JP2002521316A - 炎症および線維症症状の治療における組換えヒトウテログロビンの使用 - Google Patents

炎症および線維症症状の治療における組換えヒトウテログロビンの使用

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JP2002521316A JP2000560856A JP2000560856A JP2002521316A JP 2002521316 A JP2002521316 A JP 2002521316A JP 2000560856 A JP2000560856 A JP 2000560856A JP 2000560856 A JP2000560856 A JP 2000560856A JP 2002521316 A JP2002521316 A JP 2002521316A
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クララジェン、インコーポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】 原発性癌細胞増殖と腫瘍転移の予防または治療のための、ならびに造血刺激のための組成物と方法が特許請求される。本発明はまた、組換えヒトウテログロビン（ｒｈＵＧ）を用いてウテログロビン受容体をターゲティングすることにより癌およびウテログロビン受容体関連症状を治療する方法に関する。また、ウテログロビン受容体の精製方法、およびそのような受容体を使用して、ウテログロビン構造類似体およびＵＧ受容体リガンドを同定する方法が開示および特許請求される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願の参照） 本出願は、米国特許出願第０９／０８７，２１０号（１９９８年５月２
８日出願）の一部継続出願であり、後者はさらに米国特許出願第０８／８６４，
３５７号（１９９７年５月２８日出願）の一部継続出願である。前記出願の各々
は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】 （発明の分野） 本発明は一般に、未変性のヒトウテログロビン（ｈＵＧ）または組換えヒトウ
テログロビン（ｒｈＵＧ）を使用する炎症および繊維症症状の治療に関する。Ｕ
Ｇ（ｈＵＧまたはｒｈＵＧ）の新規の生理学的役割および治療法が同定される。
具体的には本発明は、ｈＵＧまたはｒｈＵＧを投与してＰＬＡ2Sを阻害しおよび
／またはフィブロネクチン沈着を防止することによる、炎症および繊維症症状の
治療に関する。本発明はさらに、肺の重大な臨床症状である新生児呼吸窮迫症候
群（ＲＤＳ）や気管支肺異形成症（ＢＰＤ）、および腎臓の疾患である糸球体性
腎症（いずれも炎症および繊維症症状を特徴とする）の治療方法を提供する。本
発明はまた、ウテログロビンを投与してその受容体を介して腫瘍抑制を仲介する
ことによる、癌の治療方法を提供する。さらに本発明は、そのような受容体を産
生する細胞からウテログロビン受容体を精製し、そのような精製した受容体を使
用してＵＧ受容体リガンドおよびウテログロビン構造類似体を同定する方法を提
供する。
【０００３】 本出願で引用される文書は、本発明が関連する分野の技術の現状に関するもの
であり、その各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】 （発明の背景） 炎症、繊維症、および癌症状 炎症および繊維症疾患の治療のための改良された治療薬の探索が、近年注目さ
れている。肺表面活性物質欠乏疾患である新生児ＲＤＳは、早産新生児の死亡の
主原因であるという点で特に興味深い症状である。肺表面活性物質の導入は、Ｒ
ＤＳ患者の生存率を大幅に改善するが、この患者群では慢性の炎症および繊維症
疾患が高率に出現することが大きな問題である。同様に、遺伝性フィブロネクチ
ン沈着糸球体腎症により、最終段階の腎不全が起き、患者の腎臓がブロックされ
、血液をろ過できなくなる。腎症は、腎臓のフィブロネクチン沈着と繊維症が特
徴であり、このため腎臓が機能しなくなり、最終的に生命を維持できなくなる。
【０００５】 ＰＬＡ2 （ホスホリパーゼＡ2 ）（グリセロリン脂質のＳｎ２位置のエステル
結合を加水分解する内因性酵素の群）は、炎症および繊維症症状に関与するとさ
れている多くのタンパク質の１つである。これはまた、肺での表面活性物質リン
脂質の加水分解に関与する。ＵＧ（また、ＣＣ１０、ＣＣ１６、ＣＣ１７、尿タ
ンパク質−１、Ｐ−１、プロゲステロン結合タンパク質、ＰＣＢ結合タンパク質
、クララ細胞分泌タンパク質（ＣＣＳＰ）、ブラストキニン、レチノール結合タ
ンパク質、リン脂質結合タンパク質、およびアルファ２−ミクログロブリンとし
ても知られている）は、インビトロでＰＬＡ2 の活性を阻害する。
【０００６】 ウテログロビンは、球形のホモダイマー型タンパク質である。その分子量は１
５．８kDa であるが、電気泳動ゲルでは１０kDa に対応するサイズで泳動する。
ヒトウテログロビンは、成人の肺に豊富に存在し、総可溶性タンパク質の約７％
を占める。しかしその発現は、成長しているヒト胎児では妊娠の後期までは、充
分に活性化されない。従って早期産児の細胞外肺液は、成人よりヒトＵＧの含量
がはるかに少ない。ＵＧはまた、膵臓により発現される。
【０００７】 ＰＬＡ2Sは、細胞リン脂質貯蔵部からアラキドン酸（ＡＡ）を放出するため、
炎症応答において決定的に重要な役割を果たす。ＡＡは、アラキドン酸カスケー
ドとして知られているプロセスにより代謝されて多くの強力な炎症メディエータ
ーになる。
【０００８】 いくつかの急性および慢性の臨床症状は、血清中または局所的ＰＬＡ2 活性の
上昇を特徴とする（下記表１を参照）。
【０００９】
【００１０】 臨床用途に利用できる有効なＰＬＡ2 インヒビターは現在存在しない。今日ま
で、わずかのＰＬＡ2 インヒビターが臨床治験まで進んだだけであり、市販に値
するものは１つのない。
【００１１】 フィブロネクチン（Ｆｎ）は、２００kDa の糖タンパク質であり、いくつかの
異なる型で存在し、異なる組織から分泌される。Ｆｎは必須タンパク質であり、
マウスのＦｎ遺伝子のターゲティング破壊により、胚形成において中心的役割を
有することが証明された。Ｆｎはまた、炎症、細胞接着、組織修復および繊維化
において中心的な役割を果たし、傷害部位に沈着する。血漿フィブロネクチン（
ｐＦｎ）は肝臓により分泌され、血漿中で循環する。肺では、細胞フィブロネク
チン（ｃＦｎ）は炎症と傷害時に分泌される。炎症の発現中に多数の炎症細胞と
繊維芽細胞が肺に浸潤し、これが肺繊維化そして最終的に死を引き起こすことが
ある。新生児ＲＤＳや肺のＢＰＤ、および腎臓の糸球体性腎症のようなヒトの臨
床症状で、Ｆｎレベルの上昇が検出されている。
【００１２】 改良された癌治療薬や予防薬に対する探索は、科学や医学の現状の課題である
。癌細胞は、免疫系により外来であると認識されないため、これらは、体の生存
機能が影響を受けるまで無制限に増殖することができる。現在の治療法は、主に
化学療法と放射線照射であり、いずれも腫瘍細胞とともに正常細胞にも毒性が高
い。今日まで、腫瘍細胞増殖の、天然に存在する非毒性の細胞外抑制物質は見つ
かっていない。
【００１３】 ＵＧの役割 精製したヒトＵＧのアミノ酸分析は、これが他の「ＵＧ様」タンパク質（例え
ば、ウサギＵＧ）に構造が似ているが、同一ではないことが明らかにしている。
