KR20080045765A - 인터페론 알파 수용체-1에 대한 인체화 항체 - Google Patents

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조세핀 엠 카다렐리
챙-후이 티모시 챈
다비드 킹
크리스토퍼 알. 베빙톤
사라 리 포그
프란시스 제이. 카아
스테픈 윌리암스
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메다렉스, 인코포레이티드
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Abstract

IFNAR-1과 결합하는 인체화된 단일클론성 항체, 및 관련 항체에 근거한 조성물 및 분자가 개시되어 있다. 또한 인체화된 항체를 포함하는 약학 조성물과, 인체화된 항체를 사용하는 치료 및 진단 방법이 또한 개시되어 있다.
IFNAR-1, 인체화된 단일클론성 항체

Description

인터페론 알파 수용체-1에 대한 인체화 항체{HUMANIZED ANTIBODIES TO INTERFERON ALPHA RECEPTOR-1 (IFNAR-1)}
본원 발명은 인터페론 알파 수용체-1 (IFNAR-1)과 결합하는 인체화된 단일클론성 항체, 그에 근거한 조성물, 인체화된 항체를 사용하는 치료 및 진단 방법에 관한 것이다.
타입 I 인터페론류 (IFN) (IFN-a, IFN-, IFN-t3, IFN-X)는 항바이러스성, 항종양 및 면역조절성 효과를 가지는 구조적으로 관련있는 사이토카인류의 일족이다 (Hardy 등, Blood. 97: 473, 2001; Cutrone 및 Langer, J. Biol. Chem. 276: 17140, 2001). 인간 IFNa 위치는 두 개의 아족(subfamily)를 포함한다. 제 일 아족은 14개 비-대립 유전자 및 적어도 80% 상동성을 가지는 4개 가유전자(pseudogenes)로 구성된다. 제 이 아족, 전부 또는 오메가 (o)는 5 개의 가유전자 및 IFNa 유전자와 70% 상동성을 보이는 1 개의 기능성 유전자를 포함한다 (Weissmann 및 Weber, Prog. Nucl. Acids Res. Mol. Biol., 33: 251-300, 1986). IFNa의 서브타입들은 상이한 특이 활성을 가지나, 동일한 생물학적 범위를 지니며 (Streuli 등. PNAS-USA 78: 2848,1981) 및 동일한 세포 수용체를 가진다 (Agnet M. 등. in "Interferon 5"Ed. 1. Gresser p. 1-22, Academic Press, London 1983).
인터페론 (3 (IFN )은 IFNa 유전자와 약 50% 상동성을 가지는 단일 유전자에 의해 암호화되어 있다.
활성화된 임파구에 의해 생성되는 감마 인터페론은 알파/베타 인터페론류와 어떠한 상동성도 가지지 않으며, 이들의 수용체와 반응하지 않는다.
모든 인간 타입 I 인터페론류는 두 가지 막투과 단백질, IFNAR-1 및 IFNAR-2로 구성되는 세포 표면 수용체 (IFN 알파 수용체, IFNAR)과 결합한다. IFNAR-1은 IFNAR 복합체의 높은 친화성 결합 및 차별적 특이성에 필수적인 것이다 (Cutrone, 2001, 상기 기재). 타입 I IFN 서브타입들 각각의 기능적 차이는 확인되지 않았지만, 각각은 IFNAR 수용체 성분과 상이한 상호작용을 보이며, 이는 잠재적인 다양한 신호 결과로 이끄는 것으로 생각된다 (Cook 등. (1996) J. Biol. Chem., 271: 13448). 특히, IFNAR-1 및 IFNAR-2의 돌연변이 형태를 이용한 연구에서, 알파 및 베타 인터페론류는 각각의 사슬과 상이하게 작용함으로써 수용체를 통해 다르게 신호를 내는 것으로 제시하고 있다 (Lewerenz 등. (1998) J. Mol. Biol. 282: 585).
타입 I IFNs의 초기 기능 연구는 바이러스성 감염에 대한 선천적 방어에 초점을 맞추었다 (Haller 등. (1981) J. Exp. Med. 154: 199; Lindenmann 등. (1981) Methods Enzymol. 78: 181). 더 최근의 연구는, 그러나, 후천성 면역 반응에서 타입 I IFNs가 강력한 면역조절 사이토카인이라는 것을 제시한다. 특히, 타입 I IFNs는 Thl 경로를 따라 나이브(naive) T 세포의 분화를 용이하게 하고 (Brinkmann 등. (1993) J. Exp. Med. 178: 1655), 항체 생산을 향상시키고 (Finkelman 등. (1991) J. Exp. Med. 174: 1179) 및 메모리 T 세포의 기능 활성 및 생존을 지지하는 (Santini, 등. (2000) J. Exp. Med. 191: 1777; Tough 등. (1996) Science 272: 1947) 것으로 나타났다.
많은 연구 그룹에서 행한 최근의 연구는 IFN-a가 수지상 세포의 성숙분열 또는 활성을 향상시킨다는 것을 제시하고 있다 (Santini, 등. (2000) J. Exp. Med., 191: 1777; Luft 등. (1998) J. Immunol., 161: 1947; Luft 등. (2002) Int. Immunol. 14: 367; Radvanyi 등. (1999) Scand. J. Immunol. 50: 499). 더욱이, of 타입 I 인터페론류의 발현 증가는 많은 자가면역 질환에서 나타나고 있다 (Foulis 등. (1987) Lancet, 2: 1423; Hooks 등. (1982) 관절염 Rheum 25: 396; Hertzog 등. (1988) Clin. Immunol. hnmunopathol. 48: 192; Hopkins 및 Meager (1988) Clin. Exp. Immunol. 73: 88; Arvin 및 Miller (1984) 관절염 Rheum. 27: 582).
이것의 가장 많이 연구된 예는 IFN-a의 농도 증가와 연계되어 있는, 인슐린-의존성 당뇨 (IDDM) (Foulis (1987) 상기 기재) 및 전신성 홍반성 루퍼스 (SLE) (Hooks (1982) supra), 및 IFN-P가 더 중요한 역할을 하는, 류마티스 관절염 (RA) (Hertzog (1988), Hopkins 및 Meager (1988), Arvin 및 Miller (1984), 상기 기재)이다.
또한, 인터페론 투여는 건선 및 다발성 경화증 환자에서 잠재적인 병을 악화시켜 자가면역 질환의 이력이 없는 환자에게 SLE 유사 증상을 유도하는 것으로 보고되고 있다. 인터페론-α는 정상적인 마우스에게 사구체 신염을 유도하고 및 NZB/W 마우스의 자발적인 자가면역 질환의 개시를 촉진시키는 것으로 나타났다. 또한, 특정 경우, IFN-α 요법은 발열 및 신경질환을 포함하는 바람직하지 않은 부작용을 야기하는 것으로 나타났다. 그러므로 타입 I IFN의 활성을 저해시키는 것이 상기 환자에게 유리할 수 있고, 및 타입 I IFN 활성 저해 시키는 데 효과적인 제제의 필요성이 존재한다는 병인론적 상황이 있다.
본 발명 인간의 타입 I IFN의 생물학적 활성에 대한 길항체를 제공한다. 이러한 길항체들은, 예를 들어 타입 I-IFN (IFN al)의 생산 또는 발현이 병인성 징후와 연관이 있는 상황에서 치료(예방 포함) 목적에 사용될 수 있다, 그러한 길항체들은 또한 다양한 질병의 진단에 또는 그러한 질병의 진전 연구에 사용될 수 있다.
본 발명은 쥐의 CDR 서열이 개질되지 않은 인간의 골격(framework) 서열에 직접적으로 연결된 IFNAR-1 수용체에 대한 직접적인 항체로서, 고도의 친화성, 기능성 항체를 나타내는 인체화된 항체를 제공한다. 더욱이, 본 발명은 항체자체의 항원성을 저하시키기 위해 추가적인 항체 개질체를 포함하는 인체화된 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 상술한 항체의 단편물을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 IFN 알파 수용체-1에 특이적으로 결합하는 것으로서, 서열 번호: 1, 서열 번호 : 2, 또는 서열 번호 : 3의 상보성 결정 영역 아미노 산 서열들을 포함하는 중사슬 가변 영역; 서열 번호 : 4, 서열 번호 : 5, 또는 서열 번호 : 6의 상보성 결정 부위 아미노산 서열들을 포함하는 경사슬 가변 영역; 및 인간 항체 또는 인간 항체 콘센서스(concensus) 골격의 중사슬 및 경사슬에 있고, 인간 항체 또는 인간 항체 콘센서스 골격로부터는 변경되지 않은 가변 도메인 골격 영역을 포함하는 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 IFN 알파 수용체-1에 특이적으로 결합하는 것으로서, 쥐 항체 64G12의 CDR1 (서열 번호 : 1), CDR2 (서열 번호 : 2), 및 CDR3 (서열 번호 : 3)의 아미노산 서열 중, CDR3 (서열 번호 : 3)의 아미노산 서열에서는 적어도 하나의 아미노산 치환이 일어난 그러한 아미노산 서열, 및 인간 항체 또는 인간 항체 콘센서스 골격으로부터 유도된 가변 도메인 골격 영역을 포함하는 중사슬 가변 영역을 가지는 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물을 제공한다.
바람직하게는, 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물은 쥐 항체 64G12적어도 50% IFN 알파 수용체-1 결합 친화도를 보유하고 있다. 이러한 양태에서, 상기 가변 도메인 골격 영역은 인간 항체 또는 인간 항체 콘센서스 골격으로부터 불변일 수 있거나, 또는 골격 잔기내에서 특이한 치환을 가질 수 있다. 바람직한 양태에서, 상기 항체 또는 항체 단편물은 CDR3의 위치 4에서 아미노산 치환이 나타난 것이다.
바람직하게는, 이러한 치환은 프롤린이 L, N, E,, A, C, G, S, I, R, D, M, H, T, W, 및 K로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산, 더욱 바람직하게는 L, E, V, A, C, G, S, I, R, D, M, T, W, 및 K로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으 로의 치환이다. 다른 바람직한 양태에서, 상기 항체 또는 항체 단편물은 CDR3의 위치 11에서 아미노산 치환이 나타난 것이다. 바람직하게는, 이러한 치환은 티로신이 L, E, Q, R, V, A, F, G, C, I, T, W, H, K, D, 및 S로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산, 더욱 바람직하게는 E, R, V, A, F, 및 H로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으로의 치환이다. 다른 바람직한 양태에서, 상기 항체 또는 항체 단편물 또한 쥐 항체 64G12의 CDR1 (서열 번호 : 4), CDR2 (서열 번호 : 5), 및 CDR3 (서열 번호 : 6)의 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 IFN 알파 수용체-1를 특이적으로 결합하는 것으로서, 쥐 항체 64G12 의 CDRl (서열 번호 : 1), CDR2 (서열 번호 : 2), 및 CDR3 (서열 번호 : 3)의 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역; 및 쥐 항체 64G12의 of CDR1 (서열 번호 : 4), CDR2 (서열 번호 : 5), 및 CDR3 (서열 번호 : 6)의 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함하는 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물을 제공하는 바, 상기 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물은 24H, 29H, 37H, 40H, 71H, 78H, 19L, 37L, 46L, 58L, 70L, 및 83L로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서 적어도 하나의 아미노산이 치환되고, 상기 각 아미노산 위치는 카밧(Kabat)에 설정된 번호매김 체계를 이용하여 결정된 것이다.
바람직한 양태에서, 상기 아미노산 치환은 카밧에 설정된 번호매김 체계를 이용하여 결정된 잔기 24H의 페닐알라닌을 알라닌으로, 카밧에 설정된 번호매김 체계를 이용하여 결정된 잔기 29H의 루이신을 메티오닌으로, 카밧에 설정된 번호매김 체계를 이용하여 결정된 잔기 29H의 루이신을 알라닌으로, 잔기 37H의 발린을 이소 루이신으로 및 카밧에 설정된 번호매김 체계를 이용하여 결정된 잔기 40H에서의 알라닌을 트레오닌으로, 카밧에 설정된 번호매김 체계를 이용하여 결정된 잔기 40H의 알라닌을 프롤린으로, 카밧에 설정된 번호매김 체계를 이용하여 결정된 잔기 71H의 아르기닌을 리신으로, 카밧에 설정된 번호매김 체계를 이용하여 결정된 잔기 78H의 발린을 루이신으로, 카밧에 설정된 번호매김 체계를 이용하여 결정된 잔기 19L의 발린을 알라닌으로, 카밧에 설정된 번호매김 체계를 이용하여 결정된 잔기 37L의 글루타민을 루이신으로, 카밧에 설정된 번호매김 체계를 이용하여 결정된 잔기 46L의 루이신을 알라닌으로, 카밧에 설정된 번호매김 체계를 이용하여 결정된 잔기 58L의 발린을 이소루이신으로, 카밧에 설정된 번호매김 체계를 이용하여 결정된 잔기 70L의 세린을 아스파르트 산으로, 또는 카밧에 설정된 번호매김 체계를 이용하여 결정된 잔기 83L의 페닐알라닌을 트레오닌으로 치환한 것이다.
본 발명의 다른 바람직한 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물은 도 1B (H2)의 서열 번호 : 8, 도 1D (H3)의 서열 번호 : 10, 도 1 E (M3)의 서열 번호 : 11, 도 1H (M3-A)의 서열 번호 : 14, 도 1I (M3-B)의 서열 번호 : 15, 도 1J(M3-A/B)의 서열 번호 : 16, 도 1K (DI M3)의 서열 번호 : 17 및 도 1L (DI M3-B)의 서열 번호 : 18로 구성되는 군으로부터 선택된 중사슬 가변 영역 아미노산 서열; 및 도 2B (K6)의 서열 번호 : 20, 도 2C (Kl)의 서열 번호 : 21, 도 2D (Kl-C)의 서열 번호 : 22, 도 2E (Kl-D)의 서열 번호 : 23, 도 2F (Kl-E)의 서열 번호 : 24, 도 2G (Kl-C/D)의 서열 번호 : 25, 도 2H (Kl-C/E)의 서열 번호 : 26, 도 21 (Kl-D/E)의 서열 번호 : 27, 도 2J (Kl-C/D/E)의 서열 번호 : 28, 도 2K (DI Kl)의 서열 번 호 : 29 및 도 2L (DI Kl-C)의 서열 번호 : 30로 구성되는 군으로부터 선택된 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 중사슬 및 경사슬 가변 영역들의 바람직한 짝은: 도 1B (H2)의 서열 번호 : 8에 설정된 아미노산 서열을 가지는 가변 중사슬 아미노산 서열과 도 2B (K6)의 서열 번호 : 20에 설정된 아미노산 서열을 가지는 가변 경사슬 아미노산 서열, 도 1B (H2)의 서열 번호 : 8 에 설정된 아미노산 서열을 가지는 가변 중사슬 아미노산 서열과 도 2C (Kl)의 서열 번호 : 21 에 설정된 아미노산 서열을 가지는 가변 경사슬 아미노산 서열, 도 1D (H3)의 서열 번호 : 10 에 설정된 아미노산 서열을 가지는 가변 중사슬 아미노산 서열과 도 2B (K6)의 서열 번호 : 20 에 설정된 아미노산 서열을 가지는 가변 경사슬 아미노산 서열, 도 ID (H3)의 서열 번호 : 10 에 설정된 아미노산 서열을 가지는 가변 경사슬 아미노산 서열과 도 2C (Kl)의 서열 번호 : 21 에 설정된 아미노산 서열을 가지는 가변 경사슬 아미노산 서열, 도 1E (M3)의 서열 번호 : 11 에 설정된 아미노산 서열을 가지는 가변 중사슬 아미노산 서열과 도 2C (Kl)의 서열 번호 : 21에 설정된 아미노산 서열을 가지는 가변 경사슬 아미노산, 도 1K (DI M3)의 서열 번호 : 17 에 설정된 아미노산 서열을 가지는 가변 중사슬 아미노산 서열과 도 2C (Kl)의 서열 번호 : 21 에 설정된 아미노산 서열을 가지는 가변 경사슬 아미노산 서열, 도 11 (M3-B)의 서열 번호 : 15 에 설정된 아미노산 서열을 가지는 가변 중사슬 아미노산 서열 과 도 2C (Kl)의 서열번호 : 21 에 설정된 아미노산 서열을 가지는 가변 경사슬 아미노산 서열, 도 1L (DI M3-B)의 서열 번호 : 18 에 설정된 아미노산 서열을 가지는 가변 중사슬 아미노산 서열과 도 2C (Kl)의 서열 번호 : 21 에 설정된 아미노산 서열을 가지는 가변 경사슬 아미노산 서열, 도 1E (M3)의 서열 번호: 11 에 설정된 아미노산 서열을 가지는 가변 중사슬 아미노산 서열과 도 2D (Kl-C)의 서열 번호 : 22 에 설정된 아미노산 서열을 가지는 가변 경사슬 아미노산 서열, 도 11 (M3-B)의 서열 번호 : 15 에 설정된 아미노산 서열을 가지는 가변 중사슬 아미노산 서열과 도 2D (Kl-C)의 서열 번호 : 22 에 설정된 아미노산 서열을 가지는 가변 경사슬 아미노산 서열, 도 1K (DI M3)의 서열 번호 : 17 에 설정된 아미노산 서열을 가지는 가변 중사슬 아미노산 서열과 도 2D (Kl-C)의 서열 번호 : 22 에 설정된 아미노산 서열을 가지는 가변 경사슬 아미노산 서열, 또는 도 1L (DI M3-B)의 서열 번호 : 18에 설정된 아미노산 서열을 가지는 가변 중사슬 아미노산 서열과 도 2D (Kl-C)의 서열 번호 : 22 에 설정된 아미노산 서열을 가지는 가변 경사슬 아미노산 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명의 상기 인체화된 항체는 또한 인간 불변 중사슬 및 경사슬 도메인들을 포함한다. 바람직한 양태에서, 상기 인간 불변 경사슬 부위는 인간 감마 1, 감마 2, 감마 3, 및 감마 4로 구성되는 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 상기 인간 불변 중사슬 부위는 감마 1이다. 다른 양태에서, 본 발명이 인체화된 항체는 1X10-7 M 이하의 Kd의 IFN 알파 수용체-1 결합 친화도를 가지며, 더욱 바람직하게는 lx10-8 M 이하의 Kd의 결합 친화도를 가진다. "lXl0-7 M 이하의 Kd의 결합 친화도"는 1X10-7 M의 결합 친화도 또는 더 큰 전체 결합 친화도를 의 미한다. 다른 양태에서, 상기 결합 친화성은 1X10-7 내지 5X10-10 M 범위에 있거나, 또는 1X10-8 내지 5X10-10 M의 범위에 있거나, 또는 1X10-9 내지 5x10- l0 M 범위에 있다. 다른 양태에서, 본 발명의 인체화된 항-IFNAR-1 항체, 또는 항체 단편물은 시험관내 및 생체내에서 생물학적으로 활성적이고 및 다중 타입 I 인터페론류에 의해 유도된생물학적 반응을 저해한다.
