KR101320694B1 - 혈액 처리용 조성물 및 이를 포함하는 자가면역질환 진단용 키트 세트 - Google Patents
혈액 처리용 조성물 및 이를 포함하는 자가면역질환 진단용 키트 세트 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 혈액 처리용 조성물, 이를 포함하는 자가면역질환 진단용 키트 세트 및 이를 이용한 자가면역질환의 모니터링 방법에 관한 것이다.
본 발명은 환자 혈액세포 자극을 통한 기질효소 증폭 기술로 류마티스 관절염 등 자가면역질환의 조기진단, 질병 활성도 및 치료반응 예측 평가의 정확도를 향상시킬 수 있다.
본 발명은 환자 혈액세포 자극을 통한 기질효소 증폭 기술로 류마티스 관절염 등 자가면역질환의 조기진단, 질병 활성도 및 치료반응 예측 평가의 정확도를 향상시킬 수 있다.
Description
본 발명은 혈액 처리용 조성물, 이를 포함하는 자가면역질환 진단용 키트 세트 및 이를 이용한 자가면역질환의 모니터링 방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는 본 발명은 류마티스 관절염 환자의 말초혈액 세포를 본 발명의 혈액 처리용 조성물로 자극하여 증폭되어진 특정 금속 단백질 분해효소(MMP)를, 류마티스 관절염에 특이적으로 작용하는 광학 프로브 복합체를 도포한 진단 키트에 얹어 정상인과 류마티스 환자를 조기에 구별함과 동시에 치료반응 예측을 혈액에서 정확하고 쉽게 평가하고 모니터링 하는 기술에 관한 것이다.
류마티스 관절염은 현재까지 정확한 원인이 밝혀지지 않은 자가 면역성 질환으로 관절 활막에 염증을 유발하여 손가락, 발가락 등의 작은 관절부터 팔꿈치, 어깨, 무릎, 고관절에 이르는 큰 관절까지 파괴되어 결국 운동장애와 관절 변형을 가져올 뿐 아니라 다양한 종류의 장기침범을 가져오는 전신질환이며, 초기 진단이 지연되거나 조기치료 실패 시 대부분 비가역적인 만성질환으로 이환되며, 이로 인해 직업을 잃거나 수명이 단축되는 등 삶의 질에 크나큰 손실을 미치게 된다.
현재 임상에서 사용되고 있는 1987년 미국 류마티스 학회(ACR) 기준 류마티스 관절염 진단기준에는 생물학 표지자 중에서 류마티스인자(rheumatoid factor;RF)만이 유일한 기준에 포함되어 있으나 RF는 진단의 특이도가 낮아 조기진단에 도움을 주기는커녕 진단을 모호하게 만드는 경우가 종종 있어 임상적으로 확진의 보조적 수단으로 한계가 있다.
류마티스 관절염은 조기에 적극적 치료를 시작하면 관절통이나 관절강직이 호전되며 치료반응이 좋을 경우 삶의 질이 개선되고 방사선학적 골 파괴 및 심각한 신체장애와 수명 단축을 예방 또는 지연시킬 수 있다. 질병 치료효과를 모니터링 하기 위해 현재 사용하고 있는 적혈구 침강속도(erythrocyte sedimentation rate;ESR)나 C-반응 단백(C-reactive protein;CRP)은 관절의 특이 물질이 아닌 전신 질환 혹은 염증상태에서 비특이적으로 반응하는 한계점이 있어 특이적 검사지표로서 활용에 한계가 있다.
류마티스 관절염의 혈청학적 조기 진단을 위해 최근 개발되어 임상적용 가능성이 제기되고 있는 항핵주위인자, 항케라틴항체, 항RA33, 항Sa항체 등의 검사들은 RF와 같은 기존 검사보다 특이도는 향상되고 있으나 질병에 대한 민감도가 떨어지고 검사과정이 복잡하기 때문에 임상에서 널리 사용되지 않고 있다. 2010년 개정된 미국 류마티스 학회 류마티스 관절염 진단 기준에 포함된 생물학적 표지자인 항고리 시트룰린 항체(Anti-CCP) 또한 특이도는 높지만 민감도는 낮아 환자 진단을 놓칠 가능성이 제시되었고, 항 CCP농도와 질병 활성도 간의 상관관계가 뚜렷하지 않은 것으로 밝혀져 치료반응을 모니터링 하는 데는 미흡하다는 단점이 있다. 미흡한 점을 보충하기 위한 다른 생물학적 표지자 후보로 대두되고 있는 기질 금속 단백질 분해효소는 활막에서 직접적으로 생성되므로 류마티스 관절 파괴에 관여하는 중요한 효소 중에 하나라는 장점이 있어 조기진단 뿐만 아니라 치료 효과를 모니터링 하는데 큰 역할을 할 것으로 기대되어 기질 금속 단백질 분해효소 발현과 류마티스 관절염 진행의 상관성에 대한 연구는 광범위하게 이루어져 왔으며, 주로 기질 금속 단백질 분해효소 항체를 이용하여 발현되는 양을 측정하는 키트가 개발되어 있다. 거의 대부분의 관절염 진행에 따른 기질 금속 단백질 분해효소 발현의 변화를 연구한 자료에서는 체내 생산 및 분비되는 활성 및 비활성상태의 기질단백질 분해효소를 모두 정량한 비특이적 검사결과여서 류마티스 관절염 중증도에 직접적인 영향을 미치는 활성화 기질 금속 단백질 분해효소의 정량적 검사기술의 개발이 필요하다. 류마티스 관절염 환자의 활막세포 혹은 활막에 발현되어 있는 기질 금속 단백질 분해효소를 조사하여 질병발생에 있어서의 중요성은 밝혀져 있으나, 말초혈액 세포의 기질 금속 단백질 분해효소 생산 잠재력에 대한 연구는 거의 발표된 바 없다. 류마티스 관절염 환자와 정상인의 혈액 내의 기질 금속 단백질 분해효소 농도와 치료 후의 기질 금속 단백질 분해효소 발현 양의 변화를 연구한 자료는 있으나 일관성이 낮으며 관절염 치료반응에 대한 예측검사 연구는 전혀 되어 있지 않다.