ヒトＵＧとウサギＵＧの間では、７０アミノ酸のうち３９が同一である（図１参
照）。「ＵＧ様」タンパク質（ヒトＵＧ／ＣＣ１０、ラットＣＣ１０、マウスＣ
Ｃ１０、およびウサギＵＧを含む）は、種特異的かつ組織特異的な抗原性の差、
ならびにその組織分布とインビトロでの生化学的活性の差を示す。ＵＧ様タンパ
ク質は、起源の組織や種（ラット肺、ヒト尿、喀痰、血液成分、ウサギ子宮、ラ
ットとヒト前立腺、およびヒト肺を含む）に関して、多くの異なる状況で説明さ
れている。現在は、これらのタンパク質について生理学的役割は不明である。
【００１４】 何年もの研究にもかかわらず、これらのタンパク質のインビボでの生物学的役
割は不明である。ＵＧ様タンパク質の間で構造的同一性が無いために、あるタン
パク質が、構造が関連するタンパク質が示すインビトロまたは他の活性に基づき
、ヒトでインビボ治療機能が有するどうかを予測することが困難になっている。
例えば、ヒトウテログロビンは同じ測定法で、ウサギＵＧが結合するプロゲステ
ロンの量の５％未満にしか結合しない。ヒトＵＧは、等電点（４．６）がウサギ
ＵＧ（５．４）より低い。
【００１５】 ストリップ（Stripp）ら（１９９６）は、ウテログロビンの発現を排除するた
めに作成したウテログロビンノックアウトマウスについての研究を報告している
。このマウスは、ウテログロビン分泌顆粒の代わりに奇妙な細胞内構造を示すク
ララ細胞を有するが、他の表現型はない。肺の炎症と繊維化を伴う肺機能が予測
されるため、この観察結果は非常に意味がある。さらに、このノックアウトマウ
スは、腎臓、膵臓、または生殖器の異常の証拠がなく、ウテログロビンタンパク
質が、インビボで炎症または繊維症の制御に大きな役割を持たないことを示して
いる。
【００１６】 レイトン（Leyton）ら（１９９４）は、腫瘍細胞によるアラキドン酸の放出の
阻害に起因するウテログロビンの抗転移性を報告した（米国特許第５，６９６，
０９２号、パチエルノ（Patierno）ら）。クンヅー（Kundu）ら（１９９６）は
、この研究を続けて、多様な型の腫瘍細胞によるＥＣＭ浸潤の阻害を観察してい
る。ＥＣＭ浸潤は、応答する細胞型における１９０kDa のウテログロビン結合タ
ンパク質の存在と相関した。このタンパク質が欠如した細胞のＥＣＭ浸潤活性は
、ウテログロビンにより阻害されなかった。
【００１７】 （発明の目的） 従って本発明の目的は、腫瘍抑制有効量の組換えヒトウテログロビン（ｒｈＵ
Ｇ）またはその断片もしくは誘導体を投与することを含む、原発性癌細胞増殖の
予防または治療方法を提供することである。
【００１８】 本発明のさらなる目的は、腫瘍抑制有効量のｒｈＵＧと薬剤学的に許容される
担体または希釈剤とからなる医薬組成物を提供することである。このような組成
物は、還元型および非還元型のモノマー型およびダイマー型ｒｈＵＧの混合物か
らなり、好ましくは還元モノマー型ｒｈＵＧからなる。
【００１９】 本発明の別の目的は、フィブロネクチン阻害有効量のｒｈＵＧまたはその断片
もしくは誘導体を投与することを含む、フィブロネクチン凝集および／または沈
着を阻害することにより腫瘍転移を予防または治療する方法を提供することであ
る。
【００２０】 さらに本発明の目的は、造血刺激有効量のｒｈＵＧまたはその断片もしくは誘
導体を投与することからなる、造血刺激方法を提供することである。
【００２１】 さらに本発明の目的は、造血刺激有効量のｒｈＵＧまたはその断片もしくは誘
導体と、薬剤学的に許容される担体または希釈剤とを含んでなる医薬組成物を提
供することである。
【００２２】 本発明のさらなる目的は、試料からウテログロビン受容体を精製する方法であ
って、 （ａ）試料に、固層支持体に結合したｒｈＵＧを接触させ； （ｂ）固層支持体からウテログロビン受容体の精製試料を溶出する、工程を含
んでなる上記方法を提供することである。
【００２３】 さらに本発明の目的は、ウテログロビン構造類似体および／またはＵＧ受容体
リガンドである化合物、ペプチドまたはタンパク質を含む試料のスクリーニング
に使用するための精製ウテログロビン受容体を提供することである。
【００２４】 最後に本発明の目的は、原発性癌細胞増殖と腫瘍転移の治療または予防のため
に、および造血の刺激のために、有効量のｒｈＵＧを投与してウテログロビン受
容体をターゲティングする方法を提供することである。
【００２５】 （発明の要約） ウテログロビンは、ＰＬＡ2 の阻害およびインビボでのフィブロネクチン沈着
と繊維化の予防において中心的な生理的役割を果たすことがわかっている。トラ
ンスジェニックウテログロビン「ノックアウト」マウスの新しい株で行われた実
験と、胚の炎症と繊維化を示す新生児呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）のサルモデルで
行われた実験とを組合せて、これらの作用が証明されている。本発明のウテログ
ロビンノックアウトマウス（以後、「ＵＧ ＫＯマウス」）は、疾患発症の初期
および後期に、それぞれ致死的な糸球体性腎症と腎実質繊維症を示す。正常なマ
ウスに外因性Ｆｎを投与すると、腎臓でＦｎ沈着が起きるが、等量のＦｎとｒｈ
ＵＧを投与するとこれは起きない。
【００２６】 ｒｈＵＧの存在下でインビボのＰＬＡ2 活性が低下することが証明されている
。最初の実験で、機能性ＵＧ遺伝子を有する同腹子のＰＬＡ2 活性に比較して、
ＵＧの非存在下で血清ＰＬＡ2 活性が大幅に上昇することを、ＵＧ ＫＯマウス
の表現型が明らかにした。第２の実験では、ＲＤＳに罹っている早産児サルにｒ
ｈＵＧを投与すると、肺の細胞外液でＰＬＡ2 活性を阻害することが証明された
。
【００２７】 他の実験は、インビトロのＰＬＡ2 が、ＲＤＳの治療に使用される人工表面活
性物質（典型的にはサーバンタ（Survanta））を分解することができ、ＵＧがそ
の分解を阻害することができることを示している。これらの実験は、ＵＧが、気
管内または静脈内投与後に、インビボでのＰＬＡ2 阻害とＦｎ沈着を仲介するこ
とを証明している。
【００２８】 ウテログロビンノックアウトマウスを用いた実験は、ｒｈＵＧが欠乏している
かまたはそのタンパク質自身が機能欠失突然変異を受けていることが明らかな症
状の治療に、ｒｈＵＧを使用できることを証明している。循環流中または炎症も
しくは繊維化の部位で機能性内因性ウテログロビンが欠失している炎症または繊
維症症状を治療または予防するのに、ｒｈＵＧを使用できることが発見されてい
る。いくつかの肺炎症または繊維症症状（新生児ＢＰＤを発症する危険性のある
早産児を含む）で、血清中および／または気管支肺胞洗浄液中のｈＵＧレベルが
低下することがわかっている。欠乏しているかまたは欠陥のある内因性ウテログ
ロビンを補足して、そのような炎症および繊維症症状を予防または治療するのに
、ＵＧを使用できることがわかっている。
【００２９】 腺癌および癌ウイルス形質転換上皮細胞中では、ウテログロビン発現は、劇的
に低下しているかまたは完全に欠失している。腺癌細胞株をヒトＵＧ（ｈＵＧ）
−ｃＤＮＡ作製体で安定にトランスフェクトすることにより、強制ＵＧ発現が、
ＵＧ受容体を発現する細胞のみによる足場非依存性増殖と細胞外マトリックス浸
潤を抑制することが見いだされた。これらの受容体陽性細胞を精製ｈＵＧで処理
すると、同じ結果が得られた。これらのデータは、ＵＧが自己分泌と傍分泌経路
により、癌細胞にその抑制作用を示していることを規定している。これは、細胞