다른 관점에서, 본 발명은 IFN 알파 수용체-1를 발현하는 세포상에서 타입-I 인터페론의 IFN 알파 수용체-1에 대한 결합을 저해시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 상기 세포를 본 발명의 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물과 접촉시켜 IFN 알파 수용체-1에 대한 타입 1 인터페론의 결합을 저해하는 것을 포함한다. 다른 관점에서, 본 발명은 목적물에서 면역반응을 저해하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본 발명의 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물을 목적물에 투여하여 면역반응이 저해되는 것을 포함한다. 저해될 상기 면역 반응은, 예를 들어, 세포상에서 MHC class I 또는 MHC class II의 발현이 조절되는 것이거나 또는 수지상 세포 발생이 유도되는 것이거나, 또는 혼합된 임파구 반응에 의해 특징되는 것일 수 있다. 면역 반응의 저해는 GMCSF/IFN 유도 수지상 세포와 같은 알로자극(allostimulatory) 세포의 저해를 포함한다.
본 발명은 또한 목적물에서 자가면역 질환, 이식 거부, 또는 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 목적물에게 본 발명의 인체화된 항체 또는 항체 단편물을 투여하여 목적물이 자가면역 질환, 이식거부, 또는 GVHD에 대하여 치료되는 것을 포함한다. 일 양태에서, 상기 자가면역 질환은 염증성 장질환 (Inflammatory Bowel Disease:IBD)일 수 있다. 다른 양태에서, 상기 자가면역 질환은 전신성 홍반성 루퍼스 (SLE)이다. 다른 양태에서, 상기 자가면역 질환은 인슐린 의존성 당뇨병이다 (IDDM). 다른 양태에서, 상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염 (RA)이다.
본 발명은 또한 목적물에서의 혈청 C 반응성 단백질 (CRP) 수준을 조절하는 방법, 목적물에서의 혈청 네오프테린 수준을 조절하는 방법, 및 목적물에서 B-세포 증식을 조절하는 방법을 제공하는 바, 상기 방법들은 본 발명의 인체화된 항체 또는 항체 단편물을 목적물에 투여하는 것을 포함한다.
다른 관점에서, 본 발명 또한 혼성화 (chimeric) 항-IFNAR-1 항체, 또는 항체 단편물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 혼성화 항체는 인간 중사슬 및 경사슬 불변 영역에 기능적으로 연결된, 쥐의 항-IFNAR-1 항체 64G12의 중사슬 가변 도메인 및 경사슬 가변 도메인 (각각 도 1A의 서열 번호 : 7 및 도 2A의 서열 번호 : 19)을 포함한다. 바람직한 인간 중사슬 불변 영역은 인간 감마 1, 인간 감마 2, 인간 감마 3 및 인간 감마 4, 더욱 바람직하게는 인간 감마 1를 포함한다.
본 발명에 따른 IFNAR-1과 결합하는 인체화된 단일클론성 항체 및 그에 근거한 조성물은 다양한 시험관 및 생체 내 진단과 치료 유동성을 가진다. 선택적으로 목적물에 생체 내 투여하여 타입I 인터페론이 역할을 하는 다양한 질병을 치료, 예방 및 진단할 수 있다. 자가 면역질환, 이식거부 또는 이식편 대 숙주 질환의 치료용 약제를 제조하는 데 사용할 수 있는 약학 조성물을 얻을 수 있다.
본 발명은 인터페론-알파 수용체 1 (IFNAR-1)에 직접적으로 대항하는 신규의 인체화된 및 혼성화 (chimeric) 항체를 제공한다. 일 관점에서, 본 발명의 인체화된 항체는 인간 생식계열 서열로부터 변화되지 않은 골격 (FR) 영역을 함유한다. 다른 관점에서, 상기 인체화된 항체는 공여 쥐의 항체에 비해, CDR 부위내에서, 바람직하게는 CDR3에서 변이를 포함하여, 예를 들어 항체의 결합이 향상된 것이다. 다른 관점에서, 상기 인체화된 항체는 인간 생식계열 서열에 대하여, 골격 영역 내에서 변이를 포함하는 것으로, 예를 들어, 항체의 면역원성이 감소된 것이다 (예를 들어, T-세포 에피토프들을 제거한 것). 본 발명의 항체는, 예를 들어, 타입 I 인터페론 (IFN)의 생산 또는 발현이 병인성 징후와 관련이 있는 경우에 치료 목적에 사용될 수 있다.
쥐의 항-인간 IFNAR-1 단일클론성 항체 64G12의 CDR들은 인간 항체 서열 의 FR들에 접합되어 64G12 항-IFNAR-1 mAb 및 높은 항원 결합 친화성의 항원 결합 특성을 가지면서, 또한 HAM : A 의 유도 감소 및 증가된 이펙터(effector) 활성을 보이는 인체화된 항체 및 항체-유도 제제를 제공할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
바람직하게는, 상기 인간 골격 아미노산 서열은 결과된 항체가 인체 생체 투여에 적합하게 되는 그러한 서열로 선택된다. 이러한 것은, 예를 들어, 그러한 인간 FR들을 포함하는 항체의 선행 사용에 근거하여 결정될 수 있다.
바람직하게는, 상기 인간 FR들은 자체로는 의미있는 면역원성이 아닌 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 IFNAR-1과 특이적으로 결합하고 및 타입 I 인터페론류의 작용을 차단할 수 있는 인체화된 항체에 관한 것이다.
바람직하게는, 그러한 인체화된 항체는 IFNAR-1에 양호한 결합 친화성을 가지고 및 모든 타입 I 인터페론류, 예를 들어 64G12에 대하여 양호한 차단 활성을 가지는 항체로부터 유도된다. 바람직하게는, 그런 인체화된 항체는 높은 친화성 (KD =1. 2x10-9 M)을 가지고 IFNAR-1와 결합하는 것으로 보고되고 있는, IgG 이소타입의 쥐 항체인, 64G12로부터 유도된 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 인체화된 항체는 64G12와 동일한 에피토프와 결합한다. 그러한 항체는 IFNAR-1 또는 IFNAR-1-발현 세포와의 결합에 대하여 64G12와 경쟁하는 능력에 근거하여, 확인될 수 있다. 64G12가 결합하는 에피토프는 펩티드: CNFSSLKLNVYE (서열 번호 : 42)를 포함하는 것으로 발견되었다. 이러한 펩티드는 IFNAR1의 세포외 부분의 서브도메인 1에 존재한다.
이러한 펩티드 내의 특정 치환은 항체 결합을 상당하게 저해하고, 또한 타입 -I IFNs의 결합 및 활성을 저해한다.
상기 쥐의 항-IFNAR-1 단일클론성 항체 64G12, 및 이의 생산 이전에 설명되어 있고 (미국 특허 번호 5,919, 453) 및 1992년 2월 26일 자로 ECACC (European Collection of Animal Cell Cultures Porton Down Salisbury, Wiltshire SP4 056, 영국)에 기탁하였다.
전술한 바와 같이, 인체화된 항체는 쥐 및 혼성화 항체보다 더 강력한 장점, 예를 들어, 인체에 있어서 감소된 면역원성을 부여한다. 이것은 그러한 인체화된 항체가 생체내로, 예를 들어, SLE, IDDM, RA, 등과 같은 자가면역 질환 치료를 위해, 또는 이식거부 또는 GVHD의 예방을 위해 투여될 때, HAMA 반응을 감소시키고 및 이 반응을 이끌어내는 것을 강력히 제거하기 때문에, 유용하다. 또한, 그러한 항체는 향상된 약리동력학적 특성을 나타낸다.
본 발명의 인체화된 항체는 전장 중사슬 및 경사슬을 가지는, 온전한 항체 분자; 이의 단편물, 예를 들어 Fab, Fab', (Fab') 2, 또는 Fv 단편물; 단일사슬 항체 단편물, 예를 들어 단일 사슬 Fv, 경사슬 또는 중사슬 단량체 또는 이량체; 연결 구조체로 서로 결합된, 두 개, 세 개, 네 개 또는 그 이상의 항체 또는 이의 단편물을 포함하는 다가 단일특이성 항원 결합 단백질; 또는 이러한 것 또는 MAb 64G12와 동일한 특이성을 가지는 임의의 다른 분자의 임의의 단편물 또는 유사체를 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서 상기 항체는 전장의 중사슬 및 경사슬을 가지는 온전한 항체를 포함한다.
본 발명이 더욱 잘 이해되기 위해, 먼저 특정 용어가 정의된다. 추가의 정의 는 상세한 설명에서 설정되어 있다.
용어 “인터페론 알파 수용체” “IFNAR-1", 및 "IFNAR-1 항원"은 본 명세서에서 서로 교환적으로 사용되며, 인간 IFNAR-1의 변이체, 이소폼(isoform) 및 종 유사체 (species homolog)를 포함한다. 따라서, 본 발명의 인간 항체는 특정의 경우, 인간이 아닌 종의 IFNAR-1과 또는 인간 IFNAR-1와 구조적으로 연관이 있는 다른 단백질 (예를 들어, 인간 IFNAR-1 유사체)와 교차결합할 수 있다. 다른 경우, 상기 항체는 may be completely specific for 인간 IFNAR-1에 대하여 완전하게 특이적이며, 종 또는 다른 유형과는 교차 반응을 보이지 않는다.
용어 "항체"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, IgG, IgM 및 IgA 이소타입들을 포함하는 전체 항체, 및 이의 임의의 항원 결합 단편물 (예를 들어, "항원-결합 부분") 또는 단일 사슬을 포함하는 것으로 사용된다. “항체”는 디설파이드 결합에 의해 상호 연결된 적어도 두 개의 중사슬 (H) 및 두 개의 경사슬 (L)을 포함하는 당단백질, 또는 이의 항원결합 부분을 지칭한다. 각 중사슬은 중사슬 가변 영역 (VH로 약칭) 및 중사슬 불변 영역으로 구성된다. 상기 IgG 중사슬 불변 영역은 네 개의 도메인, 즉, CHI, 힌지, CH2 및 CH3로 구성된다. 각 경사슬은 경사슬 가변 영역 (VL로 약칭) 및 경사슬 불변 영역으로 구성된다. 경사슬 불변 영역은 하나의 도메인, CL으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 또한, 골격 영역(FR)으로 명명되는 더 보존되어 있는 부위가 중간에 개재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)로 명명되는, 초가변성 영역으로 더욱 나누어질 수 있다. 각 VH 및 VL은 세 개의 CDR 및 네 개의 FR로 구성되고, 아미노-말단에서부터 카르복시-말단까지 하기 순서대로 배열되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중사슬 및 경사슬의 가변 영역은 항원과 상호 작용을 하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은, 면역글로불린이, 숙주 조직, 또는 면역체계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 기본 상보 시스템(classical complement system)의 제 1 요소(Clq)를 포함하는 인자와의 결합을 매개할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 항체의 "항원-결합 부분" (또는 단순히"항체 부분") 용어는 항원 (예를 들어, IFNAR-1)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편물을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편물에 의해 수행될 수 있음이 나타났다. 항체의 "항원- 결합 부분"의 용어내에 포함되는 결합 단편물의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CHI 도메인으로 구성되는 일가 단편물인 Fab 단편물; (ii) 힌지 부위에서 디설파이드 결합으로 연결된 두개의 Fab 단편물을 포함하는 이가 단편물인, F(ab') 2 단편물; (iii) VH 및 Cm 도메인으로 구성되는 Fd 단편물; (iv) 항체의 단일 사슬의 VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편물; (v) VH 도메인으로 구성되어 있는, dAb 단편물 (Ward 등., (1989) Nature 341: 544-54 6); 및 (vi) 분리된상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 더욱이, Fv 단편물의 두 개 도메인, VL 및 VH이 독립된 유전자에 의해 암호화되어 있지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여, VL 및 VH 영역이 짝지어 일가 분자 (단일 사슬 Fv (scFv)로 알려진; 참조, 예를 들어, Bird 등. (1988) Science 242: 423-426; 및 Huston 등. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883)를 형성하는 단일 단백질 분자로 만들어주는 합성 연결체에 의해, 또는 디설파이드 결합 사용과 같은 다른 수단을 통해서, 또는 이량화 모티프(motif)를 통해서 연결될 수 있다. 그러한 단일 사슬은 항원의 "항원-결합 부분" 용어 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이러한 항체 단편물은 당해 분야의 숙련자에 공지된 통상적인 기술로 얻어지며, 및 그 단편물들의 유용성은 온전한 항체에서와 동일한 방식으로스크린되어진다.
용어 "에피토프"는 항체와 특이적 결합을 할 수 있는 단백질 결정자를 의미한다. 에피토프들은 통상 아미노 산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 집합배치로 구성되고, 그리고 통상 특이적 삼차원적 구조 특성은 물론 특이적 하전 특성을 가진다.
조직형상적(conformational) 및 비조직형상적 에피토프는 변성 용매 존재하에서는 후자와의 결합은 그렇지 않은데 비해 전자와의 결합이 소실된다는 점에서 구별된다.
용어 "단일클론성 항체" 또는 "단일클론성 항체 조성물"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단일 분자성 조성물의 항체 분자를 제조하는 것을 지칭한다. 단일클론성 항체 조성물은 특정 에피토프에 대하여 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다. 따라서, 용어 "인간 단일클론성 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 가지는, 단일결합 특이성을 보이는 항체를 지칭한다. 일 양태에서, 인간 단일클론성 항체는 불멸 세포로 융합된 인간 중사슬 전 이유전자 및 경사슬 전이유전자를 포함하는 제놈을 가지는 형질 전환된 비 인간 동물, 예를 들어, 형질전환 동물로부터 얻은 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된다.
“분리된 항체”는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 상이한 항원적 특이성을 가지는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예를 들어, IFNAR-1에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 IFNAR-1외 다른 항원과 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 인간 IFNAR-1의 에피토프, 이소폼, 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는, 그러나, 예를 들어, 다른 종에서 나온 다른 관련있는 항원과 교차반응성을 가진다 (예를 들어, IFNAR-1 종 유사체). 더욱이, 분리된 항체는 다른 세포성 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없다. 본 발명의 일 양태에서, 상이한 특이성을 가지는 "분리된" 단일클론성 항체들의 조합물이 잘 정의된 조성물에서 혼합된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "특이성 결합"은 소정의 항원으로의 항체 결합을 지칭한다. 통상적으로, 항체는 10-7 M이하의 분리상수 (KD)로 결합하고, 및 소정의 항원과는, 소정의 항원 또는 밀접한 관련이 있는 항원외의 다른 비-특이성 항원 (예를 들어, BSA, 카제인)과의 결합에 대한 KD보다 적어도 두 배 적은 KD로 결합한다. 용어 “항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이성인 항체" 는 용어 “항원에 특이적으로 결합하는 항체”와 상호 교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 IgG 항체에 대한“높은 친화성”용 어는 10-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 10-9 M 이하, 및 더더욱 바람직하게는 10-1 M 이하의 KD를 가지는 항체를 지칭한다. 그러나, “높은 친화성" 결합은 다른 항체 이소타입들에게는 변할수 있다.
예를 들어, IgM 이소타입에 대한 “높은 친화성”결합은 10-7 M 이하, 더욱 바람직하게는 10-8 M 이하의 KD를 가지는 항체를 지칭한다.
용어 “Kassoc” 또는 “Ka”는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 특정 항체-항원 작용의 결합 속도를 지칭하는 것으로 의도되고, 용어 "Kdis" 또는 "Kd"는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 특정 항체-항원 상호작용의 분리 속도를 지칭하는 것으로 의도된다. 용어 "KD"는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, Kd to Ka의 비 (즉, Kd/Ka)로부터 얻어지는 분리 상수를 지칭하며, 몰농도로 표시된다 (M).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "이소타입"은 중사슬 불변 영역 유전자에 의해 암호화되는 항체 부류 (예를 들어, IgM, IgA 또는 IgGl)를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "이소타입 전환"은 항체의 부류 또는 이소타입이 하나의 Ig 부류에서 다른 Ig 부류의 하나로 변하는 현상을 뜻한다.
용어 "자연 발생"은, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 목적물에 적용될 때, 목적물이 자연에서 발견될 수 있는 사실을 뜻한다. 예를 들어, 자연의 원천에서 분리될 수 있는 유기체 (바이러스 포함)에 존재하고 실험실에서 사람에 의해 의 도적으로 개조되지 않은 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 자연 발생적이다.
용어 "재배열되지 않은" 또는 "생식계열 형상"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, V 세그먼트를 참조하면, V 세그먼트가 재조합되지 않고 D 또는 J 세그먼트에 바로 인접해 있는 형상을 뜻한다.
용어 "핵산 분자"는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산 분자는 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있고, 바람직하게는 이본쇄 DNA이다.
본 명세서에서 개시되고 및 청구되는 바와 같이, 설정된 서열은 "보존성(conservative) 서열 개조물", 즉, 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 항체 또는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합특성에 현저히 영향을 주거나 변화시키지 않는 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열 개조물을 포함한다. 그러한 보존성 서열 개조물은 뉴클레오타이드 및 아미노산 치환체, 첨가물 및 삭제물을 포함한다. 개조물은 당해 분야에 공지된 표준 방법, 예를 들어 부위-지정 돌연변이법 및 PCR-매개 돌연변이법으로 만들 수 있다. 보존성 아미노산 치환체는 아미노산 잔기가 유사한 측새를 가지는 아미노산 잔기로 치환된 것을 포함한다. 유사 측쇄를 가지는 아미노산 잔기 군은 당해 분야에 정의되어 있다. 이러한 군은 염기성 측쇄(예를 들어 , 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트 산, 글루탐산), 무하전 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루 이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소루이신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 가지는 아미노 산을 포함한다. 따라서, 인간 항-IFNAR-1 항체에서 예상되는 비본질적 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄군을 갖는 아미노산 잔기로 치환된다.
핵산에 대하여, 용어 "실질적 상동성"은 두 개의 핵산, 또는 이의 지정된 서열이, 최적으로 배열되고 비교될 때, 적절한 뉴클레오타이드 삽입체 또는 삭제물과, 상기 뉴클레오타이드의 적어도 약 80%, 통상 적어도 약 90% to 95%, 및 더욱 바람직하게는 적어도 약 98% to 99.5%로 동일한 것을 의미한다. 선택적으로, 실질적 상동성은 세그먼트들이 선택적 하이브리드화 조건하에서 본쇄의 상보물과 하이브리드화되는 때 존재한다.
두 개 서열간의 동일성 비율은 상기 두 서열의 최적 배열에 필요한 간격(gap)의 수 및 각 간격의 길이를 고려할 때, 상기 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 상동성 = 동일 위치의 수/전체 위치 수 x 100). 두 서열간의 동일성 비율의 결정은 하기 비제한적 실시예에서 설명되는 바와 같이, 수학적 알고리즘으로 이뤄질 수 있다.
