发明内容
本发明的目的是提供一种CD19单克隆抗体去甲斑蝥素免疫脂质体,通过以下步骤制备:
(1)CD19单克隆抗体(ZCH-4-2E8单抗)的研制:基本按Koller & Milstein报告的鼠-鼠杂交瘤经典方法制备[1],并经第6届国际人类白细胞分化抗原协作组会议(6th International Workshop and Conference on Human LeukocyteDifferentiated Antigens,HLDA6)鉴定,正式命名为CD 19抗体。2E8单抗及其免疫球蛋白可变区基因序列和相应的氨基酸序列被专利号:ZL200610052289.7)公开。2E8单抗可变区基因编码的氨基酸序列如下:重链可变区基因(VH2E8)编码的氨基酸序列SEQ ID NO 3:EVKLVESGPELKKPGETVKISCKASGYSFRNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYSGEPTHADAFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARRDFDGYYYAMDYWGQGTSVTVSSE;
轻链可变区基因(VL2E8)编码的氨基酸序列SEQ ID NO 4:DIQMTQTSSYLSVSLGGRVTITCKASDHINNWLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLATGIPSRFSGSGSGKDYTLSITSLQTYWSTPWTFGGGTKLEIK
(2)2E8修饰的立体空间稳定去甲斑蝥素脂质体(sterically stabilizedliposome-NCTD modified by antibody 2E8,2E8-SL-NCTD)的制备
首先采用薄膜分散法,制备立体空间稳定去甲斑蝥素脂质体(SL-NCTD)。其中大豆卵磷脂(PC)、胆固醇(CHO)、甲氧基-聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-PE)按起始摩尔比为2∶1∶0.01,NCTD与PC的质量比(w/w)为1∶20。高效液相检测NCTD的包封率达(46.5±2.21)%。
2E8修饰的立体空间稳定去甲斑蝥素脂质体(2E8--SL-NCTD)的制备主要采用后插技术将抗人CD19单抗ZCH-4-2E8与SL-NCTD连接。其中大豆卵磷脂(PC)、胆固醇(CHO)、甲氧基-聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-PE)和马来酰亚胺-聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺(Mal-PEG2000-PE)起始摩尔比为2∶1∶0.008∶0.002。当起始的2E8与胶束中Mal-PEG2000-DSPE按摩尔比1∶50反应时,2E8获得的最佳连接率为(58.70±3.32)%或每个脂质体上含有9个2E8(IgM)抗体分子(9IgM/liposome)。粒径测定仪检测2E8-SL-NCTD的平均粒径为118.32±2.03nm。2E8免疫脂质体(2E8-SL)的靶向性采用流式细胞术检测带藻红蛋白(PE)的2E8-SL-PE与CD19抗原阳性的B细胞系白血病细胞株Nalm-6细胞、B细胞系淋巴瘤细胞Raji细胞和CD19抗原阴性的T细胞系白血病细胞株Molt-3、急性红白血病细胞株K562细胞的反应性来完成,结果显示,2E8-SL-PE能特异性地与Nalm-6和Raji细胞结合,阳性率分别为89.44%和88.73%,而几乎不与Molt-3和K562细胞结合,后两者的阳性率分别仅为1.95%和1.39%,说明该免疫脂质体具有明显的靶向识别作用。我们所制备的2E8-SL-PE对靶细胞(Nalm-6)的结合效率是无抗体标记的普通脂质体SL-PE对靶细胞结合效率的15倍,显著高于其他作者所报道的连接其他克隆号的抗人CD19单抗的免疫脂质体对靶细胞的结合效率,后者较普通SL对靶细胞的结合效率仅2倍。
本发明的另一个目的是提供该CD19单克隆抗体免疫脂质体(2E8-SL-NCTD)在特异性靶向杀伤B淋巴细胞白血病及其干细胞中的应用。所述B淋巴细胞为白血病细胞株Nalm-6细胞、B细胞系淋巴瘤细胞Raji细胞和CD19抗原阴性的T细胞系白血病细胞株Molt-3、急性红白血病细胞株K562细胞。
