CN102143760B - 前列腺素e2结合蛋白及其用途 - Google Patents

前列腺素e2结合蛋白及其用途 Download PDF

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J.沈
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A.穆尔塔扎
E.塔查
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Abstract

本发明包括前列腺素E2（PGE2）结合蛋白。本发明涉及其为野生型、嵌合、CDR移植的和人源化的抗体。优选抗体对于前列腺素E2具有高亲和力，并且在体外和体内中和前列腺素E2活性。本发明的抗体可以是全长抗体或其抗原结合部分。还提供了制备方法和使用本发明的抗体的方法。本发明的抗体或抗原结合部分用于检测前列腺素E2且用于抑制前列腺素E2活性，例如在患有其中前列腺素E2活性是有害的病症的人受试者中。

Description

前列腺素E2结合蛋白及其用途
相关申请援引
本申请是非临时性申请，要求2008年7月8日提交的美国临时申请系列号61/134,264、和于2008年10月23日提交的美国临时申请系列号61/197,258的优先权，其内容在此通过援引并入。
发明领域
本发明涉及对脂质代谢产物例如前列腺素E2（PGE2）特异的结合蛋白及其组合物，例如抗体和抗原结合部分，以及制备、表征和在疾病预防、诊断和治疗中使用其的方法。
发明背景
生物学活性脂质例如前列腺素（PG）、血栓烷（TX）、白三烯（LT）和1-磷酸-鞘氨醇在各种病症的病因学中起关键生理学作用。（Wymann，MP和Schneiter R，Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 9（2）:162-76（2008））。在炎症过程中，细胞磷脂酶特别是磷脂酶A2和C被激活，并且使细胞膜磷脂降解为花生四烯酸（AA）。AA通过2个主要途径进行代谢――环加氧酶（COX）和脂肪加氧酶（LO）途径。COX途径产生前列腺素（PGD2、PGE2、PGF2 α、前列腺环素或PGI2、和血栓烷A2或TXA2）。LO途径具有2个分支；5-LO途径产生白三烯（例如，LTA4、LTB4、LTC4、LTD4、LTE4和LTF4），并且15-LO途径产生脂氧素（例如，LXA4、LXB4）。前列腺素类例如前列腺素（PG）、血栓烷（TX）和白三烯（LT）具有各种生理活性用于维持体内的局部稳态（The Pharmacological Basis of Therapeutics，Gilman，等人编，第7版，第660页，Macmillan Publishing Co.，New York（1985））。COX的产物PG G2/ PG H2通过组织特异性异构酶的作用转换为特定PGs，以产生PGI2、TXA2、PGD2、PGE2和PGF2 α。PGs的生物学功能通过组织特异性细胞表面视紫红质样7次跨膜G蛋白偶联受体（GPCRs）介导。每种PG的精确生理学/病理学作用由细胞背景、受体表达谱、配体亲和力和与信号转导途径的差别偶联决定（Haluska 等人，Annu. Rev. Pharm. Tox. 10:213（1989）；Prostanoids and their Receptors. In Comprehensive Medicinal Chemistry，第643页，Pergamon Press，Oxford（1990））。PGs一般在vasomotricity调节、睡眠/清醒周期、肠分泌、脂解、肾小球过滤、肥大细胞脱颗粒作用、神经传递、血小板聚集、leuteolysis、子宫肌层收缩和分娩、炎症和关节炎、动脉导管开放、细胞生长和分化、和免疫应答调节中起广泛多样的生理学作用。在病理生理学上，PGs已牵涉各种疾病，包括疼痛和炎症、癌症、神经学疾病、心血管疾病和高血压。
前列腺素E2（PGE2）是前列腺素类家族成员。PGE2广泛参与胃肠道收缩和松弛、胃酸分泌、平滑肌松弛和神经递质释放。已鉴定了关于PGE2的4种亚型受体，包括EP1、EP2、EP3和EP4（Negishi，M. 等人，J. Lipid Mediators Cell Signalling，12:379-391（1995）），其各自涉及不同的信号转导途径。
PGE2是AA代谢的COX途径的主要产物。它是在关节中合成的主要PG，并且在关节炎炎症和发病机理中起重要作用。已鉴定了5种PGE2合酶。（Smith WL，Am. J. Physiol. 263（2 Pt 2）:F181-91（1992））。在这5种中，膜PGE合酶（mPGES）-1看起来是负责PGE2生产的关键PGE2转换酶。相对于其他PGE合酶，MPGES-1显示出最高催化活性，并且与COX-1和/或COX-2结合起作用，以将PGH2转换为PGE2。使用mPGES-1 KO小鼠（Kamei，D.，等人，J. Biol. Chem.，279（32）:33684-95（2004）；Trebino，C.E.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100（15）:9044-9（2003）、特异性PGE2受体同种型KO小鼠（McCoy，J.M.，等人 J. Clin. Invest.，110（5）:651-8（2002）；Majima，M.，等人 Trends Pharmacol. Sci.，24（10）:524-9（2003）；和Amano，H.，等人，J. Exp. Med.，197（2）:221-32（2003）；和抗PGE2特异性抗体（Portanova，J.P.，等人，J. Exp. Med.，184（3）:883-91（1996）；Zhang，Y.，等人，J. Pharmacol. Exp. Ther.，283（3）:1069-75（1997）的研究暗示PGE2在类风湿性关节炎（RA）、疼痛和炎症以及癌症发展的动物模型中起主要作用。在不存在mPGES-1的情况下，COX-1、COX-2和其他PGE2合酶的水平保持相对不变。与野生型小鼠比较，mPGES-1 KO小鼠是存活、能育且正常发育的。然而，它们显示出在PGE2生产的基础水平中以及在用各种免疫刺激攻击后来自巨噬细胞的PGE2生产中的急剧减少。此外，TXA2的生产增加。mPGES-1 KO小鼠显示关节炎发展的发生率和严重性减少，并且在各种模型中显示针对疼痛和炎症的抗性。几个实验室已独立产生了各种EP受体同种型KO小鼠。这些小鼠是存活、能育且正常发育的。使用特异性EP同种型KO小鼠的研究证实PGE2的各种功能经由特异性EP同种型介导。例如，EP4同种型的缺乏明确影响小鼠中关节炎发展的严重性，而EP3的缺乏通过调节经由基质细胞的VEGF生产和血管发生来影响肿瘤发展和进展。
前列腺素生物合成和代谢中的缺陷目前被认为在自身免疫和炎性病症的病因学中起重要作用。例如，与来自未受影响受试者的滑膜组织比较，来自患有类风湿性关节炎的患者的滑膜组织产生更大量的PGE2和前列腺素F2 α（PGF2 α）（Blotman，F.，等人，Rev. Rhum. Mal. Osteoartic，46（4）:243-7（1979））。相似地，在显示出食物耐受不良继发的全身性和胃肠道症状的患者中出现PGE2和PGF2 α的合成增加。因此，摄入特定食物继发的偏头痛可以是2-系列前列腺素合成增加的结果。多发性硬化也与前列腺素PGE1和PGE2正常水平中的不平衡相关。生殖的许多方面例如生殖力、妊娠和分娩可以通过前列腺素调节。前列腺素还在生殖生理学中起主要作用。过量前列腺素合成促使痛经和生产，这可以通过静脉内施用前列腺素或通过插入前列腺素阴道栓进行诱导。（Wang L. 等人，Occup. Environ. Med. 61（12）:1021-1026（2004））。PGE2的过量合成也在生殖病症中起主要作用，例如不育、反复流产、先兆子痫和子痫。因此存在关于对于PGE2特异性的抗体的需要，所述抗体阻断或调节其生物学功能，可以用于预防和治疗与PGE2过量生产相关的疾病，以及诊断目的。
高度特异性、高亲和力（KD为约300pM）抗PGE2 mAb――2B5的产生已得到报道。（Mnich SJ，等人 J. Immunol. 155（9）:4437-44（1995））。2B5相对于吲哚美辛COX-1,2抑制剂的功效在小鼠中疼痛和炎症以及在大鼠中佐剂诱发性关节炎的动物模型中进行测定。（Portanova JP 等人，J. Exp. Med. 184（3）:883-91（1996））。这些研究明确显示2B5在减少疼痛和炎症以及关节炎严重性方面与吲哚美辛一样有效，暗示PGE2是这些动物模型中AA代谢的COX-1，2途径中的关键参与者。
通过COX抑制剂抑制泛-PG生产已是数十年来充分确定的治疗策略。COX的2种同种型COX-1和COX-2是已知的，其各自由不同基因编码。2种同种型执行基本上相同的催化反应，并且具有相似的三级结构（Garavito RM，等人，Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32:183-206（2003））。COX-1在几乎所有组织中组成性表达，并且被认为在很大程度上负责正常“看家”功能，例如胃细胞保护和稳态。相比之下，COX-2在特定组织中组成性表达，并且可在炎症和癌症部位高度诱导。因此，COX-2介导的PG生产被认为在炎症和癌症部位起重要作用。传统非类固醇消炎药（NSAIDs）例如阿司匹林、吲哚美辛、布洛芬）抑制2种COX同种型。这些化合物是对于疼痛、类风湿性关节炎（RA）、骨关节炎（OA）和心血管疾病最广泛使用的药物，并且目前考虑用于预防结肠癌和AD。传统NSAIDs的主要障碍是在高危群体中的胃和肾不利事件，这被认为是由于COX-1的抑制。因此，第二代NSAIDs，COX-2选择性抑制剂（例如，塞来考昔，西乐葆；罗非昔布，万络；伐地考昔，Bextra），被认为具有更佳的治疗谱。这种假设已导致其广泛用于疼痛、RA和OA。自从在1999年批准第一种COX-2抑制剂后，在2004年COX-2抑制剂的组合销售是约US $ 50亿。然而，近期某些COX-2选择性抑制剂撤出市场，并且处于FDA审查下，由于关于特定COX-2抑制剂在高危患者中的心血管副作用。与COX抑制剂相关的阻碍可能由于其抑制所有PGs的能力而引起，并且特别是由于其差别干扰PGI2和TXA2生产的能力而引起，所述PGI2和TXA2在维持心血管稳态中起重要作用（Martínez-González J. 等人，Curr. Pharm. Des. 13（22）：2215-2227（2007））。COX抑制可能使得更多的AA对于LO途径可用，因此增加白三烯和脂氧素生产，这可能促成COX抑制相关不利效应。使用COX-1和/或COX-2敲除小鼠以及COX-1和COX-2特异性抑制剂的近期研究也暗示关于2种COX同种型的生理学作用的假设可能是不正确的。（Loftin，C.D.，等人 Prostaglandins Other Lipid Mediat. 68-69:177-85（2002））。这些研究暗示COX-1和COX-2在供应PGs以维持组织稳态中都起重要作用，并且2种同种型可能促成疾病发展，例如疼痛、炎症和癌症。因此，用特异性抗体阻断COX-1和COX-2途径下游的有害PGE2看起来是用于治疗特定人疾病的有吸引力的方法。
重要生物学活性前列腺素的另一个例子是PGD2。PGD2是在免疫攻击后由肥大细胞生产的花生四烯酸的主要环加氧酶产物（Lewis，等人，J. Immunol. 129:1627-1631（1982））。活化肥大细胞，PGD2的主要来源，是在病状中驱动变应性应答中的关键参与物（player）之一，所述病状例如哮喘、变应性鼻炎、变应性结膜炎、变应性皮炎和其他疾病（Brightling，等人，Clin. Exp. Allergy 33:550-556（2003））。近期研究已显示PGD2通过2种不同的G蛋白偶联受体（GPCRs）发挥其作用――在各种人组织中表达的T辅助2型细胞（CRTH2）上表达的D-前列腺素类受体（DP）和化学吸引剂受体-同源分子。PGD2/CRTH2系统介导嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和Th2细胞的趋化性，这涉及变应性炎症的诱导（Ulven T 等人，Curr. Top. Med. Chem. 6（13）:1427-1444（2006））。PGD2的许多作用通过其对D型前列腺素（“DP”）受体的作用而介导，所述DP受体是在上皮和平滑肌上表达的G蛋白偶联受体。在哮喘中，呼吸上皮长久以来已被认为是驱动疾病发展的炎性细胞因子和趋化因子的关键来源（Holgate，等人，Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162:113-117（2000））。在哮喘的实验鼠模型中，DP受体在抗原攻击后在气道上皮上急剧上调（Matsuoka，等人，Science 287:2013-2017（2000））。DP受体涉及人变应性鼻炎，特征在于喷嚏、痒、rhinorea和鼻充血症状的常见变应性疾病。DP拮抗剂已显示在减轻许多物种中的变应性鼻炎症状中有效，并且更具体而言已显示抑制抗原诱导的鼻充血，变应性鼻炎中表现最多的症状（Jones，等人，Am. J. Resp. Crit. Care Med. 167:A218（2003）；Arimura，等人，S-5751. J. Pharmacol. Exp. Ther. 298（2）:411-9（2001））。DP拮抗剂在变应性结膜炎和变应性皮炎的实验模型中也是有效的（Arimura 等人，S-5751. J. Pharmacol. Exp. Ther. 298（2）:411-9（2001）；Torisu，等人，Bioorg. & Med. Chem. 12:5361-5378（2004））。因此也存在关于对于PGD2特异性的抗体的需要，并且阻断或调节其生物学功能因此可以用于预防和治疗与PGD2过量生产相关的疾病。
1-磷酸鞘氨醇（S1P）是诱导许多细胞效应的生物学活性脂质的另一个例子，包括导致血小板聚集、细胞增殖、细胞形态、肿瘤细胞侵袭、内皮细胞趋化性和内皮细胞体外血管发生的那些。S1P受体因此是用于治疗应用例如伤口愈合和肿瘤生长抑制的良好靶。S1P部分经由命名为S1P1、S1P2、S1P3、S1P4和S1P5（以前分别被称为EDG-1、EDG-5、EDG-3、EDG-6和EDG-8）的一组G蛋白偶联受体给细胞发信号。这些受体与关于结构相关溶血磷脂酸（LPA）的3种其他受体（LPA1、LPA2和LPA3（以前为EDG-2、EDG-4和EDG-7））共享50-55％氨基酸和簇同一性。（Ishii，I. 等人，Mol. Pharmacol. 58（5）:895-902（2000））。当配体与那种受体结合时，在G蛋白偶联受体（GPCR）中诱导构象转变，促使在结合的G蛋白的α-亚单位上的GDP由GTP替换和G蛋白后续释放到细胞质内。α-亚单位随后与βγ-亚单位解离，并且每个亚单位随后可以与效应蛋白质结合，这激活第二信使，导致细胞应答。最后，在G蛋白上的GTP水解为GDP，并且G蛋白的亚单位彼此再次结合，并且随后与受体再次结合。扩增在一般GPCR途径中起主要作用。一种配体与一种受体的结合导致许多G蛋白的活化，各自能够与许多效应蛋白质结合，导致扩增的细胞应答。S1P受体成为良好的药物靶，因为个别受体是组织和应答特异性的。S1P受体的组织特异性是重要的，因为开发对于一种受体选择性的激动剂或拮抗剂使细胞应答集中于包含那种受体的组织，限制不希望有的副作用。S1P受体的应答特异性也是重要的，因为它允许开发起始或抑制特定细胞应答而不影响其他应答的激动剂或拮抗剂。例如，S1P受体的应答特异性可以允许起始血小板聚集而不影响细胞形态的S1P模拟物。
S1P作为鞘氨醇的代谢产物在其与鞘氨醇激酶的反应中形成，并且大量贮存于血小板聚集体中，其中存在高水平的鞘氨醇激酶且不存在鞘氨醇裂解酶。S1P在血小板聚集过程中释放，在血清中累积，并且也在恶性腹水中发现。S1P生物降解最可能经由通过磷酸外切水解酶（ectophosphohydrolases）水解而进行，特别是1-磷酸-鞘氨醇磷酸水解酶。因此存在关于对于S1P特异性的抗体的需要，用于通过阻断其与受体的相互作用或稳定S1P且增强其生物效应来调节其生物学功能，用于在预防或治疗自身免疫疾病、炎性疾病和癌症中使用。
由于PGE2在各种人病症中的作用，已设计了抑制或对抗PGE2活性的治疗策略。特别地，适合于递送给人的治疗抗体仍未得到报道，所述治疗抗体与PGE2结合且中和PGE2。本领域存在关于能够结合且中和PGE2的改良抗体的需要。
发明概述
本发明涉及对脂质代谢产物例如前列腺素E2（PGE2）特异的结合蛋白。本发明的PGE2结合蛋白包括但不限于能够结合PGE2的抗体、抗原结合片段、和具有各种支架的抗原结合片段。
本发明的一个方面涉及能够结合PGE2的结合蛋白。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白具有中和、稳定、拮抗和/或激动活性。在另一个实施方案中，结合蛋白能够调节PGE2的生物学功能。例如，结合蛋白能够至少部分中和PGE2。
在本发明的一个方面，结合蛋白能够结合PGE2，并且阻止PGE2与一种或更多种PGE2受体（例如，EP1、EP2、EP3和EP4）结合。在本发明的一个实施方案中，结合蛋白能够结合PGE2，并且阻止PGE2与EP1、EP2、EP3和EP4受体结合。
本发明提供了制备、表征且使用PGE2结合蛋白作为单一疗法或作为与其他治疗剂的组合疗法的方法；以及在预防和/或治疗由PGE2介导的疾病中的方法，所述疾病例如自身免疫和炎性疾病，例如类风湿性关节炎、Crohn氏病、骨关节炎、AMD、淋巴结病、溶血性贫血、紫癜、强直性脊柱炎、多发性硬化、糖尿病、癌症、疼痛、骨丢失/恢复、atherosclelotic病、生殖病症和其他疾病。本发明的结合蛋白还可以用于此种疾病的诊断中。
在本发明的一个实施方案中，结合蛋白是结合PGE2的分离的抗体或其抗原结合片段。此种结合可以在基于生物素化PGE2的ELISA测定中加以证实，其中EC50选自约1x10-6 - 约1x10-7 M、约1x10-7 - 约1x10-8 M、约1x10-8 - 约1x10-9 M、约10-9 - 约10-10 M、约1x10-10 - 约1x10-11 M、和约10-11 - 约10-12 M。在另一个实施方案中，结合蛋白与PGE2的结合在基于3H标记的PGE2的放射免疫测定中加以证实，其中KD选自约1x10-6 - 约1x10-7 M、约1x10-7 - 约1x10-8 M、约1x10-8 - 约1x10-9 M、约10-9 - 约10-10 M、约1x10-10 - 约1x10-11 M和约10-11 - 约10-12。在另一个实施方案中，结合蛋白与PGE2的结合在FLIPR中加以证实，其中通过其受体EP4介导的PGE2诱导的钙流入通过结合蛋白与PGE2的结合加以抑制，其中IC50选自约1x10-6 - 约1x10-7 M、约1x10-7 - 约1x10-8 M、约1x10-8 - 约1x10-9 M、约10-9 - 约10-10 M、约1x10-10 - 约1x10-11 M和约10-11 - 约10-12。
在一个实施方案中，在基于FACS的受体结合测定中，抗体抑制生物素化PGE2与细胞表面上的EP1、EP2、EP3和/或EP4受体结合，或在基于ELISA的受体结合测定中，抗体抑制生物素化PGE2与使用受体表达细胞制备的膜制剂上的EP1、EP2、EP3和/或EP4受体结合，其中IC50为约1x10-6 - 约1x10-7 M、约1x10-7 - 约1x10-8 M、约1x10-8 - 约1x10-9 M、约10-9 - 约10-10 M、约1x10-10 - 约1x10-11 M和约10-11 - 约10-12，或在基于3H PGE2的放射免疫测定中，抗体抑制3H- PGE2与细胞表面或膜制剂上的EP1、EP2、EP3和/或EP4受体结合，其中IC50为约1x10-6 - 约1x10-7 M、约1x10-7 - 约1x10-8 M、约1x10-8 - 约1x10-9 M、约10-9 - 约10-10 M、约1x10-10 - 约1x10-11 M和约10-11 - 约10-12，和/或在EP4介导的FLIPR测定中，抗体抑制PGE2诱导的钙流入，其中IC50为1x10-6 - 约1x10-7 M、约1x10-7 - 约1x10-8 M、约1x10-8 - 约1x10-9 M、约10-9 - 约10-10 M、约1x10-10 - 约1x10-11 M和约10-11 - 约10-12。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段结合PGE2，并且在基于细胞表面的受体结合测定中，或在基于放射免疫测定的受体结合测定中，在100 nM的浓度下使PGE2与其受体中的至少一种的结合抑制约70-100％。
在一个实施方案中，抗体是19C9、4F10、15F10、K1B、K7H、K3A、L11、L21、2B5-7.0、2B5-8.0或2B5-9.0或其变体。在一个实施方案中，变体是人源化变体，例如Hu2B5.P1或Hu2B5.P2。
在另一个方面，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其结合PGE2，并且在角叉菜胶诱导的啮齿类动物爪水肿模型中，使爪水肿抑制约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一个特定实施方案中，在角叉菜胶诱导的啮齿类动物爪水肿模型中，抗体使爪水肿抑制超过约10％。
在另一个方面，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其结合PGE2，并且在啮齿类动物胶原诱导的关节炎模型中，使爪肿胀或平均关节炎得分抑制约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一个特定实施方案中，在啮齿类动物胶原诱导的关节炎模型中，抗体使爪肿胀或平均关节炎得分抑制超过10％。
在另一个方面，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其结合PGE2，并且在角叉菜胶诱导的啮齿类动物爪水肿模型中，使爪水肿抑制约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一个特定实施方案中，在角叉菜胶诱导的啮齿类动物爪水肿模型中，抗体使爪水肿抑制超过约10％。
在另一个方面，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其结合PGE2，并且在啮齿类动物胶原诱导的关节炎模型中，使爪肿胀或平均关节炎得分抑制约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一个特定实施方案中，在啮齿类动物胶原诱导的关节炎模型中，抗体使爪肿胀或平均关节炎得分抑制超过10％。
在另一个实施方案中，如通过放射免疫测定测量的，本发明的结合蛋白对于PGE2具有至多约10-3s-1；至多约10-4s-1；至多约10-5s-1；或至多约10-6s-1的解离速率（off rate）常数（koff）。优选地，如通过放射免疫测定测量的，本发明的结合蛋白对于PGE2具有约10-3s-1 - 约10-4s-1；约10-4s-1 - 约10-5s-1；或约10-5s-1 - 约10-6s-1的解离速率常数（koff）。
在另一个实施方案中，通过放射免疫测定测定的，本发明的结合蛋白对于PGE2具有至多约10-6 M；至多约10-7 M；至多约10-8 M；至多约10-9 M；至多约10-10 M；至多约10-11 M；至多约10-12 M；或至多10-13 M的解离常数（KD）。优选地，本发明的结合蛋白对于PGE2具有约10-7 M - 约10-8 M；约10-8 M - 约10-9 M；约10-9 M - 约10-10 M；约10-10 - 约10-11 M；约10-11 M - 约10-12 M；或约10-12 - M 约10-13 M的解离常数（KD）。本发明的一个方面提供了针对本发明的至少一种PGE2结合蛋白的至少一种PGE2抗独特型抗体。抗独特型抗体包括包含分子的任何蛋白质或肽，所述分子包括免疫球蛋白分子的至少一部分，例如但不限于重或轻链或其配体结合部分的至少一个互补决定区（CDR）、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、构架区，或；其任何部分，其可以掺入本发明的结合蛋白内。
在另一个方面，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其结合前列腺素E2，并且在基于细胞表面的受体结合测定中，其中IC50选自约1x10-6 - 1x10-7 M、1x10-7 - 1x10-8 M、1x10-8 - 1x10-9 M、10-9 - 10-10 M、1x10-10 - 1x10-11 M和10-11 - 10-12 M，或在基于ELISA的受体结合测定中，其中IC50选自约1x10-6 - 1x10-7 M、1x10-7 - 1x10-8 M、1x10-8 - 1x10-9 M、10-9 - 10-10 M、1x10-10 - 1x10-11 M和10-11 - 10-12 M，抑制前列腺素E2与E1、E2、E3和E4受体中的至少一种结合。
在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段结合前列腺素E2，并且在基于细胞表面的受体结合测定中或在基于3H-PGE2的放射免疫测定中，使用表达E1、E2、E3和E4受体中的至少一种的细胞，或表达E1、E2、E3和E4受体中的至少一种的细胞膜制剂，在约100 nM的浓度下使前列腺素E2与E1、E2、E3和E4受体中的至少一种的结合抑制约70-100％。在一个实施方案中，抗体选自19C9、4F10、15F10、K1B、K7H、K3A、L11、L21、2B5-7.0、2B5-8.0和2B5-9.0。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段能够调节前列腺素E2的生物学功能，例如中和前列腺素E2。抗体或其抗原结合片段选自免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植的抗体、人源化抗体、Fab、Fab’、F（ab’）2、Fv、二硫化物连接的Fv、scFv、单结构域抗体、双抗体、多特异性抗体、双重特异性抗体和双特异性抗体。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段是人源化抗体。在另一个实施方案中，抗体选自Hu2B5.P1 和 Hu2B5.P2。本发明还提供了药物组合物，其包括抗体或其抗原结合片段、和药学可接受的载体。在一个实施方案中，药物组合物进一步包括至少一种另外治疗剂用于治疗其中前列腺素E2活性是有害的病症。
在另一个方面，本发明提供了生成与前列腺素E2结合的抗体或其片段的方法，其包括用前列腺素E2-甲状腺球蛋白免疫接种非人动物，收集包含抗前列腺素E2抗体的体液或器官，并且分离抗前列腺素E2抗体的步骤。
在另一个方面，本发明提供了包括抗原结合结构域的人源化抗体，能够结合前列腺素E2，包括包含选自SEQ ID NOs：54-59的氨基酸序列的至少一个CDR区。在另一个实施方案中，本发明提供了包括抗原结合结构域的人源化抗体，所述抗原结合结构域包括包含氨基酸序列的至少一个CDR区，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NOs：54-59的氨基酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％同源。在一个实施方案中，人源化抗体包括选自SEQ ID NOs：78、79、80和81的氨基酸序列。
在一个方面，本发明的结合蛋白能够结合PGE2，所述抗原结合结构域包括包含选自下述的氨基酸序列的至少一个CDR：
。
在另一个实施方案中，本发明提供了包括抗原结合结构域的结合蛋白或其片段，所述抗原结合结构域包括包含选自下述的氨基酸序列的至少一个CDR：SEQ ID NOs：6、7、8、10、11、12、14、15、16、18、19、20、22、23、26、27、28、30、31、32、34、35、37、38和39。在另一个实施方案中，结合蛋白或其片段包括抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包括包含选自下述的氨基酸序列的至少一个VH区：SEQ ID NOs：5、13、21、25、33、40、42和44。在另外一个实施方案中，结合蛋白或其片段包括抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包括包含选自下述的氨基酸序列的至少一个VL区：SEQ ID NOs：9、17、24、29、36、41、43和45。在另外一个实施方案中，结合蛋白或其片段包括抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包括包含选自SEQ ID NOs：54-59的氨基酸序列的至少一个CDR区。
在一个实施方案中，结合蛋白包括例如选自VH CDR组的至少3个CDRs，所述VH CDR组选自SEQ ID NOs：6、7和 8；SEQ ID NOs：14、15和 16；SEQ ID NOs：14、22和 23、SEQ ID NOs：26、27和 28和 32；SEQ ID NOs：26、34和 35；和SEQ ID NOs：54、55和 56。在另一个实施方案中，所述至少3个CDRs选自VL CDR组，所述VL CDR组选自SEQ ID NOs：10、11和 12；SEQ ID NOs：17、18和 19；SEQ ID NOs：30、31和 32；SEQ ID NOs：37、38和 39；SEQ ID NOs：42、43和 44；和SEQ ID NOs：57、58和 59。在另外一个实施方案中，所述至少3个CDRs包括具有SEQ ID NOs：54、55和 56的氨基酸序列的VH CDR组，和/或具有SEQ ID NOs：57、58和 59的氨基酸序列的VL CDR组。
在另一个实施方案中，结合蛋白包括至少2个可变结构域CDR组，例如选自SEQ ID NOs：6、7、8和 SEQ ID NOs：10、11、12；SEQ ID NOs：14、15、16和 SEQ ID NOs：18、19、20；SEQ ID NOs：14、22、23和 SEQ ID NOs：10、11、12；SEQ ID NOs：26、27、28和 SEQ ID NOs：30、31、32；和 SEQ ID NOs：26、34、35和 SEQ ID NOs：37、38、39。
在另一个实施方案中，本发明的结合蛋白包括具有选自下述的氨基酸序列的2个可变结构域：SEQ ID NO:5和 SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:13和 SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:21和 SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25和 SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:33和 SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:40和 SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:42和 SEQ ID NO:43；和 SEQ ID NO:44和 SEQ ID NO:45。在另一个实施方案中，所述2个可变结构域具有选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:60和 SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:62和 SEQ ID NO:63；SEQ ID NO:64和 SEQ ID NO:65；SEQ ID NO:66和 SEQ ID NO:67；SEQ ID NO:68和 SEQ ID NO:69；SEQ ID NO:70和 SEQ ID NO:71；SEQ ID NO:72和 SEQ ID NO:73；SEQ ID NO:74和 SEQ ID NO:75；和 SEQ ID NO:76和 SEQ ID NO:77。在另一个实施方案中，所述2个可变结构域具有选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:78和 SEQ ID NO:79；和 SEQ ID NO:80和 SEQ ID NO:81。
在另一个方面，本发明提供了与前列腺素E2结合的人源化抗体或其片段，所述人源化抗体包括包含选自下述的氨基酸序列的至少一个VH区：SEQ ID NOs：60、62、64、66、68、70、72、74、76、78和80。在另一个实施方案中，人源化抗体或其片段包括包含选自下述的氨基酸序列的至少一个VL区：SEQ ID NOs：61 63、65、67、69、71、73、75、77、79和81。在另外一个实施方案中，所述至少一个VH区或至少一个VL区包括包含至少一个氨基酸置换的人受体构架序列，其中所述构架序列的氨基酸序列与人受体构架序列的序列至少65％相同。例如，人受体构架可以包括在关键残基上的至少一个构架氨基酸置换，所述关键残基选自与CDR相邻的残基、糖基化位点残基、罕见残基、能够与前列腺素E2相互作用的残基、能够与CDR相互作用的残基、典型残基、在重链可变区和轻链可变区之间的接触残基、在Vernier区内的残基、和在Chothia限定的可变重链CDR1和Kabat限定的第一个重链构架之间重叠的区域中的残基。
在另一个实施方案中，结合蛋白进一步包括人受体构架。
在本发明的一个实施方案中，人重链和轻链受体序列选自表7和表8中所述的序列（实施例4.2.1）。其他人重链和轻链受体序列是本领域众所周知的，并且适合于与本发明一起使用。在一个实施方案中，结合蛋白是能够结合PGE2的CDR移植的抗体或其抗原结合部分。在另一个实施方案中，结合蛋白是能够结合PGE2的人源化抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，CDR移植的抗体或人源化抗体或其抗原结合部分包括此处公开的一个或更多个CDRs，例如3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、或6个或更多个CDRs。在另一个实施方案中，CDR移植的抗体或人源化抗体或其抗原结合部分包括人受体构架。所述人受体构架可以是人免疫球蛋白的任何受体构架。在一个特定实施方案中，人受体构架是此处公开的人受体构架中的任何一个。在一个实施方案中，将CDRs掺入人受体构架的人抗体可变结构域内。在一个实施方案中，人抗体可变结构域是共有人可变结构域。在另一个实施方案中，人受体构架包括在关键残基上的至少一个构架区氨基酸置换，其中所述关键残基选自与CDR相邻的残基；糖基化位点残基；罕见残基；能够与PGE2相互作用的残基；能够与CDR相互作用的残基；典型残基；在重链可变区和轻链可变区之间的接触残基；在Vernier区内的残基；和在Chothia限定的可变重链CDR1和Kabat限定的第一个重链构架之间重叠的区域中的残基。在一个实施方案中，人受体构架人受体构架包括至少一个构架区氨基酸置换，其中所述构架的氨基酸序列与所述人受体构架的序列至少65％相同，并且包括与所述人受体构架相同的至少70个氨基酸残基。在一个实施方案中，在关键残基上的构架区氨基酸置换选自在重链可变区中在位置48上的M（人）至I（小鼠）、在位置68上的V（人）至A（小鼠）、在位置70上的M（人）至L（小鼠）、和在位置72上的T（人）至V（小鼠）；以及在轻链可变区中在位置2上的I（人）至V（小鼠）、和在位置3上的V（人）至L（小鼠）。
在另一个方面，本发明提供了包括结合蛋白中的任何一种和接头多肽和/或免疫球蛋白恒定结构域的抗体构建体。在一个实施方案中，抗体构建体选自免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植的抗体、人源化抗体、Fab、Fab’、F（ab’）2、Fv、二硫化物连接的Fv、scFv、单结构域抗体、双抗体、多特异性抗体、双重特异性抗体和双特异性抗体。在一个实施方案中，抗体构建体包括选自下述的重链免疫球蛋白恒定结构域：人IgM恒定结构域、人IgG1恒定结构域、人IgG2恒定结构域、人IgG3恒定结构域、人IgG4恒定结构域、人IgE恒定结构域和人IgA恒定结构域。在一个实施方案中，抗体构建体包括具有选自下述的氨基酸序列的免疫球蛋白恒定结构域：SEQ ID NO.:1；SEQ ID NO.:2；SEQ ID NO.:3；SEQ ID NO.:4；和SEQ ID NO.:5。
在另一个实施方案中，本发明提供了包括抗PGE2抗体构建体和选自下述的试剂的抗PGE2抗体缀合物：免疫粘附分子、显像剂、治疗剂和细胞毒性剂。在一个实施方案中，所述试剂是选自下述的显像剂：放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记和生物素。在另一个实施方案中，显像剂是例如选自下述的放射性标记：3H、 14C、 35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm。在另一个实施方案中，所述试剂是选自下述的治疗或细胞毒性剂：抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类、毒素和细胞凋亡剂。
在另一个实施方案中，结合蛋白是糖基化的。在一个特定实施方案中，PGE2结合蛋白具有人糖基化模式。
在另一个实施方案中，PGE2结合蛋白、抗体构建体或抗体缀合物是结晶的（例如，作为晶体存在）。在一个实施方案中，晶体是无载体的药学控释晶体。在另一个实施方案中，结晶结合蛋白、结晶抗体构建体或结晶抗体缀合物具有比其可溶性对应物更长的体内半衰期。在另一个实施方案中，结晶结合蛋白、结晶抗体构建体或结晶抗体缀合物在结晶化后保留生物学活性。
本发明的一个方面涉及包括能够PGE2的结合蛋白的DVD结合蛋白。优选地，DVD结合蛋白能够结合2个PGE2结合位点或结合PGE2和第二种靶。第二种靶选自 组胺和组胺受体、
和壳多糖酶。在一个实施方案中，DVD结合蛋白能够识别PGE2和IL-1β，PGE2和IL-9；PGE2和IL-4；PGE2和IL-5；PGE2和IL-25；PGE2和TARC；PGE2和MDC；PGE2和MIF；PGE2和TGF-β；PGE2和LHR 激动剂；PGE2和CL25；PGE2和SPRR2a；PGE2和SPRR2b；或PGE2和ADAM8。在一个实施方案中，DVD结合蛋白能够结合PGE2和TNFα。
在另一个方面，本发明提供了编码PGE2结合蛋白、抗体构建体或抗体缀合物的分离的核酸。一个进一步的实施方案提供了包括本发明的分离核酸的载体，其中所述载体选自pcDNA；pTT（Durocher 等人，Nucleic Acids Research 2002，第30卷，No.2）；pTT3（具有另外的多克隆位点的pTT）；pEFBOS（Mizushima，S.和Nagata，S.,（1990）Nucleic Acids Research 第18卷，No. 17）；pBV；pJV；pA2；和pBJ。
在另一个方面，本发明提供了用本发明的载体转化的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞（例如，大肠杆菌（E. coli））。在另一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如原生生物细胞、动物细胞、禽类细胞、植物细胞、真菌细胞（例如酵母细胞，例如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、哺乳动物细胞（例如，CHO、COS和 HEK293）、昆虫细胞（例如，Sf9）。
在另一个方面，本发明提供了生产结合PGE2的蛋白质的方法，其包括在足以生产结合PGE2的结合蛋白的条件下，在培养基中培养本发明的任何一种宿主细胞。另一个实施方案提供了根据本发明的方法生产的结合蛋白。
在另一个方面，本发明提供了包括结晶PGE2结合蛋白、结晶抗体构建体或结晶抗体缀合物、成分和/或至少一种聚合载体的制剂。在一个实施方案中，聚合载体是选自下述的聚合物：聚丙烯酸、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基酸、聚酐、聚羧酚酸肽、聚酯、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚b-羟基丁酸酯、聚己内酯、聚二氧杂环己酮（poly（dioxanone））、聚乙二醇、聚（羟丙基）甲基丙烯酰胺、聚有机磷腈、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、马来酐-烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、白蛋白、藻酸酯、纤维素和纤维素衍生物、胶原、纤维蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖（glycaminoglycans）、硫酸化多糖（polyeaccharides）、及其掺合物和/或共聚物。在另一个实施方案中，所述成分选自白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇（lactitol）、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗受试者的方法，其包括给受试者施用有效量的PGE2结合蛋白、抗体构建体、缀合物或组合物的步骤。在一个实施方案中，受试者是患有炎性疾病或本文公开的其他病症的哺乳动物例如人。在一个实施方案中，本发明提供了减少、改善或预防此种疾病或病症的一种或更多种症状的方法，例如（a）类风湿性关节炎、变应性关节炎、青少年关节炎、强直性脊柱炎和骨关节炎；（b）由病毒诱导的特定病，例如格-巴二氏（Guillain Barre）综合征、传染性单核细胞增多症、其他病毒性淋巴结病和疱疹病毒感染；（c）多发性硬化和其他脱髓鞘疾病；（d）血液学病症，例如溶血性贫血和血小板减少症；（e）内分泌学病症，例如糖尿病、Addison氏病、特发性甲状旁腺机能减退和慢性淋巴细胞性甲状腺炎；（f）胶原病症，例如全身性红斑狼疮；和（g）生殖病症，例如闭经、不育、复发性流产和子痫；和（h）肿瘤，例如头颈肿瘤、肺癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌等；和（i）包括Crohn氏病和溃疡性结肠炎的炎性肠病；和（j）与骨关节炎和其他病症相关的疼痛；和（k）眼病症例如年龄相关黄斑变性（AMD）的症状。
