KR101694753B1 - 크로몰린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 크로몰린(cromolyn) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 크로몰린은 간성상세포(Hepatic stellate cell, HSC)의 주요 분비 마커로 알려진 콜라겐 축척 및 TGF-β의 생성을 억제할 뿐만 아니라, 간세포에서 TGF-β 처리로 인한 간세포의 이동을 억제하고, EMT 진행으로 인한 E-카데린(E-cadherin)의 발현 감소를 억제하며, 간세포의 항노화 효과를 가지므로, HSC 세포의 활성을 억제하는 효과를 가질뿐만 아니라 간세포의 기능을 회복시키는 이중적인 효과를 가지므로, 간경변증을 포함하는 다양한 간 질환의 근본적인 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

크로몰린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간질환 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for treating or preventing liver disease containing cromolyn or pharmaceutically acceptable salts thereof as an active ingredient}
본 발명은 크로몰린(cromolyn) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간경변(liver cirrhosis)을 포함하는 다양한 간질환(liver disease) 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
간 섬유증(Liver fibrosis, hepatic fibrosis)은 간 장애의 결과 간에 섬유가 증가한 상태를 말하며, B형, C형 간염 바이러스, 알코올, 독성 물질 등의 원인으로 인한 간세포의 손상 등 급성 손상에 기인한 것일 수 있다. 손상에 대한 가역적인 상처-치료반응은 간 수리 및 반흔(scar) 형성 사이의 중요한 밸런스를 반영한다(참고문헌 1 참조). 만성 손상은 간실질 조직(liver parenchyma)이 반흔 조직으로 점진적으로 치환되도록 하기 때문에 결국 간경화가 나타나게 된다. 섬유화는 또한, 과도한 세포외기질과 같은 반흔 조직의 침착으로 인한 과도한 상처 치유반응과 연관되어 있다. 간에 섬유화가 확산되는 경우 간경화를 야기하며, 결국 간부전 및 간암(hepatocellular carcinoma)과 같은 합병증을 야기하여 결국 환자를 사망에 이르게 할 수 있다.
간성상세포(Hepatic stellate cell, HSC)는 질환을 촉발하는 세포 유형으로서 간염 바이러스 감염 및 알코올 섭취와 같은 다양한 질병의 원인에 의한 간경변의 발달에 중요한 기여인자이다(참고문헌 2 참조). HSC가 활성화되면, 세포외기질 컴포넌트, 예를 들어 콜라겐이 과도하게 축적되며, 이는 간 맥관구조 및 간 아키텍쳐(architecture)를 파괴하고, 문맥압(portal pressure)을 상승시켜 관련 증상들을 일으킨다. 이러한 일련의 현상은 HSC를 다시, 연속적으로 활성화시켜 유해한 사이클이 형성되면서 간경변(간경화) 과정이 촉발되게 된다(참고문헌 3 참조). HSC 증식 및 활성화는 다양한 시그널링 과정에 의해 매개 되는데(참고문헌 4 참조), HSC 시그널링 저해제는 항-섬유화제로 개발될 가능성이 있어 꾸준히 연구되고 있다. 몇 가지 합성 화합물 및 생물학적 치료제의 항-섬유화 효과는 HSC 증식-관련 성장인자 및 HSC의 증식반응을 감소시키는 이의 관련 시그널링 경로와 연관되어 있다(참고문헌 5 및 6 참조).
예를 들어, 커큐민(curcumin)(참고문헌 7 참조), 실리마린(silymarin)(참고문헌 8 참조)을 함유하는 식물 추출물, 은행엽 추출물(Ginkgo biloba extract, 참고문헌 9 참조), 살비아 추출물(Salvia extract, 참고문헌 10 참조)은 근섬유아세포(myofibroblasts)를 활성화시키고 간에 침착되는 결합조직 성장인자를 억제하고(참고문헌 11 참조), 섬유생성 컴포넌트의 방출을 촉진시킴으로써, 전섬유생성(profibrogenic) 경로에 기여하는 TGF-β 경로를 억제한다고 보고되어 있다(참고문헌 12 참조).
