KR101503323B1 - 나노프로브를 이용한 자가면역질환 진단용 말초 혈액 세포 내 활성 기질 금속 단백질 분해효소의 정량화 방법 - Google Patents

나노프로브를 이용한 자가면역질환 진단용 말초 혈액 세포 내 활성 기질 금속 단백질 분해효소의 정량화 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자가면역질환의 진단을 위한 정보를 제공하기 위하여, 말초 혈액 세포를 자극하고 단백질 분비를 억제시켜, 형광체, MMP 특이적 펩타이드 기질, 소광체 및 고분자를 포함하는 MMP 특이적 나노프로브로 상기 말초 혈액 세포를 표지한 후 유세포 분석기를 사용하여 활성화된 MMP의 양을 정량화하는 방법에 관한 것이다.

Description

나노프로브를 이용한 자가면역질환 진단용 말초 혈액 세포 내 활성 기질 금속 단백질 분해효소의 정량화 방법{Method for quantifying Matrix metalloproteinases in peripheral blood cell using nanoprobe for diagnosing autoimmune diseases}
본 발명은 자가면역질환의 진단을 위한 정보를 제공하기 위하여, 말초 혈액 세포 중의 활성화된 기질 금속 단백질 분해효소 (Matrix metalloproteinase, MMP)를 정량화하는 방법에 관한 것이다.
류마티스 관절염은 현재까지 정확한 원인이 밝혀지지 않은 자가면역성 질환으로 관절 활막에 염증을 유발하여 손가락, 발가락 등의 작은 관절부터 팔꿈치, 어깨, 무릎, 고관절에 이르는 큰 관절까지 파괴되어 결국 운동 장애와 관절 변형을 가져올 뿐 아니라 다양한 종류의 장기침범을 가져오는 전신질환이며, 초기 진단이 지연되거나 조기치료 실패시 대부분 비가역적인 만성질환으로 이환되어 이로 인해 직업을 잃거나 수명이 단축되는 등 삶의 질에 크나큰 손실을 미치게 되는 질병이다.
현재 임상에서 사용되고 있는 1987년 미국 류마티스 학회 (ACR)의 류마티스 관절염 진단에는 생물학 표지자 중에서 류마티스인자 (rheumatoid factor;RF)만이 유일한 기준에 포함되어 있으나 RF는 진단의 특이도가 낮아 조기 진단에 도움을 주기보다는 진단을 모호하게 만드는 경우가 종종 있어 임상적으로 확진의 보조적 수단으로 한계가 있다.
류마티스 관절염은 조기에 적극적 치료를 시작하면 관절통이나 관절 강직이 호전되며 치료 반응이 좋을 경우 삶의 질이 개선되고 방사선학적 골 파괴 및 심각한 신체 장애와 수명 단축을 예방 또는 지연시킬 수 있다. 질병 치료 효과를 모니터링 하기 위해 현재 사용하고 있는 적혈구 침강속도 (erythrocyte sedimentation rate;ESR)나 C-반응 단백 (C-reactive protein;CRP) 방법은 관절의 특이 물질이 아닌 전신 질환 혹은 염증 상태에서 비특이적으로 반응하는 한계점이 있어 특이적 검사 지표로서 그 활용에 한계가 있다.
류마티스 관절염의 혈청학적 조기 진단을 위해 최근 개발되어 임상 적용 가능성이 제기되고 있는 항핵주위인자, 항케라틴항체, 항RA33, 항Sa항체 등의 검사들은 RF와 같은 기존 검사보다 특이도는 향상되고 있으나 질병에 대한 민감도가 떨어지고 검사과정이 복잡하기 때문에 임상에서 널리 사용되지 않고 있다. 2010년 개정된 미국 류마티스 학회 류마티스 관절염 진단 기준에 포함된 생물학적 표지자인 항고리 시트룰린 항체 (Anti-CCP) 또한 특이도는 높지만 민감도는 낮아 환자 진단을 놓칠 가능성이 제시되었고, 항 CCP농도와 질병 활성도 간의 상관관계가 뚜렷하지 않은 것으로 밝혀져 치료반응을 모니터링 하는 데는 미흡하다는 단점이 있다.
상기 미흡한 점을 보충하기 위한 다른 생물학적 표지자 후보로 대두되고 있는 기질 금속 단백질 분해효소는 활막에서 직접적으로 생성되므로 류마티스 관절 파괴에 관여하는 중요한 효소 중에 하나라는 장점이 있어 조기 진단 뿐만 아니라 치료 효과를 모니터링 하는데 큰 역할을 할 것으로 기대되어 기질 금속 단백질 분해효소 발현과 류마티스 관절염 진행의 상관성에 대한 연구가 광범위하게 이루어져 왔다.
한편, 류마티스 관절염 환자의 활막세포 혹은 활막에 발현되어 있는 기질 금속 단백질 분해효소를 조사하여 질병 발생에 있어서 기질 금속 단백질 분해효소의 중요성은 밝혀져 있으나, 말초 혈액 세포의 기질 금속 단백질 분해효소 생산 잠재력에 대한 연구는 거의 발표된 바 없다. 류마티스 관절염 환자와 정상인의 혈액 세포 내의 기질 금속 단백질 분해효소 농도와 치료 후의 기질 금속 단백질 분해효소 발현 양의 변화를 연구한 자료는 있으나 일관성이 낮으며 관절염 치료 반응에 대한 예측검사 연구는 전혀 되어 있지 않다.
등록특허 제10-1103548호는 형광체, 소광체, 기질 금속 단백질 분해효소에 의하여 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질 및 생체 적합성 고분자로 이루어진 기질 금속 단백질 분해효소의 활성 측정용 나노입자 센서를 기술하고 있는데, 이는 상기 나노입자 센서를 혈관에 투입하여, 조직 내부에서의 기질 금속 단백질 분해효소의 발현 정도를 영상화하는 기술에 관한 것으로서, 환자의 말초 혈액 세포 내에 존재하는 금속 단백질 분해효소를 포획하여 유세포 분석을 통하여 정량화하는 하는 기술과는 차이가 있다. 이와 같이, 현재까지의 나노영상 프로브는 In vivo 이미징과 In vitro 상에서의 세포내 유입을 현미경으로 관찰하여 보여주는 방법으로 사용되었다.
