering av proinflammatoriske cytokiner som TNFa eller IL-1 (f.eks. IRAK, NIK, IKK, p38 eller MAP-kinaseinhibitorer), IL-ip omdannende enzyminhibitorer (f.eks. Vx740), anti-P7s, p-selektinglykoproteinligand (PSGL), TACE-inhibitorer, inhibitorer av T-cellesignalisering slik som kinaseinhibitorer, metalloproteinaseinhibitorer, sulfasalazin, azatioprin, 6-merkaptopuriner, angiotensinomdannende enzyminhibitorer, løselige cytokinreseptorer og derivater derav (f.eks. løselige p55 eller p75 TNF-reseptorer, sIL-lRI, sIL-lRII, SIL-6R, løselig IL-13 reseptor (sIL-13)) og antiinflammatoriske cytokiner (f.eks. IL-4, IL-10, IL-13 og TGFp).

Foretrukne eksempler på terapeutiske agenser for multippel sklerose, som antistoffet eller antigenbindende del derav kan bli kombinert med, innbefatter interferon-p, for eksempel IFNpia og IFNpib; kopakson, kortikosteroider, IL-1 inhibitorer, TNF-inhibitorer og antistoffer til CD40-ligand og CD80.

De farmasøytiske blandingene i den foreliggende oppfinnelsen kan innbefatte "en terapeutisk effektiv mengde" eller en "profylaktisk effektiv mengde" av et antistoff eller antistoffdel av oppfinnelsen. En "terapeutisk effektiv mengde" henviser til en mengde som er effektiv, ved doser og for tidsperioder som er nødvendige, for å oppnå det ønskede terapeutiske resultatet. En terapeutisk effektiv mengde av antistoffet eller antistoffdelen kan variere i henhold til faktorer som sykdomstilstanden, alderen, kjøn-net og vekten til individet og evnen antistoffet eller antistoffdelen har til å utløse en ønsket respons i individet. En terapeutisk effektiv mengde er også en mengde der enhver toksisk eller skadelig effekt av antistoffet eller antistoffdelen blir overskygget av de terapeutisk gunstige effektene. En "profylaktisk effektiv mengde" henviser til en mengde som er effektiv, ved doser og for tidsperioder som er nødvendige, for å oppnå det ønskede profylaktiske resultatet. Normalt, siden en profylaktisk dose blir anvendt i individer i forkant av eller på et tidlig sykdoms-stadium, vil den profylaktisk effektive mengden være mindre enn den terapeutisk effektive mengden.

Dosedietter kan bli justert for å gi den optimale ønskede responsen (f.eks. en terapeutisk eller profylaktisk respons) . For eksempel kan en enkel bolus bli administrert, flere oppdelte doser kan bli administrert over tid eller dosen kan bli redusert eller økt proporsjonalt etter behov i den terapeutiske situasjonen. Det er spesielt fordelaktig å formulere parenterale blandinger i doseenhetsform for å lette administreringen og ensartetheten til dosen. Doseenhetsform, slik det er anvendt heri, henviser til fysisk atskilte enheter egnet som enkle doser for pattedyrindi-videne som skal bli behandlet; der hver enhet inneholder en forhåndsbestemt mengde av aktiv forbindelse beregnet til å fremkalle den ønskede terapeutiske effekten sammen med den nødvendige farmasøytiske bæreren. Spesifiseringen for dose-enhetsf ormene i den foreliggende oppfinnelsen er diktert av og direkte avhengig av (a) de unike karakteristikaene til den aktive forbindelsen og den spesielle terapeutiske eller profylaktiske effekten som skal bli oppnådd og (b) de naturlige begrensningene i faget for å fremstille en slik aktiv forbindelse for behandling av sensitivitet i individer.

Et eksempel på et ikke-begrensende område for en terapeutisk eller profylaktisk effektiv mengde av et antistoff eller antistoffdel i den foreliggende oppfinnelsen er 0,01-20 mg/kg, mer foretrukket 1-10 mg/kg, til og med mer foretrukket 0,3-1 mg/kg. Det skal bli nevnt at doseverdier kan variere med typen og alvorlighetsgraden av tilstanden som skal bli lindret. Videre skal det bli forstått at spesifikke dosedietter for ethvert spesielt individ skal bli justert over tid i henhold til individuelle behov og den profesjonelle vurderingen til personen som administrerer eller veileder administreringen av blandingene, og at dose-områder som er fremlagt heri bare er eksempler og ikke er ment å begrense omfanget eller praktiseringen av den krevde blandingen.

VII. Anvendelser av antistoffene i oppfinnelsen

På grunn av deres evne til å binde til hlL-12, kan anti-hIL-12 antistoffene, eller deler derav, i den foreliggende oppfinnelsen bli anvendt for å detektere hlL-12 (f.eks. i en biologisk prøve som serum eller plasma) ved å anvende en konvensjonell immuntest, slik som en enzymkoblet immunsor-berende test (ELISA), en radioimmuntest (RIA) eller vevim-munhistokjemi. Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for å detektere hlL-12 i en biologisk prøve, som innbefatter å la en biologisk prøve komme i kontakt med et antistoff, eller antistoffdel, i oppfinnelsen og detektere enten antistoffet (eller antistoffdel) bundet til hlL-12 eller ubundet antistoff (eller antistoffdel), for dermed å detektere hlL-12 i den biologiske prøven. Antistoffet merkes direkte eller indirekte med en detekterbar substans for å lette deteksjon av det bundne eller ubundne antistoffet. Egnede detekterbare substanser inkluderer ulike enzymer, prostetiske grupper, fluorescerende materialer, luminescerende materialer og radioaktive materialer. Eksempler på egnede enzymer innbefatter pepperrotperoksidase, alkalisk fosfatase, p-galaktosidase eller acetylkolinesterase; eksempler på egnede prostetiske gruppekomplekser innbefatter streptavidin/biotin og avidin/biotin; eksempler på egnede fluorescerende materialer inkluderer umbelliferon, fluore-scein, fluoresceinisotiocyanat, rodamin, diklortriazinyl-aminfluorescein, dansylklorid eller fykoerytrin; et eksempel på et luminescerende materiale innbefatter luminol; og eksempler på egnet radioaktivt materiale innbefatter 125I,131I, 35S eller 3H.

Alternativt til å merke antistoffet kan hlL-12 bli under-søkt i biologiske væsker med en konkurranseimmuntest ved å anvende rhIL-12 standarder merket med en detekterbar substans og et umerket anti-hIL-12 antistoff. I denne testen kombineres den biologiske prøven, de merkede rhIL-12 stand-ardene og anti-hIL-12 antistoffet, og mengden av merket rhIL-12 standard bundet til det umerkede antistoffet blir bestemt. Mengden av hlL-12 i den biologiske prøven er in-vers proporsjonal med mengden av merket rhIL-12 standard bundet til anti-hIL-12 antistoffet.

Y61- og J695-antistoffene i den foreliggende oppfinnelsen kan også bli anvendt for å detektere IL-12 fra andre arter enn mennesker, spesielt IL-12 fra primater. For eksempel kan Y61 bli anvendt for å detektere IL-12 i cynomolgus- og rhesusape. J695 kan bli anvendt for å detektere IL-12 i cynomolgusape, rhesusape og bavian. Imidlertid kryssreagerer ingen av antistoffene med mus eller rotte IL-12 (se Eksempel 3, avsnitt F).

Antistoffene og antistoffdelene i den foreliggende oppfinnelsen kan nøytralisere hlL-12 aktivitet in vitro (se Eksempel 3) og in vivo (se Eksempel 4). Derfor kan antistoffene og antistoffdelene i den foreliggende oppfinnelsen bli anvendt til å inhibere IL-12 aktivitet, f.eks. i en cellekultur inneholdende hlL-12, i mennesker eller andre pattedyr (f.eks. primater som bavian, cynomolgus og rhesus) som har IL-12 som kryssreagerer med et antistoff i den foreliggende oppfinnelsen. I en foretrukket utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et isolert humant antistoff, eller antigenbindende del derav, som nøytraliserer aktiviteten til humant IL-12, og minst ett ekstra primat IL-12 valgt fra gruppen som består av bavian IL-12, silkeape IL-12, sjimpanse IL-12, cynomolgus IL-12 og rhesus IL-12, men som ikke nøytraliserer aktiviteten til mus IL-12. IL-12 er fortrinnsvis humant IL-12. I en cellekultur inneholdende eller som mistenkes for å inneholde hlL-12, kan for eksempel et antistoff eller antistoffdel i den foreliggende oppfinnel sen bli satt til kulturmediet for å inhibere hlL-12 aktivitet i kulturen.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å inhibere IL-12 aktivitet i et individ som lider av en sykdom der IL-12 aktivitet er skadelig. IL-12 har blitt implisert i patofysiologien til mange forstyrrelser (Windhagen et al., (1995) J. Exp. Med. 182:1985-1996; Morita et al., (1998) Arthritis and Rheumatism 41:306-314; Bucht et al., (1996) Clin. Exp. Immunol. 103:347-367; Fais et al., (1994) J. Interferon Res. 14:235-238; Parronchi et al., (1997) Am. J. Path. 150:823-832; Monteleone et al.,

(1997) Gastroenterology. 112:1169-1178 og Berrebi et al.,

(1998) Am. J. Path. 152:667-672; Parronchi et al., (1997) Am. J. Path. 150:823-832). Oppfinnelsen tilveiebringer fremgangsmåter for å inhibere IL-12 aktivitet i et individ som lider av en slik forstyrrelse, der fremgangsmåten innbefatter administrering til individet av et antistoff eller antistoffdel i den foreliggende oppfinnelsen slik at IL-12 aktivitet i individet blir inhibert. IL-12 er fortrinnsvis humant IL-12 og individet er et menneske. Alternativt kan individet være et pattedyr som uttrykker et IL-12 som et antistoff i oppfinnelsen kryssreagerer med. Enda videre kan individet være et pattedyr der hlL-12 har blitt introdusert (f.eks. ved administrering av hlL-12 eller med ekspresjon av et hlL-12 transgen). Et antistoff i den foreliggende oppfinnelsen kan bli administrert til et menneske for terapeutiske formål (diskutert videre nedenfor). I tillegg kan et antistoff i den foreliggende oppfinnelsen bli administrert til et ikke-humant pattedyr som uttrykker et IL-12 som antistoffet kryssreagerer med for veterinærformål eller som en dyremodell for human sykdom. Med hensyn til det sistnevnte kan slike dyremodeller være egnet for å evaluere den terapeutiske effekten av antistoffer i den foreliggende oppfinnelsen (f.eks. teste doser og tidsplan for administrering). Slik det er anvendt heri, er uttrykket "en forstyrrelse der IL-12 aktivitet er skadelig" ment å innbefatte sykdommer og andre forstyrrelser der nærværet av IL-12 i et individ, som lider av forstyrrelsen, har blitt vist å være, eller er mistenkt for å være, enten ansvarlig for patofysiologien til forstyrrelsen eller en faktor som bidrar til en forver-ring av forstyrrelsen. En forstyrrelse der IL-12 aktivitet er skadelig er derfor en forstyrrelse der inhibisjon av IL-12 aktivitet forventes å lette symptomene og/eller progresjonen av forstyrrelsen. Slike forstyrrelser kan forekomme for eksempel med en økning i IL-12 konsentrasjonen i en biologisk væske til et individ som lider av forstyrrelsen (f.eks. en økning i konsentrasjonen av IL-12 i serum, plasma, synovialvæske, osv. i individet), som for eksempel kan bli detektert ved å anvende et anti-IL-12 antistoff, som beskrevet ovenfor. Det er mange eksempler på forstyrrelser der IL-12 aktivitet er skadelig. I én utførelse kan antistoffene, eller antigenbindende deler derav, bli anvendt i terapi for å behandle sykdommene eller forstyrrelsene beskrevet heri. I en annen utførelse kan antistoffene, eller antigenbindende deler derav, bli anvendt for produk-sjonen av en medisin for behandling av sykdommene eller forstyrrelsene beskrevet heri. Anvendelsen av antistoffene og antistoffdelene i den foreliggende oppfinnelsen i behandlingen av noen få ikke-begrensende spesifikke forstyrrelser er diskutert videre nedenfor:

A. Revmatoid artritt:

Interleukin 12 har blitt implisert i å spille en rolle i

inflammatoriske sykdommer som revmatoid artritt. Induserbar IL-12 p40-budbærer har blitt detektert i synovia fra revma-toide artrittpasienter, og IL-12 har blitt vist å foreligge i synovialvæskene fra pasienter med revmatoid artritt (se

f.eks. Morita et al., (1998) Arthritis and Rheumatism 41:306-314). IL-12 positive celler har blitt funnet i det underliggende laget til revmatoid artritt synoviom. De humane antistoffene og antistoffdelene i den foreliggende

oppfinnelsen kan bli anvendt for å behandle for eksempel

revmatoid artritt, juvenil revmatoid artritt, Lyme-artritt, revmatoid spondylitt, osteoartritt og giktartritt. Normalt administreres antistoffet, eller antistoffdelen, systemisk, selv om lokal administrering av antistoffet eller antistof fdelen kan være fordelaktig for bestemte forstyrrelser. Et antistoff, eller antistoffdel, i den foreliggende oppfinnelsen kan også bli administrert sammen med én eller flere ekstra terapeutiske agenser som er egnet for behandlingen av autoimmune sykdommer.