HSC에 의해 섬유화 과정이 진행됨에 따라 간세포 손상은 더욱 심각해진다. 섬유화 동안, 간세포는 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition; EMP)(참고문헌 13 및 14 참조) 및 텔로미어의 단축으로 인한 노화(senescence)를 겪게 된다(참고문헌 15 참조). 결과적으로 간세포는 기능을 잃게 되고 간부전이 일어나게 된다. 비록 간섬유증 또는 간경화에 대한 대부분의 치료제에 대한 연구는 HSC에 초점이 맞추어져 있으나, HSC는 간의 15% 미만을 구성하는 반면, 간세포는 간의 실질(parenchymal) 세포인 간 조직의 최대 70%를 차지한다(참고문헌 16 및 17 참조). 따라서 만성 손상으로부터 간세포를 보호하거나 회복시키는 것은 새로운 간경화 치료제의 개발에 있어서 매우 중요하다. 이러한 약리 전략은 유전자 발현에 기초한 조절제 화학 후보물질을 발견하는 효율적 툴(tool)로 개발되었다(참고문헌 18 참조). 상기 접근법은 새로운 질병 치료제를 재설계하고 새로운 약물을 개발하는 데 사용될 수 있다.
또한, 연결 맵(connectivity map)은 유전자 발현을 변경하는 화학 후보물질을 평가하는데 사용되는 주목할만한 알고리즘이다(참고문헌 19 및 20 참조). 상기 약리 전략은 in vivo에서 높은 기능성을 나타낼 것으로 예상되는 후보 물질을 감별하기 위한 것으로서, 약물 개발과정을 보다 효율적으로 만들 수 있다.
한편, 크로몰린(Cromolyn)은 폐 점막과 눈에 존재하는 감작된 비만세포에서 히스타민(histamine)과 루코트리엔(leukotriene)이 분비되는 것을 억제하는 화합물로, 아직까지 정확한 작용기전은 알려져 있지 않지만, 칼슘 이온이 세포 내로 들어가는 것을 간접적으로 막는 것으로 알려져 있다. 또한, 크로몰린은 폐에서 신경반사를 억제시켜서 타치키닌(tachykinin)에 의한 2차적 기관지 경련을 억제하며, 호중구, 단핵구, 호산구 등의 면역세포들의 이동을 억제하고 림프구의 beta-2 작용기를 하향조절함이 알려져 있으나, 간경변을 포함하는 다양한 간질환에 대한 효과에 대해서는 알려진 바 없다.
따라서, 본 발명자들은 간경변증의 근본적인 치료제를 개발하기 위해 노력한 결과, 연결 맵을 통해 선별된 크로몰린이 간성상세포의 주요 분비 마커로 알려진 콜라겐 축척 및 TGF-β의 생성을 억제할 뿐만 아니라, 간세포에서 TGF-β 처리로 인한 간세포의 이동을 억제하고, EMT 진행으로 인한 E-카데린(E-cadherin)의 발현 감소를 억제하며, 간세포의 항노화 효과를 가지므로, HSC 세포의 활성을 억제하는 효과를 가질 뿐만 아니라 간세포의 기능을 회복시키는 이중적인 효과를 가지므로, 간경변증의 근본적인 치료제로 사용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
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본 발명은 목적은 크로몰린(cromolyn) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간질환 예방 및 치료용 약학적 조성물, 및 건강식품에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 크로몰린(cromolyn) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 크로몰린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
본 발명의 크로몰린(cromolyn) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 간성상세포(Hepatic stellate cell, HSC)의 주요 분비 마커로 알려진 콜라겐 축척 및 TGF-β의 생성을 억제할 뿐만 아니라, 간세포에서 TGF-β 처리로 인한 간세포의 이동을 억제하고, EMT 진행으로 인한 E-카데린(E-cadherin)의 발현 감소를 억제하며, 간세포의 항노화 효과를 가지므로, HSC 세포의 활성을 억제하는 효과를 가질 뿐만 아니라 간세포의 기능을 회복시키는 이중적인 효과를 가지므로, 간경변증을 포함하는 다양한 간 질환의 근본적인 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 연결 맵(connectivity map)을 이용한 항-간경변 후보물질(candidate agent)을 확인하는 방법을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 후보물질을 이용하여 간성상세포(Hepatic stellate cell, HSC)에 대한 증식 효과 및 세포 독성 효과를 확인한 도이다:
A: HSC-T6 세포주에 무처리 대조군(control), 크로몰린(cromolyn) 및 이오노마이신(ionomycin)을 각각 처리한 후, 세포 증식 효과를 MTT 분석으로 확인한 도이다;
B: LX-2 세포주에 무처리 대조군(control), 크로몰린(cromolyn) 및 이오노마이신(ionomycin)을 각각 처리한 후, 세포 증식 효과를 MTT 분석으로 확인한 도이다;
C: HSC-T6 세포주에 크로몰린(cromolyn) 및 이오노마이신(ionomycin)을 각각 농도별로 처리한 후, 세포 독성 효과를 LDH 분석으로 확인한 도이다; 및
D: LX-2 세포주에 크로몰린(cromolyn) 및 이오노마이신(ionomycin)을 각각 농도별로 처리한 후, 세포 독성 효과를 LDH 분석으로 확인한 도이다.
