CN105521489A - 抗人TNF-αIgY抗体及其治疗皮肤疾病的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域。本发明提供了一种抗人肿瘤坏死因子α(TNF-α)卵黄抗体IgY及其制备方法，含其药物组合物，以及其治疗皮肤疾病的应用。所述抗人TNF-α卵黄抗体IgY及含其外用制剂或外用乳膏能有效治疗酒糟鼻、湿疹和牛皮癣等常见皮肤病。

Description

抗人TNF-αIgY抗体及其治疗皮肤疾病的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域。本发明涉及抗人肿瘤坏死因子α(TNF-α)卵黄抗体IgY及其制备方法，含其药物组合物，以及其治疗皮肤疾病的应用。
发明背景
酒糟鼻(Rosacea)、湿疹(Eczema)、银屑病(Psoriasis)是常见的、多发的皮肤疾病。本发明者继ZL97112184.2和ZL99119812.3后，进一步证明，酒糟鼻、湿疹、银屑病等皮肤炎症性疾病均与局部皮肤组织内的“细胞因子风暴”(CytokineStorm)相关。应用抗细胞因子(IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-23、TNF-α、MCP-1等)及其受体的抗体制成外用药，能进入炎症皮肤组织，中和、排除皮肤组织内过量表达和分泌的炎症因子，阻断和抑制“细胞因子风暴”，有效地治疗各种皮肤炎症性疾病。
酒糟鼻、湿疹、银屑病患者中，肿瘤坏死因子-α过度表达，其中患者皮损区的TNF-α比皮损区周围正常皮肤表皮及正常人皮肤表皮的TNF-α显著增高。患者外周血单核细胞(PBMC)中TNF-αmRNA的表达与正常人对照，使用半定量逆转录-多聚酶联反应来检测，发现酒糟鼻、湿疹和银屑病患者PBMC中TNF-αmRNA表达显著增高，为了排除TNF-α基因表达的影响，用高度敏感的酶联免疫吸附法只测定TNF-α三聚体分子活性，发现患者血浆中TNF-α水平显著增高。
TNF-α的生物学活性主要是通过细胞膜上的特异性受体传递信号而实现的。TNF-α受体有两种，即相对分子量分别为55000的TNF-RI(CD120α)和75000的TNF-RII(CD120β)，该两种TNF受体均为糖蛋白，氨基酸顺序分析显示两类受体胞外区域的氨基酸序列高度相似，但是胞内区域则完全不同。由于他们的不同信号传递机制，二者除分子量不同外，在配体结合力、糖基化程度、免疫反应性和蛋白水解肽链图谱学方面均有差异。TNF-RI引起的作用非常广泛，它包括杀伤细胞活性、抗病毒活性、诱导Mn-SOD、ICAM-1及IL-6的表达、促进成纤维细胞增殖以及细胞程序化死亡、激活NF-KB等多种生物学、活性物质的信号传递。TNF-RII主要传递胸腺细胞和NK等淋巴细胞的增殖信号，通过促进TNF-α结合TNF-RI而增加TNF-RI诱导的作用，同时也增加ICAM-1的表达。
TNF-α是与皮肤免疫炎症反应密切相关的重要细胞因子之一，TNF-α不仅能够诱导皮肤内粘附分子的表达，促进淋巴细胞的浸润，加速朗格罕氏细胞的成熟，增强其活化T细胞的能力，而且还能够促进角质形成细胞的增殖。TNF-α的两个受体皆以可溶性形式存在细胞表面。TNF-α必须与细胞表面的受体结合才能激活细胞信号转导，发挥促炎症及免疫调节等方面的作用。
传统上治疗皮肤炎症疾病广泛选用抗生素类或激素类药物，这些药物长期使用会让患者产生依赖性；而且激素会破坏患者的免疫系统和抵抗力，对患者的身体健康有很大的副作用并且不能从根本达到治愈疾病的目的。综上所述，TNF-α是导致皮肤免疫炎症反应关键的细胞因子之一，我们利用生物技术制备了抗人TNF-α卵黄抗体IgY，较治疗银屑病的单抗制剂更好，因为多克隆的卵黄抗体能识别更多TNF-α靶分子位点，亲和力更好。本发明旨在通过特异性的抗人TNF-α卵黄抗体IgY与TNF-α特异性结合，阻断其与TNF受体结合而达到中和TNF-α的生物活性，从根本上阻止其下游促炎症等作用，最终达到治疗皮肤炎症的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供能用于治疗酒糟鼻、湿疹和银屑病等常见皮肤病的抗体。