我们的研究证实2E8-SL-NCTD能通过受体介导内吞机制内化到Nalm-6细胞内,将NCTD靶向传输到Nalm-6细胞内而发挥杀靶细胞作用。2E8-SL-NCTD对CD19阳性的Nalm-6细胞的生长抑制作用呈明显时间和剂量的依赖性。NCTD的浓度在10μM-50μM的浓度范围内,2E8-SL-NCTD对CD19阳性的Nalm-6细胞72小时的抑制率(44.40%-97.17%)显著高于CD19阴性的Molt-3细胞(7.04%-58.23%)(P<0.01)。当NCTD的浓度为20μM时,2E8-SL-NCTD对CD19阳性的Nalm-6细胞24,48,72小时的抑制率分别为18.41%,47.44%,68.13%,显著高于2E8-SL-NCTD对CD19阴性的Molt-3细胞24,48,72小时的抑制率(5.99%,10.05%,13.80%)(P<0.01)。Prohibit分析显示2E8-SL-NCTD对Molt-3细胞72小时IC50值(45.90μM)是Nalm-6细胞(14.52μM)的3倍。以上结果提示2E8-SL-NCTD能对CD19+的肿瘤细胞或B系白血病干细胞(CD19+)产生特异性的细胞毒作用,而减少对正常组织或正常干细胞(CD 19-)非特异性毒性作用。
本发明的有益之处是:ZCH-4-2E8修饰的NCTD立体空间稳定的脂质体(sterically stabilized immunolipsome,SL)是利用本实验自行研制的抗CD19高亲和力的IgM亚类的单抗(ZCH-4-2E8),通过胶束转移法与NCTD空间稳定脂质体成功连接,制备而成的一种新型构像的靶向B淋巴细胞白血病的免疫脂质体(2E8-SL-NCTD)。
2E8所结合的抗原具有95kDa的分子量,该单抗在人体各组织细胞中的表达谱与其他抗人抗人CD19单抗类似,但它不能阻滞标准进口抗人抗人CD19单抗(克隆名SJ25-C1)与B淋巴细胞的结合,说明其识别的抗原表位与标准进口抗人CD19单抗(克隆名SJ25-C1)不同。
ZCH-4-2E8修饰的NCTD空间稳定脂质体是一种新型构像的免疫脂质体,国际上尚无ZCH-4-2E8修饰的NCTD空间稳定脂质体靶向治疗B淋巴细胞白血病、淋巴瘤的研究报道。该免疫脂质体(2E8-SL-NCTD)有望能特异性靶向杀伤B淋巴细胞白血病干细胞及其子代细胞,具有彻底根治急慢性B淋巴细胞白血病和淋巴瘤的潜在应用前景。
我们采用ZCH-4-2E8修饰的NCTD空间稳定脂质体(2E8-SL-NCTD)并非天然存在,而是经过一系列繁琐而复杂的技术过程制备而成,该制剂可靶向治疗B系恶性肿瘤。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1
本发明提供的一种抗人CD19单抗免疫脂质体,通过以下步骤制备:
(1)ZCH-4-2E8单抗的研制:参照专利号:ZL200610052289.7实施例1-2公开的方法制备。基本按Koller & Milstein报告的鼠-鼠杂交瘤经典方法进行[1]。以急性B淋巴细胞白血病细胞作为免疫原,将107白血病细胞给8周龄雌性Balb/C小鼠作腹腔注射4次,每周一次,最后一次注射后第4天,脱臼杀死小鼠,无菌取脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株NS-1(购自美国ATCC公司)细胞按6∶1混合,以50%聚乙二醇(PEG,美国Sigma公司,分子量3350道尔顿)溶液作为融合媒介进行细胞融合,于96孔板(美国Falcon公司)中进行选择性培养,于融合后第9~20天,隔日用免疫原细胞对培养上清进行间接免疫荧光法(IIF)筛选。阳性孔细胞经3次克隆化并连续2次100%孔达到阳性,即建立了能持续分泌2E8单抗的杂交瘤细胞。该细胞分泌的2E8抗体经第6届国际人类白细胞分化抗原协作组会议(6th International Workshop andConference on Human Leukocyte Differentiated Antigens,HLDA6)鉴定,正式命名为CD19抗体[2]。2E8单抗的免疫球蛋白重链可变区基因(VH2E8)和轻链可变区基因(VL2E8)已经被克隆和测序。抗人CD19鼠免疫球蛋白重链可变区基因见SEQ ID NO 1核苷酸序列及SEQ ID NO 3氨基酸序列;抗人CD19鼠免疫球蛋白轻链可变区基因见SEQ ID NO 2的核苷酸及SEQ ID NO 4氨基酸序列。
该杂交瘤细胞经8个多月的连续传代培养和反复冻融,其分泌2E8单抗的能力稳定。以其腹水(荧光法效价1∶3200)或培养上清(荧光法效价1∶16)作为2E8单抗的来源。2E8腹水经凝胶层析柱纯化[3],经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行电泳分析,抗体纯度达到99%以上,用于下一步研究。