在另一个方面，本发明提供了包括PGE2结合蛋白、抗体、构建体、缀合物或组合物和药学可接受的载体的药物组合物。在一个实施方案中，药学可接受的载体充当用于增加结合蛋白吸收或分散的佐剂。在一个实施方案中，佐剂是透明质酸酶。药物组合物可以进一步包括用于诊断或治疗其中PGE2活性是有害的病症的至少一种另外的试剂，例如选自下述的试剂：治疗剂，显像剂；细胞毒性剂；血管发生抑制剂（例如，抗VEGF抗体或VEGF-trap）；激酶抑制剂（例如，KDR或TIE-2抑制剂）；共刺激分子阻断剂（例如，抗B7.1、抗B7.2、CTLA4-Ig或抗CD20）；粘附分子阻断剂（例如，抗LFA-1、抗E/L选择蛋白或小分子抑制剂）；抗细胞因子抗体或其功能片段（例如，抗IL-18、抗TNF或抗IL-6/细胞因子受体抗体）；氨甲蝶呤；环孢菌素；雷帕霉素；FK506；可检测标记或报道分子；TNF拮抗剂；抗风湿剂；肌肉弛缓剂；麻醉药；非类固醇消炎药（NSAID）；止痛剂；麻醉剂；镇静剂；局部麻醉剂；神经肌肉阻断剂；抗微生物剂；抗牛皮癣剂；皮质类固醇；促蛋白质合成类固醇；促红细胞生成素；免疫接种；免疫球蛋白；免疫抑制剂；生长激素；激素替代药物；放射性药物；抗抑郁药；抗精神病药；刺激剂；哮喘药物治疗；β激动剂；吸入类固醇；经口类固醇；肾上腺素或其类似物；细胞因子；和细胞因子拮抗剂。
在另一个方面，本发明提供了用于抑制和/或减少PGE2活性的方法，其包括使PGE2与PGE2结合蛋白接触，从而使得PGE2活性被抑制和/或减少。在一个实施方案中，本发明提供了用于抑制和/或减少患有其中PGE2活性是有害的病症的受试者中的PGE2活性的方法，其包括给受试者施用结合蛋白，从而使得受试者中的PGE2活性被抑制和/或减少。在另一个实施方案中，该方法包括给受试者施用本发明的PGE2结合蛋白，从而使得达到治疗。
在另一个方面，本发明提供了治疗（例如，治愈、压制、改善、延迟或预防发作，或预防再发生或复发）或预防受试者中的PGE2相关病症的方法。该方法包括：以足以治疗或预防PGE2相关病症的量，给受试者施用PGE2结合蛋白（特别是拮抗剂），例如抗PGE2抗体或其片段。PGE2拮抗剂例如抗PGE2抗体或其片段可以单独或与其他治疗模式组合施用于受试者。
在一个实施方案中，受试者是患有一种或更多种PGE2相关病症（例如，特征在于过量PGE2水平或生物合成）的哺乳动物例如人。在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗受试者中的炎性病症和免疫病症的方法，所述病症的特征可以在于过量PGE2生物合成，所述方法包括给受试者施用有效量的对于PGE2特异性的抗体。可以通过根据本发明的方法治疗的病症包括其中已牵涉过量PGE2合成的自身免疫和炎性疾病和肿瘤。此种病症包括：（a）类风湿性关节炎、变应性关节炎、青少年关节炎、强直性脊柱炎和骨关节炎；（b）由病毒诱导的特定病，例如格-巴二氏综合征、传染性单核细胞增多症、其他病毒性淋巴结病和疱疹病毒感染；（c）多发性硬化和其他脱髓鞘疾病；（d）血液学病症，例如溶血性贫血和血小板减少症；（e）内分泌学病症，例如糖尿病、Addison氏病、特发性甲状旁腺机能减退和慢性淋巴细胞性甲状腺炎；（f）胶原病症，例如全身性红斑狼疮；和（g）生殖病症，例如闭经、不育、复发性流产和子痫；和（h）肿瘤，例如头颈肿瘤、肺癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌等；和（i）包括Crohn氏病和溃疡性结肠炎的炎性肠病；和（j）与骨关节炎和其他病症相关的疼痛；和（k）眼病症例如年龄相关黄斑变性（AMD）。在另一个方面，本申请提供了用于在体外检测样品中PGE2的存在的方法（例如，生物学样品，例如血清、血浆、组织、活组织检查）。主题方法可以用于诊断病症，例如免疫细胞相关病症。该方法包括：（i）使样品或对照样品与如本文描述的抗PGE2抗体或其片段接触；和（ii）检测在抗PGE2抗体或其片段和样品或对照样品之间的复合物形成，其中相对于对照样品，在样品中的复合物形成中的统计上显著变化指示样品中PGE2的存在。
在另外一个方面，本申请提供了用于在体内检测PGE2的存在的方法（例如，在受试者中的体内成像）。主题方法可以用于诊断病症，例如PGE2相关病症。该方法包括：（i）在允许抗体或片段与PGE2结合的条件下，给受试者或对照受试者施用如本文描述的抗PGE2抗体或其片段；和（ii）检测在抗体或片段和PGE2之间的复合物形成，其中相对于对照受试者，在受试者中的复合物形成中的统计上显著变化指示PGE2的存在。
在另一个方面，本发明的结合蛋白可用于治疗选自下述的病症：关节炎、骨关节炎、青少年慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、全身性红斑狼疮、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变应性疾病、牛皮癣、皮炎硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、与器官移植相关的急性或慢性免疫性疾病、肉状瘤病、动脉粥样硬化、弥散性血管内凝血、Kawasaki氏病、Grave氏病、肾病综合征、慢性疲乏综合征、韦格纳氏肉芽肿病、过敏性紫癜（Henoch-Schoenlein purpurea）、肾显微血管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、脓毒性休克、中毒性休克综合征、脓毒病综合征、恶病质、传染病、寄生虫病、获得性免疫缺陷综合征、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬变、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭、心肌梗死、Addison氏病、散发性多腺性I型缺陷和多腺性II型缺陷、Schmidt氏综合征、成人（急性）呼吸窘迫综合征、秃头、斑秃（alopecia areata）、血清反应阴性关节病（arthopathy）、关节病、Reiter氏病、牛皮癣性关节病、溃疡性结肠炎性关节病、肠病性滑膜炎、衣原体、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关性关节病、脊椎关节病（spondyloarthopathy）、动脉粥样化疾病/动脉硬化、特应性变态反应、自身免疫性大疱性疾病、寻常天疱疮、落叶状天疱疮、类天疱疮、线性IgA疾病、自身免疫性溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、青少年性恶性贫血、肌痛脑炎/Royal Free疾病、慢性粘膜皮肤念珠菌病、巨细胞性动脉炎、原发性硬化性肝炎、隐原性自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷病综合征、获得性免疫缺陷相关病、乙型肝炎、丙型肝炎、常见的各种免疫缺陷（常见的可变低丙种球蛋白血症）、扩张型心肌病、女性不育、卵巢衰竭、过早卵巢衰竭、纤维化肺疾病、隐原性纤维化肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、结缔组织病相关性间质性肺病、混合型结缔组织病相关性肺病、全身性硬皮病相关性间质性肺病、类风湿性关节炎相关性间质性肺病、全身性红斑狼疮相关性肺病、皮肌炎/多肌炎相关性肺病、Sjögren氏病相关性肺病、强直性脊柱炎相关性肺病、脉管炎性弥散性肺病、含铁血黄素沉着病相关性肺病、药物诱导的间质性肺病、纤维化、放射性纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴细胞性浸润性肺病、传染后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎（传统自身免疫性或狼疮样肝炎）、2型自身免疫性肝炎（抗LKM抗体肝炎）、自身免疫介导的低血糖、具有黑棘皮症的B型胰岛素耐受性、甲状旁腺机能减退、与器官移植相关的急性免疫性疾病、与器官移植相关的慢性免疫性疾病、骨关节病、原发性硬化性胆管炎、1型牛皮癣、2型牛皮癣、特发性白细胞减少（leucopaenia）、自身免疫性嗜中性白细胞减少症、肾脏病NOS、肾小球肾炎（glomerulonephritides）、肾显微血管炎（vasulitis）、莱姆病、盘状红斑狼疮、特发性男性不育症或NOS、精子自身免疫性、多发性硬化（所有亚型）、交感性眼炎、结缔组织病继发的肺动脉高压、Goodpasture氏综合征、结节性多动脉炎的肺表现、急性风湿热、类风湿性脊椎炎、Still氏病、全身性硬皮病、Sjörgren氏综合征、Takayasu氏病/动脉炎、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少症、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿性（goitrous）自身免疫性甲状腺功能减退（Hashimoto氏病）、萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退、原发性粘液性水肿、晶状体性（phacogenic）葡萄膜炎、原发性血管炎、白癜风急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬变、酒精诱导的肝损伤、胆汁郁积（choleosatatis）、特应性肝病、药物诱导的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、变态反应和哮喘、B群链球菌（GBS）感染、精神障碍（例如，抑郁和精神分裂症）、Th2型和Th1型介导的疾病、急性和慢性痛（不同形式的疼痛）、以及癌症例如肺、乳腺、胃、膀胱、结肠、胰、卵巢、前列腺和直肠癌以及造血恶性肿瘤（白血病和淋巴瘤）、无β脂蛋白血症（Abetalipoprotemia）、手足发绀、急性和慢性寄生或感染过程、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病（ALL）、急性髓细胞样白血病（AML）、急性或慢性细菌感染、急性胰腺炎、急性肾功能衰竭、腺癌、心房（aerial）异位搏动、AIDS痴呆复征、酒精诱导的肝炎、变应性结膜炎、过敏性接触性皮炎、变应性鼻炎、同种异体移植物排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肌萎缩性侧索硬化、贫血、心绞痛、前角细胞（horn cell）变性、抗cd3治疗、抗磷脂综合征、抗受体超敏反应、主动脉和周围性动脉瘤（aneuryisms）、主动脉壁夹层形成、高动脉压、动脉硬化、动静脉瘘、共济失调、心房纤维颤动（持续性或阵发性）、心房扑动、房室传导阻滞、B细胞淋巴瘤、骨移植物排斥、骨髓移植（BMT）排斥、束支传导阻滞、Burkitt氏淋巴瘤、烧伤、心律失常、心脏震晕综合征、心脏肿瘤、心肌病、心肺分流术炎症应答、软骨移植排斥、小脑皮质变性、小脑病症、紊乱性或多源性房性心动过速、化学疗法相关病症、chromic髓细胞性白血病（CML）、慢性酒精中毒、慢性炎性病理学、慢性淋巴细胞性白血病（CLL）、慢性阻塞性肺部疾病（COPD）、慢性水杨酸盐中毒、结肠直肠癌、充血性心力衰竭、结膜炎、接触性皮炎、肺源性心脏病、冠状动脉疾病、Creutzfeldt-Jakob病、培养物阴性脓毒病、囊性纤维化、细胞因子疗法相关病症、拳击员痴呆（Dementia pugilistica）、脱髓鞘病、登革出血热、皮炎、皮肤病学状况、多尿症（diabetes）、糖尿病、糖尿病性动脉硬化性（ateriosclerotic）疾病、弥漫性Lewy小体病、扩张性充血性心肌病、基底神经节病症、中年唐氏综合征、由阻断CNS多巴胺受体的药物诱导的药物诱导的运动障碍、药物敏感性、湿疹、脑脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、会厌炎、EB病毒感染、红斑性肢痛病、锥体外束和小脑病症、家族性嗜血细胞性（hematophagocytic）淋巴组织细胞增多症、胎儿胸腺移植排斥、Friedreich氏共济失调、功能性外周性动脉病症、真菌性脓毒病、气性坏疽病、胃溃疡、肾小球肾炎、任何器官或组织的移植物排斥、革兰氏阴性脓毒病、革兰氏阳性脓毒病、由于细胞内生物的肉芽肿、毛细胞性白血病、Hallerrorden-Spatz病、Hashimoto氏甲状腺炎、枯草热、心脏移植排斥、血色素沉着症、血液透析、溶血性尿毒性综合征/血栓溶解性血小板减少性紫癜、出血、肝炎（A）、希氏束心律失常（arrythmias）、HIV感染/HIV神经病、何杰金氏病、运动过度性运动障碍、超敏反应、超敏感性肺炎、高血压、运动机能减退性运动障碍、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、特发性Addison氏病、特发性肺纤维化、抗体介导的细胞毒性、虚弱、婴儿型脊髓性肌萎缩、主动脉炎症、流行性感冒a、电离辐射照射、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、缺血性再灌注损伤、缺血性中风、青少年类风湿性关节炎、青少年脊髓性肌萎缩、卡波西氏肉瘤、肾移植排斥、军团杆菌、利什曼病、麻风病、皮层脊髓系统损伤、脂肪水肿、肝移植排斥、淋巴水肿（lymphederma）、疟疾、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多症、恶性黑素瘤、脑膜炎、脑膜炎球菌血症、代谢性/特发性、偏头痛、线粒体多系统病症、混合型结缔组织病、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多系统变性（Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager和Machado-Joseph）、重症肌无力、鸟胞内分支杆菌、结核分支杆菌、骨髓异常增生综合征、心肌梗死、心肌缺血性病症、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、肾变病、神经变性疾病、神经原性I肌萎缩、嗜中性粒细胞减少性发烧、非何杰金淋巴瘤、腹主动脉及其分支闭塞、occulsive动脉病症、okt3治疗、睾丸炎/附睾炎（epidydimitis）、睾丸炎/输精管切除术逆转操作、器官巨大症、骨质疏松症、胰移植排斥、胰癌、恶性肿瘤的瘤旁综合征/高钙血症、甲状旁腺移植排斥、盆腔炎症性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、外周性动脉粥样硬化（atherlosclerotic）疾病、外周血管病症、腹膜炎、恶性贫血、卡氏肺囊虫性肺炎、肺炎、POEMS综合征（多发性神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病、和皮肤变化综合征）、灌注后综合征、泵后综合征、MI心切开术后综合征、先兆子痫、进行性核上（supranucleo）麻痹、原发性肺动脉高压、放射治疗、Raynaud氏现象和疾病、Raynoud氏病、Refsum氏病、常规狭窄QRS心动过速、肾血管性高血压、再灌注损伤、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、Lewy小体型老年性痴呆、血清反应阴性关节病、休克、镰状细胞贫血、皮肤同种异体移植物排斥、皮肤变化综合征、小肠移植排斥、实体瘤、特殊心律失常（arrythmias）、脊髓性共济失调、脊髓小脑变性、链球菌肌炎、小脑结构损伤、亚急性硬化性全脑炎、晕厥、心血管系统梅毒、全身性过敏反应（anaphalaxis）、全身炎症反应综合征、全身发作性青少年类风湿性关节炎、T细胞或FAB ALL、毛细血管扩张、血栓闭塞性脉管炎、血小板减少症、毒性、移植物、创伤/出血、III型超敏反应、IV型超敏反应、不稳定心绞痛、尿毒症、尿脓毒病、荨麻疹、心脏瓣膜疾病、静脉曲张、血管炎、静脉疾病、静脉血栓形成、心室纤维性颤动、病毒和真菌感染、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎、病毒相关性噬红细胞（hemaphagocytic）综合征、Wernicke-Korsakoff综合征、Wilson氏病、任何器官或组织的异种移植排斥、急性冠状动脉综合征、急性特发性多神经炎、急性炎性脱髓鞘性多发性神经根性神经病、急性缺血、成人Still氏病、斑秃、过敏反应、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、动脉硬化、特应性湿疹、特应性皮炎、自身免疫性皮炎、与链球菌感染相关的自身免疫性病症、自身免疫性肠病、自身免疫性听力丧失、自身免疫性淋巴细胞增生综合征（ALPS）、自身免疫性心肌炎、自身免疫性过早卵巢衰竭、睑炎、支气管扩张、大疱性类天疱疮、心血管病、灾变性抗磷脂综合征、乳糜泻、颈椎关节强硬、慢性缺血、疤痕性类天疱疮、具有多发性硬化风险的临床孤立综合征（CIS）、结膜炎、儿童期发病性精神病（Childhood Onset Psychiatric Disorder）、慢性阻塞性肺部疾病（COPD）、泪囊炎、皮肌炎、糖尿病性视网膜病、糖尿病、椎间盘突出（Disk Herniation）、盘脱垂（Disk Prolaps）、药物诱导的免疫性溶血性贫血、心内膜炎、子宫内膜异位、眼内炎、巩膜外层炎、多形性红斑、重型多形性红斑、妊娠期类天疱疮、格-巴二氏综合征（GBS）、枯草热、Hughes综合征、特发性帕金森氏病、特发性间质性肺炎、IgE介导的变态反应、免疫性溶血性贫血、内含体肌炎、传染性眼炎性疾病、炎性脱髓鞘疾病、炎性心脏病、炎性肾病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、干燥性角膜结膜炎（keratojuntivitis sicca）、Kussmaul病或Kussmaul-Meier病、Landry氏麻痹、朗格汉斯（Langerhan’s）细胞组织细胞增多症、网状青斑、黄斑变性、显微镜下多脉管炎、morbus bechterev、运动神经元病症、粘膜类天疱疮、多器官衰竭、重症肌无力、脊髓异常增生综合征、心肌炎、神经根障碍、神经病、非甲非乙型肝炎、视神经炎、骨质溶解、少关节的JRA、周围动脉闭塞性疾病（PAOD）、周围血管疾病（PVD）、外周动脉疾病（PAD）、静脉炎、结节性多动脉炎（或结节性动脉外膜炎）、多软骨炎、风湿性多肌病、白发症、多关节的JRA、多发性内分泌缺陷综合征、多肌炎、风湿性多肌病（PMR）、泵后综合征（Post-Pump Syndrome）、原发性帕金森综合征、前列腺炎、单纯红细胞再生障碍、原发性肾上腺机能不足、复发型视神经脊髓炎、再狭窄、风湿性心脏病、SAPHO（滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥厚和骨炎）、硬皮病、继发性淀粉样变性、休克肺、巩膜炎、坐骨神经痛、继发性肾上腺机能不足、聚硅氧烷相关的结缔组织病、Sneddon-Wilkinson皮肤病、关节强硬性脊椎炎（spondilitis ankylosans）、Stevens-Johnson综合征（SJS）、全身性炎症应答综合征、颞动脉炎、弓形体视网膜炎、中毒性表皮坏死松解、横贯性脊髓炎、TRAPS（肿瘤坏死因子受体，I型变态反应，II型糖尿病、荨麻疹、普通型间质性肺炎（UIP）、脉管炎、春季结膜炎、病毒性视网膜炎、Vogt-Koyanagi-Harada综合征（VKH综合征）、湿黄斑变性和伤口愈合。
在一个实施方案中，可以用本发明的组合物和方法治疗或诊断的疾病包括但不限于：原发性和转移性癌症，包括乳腺、结肠、直肠、肺、口咽、下咽、食道、胃、胰、肝、胆囊和胆管、小肠、尿道（包括肾、膀胱和尿道上皮）、女性生殖道（包括子宫颈、子宫和卵巢，以及绒毛膜癌和妊娠性滋养层细胞病）、男性生殖道（包括前列腺、精囊、睾丸和生殖细胞肿瘤）、内分泌腺（包括甲状腺、肾上腺和脑下垂体）和皮肤的癌，以及血管瘤，黑素瘤，肉瘤（包括从骨和软组织产生的肉瘤以及卡波西氏肉瘤），脑、神经、眼和脑膜（包括星形细胞瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、成神经细胞瘤、神经鞘瘤（Schwannomas）和脑膜瘤）的肿瘤，从造血恶性肿瘤例如白血病和淋巴瘤（何杰金与非何杰金淋巴瘤）产生的实体瘤。
该方法包括以足以治疗（例如，减少、改善）或预防一种或更多种症状的量，给受试者施用PGE2拮抗剂，例如PGE2抗体或其片段。PGE2抗体可以在治疗上或预防上或两者进行施用。PGE2拮抗剂例如抗PGE2抗体或其片段可以单独或与其他治疗模式组合施用于受试者，如本文描述的。优选地，受试者是患有如本文描述的PGE2相关病症的哺乳动物例如人。
在另一个方面，本发明的结合蛋白用于治疗选自下述的病症：急性成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞样白血病、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外、膀胱癌、骨癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、脑干神经胶质瘤、脑瘤、脑干神经胶质瘤、小脑strocytoma/恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、成髓细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视通路和下丘脑神经胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、类癌瘤、类癌瘤、原发不明性胃肠癌、中枢神经系统淋巴瘤、原发性小脑星形细胞瘤、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增生性病症、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因家族肿瘤（Ewing Family of Tumor）、颅外胚细胞瘤、性腺外胚细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼内黑色素瘤、成视网膜细胞瘤、胆囊癌、胃（胃）癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤（GIST）、颅外胚细胞瘤、性腺外胚细胞瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤、脑干神经胶质瘤、大脑星形细胞瘤神经胶质瘤、儿童期视通路和下丘脑神经胶质瘤、多毛细胞白血病、头与颈癌、肝细胞（肝）癌、何杰金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌（内分泌胰腺）、卡波济肉瘤、肾（肾细胞）癌、喉癌、急性成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞样白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、多毛细胞白血病、唇和口腔癌、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、AIDS相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、华氏（Waldenström）巨球蛋白血症、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、成髓细胞瘤、黑色素瘤、眼内（眼）黑色素瘤、Merkel细胞癌、恶性间皮瘤、原发不明颈部转移性鳞癌、口癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物、蕈样真菌病、骨髓发育不良综合征、骨髓发育不良/骨髓增生性疾病、髓性白血病、慢性髓细胞样白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生性病症、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口癌、口腔癌、唇和口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度潜在恶性肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞胰腺癌、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、成松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体瘤、浆细胞赘生物/多发性骨髓瘤、胸膜肺胚细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞（肾）癌、肾盂和输尿管、移行细胞癌、成视网膜细胞瘤、唾液腺癌、肉瘤、尤因家族肿瘤、卡波济肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、塞扎里（Sézary）综合征、皮肤癌（非黑色素瘤）、皮肤癌（黑色素瘤）、Merkel细胞皮肤癌、小肠癌、鳞状细胞癌、原发不明颈部转移性鳞癌、胃（胃）癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、妊娠滋养细胞肿瘤、输尿管和肾盂、移行细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫内膜子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、华氏巨球蛋白血症、肾母细胞瘤。
在另一个方面，本发明提供了治疗患有其中PGE2是有害的病症的患者的方法，所述方法包括在如上文讨论的第二种试剂施用之前、同时或之后，施用上文公开的任何一种结合蛋白的步骤。在一个实施方案中，可以与一种或更多种PGE2拮抗剂（例如，抗PGE2抗体或其片段）共施用和/或共配制的第二种治疗剂包括但不限于下述中的一种或更多种：吸入类固醇；经口类固醇；β激动剂，例如短效或长效β激动剂；白三烯或白三烯受体拮抗剂；组合药物例如ADVAIR；IgE抑制剂，例如抗IgE抗体（例如，XOLAIR）；磷酸二酯酶抑制剂（例如，PDE4抑制剂）；黄嘌呤；抗胆碱能药；肥大细胞稳定剂例如色甘酸钠；IL-4抑制剂；IL-5抑制剂；嗜伊红粒细胞趋化蛋白/CCR3抑制剂；组胺或其受体包括H1、H2、H3和H4拮抗剂，和前列腺素D或其受体（DP1和CRTH2）拮抗剂。此种组合可以用于治疗哮喘和其他呼吸病症。可以与一种或更多种抗PGE2抗体或其片段共施用和/或共配制的治疗剂的另外例子尤其包括下述中的一种或更多种：TNF拮抗剂（例如，TNF受体的可溶性片段，例如p55或p75人TNF受体或其衍生物，例如75 kD TNFR-IgG（75 kD TNF受体-IgG融合蛋白，ENBREL））；TNF酶拮抗剂，例如TNF转换酶（TACE）抑制剂；毒蕈碱受体拮抗剂；TGF-β拮抗剂；干扰素γ；perfenidone；化学治疗剂，例如氨甲蝶呤、来氟米特或西罗莫司（雷帕霉素）或其类似物，例如CCI-779；COX2和cPLA2抑制剂；NSAIDs；免疫调节剂；p38抑制剂、TPL-2、MK-2和NFkB抑制剂。另外的第二种试剂选自布地萘德，表皮生长因子，皮质类固醇，环孢菌素，柳氮磺吡啶，氨基水杨酸盐，6-巯基嘌呤，硫唑嘌呤，甲硝唑，脂肪加氧酶抑制剂，美沙拉秦，奥沙拉嗪，巴柳氮，抗氧化剂，血栓烷抑制剂，IL-1受体拮抗剂，抗IL-1β，单克隆抗体，抗IL-6单克隆抗体，生长因子，弹性蛋白酶抑制剂，吡啶基-咪唑化合物，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF的抗体或激动剂，CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配体的抗体，氨甲蝶呤，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，霉酚酸酯，来氟洛米，NSAIDs，布洛芬，皮质类固醇，强的松龙，磷酸二酯酶抑制剂，腺苷激动剂，抗凝剂，补体抑制剂，肾上腺素能药，IRAK，NIK，IKK，p38，MAP激酶抑制剂，IL-1β转换酶抑制剂，TNFα转换酶抑制剂，T细胞发信号抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，柳氮磺吡啶，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，血管紧张素转换酶抑制剂，可溶性细胞因子受体，可溶性p55 TNF受体，可溶性p75 TNF受体，sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R，抗炎细胞因子，IL-4、IL-10、IL-11和TGFβ。
在一个特定实施方案中，本发明提供了治疗患有其中前列腺素E2是有害的病症的患者的方法，所述方法包括在第二种试剂施用之前、同时或之后，施用本发明的结合蛋白的步骤，其中所述第二种试剂选自目前用于治疗各种人疾病和病症的药物。此种药物的列表可从因特网在www.drugs.com处获得。这个列表经常更新以反映用于治疗各种人疾病的技术水平。此种药物的列表还可从最新更新的药物指导获得（Complete Guide to Prescription & Nonpresciption Drugs 2008. by H. Winter Griffith，Stephen Moore，ISBN-13：978-0399533723）。抗PGE2结合蛋白可以与上述列表中用于特定疾病病状的任何治疗组合。例如，抗PGE2结合蛋白可以与用于治疗类风湿性关节炎和青少年类风湿性关节炎的一种或更多种试剂组合。这些试剂的例子包括但不限于，氨甲蝶呤、来氟米特、低剂量皮质类固醇例如泼尼松或可的松、抗疟疾药物治疗例如羟氯喹、金、柳氮磺胺吡啶、青霉胺、环磷酰胺、环孢菌素、米诺环素、乙氨酚、阿司匹林、布洛芬、萘普生、塞来考昔、英夫利昔单抗、依那西普、阿达木单抗、阿巴他赛、利妥昔单抗、阿那白滞素和其他靶向IL-6、IL-6R、IL-17、IL-18、IL-23、B7.1/B7.2的新生物制剂和经口递送试剂。抗PGE2结合蛋白可以与用于治疗骨关节炎的一种或更多种试剂组合。这些试剂的例子包括但不限于乙氨酚、阿司匹林、布洛芬、萘普生、塞来考昔、类固醇、人工关节液例如欣维可和海尔根。抗PGE2结合蛋白可以与用于治疗Crohn氏病的一种或更多种试剂组合。这些试剂的例子包括但不限于阿达木单抗、azasan、安萨科、硫唑嘌呤、柳氮磺胺吡啶、布地奈德、entocort、灭滴灵、依木兰、英夫利昔单抗、巯嘌呤、甲硝唑、protostat、巯基嘌呤、类克和柳氮磺胺吡啶。抗PGE2结合蛋白可以与用于治疗强直性脊柱炎的一种或更多种试剂组合。这些试剂的例子包括但不限于acetocot、乙酰水杨酸、acuprin 81、阿达木单抗、aleve、双霉素钙、萘普生钠制剂、aristocort、阿司匹林、aspirtab、曲安奈德、百服宁、buffex、凯扶兰、西乐葆、奇诺力、可的松、双氯芬酸、奥沙拉秦钠、easprin、依那西普、吲哚美辛、茚甲新、英夫利昔单抗、萘普生、类克、曲安西龙和扶他林。抗PGE2结合蛋白可以与用于治疗多发性硬化的一种或更多种试剂组合。这些试剂的例子包括但不限于Avonex、Azasan、硫唑嘌呤、Betaseron、Bubbli-Pred、克帕松、Cotolone、格拉默、依木兰、干扰素β-1a、干扰素β-1b溶液、Key-Pred、Key-Pred SP、米托蒽醌、那他珠单抗、诺消灵、Orapred、Orapred ODT、Pediapred、Pred-Ject-50、Predacort 50、Predalone 50、Predate-50、泼尼松龙、Prelone、利比和Tysabri。抗PGE2结合蛋白可以与用于治疗各种人癌症和恶性肿瘤的一种或更多种试剂或治疗方法组合。除可从因特网网站www.drugs.com和最新更新的药物指导（Complete Guide to Prescription & Nonpresciption Drugs 2008. by H. Winter Griffith，Stephen Moore，ISBN-13：978-0399533723）获得的列表外，NCI还维持了关于由美国食品与药物管理局（FDA）批准用于治疗癌症或与癌症相关病状的特定药物的药物信息。这些试剂的例子包括但不限于Abraxane、亚得里亚霉素、Adrucil、艾达乐、阿仑珠单抗、力比泰、氨基酮戊酸、阿那曲唑、阿瑞匹坦、瑞宁得、阿诺新、Arranon、三氧化二砷、阿伐他汀（贝伐珠单抗）、阿扎胞苷、贝伐珠单抗、贝沙罗汀、硼替佐米、Campath（阿仑珠单抗）、Camptosar（盐酸依立替康）、卡培他滨、卡铂、西妥昔单抗、顺铂、Clafen（环磷酰胺）、氯法拉滨、Clofarex（氯法拉滨）、科罗拉（氯法拉滨）、环磷酰胺、阿糖胞苷、Cytosar-U（阿糖胞苷）、Cytoxan（环磷酰胺）、达珂（地西他滨）、达沙替尼、地西他滨、DepoCyt（脂质体阿糖胞苷）、DepoFoam（脂质体阿糖胞苷）、盐酸右雷佐生、多西他赛、Doxil（盐酸多柔比星脂质体）、盐酸多柔比星、盐酸多柔比星脂质体、Dox-SL（盐酸多柔比星脂质体）、Efudex（氟尿嘧啶）、Ellence（盐酸表柔比星）、乐沙定（奥沙利铂）、Emend（阿瑞匹坦）、盐酸表柔比星、爱必妥（西妥昔单抗）、盐酸厄洛替尼、Evacet（盐酸多柔比星脂质体）、易维特（盐酸雷洛昔芬）、依西美坦、Faslodex（氟维司群）、弗隆（来曲唑）、Fluoroplex（氟尿嘧啶）、氟尿嘧啶、氟维司群、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉妥珠单抗奥佐米星、健择（盐酸吉西他滨）、格列卫（甲磺酸伊马替尼）、赫赛汀（曲妥珠单抗）、和美新（盐酸托泊替康）、甲磺酸伊马替尼、咪喹莫特、易瑞沙（吉非替尼）、盐酸依立替康、伊沙匹隆、Ixempra（伊沙匹隆）、Keoxifene（盐酸雷洛昔芬）、凯望斯（帕利夫明）、二甲苯磺酸拉帕替尼、来那度胺、来曲唑、聚左旋糖（氨基酮戊酸）、LipoDox（盐酸多柔比星脂质体）、脂质体阿糖胞苷、Methazolastone（替莫唑胺）、Mylosar（阿扎胞苷）、麦罗塔（吉妥珠单抗奥佐米星）、纳米颗粒紫杉醇（紫杉醇白蛋白稳定化纳米颗粒制剂）、奈拉滨、Neosar（环磷酰胺）、Nexavar（甲苯磺酸索拉非尼）、尼洛替尼、诺瓦得士（柠檬酸它莫西芬）、Oncaspar（培门冬酶）、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定化纳米颗粒制剂、帕利夫明、帕木单抗、Paraplat（卡铂）、伯尔定（卡铂）、培门冬酶、培美曲塞二钠、Platinol-AQ（顺铂）、Platinol（顺铂）、盐酸雷洛昔芬、Revlimid（来那度胺）、Rituxan（利妥昔单抗）、利妥昔单抗、Sclerosol胸膜内气溶胶（滑石）、甲苯磺酸索拉非尼、Sprycel（达沙替尼）、灭菌滑石粉（滑石）、Steritalc（滑石）、苹果酸舒尼替尼、索坦（苹果酸舒尼替尼）、昔诺韦（沙立度胺）、滑石、柠檬酸它莫西芬、Tarabine PFS（阿糖胞苷）、特罗凯（盐酸厄洛替尼）、Targretin（贝沙罗汀）、Tasigna（尼洛替尼）、泰素（紫杉醇）、泰索帝（多西他赛）、Temodar（替莫唑胺）、替莫唑胺、Temsirolimus、Thalomid（沙立度胺）、沙立度胺、Totect（盐酸右雷佐生）、盐酸托泊替康、Torisel（Temsirolimus）、曲妥珠单抗、Trisenox（三氧化二砷）、Tykerb（二甲苯磺酸拉帕替尼）、Vectibix（帕木单抗）、万珂（硼替佐米）、Vidaza（阿扎胞苷）、Vorinostat、希罗达（卡培他滨）、Zinecard（盐酸右雷佐生）、唑来膦酸、Zolinza（Vorinostat）和择泰（唑来膦酸）。
在一个优选实施方案中，上文公开的PGE2结合蛋白药物组合物通过选自下述的至少一种方式施用于受试者：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、盆腔内、心包内（intrapericardiac）、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、快速浓注、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内和经皮。
附图简述
本发明的前述和其他目的、特征和优点以及本发明其自身，根据优选实施方案的下述描述当连同附图一起阅读时将得到更充分理解，其中：
图1提供了在实施例1.1.A中所述的ELISA中2种杂交瘤衍生的mAbs 15F10.3C9和1F7.1D5与生物素- PGE2的结合的测量。
图2提供了在实施例1.1.A中所述的ELISA中2种杂交瘤衍生的mAbs 19C9.4B10和4F10.3B9与生物素- PGE2的结合的测量。
图3提供了在实施例1.1.A中所述的ELISA中PROfusionTM衍生的mAbs K1B、K7H、K3A、L11和L21与生物素- PGE2的结合的测量。
图4提供了在实施例1.1.A中所述的ELISA中重组抗PGE2 mAbs 2B5-7.0、2B5-8.0和2B5-9.0与生物素- PGE2的结合。杂交瘤衍生的抗体2B5是这个测定中的阳性对照。
图5提供了如实施例1.1.C 1中所述，通过FLIPR测量的在EP4转染的HEK293 Gα16稳定细胞系中抗PGE2 mAb 2B5-8.0中和PGE2诱导的Ca++流入。杂交瘤衍生的抗体2B5是这个测定中的阳性对照。
图6提供了如实施例1.1.C 1中所述，通过FLIPR测量的在EP4转染的HEK293 Gα16稳定细胞系中人源化抗PGE2 mAb 2B5.5、2B5.6、2B5.7和2B5.8中和PGE2诱导的Ca++流入。
图7提供了如实施例1.1.C 1中所述，通过FLIPR测量的在EP4转染的HEK293 Gα16稳定细胞系中人源化抗PGE2 mAb 2B5.1、2B5.2、2B5.3和2B5.4中和PGE2诱导的Ca++流入。
图8提供了如实施例3中所述抗PGE2抗体2B5.7、2B5.8和2B5.9的VH区和VL区的比对。
图9提供了通过MAS（平均关节炎得分）测量的在胶原诱导的关节炎模型中抗PGE2抗体、抗鼠TNF抗体及其组合的功效。
发明详述
本发明涉及结合PGE2的前列腺素E2（PGE2）结合蛋白，特别是抗PGE2抗体或其抗原结合片段。本发明的各个方面涉及抗体和抗体片段、及其药物组合物、以及用于制备此种抗体和片段的核酸、重组表达载体和宿主细胞。本发明还包含了使用本发明的抗体在体外或体内检测PGE2，抑制一种或更多种PGE2活性；和调节基因表达的方法。
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。同样，除非另有具体说明，术语例如“元件”或“组分”涵盖包含一个单位的元件和组分以及包含超过一个亚单位的元件和组分。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。使用标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制、和递送、以及患者治疗。
为了本发明可以更容易地理解，选择的术语在下文定义。
如本文使用的，术语“多肽”指氨基酸的任何聚合链。术语“肽”和“蛋白质”可与术语多肽互换使用，且同样指氨基酸的聚合链。术语“多肽”包含天然或人工蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。多肽可以是单体或聚合的。
术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”是这样的蛋白质或多肽，其由于其衍生起源或来源不与天然结合的组分结合，所述天然结合的组分在其天然状态下与其伴随；基本上不含来自相同物种的其他蛋白质；由来自不同物种的细胞表达；或在自然界中不存在。因此，化学合成或在不同于其天然起源的细胞的细胞系统中合成的多肽将是与其天然结合的组分“分离的”。还可以通过分离，使用本领域众所周知的蛋白质纯化技术，使得蛋白质基本上不含天然结合的组分。
如本文使用的，术语“回收”指通过分离，例如使用本领域众所周知的蛋白质纯化技术，使得化学种类例如多肽基本上不含天然结合的组分的过程。
如本文使用的，术语“前列腺素E2”（本文缩写为PGE2）指具有下述结构的前列腺素或其保留某些或全部PGE2活性的变体：
如本文使用的，“生物学活性”指细胞因子的固有生物学特性。PGE2的生物学特性包括但不限于与PGE2受体结合。
如本文使用的，关于抗体、蛋白质、或肽与第二种化学种类相互作用的术语“特异性结合”或“特异地结合”，意指相互作用取决于化学种类上特定结构（例如，抗原决定簇或表位）的存在；例如，抗体识别且与特定蛋白质结构结合而不是一般地与蛋白质结合。如果抗体对表位“A”特异，那么在包含标记的“A”和抗体的反应中，包含表位A的分子（或游离的，未标记的A）的存在将减少与抗体结合的标记的A的量。
如本文使用的，术语“抗体”广泛地指包含4条多肽链－2条重（H）链和2条轻（L）链的任何免疫球蛋白（Ig）分子，或其保留Ig分子的基本表位结合特征的任何功能片段、突变体、变体或衍生。此种突变体、变体或衍生抗体形式是本领域已知的。其非限制性实施方案在下文讨论。
在全长抗体中，每条重链包含重链可变区（在本文中缩写为HCVR或VH）和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区（在本文中缩写为LCVR或VL）和轻链恒定区。轻链恒定区包含1个结构域CL。VH和VL区可以进一步细分成称为互补性决定区（CDR）的高变区，用称为构架区（FR）的较保守区域点缀。每个VH和VL由3个CDRs和4个FRs组成，以下列顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）、种类（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）或亚类。
