TW201014602A - Prostaglandin E2 binding proteins and uses thereof - Google Patents

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TW201014602A
TW201014602A TW098123109A TW98123109A TW201014602A TW 201014602 A TW201014602 A TW 201014602A TW 098123109 A TW098123109 A TW 098123109A TW 98123109 A TW98123109 A TW 98123109A TW 201014602 A TW201014602 A TW 201014602A
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Jijie Gu
Charles W Hutchins
rong-rong Zhu
Jianwei Shen
Maria C Harris
Eileen Belanger
Anwar Murtaza
Edit Tarcsa
William B Stine
Chung Ming Hsieh
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Abbott Lab
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Description

201014602 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於結合蛋白及其組合物’例如對諸如前列腺 素E2(PGEZ)之脂質代謝物具特異性之抗體及抗原結合部 分，及其製備方法、表徵方法及在預防、診斷及治療疾病 中之使用方法。 本申請案為主張2008年7月8曰申請之美國臨時申請案第 61/134,264號及2〇08年10月23曰申請之美國臨時申請案第 61/197,258號之優先權的非臨時申請案，該等申請案之内 容以引用的方式併入本文中。 【先前技術】 諸如前列腺素（PG)、凝血脂素（TX)、白三烯（LT)及神經 鞘胺醇-1 -磷酸酯之生物活性脂質在各種病症之病源學中起 關鍵生理學作用。（Wymann，MP 及 Schneiter R, Nat. Rev.
Mol. Cell. Biol· 9(2):162-76 (2008))。在發炎期間，細胞 磷脂酶（尤其磷脂酶A2及C)被活化且將細胞膜磷脂降解為 花生四烯酸（AA)。AA藉由兩種主要途徑環加氧酶（COX)及 脂質加氧酶（LO)路徑代謝。COX路徑產生前列腺素 (PGD2、PGE2、PGF2a、前列環素或PGI2，及凝血脂素A2 或TXA2)。LO路徑具有兩個分支；5-LO路徑產生白三烯 (例如 LTA4、LTB4、LTC4、LTD4、LTE4及 LTF4)且 15-LO 路徑產生脂氧素（例如LXA4、LXB4)。諸如前列腺素 (PG)、凝血脂素（TX)及白三烯（LT)之前列腺素類化合物具 有各種生理學活性以在體内保持局部内穩定（The 141568.doc 201014602
Pharmacological Basis of Therapeutics，Gilman等人編，第 7 版，第 660 頁，Macmillan Publishing Co” New York (1985))。COX、PG G2/PG H2之產物藉由組織特異性異構 酶的作用轉化成特異性PG，從而產生PGI2、TXA2、 PGD2、PGE2及PGF2a。PG之生物功能由組織特異性細胞表 面視紫質樣七次跨膜G蛋白偶合受體（GPCR)介導。各PG之 精確生理學/病理學作用由細胞環境（cellular context)、受 體表現概況、配位體親和力及與信號轉導路徑之差異偶合 確定（Haluska 等人，Annu. Rev. Pharm. Tox. 10:213 (1989) ; Prostanoids and their Receptors. In Comprehensive Medicinal Chemistry，第 643 頁，Pergamon Press, Oxford (1990) )。PG—般在血管舒縮運動性調節、睡/醒週期、腸 分泌、脂肪分解、腎小球過濾、肥大細胞去顆粒、神經傳 遞、血小板凝集、黃體分解、子宮肌層收縮及分娩、發炎 及關節炎、開放性動脈導管、細胞生長及分化，及免疫反 φ 應之調控中起多種生理學作用。在病理生理學方面，PG亦 在包括疼痛及發炎、癌症、神經疾病、心血管疾病及高血 . 壓之多種疾病中涉及。 前列腺素E2(PGE2)為前列腺素類化合物家族之成員。 PGE2廣泛參與胃腸道收縮及鬆弛、胃酸分泌、平滑肌鬆弛 及神經傳遞質釋放。已鑑別出pge2之四種次型之受體，包 括 EP1、EP2、EP3 及 EP4(Negishi，Μ.等人，J. Lipid Mediators Cell Signalling，12:379-391 (1995))，其各自涉 及於不同信號轉導路徑中。 141568.doc 201014602 PGE2為AA代謝之COX路徑的主要產物。其為關節中合 成之主要PG且在發炎及關節炎之發病機制中起重要作用。 已鑑別出 5種 PGE2合成酶。（8111^111^1^，八111.1.?1^31〇1· 263(2 Pt 2):F 181-91 (1992))。在此等五種合成酶中，膜 PGE合成酶（mPGES)-l似乎為負責PGE2產生之關鍵PGE2轉 化酶。MPGES-1呈現相對於其他PGE合成酶之最高催化活 性且與COX-1及/或COX-2結合發揮作用將PGH2轉化為 PGE2。使用 mPGES-1 KO 小鼠（Kamei，D·等人，J. Biol. Chem.，279(32):33684-95 (2004) ; Trebino，C.E.等人， Proc. Natl. Acad· Sci. USA 100(15):9044-9 (2003))、特異 性PGE2受體同功異型物KO小鼠（McCoy，J.M.等人，J. Clin. Invest., 1 10(5):651-8 (2002) ; Majima，M.等人，Trends Pharmacol. Sci.，24(10):524-9 (2003);及 Amano，H.等人， J. Exp. Med.，197(2):221-32 (2003))及抗PGE2特異性抗體 (Portanova，J.P.等人，J. Exp. Med.， 184(3):883-91 (1996) ; Zhang, Y.等人，J. Pharmacol. Exp. Ther., 283(3): 1069-75( 1997))進行之研究表明PGE2在類風濕性關 節炎（RA)、疼痛及發炎及癌症發展的動物模型中起重要作 用。在不存在mPGES-1之狀況下，COX-1、COX-2及其他 PGE2合成酶之含量保持相對不變。mPGES-1 KO小鼠相較 於野生型小鼠而言有活力、能生育且正常發育。然而，其 在以各種發炎刺激物挑戰後呈現PGE2之基礎產生量以及 PGEz自巨噬細胞之產生的急劇降低。此外，TXA2之產生 增加。mPGES-1 KO小鼠顯示降低之發病率及關節炎發展 141568.doc -6 - 201014602 2嚴重程度’且在不同模型中顯示對疼痛及發炎的抗性。 若，實驗室已獨立產生不同Ep受體同功異型物&〇小鼠。 此等】、乳有活力、能生育且正常發育。使用特異性Ep同功 異型物κο小鼠進行之研究證明pGE2的各種功能係經特異 !·生EP同功異型物介導。舉例而言，缺乏同功異型物明 顯衫響小鼠之關節炎發展的嚴重程度，而缺乏EP3藉由調 節基質細胞的VEGF產生及血管生成來影響腫瘤發展及進 展。 現咸信前列腺素之生物合成及代謝中之缺陷在自體免疫 及發炎病症之病源學中起重要作用。舉例而言，來自羅患 類風濕性關節炎之患者的滑膜組織相較於來自未受影響個 體之滑膜組織產生較大量的pGE2及前列腺素F2a(pGF2a) (Blotman，F.等人’ Rev. Rhum Mal. 〇ste〇artic，46(4):243_ 7 (1979))。類似地，展現繼發於食物不耐之全身及腸胃症 狀之患者中出現PGE2及PGFh的合成增加。因此，繼發於 〇 某些食物攝取後之偏頭痛可能為2系列前列腺素之合成增 加的結果。多發性硬化症亦與前列腺素pGEi& pGE2之正 常含里的不平衡有關。生殖的多個方面（例如生育、妊娠 及分挽）可受前列腺素調控。前列腺素在生殖生理學中亦 起重要作用。過量前列腺素合成引起痛經及分娩，其可藉 由靜脈内投與前列腺素或藉由插入前列腺素子宮托誘發。 (Wang L.等人，〇ccup Environ· Med. 61(12):1021-1026 (2004))。PGE2過量合成亦在諸如不孕症、反覆流產、先 死驚厥及驚厥之生殖病症中起重要作用。因此，對阻斷或 141568.doc 201014602 調節pge2之生物功能的對pge2具特異性之抗體存在需 要，其可用於預防及治療與過量產生pge2有關之疾病以及 用於診斷目的。 高特異性、高親和力（KD為約300 pM)之抗PGE2 mAb、 2B5之產生業已報導過（Mnich SJ #A，J.Immunol. 15 5(9):443 7-44 (1995))。在小鼠中之疼痛及發炎及大鼠中 佐劑誘發之關節炎的動物模型中測定2B5相對於COX-l，2 抑制劑β弓丨n朵美辛（indomethacin)之功效。（Portanova JP等 人，J. Exp，Med. 184(3):883-91 (1996))。此等研究明顯顯 示2B5在減輕疼痛及發炎以及關節炎嚴重程度方面與吲哚 美辛一樣有效，推論在此等動物模型中PGE2為AA代謝之 COX-1，2路徑的關鍵參與者。 用COX抑制劑抑制pan-PG產生已成為幾十年來充分確認 之治療策略。已知COX之兩種同功異型物c〇X-l及COX-2’其各自由不同基因編碼。兩種同功異型物執行基本上 相门之催化反應且具有類似三級結構（Garavito RM等人，
Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32:183-206 (2003))。 COX-1幾乎在所有組織中會組成性地表現且咸信主要負責 正常「管家」功能，諸如胃細胞保護及内穩定。相反地， COX-2則會組成性地表現於特定組織中，且在發炎及癌症 部位會高度地誘導出來。因此，認為COX-2介導之PG產生 在發炎及癌症部位扮演重要的作用。慣用非類固醇消炎藥 (NSAID)(例如阿司匹靈（aspirin)、吲哚美辛、布洛芬 (ibuProfen))抑制此兩種COX同功異型物。此等化合物為疼 141568.doc 201014602 痛、類風濕性關節炎（RA)、骨關節炎（OA)及心企管疾病的 最廣泛使用之藥物，而現在考慮用以預防結腸癌及AD。 慣用NSAID之主要不利條件為高風險人群中之胃及腎不良 事件，咸信其係由抑制COX-1引起。因此，咸信第二代 NSAID(COX-2選擇性抑制劑，例如赛利克西（celecoxib)、 西樂操（Celebrex);羅非考昔（rofecoxib)、萬絡（Vioxx); 伐地考昔（valdecoxib)、貝曲（Bextra))具有更佳治療概況。 此假定已導致其廣泛用於疼痛、RA及OA。自從在1999年 核准第一種COX-2抑制劑以來，2004年COX-2抑制劑的總 銷售額為約五十億美元。然而，最近一些COX-2選擇性抑 制劑由於某些COX-2抑制劑在高風險患者中的心血管副作 用而撤離市場，且正受FDA審查。可能由於COX抑制劑抑 制所有PG之能力且尤其由於COX抑制劑差別干擾PGI2及 TXA2(此兩者皆在保持心血管内穩定中起重要作用）產生之 能力而產生與COX抑制劑相關之不利條件（Martinez- ® Gonzalez J·等人，Curr. Pharm· Des. 13(22):2215-2227 (2007))。抑制COX可使更多AA可用於LO路徑，因此增加 -可能造成與COX抑制相關之不良影響的白三烯及脂氧素之 產生。使用COX-1及/或COX-2基因剔除小鼠及COX-1及 COX-2特異性抑制劑進行的新近研究亦表明’關於兩種 COX同功異型物之生理學作用的假定不正確。（Loftin, C.D.等人 ’ Prostaglandins Other Lipid Mediat. 68-69:177-85 (2〇〇2))。此等研究表明COX-1及COX-2在供應PG以保 持組鐵内穩定中皆有重要作用’且兩種同功異型物皆可造 141568.doc 201014602 成諸如疼痛、發炎及癌症之疾病發展。因此，以特異性抗 體阻斷COX-1及COX-2路徑下游之有害PGE2似乎為治療某 些人類疾病之有吸引力的方法。 重要生物活性前列腺素之另一實例為PGD2。PGD2為肥 大細胞在免疫挑戰時產生之花生四烯酸的主要環加氧酶產 物（Lewis等人，J· Immunol. 129:1 627-163 1 (1982))。活化 肥大細胞（PGD2之主要來源）為在諸如哮喘、過敏性鼻炎、 過敏性結膜炎、過敏性皮膚炎及其他疾病之病狀中驅動過 敏性反應之一種關鍵作用者（Brightling等人，Clin. Exp. Allergy 33:550-556 (2003))。新近研究已顯示PGD2經在多 種人類組織中表現之兩種不同G蛋白偶合受體（GPCR)D-前 列腺素類化合物受體（DP)及第2型輔助T細胞（CRTH2)上表 現之化學引誘劑受體同源分子發揮其作用。PGD2/CRTH2 系統介導嗜伊紅血球、嗜鹼性細胞及Th2細胞之趨化性， 其牽涉於過敏性發炎之誘發中（Ulven T等人，<：111*1\1'〇?· Med. Chem. 6(13):1427-1444 (2006))。PGD2之許多作用係 經由其對表現於上皮及平滑肌上之G蛋白偶合受體D型前 列腺素（「DP」）受體的作用介導。在哮喘中，長期以來已 公認呼吸上皮為驅使疾病進展之發炎性細胞激素及趨化因 子之關鍵來源（Holgate 等人，Am. J· Respir. Crit. Care Med. 162:113-117 (2000))。在哮喘之實驗鼠類模型中，氣 管上皮上之DP受體在抗原挑戰時顯著上調（Matsuoka等 人，Science 287:2013-2017 (2000))。DP 受體牽涉於人類 過敏性鼻炎中，其係特徵為打喷嚏、瘙癢、鼻出血及鼻充 141568.doc -10- 201014602 血之症狀的常見過敏性疾病。已顯示DP拮抗劑有效緩解多 種物種之過敏性鼻炎症狀，且更特定言之已顯示抑制抗原 誘發之鼻充血（過敏性鼻炎之最明顯症狀）（J〇nes等人，Am. J. Resp. Crit. Care Med. 167:A218 (2003) ; Arimura等人， S-5751. J. Pharmacol. Exp. Ther. 298(2):411-9 (2001))。DP 拮抗劑在過敏性結膜炎及過敏性皮膚炎之實驗模型中亦有 效（Arimura 等人，S-5751. J. Pharmacol. Exp· Ther. 298(2):411-9 (2001); Torisu等人，Bioorg. & Med. Chem. 12:5361-5378 (2004))。因此，亦需要對PGD2具特異性且 阻斷或調節其生物功能，且因此可用於預防及治療與 PGD2過度表現有關之疾病之受體。 神經鞘胺醇-1-磷酸酯（S1P)為誘發許多細胞效應之生物 活性脂質的另一實例，包括導致血小板凝集、細胞增殖、 細胞形態、腫瘤細胞侵入、内皮細胞趨化性及内皮細胞活 體外血管生成之彼等效應。因此，S 1P受體為諸如傷口癒 φ 合及腫瘤生長抑制之治療應用的良好目標。S1P部分經由 一組名為S1P1、S1P2、S1P3、S1P4及S1P5(原名分別為 EDG-1、EDG-5、EDG-3、EDG-6及 EDG-8)之 G蛋白偶合受 體向細胞傳導信號。此等受體與結構上相關之溶血磷脂酸 (LPA)的三種其他受體（LPA1、LPA2及LPA3(原名為EDG-2、EDG-4及EDG-7))共有50-5 5%胺基酸及叢集一致性。 (Ishii, I.等人，Mol. Pharmacol. 58(5):895-902 (2000))。在 G蛋白偶合受體（GPCR)中，當配位體與彼受體結合時誘發 構形改變，從而導致相關G蛋白之α次單元上的GDP置換為 141568.doc 11 201014602 GTP且隨後使G蛋白釋放至細胞質中β α次單元隨後自叶次 單元解離且各次單元可隨後與效應蛋白締合，該等效應蛋 白使第二信使活化而產生細胞反應。最終〇蛋白上之
被水解成GDP，且G蛋白之次單元再次彼此締合且隨後與 受體締合。擴增對一般GPCR途徑具有重要作用。一配位 體與一受體結合導致許多〇蛋白活化，其各自能夠與許多 效應蛋白締合，導致擴增之細胞反應。由於個別受體皆為 組織特異性與反應特異性受體，因此Slp受體成為良好藥 物目標。由於開發對一種受體具有選擇性之促效劑或拮抗 劑使細胞反應侷限於含彼受體之組織從而限制不當^作 用，因此S1P受體之組織特異性係重要的。由於sip受體之 反應特異性允許開發出在不影響其他反應之狀况下啟始或 抑制某些細胞反應之促效劑或拮抗劑，因此其亦係重要 的。舉例而言，Slp受體之反應特異性可允許啟始金小板 凝集而不影響細胞形態的S1P模擬。
S1P以神經稍胺醇之代謝物形式在神經勒胺醇與神經与 胺醇激酶之反應中形成且大㈣存於存在高含量神經勒月 醇激酶以存在神_胺醇解離酶之血小板凝集物中, Slp在血小板凝集期間釋放，積聚於血清h亦存在於； ^腹水中。S1P生物降解最可能經由胞外磷酸水解酶（尤j rd1勒㈣酸水解酶）水解而進行。因此需《 接一、’、挫以供藉由阻斷其與受體相互作用或穩定S1PJ =二物效應來調節其生物功能之抗趙，用於預防❹ 體免疫疾病、發炎性疾病及癌症。 141568.doc •12· 201014602 由於PGE2在多種人類病症中之作用，已設計出治療策 略來抑制或抵抗PGE2活性。詳言之，尚未報導適於傳遞 至人類之結合及中和PGE2的治療抗體。此項技術中對能 夠結合及中和PGE2的改良抗體存在需要。 【發明内容】 本發明係關於對諸如前列腺素E2(PGE2)之脂質代謝物具 特異性之結合蛋白。本發明之PGE2結合蛋白包括（但不限 於）能夠結合PGE2之抗體、抗原結合片段及具有各種骨架 之抗原結合片段。 本發明之一態樣係關於能夠結合pge2之結合蛋白。在一 實施例中，本發明之結合蛋白具有中和、穩定、拮抗及/ 或促效活性。在另一實施例中，結合蛋白能夠調節PGE2之 生物功能。舉例而言，結合蛋白能夠至少部分中和PGE2。 在本發明之一態樣中，結合蛋白能夠結合pge2且防止 PGE2與一或多個PGE2受體（例如EP1、EP2、EP3及EP4)結 合。在本發明之一實施例中，結合蛋白能夠結合PGE2且防 止PGE2與EP1、EP2、EP3及EP4受體結合。 本發明提供pge2結合蛋白之製備、表徵方法及使用 pge2結合蛋白作為單獨療法或與其他治療劑一起作為組合 療法之方法；及預防及/或治療由PGE2介導之疾病的方 法，例如自體免疫及發炎性疾病，諸如類風濕性關節炎、 克隆氏病（Crohn's disease)、骨關節炎、AMD、淋巴腺 病、溶血性貧血、紫癜、關節黏連性脊椎炎、多發性硬化 症、糖尿病、癌症、疼痛、骨質流失/復原、動脈粥樣硬 141568.doc -13 - 201014602 化疾病、生殖病症及其他疾病。本發明之結合蛋白亦可用 於診斷該等疾病。 在本發明之一實施例中，結合蛋白為結合pGE2之經分離 抗體或其抗原結合片段。可在基於經生物素標記之 ELISA之檢定中以選自由以下組成之群的證明該結 口 .約 1 X 1 〇 6 至約 1 χ i 〇-7 M、約 i χ i 〇.7 至約 ^ ^ 〇_8 μ、約 1 χ 1 〇至約1 X 1 0 9 Μ、約丨〇-9至約i 〇.丨〇 Μ、約1 χ 1 〇至約 1x10 Μ及約10-11至約10-12Μβ在另一實施例中，在基於 經Η標記之pGE2的放射免疫檢定中以選自由以下組成之群 的KD證明結合蛋白與Ρ(3Ε2之結合：約ΐχ1〇_6至約ΐχΐ〇_7 Μ、約 1x10 7至約 lxl〇-8 Μ、約 lxl〇-8至約 1χ1〇-9 Μ、約 1〇-9 至約 10 0 Μ、約 lxio·10至約 1 χΐ〇-" Μ及約 ίο-11 至約 1〇-12。 在另一實施例中，在經PGE2受體ΕΡ4介導之PGE2誘發鈣流 入受結合蛋白與PGE2結合抑制的FLIPR中以選自由以下組 成之群的ICso證明結合蛋白與pge2之結合：約ixi〇_6至約 lxl(T7 Μ、約 ΐχίο’7 至約 1χ10·8 M '約 1χ1〇-8 至約 1χ1〇·9 Μ、約 ΙΟ·9至約 10·ι〇 Μ、約 1χ1〇·1〇至約 1χ1〇·η Μ及約 1〇·η 至約1〇-12。 在一實施例中，在基於FACS之受體結合檢定中抗體以 以下ICsq抑制經生物素標記之pGE2與細胞表面上EP1、 EP2、EP3及/或EP4受體之結合，或在基於ELISA之受體結 合檢定中抗體以以下IC5〇抑制經生物素標記之pge2與使用 受體表現細胞製備之膜製劑上EP1、EP2、EP3及/或EP4受 體的結合：約ΙχΙΟ·6至約1χ1〇-7 Μ、約lxlO·7至約lxl〇-8 141568.doc -14- 201014602 Μ、約 lxlO·8至約 lxl〇_9 Μ、約 1〇·9至約 1〇-ι〇Μ、約 1χ1〇-ι〇 至約lxlO·11 Μ及約ΙΟ·11至約10“2，或在基於3h Pge2之放 射免疫檢定中抗體以以下IC5〇抑制3H-PGE2與細胞表面或 膜製劑上EP1、EP2、EP3及/或EP4受體之結合：約1 xlO-6 至約 lxlO·7 Μ、約 lxlO-7 至約 1χΐ〇-8 μ、約 lxlO-8 至約 lxlO9 Μ、約 ΙΟ·9 至約1(Γ1()Μ、約 ixi〇-10 至約 ΐχίο·11 μ 及 約10·11至約1〇_12 ’及/或在ΕΡ4介導之flIPR檢定中抗體以 以下IC5〇抑制PGE2誘發之妈通量：約lxi〇·6至約ixi〇·7 μ、 約 lxlO·7 至約 lxlO·8 Μ、約 lxlO·8 至約 lxl0-9 M、約 1〇-9 至 約 10_1()M、約 lxlO·10至約 1χ1〇·" Μ及約 10·11至約 1〇·12 Μ。 在一實施例中，抗體或其抗原結合片段結合PGE2且在基於 細胞表面之受體結合檢定或在基於放射免疫檢定之受體結 合檢定中在100 nM之濃度下抑制PGE2與其至少一種受體 的結合達約70-100%。 在一實施例中，抗體為19C9、4F10、15F10、K1B、 K7H、K3A、Lll、L21、2B5-7.0、2B5-8.0 或 2B5-9.0 或其 變異體。在一實施例中，變異體為人類化變異體，諸如 Hu2B5.Pl 或 Hu2B5.P2。 在另一態樣中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片 段，其結合PGE2且在角又菜膠誘發之齧齒動物爪水腫模型 中抑制爪水腫達約10%、20%、30%、40%、50%、60%、 70%、80%、90%或100%。在一特定實施例中，在角叉菜 膠誘發之齧齒動物爪水腫模型中抗體抑制爪水腫超過約 10%。 141568.doc •15- 201014602 在另一態樣中’本發明提供經分離抗體或其抗原結合片 段’其結合PGE2且在齧齒動物之膠原蛋白誘發之關節炎模 型中抑制爪腫脹或平均關節炎計分達約10%、20%、 30〇/〇、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%。在一 特定實施例中，在齧齒動物之膠原蛋白誘發之關節炎模型 中抗體抑制爪腫脹或平均關節炎計分超過1〇〇/0。 在另一態樣中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片 段’其結合PGE2且在角叉菜膠誘發之齧齒動物爪水腫模型 中抑制爪水腫達約 10%、20〇/〇、30%、40%、50%、60%、 70%、80%、90%或100¾。在·一特定實施例中，在角叉菜 膠誘發之齧齒動物爪水腫模型中抗體抑制爪水腫超過約 10%。 在另一態樣中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片 段’其結合PGE2且在齧齒動物之朦原蛋白誘發之關節炎模 型中抑制爪腫脹或平均關節炎計分達約10%、20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%。在一 特定實施例中，在齧齒動物之膠原蛋白誘發之關節炎模型 中抗體抑制爪腫脹或平均關節炎計分超過10%。 在另一實施例中，如放射免疫檢定所量測，本發明之結 合蛋白具有至多約ιοΛ·1 ;至多約ΙΟΛ·1 ;至多約ΐοΛ·1 ; 或至多約ΙΟ·%-1之與pge2之解離速率常數（koff)。較佳地， 如放射免疫檢定所量測，本發明之結合蛋白具有約1 Ο·%-1 至約 ιοΛ-1 ;約 10Λ·1 至約 ιοΛ·1 ;或約 1〇-5,至約 10-6S-1 的與PGE2之解離速率常數（k〇ff)。 141568.doc -16 - 201014602
在另一實施例中，藉由放射免疫檢定所測定，本發明之 結合蛋白具有至多約1(Τ6 Μ ;至多約ΙΟ·7 Μ ;至多約10-s Μ，至多約10·9 Μ ;至多約ΙΟ·10 Μ ;至多約1〇-" Μ ;至多 約10 Μ ;或至多10-丨3μ的與PGE2之解離常數（Kd)。較佳 地，本發明之結合蛋白具有約ΗΓ7 Μ至約ΙΟ·8 M ;約1〇·8 M 至約 10 9 M ;約 1〇_9 Μ至約 ΙΟ·10 Μ ;約 ΙΟ.10至約 1〇-ii M ; 約1〇 U M至約1G·12 Μ ;或約1〇·12 Μ至約1〇七M的與pGE2 之解離常數（KD)。本發明之一態樣提供至少一種針對至少 一種本發明之PGE2結合蛋白的PGE2抗個體基因型抗體。 抗個體基因型抗體包括含有以下分子之任何蛋白質或肽， 該分子包含免疫球蛋白分子之至少一部分’諸如（但不限 於）重鏈或輕鏈之至少一個互補決定區（CDR)或其配位體結 合部分、重鏈或輕鏈可變區、重鏈或輕鏈恆定區、構架區 或其可併入本發明之結合蛋白中的任何部分。 在另一態樣中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片 段’其結合前列腺素E2且在基於細胞表面之受體結合檢定 中以選自由以下組成之群的ICm抑制前列腺素匕與£1、 E2、E3及E4受體中之至少一者的結合：約1χ1〇.6至ΐχΐ〇.7 Μ、1x10-7 至 lxl0-8 Μ、lxl〇-8 至 1χ1〇-9 Μ、1〇_9至1〇1〇 Μ、丨><10_丨Q至1χ10-丨1厘及10-1丨至1〇-〗2μ，或在基於elisa 之受體結合檢定中以選自由以下組成之群的KM抑制前列 腺素E2與El、E2、 lxl〇-6 至 lxl〇-7 Μ Ε3及Ε4受體中之至少一者的結合：約 、1χ1〇7 至 lxl0·8 M、lxio·8 至 1χ1〇.ί Μ、10·9至 ίο·10 μ 1 Χίο·10 至 1 ΧΙΟ·11 jy[及 1〇- 至 ΙΟ.12 Μ。 141568.doc -17- 201014602 在另一實施例中，抗體或其抗原結合片段結合前列腺素 E2且在基於細胞表面之受體結合檢定或使用表現El、E2、 E3及E4受體中之至少一者的細胞或細胞膜製劑的基於3h_ PGE2之放射免疫檢定中在約1〇〇 nM之濃度下抑制前列腺 素E2與E1、E2、E3及E4受體中至少一者的結合達約7〇_ 100°/。。在一實施例中，抗體係選自由19C9、4F1〇、 15F10、K1B、K7H、K3A、Lll、L21、2B5-7.0、2B5-8.0 ❿ ❿ 及2B5-9.0組成之群。在另一實施例中，抗體或其抗原結 合片段能夠調節前列腺素E2之生物功能，諸如中和前列腺 素E2。抗鱧或其抗原結合片段係選自由以下組成之群：免 疫球蛋白分子、單株抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體、人 類化抗體、Fab、Fab，、F(ab，）2、Fv、雙硫鍵連接之Fv、 scFv單域抗體、雙功能抗體、多特異性抗體、雙重特異 性抗體及雙特異性抗體。在一實施例中，抗體或其抗原結 合片段為人類化抗體。在另一實施例中，抗體係選自由 Hu2B5.Pl及Hu2B5.P2組成之群。本發明亦提供包含抗體 或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合 物。在一實施例中，醫藥組合物進一步包含至少一種用於 治療前列腺素E2活性有害之病症的其他治療劑。 、 態樣中’本發明提供產生結合前列腺素I之抗體 或其片段之方法’該方法包含以下步驟：卩前列腺素& :狀腺球蛋白免疫非人類動物，收集包含抗 艘之體液或器官，及分離該抗前列腺扣抗體。 在另—態樣中，本發明提供包含能夠結合前列腺素匕之 141568.doc •18. 201014602 抗原結合域之人類化抗體，該抗原結合域包含至少一個包 含選自由SEQ ID NO: 54-59組成之群之胺基酸序列的CDR 區。在另一實施例中，本發明提供包含抗原結合域之人類 化抗體，該抗原結合域包含至少一個包含與選自由SEQ ID NO: 54-59組成之群之胺基酸序列至少約60%、至少約 65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約 85%、至少約90%、至少約95%或至少約98%同源之胺基酸 序列的CDR區。在一實施例中，人類化抗體包含選自由 SEQ ID NO: 78、79、80及81組成之群的胺基酸序列。 在一態樣中，本發明結合蛋白能夠結合PGE2，該抗原 結合域包含至少一個包含選自由以下組成之群之胺基酸序 列的 CDR : CDR-H1 : GYTFTKYWLG(SEQ ID NO: 54)、 CDR-H2 ： DIYPGYDYTHYNEKFKD(SEQ ID NO: 55)、 CDR-H3 ： SDGSSTY(SEQ ID NO: 56) 、CDR-L1 ： TSSQNIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO: 57)、CDR-L2 ： KVSNRFSG(SEQ ID NO: 58)、CDR-L3 : FQVSHVPYT (SEQ ID NO: 59)。 在另一實施例中，本發明提供包含抗原結合域之結合蛋 白或其片段，該抗原結合域包含至少一個包含選自由以下 組成之群之胺基酸序列的CDR : SEQ ID NO: 6、7、8、 10、11、12、14、15、16、18、19、20、22、23、26、 27、28、30、31、32、34、35、37、38 及 39。在另一實施 例中，結合蛋白或其片段包含抗原結合域，該抗原結合域 包含至少一個包含選自由以下組成之群之胺基酸序列的 141568.doc -19- 201014602 VH區：SEQ ID NO: 5、13、21、25、33、40、42及 44。 在另一實施例中，結合蛋白或其片段包含抗原結合域，該 抗原結合域包含至少一個包含選自由以下組成之群之胺基 酸序列的 VL區：SEQ ID NO: 9、17、24、29、36、41、43 及45。在另一實施例中，結合蛋白或其片段包含抗原結合 域，該抗原結合域包含至少一個包含選自由SEQ ID NO: 54-59組成之群之胺基酸序列的CDR區。 在一實施例中，結合蛋白包含至少3個例如選自以下VH CDR組之CDR，該VH CDR組選自由SEQ ID NO: 6、7及 8 ; SEQ ID NO: 14、15及 16 ; SEQ ID NO: 14、22及 23， SEQ ID NO: 26、27及 28，及 32 ; SEQ ID NO: 26、34及 35 ;及SEQ ID NO: 54、55及56組成之群。在另一實施例 中，至少3個CDR係選自以下VL CDR組，該VL CDR組係 選自由 SEQ ID NO: 10、11及 12 ; SEQ ID NO: 17、18及 19 ; SEQ ID NO: 30、31 及 32 ; SEQ ID NO: 37、38及 39 ; SEQ ID NO: 42、43 及 44 ;及 SEQ ID NO: 57、58 及 59 組成 之群。在另一實施例中，至少3個CDR包含具有SEQ ID NO: 54、55及56之胺基酸序列的VH CDR組及/或具有SEQ ID NO: 57、58及59之胺基酸序列的VL CDR組。 在另一實施例中，結合蛋白包含至少兩個例如選自由以 下組成之群的可變域CDR組：SEQ ID NO: 6、7、8及SEQ ID NO: 10、11、12 ; SEQ ID NO: 14、15、16及 SEQ ID NO: 18、19、20 ; SEQ ID NO: 14、22、23及 SEQ ID NO: 10、11、12 ; SEQ ID NO: 26、27、28及 SEQ ID NO: 30、 141568.doc -20- 201014602 31、32 ;及 SEQ ID NO: 26、34、35及 SEQ ID NO: 37、 38、39。
在另一實施例中，本發明之結合蛋白包含兩個可變域， 該兩個可變域具有選自由以下組成之群的胺基酸序列： SEQ ID NO:5 及 SEQ ID NO:9 ; SEQ ID NO:13 及 SEQ ID NO:17 ; SEQ ID NO:2i 及 SEQ ID NO:24 ; SEQ ID NO:25及 SEQ ID NO:29 ; SEQ ID NO:33及 SEQ ID NO:36 ; SEQ ID NO:40及 SEQ ID NO:41 ; SEQ ID NO:42及 SEQ ID NO:43 ; 及SEQ ID NO:44及SEQ ID NO:45。在另一實施例中’兩 個可變域具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQID NO:60及 SEQ ID NO:61 ; SEQ ID NO:62及 SEQ ID NO:63 ; SEQ ID NO:64及 SEQ ID NO:65 ; SEQ ID NO:66及 SEQ ID NO:67 ; SEQ ID NO:68及 SEQ ID NO:69 ; SEQ ID NO:70及 SEQ ID NO:71 ; SEQ ID NO:72及 SEQ ID NO:73 ; SEQ ID NO:74 及 SEQ ID NO:75 ;及 SEQ ID NO:76 及 SEQ ID NO:77。在另一實施例中，兩個可變域具有選自由以下組 成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79; 及 SEQ ID NO:80及 SEQ ID NO:81 ° 在另一態樣中’本發明提供結合前列腺素E2之人類化抗 體或其片段，該人類化抗體包含至少一個包含選自由以下 組成之群之胺基酸序列的VH區：SEQ ID NO: 60、62、 64、66、68、70、72、74、76、78 及 80。在另一實施例 中，人類化抗體或其片段包含至少一個包含選自由以下組 成之群之胺基酸序列的VL區：SEQ ID NO: 61、63、65、 141568.doc -21. 201014602 67、69、71、73、75、77、79及81。在另一實施例中至 少一個VH區或至少一個VL區包含含有至少一個胺基酸取 代之人類受體構架序列，其中該構架序列之胺基酸序列與 該人類受體構架序列之序列至少65%_致。舉例而言，人 類受體構架在關鍵殘基處可包含至少一個構架胺基酸取 代，該關鍵殘基係選自由以下組成之群：與(：〇尺相鄰之殘 基、糖基化位點殘基、稀有殘基、能夠與前列腺素E2相互 作用之殘基、能夠與CDR相互作用之殘基、典型殘基、重 鏈可變區與輕鏈可變區之間的接觸殘基、Vemierg内之殘 基，及在Chothia界定之可變重鏈CDR^Kabat界定之第一 重鏈構架之間重疊之區域中的殘基。 在另一實施例中，結合蛋白進一步包含人類受體構架。 在本發明之一實施例中，人類重鏈及輕鏈受體序列係選 自表7及表8(實例4.2.1)中所述之序列.其他人類重鏈及輕 鍵受體序列為此項技術中所熟知且適用於本發明。在一實 施例中’結合蛋白為能夠結合PGE2之CDR移植抗體或其 抗原緯合部分。在另一實施例中’結合蛋白為能夠結合 PGE2之人類抗體或其抗原結合部分。在一實施例中， C D R移植抗體或人類化抗體或其抗原結合部分包含一或多 個本文揭示之CDR，例如三個或三個以上，四個或四個以 上，五個或五個以上，或六個或六個以上CDR。在另一實 施例中，CDR移植抗體或人類化抗體或其抗原結合部分包 含人類受體構架。該人類受體構架可為人類免疫球蛋白之 任何受體構架。在一特定實施例中，人類受體構架為本文 141568.doc -22· 201014602 揭示之任一人類受體構架。在一實施例中，CDR係併入至 人類受體構架之人類抗體可變域中。在一實施例中，人類 抗體可變域為共同人類可變域。在另一實施例中，人類受 體構架在關鍵殘基處包含至少一個構架區胺基酸取代，其 . 中該關鍵殘基係選自由以下組成之群：與Cdr相鄰之殘 基；糖基化位點殘基；稀有殘基；能夠與PGE2相互作用 之殘基；能夠與CDR相互作用之殘基；典型殘基；重鏈可 φ 變區與輕鏈可變區之間的接觸殘基；Vernier區内之殘基； 及在Chothia界定之可變重鏈CDR1與Kabat界定之第一重鍵 構架之間重疊之區域中的殘基。在一實施例中，人類受體 構架包含至少一個構架區胺基酸取代，其中該構架之胺基 酸序列與該人類受體構架之序列至少65%一致且包含至少 70個與該人類受體構架一致之胺基酸殘基。在一實施例 中’關鍵殘基處之構架區胺基酸取代係選自由以下組成之 群：在重鏈可變區中位置482M(人類）取代為T(小鼠），位 〇 置68之V(人類）取代為A(小鼠），位置70之Μ(人類）取代為 L(小鼠）’及位置72之Τ(人類）取代為ν(小鼠）；及在輕鏈可 變區中位置2之1(人類）取代為ν(小鼠）及位置3之乂（人類）取 代為L(小鼠）。 在另一態樣中，本發明提供包含結合蛋白及連接多肽及/ 或免疫球蛋白恆定域令之任一者的抗體構築體。在一實施 例中，抗體構築體係選自由以下組成之群：免疫球蛋白分 子、單株抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體、人類化抗體、 Fab ' Fab’ ' F(ab')2、Fv、雙硫鍵連接之fv、scFv、單域抗 141568.doc -23- 201014602 體、雙功能抗體、多特異性抗體、雙重特異性抗體及雙特 異性抗體。在一實施例中，抗體構築體包含選自由以下組 成之群的重鏈免疫球蛋白恆定域：人類IgM恆定域、人類 IgGl恆定域、人類igG2恆定域、人類IgG3恆定域、人類 IgG4恆定域，人類igE恆定域及人類IgA恆定域。在一實施 例中’抗體構築體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸 序列的免疫球蛋白恆定域：SEQ ID NO:l ; SEQ ID NO:2 ; SEQ ID NO:3 ; SEQ ID NO:4 ;及 SEQ ID NO:5。 在另一實施例中，本發明提供抗PGE2抗體結合物，該 結合物包含抗PGE2抗體構築體及選自由免疫黏附分子、 顯影劑、治療劑及細胞毒性劑組成之群的藥劑。在一實施 例中，該藥劑為選自由放射性標記、酶、螢光標記、發光 標記、生物發光標記、磁性標記及生物素組成之群的顯影 劑。在另一實施例中，顯影劑例如為選自由3H、14C、 35S、9°Y、99Tc、出1!1、125I、131l、π。、…如及⑴化組 成之群的放射性標記。在另一實施例中，藥劑為選自由抗 代謝物、烷基化劑、抗生素、生長因子、細胞激素、抗血 管生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環黴素（anthracycline)、毒 素及細胞凋亡劑組成之群的治療劑或細胞毒性劑。 在另一實施例中，結合蛋白經糖基化。在一特定實施例 中’ PGE2結合蛋白具有人類糖基化模式。 在另一實施例中’使PGE2結合蛋白、抗體構築體或抗 體結合物結晶化（例如以晶體形式存在）^在一實施例中， 晶體為無載劑醫藥控制釋放晶體。在另一實施例中，結晶 141568.doc -24- 201014602 化結合蛋白、結晶化抗體構築體或結晶化抗體結合物具有 比其可溶性對應物大的活體内半衰期。在另一實施例中， 結晶化結合蛋白、結晶化抗體構築體或結晶化抗體結合物 在結晶化後保留其生物活性。
本發明之一態樣係關於包含能夠結合PGE2之結合蛋白 的DVD結合蛋白。較佳地，DVD結合蛋白能夠結合兩個 PGE2結合位點或結合PGE2及第二目標。第二目標係選自 由以下組成之群：CSFl(MCSF)、CSF2(GM-CSF)、 CSF3(GCSF)、FGF2、IFNal、ΙΡΝβΙ、IFNy、組織胺及組 織胺受體、11^-1〇1、1[-10、1[-2、11^3、1[-4、1[-5、1卜 6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12a、IL-12P、 IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、KITLG、 PDGFB、IL-2Rp、IL-4R、IL-5Ra、IL-8Ra、IL-8Rp、IL-12RP1 ' IL-12Rp2 > IL-13Ral > IL-13Ra2 ' IL-18R1 ' TSLP 、 CCL1 、 CCL2 、 CCL3 、 CCL4 、 CCL5 、 CCL7 、 CCL8 、 CCL13 、 CCL17 、 CCL18 、 CCL19 、 CCL20 、 CCL22、CCL24、CX3CL1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、 XCL1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、 CCR8、CX3CR1、GPR2、XCR1、FOS、GATA3、JAK1、 JAK3、STAT6、TBX21、TGFB1、TNFSF6、YY1、 CYSLTR1、FCER1A、FCER2、LTB4R、TB4R2、LTBR及 殼質酶。在一實施例中，DVD結合蛋白能夠識別PGE2及 IL-Ιβ ; PGE2及 IL-9 ; PGE2及 IL-4 ; PGE2及 IL-5 ; PGE2及 IL-25 ; PGE2 及 TARC ; PGE2 及 MDC ; PGE2及 MIF ; PGE2 141568.doc -25- 201014602 及 TGF-β ; PGE2 及 LHR促效劑；PGE2 及 CL25 ; PGE2 及 SPRR2a ; PGE2 及 SPRR2b ;或 PGE2 及 ADAM8。在一實施 例中，DVD結合蛋白能夠結合PGE2及TNFa。 在另一態樣中，本發明提供編碼PGE2結合蛋白、抗體 構築體或抗體結合物之經分離核酸。另一實施例提供包含 本發明之經分離核酸之載體，其中該載體係選自由以下組 成之群：pcDNA ; pTT(Durocher 等人，TVwc/ez'c Jc/办 2002，第30卷，第2期）；pTT3(具有額外多選殖 位點之pTT) ; pEFBOS(Mizushima，S.及Nagata，S·, (1990) TVwc/e/c /iesearc/z 第 18 卷，第 17期）；pBV ; pJV ; pA2 ;及 pBJ。 在另一態樣中，本發明提供經本發明之載體轉型之宿主 細胞。在一實施例中，宿主細胞為原核細胞（例如大腸桿 菌（E_ coli))。在另一實施例中，宿主細胞為真核細胞，例 如原生生物細胞、動物細胞、禽類細胞、植物細胞、真菌 細胞（例如酵母細胞，諸如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae))、哺乳動物細胞（例如 CHO、COS及 HEK293)、 昆蟲細胞（例如Sf9)。 在另一態樣中，本發明提供產生結合PGE2之蛋白質的 方法，其包含在足以產生結合PGE2之結合蛋白的條件下 在培養基中培養本發明之任一宿主細胞。另一實施例提供 根據本發明之方法產生的結合蛋白。 在另一態樣中，本發明提供包含結晶化PGE2結合蛋 白、結晶化抗體構築體或結晶化抗體結合物、成分及/或 141568.doc -26· 201014602 至少一種聚合載劑之調配物。在一實施例中，聚合載劑為 選自由以下組成之群的聚合物：聚（丙烯酸）、聚（氰基丙烯 酸醋）、聚（胺基酸）、聚（針）、聚（縮肽）、聚（醋）、聚（乳 酸）、聚（乳酸-共-乙醇酸）或PLGa、聚（b_羥基丁酸酯）、聚 (己内酯）、聚（二氧環己酮）、聚（乙二醇）、聚（（羥丙基）甲 基丙稀酿胺）、聚[(有機）磷氮烯]、聚（原酸酯）、聚（乙烯 ‘醇）、聚（乙烯吡咯啶酮）、順丁烯二酸酐_烷基乙烯基醚共 0 聚物、氧化異丙烯多元醇類、白蛋白、海藻酸鹽、纖維素 及纖維素衍生物、膠原蛋白、血纖維蛋白、明膠、玻尿 酸、寡醣、甘胺基聚糖、硫酸多醣及其摻合物及/或共聚 物。在另一實施例中，該成分係選自由白蛋白、蔗糖、海 藻糖、乳糖醇、明膠、羥丙基環糊精、甲氧基聚乙二醇 及聚乙一醇組成之群。 在另態樣中’本發明提供治療個體之方法，其包含向 該個體投與有效量之PGE2結合蛋白、抗體構築體、結合 ❹ 物或組合物之步驟。在一實施例中，個體為哺乳動物，諸 如羅患發炎性疾病或本文所述之其他病症之人類。在—實 施例中，本發明提供減輕、改善或預防該疾病或病症之— 或多種症狀的方法，諸如以下疾病或病症之症狀：（句類風 濕性關節炎、過敏性關節炎、青少年型關節炎、關節黏連 性脊椎炎及骨關節炎；（b)由病毒誘發之某些疾病，諸如 格-巴一氏症候群（Guillain Barre syndr〇me)、感染性單核 白血球增多症、其他病毒性淋巴腺病及疱疹病毒感染；（c) 多發性硬化症及其他脫髓鞘疾病；（d)血液病，諸如溶血性 141568.doc •27· 201014602 貧血及血小板減少症；（e)内分泌病症，諸如糖尿病、艾迪 森氏病（Addison's disease)、特發性副甲狀腺低能症及慢性 淋巴細胞性甲狀腺炎；（f)膠原蛋白病變，諸如全身性紅斑 狼瘡症；及（g)生殖病症’諸如閉經、不孕症、反覆性流產 及驚厥；及（h)腫瘤，諸如頭頸部Μ瘤、肺癌、胃癌、前列 腺癌、胰腺癌等；及⑴發炎性腸病’包括克隆氏病及潰瘍 性結腸炎；及（j)與骨關節炎及其他病症有關之疼痛；及 (k)眼病，諸如年齡相關之黃斑變性（AMD)。 在另一態樣中，本發明提供包含PGE2結合蛋白、抗 體、構築禮、結合物或組合物及醫藥學上可接受之載劑的 醫藥組合物。在一實施例中，醫藥學上可接受之載劑充當 適用於增加結合蛋白之吸收或分散之佐劑。在一實施例 中’佐劑為玻尿酸酶。醫藥組合物可進一步包含至少一種 用於診斷或治療PGE2活性有害之病症的額外藥劑，例如 選自由以下組成之群的藥劑：治療劑；顯影劑；細胞毒性 劑；血管生成抑制劑（例如抗VEGF抗體或VEGF-trap);激 酶抑制劑（例如KDR或TIE-2抑制劑）；共刺激分子阻斷劑 (例如抗B7.1、抗B7.2、CTLA4-Ig或抗CD20);黏附分子阻 斷劑（例如抗LFA_1、抗E/L選擇素（selectin)或小分子抑制 劑），抗細胞激素抗體或其功能片段（例如抗IL-1 8、抗TNF 或抗IL-6/細胞激素受體抗體）；甲胺喋呤；環孢黴素 (cyclosporine);雷帕黴素（rapamycin) ; FK506 ;可债測標 §己或報導體；TNF拮抗劑；抗風濕藥；肌肉鬆他劑；麻醉 藥；非類固酵消炎藥（NSAID);止痛劑；麻醉劑；鎮靜 141568.doc •28· 201014602 劑；局部麻醉劑；神經肌肉阻斷劑；抗微生物劑；抗牛皮 癖藥；皮質類固醇；同化類固醇；紅血球生成素；免疫作 用’免疫球蛋白；免疫抑制劑；生長激素；激素替代藥 物；放射性藥品；抗抑鬱劑；抗精神病藥物；興奮劑；哮 喘藥物；β促效劑；吸入類固醇；口服類固醇；腎上腺素 或其類似物；細胞激素；及細胞激素拮抗劑。 在另一態樣中’本發明提供抑制及/或降低pGE2活性之 參 方法，其包含使PGE2與PGE2結合蛋白接觸以使得PGE2活 性被抑制及/或降低。在一實施例中，本發明提供在罹患 PGE2活性有害之病症的個體中抑制及/或降低PGE2活性之 方法’其包含向該個體投與結合蛋白以使得個體中之 PGE2活性被抑制及/或降低。在另一實施例中該方法包 含向個體投與本發明之PGE2結合蛋白以使得實現治療。 在另一態樣中，本發明提供在個體中治療（例如治癒、 抑制、改善、延遲或預防發作或預防重現或復發）或預防 • PGE2相關病症之方法。該方法包括：以足以治療或預防 PGE2相關病症之量向個體投與pGE2結合蛋白（尤其拮抗 劑），例如抗PGE2抗體或其片段。PGE2拮抗劑（例如抗 PGE2抗體或其片段）可單獨《與其他治療方式組合向個體 投與。 在一實施例中，個體為哺乳動物，例如罹患一或多種 PGE2相關病症（例如特徵為過量⑽^含量或生物合成）之 人類。在-實施例中，本發明提供治療個體之發炎性病症 及免疫病症之方法，該等病症特徵為過量PGR生物合成， 141568.doc •29· 201014602 該等方法包含向該個體投與有效量之對PGE2具特異性的抗 體。可藉由本發明方法治療之病症包括涉及過量PGe2合成 的自體免疫及發炎性疾病及腫瘤。該等病症包括：（a)類風 濕性關節炎、過敏性關節炎、青少年型關節炎、關節黏連 性脊椎炎及骨關節炎；（b)由病毒誘發之某些疾病，諸如 格·巴一氏症候群、感染性單核白血球增多症、其他病毒 . 性淋巴腺病及疱疹病毒感染；（e)多發性硬化症及其他脫髓 . 鞘疾病；（d)血液病，諸如溶血性貧血及血小板減少症； (e)内分泌病症，諸如糖尿病、艾迪森氏病、特發性副甲狀參 腺低能症及慢性淋巴細胞性甲狀腺炎；⑴膠原蛋白病變， 諸如全身性紅斑狼瘡症；及（g)生殖病症，諸如閉經、不孕 症、反覆性流產及驚厥；及（h)腫瘤，諸如頭頸部腫瘤、肺 癌、胃癌、前列腺癌、姨腺癌等；及⑴發炎性腸病，包括 克隆氏病及潰瘍性結腸炎；及⑴與骨關節炎及其他病症有 關之疼痛；及⑻眼病’諸如年齡相關之黃斑變性（amd)。 