특히 유세포 분석 방법과 연관하여, 현재 임상에서 사용되고 있는 유세포 분석 기술은 특정 세포의 세포 표면 특이적 마커의 항체를 이용한 분석 방법이며, 항체의 리간드와의 높은 결합성과 특이성을 이용하여 시행되어 백혈병이나 에이즈 환자의 세포를 이용한 치료 효과 확인이나 질병 판정에 사용되고 있다. 그러나, 유세포 분석법으로 세포 내에서 생성되어 세포 밖으로 배출되는 물질을 분석한 경우는 미미한 상태이다. 류마티스 관절염의 초기 단계에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있는 기질 금속 단백질 분해효소의 경우 위와 같은 연구는 시도조차 되지 않았으며, 이를 밖으로 배출되지 않도록 캡쳐하는 기능도 연구되어 있지 않다.
한편, 거의 대부분의 관절염 진행에 따른 기질 금속 단백질 분해효소 발현의 변화를 연구한 자료는 체내 생산 및 분비되는 활성 및 비활성 상태의 기질 단백질 분해효소를 모두 정량한 비특이적 검사 결과여서 류마티스 관절염 중증도에 직접적인 영향을 미치는 활성화 기질 금속 단백질 분해효소만을 정량적으로 분석할 수 있는 검사 기술의 개발이 필요한 실정이다.
결론적으로, 자가면역질환 진단을 위하여 기질 금속 단백질 분해효소의 포획 기술과 이를 정량할 수 있는 기술, 특히 유세포 분석을 활용하여 혈액 세포 내에서 활성화된 상태의 기질 금속 단백질 분해효소만을 정량하여 환자의 중증도별 분석이 가능한 기술을 제시하여야 할 필요가 있다.
1. 2012년 대한민국 특허출원 제0090911호 2. 2009년 대한민국 특허출원 제0096373호
본 발명자들은 환자의 말초 혈액을 이용한 자가면역질환 진단 기술의 개발을 위하여 예의 연구 노력하였고, 그 결과 초기 류마티스 관절염의 표지자로서 기질 금속 단백질 분해효소가 중요한 역할을 하고, 상기 기질 금속 단백질 분해효소를 생산하는 말초 혈액 세포 내에서 이들의 발현량은 류마티스 관절염 환자와 정상인 사이에서 차이를 보인다는 점에 착안하여, 적정 화학 자극을 통하여 말초 혈액 세포 내 기질 금속 단백질 효소의 발현량의 차이를 증폭시키는 방법을 개발하였으며, 더 나아가 세포 밖으로 분비되는 기질 금속 단백질 분해효소를 세포 내에 포획시키고, MMP 특이적 나노프로브를 항체 대용으로 이용함으로써, 활성 상태의 MMP만을 정량할 수 있는 유세포 분석 방법을 개발해 냄으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
또한, 본 발명은 기존의 항체를 이용한 유세포 분석법을 대체하기 위한 것으로, 나노입자 기반 MMP 특이적 나노프로브를 이용하여 류마티스 관절염 환자의 말초 혈액 세포에서 활성화되는 MMP를 실시간 유세포 분석법으로 정량하고, 이를 통하여 세포내의 활성 상태 기질 금속 단백질 분해효소의 정확한 양을 확인하여 환자 상태를 모니터링 하는데 도움을 주는 동시에 비용의 단축과 정확한 질병 활성도 평가 및 치료 반응 평가에 응용하기 위한 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 자가면역질환의 진단을 위한 정보를 제공하기 위하여, 말초 혈액 세포를 자극하여 생성되는 단백질의 분비를 억제시켜, 형광체, MMP 특이적 펩타이드 기질, 소광체 및 고분자를 포함하는 MMP 특이적 나노프로브로 상기 말초 혈액 세포를 표지한 후 유세포 분석기를 사용하여 활성화된 MMP의 양을 정량화하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 관점은 자가면역질환의 진단을 위한 정보를 제공하기 위하여 (i) 말초 혈액 세포를 자극하고, 말초 혈액 세포의 단백질 분비를 억제시키는 단계와 (ii) 하기 구조식 1의 MMP 특이적 나노프로브로 상기 말초 혈액 세포를 표지하는 단계 및 (iii) 유세포 분석기를 사용하여 활성화된 MMP의 양을 정량화하는 단계를 포함하는, 말초 혈액 세포 중의 활성화된 MMP를 정량화하는 방법을 제공하는 것이다.
[구조식 1]
Figure 112013027827194-pat00001

여기서, 상기 (A)는 형광체이고, 상기 (B)는 MMP에 의하여 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질이고, 상기 (C)는 소광체이며, 상기 (D)는 고분자이다.
여기서, 상기 형광체 및 상기 소광체는 상기 펩타이드 기질의 아미노 말단, 라이신, 시스테인, 또는 카르복실산에 결합 될 수 있고, 고분자는 상기 펩타이드 기질의 C 말단의 카르복실산 또는 시스테인의 -SH기와 결합될 수 있다.
상기 형광체 (A)와 소광체 (C) 사이의 거리는 형광체와 소광체 사이에서 발생하는 소광 효과를 최대화하여, 형광체의 형광이 최소화될 수 있게 조절한다. 형광체와 소광체 사이의 거리를 수십 나노미터 이내로 유지시킴으로써 발생하는 소광 효과에 의해서 형광체의 형광 세기가 최소가 되게 합성하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 제조된 MMP 특이적 나노프로브는, 형광체, 소광체, 및 펩타이드 기질을 쉽게 변경하고 제어 할 수 있기 때문에, 다양한 MMP 측정용 나노프로브를 설계할 수 있다.
