TWI508745B - ＴＮＦ－α結合蛋白 - Google Patents

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TWI508745B
TWI508745B TW100112086A TW100112086A TWI508745B TW I508745 B TWI508745 B TW I508745B TW 100112086 A TW100112086 A TW 100112086A TW 100112086 A TW100112086 A TW 100112086A TW I508745 B TWI508745 B TW I508745B
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antibody
antigen
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TW100112086A
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Lorenzo Benatuil
Tariq Ghayur
Carrie L Goodreau
Peter C Isakson
Jochen Salfeld
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Abbvie Inc
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Publication date
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Description

TNF-α結合蛋白
本發明係關於TNF-α結合蛋白及其在預防及/或治療急性及慢性免疫性疾病(例如類風濕性關節炎、骨關節炎、乾癬、多發性硬化、及其他自體免疫性疾病)中之用途。
本申請案主張於2010年4月7日提出申請之美國臨時專利申請案第61/321,633號之優先權，其全文出於任何目的以引用方式明確地併入本文中。
業內需要能夠結合TNF-α(亦稱作腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha、tumor necrosis factor-α)、TNF及惡病質素(cachectin))之改良抗體。在一實施例中，抗體能夠中和TNF-α。本發明提供新穎家族之結合蛋白、CDR移植抗體、人類化抗體及其片段，其能夠結合TNF-α、以高親和性結合TNF-α、並結合及中和TNF-α。
本發明係關於結合TNF-α之TNF-α結合蛋白、尤其抗TNF-α抗體或其抗原結合部分。在一實施例中，能夠結合TNF-α之抗體、或其抗原結合部分包含選自由SEQ ID NO:22-36組成之群之胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供包含能夠結合人類TNF-α之抗原結合域的人類化結合蛋白，該抗原結合域包含至少一個CDR包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:22之殘基31-35；SEQ ID NO:22之殘基50-65；SEQ ID NO:22之殘基98-106；SEQ ID NO:23之殘基24-34；SEQ ID NO:23之殘基50-56；及SEQ ID NO:23之殘基89-97，其中該結合蛋白包含人類接受體(acceptor)框架。在一實施例中，結合蛋白包含至少3個CDR，例如，包含選自由以下組成之群之可變域CDR組：(a)SEQ ID NO:22之殘基31-35；SEQ ID NO:22之殘基50-65；及SEQ ID NO:22之殘基98-106；及(b) SEQ ID NO:23之殘基24-34；SEQ ID NO:23之殘基50-56；及SEQ ID NO:23之殘基89-97。在特定實施例中，抗原結合域包含胺基酸序列，該胺基酸序列包含SEQ ID NO:22之殘基31-35；SEQ ID NO:22之殘基50-65；SEQ ID NO:22之殘基98-106；SEQ ID NO:23之殘基24-34；SEQ ID NO:23之殘基50-56；及SEQ ID NO:23之殘基89-97。
在一實施例中，抗原結合域包含VH區，例如其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 24、25、28、29、30、31、32及33。在另一實施例中，抗原結合域包含VL區，例如其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 26、27、34、35及36。在特定實施例中，抗原結合域包含VH區及VL區，例如，其中該VH區包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 24、25、28、29、30、31、32及33且該VL區包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 26、27、34、35及36。
在一實施例中，人類接受體框架包含至少一個選自由SEQ ID NO: 6-21組成之群之胺基酸序列。在特定實施例中，人類接受體框架包含選自由SEQ ID NO: 9、10、11、12、15、16、17及21組成之群之胺基酸序列。在另一實施例中，人類接受體框架包含至少一個框架區胺基酸取代，其中該框架之胺基酸序列與人類接受體框架之序列至少65%一致且包含至少70個與人類接受體框架一致之胺基酸殘基。在另一實施例中，人類接受體框架在關鍵殘基包含至少一個框架區胺基酸取代，該關鍵殘基選自由以下組成之群：毗鄰CDR之殘基；糖基化位點殘基；稀有殘基；能夠與人類TNF-α相互作用之殘基；能夠與CDR相互作用之殘基；典型殘基；重鏈可變區與輕鏈可變區之間之接觸殘基；游標區(Vernier zone)內之殘基；及在Chothia界定之可變重鏈CDR1與Kabat界定之第一重鏈框架之間重疊之區中的殘基。在一實施例中，關鍵殘基選自由以下組成之群：H1、H12、H24、H27、H29、H37、H48、H49、H67、H71、H73、H76、H78、L13、L43、L58、L70及L80。在一實施例中，VH突變選自由以下組成之群：Q1E、I12V、A24V、G27F、I29L、V29F、F29L、I37V、I48L、V48L、S49G、V67L、F67L、V71K、R71K、T73N、N76S、L78I及F78I。在另一實施例中，VL突變選自由以下組成之群：V13L、A43S、I58V、E70D及S80P。在一實施例中，結合蛋白包含兩個可變域，其中該兩個可變域具有選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:27。
在一實施例中，結合蛋白結合TNF-α。在另一實施例中，結合蛋白調節TNF-α之生物功能。在另一實施例中，結合蛋白中和TNF-α。在又一實施例中，結合蛋白減弱TNF-α與其受體結合之能力，例如，結合蛋白減弱前人類TNF-α、成熟人類TNF-α或截短人類TNF-α與其受體結合之能力。在又一實施例中，結合蛋白降低一或多種TNF-α生物活性，其選自由以下組成之群：TNF依賴性細胞因子產生；TNF依賴性細胞殺死；TNF依賴性炎症；TNF依賴性骨蝕；及TNF依賴性軟骨損傷。
在一實施例中，結合蛋白具有選自由以下組成之群之結合速率常數(Kon )：至少約102 M-1 s-1 、至少約103 M-1 s-1 、至少約104 M-1 s-1 、至少約105 M-1 s-1 及至少約106 M-1 s-1 ，如藉由表面電漿共振所量測。在另一實施例中，結合蛋白具有選自由以下組成之群之離解速率常數(Koff )：至多約10-3 s-1 、至多約10-4 s-1 、至多約10-5 s-1 、及至多約10-6 s-1 ，如藉由表面電漿共振所量測。在又一實施例中，結合蛋白具有選自由以下組成之群之解離常數(KD )：至多約10-7 M、至多約10-8 M、至多約10-9 M、至多約10-10 M、至多約10-11 M、至多約10-12 M、及至多10-13 M。
在一實施例中，結合蛋白包含選自由以下組成之群之重鏈免疫球蛋白恆定域：人類IgM恆定域、人類IgG1恆定域、人類IgG2恆定域、人類IgG3恆定域、人類IgG4恆定域、人類IgA恆定域及人類IgE恆定域。在特定實施例中，重鏈免疫球蛋白恆定區域係人類IgG1恆定域。在另一實施例中，結合蛋白進一步包含選自由以下組成之群之輕鏈免疫球蛋白恆定域：人類Ig κ恆定域及人類Ig λ恆定域。舉例而言，在一實施例中，結合域包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的免疫球蛋白恆定域：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5。在特定實施例中，人類IgG1恆定域包含選自由SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3組成之群之胺基酸序列。在另一實施例中，輕鏈免疫球蛋白恆定區域係包含胺基酸序列SEQ ID NO:4之人類Igκ恆定域。在又一實施例中，輕鏈免疫球蛋白恆定區域係包含胺基酸序列SEQ ID NO:5之人類Ig λ恆定域。
在特定實施例中，本發明提供能夠結合人類TNF-α之結合蛋白，該結合蛋白包含：Ig恆定重鏈區，其具有選自由SEQ ID NO:2及SEQ ID NO: 3組成之群之胺基酸序列；Ig恆定輕鏈區，其具有選自由SEQ ID NO:4及SEQ ID NO: 5組成之群之胺基酸序列；Ig可變重鏈區，其具有選自由SEQ ID NO: 24、25、28、29、30、31、32及33組成之群之胺基酸序列；及Ig可變輕鏈區，其具有選自由SEQ ID NO: 26、27、34、35及36組成之群之胺基酸序列。在特定實施例中，本發明之結合蛋白選自由以下組成之群：免疫球蛋白分子、Fv、二硫鍵連接之Fv、單株抗體、scFv、嵌合抗體、單域抗體、CDR移植抗體、雙功能抗體、人類化抗體、多特異性抗體、Fab、雙重特異性抗體、Fab'片段、雙特異性抗體、F(ab')2片段、DVD-IgTM 、包含兩個Fab片段在鉸鏈區由二硫橋連接的二價片段、由VH及CH1域組成之Fd片段、由抗體單臂之VL及VH域組成的Fv片段、dAb片段、分離之互補決定區(CDR)及單鏈抗體。
在另一態樣中，本發明提供包含本發明結合蛋白之結晶結合蛋白，其中該結合蛋白呈晶體形式。在一實施例中，晶體係不含載劑之醫藥控制釋放晶體。在另一實施例中，結合蛋白之活體內半衰期長於結合蛋白之可溶性對應部分。在另一實施例中，結合蛋白保留生物活性。
在另一態樣中，本發明提供用於釋放TNF-α結合蛋白之組合物，該組合物包含：(a)調配物，其中該調配物包含本發明之結晶結合蛋白及成份；及(b)至少一種聚合載劑。在一實施例中，聚合載劑係選自由以下組成之群之一或多者的聚合物：聚丙烯酸、聚氰基丙烯酸酯、聚胺基酸、聚酸酐、聚縮酚酸肽(depsipeptide)、聚酯、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物、聚b-羥基丁酸酯、聚己內酯、聚二氧雜環己酮；聚乙二醇、聚羥丙基甲基丙烯醯胺、聚有機磷腈、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、馬來酸酐-烷基乙烯基醚共聚物、普羅尼克(pluronic)多元醇、白蛋白、海藻酸鹽、纖維素及纖維素衍生物、膠原、纖維蛋白、明膠、透明質酸、寡糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖、及其摻合物及共聚物。在另一實施例中，該成份選自由以下組成之群：白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇(lactitol)、明膠、羥丙基-β-環糊精、甲氧基聚乙二醇及聚乙二醇。
在另一態樣中，本發明提供TNF-α結合蛋白構築物(construct)，其包含本發明之TNF-α結合蛋白及選自由連接體及免疫球蛋白恆定域組成之群之多肽。在一實施例中，結合蛋白具有人類糖基化模式。在另一實施例中，結合蛋白構築物係結晶TNF-α結合蛋白構築物。在又一實施例中，結晶TNF-α結合蛋白構築物係不含載劑之醫藥控制釋放結晶TNF-α結合蛋白構築物。在特定實施例中，TNF-α結合蛋白構築物之活體內半衰期長於結合蛋白構築物之可溶性對應部分。在另一實施例中，結合蛋白構築物保留生物活性。
在另一態樣中，本發明提供TNF-α結合蛋白偶聯物，其包含本發明之TNF-α結合蛋白構築物且進一步包含選自由以下組成之群之試劑：免疫黏附分子、成像劑、治療劑及細胞毒性劑。在一實施例中，該試劑係選自由以下組成之群之成像劑：放射標記、酶、螢光標記、發光標記、生物發光標記、磁性標記及生物素。在一實施例中，成像劑係選自由以下組成之群之放射標記：3 H、14 C、35 S、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I、177 Lu、166 Ho及153 Sm。在另一實施例中，該試劑係選自由以下組成之群之治療劑或細胞毒性劑：抗代謝劑、烷基化試劑、抗生素、生長因子、細胞因子、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環抗生素、毒素及細胞凋亡劑。
在另一態樣中，本發明提供編碼本發明結合蛋白之分離核酸。在另一態樣中，本發明提供包含本發明之分離核酸的載體。在一實施例中，該載體選自由pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV及pBJ組成之群。在一實施例中，本發明提供包含本發明之載體之宿主細胞。在另一實施例中，宿主細胞係原核細胞，例如大腸桿菌(E. coli)。在另一實施例中，宿主細胞係真核細胞，例如，原生生物細胞、動物細胞、植物細胞或真菌細胞。在另一實施例中，真核細胞係選自由哺乳動物細胞、禽類細胞及昆蟲細胞組成之群之動物細胞。舉例而言，宿主細胞係CHO細胞、COS細胞、酵母細胞(例如，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))或昆蟲Sf9細胞。
在另一態樣中，本發明提供產生結合TNF-α之蛋白的方法以及由該方法產生之TNF-α結合蛋白，該方法包含以下步驟：在足以產生結合TNF-α之結合蛋白的條件下在培養基中培養本發明之宿主細胞。
在另一態樣中，本發明提供包含本發明結合蛋白及醫藥上可接受之載劑的醫藥組合物。在一實施例中，醫藥上可接受之載劑起到佐劑作用用於增加結合蛋白之吸收或分散。在另一實施例中，佐劑係透明質酸酶。在另一實施例中，該醫藥組合物進一步包含用於治療TNF-α活性有害之病症的至少一種其他治療劑，例如，治療劑、成像劑、細胞毒性劑、血管生成抑制劑、激酶抑制劑、共刺激分子阻斷劑、黏附分子阻斷劑、抗細胞因子抗體或其功能片段、甲胺喋呤(methotrexate)、環孢素(cyclosporine)、雷帕黴素(rapamycin)、FK506、可檢測標記、可檢測報告子、TNF-α拮抗劑、抗風濕藥；肌肉鬆弛劑、麻醉藥、非類固醇消炎藥(NSAID)、止痛劑、麻醉劑、鎮靜劑、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗微生物劑、抗乾癬劑、皮質類固醇、同化類固醇、紅血球生成素、免疫接種、免疫球蛋白、免疫抑制劑、生長激素、激素替代藥物、放射性醫藥、抗抑鬱劑、抗精神病劑、刺激劑、哮喘藥物、β激動劑、吸入性類固醇、口服類固醇、腎上腺素或其類似物、細胞因子及細胞因子拮抗劑。
在另一態樣中，本發明提供治療哺乳動物之方法，其包含向該哺乳動物投與有效量之本發明醫藥組合物的步驟。在另一實施例中，本發明提供降低人類TNF-α活性之方法，該方法包含以下步驟：使人類TNF-α與本發明之結合蛋白接觸以降低人類TNF-α活性。在另一實施例中，本發明提供降低人類個體的人類TNF-α活性之方法，該人類個體患有TNF-α活性有害之病症，該方法包含以下步驟：向該人類個體投與本發明之結合蛋白以降低人類個體之人類TNF-α活性。在另一實施例中，本發明提供治療個體中TNF-α活性有害之疾病或病症的方法，該方法包含以下步驟：向該個體投與本發明結合蛋白以達成治療。
在另一實施例中，本發明提供治療患有TNF-α有害之病症的患者之方法，其包含以下步驟：在投與第二藥劑之前、同時或之後投與本發明之結合蛋白，其中該第二藥劑選自由以下組成之群：能夠結合人類IL-12之抗體或其片段；PGE2；LPA；NGF；CGRP；SubP；RAGE；組胺；組胺受體阻斷劑；緩激肽；IL-1α；IL-1β；VEGF；PLGF；甲胺喋呤；皮質類固醇、糖皮質激素受體調節劑；環孢素、雷帕黴素、FK506、非類固醇消炎劑、及硬化蛋白。在一實施例中，該病症選自由以下組成之群：呼吸疾病；哮喘；過敏性及非過敏性哮喘；因感染引起之哮喘；因感染呼吸道合胞病毒(RSV)引起之哮喘；慢性阻塞性肺病(COPD)；涉及氣道發炎之病況；嗜酸粒細胞增多症；纖維化及黏液產生過量；囊性纖維化；肺纖維化；異位性病症；異位性皮炎；蕁麻疹；濕疹；過敏性鼻炎；過敏性腸胃炎；皮膚之發炎及/或自體免疫性病況；胃腸器官之發炎及/或自體免疫性病況；發炎腸病(IBD)；潰瘍性結腸炎；克羅恩氏病(Crohn's disease)；肝之發炎及/或自體免疫性病況；肝硬化；肝纖維化；由B型及/或C型肝炎病毒引起之肝纖維化；硬皮病；腫瘤或癌症；肝細胞癌；膠質細胞瘤；淋巴瘤；霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)；病毒感染；細菌感染；寄生蟲感染；HTLV-1感染；保護性1型免疫反應表現之抑制、及在疫苗接種期間保護性1型免疫反應表現之抑制。在一實施例中，該病症選自由以下組成之群：類風濕性關節炎、骨關節炎、幼年型慢性關節炎、敗血性關節炎、萊姆關節炎(Lyme arthritis)、乾癬性關節炎、反應性關節炎、脊椎關節病、全身性紅斑狼瘡、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、發炎腸病、胰島素依賴性糖尿病、甲狀腺炎、哮喘、過敏性疾病、乾癬、皮炎硬皮病、移植物抗宿主疾病、器官移植物排斥、與器官移植相關之急性或慢性免疫疾病、結節病、動脈粥樣硬化、彌漫性血管內凝血、川崎病(Kawasaki's disease)、格雷夫斯氏病(Grave's disease)、腎病症候群、慢性疲勞症候群、韋格納氏肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)、亨諾-許蘭二氏紫癜(Henoch-Schoenlein purpurea)、腎之顯微血管炎、慢性活動性肝炎、葡萄膜炎、敗血性休克、毒性休克症候群、敗血症症候群、惡病質、傳染病、寄生蟲病、後天性免疫缺陷症候群、急性橫貫性脊髓炎、亨庭頓氏舞蹈症(Huntington's chorea)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、中風、原發性膽汁性肝硬化、溶血性貧血、惡性腫瘤、心臟衰竭、心肌梗塞、阿狄森氏病(Addison's disease)、散發性、I型多腺缺陷症及II型多腺缺陷症、施密特氏症候群(Schmidt's syndrome)、成人(急性)呼吸窘迫症候群、禿髮、斑禿、血清陰性關節病、關節病、賴特爾病(Reiter's disease)、乾癬性關節病、潰瘍性鮞狀關節病、腸病性滑膜炎、衣原體、耶爾森菌(yersinia)及沙門菌(salmonella)相關之關節病、脊椎關節病、動脈粥樣硬化疾病/動脈硬化、異位性過敏症、自體免疫性大疱病、尋常天疱瘡、葉狀天疱瘡、類天疱瘡、線性IgA病、自體免疫性溶血性貧血、庫姆(Coombs)陽性溶血性貧血、後天性惡性貧血、幼年型惡性貧血、肌痛性腦炎/慢性疲勞病(Royal Free Disease)、慢性黏膜皮膚念珠菌病、巨細胞動脈炎、原發性硬化性肝炎、隱原性自體免疫性肝炎、後天性免疫缺陷症候群、後天性免疫缺陷有關疾病、B型肝炎、C型肝炎、普通變異免疫缺陷症(普通變異γ球蛋白過少)、擴張型心肌病、女性不育、卵巢功能衰竭、早熟卵巢功能衰竭、纖維化肺疾病、隱原性纖維化肺泡炎、發炎後間質肺病、間質性肺炎、結締組織病相關之間質肺病、混合結締組織病相關之肺病、全身性硬化症相關之間質肺病、類風濕性關節炎相關之間質肺病、全身性紅斑狼瘡相關之肺病、皮肌炎/多肌炎相關之肺病、薛格連氏病(Sjgren's disease)相關之肺病、強直性脊柱炎相關之肺病、血管炎彌漫性肺病、血鐵質沉著相關之肺病、藥物誘發之間質肺病、纖維化、輻射纖維化、閉塞性細枝氣管炎、慢性嗜酸粒細胞性肺炎、淋巴細胞浸潤性肺病、感染後間質肺病、痛風性關節炎、自體免疫性肝炎、1型自體免疫性肝炎(典型自體免疫或狼瘡狀肝炎)、2型自體免疫性肝炎(抗LKM抗體肝炎)、自體免疫調介之低血糖、患有黑棘皮症之B型胰島素抗性、甲狀旁腺功能低下症、與器官移植相關之急性免疫疾病、與器官移植相關之慢性免疫疾病、骨關節病、原發性硬化性膽管炎、1型乾癬、2型乾癬、特發性白血球減少症、自體免疫性嗜中性白血球減少症、NOS腎病、腎小球性腎炎、腎之顯微血管炎、萊姆病(Lyme disease)、盤狀紅斑狼瘡、特發性或NOS男性不育、精子自體免疫病、多發性硬化(所有亞型)、交感性眼炎、繼發於結締組織病之肺動脈高血壓症、古德帕斯徹氏症候群(Goodpasture's syndrome)、結節性多動脈炎之肺病、急性風濕熱、類風濕性脊柱炎、斯提耳病(Still's disease)、全身性硬化症、薛格連氏症候群(Sjrgren's syndrome)、高安氏病(Takayasu's disease)/動脈炎、自體免疫性血小板減少症、特發性血小板減少症、自體免疫性甲狀腺疾病、甲狀腺功能亢進症、甲狀腺腫自體免疫性甲狀腺功能低下症(橋本氏病(Hashimoto's disease))、萎縮性自體免疫性甲狀腺功能低下症、原發性黏液性水腫、晶狀體源性葡萄膜炎、原發性血管炎、白斑急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬化、酒精誘發之肝損傷、膽汁淤積、特異體質性肝病、藥物誘發之肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、過敏症及哮喘、B群鏈球菌(group B streptococci)(GBS)感染、精神病症(例如，抑鬱症及精神分裂症)、Th2型及Th1型調介之疾病、急性及慢性疼痛(不同形式之疼痛)，及癌症，例如肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺及直腸癌及造血惡性腫瘤(白血病及淋巴瘤)，無β脂蛋白血症、手足發紺、急性及慢性寄生或傳染過程、急性白血病、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性或慢性細菌感染、急性胰腺炎、急性腎衰竭、腺癌、心房異位性博動、AIDS癡呆複合症、酒精誘發之肝炎、過敏性結膜炎、過敏性接觸性皮炎、過敏性鼻炎、同種異體移植排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺陷症、肌萎縮性側索硬化症、貧血、心絞痛、前角細胞變性、抗CD3療法、抗磷脂症候群、抗受體過敏性反應、主動脈及外周動脈瘤、主動脈剝離、動脈性高血壓、動脈硬化、動靜脈瘺、共濟失調、心房顫動(持續性或陣發性)、心房撲動、房室傳導阻滯、B細胞淋巴瘤、骨移植排斥、骨髓移植(BMT)排斥、束支傳導阻滯、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、燒傷、心律不齊、心肌頓抑症候群、心臟腫瘤、心肌病、心肺繞道發炎反應、軟骨移植排斥、小腦皮質變性、小腦病症、紊亂性或多灶性心房心動過速、化學療法相關之病症、慢性骨髓細胞性白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性發炎病狀、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性水楊酸中毒、結腸直腸癌、充血性心臟衰竭、結膜炎、接觸性皮炎、肺源性心臟病、冠狀動脈疾病、庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、培養陰性敗血症、囊性纖維化、細胞因子療法相關之病症、拳擊手癡呆、脫髓鞘疾病、登革出血熱、皮炎、皮膚病、糖尿病(diabetes、diabetes mellitus)、糖尿病性動脈硬化病、彌漫性路易體疾病(Diffuse Lewy body disease)、擴張型充血性心肌病、基底神經節病症、中年人唐氏症候群(Down's Syndrome)、由阻斷CNS多巴胺(dopamine)受體之藥物誘發之藥物誘發之運動障礙、藥物敏感、濕疹、腦脊髓炎、心內膜炎、內分泌病、會厭炎、艾伯斯坦-巴爾病毒感染(Epstein-Barr virus infection)、紅斑性肢痛病、錐體束外及小腦病症、家族性嗜血細胞性淋巴組織細胞增多症、胎兒胸腺移植排斥、弗裏德賴希共濟失調(Friedreich's ataxia)、功能性外周動脈病症、真菌敗血症、氣性壞疽、胃潰瘍、腎小球腎炎、任何器官或組織之移植排斥、革蘭氏(gram)陰性敗血症、革蘭氏陽性敗血症、因細胞內有機體引起之肉芽腫、毛細胞白血病、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、橋本氏甲狀腺炎(Hashim oto's thyroiditis)、花粉熱、心臟移植排斥、血色素沉著症、血液透析、溶血性尿毒症候群/溶血栓性血小板減少性紫癜、出血、肝炎(A)、房室束心律不整、HIV感染/HIV神經病、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、運動過度性運動障礙、過敏反應、過敏性肺炎、高血壓、運動減退性運動障礙、下丘腦-垂體-腎上腺軸評估、特發性阿狄森氏病、特發性肺纖維化、抗體調介之細胞毒性、衰弱、嬰兒脊髓性肌萎縮、主動脈發炎、A型流感、電離輻射暴露、虹膜睫狀體炎/葡萄膜炎/視神經炎、局部缺血-再灌注損傷、局部缺血性中風、幼年型類風濕性關節炎、幼年型脊髓性肌萎縮、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、腎移植排斥、退伍軍人桿菌屬(legionella)、利什曼病(leishmaniasis)、麻風、皮質脊髓系統損傷、脂性水腫、肝移植排斥、淋巴水腫、瘧疾、惡性淋巴瘤、惡性組織細胞增多症、惡性黑色素瘤、腦膜炎、腦膜炎球菌血症、代謝性/特發性、偏頭痛、粒線體多系統病症、混合性結締組織病、單株γ球蛋白病、多發性骨髓瘤、多系統變性(Menzel、Dejerine-Thomas、Shy-Drager及Machado-Joseph)、重症肌無力、鳥胞內分枝桿菌、結核分枝桿菌、骨髓增生異常症候群、心肌梗塞、心肌局部缺血病症、鼻咽癌、新生兒慢性肺病、腎炎、腎病、神經變性疾病、神經源性I肌萎縮、嗜中性白血球減少發燒、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)、腹主動脈及其分枝阻塞、阻塞性動脈病症、OKT3療法、睾丸炎/副睾炎、睾丸炎/輸精管切除術逆轉程序、器官巨大症、骨質疏鬆症、胰腺移植排斥、胰腺癌、副腫瘤症候群/惡性腫瘤之高鈣血症、甲狀旁腺移植排斥、骨盆發炎疾病、常年性鼻炎、心包疾病、外周動脈粥樣硬化性疾病、外周血管病症、腹膜炎、惡性貧血、卡氏肺囊蟲肺炎(pneumocystis