如本文使用的，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”（或简单地“抗体部分”），指保留与抗原（例如，PGE2）特异性结合的能力的一种或更多种抗体片段。抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。此种抗体实施方案也可以具有双特异性、双重特异性、或多特异性形式，与2种或更多不同抗原特异性结合。包含在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的例子包括（i）Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；（ii）F（ab'）2片段，包含由铰链区的二硫键连接的2个Fab片段的二价片段；（iii）由VH和CH1结构域组成的Fd片段；（iv）由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，（v）dAb片段（Ward 等人，（1989）Nature 341：544-546，Winter 等人，PCT公开WO 90/05144 A1），它包含单个可变结构域；和（vi）分离的互补性决定区（CDR）。此外，尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头来连接，所述合成接头使得它们能够作为单条蛋白质链制备，在所述单条蛋白质链中VL和VH区配对以形成单价分子（称为单链Fv（scFv）；参见，例如，Bird等人，（1988）Science 242：423-426；和Huston等人，（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：5879-5883）。此种单链抗体也包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。也包含其他形式的单链抗体例如双抗体。双抗体是二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用的接头太短而不允许相同链上的2个结构域之间的配对，从而促使结构域与另一条链的互补结构域配对且产生2个抗原结合部位（参见例如，Holliger，P.等人，（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.等人，（1994）Structure 2：1121-1123）。此种抗体结合部分是本领域已知的（Kontermann和Dubel编者，Antibody Engineering（2001）Springer-Verlag. New York. 第790页（ISBN 3-540-41354-5）。
如本文使用的，术语“抗体构建体”指包括与接头多肽或免疫球蛋白恒定结构域连接的本发明的一个或更多个抗原结合部分的多肽。接头多肽包含通过肽键连接的2个或更多氨基酸残基，且用于连接一个或更多个抗原结合部分。此种接头多肽是本领域众所周知的（参见例如，Holliger，P.等人，（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.等人，（1994）Structure 2：1121-1123）。“免疫球蛋白恒定结构域”指重或轻链恒定结构域。人IgG重链和轻链恒定结构域氨基酸序列是本领域已知的，并且在表1中表示。
表1：人IgG重链恒定结构域和轻链恒定结构域的序列
再进一步地，抗体或其抗原结合部分可以是较大免疫粘附分子的部分，通过抗体或抗体部分与一种或更多种蛋白质或肽的共价或非共价结合形成。此种免疫粘附分子的例子包括使用链霉抗生物素蛋白核心区，以制备四聚scFv分子（Kipriyanov，S.M.，等人（1995）Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101），以及使用半胱氨酸残基、标记肽和C末端多组氨酸标记，以制备二价和生物素化scFv分子（Kipriyanov，S.M.，等人（1994）Mol. Immunol. 31:1047-1058）。抗体部分例如Fab和F（ab'）2片段可以使用常规技术由完整抗体制备，例如完整抗体分别地木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，抗体、抗体部分和免疫粘附分子可以使用标准重组DNA技术获得，如本文描述的。
如本文使用的，“分离的抗体”意指这样的抗体，其基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体（例如，特异性结合PGE2的分离的抗体基本上不含特异性结合除PGE2外的抗原的抗体）。然而，特异性结合PGE2的分离的抗体可以与其他抗原例如前列腺素E1（PGE1）分子具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学药品。
如本文使用的，术语“人抗体”预期包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括例如在CDRs且特别是CDR3中，不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基（例如，在体外通过随机或位点专一诱变或在体内通过体细胞突变引入的突变）。然而，如本文使用的，术语“人抗体”不预期包括其中来源于另一种哺乳动物物种例如小鼠种系的CDR序列已移植到人构架序列上的抗体。
如本文使用的，术语“重组人抗体”预期包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染到宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体（在下文部分II C中进一步描述），从重组、组合人抗体文库中分离的抗体（Hoogenboom H.R.,（1997）TIB Tech. 15：62-70；Azzazy H.和Highsmith W.E.,（2002）Clin. Biochem. 35：425-445；Gavilondo J.V.和Larrick J.W.（2002）BioTechniques 29：128-145；Hoogenboom H.和Chames P.（2000）Immunology Today 21：371-378），从对于人免疫球蛋白基因是转基因的动物（例如小鼠）中分离的抗体（参见例如，Taylor，L. D.等人，（1992）Nucl. Acids Res. 20：6287-6295；Kellermann S-A.和Green L.L.（2002）Current Opinion in Biotechnology 13：593-597；Little M.等人，（2000）Immunology Today 21：364-370），或通过包括使人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列剪接的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。此种重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而，在一些实施方案中，对此种重组人抗体实施体外诱变（或，当使用对于人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变），且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是，尽管来源于人种系VH和VL序列且与人种系VH和VL序列相关，但可能在体内的人抗体种系集内非天然存在的序列。一个实施方案提供了能够结合PGE2的全人抗体，这可以使用本领域众所周知的技术产生，例如但不限于，使用人Ig噬菌体文库，例如Jermutus等人，PCT公开号WO 2005/007699 A2中公开的那些。
术语“嵌合抗体”指包含来自一个物种的重和/或轻链可变区序列以及来自另一个物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接的鼠重和轻链可变区的抗体。
术语“CDR移植的抗体”指包含来自一个物种的重和/或轻链可变区序列的抗体，但其中VH和/或VL的一个或更多个CDR区域的序列用另一个物种的CDR序列替换，例如具有鼠重和轻链可变区的抗体，其中一个或更多个鼠CDRs（例如，CDR3）已用人CDR序列替换。
术语“人源化抗体”指包含来自非人物种（例如，小鼠）的重和轻链可变区序列的抗体，但其中至少部分VH和/或VL序列已改变成更“人样”，即更类似于人种系可变序列。一种类型的人源化抗体是CDR移植的抗体，其中将人CDR序列引入非人VH和VL序列以替换相应的非人CDR序列。在一个实施方案中，提供了人源化抗PGE2抗体和抗原结合部分。此种抗体这样产生：通过使用常规杂交瘤技术获得鼠抗PGE2单克隆抗体产生，随后为使用体外基因工程的人源化，例如Kasaian等人PCT公开号WO 2005/123126 A2中公开的那些。
术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文中可互换使用。本领域公认的这些术语指氨基酸残基编号系统，所述氨基酸残基比抗体或其抗原结合部分的重和轻链可变区中的其他氨基酸残基更可变（即高变）（Kabat等人，（1971）Ann. NY Acad ， Sci. 190：382-391和Kabat，E.A.等人，（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest ， Fifth Edition，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242）。对于重链可变区，高变区对于CDR1为氨基酸位置31－35，对于CDR2为氨基酸位置50－65，且对于CDR3为氨基酸位置95－102。对于轻链可变区，高变区对于CDR1为氨基酸位置24－34，对于CDR2为氨基酸位置50－56，且对于CDR3为氨基酸位置89－97。
如本文使用的，术语“受体”和“受体抗体”指提供或编码一个或更多个构架区的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％氨基酸序列的抗体或核酸序列。在一些实施方案中，术语“受体”指提供或编码一个或多个恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在另外一个实施方案中，术语“受体”指提供或编码一个或更多个构架区和一个或多个恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在一个具体实施方案中，术语“受体”指提供或编码一个或更多个构架区的至少80％、优选至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％氨基酸序列的人抗体氨基酸或核酸序列。依照这个实施方案，受体可以包含在人抗体的一个或更多个特定位置上不存在的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少10个氨基酸残基。受体构架区和/或一个或多个受体恒定区可以例如衍生自或得自种系抗体基因、成熟抗体基因、功能抗体（例如，本领域众所周知的抗体、在开发中的抗体、或商购可得的抗体）。
如本文使用的，术语“CDR”指在抗体可变序列内的互补性决定区。在重链和轻链的每个可变区中存在3个CDRs，所述CDRs对于每个可变区命名为CDR1、CDR2和CDR3。如本文使用的，术语“CDR组”指在能够结合抗原的单个可变区中出现的3个CDRs的组。这些CDRs的确切边界已根据不同系统不同地限定。由Kabat（Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institutes of Health，Bethesda，Md.（1987）和（1991））描述的系统，不仅提供了可应用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，还提供了限定3个CDRs的精确残基边界。这些CDRs可以被称为Kabat CDRs。Chothia和同事（Chothia和Lesk，J. Mol. Biol. 196：901-917（1987）以及Chothia 等人，Nature 342：877-883（1989））发现Kabat CDRs内的某些亚部分采取几乎相同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平上具有大的多样性。这些亚部分命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指轻链和重链区域。这些区域可以被称为Chothia CDRs，所述Chothia CDRs具有与Kabat CDRs重叠的边界。与Kabat CDRs重叠的限定CDRs的其他边界已由Padlan（FASEB J. 9：133-139（1995））和MacCallum（J Mol Biol 262（5）：732-45（1996））描述。再其他的CDR边界定义可能不严格地遵循上文所述系统之一，但仍将与Kabat CDRs重叠，尽管按照特定残基或残基组或甚至整个CDRs并不显著影响抗原结合的预测或实验发现，它们可以缩短或加长。本文使用的方法可以利用根据这些系统中的任何一种限定的CDRs，尽管优选实施方案使用Kabat或Chothia限定的CDRs。
如本文使用的，术语“典型(canonical)”残基指在CDR或构架中限定特定典型CDR结构的残基，如由Chothia 等人，J. Mol. Biol. 196:901-907（1987）；Chothia 等人，J. Mol. Biol. 227:799（1992）限定的。根据Chothia 等人，许多抗体的CDRs的关键部分具有几乎相同的肽主链证实，尽管在氨基酸序列水平上具有很大多样性。每个典型结构主要指定一组肽主链扭角用于氨基酸残基的邻接区段形成环。
如本文使用的，术语“供体”和“供体抗体”指提供一个或更多个CDRs的抗体。在一个优选实施方案中，供体抗体是来自与构架区获得自或衍生自的抗体不同的物种的抗体。在人源化抗体的背景中，术语“供体抗体”指提供一个或更多个CDRs的非人抗体。
如本文使用的，术语“构架”或“构架序列”指减去CDRs的可变区的剩余序列。因为CDR序列的确切定义可以由不同系统来决定，所以对构架序列的含义进行相应不同的解释。6个CDRs（轻链的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，以及重链的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3）也将轻链和重链上的构架区分成在每条链上的4个亚区（FR1、FR2、FR3和FR4），其中CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，且CDR3位于FR3和FR4之间。不将特定亚区指定为FR1、FR2、FR3或FR4，如其他人提及的，构架区代表单条天然存在的免疫球蛋白链可变区内的组合FRs。如本文使用的，FR代表4个亚区之一，且FRs代表构成构架区的4个亚区中的2个或更多。关于示例性FR序列参见表5和6。
如本文使用的，术语“种系抗体基因”或“种系抗体基因片段”指由非淋巴样细胞编码的免疫球蛋白序列，所述非淋巴样细胞尚未经历成熟过程，所述成熟过程导致用于表达特定免疫球蛋白的遗传重排和突变（参见，例如，Shapiro 等人，Crit. Rev. Immunol. 22（3）：183-200（2002）；Marchalonis 等人，Adv Exp Med Biol. 484：13-30（2001））。由本发明的各种实施方案提供的优点之一源于下述认识：种系抗体基因比成熟抗体基因更可能保存物种中个体特有的基本氨基酸序列结构，因此当在那个物种中治疗上使用时，更不可能被识别为来自外来来源。
如本文使用的，术语“关键”残基指在可变区内对抗体特别是人源化抗体的结合特异性和/或亲和力具有更多影响的特定残基。关键残基包括但不限于下述中的一个或更多个：与CDR相邻的残基、潜在糖基化位点（可以是N-或O-糖基化位点）、罕见残基、能够与抗原相互作用的残基、能够与CDR相互作用的残基、典型残基、在重链可变区和轻链可变区之间的接触残基、在Vernier区内的残基、和在Chothia限定的可变重链CDR1和Kabat限定的第一个重链构架之间重叠的区域中的残基。
如本文使用的，术语“人源化抗体”是抗体或其变体、衍生物、类似物或片段，其与目的抗原免疫特异性结合，且包括基本上具有人抗体的氨基酸序列的构架（FR）区、和基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区（CDR）。如本文使用的，在CDR上下中的术语“基本上”指具有与非人抗体CDR的氨基酸序列至少80％、优选至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的CDR。人源化抗体包括基本上所有的至少一个、且一般为2个可变结构域（例如，Fab、Fab'、F（ab'）2、FabC、Fv），其中所有或基本上所有CDR区对应非人免疫球蛋白（即，供体抗体）的那些，且所有或基本上所有构架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。优选地，人源化抗体也包含至少部分免疫球蛋白恒定区（Fc），一般为人免疫球蛋白的那种。在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链以及至少重链的可变结构域。抗体还可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在一些实施方案中，人源化抗体仅包含人源化轻链。在一些实施方案中，人源化抗体仅包含人源化重链。在具体实施方案中，人源化抗体仅包含轻链和/或人源化重链的人源化可变结构域。
人源化抗体可以选自免疫球蛋白的任何类别，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，和任何同种型，包括但不限于IgG 1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可以包括来自超过一个类别或同种型的序列，并且可以选择特定恒定结构域，以使用本领域众所周知的技术最佳化所需效应子功能。
人源化抗体的构架和CDR区无需与亲本序列精确对应，例如供体抗体CDR或共有构架可以通过至少一个氨基酸残基的置换、插入和/或缺失进行诱变处理，从而使得在那个位点上的CDR或构架残基与供体抗体或共有构架不对应。然而，在一个优选实施方案中，此种突变将不是广泛的。通常，至少80％、优选至少85％、更优选至少90％且最优选至少95％的人源化抗体残基将与亲本FR和CDR序列的那些对应。如本文使用的，术语“共有构架”指在共有免疫球蛋白序列中的构架区。如本文使用的，术语“共有免疫球蛋白序列”指来自在相关免疫球蛋白序列家族中最频繁出现的氨基酸（或核苷酸）形成的序列（参见例如，Winnaker，From Genes to Clones（Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany 1987）。在免疫球蛋白家族中，共有序列的每个位置由在家族中在那个位置上最频繁出现的氨基酸占据。如果2个氨基酸同样频繁地出现，那么任一都可以包括在共有序列中。
如本文使用的，“Vernier”区指可以调整CDR结构且细调与抗原的适合的构架残基亚群，如由Foote和Winter（1992）J. Mol. Biol. 224:487-499）描述的。Vernier区残基形成在CDRs下的层，并且可以影响CDRs的结构和抗体的亲和力。
术语“多价结合蛋白”在本说明书用于指包含2个或更多个抗原结合部位的结合蛋白。多价结合蛋白优选经工程改造为具有3个或更多个抗原结合部位，且一般不是天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”指能够结合2种或更多种相关或无关靶的结合蛋白。如本文使用的，双重可变结构域（DVD）结合蛋白是这样的结合蛋白，其包含2个或更多个抗原结合部位，且是四价或多价结合蛋白。此种DVD结合蛋白可以是单特异性的，即能够结合一种抗原，或多特异性的，即能够结合2种或更多种抗原。包含2条重链DVD多肽和2条轻链DVD多肽的DVD结合蛋白称为DVD-IgTM。每一半DVD-Ig包含重链DVD多肽，和轻链DVD多肽，和2个抗原结合部位。每个结合部位包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中每个抗原结合部位总共6个涉及抗原结合的CDRs。
如本文使用的，术语“中和”指当结合蛋白特异性结合细胞因子或脂质代谢产物时，中和细胞因子或脂质代谢产物的生物学活性。优选地，中和结合蛋白是中和抗体，其与PGE2的结合导致PGE2生物学活性的抑制。优选地，中和结合蛋白结合PGE2，并且使PGE2的生物学活性减少至少约10％、20％、40％、60％、80％、85％或更多。PGE2生物学活性通过中和结合蛋白的抑制可以通过测量本领域众所周知的一种或更多种PGE2生物学活性指示剂进行评估。例如，使用超表达EP4受体的HEK293细胞通过EP4测定的PGE2诱导的钙流入的抑制（参见实施例1.1.C 1）。
术语“活性”包括活性例如抗体对于抗原的结合特异性/亲和力，例如与PGE2抗原结合的抗PGE2抗体和/或抗体的中和能力，例如其与PGE2的结合抑制PGE2生物学活性的抗PGE2抗体，例如使用超表达EP4受体的HEK293细胞通过EP4测定的PGE2诱导的钙流入的抑制（参见实施例1.1.C 1）。
术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任何多肽决定簇。在一些实施方案中，表位决定簇包括分子例如氨基酸、糖侧链、磷酰基、或磺酰基的化学活性表面群组（grouping），且在一些实施方案中，可以具有具体三维结构特征、和/或具体电荷特征。表位是由抗体结合的抗原区域。在一些实施方案中，当抗体在蛋白质和/或大分子复杂混合物中优先识别其靶抗原时，它特异性结合抗原。
如本文使用的，术语“表面等离子体共振”指通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度改变，例如使用BIAcore系统（Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden和Piscataway，NJ），允许分析实时生物特异性相互作用的光学现象。关于进一步的描述，参见Jönsson，U.,等人，（1993）Ann. Biol. Clin. 51：19-26；Jönsson，U.,等人，（1991）Biotechniques 11：620-627；Johnsson，B.,等人，（1995）J. Mol. Recognit. 8：125-131；和Johnnson，B.,等人，（1991）Anal. Biochem. 198：268-277。
如本领域已知的，如本文使用的术语“kon”意指抗体与抗原结合以形成抗体/抗原复合物的结合速率常数。
如本领域已知的，如本文使用的术语“koff”意指抗体从抗体/抗原复合物中解离的解离速率常数。
如本领域已知的，如本文使用的术语“KD”意指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。
如本文使用的，术语“标记的结合蛋白”指具有标记掺入的蛋白质，所述标记提供了结合蛋白的鉴定。优选地，标记是可检测标记，例如，掺入放射性标记的氨基酸或使生物素化（biotinyl）部分与多肽附着，所述生物素化部分可以通过标记的抗生物素蛋白（例如包含可以通过光学或比色法检测的荧光标记或酶促活性的链霉抗生物素蛋白）进行检测。关于多肽的标记例子包括但不限于下述：放射性同位素或放射性核素（例如，3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho、或153Sm）；荧光标记（例如，FITC、罗丹明、镧系磷光体）；酶促标记（例如，辣根过氧化物酶、萤光素酶、碱性磷酸酶）；化学发光标记；生物素化基团；由次级报道分子识别的预定多肽表位（例如，亮氨酸拉链对序列、关于第二抗体的结合位点、金属结合结构域、附加表位）；和磁性试剂，例如钆螯合物。
术语“抗体缀合物”指与第二种化学部分，例如治疗或细胞毒性剂化学连接的结合蛋白例如抗体。术语“试剂”在本文中用于指化合物、化合物混合物、生物大分子、或由生物学材料制备的提取物。优选地，治疗或细胞毒性剂包括但不限于，百日咳毒素、紫素、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷（tenoposide）、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安、和嘌呤霉素及其类似物或同源物。
如本文使用的，术语“晶体”和“结晶的”指以晶体形式存在的抗体或其抗原结合部分。晶体是物质固态的一种形式，它不同于其他形式例如无定形固态或液晶态。晶体由规则、重复、三维排列的原子、离子、分子（例如，蛋白质例如抗体）、或分子组合（assembly）（例如，抗原/抗体复合物）组成。这些三维排列根据特定数学关系排列。晶体中重复的基本单位或构件被称为不对称单位。符合给定、明确的晶体学对称性的排列中的不对称单位重复提供了晶体的“晶胞”。通过在所有3个维度中规则平移的晶胞重复提供了晶体。参见Giege，R.和Ducruix，A. Barrett，Crystallization of Nucleic Acids and Proteins，a Practical Approach，第2版，第20 1-16页，Oxford University Press，New York，New York,（1999）。
一个实施方案提供了用于释放结合蛋白的组合物，其中所述组合物包括制剂，所述制剂转而包括如上文公开的结晶结合蛋白、结晶抗体构建体或结晶抗体缀合物和成分；和至少一种聚合载体。优选地，聚合载体是选自由下述组成的组的一种或更多种的聚合物：聚丙烯酸、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基酸、聚酐、聚羧酚酸肽、聚酯、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚b-羟基丁酸酯、聚己内酯、聚二氧杂环己酮；聚乙二醇、聚（羟丙基）甲基丙烯酰胺、聚有机磷腈、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、马来酐-烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、白蛋白、藻酸酯、纤维素和纤维素衍生物、胶原、纤维蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖（glycaminoglycans）、硫酸化多糖（polyeaccharides）、及其掺合物和/或共聚物。优选地，成分选自白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。另一个实施方案提供了用于治疗哺乳动物的方法，其包括给哺乳动物施用有效量的上文公开的组合物的步骤。
术语“多核苷酸”在本文中意指2个或更多核苷酸的聚合形式，所述核苷酸为核糖核苷酸或脱氧核苷酸，或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括单和双链形式的DNA，但优选为双链DNA。
如本文使用的，术语“分离的多核苷酸”应意指下述多核苷酸（例如，基因组的、cDNA、或合成来源的，或其某一组合），由于其来源，“分离的多核苷酸”不与在自然界中发现“分离的多核苷酸”与之结合的全部或部分多核苷酸结合；与在自然界中它不与之连接的多核苷酸可操作地连接；或在自然界中不作为较大序列的部分存在。
如本文使用的，术语“载体”意指能够运输它已与之连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，它指另外的DNA区段可以连接到其内的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组内。某些载体能够在它们已引入其内的宿主细胞中自主复制（例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体）。其他载体（例如非游离型哺乳动物载体）在引入宿主细胞内后可以整合到宿主细胞基因组内，且因此连同宿主基因组一起进行复制。此外，某些载体能够指导它们与之可操作地连接的基因表达。此种载体在本文中被称为“重组表达载体”（或简单地，“表达载体”）。一般而言，在重组DNA技术中使用的表达载体通常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明预期包括此种其他形式的表达载体，例如提供等价功能的病毒载体（例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒）。
术语“可操作地连接的”指其中所述组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中的并列。与编码序列“可操作地连接的”控制序列以这样的方式连接，从而使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下完成。“可操作地连接的”序列包括与目的基因邻接的表达控制序列，和反式或在远处起作用以控制目的基因的表达控制序列。如本文使用的，术语“表达控制序列”指实现它们与之连接的编码序列表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号例如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列（即，Kozak共有序列）；增强蛋白质稳定性的序列；和需要时，增强蛋白质分泌的序列。此种控制序列的性质依赖于宿主生物而不同；在原核生物中，此种控制序列一般包括启动子，核糖体结合位点，和转录终止序列；在真核生物中，此种控制序列一般包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”预期包括其存在是表达和加工必需的组分，且还可以包括其存在是有利的另外组分，例如前导序列和融合配偶体序列。本发明的蛋白质构建体可以使用本领域已知的表达载体和宿主细胞进行表达且纯化，包括表达盒、载体、重组宿主细胞，和用于来自单个开放读码框的重组蛋白质和前蛋白质的重组表达和蛋白酶解加工的方法（例如，WO 2007/014162）。
如本文定义的，“转化”指外源DNA通过其进入宿主细胞的任何方法。转化可以使用本领域众所周知的各种方法在天然或人工条件下发生。转化可以依赖于用于将外来核酸序列插入原核或真核宿主细胞内的任何已知方法。该方法基于待转化的宿主细胞进行选择，且可以包括但不限于，病毒感染、电穿孔、脂质转染、和粒子轰击。此种“转化的”细胞包括其中插入的DNA能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体部分复制的稳定转化的细胞。它们还包括瞬时表达插入的DNA或RNA有限时间段的细胞。
如本文使用的，术语“重组宿主细胞”（或简单地“宿主细胞”）意指其中已引入外源DNA的细胞。应当理解此种术语不仅意指特定的受试细胞，还意指此种细胞的后代。因为由于突变或环境影响可能在随后世代中出现某些修饰，所以此种后代实际上可能不等同于亲本细胞，但仍包括在如本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。优选地，宿主细胞包括原核细胞、真核细胞、昆虫细胞或选自任何生命界的细胞。优选地，真核细胞包括原生生物、真菌、植物和动物细胞。最优选地，宿主细胞包括但不限于原核细胞系大肠杆菌；哺乳动物细胞系CHO、HEK 293和COS；昆虫细胞系Sf9；和真菌细胞酿酒酵母。
标准技术可以用于重组DNA、寡核苷酸合成、以及组织培养和转化（例如，电穿孔、脂质转染）。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明书或如本领域通常完成的或如本文所述的来进行。前述技术和程序一般可以根据本领域众所周知以及如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。参见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual（第2版， Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.（1989））。
如本领域已知且如本文使用的，“转基因生物”指具有包含转基因的细胞的生物，其中引入生物（或生物祖先）内的转基因表达在该生物中非天然表达的多肽。“转基因”是DNA构建体，所述DNA构建体稳定且可操作地整合到转基因生物由其发育的细胞的基因组内，从而指导编码的基因产物在转基因生物的一种或多种细胞类型或组织中表达。
术语“调节”和“调整”可互换使用，且如本文使用的，指目的分子活性（例如，PGE2的生物学活性）中的变化或改变。调整可以是目的分子的某一活性或功能量级中的增加或减少。分子的示例性活性和功能包括但不限于，结合特征、酶促活性、细胞受体激活、和信号转导。
相应地，如本文使用的，术语“调节剂”是能够改造或改变目的分子活性或功能（例如，PGE2的生物学活性）的化合物。例如，与在不存在调节剂的情况下观察到的活性或功能量级相比较，调节剂可以引起分子某一活性或功能量级中的增加或减少。在某些实施方案中，调节剂是减少分子至少一种活性或功能量级的抑制剂。示例性抑制剂包括但不限于，蛋白质、肽、抗体、肽体（peptibodies）、碳水化合物或小有机分子。肽体在例如WO01/83525中描述。
如本文使用的，术语“激动剂”指当与目的分子接触时，与在不存在激动剂的情况下观察到的活性或功能量级相比较，引起分子某一活性或功能量级中的增加的调节剂。具体目的激动剂可以包括但不限于，PGE2或多肽、核酸、碳水化合物、或与PGE2结合的任何其他分子。
如本文使用的，术语“拮抗剂”或“抑制剂”指当与目的分子接触时，与在不存在拮抗剂的情况下观察到的活性或功能量级相比较，引起分子某一活性或功能量级中的减少的调节剂。具体目的拮抗剂包括阻断或调节PGE2生物学或免疫活性的那些。PGE2拮抗剂和抑制剂可以包括但不限于，蛋白质、核酸、碳水化合物、或与PGE2结合的任何其他分子。
术语“抑制与受体的结合”指结合蛋白阻止PGE2与其一种或更多种受体结合的能力。与受体结合的此种抑制将导致减少或取消通过PGE2与其一种或多种受体结合介导的生物学活性。
如本文使用的，术语“有效量”指疗法的量，其足以减少或改善病症或其一种或更多种症状的严重性和/或持续时间，预防病症进展，引起病症消退，预防与病症相关的一种或更多种症状复发、发展、发作或进展，检测病症，或增强或改善另一种疗法（例如，预防或治疗剂）的预防或治疗作用。
如本文使用的，术语“样品”以其最广泛的含义使用。如本文使用的，“生物学样品”包括但不限于，来自生物（living thing）或从前生物的任何量的物质。此种生物包括但不限于，人、小鼠、大鼠、猴、狗、兔和其他动物。此种物质包括但不限于，血液、血清、尿、滑液、细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结和脾。
在一个优选实施方案中，结合蛋白是能够结合PGE2的CDR移植的抗体或其抗原结合部分。优选地，CDR移植的抗体或其抗原结合部分包括来自上文公开的2B5-7.0、或2B5-8.0或2B5-9.0的一个或更多个CDRs。优选地，CDR移植的抗体或其抗原结合部分包括人受体构架。更优选地，人受体构架是与2B5-7.0、或2B5-8.0或2B5-9.0的小鼠抗体构架具有> 60％同源性的任何一种人受体构架。
在一个优选实施方案中，结合蛋白是能够结合PGE2的人源化抗体或其抗原结合部分。优选地，人源化抗体或其抗原结合部分包括掺入人受体构架的人抗体可变结构域内的上文公开的一个或更多个CDRs。优选地，人抗体可变结构域是共有人可变结构域。更优选地，人受体构架包括在关键残基上的至少一个构架区氨基酸置换，其中所述关键残基选自与CDR相邻的残基；糖基化位点残基；罕见残基；能够与PGE2相互作用的残基；能够与CDR相互作用的残基；典型残基；在重链可变区和轻链可变区之间的接触残基；在Vernier区内的残基；和在Chothia限定的可变重链CDR1和Kabat限定的第一个重链构架之间重叠的区域中的残基。优选地，人受体构架人受体构架包括至少一个构架区氨基酸置换，其中所述构架的氨基酸序列与所述人受体构架的序列至少65％相同，并且包括与所述人受体构架相同的至少70个氨基酸残基。
在一个实施方案中，人源化抗体或其抗原结合部分包括上文公开的3个或更多个CDRs。在一些实施方案中，人源化抗体或其抗原结合部分包括上文公开的6个CDRs。
本发明的一个实施方案提供了包括上文公开的结合蛋白中的任何一种和接头多肽或免疫球蛋白的抗体构建体。在一个优选实施方案中，抗体构建体选自免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植的抗体、人源化抗体、Fab、Fab’、F（ab’）2、Fv、二硫化物连接的Fv、scFv、单结构域抗体、双抗体、多特异性抗体、双重特异性抗体、DVD-IgTM和双特异性抗体。在一个优选实施方案中，抗体构建体包括选自下述的重链免疫球蛋白恒定结构域：人IgM恒定结构域、人IgG1恒定结构域、人IgG2恒定结构域、人IgG3恒定结构域、人IgG4恒定结构域、人IgE恒定结构域和人IgA恒定结构域。在另一个实施方案中，本发明提供了包括上文公开的抗体构建体和选自下述的试剂试剂的抗体缀合物：免疫粘附分子、显像剂、治疗剂和细胞毒性剂。在一个优选实施方案中，显像剂选自放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记和生物素。更优选地，显像剂是选自下述的放射性标记：3H、 14C、 35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm。在一个优选实施方案中，治疗或细胞毒性剂选自抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类、毒素和细胞凋亡剂。
在另一个实施方案中，抗体构建体是糖基化的。优选地，糖基化是人糖基化模式。
在另一个实施方案中，上文公开的结合蛋白、抗体构建体或抗体缀合物是晶体。优选地，晶体是无载体的药学控释晶体。在一个优选实施方案中，结晶结合蛋白、结晶抗体构建体或结晶抗体缀合物具有比其可溶性对应物更长的体内半衰期。在另一个优选实施方案中，结晶结合蛋白、结晶抗体构建体或结晶抗体缀合物在结晶化后保留生物学活性。
本发明的一个方面涉及编码上文公开的任何一种结合蛋白、抗体构建体或抗体缀合物的分离的核酸。一个进一步的实施方案提供了包括上文公开的分离核酸的载体，其中所述载体选自pcDNA；pTT（Durocher 等人，Nucleic Acids Research 2002，第30卷，No.2）；pTT3（具有另外的多克隆位点的pTT）；pEFBOS（Mizushima，S.和Nagata，S.,（1990）Nucleic Acids Research 第18卷，No. 17）；pBV；pJV；pA2；和pBJ。
在另一个方面，用上文公开的载体转化宿主细胞。优选地，宿主细胞是原核细胞。更优选地，宿主细胞是大肠杆菌。在另一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞。优选地，真核细胞选自原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。更优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于CHO、HEK293和COS；或真菌细胞例如酿酒酵母；或昆虫细胞例如Sf9。
本发明的另一个方面提供了生产结合PGE2的结合蛋白的方法，其包括在足以生产结合PGE2的结合蛋白的条件下，在培养基中培养上文公开的任何一种宿主细胞。另一个实施方案提供了根据上文公开的方法生产的结合蛋白。
本发明还提供了包括如上文公开的结合蛋白、抗体构建体或抗体缀合物和药学可接受的载体的药物组合物。在一个进一步的实施方案中，药物组合物包括用于治疗其中PGE2活性是有害的病症的至少一种另外的治疗剂。优选地，另外的试剂选自：治疗剂，显像剂，细胞毒性剂，血管发生抑制剂（包括但不限于抗VEGF抗体或VEGF-trap）；激酶抑制剂（包括但不限于KDR和TIE-2抑制剂）；共刺激分子阻断剂（包括但不限于抗B7.1、抗B7.2、CTLA4-Ig、抗CD20）；粘附分子阻断剂（包括但不限于，抗LFA-1 Abs、抗E/L选择蛋白Abs、小分子抑制剂）；抗细胞因子抗体或其功能片段（包括但不限于抗IL-18、抗TNF、抗IL-6/细胞因子受体抗体）；氨甲蝶呤；环孢菌素；雷帕霉素；FK506；可检测标记或报道分子；TNF拮抗剂；抗风湿剂；肌肉弛缓剂，麻醉药，非类固醇消炎药（NSAID），止痛剂，麻醉剂，镇静剂，局部麻醉剂，神经肌肉阻断剂，抗微生物剂，抗牛皮癣剂，皮质类固醇，促蛋白质合成类固醇，促红细胞生成素，免疫接种，免疫球蛋白，免疫抑制剂，生长激素，激素替代药物，放射性药物，抗抑郁药，抗精神病药，刺激剂，哮喘药物治疗，β激动剂，吸入类固醇，肾上腺素或其类似物，细胞因子，和细胞因子拮抗剂。
在另一个方面，本发明提供了用于抑制PGE2活性的方法，其包括使PGE2与上文公开的结合蛋白接触，从而使得PGE2活性被抑制。在一个相关方面，本发明提供了用于抑制患有其中PGE2活性是有害的病症的人受试者中的PGE2活性的方法，其包括给人受试者施用上文公开的结合蛋白，从而使得人受试者中的PGE2活性被抑制并且达到治疗。
在另一个方面，本发明提供了治疗（例如，治愈、压制、改善、延迟或预防发作，或预防再发生或复发）或预防受试者中的PGE2相关病症的方法。该方法包括：以足以治疗或预防PGE2相关病症的量，给受试者施用如本文所述的PGE2结合蛋白（特别是拮抗剂），例如抗PGE2抗体或其片段。如本文描述的，PGE2拮抗剂例如抗PGE2抗体或其片段可以单独或与其他治疗模式组合施用于受试者。
在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗（例如，减少、改善）或预防哺乳动物受试者中的一种或更多种症状的方法和组合物，所述哺乳动物受试者例如患有一种或更多种PGE2相关病症的人，包括例如其中已牵涉过量PGE2合成的自身免疫和炎性疾病和肿瘤。此种病症包括：（a）类风湿性和变应性关节炎；（b）由病毒诱导的特定病，例如格-巴二氏综合征、传染性单核细胞增多症、其他病毒性淋巴结病和疱疹病毒感染；（c）多发性硬化和其他脱髓鞘疾病；（d）血液学病症，例如溶血性贫血和血小板减少症；（e）内分泌学病症，例如糖尿病、Addison氏病、特发性甲状旁腺机能减退和慢性淋巴细胞性甲状腺炎；（f）胶原病症，例如全身性红斑狼疮；和（g）生殖病症，例如闭经、不育、复发性流产和子痫；和（h）肿瘤，例如头颈肿瘤、肺癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌等；和（i）胃肠器官病症（例如炎性肠病（IBD），例如溃疡性结肠炎和/或Crohn氏病）；和（j）疼痛病症，例如与骨关节炎和其他病症相关的疼痛；和（k）眼病症例如年龄相关黄斑变性（AMD）。因此，本公开内容包括PGE2结合试剂（例如，抗PGE2抗体或其片段）用于治疗的用途和PGE2结合试剂（例如，抗PGE2抗体或其片段）用于制备用于治疗的药剂的用途。