도 3은 간성상세포주에 크로몰린 처리 후, 분비되는 콜라겐(collagen) 및 TGF-β 수준(level) 변화를 확인한 도이다:
A: HSC-T6 및 LX-2 세포주에 크로몰린을 농도별로 처리 후, 상대적인 콜라겐 양을 나타낸 도이다; 및
B: HSC-T6 및 LX-2 세포주에 크로몰린을 농도별로 처리 후, 상대적인 TGF-β 양을 나타낸 도이다.
도 4는 간세포(Hepatocyte)에서 크로몰린 처리에 의한 TGF-β로 유도된 EMP (epithelial mesenchymal transition)의 억제효과를 확인한 도이다:
A: 크로몰린 처리 0시 및 48시간 후, TGF-β(2 ng/mL) 존재 또는 부존재하에서 크로몰린의 세포 이동성(cell motility)에 대한 효과를 wound 분석을 통해 현미경으로 확인한 도이다(Scale bar: 100 ㎛);
B: 상처의 회복 거리 측정한 후, 크로몰린 처리 O시의 거리와 비교하여 상대적인 퍼센트로 나타낸 도이다; 및
C: E-카데린(E-cadherin)의 발현 변화를 확인한 도이다.
도 5는 β-갈락토시다아제(β-galactosidase) 형성에 있어서 크로몰린의 효과를 확인한 도이다:
A: 크로몰린 처리 후, β-갈락토시다아제 염색을 통해 항노화 효과를 확인한 도이다; 및
B: 일차 간세포 분리 3일 후, β-갈락토시다아제-양성 세포를 현미경을 통해 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 크로몰린(cromolyn) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 크로몰린은 하기 [화학식 1]로 기재되는 화합물이다.
[화학식 1]
Figure 112015083995150-pat00001
상기 크로몰린은 간성상세포(Hepatic stellate cell, HSC) 활성을 억제하고, 간세포(Hepatocyte)의 기능을 회복하는 것이 바람직하고, 상기 간성상세포 활성 억제는 간성상세포에서 콜라겐 축적을 억제하고, TGF-β 생성을 억제하는 것이 보다 바람직하고, 상기 간세포의 기능 회복은 크로몰린이 간세포에서 EMT 진행으로 인한 E-카데린(E-cadherin) 발현의 감소를 유의적으로 억제하고, 간세포의 항노화 효과를 나타내는 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 간질환은 간경변(liver cirrhosis), 간 섬유증(Liver fibrosis), 간부전(liver failure), 간암(liver cancer) 및 간염(hepatitis)으로 구성된 군으로부터 선택되는 간질환인 것이 바람직하고, 간경변, 간 섬유증, 간부전인 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 연결 맵(connectivity map)을 이용하여 항-간경변 후보물질을 1차 선발한 후(표 1 및 도 1 참조), 부작용을 고려하여, 크로몰린 및 이오노마이신을 2차 선발하였다.
또한, 본 발명자들은 간성상세포에 대한 세포독성 효과 확인을 통해, 이오노마이신은 세포독성 가능성을 가지므로, 본 발명은 크로몰린을 최종 후보물질로 선정하였다(도 2 참조).