carinii pneumonia)、肺炎、POEMS症候群(多神經病、器官巨大症、內分泌病、單株γ球蛋白病及皮膚變化症候群)、灌注後症候群、泵送後症候群、MI心切開術後症候群、先兆子癇、進行性核上性麻痺、原發性肺動脈高血壓症、放射療法、雷諾現象(Raynaud's phenomenon)及疾病、雷諾病、雷夫蘇姆病(Refsum's disease)、規則性窄QRS心動過速、腎血管性高血壓、再灌注損傷、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年舞蹈症、路易體型老年性癡呆、血清陰性關節病、休克、鐮狀細胞貧血、皮膚同種異體移植排斥、皮膚變化症候群、小腸移植排斥、實體瘤、特異性心律不整、脊柱共濟失調、脊髓小腦變性、鏈球菌肌炎、小腦結構損傷、亞急性硬化性全腦炎、暈厥、心血管系統梅毒、全身性過敏反應、全身性發炎反應症候群、全身性發作幼年型類風濕性關節炎、T細胞或FAB ALL、毛細管擴張、閉塞性血栓性脈管炎、血小板減少症、毒性、移植、創傷/出血、III型過敏反應、IV型過敏反應、不穩定型心絞痛、尿毒症、尿敗血症、蕁麻疹、心臟瓣膜病、靜脈曲張、血管炎、靜脈疾病、靜脈血栓形成、心室顫動、病毒及真菌感染、病毒性腦炎/無菌腦膜炎、病毒相關之噬血細胞症候群、魏尼凱-科爾薩科夫症候群(Wernicke-Korsakoff syndrome)、威爾森氏病(Wilson's disease)、任何器官或組織之異種移植排斥、急性冠脈症候群、急性特發性多神經炎、急性發炎脫髓鞘多發性神經根神經病、急性局部缺血、成人斯提耳病、斑禿、過敏反應、抗磷脂抗體症候群、再生不全性貧血、動脈硬化、異位性濕疹、異位性皮炎、自體免疫性皮炎、與鏈球菌感染相關之自體免疫性病症、自體免疫性腸病變、自體免疫性聽力損失、自體免疫性淋巴增生症候群(ALPS)、自體免疫性心肌炎、自體免疫性早熟卵巢功能衰竭、眼瞼炎、枝氣管擴張症、大疱性類天疱瘡、心血管疾病、災難性抗磷脂症候群、乳糜瀉、頸椎病、慢性局部缺血、瘢痕性類天疱瘡、具有多發性硬化風險之臨床孤立症候群(CIS)、結膜炎、兒童期精神異常、慢性阻塞性肺病(COPD)、淚囊炎、皮肌炎、糖尿病視網膜病變、糖尿病、椎間盤突出、椎間盤脫出、藥物誘發之免疫性溶血性貧血、心內膜炎、子宮內膜異位症、眼內炎、上鞏膜炎、多形紅斑、重型多形紅斑、妊娠性類天疱瘡、吉蘭-巴雷症候群(Guillain-Barrsyndrome)(GBS)、花粉熱、休斯症候群(Hughes syndrome)、特發性帕金森氏病、特發性間質肺炎、IgE調介之過敏症、免疫溶血性貧血、包涵體肌炎、傳染型眼睛發炎疾病、發炎脫髓鞘疾病、發炎心臟疾病、發炎腎病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、乾燥性角膜結膜炎、庫斯毛耳病(Kussmaul disease)或庫斯毛耳-邁埃爾病(Kussmaul-Meier disease)、蘭德里氏麻痺、郎格罕細胞(Langerhan's cell)組織細胞增多症、網狀青斑、黃斑變性、顯微多血管炎、白赫鐵列夫症(morbus bechterev)、運動神經元病症、黏膜性類天疱瘡、多器官衰竭、重症肌無力、骨髓增生異常症候群、心肌炎、神經根障礙、神經病、非A非B型肝炎、視神經炎、骨質溶解、卵巢癌、少關節性JRA、外周動脈阻塞性疾病(PAOD)、外周血管疾病(PVD)、外周動脈疾病(PAD)、靜脈炎、結節性多動脈炎(或結節性動脈周圍炎)、多軟骨炎、風濕性多肌痛、白髮症、多關節JRA、多內分泌缺乏症候群、多肌炎、風濕性多肌痛(PMR)、泵送後症候群、原發性帕金森病(primary Parkinsonism)、前列腺及直腸癌及造血惡性腫瘤(白血病及淋巴瘤)、前列腺炎、純紅血球再生不全、原發性腎上腺機能不全、復發性視神經脊髓炎、再狹窄、風濕性心臟疾病、sapho(滑膜炎、痤瘡、膿疱病、骨肥厚及骨炎)、硬皮病、繼發性澱粉樣變性、休克肺、鞏膜炎、坐骨神經痛、繼發性腎上腺機能不全、聚矽氧相關之結締組織病、史奈頓威金森皮膚病(Sneddon-Wilkinson dermatosis)、強直性脊椎炎、史-約症候群(Stevens-Johnson syndrome)(SJS)、全身性發炎反應症候群、顳動脈炎、弓形體視網膜炎、毒性表皮壞死溶解症、橫貫性脊髓炎、TRAPS(腫瘤壞死因子受體相關之週期性症候群)、1型過敏反應、II型糖尿病、蕁麻疹、尋常性間質肺炎(UIP)、血管炎、春季結膜炎、病毒性視網膜炎、沃格特-小柳-原田症候群(Vogt-Koyanagi-Harada syndrome)(VKH症候群)、濕性黃斑變性、傷口癒合、耶爾森菌及沙門菌相關之關節病。
在另一實施例中，本發明提供治療患有TNF-α有害之病症的患者之方法，該方法包含以下步驟：在投與第二藥劑之前、同時或之後投與本發明之結合蛋白，其中該第二藥劑選自由以下組成之群：吸入性類固醇；β-激動劑；短效或長效β-激動劑；白三烯或白三烯受體之拮抗劑；ADVAIR；IgE抑制劑；抗IgE抗體；XOLAIR；磷酸二酯酶抑制劑；PDE4抑制劑；黃嘌呤；抗膽鹼激導性藥物；肥大細胞穩定劑；色甘酸(Cromolyn)；IL-4抑制劑；IL-5抑制劑；嗜酸細胞趨化因子(eotaxin)/CCR3抑制劑；組胺或其受體(包括H1、H2、H3及H4)之拮抗劑；前列腺素D或其受體DP1及CRTH2之拮抗劑；TNF拮抗劑；TNF受體之可溶性片段；ENBREL；TNF酶拮抗劑；TNF轉化酶(TACE)抑制劑；毒蕈鹼受體拮抗劑；TGF-β拮抗劑；干擾素γ；哌非尼酮(perfenidone)；化學治療劑、甲胺喋呤；來氟米特(leflunomide)；西羅莫司(sirolimus)(雷帕黴素)或其類似物、CCI-779；COX2或cPLA2抑制劑；NSAID；免疫調節劑；p38抑制劑；TPL-2、MK-2及NFkB抑制劑；布替耐德(budenoside)；表皮生長因子；皮質類固醇；環孢素；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；胺基水楊酸酯；6-巰基嘌呤；硫唑嘌呤(azathioprine)；甲硝唑(metronidazole)；脂肪加氧酶(lipoxygenase)抑制劑；美沙拉秦(mesalamine)；奧沙拉秦(olsalazine)；巴柳氮(balsalazide)；抗氧化劑；血栓烷(thromboxane)抑制劑；IL-1受體拮抗劑；抗IL-1β抗體；抗IL-6抗體；生長因子；彈性蛋白酶抑制劑；吡啶基-咪唑化合物；以下之抗體或激動劑；LT、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、E M AP-II、GM-CSF、FGF或PDGF；CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配體之抗體；FK506；雷帕黴素；黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil)；布洛芬(ibuprofen)；潑尼松龍(prednisolone)；磷酸二酯酶抑制劑；腺苷激動劑；抗血栓劑；補體抑制劑；腎上腺素激導劑(adrenergic agent)；IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑；IL-1β轉化酶抑制劑；TNF-α轉化酶抑制劑；T細胞信號傳導抑制劑；金屬蛋白酶抑制劑；6-巰基嘌呤；血管緊張素轉化酶抑制劑；可溶性細胞因子受體；可溶性p55 TNF受體；可溶性p75 TNF受體；sIL-1RI；sIL-1RII；sIL-6R；抗發炎細胞因子；IL-4；IL-10；IL-11；及TGF-β。
在一實施例中，藉由至少一種選自由以下組成之群之方式投與個體本發明結合蛋白：非經腸、皮下、肌內、靜脈內、關節內、枝氣管內、腹內、囊內、軟骨內、腔內、體
腔內、小腦內、腦室內、結腸內、頸管內、胃內、肝內、心肌內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊柱內、滑膜內、胸內、子宮內、膀胱內、濃注(bolus)、陰道、直腸、頰、舌下、鼻內及經皮。
本發明係關於結合TNF-α(即腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子-α、TNF、惡病質素)之TNF-α結合蛋白，尤其抗TNF-α抗體，或其抗原結合部分。本發明之各態樣係關於抗體及抗體片段，及其醫藥組合物，以及用於製備該等抗體及片段之核酸、重組表現載體及宿主細胞。本發明亦涵蓋使用本發明抗體檢測人類TNF-α、活體外或活體內抑制人類TNF-α、及調節基因表現或TNF-α有關功能的方法。亦闡述包含本發明抗體之組合物，以及使用該等抗體之方法。
除非本文中另有定義，否則本發明所用之科學及技術術語應具有熟習此項技術者通常所瞭解之含義。然而，該等術語之含義及範疇應明確，即使有任何潛在歧義，本文所提供之定義亦優先於任何字典或外在定義。此外，除非另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。在本案中，除非另有說明，否則使用「或」意指「及/或」。此外，使用術語「包括(including)」以及該術語之其他形式(例如「includes」及「included」)不受限制。同時，除非另外明確說明，否則諸如「元素」或「組份」等術語涵蓋包含一個單元之元素及組份及包含一個以上亞單元之元素及組份。
一般而言，用於本文所述細胞及組織培養、病理學、腫瘤學、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學、以及蛋白質及核酸化學以及雜交之命名及技術係業內熟知且常用。除非另有說明，否則本發明方法及技術通常係根據業內熟知之習用方法且如本說明書中引用及論述的各種一般及更特定參考文獻中所述實施。酶反應及純化技術係根據製造商說明書，或業內習用方法，或本文所述實施。用於本文所述分析化學、合成有機化學、以及醫學及藥物化學之命名及實驗室程序以及技術係業內熟知且常用者。化學合成、化學分析、藥物製備、調配及遞送、以及患者之治療使用標準技術。
為更容易地理解本發明，在下文中定義所選術語。
術語「多肽」係指胺基酸之聚合鏈。術語「肽」及「蛋白質」可與術語多肽互換使用且亦係指胺基酸之聚合鏈。術語「多肽」涵蓋天然或人工合成蛋白質、蛋白質片段及蛋白質序列之多肽類似物。多肽可為單體或聚合物。
術語「經分離蛋白質」或「經分離多肽」根據其起源或衍生源係如下蛋白質或多肽：不與原本在其天然狀態下伴隨其之天然結合組份相結合；實質上不含來自相同物種之其他蛋白質；可由來自不同物種之細胞表現；或在天然狀態下不存在。因此，經化學合成或在不同於多肽天然起源之細胞的細胞系統中合成之多肽係與其天然結合組份「分離」的。亦可藉由分離利用業內熟知之蛋白質純化技術使蛋白質實質上不含天然結合組份。
術語「回收」係指藉由分離利用(例如)業內熟知之蛋白質純化技術使化學物質(例如多肽)實質上不含天然結合組份的過程。
術語「人類TNF-α」(本文中縮寫為hTNF-α)包括三聚細胞因子蛋白質。該術語包括包含三種17.5 kD TNF-α蛋白質之同源三聚體蛋白質。該同源三聚體蛋白質稱作「TNF-α蛋白質」。術語人類「TNF-α」意欲包括重組人類TNF-α(rhTNF-α)，其可藉由標準重組表現方法製得。人類TNF-α之序列示於表1中。
「生物活性」係指細胞因子之任何固有生物性質。TNF-α之生物性質包括(但不限於)結合TNF受體。
在提及抗體、蛋白質、或肽與第二化學物質之相互作用時，術語「特異性結合」(「specific binding」或「specifically binding」)意指該相互作用取決於化學物質上之特定結構(例如抗原決定簇或表位)的存在；例如，抗體識別並結合特異性蛋白結構而非通常蛋白。若抗體對表位「A」具有特異性，則在含有經標記「A」及抗體之反應中存在含有表位A(或游離未標記A)之分子將減少經標記A結合抗體之量。
廣義而言，術語「抗體」係指任何免疫球蛋白(Ig)分子或其抗原結合部分，其包含四條多肽鏈、兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈、或任何功能片段、突變體、變體或其衍生物，其保留Ig分子之基本表位結合特徵。該等突變體、變體或衍生抗體模式已為業內所知。下文論述其非限制性實施例。
在全長抗體中，各重鏈包含重鏈可變區(本文縮寫為HCVR或VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個域CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文縮寫為LCVR或VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個域CL。可將VH及VL區進一步細分成高度可變區(稱為互補決定區(CDR))及較為保守之區(稱為框架區(FR))，二者間雜排列。各VH及VL由三個CDR及四個FR構成，其自胺基端至羧基端按下列順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可為任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞類。
術語抗體之「抗原結合部分」或「抗原結合區」(或簡稱為「抗體部分」)係指抗體之一或多個片段，其保留特異性結合抗原(例如hTNF-α)之能力。可由全長抗體之片段實施抗體之抗原結合功能。該等抗體實施例亦可具有雙特異性、雙重特異性或多特異性模式；特異性結合兩種或更多種不同抗原。術語抗體之「抗原結合部分」內所涵蓋結合片段之實例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，即包含兩個Fab片段在鉸鏈區由二硫橋連接的二價片段；(iii)由VH及CH1域組成之Fd片段；(iv)由抗體單臂之VL及VH域組成的Fv片段；(v) dAb片段(Ward等人，(1989) Nature 341:544-546，Winter等人，PCT公開案WO 90/05144 A1)，其包含單一可變域；及(vi)分離之互補決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段之兩個域(VL及VH)係由單獨基因編碼，但可使用重組方法藉由合成連接體將此兩個域連接在一起，此合成連接體使其能夠以其中VL及VH區配對形成單價分子的單一蛋白鏈(稱為單鏈Fv(scFv))產生(例如，參見Bird等人，(1988) Science 242:423-426；及Huston等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。此等單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」內。亦涵蓋單鏈抗體之其他形式，例如雙功能抗體。雙功能抗體係二價雙特異性抗體，其中VH及VL域在多肽單鏈上表現，但所用連接體太短以致不容許相同鏈上之兩個域之間配對，從而迫使此等域與另一鏈之互補域配對並形成兩個抗原結合位點(參見，例如，Holliger等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak等人(1994) Structure 2:1121-1123)。該等抗體結合部分已為業內所知(Kontermann及Dubel編輯，Antibody Engineering(2001) Springer-Verlag.New York.第790頁(ISBN 3-540-41354-5)。
術語「抗體構築物」係指包含由連接體多肽或免疫球蛋白恆定域連接之本發明之一或多個抗原結合部分的多肽。連接體多肽包含由肽鍵連接之兩個或更多個胺基酸殘基且用於連接一或多個抗原結合部分。該等連接體多肽已為業內熟知(例如，參見Holliger等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak等人(1994) Structure 2:1121-1123)。免疫球蛋白恆定域係指重鏈或輕鏈恆定域。人類IgG重鏈及輕鏈恆定域胺基酸序列已為業內所知且於表2中表示。
抗體或其抗原結合部分可為藉由抗體或抗體部分與一或多種其他蛋白質或肽共價或非共價締合所形成的較大免疫黏附分子之一部分。該等免疫黏附分子之實例包括使用抗生蛋白鏈菌素核心區域來製造四聚體scFv分子(Kipriyanov等人(1995) Hum. Antibod. Hybridomas 6:93-101)及使用半胱氨酸殘基、標記肽及C-端聚組胺酸標籤來製造二價及生物素化scFv分子(Kipriyanov等人(1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058)。諸如Fab及F(ab')2片段等抗體部分可利用習用技術自全抗體製備，例如全抗體的分別木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消解。此外，抗體、抗體部分及免疫黏附分子可利用如本文所述標準重組DNA技術來獲得。
「經分離抗體」係指實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體或其抗原結合部分(例如，與hTNF-α特異性結合之經分離抗體實質上不含與除hTNF-α以外之抗原特異性結合之抗體)。然而，與hTNF-α特異性結合之經分離抗體可與其他抗原(例如其他物種之TNF-α分子)具有交叉反應性。此外，經分離抗體可實質上不含其他細胞材料及/或化學品。
術語「人類抗體」包括具有源自人類種系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體或其抗原結合部分。本發明之人類抗體可在(例如)CDR內且尤其CDR3內包括不由人類種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如，藉由活體外隨機誘變或定點誘變或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。然而，術語「人類抗體」並不欲包括其中源自另一哺乳動物物種(例如小鼠)種系之CDR序列已移植至人類框架序列上的抗體。
術語「重組人類抗體」意欲包括藉由重組方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體或其抗原結合部分，例如使用轉染至宿主細胞中之重組表現載體表現之抗體，自重組、組合人類抗體庫分離之抗體(Hoogenboom(1997) Trends Biotechnol. 15:62-70；Azzazy及Highsmith(2002) Clin. Biochem. 35:425-445；Gavilondo及Larrick(2000) BioTechniques 29:128-145；Hoogenboom及Chames(2000) Immunol. Today 21:371-378)，自人類免疫球蛋白基因之轉基因動物(例如小鼠)分離的抗體(例如，參見Taylor等人(1992) Nucl.Acids Res.) 20:6287-6295；Kellermann及Green(2002) Current Opin. Biotechnol. 13:593-597；Little等人(2000) Immunol. Today 21:364-370)或藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列上的任何其他方式製備、表現、產生或分離的抗體。此等重組人類抗體具有源自人類種系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區。然而，在某些實施例中，此等重組人類抗體可經受活體外誘變(或者，當利用人類Ig序列轉基因動物時，經受活體內體細胞誘變)，且因此重組抗體之VH及VL區的胺基酸序列儘管源自人類種系VH及VL序列並與其相關，但其係可不天然存在於人類活體內抗體種系譜中的序列。
術語「嵌合抗體」係指包含一個物種之重鏈及輕鏈可變區序列及另一物種之恆定區序列之抗體或其抗原結合部分，例如具有連接至人類恆定區之鼠類重鏈及輕鏈可變區的抗體。
術語「CDR移植抗體」係指包含一個物種之重鏈及輕鏈可變區序列但VH及/或VL之一或多個CDR區的序列經另一物種之CDR序列替換的抗體或其抗原結合部分，例如具有其中一或多個人類CDR(例如CDR3)經鼠類CDR序列替換之人類重鏈及輕鏈可變區的抗體。
術語「人類化抗體」係指包含非人類物種(例如小鼠)之重鏈及輕鏈可變區序列但其中VH及/或VL序列之至少一部分已變得更「人類樣(human-like)」，即更類似於人類種系可變序列的抗體或其抗原結合部分。一類人類化抗體係CDR移植抗體，其中將非人類CDR序列引入人類VH及VL框架中。
術語「Kabat編號」、「Kabat定義」及「Kabat標記」在本文中可互換使用。業內識別之該等術語係指編號比抗體或其抗原結合部分之重鏈及輕鏈可變區中之其他胺基酸殘基可變性更大(即超變)之胺基酸殘基的系統(Kabat等人(1971)Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391及Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第5版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公開案第91-3242號)。亦參見「Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains」，Kontermann及Dbel編輯，Antibody Engineering (Springer-Verlag,Berlin,2001)，第31章，尤其第432至433頁。就重鏈可變區而言，超變區範圍為31至35位胺基酸(CDR1)、50至65位胺基酸(CDR2)、及95至106位胺基酸(CDR3)。就輕鏈可變區而言，超變區範圍為24至34位胺基酸(CDR1)、50至56位胺基酸(CDR2)、及89至97位胺基酸(CDR3)。
術語「接受體」及「接受體抗體」係指提供或編碼一或多個框架區之至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或100%胺基酸序列的抗體或核酸序列。在一些實施例中，術語「接受體」係指提供或編碼恆定區之抗體胺基酸或核酸序列。在又一實施例中，術語「接受體」係指提供或編碼一或多個框架區及恆定區之抗體胺基酸或核酸序列。在具體實施例中，術語「接受體」及「接受體抗體」係指提供或編碼一或多個框架區之至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或100%胺基酸序列的人類抗體胺基酸或核酸序列。根據此實施例中，接受體可含有在人類抗體之一或多個特異性位置處不存在之至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或至少10胺基酸殘基。舉例而言，可自種系抗體基因、成熟抗體基因、功能抗體(例如，業內熟知之抗體、開發中之抗體或市售抗體)衍生或獲得接受體框架區及/或接受體恆定區。
術語「CDR」係指抗體可變序列內之互補決定區。對於可變區之每一者而言，在重鏈及輕鏈可變區之每一者中存在三個CDR，其指示為CDR1、CDR2及CDR3。術語「CDR組」係指存在於能夠結合抗原之單一可變區中之三個CDR群。已根據不同系統不同地界定該等CDR之準確邊界。由Kabat闡述之系統(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987)及(1991))不僅提供適用於抗體之任一可變區的明確殘基編號系統，並且亦提供界定該三個CDR之精確殘基邊界。該等CDR可稱作Kabat CDR。Chothia及合作者(Chothia及Lesk(1987) J. Mol. Biol. 196:901-917)及Chothia等人(1989) Nature 342:877-883)發現，Kabat CDR內之某些子部分儘管在胺基酸序列層面上具有較大差異但仍採用幾乎相同肽骨架構象。該等子部分指示為L1、L2及L3或H1、H2及H3，其中「L」及「H」分別指示輕鏈及重鏈區。該等區可稱作Chothia CDR，其具有與Kabat CDR重疊之邊界。界定與Kabat CDR重疊之CDR的其他邊界已由Padlan(1995) FASEB J. 9:133-139及MacCallum(1996) J. Mol. Biol. 262(5):732-745闡述。又一些CDR邊界界定可不嚴格遵循以上系統中之一者，而是仍然與Kabat CDR重疊，但其可根據預測或實驗發現變短或變長，而特定殘基或殘基群組或甚至完整CDR並不顯著影響抗原結合。本文所用方法可採用根據該等系統中之任一者界定之CDR，但特定實施例使用Kabat或Chothia界定之CDR。
術語「典型」殘基係指CDR或框架中界定特定典型CDR結構之殘基，如由Chothia等人(1987) J. Mol. Biol. 196:901-917；Chothia等人，(1992) J. Mol. Biol. 227:799-817定義。根據Chothia等人，許多抗體之CDR的關鍵部分儘管在胺基酸序列層面上具有較大差異但仍採用幾乎相同之肽骨架構象。對於形成環之胺基酸殘基之連續區段而言，每一典型結構主要指定一組肽骨架扭轉角。
術語「供體」及「供體抗體」係指提供一或多個CDR之抗體。在特定實施例中，供體抗體係不同於獲得或衍生框架區之抗體的物種之抗體。在人類化抗體上下文中，術語「供體抗體」係指提供一或多個CDR之非人類抗體。
術語「框架」或「框架序列」係指可變區減去CDR後之保留序列。由於可藉由不同系統確定CDR序列之準確界定，故框架序列之含義具有相應的不同解釋。6個CDR(輕鏈之CDR-L1、-L2及-L3及重鏈之CDR-H1、-H2及-H3)亦在每一鏈上將輕鏈及重鏈上之框架區分成四個亞區(FR1、FR2、FR3及FR4)，其中CDR1位於FR1與FR2之間，CDR2位於FR2與FR3之間，且CDR3位於FR3與FR4之間。在未將特定亞區指定為FR1、FR2、FR3或FR4情況下，表示為其他形式之框架區代表天然存在之免疫球蛋白單鏈之可變區內的組合FR's。FR代表四個亞區中之一，且FRs代表構成框架區之四個亞區中之兩個或更多個。
