JP7398677B2 - ウテログロビンを構造基盤とする二重特異性ポリペプチド - Google Patents
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Description
他方、組換え技術を用いることで異なる二つの結合特性を有する二重特異性抗体を創出することができる。二重特異性抗体は、細胞表面上の二つの受容体を同時に阻害でき、二つのリガンドと同時に結合でき、二つの異なる受容体を結合させることでシグナル伝達が可能であり、および細胞同士を相互作用させることができる、といった有用性を示す(非特許文献1)。
本発明者らは、ウサギウテログロビンの構造解析からヒトウテログロビンの立体構造を推定し、その推定構造からヒトウテログロビンがホモ二量体を形成する際に会合している部位に着目した。結果、会合している部位にアミノ酸残基の変異を加えることで、効率的にヘテロ二量体を形成できることを見出した。
<ヘテロ二量体ウテログロビンを規定する二重特異性ポリペプチド>
[1]
ヘテロ二量体ウテログロビンを構造基盤とする二重特異性ポリペプチド。
[2]
ヘテロ二量体ウテログロビンはA鎖およびB鎖を含み、ここに、A鎖およびB鎖は、互いに異なり、野生型ウテログロビンモノマーにおいて1個または数個のアミノ酸残基の変異を有し、そしてその変異に由来する会合によってヘテロ二量体を形成させる、[1]記載の二重特異性ポリペプチド。
[3]
A鎖およびB鎖が有する変異がアミノ酸残基の対置換であり、その対置換により会合が生じ、それによりヘテロ二量体ウテログロビンの形成が促進し、かつホモ二量体ウテログロビンの形成が阻害される、[1]または[2]記載の二重特異性ポリペプチド。
[4]
アミノ酸残基の対置換が、配列番号1で表されるアミノ酸配列における5番目のセリン(S)および68番目のロイシン(L)、27番目のロイシン(L)および68番目のロイシン、28番目のフェニルアラニン(F)および66番目のセリン(S)、33番目のアスパラギン酸(D)および51番目のリジン(K)、ならびに44番目のロイシン(L)および47番目のスレオニン(T)での一対の置換である、[3]記載の二重特異性ポリペプチド。
[5]
アミノ酸残基の対置換が、A鎖における、配列番号1で表されるアミノ酸配列の33番目のアスパラギン酸(D)およびB鎖における51番目のリジン(K)での一対の置換である、[4]記載の二重特異性ポリペプチド。
[6]
対置換が、A鎖において、配列番号1で表されるアミノ酸配列の33番目のアスパラギン酸(D)を、リジン(K)、アルギニン(R)またはヒスチジン(H)に置換し、かつB鎖において51番目のリジン(K)を、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)に置換する、[4]記載の二重特異性ポリペプチド。
[7]
対置換が、A鎖において、配列番号1で表されるアミノ酸配列の33番目のアスパラギン酸(D)をリジン(K)に置換し、かつB鎖において51番目のリジン(K)をグルタミン酸(E)に置換するものである、[6]記載の二重特異性ポリペプチド。
[8]
ウテログロビンA鎖およびB鎖がジスルフィド結合している、[1]から[7]のいずれか記載の二重特異性ポリペプチド。
[9]
ウテログロビンA鎖およびB鎖がともに、配列番号1で表されるアミノ酸配列の44番目のロイシン(L)、34番目のメチオニン(M)および59番目のロイシン(L)の中から選ばれる少なくとも1つがシステイン(C)に置換する変異を有する、[1]から[8]のいずれか記載の二重特異性ポリペプチド。
[10]
ウテログロビンがヒトウテログロビンである、[1]から[9]のいずれか記載の二重特異性ポリペプチド。
[10-2]
アミノ酸残基の対置換が、A鎖における、配列番号1で表されるアミノ酸配列における29番目のセリン(S)がリジン(K)に置換していること、B鎖における、配列番号1で表されるアミノ酸配列における62番目のリジン(K)がアスパラギン酸(D)にかつ29番目のセリン(S)がアスパラギン酸(D)に置換していることである、[3]記載の二重特異性ポリペプチド。
[10-3]
アミノ酸残基の対置換が、A鎖における、配列番号1で表されるアミノ酸配列の28番目のフェニルアラニン(F)およびB鎖における66番目のセリン(S)での一対の置換である、[3]記載の二重特異性ポリペプチド。