한편, 등록특허 제10-1103548호는 형광체, 소광체, 기질 금속 단백질 분해효소에 의하여 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질 및 생체 적합성 고분자로 이루어진 기질 금속 단백질 분해효소의 활성 측정용 나노입자 센서를 기술하고 있는데, 이는 상기 나노입자 센서를 환부 조직에 투입하여, 조직 내부에서의 기질 금속 단백질 분해효소의 발현 정도를 영상화하는 기술에 관한 것으로서, 환자의 말초 혈액 내에 존재하는 극소량의 금속 단백질 분해효소를 증폭시켜 정량화 및 영상화하는 기술과는 차이가 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 환자의 말초 혈액을 이용한 자가면역질환 조기 진단 기술의 개발을 위하여 예의 연구 노력하였고, 그 결과 초기 류마티스 관절염의 골미란에 기질 금속 단백질 분해효소가 중요한 역할을 하고, 이를 생산하는 대식세포의 수가 류마티스 관절염 환자와 정상인의 말초혈액 내에서 차이를 보인다는 점에 착안하여, 적정 화학 자극을 통한 대식세포의 기질 금속 단백질 효소의 발현량의 차이가 환자와 정상인 사이에서 극대 되는 방법을 성립시킴으로써, 본 발명을 완성하게 되었다. 또한, 기질 금속 단백질 분해효소에 특이적으로 반응하는 형광 센서를 도포한 분자진단 키트를 개발하여 혈액세포 자극 전후 및 각각의 화학 인자에 따른 MMP 발현량의 차이를 류마티스 관절염 환자와 정상인 사이에서 정량 및 모니터링 할 수 있는 기술을 개발하였다.
따라서 본 발명의 목적은 환자의 말초 혈액 중 존재하는 기질 금속 단백질 분해효소(Matrix metalloproteinase, MMP)의 발현량의 차이를 극대화시키기 위한, 자가면역질환 진단용 혈액 처리 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 혈액 처리 조성물 및 형광 센서를 도포한 분자진단 키트를 포함하는 자가면역질환 진단용 키트 세트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 혈액 처리 조성물을 이용하여 환자의 말초 혈액 중 존재하는 기질 금속 단백질 분해효소의 발현량의 차이를 극대화시키는 혈액 처리 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 자가면역질환 진단을 위한 정보를 제공하기 위하여, 혈액 중 존재하는 기질 금속 단백질 분해효소를 정량화 또는 영상화하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 하나의 관점은 LPS(Lipopolysacharide), PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate), TNF-α(Tumor necrosis factor-alpha), IL-1β(interleukin-1β) 및 GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)로 이루어진 군으로부터 일 이상 선택되는 혈액 자극 물질을 포함하는, 자가면역질환 진단을 위한 혈액 처리용 조성물을 제공하는 것이다.
본 연구의 최종 목표는 자가면역질환의 조기진단, 질병 활성도 및 치료반응 예측 평가의 정확도를 향상시키기 위하여, 류마티스 관절염 환자의 말초혈액과 정상인의 말초혈액에서 류마티스 관절염의 인자를 구별해낼 수 있는 방법을 개발하는 것이었다. 혈액 속에는 대식세포와 수지상세포 등 다양한 면역세포가 존재하고 있으며 이들은 면역질환이 진행되면서 그 수가 증식하게 되는데, 대식세포는 본 연구진이 측정하고자 하는 기질 금속 단백질 분해효소(MMP)를 발현하는 세포로 알려져 있어 정상인과 류마티스 관절염 환자의 혈액을 동일한 농도의 화학 물질을 처리하여 자극을 주면 정상인과 류마티스 환자 사이의 기질 금속 단백질 분해효소 (MMP)의 발현량의 차이가 극대화 될 것이라는 점에 착안하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 조성물은, 혈액 중 기질 금속 단백질 분해효소(Matrix metalloproteinase, MMP)의 발현량의 차이를 극대화시켜 말초 혈액을 통한 자가면역질환의 조기 진단을 가능하게 하는데, 상기 자가면역질환은 예컨대 골관절염 또는 류마티스 관절염일 수 있다.
상기 기질 금속 단백질 분해효소는 인테그린(integrin) 신호전달과 세포주위 기질(pericellular matrix)의 분해에 따른 세포 운동에 관련된, 아연 의존성 엔도펩티다제로서, 예컨대, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7 내지 MMP-21, MMP-22, MMP-23A, MMP-23B, MMP-24 내지 MMP-28 중에서 선택되는 일 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 관점은 (i) 상기 혈액 처리용 조성물 및 (ii) 형광체-펩타이드-소광체를 포함하는 복합체로 코팅된 키트를 포함하는 자가면역질환 진단용 키트 세트로서, 상기 펩타이드는 기질 금속 단백질 분해효소(Matrix metalloproteinase, MMP)에 의하여 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질인 것을 특징으로 하는 자가면역질환 진단용 키트 세트를 제공하는 것이다.