(2)2E8修饰的立体空间稳定性去甲斑蝥素脂质体(sterically stabilizedliposome-NCTD modified by antibody 2E8,2E8-SL-NCTD)的制备:首先采用薄膜分散法[4],制备立体空间稳定性去甲斑蝥素脂质体(SL-NCTD)。将大豆卵磷脂(PC)、胆固醇(CHO),甲氧基-聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-PE)按2∶1∶0.01的摩尔比溶于氯仿中,减压旋转蒸发去除有机溶剂,形成一层均匀脂质薄膜,然后在含有NCTD的HBS(HEPES Buffered Saline)缓冲液中[25mMHEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸),140mMNaCl,pH7.4,NCTD/PC(w/w)=1∶20]水化,直至薄膜完全从瓶壁上洗脱下来,形成脂质体混悬液(整个过程注意避氧)。此脂质体混悬液通过一系列孔径为1.2,0.4,0.1微米的聚碳酸脂膜整粒10次,使粒径基本一致。未被包封的NCTD经Sephadex G-50,以HBS溶液(25mMHEPES,140mM NaCl,pH7.4)洗脱去除,并收集,以备高效液相检测NCTD的包封率。SephadexG-50湿装柱法(玻璃柱:1cm×30cm,),分别取NCTD,空白脂质体和NCTD脂质体和悬液1ml,过SephadexG-50,流速1ml/min,每分钟收集一份洗脱液,共收集25份。分光光度法测量NCTD在213nm处的吸光值(A)。以吸光值(A)对洗脱体积作流出曲线(图1),脂质体主要在6-11ml流出,游离NCTD主要在14-16ml流出。
(3)胶束准备:mPEG2000-PE(甲氧基-聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺)和Mal-PEG2000-DSPE(马来酰亚胺-聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺)按4∶1摩尔比溶于氯仿中,减压旋转蒸发(0.06-0.07MPa,40℃)去除有机溶剂并真空过夜干燥。而后在HEPES溶液中(25mM HEPES,pH7.4,胶束摩尔浓度10mM)65℃水化1小时,水化时不断搅拌;
(4)2E8与胶束连接:2E8单抗通过Mal-PEG2000-DSPE与脂质体连接[5]。即:10mg/ml 2E8单抗与Traut′s试剂(2-亚氨基硫烷盐酸盐)按1∶50摩尔比反应(增加单抗分子中二硫键),未反应的Traut′s通过Sephadex G-50,以HBS为洗脱液去除(参见图2A:2E8单抗的硫醇化)。然后,2E8以浓度180ug 2E8/umol PC与胶束(mPEG2000-PE∶Mal-PEG2000-DSPE=4∶1)在HBS中,4℃孵育反应过夜(反应过程注意避氧)(参见图2B:2E8与胶束(Mal-PEG2000-DSPE/mPEG-PE)的连接)。
(5)2E8单抗从胶束转移至脂质体:将所获得的抗体与胶束的混悬液通过0.22um的微孔滤膜以去除未连接单抗的胶束和自身发生聚集的胶束。过滤后的悬液与先前制备的SL-NCTD,按磷脂摩尔比0.05∶1(脂质体中的磷脂主要是PC),60℃敷育1小时,待其冷却后,过Sepharose CL-4B色谱柱,以HBS平衡并洗脱柱子,去除未转移的2E8单抗(参见图2C:2E8胶束转移至空间稳定去甲斑蝥素脂质体(NCTD-SL)表面)。Sepharose CL-4B湿装柱(直径1.5cm,柱床体积44ml),分别取0.5ml游离2E8(2E8浓度:2mg/ml)与0.5mlSL-NCTD(NCTD浓度:0.5mg/ml),经Sepharose CL-4B,以HBS洗脱。流速1ml/min,每2ml收集一份洗脱液,分光光度计检测每份洗脱液在280nm(抗体)和213nm(NCTD)处的吸光值(A),以吸光值对流份号作流出曲线。在213nm处所收集的部分为纯化的CD19单克隆抗体修饰的长循环去甲斑蝥素脂质体即2E8-SL-NCTD(图3)。图2为2E8-SL-NCTD与游离2E8经Sepharose CL-4B分离,2E8-SL-NCTD主要在第7-10个流份出峰,游离2E8主要在第15-18流份出峰,两部分完全分离。
实施例22E8-SL-NCTD的评价及靶向杀伤作用
(1)SDS-PAGE和流式细胞术证明2E8与SL-NCTD连接成功。