人類重鏈及輕鏈接受體序列已為業內所知。在本發明之一個實施例中，人類重鏈及輕鏈接受體序列選自V-base(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)或IMGT(international ImMunoGeneTics information system(http://imgt.cines.fr/textes/IMGTrepertoire/LocusGenes/))列舉的序列。在本發明之另一實施例中，人類重鏈及輕鏈接受體序列選自表3及表4中所述序列。
術語「種系抗體基因」或「基因片段」係指由非淋巴樣細胞編碼之免疫球蛋白序列，該等非淋巴樣細胞未經受可引起遺傳重排及特定免疫球蛋白之表現突變的成熟過程(例如，參見Shapiro等人(2002) Crit. Rev. Immunol. 22(3):183-200；Marchalonis等人(2001) Adv. Exp. Med. Biol. 484:13-30)。由本發明不同實施例提供之優勢之一源自以下認識：種系抗體基因比成熟抗體基因更有可能保留物種中之個體的必需胺基酸序列結構特性，因此在該物種中治療性使用時較不可能被視為來自外源。
術語「關鍵」殘基係指對抗體、尤其人類化抗體之特異性及/或親和性具有更大影響之可變區內的某些殘基。關鍵殘基包括(但不限於)以下中之一或多者：毗鄰CDR之殘基、潛在糖基化位點(例如，N-或O-糖基化位點)、稀有殘基、能夠與抗原相互作用之殘基、能夠與CDR相互作用之殘基、典型殘基、重鏈可變區與輕鏈可變區之間之接觸殘基、游標區內之殘基、及在Chothia界定之可變重鏈CDR1與Kabat界定之第一重鏈框架之間重疊之區中的殘基。
術語「人類化抗體」係免疫特異性結合目標抗原之抗體或其變體、衍生物、類似物或片段，且其包含實質上具有人類抗體之胺基酸序列的框架(FR)區及實質上具有非人類抗體之胺基酸序列的互補決定區(CDR)。術語「實質上」在CDR上下文中係指胺基酸序列與非人類抗體之胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的CDR。人類化抗體包含實質上所有至少一個、且通常兩個可變域(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)，其中所有或實質上所有CDR區皆對應於非人類免疫球蛋白(即供體抗體)之彼等，且所有或實質上所有框架區皆為人類免疫球蛋白共有序列之彼等。在特定實施例中，人類化抗體亦包含免疫球蛋白恆定區(Fc)、通常人類免疫球蛋白之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體含有輕鏈、以及重鏈之至少可變域。抗體亦可包括重鏈之CH1、鉸鏈、CH2、CH3及CH4區。在一些實施例中，人類化抗體僅含有人類化輕鏈。在一些實施例中，人類化抗體僅含有人類化重鏈。在具體實施例中，人類化抗體僅含有輕鏈之人類化可變域及/或人類化重鏈。
人類化抗體可選自任一種類之免疫球蛋白，包括(例如)IgM、IgG、IgD、IgA及IgE，及任何同種型(包括但不限於(例如)IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)。人類化抗體可包含一個以上種類或同種型之序列，且可使用業內熟知之技術選擇特定恆定域以優化期望效應功能。
人類化抗體之框架及CDR區不需精確對應於親代序列，例如，可藉由至少一個胺基酸殘基之替換、插入及/或缺失誘變處理供體抗體CDR或共有框架以使該位點處之CDR或框架殘基不對應於供體抗體或共有框架。在特定實施例中，該等突變不具有廣泛性。通常，至少80%、至少85%、至少90%及至少95%人類化抗體殘基將對應於親代FR及CDR序列之彼等殘基。術語「共有框架」係指共有免疫球蛋白序列中之框架區。術語「共有免疫球蛋白序列」係指自有關免疫球蛋白序列家族中之最常見胺基酸(或核苷酸)形成的序列(例如，參見Winnaker,From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany 1987)。在免疫球蛋白家族中，該家族中該位置處最常見之胺基酸佔據共有序列中之每一位置。若兩個胺基酸同等頻繁出現，則共有序列何中可包括任一者。
術語「游標」區係指可調節CDR結構及細調與抗原之配合性的框架殘基亞組，如由Foote及Winter(1992) J. Mol. Biol. 224:487-499所述。游標區殘基形成下伏CDR之層且可影響CDR之結構及抗體之親和性。
術語「多價結合蛋白」在本說明書中用於表示包含兩個或更多個抗原結合位點之結合蛋白。多價結合蛋白可經設計具有三個或更多個抗原結合位點且通常不為天然存在抗體。術語「多特異性結合蛋白」係指能夠結合兩個或更多個相關或不相關靶標之結合蛋白。本文所用雙重可變域(DVD)結合蛋白或免疫球蛋白(DVD-Ig)係包含兩個或更多個抗原結合位點且為四價或多價結合蛋白之結合蛋白。該等DVD-Ig可具有單特異性(即，能夠結合一種抗原)或多特異性(即，能夠結合兩種或更多種抗原)。包含兩條重鏈DVD-Ig多肽及兩條輕鏈DVD-Ig多肽之DVD-Ig結合蛋白稱作DVD-Ig。DVD-Ig之一半各自包含重鏈DVD-Ig多肽、及輕鏈DVD-Ig多肽及兩個抗原結合位點。各結合位點包含重鏈可變域及輕鏈可變域，每個抗原結合位點具有總共6個參與抗原結合之CDR。DVD結合蛋白及製備DVD結合蛋白之方法揭示於美國專利第7,612,181號中。
本發明之一個態樣係關於包含能夠結合TNF-α之結合蛋白的DVD結合蛋白。在特定實施例中，DVD結合蛋白能夠結合TNF-α及第二靶標。
術語「中和」係指當結合蛋白特異性結合細胞因子時中和細胞因子之生物活性。在特定實施例中，中和結合蛋白係與hTNF-α之結合可抑制hTNF-α之生物活性的中和抗體，例如，中和結合蛋白會結合hTNF-α並將hTNF-α之生物活性降低至少約20%、40%、60%、80%、85%或更多。可藉由量測業內熟知之hTNF-α生物活性的一或多個指示評定中和結合蛋白對hTNF-α之生物活性的抑制。舉例而言，中和TNF-α對L929細胞之細胞毒性。
在另一實施例中，術語「激動」係指在結合蛋白特異性結合TNF-α(例如hTNF-α)時增大TNF-α之生物活性。在特定實施例中，激動結合蛋白係與TNF-α之結合可增大TNF-α之生物活性的激動抗體。在特定實施例中，激動結合蛋白會結合TNF-α並將TNF-α之生物活性增大至少約20%、40%、60%、80%、85%、90%、95、96%、97%、98%、99%及100%。可藉由業內熟知之TNF-α生物活性的一或多個指示評定激動結合蛋白對TNF-α之生物活性的抑制。
術語「活性」包括以下活性，例如抗體(例如結合TNF-α抗原之抗hTNF-α抗體)對抗原之結合特異性/親和性、及/或抗體(例如與hTNF-α之結合可抑制hTNF-α之生物活性的抗hTNF-α抗體)之中和功效(或激動功效)，例如，中和TNF-α對L929細胞之細胞毒性。
術語「表位」或「抗原決定簇」係指與免疫球蛋白(例如抗體)或T細胞受體結合之抗原上的位點。在某些實施例中，表位決定簇包括分子之化學活性表面基團(例如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基)，且在某些實施例中可具有特異性三維結構特性及/或特異性電荷特性。表位係抗原由抗體結合之區。在某些實施例中，據稱當抗體優先識別蛋白質及/或大分子之複合混合物中之其靶抗原時，抗體特異性結合抗原。表位可自由蛋白質之三級摺疊並置之連續胺基酸或非連續胺基酸形成。在暴露於變性溶劑時，通常保留自連續胺基酸形成之表位，而在用變性溶劑處理時通常損失由三級摺疊形成之表位。在獨特空間構象中，表位通常包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸。確定由給定抗體結合表位之方法(即表位圖譜分析)已為業內熟知且包括(例如)免疫印跡及免疫沉澱分析，其中測試TNF-α之重疊或連續肽與給定抗TNF-α抗體的反應性。確定表位之空間構象的方法包括業內之技術及彼等本文所述者，例如，x射線結晶學及2維核磁共振(例如，參見Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology ，第66卷，G. E. Morris編輯，(1996))。
本發明亦涵蓋結合TNF-α上之表位的抗體，該表位包含由本文所述特定抗體識別之所有或一部分表位(例如，相同或重疊區或區之間之區或跨該區之區)。
本發明亦涵蓋結合與本文所述抗體競爭結合TNF-α(例如人類TNF-α)之相同表位及/或抗體的抗體。可使用常用技術鑑別識別相同表位或競爭結合之抗體。該等技術包括(例如)免疫分析，其顯示一種抗體阻斷另一抗體與靶抗原結合之能力，即競爭性結合分析。在如下分析中測定競爭性結合：其中在測試下免疫球蛋白抑制參考抗體與共同抗原(例如hTNF-α)特異性結合。已知多種類型之競爭性結合分析，例如：固相直接或間接放射免疫分析(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析(EIA)、夾心法競爭分析(參見Stahli等人(1983) Methods in Enzymol. 9:242)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見Kirkland等人(1986) J. Immunol. 137:3614)；固相直接標記分析、固相直接標記夾心法分析(參見Harlow及Lane,Antibodies： A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Press(1988))；使用I-125標記之固相直接標記(參見Morel等人(1988) Mol. Immunol. 25(1):7)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人(1990) Virol. 176:546)；及直接標記RIA.(Moldenhauer等人(1990) Scand. J. Immunol. 32:77)。通常，該分析涉及使用與固體表面結合之純化抗原或具有該純化抗原或該固體表面中任一者之細胞、未標記測試免疫球蛋白及經標記參考免疫球蛋白。藉由測定在測試免疫球蛋白存在下標記與固體表面或細胞結合之量來量測競爭抑制。通常存在過量測試免疫球蛋白。通常，當存在過量競爭抗體時，其將參考抗體與共同抗原之特異性結合抑制至少50%至55%、55%至60%、60%至65%、65%至70%、70%至75%或更多。
其他技術包括(例如)表位圖譜分析方法，例如抗原：抗體複合物之晶體的x射線分析，其可原子拆分表位。其他方法監測抗體與抗原片段或抗原之突變變化形式的結合，其中由於抗原序列內胺基酸殘基之修飾所致之結合損失經常被視為可指示表位組份。另外，亦可使用表位圖譜分析之計算組合方法。該等方法取決於目標抗體自組合噬菌體呈現肽庫親和分離特異性短肽的能力。隨後該等肽可視為界定對應於用於篩選肽庫之抗體之表位的引導者。對於表位圖譜分析而言，亦已開發計算算法，其顯示可圖譜分析構象不連續性表位。
術語「表面電漿共振」係指使得可藉由利用(例如)BIAcore系統(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,SWeden 及Piscataway,NJ)檢測生物感測器基質內之蛋白質濃度變化來實時分析生物特異性相互作用之光學現象。關於其他說明，參見Jnsson等人(1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26；Jnsson等人(1991) Biotechniques 11:620-627；Johnsson等人(1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131；及Johnsson等人(1991) Anal. Biochem. 198:268-277。
術語「Kon 」係指結合蛋白(例如抗體)與抗原締合形成(例如)抗體/抗原複合物的結合速率常數，如業內所知。「Kon」亦稱為術語「締合速率常數」或「ka」，如本文互換使用。指示抗體與其靶抗原之結合速率或抗體與抗原之間之複合物形成速率的此值亦由以下方程展示：
抗體(「Ab」)+抗原(「Ag」)→Ab-Ag
術語「Koff 」係指結合蛋白(例如抗體)自(例如)抗體/抗原複合物之針對解離之離解速率常數或「解離速率常數」，如業內所知。此值指示抗體自其靶抗原之解離速率或Ab-Ag隨時間分離成游離抗體及抗原的速率，如由以下方程所示：
Ab+Ag←Ab-Ag
術語「KD 」係指「平衡解離常數」且係指於平衡下在滴定量測中獲得之值，或藉由解離速率常數(koff)除以締合速率常數(kon)獲得的值。使用締合速率常數、解離速率常數及平衡解離常數表示抗體與抗原之結合親和性。測定締合及解離速率常數之方法已為業內熟知。使用基於螢光之技術可提供高靈敏度且能在平衡下檢驗生理緩衝液中之試試樣。可使用其他實驗方法及儀器(例如BIAcore(生物分子相互作用分析)分析(例如，可自BIAcore International AB,a GE Healthcare公司，Uppsala,Sweden購得之儀器)。另外，亦可使用KinExA(動態棄除分析(Kinetic Exclusion Assay))分析，其可自Sapidyne Instruments(Boise,Idaho)購得。
術語「標記結合蛋白」係指納入可鑑別結合蛋白之標記物之蛋白質。在特定實施例中，該標記物係可檢測標記，例如，納入經放射標記之胺基酸或連接至具有可藉由經標記抗生物素蛋白檢測之生物素基部分的多肽(例如，含有螢光標記物或具有可藉由光學或比色方法檢測之酶促活性的鏈黴抗生物素蛋白)。用於多肽之標記物的實例包括(但不限於)以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3 H、 14 C、 35 S、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I、177 Lu、166 Ho或153 Sm)；螢光標記物(例如，FITC、羅丹明(rhodamine)、鑭系元素磷光體)、酶標記物(例如，辣根過氧化物酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)；化學發光標記；生物素基團；由第二報告子識別之預先確定之多肽表位(例如，亮胺酸拉鏈對序列、第二抗體之結合位點、金屬結合域、表位標籤)；及磁性劑，例如釓螯合物。
術語「抗體偶聯物」係指化學連接至第二化學部分(例如治療劑或細胞毒性劑)之結合蛋白(例如抗體)。術語「試劑」表示自生物材料製得之化學化合物、化學化合物之混合物、生物大分子或萃取物。在特定實施例中，治療劑或細胞毒性劑包括(但不限於)百日咳毒素(pertussis toxin)、紫杉醇(taxol)、細胞鬆弛素B(cytochalasin B)、短桿菌肽D(gramicidin D)、溴化乙錠、依米丁(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicine)、多柔比星(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光輝黴素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycin D)、1-去氫睾甾酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)、及嘌呤黴素(puromycin)、及其類似物或同系物。
術語「晶體」及「結晶化」係指以晶體形式存在之抗體或其抗原結合部分。晶體係物質之一種固態形式，其不同於其他形式(例如非晶形固態或液體結晶態)。晶體包含原子、離子、分子(例如，諸如抗體等蛋白質)或分子總成(例如，抗原/抗體複合物)之規則重複三維陣列。該等三維陣列係根據該領域所充分瞭解之具體數學關係來佈局。晶體中重複之基本單元或結構單元稱作不對稱單元。佈局中不對稱單元依從明確定義之給定晶體對稱性之重複可產生晶體之「晶胞」。晶胞藉由規則性平移來重複可產生晶體。參見Gieg等人，第1章，Crystallization of Nucleic Acids and Proteins,A Practical Approach ，第2版(Ducruix及Gieg編輯)(Oxford University Press,New York,1999)，第1至16頁。
術語「多核苷酸」意指兩個或更多個核苷酸、核糖核苷酸(RNA)或去氧核糖核苷酸(DNA)之聚合物形式或任何類型之核苷酸的修飾形式。該術語包括DNA之單鏈及雙鏈形式，但在特定實施例中係雙鏈DNA。
術語「經分離多核苷酸」意指(例如)基因組來源、cDNA來源、或合成來源或其某一組合之多核苷酸，根據其來源，該「經分離多核苷酸」：並非與全部或一部分在天然狀態下於其中可發現該「經分離多核苷酸」之多核苷酸相結合；係以可操作方式與在天然狀態下其並未與之連接的多核苷酸相連接；或未在天然狀態中作為較大序列之一部分出現。
術語「載體」係指能夠轉運與其所連接的另一核酸的核酸分子。一類載體為「質體」，其係指其中可連接另外的DNA區段之環形雙鏈DNA環。另一類載體為病毒載體，其中該另外的DNA區段係連接至病毒基因組中。某些載體能夠在其所進入之宿主細胞中進行自主複製(例如，具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非游離型哺乳動物載體)可在進入宿主細胞中時整合至該宿主細胞之基因組中，並藉此隨宿主基因組一同複製。此外，某些載體能夠引導與其操作性連接之基因的表現。本文將此等載體稱作「重組表現載體」(或簡稱為「表現載體」)。一般而言，在重組DNA技術中可用之表現載體經常呈質體形式。在本說明書中，「質體」與「載體」可互換使用，此乃因質體係載體之最常用形式。然而，本發明欲包括可提供等效功能之其他形式之表現載體，例如病毒載體(例如，複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
術語「操作性連接」係指其中所述組件呈容許其依所計畫方式發揮功能之關係的並列。與編碼序列「操作性連接」之控制序列之連接方式應使該編碼序列之表現可在與該等控制序列相容之條件下達成。「操作性連接之」序列既包括與目標基因鄰接之表現控制序列，亦包括以傳遞或遠距作用以控制目標基因之表現控制序列。術語「表現控制序列」係指對於實現其所連接編碼序列的表現及加工不可缺少之多核苷酸序列。表現控制序列包括適宜之轉錄起始、終止、啟動子及增強子序列；有效RNA加工信號，諸如剪接及聚腺苷酸化信號；穩定胞質mRNA之序列；增強轉譯效率之序列(即，Kozak共有序列)；增強蛋白質穩定性之序列；且需要時，包括可增強蛋白質分泌之序列。該等控制序列之性質視宿主有機體而不同；在原核生物中，該等控制序列通常包括啟動子、核糖體結合位點、及轉錄終止序列；在真核生物中，該等控制序列通常包括啟動子及轉錄終止序列。術語「控制序列」意欲包括其存在對於表現及加工係不可缺少之組件且亦可包括額外的其存在係有益之組件，例如前導序列及融合夥伴序列。
「轉化」係指外源DNA進入宿主細胞之任何過程。轉化可在天然或人工條件下使用業內熟知之各種方法進行。轉化可依賴於將外源核酸序列插入原核或真核宿主細胞中之任何已知方法。該方法係基於所轉化之宿主細胞選擇，且可包括(但不限於)病毒感染、電穿孔、脂質轉染及粒子轟擊。該等「經轉化」細胞包括穩定轉化之細胞，其中插入之DNA能夠複製為自主複製質體或宿主染色體之一部分。其亦包括在有限時間段內瞬時表現插入DNA或RNA的細胞。
術語「重組宿主細胞」(或簡稱為「宿主細胞」)係指向其中引入外源DNA之細胞。應瞭解，此等術語不僅意欲指特定個體細胞而且亦指此一細胞之子代。由於突變或環境影響可使後續各代發生某些改變，因此，此子代實際上可能與母細胞不同但卻仍涵蓋於術語「宿主細胞」之範疇內。在特定實施例中，宿主細胞包括選自生命王國中之任一者的原核及真核細胞。真核細胞包括原生生物、真菌、植物及動物細胞。在特定實施例中，宿主細胞包括(但不限於)原核細胞系大腸桿菌；哺乳動物細胞系CHO、HEK 293及COS；昆蟲細胞系Sf9；及真菌細胞釀酒酵母。
重組DNA、寡核苷酸合成、及組織培養及轉化(例如，電穿孔、脂質轉染)可使用標準技術。酶促反應及純化技術可依照製造商之說明書實施，或如業內貫常方法實施，或如本文所述實施。通常可根據業內熟知之習用方法且如各種一般且更具體參考文獻中所述實施以上技術及程序，貫穿本說明書引用且論述該等參考文獻。參見(例如)Sambrook等人Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))。
「轉基因有機體」係指具有含有轉基因之細胞的有機體，其中該引入有機體(或原代有機體)中之轉基因表現在有機體中天然不表現的多肽。「轉基因」係以可操作方式穩定整合至可發育成轉基因有機體之細胞基因組中的DNA構築物，其可引導編碼基因產物在轉基因有機體之一或多種細胞類型或組織中表現。
術語「調控」與「調節」可互換使用且係指目標分子之活性(例如，hTNF-α之生物活性)的改變或變化。調節可為目標分子之某一活性或功能的量值增大或減小。分子之實例性活性及功能包括(但不限於)結合特性、酶活性、細胞受體活化及信號轉導。
相應地，術語「調節劑」係能夠使目標分子之活性或功能(例如hTNF-α之生物活性)發生改變或變化的化合物。舉例而言，與不存在調節劑下觀察到之分子某一活性或功能的量值相比，調節劑可引起該活性或功能的量值增大或減小。在某些實施例中，調節劑係抑制劑，其使分子之至少一種活性或功能的量值增大。實例性抑制劑包括(但不限於)蛋白質、肽、抗體、肽體、碳水化合物或小有機分子。肽體闡述於(例如)國際PCT公開案WO 01/83525中。
術語「激動劑」係指在與目標分子接觸時與不存在激動劑下觀察到之分子某一活性或功能的量值相比會引起該活性或功能的量值增大的調節劑。目標之特定激動劑可包括(但不限於)TNF-α多肽或多肽、核酸、碳水化合物、或結合hTNF-α之任何其他分子。
術語「拮抗劑」或「抑制劑」係指在與目標分子接觸時與不存在拮抗劑下觀察到之分子某一活性或功能的量值相比會引起該活性或功能的量值減小的調節劑。目標之特定拮抗劑包括彼等阻斷或調節TNF-α(例如hTNF-α)之生物或免疫活性者。hTNF-α之拮抗劑及抑制劑可包括(但不限於)蛋白質、核酸、碳水化合物、或結合hTNF-α之任何其他分子。
術語「有效量」係指療法足以減輕或改善病症或其一或多種症狀之嚴重程度及/或持續時間、防止病症進展、引起病症消退、防止與病症相關之一或多種症狀復發、發育、發作或進展、檢測病症或增強或概率另一療法(例如預防劑或治療劑)之預防或治療效應之量。
術語「試樣」在本文中以其最廣泛意義使用。「生物試樣」包括(但不限於)任何量的來自活的生物(living thing)或死的生物(formerly living thing)之物質。該等生物包括(但不限於)人類、小鼠、大鼠、猴、狗、兔及其他動物。該等物質包括(但不限於)血液、血清、尿、滑液、細胞、器官、組織、骨髓、淋巴結及脾。
I.結合人類TNF-α之抗體
本發明之一個態樣提供經分離鼠類單株抗體或其抗原結合部分，其以高親和性、低離解速率及高中和能力結合TNF-α。本發明之第二態樣提供結合TNF-α之嵌合抗體。本發明之第三態樣提供結合TNF-α之CDR移植抗體或其抗原結合部分。本發明之第四態樣提供結合TNF-α之人類化抗體或其抗原結合部分。在特定實施例中，抗體或其部分係經分離抗體。在一實施例中，本發明之抗體係中和人類抗TNF-α或調節TNF-α功能。
A.　製備抗TNF-α抗體之方法
本發明之抗體可由業內已知多種技術中之任一者製備。
1.　使用雜交瘤技術之抗TNF-α單株抗體
單株抗體可使用業內已知之多種技術(其包括使用雜交瘤、重組及噬菌體呈現技術、或其組合)製得。舉例而言，單株抗體可使用雜交瘤技術產生，該等技術包括彼等業內已知且教示於以下中者：例如，Harlow等人,Antibodies: A Laboratory Manual ,(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)；Hammerling等人編輯，「Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas」，Research Monographs in Immunology ，第3卷(J.L. Turk總編輯)(Elsevier,New York,1981)，第563至587頁。術語「單株抗體」並不限於經由雜交瘤技術產生之抗體。術語「單株抗體」係指源自單一純系(其包括任何真核、原核或噬菌體純系)之抗體而並非係指產生其之方法。
使用雜交瘤技術產生及篩選特異性抗體之方法係業內常規且熟知之方法。在一個實施例中，本發明提供產生單株抗體之方法以及由該方法產生之抗體，該方法包含在分泌本發明抗體之雜交瘤細胞中進行培養，其中該雜交瘤係藉由如下產生：使分離自經本發明抗原免疫之小鼠之脾細胞與骨髓瘤細胞融合且隨後篩選自雜交瘤純系之融合產生的雜交瘤，該雜交瘤純系分泌能夠結合本發明多肽之抗體。簡言之，可用TNF-α抗原免疫小鼠。在特定實施例中，投與TNF-α抗原與佐劑以刺激免疫反應。該等佐劑包括完全或不完全弗氏佐劑(Freund's adjuvant)、RIBI(胞壁醯二肽)或ISCOM(免疫刺激複合物)。該等佐劑可藉由以局部沈積掩蔽多肽而防止其快速分散，或其可含有刺激宿主分泌巨噬細胞及免疫系統之其他組份的趨化因子之物質。在特定實施例中，若投與多肽，則免疫方案將包括多肽之兩次或更多次投與，其經幾周分散開。
在對動物免疫接種TNF-α抗原後，可自動物獲得抗體及/或產生抗體之細胞。藉由使動物流血或處死動物自該動物獲得含有抗TNF-α抗體之血清。血清可如自動物獲得之原樣使用，可自血清獲得免疫球蛋白部分，或可自血清純化抗TNF-α抗體。以此方式獲得之血清或免疫球蛋白係多株，因此具有性質之異質陣列。
在檢測免疫反應時，例如，檢測小鼠血清中對抗原TNF-α具有特異性之抗體，收穫小鼠脾並分離脾細胞。隨後藉由熟知技術融合脾細胞與任何適宜骨髓瘤細胞，例如可自ATCC獲得之細胞系SP20的細胞。藉由有限稀釋選擇並選殖雜交瘤。隨後針對分泌能夠結合TNF-α之抗體的細胞藉由業內已知方法分析雜交瘤純系。可藉由用陽性雜交瘤純系免疫小鼠產生通常含有高含量抗體之腹水。
在另一實施例中，可自免疫動物製備產生抗體之永生化雜交瘤。在免疫後，處死動物並融合脾B細胞與永生化骨髓瘤細胞，如業內熟知。例如，參見Harlow及Lane，同上。在特定實施例中，骨髓瘤細胞並不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌性細胞系)。在融合及抗生素選擇後，使用TNF-α或其部分、或表現TNF-α之細胞篩選雜交瘤。在特定實施例中，使用酶聯免疫分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)實施初始篩選。ELISA篩選之實例提供於國際PCT公開案WO 00/37504中。