말초 혈액을 이용한 자가면역질환 조기 진단이라는 목적을 수행하기 위하여, 본 발명에서는 상술한 바와 같이 적정 자극으로 증폭되어진 혈액을 류마티스 관절염에 특이적으로 작용하는 광학 프로브 복합체를 도포한 진단 키트에 얹어 효소에 의해 복원되는 양의 차이에 의한 형광 복원량을 모니터링 한다.
이때 이용되는 류마티스 관절염 특이적 광학 프로브 복합체는 기질 금속 단백질 분해효소의 기질로 알려진 아미노산 염기서열을 이용해 제작한 펩티드를 골격으로 하는 형광체-펩타이드-소광체를 포함하는 복합체로서, 상기 펩타이드가 기질 금속 단백질 분해효소(Matrix metalloproteinase, MMP)에 의하여 특이적으로 분해되는 경우, 형광체가 소광체로부터 분리되어 형광을 발하게 된다.
일 구현예에서, 상기 형광체는 시아닌, 플루오레신, 테트라메틸로드아민, 알렉사 또는 보디피일 수 있으며, 바람직하게는 이중 근적외선 빛을 방출 및 흡수하여 세포, 혈액 및 생체 조직 등과 간섭 또는 흡수가 최소화되는 시아닌계 Cy 5.5(Ex/Em 670/690)일 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 소광체는 블랙홀 소광체(blackhole quencher) 또는 블랙베리 소광체(blackberry quencher)일 수 있으며, 또한 소광체로는 형광체의 발광파장과 같거나 거의 유사한 파장대의 것을 사용하여야 소광효과를 극대화할 수 있기 때문에 형광체로서 Cy5.5를 사용하는 경우에는 그것의 형광대와 비슷한 BHQ-3 (abs. 620 nm - 730 nm)를 사용하는 것이 바람직하다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 광학 프로브 복합체는 MMP의 기질 펩타이드와 결합되어 있는 고분자를 더 포함할 수 있는데, 이는 상기 복합체를 키트 표면에 일일이 고정시키는 것보다 고분자 상에 다수의 복합체를 연결시킨 후 이를 진단용 키트에 도포하는 것이 광학 프로브 복합체를 키트 상에 최대한 많이 고정시킬 수 있는 방법이기 때문이다.
일 구현예에서 상기 고분자로는 키토산, 덱스트란, 히알루론산, 폴리아미노산 또는 헤파린을 사용할 수 있다.
상기 MMP 효소에 의하여 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질로는 MMP 효소의 종류에 따라 적당한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 MMP-2, MMP-3, MMP-9 또는 MMP-13의 정량화를 위해서는 아미노산 서열 Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Lys-Gly-Gly을 포함하는 펩타이드 기질을, MMP-3, MMP-7 또는 MMP-13의 정량화를 위해서는 아미노산 서열 Gly-Val-Pro-Leu-Ser-Leu-Thr-Met-Gly-Lys-Gly-Gly을 포함하는 펩타이드 기질을 사용할 수 있다. 또한, MMP-2, MMP-3 또는 MMP-13의 정량화를 위해서는 아미노산 서열 Gly-Pro-Leu-Gly-Met-Arg-Gly-Leu-Gly-Lys-Gly-Gly을 사용할 수 있다.
예컨대, 아미노산 서열 Gly-Val-Pro-Leu-Ser-Leu-Thr-Met-Gly-Lys-Gly-Gly을 포함하는 펩타이드 기질을 포함하는 광학 프로브 복합체를 도포한 인 비트로 진단 키트를 사용하는 경우, 여러 MMP 아형 중에서, MMP-3, MMP-7 또는 MMP-13과의 반응에 의해 높은 형광 복원율을 나타내며, 특히 MMP-3에 대하여 현저한 특이성을 확인할 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 광학 프로브 복합체를 도포한 인 비트로 진단 키트는 MMP 효소의 농도에 비례하여 증가하는 형광 발현을 나타내므로, 혈액 내의 특정 MMP 효소 정량적으로 분석하여 류마티스 관절염의 진행 활성화 정도의 모니터링을 가능하게 한다.