在另-態樣中’本申請案提供偵測活體外樣本（例如生物 學樣本’諸如血清、血漿、組織、活組織檢查）中阳以_ 在的方的方法可用於診斷例如免疫細胞相關病症 之病症。該方法包括：⑴使樣本或對照樣本與如本文所述 之抗PGE2抗體或其片段接觸；及⑴)债測抗pew抗體或其· 片段與樣本或對照樣本之間複合物的形成，其令樣本相對 於對』'樣本之複合物形成之統計學上顯著的變化指示樣本 中存在PGE2。 另心樣中本申凊案提供偵測活體内ME2存在之 J41568.doc •30- 201014602 方法（例如在個體中活體内成像）。標的方法可用於診斷例 如PGE2相關病症之病症。該方法包括：⑴在允許抗體或 片段與PGE2結合之條件下向個體或對照個體投與如本文 所述之抗PGE2抗體或其片段；及（π)偵測抗體或片段與 PGE2之間複合物的形成，其中個體相對於對照個體之複 合物形成之統計學上顯著的變化指示存在PGE2。 . 在另一態樣中，本發明之結合蛋白適用於治療選自由以 籲 下組成之群的病症：關節炎、骨關節炎、青少年慢性關節 炎、膿毒性關節炎、萊姆關節炎（Lyme arthdtis)、牛皮癬 性關節炎、反應性關節炎、脊椎關節病、全身性紅斑狼瘡 症、克隆氏病、潰瘍性結腸炎、發炎性腸病、胰島素依賴 性糖尿病、甲狀腺炎、哮喘、過敏性疾病、牛皮癬、皮膚 炎性硬皮病、移植物抗宿主疾病、器官移植排斥反應、與 器官移植有關之急性或慢性免疫疾病、肉狀瘤病、動脈粥 樣硬化、散播性血管内凝血、川崎氏病（Kawasaki,s φ dlSeaSe)、格雷夫氏病（Grave's disease)、腎病症候群、慢 性疲勞症候群、華格納氏肉芽病（Wegener，s granul〇matosis)、亨偌·絲奇恩賴紫癜（Hen〇ch Sch〇eniein purpurea)、腎臟之微觀脈管炎、慢性活動型肝炎、葡萄膜 炎、敗血性休克、中毒性休克症候群、膿毒病症候群、惡 病質、感染性疾病、寄生蟲病、後天免疫缺乏症候群、急 性橫貫性脊髓炎、亨廷頓氏舞蹈病（Huntingt〇n,s此〇咖）、 帕金森氏病（Parkinson，s disease)、阿茲海默氏病 (Alzheimer’s disease)、中風、原發性膽汁性肝硬化、溶血 141568.doc -31· 201014602 性貧血、惡性疾病、心臟衰竭、心肌梗塞、艾迪森氏病、 偶發性I型多腺低減及II型多腺低減、史密特氏症候群 (Schmidt's syndrome)、成人（急性）呼吸窘迫症候群、禿頭 症、斑禿、血清陰性關節病、關節病、萊特爾氏病 (Reiter's disease)、牛皮癖性關節病、潰瘍性結腸炎性關節 病、腸病性滑膜炎、彼衣菌、耶氏桿菌（yersinia)及沙門氏 菌（salmonella)相關之關節病、脊椎關節病、動脈粥樣化病/ . 動脈硬化症、特異體質過敏症、自體免疫性水皰病、尋常 天疱瘡 '落葉狀天疱瘡、類天疱瘡、線狀IgA病、自體免 〇 疫性溶血性貧血、庫氏試驗陽性溶血性貧血（c〇〇mbs positive haemolytic anaemia)、後天惡性貧血、青少年惡性 貧血、肌痛性腦炎/皇家自由病（Royal Free Disease)、慢性 皮膚黏膜念珠菌病、巨細胞動脈炎、原發性硬化性肝炎、 隱源性自體免疫性肝炎、後天免疫缺乏疾病症候群、後天 免疫缺乏相關疾病、B型肝炎、c型肝炎、普通易變型免 疫缺乏（普通易變型低丙球蛋白血症）、擴張性心肌病、女 子不孕症、印巢功能衰竭、印巢早衰、纖維化肺病、隱源® 性致纖維性肺泡炎、發炎後間質性肺病、間質性肺炎、結 締、’且織病相關之間質性肺病、混合結締組織病相關之肺 病、全身性硬化症相關之間質性肺病、類風濕性關節炎相 關之間質性肺病、全身性紅斑狼療症相關之肺病、皮肌炎/ 多肌炎相關之肺病、休格連氏病相關之肺病⑽㈣心 chsease associated iung心⑽）、關節黏連性脊椎炎相關 之肺病、脈管炎性彌漫性肺病、血黃素沈積症相關之肺 141568.doc -32- 201014602 病、藥物誘發之間質性肺病、纖維化、放射性纖維化、閉 塞性細支氣管炎、慢性嗜伊紅血球性肺炎、淋巴細胞浸潤 性肺病、感染後間質性肺病、痛風性關節炎、自體免疫性 肝炎、1型自體免疫性肝炎（經典自體免疫或類狼瘡性肝 . 炎）、2型自體免疫性肝炎（抗職抗體肝炎）、自體免疫介 . $之低讀症、B型胰島素抗性伴發黑色棘皮病、副甲狀 ' 隸能症、與器官移財關之急性免疫錢、與ϋ官移植 φ 冑關之慢性免疫疾病、非炎性骨關節病、原發性硬化性膽 管炎、1型牛皮癣、2型牛皮癬、特發性白血球減少病、自 體免疫性嗜中性球減少症、腎病N〇s、腎小球腎炎、腎臟 之微觀脈管炎、萊姆病（lyme disease)、盤狀紅斑狼瘡、特 發性男性不孕症或N〇s、精子自體免疫、多發性硬化症 (所有次型）、交感性眼炎、結締組織病繼發之肺性高血 壓、古巴士德氏症候群（Go〇dpasture,s syndr〇me)、結節性 多動脈炎之肺部表現、急性風濕熱、類風濕性脊椎炎、斯 e 蒂爾病（stiu's disease)、全身性硬化症、休格連氏症候 群、而女氏病（Takayasu's disease)/動脈炎、自體免疫性血 小板減少症、特發性血小板減少症、自體免疫性甲狀腺 病、曱狀腺機能亢進症、甲狀腺腫性自體免疫性曱狀腺低 能症（橋本氏病（Hashimoto’s disease))、萎縮性自體免疫性 甲狀腺低能症、原發性黏液水腫、晶狀體源性葡萄膜炎、 原發性脈管炎、白斑病急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬 化、酒精誘發之肝損傷、膽汁淤積、特質性肝病、藥物誘 發之肝炎、非酒精性脂肪變性肝炎、過敏症及哮喘、B族 141568.doc 33- 201014602 鏈球菌（GBS)感染、精神障礙（例如抑鬱症及精神分裂 症）、Th2型及Th 1型介導之疾病、急性及慢性疼痛（不同形 式之疼痛）、及諸如肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸 癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌及直腸癌之癌症及造血系 統惡性疾病（白血病及淋巴瘤）、無β脂蛋白血症、手足發 紺、急性及慢性寄生或感染過程、急性白血病、急性淋巴 母細胞白血病（ALL)、急性骨髓白血病（Aml)、急性或慢 性細菌感染、急性胰腺炎、急性腎衰竭、腺癌、心房異位 搏動、AIDS癡呆複合症、酒精誘發之肝炎、過敏性結膜 炎、過敏性接觸性皮膚炎、過敏性鼻炎、同種異體移植排 斥反應、α-1 -抗胰蛋白酶缺乏、肌肉萎縮性侧索硬化、貧 血、心絞痛、前角細胞退化、抗cd3療法、抗破脂症候 群、抗受體過敏反應、主動脈及周圍動脈瘤、主動脈剝 離、動脈性南血壓、動脈硬化症、動靜脈瘺、共濟失調、 心房微顫（持續性或陣發性）、心房撲動、房室傳導阻滯、 B細胞淋巴瘤、骨移植物排斥反應、骨趙移植（BMT)排斥 反應、束枝傳導阻滯、伯基特淋巴瘤（Burkitt，s lymphoma)、燒傷、心律不整、心臟頓抑症候群、心臟腫 瘤、心肌病、心肺分流發炎反應、軟骨移植排斥反應、小 腦皮質退化、小腦病症、紊亂性或多源性房性心動過速、 與化學療法有關之病症、慢性趙細胞白血病（CML)、慢性 酒精中毒、慢性發炎性病變、慢性淋巴細胞性白血病 (CLL)、慢性阻塞性肺病（COPD)、慢性水揚酸中毒、結腸 直腸癌、充血性心臟衰竭、結膜炎、接觸性皮膚炎、肺原 141568.doc -34- 201014602 性心臟病、冠狀動脈疾病、庫賈氏病（Creutzfeldt_Jak〇b disease)、培養物陰性敗血症、囊腫性纖維化、細胞激素 療法相關之病症、拳擊員癡呆、脫髓鞘疾病、登革出血熱 (dengue hemorrhagic fever)、皮膚炎、皮膚病病狀、糖尿 病（diabete、糖尿病（diabetes mellitus)、糖尿病性動脈硬化 病泛發性路易體疾病（Diffuse Lewy body disease)、擴張 型充血性心肌病、基底神經節病症、中年唐氏症候群 參 （Down's Syndrome in middle age)、由阻斷 CNS 多巴胺受體 之藥物誘發的藥物誘發之運動障礙、藥物敏感、濕疹、腦 脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、會厭炎、EB病毒感染 (Epstein-Barr Wrus infection)、肢端紅痛症、錐體外及小 腦病症、豕族性噬血性淋巴組織細胞增殖症、胚胎胸腺移 植排斥反應、弗立特里希氏共濟失調（Friedreichis ataxia)、功旎性周圍動脈病症、真菌性敗血症、氣性壞 疽、月〉貝瘍、腎小球腎炎、任何器官或組織的移植物排斥 φ 反應、革蘭氏陰性敗血症、革蘭氏陽性敗血症、胞内生物 體引起之肉芽腫、毛細胞白血病、哈勒沃登-施帕茨病 (Hallen：0rden-Spatz disease)、喬本氏曱狀腺炎（Hashim〇t〇,s thyroiditis)、花粉熱、心臟移植排斥反應、血色素沈著 症、血液透析、溶血性尿毒癥候群/溶栓性血小板減少性 紫癜、出血、肝炎（A)、希氏束心律不整（His bundle arrythmias)、mv 感染 /HIV神經病、霍奇金病（H〇dgkin,s disease)、運動過度病症、過敏反應、過敏性肺炎、高血 壓、運動功能減退病症、下丘腦_垂體_腎上腺轴評估、特 141568.doc -35- 201014602 發性艾迪森氏病、特發性肺纖維化、抗體介導之細胞毒 性、無力、嬰兒脊髓性肌萎縮症、主動脈發炎、a型流 感、電離輻射曝露、虹膜睫狀體炎/葡萄膜炎/視神經炎、 缺血再灌注損傷、缺血性中風、青少年類風濕性關節炎、 青乂年脊知性肌萎縮症、卡波西氏肉瘤（Kap〇srs sarcoma)、腎臟移植排斥反應、退伍軍人桿菌 (legionella)、利什曼體病（ieishmaniasjs)、麻風病、皮質脊 髓系統病變、脂性水腫、肝移植排斥反應、淋巴水腫 '瘧 疾、惡性淋巴瘤、惡性組織球病、惡性黑素瘤、腦膜炎、 腦膜炎球菌血症、代謝性/特發性偏頭痛、粒線體複合系 統病症、混合結締組織病、單株球蛋白症、多發性骨髓 瘤、多系統退化（Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager 及
Machado-Joseph)、重症肌無力、胞内鳥型分枝桿菌 (mycobacterium avium intracellulare)、結核分枝桿菌 (mycobacterium tubercul〇sis)、骨髓發育不良症候群、心 肌梗塞、心肌缺血病症、鼻咽癌、新生兒慢性肺病腎 火、腎病、神經退化性疾病、j型神經性肌肉萎縮、中性 白血球減少性發熱、非霍奇金淋巴瘤（n〇n_H〇dgkins lymphoma)、腹主動脈及其分支堵塞、阻塞性動脈病症、 okt3療法、睪丸炎/副睪丸炎、睪丸炎/輸精管切除逆轉程 序、内臟增大、骨質疏鬆症、胰腺移植排斥反應、胰腺 癌、腫瘤相關症候群/惡性高血鈣症、副甲狀腺移植排斥 反應、盆腔發炎性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、周圍動 脈粥樣硬化疾病、周圍血管疾病、腹膜炎、惡性貧血、卡 141568.doc -36 - 201014602 氏肺囊蟲肺炎（Pneumocystis carinii pneumonia)、肺炎、 POEMS症候群（多發性神經病、内臟增大、内分泌病、單 株球蛋白症及換膚症候群）、灌注後症候群、泵後症候 群、MI心切開術後症候群、先兆驚厥、進行性核上性麻 痒、原發性肺性高血壓、放射療法、雷諾現象（Raynaud，s phenomenon)及疾病、雷諾病、雷夫蘇姆氏病（Refsum，s disease)、規則狹窄QRS心動過速、腎血管性高血壓、再灌 注損傷、限制型心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、 路易體型老年癡呆（Senile Dementia of Lewy body type)、 企清陰性關節病、休克、鐮形細胞性貧企、皮膚同種異體 移植排斥反應、換膚症候群、小腸移植排斥反應、實體腫 瘤、特異性心律不整、脊趙性共濟失調、脊趙小腦退化、 鏈球菌肌炎、小腦結構病變、亞急性硬化泛腦炎、昏厥、 、血管系統梅毒、全身性過敏、全身性發炎反應症候群、 全身發作型青少年類風濕性關節炎、T細胞或FAB ALL、 毛細管擴張、血栓閉塞性血管炎、血小板減少症、中毒、 移植、外傷/出血、ΙΠ型過敏反應、IV型過敏、不穩定型 〜紋痛、尿毒癥、尿膿毒病、蓴麻療、心臟瓣膜病、靜脈 曲張、脈管炎、靜脈疾病、靜脈栓塞、心室纖維性顫動' 病毒及真菌感染、病毒性腦炎/無菌性腦膜炎、病毒相關 之嗟血症候群、韋尼克-科爾薩科夫症候群（Wernicke-Korsakoff syndrome)、威爾遜氏病（Wilson's disease)、任 何器官或組織的異種移植物排斥反應、急性冠狀動脈症候 群 '急性特發性多發性神經炎、急性發炎性脫髓鞘性多神 141568.doc •37- 201014602 經根神經病、急性缺血、成人斯蒂爾病（Adult Stm，s Disease)、斑禿、過敏症、抗磷脂抗體症候群、再生不全 性貧血、動脈硬化症、特應性濕疹、異位性皮膚炎、自體 免疫性皮膚炎、與鏈球菌感染有關之自體免疫病症、自體 免疫性腸病、自體免疫性聽力損失、自身免疫性淋巴增生 性症候群（ALPS)、自體免疫性心肌炎、自體免疫性卵巢早 衰、臉炎、支氣管擴張、大皰性類天疱瘡、心血管疾病、 災難性抗碟脂症候群、乳糜瀉、頸椎關節黏連、慢性缺 血、瘢痕性類天疱瘡、具有多發性硬化症風險之臨床孤立 症候群（CIS)、結膜炎、兒童期初發型精神異常、慢性阻 塞性肺病（COPD)、淚囊炎、皮肌炎、糖尿病性視網膜病 變、糖尿病、椎間盤突出症、盤脫垂、藥物誘發之免疫性 溶血性貧血、心内膜炎、子宮内膜異位、眼内炎、上鞏膜 炎、多形性紅斑、重症多形性紅斑、妊娠期類天疱瘡、 格-巴二氏症候群（GBS)、花粉熱、休斯症候群（Hughes Syndrome)、特發性帕金森氏病、特發性間質性肺炎、IgE 介導之過敏症、免疫性溶血性貧血、包涵體肌炎、感染性 眼部發炎疾病、發炎性脫髓鞘疾病、發炎性心臟病、發炎 性腎病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、乾眼症、庫斯病 (Kussmaul disease)或庫斯·麥爾病（Kussmaul_Meier Disease)、蘭德里麻痺（Landry’s Paralysis)、朗格漢氏細胞 組織球病（Langerhan's Cell Histiocytosis)、網狀青斑、黃 斑變性、顯微性多血管炎、白赫鐵列夫症（M〇rbus Bechterev)、運動神經元病症、黏膜類天疱瘡、多器官衰 141568.doc -38- 201014602 竭、重症肌無力、骨髓發育不良症候群、心肌炎、神經根 病症、神經病、非A非B型肝炎、視神經炎、骨質溶解、 少關節型青少年類風濕性關節炎（Pauciarticular JRA)、周 圍動脈閉塞性疾病（PAOD)、周圍血管疾病（PVD)、周圍動 脈疾病（PAD)、靜脈炎、結節性多動脈炎（或結節性動脈周 圍炎）、多軟骨炎、風濕性多肌痛、白髮症、多關節型 JRA、多發性内分泌缺乏症候群、多發性肌炎、風濕性多 肌痛（PMR)、泵後症候群、原發性帕金森氏症、前列腺 炎、純紅細胞發育不全、原發性腎上腺機能不全、復發性 視神經脊髓炎、再狹窄、風濕性心臟病、SAPHO(滑膜 炎、痤瘡、膿皰病、骨肥厚及骨炎）、硬皮病、繼發性澱 粉樣變性病、休克肺、鞏膜炎、坐骨神經痛、繼發性腎上 腺機能不全、聚矽氧相關之結締組織疾病、角層下膿皰性 皮膚病（Sneddon-Wilkinson Dermatosis)、關節黏連性脊椎 炎 '帝文生氏-強生症候群（Stevens-Johnson Syndrome， SJS)、全身性發炎反應症候群、顳動脈炎、弓形蟲性視網 膜炎、中毒性表皮壞死溶解、橫貫性脊髓炎、TRAPS(腫 瘤壞死因子受體）、1型過敏反應、II型糖尿病、蓴麻疹、 尋常性間質肺炎（UIP)、脈管炎、春季結膜炎、病毒性視 網膜炎、沃格特-小柳-原田症候群（Vogt-Koyanagi-Harada syndrome)(VKH症候群）、濕式黃斑變性及傷口瘡合。 在一實施例中，可以本發明之組合物及方法治療或診斷 之疾病包括（但不限於）原發性及轉移性癌症，包括乳癌、 結腸癌、直腸癌、肺癌、口咽癌、下σ燕癌、食道癌、胃 141568.doc -39- 201014602 癌、胰腺癌、肝癌、膽囊癌及膽管癌、小腸癌、泌尿道癌 (包括腎癌、膀胱癌及尿路上皮癌）、女性生殖道癌（包括子 宮頸癌、子宮癌及卵巢癌以及絨膜癌及妊娠滋養層細胞疾 病）、男性生殖道癌（包括前列腺癌、精囊癌、睪丸癌及生 殖細胞腫瘤）、内分泌腺癌（包括甲狀腺癌、腎上腺癌及垂 體腺癌）及皮膚癌，以及血管瘤、黑素瘤、肉瘤（包括骨骼 及軟組織以及卡波西氏肉瘤（Kap〇siis sarc〇ma)引起之彼等 瘤）、腦瘤、神經瘤、眼腫瘤及脊膜瘤（包括星形細胞瘤、 神經膠質瘤、神經膠母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、神經 瘤、神經母細胞瘤、神經鞘瘤及腦膜瘤）、由諸如白血病 之造血系統惡性疾病引起的實體腫瘤，及淋巴瘤（霍奇金 淋巴瘤（Hodgkin's lymph〇ma)及非霍奇金淋巴瘤（n〇n_ Hodgkin’s lymphoma)) ° s亥方法包含以足以治療（例如減輕、改善）或預防一或多 種症狀之量向個體投與PGE2括抗劑，例如ρ〇Ε2抗體或其 片段。PGE2抗體可投與供治療或預防或兩者。pGE2拮抗 劑（例如抗PGE2抗體或其片段）可如本文所述單獨或與其他 治療方式組合向個體投與。較佳地，個體為哺乳動物，例 如罹患本文所述之PGE2相關病症之人類。 在另一態樣中，本發明之結合蛋白適用於治療選自由以 下組成之群的病症：急性淋巴母細胞白血病、急性骨趙白 血病、腎上腺皮質癌、肛門癌、闌尾癌、小腦星形細胞 瘤、大腦星形細胞瘤、基底細胞癌、膽管癌、肝外癌、膀 胱癌、骨癌、骨肉瘤/惡性纖維組織細胞瘤腦幹神經膠質 141568.doc -40· 201014602 瘤、腦瘤、腦幹神經膠質瘤、大腦星形細胞瘤/惡性神經 膠質瘤、室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、幕上原始神經外胚 層瘤、視覺路徑及下丘腦神經膠質瘤、乳癌、支氣管腺瘤/ 類癌、類癌瘤、類癌瘤、原發灶不明之胃腸道癌、中樞神 經系統淋巴瘤、原發性小腦星形細胞瘤、子宮頸癌、慢性 淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病慢性骨髓增生性病 症、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚τ細胞淋巴瘤、子宮内膜 癌、室管膜瘤、食道癌、尤文（Ewing)家族腫瘤、顱外生 殖細胞腫瘤、性腺外生殖細胞腫瘤、肝外膽管癌、眼癌、 眼内黑素瘤視網膜母細胞瘤、膽囊癌、胃癌、胃腸道類癌 瘤、胃腸道基質瘤（GIST)、顧外生殖細胞腫瘤、性腺外生 殖細胞腫瘤、卵巢生殖細胞腫瘤、妊娠滋養層細胞腫瘤、 神經膠質瘤、腦幹神經膠質瘤、大腦星形細胞瘤神經膠質 瘤、兒童視覺路徑及下丘腦神經膠質瘤、毛細胞白血病、 頭頸癌、肝細胞（肝）癌、霍奇金淋巴瘤、下嚥癌、眼内黑 素瘤、騰島細胞癌（内分泌胰腺）、卡波西肉瘤、腎（腎細 胞）癌、喉癌、急性淋巴母細胞白血病、急性骨髓白企 病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、毛細胞 白血病、唇及口腔癌、肝癌、非小細胞肺癌、小細胞肺 癌、AIDS相關性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤 '皮膚τ細胞淋巴 瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原發性中樞神經系 統淋巴瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症（WaldenstrOm Macroglobulinemia)、骨骼惡性纖維組織細胞瘤/骨肉瘤、 神經管胚細胞瘤、黑素瘤、眼内（眼）黑素瘤 '梅克爾細胞 141568.doc •41- 201014602 癌（Merkel Cell Carcinoma)、惡性間皮瘤、原發灶隱匿之 轉移性鱗狀頸癌、口癌、多發性内分泌瘤症候群、多發性 骨髓瘤/漿細胞贅瘤、蕈樣肉芽腫、骨髓發育不良症候 群、骨髓發育不良/骨髓增生性疾病、骨髓性白血病、慢 性骨髓白血病、多發性骨髓瘤、骨髓增生性病症、鼻腔及 鼻竇癌、鼻咽癌、神經母細胞瘤、口部癌症（OM Cancer)、口腔癌（〇rai cavity Cancer)、唇及 口咽癌、骨肉 瘤/骨絡惡性纖維組織細胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵 巢生殖細胞腫瘤、卵巢低度惡性潛在腫瘤、胰腺癌、胰島 細胞胰腺癌、鼻竇及鼻腔癌、副甲狀腺癌、陰莖癌 '咽 癌、嗜鉻細胞瘤、松果體母細胞瘤及幕上原始神經外胚層 瘤、垂體瘤、漿細胞贅瘤/多發性骨髓瘤、胸膜肺母細胞 瘤、前列腺癌、直腸癌、腎細胞（腎）癌、腎盂及輸尿管 癌、移行細胞癌、視網膜母細胞瘤、唾液腺癌、肉瘤、尤 文家族腫瘤、卡波西肉瘤、軟組織肉瘤、子宮肉瘤、塞紮 萊症候群（S6zary Syndrome)、皮膚癌（非黑素瘤）、皮膚癌 (黑素瘤）、梅克爾細胞皮膚癌（Merkel Cell Skin Carcinoma)、小腸癌、鱗狀細胞癌、原發灶隱匿之轉移性 鱗狀頸癌、胃癌、幕上原始神經外胚層瘤、皮膚T細胞淋 巴瘤、睪丸癌、喉癌、胸腺瘤、胸腺瘤、胸腺瘤及胸腺 癌、甲狀腺癌、腎盂及輸尿管移行細胞癌、奴娘滋養層細 胞腫瘤、輸尿管及腎盂癌、移行細胞癌、尿道癌、子宮 癌、子宮内膜子宮肉瘤、陰道癌、視覺路徑及下丘腦神經 膠質瘤、陰門癌、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、威爾姆氏 141568.doc • 42- 201014602 瘤（Wilms Tumor) 〇 在另一態樣中，本發明提供治療罹患PGE2有害之病症 之患者的方法，其包含在投與如上文所述之第二藥劑之 前、同時或之後投與如上文所揭示之任一結合蛋白的步 驟。在一實施例中，可與一或多種PGE2拮抗劑（例如抗 PGE2抗體或其片段）共投與及/或共調配之第二治療劑包括 (但不限於）以下一或多者：吸入類固醇；口服類固醇；β促 效劑，例如短效或長效β促效劑；白三烯或白三稀受體之 拮抗劑；組合藥物，諸如ADVAIR ; IgE抑制劑，例如抗 IgE抗體（例如XOLAIR);磷酸二酯酶抑制劑（例如PDE4抑 制劑）；黃嘌呤；抗膽鹼藥物；肥大細胞穩定劑，諸如色 甘酸；IL-4抑制劑；IL-5抑制劑；嗜酸性粒細胞趨化因子 (eotaxin)/CCR3抑制劑；組織胺或其受體（包括HI、H2、 H3及H4)之拮抗劑，及前列腺素D或其受體（DPI及CRTH2；) 之拮抗劑。該等組合可用於治療哮喘及其他呼吸障礙。可 與一或多種抗PGE2抗體或其片段共投與及/或共調配之治 療劑的其他實例包括以下一或多者：尤其TNF拮抗劑（例如 TNF受體之可溶性片段，例如p55或p75人類TNF受體或其 衍生物，例如75 kD TNFR-IgG(75 kD TNF受體-IgG融合蛋 白質，ENBREL)) ; TNF酶拮抗劑，例如TNF轉化酶（TACE) 抑制劑；蕈毒鹼受體拮抗劑；TGF-β拮抗劑；干擾素γ ;佩 福尼酮（perfenidone);化學治療劑，例如甲胺嗓。令、來氟 米特（leflunomide)或西羅莫司（sirolimus)(雷帕黴素）或其類 似物，例如CCI-779 ; COX2及CPLA2抑制劑；NSAID ;免 141568.doc •43- 201014602 疫調節劑；p38抑制劑，TPL-2、MK-2及NFkB抑制劑。額 外第二藥劑係選自由以下組成之群：布替耐德 (budenoside)、表皮生長因子、皮質類固醇、環抱素 (cyclosporin)、柳氮績胺°比咬（sulfasalazine)、胺基水楊酸 酯、6-疏嘌呤、硫0坐嘌吟（azathioprine)、曱硝噠嗤 (metronidazole)、脂質加氧酶抑制劑、美沙拉嗓 (mesalamine)、奥沙拉嗪（olsalazine)、巴柳氮 (balsalazide)、抗氧化劑、凝血脂素抑制劑、IL-1受艘拮抗 劑、抗IL- 1β、單株抗體、抗IL-6单株抗體、生長因子、彈 性蛋白酶抑制劑、吡啶基-咪唑化合物、TNF、LT、IL-1、 IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF及 PDGF之抗體或促效劑、CD2、CD3、 CD4 、 CD8 、 CD25 、 CD28 、 CD30 、 CD40 、 CD45 、 CD69、CD90或其配位體之抗體、曱胺喋呤、環孢素、 FK506、雷帕黴素、黴酚酸嗎啉乙酯、來氟米特、 NSAID、布洛芬、皮質類固醇、潑尼龍（prednisolone)、磷 酸二酯酶抑制劑、腺苷促效劑、抗血栓形成劑、補體抑制 劑、腎上腺素劑、IRAK、NIK、IKK、p38、MAP激酶抑 制劑、IL-Ιβ轉化酶抑制劑、TNFa轉化酶抑制劑、T細胞 信號傳導抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮磺胺"比啶、硫 °坐嘌吟、6-疏嘌呤、血管收縮素轉化酶抑制劑、可溶性細 胞激素受體、可溶性p55 TNF受體、可溶性p75 TNF受體、 sIL-lRI、sIL-lRII、SIL-6R、消炎細胞激素、IL-4、IL-10、IL-11 及 TGFp。 141568.doc -44· 201014602 在一特定實施例中，本發明提供治療罹患前列腺素e2有 害之病症之患者的方法，該方法包含在投與第二藥劑之 前、同時或之後投與本發明之結合蛋白的步驟，其中該第 二藥劑係選自由普遍用於治療各種人類疾病及病症之藥物 組成之群。該等藥物之清單可自網際網路www.drugs.com 獲得。此清單頻繁更新以反映各種人類疾病治療的技術現 狀。該等藥物之清單亦可獲自最新藥物指南（H. Winter Griffith, Stephen Moore之 Complete Guide to Prescription & Nonpresciption Drugs 2008., ISBN-13: 978-0399533723)° 抗PGE2結合蛋白可與上文清單中之用於特定疾病病況之任 何療法組合。舉例而言，抗PGE2結合蛋白可與一或多種用 於治療類風濕性關節炎及青少年類風濕性關節炎之藥劑組 合。此等藥劑之實例包括（但不限於）甲胺喋呤、來氟米 特、低劑量皮質類固醇（諸如普賴蘇（prednisone)或皮質銅 (cortisone))，抗瘧疾藥物（諸如羥基氯化奎寧 (hydroxychloroquine))、金、柳氮確胺"比咬、青黴胺 (penicillamine)、環鱗醯胺（cyclophosphamide)、環抱徽素 (cyclosporine)、二曱胺四環素（minocycline)、乙醯胺苯盼 (acetaminophen)、阿司匹靈（aspirin)、布洛芬、萘普生 (naproxen)、賽利克西、英利昔單抗（Infliximab)、依那西 普（etanercept)、阿達木單抗（adalimumab)、阿巴西普 (abatacept)、利妥昔單抗（rituximab)、阿那白滞素 (anakinra)及其他靶向化-6、11^-611、11^17、11^18、1[-23、B7.1/B7.2之新穎生物劑及經口傳遞藥劑。抗PGE2結 141568.doc -45- 201014602 合蛋白可與一或多種用於治療骨關節炎之藥劑組合。此等 藥劑之實例包括（但不限於）乙醯胺苯酚、阿司匹靈、布洛 芬、萘普生、賽利克西、類固醇、人造關節液，諸如欣維 可（synvisc)及膝爾康（hyalgan)。抗PGE2結合蛋白可與一或 多種用於治療克隆氏病之藥劑組合。此等藥劑之實例包括 (但不限於）阿達木單抗、咪。坐硫嘌吟錠（azasan)、阿薩克 (asacol)、硫》坐嗓吟、續胺塞拉金（azulfidine)、布地縮松 (budesonide)、依託科特（entocort)、滅滴靈（flagyl)、移護 寧（imuran)、英利昔單抗、疏17票呤、甲硝達嗤、普洛托斯 他（protostat)、疏基嗓呤（purinethol)、瑞米卡德（remicade) 及柳氮磺胺吡啶。抗PGE2結合蛋白可與一或多種用於治療 關節黏連性脊椎炎之藥劑組合。此等藥劑之實例包括（但 不限於）阿西脫克（acetocot)、乙醯水揚酸、阿卡普林 81(acuprin 81)、阿達木單抗、阿立伏（aleve)、阿姆闊 (amcort)、阿那普西（anaprox)、阿瑞斯托闊（aristocort)、 阿司匹靈、阿斯皮塔（aspirtab)、阿紮馬闊（azmacort)、百 服寧（bufferin)、巴福克斯（buffex)、凯扶蘭（cataflam)、西 樂葆（celebrex)、速免痛（clinoril)、皮質酮、雙氣芬酸 (diclofenac)、地泊坦（dipentum)、艾斯普林（easprin)、依 那西普（etanercept)、°引σ朵辛（indocin)、°引D朵美辛、英利昔 單抗、萘普生、瑞米卡德、曲安西龍（triamcinolone)及服 他寧（voltaren)。抗PGE2結合蛋白可與一或多種用於治療 多發性硬化症之藥劑組合。此等藥劑之實例包括（但不限 於）阿凡尼西（Avonex)、味。坐硫嗓呤錠、硫嗤°票呤、倍泰龍 141568.doc -46- 201014602 (Betaseron) 布比普瑞（Bubbli-Pred)、克帕松 (Copaxone)、扣托隆（Cotolone)、格拉默（Glatiramer)、移 護寧、干擾素β-la、干擾素β-lb溶液、凱普瑞（Key-Pred)、 凱普瑞SP(Key-Pred SP)、 米托蒽酿 (Mitoxantrone)、那他珠單抗（Natalizumab)、那凡曲隆 (Novantrone)、奥拉普德（Orapred)、奥拉普德ODT、培地 普德（Pediapred)、普瑞傑特50(Pred-Ject-50)、普瑞達闊 50(Predacort 50)、普瑞達龍 50(Predalone 50)、普瑞德特 50(Predate-50)、潑尼龍、普瑞隆（Prelone)、利比（Rebif)及 泰沙比瑞（Tysabri)。抗PGE2結合蛋白可與一或多種用於治 療各種人類癌症及惡性疾病之藥劑或治療程序組合。除了 可自網際網路網站www.drugs.com及最新藥物指南（H. Winter Griffith, Stephen Moore 之 Complete Guide to Prescription & Nonpresciption Drugs 2008., ISBN-13: 978-0399533723)獲得之清單之外，NCI亦保留關於美國食品及 藥品管理局（U_S. Food and Drug Administration，FDA)批 准用於治療癌症或與癌症相關病狀之某些藥物的藥物資 訊。此等藥劑之實例包括（但不限於）阿百先（Abraxane)、 阿德力徽素（Adriamycin)、阿杜西（Adrucil)、艾達樂 (Aldara)、阿倫單抗（Alemtuzumab)、力比泰（Alimta)、胺 基乙醢丙酸、安美達錠（Anastrozole)、阿瑞匹坦 (Aprepitant) ' 瑞寧德（Arimidex)、阿諾新（Aromasin)、阿 侖恩（Arranon)、三氧化二石申、阿瓦斯灯（Avastin)(貝伐單 抗（Bevacizumab))、阿紮胞苷（Azacitidine)、貝伐單抗、接 141568.doc -47- 201014602 薩羅丁（Bexarotene)、领替佐米（B〇rtezomib)、坎帕斯 (Campath)(阿倫單抗）、坎普托斯塔（Camptosar)(鹽酸伊立 替康（Irinotecan Hydrochloride))、卡培他濱 (Capecitabine)、卡始（carboplatin)、西妥昔單抗 (Cetuximab)、順始（cisplatin)、卡拉务（Clafen)(環填醢 胺）、氯伐拉濱（Clofarabine)、科洛法瑞（Cl〇farex)(乳伐拉 濱）、科羅拉（Clolar)(氣伐拉濱）、環磷醯胺、阿糖胞苷 (Cytarabine)、賽德薩-U(Cytosar-U)(阿糖胞普）、賽托先 (Cytoxan)(環磷醯胺）、達珂（Dacogen)(地西他濱 (Decitabine))、達沙替尼（Dasatinib)、地西他濱、蒂潑西 (DepoCyt)(脂質阿糖胞苷）、蒂潑福馬（DepoFoam)(脂質阿 糖胞苷）、鹽酸右雷佐生（Dexrazoxane Hydrochloride)、多 西他賽（Docetaxel)、多昔（Doxil)(鹽酸多柔比星脂質體 (Doxorubicin Hydrochloride Liposome))、鹽酸多柔比星、 鹽酸多柔比星脂質體、Dox-SL(鹽酸多柔比星脂質體）、艾 福德（Efudex)(氟尿嘧啶）、艾倫斯（Ellence)(鹽酸表柔比星 (Epirubicin Hydrochloride))、樂沙定（Eloxatin)(奥沙利鉑 (oxaliplatin))、艾蒙德（Emend)(阿瑞匹坦（Aprepitant))、鹽 酸表柔比星、愛必妥（Erbitux)(西妥昔單抗）、鹽酸埃羅替 尼（Erlotinib Hydrochloride)、艾伐昔特（Evacet)(鹽酸多柔 比星脂質體）、艾維斯達（Evista)(鹽酸雷洛昔芬（Raloxifene Hydrochloride))、依西美坦（Exemestane)、伐斯洛德 (Faslodex)(氟維斯群（Fulvestrant))、非馬拉（Femara)(來曲 唑（Letrozole))、氟洛普雷（Fluoroplex)(氟尿嘧啶）、氟尿嘧 141568.doc •48· 201014602 啶、氟維斯群、吉非替尼（Gefitinib)、鹽酸吉西他濱 (Gemcitabine Hydrochloride)、吉妥單抗奥 α坐米星 (Gemtuzumab Ozogamicin)、健擇（Gemzar)(鹽酸吉西他 濱）、格列衛（Gleevec)(甲磺酸伊馬替尼（Imatinib Mesylate))、 赫赛汀（Herceptin)(曲妥珠單抗 (Trastuzumab))、和美新（Hycamtin)(鹽酸拓撲替康 (Topotecan Hydrochloride))、甲績酸伊馬替尼、咪嗜莫特 (Imiquimod)、易瑞沙（Iressa)(吉非替尼）、鹽酸伊立替康、 伊沙匹隆（Ixabepilone)、埃坡黴素（Ixempra)(伊沙匹隆）、 克奥昔芬（Keoxifene)(鹽酸雷洛昔芬）、克皮凡昔 (Kepivance)(帕麗非明（Palifermin))、二曱苯磺酸拉帕替 (Lapatinib Ditosylate)、來那度胺（Lenalidomide)、來曲 唑、雷戊蘭（Levulan)(胺基乙醯丙酸）、立波杜 (LipoDox)(鹽酸多柔比星脂質體）、脂質阿糖胞苷、美赛唑 斯通（Methazolastone)(替莫唾胺（Temozolomide))、美洛沙 (]\^1〇3&1*)(阿紮胞普）、麥羅塔（]^[71〇丨&1§)(吉妥單抗奥。坐来 星）、奈米粒子太平洋紫杉醇（太平洋紫杉酵白蛋白穩定化 奈米粒子調配物）、奈拉濱（Neiarabine)、尼奥沙 (Neosar)(環磷醯胺）、多吉美（Nexavar)(甲苯磺酸索拉非尼 (Sorafenib Tosylate))、尼羅替尼（Nilotinib)、諾瓦得士 (Nolvadex)(檸檬酸他莫昔芬（Tamoxifen citrate))、恩卡斯 巴（Oncaspar)(培門冬酶（Pegaspargase))、奥沙利翻、太平 洋紫杉醇、太平洋紫杉醇白蛋白穩定化奈米粒子調配物、 帕麗非明（Palifermin)、帕尼單抗（Panituinumab)、帕拉普 141568.doc •49· 201014602 拉（Paraplat)(卡鉑）、伯爾定（Paraplatin)(卡鉑）、培門冬 酶、培美曲塞二納（Pemetrexed Disodium)、帕拉提諾_ AQ(Platinol-AQ)(順舶）、帕拉提諾（Platinol)(順翻）、鹽酸 雷洛昔芬、雷利米得（Revlimid)(來那度胺）、美羅華 (Rituxan)(利妥昔單抗（Rituximab))、利妥昔單抗、司蘭索 胸膜内氣溶膠（Sclerosol Intrapleural Aerosol)(滑石粉）、曱 苯磺酸索拉非尼、撲瑞赛（Spry cel)(達沙替尼）、無菌滑石 粉（滑石粉）、斯特瑞托克（Steritalc)(滑石粉）、蘋果酸舒尼 替尼（Sunitinib Malate)、舒坦特（Sutent)(蘋果酸舒尼替 尼）、赛諾維（Synovir)(沙立度胺）、滑石粉、檸檬酸他莫昔 芬、塔拉賓（Tarabine)PFS(阿糖胞苷）、特羅凱（Tarceva)(鹽 酸埃羅替尼）、塔革雷；丁（Targretin)(搭薩羅丁 (Bexarotene))、塔賽格納（Tasigna)(尼羅替尼）、紫杉紛（太 平洋紫杉醇）、泰素帝（多西他賽）、替莫達（Temodar)(替莫 。坐胺）、替莫0坐胺、坦西莫司（Temsirolimus)、賽羅密德 (Thalomid)(沙立度胺）、沙立度胺、托泰克（Totect)(鹽酸右 雷佐生）、鹽酸拓撲替康、馱瑞塞爾（Torisel)(坦西莫司 (Temsirolimus))、曲妥珠單抗、三森諾（Trisenox)(三氧化 二砷）、泰克布（Tykerb)(二曱苯磺酸拉帕替）、維克替比 (Vectibix)(帕尼單抗（Panitumumab))、萬珂（Velcade)(侧替 佐米）、維達紮（Vidaza)(阿紮胞苷）、伏立諾他 (Vorinostat)、希羅達（Xeloda)(卡培他濱（Capecitabine))、 辛卡德（Zinecard)(鹽酸右雷佐生）、《>坐來膦酸（Zoledronic Acid)、唑林紮（Zolinza)(伏立諾他（Vorinostat))及擇泰 141568.doc -50- 201014602 (Zometa)(唑來膦酸）。
在-較佳實施例中，上文揭示之咖2結合蛋白醫藥組 合物係藉由至少一種選自以下之模式投與個體：非經腸、 皮下' 肌肉内、靜脈内、關節内、支氣管内、腹内、囊 内、軟骨内、腔内、體腔内、小腦内、腦室内、大腸内、 子宮頸内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包 内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直腸内、腎内、 視網膜内、脊椎内、滑臈内、胸腔内、子宮内、膀胱内、 快速注射、陰道、直腸、經頰、舌下、鼻内及經皮。 【實施方式】 當與隨附圖式一起閱讀時，自以下對較佳實施例之描述 將更充分理解本發明之前述及其他目標、特徵及優勢以及 本發明自身。 本發明係關於前列腺素E2(PGE2)結合蛋白，尤其結合 PGE2之抗pci抗體或其抗原結合片段。本發明之多個態 樣係關於抗體及抗體片段及其醫藥組合物，以及用於製備 該等抗體及片段之核酸、重組表現載體及宿主細胞。本發 明亦涵蓋使用本發明抗體來在活體外或活體内偵測pgE2、 抑制一或多種PGE2活性；及調控基因表現之方法。 除非本文另外定義，否則結合本發明使用之科學及技術 術語將具有一般技術者通常所瞭解之含義。術語之含義及 範脅應為清晰的，然而’在任何隱約含糊之事件中，本文 &供之定義優先於任何字典或外來定義。此外，除非上下 文另外要求，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括 141568.doc •51· 201014602 單數。在本申請案中，除非 Γ L t 卜說明，否則使用「或J意 明及/或」。此外，使用術語「自β 匕括（including)」（以及J: 他形式，諸如「includes」及「in〗^ ( 八 .._ ,, neluded」）不具有限制 性。同樣，除非另外明確說明， 乃否則啫如「元件」或「組 件」之術語涵蓋包含一個單元 〇 早兀之兀件及組件及包含一個以 上次單元之元件及組件。 -般而言，本文所述之與細胞及組織培養、分子生物 學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質與核酸化學及雜 交有關的所使用之命名法及其技料此項技術中所熟知及 常用之命名法及技術。除非另外說明，否則—般根據此項 技術中熟知之習知方法及如本說明書全文所引用及論述之 多種-般及更為具體之參考文獻所描述之方法執行本發明 之方法及技術。酶促反應及純化技術係根據製造商說明 書，如此項技術中通常所實現或如本文所述來執行。本文 所述之結合分析化學、合成有機化學及醫學及醫藥化學使 用之命名法及其實驗室程序與技術為此項技術中所熟知及 常用之命名法及程序與技術。對於化學合成、化學分析、 醫藥製備、調配及傳遞及患者之治療使用標準技術。 本發明可更容易地理解，所選擇之術語定義如下。 如本文所用之術語「多肽」係指胺基酸之任何聚合鏈。 術語「肽」及「蛋白質」可與術語多肽互換使用且亦係指 胺基酸之聚合鏈。術語「多肽」涵蓋天然或人工蛋白質、 蛋白質片段及蛋白質序列之多肽類似物。多肽可為單體或 聚合體。 141568.doc •52- 201014602 術》° 經分離蛋白質」或「經分離多肽」為一種蛋白質
或多狀，根據其獲得起源或來源，該蛋白質或多肽不與其 以天然狀態存在時相伴之天然相關組份締合；實質上不含 來自同一物種之其他蛋白質；由來自不同物種之細胞表 現；或在自然界中不存在。因此，化學合成或在不同於其 ^然起源之細胞的細胞系統中合成之多肽將與其天然相關 組份「分離」。使用此項技術中熟知之蛋白質純化技術藉 由分離亦可使蛋白質實質上不含天然相關組份。 如本文所用之術語Γ回收」係指例如使用此項技術熟知 之蛋白質純化技術藉由分離使化學物質（諸如多肽）實質上 不含天然相關組份之過程。 :本文所用之術語「前列腺素E2」（本文中縮寫為㈣2) 係指具有以下結構之前列腺素或其保留-些或全部_2活
如本文所用之「生物活性传
」係托、、，田胞激素之固有生物學 特丨生。PGE2之生物學特性包括 人。 括（仁不限於）與PGE2受體結 相^文所用之關於抗體、蛋白質或肽與第二化學物質之 學物η「特異性結合」意謂該相互作用取決於化 在.例如 如抗原衫子或抗原以基）之存 k體識別且結合料蛋白質結構而非與蛋白質 14J568.doc •53- 201014602 廣泛結合。若抗體對抗原決定基「A」具有特異性，則在 含經標記「A」及抗體之反應中存在含抗原決定基A之分 子（或游離、未經標記之A)將減少與該抗體結合之經標記A 的量。 如本文所用之術語「抗體」泛指包含四個多肽鏈（兩個 重（H)鏈及兩個輕（L)鏈）之任何免疫球蛋白（Ig)分子或其保 留Ig分子之必需抗原決定基結合特徵的任何功能片段、突 變體、變異體或衍生物。該突變體、變異體或衍生物抗體 型式為此項技術中所已知。下文論述其非限制性實施例。 在全長抗體中，各重鏈包含重鏈可變區（本文中縮寫為 HCVR或VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含3個結構域 CHI、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區（本文中縮寫為 LCVR或VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個結構域 CL。可將VH及VL區進一步細分為高變區（稱為互補決定區 (CDR))，其間散布有更為保守之區（稱作構架區（FR))。各 VH及VL由三個CDR及四個FR構成，且自胺基末端至羧基 末端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、 CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可為任何類型（例如IgG、 IgE、IgM、IgD、IgA 及 IgY)、類別（例如 IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4、IgAl 及 IgA)或子類。 如本文所用之術語抗體之「抗原結合部分」或「抗原結 合片段」（或簡稱為「抗體部分」）係指保留與抗原（例如 PGE2)特異性結合之能力的抗體之一或多個片段。抗體之 抗原結合功能可由全長抗體之片段執行。該等抗體實施例 • 54· 141568.doc 201014602 亦可具有雙特異性、雙重特異性或多特異性型式；其與兩 個或兩個以上不同抗原特異性結合。術語抗體之「抗原結 合部分」内所涵蓋之結合片段的實例包括：（i) Fab片段， 一種由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；（ii) F(ab')2 片段，一種包含經由位於鉸鏈區之二硫橋鍵連接之兩個 Fab片段的二價片段；（iii) Fd片段，其係由VH及CH1域組 成；（iv) Fv片段，其係由抗體之單一臂之VL及VH域組 成；（v) dAb 片段（Ward等人，（1989) 341:544-546，
Winter等人，PCT公開案WO 90/05144 A1)，其包含單一可 變域；及（vi)經分離互補決定區（CDR)。此外，儘管Fv片 段之兩個結構域（VL及VH)係由獨立基因編碼，但其可使 用重組方法藉由使得其能夠製備為VL及VH區配對形成單 價分子之單一蛋白質鏈（稱為單鏈Fv(scFv);例如參見Bird 等人，（1988) 242:423-426 ;及 Huston 等人， (1988) /Voc. dead. Sci. C/M 85:5879-5883)的合成連 接子聯接。該等單鏈抗體亦涵蓋於術語抗體之「抗原結合 部分」内。亦涵蓋單鏈抗體之其他形式，諸如雙功能抗 體。雙功能抗體為二價、雙特異性抗體，其中VH及VL域 表現於單個多肽鏈上，但使用過短以致於相同鏈上之兩個 結構域之間不能配對的連接子，藉此迫使該等結構域與另 一鏈之互補結構域配對且形成兩個抗原結合位點（例如參 見 Holliger，P 等人，（1993) iVoc. iVai/· Jcad Sc/, 90:6444-6448 ； Poljak, R.J^A > (1994) Structure 2:1121-1123)。該等抗體結合部分為此項技術中所已知 141568.doc 55· 201014602 (Kontermann 及 Dubel 編，Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag，New York，第 790 頁（ISBN 3-540-41354-5)。 如本文所用之術語「抗體構築體」係指包含一或多個與 連接多肽或免疫球蛋白恆定域連接之本發明抗原結合部分 的多肽。連接多肽包含兩個或兩個以上經肽鍵聯接之胺基 酸殘基且用於連接一或多個抗原結合部分。該等連接多肽 為此項技術中所熟知（例如參見Holiiger，p等人’（1993) /Voc. 90:6444-6448，Poljak，R.J 等 人，（1994) 2:1121-1123)。免疫球蛋白怪定域係 指重鏈或輕鏈恆定域。人類重鏈及輕鏈恆定域胺基酸 序列為此項技術中所已知且呈現於表1中。 表1:人類IgG重鏈恆定域及輕鏈恆定域之序列
蛋白質 序列標識符 序列 12345678901234567890123456789012 Igy-Ι怪定區 SEQIDNO.rl ASTKGPSVFFLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK Ig γ-1怪定區突變艘 SEQ ID NO. ：2 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK •56- 141568.doc 201014602