두 개 뉴클레오타이드 서열간의 동일성 비율은 NWSgapdna. CMP 매트릭스 및 40,50, 60,70, 또는 80의 간격 가중치와 1,2, 3,4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지(http://www. gcg. com에서 이용가능)에 있는 GAP 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 두 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열간의 동 일성 비율은 또한 PAM120 가중치 잔기 표, 12의 간격 길이 페널티 및 4의 간격 길이 페널티를 사용하는, ALIGN 프로그램 (version 2.0)에 포함된 E. Meyers 및 W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988))의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 두 아미노산 서열간의 동일성 비율은 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16,14, 12,10, 8,6, 또는 4의 간격 가중치 및 1, 2,3, 4,5, 또는 6의 간격 가중치를 사용하는, GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램 (http://www. gcg. com에서 이용가능)에 포함되어 있는 Needleman 및 Wunsch (J ; Mol. Biol. 48: 444- 453 (1970) ) 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 핵산 및 단백질 서열은 또한 예를 들어, 관계있는 서열을 확인하기 위해 공공의 데이터베이스에 대해 탐색을 수행하는 "조회(query) 서열"로서 사용될 수 있다. 그러한 탐색은 Altschul, 등. (1990) J ; Mol. Biol. 215: 403-10의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (version 2. 0)을 사용하여 수행될 수 있다.
NBLAST 프로그램, 점수 =100, 단어길이=12를 사용하여 BLAST 뉴클레오타이드 탐색을 실시하여, 본 발명의 핵산 분자와 유사한 뉴클레오타이드 서열을 얻을 수 있다. XBLAST 프로그램, 점수=50, 단어길이=3을 사용하여 BLAST 단백질 탐색을 실시하여 본 발명의 단백질 분자와 유사한 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교하기 위한 간격된(gapped) 배열을 얻기위해, Altschul 등., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402에 설명된 바와 같이 Gapped BLAST를 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 각 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 기설정 변수들을 사용할 수 있다. 참조 http ://www. ncbi. nhn. nih. gov.
핵산 전체 세포, 세포 용해물 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 알카리성/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로즈 젤 전기영동 및 당해분야에 공지된 다른 기술를 포함하는 표준 기술에 의해, 다른 세포 성분 또는 다른 오염물 예를 들어, 다른 세포성 핵산 또는 단백질로부터 정제될 때, “분리되었”거나 또는 “실질적으로 순수하게 되었”다, 참조, F. Ausubel, 등., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing 및 Wiley Interscience, New York (1987).
cDNA, 게놈성 또는 혼합물로부터 얻어진 본 발명의 핵산 조성물은, 가끔 순수한 서열 (개질된 제한효소 부위 등을 제외하고)로 있지만, 표준 기술에 따라 변이되어 유전자 서열을 제공할 수 있다s. 코딩 서열에 대하여, 이러한 변이는 원하는 바 대로 아미노산 서열에 영향을 끼친다. 특히, 천연 V, D, J, 불변, 스위치 및 다른 그러한 서열과 실질적으로 유사하거나 또는 그것에서부터 유도된 DNA 서열이 의도된 것이다 (여기서 "유도된"은 다른 서열과 동일하거나 개조된 서열을 가르킨다).
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적인 관계로 놓여질 때 “기능적으로 연결되었”다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서가 코딩 서열의 전사에 영향을 준다면 그 서열에 기능적으로 연결된 것이다. 전사 조절 서열에 관하여, 기능적으로 연결되었다는 것은 연결되어 있는 DNA 서열이 인접해있고, 필요한 경우, 두 개의 단백질 코딩 부위를 연속적으로 그리고 독출틀(reading frame)안에서 연결하는 것을 뜻한다. 스위치 서열에 대해서, 기능적으로 연결되었다는 것은 서열이 스위치 재조합을 실 천할 수 있는 것을 뜻한다.
용어 "벡터"는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 연결된 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 벡터의 한 가지 유형은 "플라즈미드"이고 이것은 추가적인 DNA 세그먼트가 결찰될 수 있는 원형 이중 본쇄 DNA 루프를 말한다. 벡터의 다른 유형은 바이러스성 벡터이고, 여기서 추가적인 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 특정 벡터는 유입되는 숙주세포에서 자가 복제를 할 수 있다 (예를 들어, 복제의 박테리아 원점을 가지는 박테리아성 벡터 및 에피솜성 포유동물 벡터). 다른 벡터들 (예를 들어, 비-에피솜성 포유동물 벡터)은 숙주 세포로 유입시 숙주세포의 게놈으로 통합될 수 있고 따라서 숙주 게놈에 따라 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 기능적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 그러한 벡터를 "재조합 발현 벡터" (또는 단순히, "발현 벡터")로 지칭한다.
일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 종종 플라즈미드의 형태로 있다. 본 명세서에서, "플라즈미드" 및 "벡터"는 상호 교환적으로 사용할 수 있는 데, 플라즈미드는 벡터의 가장 공통적으로 사용되는 형태이기 때문이다. 그러나, 본 발명은 동일한 기능을 하는 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 결핍 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함한다.
용어 "재조합 숙주 세포" (또는 단순히 "숙주 세포")는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 재조합 발현 벡터가 유입된 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. 그러한 용어들은 특정 목적 세포뿐 아니라 그러한 세포의 자손들을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 특정 개조물들이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인하여 연속되는 세대에서 일어나기 때문에, 그러한 자손들은, 사실, 모체 세포와 동일하지 않지만, 그러나 여전히 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "숙주 세포"의 범위내에 포함된다. 재조합 숙주 세포는 예를 들어, CHO 세포 및 임파구성 세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "목적물"은 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다.
용어 "비인간 동물"은 모든 척추 동물, 예를 들어, 비인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류, 등과 같은 포유동물 및 비-포유동물을 포함한다.
본 발명의 다양한 관점은 하기 부단원에서 더욱 상세히 설명된다.
IFNAR -1에 대한 인체화된 항체의 생산
목적의 인체화된 항체는 IFNAR-1 (바람직하게는 64G12)과 결합하는 항체의가변 중사슬 (VH) 및 가변 경사슬 (VL)을 암호화하는 핵산서열을 얻고, 상기 VH 및 VL 서열에서 CDR를 확인하고, 및 그러한 CDR-암호화 핵산 서열을 선택된 인간 골격-암호화 핵산 서열로 접합함으로써 생산된다. 면역글로불린을 암호화하는 핵산 서열을 클로닝하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 그러한 방법은 일반적으로 적절한 프라이머를 사용하는 중합효소 사슬 반응(PCR)으로, 클론될 면역글로불린-암호화 서열을 증폭시키는 것을 포함한다.
면역글로불린 핵산 서열, 특히 쥐의 가변 중사슬 및 가변 경사슬 서열을 증폭시키는데 적합한 프라이머는 문헌에 보고되어 있다. 그러한 면역글로불린-암호화 서열을 클론한 후, 당해 분야에 공지된 방법으로 서열분석한다. 이것은 VH- 및 VL-암호화 서열, 및 더 상세하게는 CDR 및 FR를 암호화하는 이의 부분을 확인하는데 효과적이다. 이것은, 예를 들어, Boss 등의 미국 특허 번호 4,816, 397 및 Winter의 미국 특허 번호 5,225, 539에 개시된 것을 포함하는 공지된 방법으로 수행될 수 있다.
일단 인체화될 항체의 CDR 및 FR를 암호화하고 있는 DNA 서열이 확인되면,CDR를 암호화하고 있는 아미노산 서열이 확인되고 (핵산 서열 및 유전 코드에 근거하고 및 이전의 항체 서열과 비교함으로써 유추되는) 및 CDR-암호화 핵산 서열을 선택된 인간 FR-암호화 서열에 접합한다. 이것은 적절한 프라이머 및 링커를 사용하여 달성될 수 있다. 소정의 핵산 서열을 결찰하는데 제공되는 적절한 프라이머 및 링커를 선택하는 방법은 통상의 기술자의 범위내에 있다.
전술한 바와 같이, 인체화에 사용되는 선택된 인간 FR은 바람직하게는 생체 투여에 적합한 것, 즉 자체로 인체에 면역원성이 아닌 것이다.
CDR-암호화 서열을 선택된 인간 FR-암호화 서열에 접합한 후, "인체화된" 가변 중사슬 및 가변 경사슬 서열을 암호화하고 있는 결과된 DNA 서열을 발현시켜 인체화된 Fv를 생산하거나, 또는 인간 불변 영역 서열에 연결하여 IFNAR-1과 결합하는 인체화된 항체를 생산한다. 일반적으로, 상기 인체화된 VH 및 VL 서열은 전체 αIFNAR-1 항체 분자의 부분으로서, 즉, 이의 암호화 DNA 서열이 상업적으로 이용가능한 라이브러리로부터 얻어진, 또는 예를 들어, DNA 서열을 얻는 전술한 방법중 하나를 사용하여 얻어진 인간 불변 도메인 서열과의 융합 단백질로서 발현된다. 상기 인체화된 항체 분자의 경사슬 또는 중사슬 가변 도메인은 적절하게, 인간 경사슬 또는 중사슬 불면 도메인과 융합된다 (용어 중사슬 불변 도메인은, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 특별히 언급되지 않는 한 힌지 영역을 포함하는 것으로 이해되어야 한다).
존재하는 경우, 상기 인체화된 항체 분자의 인간 불변 도메인은 항체의 제시된 기능에 대하여, 특히 요구되는 이펙터 기능이 없는 것으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 중사슬 가변 영역에 융합된 중사슬 불변 도메인은 인간 IgA, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 바람직하게는 인간 IgG 도메인이 사용된다. 경사슬 가변 영역에 융합될 수 있는 경사슬 인간 불변 도메인은 인간 람다 또는 인간 카파 사슬을 포함한다. 바람직하게는 인간 카파 사슬 도메인이 사용된다.
인간 불변 도메인의 유사물이 선택적으로 유리하게 사용될 수 있다. 이것은 상응하는 인간 도메인 외 하나 이상의 추가적인 아미노산을 포함하는 불변 도메인, 또는 상응하는 인간 도메인의 하나 이상의 기존 아미노산이 삭제되거나 변형된 불변 도메인을 포함한다. 그러한 도메인은, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 지정 돌연변이법에 의해 얻어질 수 있다. 그러나 VH 및 VL 서열 또한 불변 서열 무존재하에서 발현되어 인체화된 αIFNAR-1 Fv를 생산할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 인간 불변 서열의 융합은 잠재적으로 바람직한데 왜냐하면 결과된 인체화된 αIFNAR- 1 항체가 실질적으로 향상된 약리동력학 양상을 보일 수 있기 때문이다.
공지된 단백질을 암호화하는 DNA를 합성하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 그러한 방법을 사용하여, 목적의 인체화된 VL 및 VH 서열 (불변 영역을 가지거나 가지지 않는)를 암호화하는 DNA 서열을 합성하고, 다음 재조합 항체의 발현에 적합한 벡터 시스템에서 발현시킨다. 이것은 인간 불변 도메인 서열과 융합 단백질로서 발현되고 및 연합되어 기능성 (항원 결합) 항체 또는 항체 단편물을 생산하게되는 목적의 인체화된 VL 및 VH 서열에 제공되는 임의의 벡터 시스템에서 수행될 수 있다. 유용한 방법이, 예를 들어, Boss 등의 미국 특허 번호 4, 816, 397 및 Winter의 미국 특허 번호 5,225, 539에 개시되어 있다.
재조합 항체 및 인체화된 항체의 발현에 적합한 발현 벡터 및 숙주 세포는 당해 분야에 공지되어 있다. 하기 참조 문헌은 본 발명을 수행하는데 유용한 재조합 면역글로불린의 발현에 적합한 방법 및 벡터를 대표적으로 나타낸다: Weidle 등., Gene, 51: 21-29 (1987); Dorai 등., J. Immunol., 13 (12): 4232- 4241 (1987); De Waele 등., Eur. J. Biochem., 176: 287-295 (1988); Colcher 등., Cancer Res., 49: 1738-1745 (1989); Wood 등., J. Immunol., 145 (9): 3011-3016 (1990); Bulens 등., Eur. J. Biochem., 195: 235-242 (1991); Beldsington 등., Biol. Technology, 10: 169 (1992); King 등., Biochem. J., 281: 317-323 (1992); Page 등., Biol. Technology, 9: 64 (1991) ; King 등., Biochem. J., 290: 723-729 (1993) ; Chaudhary 등., Nature, 339: 394-397 (1989); Jones 등., Nature, 321: 522-525 (1986); Morrison 및 Oi, Adv. Immunol., 44: 65-92 (1989); Benhar 등., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 12051-12055 (1994); Singer 등., J. hnunol., 150: 2844-2857 (1993); Couto 등., Hybridoam, 13 (3): 215-219 (1994); Queen 등., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 (1989); Caron 등., Cancer Res., 52: 6761-6767 (1992); Coloura 등, J. hnmunol. Meth., 152: 89-109 (1992). 더욱이, 재조합 항체의 발현에 적합한 벡터는 상업적으로 이용가능하다. 상기 벡터는, 예를 들어, 나신(bare) 핵산 세그먼트, 부형제-연합된 핵산 세그먼트, 핵단백질, 플라즈미드, 바이러스, 비로이드, 또는 전이인자(transposable element)일 수 있다.
기능성 면역글로불린을 발현시킬 수 있는 것으로 알려진 숙주세포는, 예를 들어: 차이니즈 햄스터 오바리(Chinese Hamster Ovary) (CHO) 세포와 같은 포유동물 세포; COS 세포; NSO 및 SP2/0 세포와 같은 골수종 세포; 이스체리키아 콜리와 같은 박테리아; 사카로마이에스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모; 및 숙주 세포를 포함한다. 이것들 중에서, CHO 세포가 효과적으로 면역글로불린을 발현시키고 분비하는 능력이 있기 때문에 많은 연구자들이 사용한다. NSO 세포는 본 발명에 유용한 숙주 세포의 바람직한 유형 중 하나이다.
본질적으로, 인체화된 항체의 재조합 발현은 두가지 일반적인 방법에 의해 얻어진다. 첫째 방법에서, 숙주 세포는 선택된 불변 영역에 선택적으로 융합된 VH 및 VL 가변 서열 둘 다의 발현에 제공되는 단일 벡터로 형질전환된다. 두 번째 방법에서 숙주 세포는 두개의 벡터, 각각은 선택된 불변 영역에 선택적으로 각각 융 합된, VH 또는 VL 서열 중 하나의 발현에 제공되는 벡터로 형질전환된다.
인간 불변 도메인 서열은 당해 분야에 공지되어 있고, 및 문헌에 나타나 잇다. 바람직한 인간 불변 경사슬 서열 (CL)은 카파 및 람다 불변 경사슬 서열을 포함한다. 바람직한 인간 불변 중사슬 서열은 인간 감마 1, 인간 감마 2, 인간 감마 3, 인간 감마 4, 및 변형된 효과 또는 기능, 예를 들어, 향상된 생체 수명, 감소된 Fc 수용체 결합 등을 위해 제공되는, 이들의 변이물을 포함한다.
발현 후, the 결과된 인체화된 항체의 항원 결합 친화성은 공지된 방법, 예를 들어, 스캐차드(Scatchard) 분석법으로 분석된다. 이상적으로는, 인체화된 항체의 항원-결합 친화성은 모체 항원, 64G12와 근사할 것이고, 또는 모체 항체 (즉, CDR를 제공한 항체)의 결합 친화성의 적어도 50%를 보유할 것이다.
인간 항체의 CDR의 적어도 일부분을 비인간 항체로부터 유도된 CDR로 치환할 수 있는 임의의 방법에 의해, 항체를 인체화시킬 수 있다. 윈터(Winter) 는 본 발명의 인체화된 항체를 제조하는 데 사용될 수 있는 방법을 설명한다 (영국 특허 출원 번호 GB 2188638A, 1987년 3월 26일자 출원), 이의 내용은 참조문헌에 포함된다. 인간 CDR는, 예를 들어, “인간 단핵 식균세포상의 면역글로불린 G용 Fc 수용체에 대한 인체화된 항체”제목의, 국제특허 출원 번호 WO 94/10332에 설명된 바와 같은, 올리고뉴클레오타이드 부위-지정 돌연변이법을 사용하여 비인간 CDR로 치환될 수 있다.
특정 아미노산이 치환되고, 삭제되거나 또는 첨가된 혼성화 및 인체화된 항체가 또한 본 발명의 범위내에 있다. 특히, 바람직한 인체화된 항체는 골격 영역에 서 아미노산 치환이 치환되어, 항원으로의 결합을 향상시키는바, 예를 들어, 마우스 CDR를 가지는 인체화된 항체에서, 인간 골격 영역에 위치한 아미노산은 마우스 항체내의 상응하는 위치에 있는 아미노산으로 치환될 수 있다. Such 그러한 치환은 특정의 경우 항원에 대한 인체화된 항체의 결합을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 항체 in which 아미노산이 첨가되거나, 삭제되거나 또는 치환된 항체를 개조된 항체 또는 변경된 항체로 지칭한다.
본 발명 또한 본 명세서에서 설정된 인체화된 항체 및 항체 단편물에 실질적으로 유사한 변이체 및 등가체를 포함한다. 이러한 것은, 예를 들어, 보전성(conservative) 치환체, 즉, 유사한 아미노산에 의한 하나 이상의 아미노산의 치환체를 포함한다. 예를 들어, 보전성 치환은 하나의 아미노산이 동일한 일반적 부류에 있는 다른 아미노산으로 치환, 예를 들어, 하나의 산성 아미노산이 다른 산성 아미노산으로, 하나의 염기성 아미노산이 다른 염기성 아미노산으로, 또는 하나의 중성 아미노산이 다른 중성 아미노산으로 치환되는 것을 말한다. 보전성 아미노산 치환에 의해 의도되는 것은 당해 분야에 공지되어 있다.
용어 "실질적으로 유사한"은 목적의 아미노산 서열 (올리고- 또는 폴리펩티드 또는 단백질의)과 연관된, 참조 아미노산 서열과의 유사성에 대하여 사용된다. 이러한 용어는 “대응성”-즉, 동일한 아미노산잔기들이 병렬적으로 위치된 상태-에서 목적 및 참조 서열을 "정렬(alignment)" 했을 때, 즉 최소한 수의 "공(null)" 염기를 목적 및/또는 참조 서열데 삽입하여 상기 서열간의 대응하는 기존의 염기수를 최대화할 때, 목적 및 참조 서열간에 적어도 약 75%가 있는 것으로 정의된다. " 공" 염기는 목적 및 참조 서열의 부분이 아니다; 또한, 목적 서열에 삽입되는 “공”염기의 최소 수는 참조 서열에 삽입되는 최소수와 다를 수 있다. 이러한 정의에서, 참조서열은 목적 서열과 “관계 있는” 것으로 간주되며, 여기서 양쪽 아미노산 서열들은αIFNAR-1 항체이거나 또는 αIFNAR-1 결합 친화성을 가지는 항체단편물인 단백질 또는 단백질 부분을 구성한다. 이러한 αIFNAR-1 항체 또는 항체 단편물을 포함하는 단백질 각각은 독립적으로 항체 또는 항체 단편물, 또는 예를 들어, 융합 단백질s, 이중- 및 다중-특이성 항체, 단일 사슬 항체 등과 같은 이중- 또는 다중-기능성 단백질이다.