I den murine modellen for revmatoid artritt med kollagenindusert artritt (CIA), førte behandling av mus med et

anti-IL-12 mAb (rotte anti-mus IL-12 monoklonalt antistoff, C17.15) i forkant av artritt til markant undertrykkelse av igangsettingen og reduserte forekomsten og voldsomheten av sykdommen. Behandling med anti-IL-12 mAb kort tid etter igangsetting av artritt reduserte voldsomheten, men senere behandling av musene med anti-IL-12 mAb etter sykdomstart hadde minimal effekt på voldsomheten av sykdommen.

B. Crohns sykdom

Interleukin 12 spiller også en rolle i den inflammatoriske tarmsykdommen Crohns sykdom. Økt ekspresjon av IFN-y og IL-12 forekommer i tarmslimhinnen hos pasienter med Crohns sykdom (se f.eks. Fais et al., (1994) J. Interferon Res. 14:235-238; Parronchi et al., (1997) Amer. J. Pathol. 150:823-832; Monteleone et al., (1997) Gastroenterology 112:1169-1178; Berrebi et al., (1998) Amer. J. Pathol. 152:667-672). Anti-IL-12 antistoffer har blitt vist å undertrykke sykdom i musemodeller med kolitt, f.eks. TNBS-indusert kolitt i IL-2 "knockout"-mus, og nylig i IL-10 "knockout"-mus. Derfor kan antistoffene, og antistoffdelene, i den foreliggende oppfinnelsen bli anvendt i behandlingen av inflammatoriske tarmsykdommer.

C. Multippel sklerose

Interleukin 12 har blitt implisert som en nøkkelmediator av multippel sklerose. Ekspresjon av den induserbare IL-12 p40-budbæreren, eller selve IL-12, kan bli vist i lesjoner av pasienter med multippel sklerose (Windhagen et al.,

(1995) J. Exp. Med. 182:1985-1996, Drulovic et al., (1997) J. Neurol. Sei. 147:145-150). Kronisk progressive pasienter med multippel sklerose har økte nivåer i sirkulasjonen av IL-12. Undersøkelser med T-celler og antigenpresenterende celler (APCer) fra pasienter med multippel sklerose av-slørte en selvforsterkende serie av immuninteraksjoner som grunnlaget for progressiv multippel sklerose som fører til en Thl-type immunrespons. Økt sekresjon av IFN-y fra T-cellene førte til økt IL-12 produksjon av APCer, som fortsatte syklusen uavbrutt og førte til en kronisk tilstand av en Thl-type immunaktivering og sykdom (Balashov et al.,

(1997) Proe. Nati. Acad. Sei. 94:599-603). Rollen IL-12 har i multippel sklerose har blitt undersøkt ved å anvende eksperimentelle allergiske encefalomyelitt (EAE) -modeller i mus og rotte for multippel sklerose. I en tilbakefallende-remitterende EAE-modell av multippel sklerose i mus førte forhåndsbehandling med anti-IL-12 mAb til forsinket para-lyse og reduserte kliniske verdier. Behandling med anti-IL-12 mAb når paralysen var maksimal, eller i løpet av den følgende remisjonsperioden, reduserte kliniske verdier. Derfor kan antistoffene, eller antigenbindende deler derav, i den foreliggende oppfinnelsen redusere symptomer assosiert med multippel sklerose i mennesker.

D. Insulinavhengig diabetes mellitus

Interleukin 12 har blitt implisert som en viktig mediator av insulinavhengig diabetes mellitus (IDDM). IDDM ble indusert i NOD-mus ved administrering av IL-12, og anti-IL-12 antistoffer virket beskyttende i en adoptiv overførings-modell av IDDM. Pasienter som fikk IDDM tidlig erfarer ofte en periode med "hvetebrødsdager," der noe residual funksjon i celleøyene er opprettholdt. Disse residuale celleøyene produserer insulin og regulerer blodglukosenivåer bedre enn administrert insulin. Behandling av disse pasientene, som fikk sykdommen tidlig, med et anti-IL-12 antistoff kan hindre videre nedbrytning av celleøyer og dermed opprett-holde en endogen insulinkilde.

E. Psoriasis

Interleukin 12 har blitt implisert som en nøkkelmediator i psoriasis. Psoriasis involverer akutte og kroniske hudle-sjoner som er assosiert med en THl-type cytokinekspresjons-profil (Hamid et al., (1996) J. Allergy Clin. Immunol. 1:225-231; Turka et al., (1995) Mol. Med. 1:690-699). IL-12 p35- og p40-mRNA'er ble detektert i prøver av syk menneske-hud. Derfor kan antistoffene, eller antigenbindende deler derav, i den foreliggende oppfinnelsen lindre kroniske hud-forstyrrelser som psoriasis.

Den foreliggende oppfinnelsen er videre illustrert med de følgende eksemplene, som ikke på noen som helst måte skal bli tolket som begrensende. Innholdet av alle siterte refe-ranser, innbefattende litteraturreferanser, innvilgede pa-tenter og publiserte patentsøknader, som er sitert i gjennom hele denne søknaden, er herved uttrykkelig inkorporert med referanse. Det skal videre bli forstått at innholdet i alle tabellene som er vedlagt heri (se Appendiks A) er inkorporert med referanse.

APPENDIKS A

APPENDIKSA

APPENDIKS A

APPENDIKSA

APPENDIKS A

EKSEMPLER

Eksempel 1: Isolering av anti-IL-12 antistoffer A. Screening for IL-12 bindende antistoffer

Antistoffer til hlL-12 ble isolert ved å screene tre separate scFv-fagdisplaybiblioteker fremstilt ved å anvende humane VL- og VH-cDNA'er fra mRNA avledet fra humane mand-ler (henvist til som scFv 1), mandel og lymfocytter i perifert blod (PBL) (henvist til som scFv 2) og beinmargs-avledede lymfocytter (henvist til som BMDL). Konstruksjon av biblioteket og seleksjonsfremgangsmåter er beskrevet i Vaughan et al., (1996) Nature Biotech. 14:309-314.

Bibliotekene ble screenet ved å anvende antigenene human IL-12 p70-subenhet, human IL-12 p40-subenhet, kimærisk IL-12 (mus p40/human p35), mus IL-12, biotinylert humant IL-12 og biotinylert kimærisk IL-12. IL-12 spesifikke antistoffer ble selektert ved å overføre antigenet på immunrør ved anvendelse av standard fremgangsmåter (Marks et al., (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597). scFv 2-biblioteket ble screenet ved å anvende enten IL-12, eller biotinylert IL-12, og genererte et betydelig antall IL-12 spesifikke bindere. Fem ulike klonotyper ble selektert, bestemt med BstNl enzyma-tiske kuttemønstre og bekreftet med DNA-sekvensering. Hovedklonotypene var VHDP58/VLDPL11, VHDP77/VLDPK31, VHDP47/VL og VHDP77/VLDPK31, der alle gjenkjente p40-subenheten til IL-12.

Screening av BMDL-biblioteket med IL-12 p70 genererte tre ulike klonotyper. To av disse ble funnet å være kryssreak-tive kloner. Den dominerende klonen ble sekvensert og bestod av VHDP35/VLDP. Denne klonen gjenkjenner p40-subenheten til IL-12. Screening av scFv 1-biblioteket, ved å anvende IL-12 p70, resulterte ikke i spesifikke IL-12 antistoffer .

For å identifisere IL-12 antistoffer som fortrinnsvis binder til p70-heterodimeren eller p35-subenheten til IL-12, i stedet for p40-subenheten, ble det kombinerte scFv 1 + 2 biblioteket og BMDL-biblioteket anvendt. For å selektere IL-12 antistoffer som gjenkjente p70-heterodimeren eller p35-subenheten, ble fagbiblioteker preinkubert og selektert i nærvær av fri p4 0. Sekvensering av isolerte kloner fremskaffet ni ulike antistofflinjer. Subenhetprefe-ranser ble videre analysert med 'mikro-Friguet'-titrering. Supernatanten som inneholdt scFv ble titrert på biotin-fanget IL-12 i en ELISA, og ED50ble bestemt. scFv-konsentrasjonen som fører til 50 % ED ble preinkubert med økende konsentrasjoner av fri p70 eller p40 (inhibitorer). En reduksjon i ELISA-signalet på plater dekket med biotin-IL-12 ble målt og plottet mot konsentrasjonen av fri p70 eller p40. Dette ga IC50for hver klon med hensyn til p70 og p40. Hvis titreringene for begge subenhetene overlapper, binder scFv til både p40 og p70. En hvilken som helst variasjon fra dette gir preferansegraden av p70 i forhold til p40.

B. Affinitetsmodning av antistofflinje som er spesifikk for IL-12 (Joe 9)

Klonene ble testet for deres evne til å inhibere IL-12 binding til dets reseptor i en IL-12 reseptorbindingstest (henvist til som RBA) og for deres evne til å inhibere IL-12 indusert proliferasjon av PHA-stimulerte humane blastceller (PHA-test), beskrevet i Eksempel 3. Klon Joe 9 hadde den laveste ICso-verdien i både RBA- og PHA-testen med en ICso-verdi på 1 x IO<-6>M i begge tester. I tillegg hadde den variable regionen på den tunge kjeden (VH) til Joe 9 fær-rest forandringer sammenlignet med den mest lignende kimbanesekvensen COS-3, identifisert fra VBASE-databasen. Tabell 1 (se Appendiks A) viser VH3-kimbanesekvensfamilien, der COS-3 er et medlem, så vel som medlemmer av Vxl-kim-banesekvensfamilien. Derfor ble Joe 9 selektert for affinitetsmodning. Aminosyresekvensene til VH og VL til Joe 9-villtype (Joe 9 wt) antistoffet er vist i Figur 1A-1D.

For å øke affiniteten til Joe 9 ble ulike mutasjoner av den komplementbestemmende regionen 3 (CDR3) på både de tunge og lette kjedene laget. CDR3-variantene ble laget med målstyrt PCR-mutagenese ved å anvende degenererte oligonukleotider spesifikke for enten tung kjede CDR3 (henvist til som "H3") eller lett kjede CDR3 (henvist til som "L3"), med et gjennomsnitt på tre basesubstitusjoner i hver CDR3 (henvist til som "spike"). PCR-mutagenese av tung kjede CDR3 ble utført ved å anvende det degenererte oligonukleotidet til tung kjede inneholdende en randomisert blanding av alle fire nukleotidene,

5 ' TGTCCCTTGGCCCCA (G) (T) (A) (G) (T) (C) (A) (T) (A) (G) (C) (T) (C) (C)

(C)(A)(C)(T) GGTCGTACAGTAATA 3' (SEKV ID NR:580), og oligonukleotid pUC Revers Tag GAC ACC TCG ATC AGC GGA TAA CAA

TTTCAC ACA GG (SEKV ID NR:581) for å generere et repertoar av tung kjede CDR3-mutanter. Den lette kjeden til forelderantistoffet ble amplifisert ved å anvende Joe 9 revers oligonukleotid (5'TGG GGC CAA GGG ACA 3' (SEKV ID NR:582) og fdteteseq 24+21 oligonukleotidet (5'-ATT CGT CCT ATA CCG

TTC TAC TTT GTC GTC TTT CCA GAC GTT AGT-3' (SEKV ID

NR:583).

Komplementæritet mellom de to PCR-produktene ble benyttet til å styre hybridisering av de to fragmentene i en PCR-reaksjon som satte fragmentene sammen, og det fullengde rekombinerte scFv-biblioteket ble amplifisert med pUC Revers Tag (SEKV ID NR:581) og fdTag 5'-ATT CGT CCT ATA CCG TTC-3' (SEKV ID NR:584). PCR-mutagenese av den lette kjeden ble utført ved å anvende oligonukleotidet til den lette kjeden inneholdende en blanding av alle fire nukleotidene,

5'GGTCCCAGTTCCGAAGACCCTCGAACC(C)(C)(T)(C)(A)(G)(G)(C)(T)(G)

(C)(T)(G)(T)(C)ATATGACTGGCAGTAATAGTCAGC 3' (SEKV ID

NR:585), og Joe 9 revers oligonukleotid 5'TGG GGC CAA GGG

ACA3' (SEKV ID NR:586) for å lage et repertoar av lett kjede CDR3-mutanter. Den tunge kjeden til forelderantistoffet ble amplifisert med pUC Revers Tag (SEKV ID NR:581) og HuJH3F0R oligonukleotid 5'TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC3' (SEKV ID NR:587). Komplementæritet mellom de to PCR-produktene ble anvendt til å styre hybridisering av de to fragmentene i en PCR-reaksjon som satte fragmentene sammen, og det fullengde rekombinerte scFv-biblioteket ble amplifisert med Revers Tag GAC ACC TCG ATC AGC G (SEKV ID NR: 588) og HuJX, 2-3 FOR NOT oligonukleotid 5'GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC

CGC ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC 3' (SEKV ID NR:589).