본 발명의 또 다른 관점은 LPS(Lipopolysacharide), PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate), TNF-α(Tumor necrosis factor), IL-1β(interleukin-1β) 및 GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 일 이상의 물질로 혈액을 자극하여, 기질 금속 단백질 분해효소(Matrix metalloproteinase)의 발현량의 차이를 극대화시키는 혈액 처리 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같이 본 발명의 혈액 처리 방법을 통해 증폭된 말초 혈액 중에 존재하는 기질 금속 단백질 분해효소의 정량화 및/또는 영상화를 위해서는 당업계에 일반적으로 알려진 단백질 정량 방법이라면 그 무엇이든 제한 없이 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명에 의하여 제공되는, 기질 금속 단백질 분해효소 특이적 펩타이드 기질을 포함하는 광학 프로브 복합체를 도포한 인 비트로 진단 키트를 사용하거나, 유세포 분석 방법을 사용하거나 또는 현재 시판되고 있는 MMP 단백질 정량 방법 중의 하나인 ELISA(Enzyme linked Immunosolbent assay)를 사용할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 관점은, (i) 본 발명의 혈액 처리용 조성물을 사용하여 혈액을 자극 내지 증폭하는 단계 및 (ii) 상기 처리된 혈액을 형광체-펩타이드-소광체를 포함하는 복합체로 코팅된 키트에 적용시키는 단계를 포함하는, 혈액 중 존재하는 기질 금속 단백질 분해효소를 정량화 또는 영상화하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 기질 금속 단백질 분해효소를 정량화 또는 영상화하는 방법은 시판되고 있는 ELISA 기법에서 감지해 낼 수 있는 최소 농도와 비슷한 수준의 감도를나타내는 바, 자가면역질환의 조기 진단을 위한 정보를 제공하는 데에 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명은 환자 혈액세포 자극을 통한 기질효소 증폭 기술로 자가면역질환의 조기진단, 질병 활성도 및 치료반응 예측 평가의 정확도 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 그 측정방법이 간단하여 효과적인 치료기회 제공, 의료 시간과 비용의 단축 효과를 나타낸다.
도 1은 형광체-펩타이드-소광체-고분자를 포함하는 광학 프로브 복합체의 모식도이다. 최대량의 복합체를 키트에 도포할 수 있게 하기 위하여, 형광체-펩타이드-소광체 복합체를 글리이콜 키토산 고분자에 결합시킨 모습을 보여준다.
도 2는 MMP에 특이적으로 반응하여 형광이 복원되는 인 비트로 진단 키트의 모식도를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 인 비트로 진단 키트의 MMP 단백질 특이성을 보여주는 실험 결과이다. 아미노산 서열 Gly-Val-Pro-Leu-Ser-Leu-Thr-Met-Gly-Lys-Gly-Gly을 포함하는 펩타이드 기질을 포함하는 광학 프로브 복합체를 도포한 키트를 사용한 경우, 금속 단백질 분해효소의 여러 아형 중 특히 MMP-3에 매우 특이적으로 반응하여 형광이 40배 이상 복원되는 것을 확인하였다.
도 4는 기질금속 단백질 분해효소(MMP-3)의 농도에 따른 형광 복원률 측정 결과를 나타낸다.
도 5는 혈청 내 기질 금속 단백질 분해효소(MMP-3)에 의한 형광 복원률 측정 결과를 나타낸다.
도 6은 류마티스 관절염 동물모델의 주수별 발현량의 정량적 확인 결과를 나타낸다.
도 7은 류마티스 관절염 환자의 말초혈액을 자극하는 방법에 관한 모식도를 나타낸다.
도 8a 및 8b는 본 발명의 인 비트로 진단 키트를 이용한 류마티스 관절염 환자의 혈액 자극 수의 기질 금속 단백질 분해효소(MMP-3)의 발현량을 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 류마티스 관절염 환자의 혈액 중 기질 금속 단백질 분해효소(MMP-3)의 발현량을 유세포 분석기를 이용하여 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 MMP에 특이적으로 반응하여 형광이 복원되는 인 비트로 진단 키트의 모식도를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 인 비트로 진단 키트의 MMP 단백질 특이성을 보여주는 실험 결과이다. 아미노산 서열 Gly-Val-Pro-Leu-Ser-Leu-Thr-Met-Gly-Lys-Gly-Gly을 포함하는 펩타이드 기질을 포함하는 광학 프로브 복합체를 도포한 키트를 사용한 경우, 금속 단백질 분해효소의 여러 아형 중 특히 MMP-3에 매우 특이적으로 반응하여 형광이 40배 이상 복원되는 것을 확인하였다.
도 4는 기질금속 단백질 분해효소(MMP-3)의 농도에 따른 형광 복원률 측정 결과를 나타낸다.
도 5는 혈청 내 기질 금속 단백질 분해효소(MMP-3)에 의한 형광 복원률 측정 결과를 나타낸다.
도 6은 류마티스 관절염 동물모델의 주수별 발현량의 정량적 확인 결과를 나타낸다.
도 7은 류마티스 관절염 환자의 말초혈액을 자극하는 방법에 관한 모식도를 나타낸다.
도 8a 및 8b는 본 발명의 인 비트로 진단 키트를 이용한 류마티스 관절염 환자의 혈액 자극 수의 기질 금속 단백질 분해효소(MMP-3)의 발현량을 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 류마티스 관절염 환자의 혈액 중 기질 금속 단백질 분해효소(MMP-3)의 발현량을 유세포 분석기를 이용하여 측정한 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. 형광체-펩타이드-소광체-고분자 복합체 제조(도 1)
먼저, 형광체와 소광체가 결합된 펩타이드를 제조하기 위해, 펩타이드는 고체상 합성법(solid phase synthesis)을 따라 에프목 방법(Fmoc strategy)으로 제조하고, 상기 제조된 펩타이드 서열에 형광체와 소광체를 화학적으로 결합하였다.