유세포 분석용 염색을 위한 MMP 특이적 나노프로브의 적정 농도는 10 nM, 20 nM, 50 nM, 100 nM일 수 있다. 상기 적정 농도는 MMP특이적 나노프로브를 실험군으로 설정하는 경우 소광체를 포함하지 않은 대조군 프로브와의 비교를 위하여 적의 선택될 수 있으며, 대조군 프로브와 비교하여 초기 형광량이 비슷한 수준으로 선택할 수 있다.
유세포 분석용 염색을 위한 기질 금속 단백질 분해효소 나노프로브의 적정 염색 시간은 15분, 30분, 45분, 1시간일 수 있고, 좋기로는 30분일 수 있다. 본 발명의 나노프로브에 세포 독성이 없다는 것은 밝혀져 있으나 세포를 오래 방치하면 상태가 나빠질 수 있으므로 상기 적정 염색 시간은 환자의 중증도와 정상인과의 차이를 세포의 손상없이 보여주기 위한 적정 시간일 수 있다.
상기 방법은 활성화 상태의 MMP만을 정량화할 수 있는 것이고, 그 결과 질병의 중증도에 영향을 미치는 활성화된 인자만을 선택적으로 파악할 수 있다는 이점을 갖는 방법일 수 있다. 상기 방법은 활성화 상태의 MMP의 양에 따라 형광의 밝기가 조절되는 것일 수 있다.
류마티스 관절염 환자 말초 혈액 세포 내의 MMP는 물질 특성상 세포 외부로 분비되는 성질이 있어 이를 세포 내부에 잡아둘 수 있는 화학 물질을 찾아야 할 필요가 있다. 또한 세포 사멸 등 부작용이 없는 상기 화학 물질의 적정 처리 농도 조건을 수립하여야 한다.
상기 단계 (i)의 말초 혈액 세포 자극은 LPS (Lipopolysacharide), PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate), TNF-α (Tumor necrosis factor), IL-1β (interleukin-1β) 및 GM-CSF (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상으로 말초 혈액 세포를 처리하는 것에 의하여 수행되는 것일 수 있다. 혈액 세포를 상기 물질 중 1 이상으로 처리함으로써 관절염 환자와 정상인 사이의 MMP 발현량의 차이를 극대화시킬 수 있다.
상기 단계 (i)의 세포의 단백질 분비 억제는 브레펠딘 A (Brefeldin A) 모넨신 (monensin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상으로 처리하는 것에 의하여 수행되는 것일 수 있다.
상기 단계 (i)의 말초 혈액 세포 자극과 세포의 단백질 분비 억제는 동시에 수행되는 것일 수 있다.
상기 단계 (i)은 세포를 PMA 및 브레펠딘 A로 동시에 처리하는 것에 의하여 수행되는 것일 수 있다.
상기 PMA의 농도는 5 내지 100 ng/ml, 예컨대 100, 50, 25, 5 ng/ml이고, 상기 브레펠딘 A의 농도는 1 내지 50 ng/ml, 예컨대 50, 25, 5, 1 ng/ml일 수 있다. 좋기로는, 세포 독성이 최소화 되는 농도로서, 상기 단계 (i)은 세포를 50 ng/ml의 PMA 및 25 ng/ml의 브레펠딘 A로 처리하여 MMP를 세포 내에 포획함으로써 수행되는 것일 수 있다.
상기 포획 과정은 1~9 시간 동안, 예컨대 1,2,3,6 및9 시간 동안 수행될 수 있다.
좋기로는, 상기 포획 과정은 단백질 포획의 효율성이 가장 우수한 6 시간 동안 수행될 수 있다.
상기 MMP는 인테그린 (integrin) 신호 전달과 세포주위 기질 (pericellular matrix)의 분해에 따른 세포 운동에 관련된, 아연 의존성 엔도펩티다제로서, 예컨대, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7 내지 MMP-21, MMP-22, MMP-23A, MMP-23B, MMP-24 내지 MMP-28 중에서 선택되는 일 이상일 수 있다.
좋기로는, MMP는 MMP-3일 수 있다.
상기 말초 혈액 세포는 호산구 (eosinophil), 호염기구 (basophil), 호중구 (neutrophil), 림프구 (lymphocyte) 및 단핵구 (monocyte)를 포함하는 백혈구 (leukocytes)일 수 있다.
본 발명의 방법은 자가면역질환을 진단하거나 그 질환의 활성도를 변별하기 위하여 사용될 수 있고, 상기 자가면역질환은 골관절염 또는 류마티스 관절염일 수 있다.
상기 단계 (ii)의 세포 표지는 상기 MMP 특이적 나노프로브를 상기 말초 혈액 세포 속으로 유입시키는 것에 의하여 수행되는 것일 수 있다.
상기 목적을 수행하기 위하여 본 발명에서는 나노입자 기반 MMP 특이적 나노프로브를 류마티스 관절염 환자의 말초 혈액 세포에 침투시켜 유세포 분석을 수행할 수 있다.
말초 혈액을 이용한 자가면역질환 진단이라는 목적을 수행하기 위하여, 본 발명에서는 상술한 바와 같이 적정 자극으로 혈액 세포 내에서 MMP를 자극, 분비 억제하여 포획한 후, 대상 MMP에 특이적으로 작용하는 나노프로브로 표지하여 유세포 분석 방법을 통하여 MMP를 정량하고, 자가면역질환의 질병 진행도를 모니터링 할 수 있다.
본 발명은 MMP 특이적 나노프로브를 항체 대신 이용하여, 기존에 나와 있는 FLS 특이적 항체를 이용한 질병 구별 및 활성도 측정과는 달리 MMP의 발현량에 따른 세포 내부의 형광 복원률 차이를 유세포 분석 방법으로 측정하여 질병 활성도의 모니터링 및 정량이 가능한　원천 기술을 개발한 것이다.