당해 분야 숙련자는 (통상적인 실험으로) 항체가 자가면역 질환의 치료목적에 또는 이식 거부 예방 목적에 유효하고 비독성적인 양이 얼마인지를 결정할 수 있을 것이다. 일반적으로, 그러나, 효과적인 투여량은 일일 체중 킬로그람당 약 0.05 내지 100 밀리그램 범위이다.
본 발명의 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물은 전술한 치료 방법에 따라허, 목적물에 치료적 또는 예방적 효과를 나타내기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 본 발명의 항체는 인간 또는 다른 동물에게 본 발명의 항체를 통상적인 약학적 허용 부형제, 희석제, 및/또는 약학첨가제와 결합하여 제조한 통상적인 투약 형태로 투여될 수 있다. 당해 분야 숙련자는 약학적 허용 부형제, 희석제, 및/또는 약학첨가제의 형태 및 특성은 혼합되는 활성 성분의 양, 투여 경로 및 다른 공지된 변수들에 의해 결정된다는 것을 숙지하고 있다.
본 발명의 항체 (또는 이의 단편물)의 투여 경로는 구강, 비경구, 흡입, 또 는 국소적일 수 있고, 용어 비경구는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질내, 또는 복강내 투여를 포함한다. 비경구 투여의 피하, 정맥내, 및 근육내 형태가 일반적으로 바람직하다.
IFNAR -1에 대한 인체화된 단일클론성 항체를 생산하는 형질전환종(transfectomas)의 생성
본 발명의 인체화된 항체 또한, 예를 들어, 당해 분야에 공지된 바와 같은, 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질전환 방법 (예를 들어, Morrison, S. (1985) Science 229: 1202)을 조합하여 사용함으로, 숙주세포 형질전환종에서 생성될 수 있다.
예를 들어, 항체, 또는 이의 항체 단편물을 발현시키기 위해, 부분 또는 전장 경사슬 및 중사슬을 암호화하는 DNA는 표준적인 분자 생물학 기술 (예를 들어, PCR 증폭, 부위 지정 돌연변이법)으로 얻어질 수 있고, 및 발현 벡터에 삽입되어 유전자가 전사 및 번역 조절 서열에 기능적으로 연결될 수 있다. 이러한 맥락에서, 용어 "기능적으로 연결된"은 항체 유전자가 벡터에 결찰되어 벡터 내의 전사 및 번역 조절 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 의도된 기능을 실현하는 것으로 사용된다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 양립할 수 있는 것으로 선택된다. 항체 경사슬 유전자 및 항체 중사슬 유전자는 개별 벡터에 삽입되거나 또는 양 유전자들이 동일한 발현 벡터에 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편물 및 벡터 상의 상보적 제한 부위 결찰, 또는 제한 부위가 없다면 블런트 말단 결찰)에 의해 발현 벡터로 삽입된다. 여기서 설명된 항체의 경사슬 및 중사슬 가변 영역은, 이들을 소정의 이소타입의 중사슬 불변 및 경사슬 불변 영역을 이미 암호화하고 있는 발현 벡터로 삽입함으로써 임의의 항체 이소타입의 전장 항체 유전자를 창출하여 VH 세그먼트가 벡터 내에서 CH 세그먼트(들)과 기능적으로 연결되고 및 VI세그먼트는 벡터내에서 CL 세그먼트와 기능적으로 연결되도록 하는데 사용될 수 있다. 추가적으로 또는 선택적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체의 분비를 용이하게 해주는 신호 펩티드를 암호화할 수 있다.
항체 사슬 유전자는 벡터로 클론되어 신호 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 독출틀에 맞게 연결될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드 (비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 포함한다. 용어"조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 조절하는 다른 발현 조절 인자 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 그러한 조절 서열은 Goeddel ; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)에 설명되어 있다. 당해 분야 숙련자는 조절 서열의 선택을 포함하는, 발현 벡터의 고안은 형질전환될 숙주 세포의 선택, 바람직한 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 의존한다는 것을 인식하고 있다.
바람직한 포유동물 숙주 세포발현용 조절 서열은 포유동물 세포에서 고도 의 단백질 발현을 이루는 바이러스 요소, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 시미안(Simian) 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스, (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기(late) 프로모터 (AdMLP) ) 및 폴리요마로부터 유도된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다.
선택적으로, 유비퀴틴 프로모터 또는 p-글로빈 프로모터와 같은 비바이러스성 조절 서열이 사용될 수 있다.
항체 사슬 유전자 및 조절 서열에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가적인 서열s, 예를 들어, 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기원) 및 선택 표시 유전자를 포함할 수 있다. 선택 표시 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다 (참조, 예를 들어, Axel등의 미국 특허 번호 4,399, 216, 4,634, 665 및 5,179, 017). 예를 들어, 일반적으로 선택 표시 유전자는 G41 S, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 벡터가 도입된 숙주 세포에 부여한다. 바람직한 선택표시 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선택/증폭을 가진 dhfr-숙주 세포에 사용) 및 네오 유전자 (G418 선택용)를 포함한다.
경사슬 및 중사슬의 발현을 위해, 중사슬 및 경사슬을 암호화하는 발현 벡터를 표준기술을 사용하여 숙주 세포로 형질전환 시킨다. 용어 "형질 전환"의 다양한 형태는 외부 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주세포로 도입하기 위해 통상적으로 사용되는 다양한 기술, 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 칼슘 포스페이트 침전법, DEAE-덱스트란 형질전환법등을 포함한다.
본 발명의 재조합 항체를 발현시키기 위한 바람직한 포유동물 숙주 세포는 CHO 세포 (dhfr-CHO 세포 포함, Urlaub 및 Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220에 설명, 예를 들어, R. J. Kaufman 및 P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621에 설명된 바와 같이 DHFR 표시 마커를 사용), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히 NSO 골수종 세포와 같이 사용하기 위해, 다른 바람직한 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 33841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다.
항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포로 도입할 때, 항체는 숙주 세포에서 항체의 발현 또는, 더욱 바람직하게는, 숙주 세포가 성장되는 배양 배지로 항체를 분비하기에 충분한 시간동안 숙주세포를 배양함으로써 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
약학적 조성물
다른 관점에서, 본 발명은 약학적 허용 부형제와 같이 제형된, 본 발명의 인체화된 단일클론성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분의 하나 또는 조합물을 포함하는 조성물, 예를 들어, 약학적 조성물을 제공한다. 그러한 조성물은 본 발명의 (예를 들어, 하나 이상의 상이한) 인체화된 항체의 하나 또는 조합물을 포함할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 인간 IFNAR-1 상의 상이한 에피토프에 결합하고 상 보적인 활성을 가지는 인체화된 항-IFNAR-1 항체들의 조합물을 포함하는 치료 조성물을, 예를 들어, 약학적 조성물로서 제공한다. 더욱이, 본 발명의 인체화된 항체는 독소 또는 방사선 표지물과 같은 치료제제와 접합되어 면역 접합체를 형성하거나 또는 하나 이상의 추가 항체와 연결되어 이중 특이성 (또는 다중특이성) 분자를 형성할 수 있다. 다른 양태에서, 치료 조성물은 본 발명의 면역 접합체 또는 이중 특이성 (또는 다중특이성) 분자를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물 또한 조합 요법, 즉 다른 제제와 혼합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합 요법은 본 발명의 조성물과 적어도 하나의 다른치료제를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "약학적 허용 부형제"는 생리적으로 허용되는 임의의 및 모든 용제, 분산 매질, 코팅, 항바이러스 및 항진균제제, 등장성 및 흡수 지영 제제등을 포함한다. 바람직하게는, 부형제는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 피부l 투여 (예를 들어, 주사 또는 관류로)에 적합한 것이다. 투여 경로에 따라, 상기 활성 화합물, 즉 항체, 이중 특이성 및 다중 특이성 분자는 화합물을 불활성화 시킬 수 있는 산 및 다른 자연적 환경의 작용으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.
"약학적 허용 염"은 모체 화합물의 바람직한 생물학적 활성을 유지하고 어떠한 바람직하지 않은 독소 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다 (참조, 예를 들어, Berge, S. M., 등. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19).
그러한 염의 예는 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다. 산 부가 염은 염 산, 질산, 인산, 황산, 브롬산, 요요드산, 포스포러스 산등과 같은 비독성 무기산은 물론, 지방족 모노- 및 디카르복실 산, 페닐-치한 알카노 산, 하이드록시 알카노 산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 설포닉 산 등과 같은 유기산으로부터 유도된 것을 포함할 수 있다. 염기 부가 염은 소듐, 포타슘, 마그네슘, 칼슘 등과 같은 알카리 토금속은 물론, N, N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등과 같은 비독성 유기 아민류로부터 유도된 것을 포함한다.
본 발명의 조성물은 당해 분야에 공지된 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 당해 기술자에게 인식되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 양상은 원하는 결과에 따라 변할 수 있다. 활성 화합물은 이식물, 경피 패치 및 미소캡슐 전달 시스템을 위시한 조절된 방출 제형과 같은 빠른 방출에 화합물을 보호하는 부형제와 같이 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜 산, 콜라겐, 폴리오소에스테르, 및 폴리락트 산과 같은 생분해성 생체적합성 폴리머를 사용할 수 있다. 그러한 제형을 제조하는 방법은 특허화되어 있거나 또는 일반적으로 당해 분야 기술자에게 공지되어 있다. 참조, 예를 들어, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
특정 투여 경로로 본 발명의 화합물을 투여하기 위해, 화합물을 이의 불활성화를 방지하는 물질로 코팅하거나 같이 투여하는 겅이 필요할 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물은 적절한 부형제, 예를 들어, 리포좀, 또는 희석제내에서 목적물에 투 여될 수 있다.
약학적 허용 희석제은 식염수 및 수성 완충용액을 포함한다.
리포좀은 수중유중수(water-in-oil-in-water) CGF 에멀젼은 물론 통상적인 리포좀을 포함한다 (Strejan 등 (1984) J Neui-oinimunol. 7 : 27).
약학적 허용 부형제는 멸균 주사용액 또는 분산액의 즉시 제조하기 위한 멸균 수성 용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 약학적으로 활성 성분에 대한 그러한 매질 및 제제는 당해 분야에 공지되어 있다. 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 양립할 수 없는 것이 아닌 한, 본 발명의 약학적 조성물에서의 사용은 허용된다. 보조적 활성 화합물 또한 조성물에 포함될 수 있다.
치료 조성물은 제조 및 보관 조건하에서 멸균 및 안정상태에 있어야 한다. 조성물은 용액, 미소에멀젼, 리포좀, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 규칙적인 구조로 제형될 수 있다. 부형제는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적절한 혼합물을 포함하는 용제 또는 분산액 매질일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅물을 사용으로, 분산액의 경우 원하는 입자 크기를 유지함으로써, 및 계면활성제를 사용함으로써, 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 많은 경우, 조성물에 등장성 제제, 예를 들어, 설탕, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알콜류, 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다.
조성물에, 예를 들어, 모노스테아레이트 염류 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제를 포함시킴으로써 주사조성물의 흡수를 지연시킬 수 있다.
멸균 주사 용액은 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합물과 함께 활성성분을 적적한 용제에 적당한 양으로 함유시킨 후 멸균 여과를 함으로써 제조될 수 있다.
일반적으로 분산액은 기본 분산액 매질 및 상기 열거한 것들중 요구되는 다른 성분을 포함하는 멸균 운반물로 활성 화합물을 함유시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 용액 제조용 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이전의 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 소정의 추가 성분을 분말로 나오게 하는 진공 건조 및 동결건조이다.
투약법은 최적의 바람직한 반응 (예를 들어, 치료 반응)이 나오도록 조절될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼러스가 투여될 수 있고, 시간에 걸쳐 여러분 나눠진 복용량이 투여될 수 있거나, 또는 복용량은 치료 상황의 위급함에 따라 감소되거나 증가될 수 있다. 비경구 조성물을 투여 및 투약량 통일성을 용이하게 하기 위한 투약 단위체 형태로 제형하는 것이 특히 유리하다. 투약 단위체 형태는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 치료될 목적물에 단일 투약체로 적합한 물리적으로 구별된 단위체를 지칭한다; 각 단위체는 필요한 약학적 부형제와 연합하여 바람직한 치료효과를 창출하는데 계산된, 활성 화합물의 소정의 양을 포함한다. 본 발명의 투약 단위 형태의 내역은(a) 이루고자하는 활성 화합물의 유일한 특성 및 특별한 치료효과 및 (b)개인의 민감성을 치료하는 그러한 활성성분을 조합하는 당해 분야에 내재된 제한에 의해 그리고 직접적으로 의존하여 결정된다.
약학적 허용 항산화제의 예는: (1)아스코브 산, 시스테인 하이드로클로라이드, 소듐 비설페이트, 소듐 메타비설파이트, 소듐 설파이트 등과 같은 수용성 항산 화제; (2) 아스코필 팔미테이트, 부틸레이티드 하이드록시아니솔 (BHA), 부틸레이티드 하이드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등과 같은 지용성(oil-soluble) 항산화제; 및 (3)시트르 산, 에틸렌디아민테트라아세트 산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르 산, 인산등과 같은 금속 킬레이팅 제제를 포함한다.
치료 조성물에 대하여, 본 발명의 제형은 구강, 비강, 국소 (볼l 및 설하 포함), 직장, 질내 및/또는 비경구 투여에 적합한 것이다. 제형들은 단위 투약 형태로 제공되는 것이 편리하고, 약학 당해 분야에 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다.
단일 투약 형태를 생성하는 부형제 물질과 혼합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료될 목적물 및 특정 투여 양상에 따라 다르다. 단일 투약 형태를 생성하는 부형제 물질과 혼합할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 나타내는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 일백 퍼센트에서, 이러한 양은 활성성분이 약 0.01 퍼센트 내지 99 퍼센트, 바람직하게는 약 0.1 퍼센트 내지 약 70 퍼센트, 가장 바람직하게는 약 1 퍼센트 내지 약 30 퍼센트 범위이다.
용어 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여되는"은, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 장내 및 국소 투여와는 다른 투여 방식, 통상 주사에 의한 것을 의미하고, 제한없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 낭내(intracapsular), 안와내(intraorbital), 심장내, 피부내, 복강내, 기관지, 피하, 각피하(subcuticular), 관절내, 피막하(subcapsular), 지주막하(subarachnoid), 척추내, 경막외(epidural) 및 간내(intrastemal) 주사 및 관류를 포함한다.
바람직한 본 발명의 항체 조성물의 투여 경로는 정맥내, 근육내 및 복강내 경로이다. 바람직한 전달 형태는 주사 및 관류이다.
본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있는 적절한 수성 및 비수성 부형제의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은), 및 이의 적절한 혼합물, 올리브유 같은 식물성 기름, 및 에틸 올레이트와 같은 주사용 유기 에스테르류를 포함한다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅물을 사용으로, 분산액의 경우 원하는 입자 크기를 유지함으로써, 및 계면활성제를 사용함으로써, 적절한 유동성을 유지할 수 있다.
이러한 조성물은 또한 방부제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제을 포함할 수 있다. 미생물을 방지하기 위해, 상술한 멸균과정 및 다양한 항박테리아 및 항진균 제제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브 산등을 포함하는 것으로 이뤄질 수 있다. 또한, 조성물에 등장성 제제, 예를 들어, 설탕, 염화나트륨 등을 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 조성물에, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제를 포함시킴으로써 약학적 주사물의 흡수를 지연시킬 수 있다.
본 발명의 화합물을 약학물로서 예를 들어 인간 또는 동물에 투여시, 이것은 단독으로, 또는 예를 들어, 약학적 허용 부형제과 조합하여 활성성분을 0.01 to 99.5% (더욱 바람직하게는, 0.1 to 90%) 포함하는 약학적 조성물로서 우텨될 수 있다.
선택된 투여 경로에 관계없이, 적절한 수화 형태 및/또는 본 발명의 약학적 조성물로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물은 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 약학적 허용 투약 형태로 제형된다.
본 발명의 약학적 조성물내의 활성 성분의 실제 투약 수준은, 환자에 유해하지 않고, 특정 환자에 대한 바람직한 치료 반응을 이루는데 유효한 활성 성분의 양, 조성물, 및 투여 양상을 얻기 위해 달라질 수 있다. 선택된 투약 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물, 또는 이의 에스테르 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 선택된 특정 화합물의 배출율, 치료기간, 사용된 특정 조성물과 조합하여 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 나이, 성별, 체중, 상태, 유전적 건강성 및 이전의 의학적 이력, 및 의료 분야에 공지된 다른 요인들을 포함하는 다양한 약물동력학 요인에 의존한다.
당해 분야의 통상적인 기술의 의사 또는 수의사는 및 요구된 약학적 조성물의 유효량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 약학적 조성물에 사용된 본 발명의 화합물의 투여량을 바람직한 치료 효과를 이루는데 필요한 것 보다 낮은 수준에서 시작하여 바라는 효과가 달성될 때까지 점차적으로 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 적절한 일일 투여량은 치료효과를 나타내는데 유효한 최저 양의 화합물 양이 될 것이다. 그러한 유효 투여량은 일반적으로 상술한 요인에 의존한다. 바람직하게는 타겟 위치에 근접하게, 정맥내, 근육내, 복강내, 또는 피하 투여하는 것이 바람직하다. 필요시, 치료 조성물의 효과적인 일일 투여량은 하루동안 두 번, 세 번, 네 번, 다섯 번, 여섯 번 또는 그 이상의 분할 투여량으로 일정한 간격으로, 선택적으로는 단일 투약 형태로, 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물이 단독으로 투여되는 것이 가능하지만, 약학적 제형 (조성물)로서 화합물을 투여하는 것이 바람직하다.