구체적으로 형광체로는 Cy5.5(ex/em, 670/690)를 사용하였고, Cy5.5 형광체의 형광을 소광시킬 수 있는 소광체로는 BHQ-3(abs. 620 nm - 730 nm)를 사용하였다. MMP 단백질 효소에 선택적으로 분해되는 펩타이드 기질로는NH2-Gly-Val-Pro-Leu-Ser-Leu-Thr-Met-Gly-Lys(Boc)-Gly-Gly-COOH을 에프목(Fmoc) 펩타이드 합성방법으로 제조하고, 펩타이드 기질 5 mg에 근적외선 형광체인 Cy5.5-HNS 에스터 8.5㎎, N-메틸모르폴린 8μl, 4-디메틸아미노피리딘 0.3 mg을 200μl의 디메틸포름아미드에 녹인 후 12 시간 상온에서 반응시켰다. 반응이 종료한 용액을 차가운 에틸 에테르 4 ml로 침전시키고 원심분리하여 상등액은 제거한 후 차가운 에틸 에테르 2 ml로 다시 세척하였다. 표면의 에틸 에테르를 제거한 후 스피드 베큠(speed vacuum) 또는 진공 오븐(vacuum oven)으로 건조시켜 Cy5.5-Gly-Val-Pro-Leu-Ser-Leu-Thr-Met-Gly-Lys(Boc)-Gly-Gly-COOH 전구체를 제조하였다.
건조된 상기의 펩타이드 전구체의 보호기를 탈보호하기 위하여, 상기의 물질을 트리플로오로아세트산 1 ml, 증류수 25 μl, 아니솔(Anisole) 25 μl를 넣어서 1 시간 동안 상온에서 반응시켰다. 로터리 펌프(Rotary pump)를 이용하여 용액을 모두 제거한 후, 이를 HPLC 용리액(eluent)(0.1% TFA이 있는 식염수:0.1% TFA가 있는 아세토니트릴 =1:1) 1ml에 녹인 후, 필터(0.45μm, 유기용매 사용 가능한 필터)하였다. HPLC 용리액(eluent)(0.1% TFA이 있는 식염수: 0.1% TFA이 있는 아세토니트릴 =1:1), 애질런트(Agilent)ZORBAX SB-C18 컬럼 (9.4 x 150 mm)을 이용하여, 0.1% TFA이 있는 5% 아세토니트릴, 0.1% TFA이 있는 95% 식염수로 HPLC를 안정화시켰다. 20분 동안 기울기 용리(gradient elution) (0분에 5%, 5분에 22%, 20분에 40% 아세토니트릴 (0.1% TFA이 있는) vs DW (0.1% TFA가 있는))을 통하여 물질을 분리시켰다. 이때, UV 220nm, FLD ex: 675nm em: 690nm에서 측정한 후 Cy5.5-Gly-Val-Pro-Leu-Ser-Leu-Thr-Met-Gly-Lys-Gly-Gly-COOH 물질을 분리하였다. 분리한 물질을 분자량을 매스(mass)를 사용하여 찍어 확인한 후 동결건조시켰다. 상기의 물질 2 ㎎에 BHQ3-NHS 에스터(Biosearch Technologies Inc., 0.71 ㎎), NMM 1.5 μl, DMAP 0.2 mg를 30μl DMSO에 녹여 상온에서 12시간 반응시켰다. HPLC 용리액(0.1% TFA이 있는 식염수: 0.1% TFA가 있는 아세토니트릴 =1:1), 애질런트(Agilent) ZORBAX SB-C18 컬럼(9.4 x 150 mm)을 이용하여, 0.1% TFA가 있는 5% 아세토니트릴, 0.1% TFA가 있는 95% 식염수로 HPLC를 안정화시켰다. 25분 동안 기울기 용리(gradient elution) (0분에 5%, 5분에 30%, 25분에 70% 아세토니트릴(0.1% TFA 있는)vs 0.1% TFA가 있는 식염수)을 통하여 물질을 분리시켰다. 이때, UV 220nm, FLD ex: 675nm em: 690nm에서 측정한 후 Cy5.5-Gly-Val-Pro-Leu-Ser-Leu-Thr-Met-Gly-Lys(BHQ3)-Gly-Gly-COOH 물질을 분리하였다. 분리한 물질을 분자량을 매스(mass)를 사용하여 찍어 확인한 후 동결건조 시켰다.
그 다음으로, 형광체-펩타이드-소광체 물질을 24-웰 플레이트에 많은 양으로 고정화하기 위하여 고분자를 사용하였다. 형광체-펩타이드-소광체를 직접 24-웰 플레이트에 붙이는 것 보다 여러개의 형광체-펩타이드-소광체를 먼저 고분자에 붙인후 그 고분자를 24-웰 플레이트에 붙이면 효율을 훨씬 증가시킬 수 있다. 이에 사용한 고분자로 생체 친화성 글라이콜 키토산(분자량 250,000 Da)을 사용하였다.
앞서 준비한 형광체-펩타이드-소광체를 100 ㎕ DMSO로 녹인 후 100 ㎕ PBS (pH 6.0)를 첨가한 후 EDC(1 mg) 및 NHS(0.8 mg)를 첨가하여 상온에서 15분 반응시켰다. 반응 종료 후 상기 용액을 글라이콜 키토산 10 mg를 15ml PBS(pH 7.4)에 녹인 용액에 첨가한 후 상온에서 12 시간 반응시켰다. 반응 종료 후 투석(dialysis)방법을 사용하여 3일간 반응하지 않은 형광체-펩타이드-소광체를 제거하였다.
이렇게 제조한 형광체-펩타이드-소광체-고분자 복합체의 모식도를 도 1에 나타내었다.
실시예
2.