Tung kjede CDR3-mutanter ble selektert ved å anvende 1 nM biotinylert IL-12 og vasket i 1 time ved romtemperatur i PBS inneholdende fritt IL-12 eller p40 ved en konsentrasjon på 7 nM. Kloner ble analysert med fag-ELISA og de som bandt til IL-12 ble testet i BIAcore kinetiske bindingsstudier ved å anvende en brikke med lav tetthet av IL-12 (se fremgangsmåte for BIAcore-analyse i Eksempel 5). Generelt måler BIAcore-analyse "real-time" bindingsinteraksjoner mellom ligand (rekombinant humant IL-12 immobilisert på en biosensormatriks) og analytt (antistoffer i løsning) med overflateplasmonresonans (SPR) ved å anvende BIAcore-systemet (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Systemet benytter de optiske egenskapene til SPR for å detektere forandringer i proteinkonsentrasjoner i en dekstranbiosensormatriks. Proteiner er bundet kovalent til dekstranmatriksen i kjente konsentrasjoner. Antistoffer injiseres gjennom dekstranmatriksen og spesifikk binding mellom injiserte antistoffer og immobilisert ligand resulterer i en økt matriksprotein-konsentrasjon og resulterende forandring i SPR-signalet. Disse forandringene i SPR-signal registreres som resonans-enheter (RU) og er vist med hensyn til tid langs y-aksen av et sensorgram. For å bestemme av-hastighets- (kav) , på-hastighets- (kpa) , assosieringshastighets- (Ka) og dissosier-ingshastighets- (Kd) konstantene, ble BIAcore-kinetikk-evalueringsprogramvare (versjon 2.1) anvendt. Kloner som hadde en forbedri ng i kav—hastigheten ble analysert med nøytraliseringstester som inkluderte inhibisjon med antistoff av IL-12 binding til dets reseptor (RBA-test), inhibisjon av IL-12 indusert proliferasjon i PHA-stimulerte humane blastceller (PHA-test) og inhibisjon av IL-12 indusert produksjon av interferon-gamma med humane blastceller

(IFNy-test) . En oppsummering av dissosieringshastighetene og/eller IC50-verdiene fra nøytraliseringstester med de ladede tung kjede CDR3-klonene 70-1 til og med 70-13 er presentert i Tabell 2 (se Appendiks A). Klon 70-1 hadde en kav-hastighet som var bedre enn Joe 9-forelderklonen og hadde den laveste IC50-verdien på 2,0 x 10"<7>M. Derfor ble klon 70-1 selektert for omdannelse til helt IgGl.

Lett kjede CDR3-mutanter ble selektert ved å anvende 1 nM biotin-IL-12 og vasket med PBS inneholdende 7 nM fri p40. Kloner ble screenet i fag-ELISA, og de som bandt til IL-12 ble testet i BIAcore-bindingsanalyse ved å anvende brikker med lav tetthet av IL-12. Kloner som hadde en av-hastighet som var bedre enn Joe 9-forelderklonen ble testet i nøy-traliseringstester som enten målte inhibisjon av IL-12 reseptorbinding eller inhibisjon av PHA-blastcelleprolifera-sjon. En oppsummering av dissosieringshastighetene og/eller ICso-verdiene fra nøytraliseringstester i lett kjede CDR3-mutantkloner, 78-34 til og med 79-1, er presentert i Tabell 2 (se Appendiks A).

Basert på kav-hastigheten, viste klonene 78-34 og 78-35 en forbedret kav-hastighet sammenlignet med forelder Joe 9. Begge disse klonene ble selektert for kombinasjonsanalyse med tung kjede mutanter.

C. Kombinasjonskloner

Mutante kloner av lett og tung kjede som hadde de beste bindingskarakteristikaene ble anvendt for i kombinasjon og sette sammen scFv'er. Mutante kloner med forbedrede styrke-karakteristika ble kombinert med PCR-overlappende forleng-else og "pull through" av de muterte VH- og VL-segmentene, som beskrevet ovenfor. Klonene 101-14 til og med 26-1, vist i Tabell 2 (se Appendiks A), ble produsert ved å kombinere tung kjede mutanter (70-2, 70-13 og 70-1) med lett kjede mutanter (78-34, 78-35 og 79-1). kav-hastighetene og/eller IC5o-verdiene fra nøytraliseringstester for disse klonene er presentert i Tabell 2.

BIAcore-bindingsanalyse identifiserte klon 101-11, produsert fra kombinasjonen av tung kjede CDR3-mutant klon 70-1 med lett kjede CDR3-mutant klon 78-34, som hadde en av-hastighet på 0, 0045 s"<1>. Denne kav-hastigheten var en signifikant forbedring sammenlignet med kav-hastighetene for enten tung kjede CDR3-mutante klonen 70-1 (0,0134 s<-1>) eller for lett kjede CDR3-mutante klonen 78-34 (0, 0164 s<-1>) alene. Videre viste klon 101-11 en signifikant forbedring i nøy-traliseringstester. Derfor ble klon 101-11 selektert for affinitetsmodning, som beskrevet nedenfor.

D. Affinitetsmodning av klon 101-11

Videre affinitetsmodning av klon 101-11 bestod av gjentatte sykluser med PCR-mutagenese av både tung og lett kjede CDR3'ene til 101-11 ved å anvende ladede oligonukleotid-primere. Klonene ble selektert med avtagende konsentrasjoner av biotinylert IL-12 (bio-IL-12). Bindingskarakteristikaene til de muterte klonene ble vurdert med BIAcore-bindingsanalyse og RBA, PHA-nøytraliseringstester. kav-hastighetene og/eller IC5o-verdiene for klonene 136-9 til og med 170-25 er presentert i Tabell 2 (se Appendiks A). Klon 103-14 hadde en forbedret ICso-verdi i både reseptorbindingstesten og PHA-blasttesten. Klon 103-14 hadde også en lav kav-hastighet og ble i samsvar med dette selektert for videre affinitetsmodning.

E. Generering og seleksjon av randomiserte biblioteker av klon 103-14 lett CDR3

Lett kjede CDR3 til klon 103-14 (QSYDRGFTGSMV (SEKV ID NR:590)) ble systematisk randomisert i 3 segmenter ved å anvende 3 ulike biblioteker, som uthevet nedenfor, der X er kodet av et randomisert kodon med sekvens NNS, der N er ethvert nukleotid og S er enten deoksycytosin eller deoksy-guanidin.

Randomisert mutagenese av alle tre lett kjede CDR'er (henvist til som L3.1, L3.2 og L3.3) til klon 103-14 ble ut-ført. Tung kjede CDR3 (henvist til som H3) til klon 103-14 ble ikke mutert. Fire randomiserte biblioteker basert på klon 103-14 (H3 og L3.1, L3.2&L3.3) ble konstruert og utsatt for mange ulike seleksjonsbetingelser, som innbefattet å anvende begrenset antigenkonsentrasjon og nærværet eller fraværet av overskudd med fritt antigen (p40 og p70). Seleksjonsutbyttet (klonene 73-B1 til og med 99-G11) ble primært screenet med BIAcore, og ved én anledning med RBA, og er vist i Tabell 2 (se Appendiks A).

Tilfeldig mutagenese av lett kjede CDR til 103-14 genererte klon Y61, som hadde en signifikant forbedring i ICso-verdi sammenlignet med forelderklonen 103-14. Y61 ble selektert for omdannelse til et fullstendig IgGl. Helt Y61-IgGl har en IC50-verdi på ca. 130 pM, som er bestemt med PHA-testen. ICso-verdien var ikke affisert av et 50-fold molart overskudd av fri p40, som demonstrerte at fri p40 ikke kryssreagerer med Y61 anti-IL-12 antistoff for dermed å redusere antistoffbindingen til heterodimeren. Fullengdesekvensene til Y61 tung kjede variabel region og lett kjede variabel region er vist nedenfor.

Peptidsekvens til Y61 tung kjede variabel region:

CDR-rester er anvist i henhold til Kabat-definisjonene.

Eksempel 2: Mutasjon av Y61 1 hypermutasjons- og kontaktposisjoner

Normalt kan seleksjon av rekombinante antistoffer med forbedrede affiniteter bli utført ved å anvende fagdisplayfremgangsmåter. Dette oppnås ved å vilkårlig mutere kombinasjoner av CDR-rester for å generere store biblioteker inneholdende enkeltkjedede antistoffer med ulike sekvenser. Normalt blir antistoffer med forbedrede affiniteter selektert basert på deres evne til å nå en likevekt i en antistof f/antigen-reaksjon. Når imidlertid Y61 scFV ble uttrykt på fagoverflate og inkubert med IL-12, kunne ikke seleksjonsbetingelser bli funnet som ville muliggjøre at systemet nådde normal antistoff/antigen-likevekt. scFV-fagen for-ble bundet til IL-12, trolig pga. en uspesifikk interaksjon, siden renset Y61 scFv har normale dissosierings-kinetikker. Siden de vanlige fremgangsmåtene for fagdisplayaffinitetsmodning til Y61 (dvs. dannelse av bibliotek og seleksjoner med mutagenese av flere CDR-rester) ikke kunne bli anvendt, ble en ny strategi utviklet der individuelle CDR-posisjoner ble mutert.

Denne strategien involverer seleksjon av egnede CDR-posisjoner for mutasjon og er basert på identifisering og seleksjon av aminosyrer som er foretrukne selektive mutagenese-, kontakt- og/eller hypermutasjonsposisjoner. Kontaktposisjoner er definert som rester med en høy sannsynlighet for kontakt med et antigen når antigenet interagerer med antistoffet, mens hypermutasjonsposisjoner er definert som rester vurdert til å ha en høy sannsynlighet for somatisk hypermutasjon i løpet av in vivo- affinitetsmodning av antistoffet. Foretrukne selektive mutageneseposisjoner er CDR-posisjoner som er både kontakt- og hypermutasjonsposisjoner. Y61-antistoffet var allerede optimalisert i CDR3-regionene ved å anvende fremgangsmåten beskrevet i Eksempel 1, derfor var det vanskelig å videre forbedre området som lig-ger i senteret av antistoffbindingssetet ved å anvende fagdisplayseleksjonsfremgangsmåter. Større forbedringer i aktivitet ble fremskaffet med mutasjon av potensielle kontaktposisjoner utenfor CDR3-regionene ved enten å fjerne en skadelig antigen/antistoff-kontakt eller lage en ny kontakt .

Aminosyrerester i Y61 som ble betraktet som kontaktpunkter med antigen, og de CDR-posisjonene som er seter for somatiske hypermutasjoner i løpet av in vivo-affinitetsmodning, er vist i Tabell 3 (se Appendiks A). For Y61-affinitetsmodning ble 15 rester utenfor CDR3, 3 rester i L3-løkken og 5 rester i H3-løkken selektert for PCR-mutagenese.

Y61 scFv-gen ble klonet inn i pUCl 19(Sfi) plasmidvektoren for mutagenese. Oligonukleotider ble designet og syntetisert med randomiserte kodoner for å mutere hver selekterte posisjon. Etter PCR-mutagenese ble et lite antall kloner (~24) sekvensert og uttrykt i en vertscelle, for eksempel i en bakterie-, gjær- eller pattedyrvertscelle. Det uttrykte antistoffet ble renset og kavmålt ved å anvende BIAcore- systemet. Kloner med forbedrede av-hastigheter, som sammenlignet med Y61, ble deretter testet i nøytraliseringstest-er. Denne fremgangsmåten ble repetert for andre CDR-posisjoner. Individuelle mutasjoner som hadde forbedret nøy-traliserende aktivitet ble kombinert for å generere et antistoff med enda større nøytraliseringsevne.

Y61 CDR-posisjonene, som ble mutert for å kunne bedre nøy-traliseringsevnen og de respektive aminosyresubstitusjonene i hver posisjon, er vist i Figurene 2A-2H. Av-hastigheter, bestemt med BIAcore-analyse, er gitt. Disse av-hastighetene er også vist i histogrammene til høyre for hver tabell.

Resultater av disse substitusjonene i posisjonene H30, H32, H33, H50, H53, H54, H58, H95, H97, H101, L50, L92 og L93 demonstrerte at alle aminosyresubstitusjoner som ble under-søkt resulterte i antistoffer med dårligere av-hastigheter enn Y61. I posisjonene H52, L32 og L50 bedret bare én aminosyresubstitusjon av-hastigheten til Y61, alle andre forandringer affiserte aktiviteten ugunstig. For L50 forbedret denne enkle forandringen Gly—>Tyr nøytraliser-ingsevnen til Y61 signifikant (5-10 fold). Resultatene demonstrerte viktigheten av disse posisjonene for Y61-aktivitet og antyder at fagdisplay i de fleste tilfellene var i stand til å selektere de optimale restene. Imidlertid, i posisjonene H31, H56, L30 og L94, ble flere substitusjoner funnet å bedre Y61 av-hastighet, hvilket antyder at disse posisjonene også var viktige for antigenbinding, selv om fagdisplaytilnærmingsmåten ikke muliggjør seleksjon av de optimale restene.

Selektiv mutasjon av kontakt- og hypermutasjonsposisjoner i Y61 identifiserte aminosyrerest L50 i lett kjede CDR2 og rest L94 i lett kjede CDR3, som forbedret nøytraliserings-evnen til Y61. En kombinasjon av disse mutasjonene produserte en additiv effekt og genererte et antistoff, J695, som hadde en signifikant økning i nøytraliseringsevne. Hele sekvensen til de variable regionene til J695 tung og lett kjede er vist nedenfor.

Peptidsekvens til J695 tung kjede variabel region:

CDR-rester er anvist i henhold til Kabat-definisjonene.