바람직한 양태에서, 치료 조성물은 당해 분야에 공지된 의료 장비로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 치료 조성물은 미국 특허 번호 5,399, 163; 5, 383, 851 ; 5,312, 335; 5, 064, 413; 4, 941, 880 ; 4,790, 824 ; 또는 4, 596, 556호에 개시된 장치와 같은 무바늘 피하 주사 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 공지된 이식물 및 모듈의 예는 하기에 나타나 있다: 미국 특허 번호 4, 487, 603, 조절된 속도로 약물을 분배하는 이식가능한 마이크로-관류 펌프; 미국 특허 번호 4, 486,194, 피부를 통해 약물을 투여하는 치료 장치; 미국 특허 번호 4, 447, 233, 정확한 관류 속도로 약물을 분해하는 약물 관류 펌프; 미국 특허 번호 4,447, 224, which discloses 연속적인 약물 전달용 가변적인 유동체에 이식가능한 관류 장치; 미국 특허 번호 4,439, 196, 다중의 챔버 격실을 가지는 삼투압성 약물 전달 장치; 및 미국 특허 번호 4,475, 196, 삼투압성 약물 전달 장치. 이러한 특허는 참조문헌으로 포함되어 있다. 많은 다른 그러한 이식물, 전달 시스템 및 모듈이 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 인체화된 단일클론성 항체는 생체내에서 적절한 분배가 확실하게 되도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 뇌혈류 장애(BBB)는 많은 친수성 화합물을 배제시킨다. 본 발명의 치료 화합물이 (요구된다면) BBB를 넘어서게 하기 위해서는, 예를 들어, 리포좀으로 제형화될 수 있다. For 방법s of manufacturing 리포좀을 제조하는 방법으로는, 하기를 참조할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,522, 811; 5,374, 548; 및 5,399, 331. 리포좀은 특정 세포 또는 기관에 선택적으로 이송되는 하나 이상의 물질을 포함하여 목표한 약물 전달을 향상시킨다 (참조, 예를 들어, V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). 목표지향 물질의 예는 폴레이트 또는 비오틴 (참조, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,416, 016 to Low 등.); 만노시드류 (Umezawa 등., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); 항체 (P. G. Bloeman 등. (1995) FEBSLett. 357: 140; M. Owais 등. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); 계면활성 단백질 A 수용체 (Briscoe 등. (1995) Am. J Physiol. 1233: 134)이고, 이의 다른 종류가 본 발명의 제형을 포함할 수 있고, 이에 더하여, 발명된 분자들; pl20 (Schreier 등. (1994) J : Biol. Chem. 269: 9090); 참조, K. Keinanen ; M. L. Lauklcanen (1994) FEBSLett. 346 : 123; J. J. Killion ; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4: 273)이 있다. 본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 치료 화합물은 리포좀으로 제형된다; 더욱 바람직한 양태에서, 리포좀은 목표지향 물질을 포함한다. 가장 바람직한 양태에서, 리포좀 내의 치료 화합물은 원하는 부위로 볼러스 주사로 전달된다. 상기 조성물은 주사하기 수월할 정도로 유동적이어야 한다. 제작 및 보관 조건하에서 안정해야 하며 박테리아 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대하여 보존되어 있어야 한다.
"치료적으로 유효한 투약량"은 비처리 목적물에 비해, 바람직하게는타입 I 인터페론류의 생물학적 활성을 적어도 약 20%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 40%, 더더욱 바람직하게는 적어도 약 60%, 및 더욱더 바람직하게는 적어도 약 80%로 저 해하는 것이다. 타입 I 인터페론류의 생물학적 활성을 저해하는 화합물의 능력은, 실시예에서 설명된 것과 같은, 동물 모델 시스템 또는 비정상적 타입 I 인터페론 활과 연계된 인간 조건에서의 효능이 예상되는 당해분야에 공지된 다른 모델 시스템에서 평가될 수 있다.
선택적으로, 조성물의 이러한 특성은 타입 I 인터페론류의 생물학적 활성을 저해하는 화합물의 능력을 조사함으로써 평가될 수 있다. 그러한 저해활성은 실시예에서 설명된 시험관 분석에 제한되지 않지만 이를 포함하는, 숙련된 실험자에 공지된 시험관 분석법을 사용하여 결정될 수 있다. 치료 화합물의 치료적 유효량은 타입 I 인터페론 활성을 저해하여 비정상적인 타입 I 인터페론 발현 또는 활성에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 질병 또는 질환의 증상을 개선할 수 있다. 그러한 질환 및 질병은 자가면역 질환, 이식 거부 및 GVHD를 포함한다. 당해 분야 숙련자는 목적물의 크기, 목적물 증상의 정도, 선택된 투여 조성물 또는 경로와 같은 인자에 근거하여, 그러한 양을 결정할 수 있을 것이다.
조성물은 멸균되어야 하며 조성물이 주사로 전달되는 정도로 유동성이 있어야 한다. 물외에, 부형제는 등장성 완충 식염수 용액, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 혼합물일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅물을 사용으로, 분산액의 경우 원하는 입자 크기를 유지함으로써, 및 계면활성제를 사용함으로써, 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 많은 경우, 조성물에 등장성 제제, 예를 들어, 설탕, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알콜류, 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다.
주사 조성물에, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 염류 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제를 포함시킴으로써 주사조성물을 장기간 흡수시킬 수 있다.
활성 화합물이 상기와 같이 적절하게 보호될 때, 화합물은 안정한 희석제 또는 체내 동화될 수 부형제와 함께 구강 투여될 수 있다.
본 발명의 용도 및 방법
본 발명의 인체화된 단일클론성 항-IFNAR-1 항체 및 관련 유도체/접합체 및 조성물은 다양한 시험관 및 생체내 진단과 치료 유용성을 가진다. 예를 들어, 이러한 분자들은, 예를 들어, 시험관 또는 생체외적으로 배양되는 세포로 투여될 수 있다. 선택적으로 목적물에 생체내 투여하여 타입 I 인터페론이 역할을 하는 다양한 질병을 치료, 예방 및 진단할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "목적물"은 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 모든 척추 동물, 예를 들어, 비인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류, 등과 같은 포유동물 및 비-포유동물을 포함한다.
본 발명의 항체 조성물은 전신성 홍반성 루퍼스 (SLE)환, 염증성 장질환 (IBD; 코론병, 궤양성 대장염 및 셀리악 병 포함), 인슐린 의존성 당뇨병 (IDDM) 및 류마티스 관절염 (RA)과 같은 자가면역 질환의 치료에 사용될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 항체 조성물은 이식 거부를 저해하거나 또는 방지하는데, 또는 이식편 대 숙주자 질환 (GVHD)치료에 사용될 수 있다.
염증성 장질환을 치료하는 본 발명의 항체 조성물의 용도는 2003년 4월 23일자로 출원된, "염증성 장질환의 치료 조성물 및 방법" 제목의 공동 소유의 미국 특허 출원서 일련 번호 60/465, 155에 상세히 설명되어 있고, 이의 전체 내용은 여기서 참조문헌으로 포함된다
본 발명의 인간 항체는 시험관적 치료 용도와 관련한 결합활성에 대하여 먼저 시험될 수 있다. 예를 들어, 하기 실시예에서 설명되는 Biacore 및 유동 혈구세포계산 분석법을 사용하여 본 발명의 조성물을 시험할 수 있다.
본 발명의 항체 및 조성물을 투여하는 적절한 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 적절한 투약량 또한 당해 분야 기술내에 결정될 수 있고 목적물의 연령과 나이 및 특정 약물에 의존한다.
본 발명의 인간 항-IFNAR-1 항체는 전술한 다른 치료제와 같이 투여될 수 있다.
바람직한 비경구용 약학 제조물은 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1989에 설명된 것과 같은 것이다. 최종 제조물은 활성 성분을 0. 01 내지 50% 포함한다.
그러한 접합물의 생산 방법 및 이들의 진단 및 치료에서의 용도는, 예를 들어, Shih 등., 미국 특허 번호 5,057, 313; Shih 등., Int. J. Cancer 41: 832 (1988); 공동소유의, 계류중인 미국 특허 일련번호 08/162, 912; 및, McKearn 등., 미국 특허 번호 5, 156, 840에 기재되어 있고, 이들의 내용은 참조문헌으로 포함된다.
전술한 바와 같이, 치료목적상, 인체화된 항체 조성물 및 약학적 허용 부형제는 치료적으로 유효한 양으로 환자에 투여된다. 항체 조성물 및 약학적 허용 부형제의 조합물은 생리학적으로 유의할 경우 "치료적으로 유효한 양"으로 투여될 수 있다. 제제가 수령 환자의 생리를 뚜렷한 변화를 가져온다면 "생리적으로 유의한" 것이다. 목적된 치료제제는 등가의 비목적 제제를 체계적으로 투여시 목적물에서 나타나는 것보다 의도된 목적물에 더 높은 비율의 투여량을 전달한다면 "치료적으로 유효한" 것이다.
[실시예]
본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 설명되며 이것은 제한적으로 해석되어서는 안된다. 모든 도면 및 본 출원서를 통해 인용되는 참조문헌, 특허, 공개 특허 출원서는 명백히 참조문헌으로 포함된다.
실시예 1: IFNAR-1에 특이적인 인체화된 항체의 생산
인체화된 항체를 제조하는 데 사용된 공여 CDR의 원천은 쥐의 단일클론성 항체, 64G12이고 이것은 IFNAR-1에 특이성이 있다 (미국 특허 번호 5,919, 453). A 64G12 하이브리도마 세포계통은 이미 확립되어 있었다.
64 G12 가변 영역의 클로닝
mRNA를 64G12 하이브리도마로부터, Qiagen's Oligotex mRNA Miniprep 키트를 사용하여 추출하였고, 후속적으로 cDNA를, Clontech's Marathon cDNA 증폭 키트를 사용하여 합성하였다. 64G12의 중사슬의 가변 영역은 쥐의 IgGl 유전자에 대한 프라이머 (순방향: ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCTG (서열번호 : 43) 및 역방향 : CAGTGGATAGACAGATGGGG) (서열 번호 : 44) 존재하, Qiagen's HotStarTaq를 사용하여 증폭되었고, 경사슬의 경우, 쥐의 카파 유전자 (ACTGGATGGTGGGAAGATGG) (서열 번호 : 45) 및 N-말단 아미노산 서열 (CTCACCCAGTCTCCAACCACCATGGCTGCATC) (서열 번호 : 46)에 대한 프라이머를 사용하여 증폭되었다.
64G12 항체의 N-말단의 펩티드 서열과 cDNA 클론으로부터 나온 번역된 단백질 서열과 비교함으로써 사슬을 확인하였다.
가변 영역의 작제
64G12 VH 및 VL 도메인의 서열로부터, Kabat 등의 데이터베이스 ("Sequences of Proteins of Immunological Interest" 미국, Dept. of Health and Human Services, 미국 정부 인쇄국)를 참조하고, 이의 내용은 참조문헌에 포함됨, 및 컴퓨터를 이용하여 다른 VH 및 VL 서열과의 배치하여 CDR 서열을 결정하였다.
상기 VH 서열은 서열 번호 : 7에 나타나 있다. VL 서열은 서열 번호: 19에 나타나 있다. VH 및 VL 도메인의 CDR 부위의 아미노산 서열은 하기 표 1에 기재되어 있다.
표 1
서열 번호: 서열 설명
1 TSGMGIG 64G12 VH CDR1
2 HIWWDDDKYYNPSLKS 64G12 VH CDR2
3 NYYPYDAWFDY 64G12 VH CDR3
4 SASSSINSNHLH 64G12 VL CDR1
5 RTSILAS 64G12 VL CDR2
6 QQGSNIPFT 64G12 VL CDR3
포유동물 발현 벡터로 독출틀 내에서 후속 클로닝할 수 있게 하는 제한 부위를 가진 프라이머를 사용하여, 전술한 주형으로부터 쥐의 가변 영역을 증폭시켰다.
오페론으로 제 1 시리드 인간 가변 영역 cDNA를 합성하였다.
후속적으로 탈면역화 항체를 Stratagene's QuikChange 부위-지정 돌연변이법 키트를 사용하여 kit 만들었다
전장 항체의 발현
모든 중사슬 및 경사슬 가변 영역 서열(쥐 및 인간)을 Invitrogen's 포유동물 발현 벡터 pcdna3. 1/neo 및 pcdna3. 1/hygro으로 각각, 인간 IgG 불변 영역과 동일한 독출틀 내로 클론하였다, 인간 오스테오넥틴 신호 서열을내생적 IgG 서열대신 사용하여, 재조합 항체를 분비하였다. 더욱이, 4.2 kb RNP UCOE's (Benton 등., Cytotechnology, 38: 43-46,2002)를 CMV 프로모터 상부에 삽입하여 개방 염색질(open chromatin)을 유지하고 및 항체를 고도로 발현시키는 세포를 신속히 제조하였다.
일시적 형질전환을 위해, Roche's FuGENE 6을 사용하여, 중사슬 및 경사슬을 포함하는 플라즈미드들을 인간 293 세포에 동시 형질전환시켰다. 형질전환 3-4일 후, 상등액을 수집하고, 항체를 단백질 A-세파로즈 크로마토그래피로 정제하였다.
안정한 발현을 위해, Invitrogen's DMRIE-C을 사용하여, 중사슬 및 경사슬을 포함하는 선형화된 플라즈미드들을 CHO-S 세포에 동시에 형질전환시켰다. 제네티신(Geneticin) 및 하이그로마이신(Hygromycin) B를 500ug/mL 양으로 성장배지에 첨가시켜 안정하게 형질전환된 세포들을 선택하였다. 항체 분비 세포들을 증식시키고, 배양배지로부터 항체를, 참조문헌으로 본 명세서에 포함된, Harlow 및 Lane (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.)에서 설명된 바와 같이, 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하였다.
내용이 본 명세서에 참조문헌으로 포함되는, Nakamye 등. (Nucleic Acids Res 14, 9679-9687 (1986))에서 설명된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드 부위-지정 돌연변이법을 사용하여 쥐의 64G12 CDR를 인간 골격으로 전이 시켰다. VHs의 돌연변이에 사용된 DNA 주형은 하기와 같이,인간 생식계열 서열s DP-26, DP-47, 및 DPk26로부터 나온 인간 골격 영역을 포함하였다:
(DP-26) (Genbank : HSIGDP26)
QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSNARMGVSWIRQPPGKALEWLAHIF SNDEKSYSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYY (서열 번호 : 47),
(DP-47) (Genbank : HSIGDP47)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISG SGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK (서열 번호 : 48) 및
(DPk26) (Genbank: HSIGDPK26)
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGSSLHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSFS GVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCHQSSSLP (서열 번호 : 49).
더욱이, 특정 작제물에서는, 추가적인 치환이 CDR 및/또는 FR 잔기상에 이루어져 결합 친화성을 증가시키고 또는 항체 면역원성 (또한 하기에서 설명)을 저하시켰다.
요약하면, 하기와 같은 서열을 포함하는, 일련의 인체화된 항체 중사슬 및 경사슬 가변 영역이 제작되었다. 이러한 항체 중사슬 및 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열이 도 1B-1L 및 2B-2S에 나타나 있고, 공여자 쥐의 64G12 가변 영역의 아미노산 서열이 함께 나타나 있다 (64G12 VH 서열은 도 1A의 서열 번호 : 7이고 및 64G12 VL 서열은 도 2A의 서열 번호 : 19이다).
64G12 VH의 CDR을 인간 면역글로불린 중사슬 생식계열 DP-28 골격 서열 (서열 번호 : 8 of 도 1B)과 결합함으로써 중사슬 서열 H2를 설계하였다.
64G12 VH의 CDR3을 인간 면역글로불린 중사슬 생식계열 DP-28 골격 서열 (도 1C의 서열 번호 : 9)과 결합함으로써 중사슬 서열 H2-C3를 설계하였다.
64G12 VH의 CDR을 콘센서스 인간 면역글로불린 중사슬 골격 서열 (도 1D의 서열 번호 : 10)과 결합함으로써 중사슬 서열 H3를 설계하였다.
64G12 VH의 CDR을 인간 면역글로불린 중사슬 생식계열 DP-47 골격 서열 (도 1E의 서열 번호 : 11)과 결합함으로써 중사슬 서열 M3를 설계하였다.
중사슬 서열 M3-4는 CDR3의 위치 4에서 하기 아미노산 중 하나로 치환된, M3 서열로부터 설계되었다: L, N, E, V, A, C, G, S, R, D, M, H, T, W, K 또는 I (도 1F의 서열 번호 : 12).
중사슬 서열 M3-11는 CDR3의 위치 11에서 하기 아미노산 중 하나로 치환된, M3 서열로부터 설계되었다: L, E, Q, R, V, A, F, G, C, T, W, H, K, D, S 또는 I (도 1G의 서열 번호 : 13).
중사슬 서열 M3-A는 CDRl의 위치 4에서의 아미노산 (메티오니온)을 알라닌으로 치환하여 T 세포 에피토프가 제거된 M3 서열로부터 설계되었다 (도 1H의 서열 번호 : 14).
중사슬 서열 M3-B는 CDR2의 위치 16에서의 아미노산 (세린)알라닌으로 치환하여 T 세포 에피토프가 제거된 M3 서열로부터 설계되었다 (도 1I의 서열 번호 : 15).
중사슬 서열 M3-A/B는 M3-A 및 M3-B으로부터의 양쪽 치환체를 그 서열로 포함시킨 M3 서열로부터 설계되었다 (도 1J의 서열 번호 : 16).
중사슬 서열 DI M3는 여섯 개의 골격 잔기에서 치환하여 모든 잠재적인 T 세포 에피토프를 제거시킨 M3 서열로부터 설계되었다 (도 1K의 서열 번호 : 17).
중사슬 서열 DI M3-B는 DI M3 서열로부터의 골격 치환 및 M3-B 서열로 부터의 CDR2 치환을 조합한 M3 서열로부터 설계되었다 (도 1L의 서열 번호 : 18).
경사슬 서열 K6는 64G12 VL의 CDR를 인간 면역글로불린 경사슬 생식계열 DPk-26 골격 서열과 조합함으로 설계되었다 (도 2B의 서열 번호 : 20).
경사슬 서열 Kl는 64G12 VH의 CDR를 콘센서스 인간 면역글로불린 경사슬 골격 서열과 조합함으로 설계되었다 (도 2C의 서열 번호 : 21).
경사슬 서열 Kl-C는 CDR1의 위치 4(세린)를 트레오닌으로 치환함으로 잠재적인 T 세포 에피토프의 하나가 제거된 Kl 서열로부터 설계되었다 (도 2D의 서열 번호 : 22).
경사슬 서열 Kl-D는 CDRl의 위치 12(히스티딘)를 아스파라진으로 치환함으로 잠재적인 T 세포 에피토프의 하나가 제거된 Kl 서열로부터 설계되었다 (도 2E의 서열 번호 : 23).
경사슬 서열 K1-E는 CDR3의 위치 3(글리신)을 트레오닌으로 치환함으로 잠재적인 T 세포 에피토프의 하나가 제거된 Kl 서열로부터 설계되었다 (도 2F의 서열 번호 : 24).
경사슬 서열 Kl-C/D, K1-C/E, Kl-D/E 및 Kl-C/D/E는 각각, Kl-C 및 Kl-D으로부터의 치환, Kl-C 및 Kl-E으로부터의 치환, Kl-D 및 Kl-E으로부터의 치환, 및 Kl-C, K1-D 및 Kl-E으로부터의 치환이 조합된 Kl 서열로부터 설계되었다 (각각, 도 2G, 2H, 2I, 및 2J의 서열 번호 : 25, 서열 번호 : 26, 서열 번호 : 27, 및 서열 번호 : 28).
경사슬 서열 DI Kl은 여섯 개 골격 잔기에서 치환함으로 잠재적인 모든 T 세포 에피토프가 게거된 Kl 서열로부터 설계되었다 (도 2K의 서열 번호 : 29).
경사슬 서열 DI Kl-C은 DI Kl으로부터의 골격 치환을 CDR1에서의 Kl-C으로부터의 치환과 결합한 Kl 서열로부터 설계되었다 (도 2L의 서열 번호 : 30).
경사슬 서열 DI KIDS는 다섯 개 골격 잔기에서 치환을 형성함으로 여섯 개의 잠재적인 T 세포 에피토프중 다섯 개를 제거한 Kl 서열로부터 설계되었다 (도 2M의 서열 번호 : 31).