MMP
에 특이적으로 반응하여 형광이 복원되는 인 비트로 진단
키트의
제조(도 2)
실시예 1에서 제조된 형광체-펩타이드-소광체-고분자 복합체를 아민(-NH3)이 붙어있는 키트에 도포하고 상온에서 12시간 동안 반응시켜, 형광체-펩타이드-소광체-고분자 복합체가 키트 상의 아민기와 함께 화학적 결합을 하도록 하여 MMP에 특이적으로 반응하여 형광이 복원되는 인 비트로 키트를 제조하였다.
실시예
3. 형광체-
펩타이드
-
소광체
-고분자 복합체로 코팅된 인 비트로 진단
키트의
MMPs
분해효소 특이성 확인(도 3)
실시예 2에서 제조한 인 비트로 키트의 MMP 단백질 분해 효소에 대한 선택 특이성을 관찰하였다. 구체적으로 상업적으로 판매되는 MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-9 또는 MMP-13 분해효소 (R&D systems)를 준비하고, 각 MMP를 활성화하기 위하여 MMP를 p-아미노페닐 머큐릭산(p-aminophenyl mercuric acid)(SIGMA)이 첨가된 TCNB 반응액 (0.1 M Tris, 5 mM 염화칼슘, 200 mM NaCl, 0.1% 브리즈(Brij))에 첨가하여 37℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 상기 활성화된 각각의 MMP를 혈청 실시예 2에서 제조한 인 비트로 키트에 혈청 대신 넣고, 형광 복원율을 관찰하였다. 형광 발현은 형광분석기(Hitachi, F-7000 fluorescence spectrophotometer)를 사용하여 ex: 675nm, em: 676~800nm에서 측정하였다.
그 결과 기질 금속 단백질 분해효소 중 특히 MMP-3에 특이적으로 형광이 40배 이상 복원되는 것을 관찰하였고(도 3), 이를 통해 본 발명의 인 비트로 키트가 류마티스 관절염 환자 혈액 내의 기질 금속 단백질 분해효소(MMP-3)의 양을 측정하는데 사용할 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예
4. 본 발명에 따른 복합체의 단백질 분해효소의 농도에 대한 형광 복원 및 영상화(도 4)
실시예 2에서 제조한 진단 키트의 MMP-3 분해 효소 농도에 대한 의존성을 관찰하였다. 위 실시예 3과 동일한 실험방식으로 1.88. 3.75, 7.5, 15, 30 nM의 활성화된 MMP-3를 첨가하여, 형광 발광 정도를 형광분석기로 관찰하였다.
그 결과 기질금속 단백질 분해효소(MMP-3)의 농도에 의존적으로 R2=0.991의 값을 갖는 선형 그래프를 얻을 수 있었다(도 4). 따라서 혈액 내의 기질금속 단백질 분해효소의 양에 따라 형광 복원률의 차이를 보일 것이라는 것을 간접적으로 증명하였다.
실시예
5. 혈청 내 기질 금속 단백질 분해효소(
MMP
-3)에 의한 형광
복원률
측정(도 5)
류마티스 관절염 모델로는 DBA/1J 마우스 수컷 5주령을 사용하며, 제2형 콜라겐과 면역증강제(Adjuvant), H37RA 박테리아를 함께 섞어 꼬리 피하에 천천히 주사하여 유도하였다. 이러한 과정을 2주 후에 재진행하여 Boost효과를 일으켰다.
이와 같이 류마티스 관절염 질환 동물모델을 만들고, 혈청을 주수별(3주, 4주, 5주, 6주 및 7주)로 얻어 총 7마리에 관한 분석을 시행하였다.
구체적으로, 혈액 세포 자극을 위하여 배지에 LPS (SIGMA)를 100 ng/ml의 농도로 넣어주고, 주수별로 얻은 DBA/1J 마우스의 혈액을 배지에 10배 희석하여 넣어주었다. 혈액을 넣은 후 잘 교반하여 덩어리지지 않도록 하고, 37℃/ 5% 이산화탄소가 유지되는 세포 배양기에서 배양하였다. 3시간 뒤 배지와 섞여 있는 혈액을 2 ml 튜브에 옮겨 3500rpm/4℃/5분 원심 분리하여 상층액을 분리하였다. 이와 같이 준비한 혈청 시료를 상기 실시예 2에서 제조한 진단 키트에 적용하여 형광 발광 정도를 형광분석기로 관찰하였다.
그 결과, 류마티스 관절염의 채점표의 1~2단계(총 1~4단계로 나눔)사이에 위치하는 경미한 수준(눈으로 관찰하기 힘든 정도)의 주수인 5주에서 기질금속단백질 분해효소(MMP-3)의 발현이 가장 높아 이에 따른 형광 복원률 또한 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 5).
실시예
6.
류마티스
관절염 동물모델의
주수별
발현량의 정량적 확인(도 6)
본 발명에서 이용한 진단 키트의 표준으로 사용한 재조합 기질 금속 단백질 분해효소(recombinant human MMP-3)의 농도를 바탕으로 수치 값을 계산하였다. 또한, 현재 항체 반응을 이용하여 단백질 정량의 하는 방법으로 세계적으로 널리 쓰이고 있는 항혈청진단법(ELISA_Enzyme-linked immunosorbent assay)으로 키트에 사용한 동일 검체를 도포하여 수치 값을 얻은 결과 본 연구팀이 개발한 진단 키트의 민감도가 항체를 이용한 것과 비슷한 값을 가지며, 그 값이 통계처리의 결과 유효함을 증명하였다.