外腫瘍サプレッサーの最初の証明であり、原発性腫瘍やその転移を治療するのに
ウテログロビンが使用できることの最初の証明である。さらに高令のＵＧ欠乏マ
ウスは、腫瘍を発症することが証明されており、インビボでのＵＧの腫瘍サプレ
ッサー性を確認している。
【００３０】 １つの面において本発明は、腫瘍抑制有効量の組換えヒトウテログロビン（ｒ
ｈＵＧ）またはその断片もしくは誘導体を投与することからなる、原発性癌細胞
増殖の予防または治療方法を提供する。
【００３１】 さらなる面において本発明は、腫瘍抑制有効量の組換えヒトウテログロビン（
ｒｈＵＧ）またはその断片もしくは誘導体を投与してウテログロビン受容体をタ
ーゲティングすることからなる、原発性癌細胞増殖の予防または治療方法を提供
する。
【００３２】 さらなる面において本発明は、腫瘍抑制有効量のｒｈＵＧと薬剤学的に許容さ
れる担体または希釈剤とからなる医薬組成物を提供する。好適な実施態様におい
て、ｒｈＵＧは還元型でモノマー型であり、約７５％〜約１００％、好ましくは
約９０％〜１００％、および最も好ましくは少なくとも約９５％の純度を有する
。
【００３３】 本発明のさらなる面は、フィブロネクチン阻害有効量のｒｈＵＧまたはその断
片もしくは誘導体を投与することからなる、フィブロネクチン凝集および／また
は沈着を阻害して転移を予防または治療する方法を提供する。本発明のこの面は
また、フィブロネクチン阻害有効量のｒｈＵＧを投与することによる、ウテログ
ロビン受容体のターゲティングを含む。
【００３４】 さらなる面において本発明は、造血刺激有効量のｒｈＵＧまたはその断片もし
くは誘導体を投与することからなる造血刺激方法であって、ｒｈＵＧの投与によ
りウテログロビン受容体をターゲティングすることも含む上記方法を提供する。
【００３５】 本発明はまた、造血刺激有効量のｒｈＵＧまたはその断片もしくは誘導体と、
薬剤学的に許容される担体または希釈剤とからなる医薬組成物であって、ｒｈＵ
Ｇは、約７５％〜約１００％、好ましくは約９０％〜１００％、および最も好ま
しくは少なくとも約９５％の純度を有する上記医薬組成物を提供する。
【００３６】 本発明の別の面において、試料に、固層支持体に結合したｒｈＵＧを接触させ
、次に該固層支持体からウテログロビン受容体の精製試料を溶出することからな
る、ウテログロビン受容体を産生する細胞の試料からウテログロビン受容体を精
製する方法が提供される。
【００３７】 本発明はまた、酸化型ｒｈＵＧに還元剤（例えば、ジチオスレイトールまたは
β−メルカプトエタノール）を、ｒｈＵＧを還元するのに充分な時間と温度で、
接触させることからなる、還元型ｒｈＵＧの調製方法を含む。好適な実施態様に
おいて、還元型ｒｈＵＧはモノマー型である。
【００３８】 さらに本発明は、動物を精製ウテログロビン受容体で免疫し、ウテログロビン
受容体に対する抗体を単離することからなる、ウテログロビン受容体に対する抗
体の作成方法を提供する。
【００３９】 最後に本発明は、ウテログロビン構造類似体および／またはＵＧ受容体リガン
ドである化合物、ペプチドおよびタンパク質について、試料をスクリーニングす
る手段としてウテログロビン受容体を提供する。この点で、ウテログロビン受容
体は、ウテログロビン構造類似体および／またはＵＧ受容体リガンドである化合
物、ペプチドまたはタンパク質をスクリーニングするためのキットで使用しても
よい。
【００４０】 （発明の詳細な説明） ｒｈＵＧ 本発明のｒｈＵＧは、未変性のヒトＵＧタンパク質と実質的に同じアミノ酸配
列を有する。未変性のヒトタンパク質と「実質的に同じ」アミノ酸配列を有する
アミノ酸配列は、未変性のヒトタンパク質と少なくとも７５％の同一性を有する
ｒｈＵＧを含む。好適な実施態様においてｒｈＵＧは、未変性のＵＧと少なくと
も８５％の同一性、および最も好適な実施態様においてｒｈＵＧは未変性のＵＧ
と少なくとも９８％の同一性を有する。
【００４１】 本発明の方法にはまた、ＵＧの断片または誘導体の使用が含まれる。ＵＧの「
断片」とは、未変性のタンパク質配列の６つまたはそれ以上の連続的アミノ酸を
有する未変性のアミノ酸配列の一部を意味する。「誘導体」という用語は、１つ
またはそれ以上のアミノ酸の置換、および／または１つまたはそれ以上の化学的
残基（例えば、アシル化剤、スルホン化剤、ジスルフィド結合のカルボキシメチ
ル化、または錯体もしくはキレート化金属もしくは塩イオン、例えばＭｇ+2、Ｃ
Ａ+2、またはＮａ+1）の付加を含むＵＧのペプチド類似体を意味するが、ただし
誘導体は親分子の生物活性を保持している。
【００４２】 「ＵＧ様」タンパク質には、未変性のヒトウテログロビンと実質的に同じアミ
ノ酸配列および／または実質的な配列類似性を有する、マウス、ラット、ウサギ
などから単離されたものを含む。配列類似性に関して、同様のアミノ酸は、ＵＧ
様タンパク質中で置換される（例えば、フェニルアラニンの代わりにチロシン、
またはアラニンの代わりにグリシン）。実質的に類似と考えられるＵＧ様タンパ
ク質は、約３０％の配列類似性、好ましくは５０％の配列類似性、より好ましく
は少なくとも７５％の配列類似性、そして最も好ましくは少なくとも９０〜９５
％の配列類似性を有する。ＵＧ受容体リガンドは、ＵＧ受容体に結合しその活性
のすべてまたは一部を仲介するペプチド、タンパク質または化学残基（例えば、
有機リガンド）である。ウテログロビン構造類似体は、構造類似体が未変性のタ
ンパク質の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％の活性を保持するよ
うに、未変性のウテログロビンと比較した時、実質的に類似の二次的および三次
的特徴を有する、化合物、ペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしく
は誘導体である。最も好適な実施態様において、構造類似体は、未変性のタンパ
ク質の活性の少なくとも９０％を保持する。
【００４３】 さらに本発明の方法で使用されるＵＧは、実質的に純粋である。用語「実質的
に純粋」とは、約７５％〜約１００％の純度を有するＵＧを意味する。好適な実
施態様においてＵＧは、約９０％〜約１００％の純度を有し、最も好適な実施態
様において、ＵＧは少なくとも９５％の純度を有する。
【００４４】 ＵＧの臨床的用途 本発明は別の面において、哺乳動物（これは、動物またはヒトでもよい）に有
効量のＵＧを投与することからなる、炎症または繊維症または癌症状の治療また
は予防方法を提供する。
【００４５】 症状の以下の非限定的リストは、ＵＧ欠乏、過剰のＰＬＡ2 活性、およびフィ
ブロネクチン沈着に関連した症状の代表例である。
【００４６】
【００４７】 ヒト炎症／繊維症症状、腫瘍抑制におけるＵＧ欠乏、ＰＬＡ2 活性、フィブロ
ネクチン凝集および沈着と、ウテログロビン受容体との典型的な関係を以下に要
約する。
【００４８】 新生児気管支肺異形成症（新生児ＢＰＤ） 新生児ＢＰＤは、通常呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）の結果としての新生児におけ
る肺組織の重症の炎症と不可逆的繊維化が特徴である。しかしこの症状はまた、
胎便吸入または感染によっても引き起こされる。
【００４９】 肺ｈＵＧの合成は表面活性物質とともに制御（これは妊娠の後期に始まる）さ
れているため、この症状にｈＵＧの欠乏が関与しているとされている。すなわち
重症の未熟児は、表面活性物質とともにＵＧが欠如している。ｈＵＧ欠乏は、Ｐ
ＬＡ2 活性の上昇とＦｎ関連繊維症を引き起こし、これらは新生児ＢＰＤで見ら
れる炎症と繊維症に関連している。一部の幼児は、合成表面活性物質に応答せず
、これは過剰のＰＬＡ2 活性が原因かも知れない。すなわちＵＧは、新生児ＢＰ
Ｄの治療に使用することができる。
【００５０】 好適な投与経路は、気管内または全身経路による直接注入である。
【００５１】 多臓器不全（ＭＯＦ） 細菌性敗血症または外傷によるＭＯＦに、過剰のＰＬＡ2 活性が関与している
。この症状は、肺、腎臓、膵臓、小腸および血管における、急速で大きな組織傷
害および臓器機能の喪失を含む全身性炎症応答が特徴である。最近の証拠は、Ｍ
ＯＦの誘発物質は、全身性可溶性ホスホリパーゼＡ2 活性の上昇、組織細胞膜の
直接溶解、および必須リン脂質（例えば、肺表面活性物質）の加水分解であるこ
とを指摘している。臨床の場においてＰＬＡ2 を直接阻害する試みは成功してい
ない。
【００５２】 ＭＯＦでは、ＰＬＡ2 の過度の活性化に対抗するのに内因性ＵＧの量が不充分
である。外因性に供給したＵＧを、ＭＯＦを抑制するのに使用することができる
。
【００５３】 遠隔臓器不全（ＲＯＦ）は、外傷または感染により主に影響を受けた臓器以外
の臓器への障害が関与する。遠隔臓器不全はしばしば、２つ以上の遠隔臓器に関
係し、多臓器不全に陥る。例えば膵臓炎は、アルコール摂取、感染、または外傷
に応答した膵臓の炎症であり、成人型呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性腎不全
（ＡＲＦ）、および全身性ショックを引き起こすことがある。炎症性腸疾患また
は腹膜炎の発症が、ＲＯＦ／ＭＯＦを引き起こすことがある。ＲＯＦ／ＭＯＦは
、高レベルの循環性活性化ＰＬＡ2 に関連している。ｈＵＧの全身性投与により
、ＲＯＦ／ＭＯＦを予防できることがある。ＲＯＦ／ＭＯＦ患者へのＵＧの直接
注入は、重症度を緩和し、ＰＬＡ2 介在臓器不全やショックを排除できることが
ある。
【００５４】 膵臓炎 すべての型の膵臓炎に、Ｉ型ａ可溶性ＰＬＡ2 活性（全身性でも局所性でも）
が関与する。膵臓炎はしばしば、肺不全またはＡＲＤＳを引き起こし、肺での可
溶性ＰＬＡ2 活性の上昇が特徴である。従ってインビボでの可溶性Ｉ型ＰＬＡ2
のインヒビターとして、ＵＧは、２つの型の急性膵臓炎の治療の優れた候補であ
り、すべての急性型の膵臓炎の肺不全の予防手段である。
【００５５】 好適な投与経路は、静脈内経路である。
【００５６】 炎症性腸疾患 炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（潰瘍性大腸炎、第２胃炎、およびクローン病を含む
）は、II型可溶性ＰＬＡ2 の局所的産生と活性の上昇が特徴である。ＩＢＤでは
、循環可溶性ＰＬＡ2 活性も上昇している。ＩＢＤは、ＰＬＡ2 活性の上昇の結
果として、重症例では肺不全またはＡＲＤＳを引き起こす（これは、膵臓炎に似
ている）。
【００５７】 ＩＢＤにおいて外因性ＵＧを投与する理由は、膵臓炎と同じである。すなわち
、ＰＬＡ2 、Ｆｎ凝集および／または沈着を阻害して炎症応答をダウンレギュレ
ートし、遠隔臓器（肺と腎臓）の関与を防ぐことである。
【００５８】 好適な投与経路は、入院患者では静脈内経路である。
【００５９】 細菌性肺炎 細菌性肺炎から助かった患者のＢＡＬ液は、死亡した患者より２〜３倍高レベ
ルのＵＧを有することが証明された。肺の細菌感染は、内因性可溶性ＰＬＡ2 を
過剰に活性化することがある。この作用を制御するのにＵＧを投与してもよい。
【００６０】 患者が挿管している場合は、好適な投与経路は気管内経路であり、そうでない
場合は静脈内経路である。
【００６１】 透析の合併症 透析の大きな合併症は血栓症（すなわち、自然に形成される血栓）である。こ
れらはしばしば、血管アクセスポートをふさぎ、治療の妨げとなり、同時に患者
の虚血性症状（時には生命をおびやかす）を引き起こす。血液透析患者の第２の
問題は、透析血液を患者の主循環流中に戻す近位の血管の炎症および／または繊
維化である。血管の繊維化は通常、透析血液の返血に対する抵抗または圧力の上
昇として検出される。第３の問題は、血管アクセス部位の繊維化と詰まりすなわ
ちフィステルである。第４の問題は、アテローム性動脈硬化の加速であり、第５
は、残存腎機能の喪失（ほとんどはＦｎ沈着に起因する）である。
【００６２】 透析の操作中に内因性ＵＧが透析除去される可能性は、これらの問題の理由を
提供する。内因性ＵＧが選択的に除去されると、循環Ｆｎが自由に凝集し、これ
が病巣または血栓を形成して赤血球上に沈着し、互いにまたは血管腔に付着して
凝固応答が始まる。グルタミン酸転移酵素（ＴＧ）は、基底膜、皮膚および血栓
中に存在する巨大分子状の構成格子の原因である。活性化ＴＧの基質として競合
する遊離ＵＧが存在しないと、Ｆｎと他の血栓成分が架橋する。
【００６３】 近位の血管と血管アクセス部位の両方の炎症と繊維化ならびにアテローム性動
脈硬化の加速は、血管腔中のＦｎの沈着により説明される。血管内皮へのフィブ
ロネクチン沈着は、血小板と白血球（いずれもＰＬＡ2 阻害のない場合は悪化す
る）の接着を促進する。Ｆｎの血管沈着物はまた、アテローム性動脈硬化班中に
見いだされる脂肪、コレステロールおよびタンパク質の局所的沈着を促進する。
フィブロネクチンは、アテローム性動脈硬化班の主要な成分であること、ならび
に腎症および原発性と残存性腎機能の喪失に関連する腎糸球体沈着物の主要成分
であることが知られている。従ってＵＧ投与は、炎症とフィブロネクチン沈着を
低減させることにより、これらの問題を低減または排除する。
【００６４】 ＵＧ投与の好適な経路は、透析前、透析中または透析後の静脈内注射であろう
。
【００６５】 あるいは内因性ＵＧの喪失は、透析緩衝液中にＵＧを添加することにより、ま
たは透析膜をＵＧあらかじめコーティングするか、またはその両方で防止できる
。
【００６６】 臓器移植 用語「臓器」は、例えば固体臓器（例えば、腎臓、肝臓、および心臓）ならび
に骨髄、角膜および皮膚を意味する。
【００６７】 ２つの型の臓器移植拒絶（急性と慢性）がある。急性拒絶は、しばしば移植片
を破壊する炎症性細胞によるＰＬＡ2 活性と浸潤が関与する炎症プロセスである
。
【００６８】 慢性拒絶は、移植片のＦｎ介在繊維化（移植片に限定されたアテローム性動脈
硬化を含む）が関与する。すなわちＵＧの投与は、急性および慢性の移植片拒絶
を治療または予防するのに使用される。
【００６９】 好適な投与経路は、注射である。
【００７０】 臓器移植の別の面は、ドナーからの除去前の、輸送中および受容者中の、急性
拒絶に寄与する、臓器の虚血である。虚血は、ＰＬＡ2 活性の上昇と組織壊死を
引き起こすことが知られている。従ってＵＧは、このような虚血を予防するのに
使用される。ＵＧの好適な型は、、エクスビボ臓器が保存される潅流液体または
保存緩衝液としてである。
【００７１】 Ｉ型糖尿病の予防 Ｉ型糖尿病は、自己免疫応答による膵臓組織の破壊により起きる。膵臓は通常
、可溶性ＰＬＡ2SとｈＵＧを循環流中に分泌する。壊死病変が、本発明のウテロ
グロビンノックアウト（ＫＯ）マウス（以後「ＵＧ ＫＯマウス」）の膵臓中で
報告されている。
【００７２】 ウテログロビンの非存在下では、ＵＧ ＫＯマウスは、自己免疫応答を誘発し
得る同様の膵臓組織破壊を示す。すなわちＵＧは、Ｉ型糖尿病のゆっくりした進
行を防止または停止するのに使用される。好適な投与経路は注射である。
【００７３】 腎症の予防と治療 ＵＧ ＫＯマウスでの腎Ｆｎ沈着と繊維化は、ヒト腎症におけるＦｎ沈着と繊
維化に似ている。すなわちＵＧ投与は、危険のある患者（例えば、II型糖尿病）
における腎症の進行を防止または遅くする。
【００７４】 眼の炎症の予防と治療 眼の炎症（ブドウ膜炎、網膜炎、および手術後の炎症を含む）は、ＰＬＡ2 活
性の上昇が特徴である。従ってＵＧは、局所的、眼内、または全身性に投与され
て眼の炎症を低下させる。
【００７５】 動脈硬化 動脈硬化は、体内の血管の繊維性肥厚である。これは、血管壁へのＦｎ沈着に
より開始されるかおよび／または仲介される。アテローム性動脈硬化は、Ｆｎ沈
着以外にコレステロール沈着が関与する型の動脈硬化である。従ってＵＧは、動
脈硬化を予防または低減するために投与される。
【００７６】 急性腎不全 急性腎不全（ＡＲＦ）は、典型的には遠隔臓器の炎症、感染または直接の外傷
の結果であり、これは、循環流中の可溶性ＰＬＡ2 の放出と活性化を引き起こす
。ＡＲＦ中の腎臓への傷害は非常に重症であり、急性の組織傷害が炎症により促
進され、腎臓の繊維化に変化していき、長期的に腎臓機能の低下を引き起こす。
ＵＧの抗炎症性および抗繊維化性は、ＵＧ ＫＯマウスにより証明されるように
腎臓で特に関係がある。
【００７７】 好適な投与経路は、注射または全身性投与である。
【００７８】 原発性腫瘍増殖の予防と治療 腫瘍形成は、無制御な細胞増殖とまわりの組織の浸潤の結果である。細胞受容
体により仲介されるウテログロビンの腫瘍抑制活性は、ヒトの癌の治療において
予防および／または治療薬としての可能性を示す。さらに老齢のウテログロビン
欠乏マウスの腫瘍の発症は、癌における長期のウテログロビンの欠乏の生理学的
意義を示す。
【００７９】 好適な投与経路は、注射または全身性投与である。
【００８０】 腫瘍転移の予防と治療 腫瘍細胞接着と腫瘍転移におけるフィブロネクチン沈着の役割は、充分解析さ
れている（スニダー（Snyder）ら、「フィブロネクチン：臨床医学への応用（Fi
bronectin: Applications to Clinical Medicine）」、CRC Critical Rev. Clin
.Lab. Sci. 23(1): 15-34 (1985)）。インビボでフィブロネクチン凝集と沈着を
防ぐウテログロビンの能力は、ヒト腫瘍転移の予防と治療におけるウテログロビ
ンの有用性を示している。
【００８１】 好適な投与経路は、全身性投与である。
【００８２】 ＨＩＶ感染の予防と治療 ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）によるヒト白血球の感染は、少なくとも２
つの型の膜結合ＨＩＶ受容体により仲介される。ウテログロビンは、１つまたは
それ以上のＨＩＶ受容体をブロックすることにより、白血球の感染を予防し得る
。
【００８３】 従って外因性ヒトウテログロビンは、注射または全身性投与により、ＨＩＶ患
者またはＨＩＶに暴露されたヒトに投与される。
【００８４】 造血の刺激 白血球および／または赤血球の欠乏を特徴とする臨床症状は、造血を刺激する
物質により治療される。このような臨床症状の患者集団には、化学療法患者、透
析患者、および遺伝的貧血の患者がある。ヒトウテログロビンは、白血球の増殖
因子（アオキ（Aoki）ら、１９９６）であることが証明されており、ＨＡＦは、
赤血球と白血球増殖の両方を刺激することが知られているため、ヒトウテログロ
ビンはヒトの貧血を治療するのに使用される。すべての増殖因子は、膜結合細胞
受容体を介してその作用を仲介し、従ってウテログロビンとその誘導体は、ウテ
ログロビン受容体をターゲティングして造血を刺激するのに使用される。
【００８５】 好適な投与経路は、注射と全身性投与である。
【００８６】 全体に、以下の症状の非限定的リストは、ＰＬＡ2 および／またはフィブロネ
クチン沈着の阻害、および／または腫瘍抑制、および／またはウテログロビン受
容体ターゲティングに関連するものであり、それぞれは、本発明の方法による治
療または予防の候補である：
【００８７】 関節／骨：リウマチ様関節炎と肉腫； 自己免疫：リウマチ様関節炎、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、ブドウ膜炎、全身性
エリテマトーデス（ＳＬＥ）、およびクローン病； 膵臓：膵臓炎、肉腫および癌； 腹膜：腹膜炎、虫垂炎、癌および肉腫； 血管／全身性：敗血症ショック；コラーゲン血管疾患、動脈硬化、アテローム性
動脈硬化、アナフラキシーショック、住血吸虫症、外傷誘発性ショック、癌、内
皮腫、および肉腫； 腎：急性腎不全、腎臓の細菌感染、腎腫瘍による炎症、化学療法または抗体治療
法に起因する繊維化の予防、糖尿病性腎症の予防、特発性腎症の予防および／ま
たは治療、肉腫および癌； 肝臓：肝炎、ウイルス性肝炎、および肝硬変、肉腫、癌； 膀胱：膀胱炎、尿道の炎症、尿管の炎症、膀胱の炎症（例えば、間質性膀胱炎）
、肉腫および癌； 生殖器／女性：膣炎、炎症性頸部、骨盤炎症性疾患、卵巣の炎症（卵管炎）、子
宮内膜症、膣カンジダ症、輸卵管の炎症または繊維化、癌および肉腫； 生殖器／男性：陰茎炎症、前立腺炎、細精管と膀胱の炎症、睾丸炎症、精管、副
睾丸および前立腺の炎症、癌および肉腫； 眼：ブドウ膜炎、網膜炎、外傷、化学薬品または煙による火傷、ＣＭＶ網膜炎に
よる眼の炎症、結膜炎（細菌感染）、ウイルス感染、感染性物質による眼の炎症
、眼の手術（白内障除去、レーザー手術、角膜移植、腫瘍除去を含む）後の眼の
炎症、網膜芽細胞腫（腫瘍）による眼の炎症、放射線照射後の眼の炎症、アレル
ギー反応による炎症、肉腫および癌； 心臓：心内膜炎、肉腫および癌 肺：気管支喘息、ＡＲＤＳ、肺炎、突発性肺繊維化、化学療法（ブレオマイシン
、メソトレキセート）に起因する肺繊維化、環境性化学物質（アスベスト、洗浄
液、汚染物質、例えば自動車排気ガス中のダイオキシンやＰＣＢ）に起因する肺
繊維化、煙吸入、溺水からの回復中の炎症、新生児ＲＤＳ、癌および肉腫； 腸管：炎症性腸疾患、大腸炎、クローン病、第２胃炎、新生児壊死性全腸炎、感
染性物質による炎症、ロタウイルス、ポリオウイルス、ＨＩＶ、胃潰瘍、胃食道
逆流疾患、扁桃炎、癌および肉腫； 痔： 移植：炎症または繊維化および拒絶を制御するための任意の臓器または組織の移
植手術後の投与； 耳：中耳炎、癌および肉腫； 皮膚：乾癬、じんま疹、アレルギーおよび皮膚炎、硬皮症、接触性皮膚炎、化学
性皮膚炎（毒、キヅタ、うるしかぶれ、およびＰＣＢ、塩素、アンモニウム、（
洗浄剤、毒性物質）のような化学物質への暴露）、癌および肉腫； 脾臓／胸腺：肉腫および癌； 筋肉：肉腫および癌； 造血／リンパ：癌および肉腫； 胚：癌および肉腫；および 腺（内分泌腺）：癌および肉腫。
【００８８】 さらに、ＵＧは単独で、または上記疾患症状の治療または予防に典型的に使用
される他の活性物質または組成物とともに投与される。そのような活性物質また
は組成物には、特に限定されないが、ステロイド、非ステロイド抗炎症剤（ＮＳ
ＡＩＤ）、化学療法剤、麻酔薬、免疫治療薬、抗ウイルス剤、抗真菌剤、ワクチ
ン、免疫抑制剤、造血増殖因子、ホルモン、サイトカイン、抗体、抗血栓薬、心
血管薬、または不妊治療薬がある。また、経口許容薬、ビタミンおよびミネラル
が含まれる。
【００８９】 本発明は、ＰＬＡ2 やフィブロネクチン関連症状および癌やウテログロビン受
容体関連症状の予防または治療におけるＵＧの使用に関する。疾患症状の予防に
関して「予防」とは、感受性のある集団または感受性のある可能性のある集団に
おける疾患の発症を防止、またはその重傷化もしくは進行を防ぐことを意味し、
「治療」とは、疾患または病状の緩和を意味する。
【００９０】 ＵＧは、ウテログロビン受容体をターゲティングするために投与してもよい。
ウテログロビン受容体のターゲティングとは、細胞増殖への作用を仲介するため
にリガンドが受容体に特異的に結合するのを誘発することを意味する。
【００９１】 ＵＧは、静脈内投与するか、または新生児ＲＤＳ／ＢＰＤおよび成人ＲＤＳの
治療の場合は、液体または半エアゾルの形で気管内チューブを介して投与される
。他の有効な投与経路には、局所的、眼内、皮膚、経皮、肛門、全身性、筋肉内
、除放性、経口、膣内、十二指腸内、腹腔内、および腸内投与がある。このよう
な組成物は、このような投与の必要な被験体または患者に、医学、栄養学または
獣医学分野の当業者に公知の用量と方法で、特定の被験体または患者の年令、性
別、体重、および症状を考慮して、投与することができる。本発明の組成物はま
た、制御放出製剤で投与してもよい。組成物は、他の活性物質とともに、再度特
定の被験体または患者の年令、性別、体重、および症状、および投与経路を考慮
して、投与することができる。
【００９２】 本発明の組成物の例には、経口投与用の食用可能な組成物、例えば固体または
液体製剤（例えば、カプセル、錠剤、癌剤など、および門口部の液体調製物（例
えば、経口、経鼻、肛門内、膣内製剤、例えば懸濁剤、シロップ剤、またはエリ
キシル剤；および非経口、皮下、皮内、筋肉内または静脈内投与（例えば、注射
投与）用調製物、例えば無菌懸濁剤または乳剤がある。しかし、組成物中の活性
成分は、血流中に投与された時、血液タンパク質の沈殿により凝固が起きるよう
に、タンパク質と複合体を形成してもよい。当業者はこれを考慮すべきである。
【００９３】 このような組成物においてＵＧは、適当な担体、希釈剤または賦形剤（例えば
、無菌水、生理食塩水、グルコース、ＤＭＳＯ、エタノールなど）との混合物で
もよい。ＵＧは、例えば等張水溶液、食塩水、グルコース、またはＤＭＳＯ緩衝
液で復元するための凍結乾燥型で供給することができる。ある食塩水溶液では、
ｒｈＵＧの一部の沈殿が観察されている；この観察結果は、本発明の化合物を、
例えば「塩析」法により単離するための手段として用いられる。
【００９４】 さらに本発明はまた、ＵＧが提供されるキットを包含する。キットは、適当な
担体、希釈剤または賦形剤を含有する別の容器を含んでよい。キットは、同時投
与または連続的投与ための上記症状の副作用を低減または緩和する追加の物質を
含有してもよい。追加の物質は、別の容器中でまたはＵＧとの混合物として供給
することができる。さらにキットは、成分を混合または組合せおよび／または投
与するための説明書を含有してもよい。
【００９５】 本発明はまた、治療の必要な患者に補償量のＵＧを投与することを含んでなる
、内因性機能性ＵＧの欠乏を特徴とする癌の治療または予防方法を包含する。「
補償量」とは、ＵＧの局所的肺濃度または総ＵＧ（内因性機能性ＵＧと外因性Ｕ
Ｇ）の全身性濃度を正常範囲にするのに必要なＵＧの量を意味する。さらに詳し
くは、内因性ＵＧの局所的肺濃度の正常範囲は、約＞５０μｇＵＧ／mgアルブミ
ンまたは＞５０μｇ／リットルである。血清ＵＧ濃度の正常範囲は、＞１５μｇ
／リットルである。さらに過剰のウテログロビンは、体内の可溶性および不溶性
（膜結合）ウテログロビン結合残基を飽和するのに充分な量で投与され、この量
は、ウテログロビンの循環レベルが上記正常レベルの約２〜２００倍になるよう
に、上記ウテログロビンの補償量を越えてもよい。
【００９６】 本発明の組成物は、目的（すなわち、腫瘍抑制および／またはフィブロネクチ
ンの結合により転移におけるその役割を緩和するという所望の作用を発生させる
ための血漿または組織ＵＧレベルの上昇）を達成するのに有効な量で、未変性の
および／または組換えｈＵＧを含有してもよい。組成物は、有効量の実質的に純
粋な未変性のおよび／または組換えヒトＵＧを、薬剤学的に許容される担体また
は希釈剤とともに含有してもよい。ウテログロビンは、還元型またはモノマー型
、またはその両方で存在してもよい。
【００９７】 ウテログロビンは、２０ng/kg〜５００mg/kgの単回ボーラス、単回投与または
複数回投与、または１０グラムまでの連続的注入で投与してもよい。
【００９８】 本明細書において「腫瘍抑制有効量」とは、患者の組織または体の腫瘍を抑制
しかつ腫瘍転移を予防または低減させるＵＧの量を意味する。用語「フィブロネ
クチン結合有効量」とは、フィブロネクチンに結合してその凝集および／または
沈着を低減させ、かつ腫瘍転移を予防または低下させるＵＧの量を意味する。同
様に「造血刺激有効量」とは、赤血球および白血球増殖を刺激するために投与す
ることができるウテログロビンの量を意味する。さらに「抗ＨＩＶ有効量」とは
、１つまたはそれ以上のＨＩＶ受容体を阻止するのに充分なウテログロビンの量
である。典型的には、癌の治療のために成人に投与されるＵＧの量は、０．２μ
g/kg〜５００mg/kgの単回ボーラスか、長期間にわたって投与される数グラムま
でである。新生児については新生児ＲＤＳの治療では、範囲は典型的には５０ng
/kg〜１００mg/kgの単回ボーラスか、長期間にわたって投与される１０グラムま
でである。有効かつ安全な連続的注入速度は、５０ng/kg/hr〜５００mg/kg/hrで
ある。
【００９９】 さらに本発明は、固層支持体に結合したｒｈＵＧを使用して親和性クロマトグ
ラフィーによりウテログロビン受容体を精製する方法を提供する。本方法は、試
料（例えば、ウシ心臓、脾臓、気管、肺、肝臓および大動脈であり、これらは親
和性クロマトグラフィーの前に可溶化されてもまたは部分的に精製されてもよい
）に、ウテログロビン（またはその断片もしくは誘導体、またはＵＧ様タンパク
質またはウテログロビン受容体リガンド）が結合した固層支持体を接触させるこ
とからなる。ＵＧは、固層支持体（すなわち、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ
または任意の方法で）に、または当該分野で公知の任意の方法でまたは固層支持
体に共有結合してもよい。次にＵＧ受容体タンパク質は、適当な緩衝液を使用し
て固層支持体から溶出される。
【０１００】 さらに本発明は、還元型ｒｈＵＧの調製法を提供する。本発明の方法は、酸化
型ｒｈＵＧまたは部分的に酸化したｒｈＵＧに、還元剤（例えば、ジチオスレイ
トールまたはβ−メルカプトエタノール）を、ｒｈＵＧを還元するのに充分な時
間と温度（例えば、３７℃で１５分）接触させることからなる。好適な実施態様
において、本発明の方法は、還元モノマー型ｒｈＵＧを与える。ＨＰＬＣ、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ、または他の適当な検出法のように、ｒｈＵＧを還元するのに充分
な適当な時間と適当な温度で、任意の適当な還元剤または還元剤の組合せを使用
してもよいことを、当業者は理解するであろう。
【０１０１】 さらにウテログロビン受容体は、当業者に公知の標準的方法により精製され、
ウテログロビン構造類似体および／またはウテログロビン受容体リガンドである
化合物、ペプチドまたはタンパク質をスクリーニングするのに使用される。この
点で、精製ウテログロビン受容体はまた、ウテログロビン構造類似体および／ま
たはウテログロビン受容体リガンドをスクリーニングするためのキットで使用し
てもよい。このようなスクリーニング方法は、１つまたはそれ以上の化合物、ペ
プチドおよび／またはタンパク質を含む試料に、精製ウテログロビン受容体を接
触させ、試料中の１つまたはそれ以上の成分とウテログロビン受容体との結合反
応を検出することからなる。このような結合反応（例えば、リガンド−受容体相
互作用）は、例えば受容体のＵＶスペクトルの変化を検出するか、または当業者
に公知の任意の他の方法により検出され、かつ、試料中のウテログロビン構造類
似体および／またはＵＧ受容体リガンドの存在を示す。
【０１０２】 最後に精製ウテログロビン受容体は、受容体に対する自己抗体を作成するのに
使用してもよい。このような抗体は、ウテログロビン受容体を刺激し活性化する
のに使用され、当業者に公知の標準的方法（例えば、マウスを精製ウテログロビ
ン受容体で免疫し、ハイブリドーマを調製し、ウテログロビン受容体に対する抗
体をスクリーニングする）により作成される。例えば、サムブルーク（Sambrook
）ら、「モレキュラークローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning: A
Laboratory Manual）」、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープ
レス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、ニューヨーク、１９８９を参
照されたい。
【０１０３】 例 以下の非限定例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。部およびパーセン
トは、特に明記しない場合は重量により表す。
【０１０４】 例１：インビボ実験 組換えヒトＵＧは、マンチレ（Mantile）ら（１９９３）の方法により得た。
【０１０５】 オスとメス各１匹のピー・シノセファルス（P. cynocephalus）種（それぞれ
体重約４００グラム）を、妊娠１４２日に帝王切開で出産させた。これは、ＲＤ
Ｓの確立されたモデルである（コールソン・ジェイ・ジェイ（Coalson, J.J.）
ら、ＢＰＤのヒヒモデル、II：病理学的特徴、Exp. Mol. Pathol. 37: 355-350
(1982))。
【０１０６】 出産後、幼児をケタミン（１０mg/kg）で麻酔し、直径２．５mmの気管内チュ
ーブを挿管した。橈骨動脈中に皮内注射で入れた動脈ラインから、血液ガスと圧
力を監視した。深部静脈ラインを皮内から伏在静脈中に入れ、ここから液、抗生
物質、および薬剤を投与した。動物を、サーボ制御した赤外線暖熱器で維持し、
加湿器の付いた標準的時間サイクルの圧力制御ベンチレーターで３６〜３７℃に
維持した。初期設定は、ＦｉＯ2 １．０、速度４０／分、Ｉ／Ｅ比１：１．５、
終末呼気陽圧（ＰＨＥＰ）４cm Ｈ2 Ｏ、および充分な胸部運動の必要に応じた
最大吸気圧（ＰＩＰ）である。ＦｉＯ2 は１．０に維持し、ＰＩＰは、４０±１
０トールでＰａＣＯ2 を維持するように制御した。血液ガス、ヘマトクリット、
電解質、プロトロンビン時間、部分トロンボプラスチン時間およびデキストロス
ティックスは、１時間毎に監視した。研究のために採取した血液は、ヘパリン化
した成体ヒヒの血液で容量的に置換した。静脈内注入液は、電解質１０cc/kg/hr
で投与し、心拍数が１８０拍／分を超えた時、必要に応じて増加させた。塩基欠
乏が−１０を越えた時、重炭酸ナトリウム（２meq/kg）を投与した。実験が続い
ている間、アンピシリン（５０mg/kg/日を２回に分けて）とゲンタマイシン（５
mg/kg/日を２回に分けて）を連続的に与えた。
【０１０７】 １匹の動物に表面活性物質とＰＢＳ（処理番号１）を投与し、第２の動物（処
理番号２）に表面活性物質と２投与量の１mg/kgのｒｈＵＧを投与した。表面活
性物質とｒｈＵＧの両方とも、気管内チューブを介して直接肺に投与した。使用
した表面活性物質はサーバンタ（Survanta）であり、これはウシの肺組織由来の
表面活性物質調製物であり、リン脂質以外に表面活性物質アポタンパク質ＢとＣ
を含有する。ｒｈＵＧの最初の投与量は表面活性物質とともに与え、第２の投与
量は、第１の投与の４時間後に投与した。動脈血液ガス、電解質およびＥＫＧに
ついて、動物を監視した。表面活性物質治療の開始５０時間後に、動物を屠殺し
た。２４時間目と４８時間目にプロテアーゼインヒビター（ＰＭＳＦ、１０μg/
kgロイペプチン、１０μg/mlのペプスタチンおよびバシトロシン）を含有するＰ
ＢＳで肺を洗浄した。これらを、ＰＬＡ2 活性について測定するまで−８０℃に
凍結した。総タンパク質は、ブラッドフォード（Bradford）法（バイオラッド（
BioRad））で測定した。肺洗浄液中のＰＬＡ2 活性は、レビン（Levin）ら（１
９８６：前述）に従って測定し、以下の表に示す。
【０１０８】
【０１０９】 上記データは、２回の測定の平均である。結果は、ｒｈＵＧの気管内投与が、
インビボでＰＬＡ2 を阻害することを示す。表面活性物質とｒｈＵＧを投与され
た動物は、表面活性物質を投与されたがｒｈＵＧは投与されなかった動物と比較
して、肺洗浄液中のＰＬＡ2 活性が著しく低かった。このデータは、表面活性物
質とともにｒｈＵＧを投与することは、表面活性物質リン脂質を保護するのに有
効であることを確認している。
【０１１０】 例２：インビトロの可溶性ＰＬＡ2 による人工表面活性物質の加水分解の阻害 ｒｈＵＧは、インビトロで可溶性ＰＬＡ2Sによる人工表面活性物質の加水分解
を阻害する。サーバンタ（Survanta）はウシの肺由来の人工表面活性物質であり
、ＲＤＳを有する早産新生児やＲＤＳを有する成人（ＡＲＤＳ）を治療するのに
使用される。Ｉ群可溶性ＰＬＡ2 （すなわち、ブタ、膵臓ＰＬＡ2 （ベーリンガ
ーマンハイム（Boehringer Mannheim））によるサーバンタ（Survanta）の加水
分解は、基質として蛍光ホスファチジルコリン基質（ケイマンケミカルズ（Caym
an Chemicals））と競合して、生成物としてアラキドン酸を生成できることが特
徴である。
【０１１１】 サーバンタ（Survanta）は、Ｉ群可溶性ＰＬＡ2Sによるインビトロ分解の基質
である。サーバンタ（Survanta）は、ヒト肺の細胞外液中に存在するＰＬＡ2Sに
よりインビトロで急速に分解される。ｒｈＵＧは、インビトロでのサーバンタ（
Survanta）の分解を阻害する。
【０１１２】 例３：ＵＧノックアウトマウスの作製 哺乳動物の生理におけるウテログロビンの役割を測定するため、ならびに重症
の炎症臨床症状の治療薬としてＵＧのモデルを作成するために、トランスジェニ
ックＵＧ ＫＯマウスを作成した。第１段階は、適当なＤＮＡベクターを作製し
て、これを用いて内因性マウスウテログロビン遺伝子をターゲティングし妨害す
ることである。１２９／ＳＶＪマウス株（レイ（Ray）、１９９３）のウテログ
ロビン遺伝子のエキソン３とフランキング配列を含有する３．２kbのＢａｍＨＩ
−ＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片を、レイ（Lei）ら（１９９６）が記載したように、