IgK慢定區 SEQ ID NO.:3 TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC IgX恆定區 SEQ ID NO.:4 QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDF YPGAVWAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNK YAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVE KTVAPTECS 此外，抗體或其抗原結合部分可為較大免疫黏附分子之 一部分，該較大免疫黏附分子係由該抗體或抗體部分與一 或多個其他蛋白質或肽共價或非共價締合形成。該等免疫 黏附分子包括使用抗生蛋白鏈菌素核心區製備四聚scFv分 子(ICipriyanov， S.M.等人，(1995) Human Antibodies and Z/jftrzWom似6:93-101)及使用半胱胺酸殘基、標記肽及C端 聚組胺酸標籤製備二價及經生物素標記scFv分子 (Kipriyanov，S.M.等人 ’（1994) Mo7. 31:1047- 1058)。可分別使用諸如完整抗體之木瓜蛋白酶或胃蛋白 酶消化之習知技術自完整抗體製備諸如Fab& F(ab·)2片段 之抗體部分。此外，可使用如本文所述之標準重組DNA技 術獲得抗體、抗體部分及免疫黏附分子。 如本文所用之「經分離抗體」欲指實質上不含具有不同 抗原特異性之其它抗體的抗體（例如’特異性結合PGE2之 經分離抗體實質上不含特異性結合除PGE2以外之抗原的抗 體）。然而，特異性結合PGE2之經分離抗體可對其他抗原 (諸如前列腺素El(PGE〇分子）具有交叉反應性。此外，經 分離抗體可實質上不含其他細胞物質及/或化學品。 如本文所用之術語「人類抗體」意欲包括具有來源於人 類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及怪定區的抗體。本發 明人類抗體可包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之 141568.doc -57- 201014602 胺基酸殘基（例如，藉由活體外隨機或位點特異性突變誘 發或藉由活體内體細胞突變引入之突變），例如在CDR且 尤其CDR3中。然而，如本文所用之術語「人類抗體」並 不欲包括來源於另一哺乳動物物種（諸如小鼠）之生殖系的 CDR序列已移植至人類構架序列上之抗體。 如本文所用之術語「重組人類抗體」意欲包括藉由重組 方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，諸如使用 轉染至宿主細胞中之重組表現載體表現之抗體（在下文第II C部分中進一步描述）、自重組組合人類抗體文庫分離之抗 體（Hoogenboom H.R·，（1997) 775 7Vc/l 15:62-70 ; Azzazy Η.及 Highsmith W.E., (2002) Clin. Biochem. 35:425-445 ； Gavilondo J.V.ALarrick J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145 ; Hoogenboom H.及 Chames P. (2000) Immunology Γοί/β少21:371-378)、自人類免疫球蛋白基因轉殖基因動物 (例如小鼠）分離之抗體（例如參見Taylor, L. D.等人，（1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295 ； Kellermann S-A.及 Green L.L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597 ; Little M.等人，(2000) Tmwwno/ogj Today 21:364-3 70)或藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列拼接至其他 DNA序列的任何其他方式製備、表現、產生或分離之抗 體。該等重組人類抗體具有來源於人類生殖系免疫球蛋白 序列之可變區及恆定區。然而，在某些實施例中，該等重 組人類抗體經受活體外突變誘發（或當使用人類Ig序列轉殖 基因動物時，經受活體内體細胞突變誘發）且因此重組抗 141568.doc • 58 - 201014602 體之VH及VL區胺基酸序列為儘管來源於人類生殖系VH及 VL序列且與人類生殖系VH及VL序列相關、但可能在活體 内不天然存在於人類抗體生殖系譜内的序列。一實施例提 供可使用此項技術中熟知之技術產生之能夠結合PGE2之完 全人類抗體，該等技術諸如（但不限於）使用人類Ig噬菌體 文庫（諸如Jermutus等人，PCT公開案第WO 2005/007699 A2號中所揭示之噬菌體文庫）。 術語「嵌合抗體」係指包含來自一物種之重鏈及/或輕 鏈可變區序列及來自另一物種之恆定區序列的抗體，諸如 具有鼠類重鏈及輕鏈可變區與人類恆定區連接之抗體。 術語「CDR移植抗體」係指包含來自一物種之重鏈及/ 或輕鏈可變區序列但其中VH及/或VL之一或多個CDR區之 序列經另一物種之CDR序列置換的抗體，諸如具有一或多 個鼠類CDR(例如CDR3)已經人類CDR序列置換之鼠類重鏈 及輕鏈可變區之抗體。 術語「人類化抗體」係指包含來自非人類物種（例如小 鼠）之重鏈及輕鏈可變區序列，但其中至少一部分VH及/或 VL序列已經改變而更「類似人類」，亦即更加類似於人類 生殖系可變序列的抗體。一種類型之人類化抗體為CDR移 植抗體，其中將人類CDR序列引入非人類VH及VL序列中 以置換相應非人類CDR序列。在一實施例中，提供人類化 抗PGE2抗體及抗原結合部分。該等抗體係藉由使用慣用融 合瘤技術獲得鼠類抗PGE2單株抗體，隨後使用活體外遺傳 工程改造（諸如Kasaian等人PCT公開案第WO 2005/123126 141568.doc -59- 201014602 A2號中所揭示者）人類化產生。 術語「Kabat編號」、「Kabat界定」及「Kabat標記」在 本文中可互換使用。此項技術中公認之此等術語係指相比 於抗體或其抗原結合部分之重鏈及輕鏈可變區中之其他胺 基酸殘基更可變（亦即高變）之胺基酸殘基的編號系統 (Kabat等人，（1971) dead, Sc/· 190:382-391 及
Kabat, E.A.等人，（1991) Segwewces 〇/ 〇/
Immunological Interest，第5版，美國衛生及公共服務部 (U.S. Department of Health and Human Services), NIH公開 案第91-3 242號）。對於重鏈可變區而言，高變區範圍為 CDR1之胺基酸位置31至35，CDR2之胺基酸位置50至65， 及CDR3之胺基酸位置95至102。對於輕鏈可變區而言，高 變區範圍為CDR1之胺基酸位置24至34，CDR2之胺基酸位 置50至56，及CDR3之胺基酸位置89至97。 如本文所用之術語「受體」及「受體抗體」係指提供或 編碼一或多個構架區之胺基酸序列之至少80%、至少 85%、至少90%、至少95%、至少98%或100%的抗體或核 酸序列。在一些實施例中，術語「受體」係指提供或編碼 恆定區之抗體胺基酸或核酸序列。在另一實施例中，術語 「受體」係指提供或編碼構架區及恆定區中之一或多者的 抗體胺基酸或核酸序列。在一特定實施例中，術語「受 體」係指提供或編碼一或多個構架區之胺基酸序列之至少 80%、較佳至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或 100%的人類抗體胺基酸或核酸序列。根據此實施例，受 141568.doc •60· 201014602 體可含有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5 個或至少10個不出現於人類抗體之一或多個特定位置之胺 基酸殘基。受體構架區及/或受體恆定區可例如來源於或 獲自生殖系抗體基因、成熟抗體基因、功能性抗體（例如 此項技術中熟知之抗體、處於開發中之抗體或市售抗 體）。 ： 如本文所用之術語「CDR」係指抗體可變序列内之互補 決定區。重鏈及輕鏈之可變區中各存在三個CDR，各可變 . 區之該三個CDR指定為CDR1、CDR2及CDR3。如本文所
用之術語「CDR組」係指存在於能夠結合抗原之單一可變 區中的三個CDR之群。此等CDR之確切邊界已根據不同系 統經不同界定。Kabat所述之系統（Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest (國家健康研究院 (National Institutes of Health), Bethesda, Md. (1987)及 (1991))不僅提供適用於抗體之任何可變區的明確殘基編號 φ 系統，且亦提供界定三個CDR之確切殘基邊界。此等CDR 可稱為Kabat CDR。Chothia及其合作者（Chothia及 Lesk，J. 、 Mol. Biol. 196:901-917 (1987)及 Chothia 等人，Nature 342:877-883 (1989))發現Kabat CDR内之某些子部分即使在 胺基酸序列層面具有極大多樣性，亦採用幾乎相同的肽主 鏈構形。此等子部分指定為LI、L2及L3或HI、H2及H3， 其中「L」及「H」分別表示輕鏈區及重鏈區。此等區可 稱為Chothia CDR，其具有與Kabat CDR重疊之邊界。界定 與Kabat CDR重疊之CDR之其他邊界已由Padlan(FASEB J. 141568.doc •61 · 201014602 9:133-139(1995))及 MacCallum(J Mol Biol 262(5):732- 45(1996))描述。其他CDR邊界界定可能不嚴格遵循以上系 統中之一者，但仍會與Kabat CDR重疊，不過根據待定殘 基或殘基群或甚至整個CDR不顯著影響抗原結合之預測或 實驗研究結果其可能會縮短或延長。本文中所用之方法可 利用根據此等系統中之任一者所界定之CDR，但較佳實施 例使用Kabat或Chothia界定之CDR。 如本文所用之術語「標準」殘基係指CDR或構架中界定 如由 Chothia 等人，J. Mol. Biol. 196:901-907 (1987); Chothia等人，J. Mol. Biol. 227:799 (1992)所定義之特定標 準CDR結構之殘基。根據Chothia等人，許多抗體之CDR之 關鍵部分即使在胺基酸序列層面具有極大多樣性，亦具有 幾乎相同的肽主鏈構形。各標準結構主要指定一組使胺基 酸殘基之鄰接區段形成環之肽主鏈扭轉角。 如本文所用之術語「供體」及「供體抗體」係指提供一 或多個CDR之抗體。在一較佳實施例中，供體抗體為來自 不同於獲得或產生構架區之抗體之物種的抗體。在人類化 抗體之情形下，術語「供體抗體」係指提供一或多個CDR 之非人類抗體。 如本文所用之術語「構架」或「構架序列」係指可變區 減去CDR之剩餘序列。因為CDR序列之確切界定可由不同 系統確定，所以構架序列之含義遵循相應的不同解釋。六 個CDR(輕鏈之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3及重鏈之CDR-Hl、CDR-H2及CDR-H3)亦將輕鏈及重鏈上之構架區在各 141568.doc -62- 201014602 鏈上分成四個子區（FRl、FR2、FR3及FR4)，其中CDR1位 於FR1與FR2之間，CDR2位於FR2與FR3之間，且CDR3位 於FR3與FR4之間。在不將特定子區指定為FRl、FR2、 FR3或FR4之狀況下，構架區當以其他名稱提及時代表天 然存在之單一免疫球蛋白鏈之可變區中之組合FR。如本文 所用之一 FR代表四個子區中之一者，且FR代表構成構架 區之四個子區中之兩個或兩個以上子區。例示性FR序列參 見表5及6。 如本文所用之術語「生殖系抗體基因」或「生疽系抗體 基因片段」係指由未經歷導致遺傳重排及突變從而表現特 定免疫球蛋白之成熟過程之非淋巴細胞編碼的免疫球蛋白 序列。（例如參見 Shapiro等人，Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002) ； Marchalonis 等人，Adv Exp Med Biol. 484:13-30 (2001))。本發明之各個實施例所提供之一個優 點基於如下認知：生殖系抗體基因比成熟抗體基因更可能 保留物種中個體之必需胺基酸序列結構特徵，因此當用於 治療彼物種時，不太可能判別為來自外來來源。 如本文所用之術語「關鍵」殘基係指可變區中對抗體 (尤其人類化抗體）之結合特異性及/或親和力具有較大影響 的某些殘基。關鍵殘基包括（但不限於）以下一或多種殘 基：與CDR相鄰之殘基、潛在糖基化位點（可為N-或0-糖 基化位點）、稀有殘基、能夠與抗原相互作用之殘基、能 夠與CDR相互作用之殘基、典型殘基、重鏈可變區與輕鏈 可變區之間的接觸殘基、Vernier區内之殘基，及Chothia 141568.doc -63- 201014602 界定之可變重鏈CDR1與Kabat界定之第一重鏈構架之間重 疊之區域中的殘基。 如本文所用之術語「人類化抗體」為與所關注抗原免疫 特異性結合且包含實質上具有人類抗體胺基酸序列之構架 (FR)區及實質上具有非人類抗體胺基酸序列之互補決定區 (CDR)的抗體或其變異體、衍生物、類似物或片段。如本 文所用之術語「實質上」在CDR之情形下係指具有與非人 類抗體CDR之胺基酸序列至少80%、較佳至少85%、至少 90%、至少95。/。、至少98。/。或至少99。/。一致之胺基酸序列的 CDR。人類化抗體包含至少一個且通常兩個可變域（例如 Fab、Fab，、F(ab')2、FabC、Fv)之實質上全部，其中全部 或實質上全部CDR區對應於非人類免疫球蛋白（亦即供體 抗體）之彼等CDR區且全部或實質上全部構架區為人類免 疫球蛋白共同序列之彼等構架區。較佳地，人類化抗體亦 包含免疫球蛋白恆定區（Fc)(通常為人類免疫球蛋白恆定 區）之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體含有輕 鏈以及至少重鏈之可變域。抗體亦可包括重鏈之CH1、鉸 鏈區、CH2、CH3及CH4區。在一些實施例中，人類化抗 體僅含有人類化輕鏈。在一些實施例中，人類化抗體僅含 有人類化重鏈。在特定實施例中，人類化抗體僅含有輕鏈 及/或人類化重鏈之人類化可變域。 人類化抗體可選自任何類別之免疫球蛋白，包括IgM、 IgG、IgD.、IgA及IgE，及任何同型，包括（但不限 於）IgGl ' IgG2、IgG3及IgG4。人類化抗體可包含—種以 141568.doc 201014602 上類型或同型之序列，且特定恆定域可經選擇以使用此項 技術中熟知之技術優化所要效應功能。 人類化抗體之構架區及CDR區不需要與親本序列精確對 應，例如供體抗體CDR或一致構架可藉由取代、插入及/ 或缺失至少一個胺基酸殘基來誘發突變以使在該位點處之 CDR或構架殘基不與供體抗體或共同構架對應。然而，在 . 一較佳實施例中，該等突變將不會廣泛進行。一般而言， ❹ 至少80%、較佳至少85%、更佳至少9〇〇/。及最佳至少95%之 人類化抗體殘基將對應於親本1?11及（：1)11序列之彼等殘基。 如本文所用之術語「共同構架」係指共同免疫球蛋白序列 之構架區。如本文所用之術語「共同免疫球蛋白序列」係 指由相關免疫球蛋白序列家族中最常見之胺基酸（或核苷 酸）形成之序列（例如參見Winnaker, From Genes to Clones (veriagSgeseiischaft，Weinheim，Germany 1987))。在免疫 球蛋白家族中，共同序列中之各位置係由該家族中在彼位 參置處最常見之胺基酸佔據。若兩個胺基酸以同等頻率出 現，則共同序列中可包括任一個。 如本文所用之「Vernier」區係指如Foote及Wintei>(1992) J. Mol· Biol. 224:487-499所述之可調節CDR結構且微調與 抗原之配合的構架殘基子集。Vernier區殘基形成作為 基礎之層且可對CDR之結構及抗體親和力產生影響。 術語「多價結合蛋白」在本說明書中用於表示包含兩個 或兩個以上抗原結合位點之結合蛋白。多價結合蛋白較佳 經工程改造成具有三個或三個以上抗原結合位點且通常不 141568.doc -65· 201014602 為天然存在之抗體。術語「多特異性結合蛋白」係指能夠 結合兩個或兩個以上相關或不相關目標之結合蛋白。如本 文所用之雙重可變域（DVD)結合蛋白為包含兩個或兩個以 上抗原結合位點之結合蛋白且為四價或多價結合蛋白。該 等DVD結合蛋白可為單特異性的，亦即能夠結合一個抗 原；或多特異性的，亦即能夠結合兩個或兩個以上抗原。 包含兩個重鏈DVD多肽及兩個輕鏈DVD多肽之DVD結合蛋 白稱為DVD-IgTM。DVD-Ig之每一半包含重鏈DVD多肽及 輕鏈DVD多肽，及兩個抗原結合位點。各結合位點包含重 鏈可變域及輕鏈可變域，其中每一抗原結合位點總計有6 個CDR參與抗原結合。 如本文所用之術語「中和」係指當結合蛋白特異性結合 細胞激素或脂質代謝物時，中和細胞激素或脂質代謝物之 生物活性。中和結合蛋白較佳為中和抗體，其與PGE2之結 合對PGE2之生物活性產生抑制作用。較佳地，中和結合蛋 白結合PGE2且使PGE2之生物活性降低至少約10%、20%、 40%、60%、80%、85%或85%以上。可藉由量測此項技術 中熟知的PGE2生物活性之一或多個指標來評估中和結合蛋 白對PGE2之生物活性的抑制。舉例而言，藉由使用過表現 EP4受體之HEK293細胞進行EP4檢定來評估對PGE2誘發之 鈣流入的抑制（參見實例1.1.C 1)。 術語「活性」包括以下活性，諸如抗體對抗原之結合特 異性/親和力，例如與PGE2抗原結合之抗PGE2抗體；及/或 抗體之中和效力，例如與PGE2之結合抑制PGE2之生物活 141568.doc -66- 201014602 性的抗PGE2抗體，例如藉 HF1C9Q.. 使用過表現EP4受體之 293細胞進行的EP4檢定來 a ^ y 砰估對PGE2誘發之鈣流入 1抑制（參見貫例U.C 〇。 術語「抗原決定基包括 匕括此夠與免疫球蛋白或T細胞受 體特異性結合之任何多肽決 ^ φ ^ ^ ^ ^ 子。在某些實施例中，抗原 决疋基決疋子包括分子之 舻 化予活性表面基團（諸如胺基 -夂糖側鏈、磷醯基或磺醯基），H .宜
) 且在某些實施例中，其 可具有特定三維結構特徵及/ 、 A t 及特疋電何特徵。抗原決定 土為由抗體結合之抗原區域。在某些實施例中當抗體在 :白質及/或大分子之複雜混合物中優先識別其目標抗原 時’認為該抗體特異性結合抗原。 本文所用之術語「表面電漿妓椐筏社△ # -, 包水/、m」係指允許藉由（例如） 使用 BIAcore 系統（PharmaH。r> · ^ irnarmacia Biosensor AB, Uppsala,
Sweden and Piscataway，NJ)偵測生物傳感器基質内蛋白質 濃度之改變來分析即時生物特異性相互作用之光學現象。 更多描述參見Jansson，U.等人，（1993)义⑽·价〇/ c/iw 51:19-26; J3nsson，U.等人，（1991)如咐c/2__ 11:62〇_ 627; Johnsson，B.等人，（1995) 乂施/.心cog„"· 8:125_ 131 ;及Johnnson，B·等人，(1991)如α/·及沁以㈣ 198:268 277 ° 如本文所用之術語「kon」意欲指如此項技術所已知之抗 體與抗原締合形成抗體/抗原複合物之締合速率常數。 如本文所用之術語「koff」意欲指如此項技術已知之抗 體自抗體/抗原複合物解離之解離速率常數。 141568.doc -67- 201014602 如本文所用之術語「kd」意欲指如此項技術已知之特定 抗體-抗原相互作用之解離常數。 如本文所用之術s吾「經標έ己結合蛋白」係指已併有可供 鑑別結合蛋白之標記的蛋白質。較佳地，標記為可偵測標 記物’例如併入經放射性標記之胺基酸或與可由經標記抗 生物素蛋白（例如含有可以光學或比色方法偵測之螢光標 ： 記物或酶促活性之抗生蛋白鏈菌素）偵測之具有生物素基 刀之夕狀連接。用於多狀之標記之實例包括（但不限於） 以下·放射性同位素或放射性核素（例如3H、“c、35s、 參 9〇Y、99Tc、mln、”、131l、177Lu、166如或 153Sm);螢光 標記（例如FITC、若丹明（rh〇damine)、鑭系金屬磷光體）； 酶標記（例如辣根過氧化酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶）；化 學發光標記物；生物素基；由二次報導體識別之預定多肽 抗原決定基（例如白胺酸拉鏈對序列、二次抗體之結合位 點、金屬結合域、抗原決定基標籤）；及諸如釓螯合物之 磁化劑。 術語「抗體結合物」係指以化學性方式連接第二化學部 〇 分（諸如治療劑或細胞毒性劑）之結合蛋白（諸如抗體）。本 文所用之術S#「藥劑」表示化合物、化合物之混合物、生 物大分子或由生物材料製備之萃取物。較佳地，治療劑或 細胞毒性劑包括（但不限於）百曰咳毒素（pertussis t〇xin)、 紫杉盼、細胞鬆弛素B(Cyt〇chalasin B)、短桿菌肽 D(gramicidin D)、>臭化乙錠、吐根素（emetine)、絲裂黴素 (mitomycin)、依託泊苷（et〇p〇side)、特諾波赛 141568.doc -68- 201014602 (tenoposide)、長春新驗（vincristine)、長春驗 (vinblastine)、秋水仙驗（colchicin)、多柔比星 (doxorubicin)、道諾黴素（daunorubicin)、二經基炭疽菌素 二酮（dihydroxy anthracin dione)、米托蒽酿、光神黴素 (mithramycin)、放線菌素 D(actinomycin D)、1-脫氫睪固 酮、糖皮質激素、普魯卡因（procaine)、丁卡因 (tetracaine)、利多卡因（lidocaine)、普萘洛爾（propranolol) 及11票呤黴素（puromycin)以及其類似物或同系物。 如本文所用之術語「晶體」及「結晶化」係指以晶體形 式存在之抗體或其抗原結合部分。晶體為固態物質之一種 形式，其不同於諸如非晶形固態或液晶態之其他形式。晶 體係由原子、離子、分子（例如蛋白質，諸如抗體）或分子 集合體（例如抗原/抗體複合物）之規則的重複三維陣列構 成。此等三維陣列係根據特定數學關係排列。晶體中重複 之基本單元或構建塊稱為不對稱單元。以符合既定之定義 明確的晶體學對稱性之排列重複不對稱單元提供晶體之 「單位晶胞」。在所有三個維度中藉由規則平移重複單位 晶胞將提供晶體。參見Giege，R.及Ducruix，A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach，第 2版，第 20 1-16 頁，Oxford University Press, New York，New York, (1999) o 一實施例提供用於釋放結合蛋白之組合物，其中該組合 物包含調配物，該調配物又包含如上文所揭示之結晶化結 合蛋白、結晶化抗體構築體或結晶化抗體結合物，及成 141568.doc -69- 201014602 分；及至少一種聚合載劑。較佳地’聚合載劑為選自由以 下組成之群的一或多者之聚合物：聚（丙烯酸）、聚（氰基丙 稀酸酯）、聚（胺基酸）、聚（酐）、聚（縮肽）、聚（醋）、聚（乳 酸）、聚（乳酸-共-乙醇酸）或PLGA、聚（b-經基丁酸酯）、聚 (己内酯）、聚（二氧環己酮）、聚（乙二醇）、聚（（經丙基）曱 基丙烯酿胺）、聚[(有機）磷氮烯]、聚（原酸酯）、聚（乙稀 醇）、聚（乙烯吡咯啶酮）、順丁烯二酸酐-烷基乙烯基醚共 5^物、氧化異丙稀多元醇類、白蛋白、海藥酸鹽、纖維素 及纖維素衍生物、膠原蛋白、血纖維蛋白、明膠、玻尿 酸、募膽、甘胺基聚糖、硫酸多膽，其摻合物及共聚物。 較佳地’該成分係選自由白蛋白、蔗糖、海藻糖乳糖 醇、明膠、羥丙基-β_環糊精、甲氧基聚乙二醇及聚乙二醇 組成之群。另一實施例提供治療哺乳動物之方法，其包含 向該哺乳動物投與有效量之上文所揭示之組合物的步驟。 如本文所提及之術語「聚核苷酸」意謂兩個或兩個以上 核苷酸（核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或任一類、核苷酸的 經修飾形式）之聚合形式。該術語包括DNA之 形式，但較料錢腦。 概 如不文所用之術語
刀雕不极甘毆」呵必明—裡戈 普酸（例如基因組、eDNA或合成來源者，或其某種組合 鑒於其來源’該「經分離聚核苷酸」不與在自然界" 該「經分離聚核苦酸」一起存在之聚核苦酸之全部或一 分締合；可操作性連接至在自然界中不與其連接之聚杉 酸；或本質上不作為較大序列之—部分存在。 141568.doc -70- 201014602 、如本文所用之術語「載體」意欲指—種能夠轉運已與其 、 核酸的核酸分子。-種類型之载體為「質 ，」，其係指内部可連接其他職區段之環狀雙股匪 辰另類型之载體為病毒載體，其中可將其他DNA區段 ； 料至病毒基因組。某些載體能夠在其所引人之宿主細胞 巾自主複製（例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型 哺乳動：載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物細可 參 纟引入伤主細胞中之後整合至宿主細胞之基因組中，且藉 此與宿主基因組—起複製。此外，某些載體能夠指導與其 可操作性連接之基因的表現。該等載體在本文中稱為「重 組表現载體」（或簡稱為「表現載體」）…般而言，適用 於重組職技術中之表現載體通常呈質體形式。因為質體 為載體之最常用形式，所以在本說明書中，「質體」與 「載體」可互換使用。然而，本發明意欲包括表現載體之 該等其他形式，諸如起等效作用之病毒載體(例如複製缺 • 陷型反轉錄病毒、腺病毒及與腺相關病毒）。 術》。可操作性連接」係指所述組份處於允許其按其預 定方式作用之關係中的並置。控制序列「可操作性連接」 至編碼序列係以使編碼序列之表現在與控制序列相容之條 件下實現的方式連接。「可操作性連接」之序列包括與所 關注基因鄰接之表現控制序列以及反式作用或在一定距離 外作用以控制所關注基因的表現控制序列。如本文所用之 術語「表現控制序列」係指為實現其所連接之編碼序列的 表現及加工所必需之聚核苦酸序列。表現控制序列包括適 141568.doc -71 · 201014602 备轉錄啟始、終止、啟動子及強化子序列；有效RNA加工 ^號’諸如拼接及聚腺苷酸化信號；穩定細胞質mRNA之 序列’ &两轉譯效率之序列（亦即Kozak共同序列）；增強 蛋白質穩定性之序列；及必要時增加蛋白質分泌之序列。 該等控制序列之性質視宿主生物體而不同；在原核生物 中’該等控制序列一般包括啟動子、核糖體結合位點及轉 錄終止序列；在真核生物中，該等控制序列包括啟動子及 轉錄終止序列。術語「控制序列」意欲包括存在對於表現 及加工而言必要的組份，且亦可包括存在具有益處之其他 組份’例如前導序列及融合搭配物序列。本發明之蛋白構 築體可使用此項技術中已知之表現載體及宿主細胞（包括 表現卡匣、載體、重組宿主細胞）及自單一開放閱讀框架 重組表現及蛋白水解加工重組聚合蛋白質及前蛋白質之方 法來表現及純化（例如WO 2007/014162)。 如本文所定義之「轉型」係指使外源DNA進入宿主細胞 中之任何過程。可在天然或人工條件下使用此項技術中熟 知的各種方法進行轉型◊轉型可依靠用於將外來核酸序列 插入至原核或真核宿主細胞中之任何已知方法進行。該方 法係基於所轉型之宿主細胞選擇且可包括（但不限於）病毒 感染、電穿孔、脂質轉染及粒子轟擊。該等「轉型」細胞 包括插入之DNA能夠以自主複製質體或宿主染色體之一部 分的形式複製的穩定轉型細胞。其亦包括在有限時段内短 暫表現所插入之DNA或RNA的細胞。 如本文所用之術語「重組宿主細胞」（或簡稱為「宿主 141568.doc -72· 201014602 細胞」）意欲指已引入外源DNA之細胞。應瞭解，該等術 s吾不僅欲指特定個體細胞，而且亦指該細胞之子代。因為 某些修飾可能因突變或環境影響而在繼代中發生，所以該 子代實際上可能不與親本細胞相同’但其仍包括在如本文 所用之術§吾「宿主細胞」之範鳴内。較佳地，宿主細胞包 括原核細胞、真核細胞、昆蟲細胞或選自生命界中之任一 者的細胞。較佳真核細胞包括原生生物、真菌、植物及動 物細胞。最佳地’宿主細胞包括（但不限於）原核細胞株大 腸桿菌；哺乳動物細胞株CHO、HEK 293及COS;昆蟲細 胞株Sf9，及真菌細胞釀酒酵母（s. cerevisiae)。 重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養及轉型可使用標準 技術進行（例如電穿孔、脂質轉染）。酶促反應及純化技術 可根據製造商說明書或如此項技術中通常所實現或如本文 所述執行。上述技術及程序一般可根據此項技術中熟知之 習知方法及如本說明書全文所引用及論述之各種綜合性參 考文獻及更具體之參考文獻中所述執行。例如參見
Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第 2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，N.Y. (1989))。 如此項技術已知及如本文所用之「轉殖基因生物體」係 指具有含有轉殖基因之細胞的生物體，其中引入生物體 (或生物體之祖先）中之轉殖基因表現並不在該生物體中天 然表現之多肽。「轉殖基因」為穩定且可操作性整合至發 育成轉殖基因生物體之細胞之基因組中，從而指導所編碼 141568.doc •73- 201014602 基因產物於轉殖基因生物體之一或多種細胞類型或組織中 表現的DNA構築體。 術語「調控」與「調節」可互換使用，且如本文中所使 用，其係指所關注分子之活性（例如PGE2之生物活性）的改 變或變化。調節可為所關注分子之某一活性或功能之量值 的增加或降低。分子之例示性活性及功能包括（但不限於） ： 結合特徵、酶促活性、細胞受體活化及信號轉導。 相應地，如本文所用之術語「調節劑」為能夠使所關注 分子之活性或功能（例如PGE2之生物活性）改變或變化的化 〇 合物。舉例而言’調節劑可引起分子的某一活性或功能之 量值相較於在不存在該調節劑狀況下所觀察到之活性或功 能之量值增加或減小。在某些實施例中，調節劑為降低分 子之至少一種活性或功能之量值的抑制劑。例示性抑制劑 包括（但不限於）蛋白質、肽、抗體、肽體（peptibody)、碳 水化合物或小有機分子。肽體描述於例如W〇 〇1/83525 中。 如本文所用之術語「促效劑」係指當與所關注分子接觸春 時引起分子的某一活性或功能之量值相較於在不存在促效 劑狀況下所觀察到之活性或功能之量值增加的調節劑。所 關注特定促效劑可包括（但不限於）PGE2或多肽、核酸、碳 水化合物或與PGE2結合之任何其他分子。 如本文所用之術語「拮抗劑」或「抑制劑」係指當與所 關注分子接觸時引起分子的某一活性或功能之量值才田目較於 在不存在拮抗劑狀況下所觀察到之活性或功能之量值降低 141568.doc •74- 201014602 的調玲劑所關;主特定拮抗劑包括阻斷或調節pGE2之生物 或免疫活性之拮抗劑。pGE2之拮抗劑及抑制劑可包括（但 不限於）蛋白質、核酸、碳水化合物或與pGE2結合之任何 其他分子。 術語「抑制舆受體之結合」係指結合蛋白防止pGE2與其 %體中之—或多者結合的能力。該對與受體結合之抑制將 #致降低或消除由PGE2與其受體結合所介導之生物活性。 ❹ 如本文所用之術語「有效量」係指足以降低或改善病症 或其一或多種症狀之嚴重程度及/或持續時間；阻止病症 進展；引起病症消退；預防與病症相關之一或多種症狀復 發發展 '發作或進展：偵測病症，或增強或改良另一療 法（例如預防劑或治療劑）之預防或治療作用的療法之量。 如本文所用之術語Γ樣本」係以其最廣泛意義使用。如 本文所用之生物樣本」包括（但不限於）來自活物（living thmg)或先前為活物之任何量的物質。該等活物包括（但不 • 限於)人類、小鼠、大鼠、冑、犬、家兔及其他動物。該 等物質包括(但不限於)血液、血清、尿液、滑液、細胞、 器官、組織、骨髓、淋巴結及脾臟。 在較佳實施例中，結合蛋白為能夠結合pge2之CDR移 植抗體或其抗原、结合部分。較佳地，CDR移植抗體或其抗 原結合部分包含來自上文揭示之2B5-7.0或2B5-8.0或2B5-9.0之一或多個CDR。較佳地，cDR移植抗體或其抗原結合 4刀os人類夂體構架。更佳地，人類受體構架為與 7.0或2B5-8.0或2Β5·9 〇之小鼠抗體構架具有大於6〇%同源 141568.doc -75· 201014602 性之人類受體構架中之任一者。 在較佳實施例+，結合蛋白為能夠結合pGE2之人類化 抗體或其抗原結合部分。較佳地，人類化抗體或其抗原結 〇郤为包含上文揭示之一或多個CDR併入至人類受體構架 之人類k體可變域中。較佳地，人類抗體可變域為共同人 類可變域。更佳地’人類受體構架在關鍵殘基處包含至少 一個構架區胺基酸取代’其中該關鍵殘基係選自由以下組 成之群：與CDR相鄰之殘基；糖基化位點殘基；稀有殘 基，能夠與PGE2相互作用之殘基；能夠與CDR相互作用之 殘基；典型殘基；重鏈可變區與輕鏈可變區之間的接觸殘 基，Vernier區内之殘基；及在Ch〇thia界定之可變重鏈 CDIU與Kabat界定之第一重鏈構架之間重疊之區域中的殘 基較佳地，人類受體構架包含至少一個構架區胺基酸取 代，其中该構架之胺基酸序列與該人類受體構架之序列至 少65%—致且包含至少7〇個與該人類受體構架一致之胺基 酸殘基。 在一實施例中，人類化抗體或其抗原結合部分包含三個 或三個以上上文揭示之CDR。在一特定實施例中人類化 抗體或其抗原結合部分包含六個上文揭示之CDR。 本發明之一實施例提供包含上文揭示之任一結合蛋白及 連接多肽或免疫球蛋白之抗體構築體。在一較佳實施例 中，抗體構築體係選自由以下組成之群：免疫球蛋白分 子、單株抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體、人類化抗體、 Fab、Fab·、F(abl)2、Fv、雙硫鍵連接之趵、scFv、單域抗 14I568.doc -76- 201014602 體、雙功能抗體、多特異性抗體、雙重特異性抗體、 DVD-Ig及雙特異性抗體。在一較佳實施例中，抗體構築 體包含選自由以下組成之群的重鏈免疫球蛋白恆定域：人 類IgM恆定域、人類IgG1恆定域、人類igG2恆定域、人類 IgG3恆定域、人類IgG4恆定域、人類igE恆定域及人類 恆疋域。在另一實施例中，本發明提供抗體結合物，其包 含上文揭示之抗體構築體及選自由以下組成之群的藥劑： φ 免疫黏附分子、顯影劑、治療劑及細胞毒性劑。在一較佳 實鈿例中，顯影劑係選自由放射性標記、酶、螢光標記、 發光標記、生物發光標記、磁性標記及生物素組成之群。 更佳地，顯影劑為選自由以下組成之群的放射性標記： 3H、"C、、、9〇γ、99Tc、"lin、125i、131i、177lu、166如 & 153ς 在一較佳實施例中，治療劑或細胞毒性劑係選 自由以下組成之群：抗代謝物、烷基化劑、抗生素、生長 因子、細胞激素、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環黴 ❹ 素、毒素及細胞凋亡劑。 在另一實施例中，抗體構築體經糖基化。較佳地，糖基 化為人類糖基化模式。 在另一實施例中，上文揭示之結合蛋白、抗體構築體或 抗體結合物為晶體。較佳地，晶體為無載劑醫藥控制釋放 晶體。在—較佳實施例中，結晶化結合蛋白、結晶化抗體 構築體或結晶化抗體結合物具有比其可溶性對應物大的活 體内半衰期。在另一較‘實施例中’結晶化結合蛋白、結 晶化抗體構築體或結晶化抗體結合物在結晶化後保留生物 141568.doc -77- 201014602 活性。 本發明之一態樣係關於編碼上文揭示之結合蛋白、抗體 構築體或抗體結合物中之任一者的經分離核酸。另一實施 例提供包含上文揭示之經分離核酸之載體，其中該載體係 選自由以下組成之群：pcDNA ; pTT(Durocher等人， •心 2002，第 30卷，第 2期）；pTT3(具 有額外多選殖位點之PTT) ; pEFBOS(Mizushima, S.及
Nagata, S. (1990) iVwc/eic ααζΆ /iesearc/i 第 18 卷，第 17 期）；pBV ; pJV ; pA2 ;及 pBJ。 在另一態樣中，宿主細胞經上文揭示之載體轉型。較佳 地’宿主細胞為原核細胞。更佳地，宿主細胞為大腸桿 菌。在另一實施例中，宿主細胞為真核細胞。較佳地，真 核細胞係選自由原生生物細胞、動物細胞、植物細胞及真 菌細胞組成之群。更佳地，宿主細胞為哺乳動物細胞，包 括（但不限於）CHO、HEK293及COS ;或真菌細胞，諸如釀 酒酵母；或昆蟲細胞，諸如S f 9。 本發明之另一態樣提供產生結合PGE2之結合蛋白的方 法’其包含在足以產生結合PGE2之結合蛋白的條件下在培 養基中培養上文揭示之任一宿主細胞。另一實施例提供根 據上文揭示之方法產生的結合蛋白。 本發明亦提供包含如上文揭示之結合蛋白、抗體構築體 或抗體結合物及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。在 另一實施例中’醫藥組合物包含至少一種用於治療p GE2活 性有害之病症的額外治療劑。較佳地，額外藥劑係選自由 141568.doc -78- 201014602 、下、’、成之群./α療劑、顯影劑、細胞毒性劑、血管生成 抑制劑（包括（但不限於）抗VEGF抗體或VEGF_trap);激酶 抑制劑（包括（但不限於）KDm2抑制劑共刺激分子 阻斷劑（包括（但不限於）抗B7. i、抗B7.2、CTLA4_Ig、抗
CD2〇);黏附分子阻斷劑（包括（但不限於）抗LFA-丨Ab、抗 E/Ll擇素Ab、小分子抑制劑）；抗細胞激素抗體或其功能 片段（包括（但不限於）抗US、抗TNFH6/細胞激素 受體抗體）；曱胺嗓呤；環孢黴素；雷帕黴素；FK506;可 偵測標5己或報導體；卿拮抗劑；抗風濕藥；肌肉鬆弛 劑；麻醉藥；非類固醇消炎藥（NSAID);止痛劑；麻醉 齊J ’鎮靜劑，局部麻醉劑；神經肌肉阻斷劑丨抗微生物 劑；抗牛皮癖藥；皮質類固醇；同化類固酵；紅血球生成 素；免，作用；免疫球蛋白；免疫抑制劑；生長激素；激 素替代藥物；放射性藥品：抗抑繁劑；抗精神病藥物；興 奮劑，哮喘藥物；β促效劑；吸人類固醇；腎上腺素或類 似物，細胞激素及細胞激素拮抗劑。 在另一癌'樣中，本發明提供抑制PG&活性之方法，其包 含使PGE2與上文揭不之結合蛋白接觸以使得pGE2活性受 到抑制。在一相關態樣中，本發明提供在罹患pGE2活性有 害之病症的人類個體中抑制PGE2活性之方法，其包含向該 人類個體投與上文揭示之結合蛋白以使得人類個體中之 PGE2活性被抑制且實現治療。 在另態樣中’本發明提供在個體中治療（例如治癒、 抑制、改善、延遲或預防發作或預防重現或復發）或預防 I41568.doc •79- 201014602 PGE2相關病症之方法。該方法包括：以足以治療或預防 pge2相關病症之量向個體投與pge2結合劑（尤其拮抗劑）， 例如如本文所述之抗PGE2抗體或其片段。PGE2拮抗劑（例 如抗PGE2抗體或其片段）可如本文所述單獨或與其他治療 方式組合向個體投與。 在一實施例中，本發明提供用於治療（例如減輕、改善） 或預防罹患一或多種PGE2相關病症之哺乳動物個體（例如 人類）之一或多種症狀的方法及組合物，該等病症包括例 如涉及過量PGE2合成的自體免疫及發炎性疾病及腫瘤。該 等病症包括：（a)類風濕性及過敏性關節炎；（b)某些由病 毒誘發之疾病’諸如格-巴二氏症候群、感染性單核白血 球增多症、其他病毒性淋巴腺病及疱疹病毒感染；多發 性硬化症及其他脫趙勒’疾病；（d)血液病，諸如溶企性貧灰 及企小板減少症；（e)内分泌病症，諸如糖尿病、艾迪森氏 病、特發性副甲狀腺低能症及慢性淋巴細胞性甲狀腺炎； (f)膠原蛋白病變，諸如全身性紅斑狼瘡症；及（g)生殖病 症，諸如閉經、不孕症、反覆性流產及驚厥；及（h)腫瘤， 諸如頭頸部腫瘤、肺癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌等，及 ⑴腸胃器官病症（例如發炎性腸病（IBD)，諸如潰瘍性結腸 炎及/或克隆氏病）；及⑴疼痛病症，諸如與骨關節炎及其 他病症相關之疼痛；及（k)眼病，諸如年齡相關之黃斑變性 (AMD)。因此’揭示内容包括PGe2結合劑（諸如抗Pge2抗 體或其片段）用於治療之用途及PGE2結合劑（諸如抗！>(}£2抗 體或其片段）用於製備用以治療之藥物的用途。 141568.doc -80- 201014602 該方法包含以足以治療（例如減輕、改善）或預防一或多 種症狀之置向個體投與PGE2拮抗劑，例如卩〇£2抗體或其 片幸又PGE2抗體可投與供治療或預防或兩者。ρ〇Ε2拮抗 劑（例如抗PGE2抗體或其片段）可如本文所述單獨或與其他 治療方式組合向個體投與。較佳地，個體為哺乳動物，例 如罹患本文所述之PGE2相關病症之人類。 . 在另一態樣中，本申請案提供活體外偵測樣本（例如生 φ 物學樣本，諸如血清、血漿、組織、活組織檢查）中PGE2 之存在的方法。標的方法可用於診斷例如免疫細胞相關病 症之病症。該方法包括：⑴使樣本或對照樣本與如本文所 述之抗PGE2抗體或其片段接觸；及（π)偵測抗pGE2抗體或 其片段與樣本或對照樣本之間複合物的形成，其中樣本相 對於對照樣本之複合物形成之統計學上顯著的變化指示樣 本中存在PGE2。 在另一態樣中，本發明提供治療罹患PGe2有害之病症之 φ 患者的方法，其包含在投與如上文所述之第二藥劑之前、 同時或之後投與如上文所揭示之任何結合蛋白的步驟。在 一較佳實施例中’可與一或多種PGE2拮抗劑（例如抗PGE2 抗體或其片段）共投與及/或共調配之額外治療劑包括（但不 限於）以下一或多者：MTX ; 口服類固醇；金屬蛋白酶抑 制劑；柳氮續胺°比咬；硫唾嗓吟；6-疏嘌吟；企管收縮素 轉化酶抑制劑；可溶性細胞激素受體；可溶性p55 TNF受 體；可溶性 p75 TNF受體；SIL-1RI ; SIL-1RII ; SIL-6R ; 消炎細胞激素；IL-4 ; IL-10 ; IL-11 及 TGFp。 141568.doc -81 - 201014602 在較佳實施例中，上文揭示之醫藥組合物係藉由至少 -種選自以下之模式投與：非經腸、皮下、肌肉内、靜脈 内、關郎内、支氣管内、腹内、囊内、軟骨内、腔内、體 腔内' 小腦内、腦室内、大腸内、子宮頸内、胃内、肝 内、〜肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、 刖列腺θ肺内、直腸内、腎内、視網膜内、脊椎内、滑 膜内、胸腔内、子宮内、勝胱内、快速注射、陰道、直 腸、經頰、舌下、鼻内及經皮。 本發明之一態樣提供至少一種針對至少一種本發明之 PGEZ結合蛋白的PGE2抗個體基因型抗體。抗個體基因型 抗體包括含有以下分子之任何蛋白質或肽，該分子包含免 疫球蛋白分子之至少一部分，諸如（但不限於）重鏈或輕鏈 之至少一個互補決定區（CDR)或其配位體結合部分、重鏈 或輕鏈可變區、重鏈或輕鏈恆定區、構架區或其可併入本 發明之結合蛋白中的任何部分。 I.結合前列腺素E2之抗體 在本發明中提供以高親和力、緩慢解離速率及高中和能 力與PGE2結合之鼠類單株抗體或其抗原結合部分。本發明 亦提供結合PGE2之嵌合抗體。本發明亦提供結合pGE2之 人類化抗體或其抗原結合部分。較佳地，抗體或其部分為 經分離抗體。較佳地，本發明抗體為中和人類抗pGE2及/ 或人類抗PGE2抗體。 A·抗前列腺素£2抗饉之製備方法 本發明之抗體及抗體片段可藉由任何此項技術已知之方 141568.doc -82- 201014602 法產生，諸如融合瘤、微生物（例如噬菌體、細菌、酵 母）、重組、核糖體、mRNA及DNA呈現或其組合。許多方 法可用於操作抗體以改良抗體特性，包括此項技術中熟知 之人類化、親和力成熟、抗體同型轉換、生理化學特性及 藥物動力學概況改良等。 1·使用融合瘤技術製備抗前列腺素£2單株抗體 •單株抗體可使用此項技術已知之多種技術製備，包括使 用融合瘤、重組、噬菌體及酵母呈現技術或其組合。可例 如使用融合瘤技術產生單株抗體，包括此項技術中已知且 在例如 Harlow 等人 ’ Antibodies: A Laboratory Manual， (Cold Spring Harbor Laboratory Press，第 2版。1988);
Hammerling 等人 ’ Monoclonal Antibodies and T-Cell
Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y.，1981)中教示之彼等融 合瘤技術。如本文所用之術語「單株抗體」不限於經由融 合瘤技術產生之抗體。術語「單株抗體」係指來源於包括 φ 任何真核、原核或噬菌體純系之單一純系而非由產生其之 方法產生的抗體。 •使用融合瘤技術產生及筛選特異性抗體之方法為此項技 術中常規且熟知的。在一實施例中，本發明提供產生單株 抗體之方法以及由該方法產生之抗體，該方法包含培養分 泌本發明抗體之融合瘤細胞，其中該融合瘤較佳韁由將自 以本發明抗原免疫之小鼠分離的脾細胞與骨骑瘤細胞融合 且隨後篩選由該融合產生之融合瘤中分泌能夠結合本發； 多肽之抗體的融合瘤純系來產生(參見實例12)。簡言之， 141568.doc •83- 201014602 可以稱為半抗原載體蛋白結合物的載體蛋白結合之pGE2免 疫小鼠。此處，半抗原為PGE2且載體蛋白可為牛曱狀腺球 蛋白、匙孔螺企藍蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白等中之 任一者。在一較佳實施例中，PGE2·甲狀腺球蛋白結合物 與佐劑一起投與以刺激免疫反應。該等佐劑包括完全或不 完全弗氏佐劑（Freund’s adjuvant)、RIBI(胞壁酿二狀）成 ISCOM(免疫刺激複合物）。該等佐劑可藉由將多肽隔離於 局部沈積物中來保護該多肽免於快速分散，或其可含有刺 激伯主分泌對巨嗤細胞及免疫系統之其他組份具有趨化性 之因子的物質。較佳地，若投與多肽，則免疫時程將包含 分散於數週之内投與多肽兩次或兩次以上。 以PGE2·甲狀腺球蛋白結合物免疫動物之後，可自該動 物獲得抗體及/或產生抗體之細胞。藉由放血或處死動物 自動物獲得含有抗PGE2抗體之血清。企清可如自動物中獲 付時原樣使用’可自5亥血清獲得免疫球蛋白溶離份或可自 該血清純化出抗PGE2抗體。以此方式獲得之血清或免疫球 蛋白為多株血清或免疫球蛋白，因此具有一組不同特性。 一旦彳貞測到免疫反應’例如在小鼠血清中偵測到對抗原 PGE2具有特異性之抗體，即採集小鼠脾臟且分離脾細胞。 隨後藉由熟知技術將脾細胞與例如來自細胞株SP2〇(可獲 自ATCC)之細胞的任何合適骨趙瘤細胞融合。藉由有限稀 釋來選擇及選殖融合瘤。隨後藉由此項技術中已知之方法 檢定融合瘤純系中分泌能夠結合PGE2之抗體之細胞。可藉 由用陽性融合瘤純系免疫小鼠來產生腹水，其一般含有高 141568.doc -84 - 201014602 含量之抗體。 在另一實施例中，可由經免疫動物製備產生抗體之永生 化融合瘤。免疫後’處死動物且如此項技術中所熟知將脾 B細胞與永生化骨髓瘤細胞融合。例如參見Harlow及 Lane ’同上文。在一較佳實施例中，骨髓瘤細胞不分泌免 疫球蛋白多肽（非分泌性細胞株）。在融合及抗生素選擇 -後’使用PGE2或其一部分或表現Pge2之細胞篩選融合 φ 瘤。在一較佳實施例宁，初始篩選係使用酶聯免疫檢定法 (ELISA)或放射免疫檢定法（RIA)執行，較佳為£]^8入。在 WO 00/37504中提供ELISA篩選之一實例。 選擇產生抗PGE2抗體之融合瘤’選殖且針對包括旺盛融 合瘤生長、尚抗體產量及如下文進一步論述之所要抗體特 徵之所要特徵進一步篩選。融合瘤可在同基因型動物、缺 乏免疫系統之動物（例如裸小鼠）中活體内培養及擴增或在 細胞培養物中活體外培養及擴增。選擇、選殖及擴增融合 ❹ 瘤之方法為一般技術者所熟知。 在一較佳實施例中，融合瘤為如上文所述之小鼠融合 瘤。在另一較佳實施例中，融合瘤產生於非人類、非小鼠 物種中’諸如大鼠、綿羊、豬、山羊、牛或馬。在另一實 施例中，融合瘤為人類融合瘤，其中將人類非分泌性骨髓 瘤與表現抗PGE〗抗體之人類細胞融合。 可藉由已知技術產生識別特異性抗原決定基之抗體片 段。舉例而言，本發明之Fab及F(ab，）2片段可藉由使用諸 如木瓜蛋白酶（以產生Fab片段）或胃蛋白酶（以產生 141568.doc -85- 201014602 片段）之酶進行免疫球蛋白分子之蛋白水解裂解而產生。 F(ab，)2片段含有可變區、輕鏈恆定區及重鏈之CH1域。 2.使用SLAM製備抗前列腺素£2單株抗體 在本發明之另一態樣中，由單一經分離淋巴細胞使用如 以下文獻中所述之此項技術中稱為選擇淋巴細胞抗體法 (SLAM)之程序產生重組抗體：美國專利第5,627,052號、 PCT 公開案 WO 92/02551 及 Babcock, J.S.等人，（1996) Proc. TVai/· dead. 93 :7843-7848。在此方法中，使 用抗原特異性溶血空斑檢定（antigen-specific hemolytic plaque assay)篩選分泌所關注抗體之單細胞（例如來源於第 1部分所述經免疫動物中之任一者的淋巴細胞），其中使用 諸如生物素之連接子使抗原PGE2、PGE2次單元或其片段 與綿羊紅血球偶合且用於鑑別分泌對PGE2具有特異性之抗 體的單細胞。鑑別所關注分泌抗體之細胞後，藉由逆轉錄 酶PCR自細胞取得重鏈及輕鏈可變區cDNA，且隨後可表 現該等可變區，在適當免疫球蛋白恆定區（例如人類恆定 區）之情形下，可於諸如COS、HEK293或CHO細胞之哺乳 動物宿主細胞中表現。隨後可例如藉由淘選經轉染細胞以 分離出表現針對PGE2之抗體的細胞，使經來源於活體内選 擇之淋巴細胞之經擴增免疫球蛋白序列轉染的宿主細胞於 活體外經歷進一步分析及選擇。經擴增免疫球蛋白序列可 在活體外諸如藉由活體外親和力成熟法（諸如PCT公開案 WO 97/29131及PCT公開案WO 00/56772中所述之方法）進 一步操作。 141568.doc • 86 - 201014602 3. 使用轉殖基因動物製備抗前列腺素瓦2單株抗體 在本發明之另一實施例中，藉由以pge2-載體蛋白結合 物免疫包含一些或所有人類免疫球蛋白基因座之非人類動 物來產生抗體。在一較佳實施例中，非人類動物為 XENOMOUSE轉殖基因小鼠，其為包含人類免疫球蛋白基 因座之大片段且缺乏小鼠抗體產生之經工程改造之小鼠品 系。例如參見Green等人，7:13-21 (1994) 及美國專利 5,916,771 、 5,939,598 、 5,985,615 、 5,998,209 、 6,075,181 、 6,091,001 、 6,114,598 及 6，130,3 64。亦參見 1991 年 7 月 25 曰公開之 WO 91/10741、 1994年2月3日公開之WO 94/02602、1996年10月31日公開 之 WO 96/34096及 WO 96/33735、1998 年 4 月 23 日公開之 WO 98/16654、1998 年 6 月 11 日公開之 WO 98/24893、1998 年11月12日公開之WO 98/50433、1999年9月10日公開之 WO 99/45031、1999 年 10 月 21 日公開之 WO 99/53049、 2000年2月24日公開之WO 00 09560及2000年6月29日公開 之WO 00/037504。XENOMOUSE轉殖基因小鼠產生完全人 類抗體之類成年人類譜系且產生抗原特異性人類Mab。 XENOMOUSE轉殖基因小鼠經由引入人類重鏈基因座及X 輕鏈基因座之百萬驗基（megabase)規模的生殖系構型YAC 片段而含有人類抗體譜系之約80%。參見Mendez等人， TVaiwre 15:146-156 (1997)，Green及Jakobovits «/.