酒糟鼻、湿疹和银屑病等皮肤疾病发病机理是皮肤组织内发生的″细胞因子风暴″(CytokineStorm)引起的。抗细胞因子(炎症因子)抗体能有效中和、排除皮肤组织内过量表达和分泌的炎症因子，阻止和消除″细胞因子风暴″，从而有效地治疗多种皮肤疾病。卵黄抗体为多克隆抗体，能识别″靶″分子上多个结合位点，较单克隆抗体(识别单个结合位点)具有更高的生物活性和治疗效果。而且，卵黄对人体皮肤外用，无毒副作用。
一方面，本发明提供了一种能有效治疗皮肤疾病的抗TNF-α卵黄抗体IgY。
另一方面，本发明提供了一种所述抗TNF-α卵黄抗体IgY的制备方法，该方法包括下列步骤：(a)用人TNF-α蛋白免疫产蛋鸡，收集鸡蛋；(b)分离卵黄纯化获得所述抗人TNF-α卵黄抗体IgY。
在本发明的一个实施方案中，上述制备方法的具体操作工艺包括：(a)100ug抗原加等体积氟氏完全佐剂乳化到滴水不化即可，于鸡背部皮下多点注射，注射总体积400ul/只。一周后，第二次免疫：50ug抗原加等体积氟氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可，于鸡背部皮下多点注射，注射总体积400ul/只。第二次免疫一周后进行第三次免疫，免疫剂量和方法同第二次。第三次免疫后一周采鸡翅静脉血，分离血清。间接法ELISA测抗血清效价。收集效价达十万以上鸡蛋。(b)打破鸡蛋壳，用蛋黄分离器小心分离卵黄，保证卵黄膜未破裂。将卵黄在普通滤纸翻滚数次，将卵白吸除干净，卵黄破膜收集卵黄。用2倍卵黄体积的10mMPBSpH7.4(下同)稀释卵黄，室温搅拌；用3.5％PEG6000沉淀稀释后的卵黄，10000rpm4℃离心10分钟(下同)。离心后收集上清，经普通滤纸过滤去除不溶物；向过滤后上清中加入8.5％PEG6000，室温搅拌20分钟，离心弃去上清，沉淀用卵黄体积的PBS溶解。待沉淀溶解后，向其中加入12％PEG6000沉淀卵黄抗体，室温搅拌20min；离心弃上清，沉淀用一半卵黄体积的PBS重悬溶解。在4℃条件下加入33％饱和硫酸铵，搅拌1小时，离心弃上清，沉淀1mlPBS重悬溶解。溶解后的沉淀对PBS透析，20小时以上，每6至8小时更换透析液一次。收集透析过的卵黄抗体，所述人TNF-α卵黄抗体IgY的纯度为98％。
本发明除了在细胞水平、动物模型上证明了抗TNF-αIgY抗体对治疗皮肤炎症中的生物活性，而且在人体上对酒糟鼻、湿疹和牛皮癣患者的治疗中证明了显著疗效。
因此，另一方面，本发明提供了所述抗TNF-α卵黄抗体IgY在制备皮肤疾病的药物中的用途。所述皮肤疾病优选为酒糟鼻、湿疹或牛皮癣等常见皮肤病。
另一方面，本发明提供了一种用于治疗皮肤疾病的外用药物，其中包括本发明所述抗TNF-α卵黄抗体IgY和药用辅料或药用基质。其中所述皮肤疾病优选为酒糟鼻、湿疹或牛皮癣等常见皮肤病。
本领域现有技术中所有用于化妆品或外用药的药物辅料或药用基质都可用于配制本发明所述抗体外用药。
在本发明的一个具体实施方案中，所述药用辅料为甘油，所述抗TNF-α卵黄抗体IgY浓度优选但不限于为0.5mg/ml。
本发明提供了一种用于治疗酒糟鼻的方法，该方法包括将所述外用制剂施用于患处，每日涂抹两次，每次约30微升，1月为一个疗程。
本发明提供了一种用于治疗湿疹的方法，该方法包括将所述外用制剂施用于患处，每日涂抹两次，每次约100微升，2周为1个疗程。
本发明提供了一种用于治疗牛皮癣的方法，该方法包括将所述外用制剂施用于患处，每日涂抹两次，对于小面积牛皮癣每次约200微升，具体临床施用时，医师根据患处面积大小酌情增加用量。3周为1个疗程。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述基质的配方为：