또한, 본 발명자들은 크로몰린이 활성화된 HSC 세포의 주요 분비 마커로 알려진 콜라겐 축척 및 TGF-β의 생성을 억제하는지 확인한 결과, 농도의존적으로, 콜라겐 축적을 감소시키고, TGF-β의 생성을 억제하는 것을 확인하였다(도 3 참조).
또한, 본 발명자들은 크로몰린의 간세포 EMT(epithelial-mesenchymal transition)의 억제 효과 확인한 결과, 간세포 이동 활성을 효과적으로 억제하고, E-카데린 발현의 감소를 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 4 참조).
또한, 본 발명자들은 간세포에서 크로몰린의 항 노화(Senescence) 효과를 확인한 결과, 크로몰린이 유의적인 간세포 항노화 효과를 갖는 것을 확인하였다(도 5 참조).
따라서, 본 발명의 크로몰린은 간성상세포의 주요 분비 마커로 알려진 콜라겐 축척 및 TGF-β의 생성을 억제할 뿐만 아니라, 간세포에서 TGF-β 처리로 인한 간세포의 이동을 억제하고, EMT 진행으로 인한 E-카데린의 발현 감소를 억제하며, 간세포의 항노화 효과를 가지므로, HSC 세포의 활성을 억제하는 효과를 가질 뿐만 아니라 간세포의 기능을 회복시키는 이중적인 효과를 가지므로, 간경변증을 포함하는 다양한 간 질환의 근본적인 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명은 화학식 1로 표시되는 크로몰린뿐만 아니라, 이의 약학적으로 허용되는 염, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 라세미체, 또는 입체이성질체를 모두 포함한다.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 크로몰린은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1로 표시되는 크로몰린을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시켜서 건조하거나 또는 석출 된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
상기 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 화학식 1로 표시되는 크로몰린에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.
비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 mg 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 크로몰린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
본 발명의 크로몰린은 간성상세포의 주요 분비 마커로 알려진 콜라겐 축척 및 TGF-β의 생성을 억제할 뿐만 아니라, 간세포에서 TGF-β 처리로 인한 간세포의 이동을 억제하고, EMT 진행으로 인한 E-카데린의 발현 감소를 억제하며, 간세포의 항노화 효과를 가지므로, HSC 세포의 활성을 억제하는 효과를 가질 뿐만 아니라 간세포의 기능을 회복시키는 이중적인 효과를 가지므로, 다양한 간질환의 예방 및 개선용 건강식품으로 사용될 수 있다.
본 발명의 크로몰린이 첨가되는 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 크로몰린은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 건강식품 조성물이 음료 조성물인 경우, 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 10 g이다.
또한, 본 발명에 따른 건강식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나, 본 발명의 크로몰린 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 세포 배양 및 화합물의 준비
본 발명에서 사용한 간성상세포(Hepatic stellate cell, HSC)는 서울대학교 성상현 교수 연구팀, 및 S. L. Friedman(마운트싸이나이의과대학, 미국) 연구팀으로부터 각각 LX-2 및 HCT-T6 세포주를 제공받아 실험을 수행하였고, 구체적으로, 상기 세포를 10% 열 불활성화 소태아혈청(heat inactivated fetal bovine serum) 및 1% 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지에서 37℃ 및 5%　CO2 환경에서 성장시켜 실험을 수행하였다.
또한, 간세포(hepatocyte)는 6주령의 수컷 C57BL6 마우스의 간으로부터 일차(primary) 간세포를 분리하여 실험을 수행하였다.
아울러, 이오노마이신(Ionomycin) 및 크로몰린(cromolyn, cromoglicic acid)은 케이맨 화학회사(Ann Arbor, 미국) 및 산타크루즈 바이오테크롤러지(Santa Cruz, 미국)에서 각각 구입한 후, 실험관 내(in vitro) 실험을 위하여, DMSO(dimethylsulfoxide)에 용해시켜 사용하였다.
< 실험예 1> 연결 맵(connectivity map)을 이용한 항-간경변 후보물질 선별
유전자 발현 프로필을 기반으로 간 섬유화 또는 간경변증의 치료 특성(therapeutic signature)을 확인하기 위해, GEO 데이터를 이용했다.