Exp. Med. 188:483-495 (1998) 0 4. 使用重組抗體文庫製備抗前列腺素£2單株抗體 141568.doc -87 - 201014602 亦可使用活體外方法來製備本發明之抗體，其中篩選抗 體文庫以鑑別具有所要結合特異性之抗體。該篩選重組抗 體文庫之方法為此項技術中所熟知且包括例如以下文獻中 所述之方法：Ladner等人，美國專利第5,223,409號；Kang 等人，PCT公開案第WO 92/1 8619號；Dower等人，PCT公 開案第WO 91/17271號；Winter等人，PCT公開案第WO 92/20791 號；Markland等人，PCT公開案第 WO 92/15679 號；Breitling 等人，PCT 公開案第 WO 93/01288 號； McCafferty 等人，PCT公開案第 WO 92/01047號；Garrard 等人，PCT公開案第WO 92/09690號；Fuchs等人，（1991) Bio/Technology 9:1370-1372 ; Hay 等人，（1992) //mw Antibod Hybridomas 3:81-85 ; Huse 等人，(1989) Science 246:1275-1281 ； McCafferty^A » Nature (1990) 348:552-554 ； Griffiths# A * (1993) EMBO J 12:725-734 ； Hawkins 等人，（1992) Mo/ 仏〇/ 226:889-896 ; Clackson等人， (1991) iWziwre 352:624-628 ; Gram 等人，（1992) PAMS 89:3576-3580 ; Garrad 等人，(\99\) Bio/Technology 9:1373-1377 ; Hoogenboom 等人，（1991) TVwc 及es 19:4133-4137 ;及 Barbas 等人，（1991) PAMS 88:7978-7982，美國專利申請公開案200301 86374及PCT公開案第 WO 97/29131 號。 重組抗體文庫可來自以PGE2-載體蛋白結合物免疫之個 體。或者，重組抗體文庫可來自未處理個體（亦即未經 PGE2-載體蛋白結合物免疫之個體），諸如來自未經PGE2- 141568.doc • 88 · 201014602 載體蛋白結合物免疫之人類個體的人類抗體文庫。藉由以 包含PGE2之藥劑篩選重組抗體文庫，藉此 之彼等抗體來選擇本發明之抗體。進行該筛選及選擇之方 法為此項技術中所熟知，諸如先前段落中之參考文獻中所 述之方法。為選擇對簡2具有特定結合親和力之本發明抗 - 體，諸如以特定k。《速率常數自PGE2解離之抗體，可使用 - 此項技術已知之表面電漿共振方法選擇具有所要k。ff速率 φ ^數之抗體。為選擇對PGE2具有特定中和活性之本發明抗 體，諸如具有特定ICm之抗體，可使用此項技術中已知之 評估對PGE2活性之抑制的標準方法。 舉例而言，亦可使用此項技術中已知的各種噬菌體呈現 方法來產生本發明之抗體。在噬菌體呈現方法中，功能性 抗體域呈現於攜帶其編碼聚核苷酸序列之噬菌體顆粒表面 上詳σ之可利用該嗟菌體呈現由譜系或組合抗體文庫 (例如人類或鼠類）表現之抗原結合域。可用抗原（例如使用 參經標記抗原或結合或捕獲於固體表面或珠粒之抗原）來選 擇或鑑別表現結合所關注抗原之抗原結合域的噬菌體。此 等方法中所用之嗟菌體通常為絲狀嗟菌體，該嘆菌體包括 自具有Fab、Fv或二硫鍵穩定之Fv抗體域與噬菌體基因m 或基因viii蛋白質重組融合之噬菌體表現的fd&Ml3結合 域。可用於製備本發明抗體之噬菌體呈現方法之實例包括 以下文獻中揭示之方法：Brinkman等人，j Immun〇1 Methods 182:41-50 (1995) ; Ames 等人，j Immun〇1
Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough等人，Eur· J. 141568.doc ·89· 201014602
Immunol. 24:952-958 (1994); Persic等人，Gene 187 9-18 (1997) ; Burton等人，Advances in Immunology 57:191-280 (1994) ; PCT 申請案第 PCT/GB91/01134號；PCT公開案 WO 90/02809 ； WO 91/10737 ； WO 92/01047 ； WO 92/18619 ； WO 93/1 123 6 ; WO 95/15982 ; WO 95/20401 ;及美國專利 第 5,698,426 號；第 5,223,409 號；第 5,403,484 號；第 5,580,717 號；第 5,427,908 號；第 5,750,753 號；第 5,821，047 號；第 5,571，698 號；第 5,427,908 號；第 5,516,637 號；第 5,780,225 號；第 5,658,727 號；第 5,733,743號及第 5,969，108號。 如上文參考文獻中所述，在噬菌體選擇後，可自噬菌體 分離抗體編碼區且將其用於產生包括人類抗體之完整抗體 或任何其他所要抗原結合片段，且例如下文詳細描述，使 其於包括，乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母及細 菌之任何所要宿主中表現。舉例而言，亦可使用此項技術 中已知之方法採用重組產生Fab、Fab'及F(ab')2片段之技 術，諸如PCT公開案WO 92/22324 ; Mullinax等人， BioTechniques 12(6):864-869 (1992);及 Sawai等人，AJRI 34:26-34 (1995);及 Better 等人，Science 240:1041-1043 (1988)中揭示之方法。可用於產生單鏈Fv及抗體之技術的 實例包括美國專利4,946,778及5,258,498 ; Huston等人， Methods in Enzymology 203:46-88 (1991) ; Shu 等人， PNAS 90:7995-7999 (1993);及 Skerra 等人，Science 240:103 8-1040 (1988)中所述之技術。 141568.doc 90· 201014602 可應用此項技術已知之篩選大型組合文庫之其他方法替 代用噬菌體呈現篩選重組抗體文庫來鑑別本發明之雙重特 異性抗體。一種類型之替代表現系統為如以下文獻中所述 將重組抗體文庫表現為RNA-蛋白質融合體之表現系統： 8如如让及11〇136办之？(：1'公開案第|〇 98/31700號，及
Roberts，R.W.及 Szostak，LW. (1997) P⑽· ❹ t/U 9112297-12302。在此系統中，在〇11^八與其藉由活 體外轉譯在3'端帶有嘌呤黴素（一種肽基受體抗生素）之合 成mRNA而編碼之肽或蛋白質之間形成共價融合體。因 此，可基於所編碼之肽或蛋白質（例如抗體或其部分）之特 性（諸如抗體或其部分與雙重特異性抗原之結合），自 mRNA之複雜混合物（例如組合文庫）中富集特定mRNA。可 藉由如上所述之重组方式（例#在哺乳動物宿主細胞中）表 現自該等文庫篩選回收之編碼抗體或其部分之核酸序列， 此外T藉由再進行幾輪已在最初選擇之序列中引入突 變之mRNA-肽融合體的筛選或藉由如上所述使重組抗體活 體外親和力成熟之其他方法使其經歷進—步親和力成熟。 、在另：¾'法中，亦可使用此項技術中已知的酵母呈現方 =產生本U之抗體。在酵母呈現方法中，使用遺傳方法 ^抗體域繫栓於酵母細胞壁且使其在酵母表面上呈現。詳 吕之’可利用該酵母來呈現由雄糸 現田0曰系或組合抗體文庫（例如 人類或鼠類）表現之抗原結合域。 之醏舟f用於製備本發明抗體 酵母呈現方法的實例包括驗 M9M58號中所揭示之方法。以人之美國專利第 141568-doc -91 - 201014602 5. 使用PROfusion mRNA呈現製備抗前列腺素E2單株抗體 PROfusionTM技術為上文所述之mRNA呈現技術中的一 種。PROfusionTM技術可用於呈現與其編碼DNA序列偶合 之人類抗體片段（VH或VL或scFv)以供針對各種抗原進行 選擇。可用於製備本發明抗體之mRNA呈現方法之實例包 括Szostak等人，美國專利第6,207,446號；第6,214,553 號；及Gold等人，美國專利第6,194,550號及Roberts, R_W. 及 Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302中揭示之方法。在此系統中，在mRNA與 其藉由活體外轉譯在3'端帶有嘌呤黴素（一種肽基受體抗生 素）之合成mRNA而編碼之肽或蛋白質之間形成共價融合 體。因此，可基於所編碼之肽或蛋白質（例如抗體或其部 分）之特性（諸如抗體或其部分與雙重特異性抗原之結合）， 自mRNA之複雜混合物（例如組合文庫）中富集特定mRNA。 可藉由如上所述之重組方式（例如在哺乳動物宿主細胞中） 表現自該等文庫筛選回收之編碼抗體或其部分之核酸序 列，且此外，可藉由再進行幾輪已在最初選擇之序列中引 入突變之mRNA-肽融合體的篩選或藉由如上所述使重組抗 體活體外親和力成熟之其他方法使其經歷進一步親和力成 熟。 6. 抗前列腺素£2單株抗體之親和力成熟 活體外方法亦可用於本發明抗體之親和力成熟，其中藉 由使用易錯PCR或合成組合寡核苷酸或寡核苷酸定向突變 誘發在一初始抗體之CDR及/或構架中引入點突變來產生 141568.doc -92- 201014602 突變誘發抗體文庫。接著可篩選突變誘發文庫以鑑別具有 改良結合特異性之抗體。該篩選重組抗體文庫之方法為此 項技術中所熟知且包括例如以下文獻中所述之方法： Ladner等人，美國專利第5,223,409號；Kang等人，PCT公 開案第WO 92/1 8619號；Dower等人，PCT公開案第WO 91/17271號；Winter 等人，PCT公開案第 WO 92/20791 號； Markland等人，PCT公開案第 WO 92/15679號；Breitling等 人，PCT公開案第 WO 93/01288號；McCafferty 等人，PCT 公開案第WO 92/01047號；Garrard等人，PCT公開案第WO 92/09690 號；Fuchs 等人，（1991) 烈 9:1370- 1372 ; Hay 專人，{1992) Hum Antibod Hybridomas 3.H-85 ; Huse 等人，（1989) 246:1275-1281 ;
McCafferty^ A » Nature (1990) 348:552-554 ; Griffiths 等 人，（1993) 12:725-734 ; Hawkins等人，（1992) «/
Mol Biol 226:889-896 ; Clackson 等人，（1991) 352:624-628 ； Gram 等人，(1992) PNAS 89:3576-3580 ； Garrad 等人，（1991) 9:1373-1377 ;
Hoogenboom等人，（1991) Wmc 19:4133-4137 ;及
Barbas等人，（1991) PiVdS 88..7978-7982，美國專利申請公 開案 20030186374及 PCT公開案第 WO 97/29131號。 進行該篩選及選擇之方法為此項技術中所熟知，諸如先 前段落中之參考文獻中所述。為選擇對pge2具有特定結合 親和力之本發明抗體，諸如以特定koff速率常數自PGE2解 離之抗體，可使用此項技術已知之表面電漿共振方法選擇 141568.doc -93- 201014602 具有所要1^速率常數之抗體。為選擇對pge2具有特定中 和活性之本發明抗體，諸如具有特定IC5Q之抗體，可使用 此項技術中已知之評估對PGE2活性之抑制的標準方法。 舉例而言，亦可使用此項技術中已知之各種呈現方法使 本發明抗體親和力成熟。在噬菌體呈現方法中，功能性抗 體域呈現於攜帶其編碼聚核苷酸序列之噬菌體顆粒表面 上。詳言之，可利用該噬菌體呈現由譜系或組合抗體文庫 (例如人類或鼠類）表現之抗原結合域。可用抗原（例如使用 經標記抗原或結合或捕獲於固體表面或珠粒之抗原）來選 擇或鑑別表現結合所關注抗原之抗原結合域的噬菌體。此 等方法中所用之噬菌體通常為絲狀噬菌體，該噬菌體包括 自具有Fab、Fv或二硫鍵穩定之Fv抗體域與噬菌體基因III 或基因VIII蛋白質重組融合之噬菌體表現之fd及M13結合 域。可用於製備本發明抗體之噬菌體呈現方法之實例包括 以下文獻中揭示之方法：Brinkman等人，J. Immunol. Methods 1 82:41-50 (1995) ; Ames 等人，】.11111111111〇1· Methods 184:177-186 (1995) ; Kettleborough等人，Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994) ; Persic 等人，Gene 187 9-18 (1997) ; Burton等人，Advances in Immunology 57:191-280 (1994) ; PCT 申請案第 PCT/GB91/01134號；PCT公開案 WO 90/02809 ； WO 91/10737 ； WO 92/01047 ； WO 92/18619 ； WO 93/1123 6 ; WO 95/15982 ; WO 95/20401 ;及美國專利 第 5,698,426 號；第 5,223,409 號；第 5,403,484 號；第 5,580,717 號；第 5,427,908 號；第 5,750,753 號；第 141568.doc -94- 201014602 5,821，047 號；第 5,571,698 號；第 5,427,908 號；第 5,516,637 號；第 5,780,225 號；第 5,658,727 號；第 5,733,743 號及第 5,969，1〇8 號。 如上文參考文獻中所述，在噬菌體選擇後，可自噬菌體 分離抗體編碼區且將其用於產生包括人類抗體之完整抗體 - 或任何其他所要抗原結合片段’且例如下文詳細描述，使 其於包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母及細 菌之任何所要宿主中表現。舉例而言’亦可使用此項技術 ® 中已知之方法採用重組產生Fab、Fab'及F(ab')2片段之技 術，諸如PCT公開案WO 92/22324 ; Mullinax等人’ BioTechniques 12(6):864-869 (1992);及 Sawai等人，AJRI 34:26-34 (1995);及 Better 等人，Science 240:1041-1043 (198 8)中揭示之方法。可用於產生單鏈Fv及抗體之技術的 實例包括美國專利4,946,778及5,258,498 ; Huston等人， Methods in Enzymology 203:46-88 (1991) ; Shu等人， ▲ PNAS 90:7995-7999 (1993);及 Skerra 等人，Science Ο 240:103 8-1040 (1988)中所述之技術。 、 可應用此項技術中已知之篩選大型組合文庫之其他方法 、 替代用噬菌體呈現篩選重組抗體文庫來鑑別本發明之雙重 特異性抗體。一種類型之替代表現系統為如以下文獻中所 述將重組抗體文庫表現為RNA-蛋白質融合體之表現系 統：Szostak及 Roberts之 PCT公開案第 WO 98/31700號，及 Roberts, R.W.及 Szostak, J.W. (1997) /Voc. »SW· 94:12297-12302。在此系統中，在mRNA與其藉由活 141568.doc -95- 201014602 體外轉譯在3’端帶有嘴吟徽素（一種狀美 成mRNA而編碼之肽或 广又體抗生素）之合 此，可基於所編碼之肽或 成共價融合體。因 性(諸如抗體或其部分體…刀)之特 μ 、 叉室特異性抗原之結合），白 mRNA之複雜混合物（例如組合文 藉由如上所述之重租方切,）中田集特疋mRNA。可 、，方式（例如在哺乳動物宿主 現自該等文庫篩選回收之铯m飑干）表 L L 收之編碼抗體或其部分之核酸序列， 且此外’可藉由再進行幾輪已在最初選擇之序财引入突 ^mRNA_肽融合體的_選或由如上所述使重組抗體活體 外親和力錢之其他方法使其經錢-錢和力成熟。 在另一方法中’可使用此項技術中已知之酵母呈現方法 =本發明抗體。在酵母呈現方法中，使用遺傳方法將抗 體域繫栓於酵母細胞壁且使其在酵母表面上呈現。詳一 之，可利用該酵母呈現由講系或組合抗體文庫(例如人類 或鼠類）表現之抗原結合域。可用於製備本發明抗體之酵 母呈現方法的實例包括WiUrup等人之美國專 6,699,658號中所揭示之方法。 B·產生重組前列腺素抗體 之任一者產生本發 ’其中藉由標準技 宿主細胞中。術語 可藉由此項技術中已知之多種技術中 明之抗體。舉例而言’自宿主細胞表現 術將編碼重鏈及輕鏈之表現載體轉染至 「轉染」之各種形式意欲涵蓋通常用於將外源dna引入原 核或真核宿主細胞中之多種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沈 澱、DEAE·聚葡萄糖轉染及其類似技術。儘管可能於原核 141568.doc •96· 201014602 或真核宿主細胞中表現本發明之抗體，但較佳於真核細胞 中表現抗體，且最佳於哺乳動物宿主細胞中表現，因為該 等真核細胞（且尤其哺乳動物細胞）比原核細胞更有可能組 裝及分泌適當摺疊且具免疫活性之抗體。
用於表現本發明重組抗體之較佳哺乳動物宿主細胞包括 中國倉鼠印巢（CHO細胞）（包括在Urlaub及Chasin, (1980) iVoc· 7W"/· Jcai/· &ζ·. 77:4216-4220 中描述之dhfr-CHO ❹ 細胞，例如 R‘J_ Kaufman及 P.A· Sharp (1982) Mo/· 5ζ·ο/· 159:601-621中所述，與DHFR選擇標記一起使用）、NS0骨 髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。當將編碼抗體基因之重 組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，藉由培養宿主細 胞歷時足以使抗體在宿主細胞中表現或更佳使抗體分泌至 生長宿主細胞之培養基中的一段時間而產生抗體。可使用 標準蛋白質純化方法自培養基回收抗體。 亦可使用宿主細胞產生功能性抗體片段，諸如Fab片段 ❹ 或scFv分子。應瞭解以上程序之變化在本發明範疇内。舉 例而言，可能需要用編碼本發明抗體之輕鏈及/或重鏈之 功能性片段的DNA轉染宿主細胞。亦可使用重組DNA技術 來移除一些或所有編碼與所關注抗原結合不需要之輕鏈與 重鏈中之任一者或兩者的DNA。本發明抗體亦涵蓋由該等 截短DNA分子表現之分子。此外，可藉由標準化學交聯方 法使本發明抗體與第二抗體交聯來產生一重鏈及一輕鏈為 本發明之抗體且另一重鏈及輕鏈對除所關注抗原以外之抗 原具有特異性的雙功能抗體。 141568.doc 97- 201014602 在本發明之抗體或其抗原結合部分之一較佳重組表現系 統中’藉由峨酸鈣介導之轉染將編碼抗體重鏈及抗體輕鏈 兩者之重組表現載體引入至dhfr_CH〇細胞中。在重組表現 載體中’抗體重鏈與輕鏈基因各自與CMV強化子/AdMLP 啟動子調控元件可操作性連接以驅動基因之高水準轉錄。 重組表現載體亦攜有DHFR基因，其允許使用甲胺喋呤選 擇/擴增來選擇已經該載體轉染之CHO細胞。培養所選擇 之轉型體宿主細胞以允許表現抗體重鏈及輕鍵且自培養基 回收完整抗艎。使用標準分子生物學技術來製備重組表現 載體、轉染宿主細胞、選擇轉型體、培養宿主細胞及自培 養基回收抗體。本發明進一步提供藉由在合遘培養基中培 養本發明之宿主細胞直至本發明之重組抗體得以合成來合 成本發明重組抗體之方法。該方法可進一步包含自培養基 分離重組抗體。 產生抗前列腺素£2嵌合抗體 敢合抗體為抗體之不同部分來源於不同動物物種之分 子’諸如具有來源於鼠類單株抗體之可變區及人類免疫球 蛋白恆定區之抗體。產生嵌合抗體之方法為此項技術中所 已知且在實例2.1中詳細論述。例如參見Morrison，Science 229:1202 (1985) ; 〇i等人，BioTechniques 4:214 (1986); Gillies等人，（1989) J. Immunol. Methods 125:191-202 ;美 國專利第5,807,715號；第4,816,567號及第4,816,397號。 此外，可使用為藉由將來自具有適當抗原特異性之小鼠抗 體分子之基因與來自具有適當生物活性之人類抗體分子之 141568.doc •98- 201014602 基因拼接於一起來產生「嵌合抗體」而研發的技術 (Morrison等人，1984, Proc· Natl. Acad. Sci. 81:851-855 ; Neuberger等人，1984，Nature 312:604-608 ; Takeda等人， 1985, Nature 314:452-454)。
在一實施例中，藉由用人類IgGl恆定區置換第1部分所 述之鼠類單株抗PGE2抗體之重鏈恆定區來產生本發明之嵌 合抗體。在一特定實施例中，本發明之嵌合抗體包含含有 SEQ ID 60、62、64、66、68、70、72、74、76、78及 80 之胺基酸序列的重鏈可變區（VH)及輕鏈可變區（VL)SEQ ID 61 、 63 、 65 、 67 、 69 ' 71 、 73 、 75 ' 77 、 79及81 ° 抗前列腺素E2人類化抗體 人類化抗體為來源於結合所要抗原之非人類物種抗體的 抗體分子，其具有一或多個來自非人類物種之互補決定區 (CDR)及來自人類免疫球蛋白分子之構架區。已知人類Ig 序歹1J 揭示於 4列如 www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi ; www.atcc.org/phage/hdb.html ; www.sciquest.com/ ; www.abcam.com/ ; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html ; w w w. pub lic.iastate.edu/.ab out. pedro/re search_tools.html ; www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html ； www.whfreeman. com/immunology/CH-05/kuby05.htm ; www.library.thinkquest. org/1242 9/Immune/Antibody.html ; www.hhmi.org/grants/ lectures/1996/vlab/ ; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m- ikeimages.html ; www.antibodyresource.com/ ; mcb.harvard, e du/BioLinks/Immuno-logy.html. www. immunology link, com/ ; 141568.doc -99- 201014602
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Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983)。該等輸入序列可用於降低免疫原性 或降低、增加或改良結合、親和力、締合速率、解離速 率、親和性、特異性、半衰期或如此項技術中已知之任何 141568.doc -100- 201014602 其他合適特徵。 可用來自CDR供體抗體之相應殘基取代人類構架區中之 構架殘基以改變、較佳改良抗原結合。此等構架取代係由 此項技術中熟知之方法鑑別，例如藉由模擬CDR與構架殘 基之相互作用以鑑別對抗原結合重要之構架殘基以及進行 序列比較以鑑別特定位置之異常構架殘基《(例如參見 (^1^611等人，美國專利第 5,5 85,089號；1^6〇1111^1111等人， Nature 332:3 23 (1988))。三維免疫球蛋白模型普遍可得且 為熟習此項技術者所熟悉。可獲得說明及顯示所選候選免 疫球蛋白序列之可能三維構形結構的電腦程式。檢驗此等 顯示准許分析殘基在候選免疫球蛋白序列之功能中的可能 作用，亦即，分析影響候選免疫球蛋白與其抗原結合之能 力的殘基。以此方式，可自共同及輸入序列選擇及組合FR 殘基以便達成所要之抗體特徵，諸如對目標抗原之親和力 增加。一般而言，CDR殘基直接且最大程度上參與影響抗 原結合。可使用此項技術中已知之多種技術使抗體人類 化，諸如（但不限於）Jones等人，Nature 321:522 (1986); Verhoeyen等人，Science 239:1534 (1988))，Sims等人，J. Immunol. 15 1: 2296 (1993) ; Chothia及Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987)，Carter等人，Proc. Natl. Acad. Sci_ U.S.A. 89:4285 (1992) ; Presta 等人，J. Immunol. 151:2623 (1993) , Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka等人，Protein Engineering 7(6):805-814 (1994) ; Roguska.等人，PNAS 91:969-973 (1994) ; PCT公 141568.doc -101 - 201014602 開案 WO 91/09967、PCT/: US 98/16280、US 96/18978、 US 91/09630、US 91/05939、US 94/01234、GB 89/01334、GB 91/01134、GB 92/01755 ; WO 90/14443、 WO 90/14424、WO 90/14430、EP 229246、EP 592,106 ; EP 519,596、EP 239,400、美國專利第 5,565,332 號、第 5,723,323 號、第 5,976,862 號、第 5,824,514 號、第 5,817,483 號、第 5814476 號、第 5763192 號、第 5723323 號、第 5,766886號、第 5,714,352號、第 6,204,023 號、第 6,180,370 號、第 5,693,762 號、第 5,530，101 號、第 5,585,089號、第5,225,539號；及第4,816,567號中所述之 技術。 C.抗馥之產生及產生抗體之細胞株 較佳地，本發明之抗pge2抗體展現較高的降低或中和 PGE2活性之能力’例如如藉由此項技術中已知的若干活體 外及活體内檢定中之任一者所評估（例如參見實例丨·丨c)。 舉例而言，在EP4檢定中此等抗體以至少約丨〇·6 μ、約1 〇_7 Μ、約 ΙΟ.8 Μ、約 1(Γ9 Μ、約 ΙΟ-10 Μ、約 1〇·η Μ或約 1〇·12 Μ範圍内之ICso值中和PGE2誘發之鈣流入。 在較佳實施例中’經分離抗體或其抗原結合部分結合 PGE2 ’其中該抗體或其抗原結合部分如放射免疫檢定所測 定以約0.1 s·1或更低之koff速率常數自PGE2解離，或其以約 1χ1〇_6 Μ或更低之ICso抑制PGE2活性。或者，抗體或其抗 原結合部分可如放射免疫檢定所測定以約丨x 1〇·2 s-i或更低 之koff速率常數自PGE2解離，或可以約lxl〇-7 M或更低之 141568.doc -102- 201014602 ICso抑制PGE2活性。或者，抗體或其抗原結合部分可如放 射免疫檢定所測定以約lxlO·3 s·1或更低之k()ff速率常數自 PGE2解離，或可以約ΐχ10_8 μ或更低之1(^抑制PGE2。或 者，抗體或其抗原結合部分可如放射免疫檢定所測定以約 IxlO·4 S·1或更低之kQff速率常數自PGE2解離，或可以約 1x10 Μ或更低之IC5〇抑制PGE2活性。或者，抗體或其抗 原結合部分可如放射免疫檢定所測定以約丨χ 1〇-5 或更低 ❹之kw速率常數自PGE2解離，或可以約1χ1〇-ιο 更低之 ICw抑制PGE2活性。或者，抗體或其抗原結合部分可如放 射免疫檢疋所測疋以約1 X 1 0 6 s-丨或更低之kQff速率常數自 PGE2解離，或可以約1χ10-ιι M或更低之活 性。 本發明之單株抗體阻斷POL與EPi、EP2、EP3及EP4受 體中之至少一者結合。細胞表面之基於FACS之受體結合 檢定與3H標記之PGE2結合檢定皆表明鼠類型式及人類化型 ❹ 式抗Ρ〇Ε2皆能夠有效阻斷PGE2與其受體之結合。本發明 »又心與人類化抗PGE2抗體Hu2B5.7之Fab部分複合之pge2 的晶體結構。 在某些實施例中，抗體包含重鏈恆定區，諸如IgG1、 IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或 IgD恆定區。較佳 地’重鏈恒定區為IgG 1重鏈怪定區或igG4重鍵悝定區。此 外’抗體可包含輕鏈恆定區：κ輕鏈恆定區或人輕鏈恆定 區。較佳地，抗體包含κ輕鏈恆定區。或者，抗體部分可 為例如Fab片段或單鏈pv片段。 141568.doc •103- 201014602 用於改變抗體效應功能之FC部分中胺基酸殘基的置換為 此項技術中所已知（Winter等人，美國專利第5,648,260 號；第5624821號）。抗體之Fc部分介導若干重要效應功 能’例如細胞激素誘導、ADCC、吞噬作用、補體依賴性 細胞毒性（CDC)以及抗體及抗原-抗體複合物之半衰期/清 除率。視治療目標而定’在一些狀況下，此等效應功能為 治療性抗體所需，但在其他狀況下可能並非必要或甚至有 害。某些人類IgG同型（尤其IgGl及IgG3)分別經由與FqR 及補體Clq結合來介導ADCC及CDC。新生兒Fc受體（FcRn) 為確定抗體循環半衰期的重要組份。在另一實施例中，置 換抗體恒定區（例如抗體之Fc區）中的至少一個胺基酸殘 基，以使得抗體之效應功能得以改變。在另一實施例中， Fc片段之活性可藉由使Fc部分之N連接型聚糖唾液酸化（例 如經由與複合物上之次末半乳糖的2,6鍵聯，免疫球蛋白 G(IgG)中Asn 297處存在之雙分支聚糖）而大大增強 (Anthony, RM (2008) Science 320:373-376)。 一實施例提供本發明之抗體或抗體部分經衍生化或連接 於另一功能分子（例如另一肽或蛋白質）的經標記結合蛋 白。舉例而言’本發明之經標記結合蛋白可藉由將本發明 之抗體或抗體部分與一或多個其他分子實體功能性連接 (例如經由化學偶合、基因融合、非共價締合或其他方式） 得到，該一或多個其他分子實體諸如另一抗體（例如雙特 異性抗體或雙功能抗體）、可偵測劑、細胞毒性劑、醫藥 劑及/或可介導抗體或抗體部分與另一分子（諸如抗生蛋白 141568.doc • 104- 201014602 鏈菌素核心區或聚組胺酸標籤）締合之蛋白質或肽。 可用來何生本發明之抗體或抗體部分之適用可偵測劑包 括螢光化合物。例示性螢光可<貞㈣包括螢光素、異硫氛 酸螢光素、若丹明、田 贫Α 、 一甲細萘境酿氣、藻紅素及其類 似物。亦可用諸如驗性魏酶、辣根過氧化酶、葡萄糖氧
，酶及其類似酶之可偵測酶衍生抗體。當用可偵測酶衍生 抗體時’藉由添加酶用來產生可偵測反應產物之其他試劑 對其加以偵測。舉例而言，當存在可偵測劑辣根過氧化酶 時，添加過氧化氫及二胺基聯苯胺會產生可偵測之有色反 應產物。亦可以生物素衍生抗體，且經由間接量測抗生物 素蛋白或抗生蛋白鏈菌素結合來偵測。 本發明之另一實施例提供一種結晶化結合蛋白。本發明 較佳係關於如本文所揭示之完整抗PGE2抗體及其片段之晶 體以及包含該等晶體之調配物及組合物。在一實施例中， 結晶化結合蛋白具有比結合蛋白之可溶對應物高之活體内 半衰期。在另一實施例中’結合蛋白在結晶化後保留生物 活性。 本發明之結晶化結合蛋白可按照此項技術中已知及如 WO 02072636中所揭示之方法產生。 本發明之另一實施例提供一種抗體或其抗原結合部分包 含一或多個碳水化合物殘基之糖基化結合蛋白。新生活體 内蛋白質產生可經歷稱為轉譯後修飾之進—步加工。詳古 之，可酶促添加糖（糖基）殘基，一種稱為糖基化之過程。 所得帶有共價連接之寡醣側鏈之蛋白質稱為糖基化蛋白質 141568.doc -105- 201014602 或醣蛋白。抗體為在Fe域以及可變域中具有一或多個碳水 化合物殘基之醣蛋白。Fc域中之碳水化合物殘基對Fc域之 效應功能具有重要影響，而對抗體之抗原結合或半衰期影 響極小（R. Jefferis，Prog. 21 (2005)，第 n_i6 頁）。相反’可變域之糖基化可對抗體之抗原結合活性產 生影響。可變域中之糖基化可能由於位阻作用而對抗體結 合親和力具有負面影響（c〇, M s等人，M〇1 Immun〇i (1993) 30:1361-1367)或導致對抗原之親和力增加（Waiiick， S.C.等人，Exp. Med. (1988) 168:1099-1109 ; Wright，A.等 人，EMBO J. (1991) 10:2717 2723)。 本發明之一態樣係針對產生結合蛋白之〇連接型或^^連 接型糖基化位點已突變之糖基化位點突變體。熟習此項技 術者可使用標準熟知技術產生該等突變體。保留生物活性 但具有增加或減小之結合活性的糖基化位點突變體為本發 明之其他目標。 在另一實施例中，本發明之抗體或抗原結合部分之糖基 化經修飾。舉例而言，可製備去糖基化之抗體（亦即缺乏 糖基化之抗體）。糖基化可經改變以例如增加抗體對抗原 之親和力。該等碳水化合物修飾可藉由例如改變抗體序列 中之一或多個糖基化位點實現。舉例而言，可進行一或多 個導致消除一或多個可變區糖基化位點從而消除該位點處 之糖基化的胺基酸取代。該種糖基化可增加抗體對抗原之 親和力。該種方法在PCT公開案WO 2003016466Α2及美國 專利第5,714,35〇號及第6,350,861號中進一步詳細描述。 141568.doc 201014602 或者或另外，可製備具有改變之糖基化類型的本發明之 經修飾抗體，諸如海藻糖基殘基之量減少的低海藻糖基化 抗體或平分型GlcNac結構增加之抗體。已證明該等經改變 之糖基化模式增強抗體之ADCC能力。該等碳水化合物修 • 飾可藉由例如使抗體在糖基化機構改變之宿主細胞中表現 來實現°此項技術中已描述糖基化機構改變之細胞且其可 用作表現本發明之重組抗體之宿主細胞，由此產生糖基化 φ 改變之抗體。例如參見Shields，R. L.等人，（2002) J. Biol.