En oppsummering av sammenligningen av sekvensene til tung og lett kjede variabel region, som viser linjeutviklingen av kloner som var på veien fra Joe 9 til J695, er vist i Figurene 1A-1D. CDR'ene og restnummereringen er i henhold til Kabat.

Eksempel 3: Funksjonell aktivitet til anti-hIL-12 antistoffer

For å undersøke den funksjonelle aktiviteten til de humane anti-humane IL-12 antistoffene i den foreliggende oppfinnelsen, ble antistoffene anvendt i flere tester som måler evnen et antistoff har til å inhibere IL-12 aktivitet.

A. Fremstilling av humane PHA-aktiverte lymfoblaster

Humane perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble isolert fra et leukopac høstet fra en frisk donor med Ficoll-Hypaque gradientsentrifugering i 45 minutter ved 1500 rpm, som beskrevet i "Current Protocols in Immunology," seksjon 7.1. PBMC i sjiktet mellom den vandige blodløsningen og lymfocyttsepareringsmediet ble høstet og vasket tre ganger med fosfatbufret saltvann (PBS) med sentrifugering i 15 minutter ved 1500 rpm for å fjerne Ficoll-Paque partikler.

PBMC ble deretter aktivert for å danne lymfoblaster, som beskrevet i "Current Protocols in Immunology," seksjon 6.16. Vasket PBMC ble resuspendert i 0,5-1 x IO<6>celler/ml i fullstendig RPMI-medium (RPMI 1640 medium, 10 % føtalt bovint serum (FBS), 100 U/ml penicillin, 100 ug/ml strepto-mycin) , supplementert med 0,2 % (vekt/vekt) PHA-P (Difco, Detroit, MI) og kultivert i fire dager ved 37 °C i en 5 % C02-atmosfære. Etter fire dager ble cellekulturer fortynnet 1:1 i fullstendig RPMI-medium, pluss 0,2 % (vekt/vekt) PHA-P og 50 U/ml rekombinant humant IL-2. Rekombinant humant IL-2 ble produsert ved transfeksjon av en ekspresjonsvektor, inneholdende det humane IL-2 cDNA'et, inn i COS-celler (se Kaufman et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19, 4484-4490) og renset som beskrevet i PCT/US96/01382. Cellekulturer ble deretter inkubert i ytterligere én til tre dager. PHA-blastceller ble høstet, vasket to ganger med fullstendig RPMI-medium og fryst i 95 % FBS, 5 % DMSO ved 10 x IO<6>celler/ml.

PHA-blastceller som skulle bli anvendt i IL-12 reseptorbindingstesten (se del B) ble høstet etter én dag i kultur i nærvær av IL-2, mens PHA-blastceller som skulle bli an vendt i PHA-blastproliferasjonstesten (se del C) og interferon-gamma induksjonstesten (se del D) ble høstet etter tre dager i kultur i nærvær av IL-2.

B. IL-12 reseptorbindingstest

Evnen anti-IL-12 antistoffer har til å inhibere binding av radioaktivt merket IL-12 til IL-12 reseptorer på PHA-blaster ble analysert som følger. Ulike konsentrasjoner av anti-IL-12 antistoff ble preinkubert i 1 time ved 37 °C med 50-100 pM<125>I-hIL-12 (jodmerket hlL-12 ble fremstilt ved å anvende Bolton-Hunter merkingsfremgangsmåten til en spesifikk aktivitet på 20-40 mCi/mg fra NEN-Dupont) i bindingsbuffer (RPMI 1640, 5 % FBS, 25 mM Hepes pH 7,4). PHA-blastceller, isolert som beskrevet ovenfor, ble vasket én gang og resuspendert i bindingsbuffer til en celletetthet på 2 x IO<7>celler/ml.PHA-blaster (1 x IO<6>celler) ble satt til<125>I-hIL-12 antistoffblandingen og inkubert i to timer ved romtemperatur. Cellebundet radioaktivitet ble separert fra fritt<125>I-hIL-12 med sentrifugering av testblandingen i 30 sekunder ved romtemperatur, aspirasjon av væsken og en vask med 0,1 ml bindingsbuffer, etterfulgt av sentrifugering ved 4 °C i 4 min ved 10.000 x g. Cellepelleten ble undersøkt for cellebundet radioaktivitet ved å anvende en gamma-teller. Total binding ble bestemt i fravær av antistoff og uspesifikk binding ble bestemt med inklusjon av 25 nM umerket IL-12 i testen. Inkuberinger ble utført i duplikater.

I IL-12 reseptorbindingstesten, som anvendte Y61 og J695 humane anti-IL-12 antistoffer, hadde begge antistoffer en sammenlignbar inhibisjon av IL-12 reseptorbinding. Y61 inhiberte IL-12 reseptorbinding med en IC5o-verdi på ca. 1,6

x 10"<11>, mens J695 hadde en IC5o-verdi på ca. 1,1 x 10"11M.

C. Human PHA-blastproliferasjonstest

Anti-IL-12 antistoffer ble evaluert for deres evne til å inhibere PHA-blastproliferasjon (der proliferasjon er stimulert med IL-12). Seriefortynninger av anti-IL-12 antistoff ble preinkubert i 1 time ved 37 °C, 5 % C02med 230 pg/ml hlL-12 i 100 ml fullstendig RPMI-medium i en mikrotiterplate (U-bunn med 96 brønner, Costar, Cambridge, MA). PHA-blastceller, isolert som beskrevet ovenfor, ble vasket én gang og resuspendert i fullstendig RPMI-medium til en celletetthet på 3 x IO<5>celler/ml. PHA-blaster (100 ml, 3 x IO<4>celler) ble satt til blandingen av antistoff/hlL-12, inkubert i 3 dager ved 37 °C, 5 % C02og merket i 4-6 timer med 0,5 mCi/brønn (<3>H)-Tymidin (Amersham, Arlington Heights, IL). Kulturinnholdet ble høstet over på glass-fiberfiltre ved hjelp av en cellehøster (Tomtec, Orange, CT) og (<3>H)-Tymidininkorporering i cellulært DNA ble målt med væskescintillasjonstelling. Alle prøver ble undersøkt i duplikater.

Resultatene av nøytralisering i nærvær av varierende konsentrasjoner av p70:p40 (dvs. forholdet mellom IL-12 heterodimer og fri p40-subenhet) er vist i Tabell 4 (se Appendiks A).

Analyse av det humane anti-IL-12 Y61-antistoffet i PHA-blastproliferas j onstesten demonstrerte at antistoffet inhiberte PHA-blastproliferasjon med en ICso-verdi på ca. 1,8 x 10<-10>M i nærvær av IL-12 p70 alene, uten noe overskudd av p40 (p70:p40 forhold på 1:0). I nærvær av et 50-fold overskudd av fri p40 (p70:p40 ved et forhold på 1:50), inhiberte Y61-antistoffet PHA-blastproliferasjon med en IC50-verdi på ca. 1,8 x 10"<10>M. Dette resultatet viser at evnen Y61 har til å inhibere blastproliferasjon ikke er svekket med et p40-overskudd.

Det humane anti-IL-12 J695-antistoffet inhiberte PHA-blast-proliferas jon med en IC5o-verdi på ca. 1,0 x 10<-11>M i nærvær av p70:p40 ved et forhold på 1:0. I nærvær av et p70:p40 forhold på 1:50 inhiberte dette antistoffet PHA- blastproliferasjon med en IC50-verdi på ca. 5,8 + 2,8 x 10"<12>M (n=2), som demonstrerer at p4 0-overskuddet bare hadde en liten inhibitorisk effekt på antistoffet. Totalt sett viser resultatene at J695 har forbedret nøytraliserende aktivitet sammenlignet med Y61 pga. mutasjonene i L50 og L94 .

D. Interferon-gamma induksjonstest

Evnen anti-IL-12 antistoffer har til å inhibere produk-sjonen av IFNy med PHA-blaster (der produksjon er stimulert av IL-12) ble analysert som følger. Ulike konsentrasjoner av anti-IL-12 antistoff ble preinkubert i 1 time ved 37 °C, 5 % C02med 200-400 pg/ml hlL-12 i 100 ml fullstendig RPMI-medium i en mikrotiterplate (U-bunn med 96 brønner, Costar). PHA-blastceller, isolert som beskrevet ovenfor, ble vasket én gang og resuspendert i fullstendig RPMI-medium til en celletetthet på 1 x 10<7>celler/ml. PHA-blaster (100 ul med 1 x IO<6>celler) ble satt til blandingen av antistoff/hlL-12 og inkubert i 18 timer ved 37 °C og 5 % CO2. Etter inkubering ble 150 ul cellefri supernatant fjernet fra hver brønn og nivået av produsert IFNy ble målt med ELISA (Endogen interferon-gamma ELISA, Endogen, Cambridge, MA). Hver supernatant ble testet i duplikat.

Analyse av humant anti-hIL-12 Y61-antistoff i denne testen viste at Y61 inhiberte produksjon av humant IFNy med en IC5o-verdi på ca. 1,6 x 10~<10>M, mens det humane anti-IL-12 J695-antistoffet inhiberte human IFNy-produksjon med en IC5o-verdi på ca. 5,0 ± 2,3 x IO"12 M (n=3) . Resultatet viser den solide forbedringen i affiniteten til J695 som et resultat av modifiseringene i L50 og L94.

E. Induksjon av ikke-humant IL-12 fra Isolert PBMC

For å undersøke kryssreaktiviteten til de humane anti-hlL-12 antistoffene med IL-12 fra andre arter, ble ikke-humant IL-12 produsert som følger. PBMC ble separert fra ferskt heparinisert blod med tetthetssentrifugering, som beskrevet over, ved å anvende lymfoprep (Nycomed, Oslo, Norge) for PBMC fra cynomolgusape, bavian og hund, Accu-paque (Accurate Chemical&Sei. Corp., Westbury, NY) for PBMC fra hund eller Lymfolytt-rotte (Accurate Chemical&Sei. Corp., Westbury, NY) for PBMC fra rotte.

PMBC ble deretter indusert til å produsere IL-12, som beskrevet (D'Andrea et al., (1992) J. Exp. Med. 176, 1387-1398, Villinger et al., (1995) J. Immunol. 155, 3946-3954, Buettner et al., (1998) Cytokine 10, 241-248). Vasket PBMC ble resuspendert ved 1 x IO<6>celler/ml i fullstendig RPMI-medium, supplementert med 0,0075 % (vekt/volum) SAC (Pansorbin; Calbiochem-Behring Co., La Jolla, CA) eller 1-5 mg/ml ConA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) pluss 0,0075 % SAC og inkubert i 18 timer ved 37 °C i en 5 % C02-atmos-fære. Cellefritt- og SAC-fritt medium ble høstet med sentrifugering og filtrering gjennom 0,2 mm filtre. IL-12 fra rhesusape ble fremskaffet som rekombinant rhesus IL-12 fra Emory University School of Medicine, Atlanta, GA.

F. Murin 2D6-celleproliferasjonstest

Den murine T-celleklonen 2D6 prolifererer i respons til murint IL-2, IL-4, IL-7 og IL-12 (Maruo et al., (1997) J. Leukocyte Biol. 61, 346-352). En betydelig proliferasjon ble også detektert i respons til rotte PBMC-supernatanter inneholdende rotte IL-12. Cellene responderer ikke til IL-12 fra hund, cynomolgus, bavian eller menneske. Murine 2D6-celler ble ekspandert i fullstendig RPMI-medium supplementert med 50 mM beta-merkaptoetanol (PME) og 30 ng/ml murint IL-12. Én dag før testen ble murint IL-12 vasket ut og cellene ble inkubert natten over i fullstendig RPMI-medium pluss PME.

Seriefortynninger av anti-IL-12 antistoff ble preinkubert i 1 time ved 37 °C, 5 % C02med 40 pg/ml murint IL-12 i 100 ml fullstendig RPMI-medium pluss PME i en mikrotiterplate (U-bunn med 96 brønner, Costar). 2D6-celler ble vasket én gang og resuspendert i fullstendig RPMI-medium inneholdende PME til en celletetthet på 1 x IO<5>celler/ml. 2D6-celler (100 ul, 1 x IO<4>celler) ble satt til blandingen av antistof f /hlL-12 , inkubert i 3 dager ved 37 °C, 5 % C02og merket i 4-6 timer med 0,5 mCi/brønn (<3>H)-Tymidin. Kulturinnholdet ble høstet og telt med væskescintillasjonstelling. Alle prøver ble undersøkt i duplikater.

6. Kryssreaktivitet mellom arter av J695 med ikke-humant IL-12

Kryssreaktivitet mellom arter av J695 med ikke-humant IL-12 ble analysert ved å anvende PBMC'er isolert fra flere ikke-humane arter. Tilstedeværelsen av ikke-human IL-12 aktivitet i rotte-, hund-, cynomolgus- og bavian PBMC-superna-tantene ble bekreftet ved å anvende flere biotester beskrevet ovenfor, slik som den murine 2D6-celleprolifera-sjonstesten, den humane PHA-blastproliferasjonstesten og interferon-gamma induksjonstesten ved å blokkere de ikke-humane PBMC-induserte responsene med kanin og/eller sau polyklonale antistoffer til murint og/eller humant IL-12. Kryssreaktivitet av de humane anti-hIL-12 antistoffene Y61 og J695 med ikke-humant IL-12 i PBMC-supernatanter eller renset murin og rhesus IL-12 ble deretter vurdert i den samme biotesten(e) ved å bestemme J695-antistoffkonsentrasjonen der det ble observert 50 % inhibisjon av responsen. Resultatene fra kryssreaktiviteten mellom artene er oppsummert i Tabell 5. Resultatene demonstrerer at både Y61 og J695 er i stand til å gjenkjenne IL-12 fra aper (f.eks. cynomolgus og rhesus IL-12 for Y61, og cynomolgus, rhesus og bavian for J695), og at J695 er ca. 35-fold mindre aktiv på hund IL-12; mens verken Y61 eller J695 kryssreagerer med mus eller rotte IL-12.