该方法包括以足以治疗（例如，减少、改善）或预防一种或更多种症状的量，给受试者施用PGE2拮抗剂，例如PGE2抗体或其片段。PGE2抗体可以在治疗上或预防上或两者进行施用。PGE2拮抗剂例如抗PGE2抗体或其片段可以单独或与其他治疗模式组合施用于受试者，如本文描述的。优选地，受试者是患有如本文描述的PGE2相关病症的哺乳动物例如人。
在另一个方面，本申请提供了用于在体外检测样品中PGE2的存在的方法（例如，生物学样品，例如血清、血浆、组织、活组织检查）。主题方法可以用于诊断病症，例如免疫细胞相关病症。该方法包括：（i）使样品或对照样品与如本文描述的抗PGE2抗体或其片段接触；和（ii）检测在抗PGE2抗体或其片段和样品或对照样品之间的复合物形成，其中相对于对照样品，在样品中的复合物形成中的统计上显著变化指示样品中PGE2的存在。
在另一个方面，本发明提供了治疗患有其中PGE2是有害的病症的患者的方法，所述方法包括在如上文讨论的第二种试剂施用之前、同时或之后，施用上文公开的任何一种结合蛋白的步骤。在一个优选实施方案中，可以与一种或更多种PGE2拮抗剂（例如，抗PGE2抗体或其片段）共施用和/或共配制的另外治疗剂包括但不限于下述中的一种或更多种：MTX；经口类固醇；金属蛋白酶抑制剂，柳氮磺胺吡啶，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，血管紧张素转换酶抑制剂，可溶性细胞因子受体，可溶性p55 TNF受体，可溶性p75 TNF受体，sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R，抗炎细胞因子，IL-4、IL-10、IL-11和TGFβ。
在一个优选实施方案中，上文公开的药物组合物通过选自下述的至少一种方式施用于受试者：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、盆腔内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、快速浓注、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内和经皮。
本发明的一个方面提供了针对本发明的至少一种PGE2结合蛋白的至少一种PGE2抗独特型抗体。抗独特型抗体包括包含分子的任何蛋白质或肽，所述分子包括免疫球蛋白分子的至少一部分，例如但不限于重或轻链或其配体结合部分的至少一个互补决定区（CDR）、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、构架区，或；其任何部分，其可以掺入本发明的结合蛋白内。
I. 结合前列腺素E2的抗体
在本发明中提供了鼠单克隆抗体或其抗原结合部分，其以高亲和力、慢解离速率和高中和能力与PGE2结合。本发明还提供了结合PGE2的嵌合抗体。本发明还提供了结合PGE2的人源化抗体或其抗原结合部分。优选地，抗体或其部分是分离的抗体。优选地，本发明的抗体是中和人抗PGE2和/或人抗PGE2抗体。
A. 制备抗前列腺素E2抗体的方法
本发明的抗体和抗体片段可以通过任何领域已知的方法产生，例如杂交瘤、微生物（例如噬菌体、细菌、酵母）、重组体、核糖体、mRNA和DNA展示，或其组合。许多方法可以用于处理抗体以修饰抗体性质，包括本领域众所周知的人源化、亲和力成熟、抗体同种型转换、生理化学性质和药物代谢动力学谱改善等。
1. 使用杂交瘤技术的抗前列腺素E2单克隆抗体
单克隆抗体可以使用本领域已知的广泛多样的技术来制备，包括使用杂交瘤、重组体、噬菌体和酵母展示技术，或其组合。例如，单克隆抗体可以例如使用杂交瘤技术来生产，包括本领域已知和例如Harlow 等人，Antibodies：A Laboratory Manual,（Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版1988）；Hammerling，等人：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681（Elsevier，N.Y.，1981）中教导的那些。如本文使用的，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指来源于单个克隆，包括任何真核、原核、或噬菌体克隆，而不是产生其的方法的抗体。
关于使用杂交瘤技术生产且筛选特异性抗体的方法是本领域常规且众所周知的。在一个实施方案中，本发明提供了产生单克隆抗体的方法以及通过该方法生产的抗体，所述方法包括培养分泌本发明的抗体的杂交瘤细胞，其中优选地，通过使从用本发明的抗原免疫接种的小鼠中分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤，并且随后在起源于融合的杂交瘤中筛选分泌能够结合本发明多肽的抗体的杂交瘤克隆（参见实施例1.2）。简言之，小鼠可以用称为半抗原-载体蛋白质缀合物的载体蛋白质缀合的PGE2进行免疫接种。此处，半抗原是PGE2，并且载体蛋白质可以是牛甲状腺球蛋白、钥孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白等中的任何。在一个优选实施方案中，PGE2-甲状腺球蛋白缀合物与佐剂一起施用，以刺激免疫应答。此种佐剂包括完全或不完全弗氏佐剂、RIBI（胞壁酰二肽）或ISCOM（免疫刺激复合物）。此种佐剂可以通过使其在局部沉积物中隔离来保护多肽不受快速分散，或它们可以包含刺激宿主分泌对于巨噬细胞和免疫系统的其他组分是趋化性的因子的物质。优选地，如果施用多肽，那么免疫接种时间表将涉及经过数周展开的多肽的2次或更多次施用。
在用PGE2-甲状腺球蛋白缀合物免疫接种动物后，可以由动物获得抗体和/或抗体产生细胞。通过使动物放血或处死动物，由动物获得含抗PGE2抗体血清。血清可以如它得自动物时使用，可以由血清获得免疫球蛋白馏分，或可以由血清纯化抗PGE2抗体。以这种方式获得的血清或免疫球蛋白是多克隆的，因此具有异源系列的性质。
检测出免疫应答后，例如在小鼠血清中检测出对于抗原PGE2特异性的抗体后，收获小鼠脾脏且分离脾细胞。随后通过众所周知的技术使脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞融合，例如来自可从ATCC获得的细胞系SP20的细胞。通过有限稀释选择并且克隆杂交瘤。随后通过本领域已知的方法就分泌能够结合PGE2的抗体的细胞测定杂交瘤克隆。通过用阳性杂交瘤克隆免疫接种小鼠可以产生一般包含高水平抗体的腹水液。
在另一个实施方案中，可以由免疫接种动物制备抗体生产永生化杂交瘤。在免疫接种后，处死动物，并且使脾B细胞与永生化骨髓瘤细胞融合，如本领域众所周知的。参见例如，Harlow和Lane同上。在一个优选实施方案中，骨髓瘤细胞不分泌免疫球蛋白多肽（非分泌性细胞系）。在融合和抗生素选择后，使用PGE2或其部分或表达PGE2的细胞筛选杂交瘤。在一个优选实施方案中，使用酶联免疫吸附测定（ELISA）或放射免疫测定（RIA）优选ELISA执行起始筛选。ELISA筛选的例子在WO 00/37504中提供。
如下文进一步讨论的，抗PGE2抗体生产杂交瘤被选择、克隆和进一步筛选所需特征，包括强杂交瘤生长、高抗体产生和所需抗体特征。杂交瘤可以在同系动物体内、在缺乏免疫系统的动物例如裸鼠、或在体外细胞培养中培养和扩增。选择、克隆和扩增杂交瘤的方法是本领域普通技术人员众所周知的。
在一个优选实施方案中，如上所述，杂交瘤是小鼠杂交瘤。在另一个优选实施方案中，杂交瘤在非人、非小鼠物种，例如大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马中生产。在另一个实施方案中，杂交瘤是人杂交瘤，其中人非分泌性骨髓瘤与表达抗PGE2抗体的人细胞融合。
识别特定表位的抗体片段可以通过已知技术产生。例如，本发明的Fab和F（ab'）2片段可以通过免疫球蛋白分子的蛋白酶解切割产生，使用酶例如木瓜蛋白酶（以产生Fab片段）或胃蛋白酶（以产生F（ab'）2片段）。F（ab'）2片段包含可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。
2. 使用SLAM的抗前列腺素E2单克隆抗体
在本发明的另一个方面，使用本领域中称为选择淋巴细胞抗体法（SLAM）的程序从单个、分离的淋巴细胞中产生重组抗体，所述SLAM如美国专利号5,627,052、PCT公开WO 92/02551和Babcock，J.S.等人，（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：7843-7848中所述。在这种方法中，使用抗原特异性溶血空斑测定筛选分泌目的抗体的单个细胞，例如衍生自部分1中所述的任何一种免疫接种动物的淋巴细胞，其中使用接头例如生物素使抗原PGE2或PGE2的亚单位或其片段与绵羊红血细胞偶联，并且用于鉴定分泌对于PGE2具有特异性的抗体的单个细胞。在鉴定分泌抗体的目的细胞后，通过逆转录酶PCR从细胞中拯救重和轻链可变区cDNAs，随后可以在合适的免疫球蛋白恒定区（例如，人恒定区）背景中，在哺乳动物宿主细胞例如COS、HEK293或CHO细胞中表达这些可变区。用扩增的免疫球蛋白序列转染的、来源于体内选择的淋巴细胞的宿主细胞，随后可以经历进一步的体外分析和选择，例如通过淘选转染的细胞以分离表达针对PGE2的抗体的细胞。扩增的免疫球蛋白序列进一步可以进行体外处理，例如通过体外亲和力成熟法，例如PCT公开WO 97/29131和PCT公开WO 00/56772中描述的那些。
3. 使用转基因动物的抗前列腺素E2单克隆抗体
在本发明的另一个实施方案中，通过用PGE2-载体蛋白质缀合物免疫接种非人动物来生产抗体，所述非人动物包含一些或全部人免疫球蛋白基因座。在一个优选实施方案中，非人动物是XENOMOUSE转基因小鼠，包含人免疫球蛋白基因座大片段且在小鼠抗体产生方面有缺陷的工程改造的小鼠品系。参见，例如，Green等人，Nature Genetics 7：13-21（1994）和美国专利5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598和6,130,364。还参见于1991年7月25日公开的WO 91/10741，于1994年2月3日公开的WO 94/02602，均于1996年10月31日公开的WO 96/34096和WO 96/33735，于1998年4月23日公开的WO 98/16654，于1998年6月11日公开的WO 98/24893，于1998年11月12日公开的98/50433，于1999年9月10日公开的WO 99/45031，于1999年10月21日公开的WO 99/53049，于2000年2月24日公开的WO 00 09560，和于2000年6月29日公开的WO 00/037504。XENOMOUSE转基因小鼠生产全人抗体的成体样人集合，且产生抗原特异性人Mabs。通过引入兆碱基大小的、人重链基因座和x轻链基因座的种系构型YAC片段，XENOMOUSE转基因小鼠包含约80％人抗体集合。参见Mendez 等人，Nature Genetics 15：146-156（1997），Green和Jakobovits J. Exp. Med. 188：483-495（1998）。
4. 使用重组抗体文库的抗前列腺素E2单克隆抗体
体外方法也可以用于制备本发明的抗体，其中筛选抗体文库以鉴定具有所需结合特异性的抗体。关于重组抗体文库的此种筛选的方法是本领域众所周知的，且包括在下述参考文献中描述的方法：例如，Ladner等人，美国专利号5,223,409；Kang等人，PCT公开号WO 92/18619；Dower等人，PCT公开号WO 91/17271；Winter等人，PCT公开号WO 92/20791；Markland等人，PCT公开号WO 92/15679；Breitling等人，PCT公开号WO 93/01288；McCafferty等人，PCT公开号WO 92/01047；Garrard等人，PCT公开号WO 92/09690；Fuchs等人，（1991）Bio/Technology 9：1370-1372；Hay等人，（1992）Hum Antibod Hybridomas 3：81-85；Huse等人，（1989）Science 246：1275-1281；McCafferty 等人， Nature（1990）348：552-554；Griffiths等人，（1993）EMBO J 12：725-734；Hawkins等人，（1992）J Mol Biol 226：889-896；Clackson等人，（1991）Nature 352：624-628；Gram等人，（1992）PNAS 89：3576-3580；Garrad等人，（1991）Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom等人，（1991）Nuc Acid Res 19：4133-4137；和Barbas等人，（1991）PNAS 88：7978-7982，US专利申请公开20030186374，和PCT公开号WO 97/29131。
重组抗体文库可以来自用PGE2-载体蛋白质缀合物免疫接种的受试者。可替代地，重组抗体文库可以来自首次用于实验的受试者，即未用PGE2-载体蛋白质缀合物免疫接种的受试者，例如来自未用PGE2-载体蛋白质缀合物免疫接种的人受试者的人抗体文库。通过用包括PGE2的试剂筛选重组抗体文库选择本发明的抗体，从而选择识别PGE2的那些抗体。用于进行此种筛选和选择的方法是本领域众所周知的，例如前述段落中的参考文献中所述的。为了选择对于PGE2具有特定结合亲和力的本发明的抗体，例如以特定koff速率常数与PGE2解离的那些，本领域已知的表面等离子体共振方法可以用于选择具有所需koff速率常数的抗体。为了选择对于PGE2具有特定中和活性的本发明的抗体，例如具有特定IC50的那些，可以使用用于评估PGE2活性抑制的本领域已知的标准方法。
例如，本发明的抗体也可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来产生。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域在噬菌体颗粒表面上展示，所述噬菌体颗粒携带编码其的多核苷酸序列。具体地，此种噬菌体可以用于展示由集合或组合抗体文库（例如，人或鼠）表达的抗原结合结构域。表达结合目的抗原的抗原结合结构域的噬菌体可以用抗原进行选择或鉴定，例如使用标记的抗原或被固体表面或珠结合或捕获的抗原。这些方法中使用的噬菌体一般是包括fd和M13结合结构域的丝状噬菌体，所述结合结构域由具有Fab、Fv或二硫化物稳定化的Fv抗体结构域的噬菌体表达，所述抗体结构域与噬菌体基因III或基因VIII蛋白质重组融合。可以用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法的例子包括下述参考文献中公开的那些：Brinkman 等人，J. Immunol. Methods 182：41-50（1995）；Ames 等人，J. Immunol. Methods 184：177-186（1995）；Kettleborough 等人，Eur. J. Immunol. 24：952-958（1994）；Persic 等人，Gene 187 9-18（1997）；Burton 等人，Advances in Immunology 57：191-280（1994）；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT公开WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；以及美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108。
如上文参考文献中所述，噬菌体选择后，来自噬菌体的抗体编码区可以进行分离并用于产生完整抗体，且在任何所需宿主中表达，所述完整抗体包括人抗体或任何其他所需抗原结合片段，所述宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如，如下文详细描述的。例如，也可以采用重组生产Fab、Fab'和F（ab'）2片段的技术，其中使用本领域已知的方法，例如下述参考文献中公开的那些：PCT公开WO 92/22324；Mullinax 等人，BioTechniques 12（6）：864-869（1992）；和Sawai 等人，AJRI 34：26-34（1995）；以及Better 等人，Science 240：1041-1043（1988）。可以用于生产单链Fvs和抗体的技术例子包括下述参考文献中描述的那些：美国专利4,946,778和5,258,498；Huston 等人，Methods in Enzymology 203：46-88（1991）；Shu 等人，PNAS 90：7995-7999（1993）；以及Skerra 等人，Science 240：1038-1040（1988）。
作为通过噬菌体展示筛选重组抗体文库的替代，本领域已知的用于筛选大组合文库抗体的其他方法可以应用于本发明的双重特异性抗体的鉴定。如Szostak和Roberts的PCT公开号WO 98/31700，以及Roberts，R.W.和Szostak，J.W.（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94：12297-12302中描述的，一类可替代的表达系统是其中重组抗体文库作为RNA-蛋白质融合物表达的表达系统。在这种系统中，通过在其3’末端上携带嘌呤霉素－肽基受体抗生素的合成mRNAs的体外翻译，在mRNA及其编码的肽或蛋白质之间产生共价融合。因此，基于编码的肽或蛋白质例如抗体或其部分的性质，例如抗体或其部分与双重特异性抗原的结合，特定mRNA可以从mRNAs的复杂混合物（例如，组合文库）中富集。由此种文库筛选回收的编码抗体或其部分的核酸序列，可以通过如上文所述的重组方法（例如，在哺乳动物宿主细胞中）表达，且此外可以通过mRNA-肽融合物的另外筛选循环，或通过如上文所述用于重组抗体体外亲和力成熟的其他方法实施进一步的亲和力成熟，在所述mRNA-肽融合物中已将突变引入最初选择的序列内。
在另一种方法中，本发明的抗体也可以使用本领域已知的酵母展示方法来产生。在酵母展示方法中，使用遗传方法以使抗体结构域束缚于酵母细胞壁，且将它们显示在酵母表面上。具体地，此种酵母可以用于展示由集合或组合抗体文库（例如，人或鼠）表达的抗原结合结构域。可以用于制备本发明抗体的酵母展示方法的例子包括在Wittrup等人，美国专利号6,699,658中公开的那些。
5. 使用PROfusion mRNA展示的抗前列腺素E2单克隆抗体
PROfusionTM技术是上文描述的mRNA展示技术之一。PROfusionTM技术可以用于展示与其编码DNA序列偶联的人抗体片段（VH或VL或scFv）用于针对各种抗原选择。可以用于制备本发明抗体的mRNA展示方法的例子包括在Szostak，等人美国专利号6,207,446；6,214,553；和Gold，等人美国专利号6,194,550以及在Roberts，R.W.和Szostak，J.W.（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302中公开的那些。在这种系统中，通过在其3'末端上携带嘌呤霉素――肽基受体抗生素的合成mRNAs的体外翻译，制备在mRNA和它编码的肽或蛋白质之间的共价融合物。因此，基于所编码的肽或蛋白质例如抗体或其部分的性质，例如抗体或其部分与双重特异性抗原的结合，可以从mRNAs的复杂混合物（例如，组合文库）中富集特异性mRNA。由此种文库筛选回收的编码抗体或其部分的核酸序列可以通过如上所述的重组方法进行表达（例如，在哺乳动物宿主细胞中），并且此外，可以实施进一步的亲和力成熟，通过筛选其中突变已引入最初选择的一种或多种序列内的mRNA-肽融合物的另外循环，或通过用于重组抗体的体外亲和力成熟的其他方法，如上所述。
6. 抗前列腺素E2单克隆抗体的亲和力成熟
体外方法也可以用于本发明的抗体的亲和力成熟，其中通过在一种起始抗体的CDRs和/或构架中引入一种或多种点突变产生诱变抗体文库，使用易错PCR、或合成组合寡核苷酸，或寡核苷酸指导的诱变。随后可以筛选诱变文库，以鉴定具有改善结合特异性的抗体。用于重组抗体文库的此种筛选的方法是本领域众所周知的，并且包括在例如下述中所述的方法：Ladner 等人美国专利号5,223,409；Kang 等人 PCT公开号WO 92/18619；Dower 等人 PCT公开号WO 91/17271；Winter 等人 PCT公开号WO 92/20791；Markland 等人 PCT公开号WO 92/15679；Breitling 等人 PCT公开号WO 93/01288；McCafferty 等人 PCT公开号WO 92/01047；Garrard 等人 PCT公开号WO 92/09690；Fuchs 等人（1991）Bio/Technology 9:1370-1372；Hay 等人（1992）Hum Antibod Hybridomas 3:81-85；Huse 等人（1989）Science 246:1275-1281；McCafferty 等人，Nature（1990）348:552-554；Griffiths 等人（1993）EMBO J 12:725-734；Hawkins 等人（1992）J Mol Biol 226:889-896；Clackson 等人（1991）Nature 352:624-628；Gram 等人（1992）PNAS 89:3576-3580；Garrad 等人（1991）Bio/Technology 9:1373-1377；Hoogenboom 等人（1991）Nuc Acid Res 19:4133-4137；和Barbas 等人（1991）PNAS 88:7978-7982，美国专利申请公开20030186374和PCT公开号WO 97/29131。
用于进行此种筛选和选择的方法是本领域众所周知的，例如前述段落中的参考文献中所述的。为了选择对于PGE2具有特定结合亲和力的本发明的抗体，例如以特定koff速率常数与PGE2解离的那些，本领域已知的表面等离子体共振方法可以用于选择具有所需koff速率常数的抗体。为了选择对于PGE2具有特定中和活性的本发明的抗体，例如具有特定IC50的那些，可以使用用于评估PGE2活性抑制的本领域已知的标准方法。
例如，本发明的抗体还可以使用本领域已知的各种展示方法进行亲和力成熟。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域在噬菌体颗粒表面上展示，所述噬菌体颗粒携带编码其的多核苷酸序列。具体地，此种噬菌体可以用于展示由集合或组合抗体文库（例如，人或鼠）表达的抗原结合结构域。表达结合目的抗原的抗原结合结构域的噬菌体可以用抗原进行选择或鉴定，例如使用标记的抗原或被固体表面或珠结合或捕获的抗原。这些方法中使用的噬菌体一般是包括fd和M13结合结构域的丝状噬菌体，所述结合结构域由具有Fab、Fv或二硫化物稳定的Fv抗体结构域的噬菌体表达，所述抗体结构域与噬菌体基因III或基因VIII蛋白质重组融合。可以用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法的例子包括下述参考文献中公开的那些：Brinkman 等人，J. Immunol. Methods 182:41-50（1995）；Ames 等人，J. Immunol. Methods 184:177-186（1995）；Kettleborough 等人，Eur. J. Immunol. 24:952-958（1994）；Persic 等人，Gene 187 9-18（1997）；Burton 等人，Advances in Immunology 57:191-280（1994）；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT申请WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780，225；5,658,727；5,733,743和5,969,108。
如上文参考文献中所述，在噬菌体选择后，可以分离来自噬菌体的抗体编码区，并且用于产生完整抗体包括人抗体或任何其他所需抗原结合片段，并且在任何所需宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如如下文详细描述的。例如，也可以采用重组生产Fab、Fab'和F（ab'）2片段的技术，使用本领域已知的方法，例如PCT公开WO 92/22324；Mullinax 等人，BioTechniques 12（6）:864-869（1992）；和Sawai 等人，AJRI 34:26-34（1995）；和Better 等人，Science 240:1041-1043（1988）中公开的那些。可以用于生产单链Fvs和抗体的技术的例子包括在美国专利4,946,778和5,258，498；Huston 等人，Methods in Enzymology 203:46-88（1991）；Shu 等人，PNAS 90:7995-7999（1993）；和Skerra 等人，Science 240:1038-1040（1988）中所述的那些。
作为通过噬菌体展示筛选重组抗体文库的替代，本领域已知的用于筛选大组合文库的其他方法可以应用于本发明的双重特异性抗体的鉴定。如Szostak和Roberts的PCT公开号WO 98/31700，以及Roberts，R.W.和Szostak，J.W.（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94：12297-12302中描述的，一类可替代的表达系统是其中重组抗体文库作为RNA-蛋白质融合物表达的表达系统。在这种系统中，通过在其3’末端上携带嘌呤霉素，一种肽基受体抗生素的合成mRNAs的体外翻译，在mRNA及其编码的肽或蛋白质之间产生共价融合。因此，基于编码的肽或蛋白质例如抗体或其部分的性质，例如抗体或其部分与双重特异性抗原的结合，特定mRNA可以从mRNAs的复杂混合物（例如，组合文库）中富集。由此种文库筛选回收的编码抗体或其部分的核酸序列，可以通过如上文所述的重组方法（例如，在哺乳动物宿主细胞中）表达，且此外可以通过mRNA-肽融合物的另外筛选循环，或通过如上文所述用于重组抗体体外亲和力成熟的其他方法实施进一步的亲和力成熟，在所述mRNA-肽融合物中已将突变引入最初选择的序列内。
在另一种方法中，本发明的抗体可以使用本领域已知的酵母展示方法来产生。在酵母展示方法中，使用遗传方法以使抗体结构域束缚于酵母细胞壁，且将它们显示在酵母表面上。具体地，此种酵母可以用于展示由集合或组合抗体文库（例如，人或鼠）表达的抗原结合结构域。可以用于制备本发明抗体的酵母展示方法的例子包括在Wittrup等人，美国专利号6,699,658中公开的那些。
B. 重组前列腺素E2抗体的生产
本发明的抗体可以通过本领域已知的许多技术中的任何一种来生产。例如，来自宿主细胞的表达，其中编码重和轻链的一种或多种表达载体通过标准技术转染到宿主细胞内。术语“转染”的各种形式预期包含通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞内的广泛多样的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染等。尽管可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，在真核细胞中表达抗体是优选的，并且最优选在哺乳动物宿主细胞中，因为此种真核细胞（且特别是哺乳动物细胞）比原核细胞更可能装配和分泌正确折叠和免疫学活性的抗体。
用于表达本发明的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢（CHO细胞）（包括在Urlaub和Chasin,（1980）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77：4216-4220中描述，与DHFR选择标记一起使用的dhfr-CHO细胞，例如，如R.J. Kaufman和P.A. Sharp（1982）Mol. Biol. 159：601-621中描述的）、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当编码抗体基因的重组表达载体被引入哺乳动物宿主细胞内时，抗体通过将宿主细胞培养足够时间段来生产，以允许抗体在宿主细胞中表达，或更优选地，抗体分泌到其中宿主细胞生长的培养基内。抗体可以使用标准蛋白质纯化法从培养基中回收。
宿主细胞也可以用于生产功能抗体片段，例如Fab片段或scFv分子。应当理解关于上述操作的变化在本发明的范围内。例如，可能希望用编码本发明抗体的轻链和/或重链的功能片段的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可以用于去除编码轻和重链中任一或两者对于与目的抗原结合不需要的某些或全部DNA。由此种截短DNA分子表达的分子也由本发明的抗体包含。此外，通过经由标准化学交联方法使本发明的抗体与第二种抗体交联，可以产生双功能抗体，其中一条重和一条轻链是本发明的抗体，并且另一条重和轻链对于除目的抗原外的抗原特异。
在用于重组表达本发明的抗体或其抗原结合部分的优选系统中，编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体通过磷酸钙介导的转染引入dhfr-CHO细胞内。在重组表达载体内，抗体重和轻链基因各自与CMV增强子/AdMLP启动子调节元件可操作地连接，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，所述DHFR基因允许使用氨甲蝶呤选择/扩增选择已用载体转染的CHO细胞。培养所选转化体宿主细胞以允许表达抗体重和轻链，且从培养基中回收完整的重组抗体。使用标准分子生物学技术以制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞和从培养基中回收抗体。更进一步地，本发明提供了合成本发明的重组抗体的方法，其通过在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞直至本发明的重组抗体被合成实现。该方法可以进一步包括从培养基中分离重组抗体。
抗前列腺素E2嵌合抗体的生产
嵌合抗体是其中抗体的不同部分衍生自不同动物物种的分子，例如具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。用于生产嵌合抗体的方法是本领域已知的并且在实施例2.1中详细讨论。参见例如，Morrison，Science 229:1202（1985）；Oi 等人，BioTechniques 4:214（1986）；Gillies 等人,（1989）J. Immunol. Methods 125:191-202；美国专利号5,807,715；4,816,567；和4,816,397。此外，可以使用通过使来自具有合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具有合适生物学活性的人抗体分子的基因剪接在一起，开发用于生产“嵌合抗体”的技术（Morrison 等人，1984，Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855；Neuberger 等人，1984，Nature 312:604-608；Takeda 等人，1985，Nature 314:452-454）。
在一个实施方案中，通过用人IgG1恒定区替换部分1中所述的鼠单克隆抗PGE2抗体的重链恒定区产生本发明的嵌合抗体。在一个具体实施方案中，本发明的嵌合抗体包括包含SEQ ID 60、62、64、66、68、70、72、74、76、78和80的氨基酸序列的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）SEQ ID 61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和81。
抗前列腺素E2人源化抗体
人源化抗体是衍生自结合所需抗原的非人物种抗体的抗体分子，具有来自非人物种的一个或更多个互补性决定区（CDRs）和来自人免疫球蛋白分子的构架区。已知的人Ig序列在下述中公开，例如，
。Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S. Dept. Health（1983）。如本领域已知的，此种输入的序列可以用于减少免疫原性，或减少、增强或修饰结合、亲和力、结合速率、解离速率、抗体亲抗原性、特异性、半衰期、或任何其他合适的特征。
人构架区中的构架残基可以用来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变，优选改善抗原结合。这些构架取代通过本领域众所周知的方法鉴定，例如通过对CDR和构架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合重要的构架残基，和序列比较以鉴定在特定位置上的罕见构架残基。（参见，例如，Queen 等人，美国专利号5,585,089；Riechmann 等人，Nature 332：323（1988））。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的且是本领域技术人员熟悉的。举例说明且展示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可获得的。这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能发挥中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以选择FR残基且从共有和输入序列组合，从而使得达到所需抗体特征，例如对一种或多种靶抗原的亲和力增加。一般而言，CDR残基直接且最重要地与影响抗原结合有关。抗体可以使用本领域已知的多种技术进行人源化，例如但不限于下述参考文献中描述的那些：Jones 等人，Nature 321：522（1986）；Verhoeyen 等人，Science 239：1534（1988）），Sims 等人，J. Immunol. 151：2296（1993）；Chothia和Lesk，J. Mol. Biol. 196：901（1987），Carter 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89：4285（1992）；Presta 等人，J. Immunol. 151：2623（1993），Padlan，Molecular Immunology 28（4/5）：489-498（1991）；Studnicka 等人，Protein Engineering 7（6）：805-814（1994）；Roguska. 等人，PNAS 91：969-973（1994）；PCT公开
美国专利号
和。
C. 抗体和抗体产生细胞系的生产
优选地，本发明的抗PGE2抗体显示出减少或中和PGE2活性的高能力，例如如通过本领域已知的几种体外和体内测定中的任何一种评估的（例如，参见实施例1.1.C）。例如，这些抗体在EP4测定中中和PGE2诱导的钙流入，其中IC50值在至少约10-6 M、约10-7 M、约10-8 M、约10-9 M、约10-10 M、约10-11 M或约10-12 M的范围中。
在优选实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分结合PGE2，其中抗体或其抗原结合部分以约0.1s-1或更少的koff速率常数与PGE2解离，如通过放射免疫测定测定的，或以约1 x 10-6M或更少的IC50抑制PGE2活性。可替代地，抗体或其抗原结合部分可以以约1 x 10-2s-1或更少的koff速率常数与PGE2解离，如通过放射免疫测定测定的，或以约1 x 10-7M或更少的IC50抑制PGE2。可替代地，抗体或其抗原结合部分可以以约1 x 10-3s-1或更少的koff速率常数与PGE2解离，如通过放射免疫测定测定的，或以约1 x 10-8M或更少的IC50抑制PGE2活性。可替代地，抗体或其抗原结合部分可以以约1 x 10-4s-1或更少的koff速率常数与PGE2解离，如通过放射免疫测定测定的，或以约1 x 10-9M或更少的IC50抑制PGE2活性。可替代地，抗体或其抗原结合部分可以以约1 x 10-5s-1或更少的koff速率常数与PGE2解离，如通过放射免疫测定测定的，或以约1 x 10-10M或更少的IC50抑制PGE2活性。可替代地，抗体或其抗原结合部分可以以约1 x 10-6s-1或更少的koff速率常数与PGE2解离，如通过放射免疫测定测定的，或以约1 x 10-11M或更少的IC50抑制PGE2活性。
本发明的单克隆抗体阻断PGE2与EP1、EP2、EP3和EP4受体中的至少一种结合。基于FACS的受体结合测定和在细胞表面上3H标记的PGE2结合测定证实鼠形式和人源化形式的抗PGE2都能够有效阻断PGE2与其受体的结合。本发明设想了与人源化抗PGE2抗体Hu2B5.7的Fab部分复合的PGE2的晶体结构。
在一些实施方案中，抗体包括重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。优选地，重链恒定区是IgG1重链恒定区或IgG4重链恒定区。此外，抗体可以包括轻链恒定区，κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。优选地，抗体包括κ轻链恒定区。可替代地，抗体部分可以是例如Fab片段或单链Fv片段。
Fc部分中改变抗体效应子功能的氨基酸残基替换是本领域已知的（Winter等人，美国专利号5,648,260；5624821）。抗体的Fc部分介导几种重要的效应子功能，例如细胞因子诱导、ADCC、吞噬作用、依赖补体的细胞毒性（CDC）以及抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率。取决于治疗目的，在一些情况下这些效应子功能对于治疗抗体是所需的，但在其他情况下可能是不必要的或甚至有害的。某些人IgG同种型，特别是IgG1和IgG3，经由分别与FcγRs和补体C1q结合介导ADCC和CDC。新生Fc受体（FcRn）是决定抗体循环半衰期的关键组分。在另外一个实施方案中，替换在抗体恒定区例如抗体的Fc区中的至少一个氨基酸残基，从而使得抗体的效应子功能得到改变。在另一个实施方案中，Fc片段的活性可以通过Fc部分的N-联聚糖的唾液酸化得到极大增强（例如，与在免疫球蛋白G（IgG）中Asn 297处发现的复合、二触角聚糖上的次末端半乳糖具有2,6-连接）（Anthony，RM（2008）Science 320:373-376）。
一个实施方案提供了标记的结合蛋白，其中本发明的抗体或抗体部分用另一种功能分子（例如，另一种肽或蛋白质）衍生化或连接。例如，本发明的标记的抗体或抗体部分可以通过使本发明的抗体或抗体部分与一种或更多种其他分子实体功能性连接（例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式）来衍生，所述其他分子实体例如另一种抗体（例如，双特异性抗体或双抗体）、可检测试剂、细胞毒性剂、药学试剂、和/或可以介导抗体或抗体部分与另一种分子（例如链霉抗生物素蛋白核心区或多组氨酸标签）结合的蛋白质或肽。
本发明的抗体或抗体部分可以由之衍生化的有用的可检测试剂包括荧光化合物。示例性荧光可检测试剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等。抗体也可以用可检测酶衍生化，例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡糖氧化酶等。当抗体用可检测酶衍生化时，它通过添加酶用于生产可检测反应产物的另外的试剂进行检测。例如，当可检测试剂辣根过氧化物酶存在时，添加过氧化氢和二氨基联苯胺导致可检测的有色反应产物。抗体也可以用生物素衍生化，且通过抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合的间接测量进行检测。
本发明的另一个实施方案提供了结晶结合蛋白。优选地，本发明涉及如本文公开的完整抗PGE2抗体及其片段的晶体，以及包含此种晶体的制剂和组合物。在一个实施方案中，结晶结合蛋白具有比结合蛋白的可溶性对应物更长的体内半衰期。在另一个实施方案中，结合蛋白在结晶化后保留生物学活性。
本发明的结晶结合蛋白可以根据本领域已知的和如WO 02072636中公开的方法来生产。
本发明的另一个实施方案提供了糖基化的结合蛋白，其中抗体或其抗原结合部分包含一个或多个碳水化合物残基。新生体内蛋白质生产可以经历称为翻译后修饰的进一步加工。特别地，糖（糖基）残基可以酶促添加，这个过程称为糖基化。所得到的具有共价连接的寡糖侧链的蛋白质被称为糖基化蛋白质或糖蛋白。抗体是在Fc结构域以及可变结构域中具有一个或更多个碳水化合物残基的糖蛋白。Fc结构域中的碳水化合物残基对Fc结构域的效应子功能有重要作用，对抗体的抗原结合或半衰期有最低限度的作用（R. Jefferis，Biotechnol. Prog. 21（2005），第11-16页）。相比之下，可变结构域的糖基化可能对抗体的抗原结合活性有作用。可变结构域中的糖基化可能对抗体结合亲和力具有负面作用，可能是由于空间位阻（Co，M.S.等人，Mol. Immunol.（1993）30：1361-1367），或导致对抗原的亲和力增加（Wallick，S.C.等人，Exp. Med.（1988）168：1099-1109；Wright，A.等人，EMBO J.（1991）10：2717 2723）。
本发明的一个方面涉及生成糖基化位点突变体，其中结合蛋白的O或N联糖基化位点已进行突变。本领域技术人员可以使用标准的众所周知的技术来生成此种突变体。保留生物学活性但具有增加或减少的结合活性的糖基化位点突变体是本发明的其他目的。
在另外一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分的糖基化得到修饰。例如，可以制备无糖基化（aglycoslated）抗体（即该抗体缺乏糖基化）。糖基化可以进行改变，以例如增加抗体对抗原的亲和力。此种碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或更多个糖基化位点来完成。例如，可以制备导致一个或更多个可变区糖基化位点消除的一个或更多个氨基酸取代，以从而消除那个位点上的糖基化。此种无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。此种方法在PCT公开WO2003016466A2，以及美国专利号5,714,350和6,350,861中进一步详细描述。