Chem· 277:26733-26740 ; Umana 等人，（1999) Nat
Bl〇tech. U:176·1 以及歐洲專利第 EP 1，176，195 號；PCT 公 開案 WO 03/035835 ; w〇 99/54342 80。 .蛋白質糖基化視所關注蛋白質之胺基酸序列以及表現該 蛋白質之宿主細胞而定。不同生物體可產生不同糖基化酶 (例如糖基轉移酶及糖苷酶）且具有不同的可利用受質（核苷 酸糖h由於該等因素，因此蛋白質糖基化模式及糖基殘 ❹ 基之組成可視表現特定蛋白質之宿主系統而不同。適用於 本發明之糖基殘基可包括（但不限於）葡萄糖、半乳糖、甘 路糖、海藻糖、η-乙醯基葡糖胺及唾液酸：糖基化結合蛋 白較佳包含糖基殘基以使得糖基化模式為人類的。 熟習此項技術者已知不同蛋白質糖基化可產生不同蛋白 質特徵。舉例而t，在諸如酵母之微生物帛主中產生且利 用酵母内源性途徑糖基化之治療性蛋白質的功效可比諸如 HCK’田胞株之哺乳動物細胞中表現之相同蛋白質的功效 低。該等醣蛋白亦可能在人類中具有免疫原性且在投與後 14I56S.doc -107- 201014602 展不降低之活體内半衰期。人類及其他動物 可識別特定糖基殘基且促進自血流中快速清除蛋白質^ =不利作用可包括蛋白質㈣、溶解性、對蛋㈣之敏感 又、運輸、轉運、區室化、分泌、由其他蛋白質或因子識 別、抗原性或過敏原性的改變。因此，從業人員可能偏好 具有特定糖基化組成及模式（例如與人類細胞或預定個體 動物之物種特異性細胞中所產生者相同或至少類似的糖基 化組成及模式）之治療性蛋白質。 表現不同於宿主細胞之糖基化蛋白質的糖基化蛋白質可 藉由遺傳修飾宿主細胞以表現異源糖基化酶來實現。使用 此項技術中已知之技術，從業人員可產生展現人類蛋白質 糖基化之抗體或其抗原結合部分。舉例而言，已對酵母菌 株進行遺傳修飾以表現非天然存在之糖基化酶，以使得此 等酵母菌株中所產生之糖基化蛋白質（亦即醣蛋白）展現與 動物細胞（尤其人類細胞）之蛋白質糖基化相同的蛋白質糖 基化（美國專利中請案20040018590及20〇2〇137134及pCT公 開案 WO 2005100584 A2)。 除結合蛋白外，本發明亦係針對對本發明之該等結合蛋 白具有特異性之抗個體基因型（抗Id)抗體。抗Id抗體為識 別通常與另一抗體之抗原結合區締合之獨特決定子的抗 體。可藉由以結合蛋白或其含CDR之區域免疫動物來製備 抗Id。經免疫動物將識別且應答免疫抗體之個體基因型決 定子且產生抗Id抗體。抗Id抗體亦可用作在另一動物中誘 發免疫反應之「免疫原」，從而產生所謂抗抗Id抗體。 141568.doc 108· 201014602 此外’ A習此項技術者將瞭解可使用經遺傳工程改造以 表現各種糖基化酶之宿主細胞文庫來表現所關注之蛋白 質’以使得該文庫之成員宿主細胞產生具有變異糖基化模 式之所關注蛋白質。從業人員隨後可選擇及分離具有特定 • 新顆糖基化模式之所關注蛋白質。較佳地，具有經特定選 擇之新穎糖基化模式之蛋白質展現改良或改變之生物特 性。 D·抗前列腺素E2抗體之用途 寥於本發明之抗PGE2抗體或其部分與pge2結合之能 力’其可用於使用諸如酶聯免疫吸附檢定（ELISA)、放射 免疫檢定（RIA)或組織免疫組織化學之習知免疫檢定偵測 人類PGE2(例如諸如血清或血槳之生物樣本中之pGE2)。本 發明提供一種偵測生物樣本中PGE2之方法，其包含使生物 樣本與本發明之抗體或抗體部分接觸且偵測與pGE2結合之 抗體（或抗體部分）或未結合抗體（或抗體部分），由此偵測 φ 生物樣本中之PGE2。抗體經可偵測物質直接或間接標記以 便於偵測結合或未結合抗體。合適可偵測物質包括各種 酶、辅基、螢光物質、發光物質及放射性物質。合適酶之 實例包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β_半乳糖苷酶或乙 醯膽鹼酯酶；合適輔基複合物之實例包括抗生蛋白鏈菌素/ 生物素及抗生物素蛋白/生物素；合適螢光物質之實例包 括傘酮（umbelliferone)、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹 明、二氯二喚基胺螢光素、丹醯氯或藻紅素；發光物質之 實例包括魯米諾（luminol);且合適放射性物質之實例包括 141568.doc -109- 201014602 3H、14c、35S、90Υ、99Tc 或 153Sm。
niIn、125I
mLu、66Ho 作為標記抗體之替代方法，可在生物流體中藉由競爭免 疫檢定利用經可偵測物質標記之PGE2標準物及未經標記之 抗PGE2抗體來檢定PCI。在此檢定中，組合生物樣本、 經標記PGE2標準物及抗PGE2抗體且測定與未標記抗體結 合之經標記PGE2標準物之量。生物樣本中pGE2之量與同 抗PGE2抗體結合之經標記PGE2標準物之量成反比。類似 地，亦可在生物流體中藉由競爭免疫檢定利用經可偵測物 質標記之PGE2標準物及未經標記之抗pGE2抗體來檢定 PGE2 〇 本發明之抗體及抗體部分較佳能夠在活體外及活體内中 和PGE2活性。因此，本發明之該等抗體及抗體部分可用於 例如在含有PGE2之細胞培養物中、在具有與本發明抗體交 叉反應之PGE2的人類個體或其它哺乳動物個體中抑制 PGE2活性。在一實施例中，本發明提供抑制Pge2活性之 方法，其包含使PGE2與本發明之抗體或抗體部分接觸以使 得PGE2活性被抑制。舉例而言，在含有或懷疑含有pGE2 之細胞培養物中，可向培養基中添加本發明之抗體或抗體 部分以抑制培養物中之PGE2活性。 在另一實施例中，本發明提供一種降低個體、有利地罹 患PGE2活性有害之疾病或病症之個體中PGE2活性之方 法。本發明提供降低罹患該種疾病或病症之個體中PGE2活 性之方法，該方法包含向該個體投與本發明之抗體或抗體 141568.doc •110- 201014602 部分以使得個體之PGE2活性得以降低。較佳地，個體為人 類個體。或者，個體可為表現能夠結合本發明抗體之pGE2 的哺乳動物。更進一步，個體可為已引入（例如藉由投與 PGE2或藉由表現PGE2合成酶轉殖基因）pGE2之哺乳動物。 可出於治療目的向人類個體投與本發明抗體。此外，可將 '本發明抗體投與出於獸醫學目的或作為人類疾病之動物模 型表現此夠與該抗體結合之PGE2之非人類哺乳動物。就後 參 種狀況而言，該等動物模型可用於評估本發明抗體之治療 功效（例如測試投與劑量及時程）。 本文所用之術語「PGE2活性有害之病症」意欲包括已證 實罹患該病症之個體中存在PGE2為或懷疑為造成該病症之 病理生理的原因，或為造成該病症惡化之因素的疾病及其 他病症。因此，PGE2活性有害之病症為預期降低pge2活 性會緩解病症之症狀及/或進展的病症。該等病症可表現 為例如罹患該病症之個體的生物流體中pge2之濃度增加 ❹ （例如個體之血清、血漿、滑液等中PGE2之濃度增加），其 可例如使用如上文所述之抗PGE2抗體來偵測。可用本發明 抗體治療之病症的非限制性實例包括下文與本發明抗體之 醫藥組合物相關之部分中所論述的彼等病症 已暗示PGE2在引起與類風濕性關節炎相關之病理學反應 中起關鍵作用。然而，關節炎中亦涉及不同免疫球蛋白路 扭之其他介體’且除PGE2之外阻斷此等介體亦可提供額外 治療益處。因此’可將本發明之結合蛋白併入至DVD-IgTM 蛋白質中，其中在DVD-IgTM中能夠結合目標對，該等目標 141568.doc • 111 - 201014602 對包括（但不限於）PGE2及促炎性細胞激素，諸如腫瘤壞死 因子a(TNF-a)。阻斷PGE2及TNF-α兩者可具有組合TNF-a 之DMARD作用且藉由阻斷PGE2減輕疼痛之有益作用。在 一較佳實施例中，本發明之DVD-IgTM結合目標PGE2及 TNFa且用於治療類風濕性關節炎。 本發明之一態樣係關於包含能夠結合PGE2之結合蛋白的 DVD-IgT'S合蛋白。較佳地，DVD-IgTM結合蛋白能夠結 合PGE2及第二目標。第二目標係選自由以下組成之群： TNF、EGF、EGFR、IGF1、IGF2、IGF1/2、IGFR Erb2、 Erb3、VEGF、VEGFR、Muc-l、CSFl(MCSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、FGF2、IFNyl、IFNyl、IFNy、組織 胺及組織胺受體、1]^-1〇1、11^-10、11^2、11^3、1[-4、11^-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-ll、IL-12ct、IL-12β 、 IL-14 、 IL-15 、 IL-16 、 IL-17 、 IL-18 、 IL-19 、 KITLG、PDGFB、IL-2Ra、IL-4R、IL-5Ra、IL-8Ra、IL-8R|3、IL-12R β，1、IL-12R β，2、IL-18R1、TSLP、CCL1、 CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL13、 CCL17 、 CCL18 ' CCL19 、 CCL20 、 CCL22 、 CCL24 、 CX3CL1 、 CXCL1 、 CXCL2 、 CXCL3 、 XCL1 、 CCR2 、 CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CX3CR1、 GPR2、XCR1、FOS、GATA3、JAK1、JAK3、STAT6、 TBX21、TGFB1、TNFSF6、YY1、CYSLTR1、FCER1A、 FCER2、LTB4R、TB4R2、LTBR及殼質酶。更佳地，DVD 結合蛋白能夠識別PGE2及TNF a、PGE2及IL-6、PGE2及 -112· 141568.doc 201014602 IL-Ιβ、PGE2 及 IL-6R、PGE2 及 CTLA-4、PGE2 及 EGF、 PGE2 及 IGF-1/2、PGE2 及 Erb2、PGE2 及 Erb3、PGE2 及 VEGF。最佳地，DVD結合蛋白能夠結合PGE2及TNFa。用 於治療自體免疫疾病之較佳DVD-Ig包括（但不限於）含有抗 PGE2抗體及選自由以下組成之群之目標的DVD-Ig : TNF a、IL-1 a、IL-Ιβ、IL-6 或 IL-6R、CTLA-4Ig、BAFF、 TACI、RANKL，或 DKK1 或 SOCT、MMP13，或 MMP1 或 MMP4。較佳用於癌症療法之目標對包括PGE2+EGF或 EGFR、PGE2+IGF1 或 IGF1R、PGE2+IGF2 或 IGF2R、 PGE2+IGFl/2、PGE2+VEGF 或 VEGFR、PGE2+Erb2、 PGE2+Erb3 及 PGE2+S1P。 已暗示PGE2在引起與類風濕性關節炎或癌症相關之病理 學反應中起關鍵作用。然而，關節炎或癌症中亦涉及不同 免疫球蛋白路徑之其他介體，且除PGE2之外阻斷此等介體 亦可提供額外治療益處。目前用於治療各種人類疾病及病 症之藥物的清單可在網際網路www.drugs.com獲得。此清 單頻繁更新以反映各種人類疾病治療的技術現狀《抗PGE2 可與彼清單中之用於特定疾病病況之任何療法組合。下文 提供一些實例。抗PGE2可與一或多種用於治療類風濕性關 節炎及青少年類風濕性關節炎之藥劑組合。此等藥劑之實 例包括（但不限於）下文列出之藥劑，例如在減少異常滑膜 組織（襯於關節内部之組織）生長的同時減輕疼痛及發炎之 藥物。此等藥物包括甲胺喋呤及低劑量皮質類固醇（諸如 普賴蘇或皮質酮）。在某些人當中，此等藥物亦減少關節 141568.doc -113- 201014602 損壞。用於治療類風濕性關節炎之其他藥 藥物(諸如經基氣化奎寧)、金、柳氣續胺…青黴胺、 環磷醯胺'環孢素及二甲胺四環素。此外，可開立一種以 上藥物的處方。目前可獲得阻斷特異性發炎因子（細胞激 素）之作用的較新穎生物劑。英利昔單抗、依那西普及阿 達木單抗阻斷細胞激素TNFa、阿巴西普阻斷1細胞共刺 激、利妥昔單抗消耗B細胞、阿那白滞素阻斷細胞激素介 白素-1，且其他新穎生物劑靶向IL_6、IL_6R、IL17、IL_ 18 IL-23、B7.1/B7.2。抗PGE2可與一或多種用於治療關 節黏連性脊椎炎之藥劑組合。此等藥劑之實例包括（但不 限於）皮質類固醇、細胞毒性藥物及最近使用之抗TNFa 劑抗PGE2可與一或多種用於治療多發性硬化症之藥劑組 合。此等藥劑之實例包括（但不限於）阿凡尼西、咪唑硫嘌 呤錠、硫唾嗓呤、倍泰龍、布比普瑞、克帕松、扣托隆、 格拉默、移護寧、干擾素p_la、干擾素卜lb溶液、凱普 瑞、凱普瑞SP、米托蒽醌、那他珠單抗、那凡曲隆、奥拉 普德、奥拉普德ODT、培地普德、普瑞傑特5〇、普瑞達闊 50、普知達龍50、普瑞德特50、潑尼龍、普瑞隆、利比及 泰沙比瑞。抗PGE2可與一或多種出用於 治療疼痛之藥劑或治療程序組合。抗pci可與—或多種 www.drugs.com列出用於治療克隆氏病之藥劑或治療程序 組合。抗PGE2可與一或多種www drugs c〇m列出用於汐療 各種人類癌症及惡性疾病之藥劑或治療程序組合。 D.醫藥組合物 141568.doc .114- 201014602 本發明亦提供包含本發明之抗體或其抗原結合部分及醫 藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。包含本發明抗體之醫 藥組合物係用於（但不限於）診斷、偵測或監測病症；預 防、治療、控制或改善病症或其一或多種症狀；及/或研 究。在一特定實施例中，醫藥組合物包含一或多種本發明 抗體。在另一實施例中，醫藥組合物包含一或多種本發明 - 抗體及除本發明抗體以外的一或多種用於治療pge2活性有 Φ 害之病症的預防劑或治療劑。較佳地，已知預防劑或治療 劑適用於或已用於或目前正用於預防、治療、控制或改善 病症或其一或多種症狀。根據此等實施例，組合物可進一 步包含载劑、稀釋劑或賦形劑。 本發明之抗體及抗體部分可併入適於向個體投與之醫藥 合物：。通常，醫藥組合物包含本發明之抗體或抗體部 刀及醫藥學上可接受之載劑。如本文所用，「醫藥學上可 =之載劑」包括在生理學上相容之任何及所有溶劑、分 • 散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張及吸收延遲劑 及其類似物。醫藥學上可接受之載劑的實例包括水、睡 水、錢鹽緩衝鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類似物; 2一或多者以及其組合。在許多狀況τ，較佳在組合物中 t括等張劑’例如糖、諸如甘露糖醇或山梨糖醇之多元 /或氯化鈉。醫藥學上可接受之載劑可進一步包含少 辅助物質，諸如濕濁劍或乳化劑、防腐劑或緩 強抗體或抗體部分之存放㈣有效性。 … 各種傳遞系統為已知沾 匕知的且可用於投與一或多種本發明抗 I4I568.doc •115- 201014602 體或一或多種本發明抗體與適用於預防、控制、治療或改 善病症或其一或多種症狀之預防劑或治療劑之組合，例如 囊封於脂質體、微粒、微膠囊中；能夠表現抗體或抗體片 段之重組細胞；受體介導之胞飲作用（例如參見Wu& Wu， J· Biol· Chem· 262:4429-4432 (1987));構築作為反轉錄病 母或其他載體之部分之核酸等。投與本發明之預防劑或治 療劑的方法包括（但不限於）非經腸投與（例如皮内、肌肉 内、腹膜内、靜脈内及皮下）、硬膜外投與、腫瘤内投與 及黏膜投與（例如鼻内及經口途徑）。此外，可例如藉由使 用吸入器或噴霧器及具有氣霧劑之調配物採用肺部投藥。 例如參見美國專利第6,019,968號；第5,985,320號；第 5,985,309 號；第 5,934,272 號；第 5,874,064 號；第 5,855,913號；第 5,290,540號及第 4,880,078號；及 PCT公開 案第 WO 92/19244號；第 WO 97/32572號；第 WO 97/44013 號；第WO 98/31346號及第WO 99/66903號。在一實施例 中’使用Alkermes AIR®肺部藥物傳遞技術（Alkermes， Inc·，Cambridge, Mass.)投與本發明之抗體、組合療法或本 發明之組合物。在一特定實施例中，肌肉内、靜脈内、腫 瘤内、經口、鼻内、肺部或皮下投與本發明之預防劑或治 療劑。可藉由任何便利途徑，例如藉由輸注或快速注射、 藉由經上皮或皮膚黏膜内層（例如口腔黏膜、直腸及腸黏 膜等）吸收投與預防劑或治療劑且其可與其他生物活性劑 一起投與。投藥可為全身性或局部投藥。 在一特定實施例中，可能需要向需要治療之區域局部投 141568.doc 116· 201014602 與本發明之預防劑或治療劑。 Μ , 精由例如局部輸注、注 射或藉助於植入物（該植入物為多 rj 眩月装樹 4, L次非夕孔材料，包括 膜及基彦，諸如橡膠膜（sialasUc)、 ,T； 聚&物、纖維基質（例 如T1SSUel®)或膠原蛋白基質 貝^灵兄在一實施例中，向個 體之受影響區域局部投與有效量 男议置之—或多種本發明抗體以 預防、治療、控制及/或改善病症或其症狀。在另一實施 例中，向個體之受影響區域局部投與有效量之一或多種本
發明抗體以及有效量之-或多種除本發明抗體以外的療法 (例如一或多種預防劑或治療劑）以預防、治療、控制及/或 改善病症或其一或多種症狀》 在另Λ施例中，本發明之預防劑或治療劑可以控制釋 放或持續釋放系統傳遞。在一實施例中，可使用泵來實現 控制釋放或持續釋放（參見Langer，同上文；§eft〇n 1987 CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20 ; Buchwald等人，1980, Surgery 88:507，Saudek 專人，1989，N. Engl. J. Med. 321:574)。在另一實施例中，可使用聚合材料來實現本發 明療法之控制釋放或持續釋放（例如參見Medical
Applications of Controlled Release, Langer 及 Wise(編）， CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974) ； Controlled Drug
Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen 及 Ball(編），Wiley，New York (1984) ; Ranger及 Peppas, 1983，J.，Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 ;亦參見Levy等人 ’ 1985，Science 228:190 ; During 等人，1989，Ann· Neurol. 25:351 ; Howard等人 ’ 1989，J. 141568.doc -117- 201014602
Neurosurg_7 1:105;美國專利第 5,679,377號；美國專利第 5,916,597號；美國專利第5,912,015號；美國專利第 5,989,463號；美國專利第5，128,326號；卩(：1'公開案第^¥0 99/15154號；及PCT公開案第w〇 99/20253號）。持續釋放 調配物中使用之聚合物的實例包括（但不限於）聚（曱基丙烯 酸2-羥基乙酯）、聚（甲基丙烯酸曱酯）、聚（丙烯酸）、聚（乙 稀-共-乙酸乙稀酯）、聚（曱基丙稀酸）、聚乙交酯（PLg)、 聚酸酐、聚（N-乙稀基β比B各咬酮）、聚（乙稀醇）、聚丙稀醯 胺、聚（乙二醇）、聚丙交酯（PLA)、聚（丙交酯-共-乙交 醋）(PLGA)及聚原酸醋。在一較佳實施例中，持續釋放調 配物中使用之聚合物為惰性的、不含可浸出雜質、儲存穩 定、無菌且生物可降解。在另一實施例中，控制或持續釋 放系統可鄰近預防或治療目標放置，因此僅需要全身劑量 之一部分（例如參見 Goodson，Medical Applications of Controlled Release,同上文，第 2 卷，第 115_ ；[ 3 8 頁 (1984))。
控制釋放系統論述於Langer之回顧（199〇，Science 249:1527-1 533)中。可使用熟習此項技術者已知之任何技 術製備包含一或多種本發明治療劑之持續釋放調配物。例 如參見美國專利第4,526,938號、PCT公開案WO 91/05548、PCT公開案 WO 96/20698、Ning 等人，1996, 「Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel，」
Radiotherapy & Oncology 39:179-189、Song 等人，1995 -118- 141568.doc 201014602 「Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions，」PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397 、 Cleek 等 人 ， 1997, 「Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application，」Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854 及 Lam 等人，1997, 「 Microencapsulation of Recombinant Humanized
Monoclonal Antibody for Local Delivery，」Proc. Int'l· Symp· Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760。 在一本發明組合物為編碼預防劑或治療劑之核酸的特定 實施例中，可藉由將核酸構築為適當核酸表現載體之部 分，且例如藉由使用逆轉錄病毒載體（參見美國專利第 4,980,286號）或藉由直接注射或藉由使用微粒轟擊（例如基 因槍；Biolistic，Dupont)或以脂質或細胞表面受體或轉染 劑包覆，或藉由將其與已知進入核之同源盒樣肽連接投與 (例如參見Joliot等人，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868)將其投與以使其變為在細胞内，來活體内投 與核酸以促進其所編碼之預防劑或治療劑表現。或者，可 將核酸引入胞内且藉由同源重組使其併入宿主細胞DNA中 以供表現。 調配本發明之醫藥組合物使其與預定投藥途徑相容。投 藥途徑之實例包括（但不限於）非經腸，例如靜脈内、皮 内 '皮下、經口、鼻内（例如吸入）、經皮（例如局部）、經 黏膜；及直腸投藥。在一特定實施例中，組合物係根據常 141568.doc -119- 201014602 規程序調配為適於靜脈内、皮下、肌肉内、經口、鼻内或 局部投與人類之醫藥組合物。通常，用於靜脈内投與之組 合物為於無菌等張水性緩衝液中之溶液。需要時，組合物 亦可包括增溶劑及局部麻醉劑（諸如利多卡因（lign〇eaine)) 以減輕注射部位之疼痛。 若欲局部投與本發明組合物，則組合物可調配為軟膏' 乳膏、經皮貼片、洗劑、凝膠、洗髮精、喷霧劑、氣霧 劑、溶液、乳液之形式或熟習此項技術者已知之其他形 式。例如參見 Remingt〇nis Pharmaceutical Sciences and
Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms，第 19版， Mack Pub. Co.，Easton，Pa. (1995)。對於不可噴霧之局部 劑型而言’通常採用包含與局部施用相容之載劑或一或多 種賦形劑且動力黏度較佳大於水之黏稠至半固體或固體形 式。合適調配物包括（但不限於）溶液、懸浮液、乳液、乳 膏、軟膏、散劑、擦劑、油膏及其類似物，必要時將其滅 菌或與影響諸如滲透壓之各種特性之助劑（例如防腐劑、 穩定劑、濕潤劑、緩衝劑或鹽）混合。其他合適的局部劑 型包括可噴霧之氣霧劑製劑，其中活性成分較佳與固體:戈 液體惰性载劑組合’且以與加壓揮發性物質（例如氣體推 進劑，諸如氟利昂（freon))之混合物形式封裝或封裝於塑 料擠瓶（SqUeeze bGttle)中。必要時，亦可向醫藥組合物及 劑型中添加增濕劑或保濕劑。該等其他， 玖刀之實例為此項 技術中所熟知。 則組合物可調配成 若本發明方法包含鼻内投與組合物， 141568.doc -120- 201014602 氣霧劑形式、噴霧劑、薄霧或滴劑形式。詳言之，根據本 發明使用之預防劑或治療劑可使用合適推進劑⑽如二氣 二氟甲燒、三氯氟^、二氯四氟乙烧、二氧化碳或其他 合適氣趙）以來自加慶包裝或喷霧器之氣霧劑嘴霧呈現形 式方便地傳遞。在加壓氣霧劑之狀況下，劑量單位可藉由 提供閥門以傳遞計量之量來確定。可調配含有化合物斑諸 參 如乳糖或澱粉之合適粉末基劑之粉末混合物的膠囊及藥筒 (由例如明膠構成）用於吸入器或吹入器。 若本發明方法包含經口投藥，則組合物可調配為錠劑、 膝囊、扁膠劑、凝膠藥丸（gelcap)'溶液、懸浮液及其類 似物之形式。錠劑或膠囊可藉由習知方式用醫藥學 受之賦形劑製備，該等賦形劑諸如黏合劑（例如預勝凝化 玉未㈣、聚乙烯响略㈣或經丙基甲基纖維素）；填充 ^例如乳糖、微晶纖維素或魏朗）；㈣劑（例如硬脂 = )、.滑二或广崩解劑(例如馬鈐箸殿粉或如 =’二 如十二燒基硫酸納)。錠劑可藉由此項 法塗覆。用於經口投藥之液體製劑可為例 於）溶液、㈣或懸浮液形式，或其可以在使用 削以水或其他合適媒劑復原之無 體製劑可藉由習知方式用醫 广棱供。該等液 :生：=浮劑(例如山梨糖醇糖漿、纖維素 膠)脂肪）；Μ軸如㈣脂或阿拉伯 防腐劑（例如龍基笨甲酸Η旨或㈣基苯甲 141568.doc -121. 201014602 酸丙酯或山梨酸）。適當時製劑亦可含有緩衝鹽、調味 劑、著色劑及甜味劑。經口投與之製劑可經適當調配以供 緩慢釋放、控制釋放或持續釋放預防劑或治療劑。 本發明方法可包含例如藉由使用吸入器或喷霧器肺部投 與與氣霧劑一起調配之組合物。例如參見美國專利第 6,〇19,968 號；第 5,985,32〇 冑；第 5 985 3〇9 號；第 5,934,272 號；第 5,874,064 冑；帛 5,855 913 號；第 5,290,540號及第4,880,078號；及PCT公開案第w〇 92/19244號；第 w〇 97/32572號；第 w〇 97/44013號；第 %〇 98/31346號及第貿〇 99/66903號。在一特定實施例 中，使用Alkermes AIR®肺部藥物傳遞技術（Alkemes， Inc·，Cambridge，Mass.)投與本發明抗體、組合療法及/或 本發明組合物。 本發明方法可包含藉由注射（例如藉由快速注射或連續 輸注）投與經調配用於非經腸投與之組合物。用於注射之 調配物可以添加有防腐劑之單位劑型（例如於安瓿中或於 多劑量谷器中）提供。組合物可採用諸如於油性或水性媒 劑中之懸浮液、溶液或乳液之形式且可含有諸如懸浮劑、 穩定劑及/或分散劑之調配劑。或者，活性成分可為在使 用前以合適媒劑（例如無菌無熱原質水）復原之粉末形式。 本發明方法可另外包含投與調配為儲槽式製劑之組合 物。該等長效調配物可藉由植入（例如皮下或肌肉内）或藉 由肌肉内注射來投與。因此，例如’組合物可以合適聚合 或疏水性物質（例如調配為可接受之油中之乳液）或離子交 141568.doc •122- 201014602 換樹脂或微溶衍生物（例如調配為微溶鹽）調配。 本發明方法涵蓋投與調配為中性或鹽形式之組合 藥學上可接受之鹽包括與陰離子形成之鹽，諸如衍生自鹽 酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等之鹽；及與陽離子形成 • 之鹽，諸如何生自氫氧化納、氫氧化卸、氫氧化錢、氫敦 ㈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2_乙基胺基乙醇、址 - 胺酸、普魯卡因等之鹽。 瘳 -般而言，組合物之成分單獨或以混合在一起之單位劑 型(例如以乾燥;東乾粉末或無水濃縮物形式)於指示活性劑 之置之密封容器（諸如安瓶或藥囊）中提供。當投藥模式為 輸注時，組合物可以含有無菌醫藥級水或鹽水之輸液瓶分 配。當投樂模式為注射時，可提供注射用無菌水或鹽水之 安瓶以便可在投藥之前混合成分。 詳言之，本發明亦規定本發明之—或多種預防劑或治療 劑或醫樂組合物封裝於指示藥劑之量之密封容器（諸如安 • μ或藥囊）中。在—實施例中，本發明之-或多種預防劑 或治療劑或醫藥組合物係以乾燥無菌象乾粉末或無水濃缩 •物形式於密封容器中提供且其可復原（例如用水或鹽水）成 、適當濃度以向個體投盥。μ估从 .^ 又一較佳地，本發明之一或多種預防 劑或治療劑或醫藥組合物係以密封容器中之乾燥無菌康乾 粉末形式提供’其單位劑量為至少5 mg，更佳至少1〇 mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45^、 至少50 mg、至少75 mg或至少1〇〇mg。本發明之東乾預防 劑或治療劑或醫藥組合物應在其初始容器中於沈與代之 141568.doc -123. 201014602 間儲存，且本發明之預防劑或治療劑或醫藥組合物應在復 原後1週内，較佳5天内、72小時内、48小時内、24小時 2 J時内6小時内、5小時内、3小時内或！小時内投 與。在-替代性實施财，本發明之—或多種預防劑或治 療劑或醫藥組合物係以液體形式於指示藥劑之量及浪度的 密封容器中提供。較佳地，所投與組合物之液體形式係以 至少〇·25 mg/m卜更佳至少0.5 mg/ml、至少i mg/mi、至 夕 2.5 mg/ml、至少 5 mg/ml、至少 8 mg/mi、至少 1〇 mg/m卜至少1 5 mg/kg、至少25 mg/m卜至少5〇叫劬卜至 乂 75 mg/ml或至少1〇〇 mg/mi於密封容器中提供液體形 式應在2°C與8°C之間於其初始容器中儲存。 本發明之抗體及抗體部分可併入適於非經腸投藥之醫藥 組合物中。抗體或抗體部分較佳將製備為含有〇 一々％ mg/ml抗體之可注射溶液。可注射溶液可由燧石或琥珀色 小瓶、安瓿或預填充注射器中之液體或凍乾劑型構成。緩 衝劑可為L-組胺酸（1-50 mM)，最佳5-10 mM，pH值為5 〇 至7·0(最佳為pH 6.0)。其他合適緩衝劑包括（但不限於）丁 二酸鈉、檸檬酸鈉、填酸鈉或填酸鉀。可使用濃度為〇_ 300 mM之氣化鈉來調節溶液毒性（對於液體劑型而言最隹 為150 mM)。對於凍乾劑型而言可包括低溫保護劑，主要 為0-10%蔗糖（最佳為〇·5%-1.0%)。其他合適低溫保護劑包 括海藻糖及乳糖。對於凍乾劑型而言可包括增積劑，主要 為1%-10°/。甘露糖醇（最佳為2%-4%)。液體與凍乾劑型中均 可使用穩定劑，主要為1-50 mM L-甲硫胺酸（最佳為5_1〇 141568.doc -124- 201014602 mM)。其他合適增積劑包括甘胺酸、精胺酸，其可以〇_ 0.〇5%聚山梨醇醋-80(最佳為〇·〇〇5%-〇.〇ι%)之形式包括。 其他界面活性劑包括（但不限於）聚山梨醇酯2〇&brij界面 活性劑。製備成用於非經腸投藥之可注射溶液的包含本發 • 明之抗體及抗體部分的醫藥組合物可進一步包含適用作佐 劑之藥劑，諸如用於增加治療性蛋白質（例如抗體）之吸收 : 或分散的藥劑^尤其適用之佐劑為玻尿酸酶，諸如 φ Hylenex®(重組人類玻尿酸酶在可注射溶液中添加玻尿 酸酶在非經腸投藥後，尤其皮下投藥後提高人類生物可用 性。其亦允許較高注射部位體積（亦即大於丨ml)以及較少 疼痛及不適，及最低注射部位反應發生率（參見w〇 2004078140及 US 2006104968)。 •本發明組合物可呈多種形式。此等形式包括例如液體、 半口體及固體劑型，諸如液體溶液（例如可注射溶液及可 輸/主/合液）、分散液或懸浮液、錠劑、丸劑、散劑、脂質 φ 冑及栓劑。較佳形式視投藥及治療應用之預定模式而定。 〃里較佳組合物為可注射或可輸注溶液形式，諸如類似於 彼等用於以其他抗體被動免疫人類之組合物的組合物。較 佳投^模式為非經腸（例如靜脈内、皮下、腹膜内、肌肉 & )¼式在一較佳實施例中，藉由靜脈内輸注或注射來 「抗體。在另一較佳實施例中，抗體係藉由肌肉内或皮 下注射投與。 A °療組合物在製造及儲存條件下it常須無菌且穩定。組 可調配為溶液、微乳液、分散液、脂質體或適於高藥 141568.doc •125- 201014602 物漠度之其他有序結構。可藉由將所要量之活性化合物 (亦即抗體或抗體部分)連同上文列舉之成分中之-者或該 等成分之組合併人適當溶劑中’接著根據需要過濾滅菌， 來製備無g可注射溶液…般而言，藉由將活性化合物併 入含有基礎分散介質及來自上文所列舉之成分之所需其他 成分的無菌媒劑中來製備分散液。在使用無菌;東乾粉末製 備無菌可注射溶液之狀況下，較佳製備方法為真空乾燥及 噴霧乾燥，其產生活性成分加來自其先前無菌過濾之溶液 的任何其他所要成分之粉末。可例如藉由使用諸如印磷脂 之衣料，藉由保持所需粒徑（在分散液狀況下），及藉由使 用界面活性劑來保持溶液之適當流動性。可注射組合物之 延長吸收可藉由在組合物中包括延緩吸收之藥劑（例如單 硬脂酸鹽及明膠）來達成。 可藉由此項技術中已知之多種方法投與本發明之抗體及 抗體部分，不過對於許多治療應用而言，較佳投藥途徑/ 模式為皮下注射、靜脈内注射或輸注。如熟習此項技術者 所應瞭解，投藥途徑及/或模式將視所要結果而變化。在 某些實施例中’可用防止化合物快速釋放之載劑來製備活 1"生化&物，諸如控制釋放調配物’包括植入物、經皮貼片 及微膠囊傳遞系統。可使用生物可降解、生物相容性聚合 物’諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、 聚原酸酯及聚乳酸。製備該等調配物之許多方法均已取得 專利權或通常為熟習技術者所已知。例如參見 and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. 141568.doc -126- 201014602
Robinson編，Marcel Dekker, Inc” New York，1978。 在某坠實施例中，本發明之抗體或抗體部分可例如與惰 性稀释劑或可同化之可食用載劑一同經口投與。化合物 (必要時連同其他成分）亦可囊封於硬質或軟質明膠膠囊 . 中，壓製為錠劑或直接併入至個體飲食中。對於經口治療 性投與而言，化合物可併有賦形劑且以如下形式使用··可 -攝入錠劑、經頰錠劑、糖衣錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖 φ 漿、糯米紙囊劑（wafer)及其類似形式。為了藉由非經腸投 藥之外的方式投與本發明化合物，可能需要將化合物以防 止其失活之材料塗覆或將化合物與防止其失活之材料共同 投與。 補充活性化合物亦可併入組合物中。在某些實施例中， 將本發明之抗體或抗體部分與一或多種適用於治療pGE2活 性有害之病症的其他治療劑共調配及/或共投與。舉例而 言’可將本發明之抗PGE2抗體或抗體部分與一或多種結合 φ 其他目標之其他抗體（例如結合其他細胞激素或結合細胞 表面分子之抗體）共調配及/或共投與。此外，本發明之一 或多種抗體可與兩種或兩種以上上述治療劑組合使用。兮 等組合療法可有利地利用較低劑量之所投與治療劑，因此 避免與各種單一療法相關之可能毒性或併發症。 在某些實施例中’將針對PGE2之抗體或其片段與此項技 術中已知的延長半衰期之媒介連接。該等媒介包括（但不 限於）Fc域、聚乙二醇及聚葡萄糖。該等媒介描述於例如 美國申請案第09M28,082號及公開之PCT申請案第w〇 141568.doc • 127· 201014602 99/25044號中 ° 在一特定實施例中，藉助於基因療法投與包含編碼本發 明抗體或本發明之另一預防劑或治療劑的核苷酸序列之核 酸序列以治療、預防、控制或改善病症或其一或多種症 狀。基因療法係指藉由向個體投與已表現或可表現之核酸 執行之療法。在本發明之此實施例中，核酸產生介導預防 或治療作用之其所編碼之本發明之抗體或預防劑或治療 劑。 可根據本發明使用此項技術中可利用之用於基因療法的 任何方法。基因療法之方法的一般回顧參見Goldspiel等 人，1993, Clinical Pharmacy 12:488-505 ; Wu及 Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95 ; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev.
Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 ; Mulligan, Science
260:926-932 (1993);及 Morgan 及 Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 ； May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215。重組DNA技術之所屬領域中通常已知的可 使用之方法描述於Ausubel等人（編），Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons，NY (1993);及 Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)中。基因療法之各種方 法的詳細描述揭示於US 20050042664 A1中。 在另一態樣中，本申請案特徵為在個體中治療（例如治 癒、抑制、改善、延遲或預防發作或預防重現或復發）或 預防PGE2相關病症之方法。該方法包括··以足以治療或預 141568.doc -128- 201014602 防PGE2相關病症之量向個體投與pge2結合劑（尤其拮抗 劑）’例如如本文所述之抗!>〇£2抗體或其片段。P(3E2拮抗 劑（例如抗PGE2抗體或其片段）可如本文所述單獨或與其他 治療方式組合向個體投與。 本發明心:供治療個體之發炎性病症及免疫病症之方法， 該等病症特徵為過量ρ〇Ε2生物合成，該等方法包含向個體 投與有效量之對PGE2具特異性的抗體。可藉由本發明方法 $ 治療之病症包括涉及過量pge2合成的自體免疫及發炎性疾 病及腫瘤。該等病症包括：類風濕性及過敏性關節炎； (b)某些由病毒誘發之疾病，諸如格巴二氏症候群、感染 性單核白血球增多症、其他病毒性淋巴腺病及疱疹病毒感 染；（c)多發性硬化症及其他脫髓鞘疾病；（d)血液病，諸 如溶血性貧也及血小板減少症；内分泌病症，諸如糖尿 病、艾迪森氏病、特發性副曱狀腺低能症及慢性淋巴細胞 性甲狀腺炎，（f)膠原蛋白病變’諸如全身性紅斑狼瘡症； 〇 及（g)生殖病症，諸如閉經、不孕症、反覆性流產及驚厥； 及00腫瘤，諸如頭頸部腫瘤、肺癌、胃癌、前列腺癌、胰 腺癌等，及⑴皮膚、胃腸器官之發炎及/或自體免疫病狀 (例如發炎性腸病（IBD)，諸如潰瘍性結腸炎及/或克隆氏 病）’及⑴與骨關節炎及其他病症相關之疼痛；及（k)眼 病，諸如年齡相關之黃斑變性（AMD)。因此，揭示内容包 括PGE2結合劑（諸如本文所述之抗PGe2抗體或其片段）用於 本文所述之治療的用途及PGE2結合劑（諸如本文所述之抗 PGEz抗體或其片段）用於製備用以本文所述之治療的藥物 141568.doc •129· 201014602 的用途。 廳2相關病症之實例包括（但不限於）選自由以下电成之 群的病症：關節炎、類風濕性關節炎、骨關節炎、 慢性關節炎、膿毒性關節炎、萊姆 _即犬、牛皮癬性關節 炎、反應性關節炎、脊椎關節病、全身性红斑狼療症、克 隆氏病、潰瘍性結腸炎、發炎性腸病、騰島素依㈣ 病、甲狀腺炎、哮喘、過敏性疾病、牛皮癖、皮膚炎性硬 皮病、異位t皮膚炎、移植物抗宿主疾病、器官移植排斥 反應、與器g移植右關夕姐 有關之急性或慢性免疫疾病、肉狀瘤 病、動脈粥樣硬化、散播性血管内凝血、川崎氏病、格雷 夫氏病、腎病症候群、慢性疲勞症候群、華格納氏肉芽 病、亨保-絲奇恩賴紫癜、腎臟之微觀脈管炎、慢性活動 型肝炎、葡萄膜炎、跄A M 乂士 * ,. 人敗血性休克、中毒性休克症候群、膿 毒病症候群、惡病質、感染性疾病、寄生蟲病、後天免疫 缺乏症候群、急性橫貫性㈣炎、亨廷頓氏舞蹈病、帕金 森氏病、阿兹海默氏病、中風、原發性膽汁性肝硬化、溶 血！·生貧血帛性疾病、心臟衰竭、心肌梗塞、艾迪森氏 病偶發性I型多腺低減及π型多腺低減、史密特氏症候 群成人(急f生)呼吸窘迫症候群、禿頭症、斑禿、企清陰 ί·生關節病關節病、萊特爾氏病、牛皮癬性關節病、潰瘍 性結腸炎性關節病、腸病性滑膜炎、披衣菌、耶氏桿菌及 /ν門氏菌相關之關節病、脊椎關節病、動脈粥樣化病/動 脈硬化症特異體質過敏症、自體免疫性水皰病、尋常天 癌療、落葉狀天癌瘡、類天癌瘡、線狀IgA病、自體免疫 141568.doc 201014602 性浴血性貧▲、庫氏試驗陽性溶血性貧血、後天惡性貧 血、青少年惡性貧血、肌痛性腦炎/皇家自由病、慢性皮 膚黏膜念珠菌病、巨細胞動脈炎、原發性硬化性肝炎、隱 源性自體免疫性肝炎、後天免疫缺乏疾病症候群、後天免 • 賴之相關疾病、_肝炎、c型肝炎、普通易變型免疫 缺乏（普通易變型低丙球蛋白血症）、擴張性心肌病、女子 . 体症、印巢功能衰竭、即巢早衰、纖維化肺病、隱源性 Φ ㈣維性肺泡炎、發炎後間質性肺病、間質性肺炎、結締 組織病相關之間質性肺病、混合結締组織病相關之肺病、 全f性硬化症相關之間質性肺病、類風濕性關節炎相關之 間資性肺病、全身性《斑 牙丨、斑狠瘡症相關之肺病、皮肌炎/多 肌炎相關之肺病、休格連氏病相關之肺病、關節黏連性脊 椎炎相關之肺病、脈管炎性彌漫性肺病、血黃素沈積症相 關之肺病、藥物誘發之間質性肺病、纖維化、放射性纖維 化、閉塞性細支氣管炎、慢性嗜伊紅血球性肺炎、淋巴細 參㈣潤性肺病、感染後間質性肺病、痛風性關節炎、自體 免疫陡肝x、丨型自體免疫性肝炎（經典自體免疫或類狼瘡 、肝炎）2型自體免疫性肝炎（抗LKM抗體肝炎）、自體免 疫介導之低金糖症、B型騰島素抗性伴發黑色棘皮病、副 曱狀腺低能症、與器官移植有關之急性免疫疾病、與器官 移植有關之慢性免疫疾病、非炎性骨關節病、原發性硬化 丨膽&炎、1型牛皮癬、2型牛皮癖、特發性白血球減少 病自體免疫性嗜中性球減少症、腎病n〇s、腎小球腎 炎、腎臟之微觀脈管炎、萊姆病、盤狀紅斑狼瘡、特發性 141568.doc -131. 201014602 男性不孕症或NOS、精子自體免疫、多發性硬化症（所有 次型）、交感性眼炎、結締組織病繼發之肺性高企壓、古 巴士德氏症候群、結節性多動脈炎之肺部表現、急性風渴 熱、類風濕性脊椎炎、斯蒂爾病、全身性硬化症、休格連 氏症候群、咼安氏病/動脈炎、自體免疫性血小板減少 症、特發性血小板減少症、自體免疫性f狀腺病、甲狀腺 機能宄進症、f狀腺腫性自體免疫性f狀腺低能症（橋本 氏病）、萎縮性自體免疫性甲狀腺低能症、原發性黏液水 腫、晶狀體源性葡萄膜炎、原、發性脈管[白斑病急性肝 病、k性肝病、酒精性肝硬化、酒精誘發之肝損傷、膽汁 淤積、特質性肝病、藥物誘發之肝炎、非酒精性脂肪變性 肝炎、過敏症及哮喘、B族鏈球菌（GBS)感染、精神障礙 (例如抑鬱症及精神分裂症）、Th2型及Thl型介導之疾病、 急性及慢性疼痛（不同形式之疼痛）及癌症，諸如肺癌、乳 癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌 及直腸癌及造血系統惡性疾病（白血病及淋巴瘤）、無p脂蛋 白企症、手足發紺、急性及慢性寄生或感染過程、急性白 血病、急性淋巴母細胞白血病（all)、急性骨趙白血病 (AML·)、急性或慢性細菌感染 '急性胰腺炎、急性賢衰 竭、腺癌、心房異位搏動、AIDS癡呆複合症、酒精誘發 之肝炎、過敏性結膜炎、過敏性接觸性皮膚炎、過敏性鼻 炎、同種異體移植排斥反應、α-l -抗胰蛋白酶缺乏、肌肉 萎縮性側索硬化、貧血、心絞痛、前角細胞退化、抗cd3 療法、抗磷脂症候群 '抗受體過敏反應、主動脈及周圍動 141568.doc • 132· 201014602 脈瘤、主動脈剝離、動脈性高血壓、動脈硬化症、動靜脈 瘺、共濟失調、心房微顫（持續性或陣發性）、心房撲動、 房室傳導阻滞、B細胞淋巴瘤、骨移植物排斥反應、骨髓 移植（BMT)排斥反應、束枝傳導阻滞、伯基特淋巴瘤、燒 傷、心律不整、心臟頓抑症候群、心臟腫瘤、心肌病、心 肺分流發炎反應、軟骨移植排斥反應、小腦皮質退化、小 腦病症、紊亂性或多源性房性心動過速、與化學療法有關 之病症、慢性髓細胞白血病（CML)、慢性酒精中毒、慢性 發炎性病變、慢性淋巴細胞性白企病（CLL)、慢性阻塞性 肺病（COPD)、慢性水揚酸中毒、結腸直腸癌、充血性心 臟衰竭、結膜炎、接觸性皮膚炎、肺原性心臟病、冠狀動 脈疾病、庫賈氏病、培養物陰性敗也症、囊腫性纖維化、 細胞激素療法相關之病症、拳擊員癡呆、脫髓鞘疾病、登 革出血熱、皮膚炎、皮膚病病狀、糖尿病、糖尿病性動脈 硬化病、泛發性路易體疾病、 擴張型充血·性心肌病、基底 〇 神經節病症、中年唐氏症候群、由阻斷CNS多巴胺受體之
之肉芽腫、毛細胞白血病、 病症、真菌性敗血症、氣性壞疽、胃 任何器官或組織的移植物排斥反應、 革蘭氏陽性敗血症、胞内生物體引起 血病、哈勒沃登_施帕茨病、喬本氏 141568.doc •133. 201014602 甲狀腺炎、花粉熱、心臟移植排斥反應、血色素沈著症、 血液透析、溶血性尿毒癥候群/溶栓性血小板減少性紫 瘋、出a、肝炎（A)、希氏束心律不整、mv感染神經 病、霍奇金病、運動過度病症、過敏反應、過敏性肺炎、 咼血壓、運動功能減退病症、下丘腦·垂體-腎上腺轴評 估、特發性艾迪森氏病、特發性肺纖維化、抗體介導之細 胞毒性、無力、嬰兒脊髓性肌萎縮症、主動脈發炎、a型 流感、電離輻射曝露、虹膜睫狀體炎/葡萄膜炎/視神經 炎、缺血再灌注損傷、缺血性中風、青少年類風濕性關節 炎、青少年脊髓性肌萎縮症、卡波西氏肉瘤、腎臟移植排 斥反應、退伍軍人桿菌、利什曼體病、麻風病、皮質脊髓 系統病變、脂性水腫、肝移植排斥反應、淋巴水腫、瘧 疾、惡性淋巴瘤、惡性組織球病、惡性黑素瘤、腦膜炎、 腦膜炎球g血症、代謝性/特發性偏頭痛、粒線體複合系 統病症、混合結締組織病、單株球蛋白症、多發性骨髓 瘤、多系統退化（Mencel Dejerine_Th〇mas and Machado-Joseph)、重症肌無力、胞内鳥型分枝桿菌、結核 、心肌缺血病 、神經退化性 分枝桿菌、骨魏發育不良症候群、心肌梗塞 症、鼻咽癌、新生兒慢性肺病、腎炎、腎病 疾病、1型神經性肌肉萎縮、中性白血球減少性發敎、非 霍奇金淋巴瘤、腹主動脈及其分支堵塞、阻塞性動脈病 症、療法、睪丸炎/副睪丸炎、睪丸炎/輸精管切除运 轉程序、内臟增大、骨質疏症、胰腺移植排斥反應、联 腺癌、腫瘤相關症候群/惡性高血鈣症、副曱狀腺移植朝 141568.doc •134- 201014602 參 斥反應、盆腔發炎性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、周圍 動脈粥樣硬化疾病、周圍血管疾病、腹膜炎、惡性貧血、 卡氏肺囊蟲肺炎、肺炎、POEMS症候群（多發性神經病、 内臟增大、内分泌病、單株球蛋白症及換膚症候群）、灌 注後症候群、泵後症候群、MI心切開術後症候群、先兆驚 厥、進行性核上性麻痺、原發性肺性高血壓、放射療法、 雷諾現象及疾病、雷諾病、雷夫蘇姆氏病、規則狹窄_ 心動過速、腎A管性高血麼、再隸損傷、限制型心肌 病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、路易體型老年癡呆、 血清陰性關節病、休克、鐮形細胞性貧血、皮膚同種異體 移植排斥反應、換膚症候群、小腸移植排斥反應、實體腫 瘤、特異性心律不整、㈣性共濟失調、脊髓小腦退化、 鏈球菌肌火、小腦結構病變、亞急性硬化泛腦炎、昏厥、 心血管系統梅毒、全身性過敏、全身性發炎反應症候群、 王身發作型月少年類風濕性關節炎、T細胞或fab ALL、 毛細管擴張、血栓閉塞性血管炎、血小板減少症、中毒、 移植外傷/出血、m型過敏反應、W型過敏、不穩定型 、广：尿毒癥、尿膿毒病、蓴麻疹、心臟瓣膜病、靜脈 ^脈& k、靜脈疾病、靜脈栓塞、心室纖維性顫動、 真菌感染、病毒性腦炎/無菌性腦膜炎、病毒相關