H. Human cytokinspesifisitet for J695

Spesifisiteten til J695 ble testet i en kompetitiv ELISA,

der et panel med humane cytokiner ble testet for deres evne til å interferere med bindingen av løselig J695 til immobilisert humant IL-12. Panelet med humane cytokiner innbefattet IL-la og IL-ip (Genzyme, Boston, MA), IL-2 (Endogen), IL-4, IL-10, IL-17, IFN-gamma og TGF-pi (R&D, Minneapolis, MN), IL-8 (Calbiochem), PDGF, IGF-I og IGF-II (Boehringer Mannheim Corp., Idianapolis, IN), TNFa og lymfotoksin, IL-6, løselig IL-6 reseptor, IL-11, IL-12 p70, IL-12 p40, M-CSF og LIF. EBI-3, et IL-12 p40-relatert protein som indu-seres med Epstein Barr virus-infeksjon i B-lymfocytter (Devergne et al., (1996) J. Virol. 70, 1143-1153) ble uttrykt som en human IgG-Fc kimære (EBI-3/Fc). Enkeltkjedet sædcelle-DNA fra laks (Sigma) ble også testet.

ELISA-immuntestmikrotiterplater med flat bunn (96-brønners, høy binding, Costar) ble belagt natten over ved 4 °C med 0,1 ml humant IL-12 (2 ug/ml i 0,1 M karbonatdekkende buffer (4 volumer av 0,1 M NaHCC>3 pluss 8,5 volum av 0,1 M NaHCOa) ) . Platene ble vasket to ganger med PBS inneholdende 0,05 % Tween 20 (PBS-T), blokkert med 200 ul av 1 mg/ml bovint serumalbumin (BSA, Sigma) i PBS-T i 1 time ved romtemperatur og igjen vasket to ganger med PBS-T. Prøver (100 ul) inneholdende IL-12 antistoff J695 (100 ng/ml) og hvert cytokin (2 nM) i PBS-T inneholdende 50 ug/ml BSA (PBS-T/BSA) ble tilsatt og inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Platene ble vasket 4 ganger og inkubert i 1 time ved romtemperatur med 100 ul mus anti-humant lambda-HRP (1:500 i PBS-T/BSA, Southern Biotech. Ass. Inc., Birmingham, AL). Platene ble vasket 4 ganger og fremkalt med ABTS (Kirkegaard&Perry Lab., Gaithersburg, MD) i 20-30 minutter i mørke. OD45onm ble avlest ved å anvende en mikro-plateleser (Molecular Devices, Menlo Park, CA). Prosent binding ble bestemt i forhold til J695-binding til platen belagt med IL-12 i fravær av ethvert løselig cytokin. Resultatene demonstrerte at J695-binding til immobilisert humant IL-12 bare ble blokkert med humant IL-12 p70, og i en mindre grad med humant IL-12 p40 og ikke med noen av de andre cytokinene som ble testet.

I. Binding til et nytt IL-12 molekyl

En alternativ IL-12 heterodimer har blitt beskrevet, der p35-subenheten er erstattet med et nytt pl9-molekyl. P19 ble identifisert ved å anvende 3D homologisøk for IL-6/IL-12 familiemedlemmer og syntetiseres av aktiverte dendrittiske celler. P19 binder til p40 for å danne en pl9/p40-dimer, som har IL-12 lignende aktivitet, men er ikke så potent som p35/p40-heterodimeren i IFNy-induksjon. Antistoffer som gjenkjenner p40 alene, men fortrinnsvis i sammenheng med et p70-molekyl (f.eks. J695 og Y61, se Eksempel 3H) er forventet til å også nøytralisere både p35/p40-molekylene og pl9/p40-molekylene.

Eksempel 4: In vivo-aktivitet av anti-hIL-12 antistoffer

In vivo- effektene av IL-12 antistoffer på IL-12 induserte responser ble undersøkt i en modell modifisert fra én som ble anvendt av Bree et al. for å studere effekten av humant IL-12 på perifer hematologi i cynomolgusape (Bree et al.,

(1994) Biochem. Biophys. Res. Comm. 204:1150-1157). I de tidligere studiene resulterte administrering av humant IL-12 ved 1 ug/kg/dag for en periode på 5 dager i en reduksjon i antall hvite blodceller (WBC), spesielt i undergrupper av lymfocytter og monocytter etter 24 timer. En reduksjon i antall blodplater ble observert etter 72 timer. Nivåer av plasmaneopterin, en markør for monocyttaktivering i respons til IFN-y, begynte å stige etter 24 timer og var høyest ved 72 timer.

I den første studien med humane anti-hIL-12 antistoffer ble 15 friske cynomolgusaper med en gjennomsnittsvekt på 5 kg gitt beroligende middel og delt inn i 5 grupper (n=3). Gruppe 1 mottok en intravenøs (IV) administrering av 10 mg/kg humant intravenøst immunglobulin (IVIG, Miles, Eckhart, IN, renset ved å anvende Protein A Sefarose). Gruppe 2 mottok en intravenøs administrering av 1 mg/kg C8.6.2 (nøytraliserende mus anti-humant IL-12 monoklonalt antistoff). Gruppe 3 mottok en intravenøs administrering av 10 mg/kg C8.6.2. Gruppe 4 mottok en intravenøs administrering av 1 mg/kg Y61 (humant anti-humant IL-12 antistoff, renset fra CHO-cellekondisjonert medium). Gruppe 5 mottok en intravenøs administrering av 10 mg/kg Y61.

Én time etter antistoffadministreringen mottok alle dyr en enkel subkutan (SC) injeksjon av humant IL-12 (1 ug/kg). Blodprøver ble tatt på følgende tidspunkter: start, 8, 24, 48, 96 og 216 timer og analysert for fullstendige blodcel-letall med differensialer og serumkjemi. Serum humant IL-12, C8.6.2 antistoff, Y61-antistoff, ape IFN-gamma, ape IL-10, ape IL-6 og plasmaneopterinnivåer ble også målt.

Dyr som ble behandlet med IL-12 pluss IVIG-kontrollanti-stoff (Gruppe 1) viste mange av de forventede hematologiske forandringene, innbefattende reduksjon i WBC, blodplater, lymfocytter og monocytter. Disse reduksjonene ble ikke observert eller var mindre uttalt i dyrene behandlet med enten C8.6.2- eller Y61-antistoffet ved 1 eller 10 mg/kg (Gruppene 2-5).

Serum eller plasmaprøver ble analysert med ELISA som er spesifikk for ape IFN-gamma og ape IL-10 (Biosource International, Camarillo, CA), ape IL-6 (Endogen) og plasmaneopterin (ICN Pharmaceuticals, Orangeburg, NY). IFN-gamma, IL-10 eller IL-6 ble ikke detektert i noen av dyrene behandlet med IL-12, innbefattende kontrolldyrene behandlet med IL-12 pluss IVIG. Dette skyldes trolig det lave ekspo-neringsnivået for IL-12 (bare 1 dose på 1 ug/kg). Ikke desto mindre økte plasmaneopterinnivåer ca. 3-fold i dyrene behandlet med IL-12 pluss IVIG, men var uforandret i alle de C8.6.2- eller Y61-behandlede dyrene, innbefattende dyr ene behandlet med den lavere dosen av (1 mg/kg) Y61, som indikerer at Y61 var effektiv in vivo til å blokkere denne sensitive responsen til IL-12.

I en annen studie ble in vivo-aktivitet og farmakodynamikk (PD) av J695 i cynomolgusaper studert ved administrering av eksogent rhIL-12, og det ble bestemt om J695 kunne blokkere eller redusere responsene som vanligvis er assosiert med rhIL-12 administrering. Cynomolgushannaper (n=3 per gruppe) fikk administrert en enkel dose av 0,05, 0,2 eller 1,0 mg/kg J695 eller 1 mg/kg intravenøst immunglobulin (IVIG) som en bolus intravenøs (IV) injeksjon via en saphenus-vene eller subkutant (SC) i ryggskinnet. Én time etter administreringen av J695 eller IVIG, mottok alle dyrene en enkel SC dose på 1 ug/kg rhIL-12 i ryggskinnet. Blodprøver ble tatt via lårvenen opp til 28 dager etter J695-administrering. Serum ble høstet fra hver blodprøve og testet for IL-12, J695, IFN-y og anti-J695 antistoffer med ELISA. Neopterin ble undersøkt med reversfase høytrykksvæskekromato-grafi.

Neopterinnivåene, normalisert med hensyn til nivåene av neopterin som ble målt før administrering av J695 eller rhIL-12, er vist i Figur 3. For å sammenligne suppresjonen av neopterin mellom grupper, ble arealet under kurven (AUC) som var normalisert for neopterinnivåer beregnet for hvert dyr (Tabell 6). Neopterineksponering (AUC) ble undertrykt på en doseavhengig måte mellom ca. 71 og 93 % i IV-gruppene og mellom 71 og 100 % i SC-gruppene, i forhold til IVIG-kontrollgruppene. Disse resultatene indikerer at J695-dosen som var nødvendig for 50 % inhibisjon av neopterinresponsen (ED50) var mindre enn 0,05 mg/kg når den ble administrert IV eller SC.

Tabell 6: Doseavhengig suppresjon av IL-12 indusert neopterin med J695 i cynomolgusaper

Behandling med J695 forebygget eller reduserte også forandringene i hematologi som vanligvis er assosiert med rhlL-12 administrering (leukopeni og trombocytopeni). 24 timer etter rhIL-12 administrering var antall lymfocytter redusert med ca. 50 % sammenlignet med startverdier i IV-kontrollen og SC IVIG-behandlede grupper. Administrering av J695 enten SC eller IV på alle tre dosenivåer hindret denne reduksjonen og resulterte i bortimot samme antall lymfocytter etter 24 timer som ved start. Ved 48 timer etter IL-12 administrering var antall blodplater i gruppene behandlet med IV og SC IVIG redusert med ca. 25 % sammenlignet med startverdiene.

Et eksempel på en doseringsplan med målsetning om å oppret-tholde serumnivåer over effektnivået på 90 % ville være 1 mg/kg IV og SC gitt ca. annen hver uke, eller 0,3 mg/kg gitt ca. hver uke, ved å anta noe akkumulering i løpet av gjentatt dosering. Denne studien viser at antistoff kan bli gitt trygt til aper ved slike doser. I uavhengige toksisi-tetsstudier ble det videre funnet at opp til 100 mg/kg av antistoffet kan bli gitt trygt til aper.

J695 var også effektiv til å hindre IFN-y produksjon i mus behandlet med et kimærisk IL-12, et molekyl som kombinerer den murine p35-subenheten med den humane IL-12 p40-subenheten. I motsetning til humant IL-12 som er biologisk inak-tivt i mus, har dette kimæriske IL-12 biologisk funksjon i mus, innbefattende induksjon av IFN-y. I tillegg muliggjør den humane p40-subenheten at molekylet kan bli bundet og nøytralisert av J695. Kimærisk IL-12 ved en dose på 0,05 mg/kg i.p. ble administrert til C3H/HeJ-hunnmus (10/eksperimentelle gruppe) i fem daglige doser på dagene 0, 1, 2, 3 og 4. J695 ble gitt på dagene 0, 2 og 4 ved doser på 0,05, 0,01, 0,002, 0,0004, 0,00008 og 0,000016 mg/kg 1. p., 30' før IL-12 injeksjonene. Kontrollen huIgGly ble gitt IP. ved en dose på 0,05 mg/kg på dagene 0, 2 og 4. Musene ble tappet for blod på dag 5 og IFN-y serumnivåer ble bestemt med ELISA. Resultatene viste at J695 forårsaket doseavhengig inhibisjon av IFN-y produksjon med en ED5opå ca. 0,001 mg/kg. Samlet demonstrerer disse resultatene at J695 er en sterk inhibitor av IL-12 aktivitet in vivo.

Eksempel 5: Kinetikkanalyse av binding av humane antistoffer til rekombinant humant IL-12 (rhIL-12)

"Real-time" bindingsinteraksjoner mellom fanget ligand (humant anti-rhIL-12 antistoff J695, fanget på en biosensormatriks) og analytt (rhIL-12 i løsning) ble målt med overflateplasmonresonans (SPR) ved å anvende BIAcore-systemet (Biacore AB, Uppsala, Sverige). Systemet benytter de optiske egenskapene til SPR for å detektere forandringer i proteinkonsentrasjon i en dekstranbiosensormatriks. Proteiner er bundet kovalent til dekstranmatriksen i kjente konsentrasjoner. Antistoffer injiseres gjennom dekstranmatriksen og spesifikk binding mellom injiserte antistoffer og immobilisert ligand resulterer i en økt matriksprotein-konsentrasjon og resulterende forandring i SPR-signalet. Disse forandringene i SPR-signal registreres som resonans-enheter (RU) og er vist med hensyn til tid langs y-aksen til et sensorgram.