실시예
7. 본 발명에 따른 환자 및 일반인 말초 혈액 증폭(도 7)
환자 및 일반인 검체는 동일한 시간에 수집하여 바로 처리하는 것을 기본으로 하였다. 혈액 증폭을 위한 세포 배양용 배지는 RPMI 1640(GIBCO)을 사용하였고, 짧은 시간 동안 자극을 주는 것이므로 세포의 증폭에 영향을 미칠 수 있는 어떠한 요소도 배제하기 위하여 항생제와 FBS는 넣지 않았다. 혈액세포 자극용 화학 물질로는 LPS(Lipopolysacharide), PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)(SIGMA), TNF-α(Tumor necrosis factor)(R&D Systems), IL-1β(interleukin-1β)(Calbiochem), GM-CSF (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)(R&D Systems)를 사용하였다. 상기의 물질들을 적절한 조합을 통하여 배지에 넣어주는 것으로 실험을 진행하였고, 각각의 물질 처리 농도는 다음과 같았다.
위의 물질들을 50 ml 씩 분배하여 둔 배지에 각각 넣어주고, 냉장 보관 한 뒤 혈액이 나오기 전에 37℃ 물속에 담가 따뜻하게 만들어 준 뒤 실험을 진행하였다. 실험에 사용되는 세포 배양 평판은 24 웰 플레이트로 총 1 ml 부피의 배지가 들어갈 수 있다. 본 발명에서는 혈액을 배지에 10배 희석하여 넣어 주는 것을 기본으로 하였다. 혈액은 헤파린으로 도포되어 있는 튜브에 담도록 설정하였다. 각각의 웰에 배지를 900 ul씩 넣어준 뒤, 혈액을 위아래로 잘 섞어서 혈청과 혈장이 분리되어 있지 않도록 한 뒤 100 ul씩 각 배지가 들어있는 웰에 넣어주었다. 이때 파이펫 팁에 다른 배지가 묻어 옮겨지는 것을 방지하기 위하여 팁은 계속 새 것으로 바꿔주었다. 혈액을 넣은 뒤 교반기에 얹고 잘 섞어서 덩어리져 있지 않도록 잘 섞어주고 37℃/ 5% 이산화탄소가 유지되는 세포 배양기에 편평하게 넣어주었다. 본 발명자는 편차를 줄이기 위하여 각각의 배지를 N=3으로 실험을 진행하였다. 3시간 뒤 배지와 섞여 있는 혈액을 2ml 튜브에 옮겨 3500 rpm/4℃/5분 원심 분리하여 상층액을 분리하여 영하 80도 냉동고에 보관하였다.
위와 같이 말초혈액을 자극하기 위하여 준비한 각 배지가 들어있는 웰의 모식도를 도 7에 나타내었다.
실시예
8.
실시예
7의 샘플을 이용한 진단
키트
효율성 실험 (도 8)
본 발명의 실시예 7에 따라 얻은 류마티스 관절염 환자와 정상인의 혈액에서 증폭된 기질 금속 단백질 분해효소(MMP)의 양을 측정하기 위하여 영하 80도의 보관 튜브를 꺼내어 얼음에 넣고 천천히 녹였다. 이 중 200 ul를 파이펫으로 흡입하여 1.5 ml 튜브에 옮겨 담았다. 그리고 37℃의 따뜻한 물에 넣어 1시간 동안 보관하였다. 또한, 키트 내에서의 양성 대조군으로 사용될 재조합 MMP-3를 X50, X100, X200, X400, X800배 희석하여 37℃에 15분 넣어 둔 후, APMA(aminophenylmercuric acetate)를 넣어 불활성 상태의 MMP-3를 활성 상태로 바꾸어 주고 1시간 동안 더 놓아두었다. 그동안 기질 금속 단백질 분해효소 특이적 나노프로브가 도포되어 있는 키트는 0.5% 보바인 세럼 알부민을 넣어 비 특이적 반응의 일어나지 않도록 1시간 동안 상온에서 교반하며 두었다. 1시간 후, 혈액 샘플을 키트에 150 ul넣고, 37℃에서 8시간 놓아두었다. 이때 온도에 의해 키트 내의 샘플이 증발할 여지가 있으므로 옆 부분을 꽉 막아서 넣어두었다. 8시간 후, 광학영상 장비를 이용하여 키트 내의 형광 증가량을 측정하여 수치화하고, 이미지 사진을 찍어둔 후, 환자의 정보와 비교하여 데이터를 처리하였다.
그 결과 정상인의 검체에 비해 류마티스 관절염의 증상이 심할수록 형광 복원량이 증가는 하는 것을 확인할 수 있었다(도 8). 이러한 결과로 보아 류마티스 관절염의 조기 진단이 가능할 것으로 보이며, 또한 병의 진행정도를 실시간으로 모니터링 할 수 있을 것이라 생각된다.
실시예
9.