구체적으로, 간 섬유화 또는 간경변과 관련된 유전자 발현 특징을 확인하기 위하여, NCBI에서 제공하는 GEO 데이터 중, GSE25097로부터 40명의 간경변 간 샘플 및 6명의 정상 간 샘플의 마이크로어레이 데이터를 이용하였다. 먼저, 2.5 배 이상 강도가 변한 프로브(Probe) ID를 추출하였다. 그런 다음, 프로브 ID를 유전자 기호에 병합하였다. 상기 프로브 ID가 병합된 2,226 유전자 기호를 연결 맵을 생성하기 위하여 간경변증 간에서‘logFC > ｜1.5｜’역치 배율 변화(threshold fold-change)를 적용하여, 상향 조절(upregulation)된 유전자(710개 유전자) 또는 하향 조절(downregulation)된 유전자(225개 유전자)를 분리한 후, 리스트화 하였다. 또한, 상기 분리된 2그룹 각각의 유전자 기호를 분석용 Affymetrix HG U133A에 해당하는 프로브 ID로 변환시켰다. 한편, 상기 연결 맵은 Lamb J, Crawford ED, Peck D, et al. The connectivity map: using gene-expression signatures to connect small molecules, genes, and disease. Science. 2006; 313: 1929-35에 개시된 방법을 이용하여 수행하였다.
그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, 연결 맵을 이용하여 간경변을 정상상태로 돌릴 수 있는 후보 물질을 20종을 발굴하였다(표 1).
또한, 상위 20개의 후보물질 중, 유의적인 p-값(p-values)을 갖는 cromoglicic acid(크로몰린)(CID 2882), MK-801(디조실핀(Dizocilpine)(CID 180081), 이오파노익산(iopanoic acid)(CID 3735), 이오노마이신(ionomycin)(CID 6912226), 및 톨라자마이드(tolazamide)(CID 5503)를 확인하였다. 상기 5개의 후보물질 중, MK-801은 글루타메이트 수용체(glutamate receptor)의 비경쟁적 길항 물질이며, 톨라자마이드는 글루코오스 제어를 통한 II 형 당뇨병 환자에게 사용되며, 이오파노익산는 초기 탈요소디나아제(deiodinase) 효소를 억제하기 위해 개발되었다. 그러나 상기 MK-801, 톨라자마이드 및 이오파노익산은 부작용으로 인해 미국에서 치료시 사용이 중단되었고, 간경변증 환자에게도 부작용을 일으킬 가능성이 있으므로, 본 발명은 크로몰린 및 이오노마이신을 이용하여 하기 실험을 수행하였다.
Figure 112015083995150-pat00002
< 실험예 2> 간성상세포에 대한 세포독성 효과 확인
<2-1> MTT 분석을 이용한 세포 증식 효과 확인
간성상세포에 대한 증식 활성을 확인하기 위하여 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석을 수행하였고, 간성상세포로는 상기 <실시예 1>에서 수득한 HSC-T6 및 LX2 세포주를 이용하였다.
구체적으로, MTT 분석은 각각의 세포의 세포 현탁액(Cell suspensions)을 96-웰 플레이트에 웰당 5 × 104 농도로 접종하였다. 그런 다음, pH 7.2의 PBS(phosphate-buffered saline)에 MTT를 녹인 MTT 저장 용액(5 mg/mL)을 준비한 후, 필터 처리한 다음, 상기 각각의 웰에 MTT 용액 15 μL을 첨가하였다. 37℃ 및 5%　CO2 환경에서 4시간 동안 배양한 후, 185 μL의 가용화 용액(solubilization solution/stop)을 상기 각 웰에 첨가하여 반응을 종결시킨 다음, 세포 생존율을 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 리더를 이용하여 620 nm 흡광도에서 측정하였다. 아울러, 생존율은 후보물질 처리 또는 비처리한 세포의 흡광도의 비(Ratio)를 계산하여 구하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 크로몰린 및 이오노마이신의 농도가 증가함에 따라, 증식 활성이 무처리 대조군과 비교하여 감소함을 확인하였다. 다만, HSC-T6 세포주에서 낮은 농도(0.1 μM)의 크로몰린 및 이오노마이신 처리시, 유의적인 효과를 나타내지 않았지만, LX2 세포주에서는 낮은 농도(0.1 μM)에서도 항 증식 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 2A 및 B).