경사슬 서열 DI Kl-C-DS는 DI Kl-DS으로부터의 치환 및 Kl-C으로부터의 치환이 조합된 Kl 서열로부터 설계되었다 (도 2N의 서열 번호 : 32).
경사슬 서열 DI Kl-A19V, DI K1-L37Q, DI K-1-A46L, DI K1-I58V 및 DI Kl-T83F는 각각 도 20, 2P, 2Q, 2R, 및 2S의 서열 번호 : 33, 서열 번호 : 34, 서열 번호 : 35, 서열 번호 : 36, 및 서열 번호 : 37에 나타난 골격 영역내의 강조된 아미노산을 변경함으로써 여섯 개의 잠재적인 T 세포 에피토프 중 다섯 개가 제거된 Kl 서열로부터 설계되었다
도 3A-3D는 중사슬 가변 영역s M3 (FIG. 3A) 및 DI M3-B (FIG. 3C)의 핵산서열 및 of 경사슬 가변 영역 Kl (FIG. 3B) 및 Kl-C (FIG. 3D)의 핵산서열을 나타낸다.
실시예 2: 인체화된 VH 및 VL 짝결합체(pairing)의 비아코어(Biacore) 분석
일련의 인체화된 항체 VH 및 VL 짝결합체를 생성하였고 및 쥐의 원래 항체는 물론 64G12 및 인간 IgG4 카파 불변 영역으로부터 쥐의 가변 영역을 포함하는 마우스-인간 혼성화 항체와 비교하였다. 인간 중사슬 H2 및 H3를 인간 경사슬 Kl 및 K6과 조합하여 발현시켜 항체 H2K6, H2K1, H3K6 및 H3K1를 만들었다.
이러한 가변 영역의 아미노산 서열은 도 1B, 1D, 2B, 및 2C에 나타나 있다.
항체 from 클론 64G12, H2K6, H2K1, H3K6, 및 H3K1부터 나온 항체를 비아코어 분석법 (Biacore AB, Uppsala, Sweden) 분석하여 결합 역학을 결정하였다.
정제된 재조합 IFNAR-1 세포외 단편물을 CM5 센서칩 @ 600 RU에 연결시켰다. 항체를 1.75- 80nM의 농도로 20ul/min의 유동속도로 첨가하여 결합을 측정하였다. BIA평가 소프트웨어 (Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 사용하여 결합 곡선을 랭무어(Langmuir) 결합 모델로 일치시켰다. 결정된 KD 값은 도 2에 제시된다:
표 2
항체 KD (M)
64G12(마우스 IgG1) 1.2x10-9
혼성화IgG4 3.6xlO-9
H2K6 1.3x10-9
H2K1 0.8xlO-9
H3K6 1.8x10-9
H3K1 3.4xlO-9
이러한 분석법을 사용하여, 표준 쥐 항체 및 인간 IgG4 혼성화 항체의 결합 친화성이 1.2-3.6 nM 범위에 있다는 것이 결정되었다. 모든 인체화된 항체 조합은 상기 혼성화 항체 및 원래의 쥐 하이브리도마-유도 항체 64G12과 구별할 수 없는, IFNAR-1에 대해 높은 결합 친화성을 가지는 항체를 나타낸다, 오직 CD 3만이 상기 쥐의 항체로부터 보존되어 있는, H2-C3 (도 1 C의 서열 번호 : 9)로 명명된, 다른 중사슬은 또한 K6 경사슬과 조합하여 발현되었지만, 그러나 생성된 항체는 IFNAR-1와 결합하지 않았다.
M3 (도 1E의 서열 번호 : 11, 인간 면역글로불린 중사슬 생식계열 DP-47 골 격 서열포함)로 명명된 다른 인체화된 중사슬을 Kl 경사슬과 동시 발현시켰고 IFNAR-1에 높은 친화성 결합을 할 수 있는 항체를 생성하였다. The 결합 친화성 항-인간 IgG Fc이 Biacore 칩상에 고정된 캡처 분석법을 이용하여 결합친화성을 결정하였고, 이를 항-인간 IgG Fc 표면위로 통과시켜, 인간 항-IFNAR-1 항체를 포획하였고, 이후, 용해성 IFNAR-1 결합을 25-400nM의 농도에서 측정하여 결합 친화성을 계산하였다. M3K1의 결합 친화성을 H3Kl과 비교하였다. 결과가 표 3에 제시된다.
표 3
ka (l/Ms) kd(l/s) KD(M)
H3K1 8.06E+03 5.04E-05 6.26E-09
M3K1 5.34E+03 3.79E-05 7.09E-09
플로우(Flow) 세포2-1, 저밀도 포획
ka (1/Ms) kd(l/s) KD(M)
H3K1 7.48E+03 4.81E-05 6.43E-09
M3K1 5.49E+03 4.39E-05 7.99E-09
플루우(Flow) 세포4-3, 더 높은 밀도 포획
실시예 3: 선택된 항체 서열의 탈면역화
펩티드 쓰레딩(Threading) 프로그램(Biovation, Inc.)을 사용하여 H3K1 VH 및 VK 서열을 분석하였다. 간략히, 아미노산 서열을 모든 가능한 13-mers로 분할된다. 13-mer 펩티드를 HLA-DR 알로타입의 결합 글루브(groove)의 모듈로 연속적으로 제시되고, 결합 점수가 각 대립형질에 대한 각 펩티드에 할당된다. 펩티드의 각 포켓에 결합된 측쇄에 대하여 형태 점수가 계산된다. 이러한 점수는 입체적 오버랩, 결합 글루브내의 펩티드와 잔기사이의 잠재적인 수소결합, 정전기적 상호작용 및 펩티드와 포켓 잔기사이의 선호되는 접촉에 근거한다. 다음, 각 측쇄의 형태를 변 경하고, 점수를 다시 계산한다.
잠재적인 T 세포 에피토프는 에피토프를 구성하는 특정 펩티드에서 아미노산 치환을 야기하여 제거된다. 가능하다면, 물리화학적 특성이 비슷한 아미노산을 삽입함으로 치환한다. 그러나, 특정 잠재적인 에피토프를 제거하기 위해, 상이한 크기, 전하, 또는 소수성을 가지는 아미노산들이 치환될 필요가 있다. 치환에 대한 아미노산 잔기의 숫자매김은 Kabat의 방식에 따른다 (Kabat 등, 1991). 아미노산 치환체들이 도 1H-1L 및 2D-2S에 요약 및 설명되어 있다.
잠재적인 T-세포 에피토프의 수가 감소된 일련의 항체들을 제조하였다. 이러한 것은 CDR 부위에서 잔기가 변경된 중사슬 변이체 M3-A 및 M3-B, 및 골격 잔기가 변경된 DI M3을 포함한다. 탈 면역화된 경사슬 또한 제작하고,Kl-C, Kl-D, K1-E 및 DI Kl로 명명하였다. 이러한 탈 면역화된 V-영역은 표 4에 나타난 바와 같이 여러 가지 조합물에서 인간 IgG4 항체로 발현되었다. 항체를 발현하고 정제한 후 Biacore으로 분석하였다. IFNAR-1을 690 RU로 플로우 세포 2에 및 항-인간 IgG Fc을 5000 RU로 플로우 세포 4에 붙이고, Biacore chip을 사용하였다. 항-인간 IgG Fc 상대적인, IFNAR-1에 대한 항체 결합은 플로우 세포 2에서의 반응을 플로우 세포 4에서의 반응으로 나눈 비 (Fc2/Fc4)로 결정되었다. 몇몇 변이체가, 표 4에 나타난 바와 같이, 표준 H3K1에 비해 높은 IFNAR-1 결합 활성을 보유하였다.
표 4
중사슬 경사슬 H3K1대비 % 활성
명칭 서열 번호 : 명칭 서열 번호 : Fc2/Fc4
H3 10 Kl 21 0.30 100
M3 11 Kl 21 0.42 140
DIM3 17 K1 21 0.41 137
M3 11 DIK1 29 0.17 57
DIM3 17 DIKl 29 0.06 20
M3-A 14 Kl 21 0.05 17
M3-B 15 Kl 21 0.31 103
M3-AB 16 Kl 21 0.13 43
M3 11 K1-C 22 0.29 97
M3 11 Kl-D 23 0.09 30
M3 11 K1-E 24 -0.05 -
M3 11 K1-CD 25 0.17 57
M3 11 K1-CDE 28 -0.10 -
M3 11 K1-DE 27 -0.10 -
M3-AB 16 Kl-CD 25 0.07 23
추가적인 조합 변이체 중사슬 DI M3-B 및 경사슬 DI K1-C 또한 제조되었다. 이러한 조합 변이체 또한 IFNAR-1로의 결합에 대해 시험하였다. 비록 높은 결합 친화성이 DI M3-B 중사슬에 나타나지만, DI K1-C 경사슬의 사용은 DI Kl 경사슬을 사용한 것으로 나타나는 것과 유사하게, 감소된 결합 활성으로 귀결된다. 결과는 Table 5에 제시된다. 항체를 고정된 용해성 IFNAR-1에 결합시키고 Biacore을 이용하여 결합 분석을 실시하였다. 최대 반응은 두 개 농도에서 결정되었고, 나타난 값은 4 번 결정한 것의 평균값이다.
표 5
중사슬 경사슬 H3K1 대비 % 반응
명칭 서열번호 : 명칭 서열 번호 :
H3 10 K1 21 100
M3 11 K1 21 97
M3-B 15 Kl 21 117
DIM3 17 Kl 21 149
DIM3-B 18 Kl 21 122
M3 11 K1-C 22 100
M3-B 15 K1-C 22 156
DIM3 17 K1-C 22 96
DIM3-B 18 K1-C 22 100
M3 11 DIKl 29 25
M3-B 15 DIK1 29 17
DIM3 17 DIK1 29 8
DIM3-B 18 DIK1 29 11
M3 11 DIK1-C 30 17
M3-B 15 DIKl-C 30 14
DIM3 17 DIK1-C 30 4
DIM3-B 18 DIKl-C 30 9
또한 선택된 변이체의 특성을 결정하기 위해, 이들을 친화성에 대하여 서 항체 캡쳐 분석법으로 분석하였다 (여기서 항-인간 IgG Fc를 Biacore 칩에 결합하고 용해성 IFNAR-1을 25-400 nM에서 사용하였다). 결과를 표 6에 제시하였고 이 결과는 이러한 변이체들이 높은 IFNAR 결합 친화성을 나타낸 것을 보인다.
표 6
ka (1/Ms) kd (1/s) KD(M) Ab Rmax
M3K1 5.34E+03 3.79E-05 7.09E-09 528
M3-B K1-C 5.49E+03 4.10E-05 7.47E-09 520
DIM3-BK1-C 5.61E+03 2.82E-06 5.02E-10 479
플로우 세포2-1, 저밀도 포획
ka (1/Ms) kd (1/s) KD(M) Ab Rmax
M3K1 5.49E+03 4.39E-05 7.99E-09 924
M3-B K1-C 5.46E+03 4.06E-05 7.45E-09 908
DIM3-B K1-C 4.64E+03 1.64E-05 3.53E-09 848
플로우 세포4-3, 더 높은 밀도 포획
항-인간 IgG Fc, 용해성 IFNAR (25-400nM)에의해 포획
실시예 4: 선택된 항체 서열내의 CDR 잔기 변형
변형된 CDR3 서열을 사용하여 일련의 상이한 중사슬을 생성하였다. 각각, CDR3의 11개 위치 중 하나에서 복수의 아미노산 치환체를 포함하는, 일련의 풀(pool)을 시험하기 위해 정제된 각 풀로부터 얻은 Kl 경사슬 및 항체와 동시에 발현시켰다. Biacore 실험을 실시하여 고정된 용해성 IFNAR-1에 대한 결합활성을 결정하였다. 항-IFNAR-1 항체의 CDR3 변이체 라이브러리는 항체의 풀을 고정된 용해성 IFNAR-1에 결합시킴으로써 결정되었다. 반응 단위체는 200 nM 샘플로부터 생성되었다 (A: RU 최대 결합에서; D: RU after 분리 후 800 초에서). 표 7에 나타난 바와 같이, 각 풀에 대하여 상이한 활성 수준이 나타난다.
표 7
항체중사슬 중사슬CDR3 A: 최대 결합에서의 RU D:분리 800초 후 RU H3K1 대비 최대 반응 (%)
H3(서열 10) 서열번호:10에서와 같은 194 190 100
M3-1 CDR3 aal 임의추출 74 61 38
M3-2 CDR3 aa2 임의추출 147 140 76
M3-3 CDR3 aa3 임의추출 98 88 51
M3-4 CDR3 aa4 임의추출 102 89 53
M3-5 CDR3 aa5 임의추출 60 41 31
M3-6 CDR3 aa6 임의추출 21 12 11
M3-7 CDR3 aa7 임의추출 104 99 54
M3-8 CDR3 aa8 임의추출 26 19 14
M3-9 CDR3 aa9 임의추출 87 83 45
M3-10 CDR3 aalO 임의추출 45 38 23
M3-11 CDR3 aa11 임의추출 149 146 77
풀 4 및 11을 선택하여 연구하였고 각 풀의 개별 항체를 독립적으로 생성하고 발현시켰다. 이러한 개별 항체의 서열을 도 1F의 서열 번호: 12 및 도 1G의 서열 번호: 13에 제시하였다. IFNAR-1에 대한 풀 4의 개별 항체의 결합에 대한 Biacore 분석 결과가 도 8에 도시된다. 이 데이터는 M3K1에 대하여, 최대 결합치로 제시된다. IFNAR-1에 대한 풀 11의 개별항체의 결합에 대한 Biacore 분석 결과가 표 9에 제시된다. 이 데이터는 M3K1에 대하여 최대 결합치로 제시된다.
표 8
중사슬 X 아미노산 잔기 경사슬 M3K1 대비활성 %
명칭 서열번호 : 명칭 서열 번호:
H3 10 - Kl 21 115
M3 11 - Kl 21 100
M3-4 12 L Kl 21 126
M3-4 12 N K1 21 49
M3-4 12 E K1 21 128
M3-4 12 V K1 21 122
M3-4 12 A K1 21 107
M3-4 12 C Kl 21 123
M3-4 12 G K1 21 114
M3-4 12 S K1 21 110
M3-4 12 I K1 21 106
M3-4 12 R K1 21 106
M3-4 12 D K1 21 100
M3-4 12 M Kl 21 101
M3-4 12 H K1 21 79
M3-4 12 T K1 21 103
M3-4 12 W K1 21 93
M3-4 12 K K1 21 86
표 9
중사슬 X 아미노산 잔기 경사슬 M3K1 대비 % 활성
명칭 서열 번호: 명칭 서열번호
H3 10 - K1 21 138
M3 11 - K1 21 100
M3-11 13 L Kl 21 75
M3-11 13 E K1 21 105
M3-11 13 Q K1 21 73
M3-11 13 R K1 21 220
M3-11 13 V K1 21 108
M3-11 13 A Kl 21 93
M3-11 13 F K1 21 93
M3-11 13 G K1 21 63
M3-11 13 C K1 21 64
M3-11 13 I K1 21 81
M3-11 13 T K1 21 82
M3-11 13 W K1 21 70
M3-11 13 H K1 21 104
M3-11 13 K K1 21 82
M3-11 13 D K1 21 67
M3-11 13 S K1 21 39
IFNAR-1에 대한 결합은 표 8과 9에 나타난 바와 같이 상이한 항원 결합 활성가지는 것으로 생성된 모든 변이체에 의해 유지된다.
실시예 5: 세포에 대한 항-IFNAR-1 인체화된 항체의 스캇차드 (Scatchard) 결합 분석
IFNAR-1 및 IFNAR-2을 발현하는 BALL-1 세포를 사용하여 세포에 대한 항-IFMA-l 인체화된 항체의 결합을 스캇차드 분석으로 조사하였다.
세포를 10% FCS 함유 RPMI에 배양하고 행크스 균형(Hanks Balanced) 염 용액 (HBSS)으로 4℃에서 두 번 세척하였다. 세포를 트리스 완충액(24 mM 트리스, 137 mM NaCl, 2.7 mM KC1, 0. 1% HSA, 2 mM 글루코스, 1 mM MgCl2, 1 mM CaC12, pH 7.4)에서 4x107 세포/ml 밀도로 조정하였다. 밀리포어(Millipore) 판(MAFB NOB)을 1% 탈지분유로 코팅하고 4℃에서 밤새 보관하였다. 상기 판을 결합 완충액으로 세척하고, 미표지 항체 (1000-배 초과)를 포함하는 TBS 결합 완충액 25 μl를 밀리포어 96웰 유리섬유 필터 판 (비특이성 결합 NSB)의 대조 웰에 첨가하였다. 단독 완충액 25μl를 최대 결합 대조 웰에 첨가하였다 (전체 결합). 125I-항-IFNAR-1 항체 25μl 및 BALL-1 세포를 함유한 TBS 결합 완충액 현탁액 (4X107 세포/ml) 25μl을 첨가하였다. 판을 200 RPM의 교반기에 올려놓고 4℃에서 2시간 항온처리하였다. 배양 종료시, 상기 밀리포어 판을 최종 0.5 M NaCI 농도를 가지는 냉각 TBS 결합 완충액 0.2 ml로 세척하였다. 필터를 제거하고 감마 계수기로 계수하였다. 단일 부위 결합 변수를 Prism 소프트웨어 (San Diego, CA)와 같이 사용하여 평형 결합을 평가 하였다.
스캇차드 결합 분석법을 이용한 결과, BALL-1 세포에 대한 인체화된 항체 H3K1 (IgG4 이소타입)의 친화도는 4 nM로 나타났고 이는 쥐 64G12와 유사한 것이다. 전체 세포-결합 분석으로 얻어진 낮은 나노몰 친화도 값은 정제된 재조합 리간드에 대한 항체의 친화도가 결정되는 Biacore 데이터와 비견된다 (표 10). 따라서, 단백질-기재 또는 세포-기재 분석에서, 항체의 결합 친화도는 낮은 nM 범위이다.