기존 기술은 형광 입자에 세포 표면 특이적 마커의 항체를 올리고뉴클레오타이드 링커를 이용하여 부착, 분석이 가능하도록 하는 반면, 본 발명은 나노프로브를 직접적으로 세포에 유입시켜 활성화 상태의 MMP의 양에 따라 형광의 밝기가 조절되는 점을 이용하여 정량하는 기술에 해당한다. 따라서, 본 발명은 리간드-리셉터 반응에 의해 결합하는 기존의 세포 표면 연구와는 달리 나노프로브의 세포내 유입 후, 포획된 상태의 MMP의 양에 따른 형광 복원률을 이용하므로, 질병에 영향을 미치는 주요 인자의 활성도를 세포 수준에서 파악할 수 있다. 본 발명은 항체를 사용하지 않는 유세포 분석 방법이며, 세포를 깨지 않고 세포성을 유지한 상태에서 유세포 분석을 진행할 수 있는 단백질 정량 방법이다. 또한, 종래에는 자이모그라피의 특성상 전기영동 중 상당 부분이 열에 의해 변성되므로 활성 및 비활성 상태의 MMP의 양을 분리하여 비교하기 어려우나, 본 발명은 전술한 바와 같이 세포성 유지, 즉 세포의 구조를 유지하면서 나노프로브를 유입하여 활성화 MMP에 의하여 형광이 복원되면 그 양을 유세포 분석을 통하여 측정할 수 있으므로 활성 MMP만의 정확한 정량 결과를 얻을 수 있는 장점을 갖고 있다.
본 발명에 이용되는 MMP특이적 나노프로브는 MMP의 기질로 알려진 아미노산 염기서열을 이용해 제작한 펩타이드를 골격으로 하는 형광체-펩타이드-소광체 단위를 포함하는 것으로서, 상기 펩타이드가 MMP에 의하여 특이적으로 분해되는 경우, 형광체가 소광체로부터 분리되어 형광을 발하게 된다.
상기 형광체는 플루오레신 (fluorescein), 보디피 (BODYPY), 테트라메틸로드아민 (Trtramethylrhodamine), 알렉사 (Alexa), 시아닌 (Cyanine), 알로피코시아닌 (allopicocyanine), 기타의 형광을 발생시키는 형광체 또는 이들의 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다. 또한, 양자 수득량 (quantaum yield)이 높은 형광체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 형광체는 이중 근적외선 빛을 방출 및 흡수하여 세포, 혈액 및 생체 조직 등과 간섭 또는 흡수가 최소화되는 시아닌계 Cy 5.5 (Ex/Em 670/690)일 수 있다.
상기 소광체 (C)는 형광체가 결합된 펩타이드 기질에 화학적으로 결합되는 것으로서, 소광체는 형광체가 발산하는 파장의 빛을 흡수하여 강한 소광 효과 (quenching effect)를 이룸으로써, 펩타이드가 특정 단백질 분해효소에 의해 분해되지 않으면 형광이 발광되지 않으며, 이러한 소광 효과는 형광체와 소광체의 거리가 수십 nm 이내에 있을 경우에 나타난다. 다시 말해, 특정 단백질 분해효소와 반응하여 펩타이드 기질이 분해되면 펩타이드에 결합된 형광체와 소광체가 서로 분리되어 멀어지면서 소광 효과가 없어지고, 이에 따라 형광체 고유의 형광을 발광하여 특정 단백질 분해효소의 정성 및 정량적 분석이 가능하게 된다.
본 발명에서 소광체는, 형광체에서 나오는 빛의 파장을 흡수하여 소광 효과를 최대화할 수 있는 것으로, 형광체의 발광 파장과 같거나 거의 유사한 파장대의 소광체를 사용하여야 소광 효과를 극대화할 수 있기 때문에, 형광체의 발광 파장의 범위에 따라 사용되는 소광체의 종류가 달라진다. 형광체로서 Cy5.5를 사용하는 경우에는 그것의 형광대와 비슷한 BHQ-3 (abs. 620 nm - 730 nm)를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명에 있어서 소광체는, 여기된 (excited) 형광체의 에너지를 흡수하지만 형광 에너지를 밖으로 방출하지 않으므로 형광체의 형광을 소광시킬 수 있는 물질인 'dark quencher'로서, 상업적으로 널리 상용화되어 있는 블랙홀 소광체 (black hole quenchers) (BHQ, WO01/86001, Biosearch Technologies, Inc. Novato, CA, USA) 및 블랙베리 소광체 (blackberry quencher) (Berry & Associates Inc. Dexter, MI, USA)로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 MMP 특이적 나노프로브는 MMP의 기질 펩타이드와 결합되어 있는 고분자를 포함하는데, 이는 고분자 상에 다수의 복합체를 연결시킨 후 이를 유세포 분석용 나노프로브로 사용하는 것이 형광/소광 효과를 이용한 MMP 정량 효과를 극대화 시킬 수 있고, MMP가 세포내로 유입된 후 세포 밖으로 분비되는 비율을 낮추면서 가능한 최대수의 MMP를 포획하기 위한 방편으로 고분자의 크기를 이용하기 위함이다.
상기 고분자는 키토산 (chitosan), 글리콜 키토산, 덱스트란, 히알루론산, 폴리아미노산 및 헤파린으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 고분자는 친수성 키토산일 수 있으며, 분자량 103 내지 106 인 모든 종류의 키토산, 특히, 천연 고분자인 수용성 키토산, 보다 바람직하게는 글리콜 (glycol)기가 도입되어 수용성이 증대된 글리콜 키토산을 사용할 수 있다.