針對期望特性(包括健壯雜交瘤生長、高抗體產生及期望抗體特性)選擇、選殖並進一步篩選產生抗TNF-α抗體之雜交瘤，如下文進一步論述。雜交瘤可在同源動物、無免疫細胞之動物(例如，裸鼠)中活體內培養並擴大或在細胞培養物中活體外培養並擴大。選擇、選殖及擴大雜交瘤之方法已為彼等熟習此項技術者所熟知。
在特定實施例中，雜交瘤係上述小鼠雜交瘤。在另一特定實施例中，在非人類、非小鼠物種(例如大鼠、綿羊、豬、山羊、牛或馬)中產生雜交瘤。在另一實施例中，雜交瘤係人類雜交瘤，其中融合人類非分泌性骨髓瘤與表現抗TNF-α抗體之人類細胞。
可藉由已知技術產生識別特異性表位的抗體片段。舉例而言，可藉由使用諸如木瓜酶(用以產生Fab片段)或胃蛋白酶(用以產生F(ab')2片段)等酶溶蛋白性裂解免疫球蛋白分子來產生本發明之Fab及F(ab')2片段。F(ab')2片段含有可變區、輕鏈恆定區、及重鏈之CHI域。
2.　使用SLAM之抗TNF-α單株抗體
在本發明之另一態樣中，使用業內稱作選定淋巴細胞抗體方法(SLAM)之程序自單一經分離淋巴細胞產生重組抗體，如美國專利第5,627,052號、PCT公開案WO 92/02551及Babcook等人(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848中所述。在此方法中，使用抗原特異性溶血空斑分析篩選分泌目標抗體之單一細胞(例如，自部分1中所述免疫之動物中之任一者衍生的淋巴細胞)，其中使用連接體(例如生物素)偶合抗原TNF-α、TNF-α之亞單位或其片段與綿羊紅血細胞，且其用於鑑別分泌對TNF-α具有特異性之抗體的單一細胞。在鑑別分泌抗體之目標細胞後，藉由逆轉錄酶-PCR自細胞解救重鏈及輕鏈可變區cDNA，且隨後該等可變區可在適當免疫球蛋白恆定區(例如人類恆定區)背景下於哺乳動物宿主細胞(例如COS或CHO細胞)中表現。隨後在活體外進一步分析並選擇經擴增免疫球蛋白序列轉染之宿主細胞(源自活體內選定淋巴細胞)，例如淘選轉染細胞以分離表現針對TNF-α之抗體的細胞。可藉由(例如)活體外親和成熟方法(例如彼等闡述於PCT公開案WO 97/29131及PCT公開案WO 00/56772中者)在活體外進一步處理擴增免疫球蛋白序列。
3.　使用轉基因動物之抗TNF-α單株抗體
在本發明之另一實施例中，藉由用TNF-α抗原免疫包含一些或所有人類免疫球蛋白基因座之非人類動物產生抗體。在特定實施例中，非人類動物係XENOMOUSE轉基因小鼠，即包含人類免疫球蛋白基因座之大片段且缺乏小鼠抗體產生之經改造小鼠品系。參見(例如)Green等人(1994) Nature Genet. 7:13-21及美國專利5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598及6,130,364。亦參見於1991年7月25日公開之PCT公開案WO 91/10741、於1994年2月3日公開之WO 94/02602、二者於1996年10月31日公開之WO 96/34096及WO 96/33735、於1998年4月23日公開之WO 98/16654、於1998年6月11日公開之WO 98/24893、於1998年11月12日公開之WO 98/50433、於1999年9月10日公開之WO 99/45031、於1999年10月21日公開之WO 99/53049、於2000年2月24日公開之WO 00/09560及2000年6月29日公開之WO 00/37504。XENOMOUSE轉基因小鼠產生全人類抗體之成人樣人類文庫，且產生抗原特異性人類Mab。XENOMOUSE轉基因小鼠經由引入人類重鏈基因座及x輕鏈基因座之巨鹼基大小的生殖系構造含有約80%人類抗體文庫。參見Mendez等人(1997) Nature Genet. 15:146-156；Green及Jakobovits(1998) J. Exp. Med. 188:483-495。
4.　使用重組抗體庫之抗TNF-α單株抗體
亦可使用活體外方法製備本發明抗體，其中抗體庫經篩選以鑑別具有期望結合特異性之抗體。重組抗體庫之該等篩選方法已為業內所熟知且包括以下中所述之方法，例如，美國專利第5,223,409號、PCT公開案WO 92/18619、WO 91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690及WO 97/29131、Fuchs等人(1991) Bio/Technology 9:1369-1372；Hay等人(1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85；Huse等人(1989) Science 246:1275-1281；McCafferty等人(1990) Nature 348:552-554；Griffiths等人(1993) EMBO J. 12:725-734；Hawkins等人(1992) J. Mol. Biol. 226:889-896；Clackson等人(1991) Nature 352:624-628；Gram等人(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580；Garrard等人(1991) Bio/Technology 9:1373-1377；Hoogenboom等人(1991) Nucl. Acid Res. 19:4133-4137；及Barbas等人(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982；及美國專利公開案第2003.0186374號。
重組抗體庫可來自經TNF-α或TNF-α之一部分免疫之個體。或者，重組抗體庫可來自天然個體，即未經TNF-α免疫之個體，例如來自未經人類TNF-α免疫之人類個體的人類抗體庫。藉由用包含人類TNF-α之肽篩選重組抗體庫選擇本發明抗體，藉此選擇彼等識別TNF-α之抗體。實施該篩選及選擇之方法已為業內所熟知，例如闡述於前述段落中之參考文獻中。為選擇對hTNF-α具有特定結合親和性之本發明抗體(例如，彼等以特定koff 速率常數自人類TNF-α解離者)，可使用表面電漿共振之業內已知方法來選擇具有期望koff 速率常數的抗體。為選擇對hTNF-α具有特定中和活性之本發明抗體(例如彼等具有特定IC50 者)，可使用評定hTNF-α活性之抑制的業內已知標準方法。
在一個態樣中，本發明係關於結合TNF-α(例如人類TNF-α)之經分離抗體或其抗原結合部分。在特定實施例中，抗體係中和抗體。在各個實施例中，抗體係重組抗體或單株抗體。
舉例而言，亦可使用業內已知之各種噬菌體呈現方法產生本發明抗體。在噬菌體呈現方法中，在噬菌體粒子表面上呈現功能抗體域，該等噬菌體粒子攜帶編碼其之多核苷酸序列。該噬菌體特別可用於呈現自文庫或重組抗體庫(例如人類或鼠類)表現之抗原結合域。可利用抗原(例如使用經標記抗原或結合或捕獲至固體表面或珠粒之抗原)選擇或鑒定表現結合目標抗原之抗原結合域的噬菌體。該等方法中所用噬菌體通常係包括fd及M13在內的絲狀噬菌體，自噬菌體表現之結合域與Fab、Fv或二硫鍵穩定之Fv抗體域重組融合成噬菌體基因III蛋白或基因VIII蛋白。可用於製備本發明抗體之噬菌體呈現方法的實例包括彼等揭示於以下中者：Brinkmann等人(1995) J. Immunol. Methods 182:41-50；Ames等人，(1995) J. Immunol. Methods 184:177-186；Kettleborough等人，(1994) Eur. J. Immunol. 24:952-958；Persic等人，(1997) Gene 187 9-18；Burton等人(1994) Adv. Immunol. 57:191-280；PCT公開案WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047(PCT公開案第PCT/GB91/01134號)、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、及WO 95/20401、及美國專利第5,698,426號、第5,223,409號、第5,403,484號、第5,580,717號、第5,427,908號、第5,821,047號、第5,571,698號、第5,427,908號、第5,516,637號、第5,780,225號、第5,658,727號、第5,733,743號及第5,969,108號。
如以上參考文獻中所述，在噬菌體選擇後，噬菌體之編碼抗體之區可經分離並用於產生包括人類抗體或任何其他抗原結合片段的全抗體，且在任何期望宿主(包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母及細菌)中表現，如下文詳細所述。舉例而言，亦可使用業內已知方法採用重組產生Fab、Fab'及F(ab')2片段的技術，該等方法例如彼等揭示於以下中者：PCT公開案WO 92/22324；Mullinax等人(1992) BioTechniques 12(6):864-869；及Sawai等人(1995) Am. J. Reprod. Immunol. 34:26-34；及Better等人(1998) Science 240:1041-1043。可用於產生單鏈Fvs及抗體之技術的實例包括彼等闡述於以下中者：美國專利第4,946,778號及第5,258,498號；Huston等人(1991) Methods Enzymol. 203:46-88；Shu等人，(1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:7995-7999；及Skerra等人(1998) Science 240:1038-1041。
可施用藉由噬菌體呈現、篩選大的組合庫之業內已知其他方法篩選重組抗體庫之替代方案來鑒定本發明之雙重特異性抗體。一類替代表現系統係其中重組抗體庫表現為RNA-蛋白融合物者，如PCT公開案第WO 98/31700號及Roberts and Szostak(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302中所述。在該系統中，在mRNA與肽或蛋白質之間產生共價融合，該肽或蛋白質藉由在其3'末端攜帶嘌呤黴素(一種肽基受體抗生素)之合成mRNA的活體外轉譯進行編碼。因此，可基於編碼肽或蛋白質(例如，抗體或其部分)之性質(例如抗體或其部分與雙重特異性抗原之結合)自mRNA(例如重組庫)富集特異性mRNA。可藉由上述重組方式(例如，在哺乳動物宿主細胞中)表現自該等庫之篩選回收的編碼抗體或其部分之核酸序列，且另外，其可藉由額外輪篩選已將突變引入最初所選序列的mRNA-肽融合物、或藉由重組抗體之活體外親和性成熟的其他方法(如上文所述)進一步經受親和性成熟。
在另一方法中，亦可使用業內已知之酵母呈現方法產生本發明抗體。在酵母呈現方法中，使用遺傳方法將抗體域結合至酵母細胞壁並使其在酵母表面上呈現。具體而言，可採用該酵母呈現自文庫或組合抗體庫(例如人類或鼠類)表現之抗原結合域。可用於製備本發明抗體之酵母呈現方法的實例包括彼等揭示於Wittrup等人之美國專利第6,699,658號及Frenken等人之美國專利第6,114,147號中者。
B.　重組TNF-α抗體之產生
本發明抗體可藉由業內已知多種技術中之任一者產生。舉例而言，自宿主細胞表現，其中藉由標準技術將編碼重鏈及輕鏈之表現載體轉染至宿主細胞中。術語「轉染」之各種形式意欲涵蓋眾多種習用於將外源DNA引入原核或真核宿主細胞中之技術，例如，電穿孔、磷酸鈣沉澱、DEAE-葡聚糖轉染及諸如此類。儘管可在原核或真核宿主細胞中表現本發明抗體，但預期在真核細胞(例如哺乳動物宿主細胞)中表現抗體，此乃因此等真核細胞(且特定而言哺乳動物細胞)比原核細胞更有可能裝配並分泌經適當摺疊且具有免疫活性之抗體。
用於表現本發明重組抗體之哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)(包括dhfr-CHO細胞，其闡述於Urlaub及Chasin,(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220中，其與DHFR可選標記(例如，如Kaufman及Sharp(1982) J. Mol. Biol. 159:601-621中所述)連用)、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。當將編碼抗體基因之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，藉由將宿主細胞培養一段時間來產生抗體，該段時間足以使宿主細胞中表現抗體或(具體而言)使抗體分泌至生長宿主細胞之培養基中。可使用標準蛋白純化方法自培養基回收抗體。
宿主細胞亦可用來產生功能抗體片段，例如Fab片段或scFv分子。應瞭解，上述程序之變化形式在本發明範疇內。舉例而言，可能期望用編碼本發明抗體之輕鏈及/或重鏈之功能片段的DNA轉染宿主細胞。亦可使用重組DNA技術去除某些或所有編碼輕鏈及重鏈之一者或二者的DNA，該等輕鏈及重鏈不需結合至目標抗原。本發明抗體亦涵蓋自該截短DNA分子表現的分子。另外，可藉由標準化學交聯方法使本發明抗體與第二抗體交聯來產生雙功能抗體，其中一條重鏈及一條輕鏈係本發明抗體且另一重鏈及輕鏈對除目標抗原以外之抗原具有特異性。
在用於重組表現本發明之抗體或其抗原結合部分之實例性系統中，藉由磷酸鈣調介之轉染將編碼抗體重鏈與抗體輕鏈二者之重組表現載體引入dhfr-CHO細胞中。在重組表現載體內，抗體重鏈及輕鏈基因各自以可操作方式連接至CMV增強子/AdMLP啟動子調節元件以驅動較高程度之基因轉錄。重組表現載體亦攜帶DHFR基因，從而使得可對已利用胺甲蝶呤選擇/擴增經載體轉染的CHO細胞進行選擇。對所選轉化體宿主細胞進行培養以表現抗體重鏈及輕鏈並自培養基回收完整抗體。使用標凖分子生物學技術來製備重組表現載體，對宿主細胞實施轉染，選擇轉化體，培養宿主細胞並自培養基回收抗體。另外，本發明提供藉由在適宜培養基中培養本發明宿主細胞直至合成本發明重組抗體來合成本發明重組抗體的方法。該方法可進一步包含自培養基分離重組抗體。
1.　抗hTNF-α抗體
表5係本發明抗hTNF-α抗體之VH及VL區(加粗之CDR序列)的胺基酸序列列表。
2.　抗hTNF-α嵌合抗體
嵌合抗體係抗體之不同部分源自不同動物物種(例如，具有可變區之抗體源自鼠類單株抗體及人類免疫球蛋白恆定區)的分子。產生嵌合抗體之方法已為業內已知且在實例2.1中加以詳細論述。參見(例如)Morrison(1985) Science 229:1202；Oi等人(1986) BioTechniques 4:214-221；Gillies等人(1989) J. Immunol. Methods 125:191-202；美國專利第5,807,715號、第4,816,567號及第4,816,397號。另外，可使用開發用於產生「嵌合抗體」之技術(Morrison等人(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855；Neuberger等人(1984),Nature 312:604-608；Takeda等人(1985) Nature 314:452-454；藉由剪接適當抗原特異性之小鼠抗體分子的基因以及適當生物活性之人類抗體分子的基因達成)。
在一個實施例中，藉由用人類IgG1恆定區替換部分1中所述鼠類單株抗人類TNF-α抗體之重鏈恆定區產生本發明嵌合抗體。
3.　抗TNF-α CDR-移植抗體
本發明CDR移植抗體包含人類抗體之重鏈及輕鏈可變區序列，其中VH及/或VL之一或多個CDR區經本發明鼠類抗體之CDR序列替換。任何人類抗體之框架序列可用作CDR移植之模板。然而，於該框架上之直鏈替換經常導致與抗原之結合親和性造成一些損失。人類抗體與初始鼠類抗體之同源性越大，組合鼠類CDR與人類框架之可能性將引入CDR畸變(其可降低親和性)的可能就越小。因此，在一實施例中，經選擇以替換除CDR外之鼠類可變框架的人類可變框架與鼠類抗體可變區具有至少65%序列一致性。在特定實施例中，除CDR外之人類及鼠類可變區具有至少70%序列一致性。在特定實施例中，除CDR外之人類及鼠類可變區具有至少75%序列一致性。在特定實施例中，除CDR外之人類及鼠類可變區具有至少80%序列一致性。產生嵌合抗體之方法已為業內已知且在實例2.2中加以詳細論述。(亦參見歐洲專利第EP 0 239 400號、PCT公開案WO 91/09967、美國專利第5,225,539號、第5,530,101號及第5,585,089號)，覆蓋或翻新(EP 0 592 106、EP 0 519 596、Padlan(1991)Mol. Immunol. 28(4/5):489-498；Studnicka等人(1994) Protein Eng. 7(6):805-814；Roguska等人(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973)，及鏈改組(美國專利第5,565,352號)。
在具體實施例中，本發明提供如表6中所述具有VH及/或VL鏈之CDR移植抗體。
4.　抗hTNF-α人類抗體
人類化抗體係來自非人類物種抗體之抗體分子，該非人類物種抗體結合具有非人類物種之一或多個互補決定區(CDR)及人類免疫球蛋白分子之框架區的期望抗原。已知人類Ig序列揭示於以下中：例如，www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi；www.atcc.org/phage/hdb.html；www.sciquest.com/；www.abcam.com/；www.antibodyresource.com/onlinecomp.html；www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html；www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html；www.whfreeman.com/immunology/CH-05/kuby05.htm；www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html；www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/；www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m-ikeimages.html；www.antibodyresource.com/；mcb.harvard.edu/BioLinks/Immuno-logy.html.www.immunologylink.com/；pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.-html；www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/；www.pebio.com/pa/340913/340913.html-；www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/；www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito-/Elisa.html；www.biodesign.com/table.asp；www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin-ks.html；www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html；www.isac-net.org/sites_geo.html；aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP-Start.html；baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html；www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/；www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html；www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html；imgt.cnusc.fr:8104/；www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html；antibody.bath.ac.uk/；abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html；www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem-inar/Slide01.html；www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/；www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm；www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h-umanisation/TAHHP.html；www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html；www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html；www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo-ut.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html；www.jerini.de/fr roducts.htm；www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S. Dept. Health(1983)。該等引入序列可用於降低免疫原性、或降低、增強或改變結合性、親和性、締合速率、離解速率、抗體親抗原性、特異性、半衰期或如業內已知之任何其他適宜性質。
人類框架區中之框架殘基可經CDR供體抗體之相應殘基取代以改變、改良抗原結合性。藉由業內熟知之方法鑑別該等框架取代，例如，對CDR與框架殘基之間之相互作用建模以鑑別對抗原結合重要之框架殘基，及對比序列以鑑別特定位置處之不尋常框架殘基。(例如，參見美國專利第5,585,089號；Riechmann等人(1988) Nature 332:323-327)。三維免疫球蛋白模型通常可購得且為彼等熟習此項技術者所熟知。可使用電腦程式，該等電腦程式可闡明並展示所選候選免疫球蛋白序列之可能的三維構象結構。藉由觀察該等展示內容可分析殘基在候選免疫球蛋白序列功能行使中之可能作用，即分析可影響候選免疫球蛋白結合其抗原之能力的殘基。以此方式，可自共有序列及引入序列中選擇FR殘基併合併以達成期望抗體特性，例如對靶抗原之親和性增加。一般而言，CDR殘基直接且最為實質性地參與影響抗原結合。可使用業內已知之多種技術人類化抗體，例如蛋白限於彼等闡述於以下中者：Jones等人(1986) Nature 321:522-525；Verhoeyen等人(1988) Science 239:1534-1536；Sims等人(1993) J. Immunol. 151: 2296-2308；Chothia及Lesk(1987) J. Mol. Biol. 196:901-917；Carter等人(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289；Presta等人(1993) J. Immunol. 151:2623-2632；Padlan(1991) Mol. Immunol. 28(4/5):489-498；Studnicka等人(1994) Protein Engineering 7(6):805-814；Roguska.等人(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973；PCT公開案第WO 91/09967號、WO 99/06834(國際公開案第PCT/US98/16280號)、WO 97/20032(申請案第PCT/US96/18978號)、WO 92/11272(申請案第PCT/US91/09630號)、WO 92/03461(申請案第PCT/US91/05939號)、WO 94/18219(申請案第PCT/US94/01234號)、WO 92/01047(申請案第PCT/GB91/01134號)、WO 93/06213(申請案第PCT/GB92/01755號)、WO 90/14443、WO 90/14424及WO 90/14430；歐洲公開案第EP 0 592 106號、第EP 0 519 596號及第EP 0 239 400號、美國專利第5,565,332號、第5,723,323號、第5,976,862號、第5,824,514號、第5,817,483號、第5,814,476號、第5,763,192號、第5,723,323號、第5,766,886號、第5,714,352號、第6,204,023號、第6,180,370號、第5,693,762號、第5,530,101號、第5,585,089號、第5,225,539號、及第4,816,567號。
C.　抗體及產生抗體之細胞系的產生
在一實施例中，本發明抗TNF-α抗體呈現降低或中和TNF-α活性的高能力，例如，如由業內已知之若干活體外及活體內分析中之任一者所評定。或者，本發明抗TNF-α抗體亦呈現增大或激動TNF-α活性的高能力。
在特定實施例中，分離抗體或其抗原結合部分結合人類TNF-α，其中該抗體或其抗原結合部分以如藉由表面電漿共振所測定之約0.1 s-1 或更小的koff 速率自人類TNF-α解離，或其以約1×10-6 M或更小之IC50 抑制人類TNF-α活性。或者，抗體或其抗原結合部分可以如藉由表面電漿共振所測定之約1×10-2 s-1 或更小的koff 速率自人類TNF-α解離，或可以約1×10-7 M或更小之IC50 抑制人類TNF-α活性。或者，抗體或其抗原結合部分可以如藉由表面電漿共振所測定之約1×10-3 s-1 或更小的koff 速率自人類TNF-α解離，或可以約1×10-8 M或更小之IC50 抑制人類TNF-α活性。或者，抗體或其抗原結合部分可以如藉由表面電漿共振所測定之約1×10-4 s-1 或更小的koff 速率自人類TNF-α解離，或可以約1×10-9 M或更小之IC50 抑制人類TNF-α活性。或者，抗體或其抗原結合部分可以如藉由表面電漿共振所測定之約1×10-5 s-1 或更小的koff 速率自人類TNF-α解離，或可以約1×10-10 M或更小之IC50 抑制人類TNF-α活性。或者，抗體或其抗原結合部分以如藉由表面電漿共振所測定之約1×10-5 s-1 或更小的koff 速率自人類TNF-α解離，或可以約1×10-11 M或更小之IC50 抑制人類TNF-α活性。