Xt& jil· 森-fii 、鮮、早尼克-科爾薩科夫症候群、威爾遜氏 病、任何器$ + z , 或、、且織的異種移植物排斥反應、急性冠狀動 脈症候群、$ & 夕 Μ I·生特發性多發性神經炎、急性發炎性脫髓鞘 根神經病、急性缺血、成人斯蒂爾病、斑禿、過 141568.doc -135- 201014602 敏症、磷脂抗磷脂抗體症候群、再生不全性貧血、動脈硬 化症、特應性濕疹、異位性皮膚炎、自體免疫性皮膚炎、 與鏈球菌感染有關之自體免疫病症、自體免疫性腸病、自 體免疫性聽力損失、自身免疫性淋巴增生性症候群 (ALPS)、自體免疫性心肌炎、自體免疫性印巢早衰、瞼 炎、支氣管擴張、大皰性類天疱瘡、心血管疾病、鱗脂災 難性抗磷脂症候群、乳糜瀉、頸椎關節黏連、慢性缺血、 瘢痕性類天疱瘡、具有多發性硬化症風險之臨床孤立症候 群（CIS)、結膜炎、兒童期初發型精神異常、慢性阻塞性 肺病（COPD)、淚囊炎、皮肌炎、糖尿病性視網膜病變、 糖尿病、椎間盤突出症、盤脫垂、藥物誘發之免疫性溶血 性貧血、心内膜炎、子宮内膜異位、眼内炎、上鞏膜炎、 多形性紅斑、重症多形性紅斑、妊娠期類天疱瘡、格·巴 二氏症候群（GBS)、花粉熱、休斯症候群、特發性帕金森 氏病、特發性間質性肺炎、IgE介導之過敏症、免疫性溶 血性貧血、包涵體肌炎、感染性眼部發炎疾病、發炎性脫 髓鞘疾病、發炎性心臟病、發炎性腎病、lpF/mp、虹膜 炎、角膜炎、乾眼症、庫斯病或庫斯_麥爾病、蘭德里麻 痒、朗格漢氏細胞組織球病、網狀青斑、黃斑變性、領微 性多血管炎、白赫鐵列夫症、運動神經元病症、黏膜類天 范瘡、多H官衰竭、重症肌無力、㈣發育不良症候群 心肌炎、神經根病症、神_、非A#B型肝炎、視 炎、骨質溶解、少關節型青少年類風濕性關節炎、勒 脈閉塞性㈣（P婦）、關血f_(pVD)、關 = 141568.doc -136· 201014602 病（PAD)、靜脈炎、結節性多動脈炎（或結節性動脈周圍 炎）' 多軟骨炎、風濕性多肌痛、白髮症、多關節型JRA、 多發性内分泌缺乏症候群、多發性肌炎、風濕性多肌痛 (PMR)、泵後症候群、原發性帕金森氏症、前列腺炎、純 紅細胞發育不全、原發性腎上腺機能不全、復發性視神經 脊髓炎、再狹窄、風濕性心臟病、SApH〇(滑膜炎、痤 瘡、膿皰病、骨肥厚及骨炎）、硬皮病、繼發性澱粉樣變 性病、休克肺、鞏膜炎、坐骨神經痛、繼發性腎上腺機能 不全、聚矽氧相關之結締組織疾病、角層下膿皰性皮膚 病、關節黏連性脊椎炎、帝文生氏_強生症候群（s JS)、全 身性發炎反應症候群、顳動脈炎、弓形蟲性視網膜炎、中 毋性表皮壞死溶解、橫貫性脊髓炎、TRAps(踵瘤壞死因 子乂體1型過敏反應、II型糖尿病、蓴麻療、尋常性間質 肺k (UIP)、脈官炎、春季結膜炎、病毒性視網膜炎、沃 格特-小柳-原田症候群（VKH症候群）、濕式黃斑變性及傷 口癒合。 在另一態樣中，本發明之結合蛋白適用於治療選自由以 下組成之群的病症：急性淋巴母細胞白血病、急性骨髓白 血病、腎上腺皮質癌、肛門癌、闌尾癌、小腦星形細胞 瘤大胳星$細胞瘤、基底細胞癌、膽管癌、肝外癌.、膀 胱癌、骨癌、骨肉瘤/惡性纖維組織細胞瘤腦幹神經膠質 瘤、腦瘤、腦幹神經膠質瘤、大腦星形細胞瘤/惡性神經 膠質瘤、室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、幕上原始神經外胚 層瘤、視覺路徑及下丘腦神經膠質瘤、乳癌、支氣管腺瘤/ 141568.doc -137· 201014602 類癌、類癌瘤、類癌瘤、原發灶不明之胃腸道癌、中樞神 經系統淋巴瘤、原發性小腦星形細胞瘤、子宮頸癌、慢性 淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病慢性骨髓增生性病 症、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚τ細胞淋巴瘤、子宮内膜 癌、室管膜瘤、食道癌、尤文家族腫瘤、顱外生殖細胞腫 瘤、性腺外生殖細胞腫瘤、肝外膽管癌、眼癌、眼内黑素 瘤視網膜母細胞瘤、膽囊癌、胃癌、胃腸道類癌瘤、胃腸 道基質瘤（GIST)、顱外生殖細胞腫瘤、性腺外生殖細胞腫 瘤、卵巢生殖細胞腫瘤、妇:娠滋養層細胞踵瘤、神經膠質 瘤、腦幹神經膠質瘤、大腦星形細胞瘤神經膠質瘤、兒童 視覺路徑及下丘腦神經膠質瘤、毛細胞白血病、頭頸癌、 肝細胞（肝）癌、霍奇金淋巴瘤、下嚥癌、眼内黑素瘤、胰 島細胞癌（内分泌胰腺）、卡波西肉瘤、腎（腎細胞）癌、喉 癌、急性淋巴母細胞白血病、急性骨髓白血病、慢性淋巴 細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、毛細胞白血病、唇及 口腔癌、肝癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、 性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、霍奇金淋 巴瘤、非霍奇金淋巴瘤淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴 瘤’瓦爾登斯特倫巨球蛋白金症、骨絡惡性纖維組織細胞 瘤/骨肉瘤、神經管胚細胞瘤、黑素瘤、眼内（眼）黑素瘤、 梅克爾細胞癌、惡性間皮瘤、原發灶隱 轉移性鱗狀頸 :敦口癌、夕發性内分泌瘤症候群、多發性骨趙瘤/槳细 胞贅瘤、孽樣肉芽艘、骨髓發育不良症候群、骨髓發育不 良/骨髓增生性疾病、骨髓性白血病、慢 月聰白血病、 141568.doc -138- 201014602 多發性骨髓瘤、骨髓增生性病症、鼻腔及鼻竇癌、鼻咽 癌、神經母細胞瘤、口腔癌、唇及口咽癌、骨肉瘤/骨骼 惡性纖維組織細胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、印巢生殖細 胞腫瘤、卵巢低度惡性潛在腫瘤、騰腺癌、胰島細胞胰腺 • 癌、鼻竇及鼻腔癌、副曱狀腺癌、陰莖癌、咽癌、嗜鉻細 胞瘤、松果體母細胞瘤及幕上原始神經外胚層瘤、垂體 瘤、漿細胞贅瘤/多發性骨髓瘤、胸膜肺母細胞瘤、前列 Φ 腺癌、直腸癌、腎細胞（腎）癌、腎盂及輸尿管癌、移行細 胞癌、視網膜母細胞瘤、唾液腺癌、肉瘤、尤文家族腫 瘤、卡波西肉瘤、軟組織肉瘤、子宮肉瘤、塞紮萊症候 群、皮膚癌（非黑素瘤）、皮膚癌（黑素瘤）、梅克爾細胞皮 膚癌、小腸癌、鱗狀細胞癌、原發灶隱匿之轉移性鱗狀頸 癌、胃癌、幕上原始神經外胚層瘤、皮膚τ細胞淋巴瘤、 睪丸癌、喉癌、胸腺瘤、胸腺瘤及胸腺癌、甲狀腺癌、腎 盂及輸尿管移行細胞癌、妊娠滋養層細胞腫瘤、輸尿管及 參 腎盂癌、移行細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮内膜子宮肉 瘤、陰道癌、視覺路徑及下丘腦神經膠質瘤、陰門癌、瓦 - 爾登斯特倫巨球蛋白血症及威爾姆氏瘤。 、在另-態樣中，本發明提供偵測活體外樣本(例如生物 學樣本諸如血清、血聚、組織、活組織檢查）中之 存在的方法。標的方法可用於診斷例如免疫細胞相關病症 之病症。5亥方法包括：⑴使樣本或對照樣本與如本文所述 之= PGE2抗體或其片段接觸；及（ΠΜ貞測抗觸2抗體或其 片&與樣本或對照樣本之間複合物的形成，其令樣本相對 141568.doc -139- 201014602 於對照樣本中之複合物形成令之統計學上顯著的變化指示 樣本中存在P G E 2。 在另態樣中，本申請案提供活體内偵測PGE2存在之方 法（例如在個體中活體内成像）。標的方法可用於診斷例如 PGE2相關病症之病症。該方法包括：⑴在允許抗體或片段 與PGE2結合之條件下向個體或對照個體投與如本文所述之 抗pge2^或其片段；及（ii)偵測抗體或片段與酸2之間 複合物的形成’其中個體相對於對照個體中複合物形成中 之統計學上顯著的變化指示存在PGE2。 本毛月抗體或其抗原結合部分可單獨或組合用於治療該 等疾病。應瞭解，本發明抗體或其抗原結合部分可單獨使 用或與額外藥劑（例如治療劑）組合使用，該額外藥劑係由 熟習此項技術者出於苴箱定 ’、 有㈣其預疋目的選擇。舉例而言，該額外 藥劑可為業时認為適用於治療由本發明抗㈣療之疾病 或病狀之㈣劑。該額外藥劑亦可為賦予治療組合物有益 屬性的藥劑，例如影響組合物黏度之藥劑。 應進一步转，欲包括於本發㈣二合為適於其預定 目的之彼等組合。下文Jt爽诚之蕴杰丨〆 卜文陳述之樂劑係出於說明性目的且不 欲具有限制性。作為本發明之— 5 。卩分的組合可為本發明抗 體及b -種選自以τ清單之額外藥^若 成之組合物可執行其預定功能更得所开/ 只J組合亦可包括一種 額外藥劑，例如兩種或三種額外藥劑。 如本發明進-步描述，組合療法可包括與一或多種額外 t投與之1多種PGE2拮抗劑(例如抗 141568.doc 201014602 pge2抗體或其片段），該一或多種額外治療劑例如一或多 種細胞激素及生長因子抑制劑、免疫抑制劑、消炎劑（例 如全身性消炎劑）、抗纖維變性劑、代謝抑制劑、酶抑制 劑及/或細胞毒性劑及或細胞生長抑制劑。可與一或多種 pge2拮抗劑（例如抗PGE2抗體或其片段）共投與及/或共調 配之較佳額外治療劑的實例包括（但不限於）以下一或多 者：吸入類固醇；β促效劑，例如短效或長效β促效劑；白 三烯或白三烯受體之拮抗劑；組合藥物，諸如ADVAIR ; IgE抑制劑，例如抗IgE抗體（例如XOLAIR);磷酸二酯酶 抑制劑（例如PDE4抑制劑）；黃嘌呤；抗膽鹼藥物；肥大細 胞穩定劑，諸如色甘酸；IL-4抑制劑；IL-5抑制劑；嗜酸 性粒細胞趨化因子/CCR3抑制劑；組織胺或其受體（包括， HI、H2、H3及H4)之拮抗劑，及前列腺素D或其受體（DPI 及CRTH2)之拮抗劑。該等組合可用於治療哮喘及其他呼 吸障礙。可與一或多種抗PGE2抗體或其片段共投與及/或 共調配之治療劑的其他實例尤其包括以下一或多者：TNF 拮抗劑（例如TNF受體之可溶性片段，例如p55或p75人類 TNF受體或其衍生物，例如75 kD TNFR-IgG(75 kD TNF受 體-IgG融合蛋白質，ENBREL)) ; TNF酶拮抗劑，例如TNF 轉化酶（TACE)抑制劑；簟毒鹼受體拮抗劑；TGF-β拮抗 劑；干擾素γ ;佩福尼酮；化學治療劑，例如甲胺喋呤、 來氟米特或西羅莫司（雷帕黴素）或其類似物，例如CCI-779 ; COX2及cPLA2抑制劑；NSAID ;免疫調節劑；ρ38抑 制劑，TPL-2、ΜΚ-2及NFkB抑制劑。其他組合為細胞激 141568.doc -141 - 201014602 素抑制性消炎藥（CSAID);針對其他人類細胞激素或生長 因子（例如 IL_1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、 IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、IL-21、IL-31、干擾素、 EMAP-II、GM-CSF、FGF、EGF、PDGF及内皮素-1以及此 等細胞激素及生長因子之受體）之抗體或拮抗劑。本發明 抗體或其抗原結合部分可與針對細胞表面分子之抗體組 合，該等分子諸如 CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、 CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、 CD86(B7.2)、CD90、CTLA或其配位體，包括 CD154(gp39 或 CD40L)。 治療劑之較佳組合可干擾發炎級聯的不同點。較佳實例 包括TNF拮抗劑樣嵌合人類化或人類TNF抗體、D2E7(PCT 公開案第 WO 97/29131號）、CA2(RemicadeTM)、CDP 571 及可溶性p55或p75 TNF受體、其衍生物（p75TNFRlGg (EnbrelTM)或 p55TNFRlgG(Lenercept))，以及 TNF轉化酶 (TACE)抑制劑；類似地，IL-1抑制劑（介白素-1轉化酶抑制 劑、IL-1RA等）可能由於相同原因而為有效的。 本發明醫藥組合物可包括「治療有效量」或「預防有效 量」之本發明抗體或抗體部分。「治療有效量」係指在必 需劑量下且歷時必需時段有效達成所要治療效果之量。抗 體或抗體部分之治療有效量可由熟習此項技術者確定且可 視諸如疾病病況、個體之年齡、性別及體重以及抗體或抗 體部分在個體中引起所要反應之能力的因素而變化。治療 有效量亦為抗體或抗體部分之治療有益作用超過任何毒性 141568.doc -142- 201014602 或有害作用的量。「預防有效量」係指在必需劑量下且歷 時必需時段有效達成所要預防效果之量。通常，因為在疾 病早期階段之前或在疾病早期階段時對個體使用預防劑 量’所以預防有效量將小於治療有效量。 .可調節給藥方案以提供最佳所要反應（例如治療或預防 反應）舉例而3，可投與單次大丸劑，可隨時間投與若 干分次劑量，或依治療情況之緊急需要所指示，可按比例 ❹ 咸〉'或增加劑畺。將非經腸組合物調配為易於投與且劑量 均一之單位劑型尤其有利，如本文所用之單位劑型係指適 合作為單一劑量用於待治療哺乳動物個體的物理不連續單 元；各單元含有經計算以產生所要治療作用之預定量的活 性化合物以及所需醫藥載劑。本發明之劑量 格由以下因素規定且直接取決於以下因素:⑷活性= 之獨特特徵及欲達成之特定治療或仙；及（b)混配該 活性化合物以達成個體中之治療靈敏度之技術中所固有之 ❹ 限制。 本發月之抗體或抗體部分的治療或預防有效量之一例示 性非限制範圍為更佳為。應注: ，劑量值可能隨待緩解之病狀的類型及嚴重程度而變化。應 進一步瞭解，對於任何特定個體而言，特定劑量方案應根 據個體需要及投與或監督組合物投與之個人的專業判斷隨 時間而加以調整，且本文所述之劑量範圍僅供例示，而並 非意欲限制所主張之組合物的範疇或實施。 對於熟習此項技術者而言將顯而易見，本文中所述之本 141568.doc •143- 201014602 發明方法的其他合適修改及改適為明顯的且可使用不悖離 本發明之範疇的合適等效物或本文所揭示之實施例進行。 現已詳細描述本發明，參考以下實例將更清楚理解本發 明，該等實例僅出於說明之目的包括在内且不欲限制本發 明。 實例 實例1 :產生及分離抗前列腺素£2單株抗體 實例1.1 ··鑑別抗人類前列腺素e2抗體之檢定 除非另外說明，否則使用以下檢定鑑別及表徵抗前列腺 素£2抗體。
實例 l.l.A : ELISA 根據以下兩種方法中之至少一者進行篩選結合前列腺素 E2之抗體的酶聯免疫吸附檢定。 方法1 以 50 μΐ於PBS(Invitrogen Carlsbad, CA)中的 2 pg/ml抗宿 主 Fc IgG(Sigma，St. Louis，MO)塗覆 ELISA 培養盤（Costar 3369, Corning，NY)。在4。(：下培育隔夜後，以PBS洗滌且 將培養盤以 200 μΐ Superblock(Pierce #37535, Rockford，IL) 阻斷。將含有IgG之樣本在檢定緩衝液（含有0.05% Surfactamp(Pierce #37535，Rockford，IL)之 PBS 中的 10% Superblock)中稀釋至1 pg/ml且向各孔中每孔添加50 μΐ且 在室溫下培育1小時。將培養盤以Tween-Tris緩衝之溶液 (TTBS)洗滌 4次。將 PGE2-生物素醯胺（Cayman Chemicals， Ann Arbor, MI)稀釋至30 nM且在檢定緩衝液中以1:3連續 141568.doc • 144· 201014602 稀釋。向各IgG樣本中以每孔50 μΐ添加滴定曲線樣本且在 室溫下培育1小時。如先前所述洗滌培養盤且向各孔中添 加 50 μΐ抗生蛋白鏈菌素 p〇lyhrp40(Fitzgerald Industries， Concord, ΜΑ)於檢定緩衝液中之1:5000倍稀釋液且在室溫 下培育45分鐘。進行最終洗滌步驟且使用單步驟ΤΜΒ系統 (Sigma #T8665, St. Louis，ΜΟ)及每孔 100 μΐ 2Ν H2S04將培 養盤顯色。在450 nm 下在 Molecular Devices Spectramax 培 養盤讀取器（Sunnyvale, CA)上讀取培養盤。使用GraphPad Prism 5(GraphPad軟體，La Jolla，CA)測定 EC50。 方法2 或者，使用3H-PGE2 ELISA測定前列腺素結合。以PBS 中之5 pg/ml 山羊抗人類IgG(Fc)(Thermo Scientific # 31170, Hudson, NH)或山羊抗小鼠 IgG(Fc)(Thermo Scientific # 31125，Hudson，NH)以每孔50 pL塗覆培養盤且在4°C下培 育隔夜。第二天，輕敲培養盤且吸乾（blotted dry)。將培 養盤在室溫下以每孔2〇0 pL Superblock(Thermo Scientific # 37515，Hudson, NH)阻斷1小時。輕敲培養盤且吸乾。將 單株抗體在具有 Tween 20(PBST)(Abbott Bioresearch Center, Worcester, ΜΑ)及 10% Superblock之鱗酸鹽緩衝液 中稀釋至0.04 pg/ml且向預阻斷之ELISA培養盤的各孔中 以每孔2 ng添加50 μί各抗體且在室溫下培育1小時。將各 孔以 PBS + 0.1% Tween-20 洗滌 3 次。在 PBST/10% Superblock 中製備 3H-PGE2(Perkin Elmer # NET-428,
Waltham，ΜΑ)的連續3倍滴定液。向培養盤各孔中添加50 141568.doc •145· 201014602 μΐ 3H-PGE2溶液且在室溫下培育1小時。將各孔以 PBST/10% Superblock手動洗滌6次且向各孔中添加50 pL 閃爍液（Perkin Elmer # 6013621，Waltham, ΜΑ)。使用 TopCount讀取器（Perkin Elmer，Waltham, ΜΑ)以 5分鐘計數 延遲讀取培養盤。使用GraphPad Prism 5(GraphPad軟體， La Jolla, CA)測定 EC5G值。
實例 l.l.B : PGE2 競爭 ELISA 根據以下兩種方法中之至少一者進行競爭酶聯免疫吸附 檢定以測定前列腺素對結合前列腺素E2之抗體的結合特異 性。 方法1 以每孔 50 μΐ 於 PBS(Invitrogen，Carlsbad，CA)中之 2 pg/ml 抗宿主 Fc IgG(Sigma，St. Louis，MO)塗覆 ELISA 培養 盤（Costar 3369，Corning，NY)。在 4°C 下培育隔夜後，以 200 μΐ Superblock(Pierce #37535，Rockford, IL)阻斷培養 盤。將IgG樣本在檢定緩衝液（含有0.05% Surfactamps (Pierce #37535，Rockford, IL)之PBS 中的 10% Superblock) 中稀釋至6 pg/ml。將PGE2-生物素醯胺在檢定緩衝液中稀 釋至3 nM。在300 nM開始藉由1:10倍連續稀釋製備前列腺 素 PGA2(Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI)、PGD2 (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI)及 PGE2(Cayman Chemicals, Ann Arbor，MI)的檢定緩衝液中之滴定曲線。 以每試管50 μΐ體積向試管中添加各試劑且在室溫下預培育 1小時。在預培育後，將混合物轉移至經阻斷培養盤中且 141568.doc •146· 201014602 在室溫下培育1小時。隨後，將培養盤以Tween 20-Tris緩 衝之溶液（TTBS)洗滌4次。接著向各孔中添加以1:5000倍 稀釋於檢定緩衝液（Fitzgerald Industries，Concord, MA)中 之抗生蛋白鏈菌素polyhrp40且在室溫下培育45分鐘。進行 最終洗滌步驟且使用單步驟TMB系統（Sigma #T8665, Sigma，St. Louis, MO)及每孔 100 μ1 2Ν H2S04將培養盤顯 色。在450 nm 下在 Molecular Devices Spectramax 培養盤讀 取器（Sunnyvale, CA)上讀取培養盤。未標記之前列腺素與 PGE2-生物素醯胺競爭結合之孔中的信號降低。使用 GraphPad Prism 5(GraphPad軟體，La Jolla, CA)測定 IC50 值。接著藉由pge2之IC5Q/其他前列腺素之IC5G計算交又反 應性指數。 方法2 或者，使用3H-PGE2競爭ELISA測定前列腺素選擇性。 以 PBS 中之5 pg/ml 山羊抗人類 IgG(Fc)(Thermo Scientific # 31170，Hudson，NH)或山羊抗小鼠 IgG(Fc)(Thermo Scientific # 31125，Hudson，NH)以每孔 50 μί 塗覆培養盤且 在4°C下培育隔夜。第二天，輕敲培養盤且吸乾。將培養 盤在室溫下以每孔200 μί Superblock(Thermo Scientific # 37515, Hudson, NH)阻斷1小時。輕敲培養盤且吸乾。將單 株抗體在 PBST(Abbott Bioresearch Center, Worcester, MA)/10% Superblock中稀釋至0.04 pg/ml且向預阻斷之 ELISA培養盤各孔中添加各50 μί(每孔2 ng)且在室溫下培 育卜j、時。各孔以PBS/0.1% Tween-20洗滌3次。將3H- 141568.doc -147- 201014602 PGE2(Perkin Elmer # NET-428, Waltham, ΜΑ)在 PBST/ 10% Superblock中稀釋至6 nM(2倍儲備液）。在PBST+10% Superblock中以 2000 μΜ(2倍儲備液）至 0.00004 μΜ(2χ)範圍 内的各種濃度製備各前列腺素（Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI)。混合等體積之3H-PGE2溶液與各前列腺素稀釋 液。接著向培養盤各孔中添加50 μΐ此混合物且在室溫下培 育1小時。將各孔以PBST/10% Superblock手動洗滌6次且 向各孔中添加50 pL閃爍液（Perkin Elmer # 6013621, Waltham, ΜΑ)。使用 TopCount 讀取器（Perkin Elmer, Waltham, MA)以5分鐘計數延遲讀取培養盤。使用 GraphPad Prism 5(GraphPad軟體，La Jolla, CA)測定 IC50 值。接著藉由pge2之IC5G/其他前列腺素之IC5G計算交叉反 應性指數。 實例1.1.C:量測抗前列腺素丑2抗體之功能活性 為了檢驗本發明抗PGEj^體之功能活性，在以下量測抗 體抑制PGE2活性之能力的活體外及活體内檢定中使用該等 抗體。 實例l.l.C.l : EP4生物檢定 在Ca++通量檢定中在以人類EP4受體穩定轉染之HEK293 Gal6 細胞（Abbott Bioresearch Center，Worcester，MA)中測 定抗PGE2抗體活體外抑制PGE2之細胞反應之能力。簡言 之，將編碼四種人類PGE2受體中之一者EP4的表現質體與 編碼Gal6之表現質體共轉染至人類胚胎腎細胞株293細胞 (ATCC# CRL1573，Manassas, Virginia)中。使用標準方法 141568.doc -148· 201014602 (Joseph Sambrook及 David W. Russell. Molecular Cloning: A Laboratory Manual Publisher.由 Cold Spring Harbor Laboratory Press出版，2001)選擇共表現人類EP4及Gal6 蛋白之穩定純系且用於EP4生物檢定。 將HEK293 Gal6細胞塗鋪於黑色/透明聚-D-離胺酸培養 盤（Corning #3667，Corning, NY)中且與 Ca++敏感染料 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)— 起培育 90分鐘。以 FLIPR緩衝液[含有 lx HBSS(Invitrogen Carlsbad, CA)、20 mM HEPES(Invitrogen Carlsbad, CA) ' 0.1% BSA(Sigma, St. Louis, MO)及 2.5 mM 丙續舒（probenecid)(Sigma, St. Louis, MO)]稀釋儲備PGE2(於200標準強度乙醇中）。亦在 FLIPR緩衝液中預稀釋抗PGE2抗體或同型匹配對照抗體。 向經細胞預塗鋪之各孔中添加25 μΐ PGE2或預培育之PGE2/ 抗體混合物。在連續滴定PGE2時且使用FLIPR1或 Tetra(Molecular Devices，Sunnyvale, CA)測定 PGE2之劑量 反應且使用 GiaphPad Prism 5(GraphPad軟體，La Jolla, CA)測定EC5Q。為了測試抗體，將EC5。濃度之PGE2與不同 濃度之測試抗體或同型匹配抗體（陰性對照）(ABC)—起培 育20分鐘，且添加至HEK293 Gal 6細胞中之負載染料的人 類EP4中。使用FLIPR1監測Ca++通量且使用GraphPad Prism 5(GraphPad軟體，La Jolla, CA)分析資料。 實例1.1.C.2 :使用3H-PGE2測定抗前列腺素£2抗體對PGE2 與PGE2受體之結合的競爭抑制 使用基於細胞或基於膜之受體結合檢定使用3H-PGE2(前 141568.doc -149- 201014602 列腺素 E2，[5,6,8，11，12，14，15-3H(N)]，Perkin Elmer， Waltham, MA.目錄號NET428250UC)測定抗PGE2抗體對 PGE2與PGE2受體（例如EP4或EP3)之結合的競爭抑制。 使内源表現或穩定過度表現EP4受體之細胞（亦即用於 EP4 生物檢定之 HEK293-EP4 細胞或 HEK293-EP4-Ga 1 6 細 胞）（每毫升105個細胞）在24孔培養盤中在DMEM培養基 (Invitrogen, Carlsbad, CA)/10% FCS(Sigma #T8665, Sigma, St. Louis，MO)中生長隔夜。移除培養基且添加100 μΐ結合 緩衝液（無FCS之培養基）。將培養盤置於冰上歷時10分 鐘。與示蹤劑（40 pM 3H-PGE2)—起以100 μΐ體積添加非放 射性PGE2(0-1 μΜ)。在4°C下進行平衡受體結合歷時90分 鐘。移除培養基且將細胞以200 μΐ冷培養基洗滌4次。藉由 添加20 μΐ 0.5 M NaOH採集細胞。將溶胞物轉移至液體閃 燦培養盤中。向各孔中添加1〇〇 μΐ Aquasafe 500(Zinsser Analytic, Frankfurt，Germany)加 LSC 混合液（Lumac LSC， Groningen，The Netherlands)且混合。藉由液體閃爍計數測 定細胞結合放射性。對於多數促效劑-受體相互作用而 言，假定促效劑（PGE2)之受體結合抑制遵循單位點模型。 使用 GraphPad Prism 5(GraphPad軟體，La Jolla, CA)計算 EC5〇、Ki及 Kd值。 在 3H-PGE2(前列腺素 E2，[5,6,8，11，12，14，15-3H(N)]， Perkin Elmer, Waltham，ΜΑ.目錄號 NET428250UC)與 EP3 受 體結合時使用來自過度表現ΕΡ3受體之細胞的膜製劑 (Millipore，Billerica，ΜΑ)進行對抗PGE2抗體之抑制。在結 141568.doc -150- 201014602 合檢定之前，向 Unifilter-96 GF/B 滤板（Perkin Elmer, Waltham，ΜΑ)中添加每孔50 μΐ 0.3%聚乙烯亞胺（PEI) (Sigma, St. Louis，MO)且在4°C下放置1小時直至準備使 用。在結合緩衝液（50 mM HEPES pH 7.0、10 mM MgCl2、1 mM EDTA、0.2% BSA)中以2倍濃度製備抗體之 1:3倍稀釋液。在結合緩衝液中以2倍濃度製備3H-PGE2。 接著向含有50 μΐ 200 pM 3H-PGE2之各孔中添加抗體的5〇 μΐ連續3倍稀釋液，充分混合且將其在室溫下放置1〇分 鐘。將冷凍膜解凍且再懸浮於結合緩衝液中。向各孔中添 加5 pg膜。將混合物在室溫下培育60分鐘，隨後使用 Packard 96孔採集器過濾至預處理之GF/B濾板上。接著將 培養盤乾燥1小時，隨後添加MicroscintTM20(Perkin Elmer， Waltham, ΜΑ)。接著密封培養盤且在TopCount讀取器 (Perkin Elmer, Waltham, MA)上計數。在 100 μΜ冷PGE2存 在下測定非特異性結合。使用Graphpad Prism(GraphPad軟 體，La Jolla, CA)使用所測得之放射性（cpm)測定1C50值。 實例1.1.C.3 :使用基於細胞之FACS檢定測定抗前列腺素 E2抗體對？6£2與卩0瓦2受體之結合的競爭抑制 可使用基於細胞之FACS檢定使用PGE2-生物素醯亞胺 (Cayman Chemical，Ann Arbor, Michigan.目錄號 10006987) 及抗生蛋白鏈菌素-R-藻紅素（SA-RPE; Invitrogen， Carlsbad，CA，目錄號15-4301)測定抗PGE2抗體對PGE2與 PGE2受體（例如EP4)之結合的競爭抑制。將内源表現或穩 定過度表現EP4受體之細胞（lxl〇6)(亦即用於EP4生物檢定 141568.doc -151- 201014602 之 HEK293-EP4細胞或 HEK293-EP4-Gal6細胞）在 DMEM培 養基（Invitrogen，Carlsbad, CA)/10% FCS(Sigma #T8665, Sigma，St· Louis, MO)中培養。採集細胞且以500 μΐ洗務緩 衝液（PBS/1% BSA)洗滌若干次。將細胞再懸浮於500 μΐ FACS結合緩衝液（無FCS之培養基）中。向細胞懸浮液中添 加20 μΐ PGE2-生物素醯亞胺且在4°C下培育1小時。將細胞 以洗滌緩衝液洗滌3次。將細胞再懸浮於500 μΐ FACS結合 緩衝液中且向細胞中添加20 μΐ SA-RPE且在4°C下培育30 分鐘。接著將細胞再懸浮於500 μΐ FACS結合緩衝液中且 藉由流動式細胞量測術分析細胞表面上之PGE2結合。可藉 由在以PGE2-生物素醯亞胺及SA-RPE培育之前預培育細胞 同時滴定抗PGE2抗體來測定抗PGE2抗體之抑制。 實例1.2:藉由融合瘤法產生抗前列腺素£2單株抗髏 如下獲得抗前列腺素E2小鼠單株抗體： 實例1.2.A :以前列腺素E2-甲狀腺球蛋白結合物免疫小鼠 在第1天將與完全弗氏佐劑（Pierce，Rockford, IL)或 Immunoeasy 佐劑（Qiagen，Valencia，CA)混合之 20 微克 PGE2/甲狀腺球蛋白結合物皮下注射至5隻6-8週大Balb/C小 鼠、5隻C57B/6小鼠及5隻AJ小鼠中。在第24天、第38天及 第49天將與不完全弗氏佐劑或Immunoeasy佐劑混合之25 PGE2/曱狀腺球蛋白結合物皮下注射至同一小鼠中。在 第84天、第112天或第144天，對小鼠靜脈内注射1 pg PGE2/曱狀腺球蛋白結合物。 實例1.2.B :產生融合瘤 141568.doc •152· 201014602 根據 Kohler, G·及 Milstein，Nature, 256:495 (1975)所述之 既定方法使自實例1.2.A中所述之經免疫小鼠獲得之脾細 胞與SP2/0-Ag-14細胞以5:1比率融合以產生融合瘤。以每 孔2.5 X 1 〇6個脾細胞的密度將融合產物塗鋪於％孔培養盤中 含有偶氮絲胺酸（Pierce，Rockford，IL)及次黃嗓吟（Pierce, Rockford，IL)之選擇培養基中。融合7至10天後，觀察到肉 眼可見融合瘤純系。藉由ELISA(如實例1.1 .A中所述）測試 ©來自含有融合瘤純系之各孔的上清液中針對PGE2i抗體的 存在。 使PGE2與包括牛甲狀腺球蛋白、匙孔螺血藍蛋白、牛血 清白蛋白及卵白蛋白之若干種不同載體蛋白結合。 (Amiram等人 ’ Eur. J. Biochem. 53:145-150 (1975))。如實 例1.2.A中所述以此等結合pGE2_蛋白質複合物中之一者免 疫小鼠。接著融合來自經免疫小鼠之脾細胞以產生如實例 1，2·Β所述之融合瘤。分離產生對PGEz具特異性之抗體的 ❹ 融合瘤且使用如實例1.1.Α所述之經生物素標記PGE2 ELISA表徵抗體。 實例1.2.C :鑑別及表徵抗前列腺素£2單株抗體 藉由有限稀釋按比例擴大及選殖根據實例1.2.B產生之 產生結合PGE2之抗體的融合瘤。 分離對PGE2具特異性之若干種抗體，稱為19C9、 及15F1〇。如實例i.LA所述藉由ELISA使用經生物素標記 iPGE2測定此等抗體之親和力（圖1及2)。ECso資料如下： 141568.doc -153- 201014602 igGl 15F10.3C9 1F7.1D5 EC50 ^ 10.50 0,004732 15.03
IgGl 19C9.4B10 4F10.3B9 EC50 ~ 10.50 0.02297 0.01400 如實例1.1.B所述藉由 使用各種前列腺素之競爭ELIS A進一步測定此等抗體對 PGE22特異性（表2)。 表2 : 19C9、4F10、15F10及2B5抗體之親和力及交又反應性 19C9 4F10 15F10 2B5 EC50(nM) 16 6 2 0.048 23 14 5 0.033 交叉反應性指數 PGE1: <5.6% PGE1: <3.2% PGE1:<2.9% PGE1:〜20% PGA2: -0.1% PGA2: -0.1% PGA2: <01% PGA2: -0.6% PGD2: <0.01% PGD2: <0.01% PGD2: <0.01% PGD2: <0.01% 實例2 :藉由活醴外呈現技術產生人類抗前列腺素E2抗體 實例2.1:藉由活髏外呈現技術自非免疫人類抗體文庫選 擇人類抗前列腺素E2抗體 使用PROfusionTM mRNA呈現，藉由活體外呈現技術以 單鏈Fv(scFv)型式自非免疫人類抗體文庫選擇人類抗PGE2 抗體。使用抗生蛋白鏈菌素或中性鏈親和素磁性珠粒收集 編碼結合經生物素標記之PGE2之scFv蛋白的抗體胺基酸序 列且藉由多輪選擇自文庫進一步富集。將大量產出scFv核 酸序列次選殖入適於細菌傳播的質體DNA中且挑選個別細 菌純系用於scFv序列分析且藉由文庫選擇中所用之相同抗 原結合檢定確認其PGE2結合。接著將PGE2結合scFv純系 之VH及VL DNA單獨次選殖入相應人類igG表現重鏈及輕 鏈載體中’且轉染至COS7細胞中以供igG表現。接著藉由 ELISA如實例1.1 ·Α中所述使用含有人類igG之COS7培養基 141568.doc • 154- 201014602 確認PGE2結合（表3)。 表3 : PROfusion文庫來源之PGE2抗體舆PGE2-生物素醢胺 的結合（od4S()) 生物素-PGE2(hM) 抗體 K1B K7H K3A Lll L12A L21 L20 對照组 45 0.88 0.24 0.58 0.07 0.26 0.46 0.12 0.07 15 0.82 0.29 0.78 0.07 0.22 0.41 0.09 0.05 5 0.67 0.13 0.67 0.07 0.18 0.31 0.07 0.05 2 0.27 0.10 0.61 0.07 0.13 0.32 0.06 0.08 1 0.29 0.06 0.51 0.05 0.09 0.25 0.06 0.05 0.3 0.21 0.04 0.34 0.04 0.09 0.16 0.05 0.03 0.1 0.13 0.03 0.22 0.04 0.07 0.10 0.06 0.04 0 0.07 0.04 0.11 0.04 0.08 0.08 0.07 0.03 表4提供來源於PROfusionTM mRNA呈現文庫之人類抗 PGE2抗體的VH及VL區之胺基酸序列的清單。 表4 VH及VL區之胺基酸序列的清單 SEQ ID No. 蛋白質區域 序列 123456789012345678901234567890 I.'::. :6:: 8 VH PGE2LNK1B EVQLYQSGAEVKRPGASVKVSCKTSGYTFT NYDINWVRLAPGQGLEWMGCMNPTTGKTGY AQKPQGRVTMTRDTTIATAYMELSRLTSED TAVYYCARGRGYSPGYGVAYADYWGQGTLV TVSS ：B；：；Vii-〇：：P：GE2L·^ CDR-H1 SEQ ID NO. :541¾ 酵養屬 NYDIN VH PGE2LNK1B ： CDR-H2 : SEQ·: ID: NO. :5之殘： 義_|1':..:::||:·編輔 CMNPTTGKTGYAQKFQG ：VH PGE2LNK1B CDR-H3 SEQ」ID·NO· :.5之殘 GRGYSPGYGVAYADY 123456789012345678901234567890 9 10 11 12 VL P6£2LNK1B DIQLTQSPSSLPASVGDRVTITCRASQSIS TYLNWYQQTPGKAPSLLIYAASSLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ SYSPPPTFGGGTKVEIKR VL PGE2LNK1B 顚賴:. SEQ:.'IDNOV:92^: l ::S_3 圍議 i議::: RASQSISTYLN VL PGE2LNK1B CDR-L2 SEQ ID NO. :9之殘 AASSLQS :::¾¾ ； PGE2LNKli：:- QQSYSPPPT 123456789012345678901234567890 -155- 141568.doc 201014602 14 15 16 VH PGE2LMK3A EVQLVQSGAETKKPGASVEVSCKASGYSFT E YGISWVRQAPGQGPEWMGCISPYNGKLHY Aqefqgrvtmttgtstntaymelgslrsdd TAVYYCARGGFSFYDSSGYYYVTDHWGQGT LVTVSS / ! VH BGE：2lMK3A ' ；,: SEQ ID NO.:13之 殘基31-35 EYGIS VH PGE2·賴驗 CDR-H2 SEQIDNO.:132 殘基50-66 CISPYNGKLHYAQEFQG VH PGE2[_:3|fe;i:: CDR-H3 SEQ ID NO·:13之 殘基99-115 GGFSFYDSSGYYYVTDH 123456789012345678901234567890 17 18 VL PGE2LNK3A DIRLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIG $Υυ^ΥΩζ2ί^ΚΑΡΚΙΧΙΥΑΑ3ΚΙιζ^νΡ3 _ RFSGSGFGTDFTLTISSLQPEDSATYYCOO SDTTPFTFGQGTKLEIKR VL PGE2LNKM K；：： ：：:；； SEQpD； NO：.： 殘基24-34 RASQSIGSYLN 19 20 VL PGE2LNK3A ..-.CDR謹4..:# f gEQ; ID 殘基50-56 AASKLQS vVL PGE2LNK^i:::::: . cd ㈣ 3.:::¾ i： SEQ；；： ID NO . 殘基89-97 QQSDTTPFT 123456789012345678901234567890 21 14 22 23 VH PGE2LNK7H ........ . ............ EyQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYSFT eVgiswvrqapgqgpewmgcispyngklhy AQKFLGRVTMTTDTSTNTAYMELRSLKSDD TAVYYCARGGFSSYDSSGYYYVTDHWGQGT LVTVSS VH PGE2LNK7H： CDR-H1 SEQ ID： NO .:214^ 、:::1 墓3Ϊ-35 EYGIS VH PGE2LNK7H CDR-H2 .SEQ ID NO.:21之 殘基50-66 GISPYNGKLHYAQKFLG VH PGE2LNK7H CDR-H3 :SEQ ID NO.:21之 殘基99-115 GGFSSYDSSGYYYVTDH 12:3456789012345678901234567890 24 10 11 12 VL PGE2LNK7H ... ..:..:..... DIELTQSPSSLPASVGDRVTITCRASQSXS Tn^YQQTPGKAPSLLIYAASSLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATyYCQQ sySppptfgggtkveikr VL PGE2LNK7H,.: SEQ ID: Ν〇· :24之 殘㊆4-34 RASQSISTYLN VL PGE2LNK7H CDR-L2 ； ：S5Q ID NO·. ：24；^ ::::殘篡5〇-5&: MiBSTaQS VL PGE2LNK7H CDR-L3 ：SEQ：::ID Nd, :24^： 殘基8 9-97: QQSYSPPPT 123456789012345678901234567890 25 26 27 28 VH PGE2LNL11 EV如VQSGPELKKPGTSVKVSCKASGYTLT TYAMNWVRQAPGQGLEWMGWIDT STGNPT Y: ^f£0rfvfsldtslsttylqisslkpdd TAVYYGARSSHTRPOTFWGQGTLVTVSS : VH PGE2LNL11 CDR-H1 SEQ ID NO.:25之 殘基31-35 TYAHN VH PGE2LNL11 CDR-H2 :SEQ ID NO. :25之· 殘基50-66 WIDTSTGNPTYAPGFLG VH PGE2LNL11 GDR-H3 SEQ ID NO. :25¾ 殘基99-113 SSHTRPGDF 123456789012345678901234567890
141568.doc -156- 201014602
29 灘; -31；：； :::¾ 議 1 VL P6£2LNL11 QSGLTQPPSVSGTPGQRVTISCSGSESNVG -麻涵_^節专雜邱!襲觀|: 雖tSGLY^ 戀 :議議: : SE〇: 赛; g 殘霸 S6S£SNV6TNSVN 魏賴 1K讎· GN5DRP :¾ 顯 til:· 旗::;獲鶴撫:賴·類 殘基90-101 GACDG^LSGLYV 123456789012345678901234567890 33 26 _讓: VH Ρ6Ε21Μ<21 EVQLVQSGSELKKPGTSVKVSGKASGYTLT TYAMNWVRQAPGQGLEWMGWIGTSTGNPTY AQGFTGRFVFSLDTSVNTAHLQIYSLKAED TALYYCARSSLTRPADYWGQGTLVTVSS ： VH PGE2LNL21 CDR-H1 SEQIDNO.:33i TYAMN ：:VH PGE2LNL21 CDR-H2 SEQ ID NO.:33之 屬丨 WIGTSTGNPTYAQGFTG ：;；；； 養:(.:.1,.:.雀篡的 SSLTRPADY 1234567S9012345678901234567890 議._7: VL PGE2LNL21 :聊 GLTQPPSVSGAPGQRVTISCFGSSSNJG:: 謙 i^RfSGiSKS 麵 :：：5JSCDSSLS(^|el^ SEQ ID NO·:36之 ΙΛ:ί.Γ::::Ι:麵纖 F6SSSNIGAGYDVH is: VHQE2iJlf2 :::::::: 2:· 殘基52-57 GNNHRP ''_ϋ::.ϊ>6Ε2錄邀· SEQ ID MO,:36之 殘基91-101 QSCDSSLSGAV ❹
實例3:藉由埃德曼定序（Edman Sequencing)、質譜分析 及BLAST之组合根據經解答蛋白質序列產生及表徵重组抗 前列腺素E2抗體 藉由使用埃德曼降解（Edman degradati〇n)、質譜分析與 BLAST(基礎局部比對搜尋工具（Basic Local Alignment Search Tool)，NCBI，NIH，Bethesda，MD)之組合如先前所 述（Pham，V.等人，Analyt. Biochem.352:77-86 (2006))分析 胺基酸序列來產生對PGE2具特異性之來源於融合瘤之小鼠 抗體的蛋白質序列。以 100 mM DTT(Invitrogen, Carlsbad， CA)將0.45 mg抗PGE2抗體還原成輕鏈與重鏈。藉由在具有 •157· 141568.doc 201014602
Vydac C-18逆相管柱（H-P Separations Group, Hesperia, CA) 之 Shimadzu HPLC 系統（Shimadzu Scientifc Instruments, Columbia，MD)上進行逆相HPLC來分離抗PGE2抗體之輕鏈 及重鍵。在 Applied Biosystems API QSTAR Pulsar i質譜儀 (Applied Biosystems，Foster City，CA)及 Agilent Q-TOF 質 譜儀（Agilent, Palo Alto, CA)上量測輕鏈與重鏈之分子量。 在 PE Applied Biosystems 494/785A/140C/610A 蛋白質-肽 定序儀（Applied Biosystems，Foster City, CA)上在溶液中進 行輕鏈之N端定序。將45 kL抗PGE2 2B5抗體輕鏈加載至 過濾器中心且進行42輪。將抗PGE2抗體重鏈之N端以焦麩 胺酸阻斷且其不可直接藉由埃德曼降解定序。在重鏈N端 埃德曼定序之前，使用焦楚胺酸胺肽酶（pyroglutamate aminopeptidase)(Sigma, St. Louis，MO)使重鏈 N端去阻斷 (de-blocked)。在 37°C 下以 50 mM DTT還原 80 pg抗 PGE2抗 體歷時30分鐘。向經還原樣本中添加0.42 μΐ 0.5 Μ EDTA(pH 7.5)(Invitrogen, Carlsbad, CA)直至最終EDTA濃 度為1 mM。向樣本中添加50 μΐ經復原重組嗜熱古細菌 /wrzosws)焦麵胺酸胺肽酶（Sigma, St. Louis， MO)。在40°C下培育樣本溶液15小時後，使溫度增至6〇°c 再歷時2小時。再添加10 μΐ經復原嗜熱古細菌焦楚胺酸胺 肽酶且將樣本在60°C下再培育1小時。在1 5小時、17小時 及1 8小時時點使用4 μΐ樣本進行LC/MS分析以監測去阻斷 處理之程度。當去阻斷反應完成時，藉由速度-真空機 (speed-vacuum)(Eppendorf, Westbury, NY)將溶液濃縮至約 141568.doc •158· 201014602 100 μΐ。藉由SDS-PAGE使去阻斷重鏈與輕鏈分離且接著轉 移至PVDF膜（Invitrogen，Carlsbad，CA)以供進行埃德曼定 序（Niall，HD，Methods Enzymol. 27:942-1010 (1973)) 0 為了獲得抗PGE2抗體之内部肽序列，在進行或不進行烷 基化處理之狀況下以多種蛋白酶消化抗體。首先以DTT還 原樣本。以蛋白酶直接消化經還原樣本或將其以碘乙醯胺 : (Sigma，St. Louis，MO)烷基化且隨後消化。此研究中使用 之蛋白酶包括騰蛋白酶、glu-C、asp-N及騰凝乳蛋白酶 (Sigma, St. Louis, MO)。藉由HPLC分離經蛋白酶消化之肽 的分離部分且在單獨eppendorf管中收集各分離部分以供 MS或埃德曼定序。對於LC/MS/MS分析而言，使用 MALDI-MS(Applied Biosystems，Foster City, CA)、具有任 一 LCQ-deca 之 nano-LC/ESI-MS/MS(Applied Biosystems， Foster City, CA) ' API QStar Pulsar(Applied Biosystems, Foster City, CA)及 Agilent Q-TOF(Agilent, Palo Alto, ⑩ CA)。HPLC條件為移動相Α=0·1%甲酸；移動相B=80o/〇 入0^/20%0.1%曱酸。應用1-3小時梯度（5-5 0%8)。對於埃 - 德曼定序而言’藉由ProSorb渡筒（Applied Biosystems，
Foster City, C A)將含有由蛋白酶消化產生之肽的分離部分 轉移至PVDF膜。將各分離部分稀釋成1〇〇 μΐ 0.1% TFA溶 液（Sigma，St. Louis, ΜΟ)。在以 1〇 μΐ 甲醇（sigma，St. Louis, MO)、/燕潤儲集器中之PVDF膜（Invitrogen，Carlsbad， CA)之後，向儲集器中添加樣本。自儲集器移除樣本且將 PVDF膜風乾。將PVDF膜穿孔，添加5 μ1 10%出吡代⑽稀 141568.doc -159- 201014602 溶液（Sigma, St. Louis, MO)且使膜完全乾燥。以15 μΐ 0.1% TFA洗滌PVDF膜15秒之後，以濾紙擦拭表面。向 PVDF膜添加4 μΐ曱醇且澈底乾燥。將經乾燥PVDF膜用於 埃德曼定序。 藉由比對根據上文之方法解答之重鏈與輕鏈的可變區與 小鼠生殖系序列之VH及VL資料庫（Ig-BLAST，NCBI，ΝΙΗ， Bethesda，MD)測定抗PGE2抗體之VH及VL的生殖系序列。 對於未經MS及埃德曼序列解答之區域而言，指派最接近 生殖系序列。手動鑑別可能之熱點突變以分別匹配藉由 MS測定之抗PGE2抗體的重鏈及輕鏈之實驗分子量。使用 上述方法解答抗PGE2抗體之蛋白質序列。 基於此經解答蛋白質序列構築若干型式之各自在幾個未 經解答之位置具有不同殘基的重組抗PGE2抗體（2B5-7.0、 2B5-8.0及2B5-9.0)(表5)。實例4中描述此等重組抗體之測 試。儘管抗體CDR之胺基酸序列對抗體之結合特異性、效 力及親和力而言至關重要，但構架及甚至CDR中幾個殘基 的取代、改變、缺失或添加仍在很大程度上保持抗體之結 合特異性、效力及親和力。具有至少一個或幾個該（等）取 代、改變、缺失或添加之抗體型式仍在本發明範嘴内。圖 8 中顯示抗 PGE2 抗體（2B5-7.0、2B5-8.0 及 2B5-9.0)之 VH 及 VL區的比對。 141568.doc -160- 201014602 表5 :小鼠抗PGE2抗體之經解答蛋白質序列的若干型式
SEQ ID No. 蛋白質區域 序列 123456789012345678901234567890 40 VH 2B5-7.0 QVQLQQSGPELVRPGSSVKISCKASGYTFTK YWLGWVKQRPGHGLEWIGDiyPGYDYTHYNE KFKDKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAV YFCARSDGSSTYWGQGTLVTVSA 41 VL 2B5-7.0 DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCTSSQNIVH SNGNTYLEWYLQRPGQSPKLLIYKVSNRFSG VPDRFSGSGSGTVFTLKISRVEAEDLGVYYC FQVSHVPYTFGGGTKLEIKR 42 VH 2B5-8.0 QVQLQQSGPELVRPGSSVKISCKASGYTFTK YWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGYDYTHYNE KFKDKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAI YYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSA 43 VL 2B5-8.0 DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCTSSQNIVH SNOiTYLE WYLQRPGQS PKLLIYKVSNRFSG VPDRFSGSGSGTVFTLKISRVEAEDLGVYYC ΡςνβΗνΡΥΤΕΌΰΟΤίαΕΙΚΕΙ 44 VH 2B5-9.0 QVQLQQSGPELVRPGSSVKISCKASGYTFTK YWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPYGDYTHYKE KFKDKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAV YFCARSDGSSTYWGQGTLVTVSA 45 VL 2B5-9.0 DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCTSSQNIVH SNGNTYLEWYLQRPGQSPKLLIYKVSNRFSG VPDRFSGSGSGTVFTLKISRVEAEDLGVYYC FQVSHVPYTFGGGTKLEIKR 實例4:重組抗前列腺素E2抗體 實例4.1:重組抗前列腺素E2抗體之構築及表現 藉由在細菌中同源重組使編碼小鼠抗PGE2抗體285-7·0、2B5-8.0或2B5-9.0之重鏈可變區的DNA與編碼人類 IgGl恆定區、小鼠IgGl恆定區或小鼠IgG2a恆定區之cDNA 片段融合。（Zhang, Y 等人，Nature Biotechnol. 18(12):1314-7 (2000))。使編碼 2B5-7.0、2B5-8.0 或 2B5-9.0 -161 - 141568.doc 201014602 之輕鏈可變區的DNA與人類κ恒定區或小鼠κ恆定區融合。 同上。藉由共轉染連接至ρΤΤ3表現質體中之重鏈及輕鏈 cDNA使全長抗體於293細胞中短暫表現。（Durocher, Υ等 人，Nucleic Acids Res. 30(2):E9 (2002))。藉由蛋白質 A瓊 脂糖層析法純化含有重組嵌合抗體之細胞上清液且藉由添 加酸性緩衝液溶離已結合抗體。中和抗體且透析至PBS 中。（Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Gary C. Howard及 Matthew R. Kaser編。CRC 出版（2006))。 接著在ELISA檢定中如實例1.1.A所述測試經純化嵌合抗 PGE2單株抗體2B5-7.0、2B5-8.0及2B5-9.0與PGE2結合之能 力（表6)，且在競爭ELISA中如實例1.1.B所述測試其選擇性 (表6)。所有三種重組抗PGE2單株抗體2B5-7.0、2B5-8.0及 2B5-9.0以相似的對PGE2之特異性有效結合PGE2。2B5-8.0 顯示對PGE2之結合能力最高，且選擇其用於在EP4生物檢 定中進一步表徵以表徵其中和PGE2生物活性之能力，且在 使用整組前列腺素之3H-PGE2競爭ELISA中表徵其前列腺 素選擇性。2B5-8.0在如實例1.1.C所述之EP4生物檢定中有 效抑制PGE2誘發之鈣流入（表6)。IC5Q及EC5Q資料如下： IC50 .