상기 MMP에 의하여 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질로는 MMP의 종류에 따라 적당한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 MMP-2, MMP-3, MMP-9 또는 MMP-13의 정량화를 위해서는 아미노산 서열 Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Lys-Gly-Gly을 포함하는 펩타이드 기질을, MMP-3, MMP-7 또는 MMP-13의 정량화를 위해서는 아미노산 서열 Gly-Val-Pro-Leu-Ser-Leu-Thr-Met-Gly-Lys-Gly-Gly을 포함하는 펩타이드 기질을 사용할 수 있다. 또한, MMP-2, MMP-3 또는 MMP-13의 정량화를 위해서는 아미노산 서열 Gly-Pro-Leu-Gly-Met-Arg-Gly-Leu-Gly-Lys-Gly-Gly을 사용할 수 있다.
예컨대, 아미노산 서열 Gly-Val-Pro-Leu-Ser-Leu-Thr-Met-Gly-Lys-Gly-Gly을 포함하는 펩타이드 기질을 포함하는 MMP 특이적 나노프로브를 사용하는 경우, 여러 MMP 아형 중에서, MMP-3, MMP-7 또는 MMP-13과의 반응에 의해 각각 45배, 15배, 4.5배 높은 형광 복원율을 나타내며, 특히 MMP-3에 대하여 현저한 특이성을 확인할 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 MMP 특이적 나노프로브는 MMP의 농도에 비례하여 증가하는 형광 발현을 나타내므로, 혈액 세포 내의 특정 MMP 효소를 정량적으로 분석하여 류마티스 관절염의 진행 활성화 정도에 대한 모니터링을 가능하게 한다.
본 발명의 일 구체예 나노프로브에 있어서, 상기 펩타이드 (B)는 자가면역질환에서 과다 발현되는 다양한 MMP에 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질이고, 형광체 (A)는 상기 펩타이드의 아미노 말단에 결합되어 근적외선 형광을 나타내는 시아닌 형광체인 Cy5.5이며, 소광체 (C)는 상기 펩타이드의 라이신, 시스테인 등과 결합되어 상기 형광체의 형광을 흡수하여 소광효과를 극대화시킬 수 있는 BHQ-3 (black hole quencher-3)일 수 있다. 또한, 고분자 (D)는 상기 펩타이드 (B)의 C 터미널 말단 부분의 카르복실산 또는 시스테인의 -SH 부분과 화학적으로 결합 할 수 있는 글리콜 키토산일 수 있다. 일반적으로, 고분자는 펩타이드의 C 터미널 (카르복실산), N 터미널 (아민), 라이신의 아민, 시스테인의 -SH 등의 부분과 화학적으로 결합할 수 있다.
본 발명은 MMP 특이적 나노프로브를 이용하여 세포내의 MMP를 유세포 분석기로 측정하는 기술을 위한 시스템을 개발한 것이다. 임상에서는 본래 항체를 이용한 유세포 분석법이 시행되어 일부 질병 판정에 사용하고 있으나, 세포 밖으로 배출되는 특히, MMP와 같은 물질을 분석한 경우 또는 이들에 대하여 항체 이외의 나노프로브를 이용하여 유세포 분석을 시도한 예는 없었다. 본 발명은 세포 내에서 발현되는 MMP와 같은 물질을 정량하기 위한 충분 요건으로서 대상 물질의 포획 기술을 개발한 것이다. 더 나아가 종래 기술에서처럼 항체를 이용하여 유세포 분석하는 것이 아닌, 세포 내에 유입시킨 나노프로브를 이용하여 세포 구조를 유지한 상태에서 활성화 상태의 MMP만 정량화할 수 있는 기술을 개발한 것으로서, 환자의 상태에 따른 정확한 분석이 가능하도록 한 것으로서 괄목할 만한 것이다. 이와 같은 기술을 이용하여 류마티스 관절염 환자의 중증도에 따른 MMP의 활성화 양상을 비교한다면, MMP가 류마티스 관절염 초기에 중요 인자로 작용 한다는 연구 결과를 바탕으로 위 물질을 막을 수 있는 약물을 개발하는데 이용 가능할 것으로 여겨진다.
현재까지 류마티스 관절염 환자의 혈액을 이용한 진단 검사 의학 결과는 비활성화 및 활성화 된 MMP를 구분하지 못하였고, 이로 인해 질병의 중증도에 영향을 미치는 인자의 활성화 정도를 파악하기 어려웠다. 본 발명은 말초 혈액 세포 내에서 활성화 된 MMP를 정량할 수 있도록 하여 질병 중증도별 모니터링 및 진단 정확도 향상이 가능할 것이다.
본 발명은 나노입자 기반 MMP특이적 나노프로브를 이용하여 류마티스 관절염 환자 말초 혈액 세포에서 활성화되는 MMP를 실시간 유세포 분석법으로 정확히 정량하여 환자 상태를 모니터링 하는데 매우 효율적인 기술일 수 있다.
본 발명의 방법에 의하여 항체를 이용하는 기존의 유세포 분석법은 대체될 수 있을 것으로 판단되며, 비용의 단축은 물론 더욱 정확한 질병 활성도 평가 및 치료 반응 평가가 가능할 것이다. 본 발명에 기반하면 세포 내부의 염증 유발성 활성화 MMP만을 정량할 수 있으므로 류마티스 관절염 환자의 임상 혈액 진단법에 또 하나의 대안이 될 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 기질 금속 단백질 분해효소 (MMP-3) 특이적 나노프로브의 구성 모식도를 나타낸 것이다.　
도 2는 MMP 특이적 나노프로브에 대한 대조군의 구성 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 MMP의 세포 내 포획을 웨스턴 블랏을 통하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 유세포 분석을 위한 세포 표지 방법을 나타낸 것으로,
(a) 종래 항체를 이용하는 유세포 분석용 세포 염색법
(b) 본 발명의 MMP 특이적 나노프로브를 이용하는 유세포 분석용 세포 표지법을 나타낸다.