For å lette immobilisering av geit anti-humant IgG (Southern Biotechnology Associates, kat. nr. 2040-01, Birmingham, AL) på biosensormatriksen, bindes geit anti-humant IgG kovalent via frie amingrupper til dekstranmatriksen ved å først aktivere karboksylgrupper på matriksen med 100 mM N-hydroksysuccinimid (NHS) og 400 mM N-Etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimidhydroklorid (EDC). Deretter injiseres geit anti-humant IgG over den aktiverte matriksen. Trettifem mikroliter av geit anti-humant IgG (25 ug/ml), fortynnet i natriumacetat, pH 4,5, injiseres over den aktiverte biosensoren og frie aminer på proteinet er bundet direkte til de aktiverte karboksylgruppene. Urea-gerte matriks EDC-estere deaktiveres med en injeksjon av 1 M etanolamin. Standard aminbindingstestsett var tilgjenge-lig kommersielt (Biacore AB, kat. nr. BR-1000-50, Uppsala, Sverige).

J695 ble fortynnet i HBS kjørebuffer (Biacore AB, kat. nr. BR-1001-88, Uppsala, Sverige) for å bli fanget på matriksen via geit anti-humant IgG. For å bestemme kapasiteten rhlL-12 spesifikke antistoffer har til å binde immobilisert geit anti-humant IgG, ble en bindingstest utført som følger. Delmengder av J695 (25 ug/ml; delmengder på 25 ul) ble injisert gjennom geit anti-human IgG polyklonal antistoff-koblet dekstranmatriks ved en strømningshastighet på 5^1/min. Før injeksjon av proteinet og umiddelbart etterpå, ble HBS-buffer ledet alene gjennom hver gjennomstrømnings-celle. Nettoforskjellen i signal mellom startnivået og punktet som svarer til ca. 30 sekunder etter fullføring av J695-injeksjon ble bestemt til å representere mengden av IgGl J695 som var bundet (ca. 1200 RU'er). Direkte rhIL-12 spesifikk antistoffbinding til løselig rhIL-12 ble målt. Cytokiner ble fortynnet i HBS-kjørebuffer og delmengder på 50 ul ble injisert gjennom de immobiliserte proteinmatriks-ene ved en strømningshastighet på 5 ul/min. Konsentrasjon-ene av rhIL-12 som ble anvendt var 10, 20, 25, 40, 50, 80, 100, 150 og 200 nM. I forkant av injeksjon med rhIL-12, og umiddelbart etterpå, ble HBS-buffer ledet alene gjennom hver gjennomstrømningscelle. Nettoforskjellen i startsignal og signal etter fullføring av cytokininjeksjon ble bestemt til å representere bindingsverdien til den spesielle prøven. Biosensormatrikser ble regenerert ved anvendelse av 100 mM HCI før injeksjon av den neste prøven. BIAcore-kine-tikkevalueringsprogramvare (versjon 2.1) ble anvendt til å bestemme dissosieringskonstanten (av-hastigheten) og asso-sieringskonstanten (på-hastigheten).

Representative resultater av binding av CHO-avledet J695 til rhIL-12 sammenlignet med COS-avledet J695 er vist i Tabell 7.

Molekylære kinetikkinteraksjoner mellom fanget J695 og løselig rhIL-12 ble analysert kvantitativt ved å anvende BIAcore-teknologi. Flere uavhengige forsøk ble utført og resultatene ble analysert med den tilgjengelige BIAcore-matematiske analyseprogramvaren for å utlede kinetiske has-tighetskonstanter, som vist i Tabell 8.

Tabell 8: Kinetiske hastighets- og affinitetskonstanter til J695 for rhIL-12.

Det var en liten forskjell mellom den beregnede konstanten (Kd) for interaksjonen mellom CHO-avledetJ695(Kd= 1,34-<10>M"<1>) og COS-avledet J695 (Kd = 9,74 x IO<-11>M<-1>) antistoff. Dissosieringskonstanten (Kd) mellom J695 og rhIL-12 ble estimert fra de observerte hastighetskonstantene med formelen: Kd = av-hastighet/på-hastighet.

For å bestemme assosierings- og dissosieringshastighetskonstanten for interaksjonen mellom J695 og rhIL-12, ble flere bindingsreaksjoner utført ved å anvende en bestemt mengde av J695 (2 ug/ml) og varierende konsentrasjoner av rhIL-12. "Real-time" bindingsinteraksjonssensorgrammer mellom fanget J695 og løselig rhIL-12 viste at begge antistofformene var veldig like for både assosierings- og dissosieringsfasen.

For å videre evaluere kapasiteten fanget IgGl J695 mAb har til å binde løselig rekombinant cytokin, ble en direkte BIAcore-fremgangsmåte anvendt. I denne fremgangsmåten ble geit anti-human IgG (25 ug/ml) -koblet karboksymetyldeks-transensoroverflate dekket med IgGl J695 (2 ug/ml) og rekombinant cytokin ble deretter tilsatt. Når løselig rhIL-12 ble injisert over en biosensoroverflate med fanget CHO-eller COS-avledet IgGl J695, økte mengden av signal etter som cytokinkonsentrasjonen i løsningen økte. Ingen binding ble observert med rmIL-12 (R&D Systems, kat. nr. 419-ML, Minneapolis, MN) eller enhver konsentrasjon av rhIL-12 testet opp til 1000 nM. Disse resultatene støtter konklusjonen om at IgGl J695-antistoffer gjenkjenner en særskilt determinant på rhIL-12.

Tabell 9 viser resultatene av et forsøk som anvender BIAcore for å demonstrere binding av humant IgGl J695 mAb bare til løselig rhIL-12 og ingen av de andre rekombinante cytokinene.

Eksempel 6: Videre studier av J695-affinitet for IL-12

Molekylære kinetikkinteraksjoner mellom J695-antistoff og humant IL-12 ble analysert kvantitativt ved å anvende BIAcore-plasmonresonansteknologi, og kinetiske hastighets-konstanter ble utledet.

BIAcore-teknologi ble anvendt for å måle bindingen av løselig rhIL-12 til J695 fanget til fast-fase. Et geit anti-humant IgG-antistoff ble immobilisert på biosensorbrikkene, deretter ble en bestemt mengde av J695 injisert og fanget på overflaten. Varierende konsentrasjoner av rhIL-12 ble tilført, og bindingen av IL-12 ved ulike konsentrasjoner til J695 ble målt som en funksjon av tid. Dissosierings- og assosieringshastighetskonstanter ble beregnet ved å anta kinetikker for nullte-ordens dissosiering og første-ordens assosiering, så vel som en enkel én-til-én molekylær interaksjon mellom J695 og IL-12. Tre uavhengige forsøk ble utført, og verdiene som er vist er gjennomsnitt av de tre forsøkene. Fra disse målingene ble dissosierings-(kd) og assosierings- (ka) hastighetskonstantene avledet og anvendt for å beregne en Kd-verdi for interaksjonen (se Tabell 10). Resultatene indikerte at J695 har en høy affinitet for rhIL-12.

Eksempel 7: Karakteristika og nøytraliseringsaktivitet av C17.15, et rotte monoklonalt antistoff til murint interleukin- 12

For å vurdere relevansen av IL-12 behandlingsstudier i musemodeller av inflammasjon og autoimmunitet ved anvendelse av monoklonale antistoffer spesifikke for murint IL-12 til lignende tilnærminger for sykdom hos menneske, ble interaksjonen av C17.15, et rotte anti-murint IL-12 monoklonalt antistoff, med murint IL-12 undersøkt. Evnen C17.15 har til å nøytralisere murin IL-12 aktivitet i en PHA-blastproliferas j onstest og til å blokkere binding av murint IL-12 til celleoverflatereseptorer ble vurdert, hvilket også ble gjort for kinetikkene til bindingsinteraksjonen mellom C17.15 og murint IL-12.

I en human PHA-blastproliferasjonstest (se Eksempel 3) ble seriefortynninger av C17.15 eller rotte IgG2a (et kontroll-antistoff) preinkubert med 230 pg/ml murint IL-12 i 1 time ved 37 °C. PHA-stimulerte blastceller ble satt til antistof f-IL-12 blandingene og inkubert i 3 dager ved 37 °C. Cellene ble deretter merket i 6 timer med 1 uCi/brønn av [<3>H]-tymidin. Kulturene ble høstet og [<3>H]-tymidininkorpo-rering ble målt. Uspesifikk bakgrunnsproliferasjon ble målt i fravær av tilsatt murint IL-12. Alle prøver ble testet i duplikater. IC5o(M) til C17.15 for rekombinant murint IL-12 i denne testen ble funnet å være 1,4 x 10"<11>, sammenlignet med IC5o-verdien på 5,8 x IO"<12>observert for J695 for rekombinant humant IL-12 under de samme betingelsene (se Tabell 11).

Evnen C17.15 har til å inhibere bindingen av murint IL-12 til cellulære reseptorer ble også målt. Seriefortynninger av C17.15 ble preinkubert i 1 time ved 37 °C med 100 pM [125I] -murint IL-12 i bindingsbuf fer. 2D6-cellene (2 x IO<6>) ble satt til blandingen av antistoff og [<125>I]-murint IL-12 og inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Cellebundet radioaktivitet ble separert fra fritt[12<5>I]-IL-12, og den gjenværende cellebundne radioaktiviteten ble bestemt. Total binding av merket murint IL-12 til reseptorer på 2D6-celler ble bestemt i fravær av antistoff, og uspesifikk binding ble bestemt ved inklusjon av 25 nM umerket murint IL-12 i testen. Spesifikk binding ble beregnet som den totale bindingen minus den uspesifikke bindingen. Inkuberinger ble utført i duplikater. Resultatene viste at C17.15 har en IC5o(M) på 1,5 x 10<-10>for inhibisjon av binding av murint IL-12 til cellulære reseptorer.

Affiniteten til C17.15 for rekombinant murint IL-12 ble vurdert med biomolekylær interaksjonsanalyse. Et geit anti-rotte IgG-antistoff ble immobilisert på biosensorbrikkene, etterfulgt av en injeksjon av en bestemt mengde av C17.15-antistoffet, som resulterer i fanging av C17.15 på overflaten av brikken. Varierende konsentrasjoner av rekombinant murint IL-12 ble satt til C17.15-overflaten, og bindingen av murint IL-12 til immobilisert C17.15 ble målt som en funksjon av tid. Dissosierings- og assosieringshastighetskonstanter ble beregnet ved å anta en kinetikk for nullte-ordens dissosiering og første-ordens assosiering, så vel som en enkel én-til-én molekylær interaksjon mellom immobilisert C17.15 og murint IL-12. Fra disse målingene ble dissosierings- (kd, av-hastighet) og assosierings- (ka, på-hastighet) hastighetskonstantene beregnet. Disse resultatene ble anvendt for å beregne en Kd-verdi for interaksjonen. En på-hastighet på 3,8 x IO<5>M-<1>s-1, en av-hastighet på 1,84 x IO-4s' 1 og en Kdpå 4,8 x IO<-10>ble observert for interaksjonen mellom rekombinant murint IL-12 og C17.15.

De observerte aktivitetene til C17.15 i nøytralisering av murin IL-12 aktivitet og binding til celleoverflatereseptorer, så vel som bindingskinetikkene av C17.15 til murint IL-12, korrelerer med lignende målinger for J695/rhIL-12 interaksjonen. Dette indikerer at virkningsmekanismene til rotte anti-mus IL-12 C17.15-antistoffet og anti-humant IL-12 J695-antistoffet er nesten identiske basert på på-hastighet, av-hastighet, Kd, IC5oog PHA-blasttesten. Derfor ble C17.15 anvendt som et homologt antistoff til J695 i murine modeller av inflammasjon og autoimmun sykdom for å studere effektene av IL-12 blokkering på starten eller progresjonen av sykdom i disse modelldyrene (se Eksempel 8).

Eksempel 8: Behandling av autoimmune- eller inflammasjons-baserte sykdommer i mus med administrering av a-murint IL-12 antistoff

A. Suppresjon av kollagenindusert artritt i mus med a-IL-12 antistoffet C17.15

En korrelasjon mellom IL-12 nivåer og revmatoid artritt (RA) har blitt vist. For eksempel har økte nivåer av IL-12 p70 blitt detektert i synovia til RA-pasienter sammenlignet med friske kontroller (Morita et al., (1998) Arthritis and Rheumatism 41:306-314). Derfor ble evnen som C17.15, et rotte anti-mus IL-12 antistoff, har til å undertrykke kollagenindusert artritt i mus vurdert.

DBA/l-hannmus (10/gruppe) ble immunisert med kollagen type II på Dag 0 og behandlet med C17.15, eller kontroll rotte IgG, med 10 mg/kg intraperitonealt annen hver dag fra Dag - 1 (1 dag før kollagenimmunisering) til Dag 12. Dyrene ble monitorert klinisk for utviklingen av artritt i føttene til Dag 90. Artritten ble klassifisert som: 0 - normal; 1 - artritt lokalisert til ett ledd; 2 - mer enn ett ledd involvert, men ikke hele foten; 3 - hel fot involvert; 4 - misdannelse av fot; 5 - ankylose av involverte ledd. Artrittresultatet til en mus var lik summen av artritt-klassifiseringene i hver individuelle fot til musen (maks = 20). Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt + SEM i hver gruppe.