㉟-8〇 口-- 2㈣_^6_2b5J_H EC50 | 0.03668 0.08904 0.07894 0.08696 12b5.1 2b5.2 2b5.3 2b5.4 0.06323 0.055 38 0.05911 0.05722~ 〇 141568.doc -162- 201014602 表6 :經工程改造之抗PGE2 Mab的PGE2結合、前列腺素 結合選擇性及PGE2中和效力的表徵
抗PGE2 mAb 2B5 2Β5-7.0 2Β5-8.0 2Β5-9.0 生物素-PGE2 ELIS A中之PGE2結合 (EC50，nM) 2.99 2.46 1.03 3.04 生物素-PGE2競爭 ELISA中之PG選擇性 (CRI%) PGEi 41 27 28 23 pga2 0.29 0.11 0.21 0.24 pgd2 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 3H-PGE2 ELISA 中之 PGE2 結合 (EC50，pM) 315 253 3H-PGE2 競爭 ELISA中之 PG選擇性 (CRI%) PGE2 100 100 PGE1 12 3.6 PGA2 0.17 0.04 PGD2 0.04 〈ΙΧΗΤ4 PGF2a 0.25 0.05 PGI2 ΝΑ 0.16 艾羅斯特(Iloprost) ΝΑ 0.01 卡柏羅斯特素 (Carbaprostacyclin) ΝΑ 0.18 松節烷TXA2 ΝΑ 0.00033 15R-松節烷TXA2 ΝΑ 0.00043 碳環TXA2 ΝΑ 0.0005 TXB2 <0.01 <0.01 6-嗣基 PGFla 0.4 0.64 PGB2 0.03 0.00038 8-異 PGF2a 0.02 0.092 13,14-二羥基-15-酮 基 PGE2 <0.01 0.012 2,3-二降-6-飼基· PGFla ΝΑ 0.019 15-酮基 PGE2 <0.01 0.013 19R-羥基 PGE2 <0.01 0.09 LTE4 <0.01 0.012 5(S)-HETE <0.01 <0.01 花生四烯酸 <0.01 <0.01 細胞EP4檢定中之PGE2中和效力 (IC50，pM) 38 44 實例4.2 :構築及表現人類化抗前列腺素£2抗體 141568.doc -163- 201014602 實例4.2.1 :選擇人類抗體搆架 基於胺基酸序列同源性、CDR聚類分析、所表現人類抗 體之使用頻率及關於人類抗體之晶體結構的可獲得資訊進 行人類化。考慮對抗體結合、VH-VL配對及其他因素的可 能影響’在鼠類與人類構架殘基不同之情況下，使鼠類殘 基突變成人類殘基’但有少數例外。基於對與鼠類抗體可 變區的實際胺基酸序列具有高度同源性（亦即序列相似性） 的人類生殖系抗體序列或其子組之分析來設計其他人類化 策略。 使用同源性模擬來鑑別預計對抗體CDR結構至關重要的 鼠類抗體序列獨有之殘基。使用與所關注目標蛋白質共有 序列相似性且三維座標已知之參考蛋白質來獲得初始座標 及其進一步改進之指南。比對參考蛋白質與目標蛋白質的 一級序列以使得兩種蛋白質之相同部分的座標得以比對。 自通用結構模板構築例如由殘基突變、插入或缺失產生之 兩種蛋白質之錯配部分的座標且改進能量以確保與已比對 模型座標的一致性。此計算蛋白質結構可經進一步改進或 直接用於模擬研究。 使用Vector NTI軟體單獨比對2Β5·8.〇之鼠類可變重鏈及 可變輕鏈基因序列與44人類免疫球蛋白生殖系可變重鏈或 46生殖系可變輕鏈序列（來源於NCBI Ig biast網站 httP://WWW.ncbi.nlm.nih.g〇v/igblast/retrieveig上^ )。使 用BLAST搜尋與目測之組合鑑別合適參考結構。認為參考 胺基酸序列與目標胺基酸序列之間25%的序列一致性為嘗 141568.doc 201014602 試同源性模擬運用所必需之最低值。手動構築序列比對且 以程式 Jackal(Petrey，D.等人 ’ Proteins 53 (增刊 6):430-435 (2003))產生模型座標。對基於針對人類V及J區段序列之同 源性搜尋進行2B5-8.0人類化而言，選擇VH區段VH1-18及 J區段JH4提供2B5-8.0之人類化重鏈可變區之構架。對於 2B5-8.0輕鏈可變區而言，使用VL區段01及J區段JK4(參見 表7及8)。2B5-8.0 VH與受體人類VH1-18及JH4區段之間的 構架胺基酸一致性為80.2%，而2B5-8.0 VL與受體人類01 及JK4區段之間的一致性為90_3%。儘管選擇較佳人類構架 受體VH/JH及VL/JK之特定對作為人類化2B5-8.0之受體， 但此項技術中已知與小鼠構架具有至少25%序列一致性的 其他人類構架受體亦可用於2B5-8.0之人類化且因此在本 發明範疇内。 表7 : 2B5-8.0人類化之重鏈受體序列
SEQ ID No. 蛋白質區域 序列 12345678901234567890123456789012 46 VH1-18&JH4 FR1 QVQLQQSGPELVRPGSSVKISCKAS 47 VH1-18&JH4 FR2 WVKQRPGHGLEWIG 48 VH1-18&JH4 FR3 KATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAIYYCAR 49 VH1-18&JH4 FR4 WGQGTLVTVSA 表8 : 2B5-8.0人類化之輕鏈受體序列
SEQ ID No. 蛋白質區域 序列 12345678901234567890123456789012 50 01&JK4 FR1 DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISC 51 01&JK4 FR2 WYLQRPGQSPKLLIY 52 01&JK4 FR3 VPDRFSGSGSGTVFTLKISRVEAEDLGVYYC 53 01&JK4 FR4 FGGGTKLEIKR
所選抗體之鼠類及人類構架區之一級序列共有顯著一致 141568.doc -165- 201014602 性。不同之殘基位置為將鼠類殘基納入人類化序列中以保 持鼠類抗體的所觀測結合效力的候選者。關鍵殘基處之該 等構架區胺基酸取代（回復突變成小鼠殘基之人類殘基）稱 為構架回復突變，其中關鍵殘基係選自由以下組成之群： 與CDR相鄰之殘基；糖基化位點殘基；稀有殘基；能夠與 PGE2相互作用之殘基；能夠與CDR相互作用之殘基；典 型殘基，重鏈可變區與輕鏈可變區之間的接觸殘基；
Vernier區内之殘基，及在ch〇thia界定之可變重鏈CDR1與
Kabat界定之第一重鏈構架之間重疊之區域中的殘基。在 、貫施例中，人類受體構架包含至少一個構架區胺基酸取 代，其中該構架之胺基酸序列與該人類受體構架之序列至 少65❶/。一致且包含至少7〇個與該人類受體構架一致之胺基 酸殘基。對2B5-8.0人類化而言，關鍵殘基處之構架區胺 基酸取代係選自由以下組成之群：在重鏈可變區中位置48 之Μ(人類）取代為〗（小鼠），位置⑽之乂（人類）取代為a(小 鼠），位置70之Μ(人類）取代為L(小鼠），且位置”之丁（人 類）取代為V(小鼠）；及在輕鏈可變區中位置(人類）取 代為V(小鼠）及位置3之¥(人類）取代為l(小鼠）。 指定構架殘基影響抗體之結合特性的可能性視其與cdr 殘基之接近性而^。因&，使用模型結構，鼠類序列與人 類序列之間不同的殘基根據其與可能接觸之CDR中之 任何原子的距離分級。處於任何CDR原子45 A之内的彼等 殘基視為最重要殘基且認為其係保持人類化抗體中之鼠類 殘基（亦即構架回復突變）之候選者。 141568.doc -166- 201014602 對於2B5-8.0抗體可變區之人類化而言，本發明提供之 一般方法如下。首先，藉助於電腦程式ABMOD及ENCAD (Levitt，Μ.，J. Mol. Biol. 168: 595-620 (1983))構築 2B5-8.0 抗體可變區之分子模型。隨後，基於針對人類V及J區段序 列的同源性搜尋，選擇區段VHl-18(The Immunoglobulin • Facts Book. 2001，由 Marie-Paule Lefranc及 Gerald Lefranc • 編著，Academic Press出版）及J區段JH4(同上）提供用於 2B5-8.0人類化重鏈可變區之構架。對於2B5-8.0輕鏈可變 ® 區而言，使用VL區段01(同上）及J區段JK4(同上）。2B5-8.0 VH與受體人類VH1 -1 8及JH4區段之間的構架胺基酸一致性 為80.2%，而2B5-8.0 VL與受體人類01及JK4區段之間的一 致性為90.3%。電腦模型未鑑別出任何具有需要回復突變 之CDR的顯著接觸殘基。未進行進一步置換。 設計9種不同型式之人類化2B5-8.0，稱為HU2B5.1、 HU2B5.2、HU2B5.3、HU2B5.4、HU2B5.5、HU2B5.6、 φ HU2B5.7、HU2B5.8及HU2B5.9。九種抗體不同之處在於 上文所述重鏈可變區之位置48、68、70及72及輕鏈可變區 ·· 之位置2及3處的構架回復突變。
- 表9 :小鼠抗PGE2抗體2B5-8.0之CDR
SEQ ID No. 蛋白質區域 序列 54 123456789012345678901234567890 CDR H1-- GYTFTKYWLG 55 56 CDR-H2 ---- DIYPGYDYTHYNEKFKD CDR H3 SD6SSTY 57 CDR-L1 TSSGNIVHSNGNTYLE 58 59 CDR-L2 KVSNRFSG CDR-L3 --- FQVSHVPYT 141568.doc -167- 201014602 表10:具有2B5-8.0之CDR的九種人類化抗PGE2抗體
SEQ XD No. 蛋白質區域 序列 123456789012345678901234567890 60 VH Hu2B5 · 1 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT：. 切 IGblYPGYDYTHV NEKFKDRATLTVDTSTSTAYMELRSLRSDD TAVYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSS 61 VL HU2B5.1 DWMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIV HSNGNTYLEWYLQKPGQS PQLLIYKVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCFQVSHVPYTFGGGTKVEIKR 62 VH HU2B5.2 EVQLVQS GAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT KYWLGWVRQAPCSQGLEWI GDIYPGyDYTHY NEKFKDRATLTVfiTSTSTAYMELSSLRSDD TAVYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSS 63 VL HU2B5.2 DWMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIV HSNOSTTYLEWYLQKPGQS PQLLI YKVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCFQVSHVPYTFGGGTKVEIKR 64 VH HU2B5.3 .' ..... ' ''·.. EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT KYWLGWVE^APGQGLEW I GDI YPGrtbYTHY NEKFKDRATLTVDTSTSTAYMELRSLRSDD TAVYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSS 65 VL HU2B5.3 DVLMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIV HSNGNTYLEWYLQKPGQS PQLLI YKVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCFQVSHVPYTFGGGTKVEIKR 66 VH HU2B5.4 - · . .. : . :. EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT KYWLGWVRQAPGQGLEWIGDIYPGYDYTHY NEKFKDRATLTVDTSTSTAYMELSSLRSDD TAVYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSS 67 VL HU2B5.4 DVLMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIV HSNGNTYLEWYLQKPGQS PQLLI YKVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCFQVSHVPYTFGGGTKVEIKR 68 VH HU2B5.5 . : ... EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT KYWLGWVRQAPGQGLEWMGDIYPGYDYTHY TAVYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSS 69 VL HU2B5.5 DWMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIV HSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCFQVSHVPYTFGGGTKVEIKR EVQLVQSGAEVIOiPGASVKVSCKASGYTFT 70 VH HU2B5.6 KYWLGWRQAPGQGLEWMGDIYPGYDYTHY NEKFKDRVTLTTDTSTSTAYMELSSLRSDD TAVYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSS 71 VL HU2B5.6 DWMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIV HSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCFQVSHVPYTFGGGTKVEIKR 72 VH HU2B5.7 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT KYWLGWVRQAPGQGLEWMGDIYPGYDYTHY NEKFKDRVTLTTDTSTSTAYMELRSLRSDD TAVYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSS
141568.doc -168- 201014602
SEQ ID No. 蛋白質區域 序列 123456789012345678901234567890 73 VL HU2B5.7 DVLMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIV HSNGNTYLEWYLQKPGQS PQLLIYKVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCFQVSHVPYTFGGGTKVEIKR 74 VH HU2B5.8 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT KYWLGWVRQAPGQGliEWMGDIYPGYDYTHY NEKFKDRVTLTTDTSTSTAYMELSSLRSDD TAVYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSS 75 VL HU2B5.8 DVLMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIV HSNOiTYLEWYLQKPGQS PQLLI YKVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCFQVSHVPYTFGGGTKVEIKR 76 VH HU2B5.9 EVQLVQSGAEyKKPGASVKySCKASGYTFT KYWLGWVIiQAPGQGLEWMGDITlrPGYDYTHY ΝΕΚΡκοιιντΜΐτοτετετΑΜΕΐ^ι^ϋο TAVYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSS 77 VL HU2B5.9 DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIV HSNGNTYLEW YLQKPGQS PQLL I YKVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCFQVSHVPYTFGGGTKVEIKR ❹ 實例4.2.2:人類化抗體之構築
使用寡核苷酸重新構築實例4.2· 1中所述之電腦設計之人 類化抗體。對於各可變區cDNA而言，設計6種各自具有 60-80個核苷酸之寡核苷酸以在各寡核苷酸之5'及/或3'端彼 此重疊20個核苷酸。在黏接反應中，組合所有6種募核苷 酸（oligos)，煮彿且在dNTP存在下黏接。添加DNA聚合酶I ❸ （大（Klenow)片段（New England Biolabs #M0210，Beverley， MA.))以填充重疊募核苷酸之間的約40 bp間隙。接著進行 PCR以使用兩個含有與經修飾pTT3載體中之多選殖位點互 補之懸垂序列的最外引子擴增整個可變區基因。在瓊脂糖 凝膠上分離自各cDNA裝配產生之PCR產物且切除及純化 對應於所預測可變區cDNA尺寸之色帶。在細菌中藉由同 源重組將重鏈可變區同框插入至編碼野生型人類IgGl恆定 區或含有2個鉸鏈區胺基酸突變之人類IgGl恆定區的cDNA 169- 141568.doc 201014602 片段中。（Zhang, Y等人，Nature Biotechnol. 18(12):1314-7 (2000))。突變為位置234(EU編號）處之白胺酸改變為丙 胺酸且位置235處之白胺酸改變為丙胺酸（Lund等人，J. Immunol., 147:2657 (1991))。藉由同源重組將輕鏈可變區 同框插入至人類κ恆定區中。分離細菌群落，提取質體 DNA且對cDNA插入物整體定序。將含有對應於各抗體之 恰當人類化重鏈及輕鏈的pTT3載體共轉染至HEK293細胞 中以短暫產生全長人類化抗PGE2抗體。藉由蛋白質Α瓊脂 糖層析法純化含有重組嵌合抗體之細胞上清液且藉由添加 0.1 N乙酸/0.15 M NaCl(pH 3.0)溶離經結合抗體。中和抗 體且透析至PBS中。 實例4.2.3:人類化抗PGE2抗體之替代構築 此實例描述抗PGE2抗體之人類化。基本上根據Queen, C.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989)之程序進行鼠類單株抗體2B5-8.0之人類化。首先， 鑑別出與2Β5-8·0 VH或VL胺基酸序列具有高度同源性之人 類V區段。隨後，將對保持互補決定區（CDR)之結構而言 重要的CDR序列以及構架胺基酸移植入所選人類構架序列 中。此外，將發現在相應V區子組中稀有之人類構架胺基 酸經共同胺基酸取代以降低潛在免疫原性。 對於2Β5-8.0可變區之人類化而言，本發明提供之一般 方法如下。首先，藉助於電腦程式ABMOD及ENCAD (Levitt, M·，J. Mol. Biol. 168: 595-620 (1983))構築 2B5-8.0 可變區之分子模型。隨後，基於針對人類V及J區段序列之 141568.doc -170- 201014602 同源性搜尋，選擇乂11區段1^1；(：1-1'(：1^(〇1^出113，八.0.等 人，EMBO J. 12: 725-734 (1993))及 J 區段 JH4(Ravetch， J.V.等人，Cell 27: 583-591 (1981))以提供 Hu2B5-8.0 重鏈 可變區之構架。對於Hu2B5-8.0輕鏈可變區而言，使用VL 區段TR1.37'CL(Portolano，S.等人，J. Immunol· 151: 2839-2851 (1993))及 J區段 JK2(Hieter，P.A·等人，J. Biol. Chem. 257: 1516-1522 (1982)) °2Β5-8·0 VH 與受體人類 MUC1-l’CL及JH4區段之間的構架胺基酸一致性為76%，而2B5-8.0 VL與受體人類TR1.37’CL及JK2區段之間的一致性為 84%。 在電腦模型表明與CDR顯著接觸之構架位置，以來自小 鼠V區之胺基酸取代初始人類構架胺基酸。對2B5-8.0人類 化而言，關鍵殘基處之構架區胺基酸取代係選自由以下組 成之群：在重鏈可變區中位置48之Μ(人類）取代為1(小 鼠），位置67之R(人類）取代為Κ(小鼠），位置68之V(人類） 取代為Α(小鼠），位置70之1(人類）取代為L(小鼠）且位置72 之R(人類）取代為V(小鼠）；及在輕鏈可變區中位置75之 D(人類）取代為V(小鼠）。此外，一些胺基酸已改變為同一 人類可變域子組中之共同胺基酸以消除潛在免疫原性，其 包括重鏈可變區中位置76之A取代為T，及輕鏈可變區中 位置1之E取代為D及位置2之L取代為I。 下文提供基於此人類化分析之CDR移植可變域 (Hu2B5.Pl之VH及VL)及併有所有回復突變及共同取代之 可變域（HU2B5.P2之VH及VL)的蛋白質序列。一般而言應 141568.doc -171 - 201014602 瞭解’具有一個或數個該等回復突變及共同取代之任何人 類化型式在本發明範疇内。抗體E包含VH Hu2B5.P2及VL HU2B5.P2 ;抗體 F 包含 VH Hu2B5.P2 及 VL Hu2B5.Pl ;抗體 G包含 VH Hu2B5.Pl 及 VL Hu2B5.P2 ;且抗體I 包含 VH Hu2B5.Pl 及 VL Hu2B5.Pl。 表11:具有2B5-8.0之CDR的人類化抗PGE2抗體
SEQ ID No. 蛋白質區域 序列 1234567890123456789012345678901234567890 78 VH Hu2B5.Pl QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKyWLGWVRQA PGQGLEWMGDIYPGYDYTHYNEKFKDRVTITRDTSASTAY MELSSLRSEDTAVYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSS 79 VL HU2B5.P1 ELVMTQSPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIVHSNGNTYLEW YLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGQGTKLEIK 80 VH HU2B5.P2 .. . .. ' QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKyWLGWVRQA PGQGLEWIGDIYPGYDYTHYipKFKDKATLTVDTSTSTAY MELSSLRSEDTAVYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSS 81 VL HU2B5.P2 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIVHSNGNTYLEW YLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTVFTLKI SRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGQGTKLEIK 實例4.2·4:人類化抗卩〇£2抗艟之表徵 如實例1.1.八所述藉由生物素-?〇£2£[13入或311-?0£2放 射免疫檢定測定經純化人類化抗PGE2抗體結合PGE2之能 力，如實例1.1.B所述藉由競爭性生物素-PGE2 ELISA或 3H-PGE2放射免疫檢定測定人類化抗PGE2抗體之交叉反應 性。如實例1.1.C所述使用EP4生物檢定測定人類化抗PGE2 抗體對PGE2活性之抑制。 在生物素-PGE2 ELIS A中所有人類化抗PGE2抗體能夠結 合PGE2(圖6及7 ;表12)。在EP4 FLIPR檢定中人類化抗 -172- 141568.doc 201014602 pge2抗體能夠中和及阻斷pge2介導之鈣流入。在3H-PGE2 ELISA中替代設計之人類化抗PGE2抗體E、F、G及I亦能夠 與PGE2結合（表13)。在3H-PGE2競爭ELISA中選擇Hu2B5.7 以供進一步表徵前列腺素結合特異性且顯示對PGE2之特異 性（表13)。 表12:人類化抗體的表徵
人類化抗醴 CH2B 5-8.0 HU2B5.1 Hu2B5^ Hu2B53 Hu2B5.4 Hu2B5.5 Hu2B5.6 Hu2B5.7 Hu2B5』 Hu2BS.9 EC50(pM) ELISA 41-60 63 55 59 57 37 89 79 87 NT EP4檢定中PEG2 25 pm細胞 效力下之IC50(pM) 55 55 55 47 40 47 52 78 78 125 交叉反應性指數 PGH1 12 16 14 14 14 11 11 9.3 8.5 NT PGA2 0.17 0.21 0.18 0.18 0.22 0.18 0.15 0.15 0.20 NT PGD2 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 NT 參 表13:人類化抗PGE2抗體的表徵（續） 人類化抗體ID A E F G I VH/VL Hu2B5.9 VH Hu2B5.P2/ VLHu2B5.P2 VH Hu2B5.P2/ VLHu2B5.Pl VH Hu2B5.Pl/ VLHu2B5.P2 VH Hu2B5.P2/ VLHu2B5.P2 jH-PGE2 ELISA 中之PGE2結合 (IC50，nM) 0.704 0.416 0.955 0.574 1.299 表14 :人類化抗PGE2抗醴Hu2B5.7之前列腺素選擇性的表徵 抗 PGE2 mAb 2B5 Hu2B5-7.0 3H-PGE2 競爭 ELISA PGE2 100 100 中之PG選擇性 PGE1 12 5.6 (CRI %) PGA2 0.17 0.02 PGD2 0.04 <ιχι〇·4 PGF2a 0.25 0.06 PGE NA 0.12 艾羅斯特 NA 0.006 卡柏羅斯特素 NA 0.16 松節烷TXA2 NA 0.00016 15R-松節烷TXA2 NA 0.0029 碳環TXA2 NA 0.00011 TXB2 <0.01 <0.01 6-嗣基 PGFla 0.4 0.47 PGB2 0.03 0.0004 8-異 PGF2a 0.02 0.06 13,14-二羥基-15-酮 基 PGE2 <0.01 0.0092 141568.doc -173· 201014602 2,3-二降-6-酮基 PGFla NA 0.19 15-酮基 PGE2 <0.01 0.011 19R-羥基 PGE2 <0.01 0.07 LTE4 <0.01 0.01 5(S)-HETE <0.01 <0.01 花生四浠酸 <0.01 <0.01 實例4.2.4.a :人類化抗PGE2抗體阻斷PGE2與PGE2受體之 結合 可藉由如實例1.1.D所述之使用3H-PGE2的基於細胞或基 於膜之受體結合檢定及如實例1.1 .E所述之基於細胞之 FACS檢定測定抗PGE2抗體對PGE2與PGE2受體（例如EP4)之 結合的競爭性抑制。 對於在人體中血清半衰期介於1 0與20天之間的治療性 mAb而言，每週或每兩週靜脈内或皮下3 mpk或3 mpk以下 之給藥方案的血清濃度通常介於5-15 pg/ml之間。基於此 計算，在單株抗體的習知給藥方案下，作為治療性mAb之 hu2B5.1-Hu2B5.9在100 nM(或15 pg/ml)之血清濃度下可能 完全（100%)活體内阻斷PGE2與EP4之結合。 實例4.2.5:人類化抗PGE2抗體之生物物理-化學表徵 所測試標準在諸如指示固有穩定性（差示掃描熱量測定 或DSC)與一般物理及化學穩定性（例如藉由SEC監測之包 括破碎及凝集的純度）之參數的一般藥物樣特性參數範圍 内。 用於生物物理-化學表徵之分析方法： 實例4.2.5.1 :尺寸排阻層析（SEC) 使用尺寸排阻層析基於尺寸分離蛋白質。蛋白質係於水 141568.doc -174- 201014602 性移動相中載運且穿過封裝於管柱中之多孔固定相樹脂。 管柱中之滯留時間為蛋白質之流體動力尺寸與封裝樹脂床 中之微孔尺寸的函數。較小分子可穿透至樹脂中之較小微 孔中且保持比較大分子長的時間。在自管柱溶離時，藉由 UV吸收偵測蛋白質。SEC方法使用TSK凝膠防護（TOSOH Biosciences，Montgomeryville, PA,目錄號 08543)及 TSK 凝 勝 G3000SWxL(TOSOH Biosciences, Montgomeryville, PA, 目錄號 08541)。移動相為 100 mM Na2HP04、200 mM Na2S04，pH 7.0。流動速率為0.3 mL/min。注入體積為20 pL 1 mg/mL樣本。管柱溫度為室溫。自動取樣益溫度為2_ 8°C。總運作時間為50分鐘。偵測係基於214 nm波長下之 UV吸收，帶寬設定為8 nm，使用參考波長360 nm，帶寬 1 00 nm。 實例4.2.5.1 :差示掃描熱量測定（DSC) 使用DSC儀器評估抗PGE2抗體之熱穩定性。所用DSC儀 器為具有毛細管吸收池之自動VP-DSC設備（Microcal, GE Healthcare Ltd./Microcal，Buckinghamshire, UK)。應用 l°C/min掃描速率經25°C -95°C溫度範圍對1 mg/mL之樣本 研究分子伸展。所應用之其他量測參數為16秒之匹配期， 10分鐘之預掃描等待時間，且以無反饋模式進行量測。每 次個別量測時，將420 μί樣本/空白填充至DSC量測樣本固 持器中，其中盤填充流程如下文提供。使所獲得之熱分析 圖擬合為非兩態模型以獲得不同轉變之中點溫度及焓。 成功生物學研究候選物之另一要求為蛋白質保持其天然 141568.doc -175- 201014602 狀態及構形。水溶液中之蛋白質在天然（摺疊）構形與其變 性（伸展）構形之間達成平衡。天然狀態之穩定性係基於系 統之吉布士自由能（Gibbs free energy，DG)的量值及給 (DH)與熵值（DS)變化之間的熱力學關係。正DG表明天然 狀態比變性狀態更穩定-DG正值愈大，穩定性愈高。為使 蛋白質伸展，需要打破穩定力。構形熵值克服穩定力使得 蛋白質在熵值佔優勢的溫度下伸展。DSC量測由於熱變性 導致伸展之蛋白質的DH。作為一般規則，其可表述為轉 變中點（Tm)愈高，蛋白質在低溫下愈穩定。在同一實驗過 程中，DSC亦量測蛋白質變性之熱容量（DCp)的變化。與 蛋白質伸展相關之熱容量變化主要係由於在天然狀態下包 埋，但在暴露於變性狀態下溶解之側鏈的水合作用的變 化。已顯示DSC為蛋白質及其他生物大分子之液體調配物 穩定性的有價值預測方式（Remmele，R.L_ Jr., Gombotz, W.R·，BioPharm 13, 36-46，2000 及 Remmele，R.L. Jr.,
Nightlinger, N.S., Srinivasen, S., Gombotz, W.R., Pharm. Res. 15, 200-208, 1998)。 實例4.2.6 :人類化抗PGE2抗體Hu2B5.7在純系選擇過程期 間的穩定性 實例4.2.6.A :使用DSC及SEC測定之人類化抗PGE2抗體 Hu2B5.7的穩定性 藉由使用利用DSC進行之固有熱力學純系穩定性測定 (0.79 mg/mL純系濃度，在pH 6下在10 mM檸檬酸鹽、10 mM磷酸鹽緩衝液中調配）及藉由以SEC監測純系穩定性之 141568.doc -176- 201014602 加速穩定性篩選（0.79 mg/mL純系濃度，在pH 6下在10 mM 檸檬酸鹽、10 mM磷酸鹽緩衝液中調配，在50°C下歷時7 天）評估一系列親本抗PGE2抗體之純系（亦即抗PGE2抗體） 之穩定性（表15)。 表15 :如SEC所測定之Hu2B5人類化抗體變異體HU2B5.1-Hu2B5.9純系樣本中凝集物及片段的形成（穩定性研究之開 始） 純系 凝集物(％) 單體(％) 片段(％) Hu2B5.1 1.8071 93.7885 4.4044 Hu2B5.2 1.846 94.8516 3.3025 Hu2B5.3 2.116 94.1987 3.6853 Hu2B5.4 2.234 94.5513 3.2146 Hu2B5.5 1.5906 95.1406 3.2688 Hu2B5.6 1.8265 95.446 2.7275 Hu2B5.7 1.9668 95.5818 2.4514 Hu2B5.8 2.1126 94.5969 3.2904 Hu2B5.9 1.8559 95.6031 2.541 表16 :如SEC所測定之Hu2B5人類化抗體變異體Hu2B5.1-Hu2B5.9純系樣本中凝集物及片段之形成（在50°C下儲存7 天） 純系 凝集物(％) 單體(％) 片段(％) Hu2B5.1 2.5611 91.0715 6.3675 Hu2B5.2 2.1753 93.1491 4.6755 Hu2B5.3 2.6042 92.3518 5.044 Hu2B5.4 2.1689 91.2889 6.5423 Hu2B5.5 1.901 93.7376 4.3614 Hu2B5.6 2.1577 93.817 4.0253 Hu2B5.7 2.205 93.905 3.89 Hu2B5.8 2.5144 93.3016 4.184 Hu2B5.9 1.9559 94.6313 3.4127
表15及16提供人類化抗-PGE2抗體儲存高達7天之SEC測 試的結果，顯示加速穩定性篩選開始及結束時的單體含 量。Hu2B5.7及Hu2B5.9在7天加速穩定性篩選後顯示最高 141568.doc -177- 201014602 單體含量。表17中所示之結果表明hu2B5.7相較於該組其 他純系（例如Hu2B5.4)亦具有極佳固有穩定性概況（DSC資 料）。
IgG抗體通常顯示三種伸展轉變（Tm):完整抗體之伸展 與Fc片段中CH2域之熔融、Fc片段中CH3域之熔融及Fab片 段之熔融有關。為了選擇具有所要藥物樣特性之抗PGE2抗 體，選擇具有高Tm值及高固有穩定性之純系（諸如 Hu2B5.7)(表 17)。 表17:經由DSC對人類化抗PGE2抗體純系進行的固有熱力 學純系穩定性測定（0.79 mg/mL純系抗體濃度，在pH 6下 在10 mM檸檬酸鹽、10 mM磷酸鹽緩衝液中調配） 純系 Tml(°C) Tm2(°C) Tm3(°C) Hu2B5.1 72.835 75.02 82.785 Hu2B5.2 72.845 75.08 82.67 Hu2B5.3 72.67 72.96 82.67 Hu2B5.4 71.095 72.41 82.58 Hu2B5.5 73.31 75.755 82.97 Hu2B5.6 73.035 75.585 82.95 Hu2B5.7 72.67 75.445 82.795 Hu2B5.8 72.96 75.33 82.83 Hu2B5.9 73.235 75.965 83.04 實例4.2.6.B : Hu2B5.1-Hu2B5.9之毛細管區帶電泳 毛細管區帶電泳為毛細管填充有緩衝液且分離機制係基 於分析物穿過緩衝液之電泳遷移率差異之毛細管電泳方 法。分子之電泳遷移率與電荷尺寸比有關。使用86^<；111311-Coulter ProteomeLab PA 800(Beckman Coulter, Fullerton, CA)進行CZE分析。使用中性毛細管（eCAP中性，56 cm總 長度，50 μιη I. D. Beckman-Coulter，P/N 477441， 141568.doc -178- 201014602
Fullerton，CA)。該方法使用30.2 cm毛細管，其在距離樣 本引入口 20.2 cm處具有偵測窗口。電泳緩衝液為1〇〇 mM EACA(6-胺基己酸，Sigma A7824-100 G，St. Louis，MO)， 具有0.1% MC(來自1%曱基纖維素溶液，Convergent Bioscience，目錄號 101876，Toronto, ON，Canada)，pH 5.5。 結果顯示 Hu2B5.1、Hu2B5.3、Hu2B5.5、Hu2B5.7、 Hu2B5.9 比 Hu2B5.2、Hu2B5.4、Hu2B5.6、Hu2B5.8 遷移更 偏鹼性（例如其具有較短遷移時間）。此可能係由於 Hu2B5.1、Hu2B5.3、Hu2B5.5、Hu2B5.7、Hu2B5.9在重鏈 第84號胺基酸處均具有R，而其他四個樣本在同一位置具 有S。所有9個樣本顯示主峰及微酸性及鹼性種類，但在不 同種類分布中差異不太大。 實例4.3:與PGE2複合之Hu2B5.7的結晶化 如下使Ηιι2Β5·7之Fab部分與PGE2複合且產生複合物之 晶體。 實例4.3.1 :製備及純化HU2B5.7 Fab片段 為了製備Hu2B5.7 Fab片段，首先使用Ultrafree-15 Biomax 10 kDa分子量截斷（MWCO)離心過濾裝置 (Millipore)將 0.15 M PBS 緩衝液中之 Hu2B5.7 IgG 濃縮至 2 mg/ml。預先洗滌木瓜蛋白酶凝膠漿液（Pierce)且以1:1體積 比與緩衝液 A(20 mM Na2HP04、10 mM EDTA、20 mM半 胱胺酸）一起裝入2-3次。接著將濃縮抗體與50%木瓜蛋白 酶凝膠漿液混合且在37°C下在劇烈振盪下培育24小時。離 141568.doc •179· 201014602 心分離（Beckman 6KR)抗體/漿液混合物且將上清液裝載至 經PBS預平衡之Superdex 75上。溶離主峰且彙集蛋白質。 藉由以100 mL PBS洗滌來製備25 mL蛋白質A瓊脂糖4快速 流動親和力管柱（Amersham Pharmacia)。向親和力管柱（2 mL/min流動速率）施加彙集之抗體片段。在flow-thru中收 集含有Hu2B5.7 Fab片段之溶離份（以280 nm下之UV吸收監 測）。彙集Hu2B5.7 Fab片段濃度大於0.3 mg/mL之（以280 nm下之UV吸收測定）之溶離份且在-80°C下冷凍。以SDS-PAGE評估樣本純度。 實例4.3.2 : PGE2/Hu2B5.7 Fab複合物製備 以1:1莫耳比混合PGE2及Hu2b5.7 Fab蛋白質且在4。(：下 培育1小時。以0.5 ml/min將複合物樣本裝載至預平衡（2〇 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl)Superdex 200管柱上。囊 集複合物且使用Ultrafree-15 Biomax 10 kDa分子量截斷 (MWCO)離心過濾裝置（Millipore)濃縮至24 mg/mL且在 -80°C下冷凍。以SDS-PAGE評估樣本純度。 實例4.3.3 : PGE2/Hu2B5.7 Fab複合物之結晶化 在冰上解凍冷凍之PGE2/Hu2B5.7複合物儲備液（約24 mg/mL)。混合複合物（1.0 pL)與1.0 μΙ>儲集器溶液（1·75 Μ 硫酸銨，100 mM MES pH 6.5，10 mM CaCl2)。在儲集器 上在約18°C下在沈滴井（sitting drop well)(CrysChem沈滴 盤）中混合所得液滴。一般在一週内出現鑽石樣晶體。 實例4.3.4 : PGE2/Hu2B5.7 Fab複合物晶體之低溫保護及 急称冷卻 141568.doc •180- 201014602 使用纖維迴路（fiber loop)在母液+20%甘油中採集 PGE2/Hu2B5.7 Fab複合物晶體。隨後藉由浸入液氮中急驟 冷卻晶體。 實例4.3.5 : PGE2/Hu2B5.7 Fab複合物之X射線繞射資料 收集 在IMCA束線下在Argonne，IL之先進光子源（Advanced ' Photon Source)收集PGE2/Hu2B5.7 Fab晶體之X射線繞射資 料。在資料收集期間以Oxford Cryosystems Cryostream冷 ❹ 卻器將晶體保持於100 K之溫度下。在1·0°之振盪範圍下收 集總計180個框架。以HKL2000程式組（Qtwinowski及 Minor，1997)處理資料。在測定晶體取向之後，以DENZO 整合資料且以SCALEPACK分級及合併，且置於絕對標度 上且以TRUNCATE還原為結構因子振幅（French及Wilson, 1978)。以隨機方式將5%獨特反射分配為「自由」組以計 算自由R因子（R自由）(Brtinger，1992);剩餘95°/〇反射構成 φ 「工作」組以供計算R因子（R)。 實例4.3.6 : PGE2/Hu2B5.7 Fab複合物晶體結構之分子置 換解決方案及改進 、使用程式PHASER(Read，2001)測定最大可能分子置換解 決方案。以3.0 A解析度適當空間群解答總計6個 PGE2/Hu2B5_7單體。研究模型為先前報導之Fab的晶體結 構（Protein Data Bank entry 1BJ1 ; Muller 等人.1998)。基 於分子置換解決方案產生座標。 PGE2/Hu2B5.7 Fab複合物晶體結構之改進在適當空間群 141568.doc -181 - 201014602 中以上文所述之分子置換解決方案座標開始。使用剛體改 進藉由CCP4程式組中可獲得之程式REFMAC開始改進 (Murshudov 等人，1997, Collaborative Computational Project，1994)。觀測重新PGE2電子密度。藉由公開PGE2 NMR結構lIJZ(Moy等人，2001)使用分子圖形程式0(Jones 等人，1991)及2Fo-Fc與Fo-Fc電子密度圖之檢驗指導6個 PEG2單體的手動建構。將改進程式REFMAC(Murshudov等 人，1997)用於多輪迭代限制改進，產生以下統計結果：R 為 25_8%(R 自由 30.5%)。 實例5.0 :藥物動力學分析 實例5.1:重組小鼠抗卩0£2抗體之藥物動力學分析 在Sprague Dawley大鼠及Balb/C小鼠中進行小良mAb 2B5.8.0之藥物動力學研究。以單一劑量4 mg/kg 2B5.8.0對 雄性及雌性大鼠及小鼠進行靜脈内或腹膜内（僅小鼠）給 藥，且使用基於抗原捕獲之化學發光MSD(Meso Scale Discovery)方法（Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland)分析jk清樣本。藉由使用WinNonlin進行非隔室 模型分析（non-compartmental analysis)計算藥物動力學參 數。 實例5.1.1:用於定量PK血清樣本中之2B5.8.0的檢定 使用以下MSD檢定量測大鼠及小鼠血清中之抗體濃度。 以含有 0.05% Tween-20(Sigma, St. Louis, MO)之填酸鹽緩 衝鹽水洗滌MSD抗生蛋白鏈菌素培養盤（Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)。以每孔 250 pL 阻斷溶液 141568.doc -182- 201014602 (MSD Block, Meso Scale Discovery,在 PBS中稀釋至3% 最 終濃度）阻斷培養盤1小時，覆蓋，同時在室溫下振盪（600 rpm)。洗務後，向各孔中添加70 μι經生物素標記之 PGE2(前列腺素Ε2-生物素酿胺，Cayman Chemical，Ann Arbor，Michigan，目錄號 10006987，批號 190831-191028， 檢定緩衝液中0.01 gg/mL)。覆蓋培養盤且在室溫下在振盈 (600 rpm)下培育1小時。 在分析之前，在冰上解凍大鼠及小鼠血清樣本’溫和混 合且在eppendorf離心機中在4°C下在14,000 rpm下離心分 離3分鐘。在大鼠及小鼠血清中製備標準曲線及對照樣 本。在保持1 %最終血清濃度恆定下，使用Tecan Evo自動 液體處理站將標準曲線、高、中及低對照，及血清樣本稀 釋於檢定緩衝液中。再次洗滌MSD培養盤且添加研究樣 本、標準曲線樣本及空白，以及高、中及低對照（每孔70 μΐ^)。覆蓋培養盤，且在室溫下在振盪（600 rpm)下培育1小
培育後，洗滌MSD培養盤，且向各孔中添加70 μί磺酸 基標記之山羊抗小鼠IgG(Meso Scale Discovery ;在檢定緩 衝液中稀釋至1 gg/mL)。覆蓋MSD培養盤’且在室溫下在 振盪（600 rpm)下培育1小時，接著洗滌培養盤且以2倍讀取 緩衝液（Meso Scale Discovery)顯色。在10分鐘内在MSD
Sector Imager 6000上量測化學發光。 使用四參數邏輯擬合分析標準曲線且藉由XLHt4軟體第 2·2·1 版Build 16(Microsoft Corporation, Redmond, WA)計算 141568.doc •183- 201014602 樣本濃度。使用Winonlin軟體第5.0.1版（Pharsight Corporation, Mountain View, CA)藉由非隔室模型分析計算 各動物之藥物動力學參數。 實例5.1.2 :在SD大鼠及Balb/C小鼠中進行2B5.8.0之藥物 動力學研究 經手術改變（頸靜脈插管，JVC)及常規雄性及雌性 Sprague-Dawley大鼠（約7週大，體重240-390公克）係購自 Charles River Laboratories(Wilmington, MA)。在保持於恒 定溫度及濕度且處於12小時光/暗循環下的室内圈養動 物，以正常齧齒動物飲食飼養且允許隨意取用食物及水。 每曰監測動物之水合及臨床狀態。 雄性及雌性Balb/c小鼠（體重約0.025 kg)係購自Charles River Laboratories(Wilmington, ΜΑ)。允許動物隨意取用 食物及水。在不同時間點（各時間點5隻小鼠）收集血液樣本 (0.2 mL，對大鼠而言來自尾靜脈且對小鼠而言藉由心臟 穿刺獲得），使其在室溫下凝結30分鐘，在13,200 rpm下離 心分離3分鐘，將血清轉移至eppendorf管且在-80°C下冷凍 儲存。 在大鼠中靜脈内投藥後，2B5.8.0展現抗體典型的雙指 數衰變。2B5.8.0清除率及分布體積低（表18)，且半衰期 長，T1/2 : 9.1及8.9天（分別對雄性及雌性而言）。雌性大鼠 中存在高動物間可變性，然而雄性大鼠中不存在。 在Balb/C小鼠中靜脈内投藥之後，2B5.8.0顯示極長半衰 期（對雄性及雌性而言分別為26.3及16.2天），而清除率及 141568.doc -184- 201014602 分布體積低（表18)。在小鼠中腹膜内投藥後，在早期時間 點在雌性中觀測到高動物間可變性。吸收低，1 _2天達到 37-49 pg/ml之高Cmax。半衰期長（13.8-16.1天）且生物可用 性良好（65.8-72.0%)。 表 18 : 2B5.8.0 在 Sprague-Dawley 大鼠及 Balb/C小鼠中之 主要藥物動力學參數 IV T*/2 CL Vz Vss AUC〇_ MRT 物種/制量 (天數} (mL/hr/kg) (mL/kg) iinL/kg) imc*hr/mL) (天數） 大鼠(4 M(N=5) 9.1±1.3 0.41±0.03 127±18.9 122±18.5 9.9 士 0.7 12·6±1.6 mg/kg) F(N=3) 8.5±2.2 0.37±0.13 101±13,1 88±6.2 12.0±4.6 10.8±3.5 小鼠(4 M 26.3 0.15 135 134 26.9 37.5 mg/kg) F 16.2 0.16 92 89 24.5 22.8 IP 物種/劑量 cm„ Tmax TV2 MRT AUC〇. F (ufi/mL) (天數） (天數） (天數> img-hr/niL) (%) 小鼠(4 M 37.3 2 16.1 23.4 19.4 72 mg/kg) F 49.4 1 13.8 19.3 16.1 65.8 實例5·1.3:重组人類化抗PGE2hu2B5.7及ll^l2B5·4之藥物 動力學分析 在Sprague Dawley大鼠中進行hu2B5.7及hu2B5.4的藥物 動力學研究。以單一劑量4 mg/kg hu2B5.7及hu2B5.4對雄 性大鼠靜脈内給藥且使用基於抗原捕獲之化學發光MSD (Meso Scale Discovery)方法分析血清樣本。藉由使用 WinNonlin進行非隔室模型分析計算藥物動力學參數。 實例5.1.3.1:用於定量？1^血清樣本中之1111255.7的檢定 使用以下MSD檢定量測大鼠血清中之hu2B5.7及hu2B5.4 濃度。 以含有0.05°/。Tween-20之磷酸鹽緩衝鹽水（自l〇X PBS稀 釋，Abbott Bioresearch Center, Media Room，Worcester, 141568.doc -185- 201014602 ΜΑ及 Tween-20，Sigma, St_ Louis, MO)洗務 MSD抗生蛋白 鏈菌素培養盤（Meso Scale Discovery)。以每孔250 pL阻斷 溶液（MSD Block, Meso Scale Discovery，在 PBS 中稀釋至 3%最終濃度）阻斷培養盤1小時，覆蓋，同時在室溫下振盪 (600 rpm)。洗滌後，向各孔中添加70 pL經生物素標記之 PGE2(前列腺素Ε2-生物素醯胺，Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan，目錄號 10006987，批號 190831-191028 ; 檢定缓衝液中0.01 Kg/mL)。覆蓋培養盤且在室溫下在振盪 (600 rpm)下培育1小時。 在分析之前，在冰上解柬大鼠血清樣本，溫和混合且在 eppendorf離心機中在4°C下在14,000 rpm下離心分離3分 鐘。在大鼠血清中製備標準曲線及對照樣本。使用Tecan Evo自動液體處理站將標準曲線、高、中及低對照，及血 清樣本稀釋於檢定緩衝液中，保持1%最終血清濃度恆 定。再次洗滌MSD培養盤且添加研究樣本、標準曲線樣本 及空白，以及高、中及低對照（每孔70 μ!〇。覆蓋培養盤， 且在室溫下在振盪（600 rpm)下培育1小時。 培育後，洗滌MSD培養盤，且向各孔中添加70 pL磺酸 基標記之山羊抗人類IgG(Meso Scale Discovery ;在檢定緩 衝液中稀釋至1 gg/mL)。覆蓋MSD培養盤，且在室溫下在 振盪（600 rpm)下培育1小時，接著洗滌培養盤且以2倍讀取 緩衝液（Meso Scale Discovery)顯色。在10分鐘内在MSD Sector Imager 6000上量測化學發光。 使用四參數邏輯擬合分析標準曲線且藉由XLHt4軟體第 141568.doc -186· 201014602 2.2.1 版 Build 16(Microsoft Corporation, Redmond, WA)計算. 樣本濃度。使用Winonlin軟體第5·0·1版（Pharsight Corporation, Mountain View, CA)藉由非隔室模型分析計算 各動物之藥物動力學參數。 實例5.1.3.2 :在Sprague-Dawley大鼠中進行之藥物動力學 研究 經手術改變（頸靜脈插管，JVC)之雄性Sprague-Dawley 大鼠（約7週大，體重240-390公克）係購自Charles River Laboratories(Wilmington，ΜΑ)。在保持於怪定溫度及濕度 且處於12小時光/暗循環下的室内圈養動物，以正常齧齒 動物飲食飼養且允許隨意取用食物及水。每日監測動物之 水合及臨床狀態。 在不同時間點自大鼠收集0.2 mL血液樣本，使其在室溫 下凝結30分鐘，在13,200 rpm下離心分離3分鐘，將血清轉 移至eppendorf管且在-80°C下冷康儲存。 靜脈内投藥後，hu2B5.7及hu2B5.4血清濃度雙指數衰減 (通常抗體所見）。Hu2B5.7及hu2B5.4清除率及分布體積低 且半衰期長；T1/2 :兩種抗體皆為12.4天（表19)。約10-14 天之後，若干動物展現血清hu2B5.7濃度意外降低。此等 突然降低可能係由於產生抗藥物抗體（ADA);然而，此未 經確認。最終藥物動力學計算省略具有可能ADA反應之動 物。 表19 : 4 mg/kg靜脈内給藥後hu2B5.7及hu2B5.4在雄性 Sprague-Dawley大鼠中的主要藥物動力學參數 141568.doc -187- 201014602 IV TV2 CL Vz Vss AUC〇^ MRT Ab/劑量 (天數） (mL/hr/kg) (mL/咕） (mL/kg) (mg.hr/mL) (天數） hu2B5.7/4 mg/kg (N=3) 12.4+0.6 0.41 士 0.07 176±30.8 165±19.8 9.9 土 1.8 16.8±1.0 hu2B5.4/4 mg/kg (N=4) 12.4±5.1 0.35±0.07 143±40.2 145±31.8 11.8±2.0 18.016.0 實例4.4:重組小鼠及人類化PGE2抗體的活體内功效 如下評估抗PGE2抗體之活體内功效。 實例4.4.1 :小鼠及人類化抗PGE2抗體在角叉菜膠誘發之 足墊水腫模型中的活體内功效 角叉菜膠誘發之足墊水腫為先天免疫功能之急性齧齒動 物模型。在角叉菜膠誘發之爪水腫模型中評估小鼠抗 PGE2抗體2B5-8.0之活體内功效。如先前所述類似地以角 叉菜膠誘發爪部發炎（Joseph P. Portanova 等人，J.Exp· Med. 184·· 883-891 (1996))。皮内（ID)注射發炎劑引起迅速 流入嗜中性白血球及水腫（在約4小時達到峰值），隨後引起 流入巨噬細胞及單核細胞（在約48小時達到峰值）。將 C57.BL/6 小鼠（8-10 週大，Jackson Laboratories，Bar Harbor, ME)在後足墊以5.0 mg/mL(每隻小鼠150 pg)之濃度 皮内注射30 pL PBS(左）或PBS中之λ-角叉菜膠（Sigma Aldrich, St. Louis, MO)(右）。藉由第310-119 型 Dyer spring 測徑規在基線（時間=0)及角叉菜膠挑戰後4小時量測後足 墊厚度。藉由在學生雙尾【測試（Student's two-tailed t-test) 中比較各處理組與媒劑組之平均爪腫脹來測定足厚度之顯 著差異。在角叉菜膠挑戰前1 8小時向小鼠腹膜内給予抗 PGE2抗體（2B5-8.0)劑量滴定，或在挑戰前2小時經口給予 141568.doc •188· 201014602 吲哚美辛。所量測之終點為處理後4小時右爪與左爪之間 的爪腫脹（水腫）差異。抗PGE2抗體以劑量依賴性方式抑制 爪水腫，且在10 mg/kg下提供最大40-50%爪腫脹抑制，與 吲哚美辛實現之最大抑制相當（表20)。 表20 : Ab處理後小鼠角叉菜膠誘發之足墊水腫中之爪腫脹 媒劑 抗PGE2 吲哚美辛 (PBS) (10 mg/kg » i.p.) (3 mg/kg > p.o.) ' Δ 爪腫脹(mm) 0.857+0.06 0.529±0.04 0·486±0.03 抑制％ ΝΑ 38±4.6 57±3.5 〇 實例4.4.2 :小鼠及人類化抗PGE2抗體在角叉菜膠誘發之 痛覺過敏模型中的活體内功效 藉由測定角叉菜膠誘發之痛覺過敏評估小鼠抗PGE2抗 體2Β5-8.0及人類化抗PGE2抗體Hu2B5.7之活體内功效。如 先前所述以角叉菜膠誘發爪部發炎（Joseph Ρ. Portanova等 人，J. Exp. Med. 184: 883-891 (1996))。藉由將0.1 ml的於 無菌鹽水中之0.1%角又菜膠溶液（FMC Corp., Rockland， ME)注射至 200公克雄性 Sprague Dawley大鼠（Charles River Laboratories，Portage，ME)的後足塾誘發痛覺過敏。在相 同動物中藉由Hargreaves等人，Pain. 32:77-88 (1988)之方 法測定對熱刺激之痛覺過敏反應。在注射後的選定時間使 後足暴露於高強度投影燈泡發射之輻射熱。各後爪保持與 熱源接觸之時間量量測至最搔近0.1秒。痛覺過敏反應表 示為各動物之角叉菜膠及鹽水注射之爪部之間的潛伏退縮 期差異。在某些實驗中，在投與角叉菜膠之前1小時，藉 由經口管飼法向大鼠投與0.5%甲基纖維素/0.025% Tween 141568.doc •189_ 201014602 80(Sigma Chemical Co.，St· Louis, MO)中之0引0朵美辛。在 角叉菜膠注射之前1 8小時，向其他大鼠腹膜内注射小鼠抗 PGE2 mAb、2B5-8.0或人類化抗PGE2抗體、Hu2B5.7或同 型匹配抗體。 實例4.4.2 :小鼠抗PGE2抗體在膠原蛋白誘發之關節炎中 的活體内功效 自猶他州立大學（University of Utah)(Salt Lake City, UT) 獲得II型牛膠原蛋白（凍乾）。將雄性DBA/J小鼠（8-10週 大，Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)在尾根部以 100 pL含有溶解於0.1 N乙酸中之100 pg II型牛膠原蛋白及100 pg 熱滅活結核分枝桿菌tuberculosis) H3 7Ra之乳液（完全弗氏佐劑，Difco, Laurence, KS)皮内免 疫。以膠原蛋白免疫之後21天，將小鼠以1 mg酵母聚糖 A(Zymosan A)(Sigma，St· Louis, MO)IP增強。增強後，每 曰監測小鼠的關節炎。藉由以下標準對各爪計分：0=正 常；1 =在一個部位（足或踝）腫脹；2 =在足及踝處腫脹；及 3=關節僵硬。總結各動物之計分，且各組中所有動物之總 平均值表示為MAS。除臨床計分之外，亦使用第310-119 型之Dyer spring測徑規評估小鼠之爪水腫。在第24天與第 28天之間在疾病之第一臨床徵兆時登記研究之小鼠。在實 驗結束時，自各組採集六隻爪且儲存於1 0%中性緩衝之福 馬林（formalin)中用於微CT及組織學檢查。 在 Scanco pCT-40 單元（Scanco Medical AG)上在 60 kVp 下 在160 μΑ下進行微電腦斷層攝影術。後爪（儲存於70%乙醇 141568.doc -190- 201014602 中）固定於成像管中且在18 μπι解析度下自脛骨根部至跗骨/ 疏骨關節量測小鼠踝關節的1.8 mm區段之跗骨體積。接著 使用Scanco AG μ(：Τ評估程式分析足部微電腦斷層攝影術 影像。 對於組織病理學分析而言，將福馬林固定之爪分段且以 Gills 3蘇木精（Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, ΜΙ)及 具有玫瑰紅之曙紅（Newcomer Supply, Middleton, MI)染 色。使用以下標準組織學評估疾病嚴重程度：0=正常；1 = 最小變化；2=輕微變化；3=中等變化；及4=嚴重變化。總 結各動物之計分，且總數表示為各組中所有動物的平均 值。 在小鼠（雄性DBA/1J)膠原蛋白誘發之關節炎（人類類風 濕性關節炎的標準臨床前模型）中評估單獨抗PGE2之治療 效果。在小鼠以牛II型膠原蛋白免疫後產生關節炎疾病徵 兆之後開始藥物處理。目測計分小鼠之關節炎臨床徵兆且 結果記錄為平均關節炎計分（MAS)。隨時間監測之爪腫脹 及MAS亦表示為曲線下面積（AUC)(表21)。在疾病發作 後，以抗PGE2mAb2B5處理將MAS之AUC降低22%。 表21 :抗PGE2 2B5-8.0處理之後小鼠CIA中之疾病計分、 腫脹及骨骼體積 媒劑 抗 PGE2 (PBS) (8 mg/kg，2x/週，i.p.) MAS(AUC) (計分#天數） 74+7.3 57.4+6.7 爪腫脹(AUC) (mm#天數） 14.3±1.6 8.4+1.3 骨骼體積(mm3) 1.2±0.2 1·6±0·1 141568.doc -191 - 201014602 實例4.4.2 :小鼠抗PGE2抗艟在佐劑誘發之關節炎中的活 體内功效 在佐劑誘發之關節炎模型中評估小鼠抗PGE2抗體2B5-8.0之活體内功效。如先前所述藉由足墊注射礦物油中之 乳酷·分枝桿菌6Mi_yr/cwm)(Difco Laboratories， Detroit, MI)在雄性 Lewis大鼠（Harlan，Indianapolis，IN)中 誘發關節炎。將地塞米松（dexamethasone)及》引D朵美辛 (Sigma Chemical Co.)懸浮於甲基纖維素/Tween中且藉由管 飼法分別以〇·1及2 mg/kg之劑量每日投藥兩次。2B5-8.0及 同型對照藉由腹膜内注射以1 〇 mg/kg之劑量每日投與。在 佐劑注射後第15天開始處理且繼續處理直至在第21天最終 評估未經注射之對側爪的爪體積。每週兩次小心檢查小鼠 的周圍關節中之關節炎的目測外觀，且確定疾病活動性之 計分。 藉由引用的方式併入 ' 本申請案全文可引用之所有引用參考文獻之内容（包括 文獻參考案、專利、專利申請案及網站）係如其中所引用 之參考文獻一般藉由全文引用的方式明確併入本文中。除 非另外說明，否則本發明之實施將採用此項技術中熟知的 免疫學、分子生物學及細胞生物學之習知技術。 相等物 本發明可在不悖離其精神或基本特徵之情況下以其他特 定形式實施。前述實施例因此在所有態樣中說明而非限制 本文所述之本發明。本發明之㈣因此由隨附中請專利範 141568.doc -192- 201014602 圍而非前述描述指定，且因此意欲本文涵蓋屬於申請專利 範圍相等物之含義及範圍内的所有變化。 【圖式簡單說明】 圖1提供在實例1.1.A中所述之ELISA中兩種融合瘤來源 之mAb 15F10.3C9及1F7.1D5與生物素-PGE2之結合的量測 結果；