도 5는 기질 금속 단백질 분해효소 (MMP-3)에 대한 항체의 세포내 유입 후의 위치를 나타낸 것이고;
도 6은 본 발명의 기질 금속 단백질 분해효소 (MMP-3) 특이적 나노프로브의 세포내 유입 후의 위치를 나타낸 것이다.
도 7은 항체를 이용한 정상인/류마티스 관절염 환자 혈액 세포의 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 기질 금속 단백질 분해효소 (MMP-3) 특이적 나노프로브를 이용한 정상인/류마티스 관절염 환자 혈액 세포의 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
실시예 1. MMP 특이적 나노프로브의 제조
1-1. 형광체-펩타이드-소광체 유도체 (MMP 특이적 프로브)의 제조
형광체로는 Cy5.5 (ex/em, 670/690)을 사용하였고, Cy5.5 형광체의 형광을 소광시킬 수 있는 소광체로 BHQ-3 (abs. 620 nm - 730 nm)를 사용하였다.
MMPs 단백질 효소에 선택적으로 분해되는 펩타이드 기질로는 NH2-Gly-Val-Pro-Leu-Ser-Leu-Thr-Met-Gly-Lys(Boc)-Gly-Gly-COOH을 에프목 (Fmoc) 펩타이드 합성방법으로 제조하고, 펩타이드 기질 5 mg에 근적외선 형광체인 Cy5.5-HNS 에스터 8.5 ㎎, N-메틸모르폴린 8 μl, 4-디메틸아미노피리딘 0.3 mg을 200 μl의 디메틸포름아미드에 녹인 후 12 시간 상온에서 반응시켰다. 반응이 종료한 용액을 차가운 에틸 에테르 4 ml로 침전시키고 원심분리하여 상등액은 제거한 후 차가운 에틸 에테르 2 ml로 다시 세척하였다. 표면의 에틸 에테르를 제거한 후 스피드 베큠 (speed vacuum) 또는 진공 오븐 (vacuum oven)으로 건조시켜 Cy5.5-Gly-Val-Pro-Leu-Ser-Leu-Thr-Met-Gly-Lys(Boc)-Gly-Gly-COOH 전구체를 제조하였다.
건조된 상기의 펩타이드 전구체의 보호기를 탈보호하기 위하여, 상기의 물질을 트리플로오로아세트산 1 ml, 증류수 25 μl, 아니솔 (Anisole) 25 μl를 넣어서 1 시간 동안 상온에서 반응시켰다. 로터리 펌프 (Rotary pump)를 이용하여 용액을 모두 제거한 후, 이를 HPLC 용리액 (eluent) (0.1% TFA이 있는 식염수:0.1% TFA가 있는 아세토니트릴 =1:1) 1 ml에 녹인 후, 필터 (0.45 μM, 유기용매 사용 가능한 필터)하였다. HPLC 용리액 (eluent) (0.1% TFA이 있는 식염수: 0.1% TFA이 있는 아세토니트릴 =1:1), 애질런트 (Agilent) ZORBAX SB-C18 컬럼 (9.4 x 150 mm)을 이용하여, 0.1% TFA이 있는 5% 아세토니트릴, 0.1% TFA이 있는 95% 식염수로 HPLC를 안정화시켰다. 20 분 동안 기울기 용리 (gradient elution) (0 분에 5%, 5 분에 22%, 20 분에 40% 아세토니트릴 (0.1% TFA이 있는) vs DW (0.1% TFA가 있는))을 통하여 물질을 분리시켰다. 이때, UV 220 nm, FLD ex: 675 nm em: 690 nm에서 측정한 후 Cy5.5-Gly-Val-Pro-Leu-Ser-Leu-Thr-Met-Gly-Lys-Gly-Gly-COOH 물질을 분리하였다. 분리한 물질을 분자량을 매스 (mass)를 사용하여 찍어 확인한 후 동결건조시켰다. 상기의 물질 2 ㎎에 BHQ3-NHS 에스터 (Biosearch Technologies Inc., 0.71 ㎎), NMM 1.5 μl, DMAP 0.2 mg를 30 μl DMSO에 녹여 상온에서 12 시간 반응시켰다. HPLC 용리액 (0.1% TFA이 있는 식염수 : 0.1% TFA가 있는 아세토니트릴 =1:1), 애질런트 (Agilent) ZORBAX SB-C18 컬럼 (9.4 x 150 mm)을 이용하여, 0.1% TFA가 있는 5% 아세토니트릴, 0.1% TFA가 있는 95% 식염수로 HPLC를 안정화시켰다. 25분 동안 기울기 용리 (gradient elution) (0분에 5%, 5분에 30%, 25분에 70% 아세토니트릴 (0.1% TFA 있는)vs 0.1% TFA가 있는 식염수)을 통하여 물질을 분리시켰다. 이때, UV 220 nm, FLD ex: 675 nm em: 690 nm에서 측정한 후 Cy5.5-Gly-Val-Pro-Leu-Ser-Leu-Thr-Met-Gly-Lys(BHQ3)-Gly-Gly-COOH 물질 (MMP 특이적 프로브)을 분리하였다. 분리한 물질을 분자량을 매스 (mass)를 사용하여 찍어 확인한 후 동결건조 시켰다.
1-2. MMP 특이적 나노프로브의 제조
상기 1-1에서 제조된 MMP 특이적 프로브 (형광체-펩타이드-소광체)를 고분자에 화학적으로 결합시켜 MMP 특이적 나노프로브를 제조하였다 (도 1).
구체적으로, 상기 1-1에서 제조된 MMP 특이적 프로브를 글리콜 키토산 (GC, 분자량 250,000 Da)에 결합시켰는데, 이는 세포 내 유입 후 MMP 특이적 프로브가 배출되는 비율을 감소시키기 위한 것이다.