此外或可替代地，可以制备具有改变的糖基化类型的本发明修饰的抗体，例如具有减少量的岩藻糖基残基的岩藻糖基化不足（hypofucosylated）抗体，或具有增加的等分GlcNAc结构的抗体。此种改变的糖基化模式已显示增加抗体的ADCC能力。此种碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机器的宿主细胞中表达抗体来完成。具有改变的糖基化机器的细胞已在本领域得到描述，且可以用作在其中表达本发明的重组抗体的宿主细胞，以从而生产具有改变的糖基化的抗体。参见，例如，Shields，R. L.等人（2002）J. Biol. Chem. 277：26733-26740；Umana等人（1999）Nat. Biotech. 17：176-1，以及欧洲专利号：EP 1,176,195；PCT公开WO 03/035835；WO 99/54342 80。
蛋白质糖基化取决于目的蛋白质的氨基酸序列，以及在其中表达蛋白质的宿主细胞。不同生物可以产生不同的糖基化酶（例如，糖基转移酶和糖苷酶），且具有不同的可用底物（核苷酸糖）。由于此种因素，蛋白质糖基化模式和糖基残基组成可以依赖于在其中表达特定蛋白质的宿主系统而不同。在本发明中有用的糖基残基可以包括但不限于，葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、n-乙酰葡糖胺和唾液酸。优选地，糖基化的结合蛋白包含糖基残基，从而使得糖基化模式是人的。
不同的蛋白质糖基化可以导致不同的蛋白质特征，这是本领域技术人员已知的。例如，与哺乳动物细胞例如CHO细胞系中表达的相同蛋白质的那种相比较，在微生物宿主例如酵母中生产，和利用酵母内源性途径糖基化的治疗蛋白质的功效可能是减少的。此种糖蛋白在人中也可以是免疫原性的，且在施用后显示减少的体内半衰期。人和其他动物中的特定受体可以识别特定糖基残基且促进蛋白质从血流中快速清除。其他不利效应可以包括蛋白质折叠、可溶性、对蛋白酶的易感性、运输、转运、区室化、分泌、由其他蛋白质或因子识别、抗原性、或变应原性中的变化。因此，从业者可能优先选择具有特定糖基化组成和模式的治疗蛋白质，例如等同于或至少类似于在人细胞或预期受试动物的物种特异性细胞中生产的那种的糖基化组成和模式。
表达不同于宿主细胞那种的糖基化蛋白质可以通过遗传修饰宿主细胞以表达异源糖基化酶来完成。使用本领域已知的技术，从业者可以生成显示人蛋白质糖基化的抗体或其抗原结合部分。例如，酵母菌株已进行遗传修饰以表达非天然存在的糖基化酶，从而使得在这些酵母菌株中生产的糖基化蛋白质（即，糖蛋白）显示等同于动物细胞特别是人细胞那种的蛋白质糖基化（美国专利申请20040018590和20020137134以及PCT申请WO2005100584 A2）。
除了结合蛋白，本发明还涉及对本发明的此种结合蛋白特异的抗独特型（抗Id）抗体。抗Id抗体是识别独特决定簇的抗体，所述独特决定簇一般与另一种抗体的抗原结合区相关。抗Id可以通过用结合蛋白或其含CDR区免疫接种动物来制备。免疫接种的动物将识别，且对免疫接种抗体的独特型决定簇应答且产生抗Id抗体。抗Id抗体也可以用作“免疫原”以在另外一种动物中诱导免疫应答，从而产生所谓的抗抗Id抗体。
此外，本领域技术人员将认识到，目的蛋白质可以使用宿主细胞文库来表达，所述宿主细胞进行基因工程改造以表达各种糖基化酶，从而使得文库的成员宿主细胞生产具有变体糖基化模式的目的蛋白质。从业者随后可以选择并分离具有特定新糖基化模式的目的蛋白质。优选地，具有特定选择的新糖基化模式的蛋白质显示改善或改变的生物学性质。
D. 抗前列腺素E2抗体的用途
已知其与PGE2结合的能力，本发明的抗PGE2抗体或其部分可以用于检测PGE2（例如，在生物样品中，例如血清或血浆），其中使用常规免疫测定，例如酶联免疫吸附测定（ELISA）、放射免疫测定（RIA）或组织免疫组织化学。本发明提供了用于检测生物样品中的PGE2的方法，其包括使生物样品与本发明的抗体或抗体部分接触，并且检测与PGE2结合的抗体（或抗体部分）或未结合的抗体（或抗体部分），以从而检测生物样品中的PGE2。抗体用可检测物质直接或间接标记，以促进结合或未结合的抗体的检测。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。合适酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合物的例子包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺（dichlorotriazinylamine）荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；且合适放射性材料的例子包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho、或153Sm。
作为标记抗体的替代，PGE2可以通过竞争免疫测定在生物学流体中进行测定，利用由可检测物质标记的PGE2标准和未标记的抗PGE2抗体。在这种测定中，使生物样品、标记的PGE2标准和抗PGE2抗体组合，并且测定与未标记的抗体结合的标记的PGE2标准的量。生物样品中的PGE2量与和抗PGE2抗体结合的标记的PGE2标准的量成反比。类似地，PGE2也可以通过竞争免疫测定在生物学流体中进行测定，利用由可检测物质标记的PGE2标准和未标记的抗PGE2抗体。
本发明的抗体和抗体部分优选能够在体外和体内中和PGE2活性。因此，本发明的此种抗体和抗体部分可以例如，在包含PGE2的细胞培养物中、在人受试者中或在具有本发明的抗体与其交叉反应的PGE2的其他哺乳动物受试者中用于抑制PGE2活性。在一个实施方案中，本发明提供了用于抑制PGE2活性的方法，其包括使PGE2与本发明的抗体或抗体部分接触，从而使得PGE2活性被抑制。例如，在包含或怀疑包含PGE2的细胞培养中，本发明的抗体和抗体部分可以加入培养基中，以抑制培养物中的PGE2活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于减少受试者中的PGE2活性的方法，有利地来自患有其中PGE2活性是有害的疾病或病症的受试者。本发明提供了用于减少患有此种疾病或病症的受试者中的PGE2活性的方法，所述方法包括给受试者施用本发明的抗体或抗体部分，从而使得受试者中的PGE2活性被减少。优选地，受试者是人受试者。可替代地，受试者可以是表达本发明的抗体能够与之结合的PGE2的哺乳动物。再进一步地，受试者可以是PGE2已引入其内的哺乳动物（例如，通过施用PGE2或通过表达PGE2合成酶转基因）。本发明的抗体可以施用于人受试者用于治疗目的。此外，本发明的抗体可以施用于表达抗体能够与之结合的PGE2的非人哺乳动物用于兽医学目的或作为人疾病的动物模型。关于后者，此种动物模型可以用于评估本发明的抗体的治疗功效（例如，测试施用剂量和时间过程）。
如本文使用的，术语“其中PGE2活性是有害的病症”预期包括疾病或其他病症，其中患有该病症的受试者中PGE2的存在已显示或怀疑负责病症的病理生理学或是促进病症恶化的因素。因此，其中PGE2活性是有害的病症是其中PGE2活性减少预期减轻病症症状和/或进展的病症。此种病症可以例如由患有病症的受试者生物学流体中PGE2浓度的增加（例如受试者血清、血浆、滑液等中PGE2浓度的增加）来证实，这可以例如使用如上所述的抗PGE2抗体进行检测。可以用本发明的抗体治疗的病症的非限制性例子包括在下文关于本发明抗体的药物组合物部分中讨论的那些病症。
已暗示PGE2在引起与类风湿性关节炎有关的病理应答中具有关键作用。然而，差别免疫途径的其他介质也与关节炎有关，且除PGE2外，阻断这些介质可能提供另外的治疗利益。因此，本发明的结合蛋白可以掺入DVD-IgTM蛋白质内，其中DVD-IgTM能够结合靶对，包括但不限于PGE2和促炎细胞因子，例如肿瘤坏死因子α（TNF-α）。阻断PGE2和TNF-α可能具有使TNF-α的DMARD效应和来自阻断PGE2的疼痛缓解组合的有益作用。在一个优选实施方案中，本发明的DVD-IgTM结合靶PGE2和TNFα且用于治疗类风湿性关节炎。
本发明的一个方面涉及包括能够结合PGE2的结合蛋白的DVD-IgTM结合蛋白。优选地，DVD-IgTM结合蛋白能够结合PGE2和第二种靶。第二种靶选自
组胺和组胺受体，
和壳多糖酶。更优选地，DVD结合蛋白能够识别PGE2和TNF α、PGE2和IL-6、PGE2和IL-1β、PGE2和IL-6R、PGE2和CTLA-4、PGE2和EGF；PGE2和IGF-1/2、PGE2和Erb2、PGE2和Erb3、PGE2和VEGF。最优选地，DVD结合蛋白能够结合PGE2和TNF α。用于治疗自身免疫疾病的优选DVD-Igs包括但不限于包含抗PGE2抗体和选自下述的靶的DVD-Ig：TNF α、IL-1 α、IL-1β、IL-6或IL-6R、CTLA-4Ig、BAFF、TACI、RANKL、或DKK1或SOCT、MMP13、或MMP1或MMP4。优选用于癌症治疗的靶对包括PGE2 + EGF或EGFR、PGE2 + IGF1或IGF1R、PGE2 + IGF2或IGF2R、PGE2 + IGF1/2、PGE2 + VEGF或VEGFR、PGE2 + Erb2、PGE2 + Erb3和PGE2 + S1P。
已暗示PGE2在引起与类风湿性关节炎或癌症有关的病理应答中具有关键作用。然而，差别免疫途径的其他介质也与关节炎或癌症有关，且除PGE2外，阻断这些介质可能提供另外的治疗利益。目前用于治疗各种人疾病和病症的药物列表可在因特网上在www.drugs.com处获得。这个列表经常更新以反映用于治疗各种人疾病的技术水平。抗PGE2可以与那个列表中用于特定疾病病状的治疗中的任何组合。下文提供了少数例子。抗PGE2可以与用于治疗类风湿性关节炎和青少年类风湿性关节炎的一种或更多种试剂组合。这些试剂的例子包括但不限于下文列出的试剂，例如减少疼痛和炎症同时减少异常滑膜组织（衬在关节内部的组织）生长的药物。这些药物包括氨甲蝶呤和低剂量皮质类固醇（例如泼尼松或可的松）。在一些人中，这些药物还减少关节破坏。用于治疗类风湿性关节炎的其他药物治疗包括：抗疟疾药物治疗（例如羟氯喹）、金、柳氮磺胺吡啶、青霉胺、环磷酰胺、环孢菌素和米诺环素。此外，可以开出超过一种药物。阻断特异性炎症因子（细胞因子）的效应的更新生物制剂目前是可获得的。英夫利昔单抗、依那西普和阿达木单抗阻断细胞因子TNFα，阿巴他赛阻断T细胞共刺激，利妥昔单抗耗尽B细胞，阿那白滞素阻断细胞因子白介素-1，并且其他新生物制剂靶向IL-6、IL-6R、IL-17、IL-18、IL-23、B7.1/B7.2。抗PGE2可以与用于治疗强直性脊柱炎的一种或更多种试剂组合。这些试剂的例子包括但不限于皮质类固醇、细胞毒性药物和最近地抗TNFα试剂。抗PGE2可以与用于治疗多发性硬化的一种或更多种试剂组合。这些试剂的例子包括但不限于Avonex、Azasan、硫唑嘌呤、Betaseron、Bubbli-Pred、克帕松、Cotolone、格拉默、依木兰、干扰素β-1a、干扰素β-1b溶液、Key-Pred、Key-Pred SP、米托蒽醌、那他珠单抗、诺消灵、Orapred、Orapred ODT、Pediapred、Pred-Ject-50、Predacort 50、Predalone 50、Predate-50、泼尼松龙、Prelone、利比和Tysabri。抗PGE2可以与www.drugs.com中列出用于治疗疼痛的一种或更多种试剂或治疗程序组合。抗PGE2可以与www.drugs.com中列出用于治疗Crohn氏病的一种或更多种试剂或治疗程序组合。抗PGE2可以与www.drugs.com中列出用于治疗各种人癌症和恶性肿瘤的一种或更多种试剂或治疗程序组合。
E. 药物组合物
本发明还提供了包含本发明的抗体或其抗原结合部分，和药学可接受的载体的药物组合物。包含本发明的抗体的药物组合物用于在下述方面使用，但不限于下述方面，病症诊断、检测或监控，病症或其一种或更多种症状的预防、治疗、管理或改善和/或研究。在具体实施方案中，药物组合物包含本发明的一种或更多种抗体。在另一个实施方案中，药物组合物包含本发明的一种或更多种抗体，以及除本发明抗体外用于治疗其中PGE2活性是有害的病症的一种或更多种预防或治疗剂。优选地，预防或治疗剂已知在病症或其一种或更多种症状的预防、治疗、管理或改善中有用，或已在其中已经或目前正在其中使用。依照这些实施方案，组合物可以进一步包含载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的抗体和抗体部分可以掺入适合于给受试者施用的药物组合物内。一般地，药物组合物包含本发明的抗体或抗体部分和药学可接受的载体。如本文使用的，“药学可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药学可接受的载体的例子包括下述一种或更多种：水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其组合。在许多情况下，将优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇、或氯化钠。药学可接受的载体可以进一步包含少量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，所述辅助物质增强抗体或抗体部分的保存期限或能力。
各种递送系统是已知的，且可以用于施用本发明的一种或更多种抗体或本发明的一种或更多种抗体与预防剂或治疗剂的组合，用于预防、管理、治疗或改善病症或其一种或更多种症状，例如被囊化在脂质体中、微粒、微胶囊、能够表达抗体或抗体片段的重组细胞、受体介导的胞吞（参见，例如，Wu和Wu，J. Biol. Chem. 262：4429-4432（1987））、作为逆转录病毒或其他载体部分的核酸构建等。施用本发明的预防或治疗剂的方法包括但不限于，肠胃外施用（例如，皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下），硬膜外施用，瘤内施用和粘膜施用（例如，鼻内和经口途径）。此外，可以使用肺施用，例如利用吸入器或喷雾器，和含气溶胶化剂（aerosolizing agent）的制剂。参见，例如，美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540、和4,880,078；以及PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346、和WO 99/66903。在一个实施方案中，本发明的抗体、组合疗法、或本发明的组合物使用Alkermes AIR®肺药物递送技术（Alkermes，Inc.，Cambridge，Mass.）来施用。在具体实施方案中，本发明的预防或治疗剂肌内、静脉内、瘤内、经口、鼻内、肺、或皮下施用。预防或治疗剂可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或快速浓注，通过经由上皮或粘膜皮肤衬里（例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等）吸收，且可以连同其他生物学活性剂一起施用。施用可以是全身或局部的。
在具体实施方案中，可能需要使本发明的预防或治疗剂局部施用在需要治疗的区域；这可以通过例如局部输注、注射、或通过植入物来完成，此种植入物为多孔或无孔材料，包括膜和基质，例如硅橡胶（sialastic）膜、聚合物、纤维基质（例如，Tissuel®）、或胶原基质。在一个实施方案中，有效量的本发明的一种或更多种抗体局部施用于受试者的受累区域，以预防、治疗、管理、和/或改善病症或其症状。在另一个实施方案中，有效量的本发明的一种或更多种抗体，与有效量的除本发明抗体外的一种或更多种疗法（例如，一种或更多种预防或治疗剂）组合，局部施用于受试者的受累区域，以预防、治疗、管理、和/或改善病症或其一种或更多种症状。
在另一个实施方案中，本发明的预防或治疗剂可以在控释或持续释放系统中递送。在一个实施方案中，可以使用泵以达到控释或持续释放（参见Langer，同上；Sefton，1987，CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14：20；Buchwald等人，1980，Surgery 88：507；Saudek等人，1989，N. Engl. J. Med. 321：574）。在另一个实施方案中，聚合材料可以用于达到本发明疗法的控释或持续释放（参见例如，Medical Applications of Controlled Release，Langer和Wise（编者），CRC Pres.，Boca Raton，Fla.（1974）；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen和Ball（编者），Wiley，New York（1984）；Ranger和Peppas，1983，J.，Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23：61；还参见Levy等人，1985，Science 228：190；During等人，1989，Ann. Neurol. 25：351；Howard等人，1989，J. Neurosurg. 7 1：105）；美国专利号5,679,377；美国专利号5,916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号5,128,326；PCT公开号WO 99/15154；和PCT公开号WO 99/20253。在持续释放制剂中使用的聚合物的例子包括但不限于，聚甲基丙烯酸2-羟乙酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚甲基丙烯酸、聚乙醇酸交酯（PLG）、聚酐、聚N-乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚丙交酯（PLA）、丙交酯-乙醇酸交酯共聚物（PLGA）、和聚原酸酯。在一个优选实施方案中，持续释放制剂中使用的聚合物是惰性的、不含可沥滤杂质、贮藏稳定、无菌和生物可降解的。在另外一个实施方案中，控释或持续释放系统可以接近预防或治疗靶放置，从而只需要全身剂量的部分（参见，例如，Goodson，in Medical Applications of Controlled Release，同上，第2卷，第115-138页（1984））。
控释系统在Langer（1990，Science 249：1527-1533）的综述中讨论。本领域技术人员已知的任何技术都可以用于生产包含本发明的一种或更多种治疗剂的持续释放制剂。参见，例如，美国专利号4,526,938，PCT公开WO91/05548，PCT公开WO96/20698，Ning等人，1996，"Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy &Oncology 39：179-189，Song等人，1995，"Antibody Mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science &Technology 50：372-397，Cleek等人，1997，"Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24：853-854，和Lam等人，1997，"Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24：759-760。
在具体实施方案中，当本发明的组合物是编码预防或治疗剂的核酸时，核酸可以体内施用以促进其编码的预防或治疗剂的表达，这通过下述实现，将其构建为合适的核酸表达载体的部分且施用，从而使得其成为细胞内的，例如利用逆转录病毒载体（参见美国专利号4,980,286），或直接注射，或使用微粒轰击（例如，基因枪；Biolistic，Dupont），或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，或与已知进入核的同源异型框样肽连接施用（参见，例如，Joliot等人，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：1864-1868）。可替代地，核酸可以细胞内引入且通过同源重组整合入宿主细胞DNA内用于表达。
本发明的药物组合物配制为与其预期施用途径相容。施用途径的例子包括但不限于，肠胃外，例如，静脉内、皮内、皮下、经口、鼻内（例如，吸入）、经皮（例如，局部）、跨粘膜、和直肠施用。在具体实施方案中，组合物依照常规程序配制为药物组合物，所述药物组合物适合于静脉内、皮下、肌内、经口、鼻内或局部施用于人类。一般地，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因，以减轻注射部位处的疼痛。
如果本发明的组合物将局部施用，那么组合物可以配制为软膏、乳膏、经皮贴剂、洗剂、凝胶、洗发剂、喷雾剂、气溶胶、溶液、乳剂形式或本领域技术人员已知的其他形式。参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms，第19版，Mack Pub. Co.，Easton，Pa.（1995）。对于不可喷雾的局部剂型，一般使用包含与局部应用相容的载体或一种或更多种赋形剂，且具有优选大于水的动态粘度的粘性至半固体或固体形式。合适的制剂包括但不限于，溶液、悬浮液、乳剂、乳膏、软膏、粉末、搽剂、油膏等，必要时进行灭菌或与助剂（例如防腐剂、稳定剂、湿润剂、缓冲液或盐）混合用于影响各种性质，例如，渗透压。其他合适的局部剂型包括可喷雾的气溶胶制剂，其中活性成分优选与固体或液体惰性载体组合，与加压挥发物（例如，气体推进剂，例如氟利昂）在混合物中包装或包装在挤压瓶中。必要时保湿剂（moisturizer）或湿润剂也可以加到药物组合物和剂型中。此种另外成分的例子是本领域众所周知的。
如果本发明的方法包括组合物的鼻内施用，那么组合物可以配制为气溶胶形式、喷雾剂、雾或滴剂形式。特别地，用于根据本发明使用的预防或治疗剂可以以从加压包或喷雾器呈递的气溶胶喷雾剂形式常规递送，使用合适的推进剂（例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体）。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀来确定，以递送计量的量。可以配制包含化合物和合适粉末基例如乳糖或淀粉的粉末混合物的胶囊和药液筒（由例如明胶组成），用于在吸入器或吹入器中使用。
如果本发明的方法包括经口施用，那么组合物可以配制为片剂、胶囊、扁胶剂、粒状胶囊（gelcaps）、溶液、悬浮液等形式。片剂或胶囊可以通过常规方法用药学可接受的赋形剂制备，所述赋形剂例如粘合剂（例如，预凝胶玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、或羟丙基甲基纤维素）；充填剂（例如，乳糖、微晶纤维素、或磷酸氢钙）；润滑剂（例如，硬脂酸镁、滑石或硅石）；崩解剂（例如，马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠）；或湿润剂（例如，十二烷基硫酸钠）。片剂可以通过本领域众所周知的方法进行包被。用于经口施用的液体制剂可以采取下述形式，但不限于下述形式，溶液、糖浆或悬浮液，或它们可以呈现为干燥产品，用于在使用前用水或其他合适的载体构建。此种液体制剂可以通过常规方法用药学可接受的添加剂制备，所述添加剂例如悬浮剂（例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物、或氢化食用脂肪）；乳化剂（例如，卵磷脂或阿拉伯胶）；非水载体（例如，杏仁油、油酯、乙醇、或分馏植物油）；和防腐剂（例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸）。适当时制剂还可以包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。用于经口施用的制剂可以适当地配制，用于缓慢释放、控释、或持续释放一种或多种预防或治疗剂。
本发明的方法可以包括用气溶胶化剂（aerosolizing agent）配制的组合物的肺施用，例如利用吸入器或喷雾器。参见，例如，美国专利号6,019,968；5,985,320；5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540；和4,880,078；和PCT公开号WO 92/19244；WO 97/32572；WO 97/44013；WO 98/31346；和WO 99/66903。在具体实施方案中，本发明的抗体、组合疗法、和/或本发明的组合物使用Alkermes AIR®肺药物递送技术（Alkermes，Inc.，Cambridge，Mass.）来施用。
本发明的方法可以包括配制用于通过注射（例如通过快速浓注或连续输注）肠胃外施用的组合物的施用。用于注射的制剂可以与添加的防腐剂一起以单位剂型（例如，在安瓿或多剂容器中）呈递。组合物可以采取此种形式，如在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳剂，且可以包含配制试剂例如悬浮、稳定和/或分散剂。可替代地，活性成分可以为粉末形式用于在使用前用合适的载体（例如，无菌无致热原水）构建。
本发明的方法可以另外包括配制为积存（depot）制剂的组合物的施用。此种长效制剂可以通过植入（例如皮下或肌内）或通过肌内注射来施用。因此，例如，组合物可以用合适的聚合或疏水材料（例如，作为在可接受的油中的乳剂）或离子交换树脂配制，或配制为微溶衍生物（例如，作为微溶盐）。
本发明的方法包括配制为中性或盐形式的组合物的施用。药学可接受的盐包括由阴离子形成的那些，例如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，以及由阳离子形成的那些，例如来源于氢氧化钠、钾、铵、钙、铁，异丙胺，三乙胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等的那些。
一般地，组合物的成分分开或混合在一起以单位剂型提供，例如，作为在密封容器中的干冷冻干燥粉末或无水浓缩剂，所述密封容器例如安瓿或囊剂，其指示活性剂的量。当施用方式是输注时，组合物可以用包含无菌药物级别的水或盐水的输注瓶分配。当施用方式是注射时，可以提供无菌注射用水或盐水安瓿，从而使得成分可以在施用前进行混合。
特别地，本发明还提供了包装在密封容器中的本发明的一种或更多种预防或治疗剂或药物组合物，所述密封容器例如安瓿或囊剂，其指示活性剂的量。在一个实施方案中，本发明的一种或更多种预防或治疗剂或药物组合物，作为在密封容器中的干无菌冷冻干燥粉末或无水浓缩剂提供，且可以重构（例如，用水或盐水）至合适浓度以用于给受试者施用。优选地，本发明的一种或更多种预防或治疗剂或药物组合物，作为在密封容器中的干无菌冷冻干燥粉末提供，其单位剂量为至少5 mg、更优选至少10 mg、至少15 mg、至少25 mg、至少35 mg、至少45 mg、至少50 mg、至少75 mg、或至少100 mg。冷冻干燥的本发明的预防或治疗剂或药物组合物应在其原容器中贮存于2℃－8℃，并且本发明的预防或治疗剂或药物组合物应在重构后1周内施用，优选5天内、72小时内、48小时内、24小时内、12小时内、6小时内、5小时内、3小时内、或1小时内。在可替代的实施方案中，本发明的一种或更多种预防或治疗剂或药物组合物，以液体形式在指示试剂的量和浓度的密封容器中提供。优选地，液体形式的施用的组合物在密封容器中提供，其量为至少0.25 mg/ml，更优选至少0.5 mg/ml、至少1 mg/ml、至少2.5 mg/ml、至少5 mg/ml、至少8 mg/ml、至少10 mg/ml、至少15 mg/kg、至少25 mg/ml、至少50 mg/ml、至少75 mg/ml或至少100 mg/ml。液体形式应在其原容器中贮存于2℃－8℃。
本发明的抗体和抗体部分可以掺入适用于肠胃外施用的药物组合物内。优选地，抗体或抗体部分将制备为包含0.1－250 mg/ml抗体的可注射溶液。可注射溶液可以由在燧石或琥珀色小瓶、安瓿或预装注射器中的液体或冷冻干燥剂型组成。缓冲液可以是L-组氨酸（1－50 mM），最佳5－10 mM，pH 5.0－7.0（最佳pH 6.0）。其他合适的缓冲液包括但不限于，琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。氯化钠可以用于修饰浓度0－300 mM（对于液体剂型最佳150 mM）的溶液的毒性。对于冷冻干燥剂型可以包括冷冻保护剂，主要为0－10％蔗糖（最佳0.5－1.0％）。其他合适的冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。对于冷冻干燥剂型可以包括膨胀剂，主要为1－10％甘露糖醇（最佳2－4％）。稳定剂可以在液体和冷冻干燥剂型中使用，主要为1－50 mM L-甲硫氨酸（最佳5－10 mM）。其他合适的膨胀剂包括甘氨酸、精氨酸，可以作为0－0.05％聚山梨醇酯80（最佳0.005－0.01％）包括。另外的表面活性剂包括但不限于，聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。制备为可注射溶液用于肠胃外施用、包含本发明的抗体和抗体部分的药物组合物可以进一步包含用作佐剂的试剂，例如用于增加治疗蛋白质（例如，抗体）吸收、或分散的那些。特别有用的佐剂是透明质酸酶，例如Hylenex®（重组人透明质酸酶）。在可注射溶液中添加透明质酸酶改善肠胃外施用，特别是皮下施用后的人生物利用率。它还允许具有较少疼痛和不适的更大注射部位体积（即大于1 ml），和最低限度的注射部位反应发生率。（参见WO2004078140和US2006104968）
本发明的组合物可以为多种形式。这些包括例如，液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液（例如，可注射和可输注溶液）、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。优选形式取决于预期施用方式和治疗应用。一般优选的组合物为可注射或可输注溶液形式，例如类似于由其他抗体被动免疫接种人使用的那些的组合物。优选施用方式是肠胃外的（例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内）。在一个优选实施方案中，抗体通过静脉内输注或注射来施用。在另一个优选实施方案中，抗体通过肌内或皮下注射来施用。
治疗组合物一般必须是无菌且在制备和贮存条件下是稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳剂、分散体、脂质体、或适合于高药物浓度的其他有序结构。无菌可注射溶液可以通过下述制备：将需要量的活性化合物（即，抗体或抗体部分）与上文列举的一种成分或成分组合一起掺入合适的溶剂中，必要时随后进行过滤灭菌。一般地，分散体通过将活性化合物掺入无菌载体内来制备，所述无菌载体包含基本分散介质和来自上文列举那些的必需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌、冷冻干燥粉末的情况下，优选制备方法是由其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何另外所需成分的粉末的真空干燥和喷雾干燥。溶液的正确流动性可以通过下述来维持，例如利用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下维持所需颗粒大小和利用表面活性剂。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂来引起，所述试剂例如单硬脂酸盐和明胶。
本发明的抗体和抗体部分可以通过本领域已知的多种方法来施用，尽管对于许多治疗应用，优选施用途径/模式是皮下注射、静脉内注射或输注。如技术人员将认识到的，施用途径和/或模式将依所需结果而变。在某些实施方案中，活性化合物可以与载体一起制备，所述载体将保护化合物免于快速释放，例如控释制剂，包括植入物、经皮贴剂、和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此种制剂的许多方法是获得专利保护的或是本领域技术人员一般已知的。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R. Robinson，编者，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
在某些实施方案中，本发明的抗体或抗体部分可以例如，与惰性稀释剂或可同化食用载体一起经口施用。化合物（和若需要，其他成分）也可以装入硬或软壳明胶胶囊中，压缩成片剂，或直接掺入受试者的饮食内。对于经口治疗施用，化合物可以与赋形剂掺合，且以可摄食片剂、口腔含化片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、薄片（wafer）等的形式使用。为了通过除肠胃外施用外施用本发明的化合物，可能必须用材料包被化合物、或将化合物与材料共施用，以防止其失活。
补充性活性化合物也可以掺入组合物内。在某些实施方案中，本发明的抗体或抗体部分与一种或更多种另外的治疗剂共配制和/或共施用，所述治疗剂可用于治疗其中PGE2活性是有害的病症。例如，本发明的抗PGE2抗体或抗体部分可以与结合其他靶的一种或更多种另外的抗体（例如，结合其他细胞因子或结合细胞表面分子的抗体）共配制和/或共施用。此外，本发明的一种或更多种抗体可以与2种或更多前述治疗剂组合使用。此种组合疗法可以有利地利用较低剂量的施用的治疗剂，从而避免与各种单一疗法相关的可能毒性或并发症。
在某些实施方案中，针对PGE2的抗体或其片段与本领域已知的半衰期延长载体连接。此种载体包括但不限于，Fc结构域、聚乙二醇、和葡聚糖。此种载体在例如美国申请系列号09/428,082和公开的PCT申请号WO 99/25044中描述。
在具体实施方案中，施用包括编码本发明的抗体或本发明的另一种预防或治疗剂的核苷酸序列的核酸序列，以经由基因疗法治疗、预防、管理、或改善病症或其一种或更多种症状。基因疗法指通过给受试者施用表达的或可表达核酸来进行的疗法。在本发明的这个实施方案中，核酸生产其编码的抗体或介导预防或治疗作用的本发明预防或治疗剂。
本领域可用的任何关于基因治疗的方法可以根据本发明使用。关于基因治疗方法的一般综述，参见Goldspiel等人，1993，Clinical Pharmacy 12：488-505；Wu和Wu，1991，Biotherapy 3：87-95；Tolstoshev，1993，Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32：573-596；Mulligan，Science 260：926- 932（1993）；以及Morgan和Anderson，1993，Ann. Rev. Biochem. 62：191-217；May，1993，TIBTECH 11（5）：155-215。可使用的重组DNA技术领域中通常已知的方法描述于 Ausubel等人（编者），Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY（1993）；和Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY（1990）。各种基因治疗方法的详细描述在US20050042664 A1中公开。
在另一个方面，本申请的特征在于治疗（例如，治愈、压制、改善、延迟或预防发作，或预防再发生或复发）或预防受试者中的PGE2相关病症的方法。该方法包括：以足以治疗或预防PGE2相关病症的量，给受试者施用PGE2结合试剂（特别是拮抗剂），例如如本文描述的抗PGE2抗体或其片段。PGE2拮抗剂例如抗PGE2抗体或其片段可以单独或与其他治疗模式组合施用于受试者，如本文描述的。
本发明提供了用于治疗受试者中的炎性病症和免疫病症的方法，所述病症的特征在于过量PGE2生物合成，所述方法包括给受试者施用有效量的对于PGE2特异性的抗体。可以通过根据本发明的方法治疗的病症包括其中已牵涉过量PGE2合成的自身免疫和炎性疾病和肿瘤。此种病症包括：（a）类风湿性和变应性关节炎；（b）由病毒诱导的特定病，例如格-巴二氏综合征、传染性单核细胞增多症、其他病毒性淋巴结病和疱疹病毒感染；（c）多发性硬化和其他脱髓鞘疾病；（d）血液学病症，例如溶血性贫血和血小板减少症；（e）内分泌学病症，例如糖尿病、Addison氏病、特发性甲状旁腺机能减退和慢性淋巴细胞性甲状腺炎；（f）胶原病症，例如全身性红斑狼疮；和（g）生殖病症，例如闭经、不育、复发性流产和子痫；和（h）肿瘤，例如头颈肿瘤、肺癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌等；和（i）皮肤，胃肠器官炎症和/或自身免疫病症（例如炎性肠病（IBD），例如溃疡性结肠炎和/或Crohn氏病）；和（j）与骨关节炎和其他病症相关的疼痛；和（k）眼病症例如年龄相关黄斑变性（AMD）。因此，本公开内容包括PGE2结合试剂（例如，本文所述抗PGE2抗体或其片段）用于本文所述治疗的用途和PGE2结合试剂（例如，本文所述抗PGE2抗体或其片段）用于制备用于本文所述治疗的药剂的用途。