圖2提供在實例1.1.A中所述之ELISA中兩種融合瘤來源 之mAb 19C9.4B10及4F10.3B9與生物素-PGE2之結合的量 測結果； 圖3提供在實例1.1.A中所述之ELISA中PROfusionTM來源 之 mAb K1B、K7H、K3A、L11 及 L21與生物素-PGE2之結 合的量測結果； 圖4提供在實例1.1.A中所述之ELISA中重組抗PGE2 mAb 2B5-7.0、2B5-8.0及2B5-9.0與生物素PGE2之結合。融合瘤 來源之抗體2B5在此檢定中為陽性對照； 圖5提供如實例1.1.C 1中所述藉由FLIPR所量測之抗 PGE2 mAb 2B5-8.0中和EP4轉染之HEK293 Gal6穩定細胞 株中的PGE2(25 ρΜ)誘發之Ca++流入。融合瘤來源之抗體 2B5在此檢定中為陽性對照； · 圖6提供如實例1.1 .C 1中所述藉由FLIPR所量測之人類化 抗 PGE2 mAb 2B5.5、2B5.6、2B5.7及 2B5.8 中和 EP4轉染之 HEK293。0116穩定細胞株中的？〇£2誘發之。3++流入； 圖7提供如實例1.1 .C 1中所述藉由FLIPR所量測之人類化 抗 PGE2 mAb 2B5.1、2B5.2、2B5.3及 2B5.4 中和 EP4轉染之 141568.doc •193· 201014602 HEK293。0116穩定細胞株中的卩〇£2誘發之。&++流入； 圖8提供如實例3中所述之抗PGE2抗體2B5.7、2B5.8及 2B5.9之VH區與VL區的比對；及 圖9提供藉由MAS所量測之抗PGE2抗體、抗鼠類TNF抗 體及其組合在膠原蛋白誘發之關節炎模型中之功效（平均 關節炎計分）。 141568.doc 194·

Claims (1)

  1. 201014602 七、申請專利範圍： 1. 一種包含抗原結合域之CDR移植結合蛋白或其片段，該 結合蛋白能夠結合PGE2，該抗原結合域包含至少一個包 含選自由以下組成之群之胺基酸序列的CDR : GYTFTKYWLG(SEQ ID NO: 54) ' DIYPGYDYTHYNEKFKD (SEQ ID NO: 55)、SDGSSTY(SEQ ID NO: 56)、 TSSQNIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO: 57)、KVSNRFSG (SEQ ID NO: 58)、FQVSHVPYT(SEQ ID NO: 59)。 ® 2.如請求項1之結合蛋白，其中該結合蛋白或其片段能夠 調節前列腺素Ε2之生物功能。 3. 如請求項1之結合蛋白，其中該結合蛋白或其片段能夠 中和前列腺素Ε2。 4. 如請求項1之結合蛋白，其中該結合蛋白或其片段能夠 防止前列腺素Ε2與前列腺素Ε2受體ΕΡ1結合。 5. 如請求項1之結合蛋白，其中該結合蛋白或其片段能夠 防止前列腺素Ε2與至少一種選自由ΕΡ1、ΕΡ2、ΕΡ3及 ΕΡ4組成之群的前列腺素Ε2受體結合。 .. 6.如請求項1之結合蛋白，其中該結合蛋白或其片段結合 前列腺素Ε2，利用ELISA分析，具有選自由約1χ10_6至約 lxl(T7 Μ、約 1χ1〇-7 至約 1χ1〇-8 Μ、約 1χ10_8 至約 ΙχΙΟ·9 Μ、約 ΗΓ9至約 10_1G Μ、約 lxlO_1Q至約 1χ10_η Μ及約 10_11 至約10_12Μ組成之群的EC50。 7_如請求項1之結合蛋白，其中該結合蛋白或其片段抑制 由於前列腺素E2作用於前列腺素E2受體EP4後所誘發之 141568.doc 201014602 舞流入，以EP4受體介導之FLIPR分析，具有選自由約 1><1〇6至約1><1〇-71^、約1><1〇-7至約1><1〇-8]^、約1><1〇-8 至約 lM〇-9 Μ、約 ΙΟ·9至約 ΙΟ·10 Μ、約 lxl〇-10至約 lxlO—11 Μ及約1〇-π至約ι〇-ΐ2 μ組成之群的IC5〇。 8. 如請求項1之結合蛋白’其中該結合蛋白或其片段業經 親和力熟化。 9. —種包含抗原結合域之結合蛋白或其片段，該結合蛋白 月b夠結合前列腺素β2，該抗原結合域包含至少一個包含 選自由以下組成之群之胺基酸序列的CDR : SEQ ID NO: 6、7、8、10、11、12、14、15 ' 16、18、19、20、 22 、 23 、 26 、 27 、 28 、 30 、 31 、 32 、 34 、 35 、 37 、 38 、 39 、 54 、 55 、 56 、 57 、 58及59 。 10. —種包含抗原結合域之結合蛋白或其片段，該結合蛋白 能夠結合前列腺素E2，該抗原結合域包含至少一個包含 選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH區：SEQ ID NO: 5、13、21、25、33、40、42及 44。 11. 一種包含抗原結合域之結合蛋白或其片段，該結合蛋白 能夠結合前列腺素&，該抗原結合域包含至少一個包含 選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL區：SEQ ID NO: 9、17、24、29、36、41、43及45。 12. —種包含抗原結合域之人類化結合蛋白或其片段，該結 合蛋白能夠結合前列脉素E2，該抗原結合域包含至少— 個包含選自由SEQ ID NO: 54-59組成之群之胺基酸序列 的CDR區。 141368.doc -2 - 201014602 13. 如請求項9之結合蛋白，其中該結合蛋白包含至少3個 CDR。 14. 如請求項13之結合蛋白，其中該至少3個CDR係選自由 以下組成之群中選出的VH CDR組：SEQ ID NO: 6、7及 8 ; SEQ ID NO: 14、15及 16 ; SEQ ID NO: 14、22及 23 ; SEQ ID NO: 26、27及 28 ; SEQ ID NO: 26、34及 35 ;及 SEQ ID NO: 54、55及 56。 15. 如請求項13之結合蛋白，其中該至少3個CDR係選自由 以下組成之群中選出的VL CDR組：SEQ ID NO: 10、11 及 12 ; SEQ ID NO: 18、19及 20 ; SEQ ID NO: 30、31 及 32 ； SEQ ID NO: 37、38及 39 ; SEQ ID NO: 57、58、 59 ° 16. 如請求項13之結合蛋白，其中該至少3個CDR包含具有 SEQ ID NO: 54、55及56之胺基酸序列的VH CDR組及/或 具有SEQ ID NO: 57、58及59之胺基酸序列的VL CDR 組。 17. 如請求項9之結合蛋白，其中該結合蛋白包含至少兩個 可變域CDR組。 18. 如請求項17之結合蛋白，其中該至少兩個可變域CDR組 係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 6、7、8及SEQ ID NO: 10、11、12 ; SEQ ID NO: 14、15、16及 SEQ ID NO: 18、19、20 ; SEQ ID NO: 14、22、23 及 SEQ ID NO: 10、11、12 ; SEQ ID NO: 26、27、28 及 SEQ ID NO: 30、31、32 ; SEQ ID NO: 26、34、35 及 SEQ ID 141568.doc 201014602 NO: 37、38、39 ;及 SEQ ID NO: 54、55、56&SEQ ID NO: 57、58、59 〇 19. 一種與前列腺素Ez結合之人類化抗體或其片段，該人類 化抗體包含至少一個包含選自由以下組成之群之胺基酸 序列的 VH區：SEQ ID NO: 60、62、64、66、68、7〇、 72、 74、76、78及 80。 20. —種與前列腺素&結合之人類化抗體或其片段，該人類 化抗體包含至少一個包含選自由以下組成之群之胺基酸 序列的 VL 區：SEQ ID NO: 61、63、65、67、69、71、 73、 75、77、79及 81。 21. 如a青求項1之結合蛋白，其進一步包含人類受體構架。 22·如請求項21之結合蛋白，其中該人類受體構架包含至少 一個選自由 SEQ ID NO: 46、47、48、49、50、51、52及 53組成之群的胺基酸序列。 23_如请求項21或22之人類化抗體，其中該人類受體構架包 含至少一個選自由以下組成之群的構架區胺基酸取代： 在重鏈可變區中位置48之Μ(人類）取代為1(小鼠），位置 68之V(人類）取代為Α(小鼠），位置70之Μ(人類）取代為 L(小鼠），及位置72之Τ(人類）取代為V(小鼠）；及在輕鏈 可變區中位置2之1(人類）取代為ν(小鼠）及位置3之乂（人 類）取代為L(小鼠）。 24.如請求項19或20之人類化抗體，其中該至少一個vh區或 至少一個VL區包含含有至少一個胺基酸取代之人類受體 構架序列’其中該構架序列之胺基酸序列與該人類受體 141568.doc 201014602 構架序列之序列至少65%—致。 25. 如請求項23之人類化抗體，其中該人類受體構架在關鍵 殘基處包含至少一個構架胺基酸取代，該關鍵殘基係選 自由以下組成之群：與CDR相鄰之殘基、糖基化位點殘 基、稀有殘基、能夠與前列腺素E2相互作用之殘基、能 夠與CDR相互作用之殘基、典型殘基、重鏈可變區與輕 鏈可變區之間的接觸殘基、Vernier區内之殘基，及位於 Chothia界定之可變重鏈CDR1與Kabat界定之第一重鏈構 架之間重疊區域中的殘基。 26. 如請求項1之結合蛋白，其中該結合蛋白包含兩個可變 域，其中該兩個可變域具有選自由以下組成之群的胺基 酸序列：8丑(^10 1^0:5及8£()10>^0:9;8£(5 10]^0:13及 SEQ ID NO:17 ; SEQ ID N0:21 及 SEQ ID NO:24 ; SEQ ID NO:25 及 SEQ ID NO:29 ; SEQ ID NO:33 及 SEQ ID NO:36 ; SEQ ID NO:40及 SEQ ID NO:41 ; SEQ ID NO:42 及 SEQ ID NO:43 ;及 SEQ ID NO:44及 SEQ ID NO:45。 27. 如請求項1之結合蛋白，其中該結合蛋白包含兩個可變 域，其中該兩個可變域具有選自由以下組成之群的胺基 酸序列：SEQ ID NO:60及 SEQ ID NO:61 ; SEQ ID NO:62 及 SEQ ID ΝΟ··63 ; SEQ ID NO:64及 SEQ ID NO:65 ; SEQ ID NO:66及 SEQ ID NO:67 ; SEQ ID NO:68 及 SEQ ID NO:69 ; SEQ ID NO:70及 SEQ ID NO:71 ; SEQ ID NO:72 及 SEQ ID NO:73 ; SEQ ID NO:74及 SEQ ID NO:75 ; SEQ ID NO:76 及 SEQ ID NO:77 ; SEQ ID NO:78 及 SEQ ID 141568.doc 201014602 NO:79 ;及 SEQ ID NO:80及 SEQ ID ΝΟ·8卜 28. —種包含如請求項1之結合蛋白之抗體構築體，該抗體 構築體進一步包含連接子多肽或免疫球蛋白恆定域。 29·如請求項28之抗體構築體’其中該結合蛋白係選自由以 下組成之群：免疫球蛋白分子、經雙硫鍵連接之Fv、單 株抗體、scFv、嵌合抗體、單域抗體、CDR移植抗體、 雙功能抗體、人類化抗體、多特異性抗體、Fab、雙重 特異性抗體、Fab，、雙特異性抗體、F(ab，）2及Fv。 30. 如請求項28之抗體構築體，其中該結合蛋白包含選自由 以下組成之群的重鏈免疫球蛋白恆定域：人類IgM恆定 域、人類IgG4恆定域、人類IgG1恆定域、人類IgE恆定 域、人類IgG2怪定域，及人類igG3恒定域，及人類igA 恆定域。 31. 如請求項28之抗體構築體，其中該構築體包含具有選自 由SEQ ID NO 1-4組成之群之胺基酸序列的免疫球蛋白 恆定域。 32. 如請求項28之抗體構築體，其中該結合蛋白具有人類糖 基化型態。 33. 如請求項28之抗體構築體，其中該抗體構築體為結晶化 抗體構築體。 34. 如請求項33之抗體構築體，其中該結晶化抗體構築體為 無載劑之醫藥控制釋放結晶化抗體構築體。 35. 如請求項34之抗體構築體，其中該抗體構築體相較該抗 體構築體可溶性對應物在活體内具有較長之半衰期。 141568.doc 201014602 參 3 6.如凊求項34之抗體構築體，其中該抗體構築體保留生物 活性。 37. 一種包含如請求項28之抗體構築體之抗體結合物，該抗 體結合物進一步包含選自由免疫黏附分子、顯影劑、治 療劑及細胞毒性劑組成之群的藥劑。 38. 如請求項37之抗體結合物，其中該藥劑為選自由放射性 標記、酵素、螢光標記、冷光標記、生物冷光標記、磁 性標記及生物素組成之群的顯影劑。 39. 如請求項37之抗體結合物，其中該顯影劑為選自由$ 14^. n “ Ο s Y、"Tc、丨、、1251、⑴卜 mLu、ι“Η〇及 組成之群的放射性標記。 40. 如請求項37之抗體結合物，其中該藥劑為選自由抗代謝 物、烷基化劑、抗生素、生長因子、細胞激素、抗血管 生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環黴素（anthracycline)、毒素 及細胞阔亡劑組成之群的治療劑或細胞毒性劑。 41. 如叫求項1之結合蛋白，其中該結合蛋白為結晶化結合 蛋白。 C S 153, 42. 如請求項41之結合蛋白，其中該結晶化結合蛋白為無栽 劑之醫藥控制釋放結晶化抗體。 43. —種經分離核酸’其編碼如請求項1之結合蛋白。 44. 一種經分離核酸’其編碼如請求項28之抗體構築體。 45. 種載體，其包含如請求項43或44之經分離核酸。 46. 如請求項45之載體，其中該載體係選自由pcDNA、 pTT、PTT3、pEFBOS、PBV、PJV、pBJ及 pA2 組成之 141568.doc 201014602 群。 47. —種宿主細胞，其包含如請求項μ之載體。 48. 如靖求項47之宿主細胞，其中該宿主細胞為原核細胞。 49. 如請求項48之宿主細胞，其中該宿主細胞為大腸桿菌⑺. coli)。 50. 如請求項47之宿主細胞，其中該宿主細胞為真核細胞。 5 1 ·如請求項50之宿主細胞，其中該真核細胞係選自由原生 生物細胞、動物細胞、植物細胞及真菌細胞組成之群。 52. 如请求項50之宿主細胞，其中該真核細胞為選自由哺乳 動物細胞、禽類細胞及昆蟲細胞組成之群的動物細胞。 53. 如請求項50之宿主細胞，其中該宿主細胞為CH〇細胞。 54. 如請求項50之宿主細胞，其中該宿主細胞為c〇s* HEK293。 55. 如請求項50之宿主細胞，其令該宿主細胞為酵母細胞。 56. 如請求項55之宿主細胞，其中該酵母細胞為釀酒酵母 57. 如請求項47之宿主細胞，其中該宿主細胞為昆蟲Sf9細 胞。 58. —種產生能夠結合前列腺素E2之蛋白質的方法該方法 包含在足以產生能夠結合前列腺素E2之結合蛋白之條件 下，在培養基中培養如請求項47之宿主細胞的步驟。 59. —種蛋白質，其係根據如請求項58之方法產生。 60. —種釋放結合蛋白之組合物，該組合物包含· (a)調配物，其中該調配物包含如請求項41之結晶化結 141568.doc • 8- 201014602 合蛋白， (b) 成分；及 (c) 至少一種聚合載劑。 61 _如請求項60之組合物，其中該聚合載劑為選自由以下組 成之群的聚合物：聚（丙烯酸）、聚（氰基丙烯酸酯）、聚 (胺基酸）、聚（酐）、聚（縮肽）、聚（酯）、聚（乳酸）、聚（乳 酸-共-乙醇酸）或PLGA、聚（b-羥基丁酸酯）、聚（己内 SI)、聚（二氧環己酮）、聚（乙二醇）、聚（（羥丙基）甲基丙 稀醯胺）、聚[(有機）磷氮烯]、聚（原酸酯）、聚（乙烯醇）、 聚（乙烯吡咯啶酮）、順丁烯二酸酐-烷基乙烯基醚共聚 物、氧化異丙烯多元醇類、白蛋白、海藻酸鹽、纖維素 及纖維素衍生物、膠原蛋白、血纖維蛋白、明膠、玻尿 酸、募醣、甘胺基聚糖、硫酸多醣，及其摻合物及/或共 聚物。 62·如請求項6〇之組合物，其中該成分係選自由白蛋白蔗
    糖、海藻糖、乳糖醇、明膠、羥丙基_β_環糊精、甲氧美 聚乙二醇及聚乙二醇組成之群。 63. —種如請求項6〇之組合物之用途其係用於製造治療串、 有則列腺素Ε2活性有害之病症之哺乳動物的藥物。 64. 種醫藥組合物，其包含如請求項1之結合蛋白及醫蘊 學上可醫樂 65. 如叫求項64之醫藥組合物，其中該醫藥學上可接 ::有作為用於增加該結合蛋白之吸收或分散 功能。 刮I 141568.doc 201014602 66. 67. 68. 69. 70. 71. 如明求項65之醫藥組合物，其中該佐劑為玻尿酸酶。 如請求項64之醫藥組合物，其進一步包含至少一種用於 治療前列腺素E2活性有害之病症的額外治療劑。 如明求項67之醫藥組合物，其中該額外藥劑係選自由以 下組成之群：治療劑、顯影劑、細胞毒性劑、血管生成 抑制劑、激酶抑制劑、共刺激分子阻斷劑、黏附分子阻 斷劑、抗細胞激素抗體或其功能片段、甲胺喋呤 (〇trexate)、環抱黴素（cyclosporine)、雷帕黴素 (rapamycin)、FK5〇6、可偵測標記或報導體、TNF拮抗碜 劑抗風濕藥、肌肉鬆弛劑、麻醉藥、非類固醇消炎藥 (AID)止痛劑、麻醉劑、鎮靜劑、局部麻醉劑、神 、·二肌肉阻斷劑、抗微生物劑、抗牛皮癬藥、皮質類固 醇同化類固醇、紅血球生成素、免疫劑、免疫球蛋 白免疫抑制劑、生長激素、激素替代藥物、放射性藥 〇〇抗抑鬱劑、抗精神病藥物、興奮劑、哮喘藥物、β 促效劑、吸入類固醇、口服類固醇、腎上腺素或其類似 物、細胞激素及細胞激素拮抗齊J。 ❹ -種降低前列腺素Ε2活性之活體外方法，該方法包含使 月J歹]腺素Ε2與如請求項1之結合蛋白接觸，以使得前列 腺素Ε2活性降低之步驟。 一 種如请求項1之結合蛋白之用途’其係用於製造降低 罹刚列腺素Ε2活性有害之病症之人類個體中前列腺素 Ε2活性的藥物。 種如请求項1之結合蛋白之用途，其係用於製造治療 141568.doc -10* 201014602 個體之至少一種前列腺素E2活性有害之疾病或病症的藥 物。
    72.如請求項71之用途，其中該病症係選自由以下組成之 群.自體免疫疾病、發炎性疾病、腫瘤、類風濕性關節 炎、過敏性關節炎、格_巴氏症候群(Guillain如⑽ syndrome)、感染性單核白血球增多症、病毒性淋巴腺 病、疱疹病毒感染、多發性硬化症、脫髓鞘疾病、血液 病、溶金性貧血、血小板減少症、内分泌病症、糖尿 病、艾迪森氏病（Addison's disease)、特發性副甲狀腺低 能症、慢性淋巴細胞性f狀腺炎、膠原蛋白病變、全身 性紅斑狼瘡症、生殖障礙、閉經、不孕症、反覆性流 產、：厥、頭頸部腫瘤、肺癌、胃癌、前列腺癌、胰腺 癌、胃腸H官疾病、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎克隆 氏病（Crohn's diSease)、疼痛、與骨關節炎有關之疼痛、 眼病及年齡相關之黃斑退化。 73·如請求項71之用途，其中該病症係選自由以下組成之 群：類風濕性關節炎、骨關節炎、青少年慢性關節炎、 膿毒性關節炎、萊姆關節炎(Lyme讀她)、牛皮癣性 關節炎、反應性關節炎、脊椎關節病、全身性紅斑狼瘡 症、克隆氏病、潰瘍性結腸炎、發炎性腸病、胰島素依 賴性糖尿病、甲狀腺炎、哮喘'過敏性疾病、牛皮癖、 皮膚炎性硬皮病、移植物抗宿主疾病、器官移植排斥反 應、與器官移植有關之急性或慢性免疫疾病、肉狀瘤 病、動脈粥樣硬化、散播性血管内凝五、川崎氏病 141568.doc 201014602 (Kawasaki's disease)、格雷夫氏病（Grave’s disease)、腎 病症候群、慢性疲勞症候群、華格納氏肉芽病 (Wegener’s granulomatosis)、亨偌-絲奇恩賴紫癜 (Henoch-Schoenlein purpurea)、腎臟之微觀脈管炎、慢 性活動型肝炎、葡萄膜炎、敗血性休克、中毒性休克症 候群、腹毋病症候群、惡病質、感染性疾病、寄生蟲 病、後天免疫缺乏症候群、急性橫貫性脊趙炎、亨廷Φ貝 氏舞蹈病（Huntington's chorea)、帕金森氏病（Parkins〇n，s disease)、阿效海默氏病（Alzheimer’s disease)、中風、原 發性膽汁性肝硬化、溶血性貧血、惡性疾病、心臟衰 竭、心肌梗塞、艾迪森氏病、偶發性I型多腺低減及Η型 多腺低減、史密特氏症候群（Schmidt’s syndrome)、成人 (急性）呼吸窘迫症候群、禿頭症、斑禿、血清陰性關節 病、關Sp病、萊特爾氏病（Reiter's disease)、牛皮癖性關 節病、潰瘍性結腸炎性關節病、腸病性滑膜炎、披衣 菌、耶氏桿菌（yersinia)及沙門氏菌（salmonella)相關之關 節病、脊椎關節病、動脈粥樣化病/動脈硬化症、特異體 質過敏症、自體免疫性水皰病、尋常天疱瘡、落葉狀天 疱瘡、類天疱瘡、線狀IgA病、自體免疫性溶血性貧 血、庫氏试驗％性溶血性貧血（Coombs positive haemolytic anaemia)、後天惡性貧血、青少年惡性貧 血、肌痛性腦炎/皇家自由病（Royal Free Disease)、慢性 皮膚黏膜念珠菌病、巨細胞動脈炎、原發性硬化性肝 炎、隱源性自體免疫性肝炎、後天免疫缺乏疾病症候 141568.doc •12· 201014602
    群、後天免疫缺乏相關疾病、B型肝炎、c型肝炎、普通 易變型免疫缺乏（普通易變型低丙球蛋白血症）、擴^性 心肌病、女子不孕症、印巢功能衰竭、印巢早衰、纖維 化肺病、隱源性致纖維性肺泡炎、發炎後間質性肺病、 間質性肺炎、結締組織病相關之間質性肺病、混合結締 組織病相關之肺病、全身性硬化症相關之間質性肺病、 類風濕性關節炎相關之間質性肺病、全身性紅斑狼瘡症 相關之肺病、皮肌炎/多肌炎相關之肺病、休格連氏病相 關之肺病（Sjagren’s disease associated lung 心咖）、關 :黏連性脊椎炎相關之肺病、脈管炎性彌漫性肺病、血 黃素沈積症相關之肺病、藥物誘發之間質性肺病、纖維 化、放射性纖維化、閉塞性細支氣管炎、慢性嗜伊紅血 球性肺炎、淋巴細胞浸潤性肺病、感染後間質性肺病、 痛風性關節炎、自體免疫性肝炎、丨型自體免疫性肝炎 (經典自體免疫或類狼瘡性肝炎）、2型自體免疫性肝炎 (抗LKM抗體肝炎）、自體免疫介導之低血糖症、B型胰 島素抗性伴發黑色棘皮病、副曱狀腺低能症、與器官移 植有關之急性免疫疾病、與器官移植有關之慢性免疫疾 病、非炎性骨關節病、原發性硬化性膽管炎、】型牛皮 癬、2型牛皮癣、特發性白血球減少病、自體免疫性嗜 =性球減少症、腎病NOS、腎小球腎炎、腎臟之微觀脈 管炎、萊姆病（lyme disease)、盤狀紅斑狼瘡、特發性男 性不孕症或NOS、精子自體免疫、多發性硬化症（所有次 型）、交感性眼炎、結締組織病繼發之肺性高血壓、古巴 141568.doc -13- 201014602 士德氏症候群（Goodpasture's syndrome)、結節性多動财 炎之肺部表現、急性風濕熱、類風濕性脊椎炎、斯蒂爾 病（Still’s disease)、全身性硬化症、休格連氏症候群、 尚安氏病（Takayasu’s disease)/動脈炎、自體免疫性血^ 板減少症、特發性血小板減少症、自體免疫性甲狀腺 病、甲狀腺機能亢進症、甲狀腺腫性自體免疫性曱狀腺 低能症（橋本氏病（Hashimoto's disease))、萎縮性自體免 疫性甲狀腺低能症、原發性黏液水腫、晶狀體源性葡萄 膜炎、原發性脈管炎、白斑病急性肝病、慢性肝病、酒 精性肝硬化、酒精誘發之肝損傷、膽汁淤積、特質性肝 病 '藥物誘發之肝炎、非酒精性脂肪變性肝炎、過敏症 及哮喘' B族鏈球菌（GBS)感染、精神障礙（例如抑鬱症 及精神分裂症）、Th2型及Thl型介導之疾病、急性及慢 性疼痛（不同形式之疼痛）、及諸如肺癌、乳癌、胃癌、 膀胱癌、結腸癌、騰腺癌、卵巢癌、前列腺癌及直腸癌 之癌症及造血系統惡性疾病（白血病及淋巴瘤）、無β脂蛋 白血症、手足發紺、急性及慢性寄生或感染過程、急性 白血病、急性淋巴母細胞白血病（all)、急性骨趙白血 病（AML)、急性或慢性細菌感染、急性胰腺炎、急性腎 衰竭、腺癌、心房異位搏動、AIDS癡呆複合症、酒精誘 發之肝炎、過敏性結膜炎、過敏性接觸性皮膚炎、過敏 性鼻炎、同種異體移植排斥反應、α-1 _抗胰蛋白酶缺 乏、肌肉萎縮性側索硬化、貧血、心絞痛、前角細胞退 化、抗cd3療法、抗構脂症候群、抗受體過敏反應、主 141568.doc 14 201014602 動脈及周圍動脈瘤、主動脈剝離、動脈性高血壓、動脈 硬化症、動靜脈瘺、共濟失調、心房微顫（持續性或陣發 性）、心房撲動、房室傳導阻滯、B細胞淋巴瘤、骨移植 物排斥反應、骨髓移植（BMT)排斥反應、束枝傳導阻 滯、伯基特淋巴瘤（Burkitt’s lymphoma)、燒傷、心律不 整、心臟頓抑症候群、心臟腫瘤、心肌病、心肺分流發 炎反應、軟骨移植排斥反應、小腦皮質退化、小腦病 _ 症、紊亂性或多源性房性心動過速、與化學療法有關之 病症、慢性髓細胞白血病（CML)、慢性酒精中毒、慢性 發炎性病變、慢性淋巴細胞性白血病（CLl)、慢性阻塞 性肺病（COPD)、慢性水楊酸中毒、結腸直腸癌、充血性 心臟衰竭、結膜炎、接觸性皮膚炎、肺原性心臟病、冠 狀動脈疾病、庫賈氏病（Creutzfeldt-Jakob disease)、培 養物陰性敗血症、囊腫性纖維化、細胞激素療法相關之 病症、拳擊員癡呆、脫髓鞘疾病、登革出血熱（dengue ❿ hemorrhagic fever)、皮膚炎、皮膚病病狀、糖尿病 (diabete)、糖尿病（diabetes mellitus)、糖尿病性動脈硬 化病、泛發性路易體疾病（Diffuse Lewy body disease)、 擴張型充血性心肌病、基底神經節病症、中年唐氏症候 群（Down’s Syndrome in middle age)、由阻斷CNS多巴胺 受體之藥物誘發的藥物誘發之運動障礙、藥物敏感、濕 疹、腦脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、會厭炎、EB病毒 感染（epstein-barr virus infection)、肢端紅痛症、錐體外 及小腦病症、家族性噬血性淋巴組織細胞增殖症、胚胎 141568.doc 15 201014602 胸腺移植排斥反應、弗立特里希氏共濟失調（Friecjreich's ataxia)、功能性周圍動脈病症、真菌性敗血症、氣性壞 疽、胃潰瘍、腎小球腎炎、任何器官或組織的移植物排 斥反應、革蘭氏陰性敗血症、革蘭氏陽性敗血症、胞内 生物體引起之肉芽腫、毛細胞白血病、哈勒沃登_施帕茨 病（Hallerrorden-Spatz disease)、喬本氏甲狀腺炎 (hashimoto’s thyroiditis)、花粉熱、心臟移植排斥反應、 血色素沈著症、血液透析、溶血性尿毒癥候群/溶栓性血 小板減少性紫癜、出▲_、肝炎（a)、希氏束心律不整（His bundle arrythmias)、HIV感染/HIV神經病、霍奇金病 (Hodgkin’s disease)、運動過度病症、過敏反應、過敏性 肺炎' 南血壓、運動功能減退病症、下丘腦-垂體-腎上 腺轴評估、特發性艾迪森氏病、特發性肺纖維化、抗體 介導之細胞毒性、無力、嬰兒脊髓性肌萎縮症、主動脈 發炎、a型流感、電離輻射曝露、虹膜睫狀體炎/葡萄膜 炎/視神經炎、缺血再灌注損傷、缺血性中風、青少年類 風濕性關節炎、青少年脊髓性肌萎縮症、卡波西氏肉瘤 (Kaposi’s sarcoma)、腎臟移植排斥反應、退伍軍人桿菌 (legionella)、利什曼體病（ieishmaniasis)、麻風病、皮質 脊髓系統病變、脂性水腫、肝移植排斥反應、淋巴水 腫、癔疾、惡性淋巴瘤、惡性組織球病、惡性黑素瘤' 腦膜炎、腦膜炎球菌血症、代謝性/特發性偏頭痛、粒線 體複合系統病症、混合結締組織病、單株球蛋白症、多 Shi· 發性骨越瘤、多系統退化（Mencel Dejerine-Thomas 141568.doc -16- 201014602 Drager及Machado-Joseph)、重症肌無力、胞内鳥型分枝 桿菌（mycobacterium avium intracellulare)、結核分枝桿 菌（mycobacterium tuberculosis)、骨髓發育不良症候群、 心肌梗塞、心肌缺血病症、鼻咽癌、新生兒慢性肺病、 腎炎、腎病、神經退化性疾病、I型神經性肌肉萎縮、中 性白血球減少性發熱、非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkins lymphoma)、腹主動脈及其分支堵塞、阻塞性動脈病 症、〇kt3療法、睪丸炎/副睪丸炎、睪丸炎/輸精管切除 逆轉程序、内臟增大、骨質疏鬆症、胰腺移植排斥反 應、胰腺癌、腫瘤相關症候群/惡性高血鈣症、副甲狀腺 移植排斥反應、盆腔發炎性疾病、常年性鼻炎、心包疾 病、周圍動脈粥樣硬化疾病、周圍企管疾病、腹膜炎、 惡性貧血、卡氏肺囊蟲肺炎（pneumocystis carinii pneumonia)、肺炎、POEMS症候群（多發性神經病、内臟 增大、内分泌病、單株球蛋白症及換膚症候群）、灌注後 症候群、泵後症候群、MI心切開術後症候群、先兆驚 厥、進行性核上性麻痒、原發性肺性高血壓、放射療 法、雷諾現象（Raynaud's phenomenon)及疾病、雷諾病、 雷夫蘇姆氏病（Refsum's disease)、規則狹窄QRS心動過 速、腎血管性高血壓、再灌注損傷、限制型心肌病、肉 瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、路易體型老年癡呆（Senile Dementia of Lewy body type)、血清陰性關節病、休克、 鐮形細胞性貧血、皮膚同種異體移植排斥反應、換膚症 候群、小腸移植排斥反應、實體腫瘤、特異性心律不 141568.doc -17- 201014602 整、脊髓性共濟失調、脊髓小腦退化、鏈球菌肌炎、小 腦結構病變、亞急性硬化泛腦炎、昏厥、心血管系統梅 毒、全身性過敏、全身性發炎反應症候群、全身發作型 青少年類風濕性關節炎、T細胞或FAB ALL、毛細管擴 張、jk栓閉塞性血管炎、血小板減少症、中毒、移植、 外傷/出血、III型過敏反應、IV型過敏、不穩定型心絞 痛、尿毒癥、尿膿毒病、蓴麻疹、心臟瓣膜病、靜脈曲 張、脈管炎、靜脈疾病、靜脈栓塞、心室纖維性顫動、 病毒及真菌感染、病毒性腦炎/無菌性腦膜炎、病毒相關 之嗟血症候群、韋尼克-科爾薩科夫症候群（Wemicke- Korsakoff syndrome)、威爾遜氏病（Wilson’s disease)、任 何器官或組織的異種移植物排斥反應、急性冠狀動脈症 候群、急性特發性多發性神經炎、急性發炎性脫髓鞘性 多神經根神經病、急性缺血、成人斯蒂爾病（Adult Still’s Disease)、斑禿、過敏症、抗磷脂抗體症候群、再 生不全性貧血、動脈硬化症、特應性濕疹、異位性皮膚 炎、自體免疫性皮膚炎、與鍵球菌感染有關之自體免疫 病症、自體免疫性腸病、自體免疫性聽力損失、自身免 疫性淋巴增生性症候群（ALPS)、自體免疫性心肌炎、自 體免疫性卵巢早衰、瞼炎、支氣管擴張、大皰性類天疱 瘡、心血管疾病、災難性抗磷脂症候群、乳糜瀉、頸椎 關節黏連、慢性缺血、瘢痕性類天疱瘡、具有多發性硬 化症風險之臨床孤立症候群（CIS)、結膜炎、兒童期初發 型精神異常、慢性阻塞性肺病（COPD)、淚囊炎、皮肌 141568.doc 201014602 炎、糖尿病性視網膜病變、糖尿病、椎間盤突出症、盤 脫垂、藥物誘發之免疫性溶血性貧血、心内膜炎、子宮 内膜異位、眼内炎、上鞏膜炎、多形性紅斑、重症多形 性紅斑、妊娠期類天疱瘡、格_巴二氏症候群（GuiUain_ BaW Syndr〇me)(GBS)、花粉熱、休斯症候群（仙钟“ ' Syndr〇me)、特發性帕金森氏病、特發性間質性肺炎、 - igE介導之過敏症、免疫性溶血性貧血、包涵體肌炎、 φ 感染性眼部發炎疾病、發炎性脫髓鞘疾病、發炎性心臟 病、發炎性腎病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、乾眼症、 庫斯病（KUssmaul disease)或庫斯 _ 麥爾病（Kussmaui_ Meier Disease)、蘭德里麻痺（Landry，s paraiys⑷朗格 漢氏細胞組織球病（Langerhan，s Cell Histi〇cyt〇sis)、網 狀青斑、黃斑變性、顯微性多血管炎、白赫鐵列夫症 (M〇rbus Bechterev)、運動神經元病症黏膜類天疱瘡、 多器官衰竭、重症肌無力、骨髓發育不良症候群、心肌 〇 炎、神經根病症、神經病、非A非B型肝炎、視神經炎、 骨質溶解、少關節型青少年類風濕性關節炎 (PaUCiarticular JRA)、周圍動脈閉塞性疾病（pA〇D)、周 圍也管疾病（PVD)、周圍動脈疾病（pAD)、靜脈炎、結節 性多動脈炎（或結節性動脈周圍炎）、多軟骨炎、風濕性 多肌痛、白髮症、多關節型jrRA、多發性内分泌缺之症 候群、多發性肌炎、風濕性多肌痛（PMR)、泵後症候 群、原發性帕金森氏症、前列腺炎、純紅細胞發育不 全原發性腎上腺機能不全、復發性視神經脊髓炎、再 14I568.doc 19 201014602 狹窄、風濕性心臟病、SAPHO(滑膜炎、痤瘡、膿皰 病、骨肥厚及骨炎）、硬皮病、繼發性澱粉樣變性病、休 克肺、鞏膜炎、坐骨神經痛、繼發性腎上腺機能不全、 聚矽氧相關之結締組織疾病、角層下膿皰性皮膚病 (Sneddon-Wilkinson Dermatosis)、關節黏連性脊椎炎、 帝文生氏-強生症候群（SJS)、全身性發炎反應症候群、 顳動脈炎、弓形蟲性視網膜炎、中毒性表皮壞死溶解、 橫貫性脊髓炎、TRAPS(腫瘤壞死因子受體）、1型過敏反 應、II型糖尿病、蓴麻疹、尋常性間質肺炎（UIP)、脈管 炎、春季結膜炎、病毒性視網膜炎、沃格特-小柳-原田 症候群（Vogt-Koyanagi-Harada syndrome)(VKH症候群）、 濕式黃斑變性及傷口癒合。 74. —種如請求項1之結合蛋白之用途，其係用於製造治療 罹患前列腺素E2有害之病症之患者的藥物，其中該藥物 係在投與第二藥劑之前、同時或之後投與，其中該第二 藥劑係選自由以下組成之群··選自由以下組成之群的類 風濕性關節炎或青少年類風濕性關節炎藥物：甲胺喋 吟、來氟米特（leflunomide)、低劑量皮質類固醇、普賴 蘇（prednisone)、皮質酮（cortisone)、抗癔疾藥物經基氯 化奎寧（hydroxychloroquine)、金、柳氮續胺°比咬 (sulfasalazine)、青黴胺（penicillamine)、環鱗酿胺 (cyclophosphamide)、環孢黴素、二甲胺四環素 (minocycline)、乙醯胺苯盼（acetaminophen)、阿司匹靈 (aspirin)、布洛芬（ibuprofen)、萘普生（naproxen)、賽利 141568.doc -20- 201014602 克西（celeeoxib)、英利昔單抗（Infliximab)、依那西普 (etanercept)、阿達木單抗（adalimumab)、阿巴西普 (abatacept)、利妥昔單抗（rituximab)、阿那白滞素 (anakinra)、靶向 IL-6、IL-6R、IL-17、IL-18、IL-23 及 B7.1/B7.2之生物劑及經口傳遞藥劑；選自由以下組成之 群的骨關節炎藥物：乙醯胺苯酚、阿司匹靈、布洛芬、 萘普生、赛利克西、類固醇、人造關節液欣維可 (synvisc)及膝爾康（hyalgan);選自由以下組成之群的克 隆氏病藥物：阿達木單抗、咪唾硫嗓吟錠（azasan)、阿 薩克（asacol)、硫唑嘌呤（azathioprine)、績胺塞拉金 (azulfidine)、布地縮松（budesonide)、依託科特 (entocort)、滅滴靈（Hagyl)、移護寧（imuran)、英利昔單 抗、疏嘌吟 （mercaptopurine)、 甲确建 《坐 (metronidazole)、普洛托斯他（protostat)、疏基嗓吟 (purinethol)、瑞米卡德（remicade)及柳氮磺胺吡啶；選 自由以下組成之群的關節黏連性脊椎炎藥物：阿西脫克 (acetocot)、乙醯水楊酸、阿卡普林81 (acuprin 81)、阿達 木單抗、阿立伏（aleve)、阿姆闊（amcort)、阿那普西 (anaprox)、阿瑞斯托闊（aristocort)、阿司匹靈、阿斯皮 塔（aspirtab)、阿紮馬闊（azmacort)、百服寧（bufferin)、 巴福克斯（buffex)、凱扶蘭（cataflam)、西樂葆 (celebrex)、速免痛（clinoril)、皮質酮、雙氣芬酸 (diclofenac)、地泊坦（dipentum)、艾斯普林（easprin)、依 那西普、0引〇朵辛（indocin)、π弓丨°朵美辛（indomethacin)、英 141568.doc •21 · 201014602 利昔單抗、萘普生、瑞米卡德、曲安西龍 (triamcinolone)及服他寧（voltaren);選自由以下組成之 群的多發性硬化症藥物：阿凡尼西（Avonex)、°米唾硫嗓 呤錠、硫唑嘌呤、倍泰龍（Betaseron)、布比普瑞（Bubbli-Pred)、克帕松（Copaxone)、扣托隆（Cotolone)、格拉默 (Glatiramer)、移護寧、干擾素β-la、干擾素β-lb溶液、 凱普瑞（Key-Pred)、凱普瑞SP(Key-Pred SP)、米托蒽醌 (Mitoxantrone)、那他珠單抗（Natalizumab)、那凡曲隆 (Novantrone)、奥拉普德（Orapred)、奥拉普德ODT、培 地普德（Pediapred)、普瑞傑特50(Pred-Ject-50)、普瑞達 闊 50(Predacort 50)、普瑞達龍50(Predalone 50)、普瑞德 特 50(Predate-50)、潑尼龍（Prednisolone)、普瑞隆 (Prelone)、利比（Rebif)及泰沙比瑞（Tysabri);選自由以 下組成之群的癌症或惡性疾病藥物：阿百先 (Abraxane)、阿德力黴素（Adriamycin)、阿杜西 (Adrucil)、艾達樂（Aldara)、阿儉單抗（Alemtuzumab)、 力比泰（Alimta)、胺基乙酿丙酸、安美達錄: (Anastrozole)、阿瑞匹坦（Aprepitant)、瑞寧德 (Arimidex)、阿諾新（Aromasin)、阿余恩（Arranon)、三氧 化二神、阿瓦斯汀（Avastin)(貝伐單抗（Bevacizumab))、 阿紮胞苷（Azacitidine)、貝伐單抗、搭薩羅丁 (Bexarotene)、硼替佐米（Bortezomib)、坎帕斯 (Campath)(阿儉單抗）、坎普托斯塔（Camptosar)(鹽酸伊 立替康（Irinotecan Hydrochloride))、卡培他濱 141568.doc -22- 201014602 (Capecitabine)、卡翻（Carboplatin)、西妥昔單抗 (Cetuximab)、順翻（Cisplatin)、卡拉芬（Clafen)(環磷酿 胺）、氣伐拉濱（Clofarabine)、科洛法瑞（Clofarex)(氯伐 拉濱）、科羅拉（Clolar)(氣伐拉濱）、環磷醯胺、阿糖胞苷 (Cytarabine)、賽德薩-U(Cytosar-U)(阿糖胞苷）、賽托先 (Cytoxan)(環填酿胺）、達珂（Dacogen)(地西他濱 (Decitabine))、達沙替尼（Dasatinib)、地西他濱、蒂潑西 (DepoCyt)(脂質阿糖胞苷）、蒂潑福馬（DepoFoam)(脂質 阿糖胞苷）、鹽酸右雷佐生（Dexrazoxane Hydrochloride)、多西他賽（Docetaxel)、多昔（Doxil)(鹽 酸多柔比星脂質體（Doxorubicin Hydrochloride Liposome))、鹽酸多柔比星、鹽酸多柔比星脂質體、 Dox-SL(鹽酸多柔比星脂質體）、艾福德（Efudex)(氟尿嘧 咬（Fluorouracil))、艾倫斯（Ellence)(鹽酸表柔比星 (Epirubicin Hydrochloride))、樂沙定（Eloxatin)(奥沙利銘 (Oxaliplatin))、艾蒙德（Emend)(阿瑞匹坦）、鹽酸表柔比 星、愛必妥（Erbitux)(西妥昔單抗）、鹽酸埃羅替尼 (Erlotinib Hydrochloride)、艾伐昔特（Evacet)(鹽酸多柔 比星脂質體）、艾維斯達（Evista)(鹽酸雷洛昔芬 (Raloxifene Hydrochloride))、依西美坦（Exemestane)、 伐斯洛德（Faslodex)(氟維斯群（Fulvestrant))、非馬拉 (Femara)(來曲唾（Letrozole))、氟洛普雷（Fluoroplex)(氟 尿嘧啶）、氟尿嘧啶、氟維斯群、吉非替尼（Gefitinib)、 鹽酸吉西他濱（Gemcitabine Hydrochloride)、吉妥單抗奥 141568.doc -23- 201014602 0坐米星（Gemtuzumab Ozogamicin)、徤擇（Gemzar)(鹽酸 吉西他濱）、格列衛（Gleevec)(曱項酸伊馬替尼（Imatinib Mesylate))、 赫赛汀（Herceptin)(曲妥珠單抗 (Trastuzumab))、和美新（Hycamtin)(鹽酸拓撲替康 (Topotecan Hydrochloride))、甲續酸伊馬替尼、咪啥莫 特（Imiquimod)、易瑞沙（Iressa)(吉非替尼）、鹽酸伊立替 康、伊沙匹隆（Ixabepilone)、埃坡黴素（Ixempra)(伊沙匹 隆（Ixabepilone))、克奥昔芬（Keoxifene)(鹽酸雷洛昔 芬）、克皮凡昔（Kepivance)(帕麗非明（Palifermin))、二甲 苯續酸拉帕替（Lapatinib Ditosylate)、來那度胺 (Lenalidomide)、來曲嗅、雷戊蘭（Levulan)(胺基乙醯丙 酸）、立波杜（LipoDox)(鹽酸多柔比星脂質體）、脂質阿糖 胞苦、美賽哇斯通（Methazolastone)(替莫。坐胺 (Temozolomide))、美洛沙（Mylosar)(阿紮胞苷）、麥羅塔 (Mylotarg)(吉妥單抗奥唑米星）、奈米粒子太平洋紫杉醇 (Paclitaxel)(太平洋紫杉醇白蛋白穩定化奈米粒子調配 物）、奈拉濱（Nelarabine)、尼奥沙（Neosar)(環構酿胺）、 多吉美（Nexavar)(甲苯磺酸索拉非尼（Sorafenib Tosylate))、尼羅替尼（Nilotinib)、諾瓦得士 (Nolvadex)(檸檬酸他莫昔芬（Tamoxifen Citrate))、恩卡 斯巴（Oncaspar)(培門冬酶（pegaspargase))、奥沙利銘、 太平洋紫杉醇、太平洋紫杉酵白蛋白穩定化奈米粒子調 配物、帕麗非明（Palifermin)、帕尼單抗（Panitumumab)、 帕拉普拉（Paraplat)(卡鉑）、伯爾定（Paraplatin)(卡鉑）、 141568.doc -24- 201014602 培門冬酶、培美曲 塞二納（Pemetrexed Disodium)、帕拉 提諾-AQ(Platinol-AQ)(順麵）、帕拉提諾（Platinol)(順 鉑）、鹽酸雷洛昔芬、雷利米得（Revlimid)(來那度胺）、 美羅華（Rituxan)(利妥昔單抗（Rituximab))、利妥昔單 抗、司蘭索胸膜内氣溶膝（Sclerosol Intrapleural Aerosol)(滑石粉）、甲苯磺酸索拉非尼、撲瑞賽 (Sprycel)(達沙替尼）、無菌滑石粉（滑石粉）、斯特瑞托克 (Steritalc)(滑石粉）、蘋果酸舒尼替尼（Sunitinib Malate)、舒坦特（Sutent)(蘋果酸舒尼替尼）、赛諾維 (Synovir)(沙立度胺（Thalidomide))、滑石粉、檸檬酸他 莫昔芬、塔拉賓PFS(Tarabine PFS)(阿糖胞苷）、特羅凯 (TarCeva)(鹽酸埃羅替尼）、塔革雷汀（Targretin)(蓓薩羅 丁（Bexarotene))、塔赛格納（Tasigna)(尼羅替尼）、紫杉盼 (Taxol)(太平洋紫杉醇）、泰素帝（Tax〇tere)(多西他赛）、 替莫達（Temodar)(替莫唑胺）、替莫唑胺、坦西莫司 (Temsirolimus)、赛羅密德（Thalomid)(沙立度胺）、沙立 度胺、托泰克（Totect)(鹽酸右雷佐生）、鹽酸拓撲替康、 馱瑞塞爾（Torisel)(坦西莫司）、曲妥珠單抗、三森諾 (Trisenox)(三氧化二砷）、泰克布（Tykerb)(二曱苯磺酸拉 帕替）、維克替比（Vectibix)(帕尼單抗）、萬珂 (Velcade)(棚替佐米）、維達紮（vidaza)(阿紮胞苦）、伏立 諾他（Vorinostat)、希羅達（xei〇da)(卡培他濱）、辛卡德 (zinecard)(鹽酸右雷佐生）、唑來膦酸（z〇ledr〇nic Acid)、唑林紮（Zolinza)(伏立諾他）及擇泰（z〇meta)(唑來 141568.doc 25 201014602 膦酸）。 75. 76. 77. 如請求項74之用途，其中該藥物係藉由至少一種選自以 下之模式投與··非經腸、皮下、肌肉内、靜脈内、關節 内支氣管内、腹内、囊内、軟骨内、腔内、體腔内、 小腦内、腦室内、大腸内、子宮頸内、胃内、肝内、心 肌内、月内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列 腺内、肺内、直腸内、腎内、視網膜内、脊椎内、滑膜 内、胸腔内、子宮内、膀胱内、快速注射、陰道、直 腸、經頰 '舌下、鼻内及經皮。 一種經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗 原結合片段結合前列腺素E2，且以細胞表面受體為基礎 之結合分析中，以具有選自由以下組成之群的IC5〇抑制 前列腺素E2與El、E2、E3及E4受體中之至少一者的結 合：約 lxlO·6 至 lxl〇-7 Μ、ΙχΙΟ·7 至 lxio-8 M、lxl〇-8 至 1χ1〇_9 Μ、ί〇·9至 ι〇·10 μ ' 1χ1〇-10至 ΐχ10·ιι “及 1〇-ιι至 10 12 Μ ’或以ELISA為基礎之受體結合分析中，以具有 選自由以下組成之群的IC5〇抑制前列腺素£2與e 1、E2、 E3及E4受體中之至少一者的結合：約1χ1〇-6至卜1〇·7 Μ、1χΐ〇·7 至 ΐχΐ〇·8 μ、lxl0-8 至 1χ1〇-9 Μ、1〇_9至1〇.10 Μ、1χ1〇·1()至 ΐχΐ 〇_ 丨1 μ及 ΙΟ·11至 1(Γ12 Μ。 一種經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗 原結合片段結合PGE2且在選自由以下組成之群的疾病模 型中抑制PGE2活性達約50% :角叉菜膠誘發之爪水腫模 型、角叉菜膠誘發之痛覺過敏模型、膠原蛋白誘發之關 141568.doc • 26 - 201014602 節炎模型及佐劑誘發之關節炎模型。 78. 如請求項77之抗體，其中該抗體在選自由以下組成之群 的疾病模型中抑制PGE2活性達約7〇% :角叉菜膠誘發之 爪水腫模型、角叉菜膠誘發之痛覺過敏模型、膠原蛋白 誘發之關節炎模型及佐劑誘發之關節炎模型。 79. —種經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗 原結合片段結合PGE2且在選自由以下組成之群的疾病模 型中抑制發炎達約90%:角又菜膠誘發之爪水腫模型、 角叉菜膠誘發之痛覺過敏模型、膠原蛋白誘發之關節炎 模型及佐劑誘發之關節炎模型。 80·如請求項7?之抗體，其中該抗體為^5。 8 1. —種經分離抗體或其抗原結合片段，其中該扰體或其抗 原結合片段結合前列腺素E2，且以細胞表面受體為基礎 之結合分析中或以ELISA為基礎之受體結合分析中，在 約100 nM之濃度下，抑制前列腺素匕與以、E2、以及£4 受體中之至少一者的結合達約7〇_i 〇〇%。 82·如請求項81之抗體’其中該抗體係選自由19C9、4F1〇、 15F10、K1B、K7H、K3A、Lll、L21、2B5-7.0、2B5- 8.0及285-9.0組成之群。 83.如請求項81之抗體或其抗原結合片段’其中該抗體或其 抗原結合片段能夠調節前列腺素e2之生物功能。 8 4 ·如請求項81之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其 抗原結合片段能夠中和前列腺素E2。 85·如請求項81之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其 141568.doc •27· 201014602 抗原結合片段係選自由以下組成. 又<群.免疫球蛋白分 子、單株抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體、人類化抗 體、Fab、Fab.、F(ab.)2、Fv、經雙硫鍵連接之^ scFv、單域抗體、雙功能抗體、多特異性抗體、雙重特 異性抗體及雙特異性抗體。 队如請求項81之抗體或其抗原結合片段’其中該抗體或其 抗原結合片段為人類化抗體。 、 87, -種醫藥組合物’其包含如請求項81之抗體或其抗原結 合片段及醫藥學上可接受之載劑。 88. 如請求項87之醫藥組合物，其進一步包含至少一種用於 治療前列腺素E2活性有害之病症的額外治療劑。 89· —種產生與前列腺素&結合之抗體或其片段之方法，該 方法包含以下步驟：以前列腺素EC甲狀腺球蛋白免疫非 人類動物，收集包含抗前列腺素^抗體之體液或器官， 及分離該抗前列腺素E2抗體。 90· —種包含抗原結合域之人類化抗體，該人類化抗體能夠 結合前列腺素E2，該抗原結合域包含至少一個包含選自 由SEQ ID NO: 54-59組成之群之胺基酸序列的CDR區。 91· 一種包含抗原結合域之人類化抗體，該人類化抗體能夠 結合前列腺素E2，該抗原結合域包含至少一個包含與選 自由SEQ ID NO: 54-59組成之群的胺基酸序列至少約 60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約 80%、至少約85%、至少約90°/。、至少約95%或至少約 98%同源之胺基酸序列的CDR區。 141568.doc -28- 201014602 92.如請求項1之結合蛋白，其中該結合蛋白係選自由 組成之群：免疫球蛋白分子、經雙硫鍵連接之Fv、 抗體、scFv、嵌合抗體、單域抗體、CDR移植抗體 功能抗體、人類化抗體、多特異性抗體、Fab、雙 異性抗體、Fab'、雙特異性抗體、F(ab')2及Fv。 以下 單株 、雙 重特
    141568.doc -29-
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