GC 10 mg를 튜브에 담고 100 μl DMSO로 녹인 후 14 ml PBS (pH 7.4) 에 첨가한 후 소니케이터를 이용하여 완전히 분산시켰다. MMP 특이적 프로브를 100 μl DMSO로 녹인 후 100μl PBS (pH 6.0)를 첨가한 후 EDC (1 mg) 및 Sulfo-NHS (1 mg)를 첨가하여 상온에서 15 분 반응시켰다. 반응 종료 후 상기 용액을 GC 용액에 첨가한 후 상온에서 12 시간 반응시켰다. 반응 종료 후 증류수/MeOH (1:3) 용액에서 24 시간, 증류수/MeOH (1:1) 용액에서 24 시간 및 증류수 용액에서 24 시간 투석 (dialysis)한 후 동결건조시켰다.
실시예 2. 말초 혈액 세포 자극 및 혈액 세포 내 기질 금속 단백질 분해효소 포획
류마티스 관절염 환자 및 일반인 검체의 혈액을 EDTA 튜브에 수집하여 바로 처리하였다. 전혈 500 μl를 24웰-플레이트에 넣어, PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate)를 50 ng/ml, BFA (Brefeldin) 25 ng/ml 의 농도로 동시 처리한 후 37℃ 인큐베이터 내에서 6시간 정치하였다.
금속 단백질 분해효소의 포획 여부를 웨스턴 블랏을 이용하여 확인하였다 (도 3). 환자를 류마티스 관절염 중증 정도에 따라 세 가지 (Mild, Moderate, Severe)로 분류하였고, 일반인 검체는 N1, N2로 표기하였다. 도 3의 결과는 상기 조건으로 환자 및 일반인 검체의 혈액 시료를 처리하였을 때 금속 단백질 분해효소가 성공적으로 포획되었음을 보여주고 있다. 편차를 줄이기 위하여 환자 검체 20건, 정상 검체 10건, 각 검체당 n=3으로 실험을 진행하였다.
대조군으로서 BFA만을 처리하거나, PMA를 먼저 처리한 후 BFA를 처리하는 실험을 하였다. 이들 대조군에서는 금속 단백질 분해효소가 혈액 세포 내에 포획되지 않거나, 그 포획 정도가 현저히 낮았고, 오히려 금속 단백질 분해효소의 양이 더 줄어들었다. 특히 PMA를 먼저 4 시간 처리한 후 BFA를 넣어 2 시간 처리한 경우 세포의 파괴가 심하여 세포의 포퓰레이션을 구별하기가 힘들었다.
실시예 3. 항체 또는 실시예 1의 나노프로브를 이용한 유세포 분석용 염색
(1) 항체 염색
류마티스 관절염 환자와 정상인의 말초 혈액 세포 내의 포획된 기질 금속 단백질 분해효소 (MMP-3)의 양을 측정하기 위하여 실시예 1의 포획 조건으로 처리한 50 μl의 혈액을 각각 따내어 유세포 분석기용 튜브에 담은 후, 백혈구 세포의 표면 마커인 Anti-CD45-PC5와 호중구 세포 표면 마커인 Anti-CD16b-FITC를 10 μl씩 넣어주고 15분간 암실에서 정치하였다. 그 후, Beckman coulter사의 IntraPrep㎛TM제품의 Reagent 1을 100 μl 넣어주고 잘 섞어준 후, 15분간 암실에서 정치하여 세포를 고정시켰다. 유세포 분석기용 튜브에 4 ml의 생리 식염수를 넣고, 2000 rpm에서 5분간 원심분리 하고, 상층액을 살짝 거두어 버린 뒤, Reagent 2를 100 μl 넣고, 암실에서 5분간 세포 표면에 구멍을 뚫어주는 작업 (permiabilization)을 하였다. 실험군에 Anti-MMP-3-PE (R&D systems)를 10 μl, 대조군에 Anti-IgG1-PE (R&D systems)를 10 μl를 넣어준 후, 튜브를 암실에서 15분을 정치하여 두고, 생리식염수 4 ml를 넣어 잘 섞은 뒤 2000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 생리식염수를 털어내고, 측정을 위해 500 μl의 생리식염수를 넣어 잘 풀어 준비하였다.
(2) MMP　특이적 나노프로브 염색
유세포 분석용 나노프로브 염색을 위하여 실시예 1의 포획 조건으로 처리한 50 μl의 혈액을 각각 따내고 유세포 분석기용 튜브에 담은 후, 백혈구 세포의 표면 마커인 Anti-CD45-PC5와 호중구 세포 표면 마커인 Anti-CD16b-FITC를 10 μl씩 넣어주고 15분간 암실에서 정치하였다. 그 후, Beckman coulter사의 IntraPrep㎛TM 제품의 Reagent 1을 100 μl 넣어주고 잘 섞어준 후, 15분간 암실에서 정치하여 세포를 고정시켰다. 유세포 분석기용 튜브에 4 ml의 생리 식염수를 넣고, 2000 rpm에서 5분간 원심분리 하고, 상층액을 살짝 거두어 버린 뒤, Reagent 2를 100 μl 넣고, 암실에서 5분간 세포 표면에 구멍을 뚫어주는 작업 (permiabilization)을 하였다. 실험군에 항체 대신 MMP-3　특이적 나노프로브 [GC-MMP3의 기질 펩타이드 (BHQ)-CY5.5] 8 mg/ml 10 μl를 넣어주고, 대조군에 [GC-Cy5.5] 1mg/ml 10 μl를 넣어준 후, 튜브를 암실에서 30분을 정치하여 두고, 생리식염수 4 ml를 넣어 잘 섞은 뒤 2000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 생리식염수를 털어내고, 측정을 위해 500 μl의 생리식염수를 넣어 잘 풀어준 뒤 유세포 분석기를 이용하여 금속 단백질 분해효소 (MMP-3)의 양을 측정하였다.