PGE2相关病症的例子包括但不限于选自下述的病症：关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、青少年慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、全身性红斑狼疮、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变应性疾病、牛皮癣、皮炎硬皮病、特应性皮炎、移植物抗宿主病、器官移植排斥、与器官移植相关的急性或慢性免疫性疾病、肉状瘤病、动脉粥样硬化、弥散性血管内凝血、Kawasaki氏病、Grave氏病、肾病综合征、慢性疲乏综合征、韦格纳氏肉芽肿病、过敏性紫癜、肾显微血管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、脓毒性休克、中毒性休克综合征、脓毒病综合征、恶病质、传染病、寄生虫病、获得性免疫缺陷综合征、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬变、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭、心肌梗死、Addison氏病、散发性多腺性I型缺陷和多腺性II型缺陷、Schmidt氏综合征、成人（急性）呼吸窘迫综合征、秃头、斑秃、血清反应阴性关节病（arthopathy）、关节病、Reiter氏病、牛皮癣性关节病、溃疡性结肠炎性关节病、肠病性滑膜炎、衣原体、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关性关节病、脊椎关节病（spondyloarthopathy）、动脉粥样化疾病/动脉硬化、特应性变态反应、自身免疫性大疱性疾病、寻常天疱疮、落叶状天疱疮、类天疱疮、线性IgA疾病、自身免疫性溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、青少年性恶性贫血、肌痛脑炎/Royal Free疾病、慢性粘膜皮肤念珠菌病、巨细胞性动脉炎、原发性硬化性肝炎、隐原性自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷病综合征、获得性免疫缺陷相关病、乙型肝炎、丙型肝炎、常见的各种免疫缺陷（常见的可变低丙种球蛋白血症）、扩张型心肌病、女性不育、卵巢衰竭、过早卵巢衰竭、纤维化肺疾病、隐原性纤维化肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、结缔组织病相关性间质性肺病、混合型结缔组织病相关性肺病、全身性硬皮病相关性间质性肺病、类风湿性关节炎相关性间质性肺病、全身性红斑狼疮相关性肺病、皮肌炎/多肌炎相关性肺病、Sjögren氏病相关性肺病、强直性脊柱炎相关性肺病、脉管炎性弥散性肺病、含铁血黄素沉着病相关性肺病、药物诱导的间质性肺病、纤维化、放射性纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴细胞性浸润性肺病、传染后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎（传统自身免疫性或狼疮样肝炎）、2型自身免疫性肝炎（抗LKM抗体肝炎）、自身免疫介导的低血糖、具有黑棘皮症的B型胰岛素耐受性、甲状旁腺机能减退、与器官移植相关的急性免疫性疾病、与器官移植相关的慢性免疫性疾病、骨关节病、原发性硬化性胆管炎、1型牛皮癣、2型牛皮癣、特发性白细胞减少（leucopaenia）、自身免疫性嗜中性白细胞减少症、肾脏病NOS、肾小球肾炎（glomerulonephritides）、肾显微血管炎（vasulitis）、莱姆病、盘状红斑狼疮、特发性男性不育症或NOS、精子自身免疫性、多发性硬化（所有亚型）、交感性眼炎、结缔组织病继发的肺动脉高压、Goodpasture氏综合征、结节性多动脉炎的肺表现、急性风湿热、类风湿性脊椎炎、Still氏病、全身性硬皮病、Sjörgren氏综合征、Takayasu氏病/动脉炎、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少症、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿性（goitrous）自身免疫性甲状腺功能减退（Hashimoto氏病）、萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退、原发性粘液性水肿、晶状体性（phacogenic）葡萄膜炎、原发性血管炎、白癜风急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬变、酒精诱导的肝损伤、胆汁郁积（choleosatatis）、特应性肝病、药物诱导的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、变态反应和哮喘、B群链球菌（GBS）感染、精神障碍（例如，抑郁和精神分裂症）、Th2型和Th1型介导的疾病、急性和慢性痛（不同形式的疼痛）、以及癌症例如肺、乳腺、胃、膀胱、结肠、胰、卵巢、前列腺和直肠癌以及造血恶性肿瘤（白血病和淋巴瘤）、无β脂蛋白血症、手足发绀、急性和慢性寄生或感染过程、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病（ALL）、急性髓细胞样白血病（AML）、急性或慢性细菌感染、急性胰腺炎、急性肾功能衰竭、腺癌、心房异位搏动、AIDS痴呆复征、酒精诱导的肝炎、变应性结膜炎、过敏性接触性皮炎、变应性鼻炎、同种异体移植物排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肌萎缩性侧索硬化、贫血、心绞痛、前角细胞变性、抗cd3治疗、抗磷脂综合征、抗受体超敏反应、主动脉和周围性动脉瘤（aneuryisms）、主动脉壁夹层形成、高动脉压、动脉硬化、动静脉瘘、共济失调、心房纤维颤动（持续性或阵发性）、心房扑动、房室传导阻滞、B细胞淋巴瘤、骨移植物排斥、骨髓移植（BMT）排斥、束支传导阻滞、Burkitt氏淋巴瘤、烧伤、心律失常、心脏震晕综合征、心脏肿瘤、心肌病、心肺分流术炎症应答、软骨移植排斥、小脑皮质变性、小脑病症、紊乱性或多源性房性心动过速、化学疗法相关病症、chromic髓细胞性白血病（CML）、慢性酒精中毒、慢性炎性病理学、慢性淋巴细胞性白血病（CLL）、慢性阻塞性肺部疾病（COPD）、慢性水杨酸盐中毒、结肠直肠癌、充血性心力衰竭、结膜炎、接触性皮炎、肺源性心脏病、冠状动脉疾病、Creutzfeldt-Jakob病、培养物阴性脓毒病、囊性纤维化、细胞因子疗法相关病症、拳击员痴呆、脱髓鞘病、登革出血热、皮炎、皮肤病学状况、多尿症、糖尿病、糖尿病性动脉硬化性疾病、弥漫性Lewy小体病、扩张性充血性心肌病、基底神经节病症、中年唐氏综合征、由阻断CNS多巴胺受体的药物诱导的药物诱导的运动障碍、药物敏感性、湿疹、脑脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、会厌炎、EB病毒感染、红斑性肢痛病、锥体外束和小脑病症、家族性嗜血性（hematophagocytic）淋巴组织细胞增多症、胎儿胸腺移植排斥、Friedreich氏共济失调、功能性外周性动脉病症、真菌性脓毒病、气性坏疽病、胃溃疡、肾小球肾炎、任何器官或组织的移植物排斥、革兰氏阴性脓毒病、革兰氏阳性脓毒病、由于细胞内生物的肉芽肿、毛细胞性白血病、Hallerrorden-Spatz病、hashimoto氏甲状腺炎、枯草热、心脏移植排斥、血色素沉着症、血液透析、溶血性尿毒性综合征/血栓溶解性血小板减少性紫癜、出血、肝炎（A）、希氏束心律失常、HIV感染/HIV神经病、何杰金氏病、运动过度性运动障碍、超敏反应、超敏感性肺炎、高血压、运动机能减退性运动障碍、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、特发性Addison氏病、特发性肺纤维化、抗体介导的细胞毒性、虚弱、婴儿型脊髓性肌萎缩、主动脉炎症、流行性感冒a、电离辐射照射、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、缺血性再灌注损伤、缺血性中风、青少年类风湿性关节炎、青少年脊髓性肌萎缩、卡波西氏肉瘤、肾移植排斥、军团杆菌、利什曼病、麻风病、皮层脊髓系统损伤、脂肪水肿、肝移植排斥、淋巴水肿（lymphederma）、疟疾、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多症、恶性黑素瘤、脑膜炎、脑膜炎球菌血症、代谢性/特发性、偏头痛、线粒体多系统病症、混合型结缔组织病、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多系统变性（Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager和Machado-Joseph）、重症肌无力、鸟胞内分支杆菌、结核分支杆菌、骨髓异常增生综合征、心肌梗死、心肌缺血性病症、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、肾变病、神经变性疾病、神经原性I肌萎缩、嗜中性粒细胞减少性发烧、非何杰金淋巴瘤、腹主动脉及其分支闭塞、occulsive动脉病症、okt3治疗、睾丸炎/附睾炎（epidydimitis）、睾丸炎/输精管切除术逆转操作、器官巨大症、骨质疏松症、胰移植排斥、胰癌、恶性肿瘤的瘤旁综合征/高钙血症、甲状旁腺移植排斥、盆腔炎症性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、外周性动脉粥样硬化疾病、外周血管病症、腹膜炎、恶性贫血、卡氏肺囊虫性肺炎、肺炎、POEMS综合征（多发性神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病、和皮肤变化综合征）、灌注后综合征、泵后综合征、MI心切开术后综合征、先兆子痫、进行性核上麻痹、原发性肺动脉高压、放射治疗、Raynaud氏现象和疾病、Raynoud氏病、Refsum氏病、常规狭窄QRS心动过速、肾血管性高血压、再灌注损伤、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、Lewy小体型老年性痴呆、血清反应阴性关节病、休克、镰状细胞贫血、皮肤同种异体移植物排斥、皮肤变化综合征、小肠移植排斥、实体瘤、特殊心律失常、脊髓性共济失调、脊髓小脑变性、链球菌肌炎、小脑结构损伤、亚急性硬化性全脑炎、晕厥、心血管系统梅毒、全身性过敏反应（anaphalaxis）、全身炎症反应综合征、全身发作性青少年类风湿性关节炎、T细胞或FAB ALL、毛细血管扩张、血栓闭塞性脉管炎、血小板减少症、毒性、移植物、创伤/出血、III型超敏反应、IV型超敏反应、不稳定心绞痛、尿毒症、尿脓毒病、荨麻疹、心脏瓣膜疾病、静脉曲张、血管炎、静脉疾病、静脉血栓形成、心室纤维性颤动、病毒和真菌感染、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎、病毒相关性噬红细胞（hemaphagocytic）综合征、Wernicke-Korsakoff综合征、Wilson氏病、任何器官或组织的异种移植排斥、急性冠状动脉综合征、急性特发性多神经炎、急性炎性脱髓鞘性多发性神经根性神经病、急性缺血、成人Still氏病、斑秃、过敏反应、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、动脉硬化、特应性湿疹、特应性皮炎、自身免疫性皮炎、与链球菌感染相关的自身免疫性病症、自身免疫性肠病、自身免疫性听力丧失、自身免疫性淋巴细胞增生综合征（ALPS）、自身免疫性心肌炎、自身免疫性过早卵巢衰竭、睑炎、支气管扩张、大疱性类天疱疮、心血管病、灾变性抗磷脂综合征、乳糜泻、颈椎关节强硬、慢性缺血、疤痕性类天疱疮、具有多发性硬化风险的临床孤立综合征（CIS）、结膜炎、儿童期发病性精神病、慢性阻塞性肺部疾病（COPD）、泪囊炎、皮肌炎、糖尿病性视网膜病、糖尿病、椎间盘突出、盘脱垂、药物诱导的免疫性溶血性贫血、心内膜炎、子宫内膜异位、眼内炎、巩膜外层炎、多形性红斑、重型多形性红斑、妊娠期类天疱疮、格-巴二氏综合征（GBS）、枯草热、Hughes综合征、特发性帕金森氏病、特发性间质性肺炎、IgE介导的变态反应、免疫性溶血性贫血、内含体肌炎、传染性眼炎性疾病、炎性脱髓鞘疾病、炎性心脏病、炎性肾病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、干燥性角膜结膜炎（keratojuntivitis sicca）、Kussmaul病或Kussmaul-Meier病、Landry氏麻痹、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、网状青斑、黄斑变性、显微镜下多脉管炎、morbus bechterev、运动神经元病症、粘膜类天疱疮、多器官衰竭、重症肌无力、脊髓异常增生综合征、心肌炎、神经根障碍、神经病、非甲非乙型肝炎、视神经炎、骨质溶解、少关节的JRA、周围动脉闭塞性疾病（PAOD）、周围血管疾病（PVD）、外周动脉疾病（PAD）、静脉炎、结节性多动脉炎（或结节性动脉外膜炎）、多软骨炎、风湿性多肌病、白发症、多关节的JRA、多发性内分泌缺陷综合征、多肌炎、风湿性多肌病（PMR）、泵后综合征、原发性帕金森综合征、前列腺炎、单纯红细胞再生障碍、原发性肾上腺机能不足、复发型视神经脊髓炎、再狭窄、风湿性心脏病、SAPHO（滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥厚和骨炎）、硬皮病、继发性淀粉样变性、休克肺、巩膜炎、坐骨神经痛、继发性肾上腺机能不足、聚硅氧烷相关的结缔组织病、Sneddon-Wilkinson皮肤病、关节强硬性脊椎炎（spondilitis ankylosans）、Stevens-Johnson综合征（SJS）、全身性炎症应答综合征、颞动脉炎、弓形体视网膜炎、中毒性表皮坏死松解、横贯性脊髓炎、TRAPS（肿瘤坏死因子受体，I型变态反应，II型糖尿病、荨麻疹、普通型间质性肺炎（UIP）、脉管炎、春季结膜炎、病毒性视网膜炎、Vogt-Koyanagi-Harada综合征（VKH综合征）、湿黄斑变性和伤口愈合。
在另一个方面，本发明的结合蛋白用于治疗选自下述的病症：急性成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞样白血病、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外、膀胱癌、骨癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、脑干神经胶质瘤、脑瘤、脑干神经胶质瘤、小脑strocytoma/恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、成髓细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视通路和下丘脑神经胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、类癌瘤、类癌瘤、原发不明性胃肠癌、中枢神经系统淋巴瘤、原发性小脑星形细胞瘤、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增生性病症、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因家族肿瘤（Ewing Family of Tumor）、颅外胚细胞瘤、性腺外胚细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼内黑色素瘤、成视网膜细胞瘤、胆囊癌、胃（胃）癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤（GIST）、颅外胚细胞瘤、性腺外胚细胞瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤、脑干神经胶质瘤、大脑星形细胞瘤神经胶质瘤、儿童期视通路和下丘脑神经胶质瘤、多毛细胞白血病、头与颈癌、肝细胞（肝）癌、何杰金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌（内分泌胰腺）、卡波济肉瘤、肾（肾细胞）癌、喉癌、急性成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞样白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、多毛细胞白血病、唇和口腔癌、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、AIDS相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、华氏（Waldenström）巨球蛋白血症、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、成髓细胞瘤、黑色素瘤、眼内（眼）黑色素瘤、Merkel细胞癌、恶性间皮瘤、原发不明颈部转移性鳞癌、口癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物、蕈样真菌病、骨髓发育不良综合征、骨髓发育不良/骨髓增生性疾病、髓性白血病、慢性髓细胞样白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生性病症、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口癌、口腔癌、唇和口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度潜在恶性肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞胰腺癌、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、成松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体瘤、浆细胞赘生物/多发性骨髓瘤、胸膜肺胚细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞（肾）癌、肾盂和输尿管、移行细胞癌、成视网膜细胞瘤、唾液腺癌、肉瘤、尤因家族肿瘤、卡波济肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、塞扎里（Sézary）综合征、皮肤癌（非黑色素瘤）、皮肤癌（黑色素瘤）、Merkel细胞皮肤癌、小肠癌、鳞状细胞癌、原发不明颈部转移性鳞癌、胃（胃）癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、妊娠滋养细胞肿瘤、输尿管和肾盂、移行细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫内膜子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、华氏巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。
在另一个方面，本发明提供了用于在体外检测样品中PGE2的存在的方法（例如，生物学样品，例如血清、血浆、组织、活组织检查）。主题方法可以用于诊断病症，例如免疫细胞相关病症。该方法包括：（i）使样品或对照样品与如本文描述的抗PGE2抗体或其片段接触；和（ii）检测在抗PGE2抗体或其片段和样品或对照样品之间的复合物形成，其中相对于对照样品，在样品中的复合物形成中的统计上显著变化指示样品中PGE2的存在。
在另外一个方面，本申请提供了用于在体内检测PGE2的存在的方法（例如，在受试者中的体内成像）。主题方法可以用于诊断病症，例如PGE2相关病症。该方法包括：（i）在允许抗体或片段与PGE2结合的条件下，给受试者或对照受试者施用如本文描述的抗PGE2抗体或其片段；和（ii）检测在抗体或片段和PGE2之间的复合物形成，其中相对于对照受试者，在受试者中的复合物形成中的统计上显著变化指示PGE2的存在。
本发明的抗体或其抗原结合部分可以单独或组合使用以治疗此种疾病。应当理解本发明的抗体或其抗原结合部分可以单独或与另外的试剂例如治疗剂组合使用，另外的试剂由技术人员根据其预期目的进行选择。例如，另外的试剂可以是领域公认为治疗由本发明的抗体治疗的疾病或状况有用的治疗剂。另外的试剂也可以是赋予治疗组合物有利属性的试剂，例如影响组合物粘度的试剂。
应进一步理解将包括在本发明内的组合是对其预期目的有用的那些组合。下文所述试剂是举例说明性目的的且不希望是限制性的。作为本发明部分的组合可以是本发明的抗体和选自下列的至少一种另外的试剂。组合还可以包括超过一种另外的试剂，例如，2种或3种另外的试剂，如果组合是这样的，从而使得形成的组合物可以执行其预期功能的话。
组合疗法可以包括与一种或更多种另外治疗剂共配制和/或共施用的一种或更多种PGE2拮抗剂，例如抗PGE2抗体或其片段，所述另外治疗剂例如一种或更多种细胞因子或生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂（例如，全身性抗炎剂）、抗纤维变性剂、代谢抑制剂、酶抑制剂和/或细胞毒性或细胞生长抑制剂，如本文进一步描述的。可以与一种或更多种PGE2拮抗剂，例如抗PGE2抗体或其片段共配制和/或共施用的优选另外治疗剂的例子包括但不限于下述中的一种或更多种：吸入类固醇；β激动剂，例如短效或长效β激动剂；白三烯或白三烯受体拮抗剂；组合药物例如ADVAIR；IgE抑制剂，例如抗IgE抗体（例如，XOLAIR）；磷酸二酯酶抑制剂（例如，PDE4抑制剂）；黄嘌呤；抗胆碱能药；肥大细胞稳定剂例如色甘酸钠；IL-4抑制剂；IL-5抑制剂；嗜伊红粒细胞趋化蛋白/CCR3抑制剂；组胺或其受体包括H1、H2、H3和H4拮抗剂，和前列腺素D或其受体（DP1和CRTH2）拮抗剂。此种组合可以用于治疗哮喘和其他呼吸病症。可以与一种或更多种抗PGE2抗体或其片段共施用和/或共配制的治疗剂的另外例子尤其包括下述中的一种或更多种：TNF拮抗剂（例如，TNF受体的可溶性片段，例如p55或p75人TNF受体或其衍生物，例如75 kD TNFR-IgG（75 kD TNF受体-IgG融合蛋白，ENBREL））；TNF酶拮抗剂，例如TNF转换酶（TACE）抑制剂；毒蕈碱受体拮抗剂；TGF-β拮抗剂；干扰素γ；perfenidone；化学治疗剂，例如氨甲蝶呤、来氟米特或西罗莫司（雷帕霉素）或其类似物，例如CCI-779；COX2和cPLA2抑制剂；NSAIDs；免疫调节剂；p38抑制剂、TPL-2、MK-2和NFkB抑制剂。其他组合是细胞因子抑制性消炎药（CSAIDs）；针对其他人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂，例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、IL-21、IL-31、干扰素、EMAP-II、GM-CSF、FGF、EGF、PDGF和edothelin-1，以及这些细胞因子和生长因子的受体。本发明的抗体或其抗原结合部分可以与针对细胞表面分子或其配体包括CD154（gp39或CD40L）的抗体组合，所述细胞表面分子例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80（B7.1）、CD86（B7.2）、CD90、CTLA。
治疗剂的优选组合可以在炎症级联中的不同点上进行干扰。优选例子包括TNF拮抗剂，如嵌合、人源化或人TNF抗体，D2E7、（PCT公开号WO 97/29131）、CA2（RemicadeTM）、CDP 571、和可溶性p55或p75 TNF受体，其衍生物（p75TNFR1gG（EnbrelTM）或p55TNFR1gG（Lenercept），以及TNF转换酶（TACE）抑制剂；类似地由于相同原因IL-1抑制剂（白细胞介素-1转换酶抑制剂，IL-1RA等）可以是有效的。
本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体或抗体部分。“治疗有效量”指在所需剂量和时间段有效达到所需治疗结果的量。抗体或抗体部分的治疗有效量可以由本领域技术人员来确定，且可以根据下述因素而变，例如个体疾病状态、年龄、性别、和重量，以及抗体或抗体部分在个体中引起所需应答的能力。治疗有效量也是其中治疗有利作用大于抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用的量。“预防有效量”指在所需剂量和时间段有效达到所需预防结果的量。一般地，因为预防剂量在疾病前或疾病早期时在受试者中使用，所以预防有效量将小于治疗有效量。
剂量方案可以进行调整以提供最佳所需应答（例如，治疗或预防应答）。例如，可以施用单次快速浓注方式，几个分份剂量可以随着时间过去而施用，或剂量可以如治疗情形的紧急状态所指示的按比例减少或增加。为了易于施用和剂量一致，以单位剂型配制肠胃外组合物是特别有利的。如本文使用的，单位剂型指适合作为单一剂量用于待治疗的哺乳动物受试者的物理上不连续单位；每个单位包含与所需药学载体结合的计算为产生所需疗效的预定量的活性化合物。关于本发明的单位剂型的详细说明由下述规定且直接取决于下述：（a）活性化合物的独特特征和待达到的具体治疗或预防作用，和（b）配合这种用于治疗个体中敏感性的活性化合物的领域固有的局限性。
关于本发明的抗体或抗体部分的治疗或预防有效量的示例性、非限制性范围是0.1－20 mg/kg，更优选1－10 mg/kg。应当指出剂量值可以依待减轻的状况类型和严重性而变。应进一步理解对于任何特定受试者，根据个体需要和施用或监督组合物施用的人的专业判断，具体剂量方案应当随着时间过去进行调整，并且本文所述的剂量范围仅是示例性的，且不希望限制要求保护的组合物的范围或实践。
对于本领域技术人员将显而易见的是，本文描述的本发明方法的其他合适修改和适应是明显的，且可在不背离本发明或本文公开的实施方案的范围下使用合适的等同方案作出。尽管本发明目前已得到详细描述，但通过参考下述实施例将更清楚地理解本发明，所述实施例被包括仅用于举例说明性目的且不希望限制本发明。
范例
实施例1: 抗前列腺素 E2 单克隆抗体的产生和分离
实施例1.1: 鉴定抗人前列腺素 E2 抗体的测定
除非另有说明，否则下述测定用于鉴定且表征抗前列腺素E2抗体。
实施例1.1.A: ELISA
根据下述2种方法中的至少一种执行酶联免疫吸附测定，以筛选结合前列腺素E2的抗体。
方法 1
用50 μl的在PBS（Invitrogen Carlsbad，CA）中以2 μg/ml的抗宿主Fc IgG（Sigma，St. Louis，MO）包被ELISA板（Costar 3369，Corning，NY）。在4℃下过夜温育后，用PBS洗涤，并且用200 μl Superblock（Pierce #37535，Rockford，IL）封闭板。含IgG样品在测定缓冲液（在包含0.05％Surfactamps的PBS中的10％Superblock（Pierce #37535，Rockford，IL）中稀释到1 μg/ml，并且向每个孔中加入50 μl/孔，并且在室温下温育1小时。将板用Tween-Tris缓冲液（TTBS）洗涤4次。将PGE2-生物素酰胺（biotinamide）（Cayman Chemicals，Ann Arbor，MI）稀释到30 nM，并且在测定缓冲液中1:3连续稀释。将滴定曲线样品以50 μl/孔加入每种IgG样品中，并且在室温下温育1小时。如前所述洗涤板，并且将50 μl在测定缓冲液中1:5000稀释的链霉抗生物素蛋白polyhrp40（Fitzgerald Industries，Concord，MA）加入每个孔中，并且在室温下温育45分钟。执行最后洗涤步骤，并且使用单步TMB系统（Sigma #T8665，St. Louis，MO）和100 μl /孔2N H2SO4使板显色。在Molecular Devices Spectramax板阅读器（Sunnyvale，CA）上在450 nm下阅读板。使用GraphPad Prism 5（GraphPad Software，La Jolla，CA）测定EC50。
方法 2
可替代地，使用3H-PGE2 ELISA测定前列腺素结合。用在PBS中的5 μg/ml山羊抗人IgG（Fc）（Thermo Scientific # 31170，Hudson，NH）或山羊抗小鼠IgG（Fc）（Thermo Scientific # 31125，Hudson，NH）以50 μL/孔包被板，并且在4℃下温育过夜。第二天，轻拍板且吸干。板用200 μL/孔Superblock（Thermo Scientific # 37515，Hudson，NH）在室温下封闭1小时。轻拍板且吸干。单克隆抗体在含Tween 20的磷酸盐缓冲溶液（PBST）（Abbott Bioresearch Center，Worcester，MA）和10％Superblock中稀释到0.04 μg/ml，并且将50 μL每种抗体以2ng/孔加入预封闭的ELISA板的每个孔中，并且在室温下温育1小时。孔用PBS + 0.1％Tween-20洗涤3次。在PBST/ 10％Superblock中制备3H-PGE2（Perkin Elmer # NET-428，Waltham，MA）的连续3倍滴定。将50微升3H-PGE2溶液加入板的每个孔中，并且在室温下温育1小时。孔用PBST/ 10％Superblock手工洗涤6次，并且将50 μL闪烁液（Perkin Elmer # 6013621，Waltham，MA）加入每个孔中。使用TopCount阅读器(Perkin Elmer, Waltham, MA)伴随5分钟计数延迟阅读板。使用GraphPad Prism 5（GraphPad Software，La Jolla，CA）测定EC50数目。
实施例1.1.B: PGE2 竞争 ELISA
根据下述2种方法中的至少一种执行竞争酶联免疫吸附测定，以测定关于结合前列腺素E2的抗体的前列腺素结合特异性。
方法 1
用50 μl/孔的在PBS（Invitrogen，Carlsbad，CA）中以2 μg/ml的抗宿主Fc IgG（Sigma，St. Louis，MO）包被ELISA板（Costar 3369，Corning，NY）。在4℃下过夜温育后，用200 μl Superblock（Pierce #37535，Rockford，IL）封闭板。IgG样品在测定缓冲液（在包含0.05％Surfactamps的PBS中的10％Superblock（Pierce #37535，Rockford，IL）中稀释到6 μg/ml。将PGE2-生物素酰胺在测定缓冲液中稀释到3 nM。通过1:10连续稀释在测定缓冲液中制备关于前列腺素PGA2 （Cayman Chemicals，Ann Arbor，MI）、PGD2（Cayman Chemicals，Ann Arbor，MI）和PGE2（Cayman Chemicals，Ann Arbor，MI）的滴定曲线，从300 nM开始。以各50 μl/管的体积将试剂加入管中，并且在室温下预温育1小时。在预温育后，将混合物转移至封闭板，并且允许在室温下温育1小时。接下来，将板用Tween 20-Tris缓冲液（TTBS）洗涤4次。随后将在测定缓冲液中以1:5000稀释的链霉抗生物素蛋白polyhrp40（Fitzgerald Industries，Concord，MA）加入孔中，并且在室温下温育45分钟。执行最后洗涤步骤，并且使用单步TMB系统（Sigma #T8665，St. Louis，MO）和100 μl /孔2N H2SO4使板显色。在Molecular Devices Spectramax板阅读器（Sunnyvale，CA）上在450 nm下阅读板。其中未标记的前列腺素与PGE2-生物素酰胺竞争结合的孔导致信号减少。使用GraphPad Prism 5（GraphPad Software，La Jolla，CA）测定IC50数目。随后通过其他一种或多种前列腺素的PGE2/IC50的IC50计算交叉反应性指数。
方法 2
可替代地，使用3H-PGE2 竞争ELISA测定前列腺素选择性。用50 μL/孔在PBS中的5 μg/ml山羊抗人IgG（Fc）（Thermo Scientific # 31170，Hudson，NH）或山羊抗小鼠IgG（Fc）（Thermo Scientific # 31125，Hudson，NH）包被板，并且在4℃下温育过夜。第二天，轻拍板且吸干。板用200 μL/孔Superblock（Thermo Scientific # 37515，Hudson，NH）在室温下封闭1小时。轻拍板且吸干。单克隆抗体在PBST（Abbott Bioresearch Center，Worcester，MA）/10％Superblock中稀释到0.04 μg/ml，并且将各50 μL加入预封闭的ELISA板的每个孔中（2ng/孔），并且在室温下温育1小时。孔用PBS/ 0.1％Tween-20洗涤3次。3H-PGE2（Perkin Elmer # NET-428，Waltham，MA）在PBST/ 10％Superblock中稀释到6nM（2X原液）。在PBST + 10％Superblock中制备以各种浓度的每种前列腺素（Cayman Chemicals，Ann Arbor，MI），范围从2000 μM（2X原液）到0.00004 μM（2X）。使等体积的3H-PGE2溶液和每种前列腺素稀释物混合。将50微升这种混合物加入板的每个孔中，并且在室温下温育1小时。孔用PBST/ 10％Superblock手工洗涤6次，并且将50 μL闪烁液（Perkin Elmer # 6013621，Waltham，MA）加入每个孔中。使用TopCount阅读器（Perkin Elmer，Waltham，MA）伴随5分钟计数延迟阅读板。使用GraphPad Prism 5（GraphPad Software，La Jolla，CA）测定EC50数目。随后通过其他一种或多种前列腺素的PGE2/IC50的IC50计算交叉反应性指数。
实施例1.1.C: 抗前列腺素 E2 抗体的功能活性的测量
为了检查本发明的抗PGE2抗体的功能活性，抗体用于测量抗体抑制PGE2活性的能力的下述体外和体内测定中。
实施例1.1.C.1: EP4 生物测定
抗PGE2抗体在体外抑制PGE2的细胞应答的能力在用人EP4受体稳定转染的HEK293 Gα16细胞（Abbott Bioresearch Center，Worcester，MA）中在Ca++流量测定中进行测定。简言之，将编码4种人PGE2受体之一EP4的表达质粒和编码Gα16的表达质粒，共转染到人胚胎肾细胞系293细胞（ATCC# CRL1573，Manassas，Virginia）中。使用标准方法（Joseph Sambrook和David W. Russell. Molecular Cloning：A Laboratory Manual Publisher. Published by Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001）选择共表达人EP4和Gα16蛋白质的稳定克隆，并且用于EP4生物测定。
将HEK293 Gα16细胞铺平板在黑色/透明多聚D-赖氨酸板（Corning #3667，Corning，NY）中，并且与Ca++-敏感性染料（Molecular Devices，Sunnyvale，CA）一起温育90分钟。原液PGE2（在200标准浓度（proof）乙醇中）用FLIPR缓冲液[包含1X HBSS（Invitrogen Carlsbad，CA）、20 mM HEPES（Invitrogen Carlsbad，CA）、0.1％BSA（Sigma，St. Louis，MO）和2.5 mM丙磺舒（Sigma，St. Louis，MO）]进行稀释。抗PGE2抗体或同种型匹配对照抗体也在FLIPR缓冲液中进行预稀释。将25 μl PGE2或预温育的PGE2 /抗体混合物加入用细胞预铺平板的孔中。基于PGE2的连续滴定测定PGE2的剂量应答，其中使用FLIPR1或Tetra（Molecular Devices，Sunnyvale，CA），并且使用GraphPad Prism 5（GraphPad Software，La Jolla，CA）测定EC50。对于测试抗体，在EC50浓度下的PGE2与各种浓度的测试抗体或同种型匹配抗体（阴性对照）（ABC）一起温育20分钟，并且加入在HEK293 Gα16细胞中装载染料的人EP4中。使用FLIPR1监控Ca++流量，并且使用GraphPad Prism 5（GraphPad Software，La Jolla，CA）分析数据。
实施例1.1.C.2: 使用 3 H-PGE2 通过抗前列腺素 E2 抗体竞争抑制与 PGE2 受体的 PGE2 结合
使用基于细胞或基于膜的受体结合测定，使用3H-PGE2（前列腺素E2，[5,6,8,11,12,14,15-3H（N）]，Perkin Elmer，Waltham，MA. 目录号NET428250UC），测定通过抗PGE2抗体竞争抑制与PGE2受体例如EP4或EP3的PGE2结合。
内源表达或稳定超表达EP4受体的细胞（即，用于EP4生物测定的HEK293-EP4细胞或HEK293-EP4-Gα16细胞）（105细胞/mL）在24孔板中在DMEM培养基（Invitrogen，Carlsbad，CA）/ 10％FCS（Sigma #T8665，Sigma，St. Louis，MO）中生长过夜。去除培养基，并且加入100 µl结合缓冲液（不含FCS的培养基）。将板置于冰上10分钟。在100 μl体积中加入非放射性PGE2（0-1 µM）连同示踪剂（40 pM 3H-PGE2）。在4℃下执行平衡受体结合共90分钟。去除培养基，并且将细胞用200 μl冷培养基洗涤4次。通过加入20 μl 0.5 M NaOH收获细胞。将裂解物转移至液体闪烁板。将100 μl Aquasafe 500（Zinsser Analytic，Frankfurt，Germany）加上LSC混合物（cocktail）（Lumac LSC，Groningen，The Netherlands）加入每个孔中，并且混合。通过液体闪烁计数测定细胞结合的放射性。对于大多数激动剂-受体相互作用，假定通过激动剂（PGE2）的受体结合抑制遵循单位点模型。使用GraphPad Prism 5（GraphPad Software，La Jolla，CA）计算EC50、Ki和Kd值。
使用来自超表达EP3受体的膜制剂（Millipore，Billerica，MA）执行抗PGE2抗体对3H-PGE2（前列腺素E2，[5,6,8,11,12,14,15-3H（N）]，Perkin Elmer，Waltham，MA. 目录号NET428250UC）与EP3受体结合的抑制。在结合测定前，将50 µl/孔0.3％聚乙烯亚胺（PEI）（Sigma，St. Louis，MO）加入Unifilter-96 GF/B滤板（Perkin Elmer，Waltham，MA）中，并且置于4℃1小时直至准备使用。在结合缓冲液（50 mM HEPES pH 7.0，10 mM MgCl2，1mM EDTA，0.2％BSA）中以2X浓缩制备抗体的1:3稀释物。3H-PGE2在结合缓冲液中以2X浓缩进行制备。随后将50 µl抗体的连续3倍稀释物加入包含50 µl 200 pM 3H-PGE2的每个孔中，使孔混合，并且允许在室温下静置10分钟。使冷冻膜解冻，并且重悬浮于结合缓冲液中。将5µg膜加入每个孔中。在使用Packard 96孔采集器过滤到预处理的GF/B滤板上之前，使混合物在室温下温育60分钟。随后在加入MicroscintTM20（Perkin Elmer，Waltham，MA）前使板干燥1小时。随后使板密封并且在TopCount阅读器（Perkin Elmer，Waltham，MA）上进行计数。在100 µM冷PGE2的存在下测定非特异性结合。使用Graphpad Prism（GraphPad Software，La Jolla，CA），测量的放射性（cpm）用于测定IC50值。
实施例1.1.C.3: 使用基于细胞的 FACS 测定通过抗前列腺素 E2 抗体竞争抑制与 PGE2 受体的 PGE2 结合
使用基于细胞的FACS测定，使用PGE2-生物素酰胺（Cayman Chemical，Ann Arbor，Michigan. 目录号10006987）和链霉抗生物素蛋白-R-藻红蛋白（SA-RPE；Invitrogen，Carlsbad，CA，目录号15-4301），可以测定通过抗PGE2抗体竞争抑制与PGE2受体例如EP4的PGE2结合。内源表达或稳定超表达EP4的细胞（1x106）（即，用于EP4生物测定的HEK293-EP4细胞或HEK293-EP4-Gα16细胞）在DMEM培养基（Invitrogen，Carlsbad，CA）/ 10％FCS（Sigma #T8665，Sigma，St. Louis，MO）中进行培养。收获细胞，并且用500 μl洗涤缓冲液（PBS/1％BSA）洗涤数次。使细胞重悬浮于500 µl FACS结合缓冲液（不含FCS的培养基）中。将20 μl PGE2-生物素酰胺加入细胞悬浮液中，并且在4℃下温育1小时。细胞用洗涤缓冲液洗涤3次。使细胞重悬浮于500 µl FACS结合缓冲液中，并且将20 μl SA-RPE加入细胞中且在4℃下温育30分钟。随后使细胞重悬浮于500 µl FACS结合缓冲液中，并且通过流式细胞术分析在细胞表面上的PGE2结合。在与PGE2-生物素酰胺和SA-RPE温育前，通过使细胞与抗PGE2抗体的滴定预温育，可以测定抗PGE2抗体的抑制。
实施例1.2: 通过杂交瘤方法产生抗前列腺素 E2 单克隆抗体
如下获得抗前列腺素E2小鼠单克隆抗体。
实施例1.2.A: 用前列腺素 E2- 甲状腺球蛋白缀合物免疫接种小鼠
在第1天时，将与完全弗氏佐剂（Pierce，Rockford，IL）或Immunoeasy 佐剂（Qiagen，Valencia，CA）混合的20微克PGE2/甲状腺球蛋白缀合物皮下注射到5只6-8周龄的Balb/C小鼠、5只C57B/6小鼠和5只AJ小鼠内。在第24、38和49天时，将与不完全弗氏佐剂或Immunoeasy 佐剂混合的25μg PGE2/甲状腺球蛋白缀合物皮下注射到相同小鼠内。在第84、112或144天时，用1 μg PGE2/甲状腺球蛋白缀合物静脉内注射小鼠。
实施例1.2.B: 杂交瘤的生成
根据Kohler，G.和Milstein，Nature，256:495（1975）中所述确立的方法，将从实施例1.2.A中所述免疫接种的小鼠获得的脾细胞与SP2/O-Ag-14细胞以5:1的比率融合，以生成杂交瘤。将融合产物以2.5x106脾细胞/孔的密度铺平板在96孔板中在含有重氮丝氨酸（Pierce，Rockford，IL）和次黄嘌呤（Pierce，Rockford，IL）的选择培养基中。融合后7 - 10天，观察到肉眼可见的杂交瘤集落。通过ELISA（如实施例1.1.A中所述）就针对PGE2的抗体的存在测试来自包含杂交瘤集落的每个孔的上清液。
使PGE2与几种不同的载体蛋白质缀合，包括牛甲状腺球蛋白、钥孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白和卵白蛋白。（Amiram，等人 Eur. J. Biochem. 53:145- 150（1975））。如实施例1.2.A中所述，小鼠用这些缀合的PGE2-蛋白质复合物之一进行免疫接种。随后如实施例1.2.B中所述，使来自免疫接种的小鼠的脾细胞融合，以产生杂交瘤。分离生产对于PGE2特异性的抗体的杂交瘤，并且如实施例1.1.A中所述，使用生物素化的PGE2 ELISA表征抗体。
实施例1.2.C: 抗前列腺素 E2 单克隆抗体的鉴定和表征
通过有限稀释按比例增加且克隆根据实施例1.2.B中生成的产生结合PGE2的抗体的杂交瘤。
分离出对于PGE2特异性的命名为19C9、4F10和15F10几种抗体。如实施例1.1.A中所述，使用生物素化的PGE2，通过ELISA测定这些抗体的亲和力（图1和2）。如实施例1.1.B中所述，通过与各种前列腺素的竞争ELISA进一步测定这些抗体对于PGE2的特异性（表2）。
表2: 19C9 、 4F10 、 15F10 和 2B5 抗体的亲和力和交叉反应性
实施例2: 通过体外展示技术的人抗前列腺素 E2 抗体
实施例2.1: 通过体外展示技术从非免疫人抗体文库中选择的人抗前列腺素 E2 抗体
使用PROfusionTM mRNA展示，通过体外展示技术从非免疫人抗体文库中选择以单链Fv（scFv）形式的人抗PGE2抗体。使用链霉抗生物素蛋白或neutravidin磁珠收集编码生物素化的PGE2-结合scFv蛋白质的抗体氨基酸序列，并且通过多轮选择从文库中进一步富集。将大量输出scFv核酸序列亚克隆到适合于细菌繁殖的质粒DNA内，并且挑选出个别细菌菌落用于scFv序列分析，并且通过在文库选择中使用的相同抗原结合测定证实其PGE2结合。随后将PGE2-结合scFv克隆的VH和VL DNA分别亚克隆到分别的人IgG表达重链和轻链载体内，并且转染到COS7细胞内用于IgG表达。含人IgG的COS7培养基随后通过如实施例1.1.A中所述的ELISA用于证实PGE2结合（表3）。
表3: PROfusion 文库衍生的 PGE2 抗体与 PGE2- 生物素酰胺的结合（ OD450 ）
表4提供了衍生自PROfusionTM mRNA展示文库的人抗PGE2抗体的VH和VL区的氨基酸序列列表。
表4 VH 和 VL 区的氨基酸序列列表
实施例3: 通过埃德曼（ Edman ）测序、质谱分析和 BLAST 的组合根据解决的蛋白质序列生成且表征重组抗前列腺素 E2 抗体
如先前所述（Pham，V. 等人 Analyt. Biochem.352:77-86（2006）），使用埃德曼降解法、质谱分析和BLAST（基本局部序列比对搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool），NCBI，NIH，Bethesda，MD）的组合，通过分析氨基酸序列生成对于PGE2特异性的杂交瘤衍生的小鼠抗体的蛋白质序列。用100 mM DTT（Invitrogen，Carlsbad，CA）使0.45mg抗PGE2抗体还原成轻链和重链。通过反相HPLC在Shimadzu HPLC系统（Shimadzu Scientifc Instruments，Columbia，MD）上用Vydac C-18反相柱（H-P Separations Group，Hesperia，CA）分开抗PGE2抗体的轻链和重链。在Applied Biosystems API QSTAR Pulsar i质谱仪（Applied Biosystems，Foster City，CA）和Agilent Q-TOF质谱仪（Agilent，Palo Alto，CA）上测量轻和重链的分子量。在PE Applied Biosystems 494/785A/140C/610A蛋白质-肽测序仪（Applied Biosystems，Foster City，CA）上在溶液中执行轻链的N末端测序。将45uL抗PGE2 2B5抗体的轻链装载到滤器的中心，并且执行42个循环。用焦谷氨酸封闭抗PGE2抗体的重链的N末端，并且它无法通过埃德曼降解法进行直接测序。在N末端埃德曼测序重链前，使用焦谷氨酸氨肽酶（Sigma，St. Louis，MO）使重链N末端去封闭。80 μg抗PGE2抗体用50 mM DTT在37℃下还原30分钟。将 0.42 μl 0.5 M EDTA，pH 7.5（Invitrogen，Carlsbad，CA）加入还原样品中，至1 mM的最终EDTA浓度。将50 μl重建的重组激烈热球菌（pyrococcus furiosus）焦谷氨酸氨肽酶（Sigma，St. Louis，MO）加入样品中。使样品溶液在40℃下温育15小时后，使温度增至60℃另外2小时。加入另外10 μl重建的激烈热球菌焦谷氨酸氨肽酶，并且使样品在60℃下温育另外1小时。在15小时、17小时和18小时时间点，4 μl样品用于LC/MS分析，以监控去封闭过程的程度。当去封闭反应完成时，通过高速真空（Eppendorf，Westbury，NY）使溶液浓缩至约100 μl。通过SDS-PAGE使去封闭的重链与轻链分开，并且随后转移至PVDF膜（Invitrogen，Carlsbad，CA）用于埃德曼测序（Niall，HD，Methods Enzymol. 27:942-1010（1973））。