<2-2> LDH (lactate dehydrogenase ) 분석법을 이용한 세포독성 확인
상기 <2-1>의 MTT 분석 결과가 세포 사멸로 인해 MTT 값이 감소된 것인지 확인하기 위하여, 크로몰린 및 이오노마이신의 세포독성을 LDH 분석법을 통해 확인하였다.
구체적으로, 독립된 세포 배양 배지에 크로몰린 및 이오노마이신을 양을 서서히 증가시키면서, 상기 배양 배지에 LDH가 분비되는 양을 측정하였으며, 제조사에서 제공된 방법에 따라 LDH 세포독성 분석 키트(케이맨 화학회사, 미국)를 이용하여 실험을 수행하였다. 먼저, 세포를 10% 열 불활성화 소태아혈청(heat inactivated fetal bovine serum) 및 1% 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지에서 37℃ 및 5%　CO2 환경에서 성장시켰다. 그런 다음, 상기 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 2 × 104 농도로 접종하였다. 크로몰린 및 이오노마이신을 양을 증가시키면서 첨가한 다음, 48시간 후, 각 웰에서 각각 상층액 100 μL을 새로운 플레이트에 옮기고, 100 μL 반응 용액을 각각의 웰에 첨가한 다음, 상온에서 30분 동안 오비탈 쉐이커(orbital shaker)로 가볍게 교반하면서 배양한 후, Plate reader를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 2C 및 2D에 나타낸 바와 같이, 크로몰린은 고농도(10 μM)를 제외하고는 세포독성을 나타내지 않았으나, 이오노마이신은 농도의존적으로 세포 사멸을 유도하는 것을 확인하였다.
따라서, 이오노마이신은 세포독성 가능성을 가지므로, 본 발명은 크로몰린을 최총 후보로 선정하여 하기 실험을 수행하였다.
< 실험예 3> 크로몰린의 콜라겐(collagen) 및 TGF -β 생성 억제 효과 확인
크로몰린이 활성화된 HSC 세포의 주요 분비 마커로 알려진 콜라겐 축척 및 TGF-β의 생성을 억제하는지 확인하기 위하여, LX-2 및 HCT-T6 세포주를 ELISA를 이용하여 분석하였다.
구체적으로, 먼저, 콜라겐 검출은 Sirius Red Total Collagen Detection Kit(Chondrex, 미국)를 이용하여 검출하였다. 현탁 세포를 웰 당 1 × 104 세포의 농도로 24 웰 플레이트에 접종하고, 48 시간 동안 다양한 용량으로 크로몰린을 처리하였다. 그런 다음, 희석 용액 또는 표준 시료 1.5 mL의 원심 분리 튜브에 이중으로 첨가한 다음, 각 튜브를 실온에서 20 분 동안 시리우스 적색 용액 500 μL와 함께 배양하였다. 상등액을 제거한 후, 튜브를 2번 세척하고, 최종 상등액 200 μL를 96 웰 플레이트로 옮겼다. 광학 밀도 값은 510-550 nm에서 측정하였다.
그 결과, 도 3A 및 도 3B에 나타낸 바와 같이, 크로몰린 농도를 증가시킬수록, 분비되는 콜라겐이 유의적으로 감소됨을 확인하였다. 또한, ELISA를 통해 크로몰린은 농도 의존적으로 TGF-β의 생성을 억제하는 것을 확인하였다(도 3A 및 B).