附图说明
图1图示的是卵黄抗体纯化前后的SDS-PAGE图谱。其中泳道1为标准蛋白markers；泳道2为卵黄经PBS稀释10倍(未经纯化的卵黄抗体)，上样量10ul。泳道3为纯化后的卵黄抗体，上样蛋白量10ug。
图2图示的是体外L929细胞试验结果:不同浓度抗TNF-αIgY中和TNF-α的活性曲线。
图3图示的是体外L929细胞试验结果：TNF-α卵黄抗体特异性中和TNF-α的活性。
图4图示的是家兔炎症模型耳组织切片中性粒细胞计数结果。
图5图示的是IMQ造银屑病模型及卵黄抗体治疗试验动物皮肤影像。
图6图示的是IMQ造银屑病模型评估TNF-α卵黄抗体治疗效果皮肤组织切片HE染色图片。其中A、B、C分别为正常鼠背部皮肤组织切片；D、E、F分别为IMQ造模后给予PBS鼠背皮肤切片(即空白对照组)；G、H、I分别为IMQ造模给予抗人TNF-α卵黄抗体治疗后鼠背皮肤切片(即本发明卵黄抗体治疗组)。
图7图示的二张照片是对酒糟鼻患者治疗前和治疗两个月后的对比照片。其中A为治疗前，B为治疗两月后。
图8图示湿疹患者脸部湿疹患处治疗前和治疗1周、2周、3周后的对比照片。其中A为右脸治疗前，B为右脸治疗1周，C为右脸治疗2周，D为右脸治疗3周，E为左脸治疗前，F为左脸治疗1周，G为左脸治疗2周，H为左脸治疗3周。
本发明的优势：
1.相较于现有注射用单克隆抗体，本发明的卵黄抗体制剂能够外用，可直接作用于患处，因而具有更高的安全性和更好的治疗效果。
2.本发明所述抗人TNF-α卵黄抗体是通过阻止和消除″细胞因子风暴″，因而能有效地治疗多种皮肤疾病。
实施例
在本申请中，如无特别说明，本发明的实施都使用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术都是本领域技术人员所掌握的。这些技术在本领域技术人员常用文献中有详细地描述，例如Sambrook等人编著的MolecularCloning：ALaboratoryManual，第三版等。
实施例1抗TNF-αIgY抗体的制备
1.1TNF-α免疫鸡
产蛋鸡开始免疫前，收集鸡蛋，备纯化。纯化该鸡蛋获得的卵黄抗体为对照IgY，即非人TNF-α特异性的。
适宜剂量的TNF-α(该蛋白购自PEPROTECH公司，货号：300-01A-1MG)与等体积的佐剂乳化后直接快速免疫蛋鸡，具体免疫方法如下：
初次免疫：100ug抗原加等体积氟氏完全佐剂乳化到滴水不化即可，于鸡背部皮下多点注射，注射总体积400ul/只。一周后，第二次免疫：50ug抗原加等体积氟氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可，于鸡背部皮下多点注射，注射总体积400ul/只。第二次免疫一周后进行第三次免疫，免疫剂量和方法同第二次。第三次免疫后一周采鸡翅静脉血，分离血清。间接法ELISA测抗血清效价。收集效价达十万以上鸡蛋，4℃存放备用。
1.2卵黄抗体纯化
参考PEG6000纯化卵黄IgY的方法(DianaPaulyetal.,J.Vis.Exp.(51),e3084,2011)，提高了纯化后的抗体纯度。再结合汪家政版《蛋白质技术手册》第70页的记载，硫酸铵沉淀去除PEG6000。详细步骤如下：打破鸡蛋壳，用蛋黄分离器小心分离卵黄，保证卵黄膜未破裂。将卵黄在普通滤纸翻滚数次，尽可能将卵白吸除干净，卵黄破膜收集卵黄。用2倍卵黄体积的10mMPBSph7.4(下同)稀释卵黄，室温搅拌；用3.5％PEG6000沉淀稀释后的卵黄，10000rpm4℃离心10min(下同)。离心后收集上清，经普通滤纸过滤去除不溶物；向过滤后上清中加入8.5％PEG6000，室温搅拌20min，离心弃去上清，沉淀用卵黄体积的PBS溶解。待沉淀溶解后，向其中加入12％PEG6000沉淀卵黄抗体，室温搅拌20min；离心弃上清，沉淀用一半卵黄体积的PBS重悬溶解。在4℃条件下加入33％饱和硫酸铵，搅拌1h，离心弃上清，沉淀1mlPBS重悬溶解。溶解后的沉淀对PBS透析，20小时以上，每6～8小时更换透析液一次。收集透析过的卵黄抗体，经SDS-PAGE鉴定抗体纯度。