Resultatene, som er vist i Figur 4, indikerer at et artrittresultat var målbart i de C17.15-behandlede musene bare etter dag 50 post-behandling, og at det maksimale gjennomsnittlige artrittresultatet som ble tilveiebragt med de C17.15-behandlede musene var minst 5-fold lavere enn det som ble målt i de IgG-behandlede musene. Dette demonstrerte at rotte anti-mus IL-12 antistoffet C17.15 hindret utviklingen av kollagenindusert artritt i mus.

B. Suppresjon av kolitt i mus med rotte a-murint IL-12 antistoffet C17.15 IL-12 har også blitt demonstrert til å spille en rolle i utviklingen/patologien av kolitt. For eksempel har anti-IL-12 antistoffer blitt vist å undertrykke sykdom i musemodeller med kolitt, f.eks. TNBS-indusert kolitt i IL-2 "knockout"-mus (Simpson et al., (1998) J. Exp. Med. 187 (8) :1225-34) . Likeledes har anti-IL-2 antistoffer blitt demonstrert til å undertrykke dannelse av kolitt i IL-10 "knockout"-mus. Evnen rotte anti-mus IL-12 antistoffet, C17.15, har til å undertrykke TNBS-kolitt i mus ble vurdert i to studier (Davidson et al., (1998) J. Immunol.

161 (6) :3143-9) .

I den første studien ble kolitt indusert i patogenfrie SJL-mus med administreringen av en 150 ul 50 % etanolløsning inneholdende 2,0 mg TNBS levert via et pediatrisk navle-strengsarteriekateter inn i endetarmen. Kontrolldyr ble bare behandlet med en 150 ul 50 % etanolløsning. En enkel dose på 0,75, 0,5, 0,25 eller 0,1 mg C17.15 eller 0,75 mg kontroll rotte IgG2a ble gitt intravenøst via halevenen på dag 11, og den terapeutiske effekten av behandlingen ble vurdert ved å veie dyrene på dag 11 og 17 og histologisk analysering på dag 17. Vekten til musene behandlet med C17.15 økte i løpet av 48 timer med antistoffbehandling og normaliserte seg på dag 6 etter behandling. Effekten ved behandling med C17.15 ble bekreftet histologisk. Videre ble også vurderinger av IFN-y sekresjon med CD4<+>T-celler fra milt og tykktarm til de behandlede musene, så vel som IL-12 nivåer fra milt eller tykktarm-avledede makrofager fra de behandlede musene, utført (se Tabell 12).

I den andre studien ble doseringen optimalisert og musene ble behandlet med en total dose på henholdsvis 0,1 mg eller 0,5 mg C17.15 eller 0,1 mg kontroll IgG2a, delt mellom dag 12 og 14. Det ble funnet at administreringen av C17.15 i en enkel dose med dosen på 0,1 mg/mus eller 0,25 mg/mus bare førte til delvis fremgang i TNBS-indusert kolitt og ikke resulterte i en signifikant reduksjon i CD4<+>T-celleproduk-sjonen av IFN-y in vitro, men resulterte i en signifikant reduksjon i sekresjon av IL-12, sammenlignet med ubehand-lede kontroller. En respons ble observert ved en enkel dose på 0,5 mg/mus eller mer. Doseringsdietten ble forbedret ved å ta den laveste antistoffdosen som ble testet og administrere den i to delte injeksjoner (på dag 12 og 14), som indikerer at flere lave doser kan være mer effektive enn en enkel bolus-dose. De tilveiebragte resultatene er vist i Tabell 12.

Administrering av C17.15 monoklonalt anti-IL-12 i to delte

doser, med én dag i mellom, på totalt 0,1 mg/mus eller 0,05 mg/mus førte til fullstendig reversering av kolitt, som ble vurdert med svinn og makroskopisk utseende av tykktarmen. I tillegg førte denne doseringsplanen til betydelig nedregu-lering av T-celleproduksjon i lamina propria av IFN-y og makrofagproduksjon av IL-12, slik at sistnevnte var sammenlignbar med nivåer observert i etanolbehandlede kontrollmus uten TNBS-kolitt. Derfor førte C17.15 administrering til musemodeller for TNBS-kolitt til reversert progresjon av sykdommen på en doseavhengig måte.

C. Suppresjon av eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) i mus med a-IL-12 antistoffer

Det er vanlig å anta at IL-12 spiller en rolle i patogene-sen til multippel sklerose (MS). Den induserbare IL-12 p40-budbæreren har blitt vist å være uttrykt i akutte plakk i MS-pasienter, men ikke i inflammatoriske hjerneinfarktle-sjoner (Windhagen, A. et al., (1995) J. Exp. Med. 182:1985-1996). T-celler fra MS-pasienter (men ikke kontroll T-cel ler) stimulerer IL-12 produksjon fra antigenpresenterende celler ved hjelp av ukontrollert CD40L-ekspresjon (Balashov, K. E. et al. (1997) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 94:599-603). MS-pasienter har økt IFN-y sekresjon som kan bli blokkert med a-IL-12 antistoffer in vitro (Balashov,

K. E. et al., (1997) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 94:599-603). Forhøyede nivåer av serum IL-12 er detektert i MS-pasienter, men ikke i andre nevrologiske sykdommer (Nicoletti, F et al., (1996) J. Neuroimmunol. 70:87-90). Økt IL-12 produksjon har blitt vist å korrelere med syk-domsaktivitet i MS-pasienter (Cormabella, M. et al., (1998) J. Clin. Invest. 102:671-678). Rollen IL-12 har i patogene-sen av en murin modell av multippel sklerose, eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE), har blitt studert (Leonard, J. P. et al., (1995) J. Exp. Med. 181:281-386; Banerjee, S. et al., (1998) Arthritis Rheum. (1998) 41:S33; og Segal, B. M. et al., (1998) J. Exp. Med. 187:537-546). Sykdommen i denne modellen er kjent for å bli indusert med T-celler fra THx-undergruppen. Derfor ble evnen som a-IL-12 antistoffer har til å hindre igangsetting av akutt EAE vurdert .

Et a-IL-12 antistoff ble funnet å være i stand til å inhibere igangsetting av akutt EAE, til å undertrykke sykdommen etter igangsetting og til å redusere alvorlighetsgraden av relapser i mus immunisert med autoantigenet, myelin basisk protein (Banerjee, S. et al., (1998) Arthritis Rheum.

(1998) 41:S33). De fordelaktige effektene av a-IL-12 antistoffbehandling i musene varte i mer enn to måneder etter at behandlingen opphørte. Det har også blitt demonstrert at anti-IL-12 antistoffer undertrykker sykdommen i mus som er mottakere av encefalitogene T-celler med adoptiv overføring (Leonard, J. P. et al., (1995) J. Exp. Med. 181:281-386).

Eksempel 9: Klinisk farmakologi av J695

I en dobbel blind, overkrysningsstudie fikk 64 friske menn administrert økende doser av J695 eller placebo. Måling av komplementfragment C3a før og 0,25 time etter dosering demonstrerte ikke aktivering av komplementsystemet. CRP og fibrinogennivåer økte bare i individer der symptomer for samtidige infeksjoner ble observert.

Alle individer overlevde og den totale toleransen for J695 var veldig god. Behandlingen måtte ikke bli stoppet i noen tilfeller pga. alvorlige hendelser (AE'er). De mest vanlige observerte AE'ene var hodepine og vanlig forkjøl-else/bronkitt, der ingen av disse ble kategorisert som al-vorlig .

Ett av studieindividene, en 33 år gammel singel mann, led av psoriasis guttata på begynnelsen av studien. I henhold til den randomiserte studiedesignen mottok dette individet tilfeldigvis 5 mg/kg J695 med SC-administrering. Ti dager før administrering av antistoffet hadde individet bare små atskilte papuløse lesjoner på armene og beina. Ved tidspunktet for antistoffadministreringen hadde individet økt rødfarge, tykkelse av de erytematøse plakkene og økt hyperkaratose. Én uke etter J695-administrering rapporterte individet om en forbedret hudtilstand, innbefattende ut-jevning av lesjonene og en reduksjon i flassing. Kort tid etter den andre administreringen av J695 (5 mg/kg IV) var individets hud totalt fri for psoriasislesjoner i fravær av lokal behandling. Erytematøse plakk dekket med hvite skjell dukket opp på nytt samtidig med den forventede fjerningen av J695 etter den andre antistoffadministreringen.

Eksempel 10: Sammenligning av J695 produsert av to CHO-cellelinjer

For rekombinant ekspresjon av J695 ble en rekombinant ekspresjonsvektor, som koder for både den tunge og lette kjeden til antistoffet, introdusert i dhfr" CHO-celler (Urlaub, G. og Chasin, L. A. (1980) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77:4216-4220) med kalsiumfosfat-mediert transfeksjon. I den rekombinante ekspresjonsvektoren er hvert av genene til tung og lett antistoffkjede funksjonelt koblet til en-hanser/promoter-regulatoriske elementer (f.eks. avledet fra SV40, CMV, adenovirus og lignende, slik som et CMV-enhanser/AdMLP-promoter regulatorisk element eller et SV40-enhanser/AdMLP-promoter regulatorisk element) for å oppnå høye gentranskripsjonsnivåer. Den rekombinante ekspresjonsvektoren har også et DHFR-gen, som muliggjør seleksjon av CHO-celler som har blitt transfektert med vektoren ved å anvende metotrexat-seleksjon/amplifisering.

Ett hundre og femti mikrogram av en ekspresjonsvektor som koder for peptidsekvensene til det humane J695-antistoffet ble oppløst i 2,7 ml vann i et 50 ml konisk rør. Tre hundre ul av 2,5 M CaCl2ble tilsatt og denne DNA-blandingen ble satt dråpevis til 3 ml av 2 x HEPES-bufret saltvann i et 50 ml konisk rør. Etter vorteksing i 5 sekunder og inkubering ved romtemperatur i 20 min, ble 1 ml fordelt jevnt over hver plate (fortsatt i F12-medium) og platene ble inkubert ved 37 °C i 4 timer. Væske ble fjernet med aspirasjon og 2 ml av 10 % DMSO i F12 ble satt til hver plate. DMSO-sjokket fortsatte i 1 min og deretter ble DMSO fortynnet ved til-setning av 5 ml PBS til hver plate. Platene ble vasket to ganger i PBS, etterfulgt av tilsetningen av 10 ml Alfa-MEM, supplementert med H/T og 5 % FBS (selektiv for celler som uttrykker DHFR) og inkubert natten over ved 37 °C. Celler ble overført til 96-brønnersplater med en tetthet på 100 celler per brønn, og plater ble inkubert ved 37 °C, 5 % C02i to uker, med ett mediumsbytte per uke.

Fem dager etter det siste mediumsbyttet ble kultursuper-natanter fortynnet 1:50 og testet ved å anvende en ELISA spesifikk for human IgG-gammakjede. Klonene som ga det høyeste ELISA-signalet ble overført fra 96-brønnersplatene til 12-brønnersplater i 1,5 ml/brønn med Alfa-MEM + 5 % dialysert serum. Etter 3 dager ble en annen ELISA utført som var spesifikk for human IgG-gammakjede, og de 12 klonene som hadde størst aktivitet ble fortynnet i Alfa-MEM + 5 % dialysert serum og 20 nM MTX. Cellelinje 031898 218 vokste i nærvær av 20 nM MTX tilsynelatende uten noe celledød eller reduksjon i veksthastigheten og produserte 1,8 ug/ml hlgG i en tredagers test. T-25 kulturer med 031898 218, som vokste i medium inneholdende MTX, produserte gjennomsnittlig 11,9 ug/ml av J695. Linjen, kalt ALP903, ble adaptert for å vokse i suspensjon under serum-frie betingelser, der den produserte 7,5 pg J695/celle/24 timer.

ALP903-celler ble, etter innledende seleksjon i Alfa-MEM/5 % FBS/20 nM MTX-medium, fortynnet og dyrket videre i 20 nM MTX. Cellene ble kultivert under 100 nM MTX-seleksjon, etterfulgt av fortynning og videre dyrkning i 500 nM MTX to ganger de neste 30 dagene. Ved dette tidspunktet produserte kulturen 32 ug J695/mL/24 timer. Kulturen ble subklonet med seriefortynning. Subklon 218-22 produserte 16,5 ug/ml i en

96-brønnersplate i 2 dager og 50,3 ug/ml av J695 i en 12-brønnersplate i 2 dager. Klon 218-22 ble dyrket i Alfa-MEM/5 % dialysert FBS/500 nM MTX i 38 dager, etterfulgt av adapsjon til serumfri spinnekultur, som ovenfor. Den gjennomsnittlige cellespesifikke produktiviteten til den serum-frie suspensjonskulturen, kalt ALP 905, var 58 pg/celle/24 timer.