< 실험예 4> 크로몰린의 간세포 EMT (epithelial- mesenchymal transition)의 억제 효과 확인
간세포에 있어서, 크로몰린의 복구효과를 확인하였다. 이전 다양한 연구에서 간 섬유화에 있어서 EMT 과정을 겪는다는 것이 알려져 있다(Iwaisako K, Brenner DA, Kisseleva T. What's new in liver fibrosis. The origin of myofibroblasts in liver fibrosis. Journal of gastroenterology and hepatology. 2012; 27 Suppl2: 65-8; Wiemann SU, Satyanarayana A, Tsahuridu M, et al. Hepatocyte telomere shortening and senescence are general markers of human liver cirrhosis. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 2002; 16: 935-42). 따라서, 본 발명자들은 EMT를 유도하는 TGF-β 존재 유무하에서 크로몰린 처리에 따른 일차 간세포의 운동성을 확인하였다.
구체적으로, TGF-β(2 ng/mL) 존재 또는 부존재 하에서 크로몰린 처리에 따른 세포 이동성을 공지된 wound 분석법을 이용하여 분석하였고, LDH 분석을 이용하여 상처의 회복거리를 측정하였다. 또한, TGF-β와 크로몰린을 처리한 후, E-카데린(E-cadherin) 발현 변화를 확인하였고, E-카데린 발현 변화는 일차 간세포에서 TGF-β(칼 바이오 켐, 미국) 처리한 후, E-카데린(H-180)의 대한 항체(산타크루즈, 미국)를 이용하여 웨스턴 블럿을 통해 확인하였다. 한편, 튜블린(tubulun)은 로딩 컨트롤로 사용하였다.
그 결과, 도 4A 및 B에 나타낸 바와 같이, TGF-β 부존재하에서는, 크로몰린을 처리한 그룹의 간세포 이동성은 무처리 대조군과 유의적인 차이를 나타내지 않았으나, TGF-β 존재하에서는 TGF-β는 간세포의 이동을 유도하고, 크로몰린은 이동 거리 측면에서 15% 정도 간세포 이동 활성을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 도 4C에 나타낸 바와 같이, TGF-β 처리는 EMT의 현상과 유사한, E-카데린의 발현 수준을(E-카데린의 1, 4 라인) 감소시켰으나, 크로몰린과 간세포를 공동 배양은 농도 의존적으로 EMT 진행으로 인한 E-cadherin 발현의 감소를 유의적으로 억제함을 확인하였다(도 4).
< 실험예 5> 간세포에서 크로몰린의 항 노화(Senescence) 효과 확인
노화가 섬유화와 관련된 대표적인 현상이기 때문에 노화지표인 β-갈락토시다아제(β-galactosidase) 염색을 이용하여 크로몰린의 간세포의 노화 방지 효과를 확인하였다.
SA-β-gal(Senescence β-galactosidase) 염색은 제조사에서 제공된 방법에 따라 Senescence β-Galactosidase 염색 키트(Biovision, 미국)를 사용하여 수행하였다. 구체적으로, PBS로 세척 한 후, 세포는 실온에서 15 분 동안 PBS에서 2 % 포름알데히드(formaldehyde) 및 0.2 % 글루탈알데히드(glutaraldehyde)로 고정시켰다. 고정된 세포를 PBS로 세척 한 후, 24 시간 동안 37℃에서 X-gal 염색 용액과 함께 배양하였다. 세포를 시각화하고, 사진은 자이스 PALM 레이저 캡처 미세 절제 현미경(Zeiss PALM laser capture microdissection microscope)(Zeiss, 독일)으로 촬영하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 간세포와 실험관 내에서 배양 3일 후, β-galactosidase 양성 세포 수가 현저히 증가하였으나, 크로몰린 처리에 따라 β-galactosidase 양성 세포는 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 5 A 및 B).
이하, 본 발명에 따른 각 제제의 제조예를 예시한다. 하기 제조예는 본 발명의 실시에 대한 이해를 돕기 위한 것이지 본 발명에 따른 제형의 제조방법이 하기 제조예로 한정되는 것을 의미하지 않는다.
<제조예 1> 약제의 제조
<1-1> 산제의 제조
크로몰린 10 mg
수크로오즈 100 mg
탈크 10 mg
상기 성분들을 분말화하여 혼합한 후 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
<1-2> 정제의 제조
크로몰린 10 mg
전분 100 mg
수크로오즈 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
통상의 정제의 제조방법에 따라 상기 성분들을 혼합한 후 이를 타정하여 정제를 제조한다.