图4:SDS-PAGE证明2E8-SL-NCTD在制备过程中的每一步,2E8单抗均保持完整形式(即泳道2,3,5均有完整的重链和轻链),其中泳道1:蛋白分子量,泳道2:游离2E8,泳道3:与胶束连接后的(2E8-Mal-PEG-DSPE),泳道4:空白,泳道5:2E8与SL-NCTD连接并经Sepharose CL-4B纯化去除游离的2E8后,所得的2E8-SL-NCTD。
图5:流式细胞术证实,2E8与脂质体连接成功。(A)SL-PE与Nalm-6细胞孵育后,细胞表面未探测到任何荧光。(B)2E8-SL-PE与Nalm-6细胞孵育后,细胞表面可同时探测到绿色荧光(FITC)和红色荧光(PE),右上象限FITC与PE成一一对应的直线关系。(C)SL-PE与Molt-3细胞孵育后,细胞表面未探测到任何荧光。(D)2E8-SL-PE与Molt-3细胞孵育后,细胞表面也未探测到任何荧光。
(2)BCA蛋白检测试剂盒和Stewart法[6]检测2E8与SL-NCTD连接效率为(58.70±3.32)%。根据2E8单抗的分子量(900KD)和每个脂质体约包含的磷脂分子数(80000)[7],计算出脂质体表面2E8抗体的浓度为9IgM/liposome。
(3)高效液相测定NCTD的包封率为(46.5±2.21)%。
(4)透射电镜观察脂质体的形态(图6),激光散射粒径测定仪检测2E8-SL-NCTD的平均粒径为118.32±2.03nm(图7)。
(5)ZCH-4-2E8(CD19)修饰的NCTD空间稳定的脂质体特异性靶向结合CD19高表达的肿瘤细胞,并通过受体介导内化作用将NCTD靶向传输到肿瘤细胞内,参见图8,图中:(A)流式细胞术分析2E8-SL-PE、SL-PE对Nalm-6细胞的靶向效率。2E8-SL能特异的靶向CD19高表达的Nalm-6细胞,靶向效率为89.44%。SL对Nalm-6细胞的靶向效率仅为6.13%。(B)流式细胞术分析2E8-SL-PE、SL-PE对Molt3细胞的靶向效率。2E8-SL-PE和SL对Molt3细胞的靶向效率没有显著性差异,分别仅为1.87%和1.98%。(C)流式细胞术分析2E8-SL-PE和SL对CD19+(Nalm-6,Raji细胞)和CD19-(Molt3,K562细胞)细胞的靶向效率。2E8-SL-PE能特异的靶向CD19高表达的肿瘤细胞,其对CD19高表达的肿瘤细胞的靶向效率显著高于CD19低表达的肿瘤细胞;而SL-PE对CD19高表达和CD19低表达的肿瘤细胞的靶向效率无显著性差异。(D)激光共聚焦显微镜观察2E8-SL-PE和SL-PE对Nalm-6细胞和Molt-3细胞的靶向差异。原始图像放大63倍,分别以0.1μm薄层切片扫描细胞。2E8-SL-PE处理组,在Nalm-6细胞表面(核染蓝色荧光)同时可观察到红色荧光(标记脂质体)和绿色荧光(标记2E8),在Molt-3细胞(核染蓝色荧光)表面基本未观察到任何荧光。SL-PE处理组与对照组,Nalm-6细胞和Molt-3细胞(核染蓝色荧光)表面也基本未观察到任何荧光。(E)激光共聚焦显微镜观察2E8-SL-PE在Nalm-6细胞中的内化。原始图像放大63倍,细胞分别在3μm,4μm,6μm的层面以0.1μm薄层切片扫描。30分钟,仅在Nalm-6细胞表面可探测到红色荧光;4小时,胞浆中可探测到部分红色荧光;8小时,整个胞浆中充满均匀一致的红色荧光。
(6)MTT法检测2E8-SL-NCTD对Nalm-6细胞和Molt-3细胞的靶向杀伤效率(图9):(A)2E8-SL-NCTD对CD19阳性的Nalm-6细胞的抑制作用呈明显时间和剂量的依赖性。在10μM-50μM的浓度范围内,2E8-SL-NCTD对CD19阳性的Nalm-6细胞72小时的抑制率(44.40%-97.17%)显著高于CD19阴性的Molt-3细胞(7.04%-58.23%)(P<0.01)。(B)当NCTD的浓度为20μM时,2E8-SL-NCTD对CD19阳性的Nalm-6细胞24,48,72小时的抑制率分别为18.41%,47.44%,68.13%,显著高于2E8-SL-NCTD对CD19阴性的Molt-3细胞24,48,72小时的抑制率(5.99%,10.05%,13.80%)(P<0.01)。(C)2E8-SL-NCTD对Molt-3细胞72小时IC50值(45.90μM)是Nalm-6细胞(14.52μM)的3倍。
本发明涉及的参考文献:
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本发明涉及的序列
<110>浙江大学
<120>CD19单克隆抗体免疫脂质体的制备及用途
<160>8
<170>Patent In Version 2.1
<210>1
<211>366