[11]
ヘテロ二量体ウテログロビンA鎖が第1の結合領域と連結している第1のポリペプチド、およびヘテロ二量体ウテログロビンB鎖が第1の結合領域と異なる第2の結合領域と連結している第2のポリペプチドを含む、[1]から[10]、[10-2]および[10-3]のいずれか記載の二重特異性ポリペプチド。
[12]
受容体もしくはその断片、癌抗原、MHC抗原、分化抗原からなる群から選択される1つまたはそれ以上の標的分子に結合する、[1]~[11]のいずれか記載の二重特異性ポリペプチド。
[13]
標的分子が癌抗原の標的分子に結合する、[1]~[12]のいずれか記載の二重特異性ポリペプチド。
[14]
第1または第2のポリペプチドのいずれかが癌抗原に結合する、[1]~[13]のいずれか記載の二重特異性ポリペプチド。
[15]
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドにおいて、A鎖と第1の結合領域との連結およびB鎖と第2の結合領域との連結が、該領域の特異性を破壊しない態様である、[11]記載の二重特異性ポリペプチド。
[16]
A鎖と第1の結合領域との連結およびB鎖と第2の結合領域との連結がリンカーを介する、[15]記載の二重特異性ポリペプチド。
[17]
リンカーが配列番号2で示されるアミノ酸配列を有する、[16]記載の二重特異性ポリペプチド。
[18]
第1の結合領域および第2の結合領域がそれぞれ一価の特異性を有する、[1]から[17]のいずれか記載の二重特異性ポリペプチド。
[19]
第1の結合領域および第2の結合領域の一方または両者が、少なくとも1つのさらなる結合領域を該領域の特異性を破壊しない態様で連結している、[1]から[18]のいずれか記載の二重特異性ポリペプチド。
<抗体-薬物複合体>
[20]
[1]から[19]のいずれか記載の二重特異性ポリペプチドおよび薬物を含む複合体。
<医薬組成物>
[21]
[1]から19]のいずれか記載の二重特異性ポリペプチドを含有する医薬組成物。
[22]
[20]記載の複合体を含有する医薬組成物。
[23]
ヘテロ二量体ウテログロビンA鎖が第1の結合領域と連結している第1のポリペプチド、およびヘテロ二量体ウテログロビンB鎖が第1の結合領域と異なる第2の結合領域と連結している第2のポリペプチドを含む、[1]から[14]のいずれか記載の二重特異性ポリペプチドを製造する方法であって、
a)第1のポリペプチドをコードする核酸を含む第1のベクターを用意し、
b)第2のポリペプチドをコードする核酸を含む第2のベクターを用意し、
c)第1のベクターおよび第2のベクターを細胞に同時トランスフェクションし、得られたトランスフェクト体を培養し、そして
d)第1および第2のポリペプチドを含むヘテロ二量体を回収する、
該二重特異性ポリペプチドを製造する方法。
[24]
ヘテロ二量体ウテログロビンA鎖が第1の結合領域と連結している第1のポリペプチド、およびヘテロ二量体ウテログロビンB鎖が第1の結合領域と異なる第2の結合領域と連結している第2のポリペプチドを含む、[1]から[14]のいずれか記載の二重特異性ポリペプチドを製造する方法であって、
a)第1のポリペプチドを発現する第1の細胞を用意し、
b)第2のポリペプチドを発現する第2の細胞を用意し、
c)第1の細胞および第2の細胞を共培養し、そして
d)第1および第2のポリペプチドを含むヘテロ二量体を回収する、
該二重特異性ポリペプチドを製造する方法。
[25]
ヘテロ二量体ウテログロビンA鎖が第1の結合領域と連結している第1のポリペプチド、およびヘテロ二量体ウテログロビンB鎖が第1の結合領域と異なる第2の結合領域と連結している第2のポリペプチドを含む、[1]から[14]のいずれか記載の二重特異性ポリペプチドにおいて、第1のポリペプチドまたは第2のポリペプチドをコードする核酸。
[26]
[25]記載の核酸を含む、ベクター。
[27]
[26]記載のベクターを含む、細胞。
[28]
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドをコードする核酸を含む[25]記載のベクターをともに含む、[26]記載の細胞。