纯化后的抗TNF-αIgY,在SDS-PAGE中显示符合IgY特征的65.1KD重链分子和26KD轻链分子条带(见图1)，用ImageJ图像分析软件对SDS-PAGE条带进行纯度分析，纯化后的抗TNF-αIgY纯度在98％以上。
以下实施例所用的卵黄抗体均为按照本实施例制备的抗TNF-αIgY。对照IgY为从非免疫鸡产蛋中纯化获得的IgY。
实施例2中和活性试验
2.1L929细胞凋亡中和实验
在肿瘤坏死因子TNF-α生物学活性测定方法(MATTHEWS,N.,andNEALE,M.L.In:LymphokinesandInterferons,aPracticalApproach,pp.221–225.IRLPress，1987)基础上设计。TNF-α通过与细胞膜上的TNF受体结合，介导L929细胞凋亡，尤其是在放线菌素D存在的条件，这种促凋亡作用更加明显，所以我们用MTT法通过测定L929细胞凋亡率来间接反应TNF-α的活性，在一定范围内，在培养的L929细胞中添加TNF-α，细胞的凋亡率与TNF-α的加入量成正相关。该中和试验是在L929细胞的培养过程中同时加入TNF-α和抗TNF-αIgY，抗TNF-αIgY特异性的结合在TNF-α上的受体结合位点。由于TNF-α上受体结合位点被抗TNF-αIgY占据，TNF-α不能再与其受体的结合，TNF-α通过其受体介导的促凋亡通路中断，从而实现抗TNF-αIgY抑制TNF-α对L929细胞的促凋亡作用。通过检测抗TNF-αIgY对TNF-α促细胞凋亡的抑制率，来衡量抗TNF-αIgY对TNF-α的中和活性。
2.1.1L929细胞培养
L929小鼠成纤维细胞(ATCC，No.CCL-1)用10％FBS、1mM谷氨酰胺、100U的青-链霉素的高糖DMEM(Hyclone,CatNo.SH30022.01B)，于饱和湿度，37℃，5％CO2条件下培养。细胞生长至80％融合度时传代，经0.25％胰酶-0.53mMEDTA消化液消化，含1％FBS的完全培养基终止消化，小心吹打分散细胞。离心去除消化液，调整细胞浓度后重新接种96孔细胞培养板。待细胞完全贴壁后行中和活性试验。
2.1.2抗体中和TNF-α活性测定
L929细胞贴壁后，向96孔板中加入终浓度为1μg/ml放线菌素D、1ng/mlTNF-α(此浓度不低于20倍ED50)。同时加入用完全培养基梯度稀释的抗人TNF-α卵黄抗体IgY，其抗体终浓度为20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.313μg/ml、0.156μg/ml、0μg/ml培养20小时后。用MTT细胞增殖和毒性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所，货号C0009)测定凋亡细胞数，于每孔加入10μlMTT试剂，细胞培养箱内孵育8小时，96孔板底部有不同程度的深紫色松针样Formazan出现。加入Formazan溶解液100μl/well，于细胞培养箱内6个小时待Formazan完全溶解后，用酶标仪测定595nm的吸光度。绘制抗人TNF-α卵黄抗体IgY剂量对OD值的曲线，计算抗体ND50值。
为了验证本发明抗人TNF-α卵黄抗体IgY对TNF-α的特异性，设置了对照IgY实验：L929细胞贴壁后，向96孔板中加入终浓度为1μg/ml放线菌素D、1ng/mlTNF-α。同时分别加入5μg/ml的抗人TNF-α卵黄抗体IgY和5μg/ml的对照IgY。步骤同上，用MTT细胞增殖和毒性检测试剂盒测定凋亡细胞数目。