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>101a 79c 102g 84t
<400>1
GAGGTGAAGC TGGTGGAGTC GGGACCTGAG CTGAAGAAGC CTGGAGAGAC AGTCAAGATC 60
TCCTGCAAGG CTTCCGGGTA TTCCTTCAGA AACTATGGAA TGAACTGGGT GAAGCAGGCT 120
CCAGGAAAGG GTTTAAAGTG GATGGGCTGG ATAAACACCT ACAGTGGAGA GCCAACACAT 180
GCTGATGACT TCAAGGGACG GTTTGCCTTC TCTTTGGAAA CCTCAGCTAG TACTGCCTAT 240
TTGCAGATCA ACAACCTCAA AAATGAGGAC ATGGCTACAT ATTTCTGTGC AAGACGGGAT 300
TTCGACGGAT ATTACTATGC TATGGACTAC TGGGGTCAAG GAACCTCAGT CACCGTCTCC 360
TCAGAG 366
<210>2
<211>321
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>92a 71c 74g 84t
<400>2
GATATCCAGA TGACACAGAC TTCATCCTAC TTGTCTGTAT CTCTAGGAGG CAGAGTCACC 60
ATTACTTGCA AGGCAAGTGA CCACATTAAT AATTGGCTAG CCTGGTATCA GCAGAAACCA 120
GGAAATGCTC CTAGGCTCTT AATATCTGGT GCAACCAGTT TGGCAACTGG GATTCCTTCA 180
AGATTCAGTG GCAGTGGATC TGGAAAGGAT TACACTCTCA GCATTACCAG TCTTCAGACT 240
GAAGATGATG CTACTTATTA CTGTCAACAG TATTGGAGTA CTCCGTGGAC GTTCGGTGGA 300
GGCACCAAGC TGGAAATCAA A 321
<210>3
<211>122
<212>
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>按照大肠杆菌偏爱的密码子,设计了酶切位点和接头肽的编码hPTH(1-34)的合成基因
<400>3
EVKLVESGPE LKKPGETVKI SCKASGYSFR NYGMNWVKQA PGKGLKWMGWINTYSGEPTH 60
ADAFKGRFAF SLETSASTAY LQINNLKNED MATYFCARRD FDGYYYAMDY WGQGTSVTVS 120
SE 122
<210>4
<211>107
<212>
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>4
DIQMTQTSSY LSVSLGGRVT ITCKASDHIN NWLAWYQQKP GNAPRLLISG ATSLATGIPS 60
RFSGSGSGKD YTLSITSLQT EDDATYYCQQ YWSTPWTFGG GTKLEIK 107
<210>5
<211>20
<212>
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>重链可变区5′引物序列
<400>5
GAG GTG AAG CTG GTG GAG TC
<210>6
<211>39
<212>
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>重链可变区3′引物序列
<400>6
GGA GAC GAG GGG GAA AAG CTT TGG GAA GGA CTG ACT CTC
<210>7
<211>21
<212>
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>轻链可变区5′引物序列
<400>7
GAT ATC CAG ATG ACA CAG ACT
<210>8
<211>21
<212>
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>轻链可变区3′引物序列
<400>8
GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC