MX2012011629A - Proteinas de union a tnf-alfa. - Google Patents

Proteinas de union a tnf-alfa.

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MX2012011629A
MX2012011629A MX2012011629A MX2012011629A MX2012011629A MX 2012011629 A MX2012011629 A MX 2012011629A MX 2012011629 A MX2012011629 A MX 2012011629A MX 2012011629 A MX2012011629 A MX 2012011629A MX 2012011629 A MX2012011629 A MX 2012011629A
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MX
Mexico
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binding protein
disease
tnf
antibody
human
Prior art date
Application number
MX2012011629A
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English (en)
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Jochen Salfeld
Tariq Ghayur
Peter C Isakson
Lorenzo Benatuil
Carrie L Goodreau
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Abbvie Inc
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Publication date
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Abstract

Se describen proteínas de unión aisladas, por ejemplo anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos, las cuales se unen al factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), por ejemplo, TNF-a de humano, y composiciones y moléculas basadas en anticuerpo relacionadas. También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos, así como métodos terapéuticos y de diagnóstico para utilizar los anticuerpos.

Description

PROTEÍNAS DE UNIÓN A TNF-ALFA Referencia Cruzada a la Solicitud Relacionada Esta solicitud reivindica la prioridad al Número de Solicitud de Patente Provisional Norteamericana 61/321,633, presentado el 7 de abril de 2010, la cual se incorpora expresamente por este medio en la presente por referencia en su totalidad para cualquier propósito.
Campo de la Invención La presente invención se refiere a las proteínas de unión a TNF-a y a su uso en la prevención y/o tratamiento de enfermedades inmunológicas agudas y crónicas como artritis reumatoide, osteoartritis, psoriasis, esclerosis múltiple, y otras enfermedades autoinmunes.
Antecedentes de la Invención Hay una necesidad en la técnica de anticuerpos mejorados capaces de unir TNF-a (también se refiere como factor de necrosis tumoral, factor-alfa de necrosis tumoral, factor-a de necrosis tumoral, TNF, y caquectina). En una modalidad, los anticuerpos son capaces de neutralizar TNF-a. La presente invención proporciona una nueva familia de proteínas de unión, anticuerpos injertados a CDR, anticuerpos humanizados, y fragmentos de los mismos, capaces de unir TNF-a, unir TNF-a con alta afinidad, y unir y neutralizar TNF-a.
Breve Descripción de la Invención Esta invención pertenece a las proteínas de unión a TNF-a, particularmente anticuerpos anti-TNF-a, o porciones de unión al antígeno de los mismos, que unen TNF-a. En una modalidad, el anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, capaz de unir TNF-a comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NOs.: 22-36.
En un aspecto, la invención proporciona una proteína de unión humanizada que comprende un dominio de unión al antígeno capaz de unir TNF-a humano, el dominio de unión al antígeno comprende por lo menos una CDR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: residuos 31-35 de la SEC ID NO: 22; residuos 50-65 de la SEC ID NO: 22; residuos 98-106 de la SEC ID NO: 22; residuos 24-34 de la SEC ID NO: 23; residuos 50-56 de la SEC ID NO: 23; y residuos 89-97 de la SEC ID NO: 23, donde la proteína de unión comprende una estructura aceptora humana. En una modalidad, la proteína de unión comprende por lo menos 3 CDR, por ejemplo, comprende un conjunto de CDR con dominio variable seleccionado del grupo que consiste de: (a) residuos 31-35 de la SEC ID NO: 22; residuos 50-65 de la SEC ID NO: 22; y residuos 98-106 de la SEC ID NO: 22; y (b) residuos 24-34 de la SEC ID NO: 23; residuos 50-56 de la SEC ID NO: 23; y residuos 89-97 de la SEC ID NO: 23. En modalidades particulares, el dominio de unión al antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos 31-35 de la SEC ID NO: 22; residuos 50-65 de la SEC ID NO: 22; residuos 98-106 de la SEC ID NO: 22; residuos 24-34 de la SEC ID NO: 23; residuos 50-56 de la SEC ID NO: 23; y residuos 89-97 de la SEC ID NO: 23.
En una modalidad, el dominio de unión al antígeno comprende una región de VH, por ejemplo, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: la SEC ID NOs.: 24, 25, 28, 29, 30, 31, 32, y 33. En otra modalidad, el dominio de unión al antígeno comprende una región de VL, por ejemplo, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: la SEC ID NOs.: 26, 27, 34, 35, y 36. En una modalidad particular, el dominio de unión al antígeno comprende una región de VH y una región de VL, por ejemplo, donde la región de VH comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: la SEC ID NOs.: 24, 25, 28, 29, 30, 31, 32, y 33 y la región de VL comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: la SEC ID NOs.: 26, 27, 34, 35, y 36.
En una modalidad, la estructura aceptora humana comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: la SEC ID NOs.: 6-21. En una modalidad particular, la estructura aceptora humana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: la SEC ID NOs.: 9, 10, 11, 12, 15, 16, 17, y 21. En otra modalidad, la estructura aceptora humana comprende por lo menos una sustitución de aminoácido de región de estructura, donde la secuencia de aminoácidos de la estructura es por lo menos 65% idéntica a la secuencia de estructura aceptora humana y comprende por lo menos 70 residuos de aminoácido idénticos a la estructura aceptora humana. En otra modalidad, la estructura aceptora humana comprende por lo menos una sustitución de aminoácido de región de estructura en un residuo clave, el residuo clave seleccionado del grupo que consiste de: un residuo adyacente a una CDR; un residuo de sitio de glicosilación; un residuo raro; un residuo capaz de interactuar con TNF-a humano; un residuo capaz de interactuar con una CDR; un residuo canónico; un residuo de contacto entre la región variable de cadena pesada y la región de variable de cadena ligera; un residuo dentro de una zona Vernier; y un residuo en una región que se traslapa entre una CDR1 de cadena pesada variable definida por Chothia y una primera estructura de cadena pesada definida por Kabat. En una modalidad, el residuo clave se selecciona del grupo que consiste de: H1, H12, H24, H27, H29, H37, H48, H49, H67, H71, H73, H76, H78, L13, L43, L58, L70, y L80. En una modalidad, la mutación de VH se selecciona del grupo que consiste de: Q 1 E, 112V, A24V, G27F, I29L, V29F F29L I3TV, I48L, V48L, S49G, V67L, F67L, V71K, R71K, T73N, N76S, L78I, y F78I. En otra modalidad, la mutación de VL se selecciona del grupo que consiste de: VI3L, A43S, I58V, E70D, y S80P. En una modalidad, la proteína de unión comprende dos dominios variables, donde los dos dominios variables tienen secuencias de aminoácido seleccionadas del grupo que consiste de: la SEC ID NO: 24 y SEC ID NO: 26; SEC ID NO: 24 y SEC ID NO: 27; SEC ID NO: 25 y SEC ID NO: 26; SEC ID NO: 25 y SEC ID NO: 27.
En una modalidad, la proteína de unión une TNF-a. En otra modalidad, la proteína de unión modula una función biológica de TNF-a. En otra modalidad, la proteína de unión neutraliza TNF-a. En aún otra modalidad, la proteína de unión disminuye la capacidad de TNF-a de unir a su receptor, por ejemplo, la proteína de unión disminuye la capacidad de TNF-a pro-humano, TNF-a humano maduro, o TNF-a humano truncado de unir a su receptor. En aún otra modalidad, la proteína de unión reduce una o más actividades biológicas de TNF-a seleccionadas del grupo que consiste de: producción de citosina dependiente de TNF; eliminación celular dependiente de TNF; inflamación dependiente de TNF; erosión ósea dependiente de TNF; y daño del cartílago dependiente de TNF.
En una modalidad, la proteína de unión tiene constante de asociación (Kon) seleccionada del grupo que consiste de: por lo menos aproximadamente 102M"1s"1 ; por lo menos aproximadamente 103M" s"1 ; por lo menos aproximadamente 10 M"1s"1; por lo menos aproximadamente 105M~1s" ; y por lo menos aproximadamente 106M"1s"1 ; como se midió mediante resonancia de plasmón superficial. En otra modalidad, la proteína de unión tiene una constante de disociación (Koff) seleccionada del grupo que consiste de: al menos aproximadamente 10"3s"1; al menos aproximadamente 10" s'1; al menos aproximadamente 10"5s"1; y al menos aproximadamente 10"5s"1, como se midió mediante resonancia de plasmón superficial. En aún otra modalidad, la proteína de unión tiene una constante de disociación (KD) seleccionada del grupo que consiste de: al menos aproximadamente 10"7M; al menos aproximadamente 10"8M; al menos aproximadamente 10"9M; al menos aproximadamente 10"10M; al menos aproximadamente 10"11M; al menos aproximadamente 10"12M; y al menos 10"13M.
En una modalidad, la proteína de unión comprende un dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste de: un dominio constante de IgM humano, un dominio constante de IgGI humano, un dominio constante de lgG2 humano, un dominio constante de lgG3 humano, un dominio constante de lgG4 humano, un dominio constante de IgA humano, y un dominio constante de IgE humano. En una modalidad particular, el dominio de región constante de inmunoglobulina de cadena pesada es un dominio constante de IgGI humano. En otra modalidad, la proteína de unión además comprende un dominio constante de inmunoglobulina de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste de: un dominio constante de Ig kappa humano y un dominio constante de Ig lambda humano. Por ejemplo, en una modalidad, el dominio de unión comprende un dominio constante de inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: la SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, y SEC ID NO: 5. En una modalidad particular, el dominio constante de IgGI humano comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 2 y SEC ID NO: 3. En otra modalidad, el dominio de región constante de inmunoglobulina de cadena ligera es un dominio constante de Ig kappa humano que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:4. En aún otra modalidad, el dominio de región constante de inmunoglobulina de cadena ligera es un dominio constante de Ig lambda humano que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO.:5.
En una modalidad particular, la invención proporciona una proteína de unión capaz de unir TNF-a humano, la proteína de unión que comprende: una región pesada constante de Ig que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 2 y SEC ID NO: 3; una región ligera constante de Ig que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 4 y SEC ID NO: 5; una región pesada variable de Ig que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: la SEC ID NO: 24, 25, 28, 29, 30, 31, 32, y 33; y una región ligera variable de Ig que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: la SEC ID NO: 26, 27, 34, 35, y 36. En una modalidad particular, la proteína de unión de la invención se selecciona del grupo que consiste de: una molécula de inmunoglobulina, una Fv, una Fv ligada a disulfuro, un anticuerpo monoclonal, una scFv, un anticuerpo quimérico, un solo anticuerpo de dominio, un anticuerpo injertado a CDR, un diacuerpo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo multiespecífico, un Fab, un anticuerpo específico dual, un fragmento de Fab', un anticuerpo biespecífico, un fragmento de F(ab')2, un DVD-lg™, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un enlace de disulfuro en la región de bisagra; un fragmento de Fd que consiste de los dominios de VH y CH1; un fragmento de Fv que consiste de los dominios de VL y VH de una sola ramificación de un anticuerpo, un fragmento de dAb, una región determinante de complementariedad aislada, y un solo anticuerpo de cadena.
En otro aspecto, la invención proporciona una proteína de unión cristalizada que comprende una proteína de unión de la invención, donde la proteína de unión está en la forma de un cristal. En una modalidad, el cristal es un cristal de liberación controlada farmacéutico libre de portador. En otra modalidad, la proteína de unión tiene mayor vida promedio in vivo que las contrapartes solubles de la proteína de unión. En otra modalidad, la proteína de unión conserva la actividad biológica.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición para la liberación de una proteína de unión de TNF-a, la composición comprende: (a) una formulación, donde la formulación comprende una proteína de unión cristalizada de la invención y un ingrediente; y (b) por lo menos un portador polimérico. En una modalidad, el portador polimérico es un polímero seleccionado de uno o más del grupo que consiste de: ácido de poliacrílico, policianocrilato, un poliaminoácido, un polianhídrido, un polidepsipéptido, un poliéster, ácido poliláctico, ácido poliláctico-co-glicólico, poli-B-hidroxibutriato, policaprolactona, polidioxanona; polietilenglicol, polihidroxipropilmetacrilamida, polio rganofosfazeno, poliortoésteres, polivinilalcohol , polivinilpirrolidona, copolímeros de anhídrido-alquilviniléter maleico, polioles plurónicos, albúmina, alginato, celulosa y derivados de celulosa, colágeno, fibrina, gelatina, ácido hialurónico, oligosacáridos, glicaminoglicanos, polisacáridos sulfatados, y mezclas y copolímeros de los mismos. En otra modalidad, el ingrediente se selecciona del grupo que consiste de albúmina, sucrosa, trehalosa, lactitol, gelatina, hidroxipropil- -ciclodextrina, del metoxipolietilenglicol y polietilenglicol.
En otro aspecto, la invención proporciona un constructo de proteína de unión al TNF-a que comprende la proteína de unión al TNF-a de la invención y un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de un enlace y un dominio constante de la inmunoglobulina. En una modalidad, la proteína de unión posee un patrón de glicosilación humano. En otra modalidad, el constructo de proteína de unión es un constructo de proteína de unión al TNF-a cristalizado. En aún otra modalidad, el constructo de proteína de unión al TNF-a cristalizado es un constructo de proteína de unión al TNF-a cristalizado de liberación controlada farmacéutico libre de portador. En una modalidad particular, el constructo de proteína de unión al TNF-a tiene una mayor vida promedio in vivo que la contraparte soluble del constructo de proteína de unión. En otra modalidad, el constructo de proteína de unión conserva la actividad biológica.
En otro aspecto, la invención proporciona un conjugado de unión de proteína al TNF-a que comprende un constructo de proteína de unión al TNF-a de la invención y además comprende un agente seleccionado del grupo que consiste de: una molécula de inmunoadhesión, un agente formador de imagen, un agente terapéutico, y un agente citotóxico. En una modalidad, el agente es un agente formador de imagen seleccionado del grupo que consiste de una radioetiqueta, una enzima, una etiqueta fluorescente, una etiqueta luminiscente, una etiqueta bioluminiscente, una etiqueta magnética, y biotina. En una modalidad, el agente formador de imagen es una radioetiqueta seleccionada del grupo que consiste de: 3H 14C 35S, 90Y, 99Tc, 11??, 125l, 31l, 177Lu, 166Ho, y 153Sm. En otra modalidad, el agente es un agente terapéutico o citotóxico seleccionado del grupo que consiste de: un antimetabolito, un agente alquilizante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citosina, un agente anti-angíogénico, un agente antimitótico, una antraciclina, toxina, y un agente apoptótico.
En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica una proteína de unión de la invención. En otro aspecto, la invención proporciona un vector que comprende un ácido nucleico aislado de la invención. En una modalidad, el vector se seleccionó del grupo que consiste de pcADN, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV, y pBJ. En una modalidad, la invención proporciona una célula hospedadora que comprende un vector de la invención. En otra modalidad, la célula hospedadora es una célula procariótica, por ejemplo, E. coli. En otra modalidad, la célula hospedadora es una célula eucariótica, por ejemplo, una célula protista, una célula animal, una célula vegetal, o una célula de hongo. En otra modalidad, la célula eucariótica es una célula animal seleccionada del grupo que consiste de una célula mamífera, una célula aviar, y una célula de insecto. Por ejemplo, la célula hospedadora es una célula CHO, una célula COS, una célula de levadura, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, o una célula de insecto Sf9.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir una proteína que une TNF-a, el método que comprende las etapas de cultivar una célula hospedadora de la invención en medio de cultivo bajo condiciones suficientes para producir una proteína de unión que une TNF-a así como una proteína de unión al TNF-a producida por el método.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, el portador farmacéuticamente aceptable funciona como un adyuvante útil para aumentar la absorción o dispersión de la proteína de unión. En otra modalidad, el adyuvante es hialuronidasa. En otra modalidad, la composición farmacéutica además comprende por lo menos un agente terapéutico adicional para tratar un trastorno en el cual la actividad de TNF-a es perjudicial, por ejemplo, un agente terapéutico, un agente formador de imagen, un agente citotóxico, un inhibidor de angiogénesis, un inhibidor de cinasa, un bloqueador de molécula de coestimulación, un bloqueador de molécula de adhesión, un anticuerpo anti-citosina o fragmento funcional de los mismos, metotrexato, ciclosporina, rapamicina, FK506, una etiqueta detectable, un reportero detectable, un antagonista de TNF-a, un antireumático; un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no-esteroide (NSAID, por sus siglas en inglés), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriático, un corticoesteroide, un esteroide anabólico, una eritropoyetina, una inmunización, una inmunoglobulina, un agente inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un fármaco de reemplazo de hormona, un radiofarmacéutico, un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, una medicación de asma, un beta-agonista, un esteroide inhalado, un esteroide oral, una epinefrina o análogo de los mismos, una citosina, y un antagonista de citosina.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar un mamífero que comprende la etapa de administrar al mamífero una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de la invención. En otra modalidad, la invención proporciona un método para reducir la actividad de TNF-a humano, el método comprende la etapa de: poner en contacto el TNF-a humano con la proteína de unión de la invención tal que la actividad de TNF-a humano es reducida. En otra modalidad, la invención proporciona un método para reducir la actividad de TNF-a humano en un sujeto humano que sufre de un trastorno en el cual la actividad de TNF-a es perjudicial, el método que comprende la etapa de administrar al sujeto humano la proteína de unión de la invención tal que la actividad de TNF-a humano en el sujeto humano es reducida. En otra modalidad, la invención proporciona un método para tratar un sujeto para una enfermedad o un trastorno en los cuales la actividad de TNF-a es perjudicial, el método comprende la etapa de administrar al sujeto la proteína de unión de la invención tal que el tratamiento es alcanzado.
En otra modalidad, la invención proporciona un método para tratar un paciente que sufre de un trastorno en el cual el TNF-a es perjudicial que comprende la etapa de administrar la proteína de unión de la invención anterior, concurrente, o después de la administración de un segundo agente, donde el segundo agente se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo, o fragmento del mismo, capaz de unir IL-12 humano; PGE2; LPA; NGF; CGRP; SubP; RAGE; histamina; un bloqueador del receptor de histamina; bradicinina; IL-1 alfa; IL-1 beta; VEGF; PLGF; metotrexato; un corticoesteroide, un modulador del receptor de glucocorticoide; ciclosporina, rapamicina, FK506, un agente antiinflamatorio no esferoidal, y esclerostina. En una modalidad, el trastorno se seleccionó del grupo que consiste de un trastorno respiratorio; asma; asma alérgico y no alérgico; asma debido a infección; asma debido a infección con virus sincitial respiratorio (RSV, por sus siglas en inglés); enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD, por sus siglas en inglés); una condición que involucra la inflamación de vía respiratoria; eosinofília; fibrosis y producción excesiva de moco; fibrosis quística; fibrosis pulmonar; un trastorno atópico; dermatitis atópico; urticaria; eczema; rinitis alérgica; enterogastritis alérgica; una condición inflamatoria y/o autoinmune de la piel; una condición inflamatoria y/o autoinmune de órganos gastrointestinales; enfermedades inflamatorias intestinales (IBD, por sus siglas en inglés); colitis ulcerosa; enfermedad de Crohn; una condición inflamatoria y/o autoinmune del hígado; cirrosis del hígado; fibrosis del hígado; fibrosis del hígado causada por el virus de hepatitis B y/o C; escleroderma; tumores o cánceres; carcinoma hepatocelular; glioblastoma; linfoma; Linfoma de Hodgkin; una infección viral; una infección bacteriana; una infección parásita; Infección por HTLV-1; supresión de expresión de inmunorespuestas protectoras tipo 1, y supresión de expresión de una inmunorespuesta protectora tipo 1 durante la vacunación. En una modalidad, el trastorno es seleccionado del grupo que consiste de: artritis reumatoide, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis séptica, artritis de Lyme, artritis psoriática, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus sistémico eritematoso, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad inflamatoria intestinal, diabetes mellitus dependiente de insulina, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, esclerodermia, dermatitis, injerto contra enfermedad de huésped, rechazo de trasplante de órganos, enfermedad inmune aguda o crónica asociadas con trasplante de órganos, sarcoidosis, ateroesclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, purpurea de Henoch-Schoenlein , vasculitis microscópica de los ríñones, hepatitis activa crónica, uveitis, choque séptico, síndrome de choque tóxico, síndrome de sepsia, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parásitas, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, mielitis transversal aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, malignidades, paro cardíaco, infarto del miocardio, enfermedad de Addison, esporádico, deficiencia poliglandular tipo I y deficiencia poliglandular tipo II, síndrome de Schmidt, síndrome de dificultad respiratoria (aguda) del adulto, alopecia, alopecia areata, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriática, artropatía eolítica ulcerosa, sinovitis enteropática, clamidia, yersinia y artropatía asociada a Salmonella , espondiloartropatía, enfermedad ateromatosa/arteriosclerosis, alergia atópica, enfermedad ampulosa autoinmune, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoide, enfermedad de IgA lineal, anemia hemolítica autoinmune, anemia hemolítica positiva de Coombs, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/Enfermedad" de Royal Free, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de célula gigante, hepatitis esclerótica primaria, hepatitis autoinmune criptogénica, Síndrome de Enfermedad de Inmunodeficiencia Adquirida, Enfermedades Relacionadas a Inmunodeficiencia Adquirida, hepatitis B, hepatitis C, inmunodeficiencia variada común (hipogammaglobulinemia variable común), cardiomiopatía dilatada, infertilidad femenina, falla ovárica, falla ovárica prematura, enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial post-inflamatoria, neumonitis intersticial, enfermedad del tejido conectivo asociada a enfermedad pulmonar intersticial, enfermedad del tejido conectivo mixta asociada a enfermedad pulmonar, esclerosis sistémica asociada a enfermedad pulmonar intersticial, artritis reumatoide asociada a enfermedad pulmonar intersticial, lupus eritematoso sistémico asociado a enfermedad pulmonar, dermatomiositis/polimiositis asociada a enfermedad pulmonar, enfermedad de Sjógren asociada a enfermedad pulmonar, espondilitis anquilosante asociada a enfermedad pulmonar, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, hemosiderosis asociada a enfermedad pulmonar, enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármaco, fibrosis, fibrosis por radiación, bronquiolitis obliterante, neumonía eosinofílica crónica, enfermedad pulmonar infiltrativa linfocítica, enfermedad pulmonar intersticial postinfecciosa, artritis gotosa, hepatitis autoinmune, hepatitis autoinmune tipo 1 (hepatitis autoinmune clásica o lupoide), hepatitis autoinmune tipo 2 (hepatitis de anticuerpo anti-LKM), hipoglucemia mediada autoinmune, resistencia a insulina tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroidismo, enfermedad inmune aguda asociada con trasplante de órganos, enfermedad inmune crónica asociada con trasplante de órganos, osteoartrosis, colangitis esclerótica primaria, psoriasis tipo 1, psoriasis tipo 2, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmune, enfermedad renal NOS, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de ríñones, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculina idiopática o NOS, autoinmunidad de esperma, esclerosis múltiple (todos los subtipos), oftalmía simpática, hipertensión pulmonar secundaria a enfermedad del tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, la manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, síndrome de Sjórgren, enfermedad/arteritis de Takayasu, trombocitopenia autoinmune, trombocitopenia idiopática, enfermedad tiroidea autoinmune, hipertiroidismo, hipotiroidismo, hipotiroidismo autoinmune bocioso (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmune atrófico, mixedema primaria, uveítis facogénica, vasculitis primaria, enfermedad hepática aguda del vitíligo, enfermedades del hígado crónicas, cirrosis alcohólica, lesión hepática inducida por alcohol, colestasis, enfermedad hepática idiosincrásica, hepatitis inducía por fármacos, esteatohepatitis no alcohólica, alergia y asma, infección por estreptococos del grupo B (GBS, por sus siglas en inglés), trastornos mentales (por ejemplo, depresión y esquizofrenia), enfermedades mediadas tipo Th2 y Tipo Th1, dolor agudo y crónico (diferentes formas de dolor), y cánceres como de pulmón, mama, estómago, vejiga, colon, páncreas, ovario, próstata y rectal y neoplasias hematopoyéticas (leucemia y linfoma) Abetalipoproteinemia , Acrocianosis, procesos parasitarios o infecciosos agudos y crónicos, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (LLA, por sus siglas en inglés), leucemia mieloide aguda (AML, por sus siglas en inglés), infección bacteriana aguda o crónica, pancreatitis aguda, insuficiencia renal aguda, adenocarcinomas, latidos ectópicos aéreos y complejos de demencia del SIDA, hepatitis inducida por alcohol, conjuntivitis alérgica, dermatitis de contacto alérgica, rinitis alérgica, rechazo del aloinjerto, deficiencia de alfa-1 -antitripsina, esclerosis lateral amiotrófica, anemia, angina de pecho, degeneración de células del cuerno anterior, terapia anti-CD3, síndrome antifosfolipídico, reacciones de hipersensibilidad antireceptor, aneurismas aórticas y periféricas, disección aórtica, hipertensión arterial, arteriosclerosis, fístula arteriovenosa, ataxia, fibri lación auricular (sostenida o paroxística), vibración auricular, bloqueo auriculoventricular, linfoma de células B, rechazo de injerto óseo, rechazo de trasplante de médula ósea (BMT, por sus siglas en inglés), bloqueo de rama, linfoma de Burkitt, Quemaduras, arritmias cardíacas, síndrome de aturdimiento cardíaco, tumores cardiacos, cardiomiopatía, respuesta inflamatoria a la derivación cardiopulmonar, rechazo de trasplante de cartílago, degeneraciones cerebelosas corticales, trastornos cerebelosos, taquicardia auricular caótica o multifocal, trastornos asociados con quimioterapia, leucemia mielocítica crónica (CML, por sus siglas en inglés), alcoholismo crónico, patologías inflamatorias crónicas, leucemia linfocítica crónica (CLL, por sus siglas en inglés), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD, por sus siglas en inglés), intoxicación crónica por salicilatos, carcinoma colorrectal, insuficiencia cardíaca congestiva, conjuntivitis, dermatitis de contacto, cor pulmonale, enfermedad de la arteria coronaria, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, sepsis con cultivo negativo, fibrosis quística, trastornos asociados con terapia de citosinas, Demencia pugilística, enfermedades desmielinizantes, fiebre hemorrágica del dengue, dermatitis, condiciones dermatológicas, diabetes, diabetes mellitus, enfermedad arteriosclerótica diabética, Enfermedad de cuerpos de Lewy difusa, cardiomiopatía congestiva dilatada, trastornos de los ganglios básales, Síndrome de Down en edad media, trastornos del movimiento inducidos por fármacos inducidos mediante fármacos los cuales bloquean receptores de dopamina del SNC, sensibilidad a fármacos, eczema, encefalomielitis, endocarditis, endocrinopatía, epiglotitis, infección mediante el virus de Epstein-Barr, eritromelalgia, trastornos extrapiramidales y cerebelosos, linfohistiocitosis hemofagocítica familiar, rechazo de implante del timo fetal, ataxia de Friedreich, trastornos arteriales periféricos funcionales, sepsis fúngica, gangrena gaseosa, úlcera gástrica, nefritis glomerular, rechazo de injerto de cualquier órgano o tejido, sepsis por gram negativos, sepsis por gram positivos, granulomas debido a organismos intracelulares, leucemia de células peludas, enfermedad de Hallervorden-Spatz, tiroiditis de Hashimoto, fiebre del heno, rechazo de trasplante de corazón, hemocromatosis, hemodiálisis, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombocitopénica trombótica, hemorragia, hepatitis (A), arritmias por haz de His, infección por HlV/neuropatía por VIH, enfermedad de Hodgkin, trastornos del movimiento hipercinéticos, reacciones de hipersensibilidad, neumonitis por hipersensibilidad, hipertensión, trastornos del movimiento hipocinéticos, evaluación del eje hipotalámico-pituitario-adrenal, enfermedad idiopática de Addison, fibrosis pulmonar idiopática, citotoxicidad mediada por anticuerpos, Astenia, atrofia muscular de espinal infantil, inflamación de la aorta, influenza A, exposición por radiación ionizante, iridociclitis/uveítis/neuritis óptica, daño por isquemia-reperfusión, accidente cerebrovascular isquémico, artritis reumatoide juvenil, atrofia muscular espinal juvenil, sarcoma de Kaposi, rechazo de trasplante renal, legionella, leishmaniasis, lepra, lesiones del sistema corticoespinal, lipedema, rechazo de trasplante de hígado, linfedema, malaria, linfoma maligno, histiocitosis maligna, melanoma maligno, meningitis, meningococcemia, metabólica/idiopática, dolor de cabeza, migraña, trastorno mitocondrial multisistema, enfermedad mixta del tejido conectivo, gammapatía monoclonal, mieloma múltiple, degeneraciones de sistemas múltiples (Menzel, Dejerine-Tomas, Shy-Drager, y Machado-Joseph), miastenia gravis, mycobacterium avium intracellulare, mycobacterium tuberculosis, síndrome mielodisplásico, infarto de miocardio, trastornos isquémicos miocárdicos, carcinoma nasofaríngeo, enfermedad pulmonar crónica neonatal, nefritis, nefrosis, enfermedades neurodegenerativas, atrofias musculares neurogénica I, fiebre neutropénica, linfoma de no Hodgkin, oclusión de la aorta abdominal y sus ramificaciones, trastornos arteriales oclusivos, terapia de OKT3®, orquitis/epididimitis, orquitis/procedimientos inversos de vasectomía, organomegalia, osteoporosis, rechazo de trasplante de páncreas, carcinoma pancreático, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia de malignidad, rechazo de trasplante de paratiroides, enfermedad inflamatoria pélvica, rinitis perenne, enfermedad pericárdica, enfermedad aterosclerótica periférica, trastornos vasculares periféricos, peritonitis, anemia perniciosa, neumonía por Pneumocystis carinii, neumonía, síndrome de POEMS (polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gammapatía monoclonal y síndrome de cambios en la piel), síndrome de postperfusión, síndrome de postbomba, síndrome de postcardiotomía MI, preeclampsia, supranuclear progresiva Plasy, hipertensión pulmonar primaria, terapia de radiación, fenómeno y enfermedad de Raynaud, enfermedad de Raynaud, enfermedad de Refsum, taquicardia regular de QRS estrecho, hipertensión renovascular, lesión de reperfusión, cardiomiopatía restrictiva, sarcomas, esclerodermia , corea senil, Demencia Senil de tipo cuerpos de Lewy, artropatías seronegativas, choque, anemia de células falciformes, rechazo de aloinjerto de piel, síndrome de cambios en la piel, rechazo de trasplante de intestino delgado, tumores sólidos, arritmias específicas, ataxia espinal, degeneraciones espinocerebelosas, miositis estreptocócica, lesiones estructurales del cerebelo, Panencefalitis esclerosante subaguda, Síncope, sífilis del sistema cardiovascular, anafilaxia sistémica, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, artritis juvenil reumatoide de comienzo sistémico, células T o FAB ALL, Telangiectasia, tromboangitis obliterante, trombocitopenia, toxicidad, trasplantes, trauma/hemorragia, reacciones de hipersensibilidad tipo III, hipersensibilidad tipo IV, angina inestable, uremia, urosepsis, urticaria, enfermedades valvulares cardíacas, venas varicosas, vasculitis, enfermedades venosas, trombosis venosa, fibrilación ventricular, infecciones víricas y fúngicas, encefalitis viral/meningitis aséptica, síndrome hemofagocítico viral asociado, síndrome de Wernicke-Korsakoff, enfermedad de Wilson, rechazo de xenoinjertos de cualquier órgano o tejido, síndromes coronarios agudos, polineuritis idiopática aguda, polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria aguda, isquemia aguda, enfermedad de Still del adulto, alopecia areata, anafilaxia, síndrome de anticuerpo antifosfolípido, anemia aplásica, arteriosclerosis, eccema atópico, dermatitis atópica, dermatitis autoinmune, trastorno autoinmune asociado con infección por estreptococos, enteropatía autoinmune, pérdida auditiva autoinmune, síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS, por sus siglas en inglés), miocarditis autoinmune, insuficiencia ovárica prematura autoinmune, blefaritis, bronquiectasias, penfigoide bulloso, enfermedad cardiovascular, síndrome antifosfolipídico catastrófico, enfermedad celíaca, espondilosis cervical, isquemia crónica, penfigoide cicatrícial, síndrome aislado clínicamente (CIS, por sus siglas en inglés) con riesgo de esclerosis múltiple, conjuntivitis, trastorno psiquiátrico con inicio en la infancia, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD, por sus siglas en inglés), dacriocistitis, dermatomiositis, retinopatía diabética, diabetes mellitus, hernia de disco, prolapso de disco, anemia hemolítica inmune inducida por fármacos, endocarditis, endometriosis, endoftalmitis, epiescleritis eritema multiforme, eritema multiforme mayor, penfigoide gestacional, síndrome de Guillain-Barré (GBS, por sus siglas en inglés), fiebre de heno, síndrome de Hughes, enfermedad de Parkinson idiopática, neumonía intersticial idiopática, alergia mediada por IgE, anemia hemolítica inmune, miositis por cuerpos de inclusión, enfermedad inflamatoria ocular infecciosa, enfermedad desmielinizante inflamatoria, enfermedad cardíaca inflamatoria, enfermedad renal inflamatoria, IPF/UIP, iritis, queratitis, queratoconjuntivitis sicca, enfermedad de Kussmaul o enfermedad de Kussmaul-Meier, parálisis de Landry, histiocitosis de células de Langerhans, livedo reticularis, degeneración macular, poliangiítis microscópica, morbus Bechterev, trastornos de neuronas motoras, penfigoide de membranas mucosas, insuficiencia orgánica múltiple, miastenia gravis, síndrome mielodisplastico, miocarditis, trastornos de raíz nerviosa, neuropatía, hepatitis no A no B, neuritis óptica, osteolisis, cáncer de ovario, Pauciarticular JAR, enfermedad arterial periférica oclusiva (PAOD, por sus siglas en inglés), enfermedad vascular periférica (PVD, por sus siglas en inglés), arteria periférica, enfermedad (PAD, por sus siglas en inglés), flebitis, poliarteritis nodosa (o periarteritis nodosa), policondritis, polimialgia reumática, poliosis, poliarticular JRA, síndrome de deficiencia poliendocrina, polimiositis, polimialgia reumática (PMR, por sus siglas en inglés), síndrome post-bomba, Parkinsonismo primario, cáncer de próstata y rectal y malignidades hematopoyéticas (leucemia y linfoma), prostatitis, aplasia pura de células rojas, insuficiencia adrenal primaria, neuromielitis óptica recurrente, restenosis, enfermedad cardiaca reumática, SAPHO (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis y osteítis), esclerodermia, amiloidosis secundaria, choque pulmonar, escleritis, ciática, insuficiencia adrenal secundaria, enfermedad de tejido conectivo asociada a silicona, dermatosis de Sneddon-Wilkinson, espondilitis anquilosante, síndrome de Stevens-Johnson (SJS, por sus siglas en inglés), síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, arteritis temporal, retinitis toxoplásmica , necrólisis epidérmica tóxica, mielitis transversa, TRAMPS (síndrome periódico asociado el receptor de factor de necrosis tumoral), reacción alérgica tipo 1, diabetes tipo II, urticaria, neumonía intersticial usual (UIP, por sus siglas en inglés), vasculitis, conjuntivitis vernal, retinitis viral, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada (síndrome de VKH, por sus siglas en inglés), degeneración macular húmeda, cicatrización de heridas, artropatía asociada a yersinia y Salmonella.
En otra modalidad, la invención proporciona un método para tratar de un paciente que sufre de un trastorno en el cual TNF-a es perjudicial, el método comprende la etapa de administrar la proteína de unión de la invención antes, simultáneamente, o después de la administración de un segundo agente, donde el segundo agente se selecciona del grupo que consiste de esteroides inhalados; agonistas beta; agonistas beta de acción corta o acción prolongada, antagonistas de leucotrienos o receptores de leucotrienos; ADVAIR; inhibidores de IgE; anticuerpos anti-lgE; XOLAIR; inhibidores de fosfodiesterasa; inhibidores de PDE4; xantinas, fármacos anticolinérgicos; agentes estabilizadores de mastocitos; Cromolina; inhibidores de IL-4; inhibidores de IL-5; inhibidores de eotaxina/CCR3, antagonistas de histamina o sus receptores que incluyen H1, H2, H3 y H4; antagonistas de prostaglandina D o sus receptores DP1 y CRTH2; antagonistas de TNF; un fragmento soluble de un receptor de TNF; ENBREL; antagonistas de enzima de TNF; inhibidores de la enzima convertidora de TNF (TACE, por sus siglas en inglés); antagonistas del receptor muscarínico; antagonistas de TGF-beta, interferón gamma; pirfenidona; agentes quimioterapéuticos, metotrexato; leflunomida; sirolimus (rapamicina) o un análogo de los mismos, CCI-779; COX2 o inhibidores de cPLA2; NSAIDs; inmunomoduladores; inhibidores de p38, inhibidores de TPL-2, MK-2 y NFkB; budenosida, factor de crecimiento epidérmico, corticosteroides; ciclosporina; sulfasalazina; aminosalicilatos; 6-mercaptopurina; azatioprina; metronidazol; inhibidores de lipoxigenasa; mesalamina; olsalazina; balsalazida, antioxidantes, inhibidores de tromboxano; antagonistas del receptor IL-1; anticuerpos anti-IL-1 ß; anticuerpos anti-IL-6; factores de crecimiento, inhibidores de elastasa; compuestos piridinil- imidazol; anticuerpos o agonistas de LT, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL- 9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, EMAP-II, GM- CSF, FGF, PDGF o; anticuerpos de CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos; FK506; rapamicina; micofenolato de mofetilo; ibuprofeno; prednisolona; inhibidores de fosfodiesterasa; agonistas de adensosina, agentes antitrombóticos, inhibidores de complemento, agentes adrenérgicos, IRAK, NIK, IKK, p38, o inhibidores de AP quinasa, inhibidores de la enzima convertidora de I L- 1 ß , TNF-a, inhibidores de la enzima convertidora de TNF-a, inhibidores de señalización de células T; inhibidores de metaloproteinasas, 6-mercaptopurinas; inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina; receptores de citosina solubles; receptor del TNF p55 soluble; receptor del TNF p75 soluble; slL-1 Rl ; slL-1 Rll ; slL-6R; citosinas antiinflamatorias; IL-4; IL-10; IL-11; y TGF-ß.
En una modalidad, la proteína de unión de la invención se administró al sujeto de por lo menos un modo seleccionado del grupo que consiste de parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intercerebral, intracerebroventricular, intracálica, intracervical, intragástrica, intrahepática, , intramiocardial, intraosteal, intrapélvica, intrapericardiaca, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, ¡ntrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravesical, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal y transdérmica.
Descripción Detallada de la Invención Esta invención se refiere a las proteínas de unión a TNF-a, particularmente anticuerpos anti-TNF-a, o porciones de unión al antígeno de las mismas, que unen TNF-a (es decir, factor de necrosis tumoral, factor-alfa de necrosis tumoral, factor-a de necrosis tumoral, TNF, caquectina). Varios aspectos de la invención se refieren a anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, y composiciones farmacéuticas de los mismos, así como ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes y células hospedadoras para fabricar tales anticuerpos y fragmentos. Los Métodos para utilizar los anticuerpos de la invención para detectar el TNF-a humano, para inhibir el TNF-a humano ya sea in vitro o in vivo, y para regular la expresión del gen o funciones relacionadas a TNF-a también se comprenden por la invención. Las composiciones que comprenden los anticuerpos de la presente invención, así como métodos para utilizar tales anticuerpos, también se describen.
A menos que se defina lo contrario en la presente, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tendrán los significados que son comúnmente entendidos por los expertos en la técnica. El significado y alcance de los términos debe ser claro, sin embargo, en el caso de cualquier ambigüedad latente, las definiciones proporcionadas en la presente pueden tener prioridad sobre cualquier del diccionario o extrínseca. Además, a menos que se requiera por el contexto, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos en plural se incluirán en singular. En esta aplicación, el uso de "o" se entiende como "y/o", a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "que incluye", así como otras formas del término, como "incluye" e "incluido", no es limitante. Además, términos como "elemento" o "componente" comprende tanto elementos y componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad a menos que se especifique lo contrario.
Generalmente, las nomenclaturas usadas en relación con, y técnicas de, cultivo de célula y tejido, patología, oncología, biología molecular, inmunología, microbiología, genéticas y proteína y química e hibridación de ácido nucleico descritos en la presente son aquellas bien conocidas y usadas comúnmente en la técnica. Los métodos y técnicas de la presente invención se realizan generalmente de acuerdo con los métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describen en varias referencias generales y más específicas que se citan y discuten a través de la presente especificación a menos que se indique lo contrario. Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se realizaron de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se lograron comúnmente en la técnica o como se describen en la presente. Las nomenclaturas usadas en relación con, y los procedimientos de laboratorio y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descritas en la presente son aquellas bien conocidas y usadas comúnmente en la técnica. Se utilizan técnicas estándar para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación, y suministro, y tratamiento de pacientes.
Que la presente invención puede entenderse más fácilmente, los términos seleccionados se definen a continuación.
El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena polimérica de aminoácidos. Los términos "péptido" y "proteína" se utilizan alternativamente con el término polipéptido y también se refieren a una cadena polimérica de aminoácidos. El término "polipéptido" comprende proteínas nativas o artificíales, fragmentos de proteína y análogos de polipéptido de una secuencia de proteína. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico.
El término "proteína aislada" o "polipéptido aislado" es una proteína o polipéptido que en virtud de su origen o fuente de derivación no se asocia con componentes asociados naturalmente que la acompañan en su estado nativo; está sustancialmente libre de otras proteínas de la misma especie; es expresada por una célula de una diferente especie; o no ocurre en la naturaleza. Así, un polipéptido que es sintetizado químicamente o sintetizado en un sistema celular diferente de la célula de la cual origina naturalmente será "aislado" de sus componentes asociados naturalmente. Una proteína puede también volverse libre sustancialmente de componentes asociados naturalmente mediante aislamiento, utilizando técnicas de purificación de proteína bien conocidas en la técnica.
El término "que se recupera" se refiere al proceso de proporcionar una especie química como un polipéptido libre sustancialmente de componentes asociados naturalmente mediante aislamiento, por ejemplo, utilizando técnicas de purificación de proteína bien conocidas en la técnica.
El término "TNF-a humano" (abreviado en la presente como hTNF-a), incluye una proteína citosina trimérica. El término incluye una proteína homotrimérica que comprende tres proteínas de TNF-a de 17.5 kD. La proteína homotrimérica se refiere como una "proteína de TNF-a". El término "TNF-a" humano se desea para incluir TNF-a humano recombinante (rhTNF-a, por sus siglas en inglés) que pueda prepararse mediante métodos de expresión recombinantes estándar. La secuencia de TNF-a humano se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1: Secuencia de TNF-a humano "Actividad biológica" se refiere a todas las propiedades biológicas inherentes de la citosina. Las propiedades biológicas de TNF-a incluyen pero no se limitan a unir el receptor de TNF.
Los términos "unión específica" o "unión específicamente", en referencia a la interacción de un anticuerpo, una proteína, o un péptido con una segunda especie química, se entienden que la interacción es dependiente de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, un determinante antigénico o epítopo) en la especie química; por ejemplo, un anticuerpo reconoce y une a una estructura de proteína específica en lugar de a las proteínas generalmente. Si un anticuerpo es específico para el epítopo "A", la presencia de una molécula que contiene el epítopo A (o libre, sin etiqueta A), en una reacción que contiene "A etiquetado" y el anticuerpo, reducirá la cantidad de A etiquetado limitada al anticuerpo.
El término "anticuerpo", se refiere ampliamente a cualquier molécula de inmunoglobulina (Ig, por sus siglas en inglés), o porción de unión al antígeno del mismo, comprendido de cuatro cadenas de polipéptido, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (I), o cualquier fragmento, muíante, variante, o derivación funcional del mismo, que conservan las características de unión de epítopo esencial de una molécula de Ig. Tal muíante, variante, o formatos derivados del anticuerpo se conocen en la técnica. Las modalidades no limitanles las cuales se discuten a continuación.
En un anticuerpo de longitud completa, cada cadena pesada se comprende de una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada se comprende de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera se comprende de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera se comprende de un dominio, CL. Las regiones de VH y VL pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés), intercaladas con regiones que son conservadas, llamadas regiones de marco (FR, por sus siglas en inglés). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, arreglados a partir de la amino-terminal a carboxi-terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, I gG 1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2) o subclase.
El término "porción de unión al antígeno" o "región de unión al antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo"), se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conserva la capacidad de unir específicamente a un antígeno (por ejemplo, hTNF-a). La función de la unión al antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Tales modalidades del anticuerpo pueden también tener formatos biespecíficos, duales específicos, o multiespecíficos; uniendo específicamente dos o más diferentes antígenos. Ejemplos de fragmentos de unión comprendidos dentro del término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1; (i¡) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un enlace de disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios de VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; (v) un fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature 341:544-546, Winter et al. publicación PCT WO 90/05144), la cual comprende un solo dominio variable; y (vi) una región determinante de complementariedad aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificadas para los genes separados, ellas pueden unirse, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlace sintético que les permite hacerse como una sola cadena de proteína en la cual las regiones de VL y VH se combinan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv, por sus siglas en inglés); ver, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tales anticuerpos de cadena sencilla también se desean para comprenderse dentro del término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo. Otras formas de solos anticuerpos de cadena, como diacuerpos también se comprenden. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecífico en los cuales los dominios de VH y VL se expresan en una sola cadena de polipéptido, solamente utilizando un enlace que es demasiado corto para permitir combinarse entre los dos dominios en la misma cadena, de tal modo forzando los dominios a combinarse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión al antígeno (ver, por ejemplo, Holliger, et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, et al. (1994) Structure 2: 1121-1123). Tales porciones de unión al anticuerpo se conocen en la técnica (Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer- Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5).
El término "constructo de anticuerpo" se refiere a un polipéptido que comprende una o más porciones de unión al antígeno de la invención ligadas a un polipéptido de enlace o a un dominio constante de inmunoglobulina. Los polipéptidos de enlace comprendes dos o más residuos de aminoácido unidos mediante enlaces de péptido y se utilizan para ligar una o más porciones de unión al antígeno. Tales polipéptidos de enlace son bien conocidos en la técnica (ver por ejemplo, Holliger, et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, et al. (1994) Structure 2: 1121-1123). Un dominio constante de inmunoglobulina se refiere a un dominio constante de cadena pesada o ligera. Las secuencias de aminoácido de dominio constante de cadena pesada y cadena ligera de IgG humana se conocen en la técnica y se representan en la Tabla 2.
Tabla 2: Secuencia de Dominio constante de cadena pesada y dominio constante de la cadena ligera de IgG humana Un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, puede ser parte de una molécula de inmunoadhesión grande, formada mediante asociación covalente o no covalente del anticuerpo o porción de anticuerpo con una o más otras proteínas o péptidos. Ejemplos de tales moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región de núcleo de estreptavidina para hacer una molécula de scFv tetramérica (Kipriyanov, et al. (1995) Hum. Antibod. Hybridomas 6:93-101) y uso de un residuo de cisteína, un péptido marcador y una etiqueta de polihistidina C-terminal para hacer moléculas de scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov, et al. (1994) Mol. Immunol. 31: 1047-1058). Las porciones del anticuerpo, como fragmentos Fab y F(ab')2, pueden prepararse a partir de anticuerpos enteros utilizando técnicas convencionales, como digestión de papaína o pepsina, respectivamente, de anticuerpos enteros. Por otra parte, los anticuerpos, porciones del anticuerpo y moléculas de inmunoadhesión pueden obtenerse utilizando técnicas de ADN recombinante estándar, como se describen en la presente.
Un "anticuerpo aislado" se refiere a un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, que está libre sustancialmente de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que une específicamente hTNF-a está libre sustancialmente de anticuerpos que unen específicamente antígenos distintos de hTNF-a). Un anticuerpo aislado que une específicamente hTNF-a puede, sin embargo, tener reactividad cruzada a otros antígenos, como moléculas de TNF-a de otras especies. Por otra parte, un anticuerpo aislado puede estar libre sustancialmente de otro material celular y/o productos químicos.
El término "anticuerpo humano" incluye anticuerpos, o porción de unión al antígeno del mismo, que tiene regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácido no codificados mediante secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatorias o de sitio específico in vitro o mediante mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDR y en particular CDR3. Sin embargo, el término "anticuerpo humano", no se desea para incluir anticuerpos en los cuales las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie mamífera, como un ratón, se han injertado sobre secuencias de marco humanas.
El término "anticuerpo humano recombinante" se desea para incluir todos los anticuerpos humanos, o porciones de unión al antígeno del mismo, que son preparadas, expresadas, creadas o aisladas mediante medios recombinantes, como anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora, anticuerpos aislados a partir de un recombinante, biblioteca de anticuerpo humano combinatoria (Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15:62-70; Azzazy and Highsmith (2002) Clin. Biochem. 35: 425-445; Gavilondo y Larrick (2000) BioTechniques 29: 128-145; Hoogenboom y Chames (2000) Immunol. Today 21:371-378), anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humanos (ver, por ejemplo, Taylor et al. (1992) Nucí. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann y Green (2002) Current Opin.Biotechnol. 13:593-597; Little et al. (2000) Immunol. Today 21:364-370) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que involucre empalmar secuencias del gen de inmunoglobulina humana a otras secuencias del ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas a partir de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando un animal transgénico para secuencias humanas de Ig se utiliza, en mutagénesis somática in vivo) y así las secuencias de aminoácido de las regiones de VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, mientras derivan a partir de y relacionan con secuencias de VH y VL de línea germinal humana, no puede existir naturalmente dentro del repertorio de línea germinal del anticuerpo humano in vivo.
El término "anticuerpo quimérico" se refiere a anticuerpos, o porciones de unión al antígeno del mismo, el cual comprende secuencias variables de región de cadena pesada y ligera a partir de una especie y secuencias de región constante a partir de otras especies, como anticuerpos que tienen regiones variables de cadena pesada y ligera murina ligadas a regiones constantes humanas.
El término "anticuerpo injertado con CDR" se refiere a anticuerpos, o porciones de unión al antígeno del mismo, el cual comprende secuencias de región variable de cadena pesada y ligera a partir de una especie pero en las cuáles se sustituyen las secuencias de una o más de las regiones de CDR de VH y/o VL con secuencias de CDR de otras especies, como anticuerpos que tienen regiones variables de cadena pesada y ligera humanas en los cuales una o más de las CDR humanas (por ejemplo, CDR3) se han sustituido con secuencias de CDR murino.
El término "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos, o porciones de unión al antígeno del mismo, el cual comprende secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de una especie no humana (por ejemplo, un ratón) pero en las cuales por lo menos se ha alterado una porción de la secuencia de VH y/o VL para ser más "similar a humana", es decir, más similar a secuencias variables de línea germinal humana. Un tipo de anticuerpo humanizado es un anticuerpo injertado con CDR, en el cual las secuencias de CDR no humanas se introducen en marcos de VH y VL humanas.
Los términos "numeración de Kabat", "definiciones de Kabat" y "etiquetado de Kabat" se utilizan alternativamente en la presente. Estos términos, los cuales se reconocen en la técnica, se refieren a un sistema de residuos de aminoácido de numeración los cuales son más variables (es decir, hipervariable) que otros residuos de aminoácido en las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo, o una porción de unión al antígeno del mismo (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391 y Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91 -3242). Ver también, Martin, "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," In Kontermann y Dübel, eds., Antibodv Engineering (Springer-Verlag , Berlín, 2001), Capítulo 31, especialmente páginas 432-433. Para la región variable de cadena pesada, la región hipervariable oscila de las posiciones de aminoácido 31 a 35 para CDR1, las posiciones de aminoácido 50 a 65 para CDR2, y las posiciones de aminoácido 95 a 106 para CDR3. Para la región variable de cadena ligera, la región hipervariable oscila de las posiciones de aminoácido 24 a 34 para CDR1, las posiciones de aminoácido 50 a 56 para CDR2, y las posiciones de aminoácido 89 a 97 para CDR3.
Los términos "aceptor" y "anticuerpo de aceptor" se refieren al anticuerpo o secuencia del ácido nucleico que proporciona o codifica por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% o 100% de las secuencias de aminoácido de una o más de las regiones de marco. En algunas modalidades, el término "aceptor" se refiere a la secuencia de aminoácidos de anticuerpo o ácido nucleico que proporciona o codifica las regiones constantes. En aún otra modalidad, el término "aceptor" se refiere a la secuencia de aminoácidos de anticuerpo o ácido nucleico que proporciona o codifica una o más de las regiones de marco y las regiones constantes. En una modalidad específica, el término "aceptor" se refiere a una secuencia de aminoácidos de anticuerpo humano o ácido nucleico que proporciona o codifica por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98%, o 100% de las secuencias de aminoácido de una o más de las regiones de marco. De acuerdo con esta modalidad, un aceptor puede contener por lo menos 1, por lo menos 2, por lo menos 3, menos 4, por lo menos 5, o por lo menos 10 residuos de aminoácido que no ocurren en una o más posiciones específicas de un anticuerpo humano. Una región marco de aceptor y/o regiones constantes de aceptor pueden ser, por ejemplo, derivada u obtenida de un gen de anticuerpo de línea germinal, un gen de anticuerpo maduro, un anticuerpo funcional (por ejemplo, anticuerpos bien conocidos en la técnica, anticuerpos en desarrollo, o anticuerpos disponibles comercialmente).
El término "CDR" se refiere a la región determinante de complementariedad dentro de secuencias variables del anticuerpo. Hay tres CDR en cada una de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, las cuales se designan CDR1, CDR2 y CDR3, para cada una de las regiones variables. El término "conjunto de CDR" se refiere a un grupo de tres CDR que ocurren en una sola región variable capaz de unir el antígeno. Los enlaces exactos de estas CDR se han definido diferentemente de acuerdo con diferentes sistemas. El sistema descrito por Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) y (1991)) no sólo proporciona un sistema de numeración del residuo inequívoca aplicable a cualquier región variable de un anticuerpo, sino también proporciona enlaces del residuo exactos que definen las tres CDR. Estas CDR pueden referirse como CDR de Kabat. Chothia y colaboradores (Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917) y Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883) encontraron que ciertas subporciones dentro de las CDR de Kabat adoptan conformaciones de la columna vertebral del péptido casi idénticas, a pesar de que tienen gran diversidad en el nivel de secuencia de aminoácidos. Estas subporciones se diseñaron como L1, L2 y L3 o H1, H2 y H3 donde "L" y el "H" designan las regiones de cadena ligera y cadena pesada, respectivamente. Estas regiones pueden referirse como CDR de Chothia, que tienen enlaces que se traslapan con CDR de Kabat. Otros enlaces que definen las CDR que se traslapan con las CDR de Kabat se han descritos por Padlan (1995) FASEB J. 9: 133-139 y MacCallum (1996) J. Mol. Biol. 262(5):732-745. Aún otras definiciones del enlace de CDR pueden no seguir estrictamente uno de los sistemas anteriores, pero no obstante se traslaparán con las CDR de Kabat, aunque puedan acortarse o alargarse a la luz de los resultados de predicción o experimentales cuyos residuos o grupos de residuos particulares o aún CDR enteras no tienen significativamente impacto sobre la unión al antígeno. Los métodos usados en la presente pueden utilizar CDR definidas de acuerdo con cualquiera de estos sistemas, aunque las modalidades particulares utilicen CDR de Kabat o Chothia definidas.
El término residuo "canónico" se refiere a un residuo en una CDR o un marco que define una estructura de CDR canónica particular como se definió por Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817. De acuerdo con Chothia et al., las porciones críticas de las CDR de muchos anticuerpos tienen confirmaciones de columna vertebral del péptido casi idénticas a pesar de la gran diversidad en el nivel de secuencia de aminoácidos. Cada estructura canónica especifica principalmente un conjunto de ángulos de torsión de la columna vertebral del péptido para un segmento contiguo de residuos de aminoácido que forman un bucle.
Los términos "donante" y "anticuerpo donante" se refieren a anticuerpo que proporciona una o más CDR. En una modalidad particular, el anticuerpo donante es un anticuerpo de una especie diferente del anticuerpo a partir del cual se obtienen o derivan regiones de marco. En el contexto de un anticuerpo humanizado, el término "anticuerpo donante" se refiere a un anticuerpo no humano que proporciona una o más CDR.
El término "marco" o "secuencia de marco" se refiere a las secuencias restantes de una región variable menor de las CDR. Debido a que la definición exacta de una secuencia de CDR puede determinarse por diferentes sistemas, el significado de una secuencia de marco está sometido a diferentes interpretaciones correspondientemente. Las seises CDR (CDR-L1, -L2, y -L3 de cadena ligera y CDR-H1, -H2, y -H3 de cadena pesada) también dividen las regiones de marco en la cadena ligera y la cadena pesada en cuatro subregiones (FR1, FR2, FR3 y FR4) en cada cadena, en la cual CDR1 se coloca entre FR1 y FR2, CDR2 entre FR2 y FR3, y CDR3 entre FR3 y FR4. Sin especificar las subregiones particulares como FR1, FR2, FR3 o FR4, una región marco, como se refirió por otros, representa las FR combinadas dentro de la región variable de una sola cadena de inmunoglobulina que ocurre naturalmente. Una FR representa una de las cuatro subregiones, y las FR representan dos o más de las cuatro subregiones que constituyen una región marco.
Las secuencias aceptoras de cadena pesada y cadena ligera humana se conocen en la técnica. En una modalidad de la invención las secuencias aceptoras de cadena pesada y cadena ligera humana se seleccionan a partir de las secuencias listadas de V-base (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) o de IMGT®, International ImMunoGeneTics information system® (http://imgt.cines.fr/textes/IMGTrepertoire/LocusGenes/). En otra modalidad de la invención las secuencias aceptoras de cadena pesada y cadena ligera humana se seleccionan de las secuencias descritas en la Tabla 3 y la Tabla 4.
Tabla 3: Secuencias Aceptoras de Cadena Pesada El término "gen del anticuerpo de línea germinal" o "fragmento de gen" se refiere a una secuencia de inmunoglobulina codificada mediante células no linfoides que no han experimentado el proceso de maduración que lleva al reacomodo y mutación genética para la expresión de una inmunoglobulina particular (ver, por ejemplo, Shapiro et al. (2002) Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200; Marchalonis et al. (2001) Adv. Exp. Med. Biol. 484: 13-30). Una de las ventajas proporcionadas por varias modalidades de la presente invención parte del reconocimiento de que los genes del anticuerpo de línea germinal son más probables que los genes del anticuerpo maduros para conservar estructuras de secuencia de aminoácidos esenciales características de individuos en la especie, por lo tanto, menos probabilidades de ser reconocidos a partir de una fuente extranjera cuando se usa terapéuticamente en esta especie.
El término residuos "clave" se refiere a ciertos residuos dentro de la región variable que tiene más impacto en la especificidad y/o afinidad de unión de un anticuerpo, en particular un anticuerpo humanizado. Un residuo clave incluye, pero no se limita a, uno o más de los siguientes: un residuo que está adyacente a una CDR, un sitio de glicosilación potencial (por ejemplo, sitio de N- u O-glicosilación), un residuo raro, un residuo capaz de interactuar con el antígeno, un residuo capaz de interactuar con una CDR, un residuo canónico, un residuo de contacto entre la región variable de cadena pesada y región variable de cadena ligera, un residuo dentro de la zona Vernier, y un residuo en la región que se traslapa entre la definición de Chothia de una CDR1 de cadena pesada variable y la definición de Kabat del primer marco de cadena pesada.
El término "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo o una variante, derivado, análogo o fragmento de los mismos que unen inmunoespecíficamente a un antígeno de interés y que comprende una región marco (FR, por sus siglas en inglés) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano y una región determinante complementaria (CDR, por sus siglas en inglés) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo no humano. El término "sustancialmente" en el contexto de una CDR se refiere a una CDR que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% o por lo menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de una CDR de anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente todos de por lo menos uno, y comúnmente dos, dominios variables (Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv) en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones de CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donante) y todas o sustancialmente todas las regiones marco son las de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. En una modalidad particular, un anticuerpo humanizado también comprende por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe, por sus siglas en inglés), comúnmente de una inmunoglobulina humana. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado contiene ambas la cadena ligera así como por lo menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3, y CH4 de la cadena pesada. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado contiene solamente una cadena ligera humanizada. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado contiene solamente una cadena pesada humanizada. En modalidades específicas, un anticuerpo humanizado contiene solamente un dominio variable humanizado de una cadena ligera y/o cadena pesada humanizada.
El anticuerpo humanizado puede seleccionarse de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo, por ejemplo, IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo sin limitación, por ejemplo, lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo, y dominios constantes particulares pueden seleccionarse para optimizar las funciones efectoras deseadas utilizando técnicas bien conocidas en la técnica.
Las regiones marco y de CDR de un anticuerpo humanizado no necesitan corresponder exactamente a las secuencias parentales, por ejemplo, la CDR del anticuerpo donante o el marco de consenso pueden mutagenizarse mediante sustitución, inserción y/o supresión de por lo menos un residuo de aminoácidos de modo que el residuo de CDR o marco en ese sitio no corresponda al anticuerpo donante o al marco de consenso. En una modalidad particular, tales mutaciones no son extensas. Generalmente, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, y por lo menos 95% de los residuos del anticuerpo humanizado corresponderán a los de las secuencias de FR y de CDR parentales. El término "marco de consenso" se refiere a la región marco en la secuencia de inmunoglobulina de consenso. El término "secuencia de inmunoglobulina de consenso" se refiere a la secuencia formada a partir de aminoácidos (o nucleótidos) que ocurren más frecuentemente en una familia de secuencias de inmunoglobulina relacionadas (Ver por ejemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft. Weinheim, Alemania 1987). En una familia de inmunoglobulinas, cada posición en la secuencia de consenso está ocupada por el aminoácido que ocurre más frecuentemente en tal posición en la familia. Si ocurren dos aminoácidos igualmente de manera frecuente, cualquiera puede incluirse en la secuencia de consenso.
El término zona de "Vernier" se refiere a un subconjunto de residuos marco que pueden ajusfar la estructura de CDR y adaptar el ajuste al antígeno como se describe por Foote y Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499. Los residuos de zona Vernier forman una capa que subyacente a las CDR y pueden afectar a la estructura de CDR y la afinidad del anticuerpo.
El término "proteína de unión multivalente" se utiliza en esta especificación para indicar una proteína de unión que comprende dos o más sitios de unión al antígeno. La proteína de unión multivalente puede diseñarse para tener los tres o más sitios de unión al antígeno, y no es generalmente un anticuerpo que ocurre naturalmente. El término "proteína de unión multiespecífico" se refiere a una proteína de unión capaz de unir dos objetivos más relacionados o no relacionados. Las proteínas de unión al dominio variable dual (DVD, por sus siglas en inglés) o inmunoglobulinas de unión al dominio variable dual (DVD-lg, por sus siglas en inglés) como se utiliza en la presente, son proteínas de unión que comprende dos o más sitios de unión al antígeno y son proteínas de unión tetravalentes o multivalentes. Tales DVD-Ig pueden ser monoespecíficas, es decir, capaces de unir un antígeno o multiespecífico, es decir, capaces de unir dos o más antígenos. Las proteínas de unión de DVD-lg que comprende dos polipéptidos de DVD-lg de cadena pesada y dos polipéptidos de DVD-lg de cadena ligera se refieren a una DVD-lg. Cada mitad de una DVD-lg comprende un polipéptido de DVD-lg de cadena pesada, y un polipéptido de DVD-lg de cadena ligera, y dos sitios de unión al antígeno. Cada punto de enlace comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera con un total de 6 CDR involucrados en la unión al antígeno por el sitio de unión al antígeno. Las proteínas de unión a DVD y métodos para hacer proteínas de unión a DVD se describen en el Número de Patente Norteamericana 7,612,181.
Un aspecto de la invención pertenece a una proteína de unión a DVD que comprende proteínas de unión capaces de unir TNF-a. En una modalidad particular, la proteína de unión a DVD es capaz de unir TNF-a y un segundo objetivo.
El término "neutralizante" se refiere a la neutralización de una actividad biológica de una citosina cuando una proteína de unión une específicamente la citosina. En una modalidad particular, una proteína de unión neutralizante es un anticuerpo neutralizante cuya unión al hTNF-a da lugar a la inhibición de una actividad biológica de hTNF-a, por ejemplo, la proteína de unión neutralizante que une hTNF-a y reduce una actividad biológicamente del hTNF-a por lo menos aproximadamente 20%, 40%, 60%, 80%o, 85% o más. La inhibición de una actividad biológica de hTNF-a mediante una proteína de unión neutralizante puede ser determinada midiendo uno o más indicadores de actividad biológica de hTNF-a bien conocida en la técnica. Por ejemplo la neutralización de la citotoxicidad de TNF-a en células L929.
En otra modalidad, el término "agonizante" se refiere a un aumento de una actividad biológica de TNF-a cuando una proteína de unión une específicamente TNF-a, por ejemplo, hTNF-a. En una modalidad particular, una proteína de unión agonizante es un anticuerpo agonístico cuya unión a TNF-a da lugar al aumento de una actividad biológica de TNF-a. En una modalidad particular, la proteína de unión agonística une TNF-a y aumenta una actividad biológicamente de TNF-a por lo menos aproximadamente 20%, 40%, 60%, 80%, 85%, 90%>, 95, 96%, 97%, 98%, 99%, y 100%. Una inhibición de una actividad biológica de TNF-a por una proteína de unión agonística puede ser determinada midiendo uno o más indicadores de la actividad biológica de TNF-a bien conocida en la técnica.
El término "actividad" incluye actividades como la especificidad/afinidad de unión de un anticuerpo para un antígeno, por ejemplo, un anticuerpo anti-hTNF-a que une a un antígeno de TNF-a y/o la potencia neutralizante (o potencia agonizante) de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti- hTNF-a cuya unión a hTNF-a inhibe la actividad biológica de hTNF-a, por ejemplo, la neutralización de la citotoxicidad de TNF-a en células L929.
Los términos "epítopo" o "determinante antigénico" se refieren a un sitio en un antígeno al cual una inmunoglobulina, por ejemplo, un anticuerpo, o uniones del receptor de células T. En ciertas modalidades, los determinantes de epítopo incluyen agrupamientos superficiales activos químicamente de moléculas como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo, o sulfonilo, y, en ciertas modalidades, pueden tener características estructuras tridimensionales específicas, y/o características de carga específica. Un epítopo es una región de un antígeno que está unido mediante un anticuerpo. En ciertas modalidades, un anticuerpo se dice para unir específicamente un antígeno cuando reconoce preferencial su antígeno objetivo en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. Los epítopos pueden formarse de aminoácidos contiguos o de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos se mantienen comúnmente en exposición a los solventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados mediante plegamiento terciario se pierden comúnmente en el tratamiento con solventes desnaturalizantes. Un epítopo incluye comúnmente por lo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos en una conformación espacial única. Métodos para determinar qué epítopos son unidos mediante un anticuerpo dado (es decir, mapeo de epítopo) son bien conocido en la técnica e incluyen, por ejemplo, inmunotransferencia y ensayos de inmunoprecipitación, donde el traslapado o péptidos contiguos de TNF-a se prueba para reactividad con el anticuerpo anti-TNF-a dado. Métodos para determinar la conformación espacial de epítopos incluye técnicas en la técnica y los descrito en la presente, por ejemplo, radiografía la cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional (ver, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Metods in Molecular Bioloqy. Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).
También, comprendidos por la presente invención están los anticuerpos que un epítopo a TNF-a el cual comprende todos o una porción de un epítopo reconocido por los anticuerpos particulares descritos en la presente (por ejemplo, la misma o una región traslapada o una región entre o a través de la región).
También comprendidos por la presente invención están los anticuerpos que unen el mismo epítopo y/o anticuerpos que compiten para unir a TNF-a, por ejemplo, TNF-a humano, con los anticuerpos descritos en la presente. Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo o compiten para la unión pueden identificarse utilizando técnicas rutinarias. Tales técnicas incluyen, por ejemplo, un inmunoensayo, el cual muestra la capacidad de un anticuerpo de bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno objetivo, es decir, un ensayo de unión competitivo. La unión competitiva se determina en un ensayo en el cual la inmunoglobulina bajo prueba inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común, como hTNF-a. Numerosos tipos de ensayos de unión competitivos se conocen, por ejemplo: radioinmunoanálisis directo o indirecto de fase sólida (RIA, por sus siglas en inglés), inmunoensayo de enzima directo o indirecto de fase sólida (EIA, por sus siglas en inglés), ensayo de competición de sándwich (ver Stahli et al. (1983) Metods in Enzymol. 9:242); EIA de biotina-avidina directo de fase sólida (ver Kirkland et al. (1986) J. Immunol. 137:3614); ensayo etiquetado directo de fase sólida, ensayo de sándwich etiquetado directo de fase sólida (ver Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA etiquetado directo de fase sólida utilizando la etiqueta 1-125 (ver Morel et al. (1988) Mol. Immunol. 25(1):7); EIA de biotina-avidina directo (Cheung et al. (1990) Virol. 1 76:546); y RIA etiquetado de fase sólida. (Moldenhauer et al. (1990) Scand. J. Immunol. 32:77). Comúnmente, tal ensayo involucra el uso del antígeno purificado unido a una superficie sólida o células que llevan cualquiera de éstos, una inmunoglobulina de prueba no etiquetada y una inmunoglobulina de referencia etiquetada. La inhibición competitiva es medida determinando la cantidad de enlace etiquetado a la superficie o células sólidas en presencia de la inmunoglobulina de prueba. Generalmente la inmunoglobulina de prueba está presente en exceso.
Generalmente, cuando un anticuerpo competente está presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común por lo menos 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 70-75% o más.
Otras técnicas incluyen, por ejemplo, métodos de mapeo de epítopo, como, análisis de rayos X de cristales del antígeno: complejos de anticuerpo que proporciona resolución atómica de epítopo. Otros métodos monitorean la unión del anticuerpo a fragmentos del antígeno o variaciones mutadas del antígeno donde la pérdida de unión debido a una modificación de un residuo de aminoácidos dentro de la secuencia del antígeno a menudo se considera una indicación de un componente de epítopo. Además, los métodos combinatorios de cómputo para el mapeo de epítopo pueden también utilizarse. Estos métodos se basan en la capacidad del anticuerpo de interés de aislar por afinidad a los péptidos cortos específicos de las bibliotecas combinatorias de péptido de exhibición en fagos. Los péptidos entonces se consideran como guías para la definición del epítopo que corresponde al anticuerpo usado para avaluar la biblioteca de péptido. Para el mapeo de epítopos, los algoritmos de cómputo también se han desarrollado los cuales se han mostrado a epítopos discontinuos conformacionales de mapa.
El término "resonancia del plasmón superficial" se refiere a un fenómeno óptico que permite el ensayo de interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en concentraciones de proteína dentro de una matriz de biosensor, por ejemplo utilizando el sistema de BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, NJ). Para descripciones adicionales, ver Jonsson, et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jonsson, et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131; y Johnsson, et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.
El término "Kon" se refiere a la constante de asociación para la asociación de una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo) al antígeno para formar, por ejemplo, el complejo de anticuerpo/antígeno como se conoce en la técnica. La "Kon" también es conocida por los términos "constante de asociación", o "ka", como se utiliza alternativamente en la presente. Este valor que indica el índice de unión de un anticuerpo a su antígeno objetivo o el índice de formación compleja entre un anticuerpo y antígeno también se muestra por la ecuación a continuación: Anticuerpo ("Ab") + Antígeno ("Ag")?Ab-Ag El término "Koff" se refiere a la constante de disociación para la disociación, o, "constante de disociación", de una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo), a partir del, por ejemplo, complejo de anticuerpo/antígeno como se conoce en la técnica. Este valor indica el índice de disociación de un anticuerpo a partir de su antígeno objetivo o separación del complejo Ab-Ag en un cierto tiempo en el anticuerpo y antígeno libres como se muestra por la ecuación a continuación: Ab + Ag <-Ab-Ag El término "KD" se refiere a la "constante de disociación de equilibrio" y se refiere al valor obtenido en una medida de titulación en equilibrio, o dividiendo la constante de disociación (koff) mediante la constante de asociación (kon). La constante de asociación, constante de índice de disociación y constante de disociación de equilibrio se utilizan para representar la afinidad de unión de un anticuerpo a un antígeno. Métodos para determinar las constantes de índice de asociación y disociación son bien conocidos en la técnica. Utilizando técnicas basadas en fluorescencia ofrece alta sensibilidad y la capacidad de examinar muestras en amortiguadores fisiológicos en equilibrio. Otros procesos e instrumentos experimentales como un ensayo de BIAcore® (análisis de interacción biomolecu lar) pueden usarse (por ejemplo, instrumento disponible de BIAcore International AB, una compañía de GE Healthcare, Uppsala, Suecia). Adicionalmente, puede también utilizarse un ensayo de KinExA® (Análisis Cinético de Exclusión), disponible de Sapidyne Instruments (Boise, Idaho).
El término "proteína de unión etiquetada" se refiere a una proteína con una etiqueta incorporada que proporciona la identificación de la proteína de unión. En una modalidad particular, la etiqueta es un marcador detectable, por ejemplo, la incorporación de un aminoácido radioetiquetado o unido a un polipéptido de partes de biotinilo que pueden detectarse mediante avidina etiquetada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o una actividad enzimática que pueden detectarse mediante métodos ópticos o colorimétricos). Los ejemplos de etiquetas para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H 14C 35S, 90Y, "Te, 111ln, 1251, 131l, 177Lu,, 56Ho, o 153Sm); etiquetas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánido), etiquetas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, luciferasa, fosfatasa alcalina); marcadores quimioluminiscentes; grupos de biotinilo; epítopos de polipéptido predeterminados reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión de metal, etiquetas de epítopo); y agentes magnéticos, como quelatos de gadolinio.
El término "conjugación de anticuerpo" se refiere a una proteína de unión, como un anticuerpo, ligado químicamente a una segunda mitad química, como un agente terapéutico o citotóxico. El término "agente" significa un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto hecho a partir de materiales biológicos. En una modalidad particular, los agentes terapéuticos o citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, toxina de tosferina, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorubicina, daunorubicina, antracindiona de dihidroxi, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaina, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos.
Los términos "cristal" y "cristalizado" se refieren a un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, que existe en la forma de un cristal. Los cristales son una forma del estado sólido de la materia, la cual es distinta de otras formas como el estado sólido cristalino o el estado líquido amorfo. Los cristales se componen de arreglos tridimensionales de repetición regulares de átomos, iones, moléculas (por ejemplo, proteínas como anticuerpos), o montajes moleculares (por ejemplo, complejos de antígeno/anticuerpo) . Estos arreglos tridimensionales se arreglan de acuerdo con las relaciones matemáticas específicas que se entienden bien en el campo. La unidad fundamental, o bloque estructural, que se repite en un cristal se llama la unidad asimétrica. La repetición de la unidad asimétrica en un arreglo que conforma a una simetría cristalográfica bien definida dada proporciona la "célula de unidad" del cristal. La repetición de la célula de unidad mediante traducciones regulares en todas las tres dimensiones proporciona el cristal. Ver Giegé et al., Capítulo 1, In Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach, 2a ed., (Ducruix y Giegé, eds.) (Oxford University Press, New York, 1999), pp. 1-16.
El término "polinucleótido" significa una forma polimérica de dos o más nucleótidos, los ribonucleótidos (ARN, por sus siglas en inglés) o desoxirribonucleótidos (ADN, por sus siglas en inglés) o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de una sola y doble hebra de ADN pero en una modalidad particular es ADN de doble hebra.
El término "polinucleótido aislado" significa un polinucleótido (por ejemplo, de origen genómico, cADN, u sintético, o una cierta combinación del mismo) que, en virtud de su origen, el "polinucleótido aislado": no se asocia con todos o una porción de un polinucleótido con el cual el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza; está ligado operablemente a un polinucleótido que no está ligado en la naturaleza; o no ocurre en la naturaleza como parte de una secuencia más grande.
El término "vector" se refiere a una molécula del ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico a el cual se ha ligado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble hebra circular en el cual los segmentos de ADN adicionales pueden ligarse. Otro tipo de vector es un vector viral, donde los segmentos de ADN adicionales pueden ligarse en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedadora en la cual se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores mamíferos episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores mamíferos no episomales) pueden integrarse en el genoma de una célula hospedadora tras la introducción en la célula hospedadora, y de tal modo se repliegan junto con el genoma hospedador. Por otra parte, ciertos vectores son capaces de diseñarse la expresión de los genes a los cuales se ligan operativamente. Tales vectores se refieren en la presente como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinantes están a menudo en la forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse alternativamente como el plásmido es la forma más usada comúnmente del vector. Sin embargo, la invención se desea para incluir tales otras formas de vectores de expresión, como vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectuosos de replicación, adenovirus y virus adenoasociados), los cuales sirven en funciones equivalentes.
El término "ligado operablemente" se refiere a una yuxtaposición donde los componentes descritos están en una relación que permite que funcionen de su manera deseada. Una secuencia de control "ligada operablemente" a una secuencia codificante se liga de una manera tal que la expresión de la secuencia codificante se alcance bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. Las secuencias "ligadas operablemente" incluyen secuencias de control de expresión que son contiguas con el gen de las secuencias de control de interés y expresión que actúan en el transporte o a una distancia para controlar el gen de interés. El término "secuencia de control de expresión" se refiere a secuencias de polinucleótido que son necesarias para efectuar la expresión y procesamiento de secuencias codificantes a las cuales se ligan. Las secuencias de control de expresión incluyen secuencias apropiadas de iniciación, terminación, promotoras y mejoradoras de transcripción; ARN eficiente que procesa señales como señales de empalme y poliadenilación; secuencias que estabilizan el mARN citoplásmico; secuencias que mejoran la eficacia de traducción (es decir, secuencia de consenso de Kozak); secuencias que mejoran la estabilidad de la proteína; y cuando se desea, secuencias que mejoran la secreción de la proteína. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedador; en procariotas, tales secuencias de control incluyen generalmente el promotor, sitio de enlace ribosomal, y secuencia de terminación de transcripción; en eucariotas, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de transcripción. El término "secuencias de control" se desea para incluir los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y procesamiento, y puede también incluir los componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias asociadas de fusión.
"Transformación" se refiere a cualquier proceso mediante el cual el ADN exógeno entra en una célula hospedadora. La transformación puede ocurrir bajo condiciones naturales o artificiales utilizando varios métodos bien conocidos en la técnica. La transformación puede confiar en cualquier método conocido para la inserción de secuencias del ácido nucleico extranjeras en una célula hospedadora procariótica o eucariótica. Se selecciona el método basado en la célula hospedadora a transformarse y puede incluir, pero sin limitarse a, infección viral, electroporación, lipofección, y bombardeo de partículas. Tales células "transformadas" incluyen células transformadas estables en las cuales el ADN insertado es capaz de replicarse como un plásmido de replicación autónomamente o como parte del cromosoma hospedador. También incluyen células las cuales expresan transitoriamente el ADN o ARN insertado por periodos de tiempo limitados.
El término "célula hospedadora recombinante" (o simplemente "célula hospedadora") se refiere a una célula en la cual se ha introducido el ADN exógeno. Debe entenderse que tales términos se deseas para referirse no solamente a la célula objetivo particular, sino, a la progenie de tal célula. Debido a que pueden ocurrir ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, tal progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula madre, pero todavía se incluye dentro del alcance del término "célula hospedadora". En una modalidad particular, las células hospedadoras incluyen células procarioticas y eucarioticas seleccionadas de cualquier de los Reinos de Seres Vivos. Las células eucarioticas incluyen células protistas, hongos, plantas y animales. En una modalidad particular, las células hospedadoras incluyen pero no se limitan a la línea celular procariótica E. Coli; líneas celulares de mamífero CHO, HEK 293 y COS; línea celular de insecto Sf9; y la célula fungicida Saccharomyces cerevisiae.
Las técnicas estándar pueden utilizarse para el ADN recombinante, síntesis de oligonucleótido, y cultivo y transformación de tejido (por ejemplo, electroporacíón , lipofección). Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación pueden realizarse de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se realizan comúnmente en la técnica o como se describen en la presente. Las técnicas y procedimientos anteriores pueden realizarse generalmente de acuerdo con los métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describen en varias referencias generales y más específicas las cuales se citan y discuten a través de la presente especificación. Ver, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratorv Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)).
"Organismo transgénico" se refiere a un organismo que tiene células que contienen un transgén, donde el transgén introducido en el organismo (o un antepasado del organismo) expresa un polipéptido expresado no naturalmente en el organismo. Un "transgén" es una constructo de ADN, el cual está integrado estable y operablemente en el genoma de una célula a partir de la cual un organismo transgénico que desarrolla, dirigiendo la expresión de un producto de gen codificado en uno o más tipos de célula o tejidos del organismo transgénico.
Los términos "regula" y "modula" se utilizan alternativamente, y, se refiere a un cambio o alteración en la actividad de una molécula de interés (por ejemplo, la actividad biológica de hTNF-a). La modulación puede ser un aumento o una disminución de la magnitud de una cierta actividad o función de la molécula de interés. Actividades y funciones ejemplares de una molécula incluyen, pero no se limitan a, características de unión, actividad enzimática, activación del receptor de célula, y transducción de señal.
Correspondientemente, el término "modulador" es un compuesto capaz de cambiar o alterar una actividad o función de una molécula de interés (por ejemplo, la actividad biológica de hTNF-a). Por ejemplo, un modulador puede causar un aumento o disminución en la magnitud de una cierta actividad o función de una molécula comparada a la magnitud de la actividad o función observada en la ausencia del modulador. En ciertas modalidades, un modulador es un inhibidor, el cual disminuye la magnitud de por lo menos una actividad o función de una molécula. Inhibidores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, proteínas, péptidos, anticuerpos, pepticuerpos, carbohidratos o pequeñas moléculas orgánicas. Los pepticuerpos se describe, por ejemplo, en la Publicación de PCT internacional WO 01/83525.
El término "agonista" se refiere a un modulador que, cuando hace contacto con una molécula de interés, cause un aumento en la magnitud de una cierta actividad o función de la molécula comparada a la magnitud de la actividad o función observada en ausencia del agonista. Los agonistas de interés particulares pueden incluir, pero no se limitan a, polipéptidos de TNF-a o polipéptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, o cualquier otra molécula que une a hTNF-a.
El término "antagonista" o "inhibidor" se refiere a un modulador que, cuando hace contacto con una molécula de interés causa una disminución de la magnitud de una cierta actividad o función de la molécula comparada a la magnitud de la actividad o función observada en ausencia del antagonista. Los antagonistas de interés particulares incluyen aquellos que bloquean o modulan la actividad biológica o inmunológica de TNF-a, por ejemplo, hTNF-a. Antagonistas e inhibidores de hTNF-a pueden incluir, pero sin limitarse a, proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, o cualquier otra molécula, que unen a hTNF-a.
El término "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad de una terapia la cual es suficiente para reducir o mejorar la severidad y/o duración de un trastorno o uno o más de sus síntomas, previene el progreso de un trastorno, causar la regresión de un trastorno, prevenir la recurrencia, desarrollo, aparición o progresión de uno o más síntomas asociados con un trastorno, detectar un trastorno, o mejorar o aumentar los efectos profilácticos o terapéuticos de otra terapia (por ejemplo, agente profiláctico o terapéutico).
El término "muestra" se utiliza en su sentido más amplio en la presente. Una "muestra biológica", incluye, pero no se limita a, cualquier cantidad de una sustancia a partir de un organismo vivo u organismo anteriormente vivo. Tales organismos vivos incluyen, pero no se limitan a, humanos, ratones, ratas, monos, perros, conejos y otros animales. Tales sustancias incluyen, pero no se limitan a, sangre, suero, orina, fluido sinovial, células, órganos, tejidos, médula ósea, nodos linfáticos y bazo.
I. Anticuerpos que Unen TNF-a Humano Un aspecto de la presente invención proporciona anticuerpos monoclonales murinos aislados, o porciones de unión al antígeno de los mismos, que unen a TNF-ct con alta afinidad, una disociación baja y alta capacidad de neutralización. Un segundo aspecto de la invención proporciona anticuerpos quiméricos que unen TNF-a. Un tercer aspecto de la invención proporciona anticuerpos injertados a CDR, o porciones de unión al antígeno de los mismos, que unen TNF-a. Un cuarto aspecto de la invención proporciona anticuerpos humanizados, o porciones de unión al antígeno de los mismos, que unen TNF-a. En una modalidad particular, los anticuerpos, o porciones de los mismos, son anticuerpos aislados. En una modalidad, los anticuerpos de la invención son funciones que neutralizan el anti-TFN-a humano o que modulan el TNF-a humano.
A. Método para Hacer Anticuerpos Anti-TNF-a Los anticuerpos de la presente invención pueden hacerse por cualquiera de un número de técnicas conocidas en la técnica. 1. Anticuerpos Monoclonales Anti-TNF-a Utilizando Tecnología de Hibridoma Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando una gran variedad de técnicas conocidas en la técnica incluyendo el uso de tecnologías de hibridoma, recombinantes, y de exhibición en fago, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse utilizando técnicas de hibridoma incluyendo las conocidas en la técnica y enseñadas, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratorv Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling et al., eds., "Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas," In Research Monographs in Immunology, vol. 3 (J.L. Turk, Editor General) (Elsevier, New York, 1981), pp. 563-587. El término "anticuerpo monoclonal" no se limita a anticuerpos producidos a través de tecnología de hibridoma. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un solo clon, incluyendo cualquier clon eucariótico, procariótico, o fagocítico, y no al método mediante el cual es producido.
Métodos para la producción y cribado de anticuerpos específicos utilizando tecnología de hibridoma son rutinarios y bien conocidos en la técnica. En una modalidad, la presente invención proporciona métodos para generar anticuerpos monoclonales así como anticuerpos producidos mediante el método que comprende cultivar una célula de hibridoma que secreta un anticuerpo de la invención donde el hibridoma es generado fusionando esplenocitos aislados a partir de un ratón inmunizado con un antígeno de la invención con células de mieloma y después cribando los hibridomas que resultan de la fusión para clones de hibridoma que secretan un anticuerpo capaz de unir un polipéptido de la invención.
Brevemente, los ratones pueden inmunizarse con un antígeno de TNF-a. En una modalidad particular, el antígeno de TNF-a se administra con un adyuvante para estimular la inmunorespuesta. Tales adyuvantes incluyen el adyuvante de Freund completo o incompleto, RIBI (dipéptidos de muramilo) o ISCOM (complejos inmunoestimulantes). Tales adyuvantes pueden proteger el polipéptido de rápida dispersión secuestrándolo en un depósito local, o pueden contener sustancias que estimulan al huésped para secretar factores que son químiotácticos para macrófagos y otros componentes del sistema inmune. En una modalidad particular, si se administra un polipéptido, el régimen de inmunización involucrando dos o más administraciones del polipéptido, se extendió a lo largo de varias semanas.
Después de la inmunización de un animal con un antígeno de TNF-a, los anticuerpos y/o células productoras de anticuerpo pueden obtenerse del animal. Un suero que contiene el anticuerpo anti-TNF-a es obtenido a partir del animal sangrando o sacrificando el animal. El suero puede utilizarse como el obtenido del animal, una fracción de inmunoglobulina puede obtenerse del suero, o los anticuerpos anti-TNF-a pueden purificarse a partir del suero. El suero o inmunoglobuiinas obtenidas de este modo es policlonal, así teniendo un arreglo heterogéneo de propiedades.
Una vez que se detectó una inmunorespuesta, por ejemplo, los anticuerpos específicos para el TNF-a de antígeno se detectaron en el suero de ratón, se cosechan en el bazo de ratón y aislan los esplenocitos . Los esplenocitos entonces son fusionados mediante técnicas bien conocidas para cualquiera de las células de mieloma adecuadas, por ejemplo células a partir de la línea celular SP20 disponible de ATCC. Los hibridomas son seleccionados y clonados mediante dilución limitada. Los clones de hibridoma entonces son ensayados mediante métodos conocidos en la técnica para células que secretan anticuerpos capaces de unir TNF-a. El fluido de ascitis, que contiene generalmente altos niveles de anticuerpos, puede generarse inmunizando ratones con clones de hibridoma positivos.
En otra modalidad, los hibridomas inmortalizados productores de anticuerpos pueden prepararse a partir del animal inmunizado. Después de la inmunización, se sacrifica el animal y las células B esplénicas se fusionan a las células de mieloma inmortalizadas como se conoce bien en la técnica. Ver, por ejemplo, Harlow y Lañe, Supra. En una modalidad particular, las células de mieloma no secretan polipéptidos de inmunoglobulina (una línea celular no secretora). Después de la fusión y selección de antibiótico, los hibridomas se criban utilizando TNF-a, o una porción de los mismos, o una célula que expresa TNF-a. En una modalidad particular, el cribado inicial se realiza utilizando un inmunoensayo ligado a enzima (ELISA) o un radioinmunoensayo (RIA), o un ELISA. Un ejemplo de cribado de ELISA se proporciona en la publicación de PCT internacional WO 00/37504.
Los hibridomas productores de anticuerpos anti-TNF-a se seleccionan, clonan y además criban para determinar las características deseables, incluyendo el crecimiento de hibridoma robusto, alta producción de anticuerpo y características del anticuerpo deseables, como se discute además a continuación. Los hibridomas pueden cultivarse y expandirse ¡n vivo en animales singénicos, en animales que carecen de un sistema inmunológico, por ejemplo, ratones desnudos, o en cultivo celular in vitro. Los métodos de selección, clonación y expansión de hibridomas son bien conocidos por los expertos en la técnica.
En una modalidad particular, los hibridomas son hibridomas de ratón, como se describe anteriormente. En otra modalidad particular, los hibridomas se producen en una especie no humana, no ratón como ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado o caballos. En otra modalidad, los hibridomas son hibridomas humanos, en los cuales un mieloma no secretor humano está fusionado con una célula humana que expresa un anticuerpo anti-TNF-a.
Los fragmentos del anticuerpo que reconocen epítopos específicos pueden generarse mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2 de la invención pueden producirse mediante división proteolítica de las moléculas de inmunoglobulina, utilizando enzimas como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Los fragmentos F(ab')2 contienen la región variable, la región constante de cadena ligera y el dominio de CHI de la cadena pesada. 2. Anticuerpos Monoclonales Anti-TNF-a utilizando SLAM En otro aspecto de la invención, los anticuerpos recombinantes se generan de linfocitos simples, aislados utilizando un procedimiento referido en la técnica como el método del anticuerpo de linfocito seleccionado, como se describe en el Número de Patente Norteamericana 5,627,052; Publicación PCT WO 92/02551 y Babcook, et al. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:7843. En este método, las células sencillas que secretan anticuerpos de interés, por ejemplo, linfocitos derivados de cualquiera de los animales inmunizados descritos en la Sección 1, se criban utilizando un ensayo de placa hemolítica específica para el antígeno, donde el TNF-a de antígeno, una subunidad de TNF-a, o un fragmento del mismo, se acopla a glóbulos rojos de oveja utilizando un enlace, como biotina, y se utilizan para identificar las células sencillas que secretan anticuerpos con especificidad para TNF-a. Después de la identificación de células secretoras de anticuerpos de interés, los cADN de región variable de cadena pesada y ligera son rescatados a partir de las células mediante transcriptasa-PCR inversa y estas regiones variables pueden entonces expresarse, en el contexto de regiones constantes de inmunoglobulina apropiadas (por ejemplo, regiones constantes humanas), en células hospedadora de mamífero, como células COS o CHO. Las células hospedadoras transfectadas con las secuencias de inmunoglobulina amplificadas, derivadas de linfocitos seleccionados in vivo, pueden entonces experimentar análisis adicionales y selección in vitro, por ejemplo filtrando las células transfectadas para aislar células que expresan anticuerpos a TNF-a. Las secuencias de inmunoglobulina amplificadas pueden manipularse además in vitro, como mediante métodos de maduración de afinidad in vitro como los descritos en la Publicación PCT WO 97/29131 y Publicación PCT WO 00/56772. 3. Anticuerpos Monoclonales Anti-TNF-a utilizando Animales Transgénicos En otra modalidad de la presente invención, los anticuerpos son producidos inmunizando un animal no humano que comprende alguno, o todo, del lugar de inmunoglobulina humana con un antígeno de TNF-a. En una modalidad particular, el animal no humano es un ratón transgénico de XENOMOUSE, una cepa de ratón diseñada que comprende fragmentos grandes del lugar de inmunoglobulina humana y es deficiente en la producción del anticuerpo de ratón. Ver, por ejemplo, Green et al. (1994) Nature Genet. 7: 13-21 y Patentes Norteamericanas 5,916,771; 5,939,598; 5,985,615; 5,998,209; 6,075,181; 6,091,001; 6,114,598 y 6,130,364. Ver también Publicaciones PCT WO 91/10741, publicadas el 25 de julio de 1991; WO 94/02602, publicada el 3 de febrero de 1994; WO 96/34096 y WO 96/33735, ambas publicadas el 31 de octubre de 1996; WO 98/16654, publicada el 23 de abril de 1998; WO 98/24893, publicada el 11 de junio de 1998; WO 98/50433, publicada el 12 de noviembre de 1998; WO 99/45031, publicada el 10 de septiembre de 1999; WO 99/53049, publicada el 21 de octubre, 1999; WO 00/09560, publicada el 24 de febrero de 2000; y WO 00/37504, publicada el 29 de junio de 2000. El ratón transgénico de XENOMOUSE produce un repertorio humano similar a adulto de anticuerpos humanos completamente, y genera Mabs humano de antígeno específico. El ratón transgénico de XENOMOUSE contiene aproximadamente 80% del repertorio de anticuerpo humano a través de la introducción de megabase clasificada, fragmentos de YAC de configuración de línea germinal del lugar de cadena pesada humana y x lugar de cadena ligera. Ver, Méndez et al. (1997) Nature Genet. 15: 146-156; Green y Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188:483-495. 4. Anticuerpos Monoclonales Anti-TNF-a utilizando Bibliotecas de Anticuerpos Recombinantes Los métodos in vitro también pueden utilizarse para hacer los anticuerpos de la invención, donde una biblioteca de anticuerpos se evalúa para identificar un anticuerpo que tiene la especificidad de unión deseada. Los métodos para tal evaluación de bibliotecas de anticuerpos recombinantes son bien conocidos en la técnica e incluyen los métodos descritos en, por ejemplo, el Número de Patente Norteamericana 5,223,409; Publicaciones PCT WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; y WO 97/29131; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1369-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nucí. Acid Res. 19:4133-4137; y Barbas et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:7978-7982; y Número de Publicación de Patente Norteamericana 2003,0186374.
La biblioteca de anticuerpos recombinante puede ser de un sujeto inmunizado con TNF-a, o una porción de TNF-a.
Alternativamente, la biblioteca de anticuerpos recombinante puede ser de un sujeto sin tratamiento, es decir, uno que no se ha inmunizado con TNF-a, como una biblioteca de anticuerpos humana de un sujeto humano que no se ha inmunizado con TNF-a humano. Los anticuerpos de la invención son seleccionados evaluando la biblioteca de anticuerpos recombinante con el péptido que comprende TNF-a humano de tal modo para seleccionar los anticuerpos que reconocen TNF-a. Los métodos para conducir tal evaluación y selección son bien conocidos en la técnica, como los descritos en las referencias en el párrafo anterior. Para seleccionar anticuerpos de la invención que tiene afinidades de unión particulares para hTNF-a, como los que disocian del TNF-a humano con una constante de disociación koff particular, el método conocido en la técnica de resonancia de plasmón superficial puede utilizarse para seleccionar anticuerpos que tienen la constante de disociación koff deseada. Para seleccionar anticuerpos de la invención que tiene una actividad neutralizante particular para el hTNF-a, como aquellos con una Cl50, los métodos estándar bien conocidos en la técnica para determinar la inhibición de la actividad de hTNF-a pueden utilizarse.
En un aspecto, la invención pertenece a un anticuerpo aislado, o una porción de unión al antígeno del mismo, que une TNF-a, por ejemplo, TNF-a humano. En una modalidad particular, el anticuerpo es un anticuerpo neutralizante. En varias modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante o un anticuerpo monoclonal.
Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención pueden también generarse utilizando varios métodos de exhibición de fago conocidos en la técnica. En métodos de exhibición de fago, los dominios del anticuerpo funcionales se exhibieron en la superficie de las partículas de fago que llevan las secuencias de polinucleótido que las codifican. En particular, tal fago puede utilizarse para exhibir los dominios de unión al antígeno expresados desde una biblioteca del anticuerpo de repertorio o combinatoria (por ejemplo, humana o murina). El fago que expresa un dominio de unión al antígeno que une el antígeno de interés puede seleccionarse o identificarse con el antígeno, por ejemplo, utilizando el antígeno etiquetado o antígeno unido o capturado en una superficie o pelotilla sólida. El fago usado en estos métodos es el fago filamentoso comúnmente que incluye dominios de unión a fd y M13 expresados a partir del fago con Fab, Fv o dominios del anticuerpo de Fv estabilizados con disulfuro fusionados recombinantemente al gen III del fago o proteína del gen VIII de gafo. Ejemplos de métodos de exhibición de fago que pueden utilizarse para hacer los anticuerpos de la presente invención incluyen los descritos en Brinkmann et al. (1995) J. Immunol. Metods 182:41-50; Ames et al. (1995) J. Immunol. Metods 184:177-186; Kettleborough et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:952- 958; Persic et al. (1997) Gene 1879-18; Burton et al. (1994) Adv. Immunol. 57:191-280; Publicaciones PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047 (Número de Solicitud PCT PCT/GB91/01134); WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; y WO 95/20401; y Nos. Patentes Norteamericanas 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 y 5,969,108.
Como se describen en las referencias anteriores, después de la selección de fago, las regiones codificadoras del anticuerpo a partir del fago pueden aislarse y utilizarse para generar anticuerpos enteros incluyendo anticuerpos humanos o cualquier otro fragmento de unión al antígeno deseado, y expresarse en cualquier huésped deseado, incluyendo células de mamífero, células de insecto, células de plantas, levadura, y bacterias, por ejemplo, como se describe detalladamente a continuación. Por ejemplo, técnicas para producir recombinantemente fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 pueden también emplearse utilizando métodos conocidos en la técnica como los descritos en la Publicación PCT WO 92/22324; Mullinax et al. (1992) BioTechniques 12(6):864-869; and Sawai et al. (1995) Am. J. Reprod. Immunol. 34:26-34; y Better et al. (1998) Science 240: 1041-1043. Ejemplos de técnicas que pueden utilizarse para producir Fvs y anticuerpos de cadena sencilla incluyen los descritos en los Números de Patente Norteamericana 4,946,778 y 5,258,498; Huston et al. (1991) Metods Enzymol. 203:46-88; Shu et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:7995-7999; y Skerra et al. (1998) Science 240: 1038-1041.
Alternativa a la evaluación de bibliotecas del anticuerpo recombinantes mediante exhibición de fago, otras metodologías conocidas en la técnica para evaluación de bibliotecas combinatorias grandes puede aplicarse a la identificación de anticuerpos de especificidad dual de la invención. Un tipo de sistema de expresión alternativo es uno en el cual la biblioteca de anticuerpos recombinante se expresa como fusiones de ARN-proteína, como se describen en el Número de Publicación PCT WO 98/31700 y en Roberts y Szostak (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302. En este sistema, una fusión covalente se crea entre un mARN y el péptido o proteína que se codifica mediante traducción in vitro de mARN sintéticos que llevan puromicina, un antibiótico aceptor de peptidilo, en el extremo 3'. Así, un mARN específico puede enriquecerse de una mezcla compleja de los mARN (por ejemplo, una biblioteca combinatoria) basada en las propiedades del péptido o proteína codificada, por ejemplo, anticuerpo, o porción del mismo, como la unión del anticuerpo, o porción del mismo, al antígeno de especificidad dual. Las secuencias del ácido nucleico que codifican anticuerpos, o porciones de los mismos, recuperadas a partir de la evaluación de tales bibliotecas pueden expresarse mediante medios recombinantes como se describe anteriormente (por ejemplo, en células hospedadora de mamífero) y, por otra parte, pueden someterse a maduración de afinidad adicional mediante cualquiera de las redas adicionales de cribado de las fusiones de mARN-péptido en las cuales las mutaciones se han introducido en las secuencias seleccionadas originalmente, o por otros métodos para la maduración de afinidad in vitro de anticuerpos recombinantes, como se describe anteriormente.
En otro proceso los anticuerpos de la presente invención pueden también generarse utilizando métodos de exhibición de levadura conocidos en la técnica. En los métodos de exhibición de levadura, los métodos genéticos se utilizan para unir dominios del anticuerpo a la pared celular de levadura y para exhibirlos en la superficie de la levadura. En particular, tal levadura puede utilizarse para exhibir dominios de unión al antígeno expresados desde una biblioteca de anticuerpos de repertorio o combinatoria (por ejemplo, humana o murina). Ejemplos de métodos de exhibición de levadura que pueden utilizarse para hacer los anticuerpos de la presente invención incluyen los descritos en el Número de Patente Norteamericana 6,699,658 y Frenken et al., Número de Patente Norteamericana 6,114,147. B. Producción de Anticuerpos TNF-a Recombinantes Los anticuerpos de la presente invención pueden producirse mediante cualquiera de un número de técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, expresión de células hospedadora, donde los vectores de expresión que codifica las cadenas pesadas y ligeras son transfectadas en una célula hospedadora mediante técnicas estándar. Las varias formas del término "transfección" se desean para comprender una gran variedad de técnicas usada generalmente para la introducción de ADN exógeno en una célula hospedadora procariótica o eucariótica, por ejemplo, electroporación, precipitación de calcio-fosfato, transfección de DEAE-dextrano y similares. Aunque es posible expresar los anticuerpos de la invención en células hospedadora procarióticas o eucarióticas, se contempla la expresión de anticuerpos en células eucarióticas, por ejemplo, en células hospedadora de mamífero, debido a que tales células eucarióticas (y en particular células de mamífero) son más probables que las células procarióticas para ensamblar y secretar un anticuerpo correctamente doblado e activo inmunológicamente.
Las células hospedadora de mamífero para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen el Ovario de Hámster Chino (células de CHO) (incluyendo células del dhfr-CHO, descritas en Urlaub y Chasin (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas con un marcador seleccionable de DHFR, por ejemplo, como se describen en Kaufman y Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma de NSO, células de COS y células SP2. Cuando los vectores de expresión recombinante que codifican genes del anticuerpo se introducen en células hospedadora de mamífero, los anticuerpos son producidos cultivando las células hospedadora por un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadora o, en particular, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual se hacen crecen las células hospedadora. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteína estándar.
Las células hospedadoras pueden también utilizarse para producir fragmentos del anticuerpo funcionales, como fragmentos Fabs o moléculas de scFv. Se entenderá que variaciones en el procedimiento anterior están dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, puede ser deseable para transfectar una célula hospedadora con ADN que codifica fragmentos funcionales de o la cadena ligera y/o cadena pesada de un anticuerpo de esta invención. La tecnología del ADN recombinante puede también utilizarse para eliminar algunos, o todo, el ADN que codifica cualquiera o ambas de las cadenas pesadas y ligeras que no son necesarias para unir a los antígenos de interés. Las moléculas expresadas a partir de tales moléculas de ADN truncadas también se comprenden por los anticuerpos de la invención. Además, los anticuerpos bifuncionales pueden producirse en los cuales una cadena pesada y ligera son un anticuerpo de la invención y la otra cadena pesada y ligera son específicas para un antígeno con excepción de los antígenos de interés reticulando un anticuerpo de la invención a un segundo anticuerpo mediante métodos de reticulación química estándar.
En un sistema ejemplar para expresión recombinante de un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de la invención, un vector de expresión recombinante que codifica la cadena pesada del anticuerpo y la cadena ligera del anticuerpo se introduce en las células CHO dhfr" mediante transfección mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de cadena pesada y ligera del anticuerpo están cada uno ligados operativamente a elementos reguladores del promotor pontenciador de CMV/AdMLP para conducir altos niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también lleva un gen de DHFR, el cual permite la selección de células CHO que se han transfectado con el vector utilizando la selección de metotrexato/amplificación. Las células hospedadora transformadas seleccionadas se cultivaron para permitir la expresión del anticuerpo de cadenas pesadas y ligeras y el anticuerpo intacto se recuperó del medio de cultivo. Las técnicas de biología molecular estándar se utilizaron para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células hospedadoras, seleccionar los transformantes, cultivar las células hospedadoras y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo. Aún además la invención proporciona un método para sintetizar un anticuerpo recombinante de la invención cultivando una célula hospedadora de la invención en un medio de cultivo adecuado hasta que un anticuerpo recombinante de la invención se sintetice. El método puede comprender además el aislamiento del anticuerpo recombinante del medio de cultivo. 1. Anticuerpos Anti-hTNF-a La Tabla 5 es una lista de secuencias de aminoácidos de regiones de VH y VL (secuencias de CDR en negrita) de anticuerpos anti-hTNF-a de la invención.
Tabla 5. Lista de Secuencias de Aminoácidos de las regiones de VH y VL del Anticuerpo Anti-hTNF-a Murino 2. Anticuerpos Quiméricos Anti-hTNF-a Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual diferentes porciones del anticuerpo se derivan de diferente especie animal, como anticuerpos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de ¡nmunoglobulina humana. Métodos para producir anticuerpos quiméricos se conocen en la técnica y se discute en detalle en el Ejemplo 2.1. Ver, por ejemplo, Morrison (1985) Science 229: 1202; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214-221; Gillies et al. (1989) J. Immunol. Metods 125: 191-202; Números de Patente Norteamericana 5,807,715; 4,816,567; y 4,816,397. Además, pueden utilizarse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al. (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Neuberger et al. (1984), Nature 312:604-608; Takeda et al. (1985) Nature 314:452-454; que empalman genes de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad del antígeno apropiada junto con genes de una molécula de anticuerpo humana de actividad biológica apropiada.
En una modalidad, los anticuerpos quiméricos de la invención son producidos sustituyendo la región constante de cadena pesada de los anticuerpos de TNF-a antihumano monoclonales murinos descritos en la sección 1 por una región constante de lgG1 humana. 3. Anticuerpos Injertado con CDR Anti-TNF-a Los anticuerpos injertados con CDR de la invención comprenden secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de un anticuerpo humano donde una o más de las regiones de CDR de VH y/o VL se sustituyen por secuencias de CDR de los anticuerpos murinos de la invención. Una secuencia de marco de cualquier anticuerpo humano puede servir como el molde para injertar CDR. Sin embargo, el reemplazo de la cadena lineal sobre tal marco lleva a menudo a una cierta pérdida de afinidad de unión al antígeno. Cuanto más homólogo un anticuerpo humano es al anticuerpo murino original, menos probable la posibilidad de combinar los CDR murinos con el marco humano introducirá distorsiones en las CDR que podrían reducir la afinidad. Por lo tanto, en una modalidad, el marco variable humano que es elegido para sustituir el marco variable murino aparte de los CDR tiene por lo menos 65% de identidad de secuencia con el marco de región variable del anticuerpo murino. En una modalidad particular, las regiones variables humana y murina a partir de los CDR tienen por lo menos 70% de identidad de secuencia. En una modalidad particular, las regiones variables humana y murina aparte de los CDR tienen por lo menos 75% de identidad de secuencia. En una modalidad particular, las regiones variables humana y murina aparte de los CDR tienen por lo menos 80% de identidad de secuencia. Métodos para producir anticuerpos quiméricos se conoce en la técnica y se discuten en detalle en el Ejemplo 2.2. (También ver Número de Patente EP 0 239 400; Publicación PCT WO 91/09967; Números de Patente Norteamericana 5,225,539; 5,530,101; y 5,585,089), recubrimiento o revestimiento (EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan (1991) Mol. Immunol. 28(4/5):489-498; Studnicka et al. (1994) Protein Eng. 7(6): 805-814; Roguska et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:969-973), y transposición de cadena (Número de Patente Norteamericana 5,565,352).
En una modalidad específica la invención proporciona anticuerpos injertados a CDR con cadenas de VH y/o VL como se describen en la Tabla 6.
Tabla 6: Anticuerpos injertados a CDR 4. Anticuerpos Humanizados Anti-hTNF Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo a partir del anticuerpo se especie no humana que une el antígeno deseado que tiene una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) de la especie no humana y regiones de marco de una molécula de humana inmunoglobulina. Se describen secuencias de Ig humanas conocidas, por ejemplo, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp. html; www. public. ¡asíate. edu/.about.pedro/research_tools. html; www. mgen . uni-heidelberg de/SD/IT/IT. html; www.whfreeman.com/immunology/CH-05/kuby05.htm; www.library.th i nkquest.org/12429/lmmune/Antibody.html; www. hh mi.org/grants/lectu res/ 1996/vlab/; www.path.cam.ac.uky.about.mrc7/m-ikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/lmmuno-logy. html. www. immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.-html; www. biotech . ufl .edu/. about. hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html-; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehime-u. a cjp/. about. yasuhito-/ Elisa. html; www.biodesign.com/table.asp; www. icnet. uk/axp/facs/d avies/1 i n-ks. html; www. biotech . ufl .edu/. about.fccl/protocol. html ; www. isac-net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP-Start.html; base rv. uci.kun.nl/. about. j ra a ts/linksl. html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu-blic/l NTR0.html; www. ibt. unam.mx/ ir/V_mice.html; ¡mgt.cnusc.fr:8104/; www. bioch em. u el. ac. u k/. a bout.martin abs/i ndex.html; antibody.bath.ac.uk; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www. un izh.ch/. a bout.honegger/AHOsem-i na r/S lideOl.html; www. cry s t. bbk.ac.uk/. abo ut.ubcg 07s/; www. nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www. path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h-uman¡sation/TAHHP. html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www. cry st. bioc. cam.ac.uk/. a bo-ut.fmo I i n a/Web -pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983. Tales secuencias importadas pueden utilizarse para reducir la inmunogenicidad o reducir, mejora o modificar la unión, afinidad, constante asociada, constante de disociación, avidez, especificidad, vida media, o cualquier otra característica adecuada, como se conoce en la técnica.
Los residuos de marco en las regiones de marco humanas pueden sustituirse con el residuo correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, mejorar, unir al antígeno. Estas sustituciones del marco son identificadas mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante modelado de las interacciones de los residuos de CDR y marco para identificar residuos de marco importantes para la unión al antígeno y comparación de secuencia para identificar residuos de marco inusuales en posiciones particulares. (Ver, por ejemplo, Número de Patente Norteamericana 5,585,089; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327). Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están disponibles comúnmente y son familiares a los expertos en la técnica. Los programas de computadora están disponibles los cuales ilustran y exhiben estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidata seleccionadas. La inspección de estas exhibiciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidata de unir su antígeno. De esta manera, los residuos de FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de secuencias consenso e importación de modo que la característica del anticuerpo deseado, como una mayor afinidad por los antígenos objetivo, se consigue. En general los residuos de CDR están directa y más sustancialmente involucrados de influenciar la unión al antígeno. Los anticuerpos pueden humanizarse utilizando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, como pero sin limitarse a las descritas en Jones et al. (1986) Nature; 321:522-525; Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536; Sims et al. (1993) J. Immunol. 151: 2296-2308; Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901 -917; Cárter et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:4285-4289; Presta et al. (1993) J. Immunol. 151:2623-2632; Padlan (1991) Mol. Immunol. 28(4/5):489-498; Studnicka et al. (1994) Protein Engineering 7(6): 805-814; Roguska. et al. (1994) Proc. Nail. Acad. Sci. USA 91:969-973; Nos. de Publicación PCT WO 91/09967, WO 99/06834 (Número de Solicitud Internacional PCT/US98/ 16280), WO 97/20032 (Número de Solicitud PCT/US96/18978), WO 92/11272 (Número de Solicitud PCT/US91/09630), WO 92/03461 (Número de Solicitud PCT/US91/05939), WO 94/18219 (Número de Solicitud PCT/US94/01234), WO 92/01047 (Número de Solicitud PCT/GB91/01134), WO 93/06213 (Número de Solicitud PCT/GB92/01755), WO 90/14443, WO 90/14424, y WO 90/14430; Números de Publicación Europea EP 0 592 106, EP 0 519 596, y EP 0 239 400, Números de Patente Norteamericana 5,565,332; 5,723,323; 5,976,862; 5,824,514; 5,817,483; 5,814,476; 5,763,192; 5,723,323; 5,766,886; 5,714,352; 6,204,023; 6,180,370; 5,693,762; 5,530, 101; 5,585,089; 5,225,539; y 4,816,567.
C. Producción de Anticuerpos y Línea Celular para Producir el Anticuerpo En una modalidad, los anticuerpos anti-TNF-a de la presente invención, exhiben una alta capacidad de reducir o neutralizar la actividad de TNF-a, por ejemplo, como se determinó por cualquiera de varios ensayo in vitro e ¡n vivo conocidos en la técnica. Alternativamente, los anticuerpos anti-TNF-a de la presente invención, también exhiben una alta capacidad de aumentar o agonizar la actividad de TNF-a.
En modalidades particulares, el anticuerpo aislado, o porción de unión al antígeno del mismo, une TNF-a humano, donde el anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, se disocia del TNF-a humano con una constante de disociación Koff de aproximadamente 0.1s'1 o menos, como se determinó mediante resonancia de plasmón superficial, o que inhibe la actividad de TNF-a humano con una Cl50 de aproximadamente 1 x 10"6 o menos. Alternativamente, el anticuerpo, o una porción de unión al antígeno del mismo, puede disociarse del TNF-a humano con una constante de disociación Koff de aproximadamente 1 x 10"2s'1 o menos, como se determinó mediante resonancia de plasmón superficial, o puede inhibir la actividad del TNF-a humano con una Cl50 de aproximadamente 1 x 10"7M o menos. Alternativamente, el anticuerpo, o una porción de unión al antígeno del mismo, puede disociarse del TNF-a humano con una constante de disociación Koff de aproximadamente 1 10"3s"1 o menos, como se determinó mediante resonancia de plasmón superficial, o puede inhibir la actividad del TNF-a humano con una Cl50 de aproximadamente 1 10"8M o menos. Alternativamente, el anticuerpo, o una porción de unión al antígeno del mismo, puede disociarse del TNF-a humano con una constante de disociación K0ff de aproximadamente 1 x 10"4s"1 o menos, como se determinó mediante resonancia de plasmón superficial, o puede inhibir la actividad del TNF-a humano con una Cl50 de aproximadamente 1 x 10"9M o menos. Alternativamente, el anticuerpo, o una porción de unión al antígeno del mismo, puede disociarse del TNF-a humano con una constante de disociación Koff de aproximadamente 1 x 10"5s"1 o menos, como se determinó mediante resonancia de plasmón superficial, o puede inhibir la actividad del TNF-a humano con una Cl50 de aproximadamente 1 x 10"10M o menos. Alternativamente, el anticuerpo, o una porción de unión al antígeno del mismo, puede disociarse del TNF-a humano con una constante de disociación Ko de aproximadamente 1 x 10"5s"1 o menos, como se determinó mediante resonancia de plasmón superficial, o puede inhibir la actividad del TNF-a humano con una CI50 de aproximadamente 10"11M o menos.
En ciertas modalidades, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada, como una región constante de lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM o IgD. En una modalidad, la región constante de cadena pesada es una región constante de cadena pesada de lgG1 o una región constante de cadena pesada de lgG4. Además, el anticuerpo puede comprender una región constante de cadena ligera, una región constante de cadena ligera kappa o una región constante de cadena ligera lambda. En otra modalidad, el anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera kappa. Alternativamente, la porción de anticuerpo puede ser, por ejemplo, un fragmento Fab o un fragmento Fv de cadena sencilla.
Los reemplazos de residuos de aminoácidos en la porción Fe para alterar la función efectora del anticuerpo se conocen en la técnica (ver los Números de Patente Norteamericana 5,648,260 y 5,624,821). La porción Fe de un anticuerpo media varias funciones efectoras importantes, por ejemplo, inducción de citosina, ADCC, fagocitosis, citotoxicidad dependiente de complemento (CDC, por sus siglas en inglés) e índice de vida media/separación de complejos del anticuerpo y antígeno-anticuerpo. En algunos casos estas funciones efectoras son deseables para el anticuerpo terapéutico pero en otros casos pueden ser innecesarias o aún deletéreas, dependiendo de los objetivos terapéuticos. Ciertos isotipos IgG humanos, particularmente I g G 1 e lgG3, ADCC y CDC mediato a través de unir a FcyRs y complemento C1q, respectivamente. Los receptores Fe neonatales (FcRn, por sus siglas en inglés) son los componentes críticos que determinan la vida media de circulación de anticuerpos. En aún otra modalidad por lo menos un residuo de aminoácidos se sustituye en la región constante del anticuerpo, por ejemplo la región Fe del anticuerpo, tal que las funciones efectoras del anticuerpo son alteradas.
Una modalidad proporciona una proteína de unión etiquetada donde un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención se deriva o liga a otra molécula funcional (por ejemplo, otro péptido o proteína). Por ejemplo, una proteína de unión etiquetada de la invención puede derivarse ligando funcionalmente un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención (mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más otras entidades moleculares, como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo), un agente detectable, un agente citotóxico, un agente farmacéutico, y/o una proteína o péptido que puede mediar el asociado del anticuerpo o porción de anticuerpo con otra molécula (como una región de núcleo de núcleo de estreptavidina o una etiqueta de polihistidina).
Los agentes detectables útiles con los cuales un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención puede derivarse incluyen compuestos fluorescentes. Los agentes detectables fluorescentes ejemplares incluyen fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1 -nafalensulfonilo, ficoeritrina y similares. Un anticuerpo puede también derivarse con enzimas detectables, como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, oxidasa de glucosa y similares. Cuando un anticuerpo se deriva con una enzima detectable, es detectado agregando los reactivos adicionales que la enzima utiliza para producir un producto de reacción detectable. Por ejemplo, cuando la peroxidasa de rábano picante del agente detectable está presente, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina lleva a un producto de reacción coloreado, el cual es detectable. Un anticuerpo puede también derivarse con biotina, y detectado a través de la medida indirecta de la unión de avidina o estreptavidina.
Otra modalidad de la invención proporciona una proteína de unión cristalizada. En una modalidad, la invención se relaciona con cristales de anticuerpos y fragmentos anti-TNF-a enteros de los mismos como se describe en la presente, y formulaciones y composiciones que comprende tales cristales. En una modalidad la proteína de unión cristalizada tiene una mayor vida media in vivo que las contrapartes solubles de la proteína de unión. En otra modalidad la proteína de unión conserva la actividad biológica después de la cristalización.
La proteína de unión cristalizada de la invención puede producirse de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica y como se describe en la publicación PCT WO 02/72636.
Otra modalidad de la invención proporciona una proteína de unión glicosilada donde el anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo comprende uno o más residuos de carbohidrato. La producción de proteína in vivo naciente puede experimentar transformación adicional, conocida como modificación después de translación. En particular, los residuos de azúcar (glicosilo) pueden agregarse enzimáticamente, un proceso conocido como glicosilación. Las proteínas resultantes que llevan cadenas laterales de oligosacárido ligadas covalentemente se conocen como proteínas glicosiladas o glicoproteínas. La glicosilación de proteína depende de la secuencia de aminoácidos de la proteína de interés, así como la célula hospedadora en la cual se expresa la proteína. Diferentes organismos pueden producir diferentes enzimas de glicosilación (por ejemplo, glicosiltransferasas y glicosidasas), y tienen diferentes sustratos (azúcares de nucleótido) disponibles. Debido a tales factores, el patrón de glicosilación de proteína, y composición de residuos glicosilo, puede diferir dependiendo del sistema hospedador en el cual se expresa la proteína particular. Los residuos glicosilo útiles en la invención pueden incluirse, pero no se limitan a, glucosa, galactosa, mañosa, fucosa, n-acetilglucosamina y ácido siálico. En una modalidad, la proteína de unión glicosilada comprende residuos glicosilo tal que el patrón de glicosilación es humano.
Se conoce por los expertos en la técnica que la glicosilación de proteína de diferenciación puede dar lugar a características de proteína de diferenciación. Por ejemplo, la eficacia de una proteína terapéutica producida en un huésped de microorganismo, como levadura, y glicosilado utiliza la trayectoria endógena de levadura puede reducirse comparada a la de la misma proteína expresada en una célula mamífera, como una línea celular CHO. Tales glicoproteínas pueden también ser inmunogenéticas en humanos y mostrar vida media reducida ¡n vivo después de la administración. Los receptores específicos en humanos y otros animales pueden reconocer residuos glicosilo específicos y promover la separación rápida de la proteína de la circulación sanguínea. Otros efectos adversos pueden incluir cambios en el plegamiento de proteínas, solubilidad, susceptibilidad a proteasas, tráfico, transporte, compartimentalización, secreción, reconocimiento por otras proteínas o factores, antigenicidad, o alergenicidad. Por consiguiente, un practicante puede preferir una proteína terapéutica con una composición y patrón específicos de glicosilacion, por ejemplo composición de glicosilacion y patrón idéntico, o por lo menos similar, a la producida en células humanas o en las células de especie especifica del animal objeto deseado.
La expresión de proteínas glicosiladas diferentes de la de una célula hospedadora puede alcanzarse modificando genéticamente la célula hospedadora para expresar enzimas de glicosilación heterólogas. Utilizando técnicas conocidas en la técnica un practicante puede generar anticuerpos o porciones de unión al antígeno de los mismos que exhiben la glicosilación de la proteína humana. Por ejemplo, cepas de levadura que se han modificado genéticamente para expresar enzimas de glicosilación que ocurren no naturalmente tal que las proteínas glicosiladas (glicoproteínas) producidas en estas cepas de levadura exhiben glicosilación de proteína idéntica a la de células animales, especialmente células humanas (Números de Patente Norteamericana 7,449,308 y 7,029,872).
Además, se apreciará por el experto en la técnica que una proteína de interés puede expresarse utilizando una biblioteca de células hospedadora diseñadas genéticamente para expresar varias enzimas de glicosilación, tal que las células hospedadora de miembro de la biblioteca producen la proteína de interés con patrones de glicosilación variables. Un practicante puede después seleccionar y aislar la proteína de interés con patrones del glicosilación de novedad particulares. En una modalidad, la proteína que tiene un patrón de glicosilación de novedad nuevo seleccionado particularmente exhibe propiedades biológicas mejoradas o alteradas.
D. Usos de anticuerpos Anti-TNF-a Dada su capacidad de unir a TNF-a humano, por ejemplo, los anticuerpos de TNF-a anti-humano, o las porciones de los mismos, de la invención pueden utilizarse para detectar TNF-c (por ejemplo, en una muestra biológica, como suero o plasma), utilizando un inmunoensayo convencional, como un ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA, por sus siglas en inglés), un radioinmunoensayo (RIA) o inmunohistoquímica de tejido. La invención proporciona un método para detectar TNF-a en una muestra biológica que comprende poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención y detectar el anticuerpo (o porción de anticuerpo) ligada a TNF-a o al anticuerpo desligado (o porción de anticuerpo), para así detectar TNF-a en la muestra biológica. El anticuerpo se etiqueta directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo enlazado o desenlazado. Las sustancias detectables adecuadas incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos del grupo prostético adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; y ejemplos de material radioactivo adecuados incluyen 3H 14C 35S, 90Y, "Te, 1 In, 125l, 13 1, 77Lu, 166Ho, o 153Sm.
La alternativa para etiquetar el anticuerpo, TNF-a humano puede ensayarse en fluidos biológicos mediante un inmunoensayo de competición que utiliza estándares de rhTNF-a etiquetados con una sustancia detectable y un anticuerpo TNF-a anti-humano no etiquetado. En este ensayo, se combinan la muestra biológica, estándares de rhTNF-a etiquetados y el anticuerpo TNF-a antihumano y la cantidad de estándar de rhTNF-a etiquetado enlazado al anticuerpo no etiquetado es determinante. La cantidad de TNF-a humano en la muestra biológica es inversa proporcionalmente a la cantidad de estándar de rhTNF-a etiquetado enlazado al anticuerpo anti-TNF-a. Similarmente, el TNF-a humano puede también ensayarse en fluidos biológicos mediante un inmunoensayo de competición que utiliza estándares de rhTNF-a etiquetados con una sustancia detectable y un anticuerpo de TNF-a anti-humano no etiquetado.
En una modalidad, los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención son capaces de neutralizar la actividad de TNF-a, por ejemplo, actividad de TNF-a humano, ¡n vitro e in vivo. En otra modalidad, los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención son capaces de aumentar o agonizar la actividad de TNF-a humano, por ejemplo, actividad de TNF-a humano. Por consiguiente, tales anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención pueden utilizarse para inhibir o aumentar la actividad de hTNF-a, por ejemplo, en un cultivo celular que contiene hTNF-a, en sujetos humanos o en otros sujetos mamíferos que tienen TNF-a con el cual un anticuerpo de la invención reacciona de forma cruzada. En una modalidad, la invención proporciona un método para inhibir o aumentar la actividad de hTNF-a que comprende poner en contacto hTNF-a con un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención tal que la actividad de hTNF-a es inhibida o aumentada. Por ejemplo, en un cultivo celular que contiene, o sospecha de contener hTNF-a, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención puede agregarse al medio de cultivo para inhibir o aumentar la actividad de hTNF-a en el cultivo.
En otra modalidad, la invención proporciona un método para reducir o aumentar la actividad de hTNF-a en un sujeto, ventajosamente a partir de un sujeto que sufre de una enfermedad o trastorno en el cual la actividad de TNF-a es perjudicial o, alternativamente, benéfica. La invención proporciona métodos para reducir o aumentar la actividad de TNF-a en un sujeto que sufre de tal enfermedad o trastorno, cuyo método comprende administrar al sujeto un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención tal que la actividad de TNF-a en el sujeto es reducida o aumentada. En una modalidad particular, el TNF-a es TNF-a humano, y el sujeto es un sujeto humano. Alternativamente, el sujeto puede ser un mamífero que expresa un TNF-a al cual un anticuerpo de la invención es capaz de unir. Aún además el sujeto puede ser un mamífero en el cual se ha introducido el TNF-a (por ejemplo, mediante la administración de TNF-a o mediante expresión de un transgén de TNF-a). Un anticuerpo de la invención puede administrarse a un sujeto humano para propósitos terapéuticos. Por otra parte, un anticuerpo de la invención puede administrarse a un mamífero no humano que expresa un TNF-a con el cual el anticuerpo es capaz de unir para propósitos veterinarios o como modelo animal de la enfermedad humana. Con respecto a este último, tales modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de anticuerpos de la invención (por ejemplo, prueba de dosificaciones y cursos de tiempo de la administración).
El término "un trastorno en el cual la actividad de TNF-a es perjudicial" incluye enfermedades y otros trastornos en los cuales la presencia de actividad de TNF-a en un sujeto que sufre del trastorno se ha mostrado que es o se sospecha que es responsable ya sea de la patofisiolog ía del trastorno o un factor que contribuye a un empeoramiento del trastorno. Por consiguiente, un trastorno en el cual la actividad de TNF-a es perjudicial es un trastorno en el cual se espera la reducción de la actividad de TNF-a alivie los síntomas y/o progresión del trastorno. Tales trastornos pueden evidenciarse, por ejemplo, mediante un aumento en la concentración de TNF-a en un fluido biológico de un sujeto que sufre del trastorno (por ejemplo, un aumento en la concentración de TNF-a en suero, plasma, fluido sinovial, etcétera del sujeto), que puede detectarse, por ejemplo, utilizando un anticuerpo anti-TNF-a como se describe anteriormente. Ejemplos no limitantes de trastornos que pueden tratarse con los anticuerpos de la invención incluyen aquellos trastornos discutidos en la sección a continuación pertenecientes a composiciones farmacéuticas de los anticuerpos de la invención .
Alternativamente, el término "un trastorno en el cual la actividad de TNF-a es benéfica" incluye enfermedades y otros trastornos en los cuales la presencia de actividad de TNF-a en un sujeto que sufre del trastorno se ha mostrado que es o se sospecha que es responsable ya sea de la patofisiolog ía del trastorno o un factor que contribuye a un tratamiento del trastorno. Por consiguiente, un trastorno en el cual la actividad de TNF-a es benéfica es un trastorno en el cual se espera que un aumento de actividad de TNF-a alivie los síntomas y/o progresión del trastorno. Ejemplos no limitantes de trastornos que pueden tratarse con los anticuerpos de la invención incluyen aquellos trastornos discutidos en la sección a continuación pertenecientes a composiciones farmacéuticas de los anticuerpos de la invención.
E. Composiciones Farmacéuticas La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de la invención y un portador aceptable farmacéuticamente. Las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos de la invención son para uso en, pero sin limitarse a, diagnóstico, detección, o monitoreo de un trastorno, en la prevención, tratamiento, manejo, o mejoramiento de un trastorno o uno o más síntomas del mismo, y/o en la investigación. En una modalidad específica, una composición comprende uno o más anticuerpos de la invención. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende uno o más anticuerpos de la invención y uno o más agentes profilácticos o terapéuticos con excepción de anticuerpos de la invención para tratar un trastorno en el cual la actividad de TNF-a es perjudicial. En una modalidad particular, los agentes profilácticos o terapéuticos conocidos por ser útiles para o que han sido o actualmente se están utilizando en la prevención, tratamiento, administración, o mejoramiento de un trastorno o uno o más síntomas del mismo. De acuerdo con estas modalidades, la composición puede comprenderse adicionalmente de un portador, diluyente o excipiente.
Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a un sujeto. Comúnmente, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención y de un portador aceptable farmacéuticamente. El término "portador aceptable farmacéuticamente" incluye cualquiera y todos los solventes, medio de dispersión, recubrimiento, agentes antibacterianos y antihongos, agentes retardadores isotónicos y absorción, y similares que son compatible fisiológicamente. Ejemplos de portadores aceptables farmacéuticamente incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina amortiguada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes como manitol, sorbitol, o cloruro sódico en la composición, pueden incluirse. Portadores aceptables farmacéuticamente pueden comprender además cantidades menores de sustancias auxiliares como agentes humectantes o emulsionantes, conservadores o amortiguadores, que mejoran la vida útil o eficacia del anticuerpo o porción de anticuerpo.
Varios sistemas de liberación se conocen y pueden utilizarse para administrar uno o más anticuerpos de la invención o la combinación de uno o más anticuerpos de la invención y un agente profiláctico o agente terapéutico útil para prevenir, manejar, tratar, o mejorar un trastorno o uno o más síntomas del mismo, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, endocitosis mediada por receptor (ver, Wu y Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432), construcción de un ácido nucleico como parte de un retroviral u otro vector, etcétera. Métodos para administrar un agente profiláctico o terapéutico de la invención incluyen, pero no se limitan a, administración parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea), administración epidural, administración intratumoral, y administración mucosal (por ejemplo, rutas intranasales y orales). Además, la administración pulmonar puede emplearse, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente aerosolizante. Ver, por ejemplo, Números de Patente Norteamericana 6,019,968; 5,985,320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; and 5,290,540; y Nos. de Publicaciones PCT WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, y WO 99/66903. En una modalidad, un anticuerpo de la invención, terapia de combinación, o una composición de la invención se administran utilizando la tecnología de liberación de fármaco pulmonar de AIkermes AIR® (AIkermes, Inc., Cambridge, Mass.). En una modalidad específica, los agentes profilácticos o terapéuticos de la invención se administraron intramuscular, intravenosa, intratumoral, oral, intranasal, pulmonar, o subcutáneamente. Los agentes profilácticos o terapéuticos pueden administrarse mediante cualquier ruta conveniente, por ejemplo mediante inyección de infusión o bolo, mediante absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosal oral, mucosal rectal e intestinal, etcétera) y pueden administrarse junto con otros agentes activos biológicamente. La administración puede ser sistémica o local.
En una modalidad específica, puede ser deseable administrar los agentes profilácticos o terapéuticos de la invención localmente al área en necesidad de tratamiento; esto puede alcanzarse con, por ejemplo, y no por medo de limitación, infusión local, mediante inyección, o por medio de un implante, el implante que es de un material poroso o no poroso, incluyendo membranas y matrices, como membranas sialásticas, polímeros, matrices fibrosas (por ejemplo, Tissuel®), o matrices de colágeno. En una modalidad, una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de antagonistas de la invención se administró localmente al área afectada a un sujeto para prevenir, tratar, manejar, y/o mejorar un trastorno o un síntoma del mismo. En otra modalidad, una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención se administró localmente al área afectada en combinación con una cantidad efectiva de una o más terapias (por ejemplo, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos) con excepción de un anticuerpo de la invención de un sujeto para prevenir, tratar, manejar, y/o mejorar un trastorno o uno o más síntomas del mismo.
En otra modalidad, el agente profiláctico o terapéutico puede suministrase en un sistema de liberación controlada o un liberación continua. En una modalidad, una bomba puede usarse para alcanzar la liberación controlada o sostenida (ver Langer, supra; Sefton (1987) CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al. (1980) Surgery 88:507-516; Saudek et al. (1989) N. Engl. J. Med. 321:574-579). En otra modalidad, los materiales poliméricos pueden utilizarse para alcanzar la liberación controlada o sostenida de las terapias de la invención (ver por ejemplo, Goodson, J.M., Capítulo 6, In Medical Applications of Controlled Reléase. Vol. II. Applications and Evaluation, (Langer y Wise, eds.) (CRC Press, Inc., Boca Ratón, 1984), pp. 115-138; Controlled Druq Bioavailabilitv, Drug Product Desiqn and Performance, (Smolen y Ball, eds.) (Wiley, New York, 1984); Langer and Peppas (1983) J Macrornol. Sci. Rev. Macromol. Chem. Phys. C23(l):61 -126; ver también Levy et al. (1985) Science 228: 190-192; During et al. (1989) Ann. Neurol. 25:351-356; Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71: 105-112); Números de Patente Norteamericana 5,679,377; 5,916,597; 5,912,015; 5,989,463; and 5,128,326; y Publicaciones PCT WO 99/15154 y WO 99/20253. Ejemplos de polímeros usados en formulaciones de liberación sostenida incluyen, pero no se limitan a, poli(2-hidroxietilmetacrilato), poli(metilmetacrilato), poli(ácido acrílico), poli(etilen-co-vinilacetato), poli(ácido metacrílico), poliglicólidos (PLG, por sus siglas en inglés), polianhídridos, poli(N-vinilpirrolidona), poli(vinilalcohol), poliacrilamida, poli(etilenglicol), polilactidas (PLA, por sus siglas en inglés), poli(lactida-co-glicolidas) (PLGA, por sus siglas en inglés), y poliortoéstres. En una modalidad particular, el polímero usado en una formulación de liberación sostenida es inerte, libre de impurezas lixiviables, estable en almacenamiento, estéril, y biodegradable. En aún otra modalidad, un sistema de liberación controlada o sostenida puede colocarse en proximidad del objetivo profiláctico o terapéutico, así requiriendo solamente una fracción de la dosis sistémica (ver, por ejemplo, Goodson, In Medical Applications of Controlled Reléase. Vol. II, supra, pp. 115-138 (1984).
Los sistemas de liberación controlada son discutidos en la revisión por Langer (1990, Science 249: 1527-1533). Cualquier técnica conocida por un experto en la técnica puede utilizarse para producir formulaciones de liberación sostenidas que comprenden uno o más agentes terapéuticos de la invención. Ver, por ejemplo, Número de Patente Norteamericana 4,526,938; Publicación PCT WO 91/05548; Publicación PCT WO 96/20698, Ning et al. (1996) Radiotherapy Oncol. 39: 179-189; Song et al. (1996) PDA J. Phartn. Sci. Technol. 50:372-377; Cleek et al. (1997) Proceed. Int'l. Symp. Control. Reí. Bloact. Mater. 24:853-854, y Lam et al. (1997) Proceed. Int'l. Symp. Control Reí. Bioact. Matter. 24:759-760.
En una modalidad específica, donde la composición de la invención es un ácido nucleico que codifica un agente profiláctico o terapéutico, el ácido nucleico puede administrarse in vivo para promover la expresión de su agente profiláctico o terapéutico codificado, construyéndola como parte de un vector de expresión del ácido nucleico apropiado y administrándola de modo que llegue a ser intracelular, por ejemplo, mediante el uso de un vector retroviral (ver Número de Patente Norteamericana 4,980,286), o mediante inyección directa, o mediante el uso de bombardeo de micropartícula (por ejemplo, una pistola de gen; Biolistic, DuPont), o recubrimiento con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transfeccion, o administrándolo en enlace a un péptido similar a homosecuencia el cual se conoce para ingresar el núcleo (ver, por ejemplo, Joliot et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 1864-1868). Alternativamente, un ácido nucleico puede introducirse intracelularmente e incorporarse dentro del ADN de la célula hospedadora para la expresión mediante recombinación homologa.
Una composición farmacéutica de la invención está formulada para ser compatible con su ruta deseada de administración. Ejemplos de rutas de administración incluyen, pero no se limitan a, parenteral, por ejemplo, administración intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral, intranasal (por ejemplo, inhalación), transdérmica (por ejemplo, tópica), transmucosal, y rectal. En una modalidad específica, la composición está formulada de acuerdo con procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, oral, intranasal, o tópica a seres humanos. Comúnmente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en amortiguador acuoso isotónico estéril. En caso necesario, la composición puede también incluir un agente solubilizante y un anestésico local como lidocaína para aliviar dolor en el sitio de la inyección .
Si las composiciones de la invención se van a administrar tópicamente, las composiciones pueden formularse en la forma de un ungüento, crema, parche transdérmico, loción, gel, champú, espray, aerosol, solución, emulsión, u otra forma bien conocida por un experto en la técnica. Ver, por ejemplo, Reminqton's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19a ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). Para formas de dosificación tópicas no aspersibles, formas viscosas a semisólidas o sólidas que comprenden un portador o uno o más excipientes compatibles con aplicación tópica y que tienen una mayor viscosidad dinámica que el agua se emplean comúnmente. Las formulaciones adecuadas incluyen, sin limitarse a, soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, ungüentos, polvos, linimentos, bálsamos, y similares, los cuales son, si se desea, esterilizadas o mezcladas con los agentes auxiliares (por ejemplo, conservadores, estabilizadores, agente humectantes, amortiguadores, o sales) para influenciar varias propiedades, como, por ejemplo, presión osmótica. Otras formas de dosificación tópicas adecuadas incluyen preparaciones en aerosol aspersibles donde el ingrediente activo, opcionalmente en combinación con un portador inerte sólido o líquido, es empaquetado en una mezcla con un volátil presurizado (por ejemplo, un propulsor gaseoso, como FREON®) o en una botella oprimible. Cremas hidratantes o humectantes pueden también agregarse a las composiciones y formas de dosificación farmacéuticas si se desea. Ejemplos de tales ingredientes adicionales son bien conocidos en la técnica.
Si el método de la invención comprende administración intranasal de una composición, la composición puede formularse en una forma de aerosol, espray, vaporización o en la forma de gotas. En particular, los agentes profilácticos o terapéuticos para uso de acuerdo con la presente invención pueden suministrarse adecuadamente en la forma de una presentación de espray en aerosol de paquetes presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado (por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado). En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para liberar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos (integrados de, por ejemplo, gelatina) para uso en un inhalador o insufiador pueden formularse conteniendo una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada como lactosa o almidón.
Si el método de la invención comprende administración oral, las composiciones pueden formularse oralmente en la forma de tabletas, cápsulas, sellos, cápsulas de gel, soluciones, suspensiones, y similares. Las tabletas o cápsulas pueden prepararse mediante medios convencionales con excipientes aceptables farmacéuticamente como agentes de unión (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona, o hidroxipropilmetilcelulosa); rellenos (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina, o hidrógeno fosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, o silicona); desintegrantes (por ejemplo, almidón de patata o glicolato de almidón de sodio); o agente humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio). Las tabletas pueden cubrirse mediante métodos bien conocidos en la técnica. Preparaciones líquidas para administración oral pueden tomar la forma de, pero sin limitarse a, soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para la constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de usarse. Tales preparaciones líquidas pueden prepararse mediante medios convencionales con aditivos aceptables farmacéuticamente como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa, o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o acacia); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres aceitosos, alcohol etílico, o aceites vegetales fraccionados); y conservadores (por ejemplo, metilo o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico). Las preparaciones pueden también contener sales de amortiguador, agentes saborizantes, colorantes, y dulcificantes como sea apropiado.
Preparaciones para administración oral pueden formularse adecuadamente para liberación lenta, liberación controlada, o liberación sostenida de agentes profilácticos o terapéuticos.
El método de la invención puede comprender administración pulmonar, por ejemplo, mediante medio el uso de un inhalador o nebulizador, de una composición formulada con un agente aerosolizante. Ver, por ejemplo, los Números de Patente Norteamericana 6,019,968; 5,985,320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; y 5,290,540; y las Publicaciones PCT WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, y WO 99/66903. En una modalidad específica, un anticuerpo de la invención, terapia de combinación, y/o composición de la invención se administró utilizando tecnología de liberación de fármaco pulmonar de Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass. US).
El método de la invención puede comprender administración de una composición formulada para administración parenteral mediante inyección (por ejemplo, mediante inyección de bolo o infusión continua). Las formulaciones mediante inyección pueden presentarse en una forma de dosificación única (por ejemplo, en ampollas o en recipientes de dosis múltiples) con un conservador agregado. Las composiciones pueden tomar tales formas como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación como agentes de suspensión, estabilizadores y/o dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en la forma de polvo para constitución con un vehículo adecuada (por ejemplo, agua libre de pirógeno estéril) antes de uso.
Los métodos de la invención pueden comprender adicionalmente la administración de composiciones formuladas como preparaciones de depósito. Tales formulaciones de larga activación pueden administrarse mediante implantación (por ejemplo, subcutánea o intramuscularmente) o mediante inyección intramuscular. Así, por ejemplo, las composiciones pueden formularse con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados solubles moderadamente (por ejemplo, como una sal soluble moderadamente).
Los métodos de la invención comprenden la administración de composiciones formuladas como formas neutrales o sal. Las sales aceptables farmacéuticamente incluyen las formadas con aniones como las derivadas a partir de ácidos clorhídricos, fosfóricos, acéticos, oxálicos, tartáricos, etcétera, y los formados con cationes como los derivados a partir el sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina , 2-etilaminetanol, histidina, procaína, etcétera.
Generalmente, los ingredientes de composiciones se suministran por separado o mezclan juntos en forma de dosificación única, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente sellado herméticamente como una ampolla o sobre que indica la cantidad de agente activo. Donde el modo de administración es la infusión, la composición puede dispensarse con una botella de infusión que contiene agua grado farmacéutica estéril o solución salina. Cuando el modo de administración de mediante inyección, una ampolla de agua estéril para inyección o una solución salina puede proporcionarse de modo que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración.
En particular, la invención también proporciona que uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos, o composiciones farmacéuticas de la invención se empaqueten en un recipiente sellado herméticamente como una ampolla o sobre que indica la cantidad del agente. En una modalidad, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos, o composiciones farmacéuticas de la invención se suministran como un polvo liofilizado esterilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente sellado herméticamente y pueden reconstituirse (por ejemplo, con agua o solución salina) a la concentración apropiada para ia administración a un sujeto. En una modalidad, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos o composiciones farmacéuticas de la invención se suministran como un polvo liofilizado estéril seco en un recipiente sellado herméticamente en una dosificación única de por lo menos 5 mg, por lo menos 10 mg, por lo menos 15 mg, por lo menos 25 mg, por lo menos 35 mg, por lo menos 45 mg, por lo menos 50 mg, por lo menos 75, o por lo menos 100 mg. Los agentes profilácticos o terapéuticos Mofilizados o composiciones farmacéuticas de la invención deben almacenarse de entre 2°C y 8°C en su recipiente original y los agentes profilácticos o terapéuticos, o composiciones farmacéuticas de la invención deben administrarse dentro de 1 semana, dentro de 5 días, dentro de 72 horas, dentro de 48 horas, dentro de 24 horas, dentro de 12 horas, dentro de 6 horas, dentro de 5 horas, dentro de 3 horas, o dentro de 1 hora después de reconstituirse. En una modalidad alternativa, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos o composiciones farmacéuticas de la invención se suministran en forma líquida en un recipiente sellado herméticamente que indica la cantidad y concentración del agente. En una modalidad, la forma líquida de la composición administrada se suministra en un recipiente sellado herméticamente por lo menos 0.25 mg/ml, por lo menos 0.5 mg/ml, por lo menos 1 mg/ml, por lo menos 2.5 mg/ml, por lo menos 5 mg/ml, por lo menos 8 mg/ml, por lo menos 10 mg/ml, por lo menos 15 mg/kg, por lo menos 25 mg/ml, por lo menos 50 mg/ml, por lo menos 75 mg/ml o por lo menos 100 mg/ml. La forma líquida debe almacenarse de entre 2°C y 8°C en su recipiente original.
Los anticuerpos y porciones de anticuerpos de la invención pueden incorporarse en una composición farmacéutica adecuada para administración parenteral. En una modalidad, el anticuerpo o porciones de anticuerpos se prepararán como una solución inyectable que contiene 0.1-250 mg/ml de anticuerpo. La solución inyectable puede componerse de un líquido o forma de dosificación liofilizada en un frasco de sílex o ámbar, ampolla o jeringuilla previamente llenada. El amortiguador puede ser L-histidina (1-50 mM), óptimamente 5-10 mM, de pH 5.0 a 7.0 (óptimamente pH 6.0). Otros amortiguadores adecuados incluyen pero no se limitan a, succcinato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio o fosfato de potasio. El cloruro sódico puede utilizarse para modificar la toxicidad de la solución en una concentración de 0- 300 mM (óptimamente 150 mM para una forma de dosificación líquida). Crioprotectores puede incluirse para una forma de dosificación liofilizada, principalmente 0-10% de sucrosa (óptimamente 0.5-1.0%). Otros crioprotectores adecuados incluyen trealosa y lactosa. Los agentes de volumen pueden incluirse para una forma de dosificación liofilizada, principalmente 1- 10% de manitol (óptimamente 2-4%). Los estabilizadores pueden utilizarse en las formas de dosificación líquida y liofilizada, principalmente 1-50 mM de L-metionina (óptimamente 5-10 mM). Otros agentes de volumen adecuados incluyen glicocola, arginina, pueden incluirse como 0-0.05% de polisorbato-80 (óptimamente 0.005-0.01%). Tensioactivos adicionales incluyen pero no se limitan a polisorbato 20 y tensioactivos de BRIJ.
Las composiciones de esta invención pueden estar en una variedad de formas. Éstas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma particular depende del modo deseado de administración y aplicación terapéutica. Las composiciones comunes están en la forma de soluciones inyectables o infusibles, como composiciones similares a las usadas para inmunización pasiva de humanos con otros anticuerpos. El modo de administración incluye parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular). En una modalidad particular, el anticuerpo es administrado mediante infusión o inyección intravenosa. En otra modalidad particular, el anticuerpo es administrado mediante inyección intramuscular o subcutánea.
Las composiciones terapéuticas comúnmente deben ser estériles y estables bajo condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada a alta concentración de fármaco. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo (es decir, anticuerpo o porción de anticuerpo) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con una o una combinación de ingredientes enumerados antes, como se requiera, seguido mediante esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones son preparadas incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y otros ingredientes requeridos de los enumerados antes. En el caso de polvos estériles, liofilizados para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación incluyen secado al vacío y secado por aspersión que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente estéril-filtrada del mismo. La fluidez apropiada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede causarse incluyendo, en la composición, un agente que retarda la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Los anticuerpos y porciones de anticuerpos de la presente invención pueden administrarse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, por ejemplo, la ruta/modo de administración es inyección subcutánea, inyección intravenosa o infusión. Como se apreciará por el experto en la técnica, la ruta y/o modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. En ciertas modalidades, el compuesto activo puede prepararse con un portador que protegerá el compuesto contra liberación rápida, como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos, y sistemas de liberación microencapsulados. Los polímeros biodegradables, biocompatibles pueden utilizarse, como etileno-vinilacetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones se patentan o conocen generalmente por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Druq Delivery Systems. J . R . Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
En ciertas modalidades, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención puede administrarse oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o un portador comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) pueden también incluirse en una cápsula de gelatina de capa dura o suave, comprimido en tabletas, o incorporado directamente en la dieta del sujeto. Para administración terapéutica oral, los compuestos pueden incorporarse con excipientes y usados en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, pastillas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Para administrar un compuesto de la invención por otros que la administración parenteral, puede ser necesario cubrir el compuesto con, o co-administrar el compuesto con, un material para prevenir su inactivación.
Los compuestos activos suplementarios pueden también incorporarse en las composiciones. En ciertas modalidades, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención está coformulado con y/o coadministrado con uno o más agentes terapéuticos adicionales que son útiles para tratar trastornos en los cuales la actividad de TNF-a es perjudicial. Por ejemplo, un anticuerpo anti-hTNF-a o porción de anticuerpo de la invención puede coformularse y/o coadministrarse con uno o más anticuerpos adicionales que unen otros objetivos (por ejemplo, anticuerpos que unen otras citosinas o que unen moléculas de superficie celular). Además, uno o más anticuerpos de la invención pueden utilizarse en combinación con dos o más de los agentes terapéuticos anteriores. Tales terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente dosificaciones inferiores de los agentes terapéuticos administrados, así evitando toxicidades o complicaciones posibles asociadas con varias monoterapias.
En ciertas modalidades, un anticuerpo a TNF-a o fragmento del mismo se liga a un vehículo que prolonga la vida promedio conocido en la técnica. Tales vehículos incluyen, pero no se limitan a, el dominio de Fe, polietilenglicol, y dextrano. Tales vehículos se describen, por ejemplo, en el Número de Patente Norteamericana 6,660,843.
En una modalidad específica, las secuencias del ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótido que codifican un anticuerpo de la invención u otro agente profiláctico o terapéutico de la invención se administran para tratar, prevenir, manejar, o mejorar un trastorno o uno o más síntomas del mismo mediante terapia de gen. La terapia de gen se refiere a la terapia realizada mediante la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o expresable. En esta modalidad de la invención, los ácidos nucleicos producen su anticuerpo codificado o agente profiláctico o terapéutico de la invención que media un efecto profiláctico o terapéutico.
Cualquiera de los métodos para terapia de gen disponible en la técnica puede utilizarse de acuerdo con la presente invención. Para revisiones generales de los métodos de la terapia de gen, ver Goldspiel et al. (1993) Clin. Pharm. 12:488-505; Wu y Wu (1991) Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev (1993) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) Science 260:926-932; y Morgan y Anderson (1993) Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; Robinson (1993) Trends Biotechnol. 11(5):155. Se describe métodos conocidos comúnmente en la técnica de tecnología recombinante de ADN que puede utilizarse se describen en Ausubel et al. (eds ), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993); y Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990).
Descripciones detalladas de varios métodos de terapia de gen se describen en el Número de Publicación de Patente Norteamericana 2009/0297514.
TNF-a juega un papel crítico en la patología asociada con una variedad de enfermedades que involucran elementos inmunes e inflamatorios. Estas enfermedades incluyen, pero no se limitan a, Síndrome de Enfermedad de Inmunodeficiencia Adquirida; Enfermedades Relacionadas a Inmunodeficiencia Adquirida; anemia perniciosa adquirida; síndromes coronarios agudos; dolor agudo y crónico (diferentes formas de dolor); polineuritis idiopática aguda; enfermedad inmune aguda asociada con trasplante de órganos; enfermedad inmune aguda o crónica asociada con trasplante de órganos; polirradiculoneuropatía aguda desmielinizante inflamatoria; isquemia aguda; enfermedad del hígado aguda; fiebre reumática aguda; mielitis transversal aguda; Enfermedad de Addison; síndrome de dificultad respiratoria (agudo) del adulto; Enfermedad de Still del adulto; cirrosis alcohólica; lesión hepática inducida por alcohol; enfermedades alérgicas; alergia; alopecia; alopecia areata; Enfermedad de Alzheimer; anafilasis; espondilitis anquilosante; enfermedad pulmonar asociada a espondilitis anquilosante; Síndrome de Anticuerpos Antifosfolípido; anemia aplásica; arteriesclerosis; artropatía; asma; enfermedad ateromatosa/arteriosclerosis; arteriosclerosis; alergia atópica; eczema atópico; dermatitis atópico; hipotiroidismo autoinmune atrófico; enfermedad bullar autoinmune; dermatitis autoinmune; diabetes autoinmune; trastorno autoinmune asociado a infección por Streptococcus; enteropatía autoinmune; anemia hemolítica autoinmune; hepatitis autoinmune; pérdida de oído autoinmune; Síndrome Linfoproliferativo Autoinmune (ALPS, por sus siglas en inglés); hipoglucemia mediada autoinmune; miocarditis autoinmune; neutropenia autoinmune; falla ovárica prematura autoinmune; trombocitopenia autoinmune (AITP, por sus siglas en inglés); enfermedad de tiroides autoinmune; uveitis autoinmune; bronquiolitis obliterante; Enfermedad de Behcet; blefaritis; bronquiectasia; penfigoide bullar; caquexia; enfermedad cardiovascular; síndrome antifosfolípido catastrófico; enfermedad celiaca; espondilosis cervical; clamidia; colestasis; hepatitis activa crónica; pulmonía eosinófila crónica; síndrome de fatiga crónica; enfermedad inmune crónica asociada con trasplante de órganos; isquemia crónica; enfermedades hepáticas crónicas; candidiasis mucocutánea crónica; penfigoide cicatricial; síndrome aislado clínicamente (CIS, por sus siglas en inglés) con riesgo para esclerosis múltiple; inmunodeficiencia variada común (hipogammaglobulinemia variable común); enfermedad de tejido conectivo asociada a enfermedad pulmonar intersticial; conjuntivitis; Anemia hemolítica positiva de Coombs; trastorno psiquiátrico del inicio de la niñez; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD, por sus siglas en inglés); enfermedad de Crohn; hepatitis autoinmune criptogénica; alveolitis fibrosante criptogénica; dacriocistitis, depresión, esclerodermia, dermatitis; dermatomiositis; enfermedad pulmonar asociada a dermatomiositis/polimiositis; retinopatía diabética; diabetes mellitus; miocardiopatía dilatada; lupus eritematoso discoide; hernia de disco; prolapso de disco; coagulación intravascular diseminada; hepatitis inducida por fármacos; enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármacos; anemia hemolítica inmune inducida por fármacos; endocarditis, endometriosis; endoftalmitis; sinovitis enteropática; epiescleritis; eritema multiforme; eritema multiforme mayor; infertilidad femenina; fibrosis; enfermedad pulmonar fibrótica; penfigoide gestacional; arteritis de células gigantes (GCA, por sus siglas en inglés); glomerulonefritis; hipotiroidismo con bocio autoinmune (enfermedad de Hashimoto); síndrome de Goodpasture; artritis gotosa; enfermedad de injerto contra huésped (GVHD, por sus siglas en inglés); enfermedad de Grave; infección por estreptococos del grupo B (GBS, por sus siglas en inglés); síndrome de Guillain-Barré (GBS, por sus siglas en inglés); hemosiderosis asociado a enfermedad pulmonar; fiebre de heno; insuficiencia cardiaca; anemia hemolítica; púrpura de Henoch-Schoenlein; hepatitis B; hepatitis C; síndrome de Hughes; corea de Huntington; hipertiroidismo; hipoparatiroidismo; leucopenia idiopática; trombocitopenia idiopática; enfermedad de Parkinson; neumonía intersticial idiopática; enfermedad hepática idiosincrásica; alergia mediada por IgE; anemia hemolítica inmune; miositis por cuerpos de inclusión; enfermedades infecciosas; enfermedad inflamatoria ocular infecciosa; enfermedad inflamatoria intestinal; enfermedad inflamatoria desmielinizante; enfermedad inflamatoria cardíaca; enfermedad inflamatoria renal; diabetes mellitus dependiente de insulina; neumonitis intersticial; IPF/UIP; iritis; artritis juvenil crónica; anemia perniciosa juvenil; artritis reumatoide juvenil; enfermedad de Kawasaki; queratitis; queratoconjuntivitis sicca; enfermedad de Kussmaul o enfermedad de Kussmaul-Meier; parálisis de Landry; histiocitosis de células de Langerhans; enfermedad IgA lineal; livedo reticularis; artritis de Lyme; enfermedad pulmonar infiltrativa linfática; degeneración macular; infertilidad masculina idiopática o NOS; enfermedades malignas; vasculitis microscópica de los ríñones; poliangeitis microscópica; enfermedad mixta del tejido conectivo asociada a enfermedad pulmonar; Morbus Bechterev; trastornos de neuronas motoras; penfigoide de membrana mucosa; esclerosis múltiple (todos los subtipos: primario progresivo, secundario progresivo; remitente, reincidente; etcétera); falla orgánica múltiple; encefalitis miálgica/enfermedad de Royal Free; Miastenia Gravis; síndrome de mielodisplasia; infarto de miocardio; miocarditis; síndrome nefrótico; trastornos de raíz nerviosa; neuropatía; esteatohepatitis no alcohólica; hepatitis no-A no-B; neuritis óptica; rechazo de trasplante de órganos; osteoartritis; osteólisis; cáncer de ovario; insuficiencia ovárica; pancreatitis; enfermedades parasitarias; enfermedad de Parkinson; JAR pauciarticular; penfigoide; pénfigo foliáceo; pénfigo vulgar; enfermedad oclusiva arterial periférica (PAOD, por sus siglas en inglés); enfermedad vascular periférica (PVD, por sus siglas en inglés); enfermedad arterial periférica (PAD, por sus siglas en inglés); uveítis facogénica; flebitis; poliarteritis nodosa (o periarteritis nodosa); policondritis; polimialgia reumática; poliosis; JRA poliarticular; síndrome de deficiencia poliendocrina; polimiositis; deficiencia poliglandular tipo I y deficiencia poliglandular tipo II; polimialgia reumática (PMR, por sus siglas en inglés); enfermedad pulmonar intersticial postinfecciosa; enfermedad pulmonar intersticial postinflamatoria; síndrome postbomba; falla ovárica prematura, cirrosis biliar primaria, mixedema primaria; parkinsonismo primario; colangitis esclerótica primaria; hepatitis esclerótica primaria; vasculitis primaria; cáncer de próstata y rectal y malignidades hematopoyéticas (leucemia y linfoma); prostatitis; psoriasis; psoriasis tipo 1; psoriasis tipo 2; artritis psoriásica; artropatía psoriática; hipertensión pulmonar secundaria a enfermedad del tejido conectivo; manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa; aplasia pura de células rojas; insuficiencia suprarrenal primaria; fibrosis por radiación, artritis reactiva, enfermedad de Reiter, neuromielitis óptica recurrente; enfermedad renal NOS; restenosis; artritis reumatoide; artritis reumatoide asociada a enfermedad pulmonar intersticial; enfermedad reumática del corazón; SAPHO (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis y osteítis); sarcoidosis; esquizofrenia; síndrome de Schmidt; esclerodermia; amiloidosis secundaria; choque pulmonar; escleritis; ciática; insuficiencia suprarrenal secundaria; síndrome de sepsis; artritis séptica; choque séptico; artropatía seronegativa; enfermedad del tejido conectivo asociada a silicona; enfermedad de Sjógren asociada a enfermedad pulmonar; síndrome Sjógren; dermatosis de Sneddon-Wilkinson; autoinmunidad de esperma; espondiloartropatía; espondilitis anquilosante; síndrome de Stevens-Johnson (SSJ, por sus siglas en inglés); enfermedad de Still; accidente cerebrovascular; oftalmía simpática; síndrome de respuesta inflamatoria sistémica; lupus eritematoso sistémico; lupus eritematoso sistémico asociado a enfermedad pulmonar; esclerosis sistémica; esclerosis sistémica asociada a enfermedad pulmonar intersticial; enfermedad de Takayasu/arteritis; arteritis temporal; enfermedades mediadas Tipo Th2 y Tipo Th1; tiroiditis, síndrome de choque tóxico; retinitis toxoplásmica; necrólisis epidérmica tóxica; mielitis transversa; TRAPS (receptor del factor de tumor-necrosis tipo 1 (TNFR, por sus siglas en inglés)-Síndrome Periódico Asociado); resistencia a insulina tipo B con acantosis nigricans; reacción alérgica tipo 1; hepatitis autoinmune tipo-1 (hepatitis autoinmune clásica o lupoide); hepatitis autoinmune tipo-2 (hepatitis de anticuerpo anti-LKM)e; diabetes Tipo II; artropatías de la colitis ulcerativa; colitis ulcerativa; urticaria; neumonía intersticial usual (UIP, por sus siglas en inglés); uveítis; enfermedad pulmonar difusa vasculítica; vasculitis; conjuntivitis vernal; retinitis viral; vitíligo; síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada (síndrome de VKH); granulomatosis de Wegener; degeneración macular húmeda; cicatrización de heridas; artropatía asociada a Yersinia y Salmonella.
Los anticuerpos, y porciones de anticuerpo de la invención pueden utilizarse para tratar humanos que sufren de enfermedades autoinmunes, en particular las asociadas con inflamación, artritis reumatoide, osteoartritis, psoriasis, esclerosis múltiple, y otras enfermedades autoinmunes.
Un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención también puede administrarse con uno o más agentes terapéuticos adicionales útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias.
Anticuerpos de la invención, o porciones de unión al antígeno de los mismos pueden utilizarse solas o en combinación para tratar tales enfermedades. Debe entenderse que los anticuerpos de la invención, o porción de unión al antígeno de los mismos, pueden utilizarse solos o en combinación con un agente adicional, por ejemplo, un agente terapéutico, el agente adicional que es seleccionado por el experto para su propósito deseado. Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente terapéutico reconocido en la técnica como que es útil para tratar la enfermedad o condición que es tratada por el anticuerpo de la presente invención. El agente adicional también puede ser un agente que imparte un atributo beneficioso a la composición terapéutica, por ejemplo, un agente que afecta la viscosidad de la composición.
Debe entenderse además que las combinaciones que se han de incluir dentro de esta invención son las combinaciones útiles para su propósito deseado. Los agentes indicados a continuación son ilustrativos para los propósitos y no deseados para ser limitados. Las combinaciones, que son parte de esta invención, pueden ser los anticuerpos de la presente invención y por lo menos un agente adicional seleccionado de las listas a continuación. La combinación puede también incluir más de un agente adicional, por ejemplo, dos o tres agentes adicionales si la combinación es tal que la composición formada puede realizar su función deseada.
Combinaciones particulares son fármacos antiinflamatorios no esteroidales también referidos como NSAIDS que incluyen fármacos como ibuprofeno. Otras combinaciones son corticoesteroides que incluyen prednisolona; los efectos secundarios bien conocidos del uso de esferoides pueden reducirse o aún eliminarse reduciendo la dosis de esferoides requerida cuando se tratan pacientes en combinación con los anticuerpos anti-TNF-a de esta invención. Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para artritis reumatoide con los cuales un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención puede combinarse incluyen los siguiente: fármacos antiinflamatorios supresores de citosina (CSAID, por sus siglas en inglés); anticuerpos a o antagonistas de otras citosinas o factores de crecimiento humanos, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, interferones, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión al antígeno de los mismos, pueden combinarse con anticuerpos a moléculas de superficie celular como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, CTLA o sus ligandos incluyendo CD154 (gp39 o CD40L).
Combinaciones particulares de agentes terapéuticos pueden interferir en diferentes puntos en la cascada inflamatoria autoinmune y subsecuente; ejemplos particulares incluyen antagonistas de TNF como anticuerpos de TNF quiméricos, humanizados o humanos, D2E7, (Número de Publicación PCT WO 97/29131), CA2 (Remicade™), CDP 571, y receptores de TNF p55 o p75 solubles, derivados, de los mismos, (p75TNFRIgG (Enbrel™) o p55TNFRIgG (Lenercept), y también inhibidores (TACE) enzimáticos convertidores de TNF-a; similarmente los inhibidores IL-1 (Inhibidores enzimáticos que convierten interleucina-1 , IL-IRA, etcétera) pueden ser efectivos por la misma razón. Otras combinaciones son con Interleucina 11. Aún otras combinaciones son con otros protagonistas clave de la respuesta autoinmune la cual puede actuar en paralelo a, dependiendo de o en coordinación con la función de TNF-a. Aún otras combinaciones son con inhibidores anti-CD4 sin agotamiento. Aún otras combinaciones son con antagonistas de trayectoria coestimulante CD80 (B7.1) o CD86 (B7.2) incluyendo anticuerpos, receptores solubles o ligandos antagónicos.
Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión al antígeno de los mismos, pueden también combinarse con agentes, como metotrexato, 6-MP, sulfasalazina de azatioprina, mesalazina, olsalazina cloroquinina/hidroxicloroquina, pencilamina, aurotiomalato (intramuscular y oral), azatioprina, colquicina, corticoesteroides (oral, inhalada e inyección local), agonistas de adrenorreceptores beta-2 (salbutamol, terbutalina, salmeteral), xantinas (teofilina, aminofilina), cromoglicato, nedocromil, ketotifeno, ipratropio y oxitropio, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mofetilo, leflunomida, NSAIDs, por ejemplo, ibuprofeno, corticoesteroides como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adensosina, agentes antitrombóticos, inhibidores de complemento, agentes adrenérgicos, agentes los cuales interfieren con la señalización mediante citosinas proinflamatorias como TNF-a o IL-1 (por ejemplo, IRAK, NIK, IKK, p38 o inhibidores de la MAP cinasa), IL-inhibidores enzimáticos convertidores de 1ß, inhibidores enzimáticos convertidores de TNF-a, inhibidores de señalización de células T como inhibidores de cinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores enzimáticos convertidores de angiotensina, receptores citosina solubles y derivados de los mismos (por ejemplo, receptores de TNF p55 o p75 solubles y los derivados p75TN FRIgG (Enbrel™ y p55TNFRIgG (Lenercept)) , sIL-IRI, sIL-IRII, slL-6R), citosinas antiinflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 y TGFP), celecoxib, ácido fólico, sulfato de hidroxicloroquina, rofecoxib, etanercept, infliximab, naproxeno, valdecoxib, sulfasalazina, metilprednisolona, meloxicam, acetato de metilprednisolona, tiomalato de oro y sodio, aspirina, acetónido de triamcinolona, napsilato de propoxifeno/apap, folato, nabumetona, diclofenaco, piroxicam, etodolac, diclofenaco de sodio, oxaprozina, oxicodona hcl, bitartrato de hidrocodona/apap, diclofenaco de sodio/misoprostol, fentanilo, anakinra, recombinante humano, tramadol hcl, salsalato, sulindaco, cianocobalamina/fa/piridoxina, acetaminofeno, alendronato de sodio, prednisolona, sulfato de morfina, clorhidrato de lidocaína, indometacina, sulfato de glucosamina/condroitina, amitriptilina hcl, sulfadiazina, oxicodona hcl/acetaminofeno, olopatadina hcl, misoprostol, naproxeno de sodio, omeprazol, ciclofosfamida, rituximab, IL-1 TRAP, M RA, CTLA4-IG, IL-18 BP, anti-IL-18, Anti-IL15, BIRB-796, SCIO-469, VX-702, A G-548, VX-740, Roflumilast, IC-485, CDC-801, y Mesopram. Combinaciones particulares incluyen metotrexato o leflunomida y en casos de artritis reumatoide moderada o severa, ciclosporina.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una "cantidad efectiva terapéuticamente" o una "cantidad efectiva profilácticamente" de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención. Una "cantidad efectiva terapéuticamente" se refiere a una cantidad efectiva, en dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para alcanzar el resultado terapéutico deseado. Una cantidad efectiva terapéuticamente del anticuerpo o porción de anticuerpo puede determinarse por un experto en la técnica y puede variar de acuerdo con factores como el estado de enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo de obtener una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad efectiva terapéuticamente es también una en la cual cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo, o porción de anticuerpo, es compensado por los efectos terapéuticos beneficiosos. Una "cantidad efectiva profilácticamente" se refiere a una cantidad efectiva, en dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para alcanzar el resultado profiláctico deseado. Comúnmente, puesto que una dosis profiláctica se utiliza en sujetos antes o en una etapa anterior de la enfermedad, la cantidad efectiva profilácticamente será menor que la cantidad efectiva terapéuticamente.
Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, un solo bolo puede administrarse, varias dosis divididas pueden administrarse con el tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente como se indica en las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma única de dosificación para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma única de dosificación se refiere a unidades discretas físicamente adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos a tratarse; cada unidad que contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas única de dosificación de la invención se dicta por y dependiente directamente en (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico o profiláctico particular a alcanzarse, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de composición de tal compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.
Debe observarse que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y severidad de la condición a aliviarse. Debe entenderse además que para cualquier sujeto particular, régimen de dosificación específico debe ajustarse con el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de dosificación indicados en la presente son ejemplares solamente y no se desea limitar el alcance o práctica de la composición reivindicada.
Será fácilmente evidente a los expertos en la técnica que otras modificaciones y adaptaciones adecuadas de los métodos de la invención pueden hacerse utilizando equivalentes adecuados sin apartarse del alcance de la invención o las modalidades discutidas en la presente. Ahora describiendo la presente invención detalladamente, la misma será entendida más claramente por referencia a los siguientes ejemplos, los cuales están incluidos para propósitos de ilustración solamente y no se desea que sean limitativos de la invención.
Ejemplo 1: Anticuerpos de TNF-a Anti-Humanos Recombinantes Ejemplo 1.1: Construcción y expresión de Anticuerpos de TNF-a Anti-Humano Quiméricos Recombinantes El ADN que codifica la región constante de cadena pesada del anticuerpo monoclonal TNF-a anti-humano murino MAK195 se sustituyó por un fragmento de cADN que codifica la región constante de lgG1 humana que contiene 2 mutaciones de aminoácido de región de bisagra mediante recombinación homologa en bacterias. Estas mutaciones son un cambio de leucina a alanina en la posición 234 (enumeración de UE) y un cambio de leucina a alanina en la posición 235 (Lund et al. (1991) J. Immunol. 147:2657-2662). La región constante de cadena ligera de cada uno de estos anticuerpos se sustituyó por una región constante kappa humana. Los anticuerpos quiméricos de longitud completa se expresaron transitoriamente en células HEK293 mediante co-transfección de los cADN de cadena pesada y ligera quiméricas ligados en el plásmido de expresión pHybE. Los sobrenadantes de células que contienen el anticuerpo quimérico recombinante se purificaron mediante cromatografía de sefarosa de proteína A y el anticuerpo unido se eluyó mediante la adición de amortiguador ácido. Se neutralizaron los anticuerpos y dializaron en PBS.
Los anticuerpos monoclonales TNF-a anti-humano quiméricos purificados entonces se probaron para que su capacidad para unir la proteína de hTNF-a mediante ELISA para confirmar la unión al antígeno. Ejemplo 1.2: Construcción de anticuerpos TNF-a Anti-Humano injertados a CDR Aplicando los métodos estándar bien conocidos en la técnica, las secuencias de CDR de cadenas VH y VL del anticuerpo monoclonal MAK195 (ver Tabla 5 anterior) se injertaron en diferentes secuencias aceptoras de cadena pesada y ligera humanas.
Basado en las alineaciones de secuencia de VH y VL con las secuencias de VH y VL del anticuerpo monoclonal MAK195 de la presente invención las siguientes secuencias humanas conocidas se seleccionaron: a) VH4-59 (IGHV4-59) y VH3-53 (IGHV3-53) así como las secuencias de unión hJH4 para construir secuencias aceptoras de cadena pesada, b) 1-39/012 y 3-15/L2 así como hJK2 para construir secuencias aceptoras de cadena ligera.
Al injertar CDR de VH y VL correspondientes de MAK195 en las secuencias aceptoras, las secuencias de VH y VL injertadas con CDR, humanizadas, y modificadas se prepararon (ver también Tabla 6, antes).
Ejemplo 1.3: Construcción de Retromutaciones de Marco en Anticuerpos injertados con CDR Para generar retromutaciones de marco del anticuerpo humanizado, las mutaciones se introducen en las secuencias de anticuerpo injertado con CDR como se prepararon de acuerdo con el Ejemplo 1.2, mediante síntesis desde el principio del dominio variable y/o utilizando cebadores mutagénicos y PCR, y métodos bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, WO 2007/042261; WO 99/54440; Traunecker et al. (1987) EMBO J, 10(12):3655-9 y Lanzavecchia y Scheidegger (1987) Eur. J. Immunol, 17(1 ): 105-11. Diferentes combinaciones de retromutaciones y otras mutaciones se construyen para cada uno de los injertos con CDR como sigue. Una breve descripción de las versiones de diseño propuestas de cada anticuerpo humanizado se indica a continuación. Los números de residuo para estas mutaciones se basan en el sistema de numeración de Kabat.
Para las cadenas pesadas hMAK195VH.1z, uno o más de los siguientes residuos interfaz de Vernier y VH/VL se retromutaron como sigue: G27?F, I29?L, I37?V, I48?L V67?L, V71?K, T73?N, N76?S, y F78?l.
Mutaciones adicionales incluyen la siguiente: Q1?E.
Para las cadenas pesadas hMAKI95VH.2z, uno o más de los siguientes residuos interfaz de Vernier y VH/VL se retromutaron como sigue: A24?V, F29?L, V48?L, F67?L, R71?K, S49?G, N76?S, y L78?l.
Mutaciones adicionales incluyen las siguientes: Q1?E, 112?V, y V29?F.
Para la cadena ligera hMAK195Vk.1 uno o más de los siguientes residuos interfaz de Vernier y VH/VL se retromutaron como sigue: A43?S.
Para la cadena ligera hMAK195Vk.2z uno o más de los siguientes residuos interfaz de Vernier y VH/VL se retromutaron como sigue: A43?S, I58?V.
Mutación adicional incluye las siguientes: V13?L, E70?D, y S80?P.
Ejemplo 1.4: Cadenas Pesada y Ligera Anti-hTNF-a Humanizadas que Contienen el Marco de Retromutaciones Ejemplo 1.5: Apareamiento de VH/VL del anticuerpo hMAK195 Anti-hTNF-a humanizado Ejemplo 1.6: Determinación de Afinidad Utilizando Tecnología de BIACORE Tabla 7: Reactivo Usado en Análisis de Biacore Métodos de BIACORE: El ensayo de BIACORE (Biacore, Inc. Piscataway, NJ) determina la afinidad de anticuerpos con medidas cinéticas de las constantes de disociación y asociación. La unión de anticuerpos a un antígeno objetivo (por ejemplo, un antígeno objetivo recombinante purificado) es determinada mediante medidas basadas en resonancia de plasmón superficial con un instrumento Biacore® 1000 o 3000 (Biacore® AB, Uppsala, Suecia) utilizando el análisis de HBS-EP (10 mM de HEPES [pH 7.4], 150 mM de NaCI, 3 mM de EDTA, y 0.005% de tensioactivo P20) a 25°C. Todos los productos químicos se obtienen de Biacore® AB (Uppsala, Suecia) o de otra manera de una diferente fuente como se describen en el texto. Por ejemplo, aproximadamente 5000 RU de IgG de cabra anti-ratón, (Fcv), fragmento del anticuerpo policlonal específico (Pierce Biotechnology Inc, Rockford, 111., US) diluidos en 10 mM de acetato del sodio (pH 4.5) inmovilizados directamente a través de una viruta de biosensor grado de evaluación CM5 utilizando un kit de acoplamiento de amina estándar de acuerdo con las instrucciones y procedimientos del fabricante en 25 pg/ml. Las partes sin reaccionar en la superficie del biosensor se bloquean con etanolamina. La superficie de carboximetildextrano modificada en célula de flujo 2 y 4 se utiliza como una superficie de reacción. El carboximetildextrano no modificado sin IgG de cabra anti-ratón en la célula de flujo 1 y 3 se utilizó como la superficie de referencia. Para el ensayo cinético, las ecuaciones de índice derivadas del modelo de unión de Langmuir 1:1 se ajustan simultáneamente a las fases de asociación y disociación de las ocho inyecciones (utilizando análisis de ensayo ajuste global) con el uso del software de Biaevaluation 4.0.1. Se diluyeron los anticuerpos purificados en solución salina amortiguada con HEPES para la captura a través de superficies de reacción específicas de IgG de cabra anti-ratón. Los anticuerpos a capturarse como un ligando (25 pg/ml) se inyectan sobre matrices de reacción a un caudal de 5 µ?/minuto. Las constantes de asociación y disociación, kon (M"1s"1]) y koff (s~ ), son determinadas bajo un caudal continuo de 25 µ?/minuto. Los constantes de índice son derivadas haciendo medidas de unión cinéticas en diferentes concentraciones de antígeno que se extienden desde 10-200 n . La constante de disociación de equilibrio (M) de la reacción entre anticuerpos y el antígeno objetivo entonces es calculada a partir de las constantes de índice cinéticas mediante la siguiente fórmula: KD = koff/kon. La unión se registró como una función de tiempo y calcularon las constantes de índice cinéticas. En este ensayo, puede medirse la asociación tan rápido como 106M V1 y disociación tan lenta como Tabla 8: Análisis de BIACORE de Anticuerpos Anti-hTNF-a La unión de todos los constructos humanizados caracterizadas por tecnología de Biacore se mantuvo y comparable al del anticuerpo parental murino.
Ejemplo 1.7: Neutralización de TNF-a humano Las células L929 se hicieron crecer a una densidad de semi-confluente y cosecharon utilizando 0.25% de tripsina (Gibco#25300). Se lavaron las células con PBS, contaron y resuspendieron en células 1E6/ml en medio de ensayo que contiene 4 pg/ml de actinomicina D. Se sembraron las células en una placa de 96 pozos (Costar#3599) en un volumen de 100 µ? y células 5E4/pozo. Se diluyeron los anticuerpos e IgG control a una concentración 4X en medio de ensayo y realizaron diluciones seriales 1:4. Se diluyó el huTNF-a a 400 pg/ml en medio de ensayo. Se agregó la muestra de anticuerpo (200 µ?) al huTNF-a (200 µ?) en un esquema de dilución 1:2 y dejó incubar durante 0.5 horas a temperatura ambiente.
Se agregó la solución de anticuerpo/TNF-a humano a las células en placas a 100 µ? para una concentración final de 100 pg/ml de huTNF-a y 150 nM-0.0001 nM de anticuerpo. Se incubaron las placas durante 20 horas a 37°C, 5% de C02. Para viabilidad cuantitativa, se eliminaron 100 µ? de los pozos y agregaron 10 µ? de reactivo WST-1 (Roche cat# 11644807001). Se incubaron las placas bajo condiciones de ensayo durante 3.5 horas. Se leyeron las placas en OD 420-600 nm en un lector de placa de Spectromax 190 ELISA. Un EC50 promedio de varios ensayos se incluye en la Tabla 9.
Tabla 9: Ensayo de neutralización de TNF-a humano con anticuerpos anti-hTNF-a humanizados Todos los anticuerpos anti-hTNF-a mostraron neutralización en el ensayo de neutralización de TNF-a.
Ejemplo 1.8: Análisis de Estabilidad Fisicoquímica e ¡n vitro de Anticuerpos Monoclonales Humanizados Cromatografía de Exclusión de Tamaño Se diluyeron anticuerpos a 2.5 mg/ml con agua y 20 mi analizados en un sistema de HPLC de Shimadzu utilizando una columna de gel G3000 SWXL de TSK (Tosoh Bioscience, cat# k5539-05k). Se eluyeron las muestras a partir de la columna con 211 mM de sulfato de sodio, 92 mM de fosfato de sodio, pH 7.0, a un caudal de 0.3 ml/minutos. Las condiciones de operación del sistema de HPLC fueron las siguientes: Fase móvil: 211 mM de Na2S04, 92 mM de Na2HP04*7H20, pH 7.0, Gradiente: Isocrático Flujo: 0.3 ml/minuto Longitud de onda del detector: 280 nM Temperatura del enfriador de automuestreador: 4°C Temperatura del horno de columna: ambiente Tiempo de análisis: 50 minutos La Tabla 10 contiene los datos de pureza de constructos de anticuerpo expresados como por ciento de monómero (proteína no agregada del peso molecular esperado) como se determinó por el protocolo anterior.
Tabla 10: Pureza de Anticuerpos anti-hTNF-a como Determinó Mediante Cromatografía de Exclusión de Tamaño Los anticuerpos Anti-hTNF-a mostraron un excelente de SEC con mayoría mostrada >95% de monómero.
Oodecilsulfato de sodio - Electroforesis en Gel Poliacrilamida (SDS-PAGE) Se analizaron los anticuerpos mediante dodecilsulfato de sodio - electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE, por sus siglas en inglés) bajo ambos condiciones reductoras y no reductoras. Se utilizó adalimumab lote AFP04C como un control. Para condiciones reductoras, las muestras se mezclaron 1:1 con 2X de amortiguador de muestra de SDS-PAGE de tris glicina (Invitrogen, cat# LC2676, lot# 1323208) con 100 mM de DTT, y calentaron a 60°C durante 30 minutos. Para condiciones no reductoras, las muestras se mezclaron 1:1 con amortiguador de muestra y calentaron a 100°C durante 5 minutos. Se cargan las muestras reducidas (10 mg por carril) en 12% de un gel de tris-glicina prefabricado (Invitrogen, cat# EC6005box, lot# 6111021), y se cargaron las muestras no reducidas (10 mg por carril) en 8%-16% de un gel de tris-glicina prefabricado (Invitrogen, cat# EC6045box, lot# 611 1021). Se usó SeeBlue Plus 2 (Invitrogen, cat#LC5925, lot# 1351542) como un marcador de peso molecular. Se analizaron los geles en una caja de gel de minicélulas de XCell SureLock (Invitrogen, cat# EI0001) y se separaron las proteínas primero aplicando un voltaje de 75 para apilar las muestras en el gel, seguido por un voltaje constante de 125 hasta que el frente de tinte alcanzó la parte inferior del gel. El amortiguador -de análisis usado es amortiguador de SDS de tris-glicina IX, preparado a partir de un amortiguador de SDS de tris-glicina 10X (ABC, MPS-79-080106)). Se tiñeron los geles durante la noche con tinte azul coloidal (Invitrogen cat# 46-7015, 46- 7016) y destiñeron con agua Milli-Q hasta que el fondo se volvió claro. Los geles teñidos entonces se escanearon utilizando un escáner de Expresión Epson (modelo 1680, S/N DASX003641). Análisis de Velocidad de Sedimentación Se cargaron los anticuerpos en la cámara de muestra de cada una de tres piezas centrales estándar de dos sectores de carbono EPON. Estas piezas centrales tienen 1.2 cm de longitud de trayectoria óptica y se construyeron con ventanas de zafiro. Se usó PBS para un amortiguador de referencia y cada cámara contuvo 140 µ?. Se examinaron todas las muestras simultáneamente utilizando un rotor de 4 orificios (??-60??) en una ultracentrifugadora analítica de Beckman ProteomeLab XLI (serie # PL106C01).
Se programaron las condiciones de análisis y se realizó el control de centrífuga utilizando ProteomeLab (v5.6). Las muestras y el rotor se dejaron equilibrar térmicamente durante una hora antes del análisis (20.0 ± 0.1°C). Se realiza la confirmación de la carga de célula apropiada en 3000 rpm y se registra un solo escaneo para cada célula. Las condiciones de velocidad de sedimentación son las siguientes: Volumen de Célula de Muestra: 420 mi Volumen de Célula de Referencia: 420 mi Temperatura: 20°C Velocidad de Rotor: 35.000 rpm Tiempo: 8:00 horas Longitud de onda UV: 280 nM Tamaño de Etapa Radial: 0.003 cm Colección de Datos: Un punto de datos por etapa sin promediado de señal.
Número Total de Escaneos: 100 Medida de Peso Molecular de LC-MS de Anticuerpos Intactos Se analizaron los pesos moleculares de anticuerpos intactos mediante LC-MS. Se diluyó cada anticuerpo a aproximadamente 1 mg/ml con agua. Se utilizó un sistema 1100 de HPLC (Agilent) con una microtrampa de proteína (Michrom Bioresources, Inc, cat# 004/25109/03) para desalar e introducir 5 mg de la muestra en un espectrómetro de masa API QSTAR Pulsar / (Applied Biosystems). Se utilizó un gradiente corto para eluir las muestras. Se analizó el gradiente con fase móvil A (0.08% de FA, 0.02% de TFA en agua de HPLC) y fase móvil B (0.08% de FA y 0.02% de TFA en acetonitrilo) a un caudal de 50 ml/minuto. Se operó el espectrómetro de masa a 4.5 kvolts de voltaje de aspersión con un intervalo de escaneo de 2000 a 3500 masa a relación de carga.
Medida de Peso Molecular de LC-MS de Cadenas Ligeras y Pesadas de Anticuerpo Se analizaron la medida de peso molecular de cadenas ligeras de anticuerpo (LC, por sus siglas en inglés), cadenas pesadas (HC, por sus siglas en inglés) y HC desglicosilada mediante LC-MS. Se diluyó el anticuerpo a 1 mg/ml con agua y se redujo la muestra a LC y HC con una concentración final de 10 mM de DTT durante 30 minutos a 37°C. Para desglicosilar el anticuerpo, se incubaron 100 mg de anticuerpo con 2 mi de PNGasa F, 5 mi de 10% de N-octilglucosida en un volumen total de 100 mi durante la noche a 37°C. Después de la desglicosilacion se redujo la muestra con una concentración final de 10 mM de DTT durante 30 minutos a 37°C. Se usó un sistema de HPLC Agilent 1100 con una columna C4 (Vydac, cat# 214TP5115, S/N 060206537204069) para desalar e introducir la muestra (5 mg) en un espectrómetro de masa API QSTAR Pulsar i (Applied Biosystems). Se usó un gradiente corto para eluir la muestra. Se analizó el gradiente con la fase móvil A (0.08% de FA, 0.02% de TFA en agua de HPLC) y la fase móvil B (0.08% de FA y 0.02% de TFA en acetonitrilo) a un caudal de 50 ml/minuto. Se operó el espectrómetro de masa a 4.5 kvolts de voltaje de aspersión con un intervalo de escaneo de 800 a 3500 masa a relación de carga.
Mapeo de Péptido El anticuerpo se desnaturaliza durante 15 minutos a temperatura ambiente con una concentración final de clorhidrato de guanidina 6 M en 75 mM de bicarbonato de amonio. Las muestras desnaturalizadas se redujeron con una concentración final de DTT 10 mM a 37°C durante 60 minutos, seguido por alquilación con 50 mM de ácido yodoacético (IAA, por sus siglas en inglés) en la oscuridad a 37°C durante 30 minutos. Seguido de alquilación, se dializó la muestra durante la noche contra cuatro litros de 10 mM de bicarbonato de amonio a 4°C. Se diluyó la muestra dializada a 1 mg/ml con 10 mM de bicarbonato de amonio, pH 7.8 y 100 mg de anticuerpo o bien se digirió con tripsina (Promega, cat# V5111) o Lys-C (Roche, cat# 11047 825 001) en una relación 1:20 (p/p) de tripsina/Lys-C:anticuerpo a 37°C durante 4 horas. Se enfrió rápidamente la digestión con 1 mi de HCI 1N. Mediante el mapeo de péptidos con detección de espectrometría de masas, se separaron 40 mi de la digestión mediante cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RPHPLC, por sus siglas en inglés) en una columna C18 (Vydac, cat # 218TP51 , S/N NE9606 10.3.5) con un sistema de Agilent 1100 de HPLC. La separación de péptidos se analizó con un gradiente utilizando fase móvil A. (0.02% de TFA y 0.08% de FA en agua grado de HPLC) y fase móvil B (0.02% de TFA y 0.08% de FA en acetonitrilo) a un caudal de 50 ml/minuto. El espectrómetro de masas / API QSTAR Pulsar es operado en modo positivo a 4,5 Kvolts de voltaje de aspersión y un intervalo de escaneo de 800 a 2500 masa a relación de carga.
Mapeo de Enlace de Disulfuro Para desnaturalizar el anticuerpo, se mezclan 100 mi de anticuerpo con 300 mi de guanidina-HCI 8M en 100 mM de bicarbonato de amonio. Se comprueba el pH para asegurarse de que está entre 7 y 8 y las muestras se desnaturalizaron durante 15 minutos a temperatura ambiente en una concentración final de guanidina-HCI 6M. Se diluyó una porción de la muestra desnaturalizada (100 mi) a 600 mi con agua Milli-Q para dar una concentración final de guanidina-HCI 1M. Se digirió la muestra (220 mg) con tripsina (Promega, cat# V5111, lot# 22265901) o Lys-C (Roche, cat# 11047825001, lot# 12808000) en relaciones 1:50 de tripsina o 1:50 de Lys-C: anticuerpo (p/p) (4.4 mg de enzima: 220 mg de muestra) a 37°C por aproximadamente 16 horas. Se agregaron 5 mg adicionales de tripsina o Lys-C a las muestras y se dejó proceder la digestión durante 2 horas adicionales a 37°C. Se detuvieron las digestiones agregando 1 mi de TFA a cada muestra. Se separaron las muestras digeridas mediante RPHPLC utilizando una columna C18 (Vydac, cat# 218TP51 S/N NE020630-4-1A) en un sistema de HPLC Agilent. La separación se analizó con el mismo gradiente usado para el mapeo de péptido utilizando la fase móvil A (0.02% de TFA y 0.08% de FA en agua grado de HPLC) y fase móvil B (0.02% de TFA y 0.08% de FA en acetonitrilo) a un caudal de 50 ml/minuto. Las condiciones de operación de HPLC son las mismas como las usadas para el mapeo de péptido. Se operó el espectrómetro de masa API QSTAR Pulsar i en modo positivo a 4.5 kvolts de voltaje de aspersión y un intervalo de escaneo de 800 a 2500 de relación de masa a carga. Los enlaces de disulfuro son asignados igualando los MW observados de péptidos con los MW deseados de péptidos trípticos o Lys-C ligados mediante enlaces de disulfuro.
Determinación sulfhidrilo libre El método usado para cuantificar cisteínas libres en un anticuerpo se basa en la reacción del reactivo de Ellman, 5,5'-ditio-bis (2-ácido nitrobenzoico) (DTNB, por sus siglas en inglés), con grupos sulfhidrilo (SH, por sus siglas en inglés) los cuales dan lugar a un producto cromofórico característico 5-tio-(ácido 2-nitrobenzoico) (TNB, por sus siglas en inglés). Se ilustró la reacción en la fórmula: DTNB + RSH ? RS-TNB + TNB- + H + La absorbencia del TNB- se mide en 412 nm utilizando un espectrofotómetro de Cary 50. Se trazó una curva de absorbencia utilizando diluciones del 2-mercaptoetanol (ß-??) como el estándar de SH libre y las concentraciones de los grupos sulfhidrilo libre en la proteína son determinantes de absorbencia en 412 nM de la muestra.
Se prepararon las cepas estándar de ß-?? mediante una dilución serial de 14.2 M ß-?? con agua grado de HPLC a una concentración final de 0.142 mM. Después se prepararon los estándares en triplicado para cada concentración. Se concentró el anticuerpo a 10 mg/ml utilizando un filtro centrífugo de amicon ultra 10,000 MWCO (Millipore, cat# UFC801096, lot# L3KN5251) y se cambió el amortiguador al amortiguador de formulación usado para adalimumab (5.57 mM de fosfato de sodio monobásico, 8.69 mM de fosfato de sodio dibásico, 106.69 mM de NaCI, 1.07 mM de citrato de sodio, 6.45 mM de ácido cítrico, 66.68 mM de manitol, pH 5.2, 0.1% (p/v) de Tween®). Se mezclaron las muestras en un agitador a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después se agregaron 180 mi de 100 mM de amortiguador Tris, pH 8.1 a cada muestra y estándar seguidos por la adición de 300 mi de 2 mM de DTNB en 10 mM de amortiguador de fosfato, pH 8.1. Después de mezclar completamente, se midieron las muestras y estándares para absorción en 412 nm en un espectrofotómetro de Cary 50. Se obtuvo la curva estándar trazando la cantidad de SH libre y OD 2 nm de los estándares de ß-??. Se calculó el contenido de SH libre de muestras basado en esta curva después de la sustracción del inoculo.
Cromatografía de Intercambio Catiónico Débil Se diluyó el anticuerpo a 1 mg/ml con 10 mM de fosfato de sodio, pH 6.0. Se analizó la heterogeneidad de carga utilizando un sistema de HPLC de Shimadzu con una columna analítica de WCX-10 ProPac (Dionex, cat# 054993, S/N 02722). Se cargaron las muestras en la columna en 80% de fase móvil A (10 mM de fosfato de sodio, pH 6.0) y 20% de fase móvil B (10 mM de fosfato de sodio, 500 mM de NaCI, pH 6.0) y se eluyeron a un caudal de 1.0 ml/minuto.
Perfilado del Oligosacárido Los oligosacáridos liberados después del tratamiento de PNGasa F del anticuerpo se derivaron con reactivo de etiquetado de 2-aminobenzamida (2-AB, por sus siglas en inglés). Los oligosacáridos etiquetados fluorescentes son separados mediante cromatografía líquida de alto rendimiento de fase normal (NPHPLC, por sus siglas en inglés) y las diferentes formas de oligosacáridos se caracterizan basadas en la comparación de tiempo de retención con estándares conocidos.
El anticuerpo primero se digirió con PNGasa F para dividir oligosacáridos N-ligados de la porción de Fe de la cadena pesada. Se colocó el anticuerpo (200 mg) en un tubo Eppendorf de 500 mi junto con 2 mi de PNGasa F y 3 mi de 10% de N-octilglucósido. Se agregó solución salina amortiguada con fosfato para llevar el volumen final a 60 mi. Se incubó la muestra durante la noche a 37°C en un termomezclador de Eppendorf ajustado a 700 RPM. Adalimumab lote AFP04C también se digirió con PNGasa F como un control.
Después del tratamiento de PNGasa F, se incubaron las muestras a 95°C durante 5 minutos en un set de termomezclador de Eppendorf a 750 RPM para precipitar las proteínas, después se colocaron las muestras en una centrifugadora de Eppendorf durante 2 minutos a 10,000 RPM para girar hacia abajo las proteínas precipitadas. Se transfirió el sobrenadante que contiene los oligosacáridos a un tubo de Eppendorf de 500 mi y se secó en un SpeedVac a 65°C.
Se etiquetaron los oligosacáridos con 2AB utilizando un kit de etiquetado 2AB adquirido de Prozyme (cat# GKK-404, lot# 132026). Se preparó el reactivo de etiquetado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se agregó el ácido acético (150 mi, proporcionados en el kit) al frasco de DMSO (proporcionado en kit) y es mezcló pipeteando la solución arriba y abajo varias veces. Se transfirió la mezcla de ácido acético/DMSO (100 mi) a un frasco de tinte 2-AB (justo antes de su uso) y mezcló hasta que el tinte se disuelva completamente. La solución de tinte después se agregó a un frasco de reductor (proporcionado en el kit) y mezcló bien (reactivo de etiquetado). Se agregó el reactivo de etiquetado (5 mi) a cada frasco de muestra de oligosacárido seco, y se mezcló completamente. Se colocaron los frascos de reacción en un termomezclador de Eppendorf ajustado a 65°C y 700-800 RPM durante 2 horas de reacción.
Después de la reacción de etiquetado, se eliminó el exceso de tinte fluorescente utilizando Cartuchos de GlicoClean S de Prozyme (cat# GKI-4726). Antes de agregar las muestras, se lavaron los cartuchos con 1 mi de agua Milli-Q seguido con 5 lavados de 1 mi de 30% de solución del ácido acético. Justo antes de agregar las muestras, se agregó 1 mi de acetonitrilo (Burdick y Jackson, cat# AH015-4) a los cartuchos.
Después de que todo el acetonitrilo pasa a través del cartucho, se tiñó la muestra sobre el centro del disco recién lavado y se dejó adsorber sobre el disco durante 10 minutos. Se lavó el disco con 1 mi de acetonitrilo seguido por cinco lavados de 1 mi de 96% de acetonitrilo. Se colocaron los cartuchos sobre un tubo de Eppendorf de 1.5 mi y se eluyeron los oligosacáridos etiquetados 2-AB con 3 lavados (400 mi cada lavado) de agua Milli-Q.
Se separaron los oligosacáridos utilizando una columna de HPLC de Glicosep N (cat# GKI-4728) conectada con un sistema de HPLC de Shimadzu. El sistema de HPLC de Shimadzu consistió de un regulador de sistema, desgasificador, bombas binarias, un automuestreador con un enfriador de muestra, y un detector fluorescente.
Estabilidad a Elevadas Temperaturas Se ajustó la concentración final de los anticuerpos a 2 mg/ml con los amortiguadores, tensioactivos, estabilizadores, y/o azúcares apropiados. Las soluciones de anticuerpo entonces se esterilizaron mediante filtración y se prepararon 0.25 mi de alícuotas bajo condiciones estériles. Las alícuotas se dejarán a cada -80°C, 5°C, 25°C, o 40°C durante 1, 2 o 3 semanas. Al final del período de incubación, se analizaron las muestras mediante cromatografía de exclusión de tamaño y SDS-PAGE.
Se analizaron las muestras de estabilidad mediante SDS-PAGE bajo ambas condiciones reductores y no reductoras. El procedimiento usado es el mismo como se describe en la presente. Se tiñeron los geles durante la noche con tinte azul coloidal (cat# 46-7015, 46-7016 de Invitrogen) y destiñeron con agua Milli-Q hasta que el fondo fue claro. Los geles teñidos entonces se escanearon utilizando un escáner de Expresión de Epson (modelo 1680, S/N DASX003641). Para obtener más sensibilidad, los mismos geles son tiñeron con plata utilizando el kit de teñido de plata (Owl Scientific, Gel Company, San Francisco, California US) y se utilizan los procedimientos recomendados dados por el fabricante.
Ejemplo 1.9: Transfeccion y Expresión en células HEK 293-6E Se transfectaron los constructos del vector de anticuerpo anti-hTNF-a en 293 células para la producción de proteína. El procedimiento de transfeccion de 293 células transeúntes usado es una modificación de los métodos publicadas en Durocher et al. (2002) Nucí. Acids Res. 30(2e9): I-9 y Pham et al. (2005) Biotech. Bioeng. 90(3):332-44. Los reactivos que se utilizaron en la transfeccion incluyen: • Células HEK 293-6E (línea celular embrionaria de riñon humano estable que expresa EBNA1; obtenida de National Research Council Canadá) cultivadas en matraces de Erlenmeyer disponibles en una incubadora humedecida ajustada a 130 RPM, 37°C y 5% de C02.
Medio de cultivo: Medio de Expresión de FreeStyle 293 (Invitrogen 12338-018) más 25 pg/ml de Geneticina (G418) (Invitrogen 10131-027) y 0.1% de Pluronic F-68 (Invitrogen 24040-032).
• Medio de transfeccion: Medio de Expresión de FreeStyle 293 más 10 mM de HEPES (Invitrogen 15630-080).
• Reservas de polietilenimina (PEI): 1 mg/ml de solución madre estéril, pH 7.0, preparada con 25 kDa de PEI lineal (Polysciences) y almacenado a menos de -15°C.
• Medio de Alimentación de triptona: 5% p/v de reservas estériles de Triptona N1 (Organotechnie, 19554) en Medio de Expresión de FreeStyle 293.
Preparación de célula para transfección: Aproximadamente 2-4 horas antes de la transfección, se cosecharon células HEK 293-6E mediante centrifugación y resuspendieron en medio de cultivo a una densidad de célula de aproximadamente 1 millón de células viables por mi. Para cada transfección, se transfirieron 40 mi de la suspensión de célula en un matraz de Erlenmeyer de 250-ml disponible e incubaron durante 2-4 horas.
Transfección: Se entibiaron previamente el medio de transfección y reservas de PEI a temperatura ambiente. Para cada transfección, se combinaron 25 pg de ADN de plásmido y 50 pg de polietilenimina (PEI, por sus siglas en inglés) en 5 mi de medio de transfección e incubaron durante 15-20 minutos a temperatura ambiente para permitir que se formen los complejos de ADN:PEI. Para las transfecciones de BR3-lg, se utilizaron 25 pg del plásmido de BR3-lg por transfección. Cada 5-ml de mezcla de complejo de ADN:PEI se agregaron a 40-ml de cultivo preparos previamente y regresaron a la incubadora humedecida ajustada a 130 RPM, 37°C y 5% de C02. Después de 20-28 horas, se agregaron 5 mi de Medio de Alimentación de Triptona a cada transfección y se continuaron los cultivos durante seis días.
La Tabla 11 contiene los datos de rendimiento para los anticuerpos madre expresados como miligramos por litro en células HEK 293-6E.
Tabla 11: Expresión Transitoria en Rendimientos de Anticuerpos Anti-hTNF-a en células HEK 293-6E Todos los anticuerpos se expresaron bien en células HEK 293-6E. En la mayoría de los casos >50 mg/l de anticuerpo purificado pudieron obtenerse fácilmente de sobrenadantes de células HEK 293-6E.
Incorporación por Referencia La presente invención incorpora por referencia en sus técnicas de totalidad bien conocidas en el campo de la biblioteca de biología molecular y suministro de fármacos. Estas técnicas incluyen, pero no se limitan a, técnicas descritas en las siguientes publicaciones: Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Ausubel, F. M. et al. eds., Short Protocols In Molecular Biology (4a Ed. 1999) John Wiley & Sons, NY. (ISBN 0-471 -32938-X). Controlled Drug Bioavailabilitv Drug Product Design and Performance. Smolen y Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Giegé et al., Capítulo 1, In Crystallization of Nucleic Acids and Proteins. A Practical Approach, 2a ed. (Ducruix y Giege, eds.) (Oxford University Press, New York, 1999) pp. 1 -16; Goodson, J.M., Capítulo 6, In Medical Applications of Controlled Reléase, Vol. II, Applications and Evaluation, (Langer y Wise, eds.) (CRC Press, Inc., Boca Ratón, 1984), pp. 115-138; Hammerling et al., eds., "Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas," In Research Monographs in Immunology, vol. 3 (J.L. Turk, General Editor) (Elsevier, New York, 1981 ), pp. 563-587; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Kabat et al., Seguences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987); Kabat, E. A., et al. (1991) Seguences of Proteins of Immunological Interest Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, Número de Publicación NIH 91-3242; Kontermann y Dübel, eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5); Kriegler, Gene Transfer and Expression. A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); Lu y Weiner eds., Cloning and Expression Vectors for Gene Function Analvsis (2001) BioTechniques Press. Westborough, Mass. 298 pp. (ISBN 1-881299-21-X); Goodson, J.M., Medical Applications of Controlled Reléase, (Langer y Wise, eds.) (CRC Press, Boca Ratón, 1974); Oíd and Primrose, Principies of Gene Manipularon: An Introduction To Genetic Engineering (3a Ed. 1985) Blackwell Scientific Publications, Boston; Studies in Microbioloqy, V.2:409 pp. (ISBN 0-632-01318-4); Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Ed. 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Vols. 1-3 (ISBN 0-87969-309-6); Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, (J.R. Robinson, ed.) (Marcel Dekker, Inc., New York, 1978); Winnacker, E.L. From Genes To Clones: Introduction To Gene Technology (1987) VCH Publishers, N.Y. (traducido por Horst Ibelgaufts), 634 pp. (ISBN 0-89573-614-4).
El contenido de todas las referencias citadas (incluyendo referencias de literatura, patentes, solicitudes de patente, y sitos Web) que se cita a través de esta solicitud de incorporan expresamente es por este medio por referencia en su totalidad, al igual que las referencias citadas en la presente. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique los contrario, técnicas convencionales de inmunología, biología molecular y biología de célula, que son bien conocidos en la técnica.
Equivalentes La invención puede incorporarse a otras formas específicas sin apartarse del espíritu o de las características esenciales de la misma-. Las modalidades anteriores deben por lo tanto considerarse en todos los aspectos ilustrativos más que limitantes de la invención descrita en la presente. El alcance de la invención es así indicado por las reivindicaciones anexas más que por la descripción anterior, y todos los cambios que vienen dentro del significado e intervalo de equivalencia de las reivindicaciones por lo tanto, destinadas a contenerse en la presente.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Una proteína de unión humanizada que comprende un dominio de unión al antígeno capaz de unir el factor-alfa humano de necrosis tumoral (TNF-a, por sus siglas en inglés), el dominio de unión al antígeno que comprende por lo menos una CDR que comprende una secuencia de aminoácidos de residuos 31-35 de la SEC ID NO:22; residuos 50-65 de la SEC ID NO:22; residuos 98-106 de la SEC ID NO:22; residuos 24-34 de la SEC ID NO:23; residuos 50-56 de la SEC ID NO:23; o residuos 89-97 de la SEC ID NO:23, donde la proteína de unión comprende una estructura aceptora humana. 2. La proteína de unión de la reivindicación 1, donde la proteína de unión comprende por lo menos 3 CDR. 3. La proteína de unión de la reivindicación 2, donde por lo menos 3 CDR comprenden un conjunto de CDR de dominio variable es (a) residuos 31-35 de la SEC ID NO:22; residuos 50-65 de la SEC ID NO:22; y residuos 98-106 de la SEC ID NO:22; y (b) residuos 24-34 de la SEC ID NO:23; residuos 50-56 de la SEC ID NO:23; o residuos 89-97 de la SEC ID NO:23. 4. La proteína de unión de la reivindicación 3, donde el dominio de unión al antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos 31-35 de la SEC ID NO:22; residuos 50-65 de la SEC ID NO:22; residuos 98-106 de la SEC ID NO:22; residuos 24-34 de la SEC ID NO:23; residuos 50-56 de la SEC ID NO:23; y residuos 89-97 de la SEC ID NO:23. 5. La proteína de unión de la reivindicación 1, donde el dominio de unión al antígeno comprende una región de VH. 6. La proteína de unión de la reivindicación 5, donde la región de VH comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NOs: 24, 25, 28, 29, 30, 31, 32, o 33. 7. La proteína de unión de la reivindicación 1, donde el dominio de unión al antígeno comprende una región de VL. 8. La proteína de unión de la reivindicación 7, donde la secuencia de aminoácidos de la región de VL es la SEC ID NOs: 26, 27, 34, 35, o 36. 9. La proteína de unión de la reivindicación 7, donde el dominio de unión al antígeno comprende una región de VH y una región de VL. 10. La proteína de unión de la reivindicación 9, donde la región de VH comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 24, 25, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 y la región de VL comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 26, 27, 34, 35, o 36. 11. La proteína de unión de la reivindicación 1, donde la estructura aceptora humana comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NOs: 6-21. 12. La proteína de unión de la reivindicación 11, donde la estructura aceptora humana comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nos: 9, 10, 11, 12, 15, 16, 17, o 21. 13. La proteína de unión de la reivindicación 11 o 12, donde la estructura aceptora humana comprende por lo menos una sustitución de aminoácido de la región de estructura, donde la secuencia de aminoácidos de la estructura es por lo menos 65% idéntica a la secuencia de la estructura aceptora humana y comprende por lo menos 70 residuos de aminoácido idénticos a la estructura aceptora humana. 14. La proteína de unión de la reivindicación 13, donde la estructura aceptora humana comprende por lo menos una sustitución de aminoácido de la región de estructura en el residuo clave que es un residuo adyacente a una CDR; un residuo de sitio de glicosilación; un residuo raro; un residuo capaz de interactuar con TNF-a humano; un residuo capaz de interactuar con una CDR; un residuo canónico; un residuo de contacto entre la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera; un residuo dentro de una zona a Vernier; un residuo en una región que se traslapa entre una CDR1 de cadena pesada variable definida por Chothia o una primera estructrua de cadena pesada definido por Kabat. 15. La proteína de unión de la reivindicación 14, donde el residuo clave es H1, H12, H24, H27, H29, H37, H48, H49, H67, H71, H73, H76, H78, L13, L43, L58, L70, o L80. 16. La proteína de unión de la reivindicación 15, donde la mutación de VH es Q1E, I12V, A24V, G27F, I29L, V29F, F29L, 13TV, I48L, V48L, S49G, V67L, F67L, V71 K, R71K, T73N, N76S, L78I, o F78I. 17. La proteína de unión de la reivindicación 15, donde la mutación de VL es VI 3L, A43S, I58V, E70D, o S80P. 18. La proteína de unión de la reivindicación 1, donde la proteína de unión comprende dos dominios variables que tienen las secuencias de aminoácidos de la SEC ID NO:24 y SEC ID NO:26; SEC ID NO:24 y SEC ID NO:27; SEC ID NO:25 y SEC ID NO:26; SEC ID NO:25 o SEC ID NO:27. 19. La proteína de unión de la reivindicación 1, donde la proteína de unión modula una función biológica de TNF-a. 20. La proteína de unión de la reivindicación 1, donde la proteína de unión neutraliza TNF-a. 21. La proteína de unión de la reivindicación 1, donde la proteína de unión disminuye la capacidad de TNF-a de unir a su receptor. 22. La proteína de unión de la reivindicación 21, donde la proteína de unión disminuye la capacidad de TNF-a pro-humano, TNF-a maduro-humano, o TNF-a truncado-humano de unir a su receptor. 23. La proteína de unión de la reivindicación 1, donde la proteína de unión de reducir una o más de la producción de citocina dependiente de TNF; eliminación de célula dependiente de TNF; inflamación dependiente de TNF; erosión ósea dependiente de TNF; y daño del cartílago dependiente de TNF. 24. La proteína de unión de la reivindicación 1, donde la proteína de unión tiene una constante de asociación (Kon) de por lo menos aproximadamente 102M" s"1 ¡ por lo menos aproximadamente 103M" s"1; por lo menos aproximadamente 10 M" 1s"1; por lo menos aproximadamente 105M"1s"1 ; o por lo menos aproximadamente 106M"1s"1; como se midió mediante resonancia de plasmón superficial. 25. La proteína de unión de la reivindicación 1, donde la proteína de unión tiene una constante de disociación (Koff) de al menso aproximadamente 10"3s"1; al menos aproximadamente 10" s"1; al menos aproximadamente 10"5s"1; o al menos aproximadamente 10"6s"1, como se midió mediante resonancia de plasmón superficial. 26 La proteína de unión de la reivindicación 1, donde la proteína de unión tiene una constante de disociación (KD) de al menso aproximadamente 10"7 M; al menos aproximadamente 10"8 M; al menos aproximadamente 10"9 M; al menos aproximadamente 10"10 M; al menos aproximadamente 10"11 M; al menos aproximadamente 10"12 M; o a lo más 10~13 M. 27. La proteína de unión de la reivindicación 1, donde la proteína de unión comprende un dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada de un dominio constante de IgM humana, un dominio constante de lgG1 humana, un dominio constante de lgG2 humana, un dominio constante de lgG3 humana, un dominio constante de lgG4 humana, un dominio constante de IgA humana, o un dominio constante de IgE humana. 28. La proteína de unión de la reivindicación 27, donde el dominio de región constante de inmunoglobulina de cadena pesada es un dominio constante de IgG 1 humana. 29. La proteína de unión de la reivindicación 1 o 27, donde la proteína de unión además comprende un dominio constante de kappa de Ig humana o un dominio constante de lambda de Ig humana. 30. La proteína de unión de la reivindicación 28, donde el dominio constante de lgG1 humana comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 o SEC ID NO:3. 31. La proteína de unión de la reivindicación 29, donde el dominio de región constante de inmunoglobulina de cadena ligera es un dominio constante de kappa de Ig humana que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:4 o un dominio constante de lambda de Ig humana que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:5. 32. Una proteína de unión capaz de unir TNF-a humano, la proteína de unión comprende: una región pesada constante de Ig que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 o SEC ID NO: 3; una región ligera constante de Ig que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:4 o SEC ID NO:5; una región pesada variable de Ig que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 24, 25, 28, 29, 30, 31, 32, o 33; y una región ligera variable de Ig que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 26, 27, 34, 35, o 36. 33. La proteína de unión de la reivindicación 1, donde la proteína de unión es una molécula de inmunoglobulina, un Fv, un Fv ligado a disulfuro, un anticuerpo monoclonal, un scFv, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de dominio sencillo, un anticuerpo injertado con CDR, un diacuerpo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo multiespecífico, un Fab, un anticuerpo específico dual, un fragmento Fab', un anticuerpo biespecífico, un fragmento F(ab')2, un DVD-lg™, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fabs ligados por un enlace de disulfuro en la región de bisagra; un fragmento Fd que consiste de los dominios de VH y CH1; un fragmento Fv que consiste de los dominios de VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, un fragmento dAb, una región determinante de complementariedad aislada (CDR, por sus siglas en inglés), o un anticuerpo de cadena sencilla. 34. Una proteína de unión cristalizada que comprende una proteína de unión de la reivindicación 1, donde la proteína de unión está en la forma de cristal. 35. La proteína de unión cristalizada de la reivindicación 34, donde el cristal es un cristal de liberación controlada farmacéutico libre de portador. 36. La proteína de unión cristalizada de la reivindicación 34, donde la proteína de unión tiene una mayor vida media in vivo que las contrapartes solubles de la proteína de unión. 37. Una composición para la liberación de una proteína de unión al TNF-a, la composición comprende: (a) una formulación, donde la formulación comprende la proteína de unión de la reivindicación 1 o 34 y un ingrediente; y (b) por lo menos un portador polimérico. 38. La composición de la reivindicación 37, donde el ingrediente se selecciona del grupo que consiste de albúmina, sucrosa, trehalosa, lactitol, gelatina, hidroxipropil-p-ciclodextrina, metoxipolietilenglicol, y polietilenglicol. 39. La composición de la reivindicación 37, donde el portador polimérico es un polímero seleccionado de uno o más del grupo que consiste de: ácido poliacrílico, policianocrilato, un poliaminoácido, un polianh ídrido, un polidepsipéptido, un poliéster, ácido poliláctico, ácido poliláctico-co-glicólico, poli-b-hidroxibutriato, policaprolactona, polidioxanona; polietilenglicol, polih id roxipropilmetacri lamida, polio rganofosfazeno, poliortoésteres, polivinilalcohol , polivinilpirrolidona, copolímeros de anhídrido-alquilviniléter maleico, polioles plurónicos, albúmina, alginato, celulosa y derivados de celulosa, colágeno, fibrina, gelatina, ácido hialurónico, oligosacáridos, glicaminoglicanos, polisacáridos sulfatados, y mezclas y copolímeros de los mismos. 40. Un constructo de proteína de unión al TNF-a comprende la proteína de unión de la reivindicación 1 y un enlazador o un dominio constante de inmunoglobulina. 41. El constructo de proteína de unión al TNF-a de la reivindicación 40, donde la proteína de unión posee un patrón de glicosilación humana. 42. El constructo de proteína de unión al TNF-a de la reivindicación 40, donde el constructo de proteína de unión es un constructo de proteína de unión al TNF-a cristalizado. 43. El constructo de proteína de unión al TNF-a de la reivindicación 42, donde el constructo de proteína de unión al TNF-a cristalizado es un constructo de proteína de unión al TNF-a cristalizado de liberación controlada farmacéutico libre de portador. 44. El constructo de proteína de unión al TNF-a de la reivindicación 40, donde el constructo de proteína de unión tiene una mayor vida media in vivo que las contrapartes solubles del constructo de proteína de unión. 45. Un conjugado de proteína de unión al TNF-a que comprende un constructo de proteína de unión al TNF-a de la reivindicación 40, el conjugado de proteína de unión al TNF-a adicionalmente comprende una molécula de inmunoadhesión, un agente formador de imagen, un agente terapéutico, o un agente citotóxico. 46. El conjugado de proteína de unión al TNF-a de la reivindicación 45, donde el agente es un agente formador de imagen que es una radioetiqueta, una enzima, una etiqueta fluorescente, una etiqueta luminiscente, una etiqueta bioluminiscente, una etiqueta magnética, o biotina. 47. El conjugado de proteína de unión al TNF-a de la reivindicación 46, donde la radioetiqueta es 3H 4C 35S, 90Y, 99Tc, 111ln, 125l, 131l, 177Lu, 166Ho, y 153Sm. 48. El conjugado de proteína de unión al TNF-a de la reivindicación 47, donde el agente es un agente terapéutico o citotóxico que es un antimetabolito, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, un citocina, un agente anti-angiogénico, un agente antimitótico, una antraciclina, toxina, o un agente apoptótico. 49. Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína de unión que comprende una secuencia de aminoácidos de la reivindicación 1. 50. Un ácido nucleico aislado que codifica una constructo de proteína de unión al TNF-a que comprende una secuencia de aminoácidos de la reivindicación 40. 51. Un vector que comprende un ácido nucleico aislado de la reivindicación 49 o 50. 52. El vector de la reivindicación 51, donde el vector se selecciona del grupo que consiste de pcADN, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV, y pBJ. 53. Una célula hospedadora que comprende un vector de la reivindicación 51. 54. La célula hospedadora de la reivindicación 53, donde la célula hospedadora es una célula procariótica. 55. La célula hospedadora de la reivindicación 53, donde la célula hospedadora es una célula eucariótica. 56. La célula hospedadora de la reivindicación 55, donde la célula eucariótica es una célula protista, una célula de animal, una célula de planta, una célula fungicida, una célula de levadura, una célula de mamífero, una célula aviar, o una célula de insecto. 57. La célula hospedadora de la reivindicación 55, donde la célula hospedadora es una célula CHO, una célula COS, o una célula de Saccharomyces Cerevisiae. 58. Un método para producir una proteína que une TNF-a, el método comprende las etapas de cultivar una célula hospedadora de la reivindicación 53 en medio de cultivo bajo condiciones suficientes para producir una proteína de unión que une TNF-a. 59. Una proteína de unión al TNF-a producida del método de la reivindicación 58. 60. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión de la reivindicación 1, y un portador aceptable farmacéuticamente. 61. La composición farmacéutica de la reivindicación 60, donde el portador aceptable farmacéuticamente funciona como un adyuvante. 62. La composición farmacéutica de la reivindicación 61, donde el adyuvante es hialuronidasa. 62. La composición farmacéutica de la reivindicación 60, adicionalmente comprende por lo menos un agente terapéutico adicional para tratar un trastorno en el cual la actividad de TNF-a es perjudicial. 64. La composición farmacéutica de la reivindicación 63, donde el agente adicional es un agente terapéutico, un agente formador de imagen, un agente citotóxico, un inhibidor de angiogénesis, un inhibidor de cinasa, un bloqueador de molécula de co-estimulación, un bloqueador de molécula de adhesión, un anticuerpo anti-citocina o fragmento funcional del mismo, metotrexato, cicloesporina, rapamicina, FK506, una etiqueta detectable, reportero detectable, antagonista del TNF-a, un antireumático; un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (NSAID, por sus siglas en inglés), una analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriático, un corticoesteroide, un esteroide anabólico, una eritropoyetina, una inmunización, una inmunoglobulina, un agente inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un fármaco de reemplazo de hormona, un radiofarmacéutico, un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, una medicación del asma, un beta-agonista, un esteroide inhalado, un esteroide oral, una epinefrina o análogo de la misma, un citocina, o un antagonista del citocina. 65. Un método para tratar un mamífero que comprende la etapa de administrar al mamífero una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de la reivindicación 60. 66. Un método para reducir la actividad de TNF-a humano, el método que comprende la etapa de poner en contacto el TNF-a humano con la proteína de unión de la reivindicación 1 tal que la actividad de TNF-a humano es reducida. 67. Un método para reducir la actividad de TNF-a humano en un sujeto humano que sufre de un trastorno en el cual la actividad de TNF-a es perjudicial, el método comprende la etapa de administrar al sujeto humano la proteína de unión de la reivindicación 1 tal que la actividad de TNF-a humano en el sujeto humano es reducida y/o el tratamiento se alcanza. 68. Un método para tratar a un paciente que sufre de un trastorno en el cual el TNF-a es perjudicial que comprende la etapa de administrar la proteína de unión de la reivindicación 1 anterior, concurrente, o después de la administración de un segundo agente, donde el segundo agente es un anticuerpo, o fragmento del mismo, capaz de unir IL-12 humano; PGE2; LPA; NGF; CGRP; SubP; RABIA; histamina; un bloqueador del receptor de histamina; bradicinina; IL-1alfa; IL-1beta; VEGF; PLGF; metotrexato; un corticoesteroide, un modulador del receptor de glucocorticoide; cicloesporina, rapamicina, FK506, o un agente antiinflamatorio no esteroidal. 69. El método de la reivindicación 68, donde el trastorno es un trastorno respiratorio; asma; asma alérgico y no alérgico; asma debido a infección; asma debido a infección con virus sincitial respiratorio (RSV, por sus siglas en inglés); enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD, por sus siglas en inglés); una condición que involucra la inflamación de vía respiratoria; eosinofília; fibrosis y producción excesiva de moco; fibrosis quística; fibrosis pulmonar; un trastorno atópico; dermatitis atópico; urticaria; eczema; rinitis alérgica; enterogastritis alérgica; una condición inflamatoria y/o autoinmune de la piel; una condición inflamatoria y/o autoinmune de órganos gastrointestinales; enfermedades inflamatorias intestinales (IBD, por sus siglas en inglés); colitis ulcerosa; enfermedad de Crohn; una condición inflamatoria y/o autoinmune del hígado; cirrosis del hígado; fibrosis del hígado; fibrosis del hígado causada por el virus de hepatitis B y/o C; escleroderma; tumores o cánceres; carcinoma hepatocelular; glioblastoma; linfoma; Linfoma de Hodgkin; una infección viral; una infección bacteriana; una infección parásita; Infección por HTLV-1; supresión de expresión de inmunorespuestas protectoras tipo 1, y supresión de expresión de una inmunorespuesta protectora tipo 1 durante la vacunación. 70. El método de la reivindicación 68, donde el trastorno se selecciona del grupo que consiste de: artritis reumatoide, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis séptica, artritis de Lyme, artritis psoriática, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus sistémico eritematoso, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad inflamatoria intestinal, diabetes mellitus dependiente de insulina, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, esclerodermia, dermatitis, injerto contra enfermedad de huésped, rechazo de trasplante de órganos, enfermedad inmune aguda o crónica asociadas con trasplante de órganos, sarcoidosis, ateroesclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, purpurea de Henoch-Schoenlein, vasculitis microscópica de los ríñones, hepatitis activa crónica, uveitis, choque séptico, síndrome de choque tóxico, síndrome de sepsia, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parásitas, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, mielitis transversal aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, malignidades, paro cardíaco, infarto del miocardio, enfermedad de Addison, esporádico, deficiencia poliglandular tipo I y deficiencia poliglandular tipo II, síndrome de Schmidt, síndrome de dificultad respiratoria (aguda) del adulto, alopecia, alopecia areata, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriática, artropatía eolítica ulcerosa, sinovitis enteropática, clamidia, yersinia y artropatía asociada a Salmonella, espondiloartropatía, enfermedad ateromatosa/arteriosclerosis, alergia atópica, enfermedad ampulosa autoinmune, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoide, enfermedad de IgA lineal, anemia hemolítica autoinmune, anemia hemolítica positiva de Coombs, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/Enfermedad de Royal Free, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de célula gigante, hepatitis esclerótica primaria, hepatitis autoinmune criptogénica, Síndrome de Enfermedad de Inmunodeficiencia Adquirida, Enfermedades Relacionadas a Inmunodeficiencia Adquirida, hepatitis B, hepatitis C, inmunodeficiencia variada común (hipogammaglobulinemia variable común), cardiomiopatía dilatada, infertilidad femenina, falla ovárica, falla ovárica prematura, enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial post-inflamatoria, neumonitis intersticial, enfermedad del tejido conectivo asociada a enfermedad pulmonar intersticial, enfermedad del tejido conectivo mixta asociada a enfermedad pulmonar, esclerosis sistémica asociada a enfermedad pulmonar intersticial, artritis reumatoide asociada a enfermedad pulmonar intersticial, lupus eritematoso sistémico asociado a enfermedad pulmonar, dermatomiositis/polimiositis asociada a enfermedad pulmonar, enfermedad de Sjógren asociada a enfermedad pulmonar, espondilitis anquilosante asociada a enfermedad pulmonar, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, hemosiderosis asociada a enfermedad pulmonar, enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármaco, fibrosis, fibrosis por radiación, bronquiolitis obliterante, neumonía eosinofílica crónica, enfermedad pulmonar infiltrativa linfocítica, enfermedad pulmonar intersticial postinfecciosa, artritis gotosa, hepatitis autoinmune, hepatitis autoinmune tipo 1 (hepatitis autoinmune clásica o lupoide), hepatitis autoinmune tipo 2 (hepatitis de anticuerpo anti-LKM), hipoglucemia mediada autoinmune, resistencia a insulina tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroidismo, enfermedad inmune aguda asociada con trasplante de órganos, enfermedad inmune crónica asociada con trasplante de órganos, osteoartrosis, colangitis esclerosante primaria, psoriasis tipo 1, psoriasis tipo 2, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmune, enfermedad renal NOS, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de ríñones, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculina idiopática o NOS, autoinmunidad de esperma, esclerosis múltiple (todos los subtipos), oftalmía simpática, hipertensión pulmonar secundaria a enfermedad del tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, la manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, síndrome de Sjógren, enfermedad/arteritis de Takayasu, trombocitopenia autoinmune, trombocitopenia idiopática, enfermedad tiroidea autoinmune, hipertiroidismo, hipotiroidismo, hipotiroidismo autoinmune bocioso (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmune atrófico, mixedema primaria, uveítis facogénica, vasculitis primaria, enfermedad hepática aguda del vitíligo, enfermedades del hígado crónicas, cirrosis alcohólica, lesión hepática inducida por alcohol, coleostasis, enfermedad hepática idiosincrásica, hepatitis inducía por fármacos, esteatohepatitis no alcohólica, alergia y asma, infección por estreptococos del grupo B (GBS, por sus siglas en inglés), trastornos mentales (por ejemplo, depresión y esquizofrenia), enfermedades mediadas tipo Th2 y Tipo Th1, dolor agudo y crónico (diferentes formas de dolor), y cánceres como de pulmón, mama, estómago, vejiga, colon, páncreas, ovario, próstata y rectal y neoplasias hematopoyéticas (leucemia y linfoma) Abetalipoproteinemia, Acrocianosis, procesos parasitarios o infecciosos agudos y crónicos, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (LLA, por sus siglas en inglés), leucemia mieloide aguda (AML, por sus siglas en inglés), infección bacteriana aguda o crónica, pancreatitis aguda, insuficiencia renal aguda, adenocarcinomas, latidos ectópicos aéreos y complejos de demencia del SIDA, hepatitis inducida por alcohol, conjuntivitis alérgica, dermatitis de contacto alérgica, rinitis alérgica, rechazo del aloinjerto, deficiencia de alfa-1 -antitripsina, esclerosis lateral amiotrófica, anemia, angina de pecho, degeneración de células del cuerno anterior, terapia anti-CD3, síndrome antifosfolipídico, reacciones de hipersensibilidad antireceptor, aneurismas aórticas y periféricas, disección aórtica, hipertensión arterial, arteriosclerosis, fístula arteriovenosa, ataxia, fibrilación auricular (sostenida o paroxística), vibración auricular, bloqueo auriculoventricular, linfoma de células B, rechazo de injerto óseo, rechazo de trasplante de médula ósea (BMT, por sus siglas en inglés), bloqueo de rama, linfoma de Burkitt, Quemaduras, arritmias cardíacas, síndrome de aturdimiento cardíaco, tumores cardíacos, cardiomiopatía , respuesta inflamatoria a la derivación cardiopulmonar, rechazo de trasplante de cartílago, degeneraciones cerebelosas corticales, trastornos cerebelosos, taquicardia auricular caótica o multifocal, trastornos asociados con quimioterapia, leucemia mielocitica crónica (CML, por sus siglas en inglés), alcoholismo crónico, patologías inflamatorias crónicas, leucemia linfocítica crónica (CLL, por sus siglas en inglés), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD, por sus siglas en inglés), intoxicación crónica por salicilatos, carcinoma colorrectal, insuficiencia cardíaca congestiva, conjuntivitis, dermatitis de contacto, cor pulmonale, enfermedad de la arteria coronaria, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, sepsis con cultivo negativo, fibrosis quística, trastornos asociados con terapia de citocinas, Demencia pugilística, enfermedades desmielinizantes, fiebre hemorrágica del dengue, dermatitis, condiciones dermatológicas, diabetes, diabetes mellitus, enfermedad arteriosclerótica diabética, Enfermedad de cuerpos de Lewy difusa, cardiomiopatía congestiva dilatada, trastornos de los ganglios básales, Síndrome de Down en edad media, trastornos del movimiento inducidos por fármacos inducidos mediante fármacos los cuales bloquean receptores de dopamina del SNC, sensibilidad a fármacos, eczema, encefalomielitis, endocarditis, endocrinopatía, epiglotitis, infección mediante el virus de Epstein-Barr, eritromelalgia, trastornos extrapiramidales y cerebelosos, linfohistiocitosis hemofagocítica familiar, rechazo de implante del timo fetal, ataxia de Friedreich, trastornos arteriales periféricos funcionales, sepsis fúngica, gangrena gaseosa, úlcera gástrica, nefritis glomerular, rechazo de injerto de cualquier órgano o tejido, sepsis por gram negativos, sepsis por gram positivos, granulomas debido a organismos intracelulares, leucemia de células peludas, enfermedad de Hallervorden-Spatz, tiroiditis de Hashimoto, fiebre del heno, rechazo de trasplante de corazón, hemocromatosis, hemodiálisis, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombocitopénica trombótica, hemorragia, hepatitis (A), arritmias por haz de His, infección por H I V/neuropatía por VIH, enfermedad de Hodgkin, trastornos del movimiento hipercinéticos, reacciones de hipersensibilidad, neumonitis por hipersensibilidad, hipertensión, trastornos del movimiento hipocinéticos, evaluación del eje hipotalámico-pituitario-adrenal, enfermedad idiopática de Addison, fibrosis pulmonar idiopática, citotoxicidad mediada por anticuerpos, Astenia, atrofia muscular de espinal infantil, inflamación de la aorta, influenza A, exposición por radiación ionizante, iridociclitis/uveítis/neuritis óptica, daño por isquemia-reperfusión, accidente cerebrovascular isquémico, artritis reumatoide juvenil, atrofia muscular espinal juvenil, sarcoma de Kaposi, rechazo de trasplante renal, legionella, leishmaniasis, lepra, lesiones del sistema corticoespinal, lipedema, rechazo de trasplante de hígado, linfedema, malaria, linfoma maligno, histiocitosis maligna, melanoma maligno, meningitis, meningococcemia, metabólica/idiopática, dolor de cabeza, migraña, trastorno mitocondrial multisistema, enfermedad mixta del tejido conectivo, gammapatía monoclonal, mieloma múltiple, degeneraciones de sistemas múltiples (Menzel, Dejerine-Tomas, Shy-Drager, y Machado-Joseph), miastenia gravis, mycobacterium avium intracellulare, mycobacterium tuberculosis, síndrome mielodisplástico, infarto de miocardio, trastornos isquémicos miocárdicos, carcinoma nasofaríngeo, enfermedad pulmonar crónica neonatal, nefritis, nefrosis, enfermedades neurodegenerativas, atrofias musculares neurogénica I, fiebre neutropénica, linfoma de p?-Hodgkin, oclusión de la aorta abdominal y sus ramificaciones, trastornos arteriales oclusivos, terapia de OKT3®, orquitis/epididimitis, orquitis/procedimientos inversos de vasectomía, organomegalia, osteoporosis, rechazo de trasplante de páncreas, carcinoma pancreático, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia de malignidad, rechazo de trasplante de paratiroides, enfermedad inflamatoria pélvica, rinitis perenne, enfermedad pericárdica, enfermedad aterosclerótica periférica, trastornos vasculares periféricos, peritonitis, anemia perniciosa, neumonía por Pneumocystis carinii, neumonía, síndrome de POEMS (polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gammapatía monoclonal y síndrome de cambios en la piel), síndrome de postperfusión, síndrome de postbomba, síndrome de postcardiotomía MI, preeclampsia, supranuclear progresiva Plasy, hipertensión pulmonar primaria, terapia de radiación, fenómeno y enfermedad de Raynaud, enfermedad de Raynaud, enfermedad de Refsum, taquicardia regular de QRS estrecho, hipertensión renovascular, lesión de reperfusión, cárdiomiopatía restrictiva, sarcomas, esclerodermia, corea senil, Demencia Senil de tipo cuerpos de Lewy, artropatías seronegativas, choque, anemia de células falciformes, rechazo de aloinjerto de piel, síndrome de cambios en la piel, rechazo de trasplante de intestino delgado, tumores sólidos, arritmias específicas, ataxia espinal, degeneraciones espinocerebelosas, miositis estreptocócica, lesiones estructurales del cerebelo, Panencefalitis esclerosante subaguda, Síncope, sífilis del sistema cardiovascular, anafilaxia sistémica, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, artritis juvenil reumatoide de comienzo sistémico, células T o FAB ALL, Telangiectasia, tromboangitis obliterante, trombocitopenia, toxicidad, trasplantes, trauma/hemorragia, reacciones de hipersensibilidad tipo III, hipersensibilidad tipo IV, angina inestable, uremia, urosepsis, urticaria, enfermedades valvulares cardíacas, venas varicosas, vasculitis, enfermedades venosas, trombosis venosa, fibrilación ventricular, infecciones víricas y fúngicas, encefalitis viral/meningitis aséptica, síndrome hemofagocítico viral asociada, síndrome de Wernicke-Korsakoff, enfermedad de Wilson, rechazo de xenoinjertos de cualquier órgano o tejido, síndromes coronarios agudos, polineuritis idiopática aguda, polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria aguda, isquemia aguda, enfermedad de Still del adulto, alopecia areata, anafilaxia, síndrome de anticuerpo antifosfolípido, anemia aplásica, arteriosclerosis, eccema atópico, dermatitis atópica, dermatitis autoinmune, trastorno autoinmune asociado con infección por estreptococos, enteropatía autoinmune, pérdida auditiva autoinmune, síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS, por sus siglas en inglés), miocarditis autoinmune, insuficiencia ovárica prematura autoinmune, blefaritis, bronquiectasias, penfigoide bulloso, enfermedad cardiovascular, síndrome antifosfolipídico catastrófico, enfermedad celíaca, espondilosis cervical, isquemia crónica, penfigoide cicatricial, síndrome aislado clínicamente (CIS, por sus siglas en inglés) con riesgo de esclerosis múltiple, conjuntivitis, trastorno psiquiátrico con inicio en la infancia, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD, por sus siglas en inglés), dacriocistitis, dermatomiositis, retinopatía diabética, diabetes mellitus, hernia de disco, prolapso de disco, anemia hemolítica inmune inducida por fármacos, endocarditis, endometriosis, endoftalmitis, epiescleritiss eritema multiforme, eritema multiforme mayor, penfigoide gestacional, síndrome de Guillain-Barré (GBS, por sus siglas en inglés), fiebre de heno, síndrome de Hughes, enfermedad de Parkinson idiopática, neumonía intersticial idiopática, alergia mediada por IgE, anemia hemolítica inmune, miositis por cuerpos de inclusión, enfermedad inflamatoria ocular infecciosa, enfermedad desmielinizante inflamatoria, enfermedad cardíaca inflamatoria, enfermedad renal inflamatoria, IPF/UIP, iritis, queratitis, queratoconjunctivitis sicca, enfermedad de Kussmaul o enfermedad de Kussmaul-Meier, parálisis de Landry, histiocitosis de células de Langerhans, livedo reticularis, degeneración macular, poliangiítis microscópica, morbus Bechterev, trastornos de neuronas motoras, penfigoide de membranas mucosas, insuficiencia orgánica múltiple, miastenia gravis, síndrome mielodisplastico, miocarditis, trastornos de raíz nerviosa, neuropatía, hepatitis no A no B, neuritis óptica, osteolisis, cáncer de ovario, Pauciarticular JAR, enfermedad arterial periférica oclusiva (PAOD, por sus siglas en inglés), enfermedad vascular periférica (PVD, por sus siglas en inglés), arteria periférica, enfermedad (PAD, por sus siglas en inglés), flebitis, poliarteritis nodosa (o periarteritis nodosa), policondrítis, polimialgia reumática, poliosis, poliarticular JRA, síndrome de deficiencia poliendocrina, polimiositis, polimialgia reumática (PMR, por sus siglas en inglés), síndrome post-bomba, Parkinsonismo primario, cáncer de próstata y rectal y malignidades hematopoyéticas (leucemia y linfoma), prostatitis, aplasia pura de células rojas, insuficiencia adrenal primaria, neuromielitis óptica recurrente, restenosis, enfermedad cardiaca reumática, SAPHO (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis y osteítis), esclerodermia, amiloidosis secundaria, choque pulmonar, escleritis, ciática, insuficiencia adrenal secundaria, enfermedad de tejido conectivo asociada a silicona, dermatosis de Sneddon-Wilkinson, espondilitis anquilosante, síndrome de Stevens-Johnson (SJS, por sus siglas en inglés), síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, arteritis temporal, retinitis toxoplásmica, necrólisis epidérmica tóxica, mielitis transversa, TRAMPS (síndrome periódico asociado el receptor de factor de necrosis tumoral), reacción alérgica tipo 1, diabetes tipo II, urticaria, neumonía intersticial usual (UIP, por sus siglas en inglés), vasculitis, conjuntivitis vernal, retinitis viral, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada (síndrome de VKH, por sus siglas en inglés), degeneración macular húmeda, cicatrización de heridas, artropatía asociada a yersinia y Salmonella. 71. Un método para tratar un paciente que sufre de un trastorno en el cual TNF-a es perjudicial, el método comprende la etapa de administrar la proteína de unión de la reivindicación 1 anterior, concurrente, o después de la administración de un segundo agente, donde el segundo agente es un esferoide inhalado; beta-agonistas; beta-agonistas de acción corta o acción prolongada, antagonistas de leucotrienos o receptores de leucotrienos; ADVAIR; inhibidores de IgE; anticuerpos anti-lgE; XOLAIR; inhibidores de fosfodiesterasa; inhibidores de PDE4; xantinas, fármacos anticolinérgicos; agentes estabilizadores de mastocitos; Cromolina; inhibidores de IL-4; inhibidores de IL-5; inhibidores de eotaxina/CCR3, antagonistas de histamina o sus receptores que incluyen H1, H2, H3 y H4; antagonistas de prostaglandina D o sus receptores DP1 y CRTH2; antagonistas de TNF; un fragmento soluble de un receptor de TNF; ENBREL; antagonistas de enzima de TNF; inhibidores de la enzima convertidora de TNF (TACE, por sus siglas en inglés); antagonistas del receptor muscarínico; antagonistas de TGF-beta, interferón gamma; pirfenidona; agentes quimioterapéuticos, metotrexato; leflunomida; sirolimus (rapamicina) o un análogo de los mismos, CCI-779; COX2 o inhibidores de cPLA2; NSAIDs; inmunomoduladores; inhibidores de p38, inhibidores de TPL-2, MK-2 y NFkB; budenosida, factor de crecimiento epidérmico, corticosteroides; ciclosporina; sulfasalazina; aminosaliciiatos; 6-mercaptopurina; azatioprina; metron idazol ; inhibidores de lipoxigenasa; mesalamina; olsalazina; balsalazida, antioxidantes, inhibidores de tromboxano; antagonistas del receptor IL-1; anticuerpos anti-IL-1 ß; anticuerpos anti-IL-6; factores de crecimiento, inhibidores de elastasa; compuestos piridinil-imidazol; anticuerpos o agonistas de LT, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL- 9, IL-10, IL-11, IL- 2, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, EMAP-II, GM- CSF, FGF, PDGF o; anticuerpos de CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos; FK506; rapamicina; micofenolato de mofetilo; ibuprofeno; prednisolona; inhibidores de fosfodiesterasa; agonistas de adensosina, agentes antitrombóticos, inhibidores de complemento, agentes adrenérgicos, IRAK, NIK, IKK, p38, o inhibidores de MAP quinasa, inhibidores de la enzima convertidora de IL-?ß, TNF-a, inhibidores de la enzima convertidora de TNF-a, inhibidores de señalización de células T; inhibidores de metaloproteinasas, 6-mercaptopurinas; inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina; receptores de citocina solubles; receptor del TNF p55 soluble; receptor del TNF p75 soluble; s I L- 1 R I ; s I L- 1 R 11 ; slL-6R; citocinas antiinflamatorias; IL-4; IL-10; IL-11; y TGF-ß. 72. El método de la reivindicación 67, donde la administración al sujeto es por lo menos un modo seleccionado del grupo que consiste de parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, ¡ntracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intercerebral, intracerebroventricular, intracálica, intracervical, intragástrica, intrahepática,, intramiocardial, intraosteal, intrapélvica, intrapericardiaca, intraperitoneal , intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal , intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravesical, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal y transdérmica. 73. Un método para determinar la presencia de TNF-a o fragmento del mismo en una muestra de prueba mediante un inmunoensayo, donde el inmunoensayo comprende poner en contacto la muestra de prueba con por lo menos una proteína de unión o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, y por lo menos una etiqueta detectable. 74. El método de la reivindicación 73, donde el método adicionalmente comprende las etapas de: (i) poner en contacto la muestra de prueba con por lo menos una proteína de unión o fragmento del mismo, donde la proteína de unión une a un epítopo en el TNF-a o fragmento del mismo para formar un primer complejo; (ii) poner en contacto el complejo con por lo menos una etiqueta detectable, donde la etiqueta detectable une a un epítopo en el primer complejo, o en el TNF-a o fragmento del mismo, que no es unido por la proteína o fragmento unión de la misma, para formar un segundo complejo; y (iii) detectar la presencia del TNF-a o fragmento del mismo en la muestra de prueba basada en la señal generada por la etiqueta detectable en el segundo complejo, donde la presencia del TNF-a o fragmento del mismo se correlaciona directamente con la señal generada por la etiqueta detectable. 75. El método de la reivindicación 73, donde el método adicionalmente comprende las etapas de: (i) poner en contacto la muestra de prueba con por lo menos un proteína de unión o fragmento de la misma, donde la proteína de unión o fragmento de la misma une a un epítopo en el TNF-a o fragmento del mismo para formar un primer complejo; (ii) poner en contacto el complejo con por lo menos una etiqueta detectable, donde la etiqueta detectable compite con el TNF-a o fragmento del mismo para unir a la proteína de unión o fragmento de la misma a fin de formar un segundo complejo; y (iii) detectar la presencia del TNF-a o fragmento del mismo en la muestra de prueba basada en la señal generada por la etiqueta detectable en el segundo complejo, donde la presencia del TNF-a o fragmento del mismo se correlaciona indirectamente con la señal generada por la etiqueta detectable. 76. El método de la reivindicación 73, donde el método opcionalmente comprende además el diagnosticar, pronosticar, o determinar la eficacia del tratamiento terapéutico/profiláctico del paciente.
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