나노프로브 염색의 대조군으로서는 Fluoremeter 를 이용, 실험군과 대조군 두 물질간의 형광량을 맞추어 대조군 나노프로브는 MMP-3 특이적 나노프로브 농도 대비 1/8의 농도가 되도록 대조군 나노프로브 [GC-Cy5.5] 1 mg/ml 10 μl를 넣어 사용하였다.
실시예 4. 유세포 분석용 염색 검증
상기 실시예 3의 유세포 분석용 염색을 하였을 때의 효율성을 검증하기 위하여 세포 염색 후의 이미지를 현미경으로 관찰하였다. 기존에 알려진 방법으로 호중구 (neutrophil)를 분리해 내어 30파이 디쉬에 깔아 2일간 배양하였다. 세포형광면역 염색을 위해 세포 배양액을 생리 식염수로 씻어내고, 세포를 4% 포르말린으로 고정한 뒤, 5% 세럼 알부민 15분 처리하여 불필요한 반응이 일어나는 것을 방지하였다. 상층액을 거두어 낸 뒤, 생리 식염수 1 ml를 넣고 위의 유세포 분석에 사용한 항체 CD45-PC5, CD16b-FITC (항체 관찰용)/ CD45-PE, CD16b-FITC (나노프로브 관찰용) 를 10 μl씩 희석하여 30분간 암실에 정치하여 두었다. 생리 식염수 3 ml로 씻어내고, 각각의 디쉬에 Anti-MMP-3-PE 10 μl와 MMP-3　 나노프로브 [GC-MMP3(BHQ)-CY5.5] 8 mg/ml 10 μl를 넣어주었다. 30분간 실온에서 정치한 뒤, 생리 식염수를 바꾸어 주고, 뚜껑을 덮어 올림푸스사의 형광 현미경으로 관찰하였다. 도 5는 항체를 이용한 리셉터-리간드 표적화 효율성을 보여주는 것이고, 도 6은 MMP-3 특이적 나노프로브를 이용한 침투 효율성을 실험한 것으로서, 각 세포에서의 MMP-3 발현 농도에 따라 형광의 밝기가 다른 것을 확인할 수 있다. 이는 활성화 상태의 기질금속 단백질 분해효소가 MMP-3나노프로브의 형광량을 복원할 수 있기 때문에 보여지는 결과이다.
실험 결과, 다핵구 세포 중 호중구에 기질 금속 단백질 분해효소 (MMP-3) 특이적 나노프로브가 유입되는 것을 확인할 수 있었으며, 이 결과는 항체를 사용한 경우와 동일한 경향성을 나타내어 항체를 사용한 경우와 본 발명의 나노프로브를 사용한 경우 유사하게 세포의 염색이 가능함이 입증되었다.
실시예 5. MMP 특이적 나노프로브를 이용한 유세포 분석
실시예 3의 염색 과정을 거친 혈액 세포에 대하여 유세포 분석기를 이용, 금속 단백질 분해효소 (MMP-3)의 양을 측정하였다.
도 7은 항체를 이용한 유세포 분석 결과, 도 8은 실시예 1의 MMP-3　특이적 나노프로브를 이용한 유세포 분석 실험 결과이고, 상단은 정상인, 하단은 류마티스 관절염 환자의 혈액 세포에 대한 유세포 분석 결과이다. 각각 왼쪽의 그래프는 아래부터 림프구, 단핵구, 호중구의 분포를 세포의 크기와 과립으로 나타낸 것이고, 오른쪽 도표는 두 그래프 사이 간격이 클수록 활성화된 MMP-3의 발현이 많다는 것을 의미한다. 그 변화율을 수치화 하여 나타냈으며, 그 차이가 활성화 상태의 MMP-3이다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (12)

  1. 자가면역질환의 진단을 위한 정보를 제공하기 위하여, 말초 혈액 세포 중의 활성화된 기질 금속 단백질 분해효소 (Matrix metalloproteinase, MMP)를 정량화하는 방법으로서,
    (i) 대상체로부터 분리 채취된 말초 혈액 세포를 자극하고, 말초 혈액 세포의 단백질 분비를 억제시키는 단계,
    (ii) 하기 구조식 1의 MMP 특이적 나노프로브로 상기 말초 혈액 세포를 표지하는 단계, 및
    (iii) 유세포 분석기를 사용하여 활성화된 MMP의 양을 정량화하는 단계를 포함하고, 상기 단계 (i)의 말초 혈액 세포 자극과 세포의 단백질 분비 억제는 동시에 1~9 시간 동안 수행되는 것이며, 상기 말초 혈액 세포 자극은 PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate)를 5 내지 100 ng/ml 농도로 처리함으로써 이루어지고, 상기 단백질 분비 억제는 브레펠딘 A (Brefeldin A)를 1 내지 50 ng/ml 농도로 처리함으로써 이루어지는 것인 방법:
    [구조식 1]
    Figure 112015016994076-pat00002

    (여기서, 상기 A는 형광체이고, 상기 B는 MMP에 의하여 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질이고, 상기 C는 소광체이며, 상기 D는 고분자이다).
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 말초 혈액 세포는 백혈구 (leukocytes)인 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 자가면역질환은 골관절염 또는 류마티스 관절염인 것인 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 단계 (ii)의 세포 표지는 상기 MMP 특이적 나노프로브를 상기 말초 혈액 세포 속으로 유입시키는 것에 의하여 수행되는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 형광체는 플루오레신 (fluorescein), 보디피 (BODYPY), 테트라메틸로드아민 (Trtramethylrhodamine), 알렉사 (Alexa), 시아닌 (Cyanine) 및 알로피코시아닌 (allopicocyanine)으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 소광체는 형광을 소광시킬 수 있는 블랙홀 소광체 (blackhole quencher) 및 블랙베리 소광체 (blackberry quencher)로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 고분자는 키토산, 글리콜 키토산, 덱스트란, 히알루론산, 폴리아미노산 및 헤파린으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
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