표 10
이소타입 수용체 결합 (Biacore)KD(nM) 세포 결합 친화도 (BALL-1)KD(nM)
64G12 mIgG1 1.2 3.9
H3KI hIgG4 3.4 4.0
실시예 6 : 항-IFNAR-1 인체화된 항체는 세포 증식 및 IFN-반응성 리포터 분석에서 타입 I IFN의 생물학적 활성을 저해한다
인간 B-임파아구 부킷 임파종(Burkitt's lymphoma)에서 유도된 세포라인 다우디(Daudi)는 고도의 IFNAR을 발현하고, 이러한 세포의 성장은 타입 I 인터페론류에 의해 저해된다. 인체화된 항-IFNAR-1 항체의 기능성 차단 능력을 측정하기 위해, 두 가지 상이한 분석을 실시하였다. 먼저 다우디 세포를, 항체 존재 또는 무존재 하에서, 인터페론 α2b를 사용하여 배양하고, 3[H]-티미딘의 섭취량으로 증식정도를 측정하였다. 다우디 세포는 ATCC에서 수득하였고 및 10% FCS, 및 2 mM 베타 머캅토에탄올을 함유하는 RPMI 배지에서 배양하였다. 세포를 원심분리하고, 1% 인 간 혈청 알부민(배지 및 HS)이 첨가된 배지에 1x106 세포/ml의 농도로 재현탁하였다. 세포액 를 96 웰 플레이트의 각 웰에 적절한 농도의 항체를 포함하는 200 U/ml 인터페론 α2b (Schering corporation) 100μl를 첨가하였다. 다우디 세포를 함유하는 배지 및 HS의 100μl를 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 48시간 항온처리하였다. 플레이트를 3[H]-티미딘 1 μCi으로 방사선 처리하고 추가로 24시간 배양하였다. 플레이트를 수거하고, 96-웰 섬유 필터 플레이트에 노드고, 및 a TopCount 신틸레이션 계수기(Packard)를 사용하여 계수하였다. 분당 계수를 항체 농도의 함수로 그래프 작성하였고 데이터는 Prism 소프트웨어(San Diego, CA)를 사용하여 비 선형 회귀, 시그모달 투여량-반응(가변 슬로프)에 의해 분석하였다.
두 번째 분석에서, U937 세포를 인터페론 자극 반응 요소(Interferon Stimulated Response Element)가 리포터 유전자 (ISRE-RG)에 연결된 작제물로 형질전환시키고 및 리포터 유전자의 IFN-유도 발현을 차단하는 인체화된 항-IFNAR-1 항체의 능력을 측정하였다. 세포를 10% FCS 및 2 mM 베타 머캅토에탄올을 함유하는 RPMI 배지에 배양하였다. 2% 인간 혈청 알부민이 첨가된 배지에 1x106 세포/ml의 농도로 재현탁하였다. 세포액 100μl를 96 웰 플레이트에 첨가하였다. 인터페론 α2b (Schering corporation) 200 U/ml을 함유하는 배지로 항체를 순차적으로 희석시키고, 100μl를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 이 후, 유동 혈구계수법으로, 리포터 유전자의 발현을 측정하였다. 기하 평균 형광 강도(Geometric mean fluorescent intensity) 항체 농도의 함수로 그래프 표시하였 고, 데이터는 Prism 소프트웨어(San Diego, CA)를 사용하여 비선형 회귀, 시그모달 투여량-반응(가변 슬로프)에 의해 분석하였다.
상술한 두 가지 분석법을 사용하여, 다우디 증식 분석에서 2-10 nM 의 효능(potency) 및 ISRE-RG 리포터 분석에서 2-22 nM의 효능을 얻었다. 쥐 64G12의 효능은 인체화된 IgGl 항체와 비견되었다. 결과를 표 11에 요약하였다.
표 11
이소타입 세포 증식(다우디)IC50(nM) ISRE-RG 수용체(U937)IC50(nM)
64G12 m IgG1 2.1 5. 8
H3K1 h IgG4 9.1 21.5
H3K1(IgG1) h IgG1 3.9 2.7
DIM3-B K1C h IgG1 10 4.6
상기 데이터는 인체화된 항-IFNAR-1 항체는 IFN 알파 2b에 강력한 활성을 가진다는 것을 명백히 나타내기 때문에, 항체가 IFNβ를 저해하는 능력을 시험하였다. 두 개의 시험된, 인체화된 항체 H3K1 (IgGl) 및 H3K1 (IgG4)는, 리포터 분석법으로 측정되는바, IFN 유도 세포 신호전달의 강력한 저해체로 나타났다.
H3K1 (IgGl)는 약 H3K1 (IgG4)보다 약 10배 더 강력한 반면, 쥐의 64G12는 H3K1 (IgGl)보다 3배 덜 강력한 것으로 나타났다. 리포터 분석 IFN-α 및 IFN-β에 대한 리포터 분석 결과는 도 4A-4B에 도시되어 있다.
인체화된 항-IFNAR-1 항체가 여러가지의 타입 I IFN의 생물학적 활성을 저해하는 능력을 결정하기 위해, 구별되는 IFN 알파 서브타입들을 다우디 증식 분석법으로 시험하였다. 인체화된 항체 DI M3-B K1C 또는 이소타입 대조군의 10 μg/ml 존재하에서, 하기 IFN 알파 서브타입중 하나: 2a9 2b, 4b, 8, 10, 1, 21, 5, 14, 17, 7, 6 또는 16를 사용하거나 또는 백혈구 IFN나 일반적 IFN를 사용하여, 다우디 세포를 배양하였다. 다우디 증식은 전술한 바와 같이 측정되었다. 결과는 도 5의 막대 그래프에 도시되어 있다. 나타난 바와 같이, 항-IFNAR-1 항체는 백혈구 IFN, 일반 IFN, IFN α, α2a, α2b, α4b, α8, αlO, α21, α5, αl4, αl7, α7, α6, 및 α16을 포함하는, 그러나 여기에 한정되지 않는, 여러 가지 타입 I IFN들에 의해 나타나는 반응들을 역전시키도록 유도한다.
실시예 7: 수지상 세포 성숙에 대한 항-IFNAR-1 항체의 효과
IFN 알파는 SLE 환자에서 수지상 세포 성숙 및 활성을 유도한다. IFN 알파-매개 수지상 세포 성숙을 방해하는 항-IFNAR-1 항체의 능력을 검사하기 위해 시험관(in vitro) 시스템을 설치하였다. 이 실험에서, 말초혈액 세포를 GM-CSF 및 IL-4 또는 GM-CSF 및 IFN 알파에서 배양하여 수지상 세포 표현형으로 유도하였다. GM-CSF 단독 존재하에서 배양된 배양물은 대식세포-유사 표현형을 유지하기 때문에 대조군으로 사용하였다. IFN 알파는, 세포가 항원을 받아들이는 능력 및 세포 표면 마커의 발현에서의 변화로 측정했을 때, 수지상 세포 배양물의 성숙을 강요하는 것으로 나타난다.
분석하기 위해, 25 ml 담황색 코트를 PBS로 4배 희석시켰다. 샘플을 4x50ml 원추형 튜브에 담고, 및 임파구 분리 배지 (ICN Biomedicals) 15ml를 바로 아래에 깔았다. 500xg에서 30분간 원심분리후, PBMC를 포함하는 담황색 코트를 제거하고 PBS로 세척하였다. 배양 배지에, 세포를 4x106 세포/ml로 재현탁하였단. PBMC (2.0 x 107 세포/5ml/25cm2 플라스크)를 배양배지에서 1.5 시간동안 37℃에서 배양함으로써 단핵구를 분리하고, 다음 고착되지 않은 세포를 두 번 세척하여 제거하였다. 마지막 세척후, 1% 열 불활성화 인간 혈청 (Gemini Bio Products)을 포함하는 배지에 상기 세포를 배양하였다. GM-CSF (500 U/ml), IL-4 (1000 U/ml), IFN 알파 (Intron A; 1000 U/ml), IFN (3 (1000 U/ml) 및/또는 항-IFNAR-1 항체 또는 이소타입 대조군 항체 (30ug/ml)를 적절한 배양 플라스크에 첨가하고, 세포를 3 내지 7일간 배양하였다. DC를 성숙시키기 위해, TNF-α(lOng/ml)를 3 및 5 일째 첨가하였고, DC를 PBS로 세척하고 및 37℃에서 10분간 1:5000 베르센(Versene)으로 처리하였다. 필요시, 부드럽게 세포를 긁어 DC를 떼어내서, 세척하고 분석하였다.
각 DC 배양물을 염색 배지(행크스 균형 염 용액 (HBSS) 0.2% 소듐 비카보네이트, 0.01% 소듐 아자이드, O. 1mMl EDTA, 20mM HEPES, 및 2% FCS 포함)에 재현탁하고 및 V-바닥 96-well 플레이트의 6 개 웰로 동등하게 분리하였다. 세포를 Sorvall RTH-750 원통에서 2100 rpm 속도로 맥동 회전시키고, 염색 배지 25μl에 재현탁하였다. 특이성 플루오로크롬 접합 항체 1 μg을 각 웰에 첨가하고 얼음상에서 45분간 두었다. DC를 세 번 세척하고, 2% 파라포름알데히드를 함유한 PBS 200 μl에 재현탁하고, Becton Dickinson FACScalibur를 사용하여 플로우 혈구계산법(cytometry)으로 분석하였다. 게이트(Gate)를 Forward vs. Side Scatter 그래프 상에 나타내어 분석에서 오염하는 세포를 제거하였다.
IL-4 또는 IFNα 존재하에서 GM-CSF으로부터 유도된 DC의 표현형은 상이하다. IL-4로 유도된 DC는 CD la를 발현하고 CD14와 CD123를 결핍하고 있지만, IFNα로 유도된 DC는 CD123와 CD14를 더 높은 수준으로 CDla를 더 낮은 수준으로 발현한다. 또한, IFNα-유도 DC는 IL-4-유도 DC 상에서 발견되는 것보다 더 높은 수준으로 동시자극(costimulatory) 분자 MHC class II 및 CD86를 발현한다. IFN 배양물을 인체화된 항-IFNARl 항체, H3K1로 동시 처리하면, 대식세포 (GM-CSF 단독)의 것과 닮은 발현 패턴이 나타난다. 더욱이, IFN와 H3K1로 처리된 배양물의 형태는 대식세포와 유사하게 나타나는 바, 전형적인 팬케이크-형상을 띠고 있다. 따라서, 이 실험은 상기 인체화된 항-IFNAR-1 항체가 IFNAR 유도 수지상 세포 성숙을 저해할 수 있다는 것을 보여준다. 플로우 세포계수 분석 결과는 표 12에 요약되어 있다 (네 번 실험치의 기하 평균의 중간값이 나타나 있다).
표 12
처치 CDla CD123 CD14 CD86 CD58 Class II
GM-CSF 42 135 427 172 208 123
GM-CSF & IL-4 395 0.5 0 45 73 287
GM-CSF & IFN 20 161 207 288 89 413
GM-CSF, IFN & H3K1(lgG4) 50 86 130 125 197 141
GM-CSF, IFN & hIgG4(대조군) 4 86 263 266 88 348
실시예 8: 인체화된 항-IFNAR-1 항체의 레수스 원숭이에서의 약리동력학 및 면역원성
상기 인체화된 항-IFNAR-1 항체 H3K1가 레수스 원숭이의 말초 혈액세포에 결합하는 능력을 플로우 세포계수 분석으로 평가하였다. H3K1 항체는 인간세포에서 나타나는 바와 같은 유사한 반응성을 레수스 세포에서 보이며, 이는 이 종이 예비임상 동물 시험과 관련이 있다는 것을 제시한다. 131I-표지 H3K1를 사용하여 레수스 원숭이에서 약리동력학 조사를 실시하였다. 비-인간 영장류에서 CDR-접합 항체에 대해 예상되는 바와 같이, H3K1에 대한 반감기 (t1 /2β)는 약 5. 5 일 이었다 (두마리 동물).
소멸 속도의 증가가 10일에 나타났고, 면역원성의 가능성을 보였다. 이를 조사하기 위해, 연구 대상 원숭이에게 H3K1를 세 번 투여하였고, 다음, 표지된 항체로 다시 면역성 검사를 하였다. 빠른 소멸이 관측되었고, 14-19시간의 t1 /2β가 측정되었다. 이러한 결과는 H3K1가 원숭이에서 명백한 항체 반응을 나타내고 있다는 것을 제시한다. 이전 실시예에서 설명된, 본 발명의 탈면역화된 인체화된 항체는 생체 내에서, 인체화된 항-IFNAR-1 항체의 면역원성을 감소시키는 데 사용될 수 있다.
실시예 9: 인체화된 항-IFNAR-1 항체에 의한 레수스 원숭이에서 IFNAR/IFNα 활성의 중화
약리동력학 모델을 사용하여 항-IFNAR 항체가 생체내에서 인터페론 활성을 저해하는 능력을 연구하였다. 이러한 모델에서, 외인성 IFN-α2b를 근육내로 투여하였고, 및 말초혈액 세포의 활성과 혈청 활성화 표지물의 존재를 측정하였다. 레수스 원숭이에 의 항-IFNAR-1 mAb 64G12, 인체화된 항-IFNAR-1 mAb H3K1, 또는 부 형제 대조물을 각 10mg/kg의 양으로 정맥내 관류하여 투여한 후, 인간 IFN-α2b (3x106 U/Kg)을 근육내 투여하였다. 발현 of the 세포 표면 표지물 CD86, MHC class II, MHC class I 및 IFNAR1의 발현을 24 시간에 걸쳐 관찰하였다. 또한, 혈장 표지물 네오프테린, β2 미소글로불린 및 C-반응성 단백질을 관찰하였다. 주요 발견현상은 다음과 같다: a)IFN-α2b 처리는 말초 혈액 세포상에서 MHC class I 발현을 증가시켰고 증가된 발현은 항체 처리에 의해 차단되었다, b)측정된 세 개 혈장 표지물 모두는 IFN-α2b 처리에 의해 증가되었고, H3K1은 네오프테린 수준을 50% 차단하고 CRP를 25% 감소시키도록 유도한 반면 while no change was seen with β2 미소글로불린에 대해서는 아무런 변화가 보이지 않았다. 그러므로, IFNα2b에 대한 측정할만한 생체내 반응이 관측되었고, 이는 부분적으로 항체 처리에 의해 차단된다.
[등가가치]
당해 분야의 숙련자는 단지 일상적인 실험을 이용하여 본 명세서에서 설명된 본 발명의 특정 양태의 많은 여러 등가가치를 인식하게 되거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 등가 가치는 하기 청구범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
[참조문헌]
본 명세서에서 인용한 모든 특허, 계류중인 특허 출원서 및 다른 출판물들은 그것들 전체 참조문헌으로 여기에 포함된다.
도 lA-1L은 쥐의 중사슬 가변 영역, 및 본 발명의 항-IFNAR-1 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 나타내는 모식도이다. CDR1, CDR2 및 CDR3 영역은 밑줄이 그어져 있다.
CDR 또는 골격 잔기에서 치환된 것은 이태리체로 되어 있다.
도 1A은 쥐의 원래 64G12 중사슬 가변 영역이다. 이것은 64G12 하이브리도마로부터 추출한 mRNA로부터 합성된 cDNA 라이브러리에서, 쥐의 IgGl CH1 도메인에 상보적인 5'프라이머 (atgggcagacttacattctcattcctg) (서열 번호 : 43), 및 a 3'프라이머 (cagtggatagacagatggggg) (서열 번호 : 44)을 사용하여 증폭함으로써 클론되었다. 64G12 중사슬의 CDR 서열들이 밑줄되어 있다.
도 1B는 쥐의 서열로부터 나온 CDRs 및 다른 아미노산을 인간 면역글로불린 중사슬 생식계열 DP-28 골격 서열과 결합함으로써 고안된 중사슬 가변 영역이다.
도 1C는 쥐의 서열로부터 나온 CDR- 3을 인간 면역글로불린 중사슬 생식계열 DP-28 골격 서열과 결합함으로써 고안된 중사슬 가변 영역이다.
도 1D는 쥐의 서열로부터 나온 CDRs 및 다른 아미노산을 인간 면역글로불린 중사슬 골격 서열과 결합함으로써 고안된 중사슬 가변 영역이다.
도 1E는 쥐의 서열로부터 나온 CDRs 및 다른 아미노산을 인간 면역글로불린 중사슬 생식계열 DP-47 골격 서열과 결합함으로써 고안된 중사슬 가변 영역이다.
도 1F는 L, N, E, V, A, C, G, S, R, D, M, H, T, W, K, 또는 I으로 치환된 아미노산X를 가지는 중사슬 M3이다.
도 1G는 L, E, Q, R, V, A, F, G, C, T, W, H, K, D, S, 또는 I으로 치환된 아미노산X를 가지는 중사슬 M3이다.
도 1H는 CDR-1 부위(이태리체화)에서의 아미노산을 치환함으로써 제거된T-세포 에피토프를 가지는 중사슬 M3이다.
도 1I는 CDR-2 부위 (이태리체화)에서의 아미노산을 치환함으로써 제거된 T-세포 에피토프를 가지는 중사슬 M3이다.
도 1J는 CDR-1 및 2 부위 (이태리체화)에서의 아미노산을 치환함으로써 제거된 두 개의 T-세포 에피토프를 가지는 중사슬 M3이다.
도 1K는 골격 영역에서 이태리체화된 아미노산을 변화시킴으로써 제거된 모든 잠재적 T-세포 에피토프를 가진 중사슬 M3이다.
도 1L은 골격 및 CDR-2 부위에서 이태리체화된 아미노산들을 변화시킴으로써 제거된 모든 잠재적 T-세포 에피토프를 가진 중사슬 M3이다.
도 2A-2S는 쥐의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열 및 본 발명의 항-IFNAR- 1 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산서열을 나타내는 모식도이다.
CDR1, CDR2 및 CDR3 부위는 밑줄되어 있다.
CDR 또는 골격 잔기에서의 치환은 이태리체로 표시되어 있다.
도 2A는 쥐의 원 64G12 경사슬 가변 영역이다. 이는, 상기 항체의 N-말단 펩티드 서열에 근거한 5' 프라이머 (ctcacccagtctccaaccaccatggctgcatc) (서열 번호 : 46) 및 쥐의 카파 불변 도메인에 상보적인 3' 프라이머 (actggatggtgggaagatgg) (서열 번호 : 45)를 사용하여, 64G12 하이브리도마로부터 추출한 mRNA로부터 합성된 cDNA 라이브러리에서, 증폭함으로써 클로닝되었다. 64G12 경사슬의 CDR 서열은 밑줄되어 있다.
도 2B는 쥐의 서열로부터 나온 CDRs 및 다른 아미노산을 인간 면역글로불린 경사슬 생식계열 DPk-26 골격 서열과 결합함으로써 고안된 경사슬 가변 영역이다.
도 2C는 쥐의 서열로부터 나온 CDRs 및 다른 아미노산을 인간 면역글로불린 카파 사슬 골격 서열과 결합함으로써 고안된 경사슬 가변 영역이다.
도 2D는 CDR-1에서 이태리체화된 아미노산을 변화시킴으로써 제거된 잠재적 T-세포 에피토프 중 하나를 가진 경사슬 Kl이다.
도 2E is CDR-1에서 이태리체화된 아미노산을 변화시킴으로써 제거된 잠재적 T-세포 에피토프 중 하나를 가진 경사슬 Kl이다.
도 2F는 CDR-3에서 이태리체화된 아미노산을 변화시킴으로써 제거된 잠재적 T-세포 에피토프 중 하나를 가진 경사슬 Kl이다.
도 2G는 CDR-1에서 이태리체화된 아미노산을 변화시킴으로써 제거된 잠재적 T-세포 에피토프 중 하나를 가진 경사슬 Kl이다.
도 2H는 CDR-1 및 3에서 이태리체화된 아미노산을 변화시킴으로써 제거된 잠재적 T-세포 에피토프 중 두 개를 가진 경사슬 Kl이다.