유세포
분석기를 이용한 혈액 내의
MMP
-3 발현량 측정 (도 9)
본 발명의 혈액 증폭 방법 및 인 비보 진단 키트의 임상적 가치를 확인하기 위하여, 현재 이상에서 사용되는 유세포 분석기를 사용하여 MMP-3의 발현량을 확인해 보았다. 소듐 시트레이트 튜브(BD vacutainer)에 혈액을 3 ml 뽑아 올라오는 즉시 CBC(complete blood count)를 찍은 후, 화학 물질을 처리하였다. 24 웰 세포 배양 플레이트에 500 ul의 전혈을 넣은 후, PMA 90 ng을 넣어준 뒤 3시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 넣어두었다. 3시간이 지난 뒤 Brefeldin A(SIGMA)를 200 ug/ml 넣고 다시 6시간을 37℃, 5% CO2 인큐베이션하였다. 총 9시간이 지난 뒤, 50 ul의 혈액을 따서 2개의 튜브에 각각 넣고, CD45-PC5 10 ul와 CD14-FITC 10 ul를 각각 넣고 섞어준 뒤, 15분간 실온 암실에 방치해 두었다. RBC 라이시스 완충액(Bechman coulter) 100 ul를 넣고 볼텍스로 섞어주고 실온에서 15분간 암실 방치해 두었다. 그 뒤 PBS를 4 ml 넣고 2000 g, 5분, 4℃의 조건으로 원심 분리하여 상층액을 제거하였다. 이때, 파이펫으로 따서 버리는게 아니라 자연스럽게 따라 버리는 과정으로 세포의 유실을 줄였다. 남아있는 세포에 0.1% 사포닌을 100 ul 넣어준 뒤 파이펫으로 부드럽게 섞어 주고 실온에서 5분간 암실 방치해 두었다. 그 후 대조군에는 IgG1-PE를 10 ul, 비교군에는 MMP-3-PE를 10 ul넣어주고 15분간 암실 방치해 두었다. 15분이 지난 뒤, PBS 4ml를 넣고, 2000g, 5분, 4℃의 조건으로 원심 분리하여 상층액을 제거하였다. 그 다음, 새로운 PBS 500ul를 넣고 FACS를 찍은 후 그 결과를 도 9의 그래프에 표시하였다.
도 9의 그래프에 나타난 데이터를 표로 정리하면 다음과 같다.
-Normal :정상인
-RA(S): 환자 중증도 상 (Severe)
-RA(R): 환자 약물 치료 후 활성도 감소
-RA(mi): 환자 중증도 하 (mild)
실험 결과, 정상인의 검체에 비해 류마티스 관절염의 증상이 심할수록 MMP-3의 발현량이 증가하여, 본 발명의 인 비보 진단 키트를 사용한 실시예 7에서의 결과와 일치한다는 것을 확인할 수 있었다.
Claims (12)
- LPS(Lipopolysacharide), PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate), TNF-α(Tumor necrosis factor-alpha), IL-1β(interleukin-1β) 및 GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)로 이루어진 군으로부터 일 이상 선택되는 혈액 자극 물질을 포함하는, 자가면역질환 진단을 위한 혈액 처리용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 혈액 중 기질 금속 단백질 분해효소(Matrix metalloproteinase, MMP)의 발현량의 차이를 극대화시키는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 자가면역질환은 골관절염 또는 류마티스 관절염인 것인 조성물.
- (i) 제1항에 따른 조성물 및 (ii) 형광체-펩타이드-소광체를 포함하는 복합체로 코팅된 키트를 포함하는 자가면역질환 진단용 키트 세트로서, 상기 펩타이드는 기질 금속 단백질 분해효소(Matrix metalloproteinase, MMP)에 의하여 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질인 것을 특징으로 하는 자가면역질환 진단용 키트 세트.
- 제4항에 있어서, 상기 형광체는 시아닌, 플루오레신, 테트라메틸로드아민, 알렉사 및 보디피로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 자가면역질환 진단용 키트 세트.
- 제4항에 있어서, 상기 소광체는 블랙홀 소광체(blackhole quencher) 또는 블랙베리 소광체(blackberry quencher)인 것인 자가면역질환 진단용 키트 세트.
- 제4항에 있어서, 상기 복합체는 상기 펩타이드와 결합되어 있는 고분자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 자가면역질환 진단용 키트 세트.
- 제7항에 있어서, 상기 고분자는 키토산, 덱스트란, 히알루론산, 폴리아미노산 및 헤파린으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 자가면역질환 진단용 키트 세트.
- LPS(Lipopolysacharide), PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate), TNF-α(Tumor necrosis factor), IL-1β(interleukin-1β) 및 GM-CSF (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 물질로 혈액을 자극하여, 기질 금속 단백질 분해효소(Matrix metalloproteinase)의 발현량의 차이를 극대화시키는 혈액 처리 방법.
- (i) 제1항에 따른 조성물을 사용하여 혈액을 처리하는 단계 및
(ii) 상기 처리된 혈액을 형광체-펩타이드-소광체를 포함하는 복합체로 코팅된 키트에 적용시키는 단계를 포함하는, 혈액 중 존재하는 기질 금속 단백질 분해효소를 정량화 또는 영상화하는 방법으로서,
상기 펩타이드는 기질 금속 단백질 분해효소(Matrix metalloproteinase, MMP)에 의하여 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 방법은 자가면역질환 진단을 위한 정보를 제공하기 위하여, 혈액 중 존재하는 기질 금속 단백질 분해효소를 정량화 또는 영상화하는 것인 방법.
- (i) 제1항에 따른 조성물을 사용하여 혈액을 처리하는 단계 및
(ii) 상기 처리된 혈액 중에 존재하는 기질 금속 단백질 분해효소를 유세포 분석기를 사용하여 정량화하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 자가면역질환 진단을 위한 정보를 제공하기 위하여 혈액 중 존재하는 기질 금속 단백질 분해효소를 정량화하는 방법.
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