在某些實施例中，抗體包含重鏈恆定區，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區。在一實施例中，重鏈恆定區係IgG1重鏈恆定區或IgG4重鏈恆定區。此外，抗體可包含輕鏈恆定區，即κ輕鏈恆定區或λ輕鏈恆定區。在另一實施例中，抗體包含κ輕鏈恆定區。或者，抗體部分可為(例如)Fab片段或單鏈Fv片段。
藉由替換Fc部分中之胺基酸殘基以改變抗體效應功能已為業內所知(參見美國專利第5,648,260號及第5,624,821號)。抗體之Fc部分調介若干重要效應功能，例如，抗體及抗原-抗體複合物之細胞因子誘發、ADCC、吞噬作用、補體依賴細胞毒性(CDC)及半衰期/清除速率。在一些情形下，該等效應功能對於治療性抗體係期望的，但在其他情形下端視治療目的可能為不需要或甚至有害的。某些人類IgG同種型、具體而言IgG1及IgG3分別經由結合至FcγR及補體Clq調介ADCC及CDC。新生兒Fc受體(FcRn)係決定抗體之循環半衰期之至關重要的組份。在又一實施例中，替換抗體之恆定區(例如，抗體之Fc區)中的至少一個胺基酸殘基以改變抗體之效應功能。
一個實施例提供經標記結合蛋白，其中本發明之抗體或抗體部分經衍生化或連接至另一功能分子(例如，另一肽或蛋白質)。舉例而言，本發明之經標記結合蛋白可藉由將本發明抗體或抗體部分以官能團方式連接(藉由化學偶合、基因融合、非共價鍵締合或其他方式)至一或多個其他分子實體，例如另一抗體(例如，雙特異性抗體或雙功能抗體)、檢測劑、細胞毒性劑、醫藥劑及/或可調介該抗體或抗體部分與另一分子締合之蛋白質或肽(例如抗生蛋白鏈菌素核心區或聚組胺酸標籤)來衍生。
可用以衍生本發明抗體或抗體部分之可用檢測劑包括螢光化合物。例示性螢光檢測劑包括螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、5-二甲基胺-1-萘磺醯氯、藻紅蛋白及諸如此類。亦可用諸如鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶及諸如此類等檢測酶來衍生抗體。當用檢測酶衍生抗體時，其係藉由添加可供該酶利用以產生可檢測反應產物的其他試劑來檢測。舉例而言，當存在檢測劑辣根過氧化物酶時，添加過氧化氫及二胺基聯苯胺可生成可檢測之有色反應產物。亦可用生物素衍生抗體並藉助間接量測抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素結合來加以檢測。
本發明之另一實施例提供結晶結合蛋白。在一實施例中，本發明係關於如本文所揭示全抗TNF-α抗體及其片段之晶體及包含該等晶體之調配物及組合物。在一個實施例中，結晶結合蛋白之活體內半衰期長於結合蛋白之可溶性對應部分。在另一實施例中，結合蛋白在結晶後保留生物活性。
本發明之結晶結合蛋白可根據業內已知且如PCT公開案WO 02/72636中所揭示方法產生。
本發明之另一實施例提供糖基化結合蛋白，其中抗體或其抗原結合部分包含一或多個碳水化合物殘基。活體內新生蛋白之產生可經歷其他處理，稱作轉譯後修飾。具體而言，可以酶方式添加糖(糖基)殘基，即一種稱作糖基化之製程。具有共價連接寡糖側鏈之所得蛋白稱作糖基化蛋白或糖蛋白。蛋白糖基化取決於目標蛋白之胺基酸序列、以及表現蛋白之宿主細胞。不同有機體可產生不同糖基化酶(例如，糖基轉移酶及糖苷酶)且可獲得不同物質(核苷酸糖)。由於該等因素，蛋白糖基化模式及糖基殘基之組成端視表現特定蛋白之宿主系統而有所不同。本發明中有用之糖基殘基可包括(但不限於)葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、n-乙醯葡糖胺及唾液酸。在一實施例中，糖基化結合蛋白包含糖基殘基以使糖基化模式係人類。
彼等熟習此項技術者已知，不同蛋白糖基化可產生不同蛋白特性。舉例而言，微生物宿主(例如酵母)中產生並利用酵母內源途徑糖基化之治療蛋白的功效與在哺乳動物細胞(例如CHO細胞系)中表現之相同蛋白相比可降低。該等糖蛋白亦可在人類中具有免疫原性且在投與後顯示活體內半衰期降低。人類及其他動物中之特異性受體可識別特異性糖基殘基並促使自血流快速清除蛋白。其他不良作用可包括以下中之變化：蛋白摺疊、溶解性、對蛋白酶之易感性、運輸、輸送、分室、分泌、由其他蛋白或因子之識別性、抗原性或致敏性。因此，從業者可偏好具有特定組成及糖基化模式之治療蛋白，例如與人類細胞或既定個體動物之物種特異性細胞中產生者相同或至少類似之糖基化組成及模式。
可藉由以遺傳方式改變宿主細胞以表現異源糖基化酶來表現不同於宿主細胞之糖基化蛋白。從業者可使用業內已知之技術產生呈現人類蛋白糖基化之抗體或其抗原結合部分。舉例而言，以遺傳方式改變酵母菌株以表現非天然存在之糖基化酶，以使該等酵母菌株中產生之糖基化蛋白(糖蛋白)呈現與動物細胞、尤其人類細胞之蛋白糖基化相同之蛋白糖基化(美國專利第7,449,308號及第7,029,872號)。
此外，熟習此項技術者應瞭解，可使用經遺傳改造之宿主細胞庫表現各種糖基化酶來表現目標蛋白，以使庫之成員宿主細胞產生具有不同糖基化模式之目標蛋白。從業者隨後可選擇並分離具有特定新穎糖基化模式之目標蛋白。在一實施例中，具有經特定選擇之新穎糖基化模式的蛋白呈現改良或改變之生物性質。
D.　抗TNF-α抗體之使用
舉例而言，本發明抗人類TNF-α抗體或其部分由於結合人類TNF-α之能力可使用習用免疫分析(例如酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)或組織免疫組織化學)用於檢測TNF-α(例如，在諸如血清或血漿等生物試樣中)。本發明提供檢測生物試樣中之TNF-α的方法，其包含使生物試樣與本發明抗體或抗體部分接觸並檢測與TNF-α結合之抗體(或抗體部分)或未結合抗體(或抗體部分)，藉此檢測生物試樣中之TNF-α。抗體直接或間接地經可檢測物質標記以幫助檢測結合或未結合抗體。適宜可檢測物質包括各種酶、輔基、螢光材料、發光材料及放射性材料。適宜酶之實例包括辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；適宜輔基複合物之實例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生物素蛋白/生物素；適宜螢光材料之實例包括傘形酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹醯氯或藻紅蛋白；發光材料之實例包括胺基苯二醯肼；且適宜放射性材料之實例包括3 H、14 C、35 S、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I、177 Lu、166 Ho或153 Sm。
作為標記抗體之替代方案，可藉由利用經可檢測物質標記之rhTNF-α標準物及未標記抗人類TNF-α抗體的競爭免疫分析在生物流體中分析人類TNF-α。在該分析中，將生物試樣、經標記rhTNF-α標凖物及抗人類TNF-α抗體組合並測定結合至未經標記抗體之經標記rhTNF-α標凖物之量。生物試樣中之人類TNF-α的量與結合至抗TNF-α抗體之經標記rhTNF-α標準物的量成反比。類似地，亦可藉由使用經可檢測物質標記之rhTNF-α標準物及未標記抗人類TNF-α抗體的競爭免疫分析在生物流體中分析人類TNF-α。
在一實施例中，本發明抗體及抗體部分能夠中和活體外及活體內TNF-α活性，例如人類TNF-α活性。在另一實施例中，本發明抗體及抗體部分能夠增加或激動TNF-α活性，例如人類TNF-α活性。因此，本發明之該等抗體及抗體部分可用於抑制或增加(例如)含有hTNF-α之細胞培養物、人類個體或具有與本發明抗體交叉反應之TNF-α的其他哺乳動物個體中之hTNF-α活性。在一個實施例中，本發明提供抑制或增加hTNF-α活性之方法，其包含使hTNF-α與本發明抗體或抗體部分接觸以抑制或增加hTNF-α活性。舉例而言，在含有或懷疑含有hTNF-α之細胞培養物中，可將本發明抗體或抗體部分添加至培養基中以抑制或增加培養物中之hTNF-α活性。
在另一實施例中，本發明提供降低或增加個體之hTNF-α活性的方法，該個體有利地係患有TNF-α活性有害或者有利之疾病或病症的個體。本發明提供降低或增加患有該疾病或病症之個體的TNF-α活性之方法，該方法包含投與該個體本發明抗體或抗體部分以降低或增加個體中之TNF-α活性。在特定實施例中，TNF-α係人類TNF-α，且個體係人類個體。或者，個體可為表現能夠與本發明抗體結合之TNF-α的哺乳動物。此外，個體可為向其中引入TNF-α(例如，藉由投與TNF-α或藉由表現TNF-α轉基因)之哺乳動物。可出於治療目的向人類個體投與本發明抗體。此外，出於獸醫目的或作為人類疾病之動物模型，可將本發明抗體投與表現TNF-α之非人類哺乳動物，該TNF-α能夠與抗體結合。關於後者，該等動物模型可用於評估本發明抗體之治療功效(例如，測試投與劑量及時程)。
術語「TNF-α活性有害之病症」包括疾病及其他病症，其中已顯示TNF-α活性在患有該病症之個體中之存在係或懷疑係造成該病症病理生理學的原因或導致該病症惡化之因素。因此，TNF-α活性有害之病症係預計降低TNF-α活性可緩解病症之症狀及/或進展的病症。此等病症可藉由(例如)增加TNF-α在患有該病症之個體之生物流體中之濃度(例如，增加TNF-α在該個體之血清、血漿、滑液等中之濃度)來證實，該增加可利用(例如)上文所述抗TNF-α抗體來檢測。可用本發明抗體治療之病症的非限制性實例包括彼等下文關於本發明抗體之醫藥組合物之部分中論述的病症。
或者，術語「TNF-α活性有利之病症」包括疾病及其他病症，其中已顯示在患有該病症之個體中存在TNF-α活性有利於或懷疑有利於治療該病症病理生理學的原因或促使該病症治療之因素。因此，TNF-α活性有利之病症係預計增加TNF-α活性可緩解病症之症狀及/或進展的病症。可用本發明抗體治療之病症的非限制性實例包括彼等下文關於本發明抗體之醫藥組合物之部分中論述的病症。
E.　醫藥組合物
本發明亦提供包含本發明抗體或其抗原結合部分及醫藥上可接受之載劑的醫藥組合物。包含本發明抗體之醫藥組合物可用於(但不限於)診斷、檢測或監測病症，預防、治療、管控或改善病症或其一或多種症狀，及/或用於研究。在具體實施例中，組合物包含一或多種本發明抗體。在另一實施例中，醫藥組合物包含一或多種本發明抗體及一或多種除本發明抗體以外之預防劑或治療劑以治療TNF-α活性有害的病症。在特定實施例中，預防劑或治療劑已知可用於或已經用於或目前正用於預防、治療、管控或改善病症或其一或多種症狀。根據該等實施例，該組合物可進一步包含載劑、稀釋劑或賦形劑。
本發明抗體及抗體部分可納入適於投與個體之醫藥組合物中。通常，醫藥組合物包含本發明抗體或抗體部分及醫藥上可接受之載劑。術語「醫藥上可接受之載劑」包括任何及所有生理上相容之溶劑、分散介質、塗佈劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑、及諸如此類。醫藥上可接受之載劑之實例包括以下中之一或多者以及其組合：水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及諸如此類。在許多情況下，可將等滲劑，例如，糖、多元醇(例如，甘露醇、山梨醇)或氯化鈉納入組合物中。醫藥上可接受之載劑可進一步包含少量輔助性物質，例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩衝液，其可增強抗體或抗體部分之存架壽命或有效性。
已知且可使用各種遞送系統來投與一或多種本發明抗體或一或多種本發明抗體與可用於預防、管控、治療或改善病症或其一或多種症狀之預防劑或治療劑之組合，該等遞送系統係例如脂質體囊封物、微粒、微膠囊、能夠表現抗體或抗體片段之重組細胞，受體調介之胞吞作用(例如，參見Wu及Wu(1987)J. Biol. Chem. 262:4429-4432)，作為逆轉錄病毒或其他載體之一部分的核酸構造物。投與本發明預防劑或治療劑之方法包括(但不限於)非經腸投與(例如，皮內、肌內、腹膜內、靜脈內及皮下)、硬膜外投與、瘤內投與及黏膜投與(例如，鼻內及經口途徑)。另外，可藉由使用(例如)吸入器或噴霧器及與氣溶膠化劑一起調配來利用肺投與。參見(例如)美國專利第6,019,968號、第5,985,320號、第5,985,309號、第5,934,272號、第5,874,064號、第5,855,913號及第5,290,540號；及PCT公開案第WO 92/19244號、第WO 97/32572號、第WO 97/44013號、第WO 98/31346號及第WO 99/66903號。在一個實施例中，使用Alkermes AIR經肺藥物遞送技術(Alkermes公司，Cambridge,Mass.)投與本發明抗體、組合療法或本發明組合物。在具體實施例中，本發明預防劑或治療劑係經肌內、靜脈內、瘤內、經口、鼻內、經肺或皮下投與。預防劑或治療劑可藉由任何習用途徑(例如，藉由輸注或濃注，藉由經上皮或皮膚黏膜內層(例如，口腔黏膜、直腸及腸黏膜等)吸收)投與，且可與其他生物活性劑一起投與。投與可為全身性或局部。
在具體實施例中，可期望將本發明預防劑或治療劑局部投與至需要治療之區域；此可藉由(例如但不限於)局部輸注、藉由注射、或借助植入體達成；該植入體為多孔或非多孔材料，包括膜及基質，例如矽橡膠膜(sialastic membrane)、聚合物、纖維基質(例如Tissuel)或膠原基質。在一個實施例中，將有效量之本發明一或多種抗體拮抗劑局部投與至個體之受感染區域以預防、治療、管控及/或改善病症或其症狀。在另一實施例中，將有效量之一或多種本發明抗體與有效量之除本發明抗體以外之一或多種治療劑(例如，一或多種預防劑或治療劑)組合局部投與至個體之受感染區域，從而預防、治療、管控及/或改善病症或其一或多種症狀。
在另一實施例中，可以控制釋放或持續釋放系統遞送預防劑或治療劑。在一個實施例中，可使用幫浦達成控制或持續釋放(參見Langer，同上；Sefton(1987) CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240；Buchwald等人(1980) Surgery 88:507-516；Saudek等人(1989) N. Engl. J. Med. 321:574-579)。在另一實施例中，可使用聚合材料達成本發明治療劑之控制或持續釋放(參見(例如)Goodson,J.M.，第6章，Medical Applications of Controlled Release，第II卷，Applications and Evaluation, (Langer及Wise編輯(CRC Press公司，Boca Raton,1984)，第115至138頁；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance (Smolen及Ball編輯)(Wiley,New York,1984)；Langer及Peppas(1983) J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. Phys. C23(1):61-126；亦參見Levy等人(1985) Science 228:190-192；During等人(1989) Ann. Neurol. 25:351-356；Howard等人(1989) J. Neurosurg. 71:105-112)；美國專利第5,679,377號、第5,916,597號、第5,912,015號、第5,989,463號及第5,128,326號；及PCT公開案WO 99/15154及WO 99/20253。持續釋放調配物中所用聚合物之實例包括(但不限於)聚(甲基丙烯酸2-羥基乙基酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙酸伸乙基-共-乙烯基酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯基吡咯啶酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯醯胺、聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、聚(乳酸-共-乙交酯)(PLGA)及聚原酸酯。在特定實施例中，持續釋放調配物中所用聚合物係惰性的、不含可浸出雜質、在儲存時穩定、無菌且生物可降解。在又一實施例中，可靠近預防或治療靶標放置控制或持續釋放系統，由此僅需要一部分全身劑量(參見(例如)Goodson,Medical Applications of Controlled Release ，第II卷，同上，第115-138頁(1984))。
控制釋放系統論述於Langer之綜述中(1990,Science 249:1527-1533)。可使用彼等熟習此項技術者已知之任一技術來產生包含本發明一或多種治療劑之持續釋放調配物。參見(例如)美國專利第4,526,938號、PCT公開案WO 91/05548、PCT公開案WO 96/20698，Ning等人(1996) Radiotherapy Oncol.39:179-189；Song等人，(1996) PDA J. Pharm. Sci. Technol. 50:372-377；Cleek等人(1997) Proceed. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854，及Lam等人(1997) Proceed.Int'l. Symp. Controk Rel. Bioact. Matter. 24:759-760。
在具體實施例中，若本發明組合物係編碼預防劑或治療劑之核酸，則可活體內投與核酸以促使其編碼之預防劑或治療劑表現，其係藉由以下：將該核酸構造為適當核酸表現載體之一部分並藉由諸如以下等方法將其投與至細胞內來達成：使用逆轉錄病毒載體(參見美國專利第4,980,286號)、或直接注射、或使用微粒轟擊(例如，基因槍，Biolistic，DuPont)、或用脂質或細胞表面受體或轉染劑塗佈、或將其與已知可進入核中之同源異形框樣肽相連投與(參見(例如)Joliot等人(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868)。或者，可將核酸引入細胞內並藉由同源重組將其納入宿主細胞DNA內用於表現。
可將本發明醫藥組合物調配為與其既定投與途徑相容。投與途徑之實例包括(但不限於)非經腸，例如，靜脈內、皮內、皮下、經口、鼻內(例如吸入)、經皮(例如局部)、經黏膜及直腸投與。在具體實施例中，按照常規程序將組合物調配成適於靜脈內、皮下、肌內、經口、鼻內或局部投與至人類之醫藥組合物。通常，用於靜脈內投與之組合物係無菌等滲水性緩衝劑中之溶液。若需要，該組合物亦可包括增溶劑及局部麻醉劑(例如利多卡因(lignocaine))以減輕注射位點處之疼痛。
若本發明組合物欲局部投與，則該等組合物可調配成軟膏、乳霜、經皮貼劑、洗劑、凝膠、香波、噴霧、氣溶膠、溶液、乳液形式或彼等熟習此項技術者熟知之其他形式。參見(例如)Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms ，第19版，Mack Pub.公司，Easton,Pa.(1995)。對於不可噴霧局部劑型而言，通常採用包含與局部施用相容之一載劑或一或多種賦形劑且具有比水大之動力學黏度的黏稠至半固體或固體形式。適宜調配物包括(但不限於)溶液、懸浮液、乳液、乳霜、軟膏、粉劑、擦劑、油膏及諸如此類，若需要，其經滅菌或與輔助劑(例如，防腐劑、穩定劑、潤濕劑、緩衝劑或鹽)混合以影響多種性質(例如，滲透壓)。其他適宜局部劑型包括可噴霧氣溶膠製劑，其中活性成份視情況與固體或液體惰性載劑組合包裝成與加壓揮發物(例如，氣態推進劑，例如FREON)之混合物或包裝於擠壓瓶中。若需要，亦可向醫藥組合物及劑型中添加潤濕劑或保濕劑。該等其他成份之實例已為業內熟知。
若本發明方法包含組合物之鼻內投與，則可將組合物調配成氣溶膠形式、噴霧、霧或滴劑形式。具體而言，根據本發明使用之預防劑或治療劑可藉助適當推進劑(例如，二氟二氯甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適宜氣體)方便地以氣溶膠噴霧形式由壓力包或霧化器遞送。在加壓氣溶膠情形下，則可藉由提供閥門遞送經計量之量來確定劑量單位。用於吸入器或吹入器中之膠囊及藥筒(包含明膠)可經調配包含該化合物與適宜粉末基質(例如乳糖或澱粉)之粉末混合物。
若本發明方法包含經口投與，則可將組合物經口調配成錠劑、膠囊、藥丸、凝膠膠囊、溶液、懸浮液及諸如此類等形式。錠劑或膠囊可藉由習用方式利用以下醫藥上可接受之賦形劑製得：例如，結合劑(例如，預膠凝玉米澱粉、聚乙烯基吡咯啶酮或羥丙基甲基纖維素)、填充劑(例如，乳糖、微晶纖維素、或磷酸氫鈣)、潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石粉或二氧化矽)、崩解劑(例如，馬鈴薯澱粉或澱粉乙醇酸鈉)或潤濕劑(例如，月桂基硫酸鈉)。可藉由業內熟知方法對錠劑包衣。經口投與用液體製劑可採用(但不限於)溶液、糖漿或懸浮液形式，或其可製備為乾燥產物以在使用之前用水或其他適宜媒劑構造。該等液體製劑可藉由習用方式利用醫藥上可接受之添加劑來製備，例如懸浮劑(例如，梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪)；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯樹膠)；非水性媒劑(例如，杏仁油、油性酯、乙醇或經分餾植物油)；及防腐劑(例如，對羥基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。若釋放，製劑亦可含有緩衝鹽、矯味劑、著色劑及甜味劑。可適宜地調配經口投與用製劑以緩慢釋放、控制釋放或持續釋放預防劑或治療劑。
本發明方法可包含(例如)藉由使用吸入器或噴霧器經肺投與經氣溶膠化劑調配之組合物。參見(例如)美國專利第6,019,968號、第5,985,320號、第5,985,309號、第5,934,272號、第5,874,064號、第5,855,913號及第5,290,540號；及PCT公開案WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346及WO 99/66903。在具體實施例中，使用Alkermes AIR經肺藥物遞送技術(Alkermes公司，Cambridge,Mass. US)投與本發明抗體、組合療法及/或本發明組合物。
本發明方法可包含投與調配用於藉由注射(例如藉由濃注或連續輸注)非經腸投與之組合物。注射用調配物可以單位劑型(例如於安瓿或於多劑量容器中)添加防腐劑提供。該等組合物可呈於油性或水性媒劑中的懸浮液、溶液或乳液形式，且可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。或者，活性成份可呈粉末形式，在使用前用適宜媒劑(例如滅菌無熱原水)組成。
本發明方法可另外包含投與調配成積存(depot)製劑之組合物。此等長效調配物可藉由植入(例如皮下或肌內)或藉由肌內注射投與。因此，例如，該等組合物可用適宜聚合或疏水材料(例如於可接受油中之乳液)或離子交換樹脂調配，或呈微溶性衍生物(例如微溶性鹽)。
本發明方法涵蓋投與調配成中性或鹽形式之組合物。醫藥上可接受之鹽包括與陰離子形成者，例如衍生自氫氯酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等者，及與陽離子形成者，例如衍生自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基胺基乙醇、組胺酸、普魯卡因(procaine)等者。
一般而言，組合物之成份可各別或混合在一起以單位劑型提供，例如呈無水凍乾粉末或不含水之濃縮物在諸如安瓿或藥包等標明活性劑含量的密封容器中。若投與方式係輸注，則可用含有滅菌醫藥級水或鹽水之輸注瓶分配組合物。當投與方式係注射時，可提供注射用滅菌水或鹽水的安瓿以便可在投與之前混合各成份。
本發明亦特別提供一或多種本發明之預防劑或治療劑或醫藥組合物包裝於標明該劑含量的密封容器例如安瓿或藥包中。在一個實施例中，一或多種本發明之預防劑或治療劑或醫藥組合物可以無水滅菌凍乾粉末或不含水之濃縮物於密封容器中提供或可重構(例如用水或鹽水)成適於投與個體之濃度。在一實施例中，本發明一或多種預防劑或治療劑或醫藥組合物可作為無水滅菌凍乾粉末或不含水之濃縮物於氣密性密封容器中以如下單位劑量提供：至少5 mg、至少10 mg、至少15 mg、至少25 mg、至少35 mg、至少45 mg、至少50 mg、至少75 mg或至少100 mg。本發明之凍乾預防劑或治療劑或醫藥組合物應在2℃與8℃之間於其初始容器中儲存且本發明預防劑或治療劑或醫藥組合物應在重構後1週內、5天內、72小時內、48小時內、24小時內、12小時內、6小時內、5小時內、3小時內或1小時內投與。在一替代實施例中，本發明一或多種預防劑或治療劑或醫藥組合物可以液體形式於標明試劑之量及濃度的氣密性密封容器中提供。在一實施例中，液體形式之投與組合物可於氣密性密封容器中以如下提供：至少0.25 mg/ml、至少0.5 mg/ml、至少1 mg/ml、至少2.5 mg/ml、至少5 mg/ml、至少8 mg/ml、至少10 mg/ml、至少15 mg/ml、至少25 mg/ml、至少50 mg/ml、至少75 mg/ml或至少100 mg/ml。液體形式應在2℃與8℃之間於其初始容器中儲存。
本發明抗體及抗體部分可納入適於非經腸投與之醫藥組合物中。在一實施例中，抗體或抗體部分可製備為含有0.1 mg/ml至250 mg/ml抗體之可注射溶液形式。可注射溶液可包含存於硬質或琥珀色小瓶、安瓿或預填充注射器中之液體或凍乾劑型。緩衝液可為pH為5.0至7.0(最佳pH 6.0)之L-組胺酸(1 mM至50 mM，最佳5 mM至10 mM)。其他適宜緩衝液包括(但不限於)琥珀酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉或磷酸鉀。可利用氯化鈉以0 mM至300 mM(就液體劑型而言，最佳為150 mM)之濃度來改變溶液毒性。凍乾劑型可包括主要為0-10%蔗糖(最佳為0.5-1.0%)之冷凍保護劑。
其他適宜冷凍保護劑包括海藻糖及乳糖。凍乾劑型可包括主要為1-10%甘露醇(最佳為2-4%)之填充劑。在液體及凍乾劑型二者中均可利用主要為1 mM至50 mM L-甲硫胺酸(最佳為5 mM至10 mM)之穩定劑。其他適宜填充劑包括甘胺酸、精胺酸，其可以0-0.05%聚山梨酯-80(最佳為0.005-0.01%)形式被納入。其他表面活性劑包括(但不限於)聚山梨酯20及BRIJ表面活性劑。