Den første cellelinjen som ble anvendt til å produsere J695 (ALP 903) resulterte i lavere utbytte av antistoffet fra kultur enn en annen cellelinje, ALP 905. For å sjekke at ALP 905-produsert J695 var funksjonelt identisk med det som ble produsert fra ALP 903, ble begge antistoffproduksjonene vurdert for IL-12 affinitet, for evnen til å blokkere IL-12 binding til cellulære reseptorer, for evnen til å inhibere IFN-y induksjon med IL-12 og for evnen til å inhibere IL-12 mediert PHA-blastproliferasjon.

Affinitetene av J695-produksjonene ALP 903 og ALP 905 for IL-12 ble bestemt ved å måle de kinetiske hastighetskon stantene av binding til IL-12 med overflateplasmonresonans-studier (BIAcore-analyser). Av-hastighetskonstanten (kd) og på-hastighetskonstanten (ka) til antistoffproduksjonene ALP903 og ALP905 for binding til rhIL-12 ble bestemt i tre forsøk (som beskrevet i Eksempel 3). Affiniteten, Kd, av binding til IL-12 ble beregnet ved å dividere av-hastighetskonstanten med på-hastighetskonstanten. Kdble beregnet for hvert separate forsøk for så å beregne gjennomsnittet av disse. Resultatene viste at de bestemte kinetiske parametrene og affiniteten av binding til rhIL-12 var veldig like for J695-produksjonene ALP 903 og ALP 905: den beregnede Kdvar 1,19 + 0,22 x 10<-10>M for produksjon ALP 903 og 1, 49 + 0, 47 x 10<-10>M for produksjon ALP 905 (se Tabell 13).

Evnen J695, avledet fra både ALP 903 og ALP 905, har til å blokkere binding av rhIL-12 til IL-12 reseptorer på humane PHA-aktiverte T-lymfoblaster ble vurdert (se Eksempel 3). Hver prøve av J695 ble testet ved en startkonsentrasjon på 1 x IO-<8>med 10-fold seriefortynninger. Antistoffet ble preinkubert i 1 time ved 37 °C med 50 pM [125I ]-humant IL-12 i bindingsbuffer. PHA-blastceller ble satt til blandingen av antistof f / [125I ]-humant IL-12 og inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Cellebundet radioaktivitet ble separert fra fritt [<125>I]-IL-12 med sentrifugering og vasking, og % inhibisjon ble beregnet. ICso-verdiene for J695 ble bestemt fra inhibisjonskurvene ved å anvende 4-parameters kurvetilpass-ing og ble bekreftet med to uavhengige forsøk. Inkuberinger ble utført i duplikater. Resultatene for de to J695-produk-sjonene var veldig like (se Tabell 13).

Evnen J695 fra både ALP 903- og ALP 905-celler har til å inhibere rhIL-12 indusert IFN-y produksjon i humane PHA-aktiverte lymfoblaster in vitro ble vurdert. Seriefortynninger av J695 ble preinkubert med 200 pg/ml rhIL-12 i 1 time ved 37 °C. PHA-lymfoblastceller ble tilsatt og inkubert i 18 timer ved 37 °C. Etter inkubering ble cellefri supernatant høstet og nivået av humant IFN-y bestemt med ELISA. IC5o-verdiene fra inhibisjonskurvene ble plottet mot antistoffkonsentrasjonen ved å anvende 4-parameters kurve-tilpassing. Resultatene demonstrerer at evnen de to antistof fproduksj onene har til å inhibere IFN-y produksjon er veldig lik.

PHA-blastcelleproliferasjonstesten in vitro ble anvendt for å måle nøytraliseringsevnen til ALP 903 og ALP 905 J695 for rhIL-12. Seriefortynninger av J695 av hver type ble preinkubert med 230 pg/ml humant IL-12 i 1 time ved 37 °C. Deretter ble PHA-blastceller tilsatt og inkubert i 3 dager ved 37 °C. Cellene ble deretter merket i 6 timer med 1 yCi/brønn [<3>H]-tymidin. Kulturene ble høstet og [<3>H]-tymi-dininkorporering målt. Uspesifikk proliferasjon (bakgrunn) ble målt i fravær av rhIL-12. IC5o-verdiene for ALP 903 og ALP 905 J695 ble funnet å være veldig like og er vist i Tabell 13.

Aktiviteten J695-antistoffene har i nøytralisering av rhlL-12 aktivitet, i blokkering av IL-12 binding til celleoverflatereseptorer og i binding til rhIL-12 var ikke signifikant forskjellig fra produksjon ALP 903 til produksjon ALP 905, og derfor var antistoffene produsert fra disse to ulike celletypene ekvivalente.

Ekvivalenter

Fagfolk vil gjenkjenne, eller være i stand til å vurdere, uten å anvende mer enn rutinemessig eksperimentering, mange ekvivalenter til de spesifikke utførelsene av den foreliggende oppfinnelsen beskrevet heri. Slike ekvivalenter er ment å bli omfattet av de følgende kravene.

Claims

1. Isolert humant antistoff eller antigenbindende del derav som binder p40-subenheten av human IL-12 og dissosierer fra humant IL-12 med en koff -hastighetskonstant på 1 x IO" <4> s" <1> eller mindre som bestemt med overflate plasmonresonans hvor nevnte antistoff nø ytraliserer aktiviteten av humant IL-12.

2. Isolert humant antistoff eller antigenbindende del derav som binder til humant IL-12 og dissosierer fra humant IL-12 med en koff -hastighetskonstant på 1 x IO" <4> s" <1> som bestemt med overflate plasmonresonans hvor nevnte antistoff nø ytraliserer aktiviteten av humant IL-12.

3. Isolert humant antistoff ifølge krav 1 eller antigenbindende del derav, hvor antistoffet nø ytraliserer aktiviteten av humant IL-12 når p40-subenheten er bundet til subenheten av IL-12.

4. Isolert humant antistoff ifølge ethvert av kravene 1-3 eller antigenbindende del derav, som dissosierer fra humant IL-12 med en koff -hastighetskonstant på lxlO" <5> s" <1> eller mindre.

5. Isolert humant antistoff ifølge ethvert av kravene 1-4 eller antigenbindende del derav, som inhiberer fytohemagglutinin blast-proliferasjon i et in vitro PHA-assay med en IC50 på lxlO" <8> M eller mindre.

6. Isolert humant antistoff ifølge ethvert av kravene 1-4 eller antigenbindende del derav som inhiberer fytohemagglutinin blast-proliferasjon i et in vitro PHA-assay med en IC50 på lxlO" <9> M eller mindre.

7. Isolert humant antistoff ifølge ethvert av kravene 1-4 eller antigenbindende del derav som inhiberer fytohemagglutinin blast-proliferasjon i et in vitro PHA-assay med en IC50 på lxlO" <10> M eller mindre.

8. Isolert humant antistoff eller antigenbindende del derav ifølge ethvert av kravene 1-7, hvor antistoffet er et IgGl antistoff.

9. Farmasøytisk sammensetning omfattende antistoffet eller en antigenbindende del derav ifølge ethvert av kravene 1-6 samt et farmasøytisk akseptabelt bæremiddel.

10. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 9, som videre omfatter et ytterligere middel.

11. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 10, hvor det ytterligere middel er et terapeutisk middel.

12. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 11, hvor det terapeutiske middel er valgt fra gruppen bestående av budenosid, epidermal vekstfaktor, kortikosteroider, cyklosporin, sulfasalazin, aminosalisylater, 6-merkaptopurin, azatioprin, metronidazol, lipooksygenase-inhibitorer, mesalamin, olsalazin, balsalazid, antioksydanter, tromboksan-inhibitorer, IL-1 reseptor-antagonister, anti-IL-l|3 monoklonale antistoffer, anti-IL-6 monoklonale antistoffer, vekstfaktorer, elastase-inhibitorer, pyridinyl-imidazol-forbindelser, antistoffer eller agonister av TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF og PDGF, antistoffer mot CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 eller deres ligander, metotreksat, cyklosporin, FK506, rapamycin, mykofenolat mofetil, leflunomid, NSAIDs, ibuprofen, kortikosteroider, prednisolon, fosfodiesterase- inhibitorer, adenosin-agonister, antitrombotiske midler, komplement-inhibitorer, adrenergiske midler, IRAK, NIK, IKK, p38, MAP kinase-inhibitorer, IL-ip konverterende enzym-inhibitorer, TNFa konverterende enzym-inhibitorer, T-celle-signaliseringsinhibitorer, metallprotease-inhibitorer, sulfasalazin, azatroprin, 6-merkaptopuriner, angiotensin-konverterende enzyminhibitorer, oppløselige cytokin-reseptorer, oppløselig p55 TNF-reseptor, oppløselig p75 TNF-reseptor, sIL-lRI, sIL-lRII, slL-6R, antiinflammatoriske cytokiner, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 ogTGFp.

13. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 11, hvor det terapeutiske middel er valgt fra gruppen bestående av anti-TNF antistoff og antistoffragmenter derav, TNFR-lg-konstrukter, TACE-inhibitorer, PDE4-inhibitorer,. kortikosteroider, budesonid, deksametason, sulfasalazin, 5-aminosalisylsyre, olsalazin, IL-ip konverterende enzym-inhibitorer, IL-lra, tyrosinkinase-inhibitorer, 6-merkaptopuriner og IL-11.

14. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 11, hvor det terapeutiske middel er valgt fra gruppen bestående av kortikosteroider, prednisolon, metylprednisolon, azatropin, cyklofosfamid, cyklosporin, metotreksat, 4-aminopyridin, tizanidin, interferon-pia, interferon-pib, Koplymer 1, hyperbarisk oksygen, intravenøs immunoglobulin, klabribin, antistoffer eller agonister avTNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, PDGF, antistoffer mot CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 eller deres ligander, metotreksat, cyklosporin, FK506, rapamycin, mykofenolat mofetil, leflunomid, NSAIDs, ibuprofen, kortikosteroider, , prednisolon, fosfodiesterase-inhibitorer, adenosin-agonister, antitrombotiske midler, komplement-inhibitorer, adrenergiske midler, IRAK, NIK, IKK, p38 elelr MAP kinase-inhibitorer, IL-ip konverterende enzym-inhibitorer, TACE-inhibitorer, T-celle-signaliserende inhibitorer, kinase-inhibitorer, metalloproteinase-inhibitorer, sulfasalazin, azatioprin, 6-merkaptopuriner, angiotensin-konverterende enzym-inhibitorer, opplø selige cytokin-resseptorer, opplø selig p55 TNF-reseptor, opplø selig p75 TNF-reseptor, sIL-lRI, sil-lRII, slL-6R, SIL-13R, anti-P7-midler, p-selektin glykoprotein-ligand (PSGL), antiinflammatoriske cytokiner, IL-4, IL-10, IL-13 ogTGFp.

15. Fremgangsmåte for inhibering av aktiviteten av human IL-12 in vitro, omfattende å sette humant IL-12 i kontakt med antistoffet eller den antigenbindende del derav ifølge ethvert av kravene 1-8 slik at aktiviteten av det humane IL-12 blir inhibert.

16. Anvendelse av antistoffet eller et antigenbindende fragment derav ifølge ethvert av kravene 1-8, for fremstilling av et medikament til behandling eller forebygging av en sykdom valgt fra gruppen bestående av rheumatoid artritt, osteoartritt, kronisk artritt hos unge, Lyme artritt, psoriatrisk artritt, reaktiv artritt, spondyoartrtopati, ankyloserende spondylitt, systemisk lupus erytematosus, Crohns sykdom, ulcerativ kolitt, inflammatorisk tarmsykdom, multippel sklerose, insulinavhengig diabetes mellitus, tyroiditis, astma, allergiske sykdommer, psoriasis, dermatittisk skleroderma, tyroiditis, transplantat-mot-verts-sykdom, avstøtning av organstransplantat, akutte og kroniske immunsykdommer assosiert med organtransplantasjon, sarkoidosis, aterosklerose, dissemiert intravaskulær koagulering, Kawasakis sykdom, Graves sykdom, nefrotisk syndrom, kronisk tretthetssyndrom, polyarteritis nodosa, Wegeners granulomtaosis, Henoch-Schonlein purpura, mikroskopisk vaskulitt hos nyrene, kronisk aktiv hepatitt, Sjogrens syndrom, uveitis, sepsis, septisk sjokk, sepsis-syndrom, respiratorisk nø dssyndrom, kakeksi, infeksjonsdyktige sykdommer, parasittiske sykdommer, ervervet immunsviktsyndrom, akutt transvers myelitt, myastenia gravis, Huntingdons chorea, Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, slag, primær biliær cirrhose, fibrotiske lungesykdommer, hemolytisk anemi, ondartede sykdommer, hjertesvikt og myokardialt infarkt ved administrasjon til et menneske.

17. Anvendelse ifølge krav 16, hvor sykdommen er psoriasis.

18. Anvendelse ifølge krav 16, hvor sykdommen er Crohns sykdom.

19. Anvendelse ifølge krav 16, hvor sykdommen er multippel sklerose.

20. Anvendelse ifølge krav 16, hvor sykdommen er rheumatoid artritt.

21. Isolert nukleinsyremolekyl som koder for det humane antistoff elelr en antigenbindende del derav ifølge krav 1 eller 2.

22. Rekombinant ekspresjonsvektor omfattende det isolerte nukleinsyremolekyl ifølge krav 21.

23. Vertscelle inn i hvilken den rekombinante ekspresjonsvektor ifølge krav 22 har blitt introdusert.