实验证实：本发明的抗人TNF-α卵黄抗体IgY可以明显中和TNF-α的活性，抑制L929细胞凋亡。从图2可以判断抗人TNF-α卵黄抗体IgY抑制TNF-α致L929细胞凋亡的ND50在1-2μg/ml。从图3可以看出，对照IgY不能中和TNF-α的活性，而本发明的抗人TNF-α卵黄抗体IgY明显提高添加了TNF-α的L929活细胞数。这说明本发明的抗人TNF-α卵黄抗体IgY能特异性抑制TNF-α活性。
2.2家兔炎症模型中和试验
家兔耳背部皮内注射50μl浓度为6x10-8mol/L的TNF-α溶液(相当于50ngTNF-α)，在注射部位形成10mm的皮包，在另一侧耳部两点(间隔50mm以上)皮内注射50μlTNF-α与抗人TNF-α卵黄抗体IgY的混合液，形成10mm的皮包，其中抗原与抗体的剂量分别为50ngTNF-α+26μg抗人TNF-α卵黄抗体IgY(摩尔比1:50)、50ngTNF-α+260μg抗人TNF-α卵黄抗体IgY(摩尔比1:500)。5个小时后用活检器械分别取下两耳注射部位直径10mm的表皮和真皮组织，病理切片HE染色，计数血管外嗜中性粒细胞的数量。
活检皮肤组织内由注射TNF-α引起的嗜中性粒细胞浸润数目平均为75个/0.01mm2，由于注射抗人TNF-α卵黄抗体IgY对TNF-α的中和作用，而使嗜中性粒细胞浸润数目显著减少。实验显示在抗人TNF-α卵黄抗体IgY与TNF-α的摩尔比为500：1时，嗜中性粒细胞浸润数目减少到8个/0.01mm2，在体内显著地抑制了TNF-α引起的炎症反应(见图4)。
2.3咪喹莫特造银屑病模型治疗试验
LeslievanderFits(JImmunol2009；182:5836-5845)首次分析了咪喹莫特(Imiquimod，IMQ)诱发的炎症模型类似银屑病诸多症状，并且也正在应用这种模型分析多种银屑病药物的有效性。结合胡坚(JSouthMedUniv,2013,33(9):1394-1398)等人的文章，采用了涂抹咪喹莫特的同时给予药物处理。根据咪喹莫特(商品名：丽科杰)产品说明中提到了：在给予咪喹莫特1小时后皮肤组织TNF-α浓度达到峰值。于是，我们设计了咪喹莫特造银屑病模型及卵黄抗体治疗试验如下：BABL/c鼠6～8周龄,背部剔除被毛后，用50mg5％咪喹莫特乳膏涂抹。第二天开始给予同等剂量的咪喹莫特乳膏，1小时后治疗组给予含50％甘油的PBS配制的抗人TNF-α卵黄抗体IgY100μg,对照组涂抹含50％甘油的PBS100μl，以后每天重复第二天的操作，同时观察并记录实验动物状态及皮肤红肿程度，截止实验结束，断颈处死实验鼠，分离给药部位的皮肤组织行病理学切片检查。
从图5实验动物的皮肤影像资料上可以明显看出：在给抗体药物治疗3天后，与对照组(涂抹含50％甘油的PBS)相比，给予卵黄抗体药物治疗组实验动物皮肤的红肿程度明显减轻，且动物的状态明显好转。从皮肤组织切片组图(图6)可以看出，正常鼠皮肤组织角质层为较稀薄，且表皮细胞排列规则。给予IMQ造模后，其表皮角质层增生，或角化不全，且棘细胞层增厚，向下延伸呈钉状。而IMQ造模组同时给予抗人TNF-α卵黄抗体IgY治疗后，上述症状有明显消减，如表皮角化完全，较稀薄，且棘细胞层变薄。抗人TNF-α卵黄抗体IgY对IMQ导致的银屑病症状得到了抑制。
实试例3，用鸡卵黄抗人TNF-αIgY抗体配制治疗酒糟鼻、湿疹和牛皮癣的外用药制剂
经上述方法纯化和冷冻干燥的抗人TNF-α卵黄抗体IgY28mg用4ml重蒸水溶解后逐滴加入52ml纯甘油(Glycerine或称Glycerol)中，随时搅拌，成均匀油包水状态，其最终IgY抗体浓度为0.5mg/ml。置室温(20℃±5℃)保存，待酒糟鼻、湿疹和牛皮癣患者试用。在正式制备外用乳膏(或冷霜)药品时，可采用不影响抗体活性(且保护抗体活性)的基质配方为：
实试例4