本發明組合物可呈多種形式。該等形式包括(例如)液體、半固體及固體劑型，例如液體溶液(例如，可注射及可輸注溶液)、分散液或懸浮液、錠劑、丸劑、粉劑、脂質體及栓劑。特定形式端視期望投與模式及治療應用而定。典型組合物呈可注射或可輸注溶液形式，例如與彼等用於以其他抗體對人類進行被動免疫者類似之組合物。投與模式包括非經腸(例如，靜脈內、皮下、腹膜內、肌內)投與。在特定實施例中，抗體係藉由靜脈內輸注或注射投與。在另一特定實施例中，抗體係藉由肌內或皮下注射投與。
通常，治療組合物必須無菌且在製造及儲存條件下穩定。可將該組合物調配成溶液、微乳液、分散液、脂質體或其他適於高藥物濃度之規定結構。無菌可注射溶液可藉由以下步驟來製備：將所需量活性化合物(即抗體或抗體部分)納入具有上文所列舉一種成份或多種成份組合(若需要)的適宜溶劑中，隨後進行過濾滅菌。通常，可藉由將活性化合物納入含有基本分散介質及來自彼等上文所列舉者之所需其他成份的無菌媒劑中來製備分散液。在利用無菌凍乾粉末來製備無菌可注射溶液之情形下，製備方法包括真空乾燥及噴霧乾燥，其可產生由活性成份及任一期望其他成份(來自其先前經無菌過濾之溶液)構成之粉末。可藉由(例如)利用諸如卵磷脂等包衣、藉由維持所需粒徑(就分散劑而言)以及藉由利用表面活性劑維持恰當的流動性。藉由向組合物中納入可延遲吸收之藥劑(例如，單硬脂酸鹽及明膠)可以使可注射組合物的吸收延長。
本發明抗體及抗體部分可藉由業內已知之多種方法來投與，但對於許多治療應用而言，例如，投與途徑/模式係皮下注射、靜脈內注射或輸注。如熟習此項技術者應瞭解，投與途徑及/或模式可因所期望之結果而變化。在某些實施例中，活性化合物可用可防止該化合物快速釋放之載劑(例如受控釋放調配物，包括植入體、經皮貼劑及微囊化遞送系統)來製備。可利用生物可降解之生物相容聚合物，例如乙烯基乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此等調配物之許多方法已獲得專利權或通常已為彼等熟習此項技術者所知。參見(例如)Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson編輯，Marcel Dekker公司，New York,1978。
在某些實施例中，本發明抗體或抗體部分可經口投與，例如，藉助惰性稀釋劑或可吸收食用載劑投與。亦可將此化合物(及其他成份，若需要)封裝入硬殼或軟殼明膠膠囊中、壓縮成錠劑或直接納入個體飲食中。就經口治療投與而言，可將化合物與賦形劑一起納入並以可吸收錠劑、口含錠、喉錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、糯米紙囊劑及諸如此類等形式利用。為藉由除非經腸外的途徑投與本發明化合物，可能需要用材料包覆該化合物或與該化合物共投與以防止其失活。
該等組合物中亦可納入附加活性化合物。在某些實施例中，本發明抗體或抗體部分與一或多種其他治療劑共調配及/或共投與，該等治療劑用於治療TNF-α活性有害之病症。舉例而言，本發明抗hTNF-α抗體或抗體部分可與一或多種結合其他靶之其他抗體(例如，結合其他細胞因子或結合細胞表面分子之抗體)共調配及/或共投與。此外，一或多種本發明抗體可與兩種或更多種上述治療劑組合使用。此等組合療法可有利地利用較低劑量之所投與治療劑，由此避免與各種單一療法相關之可能毒性或併發症。
在某些實施例中，使針對TNF-α之抗體或其片段連接至業內已知之延長半衰期的媒劑。該等媒劑包括(但不限於)Fc域、聚乙二醇及葡聚糖。該等媒劑闡述於(例如)美國專利第6,660,843號中。
在具體實施例中，投與包含編碼本發明抗體或本發明另一預防劑或治療劑之核苷酸序列的核酸序列藉助基因療法治療、預防、管控或改善病症或其一或多種症狀。基因療法係指藉由投與個體表現或可表現之核酸來實施的療法。在本發明之此實施例中，核酸產生其編碼抗體或本發明預防劑或治療劑，其調介預防或治療效應。
可根據本發明使用業內可得之基因療法中之任一者。關於基因療法之綜述，參見Goldspiel等人(1993) Clin. Pharm. 12:488-505；Wu及Wu(1991) Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev(1993) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan(1993) Science 260:926-932；及Morgan及Anderson(1993) Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；Robinson(1993) Trends Biotechnol. 11(5):155。可使用之重組DNA技術領域中通常習知的方法闡述於以下中：Ausubel等人(編輯)，Current Protocols in Molecular Biology ,John Wiley & Sons,NY(1993)；及Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual ,Stockton Press,NY(1990)。各種基因療法之詳細說明揭示於美國專利公開案第2009/0297514號中。
TNF-α在與涉及免疫及發炎因素之多種疾病相關的病理學中起至關重要的作用。該等疾病包括(但不限於)後天性免疫缺陷症候群；後天性免疫缺陷有關疾病；後天性惡性貧血；急性冠脈症候群；急性及慢性疼痛(不同形式之疼痛)；急性特發性多神經炎；與器官移植相關之急性免疫疾病；與器官移植相關之急性或慢性免疫疾病；急性發炎脫髓鞘多發性神經根神經病；急性局部缺血；急性肝病；急性風濕熱；急性橫貫性脊髓炎；阿狄森氏病；成人(急性)呼吸窘迫症候群；成人斯提耳病；酒精性肝硬化；酒精誘發之肝損傷；過敏性疾病；過敏症；禿髮；斑禿；阿茲海默氏病；過敏性休克；強直性脊柱炎；強直性脊柱炎相關之肺病；抗磷脂抗體症候群；再生不全性再生不全性貧血；動脈硬化；關節病；哮喘；動脈粥樣硬化疾病/動脈硬化；動脈粥樣硬化；異位性過敏症；異位性濕疹；異位性皮炎；萎縮性自體免疫性甲狀腺功能低下症；自體免疫性大疱病；自體免疫性皮炎；自體免疫性糖尿病；與鏈球菌感染相關之自體免疫性病症；自體免疫性腸病變；自體免疫性溶血性貧血；自體免疫性肝炎；自體免疫性聽力損失；自體免疫性淋巴增生症候群(ALPS)；自體免疫調介之低血糖；自體免疫性心肌炎；自體免疫性嗜中性白血球減少症；自體免疫性早熟卵巢功能衰竭；自體免疫性血小板減少症(AITP)；自體免疫性甲狀腺疾病；自體免疫性葡萄膜炎；閉塞性細枝氣管炎；貝切特氏病(Behcet's disease)；眼瞼炎；枝氣管擴張症；大疱性類天疱瘡；惡病質；心血管疾病；災難性抗磷脂症候群；乳糜瀉；頸椎病；衣原體；膽汁淤積；慢性活動性肝炎；慢性嗜酸粒細胞性肺炎；慢性疲勞症候群；與器官移植相關之慢性免疫疾病；慢性局部缺血；慢性肝病；慢性黏膜皮膚念珠菌病；瘢痕性類天疱瘡；具有多發性硬化風險之臨床孤立症候群(CIS)；普通變異免疫缺陷症(普通變異γ球蛋白過少)；結締組織病相關之間質肺病；結膜炎；庫姆陽性溶血性貧血；兒童期精神異常；慢性阻塞性肺病(COPD)；克羅恩氏病；隱原性自體免疫性肝炎；隱原性纖維化肺泡炎；淚囊炎；抑鬱症；皮炎硬皮病；皮肌炎；皮肌炎/多肌炎相關之肺病；糖尿病視網膜病變；糖尿病；擴張型心肌病；盤狀紅斑狼瘡；椎間盤突出；椎間盤脫出；彌漫性血管內凝血；藥物誘發之肝炎；藥物誘發之間質肺病；藥物誘發之免疫溶血性貧血；心內膜炎；子宮內膜異位症；眼內炎；腸病性滑膜炎；上鞏膜炎；多形紅斑；重型多形紅斑；女性不育；纖維化；纖維化肺疾病；妊娠性類天疱瘡；巨細胞動脈炎(GCA)；腎小球性腎炎；甲狀腺腫自體免疫性甲狀腺功能低下症(橋本氏病)；古德帕斯徹氏症候群；痛風性關節炎；移植物抗宿主疾病(GVHD)；格雷夫斯氏病；B群鏈球菌(GBS)感染；吉蘭-巴雷症候群(GBS)；血鐵質沉著相關之肺病；花粉熱；心臟衰竭；溶血性貧血；亨諾-許蘭二氏紫癜；B型肝炎；C型肝炎；休斯症候群；亨庭頓氏舞蹈症；甲狀腺功能亢進症；甲狀旁腺功能低下症；特發性白血球減少症；特發性血小板減少症；特發性帕金森氏病；特發性間質肺炎；特異體質性肝病；IgE調介之過敏症；免疫溶血性貧血；包涵體肌炎；傳染病；傳染型眼睛發炎疾病；發炎腸病；發炎脫髓鞘疾病；發炎心臟疾病；發炎腎病；胰島素依賴性糖尿病；間質性肺炎；IPF/UIP；虹膜炎；幼年型慢性關節炎；幼年型惡性貧血；幼年型類風濕性關節炎；川崎病；角膜炎；乾燥性角膜結膜炎；庫斯毛耳病或庫斯毛耳-邁埃爾病；蘭德里氏麻痺；郎格罕細胞組織細胞增多症；線性IgA病；網狀青斑；萊姆關節炎；淋巴細胞浸潤性肺病；黃斑變性；特發性或NOS男性不育；惡性腫瘤；腎之顯微血管炎；顯微多血管炎；混合結締組織病相關之肺病；白赫鐵列夫症；運動神經元病症；黏膜性類天疱瘡；多發性硬化(所有亞型：原發性進展型、繼發性進展型、復發緩解型等)；多器官衰竭；肌痛性腦炎/慢性疲勞病；重症肌無力；骨髓增生異常症候群；心肌梗塞；心肌炎；腎病症候群；神經根障礙；神經病；非酒精性脂肪性肝炎；非A非B型肝炎；視神經炎；器官移植物排斥；骨關節炎；骨質溶解；卵巢癌；卵巢功能衰竭；胰腺炎；寄生蟲病；帕金森氏病；少關節性JRA；類天疱瘡；葉狀天疱瘡；尋常天疱瘡；外周動脈阻塞性疾病(PAOD)；外周血管疾病(PVD)；外周動脈疾病(PAD)；晶狀體源性葡萄膜炎；靜脈炎；結節性多動脈炎(或結節性動脈周圍炎)；多軟骨炎；風濕性多肌痛；白髮症；多關節JRA；多內分泌缺乏症候群；多肌炎；I型多腺缺陷症及II型多腺缺陷症；風濕性多肌痛(PMR)；感染後間質肺病；發炎後間質肺病；泵送後症候群；早熟卵巢功能衰竭；原發性膽汁性肝硬化；原發性黏液性水腫；原發性帕金森病；原發性硬化性膽管炎；原發性硬化性肝炎；原發性血管炎；前列腺及直腸癌及造血惡性腫瘤(白血病及淋巴瘤)；前列腺炎；乾癬；1型乾癬；2型乾癬；乾癬性關節炎；乾癬性關節病；繼發於結締組織病之肺動脈高血壓症；結節性多動脈炎之肺病；純紅血球再生不全；原發性腎上腺機能不全；輻射纖維化；反應性關節炎；賴特爾病；復發性視神經脊髓炎；腎病NOS；再狹窄；類風濕性關節炎；類風濕性關節炎相關之間質肺病；風濕性心臟疾病；SAPHO(滑膜炎、痤瘡、膿疱病、骨肥厚及骨炎)；結節病；精神分裂症；施密特氏症候群；硬皮病；繼發性澱粉樣變性；休克肺；鞏膜炎；坐骨神經痛；繼發性腎上腺機能不全；敗血症症候群；敗血性關節炎；敗血性休克；血清陰性關節病；聚矽氧相關之結締組織病、薛格連氏病相關之肺病；薛格連氏症候群；史奈頓威金森皮膚病；精子自體免疫病；脊椎關節病；強直性脊椎炎；史-約症候群(SJS)；斯提耳病；中風；交感性眼炎；全身性發炎反應症候群；全身性紅斑狼瘡；全身性紅斑狼瘡相關之肺病；全身性硬化症；全身性硬化症相關之間質肺病；高安氏病/動脈炎；顳動脈炎；Th2型及Th1型調介之疾病；甲狀腺炎；毒性休克症候群；弓形體視網膜炎；毒性表皮壞死溶解症；橫貫性脊髓炎；TRAPS(腫瘤壞死因子受體1型(TNFR)相關之週期性症候群)；患有黑棘皮症之B型胰島素抗性；1型過敏反應；1型自體免疫性肝炎(典型自體免疫或狼瘡狀肝炎)；2型自體免疫性肝炎(抗LKM抗體肝炎)；II型糖尿病；潰瘍性鮞狀關節病；潰瘍性結腸炎；蕁麻疹；尋常間質肺炎(UIP)；葡萄膜炎；血管炎彌漫性肺病；血管炎；春季結膜炎；病毒性視網膜炎；白斑；Vogt-Koyanagi-Harada症候群(VKH症候群)；韋格納氏肉芽腫病；濕性黃斑變性；傷口癒合；耶爾森菌及沙門菌相關之關節病。
本發明抗體及抗體部分可用於治療患有自體免疫性疾病、具體而言與炎症、類風濕性關節炎、骨關節炎、乾癬、多發性硬化及其他自體免疫性疾病相關之彼等疾病的人類。
本發明抗體或抗體部分亦可與用於治療自體免疫性及發炎疾病之一或多種其他治療劑一起投與。
本發明抗體或其抗原結合部分可單獨或組合使用以治療該等疾病。應瞭解，本發明抗體或其抗原結合部分可單獨或與其他藥劑(例如，治療劑)組合使用，熟習此項技術者可根據期望目來選擇該其他藥劑。舉例而言，其他藥劑可係業內認可用於治療藉由本發明抗體所治療疾病或病況之治療劑。其他藥劑亦可為賦予治療組合物有益屬性之藥劑，例如，實現組合物之黏度之藥劑。
應進一步瞭解，欲納入本發明內之組合係彼等用於其期望目的之組合。下文所述藥劑係出於說明之目的而不欲具有限制性。為本發明一部分之組合可係本發明抗體及至少一種選自下文列表之其他藥劑。若組合使得所形成組合物可實施其期望功能，則組合亦可包括一種以上其他藥劑，例如，兩種或三種其他藥劑。
特定組合係亦稱作NSAID之非類固醇消炎藥物，包括諸如布洛芬等藥物。其他組合係包括潑尼松龍在內之皮質類固醇；可藉由逐漸減少當與本發明抗TNF-α抗體組合治療患者時所需類固醇劑量來降低或甚至消除類固醇利用之熟知副效應。可與本發明抗體或抗體部分組合用於類風濕性關節炎的治療劑之非限制性實例包括下列：細胞因子抑制性消炎藥物(CSAID)；其他人類細胞因子或生長因子(例如，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、干擾素、EMAP-II、GM-CSF、FGF及PDGF)之抗體或拮抗劑。本發明抗體或其抗原結合部分可與細胞表面分子(例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90、CTLA)或其配體(CD154(gp39或CD40L))之抗體組合。
治療劑之特定組合可以不同程度在自體免疫性及後續發炎級聯中進行干擾；特定實例包括TNF拮抗劑，如嵌合人類化或人類TNF抗體、D2E7(PCT公開案第WO 97/29131號)、CA2(RemicadeTM )、CDP 571及可溶性p55或p75 TNF受體、其衍生物p75TNFR1gG(EnbrelTM )或p55TNFR1gG(來那西普(Lenercept))、亦及TNF-α轉化酶(TACE)抑制劑；類似地，對於相同原因，IL-1抑制劑(介白素-1-轉化酶抑制劑、IL-1RA等)可有效。其他組合係與介白素11之組合。再一些組合係與自體免疫反應之其他起關鍵作用者之組合，其可與TNF-α功能平行、獨立或一致起作用。再一些組合係與非消耗性抗CD4抑制劑之組合。再一些組合係與協同刺激途徑CD80(B7.1)或CD86(B7.2)拮抗劑(其包括抗體、可溶性受體或拮抗性配體)之組合。
本發明抗體或其抗原結合部分亦可與以下藥劑組合：例如，甲胺喋呤、6-MP、硫唑嘌呤柳氮磺吡啶(sulphasalazine)、美沙拉秦(mesalazine)、奧沙拉秦氯喹(olsalazine chloroquinine)/羥氯喹(hydroxychloroquine)、青黴胺(pencillamine)、金硫代蘋果酸鹽(aurothiomalate)(肌內及經口)、硫唑嘌呤、秋水仙鹼(colchicines)、皮質類固醇(經口、吸入及局部注射)、β-2腎上腺素受體激動劑(沙丁胺醇(salbutamol)、特布他林(terbutaline)、沙美特羅(salmeteral))、黃嘌呤(茶鹼(theophylline)、氨茶鹼(aminophylline))、色甘酸鹽(cromoglycate)、奈多羅米(nedocromil)、酮替芬(ketotifen)、異丙托銨(ipratropium)及氧托品(oxitropium)、環孢素、FK506、雷帕黴素、黴酚酸嗎啉乙酯、來氟米特、NSAID，例如布洛芬、皮質類固醇(例如潑尼松龍)、磷酸二酯酶抑制劑、腺苷激動劑、抗血栓劑、補體抑制劑、腎上腺素激導劑、由促炎症細胞因子干擾信號傳導之藥劑，例如TNF-α或IL-1(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑)、IL-1β轉化酶抑制劑、TNF-α轉化酶(TACE)抑制劑、T細胞信號傳導抑制劑，例如激酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤、血管緊張素轉化酶抑制劑、可溶性細胞因子受體及其衍生物(例如，可溶性p55或p75 TNF受體及衍生物p75TNFRIgG(EnbrelTM 及p55TNFRIgG(來那西普)、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)、抗發炎細胞因子(例如，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13及TGFβ)、塞來考昔(celecoxib)、葉酸、硫酸羥氯喹、羅非考昔(rofecoxib)、依那西普(etanercept)、英夫利昔單抗(infliximab)、萘普生(naproxen)、伐地考昔(valdecoxib)、柳氮磺吡啶、甲基潑尼松龍、美洛昔康(meloxicam)、乙酸甲基潑尼松龍、硫代蘋果酸金鈉、阿司匹林(aspirin)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、萘磺酸丙氧吩(propoxyphene napsylate)/apap、葉酸鹽、萘丁美酮(nabumetone)、雙氯芬酸(diclofenac)、吡羅昔康(piroxicam)、依託度酸(etodolac)、雙氯芬酸鈉、奧沙普秦(oxaprozin)、鹽酸羥可待酮(oxycodone hcl)、重酒石酸二氫可待因酮(hydrocodone bitartrate)/apap、雙氯芬酸鈉/米索前列醇(misoprostol)、芬太尼(fentanyl)、阿那白滯素(anakinra)、人類重組物、鹽酸曲馬多(tramadol hcl)、雙水楊酯(salsalate)、舒林酸(sulindac)、維生素b12(cyanocobalamin)/fa/吡哆素(pyridoxine)、對乙醯胺基酚(acetaminophen)、阿侖膦酸鈉(alendronate sodium)、潑尼松龍、硫酸嗎啡(morphine sulfate)、鹽酸利多卡因(lidocaine hydrochloride)、吲哚美辛(indomethacin)、硫酸鹽葡糖胺(glucosamine sulf)/軟骨素(chondroitin)、鹽酸阿米替林(amitriptyline hcl)、磺胺嘧啶(su°fadiazine)、鹽酸羥可待酮/對乙醯胺基酚、鹽酸奧洛他定(olopatadine hcl)、米索前列醇(misoprostol)、萘普生鈉(naproxen sodium)、奧美拉唑(omeprazole)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、利妥昔單抗(rituximab)、IL-1 TRAP、MRA、CTLA4-IG、IL-18 BP、抗IL-18、抗IL-15、BIRB-796、SCIO-469、VX-702、AMG-548、VX-740、羅氟司特(Roflumilast)、IC-485、CDC-801及美索普拉(Mesopram)。特定組合包括胺甲蝶呤或來氟米特且在中度或嚴重類風濕性關節炎之情形下包括環孢素。
本發明醫藥組合物可包括「治療有效量」或「預防有效量」之本發明抗體或抗體部分。「治療有效量」係指可在所需時間段內以所需劑量有效達成期望治療效果之量。抗體或抗體一部分之治療有效量可由熟習此項技術者決定且可隨以下因素變化：例如疾病狀態、個體年齡、性別及體重以及抗體或抗體部分於該個體體內引發期望反應之能力。治療有效量亦為抗體或抗體部分之治療有益效應大於其任何毒性或有害效應之量。「預防有效量」係指在所需時間段內以所需劑量有效達成期望預防效果之量。通常，由於預防劑量係在患病之前或患病早期用於個體中，故預防有效量可小於治療有效量。
可對劑量方案加以調整以提供最佳期望反應(例如，治療或預防反應)。舉例而言，可投與單次濃注劑，可經一段時間投與數個細分劑量或可根據治療狀況緊急程度所指示按比例減少或增加劑量。以劑量單元形式來調配非經腸組合物特別有利於方便投與及達成劑量一致性。劑量單元形式係指適於作為單位劑量供擬受治療哺乳動物個體使用之物理分立單元；每一單元含有經計算可產生期望治療效應的預定量活性化合物與所需醫藥載劑之組合。本發明劑量單位形式之規格取決於且直接依賴於下列因素：(a)活性化合物之獨特特性及欲達成之特定治療或預防效應，及(b)複合此活性化合物以治療個體敏感性之技術中的固有限制條件。
應注意的是，劑量值可隨欲緩解病症之類型及嚴重性而變化。應進一步瞭解：就任一特定個體而言，應根據個體需要及投與組合物或監督組合物投與之個人的專業判斷隨時調整具體劑量方案，且本文所述劑量範圍僅為舉例說明且並非意欲限制所主張組合物之範疇或實踐。熟習此項技術者將易於得出，可使用適宜等效形式對本發明方法作出其他適宜修改及改變，而並不背離本發明或本文所揭示實施例之範疇。現在詳細描述本發明之後，藉由參照以下實例將更明確地瞭解本發明，該等實例僅出於闡釋目的納入而並不意欲對本發明具有限制性。
實例1：重組抗人類TNF-α抗體
實例1.1：重組嵌合抗人類TNF-α抗體之重構及表現
由編碼人類IgG1恆定區之cDNA片段替換編碼鼠類抗人類TNF-α單株抗體MAK195之重鏈恆定區的DNA，該人類IgG1恆定區因細菌中之同源重組含有2個鉸鏈區胺基酸突變。該等突變係234位處之白胺酸變為丙胺酸(EU編號)及235位處之白胺酸變為丙胺酸(Lund等人(1991) J. Immunol. 147:2657-2662)。該等抗體中之每一者的輕鏈恆定區由人類κ恆定區替換。藉由連接至pHybE表現質體中之嵌合重鏈及輕鏈cDNA的共轉染使全長嵌合抗體在HEK293細胞中瞬時表現。藉由蛋白A瓊脂糖凝膠層析純化含有重組嵌合抗體之細胞上清液並藉由添加酸緩衝液洗脫結合抗體。中和抗體並透析至PBS中。
隨後藉由ELISA確認抗原結合來測試純化嵌合抗人類TNF-α單株抗體結合hTNF-α蛋白之能力。
實例1.2：CDR移植抗人類TNF-α抗體之重構
藉由使用業內熟知之標準方法將單株抗體MAK195之VH及VL鏈的CDR序列(參見上表5)移植至不同人類重鏈及輕鏈接受體序列中。
基於與本發明單株抗體MAK195之VH及VL序列對準之序列VH與VL，選擇以下已知人類序列：a)　用於重構重鏈接受體序列之VH4-59(IGHV4-59)及VH3-53(IGHV3-53)以及連接序列hJH4b)　用於重構輕鏈接受體序列之1-39/O12及3-15/L2以及hJK2藉由將MAK195之相應VH及VL CDR移植至該等接受體序列中製備CDR-移植人類化且經修飾之VH及VL序列(亦參見上表6)。
實例1.3：CDR移植抗體中之框架回復突變之重構
為產生人類化抗體框架回復突變，藉由可變域之新生合成及/或使用致突變引物及PCR及業內熟知之方法將突變引入如根據實例1.2製備之CDR移植抗體序列中(參見(例如)WO 2007/042261；WO 99/54440；Traunecker等人(1987)EMBO J.,10(12):3655-9及Lanzavecchia及Scheidegger(1987) Eur. J. Immunol.,17(1):105-11)。對如下CDR-移植物中之每一者重構回復突變與其他突變之不同組合。下文闡述每一人類化抗體所提出之設計型式的概述。該等突變之殘基編號係基於Kabat編號系統。
對於重鏈hMAK195VH.1z而言，如下回復突變以下游標區及VH/VL介接殘基中之一或多者：G27→F、I29→L、I37→V、I48→LV67→L、V71→K、T73→N、N76→S及F78→I。其他突變包括以下：Q1→E。對於重鏈hMAK195VH.2z而言，如下回復突變以下游標區及VH/VL介接殘基中之一或多者：A24→V、F29→L、V48→L、F67→L、R71→K、S49→G、N76→S及L78→I。其他突變包括以下：Q1→E、I12→V及V29→F。對於輕鏈hMAK195Vk.1而言，如下回復突變以下游標區及VH/VL介接殘基中之一或多者：A43→S。對於輕鏈hMAK195Vk.2z而言，如下回復突變以下游標區及VH/VL介接殘基中之一或多者：A43→S、I58→V。其他突變包括以下：V13→L、E70→D及S80→P。
實例1.4：含有框架回復突變之人類化抗hTNF-α重鏈及輕鏈
實例1.5：人類化抗hTNF-α hMAK195抗體VH/VL對
實例1.6：使用BIACORE技術測定親和性
BIACORE方法： BIACORE分析(Biacore公司，Piscataway,NJ)利用締合速率及離解速率常數之動力學量測測定抗體之親和性。於25℃下藉由基於表面電漿共振之量測利用Biacore1000或3000儀器(BiacoreAB,Uppsala,Sweden)使用運行之HBS-EP(10 mM HEPES[pH 7.4]、150 mM NaCl、3 mM EDTA及0.005%表面活性劑P20)測定抗體與抗原(例如，純化重組靶抗原)之結合。所有化學品均係自BiacoreAB(Uppsala,Sweden)獲得或者來自本文中所述不同來源。舉例而言，使用標準胺偶合套組根據製造者之說明書及程序跨CM5研究級生物感測器晶片以25 μg/ml直接固定稀釋於10 mM乙酸鈉(pH 4.5)中之約5000 RU山羊抗小鼠IgG(Fcγ)、片段特異性多株抗體(Pierce Biotechnology公司，Rockford,I11.,US)。用乙醇胺封阻生物感測器表面上之未反應部分。使用流動室(flowcell)2及4中之經修飾羧甲基葡聚糖表面作為反應表面。使用流動室1及3中之無山羊抗小鼠IgG的未修飾羧甲基葡聚糖作為參考表面。對於動力學分析而言，利用Biaevaluation 4.0.1軟體將源自1:1Langmuir結合模型之速率方程同時擬合至所有8次注射之締合及解離相(使用全擬合分析)。將純化抗體稀釋於HEPES緩衝鹽水中以共在山羊抗小鼠IgG特異性反應性表面上捕獲。以5 μl/分鐘之流速注射欲捕獲為配體之抗體(25 μg/ml)以使其經過反應基質。在25 μl/分鐘之流速下測定締合及解離速率常數kon (M-1 s-1 )及koff (s-1 )。藉由得到介於10 nM至200 nM範圍內之不同抗原濃度下的動力學結合量測值獲得速率常數。隨後根據動力學速率常數藉由下式計算抗體與靶抗原之間之反應的平衡解離常數(M)：KD =koff /kon 。結合性記錄為時間之函數並計算動力學速率常數。在此分析中，可量測得締合速率與106 M-1 s-1 一般快且離解速率與10-6 s-1 一般慢。
藉由Biacore技術表徵之所有人類化構築物的結合皆保持不變且與鼠類親本抗體之結合相當。
實例1.7：人類TNF-α之中和
使L929細胞生長至半鋪滿密度並使用0.25%胰蛋白酶(Gibco第25300號)收穫。將該等細胞用PBS洗滌，計數並以1E6個細胞/mL重新懸浮於含有4 μg/mL放線菌素D之分析培養基中。將該等細胞以100 μL及5E4個細胞/孔之體積接種於96孔板(Costar第3599號)中。將抗體及對照IgG於分析培養基中稀釋至4倍濃度並實施1:4系列分析。將huTNF-α在分析培養基中稀釋至400 pg/mL。以1:2稀釋方案向huTNF-α(200 μL)中添加抗體試樣(200 μL)並於室溫下培育0.5小時。