<1-3> 캅셀제의 제조
크로몰린 10 mg
결정성 셀룰로오즈 3 mg
락토오즈 15 mg
스테아린산 마그네슘 1 mg
통상의 캅셀제의 제조방법에 따라 상기 성분들을 혼합한 후 젤라틴 캡슐에 충진하여 캅셀제를 제조한다.
<1-4> 과립제의 제조
크로몰린 10 mg
대두 추출물 50 mg
포도당 200 mg
전분 500 mg
상기 성분들을 혼합한 후 30% 에탄올 100mL를 첨가하여 60에서 건조시켜 과립을 형성한 후 포에 충진하여 과립제를 제조한다.
<1-5> 환제의 제조
크로몰린 10 mg
유당 1,500 mg
글리세린 1,500 mg
전분 980 mg
상기 성분들을 혼합한 후 통상의 환제의 제조방법에 따라 1환 당 4g이 되도록 제조한다.
<1-6> 주사제의 제조
크로몰린 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2,870 mg
Na2HPO412H2O 30 mg
통상의 주사제 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 mL)가 되도록 상기 성분을 혼합하여 제조한다.
<1-7> 액제의 제조
크로몰린 10 mg
이성화당 10,000 mg
만니톨 5,000 mg
정제수 적량
통상의 액제 제조방법에 따라 정제수에 상기 성분을 용해시키고, 적절한 향을 가한 다음 병에 충진하여 멸균시켜 제조한다.
<제조예 2> 식품의 제조
<2-1> 밀가루 식품의 제조
본 발명의 크로몰린 0.5~5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하였다.
<2-2> 스프 및 육즙(gravies)의 제조
본 발명의 크로몰린 0.1~5.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.
<2-3> 그라운드 비프(ground beef)의 제조
본 발명의 크로몰린 10 중량부를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.
<2-4> 유제품(dairyproducts)의 제조
본 발명의 크로몰린 5~10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
<2-5> 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
본 발명의 크로몰린을 진공 농축기에서 감압농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.
상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 본 발명의 크로몰린을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.
곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),
종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),
본 발명의 크로몰린(3 중량부),
영지(0.5 중량부),
지황(0.5 중량부)
<제조예 3> 음료의 제조
<3-1> 건강음료의 제조
액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 본 발명의 크로몰린 5 g을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 제조하였다.
<3-2> 야채 주스의 제조
본 발명의 크로몰린 5 g을 토마토 또는 당근 주스 1,000 ㎖에 가하여 야채 주스를 제조하였다.
<3-3> 과일 주스의 제조
본 발명의 크로몰린 1 g을 사과 또는 포도 주스 1,000 ㎖ 에 가하여 과일 주스를 제조하였다.

Claims (10)

  1. 크로몰린(cromolyn) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간경변(liver cirrhosis), 간 섬유증(Liver fibrosis), 간부전(liver failure) 및 간염(hepatitis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 크로몰린은 하기 [화학식 1]로 기재되는 화합물인 것을 특징으로 하는 간경변, 간 섬유증, 간부전 및 간염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112016078519393-pat00003
    .
  3. 제 1항에 있어서, 상기 크로몰린은 간성상세포(Hepatic stellate cell, HSC)에서 콜라겐 축적을 억제하는 것을 특징으로 하는 간경변, 간 섬유증, 간부전 및 간염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 크로몰린은 간성상세포에서 TGF-β 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 간경변, 간 섬유증, 간부전 및 간염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 크로몰린은 간세포(Hepatocyte)에서 E-카데린(E-cadherin)의 발현 감소를 억제시키는 것을 특징으로 하는 간경변, 간 섬유증, 간부전 및 간염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 크로몰린은 간세포의 항노화(antiSenescence) 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 간경변, 간 섬유증, 간부전 및 간염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  7. 삭제
  8. 크로몰린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간경변, 간 섬유증, 간부전 및 간염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 예방 및 개선용 건강식품.
  9. 제8항에 있어서, 상기 크로몰린은 간성상세포 활성을 억제하고, 간세포의 기능을 회복시키는 것을 특징으로 하는 간경변, 간 섬유증, 간부전 및 간염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 예방 및 개선용 건강식품.



  10. 삭제
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