[29]
細胞が大腸菌である、[27]または[28]記載の細胞。
[30]
第1のポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含む細胞、および第2のポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含む細胞を含有する共培養物。
[31]
細胞が大腸菌である、[30]記載の共培養物。
[32]
A鎖およびB鎖を含み、A鎖およびB鎖は、互いに異なり、野生型ウテログロビンモノマーにおいて1個または数個のアミノ酸残基の変異を有し、そしてその変異に由来する会合によってヘテロ二量体を形成する、ヘテロ二量体ウテログロビン。
[33]
A鎖およびB鎖が有する変異がアミノ酸残基の対置換であり、その対置換により会合が生じ、それによりヘテロ二量体ウテログロビンの形成が促進し、かつホモ二量体ウテログロビンの形成が阻害される、[32]記載のヘテロ二量体ウテログロビン。
[34]
対置換に由来する親和性および反発性の静電的相互作用により会合が生じ、それによりヘテロ二量体ウテログロビンの形成が促進し、かつホモ二量体ウテログロビンの形成が阻害される、[33]記載のヘテロ二量体ウテログロビン。
[35]
アミノ酸残基の対置換が、配列番号1で表されるアミノ酸配列における5番目のセリン(S)および68番目のロイシン(L)、27番目のロイシン(L)および68番目のロイシン、28番目のフェニルアラニン(F)および66番目のセリン(S)、33番目のアスパラギン酸(D)および51番目のリジン(K)、ならびに44番目のロイシン(L)および47番目のスレオニン(T)での一対の置換である、[34]記載のヘテロ二量体ウテログロビン。
[36]
アミノ酸残基の対置換が、A鎖における、配列番号1で表されるアミノ酸配列の33番目のアスパラギン酸(D)およびB鎖における51番目のリジン(K)での一対の置換である、[35]記載のヘテロ二量体ウテログロビン。
[37]
対置換が、A鎖において、配列番号1で表されるアミノ酸配列の33番目のアスパラギン酸(D)を、リジン(K)、アルギニン(R)またはヒスチジン(H)に置換し、かつB鎖において51番目のリジン(K)を、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)に置換するものである、[36]記載のヘテロ二量体ウテログロビン。
[38]
対置換が、A鎖において、配列番号1で表されるアミノ酸配列の33番目のアスパラギン酸(D)をリジン(K)に置換し、かつB鎖において51番目のリジン(K)をグルタミン酸(E)に置換するものである、[35]記載のヘテロ二量体ウテログロビン。
[39]
ウテログロビンA鎖およびB鎖がジスルフィド結合している、[32]から[38]のいずれか記載のヘテロ二量体ウテログロビン。
[40]
ウテログロビンA鎖およびB鎖がともに、配列番号1で表されるアミノ酸配列の44番目のロイシン(L)、34番目のメチオニン(M)および59番目のロイシン(L)の中から選ばれる少なくとも1つがシステイン(C)に置換する変異を有する、[32]から39]のいずれか記載のヘテロ二量体ウテログロビン。
[41] ヒトウテログロビンである、[32から40のいずれか記載のヘテロ二量体ウテログロビン。
ウテログロビンは、構造的には同一のモノマー2個が静電的に会合しているホモ二量体のポリペプチドである(Nature structural biology 1994,vol.1, No.8,538)。ヒトの野生型ウテログロビンモノマーのアミノ酸配列を配列番号1に示す。野生型ウテログロビンは比較的低分子量(15.8 kDa)の糖鎖が存在しないタンパク質であり、その性質は高い溶解性とpH安定性を兼ね備え、そしてタンパク分解酵素に対しても耐性である(JBC 2009,vol.284,No.39, 26646.)。
なお、野生型ヒトウテログロビンにおける一方のモノマーの33Dと他方のモノマーの51Kとが相互に会合していることは、それらを一定アミノ酸残基と対置換することでヘテロ二量体が形成されることが本件明細書の実施例において実験的に証明されたので、事実であることが明らかになった。
これらの事実および推測に基づき、本発明は、ヘテロ二量体ウテログロビンを基本とする種々の発明を提供する。
Swiss-model(swissmodel.expasy.org)においてヒトウテログロビンの配列を入力し、アミノ酸配列の相同性からモデルを構築する。最もスコアのよいものを選別、得られたPDBファイルをPymol(pymol.org)において表示させる。
・原子間距離はmeasurementタブによって算出される。表示させたモデルを図3-1および図3-2に示す。
表1中、1行目は、A鎖における、配列番号1で表されるアミノ酸配列の5番目のシステイン(S)およびB鎖における68番目のロイシン(L)での一対の置換を意味する。以下の行において同様である。なお、A鎖、B鎖は相互に変換可能である。
本発明は一つの態様として、野生型ウテログロビンの各モノマーにおける親和性の静電的相互作用を行っているアミノ酸残基をそれぞれ変異することにより、ヘテロ二量体の形成を促進し、かつホモ二量体の形成を阻害する。本発明では、野生型ウテログロビンにおいて互いに親和性の相互作用を行う各モノマーにおけるアミノ酸残基の一方を反発性の相互作用を行うアミノ酸残基にそれぞれ変異することによって、「対置換」を成立させる。即ち、1つの対置換を有するヘテロ二量体ウテログロビンは、A鎖中の1つのアミノ酸変異およびB鎖中の別の1つのアミノ酸変異を含有する。この態様を「野生置換型」と呼ぶ。
対置換が、A鎖において、配列番号1で表されるアミノ酸配列の33番目のアスパラギン酸(D)をリジン(K)に置換し、かつB鎖において51番目のリジン(K)をグルタミン酸(E)に置換するものであるものが好ましい。
置換部位5-68での例で説明する。1行目から、A鎖にS5DかつB鎖にL68Rを導入し(1つ目の対置換)、さらに2行目から、A鎖にL68DかつB鎖にS5K導入する(2つ目の対置換)。この場合、A鎖はS5DおよびL68Dの2つの変異を有する変異体になり、B鎖はS5KおよびL68Rの2つの変異を有する変異体になる。このことによって、対置換同士の組が成立する。
さらに詳細には、置換部位5-68での例として、A鎖およびB鎖の対置換は、
1行目:S5D-L68R, S5D-L68K, S5D-L68H, S5E-L68R, S5E-L68K, S5E-L68Hの6つ、
2行目:L68D-S5K, L68D-S5R, L68D-S5H, L68E-S5K, L68E-S5R, L68E-S5Hの6つ、
で、6+6=12通りある。なお、各1つの対置換を導入したヘテロ二量体も本発明の範囲内である。
1行目と2行目から各1つを選択した対置換の組み合わせは6×6=36通りである。よって、置換部位5-68におけるヘテロ二量体ウテログロビンの合計数は、12+36=48通りとなる。
他の一対の置換27-68、44-47、および29-62において同様である。
上記のようなヘテロ二量体ウテログロビンはさらに、別の変異を有することができる。例えば、本発明のヘテロ二量体ウテログロビンは、ウテログロビンA鎖およびB鎖がジスルフィド結合を形成することができる。ジスルフィド結合形成とは、1つまたは2つのポリペプチド中に存在する2つのシステイン間で共有結合を形成する過程を意味し、この結合は「-S--S-」として図式化される。本発明のヘテロ二量体ウテログロビンは、具体的には、ウテログロビンA鎖およびB鎖がともに、配列番号1で表されるアミノ酸配列の44番目のロイシン(L)、34番目のメチオニン(M)および59番目のロイシン(L)の中から選ばれる少なくとも1つがシステイン(C)に置換する変異を有することができる。これにより、本発明のヘテロ二量体ウテログロビンおよび二重特異性ポリペプチドは安定性が向上し、タンパク質の生産量が格段に上昇する。
本発明において、「二重特異性ポリペプチド」とは、少なくとも、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含む分子である。即ち、本発明の「二重特異性ポリペプチド」は、ヘテロ二量体ウテログロビンA鎖が第1の結合領域と連結している第1のポリペプチド、およびヘテロ二量体ウテログロビンB鎖が第1の結合領域と異なる第2の結合領域と連結している第2のポリペプチドを含む。好ましくは、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドにおいて、A鎖と第1の結合領域との連結およびB鎖と第2の結合領域との連結は、該領域の特異性を破壊しない態様である。
MHC抗原には、MHCクラスI抗原とMHCクラスII抗原に大別され、MHCクラスI抗原にはHLA-A、-B、-C、-E、-F、-G、-Hが含まれ、MHCクラスII抗原にはHLA-DR、-DQ、-DPが含まれる。
分化抗原には、CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6などの分化抗原群が含まれる。
本発明は別の態様として、本発明の二重特異性ポリペプチドおよび薬物が共有結合してなる複合体、ADC(antibody-drug conjugate)複合体を含む。
通常、薬物を全身投与すると、排除しようとする腫瘍細胞だけでなく、正常細胞にまでも許容されないレベルの毒性が生じ得る(Baldwin等, (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986): 603-05)。従って、毒性を最小限にしつつ最大限の有効性を追求し、癌治療において腫瘍細胞を殺すまたは阻害するための薬物を局所的に運搬するため、抗体-薬剤複合体が使用される(Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614;米国特許第4975278号)。同様、本発明の二重特異性ポリペプチドは、対応する抗原やリガンドに対して結合特性を有する一方で、多くの薬物分子は癌細胞を選択的に殺傷しないため、癌治療には用いにくい欠点がある。よって、本発明の二重特異性ポリペプチドと毒性の強い薬物、例えば毒素との結合により、高度に選択的かつ特異的な薬物複合体とすることができる。
本発明は別の態様として、ヘテロ二量体ウテログロビンA鎖が第1の結合領域と連結している第1のポリペプチド、およびヘテロ二量体ウテログロビンB鎖が第1の結合領域と異なる第2の結合領域と連結している第2のポリペプチドを含む、請求項10から13のいずれか記載の二重特異性ポリペプチドにおいて、第1のポリペプチドまたは第2のポリペプチドをコードする核酸に関する。
好ましい態様において、本発明は、ヘテロ二量体ウテログロビンA鎖が第1の結合領域と連結している第1のポリペプチド、およびヘテロ二量体ウテログロビンB鎖が第1の結合領域と異なる第2の結合領域と連結している第2のポリペプチドを含む、本発明の二重特異性ポリペプチドを製造する方法を提供する。本発明の製造方法の別の態様においては、本発明は、ポリペプチド間の会合が制御されるように、A鎖中の1つの変異およびB鎖中の別の変異の一対のアミノ酸残基の対置換を含む本発明のヘテロ二量体ウテログロビンを構造基盤とする二重特異性ポリペプチドの製造方法を提供する。そのような対置換の例は、表1から表4に示している。
本発明は、ヘテロ二量体ウテログロビンA鎖が第1の結合領域と連結している第1のポリペプチド、およびヘテロ二量体ウテログロビンB鎖が第1の結合領域と異なる第2の結合領域と連結している第2のポリペプチドを含む、本発明の二重特異性ポリペプチドにおいて、第1のポリペプチドまたは第2のポリペプチドをコードする核酸を提供する。
「核酸を改変する」とは、本発明における「改変」によって導入されるアミノ酸残基に対応するように核酸を改変することを言う。より具体的には、元(改変前)のアミノ酸残基をコードする核酸について、改変によって導入されるアミノ酸残基をコードする核酸へ改変することを言う。通常、目的のアミノ酸残基をコードするコドンとなるように、元の核酸に対して、少なくとも1塩基を挿入、欠失または置換するような遺伝子操作もしくは変異処理を行うことを意味する。即ち、元のアミノ酸残基をコードするコドンは、改変によって導入されるアミノ酸残基をコードするコドンによって置換される。このような核酸の改変は、当業者においては公知の技術、例えば、部位特異的変異誘発法、PCR変異導入法等を用いて、適宜実施することが可能である。
該ベクターとしては、挿入した核酸を安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしてはpBluescriptベクター(Stratagene社製)などが好ましいが、市販の種々のベクターを利用することができる。本発明のポリペプチドを生産する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でポリペプチドを発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であればpBESTベクター(プロメガ社製)、大腸菌であればpETベクター(Invitrogen社製)、培養細胞であればpME18S-FL3ベクター(GenBank Accession No. AB009864)、生物個体であればpME18Sベクター(Mol Cell Biol. 8:466-472(1988))などが好ましい。ベクターへの本発明のDNAの挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる(Current protocols in Molecular Biologyedit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons.Section 11.4-11.11)。
さらに、本発明は、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドをコードする核酸それぞれ含むベクターをともに含む細胞、ならびに第1のポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含む細胞、および第2のポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含む細胞の細胞混合物、共培養物を提供する。これら細胞および共培養物は、本発明の二重特異性ポリペプチドを好適に調製するのに適している。
ヘテロ二量体ウテログロビンA鎖が第1の結合領域と連結している第1のポリペプチド、およびヘテロ二量体ウテログロビンB鎖が第1の結合領域と異なる第2の結合領域と連結している第2のポリペプチドを含む、請求項1から13のいずれか記載の二重特異性ポリペプチドを製造する方法であって、
a)第1のポリペプチドをコードする核酸を含む第1のベクターを用意し、
b)第2のポリペプチドをコードする核酸を含む第2のベクターを用意し、
c)第1のベクターおよび第2のベクターを細胞に同時トランスフェクションし、得られたトランスフェクト体を培養し、そして
d)第1および第2のポリペプチドを含むヘテロ二量体を回収する、
該二重特異性ポリペプチドを製造する方法を提供する。
a)第1のポリペプチドを発現する第1の細胞を用意し、
b)第2のポリペプチドを発現する第2の細胞を用意し、
c)第1の細胞および第2の細胞を共培養し、そして
d)第1および第2のポリペプチドを含むヘテロ二量体を回収する、
該二重特異性ポリペプチドを製造する方法、を提供する。
変異型ウテログロビンの製造も同様である。
本発明は別の態様として、本発明の二重特異性ポリペプチド、および医薬的に許容される担体を含む組成物に関する。
アラニン:Ala:A
アルギニン:Arg:R
アスパラギン:Asn:N
アスパラギン酸:Asp:D
システイン:Cys:C
グルタミン:Gln:Q
グルタミン酸:Glu:E
グリシン:Gly:G
ヒスチジン:His:H
イソロイシン:Ile:I
ロイシン:Leu:L
リジン:Lys:K
メチオニン:Met:M
フェニルアラニン:Phe:F
プロリン:Pro:P
セリン:Ser:S
スレオニン:Thr:T
トリプトファン:Trp:W
チロシン:Tyr:Y
バリン:Val:V
EcoRI切断配列、マウスIgGκシグナルペプチドをコードするDNA配列、野生型ヒトウテログロビンモノマー全長をコードするDNA配列(NCBI)、リンカー配列GSSSSGSSSS、Hisタグおよびストップコドン配列、XhoI切断配列を含む遺伝子を合成した。合成した遺伝子および哺乳類発現ベクターであるpcDNA6.0 mycHisB(Invitrogen)をEcoRI(NEB)とXhoI(NEB)で切断した。切断した2つの産物をDNAライゲーションキットmighty mix(TAKARA)を用いて連結させ、野生型ウテログロビン哺乳類発現用プラスミドを作製した。
2-1:発現
トランスフェクション(形質導入)はExpiFectamine293 Transfection kit (Thermo Fisher Scentific)を用いて行った。手順は次の通りである。
Expi293F細胞(Invitrogen)をExpi293発現培地(Thermo Fisher Scentific)100mL中、3.0×106 細胞/mLとなるように37℃、125rpm、8% CO2条件下で培養した。実施例1にて調製したプラスミド[1]、[2]、[4]、[8]、[9]、[13]および[14]を100μgとOpti-MEM I 還元血清培地(Thermo Fisher Scentific)5mLを穏やかに混合し、室温で5分間静置した。ExpiFectamine293 試薬(Thermo Fisher Scentific)270μLとOpti-MEM I 還元血清培地(Thermo Fisher Scentific)5mLを穏やかに混合し、室温で5分間静置した。5分後、各プラスミド溶液とExpiFectamine溶液を穏やかに混合し、室温で20分間静置した。Expi293F細胞液100mLに混合溶液を穏やかに加え、37℃、125rpm、8% CO2で20時間培養後、ExpiFectamine 293 トランスフェクション・エンハンサー1(Transfection Enhancer 1、Thermo Fisher Scentific)500μLとExpiFectamine 293 トランスフェクション・エンハンサー2(Thermo Fisher Scentific)5mLを加えて37℃、125rpm、8% CO2条件下で1週間培養した。
1-1にて発現させて得られた[1]、[2]、[4]、[5]、[6] 、[8]、[9]、[10]、[11]、[13]、[14]、[15]および[16]のそれぞれの発現産物の精製はすべて以下のように行った。
培養液を遠心分離して上清を回収後、0.45umのフィルターでろ過した。ろ過した試料をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。カラムはHisTrap Excel 5mL(GE healthcare)を用い、カラムの平衡化、洗浄は50mM Hepes-NaOH pH7.5, 500mM NaClで行い、50mM Hepes-NaOH pH7.5, 500mM NaCl, 500mM イミダゾールで溶出した。溶出画分を回収し、50mM Hepes-NaOH pH7.5、4℃で一晩透析した。透析内液を回収し、陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。カラムはHiTrapQ HP 5mL(GE healthcare)を用い、50mM Hepes-NaOH pH7.5, 0-1M NaClの濃度勾配で溶出した。溶出画分を回収し、ゲルろ過クロマトグラフィーを行った。カラムはHiLoad16/600 Superdex75(GE healthcare)、移動相は50mM Hepes-NaOH pH7.5, 300mM NaClを用いた。溶出画分を回収し、Amicon Ultra15で濃縮した。
また、図4においてレーン[7]で示される電気泳動前の試料調製は次のように行った。ROBO4 scFv-変異型ウテログロビン(D33K)[4]発現産物および変異型ウテログロビン(K51E)発現産物[2]をモル比で1:1になるように混合し、氷上で1時間静置した。
同様の方法によって、scFv-F28SとS66Fをモル比で1:1に混合したもの[12]およびscFv-S29D,K62DとS29Kを混合したもの[17]を調製した。
実施例2にて得られた発現産物[1]-[6]、[8]-[11]、[13]-[16]の各溶液を0.2mg/mLとなるように50mM Hepes-NaOH pH7.5, 300mM NaClで希釈した。
[1]-[17]について、還元条件の電気泳動用試料は次のように調製した。
希釈したタンパク質溶液10μLに2-メルカプトエタノール0.5μLと2×Laemmli 試料緩衝液(BIO-RAD)9.5μLを加え、95℃で5分間加熱した。非還元条件の試料は希釈したタンパク質溶液10μLに2×Laemmli 試料緩衝液(BIO-RAD)10μLを加え、95℃で5分間加熱した。還元条件、非還元条件の各試料を10-20% グラジエントゲル(アトー)に1レーン当たり20μL適用し、25mM Tris, 192mM グリシン, 3.5mM SDS溶液中、25mAで60分間通電し、電気泳動を行った。泳動後のゲルを25%エタノール, 10%アセトニトリル, 0.1%クマシーブリリアントブルー250染色液で染色し、お湯で脱色した。
図4において、野生型ウテログロビンおよび変異型ウテログロビン(K51E)のモノマーの分子量は9.6kDa、ROBO4 scFvは25kDa、ROBO4 scFv-変異型ウテログロビン(D33K)(ROBO4 scFv-D33K)は36kDaである。構造解析の結果から、野生型ウテログロビンは分子間ジスルフィド結合を有し、ホモ二量体を形成していることが分かっている。還元条件下での電気泳動の結果から、[1]、[2]、[3]、[4]はモノマーの分子量にバンドが観察された。これは還元条件下ではジスルフィド結合が切断されるためである。[5]と[6]、[7]においてもK51EモノマーとROBO4 scFv-D33Kモノマーの分子量にバンドが存在していた。一方、非還元条件下ではジスルフィド結合は保持されるため、ウテログロビンはホモ二量体を形成しており、[1]と[2]では還元条件下と比較して高分子量側にバンドが観察された。ホモ二量体の分子量は19.2kDaであるので、バンドの位置は20kDa付近に確認できるはずだが、それよりも低分子量側に観察された。これは非還元条件下ではジスルフィド結合が保持されているため、純粋に分子量だけで分離できず、本来の分子量の位置よりも低分子量側にずれたと考えられる。
電気泳動の結果から、scFv-D33K_K51Eダブルトランスフェクションと共培養でscFv-D33K_K51Eのヘテロ二量体を形成していた。また、ヘテロ二量体の45kDaのバンドは結果[7]および[12]では存在していなかった。このため、scFv-D33KとK51Eを単に混ぜ合わせただけでは、ヘテロ二量体は形成しないことが判明した。
Claims (10)
- ヘテロ二量体ウテログロビンを構造基盤とする二重特異性ポリペプチドであって、
該ヘテロ二量体ウテログロビンは、野生型ウテログロビンモノマーにおいて1個のアミノ酸残基の変異を有する互いに異なるA鎖およびB鎖を含み、そしてその変異に由来する会合によってヘテロ二量体が形成され、ここに、A鎖は配列番号1で表されるアミノ酸配列の33番目のアスパラギン酸(D)からリジン(K)への変異(D33K変異)、およびB鎖は51番目のリジン(K)からグルタミン酸(E)への変異(K51E変異)を各々有し、
ヘテロ二量体ウテログロビンA鎖が第1の結合領域と連結している第1のポリペプチド、およびヘテロ二量体ウテログロビンB鎖が第1の結合領域と異なる第2の結合領域と連結している第2のポリペプチドを含む、二重特異性ポリペプチド。 - 受容体もしくはその断片、癌抗原、MHC抗原、分化抗原からなる群から選択される1つまたはそれ以上の標的分子に結合する、請求項1記載の二重特異性ポリペプチド。
- 標的分子が癌抗原である、請求項2記載の二重特異性ポリペプチド。
- 第1または第2のポリペプチドのいずれかが癌抗原に結合する、請求項3記載の二重特異性ポリペプチド。
- 第1の結合領域および第2の結合領域がそれぞれ一価の特異性を有する、請求項1から4のいずれか記載の二重特異性ポリペプチド。
- 請求項1から5のいずれか記載の二重特異性ポリペプチドおよび薬物を含む複合体。
- 請求項1から5のいずれか記載の二重特異性ポリペプチドを含有する医薬組成物。
- 請求項6記載の複合体を含有する医薬組成物。
- A鎖およびB鎖を含み、A鎖およびB鎖は、互いに異なり、野生型ウテログロビンモノマーにおいて1個のアミノ酸残基の変異を有し、そしてその変異に由来する会合によってヘテロ二量体を形成する、ヘテロ二量体ウテログロビンであって、
ここに、A鎖は配列番号1で表されるアミノ酸配列の33番目のアスパラギン酸(D)からリジン(K)への変異(D33K変異)、およびB鎖は51番目のリジン(K)からグルタミン酸(E)への変異(K51E変異)を各々有しているヘテロ二量体ウテログロビン。 - ヒトウテログロビンである、請求項9記載のヘテロ二量体ウテログロビン。
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