도 2I는 CDR-1 및 3에서 이태리체화된 아미노산을 변화시킴으로써 제거된 잠재적 T-세포 에피토프 중 두 개를 가진 경사슬 Kl이다.
도 2J는 CDR-1 및 3에서 이태리체화된 아미노산을 변화시킴으로써 제거된 잠재적 T-세포 에피토프 중 세 개를 가진 경사슬 Kl이다.
도 2K는 골격 영역에서 이태리체화된 아미노산을 변화시킴으로써 제거된 모든 잠재적 T-세포 에피토프를 가진 경사슬 Kl이다.
도 2L는 골격 영역 및 CDR-1에서 이태리체화된 아미노산을 변화시킴으로써 제거된 모든 잠재적 T-세포 에피토프를 가진 경사슬 Kl이다.
도 2M은 골격 영역에서 이태리체화된 아미노산을 변화시킴으로써 제거된 여섯 개의 잠재적 T-세포 에피토프 중 다섯을 가진 경사슬 Kl이다.
도 2N은 골격 영역 및 CDR-1에서 이태리체화된 아미노산을 변화시킴으로써 제거된 여섯 개의 잠재적 T-세포 에피토프 중 다섯을 가진 경사슬 Kl이다.
도 2O는 골격 영역에서 이태리체화된 아미노산을 변화시킴으로써 제거된 여섯 개의 잠재적 T-세포 에피토프 중 다섯을 가진 경사슬 Kl이다.
도 2P는 골격 영역에서 이태리체화된 아미노산을 변화시킴으로써 제거된 여섯 개의 잠재적 T-세포 에피토프 중 다섯을 가진 경사슬 Kl이다.
도 2Q은 골격 영역에서 이태리체화된 아미노산을 변화시킴으로써 제거된 여섯 개의 잠재적 T-세포 에피토프 중 다섯을 가진 경사슬 Kl이다.
도 2R은 골격 영역에서 이태리체화된 아미노산을 변화시킴으로써 제거된 여섯 개의 잠재적 T-세포 에피토프 중 다섯을 가진 경사슬 Kl이다.
도 2S는 골격 영역에서 이태리체화된 아미노산을 변화시킴으로써 제거된 여섯 개의 잠재적 T-세포 에피토프 중 다섯을 가진 경사슬 Kl이다.
도 3A-3D는 중사슬 가변 영역 M3 (FIG. 3A) 및 DI M3-B (FIG. 3C)의 핵산서열, 및 경사슬 가변 영역 Kl (FIG. 3B) 및 Kl-C (FIG. 3D)의 핵산서열을 나타낸다.
도 4A-4B는 인터페론-반응성 리포터 유전자 분석법으로 측정된, 항-IFNAR-1 인체화된 항체에 의한 IFN-α (도. 4A) 및 IFN-β (도. 4B) 활성 저해를 나타내는 그래프이다.
도 5는 인체화된 항-IFNAR-1 항체에 의한 여러개의 IFN 알파 서브타입의 생물학적 활성이 역전되는 것을 나타내는 막대 그래프이다.
<110> Medarex, Inc. CARDARELLI, Josephine M. CHEN, Tseng-hui Timothy KING, David BEBBINGTON, Christopher R. POGUE, Sarah Lee CARR, Francis J. 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Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Thr Ser Ile Asn Ser Asn 20 25 30 His Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Thr Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Ser Asn Ile Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 29 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 29 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Ser Asn 20 25 30 His Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Thr Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Asn Ile Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro <210> 30 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 30 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Thr Ser Ile Asn Ser Asn 20 25 30 His Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Thr Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Asn Ile Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro <210> 31 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 31 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Ser Asn 20 25 30 His Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Thr Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Asn Ile Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro <210> 32 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 32 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Thr Ser Ile Asn Ser Asn 20 25 30 His Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Thr Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Asn Ile Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro <210> 33 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 33 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Ser Asn 20 25 30 His Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Thr Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Asn Ile Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro <210> 34 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Ser Asn 20 25 30 His Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Thr Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Asn Ile Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro <210> 35 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 35 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Ser Asn 20 25 30 His Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Thr Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Asn Ile Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro <210> 36 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Ser Asn 20 25 30 His Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Thr Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Asn Ile Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro <210> 37 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 37 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Ser Asn 20 25 30 His Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Thr Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Asn Ile Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro <210> 38 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcat tctccggatt caccctgagc acttctggta tgggtatagg ctgggtccgc 120 caggctcccg ggaaggggct ggagtgggtc gcacacattt ggtgggatga tgataagtac 180 tataatccat ccctgaagag tcggttcacc atctccagag acacttccaa gaacacggta 240 tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacactgcag tatattactg tgcgagaaat 300 tactatcctt acgacgcctg gtttgactac tggggtcaag gtaccctagt caccgtctca 360 <210> 39 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 39 gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60 atcacctgca gtgccagctc aagtataaat tccaatcact tacactggta tcaacagaaa 120 ccaggaaagg cgccgaaact gctgatttac aggacatcca ttctggcttc tggagtccct 180 tctcgcttct ctggttccgg atctgggacg tctttcactc tgaccatcag ctccctgcag 240 ccggaagact tcgcaactta ttactgtcag cagggtagta atatcccatt cactttcgga 300 cagggtacca aggtggagat caaacgt 327 <210> 40 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggctt caccatgagc acttccggaa tgggtatagg ctggatccgc 120 cagacccccg ggaaggggct cgagtgggtc gcacacattt ggtgggatga tgataagtac 180 tataatccat ccctgaaggc tagattcacc atctccagag acacttccaa gaacacgctg 240 tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacactgcag tatattactg tgcgagaaat 300 tactatcctt acgacgcctg gtttgactac tggggtcaag gtaccctagt caccgtctca 360 <210> 41 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 41 gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60 atcacctgca gtgccagcac aagtataaat tccaatcact tacactggta tcaacagaaa 120 ccaggaaagg cgccgaaact gctgatttac aggacatcca ttctggcttc tggagtccct 180 tctcgcttct ctggttccgg atctgggacg tctttcactc tgaccatcag ctccctgcag 240 ccggaagact tcgcaactta ttactgtcag cagggtagta atatcccatt cactttcgga 300 cagggtacca aggtggagat caaacgt 327 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Cys Asn Phe Ser Ser Leu Lys Leu Asn Val Tyr Glu 1 5 10 <210> 43 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 43 atgggcagac ttacattctc attcctg 27 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 44 cagtggatag acagatgggg 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 45 actggatggt gggaagatgg 20 <210> 46 <211> 32 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 46 ctcacccagt ctccaaccac catggctgca tc 32 <210> 47 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Ala 20 25 30 Arg Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Asn Asp Glu Lys Ser Tyr Ser Thr Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 <210> 48 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys <210> 49 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro 85 90 95

Claims (63)

  1. 서열 번호 : 1, 서열 번호 : 2, 또는 서열 번호 : 3 의 상보성 결정 영역 (이하 "CDR"라 약칭함.) 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역;과
    서열 번호 : 4, 서열 번호 : 5, 또는 서열 번호 : 6의 상보성 결정 영역 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역; 및
    인간 항체 또는 인간 항체 콘센서스 골격의 중사슬 및 경사슬로부터의 가변 도메인 골격 영역을 포함하는 IFN 알파 수용체-1과 특이적으로 결합하는 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물로서,
    잠재적(Potential) T 세포 에피토프가 제거되도록 항체가 변경되고,
    항체가 IFN 알파 수용체-1에 1X10-7 M 이하의 KD의 결합 친화도를 유지하는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  2. 제 1항에 있어서,
    인간 중사슬 및 경사슬 불변 도메인을 더 포함하는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 인간 중사슬 불변 영역은 인간 감마 1, 감마 2, 감마 3, 및 감마 4로 구성되는 군으로부터 선택된,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 인간 중사슬 불변 영역은 감마 1인,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물은 1X10-8 M 이하의 KD의 IFN 알파 수용체-1 결합 친화도를 가지는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물은 lXl0-7 내지 5X10-1 M 범위의 IFN 알파 수용체-1 결합 친화도를 가지는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물은 1X10-8 내지 5X10-1 M 범위의 IFN 알파 수용체-1 결합 친화도를 가지는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물은 1X10-8 내지 5x10-10 M 범위의 IFN 알파 수용체-1 결합 친화도를 가지는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  9. 쥐 항체 64G12(ECACC 기탁번호 92022605)의 CDR1 (서열 번호 : 1), CDR2 (서열 번호 : 2), 및 CDR3 (서열 번호 : 3)의 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역을 가지는 IFN 알파 수용체-1과 특이적으로 결합하는 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물로서,
    CDR3의 아미노산 서열 (서열 번호 : 3), 및 인간 항체 또는 인간 항체 콘센서스 골격으로부터 유도된 가변 도메인 골격 영역의 아미노산 서열에서 적어도 하나의 아미노산 치환이 이루어진,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물이 쥐 항체 64G12(ECACC 기탁번호 92022605)의 IFN 알파 수용체-1 결합 친화도의 적어도 50%를 보유하는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  11. 제 9항에 있어서,
    인간 항체 또는 인간 항체 콘센서스 골격으로부터의 상기 가변 도메인 골격 영역은 변경되지 않은,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  12. 제 9항에 있어서,
    상기 아미노산 치환은 CDR3의 위치 4에서 일어난,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  13. 제 12항에 있어서,
    CDR3의 위치 4에서의 상기 아미노산 치환은 프롤린이 L, N, E, V, A, C, G, S, I, R, D, M, H, T, W, 및 K로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 것인,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  14. 제 12항에 있어서,
    CDR3의 위치 4에서의 상기 아미노산 치환은 프롤린이 L, E, V, A, C, G, S, I, R, D, M, T, W, 및 K로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 것인,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  15. 제 9항에 있어서,
    상기 아미노산 치환은 CDR3의 위치 11에서 일어난,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  16. 제 15항에 있어서,
    CDR3의 위치 11에서의 상기 아미노산 치환은 티로신이 L, E, Q, R, V, A, F, G, C, I, T, W, H, K, D, 및 S로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 것인,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  17. 제 15항에 있어서,
    CDR3의 위치 11에서의 상기 아미노산 치환은 티로신이 E, R, V, A, F, 및 H로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 것인,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  18. 제 9항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서,
    쥐 항체 64G12(ECACC 기탁번호 92022605)의 CDR1 (서열 번호 : 4), CDR2 (서열 번호 : 5), 및 CDR3 (서열 번호 : 6)의 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 더 포함하는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  19. 제 18항에 있어서,
    인간 중사슬 및 경사슬 불변 도메인을 더 포함하는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  20. 제 19항에 있어서,
    상기 인간 중사슬 불변 영역은 인간 감마 1, 감마 2, 감마 3, 및 감마 4로 구성되는 군으로부터 선택되는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  21. 제 19항에 있어서,
    상기 인간 중사슬 불변 영역은 인간 감마 1인,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  22. 제 9항에 있어서,
    상기 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물은 lXl0-7 M 이하의 KD의 IFN 알파 수용체-1 결합 친화도를 가지는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  23. 제 9항에 있어서,
    상기 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물은 1X10-8 M 이하의 KD의 IFN 알파 수용체-1 결합 친화도를 가지는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  24. 제 9항에 있어서,
    상기 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물은 lXl0-7 내지 5X10-1 M 범위의 IFN 알파 수용체-1 결합 친화도를 가지는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  25. 제 9항에 있어서,
    상기 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물은 1X10-8 내지 5X10-1 M 범위의 IFN 알파 수용체-1 결합 친화도를 가지는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  26. 제 9항에 있어서,
    상기 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물은 lXl0-9 내지 5X10-1 M 범위의 IFN 알파 수용체-1 결합 친화도를 가지는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  27. IFN 알파 수용체-1를 발현하는 세포상에서 IFN 알파 수용체-1에 타입 I 인터페론이 결합하는 것을 저해하는 의약의 제조에 사용되는,
    제 1항 내지 제 17항 및 제 19항 내지 제 26항 중 어느 한 항의 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  28. 제 27항에 있어서,
    상기 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물은 1X10-7 M 이하의 KD의 결합 친화도로 IFN 알파 수용체-1과 결합하는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  29. 제 27항에 있어서,
    상기 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물은 1X10-8 M 이하의 KD의 결합 친화도로 IFN 알파 수용체-1과 결합하는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  30. 제 27항에 있어서,
    상기 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물은 lXl0-7 내지 5X10-10 M 범위의 결합 친화도로 IFN 알파 수용체-1과 결합하는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  31. 목적물의 면역 반응을 저해하는 의약의 제조에 사용되는,
    제 1항 내지 제 17항 및 제 19항 내지 제 26항 중 어느 한 항의 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  32. 제 31항에 있어서,
    상기 면역 반응은 세포 상에서 MHC class I 또는 MHC class II의 발현을 조절하는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  33. 제 31항에 있어서,
    상기 면역 반응은 수지상 세포 발생을 유도하는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  34. 제 31항에 있어서,
    상기 면역 반응은 혼합된 임파구 반응을 특징으로 하는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  35. 제 31항에 있어서,
    저해된 면역 반응은 알로자극(allostimulatory) 세포의 저해를 포함하는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  36. 제 35항에 있어서,
    상기 알로자극 세포는 GMCSF/IFN-유도 수지상 세포인,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  37. 목적물의 자가면역 질환, 이식 거부, 또는 이식편 대 숙주자 질환(GVHD) 치료를 위한 의약의 제조에 사용되는,
    제 1항 내지 제 17항 및 제 19항 내지 제 26항 중 어느 한 항의 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  38. 제 37항에 있어서,
    상기 자가 면역 질환은 염증성 장질환(IBD)인,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  39. 제 37항에 있어서,
    상기 자가 면역 질환은 전신성 홍반성 루푸스(SLE)인,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  40. 제 37항에 있어서,
    상기 자가면역 질환은 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM)인,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  41. 제 37항에 있어서,
    상기 의약은 이식 거부 치료용인,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  42. 제 37항에 있어서,
    상기 의약은 GVHD 치료용인,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  43. 목적물의 혈청 CRP 농도를 변경하기 위한 의약의 제조에 사용되는,
    제 1항 내지 제 17항 및 제 19항 내지 제 26항 중 어느 한 항의 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  44. 목적물의 혈청 네오프테린 농도를 변경하기 위한 의약의 제조에 사용되는,
    제 1항 내지 제 17항 및 제 19항 내지 제 26항 중 어느 한 항의 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  45. 목적물의 B-세포 증식을 변경하기 위한 의약의 제조에 사용되는,
    제 1항 내지 제 17항 및 제 19항 내지 제 26항 중 어느 한 항의 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  46. 제 1항 내지 제 17항 및 제 22항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 항체 단편물은 다중의 타입 I 인터페론류에 의해 유도된 생물학적 반응을 저해하는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  47. 쥐 항-IFNAR-1 항체 64Gl2(ECACC 기탁번호 92022605)의 하나의 중사슬 가변 도메인 및 하나의 경사슬 가변 도메인을 포함하고, 인간 중사슬 및 경사슬 불변 영역에 기능적으로 연결되는 혼성화(chimeric) 항체 또는 항체 단편물로서,
    잠재적 T 세포 에피토프가 제거되도록 항체가 변경되고, 항체가 IFN 알파 수 용체-1에 lXl0-7 M 이하의 KD의 결합 친화도를 유지하는,
    혼성화 항체 또는 항체 단편물.
  48. (a) 잠재적 T 세포 에피토프의 삭제를 초래하는, CDR1, CDR2, CDR3 또는 골격 영역내에 아미노산 치환체를 포함하는 중사슬, 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 4에서 아미노산 치환체를 포함하는 중사슬, 및 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 11에서 아미노산 치환체를 포함하는 중사슬로 구성된 군으로부터 선택된 중사슬, 및
    K1(서열 번호: 21), K6(서열 번호: 20) 및 잠재적 T 세포 에피토프의 삭제를 초래하는, CDR1, CDR3 또는 골격 영역내에 아미노산 치환체를 포함하는 경사슬로 구성된 군으로부터 선택된 경사슬; 또는
    (b) H2(서열 번호: 8), H3(서열 번호: 10), M3(서열 번호: 11), 잠재적 T 세포 에피토프의 삭제를 초래하는, CDR1, CDR2, CDR3 또는 골격 영역내에 아미노산 치환체를 포함하는 중사슬, 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 4에서 아미노산 치환체를 포함하는 중사슬, 및 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 11에서 아미노산 치환체를 포함하는 중사슬로 구성된 군으로부터 선택된 중사슬, 및
    잠재적 T 세포 에피토프의 삭제를 초래하는, CDR1, CDR3 또는 골격 영역내에 아미노산 치환체를 포함하는 경사슬; 을 포함하는,
    IFN 알파 수용체-1에 특이적으로 결합하는 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  49. 제 48항에 있어서,
    인간 중사슬 및 경사슬 불변 도메인을 더 포함하는 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  50. 제 49항에 있어서,
    인간 중불변 영역이 인간 감마 1, 감마 2, 감마 3, 및 감마 4로 구성된 군으로부터 선택되는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  51. 제 49항에 있어서,
    인간 중불변 영역이 감마 1인,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  52. 제 48항에 있어서,
    상기 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물이 1X10-7 M 이하의 KD의 IFN 알파 수용체-1 결합 친화도를 갖는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  53. 제 48항에 있어서,
    상기 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물이 1X10-8 M 이하의 KD의 IFN 알파 수용체-1 결합 친화도를 갖는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  54. 제 48항에 있어서,
    상기 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물이 1X10-7 내지 5X10-10 M 범위의 IFN 알파 수용체-1 결합 친화도를 갖는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  55. 제 48항에 있어서,
    상기 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물이 1X10-8 내지 5X10-10 M 범위의 IFN 알파 수용체-1 결합 친화도를 갖는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  56. 제 48항에 있어서,
    상기 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물이 1X10-9 내지 5X10-10 M 범위의 IFN 알파 수용체-1 결합 친화도를 갖는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  57. IFN 알파 수용체-1를 발현하는 세포상에서 IFN 알파 수용체-1에 타입 I 인터페론이 결합하는 것을 저해하는 의약 제조에 사용되는,
    제 18항의 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  58. 목적물의 면역 반응을 저해하는 의약의 제조에 사용되는,
    제 18항의 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  59. 목적물의 자가면역 질환, 이식 거부, 또는 이식편 대 숙주자 질환(GVHD) 치료를 위한 의약의 제조에 사용되는,
    제 18항의 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  60. 목적물의 혈청 CRP 농도를 변경하기 위한 의약의 제조에 사용되는,
    제 18항의 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  61. 목적물의 혈청 네오프테린 농도를 변경하기 위한 의약의 제조에 사용되는,
    제 18항의 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  62. 목적물의 B-세포 증식을 변경하기 위한 의약의 제조에 사용되는,
    제 18항의 인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
  63. 제 27항에 있어서,
    항체 또는 항체 단편물은 다중의 타입 I 인테페론류에 의해 유도된 생물학적 반응을 저해하는,
    인체화된 항체 또는 인체화된 항체 단편물.
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