對於100 pg/mL huTNF-α及150 nM至0.0001 nM抗體而言，以100 μL向平鋪細胞中添加抗體/人類TNF-α溶液。將板於37℃、5% CO2 下培育20小時。為達到定量存活率，自孔移出100 μL並添加10 μL WST-1試劑(Roche目錄編號11644807001)。將板在分析條件下培育3.5小時。於OD 420-600 nm下使用Spectromax 190 ELISA板讀數器對板進行讀數。表9中包括若干分析之平均EC50。
在TNF-α中和分析中，所有抗hTNF-α抗體均顯示中和。
實例1.8：人類化單株抗體之物理化學及活體外穩定性分析尺寸排除層析
將抗體用水稀釋至2.5 mg/mL並在Shimadzu HPLC系統上使用TSK凝膠G3000 SWXL管柱(Tosoh Bioscience，目錄編號k5539-05k)分析20 mL抗體。自管柱用211 mM硫酸鈉、92 mM磷酸鈉(pH 7.0)以0.3 mL/分鐘之流速洗脫試樣。HPLC系統作業條件係以下：
流動相：211 mM Na2 SO4 、92 mM Na2 HPO4 *7H2 O，pH 7.0
梯度：等強度
流速：0.3 mL/分鐘
檢測器波長：280 nm
自動取樣器冷卻器溫度：4℃
管柱爐溫度：環境溫度
運行時間：50分鐘
表10含有抗體構築物之純度數據，其表示為單體(預計分子量之未聚集蛋白)百分比，如由上述方案測定。
抗hTNF-α抗體顯示優良SEC特性，其中大多數顯示有>95%單體。
十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺疑膠電泳(SDS-PAGE)
在還原及非還原兩種條件下藉由十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析抗體。使用阿達木單抗第AFP04C批作為對照。對於還原條件而言，1:1混合試樣與具有100 mM DTT之2X tris甘胺酸SDS-PAGE試樣緩衝液(Invitrogen，目錄編號LC2676，批號1323208)，並於60℃下加熱30分鐘。對於非還原條件，1:1混合試樣與試樣緩衝液並於100℃下加熱5分鐘。將還原試樣(10 mg/泳道)裝載於12%預澆注tris-甘胺酸凝膠(Invitrogen，目錄編號EC6005box，批號6111021)上，並將非還原試樣(10 mg/泳道)裝載於8%至16%預澆注tris-甘胺酸凝膠(Invitrogen，目錄編號EC6045box，批號6111021)上。使用SeeBlue Plus 2(Invitrogen，目錄編號LC5925，批號1351542)作為分子量標記。在XCell SureLock微型細胞凝膠盒(Invitrogen，目錄編號EI0001)中運行凝膠且藉由以下方法分離蛋白質：首先施加75之電壓以使試樣堆積在凝膠中，之後施加125之恆定電壓直至染劑前沿到達凝膠之底部為止。所用運行緩衝液係1X tris甘胺酸SDS緩衝液，其係自10X tris甘胺酸SDS緩衝液(ABC,MPS-79-080106)製得。將凝膠用膠狀藍色染料(Invitrogen目錄編號46-7015、46-7016)染色過夜並用Milli-Q水使其褪色直至背景透明。隨後使用Expression掃描儀(型號1680，S/N DASX003641)掃描經染色凝膠。
沉降速度分析
將抗體裝載於三個標準兩部式碳epon中心杯之每一者的試樣室中。該等中心杯具有1.2 cm光學路徑長度且構建有藍寶石窗。PBS用於參考緩衝液且每一室含有140 μL PBS。使用4孔(AN-60Ti)轉子在Beckman ProteomeLab XL-I分析超離心機(系列號PL106C01)中同時檢驗所有試樣。
程式化運行條件並使用ProteomeLab(5.6版)實施離心控制。在分析之前使試樣及轉子熱平衡1小時(20.0±0.1℃)。以3000 rpm實施適當細胞裝載之確認且記錄每一細胞之單次掃描。沉降速度條件係以下：
試樣細胞體積：420 mL
參照細胞體積：420 mL
溫度：20℃
轉子速度：35,000 rpm
時間：8:00小時
UV波長：280 nm
徑向步長：0.003 cm
數據收集：一個數據點/步，未信號平均化。
總掃描次數：100
完整抗體之LC-MS分子量量測
藉由LC-MS分析完整抗體之分子量。將每一抗體用水稀釋至約1 mg/mL。使用具有蛋白微捕集件(microtrap)(Michrom Bioresources公司，目錄編號004/25109/03)之1100 HPLC(Agilent)系統去鹽並將5 mg試樣引入API QSTAR Pulsar i質譜儀(Applied Biosystems)中。使用短梯度洗脫試樣。用流動相A(0.08% FA、0.02% TFA，存於HPLC水中)及流動相B(0.08% FA及0.02% TFA，存於乙腈中)以50 mL/分鐘之流速運行梯度。質譜儀係於4.5千伏噴霧電壓下以2000至3500質荷比之掃描範圍作業。
抗體輕鏈及重鏈之LC-MS分子量量測
藉由LC-MS分析來量測抗體輕鏈(LC)、重鏈(HC)及去糖基化HC之分子量。將抗體用水稀釋至1 mg/mL並於37℃下經30分鐘用10 mM最終濃度之DTT將試樣還原成LC及HC。為使抗體去糖基化，於37℃下將100 mg抗體與2 mL PNGaSe F、5 mL 10% N-辛基糖苷以100 mL總體積一起培育過夜。在去糖基化後，於37℃下將試樣用10 mM最終濃度之DTT還原30分鐘。使用具有C4管柱(Vydac，目錄編號214TP5115，S/N 060206537204069)之Agilent 1100 HPLC系統脫鹽並將試樣(5 mg)引入API QSTAR Pulsar i質譜儀(Applied Biosystems)中。使用短梯度洗脫試樣。用流動相A(0.08% FA、0.02% TFA，存於HPLC水中)及流動相B(0.08% FA及0.02% TFA，存於乙腈中)以50 mL/分鐘之流速運行梯度。質譜儀係於4.5千伏噴霧電壓下以800至3500質荷比之掃描範圍作業。
肽圖譜分析
於室溫下將抗體用6 M鹽酸胍在75 mM碳酸氫銨中變性15分鐘。於37℃下將變性試樣用10 mM最終濃度之DTT還原60分鐘，之後於37℃下用50 mM碘乙酸(IAA)在黑暗中烷基化30分鐘。在烷基化後，於4℃下將試樣用4升10 mM碳酸氫銨透析過夜。將透析試樣用10 mM碳酸氫銨(pH 7.8)稀釋至1 mg/mL，並於37℃下用胰蛋白酶(Promega，目錄編號V5111)或Lys-C(Roche，目錄編號11 047 825 001)以1:20(w/w)胰蛋白酶/Lys-C：抗體比率消解100 mg抗體4 hr。用1 mL 1 N HCl驟冷消解物。對於利用質譜儀檢測之肽圖譜分析而言，藉由逆相高效液相層析(RPHPLC)，在具有Agilent 1100 HPLC系統之C18管柱(Vydac，目錄編號218TP51，S/N NE9606 10.3.5)上分離40 mL消解物。利用使用流動相A(0.02% TFA及0.08% FA，存於HPLC級水中)及流動相B(0.02% TFA及0.08% FA，存於乙腈中)之梯度以50 mL/分鐘之流速運行肽分離。API QSTAR Pulsar i質譜儀係於4.5千伏噴霧電壓下以800至2500質荷比之掃描範圍以陽性模式作業。
二硫鍵圖譜分析
為使抗體變性，在100 mM碳酸氫銨中混合100 mL抗體與300 mL 8 M鹽酸胍。檢查pH以確保其介於7與8之間且於室溫下使試樣在6 M最終濃度之鹽酸胍中變性15分鐘。將一部分變性試樣(100 mL)用Milli-Q水稀釋至600 mL以得到1 M之最終鹽酸胍濃度。於37℃下用胰蛋白酶(Promega，目錄編號V5111，批號22265901)或Lys-C(Roche，目錄編號11047825001，批號12808000)以1:50胰蛋白酶或1:50Lys-C：抗體(w/w)比例(4.4 mg酶：220 mg試樣)將試樣(220mg)消解約16小時。向試樣中添加額外5 mg胰蛋白酶或Lys-C並於37℃下再消解2小時。藉由向每一試樣中添加1 mL TFA停止消解。藉由RPHPLC使用Agilent HPLC系統上之C18管柱(Vydac，目錄編號218TP51 S/N NE020630-4-1A)分離消解試樣。利用與使用流動相A(0.02% TFA及0.08% FA，存於HPLC級水中)及流動相B(0.02% TFA及0.08% FA，存於乙腈中)以50 mL/分鐘之流速的肽圖譜分析所用相同梯度運行分離。HPLC作業條件與用於肽圖譜分析之彼等條件相同。API QSTAR Pulsar i質譜儀係於4.5千伏噴霧電壓下以800至2500質荷比之掃描範圍以陽性模式作業。由肽之觀察MW與由二硫鍵連接之胰蛋白酶或Lys-C肽之預計MW比對，來指認二硫鍵。
游離巰基測定
用於定量抗體中之游離半胱胺酸的方法係基於Ellman試劑(5,5'-二硫基-雙-(2-硝基苯甲酸)(DTNB))與巰基(SH)之反應，其產生特有發色產物5-硫基-(2-硝基苯甲酸)(TNB)。以下式闡釋該反應：
DTNB+RSH→RS-TNB+TNB- +H+
於412 nm下使用Cary 50分光光度計量測TNB- 之吸光度。使用2-巰基乙醇(β-ME)之稀釋液作為游離SH標準物繪示吸光率曲線，且自412 nm下試樣之吸光度測定游離巰基在蛋白質中的濃度。
藉由用HPLC級水將14.2 M β-ME系列稀釋至0.142 mM之最終濃度來製備β-ME標準原液。隨後針對每一濃度一式三份地製備標準物。使用amicon 10,000 MWCO超離心過濾器(Millipore，目錄編號UFC801096，批號L3KN5251)將抗體濃縮至10 mg/mL並將緩衝液更換為用於阿達木單抗之調配物緩衝液(5.57 mM磷酸二氫鈉、8.69 mM磷酸氫二鈉、106.69 mM NaCl、1.07 mM檸檬酸鈉、6.45 mM檸檬酸、66.68 mM甘露醇(pH 5.2)、0.1%(w/v) Tween)。於室溫下用振盪器混合試樣20分鐘。隨後向每一試樣及標準物中添加180 mL 100 mM Tris緩衝液(pH 8.1)，之後添加300 mL存於10 mM磷酸鹽緩衝液(pH 8.1)中之2 mM DTNB。在充分混合後，利用Cary 50分光光度計量測試樣及標準物於412 nm下之吸光率。藉由繪示游離SH之量與β-ME標準物之OD412 nm的圖獲得標準曲線。基於減去空白後之此曲線計算試樣之游離SH含量。
弱陽離子交換層析法
將抗體用10 mM磷酸鈉稀釋至1 mg/mL(pH 6.0)。使用具有WCX-10 ProPac分析管柱之Shimadzu HPLC系統(Dionex，目錄編號054993，S/N 02722)分析電荷異質性。將試樣裝載於80%流動相A(10 mM磷酸鈉，pH 6.0)及20%流動相B(10 mM磷酸鈉、500 mM NaCl，pH 6.0)中之管柱上並以1.0 mL/分鐘之流速洗脫。
寡糖剖析
用2-胺基苯甲醯胺(2-AB)標記試劑衍生PNGase F處理抗體之後釋放的寡糖。藉由正相高效液相層析(NPHPLC)分離螢光標記之寡糖且基於與已知標準物比較之保留時間表徵寡糖之不同形式。
首先用PNGaseF消解抗體以自重鏈之Fc部分裂解N-連接之寡糖。將抗體(200 mg)以及2 mL PNGase F及3 mL 10% N-辛基糖苷置於500 mL Eppendorf管中。添加磷酸鹽緩衝鹽水以使最終體積為60 mL。於37℃下在設定為700 RPM之Eppendorf熱混合器中將試樣培育過夜。亦用PNGase F消解阿達木單抗第AFP04C批作為對照。
在PNGase F處理後，於95℃下在設定為750 RPM之Eppendorf熱混合器中將試樣培育5分鐘以沉澱出蛋白，隨後將試樣置於Eppendorf離心機中以10,000 RPM 2分鐘，從而使沉澱蛋白旋轉沉降。將含有寡糖之上清液轉移至500 mL Eppendorf管中並於65℃下在真空乾燥機(Speed-Vac)中乾燥。
使用自Prozyme購得之2AB標記套組(目錄編號GKK-404，批號132026)用2AB標記寡糖。根據製造商之說明書製備標記試劑。向DMSO小瓶(在套組中提供)中添加乙酸(150 mL，在套組中提供)並藉由將溶液上下抽吸幾次進行混合。將乙酸/DMSO混合物(100 mL)轉移至2-AB染劑之小瓶中(即將使用之前)並進行混合直至完全溶解染劑為止。隨後向還原劑(在套組中提供)之小瓶中添加染劑溶液並充分混合(標記試劑)。向每一乾燥寡糖試樣小瓶中添加標記試劑(5 mL)，並充分混合。將反應小瓶置於設定為65℃及700-800 RPM之Eppendorf熱混合器中反應2小時。
在標記反應後，使用來自Prozyme之GlycoClean S芯柱(目錄編號GKI-4726)去除過量螢光染劑。在添加試樣之前，將芯柱用1 mL Milli-Q水洗滌，之後用1 mL 30%乙酸溶液洗滌5次。在即將添加試樣之前，向芯柱中添加1 mL乙腈(Burdick及Jackson，目錄編號AH015-4)。
在所有乙腈均穿過芯柱後，將試樣點至剛剛洗滌之盤的中心並使其吸附至盤上並保持10分鐘。將盤用1 mL乙腈洗滌，之後用1 mL 96%丙腈洗滌5次。將芯柱置於1.5 mL Eppendorf管柱上並用Milli-Q水洗滌3次(每次洗滌400 mL)來洗脫2-AB標記之寡糖。
使用與Shimadzu HPLC系統連接之Glycosep N HPLC(目錄編號GKI-4728)分離寡糖。Shimadzu HPLC系統由系統控制器、脫氣器、二元幫浦、具有試樣冷卻器之自動取樣器、及螢光檢測器組成。
於高溫下之穩定性
用適當緩衝液、表面活性劑、穩定劑及/或糖將抗體之最終濃度調節至2 mg/mL。隨後過濾滅菌抗體溶液並在無菌條件下製備0.25 mL等份試樣。將等份試樣於-80℃、5℃、25℃或40℃下放置1週、2週或3週。在培育時期結束時，藉由尺寸排除層析及SDS-PAGE分析試樣。
在還原及非還原兩種條件下藉由SDS-PAGE分析試樣穩定性。所用程序與本文所述相同。將凝膠用膠狀藍色染料(Invitrogen目錄編號46-7015、46-7016)染色過夜並用Milli-Q水使其褪色直至背景透明。隨後使用Expression掃描儀(型號1680，S/N DASX003641)掃描經染色凝膠。為獲得更大靈敏度，使用銀染色套組(Owl Scientific,Gel公司，San Francisco,Calif. US)對相同凝膠進行銀染色且使用製造商給出之推薦程序。
實例1.9：HEK 293-6E細胞中之轉染及表現
將抗hTNF-α抗體載體構築物轉染至293細胞中用於產生蛋白質。所用293瞬時轉染程序係以下中公開之方法的修改形式：Durocher等人(2002) Nucl. Acids Res.) 30(2e9):1-9及Pham等人(2005) Biotech. Bioeng. 90(3):332-44。轉染中所用試劑包括：‧ HEK 293-6E細胞(穩定表現EBNA1之人類胚腎細胞系；自National Research Council Canada獲得)，其在設定於130 rpm、37℃及5% CO2 下之增濕培育箱中的可棄式Erlenmeyer燒瓶中培養。
‧　培養基：FreeStyle 293表現培養基(Invitrogen 12338-018)加上25 μg/m L遺傳黴素(Geneticin)(G418)(Invitrogen 10131-027)及0.1%普流尼克(Pluronic) F-68(Invitrogen 24040-032)。
‧　轉染培養基：FreeStyle 293表現培養基加上10 mM HEPES(Invitrogen 15630-080)。
‧聚乙烯亞胺(PEI)原液：1 mg/mL無菌儲液，pH 7.0，利用25 kDa PEI(Polysciences)製得並儲存於小於-15℃下。
‧　胰蛋白腖補料培養基：存於FreeStyle 293表現培養基中之5% w/v胰蛋白腖N1無菌原液(Organotechnie,19554)。
用於轉染之細胞製備： 在轉染之前約2小時至4小時，藉由離心收穫HEK 293-6E細胞並以約100萬個活細胞/mL之細胞密度重新懸浮於培養基中。對於每一轉染而言，將40 mL細胞懸浮液轉染至可棄式250 mL Erlenmeyer燒瓶中並培育2小時至4小時。
轉染：將轉染培養基及PEI原液預加熱至室溫(RT)。對於每一轉染而言，將25 μg質體DNA及50 μg聚乙烯亞胺(PEI)在5 mL轉染培養基中合併並於RT下培育15分鐘至20分鐘以形成DNA:PEI複合物。對於BR3-Ig轉染而言，每次轉染使用25 μg BR3-Ig質體。將每一5 mL DNA:PEI複合物添加至先前製備之40 mL培養物中並返回至設定於130 rpm、37℃及5% CO2 下的增濕培育箱中。20小時至28小時後，向每一轉染中添加5 mL胰蛋白腖補料培養基並將培養物繼續培養6天。
表11含有HEK 293-6E細胞中之親代抗體的產率數據，其表示為毫克/升。
所有抗體在HEK 293-6E細胞中均表現良好。在大多數情形下，可容易地自HEK 293-6E細胞之上清液獲得>50 mg/L純化抗體。
以引用方式併入
本發明以引用方式併入分子生物及藥物遞送領域中熟知之技術的全文。該等技術包括(但不限於)以下出版物中所述技術：Ausubel等人(編輯)，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,NY(1993)；Ausubel,F. M.等人編輯，Short Protocols In Molecular Biology (第4版，1999)John Wiley & Sons,NY.(ISBN 0-471-32938-X).Controlled Drug Bioavailability Drug Product Design and Performance, Smolen及Ball(編輯)，Wiley,New York(1984)；Gieg等人，第1章，Crystallization of Nucleic Acids and Proteins,A Practical Approach，第2 版， (Ducruix及Gieg編輯)(Oxford University Press,New York,1999)第1至16頁；Goodson,J.M.，第6章，Medical Applications of Controlled Release，第II卷，Applications and Evaluation ,(Langer及Wise編輯)(CRC PresS公司，Boca Raton,1984)，第115至138頁；Hammerling等人編輯，「Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas」，Research Monographs in Immunology ,第3卷(J.L. Turk總編輯)(Elsevier,New York,1981)，第563至587頁；Harlow等人,Antibodies: A Laboratory Manual ,(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)；Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987)；Kabat,E. A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第5版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公開案第91-3242號；Kontermann及Dbel編輯，Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York.第790頁(ISBN 3-540-41354-5)；Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual ,Stockton Press,NY(1990)；Lu及Weiner編輯，Cloning and Expression Vectors for Gene Function Analysis (2001) BioTechniques Press. Westborough,Mass.第298頁(ISBN 1-881299-21-X)；Goodson,J.M.,Medical Applications of Controlled Release (Langer及Wise編輯)(CRC Press,Boca Raton,1974)；Old and Primrose,Principles of Gene Manipulation: An Introduction To Genetic Engineering (第3版，1985) Blackwell Scientific Publications,Boston；Studies in Microbiology ,V.2：第409頁(ISBN 0-632-01318-4)；Sambrook,J.等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版，1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY.第1至3卷(ISBN 0-87969-309-6)；Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, (J.R. Robinson編輯)(Marcel Dekker公司，New Yorkm1978)；WinnackermE.L.From Genes To Clones: Introduction To Gene Technology (1987) VCH Publishers,N.Y.(由Horst Ibelgaufts翻譯)，第634頁(ISBN 0-89573-614-4)。
貫穿本申請案引用之所有引用參考文獻(包括參考文獻、專利、專利申請案及網站)之內容的全文皆以引用方式明確地併入本文中，如其中所引用參考文獻一般。除非另有說明，否則本發明之實踐可使用業內熟知之免疫性、分子生物學及細胞生物學學等習用技術。
等效內容
本發明可以其他具體形式來實施，而不背離其精神或基本特徵。因此，應在所有態樣上皆將上述實施例視為闡釋性而非限制本文所述之本發明。因此，本發明範疇係由隨附申請專利範圍而非由上述說明書來指定，且因此本發明意欲涵蓋申請專利範圍等效內容之含義及範圍內的所有變化。
<110>　美商亞培公司
<120>　TNF-α結合蛋白
<130>　ABT-123.1 TW
<140>　100112086
<141>　2011-04-07
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<151>　2010-04-07
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<170>　PatentIn version 3.5
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<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列說明：合成多肽
<400>　36

Claims (55)

  1. 一種人類化結合蛋白或其抗原結合片段，其包含能夠結合人類腫瘤壞死因子-α(TNF-α)之抗原結合域，該抗原結合域包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中該VH區包含選自下列所組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：24、25、28、29、30、31、32及33；該VL區包含選自下列所組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：26、27、34、35及36；該人類化結合蛋白或其抗原結合片段包含人類接受體(acceptor)框架；且其中藉由表面電漿共振所量測，該人類化結合蛋白或其抗原結合片段以至多1.56x10-10 M之解離常數(KD )結合至人類TNF-α。
  2. 如請求項1之人類化結合蛋白或其抗原結合片段，其中該人類接受體框架包含至少一個選自下列所組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：6-21。
  3. 如請求項2之人類化結合蛋白或其抗原結合片段，其中該人類接受體框架包含選自下列所組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：9、10、11、12、15、16、17及21。
  4. 如請求項2或3之人類化結合蛋白或其抗原結合片段，其中該人類接受體框架包含至少一個胺基酸取代。
  5. 如請求項4之人類化結合蛋白或其抗原結合片段，其中該胺基酸取代係選自下列所組成之群之關鍵殘基：毗鄰CDR之殘基；糖基化位點殘基；能夠與人類TNF-α相互作用之殘基；能夠與CDR相互作用之殘基；重鏈可變區 與輕鏈可變區之間之接觸殘基；游標區(Vernier zone)內之殘基；及在Chothia界定之可變重鏈CDR1及Kabat界定之第一重鏈框架之間的重疊區中的殘基。
  6. 如請求項1之人類化結合蛋白或其抗原結合片段，其中該結合蛋白包含兩個具有以下胺基酸序列之兩個可變域：SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：27；SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26；或SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：27。
  7. 如請求項1之人類化結合蛋白或其抗原結合片段，其中該結合蛋白或其抗原結合片段抑制TNF-α之生物功能。
  8. 如請求項1之人類化結合蛋白或其抗原結合片段，其中該結合蛋白或其抗原結合片段中和TNF-α。
  9. 如請求項1之人類化結合蛋白或其抗原結合片段，其中該結合蛋白或其抗原結合片段減弱TNF-α與其受體結合之能力。
  10. 如請求項9之人類化結合蛋白或其抗原結合片段，其中該結合蛋白或其抗原結合片段減弱前人類TNF-α、成熟人類TNF-α或截短人類TNF-α與其受體結合之能力。
  11. 如請求項1之人類化結合蛋白或其抗原結合片段，其中該結合蛋白或其抗原結合片段減少以下之一或多者：TNF依賴性細胞因子產生、TNF依賴性細胞殺死、TNF依賴性發炎、TNF依賴性骨蝕及TNF依賴性軟骨損傷。
  12. 如請求項1之人類化結合蛋白或其抗原結合片段，其中該結合蛋白或其抗原結合片段包含人類IgM恆定域、人 類IgG1恆定域、人類IgG2恆定域、人類IgG3恆定域、人類IgG4恆定域、人類IgA恆定域或人類IgE恆定域之重鏈免疫球蛋白恆定域。
  13. 如請求項12之人類化結合蛋白或其抗原結合片段，其中該重鏈免疫球蛋白恆定域係人類IgG1恆定域。