为了获得抗PGE2抗体的内部肽序列，用多种蛋白酶连同或不连同烷基化处理消化抗体。样品首先用DTT进行还原。还原样品用蛋白酶进行直接消化或在消化前用碘乙酰胺（Sigma，St. Louis，MO）进行烷基化。在这个研究中使用的蛋白酶包括胰蛋白酶、glu-C、asp-N和胰凝乳蛋白酶（Sigma，St. Louis，MO）。蛋白酶消化的肽的馏分通过HPLC分开，并且每种馏分收集在分开的eppendorf管中用于MS或埃德曼测序。对于LC/MS/MS分析，使用MALDI-MS（Applied Biosystems，Foster City，CA）、纳米-LC/ESI-MS/MS（Applied Biosystems，Foster City，CA）连同LCQ-deca、API QStar Pulsar（Applied Biosystems，Foster City，CA）和Agilent Q-TOF（Agilent，Palo Alto，CA）。HPLC条件是流动相A= 0.1％甲酸；流动相B= 80％ACN/20 ％0.1％甲酸。应用1-3小时梯度（5-50％B）。对于埃德曼测序，通过ProSorb药液筒（Applied Biosystems，Foster City，CA）将包含起因于蛋白酶消化的肽的馏分转移至PVDF膜。将每种馏分稀释到100 μl 0.1％TFA溶液（Sigma，St. Louis，MO）中。在用10 μl甲醇（Sigma，St. Louis，MO）湿润储库中的PVDF膜（Invitrogen，Carlsbad，CA）后，将样品加入储库中。将样品从储库中取出，并且使PVDF膜风干。使PVDF膜冲压(punch out)，加入5 μl 10％稀释的Biobrene溶液（Sigma，St. Louis，MO），并且使膜完全干燥。在用15 μl 0.1％TFA将PVDF膜洗涤15秒后，用滤纸擦拭表面。将4 μl甲醇加入PVDF膜，并且允许充分干燥。干燥的PVDF膜用于埃德曼测序。
根据上述方法用小鼠种系序列的VH和VL数据库（Ig-BLAST，NCBI，NIH，Bethesda，MD），通过解决的重链和轻链可变区的比对测定抗PGE2抗体的VH和VL的种系序列。对于通过MS和Edman测序未解决的区域，指定最紧密的种系序列。手工鉴定可能的热点突变，以匹配通过MS分别测定的抗PGE2抗体的重链和轻链的实验分子量。使用上述方法解决抗PGE2抗体的蛋白质序列。
基于这种解决的蛋白质序列构建重组抗PGE2抗体的几种形式（2B5-7.0、2B5-8.0和2B5-9.0），各自具有在少数未解决位置中的不同残基（表5）。这些重组抗体的测试在实施例4中描述。尽管抗体CDRs的氨基酸序列对于抗体的结合特异性、能力和亲和力是关键的，但在构架和甚至CDRs中的少数残基的置换、改变、缺失或添加仍可以在很大程度上维持抗体的结合特异性、能力和亲和力。具有至少一个或数个此种置换、改变、缺失或添加的抗体形式仍在本发明的范围内。抗PGE2抗体（2B5-7.0、2B5-8.0和2B5-9.0）的VH和VL区的比对显示于图8中。
表5：关于小鼠抗 PGE2 抗体的解决的蛋白质序列的几种形式
实施例4：重组抗前列腺素 E 2 抗体
实施例4.1：重组抗前列腺素 E 2 抗体的构建和表达
通过在细菌中的同源重组，使编码小鼠抗PGE2抗体2B5-7.0、2B5-8.0或2B5-9.0的重链可变区的DNA与编码人IgG1恒定区、小鼠IgG1恒定区或小鼠IgG2a恒定区的cDNA片段融合。（Zhang，Y 等人 Nature Biotechnol. 18（12）:1314-7（2000））。使编码2B5-7.0、2B5-8.0或2B5-9.0的轻链可变区的DNA与人κ恒定区或小鼠κ恒定区融合。同上。通过连接到pTT3表达质粒内的重和轻链cDNAs的共转染，在293细胞中瞬时表达全长抗体。（Durocher，Y 等人 Nucleic Acids Res. 30（2）:E9（2002））。通过蛋白A琼脂糖层析纯化包含重组嵌合抗体的细胞上清液，并且通过加入酸缓冲液洗脱结合抗体。使抗体中和且透析到PBS内。（Making and Using Antibodies：A Practical Handbook. 由Gary C. Howard和Matthew R. Kaser编辑. 由CRC出版（2006））。
随后如实施例1.1.A中所述，在ELISA测定中就其与PGE2结合的能力（表6），并且如实施例1.1.B中所述，在竞争ELISA中就其选择性（表6），测试纯化的嵌合抗PGE2单克隆抗体2B5-7.0、2B5-8.0和2B5-9.0。所有3种重组抗PGE2单克隆抗体2B5-7.0、2B5-8.0和2B5-9.0与PGE2有效结合，对于PGE2具有相似特异性。2B5-8.0证实针对PGE2的最高结合能力，并且选择用于进一步表征，以在EP4生物测定中表征其中和PGE2生物活性的能力，和在3H-PGE2竞争ELISA中表征其前列腺素选择性，其中使用前列腺素的完整组。如实施例1.1.C中所述，2B5-8.0在EP4生物测定中有效抑制PGE2诱导的钙流入（表6）。
表6：工程改造的抗 PGE2 Mabs 的 PGE2 结合、前列腺素结合选择性和 PGE2 中和能力的表征
实施例4.2：人源化抗前列腺素 E 2 抗体的构建和表达
实施例4.2.1：人抗体构架的选择
人源化基于氨基酸序列同源性、CDR簇分析、在表达的人抗体中的使用频率、和关于人抗体晶体结构的可用信息。考虑对抗体结合、VH-VL配对和其他因素的可能作用，当鼠和人构架残基不同时，使鼠残基突变为人残基，除少数例外。基于人种系抗体序列或其亚组的分析设计另外的人源化策略，所述人种系抗体序列或其亚组与鼠抗体可变区的实际氨基酸序列具有高度同源性，即，序列相似性。
同源性建模用于鉴定对于鼠抗体序列独特的残基，预测所述残基对于抗体CDRs的结构是至关重要的。与目的靶蛋白质共享序列相似性和关于其的三维坐标是已知的参考蛋白质用于获得起始坐标和关于其进一步改善的指导。参考和靶蛋白质的基本序列进行这样比对，从而使得2种蛋白质的相同部分的坐标进行比对。由一般结构模板构建关于2种蛋白质的错配部分的坐标，例如来自残基突变、插入或缺失，并且进行能量改善，以确保与已比对的模型坐标的一致性。这种计算蛋白质结构可以进一步改善或直接用于建模研究中。
使用Vector NTI软件，将2B5-8.0的鼠可变重链和可变轻链基因序列分别与44个人免疫球蛋白种系可变重链或46个种系可变轻链序列（得自在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/retrieveig.html的NCBI Ig Blast网站）进行比对。BLAST搜索和目视检查的组合用于鉴定合适的参考结构。在参考和靶氨基酸序列之间25％的序列同一性被视为尝试履行同源性建模所必需的最低限度。手工构建序列比对，且使用程序Jackal生成模型坐标（Petrey，D.，等人 Proteins 53（Suppl. 6）:430-435（2003））。对于2B5-8.0人源化，基于针对人V和J区段序列的同源性搜索，选择VH区段VH1-18和J区段JH4，以提供用于关于2B5-8.0的人源化重链可变区的构架。对于2B5-8.0轻链可变区，使用VL区段01和J区段JK4（参见表7和8）。在2B5-8.0 VH和受体人VH1-18和JH4区段之间的构架氨基酸同一性是80.2％，而在2B5-8.0 VL和受体人01和JK4区段之间的同一性是90.3％。尽管选择优选的人构架受体VH/JH和VL/JK的特定对作为用于2B5-8.0人源化的受体，但本领域已知与小鼠构架具有最低限度25％序列同一性的其他人构架受体也可以用于2B5-8.0的人源化，并且因此在本发明的范围内。
表7：用于 2B5-8.0 人源化的重链受体序列
表8：用于 2B5-8.0 人源化的轻链受体序列
所选择的抗体的鼠和人构架区的基本序列共享显著同一性。不同的残基位置是用于在人源化序列中包括鼠残基的候选物，以便保留所观察到的鼠抗体的结合能力。在关键残基上的此种构架区氨基酸置换（回复突变为小鼠残基的人残基）被称为构架回复突变，其中关键残基选自与CDR相邻的残基；糖基化位点残基；罕见残基；能够与PGE2相互作用的残基；能够与CDR相互作用的残基；典型残基；在重链可变区和轻链可变区之间的接触残基；在Vernier区内的残基；和在Chothia限定的可变重链CDR1和Kabat限定的第一个重链构架之间重叠的区域中的残基。在一个实施方案中，人受体构架包括至少一个构架区氨基酸置换，其中所述构架的氨基酸序列与所述人受体构架的序列至少65％相同，并且包括与所述人受体构架相同的至少70个氨基酸残基。对于2B5-8.0的人源化，在关键残基上的构架区氨基酸置换选自在重链可变区中在位置48上的M（人）至I（小鼠）、在位置68上的V（人）至A（小鼠）、在位置70上的M（人）至L（小鼠）、和在位置72上的T（人）至V（小鼠）；以及在轻链可变区中在位置2上的I（人）至V（小鼠）、和在位置3上的V（人）至L（小鼠）。
给定构架残基将影响抗体的结合性质的可能性依赖于其与 CDR残基的接近度。因此，使用模型结构，在鼠和人序列之间不同的残基根据其离CDRs中可能接触PGE2的任何原子的距离分级。落在任何CDR原子的4.5 Å内的那些残基被鉴定为最重要的，且被视为用于在人源化抗体中保持鼠残基（即，构架回复突变）的候选物。
对于2B5-8.0抗体可变区的人源化，在本发明中提供的一般方法如下。首先，借助于计算机程序ABMOD和ENCAD构建2B5-8.0抗体可变区的分子模型（Levitt，M.，J. Mol. Biol. 168：595-620（1983））。接下来，基于针对人V和J区段序列的同源性搜索，选择VH区段VH1-18（The Immunoglobulin Facts Book. 2001，由Marie-Paule Lefranc和Gerald Lefranc创作，由Academic Press出版）和J区段JH4（同上），以提供用于用于2B5-8.0的人源化重链可变区的构架。对于2B5-8.0轻链可变区，使用VL区段01（同上）和J区段JK4（同上）。在2B5-8.0 VH和受体人VH1-18和JH4区段之间的构架氨基酸同一性是80.2％，而在2B5-8.0 VL和受体人01和JK4区段之间的同一性是90.3％。计算机模型未鉴定出需要回复突变的与CDRs的任何显著接触残基。未进行进一步替换。
设计了命名为HU2B5.1、HU2B5.2、HU2B5.3、HU2B5.4、HU2B5.5、HU2B5.6、HU2B5.7、HU2B5.8和HU2B5.9的9种不同形式的人源化2B5-8.0。如上所述，9种抗体在重链可变区在48、68、70和72位置中以及在轻链可变区中在位置2和3中在构架回复突变中不同。
表9：小鼠抗PGE2抗体2B5-8.0的CDRs
表10: 具有2B5-8.0的CDRs的9种人源化抗PGE2抗体
实施例4.2.2: 人源化抗体的构建
使用寡核苷酸重新构建在实施例4.2.1中所述的在计算机芯片上（in silico）设计的人源化抗体。对于每个可变区cDNA，设计各60-80个核苷酸的6个寡核苷酸以在每个寡核苷酸的5’和/或3’末端相互重叠20个核苷酸。在退火反应中，组合所有6个寡核苷酸，煮沸，且在dNTPs的存在下退火。添加DNA聚合酶I，大（克列诺（Klenow））片段（New England Biolabs #M0210，Beverley，MA.）以补平重叠寡核苷酸之间的约40bp缺口。随后使用两个最外面的引物进行PCR以扩增整个可变区基因，所述两个最外面的引物含有与修饰的pTT3载体中的多克隆位点互补的突出端序列。在琼脂糖凝胶上分离源自每个cDNA集合（assembly）的PCR产物，且切除和纯化对应于预测的可变区cDNA大小的条带。通过在细菌中的同源重组将重可变区符合读框地插入编码野生型人IgG1恒定区、或含有2个铰链区氨基酸突变的人IgG1恒定区的cDNA片段上。（Zhang，Y 等人 Nature Biotechnol. 18（12）:1314-7（2000））。这些突变是在位置234（EU编号）的亮氨酸至丙氨酸的改变和在位置235的亮氨酸至丙氨酸的改变（Lund 等人 J. Immunol.，147:2657（1991））。通过同源重组将轻链可变区符合读框地插入人κ恒定区。分离细菌集落，提取质粒DNA，并且对cDNA插入片段进行整体测序。将包含对应于每个抗体的正确人源化重链和轻链的pTT3载体共转染到HEK293细胞中以瞬时生产全长人源化抗PGE2抗体。通过蛋白A琼脂糖层析纯化含有重组嵌合抗体的细胞上清液，且通过添加0.1N乙酸/0.15M NaCl（pH3.0）洗脱结合的抗体。中和抗体并将其透析到PBS中。
实施例4.2.3：人源化抗 PGE2 抗体的替代构建
这个实施例描述了抗PGE2抗体的人源化。基本上根据Queen，C.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：10029-10033（1989）的程序进行鼠单克隆抗体2B5-8.0的人源化。首先，鉴定与2B5-8.0 VH或VL氨基酸序列具有高同源性的人V区段。接下来，将对于维持CDRs结构重要的互补决定区（CDR）序列连同构架氨基酸一起移植到所选择的人构架序列内。此外，用共有氨基酸置换在相应V区亚组中发现是罕见的人构架氨基酸，以减少潜在免疫原性。
对于2B5-8.0可变区的人源化，在本发明中提供的一般方法如下。首先，借助于计算机程序ABMOD和ENCAD构建2B5-8.0可变区的分子模型（Levitt，M.，J. Mol. Biol. 168：595-620（1983））。接下来，基于针对人V和J区段序列的同源性搜索，选择VH区段MUC1-1’CL（Griffiths，A.D.，等人，EMBO J. 12：725-734（1993））和J区段JH4（Ravetch，J.V.，等人，Cell 27：583-591（1981）），以提供用于关于Hu2B5-8.0重链可变区的构架。对于Hu2B5-8.0轻链可变区，使用VL区段TR1.37’CL（Portolano，S.，等人，J. Immunol. 151：2839-2851（1993））和J区段JK2（Hieter，P.A.，等人，J. Biol. Chem. 257：1516-1522（1982））。在2B5-8.0 VH和受体人MUC1-1’CL和JH4区段之间的构架氨基酸同一性是76％，而在2B5-8.0 VL和受体人TR1.37’CL和JK2区段之间的同一性是84％。
在其中计算机模型暗示与CDRs的显著接触的构架位置上，用来自小鼠V区的氨基酸置换原始人构架氨基酸。对于2B5-8.0的人源化，在关键残基上的构架区氨基酸置换选自在重链可变区中在位置48上的M（人）至I（小鼠）、在位置67上的R（人）至K（小鼠）、在位置68上的V（人）至A（小鼠）、在位置70上的I（人）至L（小鼠）、和在位置72上的R（人）至V（小鼠）；和在轻链可变区中在位置75上的D（人）至V（小鼠）。此外，少数氨基酸已改变为相同人可变结构域亚组中的共有氨基酸，以消除潜在免疫原性，这包括在重链可变区中在位置76上的A至T置换，以及在轻链可变区中在位置1上的E至D置换和在位置2上的L至I置换。
在下文提供了基于这种人源化分析的CDR移植的可变结构域（Hu2B5.P1的VH和VL）以及掺入所有回复突变和共有区置换的可变结构域（Hu2B5.P2的VH和VL）的蛋白质序列。一般理解具有一个或数个此种回复突变和共有区置换的任何人源化形式都归入本发明的范围内。抗体E包括VH Hu2B5.P2和VL Hu2B5.P2；抗体F包括VH Hu2B5.P2和VL Hu2B5.P1；抗体G包括VH Hu2B5.P1和VL Hu2B5.P2；并且抗体I包括VH Hu2B5.P1和VL Hu2B5.P1。
表11：具有2B5-8.0的CDRs的人源化抗PGE2抗体
实施例4.2.4: 人源化抗 PGE2 抗体的表征
如实施例1.1.A中所述，通过生物素-PGE2 ELISA或3H-PGE2放射免疫测定来测定纯化的人源化抗PGE2抗体结合PGE2的能力。如实施例1.1.B中所述，通过竞争生物素-PGE2 ELISA或3H-PGE2放射免疫测定来测定人源化抗PGE2抗体的交叉反应性。如实施例1.1.C中所述，使用EP4生物测定来测定通过人源化抗PGE2抗体的PGE2活性抑制。
所有人源化抗PGE2抗体在生物素-PGE2 ELISA中都能够结合PGE2（图6和7；表12）。人源化抗PGE2抗体在EP4 FLIPR测定中能够中和且阻断PGE2介导的钙流入。替代设计的人源化抗PGE2抗体E、F、G和I在3H-PGE2 ELISA中也能够与PGE2结合（表13）。选择Hu2B5.7用于在3H-PGE2竞争ELISA中进一步表征前列腺素结合特异性，且证实对于PGE2的特异性（表13）。
表12：人源化抗体的表征
表13：人源化抗PGE2抗体的表征（续）
表14：关于人源化抗PGE2抗体Hu2B5.7的前列腺素选择性的表征
实施例4.2.4.A: 人源化抗 PGE2 抗体阻断 PGE2 与 PGE2 受体的结合
通过如实施例1.1.D中所述使用3H-PGE2的基于细胞或基于膜的受体结合测定和如实施例1.1.E中所述基于细胞的FACS测定，可以测定通过抗PGE2抗体竞争抑制与PGE2受体例如EP4的PGE2结合。
对于在人中具有10 - 20天的血清半衰期的治疗mAb，对于每周或每双周IV或SC 3mpk或更少的给药方案，血清浓度通常在5-15 μg/ml之间。基于这种计算，在100 nM（或15ug/ml）的血清浓度下，在单克隆抗体的常规给药方案下，hu2B5.1-Hu2B5.9作为治疗mAb很可能完全（100％）阻断在体内与EP4的PGE2结合。
实施例4.2.5：人源化抗 PGE2 抗体的生物物理化学表征
测试标准范围从一般药物样性质参数例如指示固有稳定性的参数（示差扫描量热法或DSC）到一般的物理和化学稳定性（例如，纯度包括通过SEC监控的片段化和聚集）。
用于生物物理化学表征的分析方法：
实施例4.2.5.1：大小排阻层析（ SEC ）
大小排阻层析用于基于大小分离蛋白质。蛋白质在水性流动相中携带，并且通过在柱中填充的多孔固定相树脂。在柱中的保留时间是蛋白质的流体动力学大小和填充树脂床中的孔大小的函数。更小的分子可以穿透到树脂中更小的孔内，并且保留得比更大分子更久。在从柱中洗脱后，通过UV吸光度检测蛋白质。SEC方法使用TSK凝胶保护（guard）（TOSOH Biosciences，Montgomeryville，PA，目录号08543）和TSK凝胶G3000SWxL（TOSOH Biosciences，Montgomeryville，PA，目录号08541）。流动相是100 mM Na2HPO4、200 mM Na2SO4，pH 7.0。流速是0.3 mL/分钟。注入体积是20 μL 1 mg/mL样品。柱温度是室温。自动进样器温度是2-8℃。总运行时间是50分钟。检测基于在214 nm波长下的UV吸光度，具有在8 nm下的带宽设置，使用在360 nm下的参考波长，具有带宽100 nm。
实施例4.2.5.1：示差扫描量热法（ DSC ）
使用DSC仪器评估抗PGE2抗体的热稳定性。使用的DSC仪器是具有毛细管室（Capillary Cell）的自动化VP-DSC设备（Microcal，GE Healthcare Ltd./Microcal，Buckinghamshire，UK）。对于以1 mg/mL的样品经过25℃ - 95℃温度范围应用1℃/分钟扫描速率研究分子的解折叠。应用的另外测量参数是16秒的适应期，10分钟的预扫描等待时间，并且在非反馈模式下执行测量。每次个别测量，将420 µL样品/空白填充到DSC测量样品支架内，用如下提供的板填充方案。获得的热谱图与非二状态模型拟合，以获得不同转变的中点温度和焓。
关于成功生物制品开发候选物的另外需求是蛋白质保留其天然状态和构象。在水溶液中的蛋白质是在天然（折叠的）构象及其变性（解折叠的）构象之间的平衡。天然状态的稳定性基于系统的吉布斯（Gibbs）自由能（DG）量级以及焓（DH）和熵（DS）改变之间的热力学关系。正DG指示天然状态比变性状态更稳定 - DG越正，稳定性越大。为了蛋白质解折叠，必须破坏稳定力。构象熵克服稳定力，允许蛋白质在其中焓变得占优势的温度下解折叠。DSC测量蛋白质由于热变性解折叠的DH。作为一般规律，可以陈述转变中点（Tm）越高，蛋白质在较低温度下越稳定。在相同实验过程中，DSC还测量关于蛋白质变性在热容量（DCp）中的改变。与蛋白质解折叠相关的热容量改变主要是由于侧链水合中的改变，所述侧链在天然状态中是包埋的，但在变性状态下变得溶剂暴露。DSC已显示是关于蛋白质和其他生物大分子的液体制剂稳定性的有价值预测法（Remmele，R.L. Jr.，Gombotz，W.R.，BioPharm 13，36-46，2000，和；Remmele，R.L. Jr.，Nightlinger，N.S.，Srinivasen，S.，Gombotz，W.R.，Pharm. Res. 15，200-208，1998）。
实施例4.2.6：在克隆选择过程期间人源化抗 PGE2 抗体 Hu2B5.7 的稳定性
实施例4.2.6.A：使用 DSC 和 SEC 人源化抗 PGE2 抗体 Hu2B5.7 的稳定性
通过使用固有热力学克隆稳定性测定使用DSC（0.79 mg/mL克隆浓度，在10 mM柠檬酸盐、10 mM磷酸盐缓冲液中在pH 6下配制）并且通过加速稳定性筛选（0.79 mg/mL克隆浓度，在10 mM柠檬酸盐、10 mM磷酸盐缓冲液中在pH 6下配制，在50℃下共7天）评估亲本抗PGE2抗体的一系列克隆（即，抗PGE2抗体）的稳定性，其中用SEC监控克隆稳定性（表15）。
表15：如通过 SEC 测定的，在 Hu2B5 人源化抗体变体 Hu2B5.1-Hu2B5.9 克隆样品中聚集体和片段的形成（稳定性研究的开始）
表16：如通过 SEC 测定的，在 Hu2B5 人源化抗体变体 Hu2B5.1 - Hu2B5.9 克隆样品中聚集体和片段的形成（在 50 ℃下 7 天贮存）
表15和16提供了关于人源化抗PGE2抗体高达7天贮存的SEC测试结果，显示在加速稳定性筛选开始和结束时的单体水平。Hu2B5.7和Hu2B5.9揭示在7天加速稳定性筛选后的最高单体水平。在表17中显示的结果证实与组的其他克隆（例如，Hu2B5.4）比较，hu2B5.7也具有非常有利的固有稳定性谱（DSC数据）。
IgG抗体一般显示3次解折叠转变（Tm）：完整抗体的解折叠与Fc片段中CH2结构域的解链、Fc片段中CH3结构域的解链和Fab片段的解链相关。为了选择具有所需药物样性质的抗PGE2抗体，选择具有高Tm值和高固有稳定性的克隆例如Hu2B5.7（表17）
表17：人源化抗 PGE2 抗体克隆经由 DSC 的固有热力学克隆稳定性测定（ 0.79 mg/mL 克隆抗体浓度，在 10 mM 柠檬酸盐、 10 mM 磷酸盐缓冲液中在 pH 6 下配制）
实施例4.2.6.B：Hu2B5.1-Hu2B5.9 的毛细管区带电泳
毛细管区带电泳是毛细管电泳法，其中毛细管用缓冲液填充，并且分离机制基于分析物通过缓冲液的电泳迁移率中的差异。分子的电泳迁移率与电荷与大小比例相关。Beckman-Coulter ProteomeLab PA 800（Beckman Coulter，Fullerton，CA）用于CZE分析。使用中性毛细管（eCAP中性，56 cm全长，50μm I. D. Beckman-Coulter，P/N 477441，Fullerton，CA）。该方法使用具有离进样入口20.2 cm的检测窗的30.2 cm毛细管。运行缓冲液是含0.1％MC（来自1％甲基纤维素溶液，Convergent Bioscience，目录号101876，Toronto，ON，Canada）的100 mM EACA（6-氨基己酸，Sigma A7824-100 G，St. Louis，MO），pH 5.5。
结果显示Hu2B5.1、Hu2B5.3、Hu2B5.5、Hu2B5.7、Hu2B5.9迁移得比Hu2B5.2、Hu2B5.4、Hu2B5.6、Hu2B5.8更碱性（basic）（例如，它们具有更短的迁移时间）。这可能是由于Hu2B5.1、Hu2B5.3、Hu2B5.5、Hu2B5.7、Hu2B5.9在重链#84氨基酸上全都具有R，而其他4种样品在相同位置上具有S。所有9种样品都显示主峰和次要的酸性和碱性种类，但在不同种类的分布中没有许多差异。
实施例4.3：与 PGE2 复合的 Hu2B5.7 的结晶化
使Hu2B5.7的Fab部分与PGE2复合，并且如下产生复合物的晶体。
实施例4.3.1：Hu2B5.7 Fab 片段的制备和纯化
为了制备Hu2B5.7 Fab片段，首先使用Ultrafree-15 Biomax 10 kDa分子量截断（MWCO）离心过滤装置（Millipore），使在0.15 M PBS缓冲液中的Hu2B5.7 IgG浓缩至2 mg/ml。使木瓜蛋白酶凝胶浆（Pierce）预洗涤，并且以1:1体积比与缓冲液A（20 mM Na2HPO4、10 mM EDTA、20 mM半胱氨酸）一起以2-3X装入。浓缩抗体随后与50％木瓜蛋白酶凝胶浆混合，并且伴随剧烈震荡在37℃下温育24小时。使抗体/浆混合物离心（Beckman 6KR），并且将上清液装载到PBS预平衡的Superdex 75上。洗脱主要峰，并且合并蛋白质。通过用100 mL PBS洗涤制备25 mL Protein A Sepharose 4 Fast Flow亲和柱（Amersham Pharmacia）。将合并的抗体片段应用于亲和柱（2 mL/分钟流速）。将包含Hu2B5.7 Fab片段的馏分（通过在280 nm下的UV吸光度监控）收集在流过物（flow-thru）中。将包含超过0.3 mg/mL的Hu2B5.7 Fab片段浓度（通过在280 nm下的UV吸光度测定）的馏分合并，并且在-80℃下冷冻。用SDS-PAGE评估样品纯度。
实施例4.3.2：PGE2/Hu2B5.7 Fab 复合物制备
PGE2和Hu2b5.7 Fab蛋白质以1:1摩尔比混合，并且在4℃下温育1小时。将复合物样品以0.5 ml/分钟装载到预平衡的（20 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl）Superdex 200柱上。使用Ultrafree-15 Biomax 10 kDa分子量截断（MWCO）离心过滤装置（Millipore），使复合物合并并且浓缩至24 mg/mL，并且在-80℃下冷冻。用SDS-PAGE评估样品纯度。
实施例4.3.3：PGE2/Hu2B5.7 Fab 复合物的结晶化
使冷冻的PGE2/Hu2B5.7复合物原液（~24 mg/mL）在冰上解冻。使复合物（1.0 μL）与1.0 μL储存溶液（1.75 M硫酸铵、100 mM MES pH 6.5、10 mM CaCl2）混合。使所得到的滴在约18℃下经过储库在坐滴（sitting drop）孔（CrysChem坐滴板）中混合。菱形样晶体一般在1周内出现。
实施例4.3.4：PGE2/Hu2B5.7 Fab 复合物晶体的冷冻保护和快速冷却
使用纤维环在母液 + 20％甘油中收获PGE2/Hu2B5.7 Fab复合物的晶体。随后通过投入液氮内使晶体快速冷却。
实施例4.3.5：PGE2/Hu2B5.7 Fab 复合物的 X 射线衍射数据收集
在Argonne，IL中的Advanced Photon Source处在IMCA束线（beamline）下收集来自PGE2/Hu2B5.7 Fab晶体的X射线衍射数据。在数据收集过程中用Oxford Cryosystems Cryostream冷却器使晶体维持在100 K的温度下。在1.0°的振荡范围下收集总共180帧。用HKL2000程序套件（Otwinowski和Minor，1997）加工数据。在测定晶体方向后，使数据与DENZO整合，并且定标且与SCALEPACK合并，并且放置在绝对标度上且用TRUNCATE减少至结构因子振幅（French和Wilson，1978）。以随机方式指定5％的独特反射至“自由”组，用于计算自由R因子（Rfree）（Brünger，1992）；其余95％的反射构成“工作”组，用于计算R因子（R）。
实施例4.3.6：PGE2/Hu2B5.7 Fab 复合物晶体结构的分子置换解决方案和改善
使用程序PHASER（Read，2001）测定最大似然分子置换解决方案。总共6种PGE2/Hu2B5.7单体在3.0 Å分辨率合适空间组下解决。搜索模型是先前报告的Fab的晶体结构（Protein Data Bank条目1BJ1；Muller 等人 1998）。坐标基于分子置换解决方案产生。
PGE2/Hu2B5.7 Fab复合物晶体结构的改善在合适的空间组中从上文描述的分子置换解决方案坐标开始。通过在CCP4程序套件中可获得的程序REFMAC（Murshudov等人，1997，Collaborative Computational Project，1994）使用刚体改善开始改善。观察到重新PGE2电子密度。通过公开的PGE2 NMR结构1IJZ（Moy 等人，2001）指导6种PGE2单体的人工构建，使用分子图形学程序O（Jones 等人，1991）以及2Fo-Fc和Fo-Fc分子密度图的检查。改善程序REFMAC（Murshudov等人，1997）用于受限改善的反复循环，导致下述统计学：R 25.8％（Rfree 30.5％）。
实施例5.0：药物代谢动力学分析
实施例5.1：重组小鼠抗 PGE2 抗体的药物代谢动力学分析
在Sprague Dawley大鼠和Balb/C小鼠中执行用小鼠mAb 2B5.8.0的药物代谢动力学研究。雄性和雌性大鼠和小鼠用4 mg/kg 2B5.8.0的单次剂量进行静脉内或腹膜内（仅小鼠）给药，并且使用基于抗原捕获的化学发光MSD（Meso Scale Discovery）方法（Meso Scale Discovery，Gaithersburg，Maryland）分析血清样品。使用WinNonlin通过非区室分析计算药物代谢动力学参数。
实施例5.1.1：用于定量 PK 血清样品中的 2B5.8.0 的测定
下述MSD测定用于测量大鼠和小鼠血清中的抗体浓度。MSD链霉抗生物素蛋白板（Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD）用含有0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲盐水（Sigma，St. Louis，MO）进行洗涤。板用250 μL/孔封闭溶液（MSD Block，Meso Scale Discovery，在PBS中稀释到3％终浓度）封闭1小时，覆盖，伴随在室温下的振荡（600rpm）。在洗涤后，将70 µL生物素化的PGE2（前列腺素E2-生物素酰胺，Cayman Chemical，Ann Arbor，Michigan，目录号10006987，批次号190831-191028，在测定缓冲液中0.01ug/mL）加入每个孔中。将板覆盖并且伴随振荡（600 rpm）在室温下温育1小时。
在分析前，使大鼠和小鼠血清样品在冰上解冻，轻轻混合，并且在eppendorf离心机中在14,000 rpm下在4℃下离心3分钟。在大鼠和小鼠血清中制备标准曲线和对照样品。Tecan Evo自动化液体处理站用于在测定缓冲液中稀释标准曲线，高、中和低对照，和血清样品，保持1％最终血清浓度不变。再次洗涤MSD板，并且加入研究样品、标准曲线样品和空白，以及高、中和低对照（70µL/孔）。使板覆盖，并且伴随振荡（600 rpm）在室温下温育1小时。
在温育后，洗涤MSD板，并且将70µL磺基标记的山羊抗小鼠IgG（Meso Scale Discovery；在测定缓冲液中稀释到1ug/mL）加入每个孔中。使MSD板覆盖，并且伴随振荡（600 rpm）在室温下温育1小时，随后洗涤板并且用2x读数缓冲液（Meso Scale Discovery）显色。在MSD Sector Imager 6000上在10分钟内测量化学发光。
使用四参数对数拟合分析标准曲线，并且通过XLfit4软件版本2.2.1 Build 16,（Microsoft Corporation，Redmond，WA）计算样品浓度。使用Winonlin软件版本5.0.1（Pharsight Corporation，Mountain View，CA）通过非区室分析对于每只动物计算药物代谢动力学参数。
实施例5.1.2：在 SD 大鼠和 Balb/C 小鼠中执行 2B5.8.0 的药物代谢动力学研究
手术改变的（颈静脉插管，JVC）和普通雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠（约7周龄，称重240-390克）购自Charles River Laboratories（Wilmington，MA）。动物饲养在维持在恒温和恒湿的房间中在12小时光/暗循环下，供应正常啮齿类动物食物，并且允许随意取用食物和水。每天监控动物的水合和临床情况。
雄性和雌性Balb/c小鼠（称重约0.025 kg）购自Charles River Laboratories（Wilmington，MA）。允许动物随意取用食物和水。在各个时间点（每个时间点5只小鼠）收集血样（经由尾静脉从大鼠并且通过心脏穿刺从小鼠0.2 mL），允许在室温下30分钟凝固，在13,200 rpm下离心3分钟，将血清转移至eppendorf管并且在-80℃下冷冻贮存。
在大鼠中静脉内施用后，2B5.8.0显示抗体一般的双指数式衰变。2B5.8.0清除率和分布容量很低（表18），并且半衰期很长，T1/2：9.1和8.9天（分别为雄性和雌性）。在雌性大鼠中可见大的动物间变异性，但在雄性中则无。
在Balb/C大鼠中IV施用后，2B5.8.0显示非常长的半衰期（雄性和雌性分别26.3和16.2天），具有低清除率和分布容量（表18）。在小鼠中腹膜内施用后，在早期时间点时，在雌性中观察到大的动物间变异性。吸收缓慢，具有到1-2天时达到的37-49 ug/ml的高Cmax。半衰期很长（13.8-16.1天），并且生物利用度良好（65.8- 72.0％）。
表18；2B5.8.0 在 Sprague-Dawley 大鼠和 Balb/C 小鼠中的主要药物代谢动力学参数
实施例5.1.3：重组人源化抗 PGE2hu2B5.7 和 hu2B5.4 的药物代谢动力学分析
在Sprague Dawley大鼠中执行用hu2B5.7和hu2B5.4的药物代谢动力学研究。雄性大鼠用4 mg/kg hu2B5.7和hu2B5.4的单次剂量进行静脉内给药，并且使用基于抗原捕获的化学发光MSD（Meso Scale Discovery）方法分析血清样品。使用WinNonlin通过非区室分析计算药物代谢动力学参数。
实施例5.1.3.1：用于定量 PK 血清样品中的 Hu2b5.7 的测定
下述MSD测定用于测量大鼠血清中的hu2B5.7和hu2B5.4 浓度。MSD链霉抗生物素蛋白板（Meso Scale Discovery）用含有0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲盐水（由10X PBS稀释，Abbott Bioresearch Center，Media Room，Worcester，MA and Tween-20，Sigma，St. Louis，MO）进行洗涤。板用250 μL/孔封闭溶液（MSD Block，Meso Scale Discovery，在PBS中稀释到3％终浓度）封闭1小时，覆盖，伴随在室温下的振荡（600rpm）。在洗涤后，将70 µL生物素化的PGE2（前列腺素E2-生物素酰胺，Cayman Chemical，Ann Arbor，Michigan，目录号10006987，批次号190831-191028，在测定缓冲液中0.01ug/mL）加入每个孔中。将板覆盖并且伴随振荡（600 rpm）在室温下温育1小时。
在分析前，使大鼠血清样品在冰上解冻，轻轻混合，并且在eppendorf离心机中在14,000 rpm下在4℃下离心3分钟。在大鼠血清中制备标准曲线和对照样品。Tecan Evo自动化液体处理站用于在测定缓冲液中稀释标准曲线，高、中和低对照，和血清样品，保持1％最终血清浓度不变。再次洗涤MSD板，并且加入研究样品、标准曲线样品和空白，以及高、中和低对照（70µL/孔）。使板覆盖，并且伴随振荡（600 rpm）在室温下温育1小时。
在温育后，洗涤MSD板，并且将70µL磺基标记的山羊抗小鼠IgG（Meso Scale Discovery；在测定缓冲液中稀释到1ug/mL）加入每个孔中。使MSD板覆盖，并且伴随振荡（600 rpm）在室温下温育1小时，随后洗涤板并且用2x读数缓冲液（Meso Scale Discovery）显色。在MSD Sector Imager 6000上在10分钟内测量化学发光。
使用四参数对数拟合分析标准曲线，并且通过XLfit4软件版本2.2.1 Build 16,（Microsoft Corporation，Redmond，WA）计算样品浓度。使用Winonlin软件版本5.0.1（Pharsight Corporation，Mountain View，CA）通过非区室分析对于每只动物计算药物代谢动力学参数。
实施例5.1.3.2：在Sprague-Dawley大鼠中执行药物代谢动力学研究
手术改变的（颈静脉插管，JVC）雄性Sprague-Dawley大鼠（约7周龄，称重240-390克）购自Charles River Laboratories（Wilmington，MA）。动物饲养在维持在恒温和恒湿的房间中在12小时光/暗循环下，供应正常啮齿类动物食物，并且允许随意取用食物和水。每天监控动物的水合和临床情况。
在各个时间点从大鼠收集0.2 mL血样，允许在室温下30分钟凝固，在13,200 rpm下离心3分钟，将血清转移至eppendorf管并且在-80℃下冷冻贮存。
在静脉内施用后，hu2B5.7和hu2B5.4血清浓度发生抗体一般的双指数式下降。Hu2B5.7和hu2B5.4清除率和分布容量很低，并且半衰期很长；对于2种抗体T1/2：12.4天（表19）。在约10-14天后，数只动物显示出血清hu2B5.7浓度中出乎意外的下降。这些突然下降可能是由于抗药物抗体（ADA）的发展；然而，这并未得到证实。具有可能ADA应答的动物从最终药物代谢动力学计算中略去。
表19：在 4 mg/kg 的静脉内剂量后 hu2B5.7 和 hu2B5.4 在雄性 Sprague-Dawley 大鼠中的主要药物代谢动力学参数
实施例4.4：重组小鼠和人源化 PGE2 抗体的体内功效
如下评估抗PGE2抗体的体内功效。
实施例4.4.1： 在角叉菜胶诱导的足垫水肿模型中小鼠和人源化抗 PGE2 抗体的体内功效
角叉菜胶诱导的足垫水肿是先天性免疫功能的急性啮齿类动物模型。在角叉菜胶诱导的爪水肿模型中评估小鼠抗PGE2抗体2B5-8.0的体内功效。如先前所述类似地执行用角叉菜胶诱导爪炎症（Joseph P. Portanova，等人 J. Exp. Med. 184：883-891（1996））。炎症试剂的真皮内（ID）注射引起在约4小时时达到顶点的嗜中性粒细胞的快速流入和流体水肿，随后为在约48小时时达到顶点的巨噬细胞和单核细胞的流入。C57.BL/6小鼠（8-10周龄，Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME）以5.0 mg/mL（150µg/小鼠）的浓度在后足垫中用30µL PBS（左）或在PBS中的λ-角叉菜胶（Sigma Aldrich，St. Louis，MO）（右）进行ID注射。在基线（时间=0）和角叉菜胶攻击后4小时时，通过Dyer弹簧卡钳型号#310-119测量后足垫厚度。通过在斯氏双尾t检验中对于每个处理组比较平均爪肿胀，测定关于爪厚度的显著差异。小鼠在角叉菜胶攻击前18小时腹膜内（IP）给予抗PGE2抗体（2B5-8.0）的剂量滴定，或攻击前2小时PO给予吲哚美辛。测量的终点是在处理后4小时右和左爪之间爪肿胀（水肿）中的差异。抗PGE2抗体剂量依赖性抑制爪水肿，并且在10 mg/kg下提供最大限度40-50％的爪水肿抑制，可与通过吲哚美辛达到的最大限度抑制比较（表20）。
表20：在 Ab 处理后在小鼠角叉菜胶诱导的足垫水肿中的爪肿胀
实施例4.4.2：在角叉菜胶诱导的痛觉过敏模型中小鼠和人源化抗 PGE2 抗体的体内功效
通过测定角叉菜胶诱导的痛觉过敏评估小鼠抗PGE2抗体2B5-8.0和人源化抗PGE2抗体Hu2B5.7的体内功效。如先前所述类似地执行用角叉菜胶诱导爪炎症（Joseph P. Portanova，等人 J. Exp. Med. 184：883-891（1996））。通过将0.1 ml在无菌盐水（FMC Corp.，Rockland，ME）中的0.1％角叉菜胶溶液注射到200-g雄性Sprague Dawley大鼠（Charles River Laboratories，Portage，ME）的后足垫内诱导痛觉过敏。通过Hargreaves 等人 Pain. 32:77-88（1988））的方法在相同动物中测定针对热刺激的痛觉过敏应答。在注射后的选择时间使后爪暴露于由高强度投影灯泡发出的辐射热。测量其中每只后爪与热源保持接触的时间量测量至最近的0.1 s。痛觉过敏应答表示为在每只动物角叉菜胶和盐水注射的爪之间在潜伏退缩期中的差异。在特定实验中，在角叉菜胶施用前1小时，通过在0.5％Methocel/0.025％Tween 80（Sigma Chemical Co.，St. Louis，MO）中的经口管饲法给大鼠施用吲哚美辛。在角叉菜胶注射前18小时，其他大鼠用小鼠抗PGE2 mAb 2B5-8.0，或人源化抗PGE2抗体Hu2B5.7，或同种型匹配的抗体进行腹膜内注射。
实施例4.4.2：在胶原诱导的关节炎中小鼠抗 PGE2 抗体的体内功效
II型牛胶原（冻干的）得自University of Utah（Salt Lake City，UT）。雄性DBA/J小鼠（8-10周龄，Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME）在尾底部用100 μL乳状液进行皮内免疫接种，所述乳状液含有在0.1 N乙酸中溶解的100 μg II型牛胶原和100 μg热灭活的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）H37Ra（完全弗氏佐剂，Difco，Laurence，KS）。用胶原免疫接种后21天，小鼠用1 mg酵母聚糖A（Sigma，St. Louis，MO）进行IP加强。在加强后，每天就关节炎监控小鼠。通过下述标准给每只爪评分：0 = 正常；1 = 在1个部位，足或踝中肿胀；2 = 在足或踝中肿胀；和3 = 僵硬。对于每只动物总计得分，并且在每个组中所有动物的总平均值表示为MAS。除临床得分外，小鼠还使用Dyer弹簧卡钳型号#310-119就爪水肿进行评估。小鼠在第一次疾病临床体征时24到28天之间加入研究。在实验结束时，收获来自每个组的6只爪，并且贮存于10％中性缓冲福尔马林中用于显微CT和组织学。