将制备好的抗人TNF-α卵黄抗体IgY甘油制剂试用于志愿者酒糟鼻3例、湿疹3例、牛皮癣6例，每天抹IgY制剂二次，每次约30μl(酒糟鼻)、100μl(湿疹)和200μl(小面积牛皮癣)结果如下(其中1例酒糟鼻、1例湿疹患者自愿给于病灶拍照，不愿拍照的患者无法提供照片)：
酒糟鼻3例:3例患者均发病2年以上，曾经口服四环素、外用甲硝唑霜(MetroCream)或甲硝唑凝胶(MetroGel)、激光等治疗无效。使用本发明的抗人TNF-α卵黄抗体IgY制剂治疗1个月，其中2例显效(见图7)，1例好转。
湿疹3例：2例脸部发病2周，1例手部发病3周，均用立思丁乳膏(FucidinHCream)治疗无效。使用本发明的抗人TNF-α卵黄抗体IgY制剂治疗2周后均有显效(见图8)。
牛皮癣6例：6例患者均发病1年以上，用各种常规外用药治疗无效。其中3例红皮型治疗经本发明的抗人TNF-α卵黄抗体IgY治疗3周后均为显效。寻常型3例，2例治疗后三周好转，1例无明显疗效。
上述三种皮肤病治疗试验表明，抗人TNF-α卵黄抗体IgY外用治疗酒糟鼻、湿疹和牛皮癣使用方便、见效快，无副作用。

Claims (10)

1.一种用于治疗皮肤疾病的抗人TNF-α卵黄抗体IgY。
2.权利要求1所述的抗人TNF-α卵黄抗体IgY，其通过下述方法制备、分离和纯化而成：(a)用人TNF-α蛋白免疫产蛋鸡，收集鸡蛋；(b)分离卵黄纯化获得所述抗人TNF-α卵黄抗体IgY。
3.权利要求1或2所述的抗TNF-α卵黄抗体IgY，其通过下述方法制备、分离和纯化而成：(a)100ug抗原加等体积氟氏完全佐剂乳化到滴水不化即可，于鸡背部皮下多点注射，注射总体积400ul/只。一周后，第二次免疫：50ug抗原加等体积氟氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可，于鸡背部皮下多点注射，注射总体积400ul/只。第二次免疫一周后进行第三次免疫，免疫剂量和方法同第二次。第三次免疫后一周采鸡翅静脉血，分离血清。间接法ELISA测抗血清效价。收集效价达十万以上鸡蛋。(b)打破鸡蛋壳，用蛋黄分离器小心分离卵黄，保证卵黄膜未破裂。将卵黄在普通滤纸翻滚数次，将卵白吸除干净，卵黄破膜收集卵黄。用2倍卵黄体积的10mMpH7.4PBS稀释卵黄，室温搅拌；用3.5％PEG6000沉淀稀释后的卵黄，10000rpm4℃离心10分钟。离心后收集上清，经普通滤纸过滤去除不溶物；向过滤后上清中加入8.5％PEG6000，室温搅拌20分钟，离心弃去上清，沉淀用卵黄体积的10mMpH7.4PBS溶解。待沉淀溶解后，向其中加入12％PEG6000沉淀卵黄抗体，室温搅拌20min；离心弃上清，沉淀用一半卵黄体积的10mMpH7.4PBS重悬溶解。在4℃条件下加入33％饱和硫酸铵，搅拌1小时，离心弃上清，沉淀用10mMpH7.4PBS1ml重悬溶解。溶解后的沉淀对PBS透析，20小时以上，每6至8小时更换透析液一次，收集透析过的抗人TNF-α卵黄抗体IgY，所述人TNF-α卵黄抗体IgY的纯度为98％。
4.权利要求1至3任一项所述的抗人TNF-α卵黄抗体IgY在制备用于治疗皮肤疾病的外用药物中的用途。
5.权利要求4所述的用途，其中所述的皮肤疾病为酒糟鼻、湿疹或银屑病等常见皮肤病。
6.一种用于治疗皮肤疾病的外用药物，其中权利要求1至3任一项所述抗TNF-α卵黄抗体IgY和药用辅料或药用基质。
7.权利要求6所述治疗皮肤疾病的外用药物，其中所述药物辅料为甘油。
8.权利要求7所述治疗皮肤疾病的外用药物，其中所述抗TNF-α卵黄抗体IgY的浓度为0.5mg/ml。
9.权利要求6所述治疗皮肤疾病的外用药物，其中所述药用基质的配方为：
10.一种用于治疗牛皮癣的方法，该方法包括将所述外用制剂施用于患处，每日涂抹两次，每次约200微升，3周为1个疗程。
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