  14. 如請求項1或12之人類化結合蛋白或其抗原結合片段，其中該結合蛋白或其抗原結合片段進一步包含輕鏈免疫球蛋白恆定域，該輕鏈免疫球蛋白恆定域包含人類Ig κ恆定域或人類Ig λ恆定域。
  15. 如請求項13之人類化結合蛋白或其抗原結合片段，其中該人類IgG1恆定域包含胺基酸序列SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。
  16. 如請求項14之人類化結合蛋白或其抗原結合片段，其中該人類Ig κ恆定域包含胺基酸序列SEQ ID NO：4，或人類Ig λ恆定域包含胺基酸序列SEQ ID NO：5。
  17. 一種能夠結合人類腫瘤壞死因子-α(TNF-α)之人類化結合蛋白，其包含：免疫球蛋白(Ig)恆定重鏈區，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3；Ig恆定輕鏈區，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5；Ig可變重鏈區，其包含選自下列所組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：24、25、28、29、30、31、32及33；及 Ig可變輕鏈區，其包含選自下列所組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：26、27、34、35及36。
  18. 如請求項1之人類化結合蛋白或其抗原結合片段，其中該結合蛋白或其抗原結合片段係選自下列所組成之群：免疫球蛋白分子、Fv、二硫鍵連接之Fv、單株抗體、scFv、嵌合抗體、單域抗體、CDR移植抗體、雙功能抗體(diabody)、人類化抗體、多特異性抗體、Fab、雙重(dual)特異性抗體、Fab'片段、雙特異性抗體、F(ab')2片段、DVD-IgTM 、包含兩個Fab片段在鉸鏈區由二硫橋連接之二價片段、由該VH及CH1域組成之Fd片段、由抗體單臂之VL及VH域組成的Fv片段、dAb片段及單鏈抗體。
  19. 一種結晶結合蛋白，其包含如請求項1之結合蛋白或其抗原結合片段，其中該結合蛋白或其抗原結合片段呈晶體形式。
  20. 如請求項19之結晶結合蛋白，其中該晶體係不含載劑之醫藥控制釋放晶體。
  21. 如請求項19之結晶結合蛋白，其中該結合蛋白或其抗原結合片段之活體內半衰期長於該結合蛋白或其抗原結合片段之可溶性對應部分(counter-part)。
  22. 一種釋放TNF-α結合蛋白之組合物，其包含：(a)調配物，其中該調配物包含如請求項1或19之結合蛋白或其抗原結合片段及成份；及(b)至少一種聚合載劑。
  23. 如請求項22之組合物，其中該成份選自由以下組成之群：白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇(lactitol)、明膠、 羥丙基-β-環糊精、甲氧基聚乙二醇及聚乙二醇。
  24. 如請求項22之組合物，其中該聚合載劑係選自由以下組成之群之聚合物：聚丙烯酸、聚氰基丙烯酸酯、聚胺基酸、聚酸酐、聚縮酚酸肽(depsipeptide)、聚酯、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物、聚b-羥基丁酸酯、聚己內酯、聚二氧雜環己酮；聚乙二醇、聚羥丙基甲基丙烯醯胺、聚有機磷腈、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、馬來酸酐-烷基乙烯基醚共聚物、普羅尼克(pluronic)多元醇、白蛋白、海藻酸鹽、纖維素及纖維素衍生物、膠原、纖維蛋白、明膠、透明質酸、寡糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖、及其摻合物及共聚物。
  25. 一種人類腫瘤壞死因子-α(TNF-α)結合蛋白構築物(construct)，其包含如請求項1之人類化結合蛋白或其抗原結合片段及連接體或免疫球蛋白恆定域。
  26. 如請求項25之TNF-α結合蛋白構築物，其中該結合蛋白或其抗原結合片段為糖基化。
  27. 如請求項25之TNF-α結合蛋白構築物，其中該結合蛋白構築物係結晶TNF-α結合蛋白構築物。
  28. 如請求項27之TNF-α結合蛋白構築物，其中該結晶TNF-α結合蛋白構築物係不含載劑之醫藥控制釋放結晶TNF-α結合蛋白構築物。
  29. 如請求項25之TNF-α結合蛋白構築物，其中該結合蛋白構築物之活體內半衰期長於該結合蛋白構築物之可溶性對應部分。
  30. 一種人類腫瘤壞死因子-α(TNF-α)結合蛋白偶聯物(conjugate)，其包含如請求項25之TNF-α結合蛋白構築物及免疫黏附分子、成像劑、治療劑或細胞毒性劑。
  31. 如請求項30之TNF-α結合蛋白偶聯物，其中該成像劑為放射標記、酶、螢光標記、發光標記、生物發光標記、磁性標記或生物素。
  32. 如請求項31之TNF-α結合蛋白偶聯物，其中該放射標記係係選自由以下組成之群：3 H、14 C、35 S、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I、177 Lu、166 Ho及153 Sm。
  33. 如請求項30之TNF-α結合蛋白偶聯物，其中該治療劑或細胞毒性劑為抗代謝劑、烷基化劑、抗生素、生長因子、細胞因子、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環抗生素、毒素或細胞凋亡劑。
  34. 一種分離之核酸，其編碼如請求項1之包含胺基酸序列的結合蛋白。
  35. 一種載體，其包含如請求項34之分離之核酸。
  36. 一種宿主細胞，其包含如請求項35之載體。
  37. 一種產生結合TNF-α之蛋白質的方法，該方法包含以下步驟：由如請求項36之宿主細胞在培養基中，在足以產生結合TNF-α之結合蛋白的條件下培養。
  38. 一種TNF-α結合蛋白，其係由如請求項37之方法產生。
  39. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1之結合蛋白或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑。
  40. 如請求項39之醫藥組合物，其中該醫藥上可接受之載劑 用作佐劑。
  41. 如請求項40之醫藥組合物，其中該佐劑係透明質酸酶。
  42. 如請求項39之醫藥組合物，其中該組合物進一步包含至少一種用於治療TNF-α活性有害之病症之其他藥劑。
  43. 如請求項42之醫藥組合物，其中該其他藥劑係治療劑、成像劑、細胞毒性劑、血管生成抑制劑、激酶抑制劑、共刺激分子阻斷劑、黏附分子阻斷劑、抗細胞因子抗體或其功能片段、甲胺喋呤(methotrexate)、環孢素(cyclosporine)、雷帕黴素(rapamycin)、FK506、可檢測標記、可檢測報告子、TNF-α拮抗劑、抗風濕藥；肌肉鬆弛劑、麻醉藥、非類固醇消炎藥(NSAID)、止痛劑、麻醉劑、鎮靜劑、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗微生物劑、抗乾癬劑、皮質類固醇、同化類固醇、紅血球生成素、免疫接種、免疫球蛋白、免疫抑制劑、生長激素、激素替代藥物、放射性藥、抗抑鬱劑、抗精神病劑、刺激劑、哮喘藥物、β激動劑、吸入性類固醇、口服類固醇、腎上腺素或其類似物、細胞因子或細胞因子拮抗劑。
  44. 一種如請求項39之醫藥組合物的用途，其用於製造用於治療患有TNF-α有害病症患者之藥劑。
  45. 一種如請求項1之結合蛋白的用途，其用於製造用於降低人類TNF-α活性的藥劑。
  46. 一種如請求項1之結合蛋白的用途，其用於製造用於降低患有TNF-α活性有害病症之人類個體中人類TNF-α活性 之藥劑。
  47. 一種如請求項1之結合蛋白的用途，其用於製造用於治療患有TNF-α有害病症之患者的藥劑，其中該藥劑係在投與第二藥劑之前、同時或之後投與，其中該第二藥劑係能夠結合人類IL-12之抗體或其片段；PGE2；LPA；NGF；CGRP；SubP；RAGE；組胺；組胺受體阻斷劑；緩激肽；IL-1α；IL-1β；VEGF；PLGF；甲胺喋呤；皮質類固醇、糖皮質激素受體調節劑；環孢素、雷帕黴素、FK506或非類固醇消炎劑。
  48. 如請求項47之用途，其中該病症係選自由下列所組成之群：呼吸疾病；哮喘；過敏性及非過敏性哮喘；因感染引起之哮喘；因感染呼吸道合胞病毒(RSV)引起之哮喘；慢性阻塞性肺病(COPD)；涉及氣道發炎之病況；嗜酸粒細胞增多症；纖維化及黏液產生過量；囊性纖維化；肺纖維化；異位性病症；異位性皮炎；蕁麻疹；濕疹；過敏性鼻炎；過敏性腸胃炎；皮膚之發炎及/或自體免疫病況；胃腸器官之發炎及/或自體免疫病況；發炎腸病(IBD)；潰瘍性結腸炎；克羅恩氏病(Crohn's disease)；肝之發炎及/或自體免疫病況；肝硬化；肝纖維化；由B型及/或C型肝炎病毒引起之肝纖維化；硬皮病；腫瘤或癌症；肝細胞癌；膠質細胞瘤；淋巴瘤；霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)；病毒感染；細菌感染；寄生蟲感染；HTLV-1感染；保護性1型免疫反應表現之抑制、及在疫苗接種期間保護性1型免疫反應表現 之抑制。
  49. 如請求項47之用途，其中該病症選自由以下組成之群：類風濕性關節炎、骨關節炎、幼年型慢性關節炎、敗血性關節炎、萊姆關節炎(Lyme arthritis)、乾癬性關節炎、反應性關節炎、脊椎關節病、全身性紅斑狼瘡、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、發炎腸病、胰島素依賴性糖尿病、甲狀腺炎、哮喘、過敏性疾病、乾癬、皮炎硬皮病、移植物抗宿主疾病、器官移植物排斥、與器官移植相關之急性或慢性免疫疾病、結節病、動脈粥樣硬化、彌漫性血管內凝血、川崎病(Kawasaki's disease)、格雷夫斯氏病(Grave's disease)、腎病症候群、慢性疲勞症候群、韋格納氏肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)、亨諾-許蘭氏紫癜(Henoch-Schoenlein purpurea)、腎之顯微血管炎、慢性活動性肝炎、葡萄膜炎、敗血性休克、毒性休克症候群、敗血症症候群、惡病質、傳染病、寄生蟲病、後天性免疫缺陷症候群、急性橫貫性脊髓炎、亨庭頓氏舞蹈症(Huntington's chorea)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、中風、原發性膽汁性肝硬化、溶血性貧血、惡性腫瘤、心臟衰竭、心肌梗塞、阿狄森氏病(Addison's disease)、散發性、I型多腺缺陷症及II型多腺缺陷症、施密特氏症候群(Schmidt's syndrome)、成人(急性)呼吸窘迫症候群、禿髮、斑禿、血清陰性關節病、關節病、賴特爾病(Reiter's disease)、乾癬性關節病、潰瘍性結腸 炎性關節病、腸病性滑膜炎，衣原體、耶爾森菌(yersinia)及沙門菌(salmonella)相關之關節病，脊椎關節病、動脈粥樣硬化疾病/動脈硬化、異位性過敏症、自體免疫性大疱病、尋常天疱瘡、葉狀天疱瘡、類天疱瘡、線性IgA病、自體免疫性溶血性貧血、庫姆(Coombs)陽性溶血性貧血、後天惡性貧血、幼年型惡性貧血、肌痛性腦炎/慢性疲勞病(Royal Free Disease)、慢性黏膜皮膚念珠菌病、巨細胞動脈炎、原發性硬化性肝炎、隱原性自體免疫性肝炎、後天性免疫缺陷症候群、後天性免疫缺陷有關疾病、B型肝炎、C型肝炎、普通變異免疫缺陷症(普通變異γ球蛋白過少)、擴張型心肌病、女性不育、卵巢功能衰竭、早熟卵巢功能衰竭、纖維化肺疾病、隱原性纖維化肺泡炎、發炎後間質肺病、間質性肺炎、結締組織病相關之間質肺病、混合結締組織病相關之肺病、全身性硬化症相關之間質肺病、類風濕性關節炎相關之間質肺病、全身性紅斑狼瘡相關之肺病、皮肌炎/多肌炎相關之肺病、薛格連氏病(Sjögren's disease)相關之肺病、強直性脊柱炎相關之肺病、血管炎彌漫性肺病、血鐵質沉著相關之肺病、藥物誘發之間質肺病、纖維化、輻射纖維化、閉塞性細枝氣管炎、慢性嗜酸粒細胞性肺炎、淋巴細胞浸潤性肺病、感染後間質肺病、痛風性關節炎、自體免疫性肝炎、1型自體免疫性肝炎(典型自體免疫或狼瘡狀肝炎)、2型自體免疫性肝炎(抗LKM抗體肝炎)、自體免疫調介之低血糖、有黑棘皮症之B型胰 島素抗性、甲狀旁腺功能低下症、與器官移植相關之急性免疫疾病、與器官移植相關之慢性免疫疾病、骨關節病、原發性硬化性膽管炎、1型乾癬、2型乾癬、特發性白血球減少症、自體免疫性嗜中性白血球減少症、NOS腎病、腎小球性腎炎、腎之顯微血管炎、萊姆病(Lyme disease)、盤狀紅斑狼瘡、特發性或NOS男性不育、精子自體免疫病、多發性硬化(所有亞型)、交感性眼炎、繼發於結締組織病之肺動脈高血壓症、古德帕斯徹氏症候群(Goodpasture's syndrome)、結節性多動脈炎之肺病、急性風濕熱、類風濕性脊柱炎、斯提耳氏病(Still's disease)、全身性硬化症、薛格連氏症候群(Sjörgren's syndrome)、高安氏病(Takayasu's disease)/動脈炎、自體免疫性血小板減少症、特發性血小板減少症、自體免疫性甲狀腺疾病、甲狀腺功能亢進症、甲狀腺腫自體免疫性甲狀腺功能低下症(橋本氏病(Hashimoto's disease))、萎縮性自體免疫性甲狀腺功能低下症、原發性黏液性水腫、晶狀體源性葡萄膜炎、原發性血管炎、白斑急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬化、酒精誘發之肝損傷、膽汁淤積、特異體質性肝病、藥物誘發之肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、過敏症及哮喘、B群鏈球菌(group B streptococci)(GBS)感染、精神病症、抑鬱症、精神分裂症、Th2型及Th1型調介之疾病、急性及慢性疼痛(不同形式之疼痛)、肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺、直腸癌、造血惡性腫瘤、白血 病及淋巴瘤、無β脂蛋白血症、手足發紺、急性及慢性寄生或傳染過程、急性白血病、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性或慢性細菌感染、急性胰腺炎、急性腎衰竭、腺癌、心房異位性博動、AIDS癡呆複合症、酒精誘發之肝炎、過敏性結膜炎、過敏性接觸性皮炎、過敏性鼻炎、同種異體移植排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺陷症、肌萎縮性側索硬化症、貧血、心絞痛、前角細胞變性、抗CD3療法、抗磷脂症候群、抗受體過敏性反應、主動脈及外周動脈瘤、主動脈剝離、動脈性高血壓、動脈硬化、動靜脈瘺、共濟失調、心房顫動(持續性或陣發性)、心房撲動、房室傳導阻滯、B細胞淋巴瘤、骨移植排斥、骨髓移植(BMT)排斥、束支傳導阻滯、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、燒傷、心律不齊、心肌頓抑(stun)症候群、心臟腫瘤、心肌病、心肺繞道發炎反應、軟骨移植排斥、小腦皮質變性、小腦病症、紊亂性或多灶性心房心動過速、化學療法相關之病症、慢性骨髓細胞性白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性發炎病、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性水楊酸中毒、結腸直腸癌、充血性心臟衰竭、結膜炎、接觸性皮炎、肺源性心臟病、冠狀動脈疾病、庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、培養陰性敗血症、囊性纖維化、細胞因子療法相關之病症、拳擊手癡呆、脫髓鞘疾病、登革出血熱、皮炎、皮膚病、糖尿病(diabetes, diabetes mellitus)、糖尿病性動脈硬化病、彌漫性路易體疾病(Diffuse Lewy body disease)、擴張型充血性心肌病、基底神經節病症、中年人唐氏症候群(Down's Syndrome)、由阻斷CNS多巴胺(dopamine)受體之藥物誘發之藥物誘發運動障礙、藥物敏感、濕疹、腦脊髓炎、心內膜炎、內分泌病、會厭炎、艾伯斯坦-巴爾病毒感染(Epstein-Barr virus 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lymphoma)、腹主動脈及其分枝阻塞、阻塞性動脈病症、OKT3®療法、睾丸炎/副睾炎、睾丸炎/輸精管切除術逆轉程序、器官巨大症、骨質疏鬆症、胰腺移植排斥、胰腺癌、副腫瘤症候群/惡性腫瘤之高鈣血症、甲狀旁腺移植排斥、骨盆發炎疾病、常年性鼻炎、心包疾病、外周動脈粥樣硬化性疾病、外周血管病症、腹膜炎、惡性貧血、卡氏肺囊蟲肺炎(pneumocystis carinii pneumonia)、肺炎、POEMS症候群(多神經病、器官巨大症、內分泌病、單株γ球蛋白病及皮膚變化症候群)、灌注後症候群、泵送後症候群、MI心切開術後症候群、先兆子癇、進行性核上性麻痺、原 發性肺動脈高血壓症、放射療法、雷諾現象(Raynaud's phenomenon)及疾病、雷諾病、雷夫蘇姆病(Refsum's disease)、規則性窄QRS心動過速、腎血管性高血壓、再灌注損傷、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年舞蹈症、路易體型老年性癡呆、血清陰性關節病、休克、鐮狀細胞貧血、皮膚同種異體移植排斥、皮膚變化症候群、小腸移植排斥、實體瘤、特異性心律不整、脊柱共濟失調、脊髓小腦變性、鏈球菌肌炎、小腦結構損傷、亞急性硬化性全腦炎、暈厥、心血管系統梅毒、全身性過敏反應、全身性發炎反應症候群、全身性發作幼年型類風濕性關節炎、T細胞或FAB ALL、毛細管擴張、閉塞性血栓性脈管炎、血小板減少症、毒性、移植、創傷/出血、III型過敏反應、IV型過敏反應、不穩定型心絞痛、尿毒症、尿敗血症、蕁麻疹、心臟瓣膜病、靜脈曲張、血管炎、靜脈疾病、靜脈血栓形成、心室顫動、病毒及真菌感染、病毒性腦炎/無菌腦膜炎、病毒相關之噬血細胞症候群、魏尼凱-科爾薩科夫症候群(Wernicke-Korsakoff syndrome)、威爾森氏病(Wilson's disease)、任何器官或組織之異種移植排斥、急性冠脈症候群、急性特發性多神經炎、急性發炎脫髓鞘多發性神經根神經病、急性局部缺血、成人斯提耳病、斑禿、過敏反應、抗磷脂抗體症候群、再生不全性貧血、動脈硬化、異位性濕疹、異位性皮炎、自體免疫性皮炎、與鏈球菌感染相關之自體免疫性病症、自體免疫性腸病變、自體免疫 性聽力損失、自體免疫性淋巴增生症候群(ALPS)、自體免疫性心肌炎、自體免疫性早熟卵巢功能衰竭、眼瞼炎、枝氣管擴張症、大疱性類天疱瘡、心血管疾病、災難性抗磷脂症候群、乳糜瀉、頸椎病、慢性局部缺血、瘢痕性類天疱瘡、具有多發性硬化風險之臨床孤立症候群(CIS)、結膜炎、兒童期精神異常、慢性阻塞性肺病(COPD)、淚囊炎、皮肌炎、糖尿病視網膜病變、糖尿病、椎間盤突出、椎間盤脫出、藥物誘發之免疫性溶血性貧血、心內膜炎、子宮內膜異位症、眼內炎、上鞏膜炎、多形紅斑、重型多形紅斑、妊娠性類天疱瘡、吉蘭-巴雷症候群(Guillain-Barré syndrome)(GBS)、花粉熱、休斯症候群(Hughes syndrome)、特發性帕金森氏病、特發性間質肺炎、IgE調介之過敏症、免疫溶血性貧血、包涵體肌炎、傳染型眼睛發炎疾病、發炎脫髓鞘疾病、發炎心臟疾病、發炎腎病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、乾燥性角膜結膜炎(keratojunctivitis sicca)、庫斯毛耳病(Kussmaul disease)或庫斯毛耳-邁埃爾病(Kussmaul-Meier disease)、蘭德里氏(Landry's)麻痺、郎格罕細胞(Langerhan's cell)組織細胞增多症、網狀青斑、黃斑變性、顯微多血管炎、白赫鐵列夫症(morbus bechterev)、運動神經元病症、黏膜性類天疱瘡、多器官衰竭、重症肌無力、骨髓增生異常症候群、心肌炎、神經根障礙、神經病、非A非B型肝炎、視神經炎、骨質溶解、卵巢癌、少關節性JRA、外周動脈阻塞性疾病(PAOD)、外周 血管疾病(PVD)、外周動脈疾病(PAD)、靜脈炎、結節性多動脈炎(或結節性動脈周圍炎)、多軟骨炎、風濕性多肌痛、白髮症、多關節JRA、多內分泌缺乏症候群、多肌炎、風濕性多肌痛(PMR)、泵送後症候群、原發性帕金森病(primary Parkinsonism)、前列腺及直腸癌及造血惡性腫瘤(白血病及淋巴瘤)、前列腺炎、純紅血球再生不全、原發性腎上腺機能不全、復發性視神經脊髓炎、再狹窄、風濕性心臟疾病、sapho(滑膜炎、痤瘡、膿疱病、骨肥厚及骨炎)、硬皮病、繼發性澱粉樣變性、休克肺、鞏膜炎、坐骨神經痛、繼發性腎上腺機能不全、聚矽氧相關之結締組織病、史奈頓威金森皮膚病(Sneddon-Wilkinson dermatosis)、強直性脊椎炎、史-約症候群(Stevens-Johnson syndrome)(SJS)、全身性發炎反應症候群、顳動脈炎、弓形體視網膜炎、毒性表皮壞死溶解症、橫貫性脊髓炎、TRAPS(腫瘤壞死因子受體相關之週期性症候群)、1型過敏反應、II型糖尿病、蕁麻疹、尋常性間質肺炎(UIP)、血管炎、春季結膜炎、病毒性視網膜炎、沃格特-小柳-原田症候群(Vogt-Koyanagi-Harada syndrome)(VKH症候群)、濕性黃斑變性、傷口癒合、耶爾森菌及沙門菌相關之關節病。
  50. 一種如請求項1之結合蛋白的用途，其用於製造用於治療患有TNF-α有害病症患者之藥劑，其中該藥劑係在投與第二藥劑之前、同時或之後投與，其中該第二藥劑係吸入性類固醇；β-激動劑；短效或長效β-激動劑；白三 烯或白三烯受體之拮抗劑；ADVAIR；IgE抑制劑；抗IgE抗體；XOLAIR；磷酸二酯酶抑制劑；PDE4抑制劑；黃嘌呤；抗膽鹼激導性藥物；肥大細胞穩定劑；色甘酸(Cromolyn)；IL-4抑制劑；IL-5抑制劑；嗜酸細胞趨化因子(eotaxin)/CCR3抑制劑；組胺或其受體(包括H1、H2、H3及H4)之拮抗劑；前列腺素D或其受體DP1及CRTH2之拮抗劑；TNF拮抗劑；TNF受體之可溶性片段；ENBREL；TNF酶拮抗劑；TNF轉化酶(TACE)抑制劑；毒蕈鹼受體拮抗劑；TGF-β拮抗劑；干擾素γ；哌非尼酮(perfenidone)；化學治療劑，甲胺喋呤；來氟米特(leflunomide)；西羅莫司(sirolimus)(雷帕黴素)或其類似物，CCI-779；COX2或cPLA2抑制劑；NSAID；免疫調節劑；p38抑制劑；TPL-2、MK-2及NFkB抑制劑；布替耐德(budenoside)；表皮生長因子；皮質類固醇；環孢素；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；胺基水楊酸酯；6-巰基嘌呤；硫唑嘌呤(azathioprine)；甲硝唑(metronidazole)；脂肪加氧酶(lipoxygenase)抑制劑；美沙拉秦(mesalamine)；奧沙拉秦(olsalazine)；巴柳氮(balsalazide)；抗氧化劑；血栓烷(thromboxane)抑制劑；IL-1受體拮抗劑；抗IL-1β抗體；抗IL-6抗體；生長因子；彈性蛋白酶抑制劑；吡啶基-咪唑化合物；以下之抗體或激動劑：LT、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL- 25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、EMAP-II、GM-CSF、FGF或PDGF；CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配體之抗體；FK506；雷帕黴素；黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil)；布洛芬(ibuprofen)；潑尼松龍(prednisolone)；磷酸二酯酶抑制劑；腺苷激動劑；抗血栓劑；補體抑制劑；腎上腺素激導劑(adrenergic agent)；IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑；IL-1β轉化酶抑制劑；TNF-α轉化酶抑制劑；T細胞信號傳導抑制劑；金屬蛋白酶抑制劑；6-巰基嘌呤；血管緊張素轉化酶抑制劑；可溶性細胞因子受體；可溶性p55 TNF受體；可溶性p75 TNF受體；sIL-1RI；sIL-1RII；sIL-6R；抗發炎細胞因子；IL-4；IL-10；IL-11；或TGF-β。
  51. 如請求項46之用途，其中該藥劑係藉由至少一種選自由以下組成之群之方式投與：非經腸、皮下、肌內、靜脈內、關節內、枝氣管內、腹內、囊內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、腦室內、結腸內、頸管內、胃內、肝內、心肌內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊柱內、滑膜內、胸內、子宮內、膀胱內、濃注(bolus)、陰道、直腸、頰、舌下、鼻內及經皮。
  52. 一種藉由免疫分析法確定測試試樣中存在TNF-α或其片段之方法，其中該免疫分析法包括使該測試試樣與至少 一種如請求項1之結合蛋白或其片段及至少一種可檢測標記接觸。
  53. 如請求項52之方法，其中該方法進一步包括以下步驟：(i)使該測試試樣與至少一種結合蛋白或其片段接觸，其中該結合蛋白結合至該TNF-α或其片段上之表位(epitope)，以形成第一複合物；(ii)使該複合物與該至少一種可檢測標記接觸，其中該可檢測標記結合至該第一複合物或該TNF-α或其片段上未與該結合蛋白或其片段結合之表位，以形成第二複合物；及(iii)基於該第二複合物中該可檢測標記產生之信號檢測該測試試樣中該TNF-α或其片段之存在，其中該TNF-α或其片段之存在與該可檢測標記產生之信號直接相關。
  54. 如請求項52之方法，其中該方法進一步包含以下步驟：(i)使該測試試樣與該至少一種結合蛋白或其片段接觸，其中該結合蛋白或其片-段結合至該TNF-α或其片段上之表位，以形成第一複合物；(ii)使該複合物與該至少一種可檢測標記接觸，其中該可檢測標記與該TNF-α或其片段競爭結合該結合蛋白或其片段，以形成第二複合物；及(iii)基於該第二複合物中該可檢測標記產生之信號檢測該測試試樣中該TNF-α或其片段之存在，其中該TNF-α或其片段之存在與該可檢測標記產生之信號間接相關。
  55. 如請求項52之方法，其中該方法視情況進一步包括診斷、預測、或評估對患者之治療性/預防性治療之效率。
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