显微计算机断层摄影术在Scanco µCT-40部件（Scanco Medical AG）上在60kVp下在160 µA下执行。后爪（贮存于70％乙醇中）在显像管中保护，并且在18µm分辨率下对于从胫骨底部到跗骨/跖骨关节的小鼠踝的1.8-mm切片测量跗骨体积。随后使用Scanco AG µCT Evaluation程序分析原始显微计算机断层摄影术图像。
对于组织病理学分析，使福尔马林固定的爪切片，并且用Gills 3苏木精（Richard-Allan Scientific，Kalamazoo，MI）和曙红与焰红染料（Newcomer Supply，Middleton，MI）染色。使用下述标准组织学评估疾病严重度：0 = 正常；1 = 最低限度改变；2 = 轻度改变；3 = 中度改变；和4 = 重度改变。对于每只动物总计得分，并且总数表示为每个组中的所有动物的平均值。
在小鼠（雄性DBA/1J）胶原诱导的关节炎，一种关于人类风湿性关节炎的标准临床前模型，中评估单独的抗PGE2的疗效。在用牛II型胶原免疫接种后在小鼠发展关节炎疾病体征后起始药物治疗。小鼠就关节炎的临床体征进行视觉评分，并且结果记录为平均关节炎得分（MAS）。随着时间过去监控爪肿胀和MAS，也表示为曲线下面积（AUC）（表21）。在疾病发作后，用抗PGE2 mAb 2B5处理使关于MAS的AUC减少22％。
表21：在抗 PGE2 2B5-8.0 处理后在小鼠 CIA 中的疾病得分、肿胀和骨体积
实施例4.4.2：在佐剂诱导的关节炎中小鼠抗 PGE2 抗体的体内功效
在佐剂诱导的关节炎模型中评估小鼠抗PGE2抗体2B5-8.0的体内功效。如先前所述，通过在矿物油中的乳酪分枝杆菌（Mycobacterium butyricum）（Difco Laboratories，Detroit，MI）的足垫注射在雄性Lewis大鼠（Harlan，Indianapolis，IN）中诱导关节炎。使地塞米松和吲哚美辛（Sigma Chemical Co.）悬浮于Methocel/Tween中，并且通过管饲法分别以0.1和2 mg/kg的剂量每天施用2次。2B5-8.0和同种型对照通过腹膜内注射以10 mg/kg的剂量每天进行施用。处理在佐剂注射后第15天时起始，并且继续直至在第21天时未注射的对侧爪的爪体积最终评估时。就外周关节中关节炎的目视现象仔细地每周检查2次小鼠，并且测定关于疾病活性的评分。
通过援引并入
可能在本申请自始至终引用的所有引用的参考文献（包括文献参考、专利、专利申请和网站）的内容都在此明确地整体通过援引并入，其中引用的参考文献也如此。除非另外指出，本发明的实践将采用本领域众所周知的免疫学、分子生物学和细胞生物学常规技术。
等同方案
本发明在不背离其精神或基本特征的情况下可以以其他具体形式具体化。前述实施方案因此在所有方面被视为是示例性的，而不是限制此处所述的本发明。本发明的范围因而由所附的权利要求而不是由前述说明书指出，且在权利要求的等价含义和范围内的所有改变因而预期包含在其中。
序列表
<110> ABBOTT LABORATORIES
<120> 前列腺素E2结合蛋白及其用途
<130> 9263.WO.01
<140> PCT/US2009/049953
<141> 2009-07-08
<150> 61/197,258
<151> 2008-10-23
<150> 61/134,264
<151> 2008-07-08
<160> 81
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Phe Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 2
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
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Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
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<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
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Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 4
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 5
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Leu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Cys Met Asn Pro Thr Thr Gly Lys Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Thr Ile Ala Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Gly Tyr Ser Pro Gly Tyr Gly Val Ala Tyr Ala Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 6
Asn Tyr Asp Ile Asn
1 5
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 7
Cys Met Asn Pro Thr Thr Gly Lys Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 8
Gly Arg Gly Tyr Ser Pro Gly Tyr Gly Val Ala Tyr Ala Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 9
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 9
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Ser Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Pro Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
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<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 10
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 11
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 12
Gln Gln Ser Tyr Ser Pro Pro Pro Thr
1 5
<210> 13
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Thr Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Glu Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met
35 40 45
Gly Cys Ile Ser Pro Tyr Asn Gly Lys Leu His Tyr Ala Gln Glu Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Gly Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Gly Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Phe Ser Phe Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Val
100 105 110
Thr Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 14
Glu Tyr Gly Ile Ser
1 5
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 15
Cys Ile Ser Pro Tyr Asn Gly Lys Leu His Tyr Ala Gln Glu Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 16
Gly Gly Phe Ser Phe Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Val Thr Asp
1 5 10 15
His
<210> 17
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 17
Asp Ile Arg Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Thr Thr Pro Phe
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 18
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 19
Ala Ala Ser Lys Leu Gln Ser
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 20
Gln Gln Ser Asp Thr Thr Pro Phe Thr
1 5
<210> 21
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met
35 40 45
Gly Cys Ile Ser Pro Tyr Asn Gly Lys Leu His Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Leu Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Phe Ser Ser Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Val
100 105 110
Thr Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 22
Cys Ile Ser Pro Tyr Asn Gly Lys Leu His Tyr Ala Gln Lys Phe Leu
1 5 10 15
Gly
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 23
Gly Gly Phe Ser Ser Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Val Thr Asp
1 5 10 15
His
<210> 24
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 24
Asp Ile Arg Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Ser Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Pro Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 25
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Thr Ser Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Pro Gly Phe
50 55 60
Leu Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Leu Ser Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser His Thr Arg Pro Gly Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 26
Thr Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 27
Trp Ile Asp Thr Ser Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Pro Gly Phe Leu
1 5 10 15
Gly
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 28
Ser Ser His Thr Arg Pro Gly Asp Phe
1 5
<210> 29
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 29
Gln Ser Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Glu Ser Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Arg Gly Asn Ser Asp Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Arg Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gly Ala Cys Asp Gly Arg Leu
85 90 95
Ser Gly Leu Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 30
Ser Gly Ser Glu Ser Asn Val Gly Thr Asn Ser Val Asn
1 5 10
<210> 31
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 31
Gly Asn Ser Asp Arg Pro
1 5
<210> 32
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 32
Gly Ala Cys Asp Gly Arg Leu Ser Gly Leu Tyr Val
1 5 10
<210> 33
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 33
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Gly Thr Ser Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Asn Thr Ala His
65 70 75 80
Leu Gln Ile Tyr Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Leu Thr Arg Pro Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 34
Trp Ile Gly Thr Ser Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe Thr
1 5 10 15
Gly
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 35
Ser Ser Leu Thr Arg Pro Ala Asp Tyr
1 5
<210> 36
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 36
Gln Ser Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Phe Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Phe Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Cys Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Ala Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 37
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 37
Phe Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His
1 5 10
<210> 38
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 38
Gly Asn Asn Asn Arg Pro
1 5
<210> 39
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 39
Gln Ser Cys Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ala Val
1 5 10
<210> 40
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 40
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ala
115
<210> 41
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 41
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Thr Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Val
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 42
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 42
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ala
115
<210> 43
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 43
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Thr Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Val
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 44
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 44
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Tyr Gly Asp Tyr Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ala
115
<210> 45
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 45
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Thr Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Val
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 46
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 46
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 47
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 47
Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 48
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 48
Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 49
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 49
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
1 5 10
<210> 50
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 50
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys
20
<210> 51
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 51
Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 52
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 52
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr Leu
1 5 10 15
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 53
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 53
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
1 5 10
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 54
Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr Trp Leu Gly
1 5 10
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 55
Asp Ile Tyr Pro Gly Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 56
Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr
1 5
<210> 57
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 57
Thr Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 58
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
1 5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 59
Phe Gln Val Ser His Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 60
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 60
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 61
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 61
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Thr Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Val
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 62
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 62
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 63
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 63
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Thr Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Val
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 64
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 64
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 65
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 65
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Thr Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Val
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 66
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 67
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 67
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Thr Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Val
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 68
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 68
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 69
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 69
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Thr Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Val
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 70
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 70
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 71
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 71
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Thr Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Val
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 72
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 72
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 73
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 73
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Thr Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Val
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 74
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 74
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 75
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 75
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Thr Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Val
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 76
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 76
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 77
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 77
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Thr Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Val
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 78
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 78
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 79
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 79
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Thr Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Val
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 80
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 80
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 81
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 81
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Thr Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Val
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (32)

1.一种包括抗原结合结构域的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够结合前列腺素E2，其中所述抗原结合结构域包括互补性决定区（CDR）序列：
和，其中所述结合蛋白不是抗体2B5。
2.权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够
（a）调节前列腺素E2的生物学功能；
（b）中和前列腺素E2；
（c）阻止前列腺素E2与选自EP1、EP2、EP3或EP4受体的前列腺素E2受体结合；和/或
（d）抑制通过前列腺素E2结合EP4受体诱导的钙流入，其中IC50为约1x10-6 - 约1x10-7 M、约1x10-7 - 约1x10-8 M、约1x10-8 - 约1x10-9 M、约10-9 - 约1x10-10 M、约1x10-10 - 约1x10-11 M或约1x10-11 - 约1x10-12 M，如在EP4受体介导的FLIPR测定中所测量的。
3.权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白已经亲和力成熟。
4.权利要求1的结合蛋白，其进一步包括人受体构架。
5.权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白是结晶结合蛋白。
6.权利要求5的结合蛋白，其中所述结晶结合蛋白是无载体的药学控释结晶结合蛋白。
7.一种包括权利要求1的结合蛋白的抗体构建体，所述抗体构建体进一步包括接头多肽和/或免疫球蛋白恒定结构域。
8.权利要求7的抗体构建体，其中所述抗体构建体包含免疫球蛋白分子、二硫化物连接的Fv、单克隆抗体、scFv、嵌合抗体、单结构域抗体、CDR移植的抗体、双抗体、人源化抗体、多特异性抗体、Fab、双重特异性抗体、Fab’、 双特异性抗体、F（ab’）2和/或Fv。
9.权利要求7的抗体构建体，其中所述抗体构建体包括：人IgM重链恒定结构域、人IgG4重链恒定结构域、人IgG1重链恒定结构域、人IgE重链恒定结构域、人IgG2重链恒定结构域、人IgG3重链恒定结构域和/或人IgA重链恒定结构域。
10.权利要求7的抗体构建体，其中所述抗体构建体包括SEQ ID NOs：1，2，3或4的免疫球蛋白恒定结构域。
11.权利要求7的抗体构建体，其中
（a）所述抗体构建体具有人糖基化模式；
（b）权利要求7的所述抗体构建体是结晶抗体构建体；
（c）（b）的所述结晶抗体构建体是无载体的药学控释结晶抗体构建体；
（d）（c）的所述无载体的药学控释结晶抗体构建体具有比所述抗体构建体的可溶性对应物更长的体内半衰期；或
（e）（a）-（d）任一项的所述抗体构建体保留生物学活性。
12.一种包括权利要求7的抗体构建体的抗体缀合物，所述抗体缀合物进一步包括：免疫粘附分子、显像剂、治疗剂或细胞毒性剂。
13.权利要求12的抗体缀合物，其中所述显像剂是放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记或生物素。
14.权利要求13的抗体缀合物，其中所述放射性标记为3H、14C、 35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm。
15.权利要求12的抗体缀合物，其中所述治疗或细胞毒性剂为抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类、毒素或细胞凋亡剂。
16.一种包括抗原结合结构域的结合蛋白，所述结合蛋白能够结合前列腺素E2，所述抗原结合结构域包括选自下述的VH和VL区：
a) SEQ ID NOs: 40和41；
b) SEQ ID NOs: 42和43；和
c) SEQ ID NOs: 44和45。
17.一种包括抗原结合结构域的人源化结合蛋白，所述结合蛋白能够结合前列腺素E2，且所述抗原结合结构域包括CDR序列SEQ ID NOs：54，55，56，57，58和59。
18.一种与前列腺素E2结合的人源化结合蛋白或其片段，所述人源化结合蛋白包括选自下述的VH和VL区：
a) SEQ ID NOs: 60和61；
b) SEQ ID NOs: 62和63；
c) SEQ ID NOs: 64和65；
d) SEQ ID NOs: 66和67；
e) SEQ ID NOs: 68和69；
f) SEQ ID NOs: 70和71；
g) SEQ ID NOs: 72和73；
h) SEQ ID NOs: 74和75；
i) SEQ ID NOs: 76和77；
j) SEQ ID NOs: 78和79；
k) SEQ ID NOs: 78和81；
l) SEQ ID NOs: 80和79；和
m) SEQ ID NOs: 80和81。
19.一种分离的核酸，其编码权利要求1-4任一项的结合蛋白或权利要求7-11任一项的抗体构建体。
20.一种载体，其包括根据权利要求19的分离的核酸。
21.权利要求20的载体，其中所述载体为pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pBJ或pA2。
22.一种宿主细胞，其包括权利要求21的载体，其中所述宿主细胞选自原核细胞、大肠杆菌、真核细胞、原生生物细胞、动物细胞、植物细胞、真菌细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、昆虫细胞、CHO细胞、COS细胞、HEK293细胞、酵母细胞、酿酒酵母细胞和昆虫Sf9细胞。
23.一种生产能够结合前列腺素E2的蛋白质的方法，所述方法包括在足以生产能够结合前列腺素E2的结合蛋白的条件下，在培养基中培养权利要求22的宿主细胞的步骤。
24.一种用于释放结合蛋白的组合物，所述组合物包括：
（a）制剂，其中所述制剂包括权利要求5的结晶结合蛋白或权利要求11的结晶抗体构建体；
（b）成分，其中所述成分为白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇或聚乙二醇；和
（c）至少一种聚合载体，其中所述聚合载体是：聚丙烯酸、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基酸、聚酐、聚羧酚酸肽、聚酯、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚b-羟基丁酸酯、聚己内酯、聚二氧杂环己酮、聚乙二醇、聚（羟丙基）甲基丙烯酰胺、聚有机磷腈、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、马来酐-烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、白蛋白、藻酸酯、纤维素、纤维素衍生物、胶原、纤维蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖、或其掺合物和/或共聚物。
25.权利要求24的组合物在制备用于治疗具有其中前列腺素E2活性是有害的病症的哺乳动物的药物中的用途，其中所述病症是炎性病症或疼痛病症。
26.一种药物组合物，其包括权利要求1-5任一项的结合蛋白、权利要求7-11任一项的抗体构建体或权利要求12-15任一项的抗体缀合物和药学可接受的载体。
27.权利要求26的药物组合物，其中所述药学可接受的载体充当用于增加吸收或分散的佐剂，其中所述佐剂是透明质酸酶。
28.权利要求27的药物组合物，其进一步包括至少一种另外的治疗试剂，所述另外的试剂选自显像剂、细胞毒性剂、血管发生抑制剂、激酶抑制剂、共刺激分子阻断剂、粘附分子阻断剂、抗细胞因子抗体或其功能片段、氨甲蝶呤、环孢菌素、雷帕霉素、FK506、可检测标记或报道分子、TNF拮抗剂、抗风湿剂、肌肉弛缓剂、麻醉药、非类固醇消炎药（NSAID）、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗微生物剂、抗牛皮癣剂、皮质类固醇、促蛋白质合成类固醇、促红细胞生成素、免疫接种、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁药、抗精神病药、刺激剂、哮喘药物治疗、β激动剂、吸入类固醇、经口类固醇、肾上腺素或其类似物、细胞因子、或细胞因子拮抗剂。
29.权利要求26的药物组合物用于制备用于减少患有其中前列腺素E2活性是有害的病症的人受试者中的前列腺素E2活性的药物的用途，其中所述病症是炎性病症或疼痛病症。
30.权利要求1-5任一项的结合蛋白、权利要求7-11任一项的抗体构建体或权利要求12-15任一项的抗体缀合物在制备用于就其中前列腺素E2活性是有害的至少一种病症治疗受试者的药物中的用途，其中所述病症是炎性病症或疼痛病症。
31.权利要求30的用途，其中所述病症为水肿、类风湿性关节炎、变应性关节炎、骨关节炎、青少年慢性关节炎、强直性脊柱炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、关节病、脊椎关节病、滑膜炎、血管炎、脊髓炎、结膜炎、动脉炎、全身性红斑狼疮、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、甲状腺炎、哮喘、变应性疾病、牛皮癣、皮炎硬皮病、肉状瘤病、Kawasaki氏病、韦格纳氏肉芽肿病、过敏性紫癜、肝炎、葡萄膜炎、结节性多动脉炎、风湿热、Reiter氏病、疼痛、与骨关节炎相关的疼痛、急性疼痛和慢性疼痛。
32.根据权利要求30的用途，其中所述结合蛋白或抗体构建体被配制为用于肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、盆腔内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、快速浓注、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内和/或经皮施用。
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