ｐＰＮＷベクターの対応する部位にサブクローニングした。エキソン２の一部と
その上流配列を含有する０．９kb断片を、ＰＣＲ（プライマー−Ｌ（イントロン
１から）：５’−ＴＴＣ ＣＡＡ ＧＧＣ ＡＧＡ ＡＣＡ ＴＴＴ ＧＡＧ
ＡＣ−３’；プライマー−Ｒ（エキソン２から）：５’−ＴＣＴ ＧＡＧ ＣＣ
Ａ ＧＧＧ ＴＴＧ ＡＡＡ ＧＧ Ｃ−３’）により増幅し、ＮｏｔＩとＸｈ
ｏＩ制限部位を、遺伝子ターゲティングベクターへのサブクローニングのために
末端に作成した。この作製体においては、２７アミノ酸をコードするエキソン２
の７９塩基対が欠失していた。ＰＣＲ断片を、ｐＰＮＷ中のネオマイシン耐性を
コードする遺伝子の上流に入れ、遺伝子ターゲティングベクターｐＰＮＷＵＧを
作成した。このベクターを図２Ａに示すが、ここでＰＧＫ−ｎｅｏカセットは、
ウテログロビン遺伝子を妨害し、タンパク質コード配列を破壊する。
【０１１３】 ｐＰＮＷＵＧ遺伝子ターゲティングベクターをＮｏｔＩで線状化し、ナギイ（
Nagy, A）ら、ＰＮＡＳ 90: 84824 (1993)に従って、ＥＳ Ｒ1 細胞中に電気
穿孔法で注入した。電気穿孔した細胞のガンシクロビルとＧ４１８選択により、
１５６クローンを得た。サザン（ＤＮＡ）ブロット解析により、１５６クローン
のウチの３つで、野生型ウテログロビンアレレの５．１kbのＨｉｎｄIII断片と
、相同的組換えから得られる８．２kbのＨｉｎｄIII断片が得られた（図２Ｂに
示す）。これらのＥＳ Ｒ1 クローンを、カペッチ（Capecchi）、Science 244:
1288 (1989)に従って、Ｃ５７ＢＬ／６胞胚中に注入した。異なるキメラ創始者
に由来する２つの異なるマウス株を作成した。ターゲティングしたウテログロビ
ン遺伝子遺伝子座を有するヘテロ接合性子孫（ＵＧ+/- ）を交配させ、子孫の遺
伝子型を、図２Ｃに示すようにＰＣＲで解析し、図２Ｄに示すようにサザンブロ
ットで解析した。
【０１１４】 例４：ＵＧ遺伝子ノックアウトとマウスＵＧ（ｍＵＧ）タンパク質の欠失の証明 ホモ接合性ノックアウトマウス（ＵＧ-/- ）が検出可能なｍＵＧを持たないこ
とを証明するために、ウテログロビン遺伝子ターゲティングマウスを、肺を含む
いくつかの臓器中のＵＧ−ｍＲＮＡとｍＵＧタンパク質の発現について、試験し
た。実験プロトコールは、施設の動物飼育および使用委員会により認可された。
ＵＧ+/+ 、ＵＧ+/- 、ＵＧ-/- マウスの異なる臓器から総ＲＮＡを単離した。逆
転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用してｍＵＧ−ｍＲＮＡを検出
した。ｍＵＧ特異的プライマーｍＰｒ（５’−ＡＴＣ ＴＴＧ ＣＴＴ ＡＣＡ
ＣＡＧ ＡＧＧ ＡＣＴ ＴＧ−３’）を使用して標的分子を逆転写し、作成
したｃＤＮＡをＰＣＲプライマーｍＰｒとｍＰｌ（５’−ＡＴＣ ＧＣＣ ＡＴ
Ｃ ＡＣＡ ＡＴＣ ＡＣＴ ＧＴ−３’）を使用して増幅した。ＰＣＲ産物を
、ＵＧ遺伝子配列のエキソン２由来のオリゴヌクレオチドプローブｍＰｐ（５’
−ＡＴＣ ＡＧＡ ＧＴＣ ＴＧＧ ＴＴＡ ＴＧＴ ＧＧＣ ＡＴＣ Ｃ−３
’）とハイブリダイズさせた。マウスＧＡＰＤＨ ＲＴ−ＰＣＲで使用したプラ
イマーとプローブは以下の通りである：ｍＧＡＰＤＨ−ｒ（５’−ＧＧＣ ＡＴ
Ｃ ＧＡＡ ＧＧＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＴ−３’）；ｍＧＡＰＤＨ−ｌ（５’
−ＡＴＧ ＧＣＣ ＴＴＣ ＣＧＴ ＧＴＴ ＣＣＴ ＡＣ−３’）；ｍＧＡＰ
ＤＨ−ｐ（５’−ＧＡＡ ＧＧＴ ＧＧＴ ＧＡＡ ＧＣＡ ＧＧＣ ＡＴＣ
ＴＧＡ ＧＧ−３’）。図２Ｅは、ｍＵＧ−ｍＲＮＡがＵＧ+/+ とＵＧ+/- マウ
スの肺で検出されたことを示す（ただし、ＵＧ-/- マウスでは検出されなかった
）。同様のデータ（示していない）は、ＵＧ-/- マウスの前立腺または子宮のい
ずれにもｍＵＧ−ｍＲＮＡが存在しないが、完全なウテログロビン遺伝子を有す
るマウスには存在することを証明している。
【０１１５】 肺中のｍＵＧタンパク質の免疫沈降とウェスタンブロット解析により、同様の
確証結果（図２Ｆに示す）が得られた。２mMのフッ化フェニルメチルスルホニル
および２０μg/mlずつのアプロチニン、ロイペプチン、およびペプスタチンＡを
含有する緩衝液（１０mMトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１％トリトンＸ−１００
、０．２％デオキシコレート、１５０mM ＮａＣｌ、５mM ＥＤＴＡ）でホモジ
ナイズすることにより、ＵＧ+/+ とＵＧ-/- マウスの腎臓、肝臓、および肺から
組織溶解物を調製した。ホモジネートを１７，５００×ｇで４℃で３０分遠心分
離し、組織溶解物または血漿タンパク質（１mg/ml）をマウスＦｎに対するウサ
ギ抗体（１：１００希釈）とともにインキュベートすることにより、既に記載さ
れているように免疫沈降させた（イー・ハーロー（E. Harlow）とディー・レー
ン（D. Lane）、「抗体：実験室マニュアル（Antibodies; a laboratory manual
）」、第１版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring
Harbor Laboratory Press）、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring H
arbor）、ニューヨーク、１９８８）。１０％グリセロール、５０mMトリス−塩
酸（ｐＨ７．５）、２５０mM ＮａＣｌ、４．３mMリン酸ナトリウムの存在下で
４℃で１時間、等モルのｍＦｎをｒｈＵＧとインキュベートし、次に抗ｍＦｎ抗
体（１：１００希釈）を加えて、精製マウスＦｎ（ｍＦｎ）とｒｈＵＧの同時免
疫沈降（マンチレ（Mantile, G.）ら、J. Biol. Chem. 267: 20343 (1993)）を
行った。等量の抽出組織タンパク質（３０μg）または免疫沈殿物を、４〜２０
％または６％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで還元条件下で分離し、次にマウ
スＦｎ（１：２０００希釈）またはＵＧ（１：２０００希釈）に対するウサギ抗
体でウェスタンブロッティングした。ＵＧ-/- マウスからの組織または液ではｍ
ＵＧは検出されなかったが、ＵＧ+/+ マウスおよびＵＧ+/- マウスからの組織は
、ｍＵＧタンパク質を含有した。
【０１１６】 最後にＵＧ-/- のみの肺の組織病理学的解析が、細気管支上皮細胞のｍＵＧ特
異的免疫染色が欠如していた。ＵＧ-/- マウス、ＵＧ+/- マウスおよびＵＧ+/+
マウスの肺組織を、ブワン固定液または１０％中性緩衝化ホルマリン固定液で固
定し、パラフィンに包埋し、４〜６ミクロンの切片にした。これらをヘマトキシ
リンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。選択した組織を、コラーゲン検出のため
にマッソン３色染色で、フィブリンのためにＰＴＡＨで、またはアミロイドタン
パク質のためにコンゴーレッドで染色した。ｍＵＧとｍＦｎの免疫組織学的検出
のために、ベクタステインウサギエリートＡＢＣキット（Vectastain rabbit El
ite ABC kit）（ベクターラボラトリーズ（Vector Laboratories））を使用した
。ｍＵＧアミノ酸配列（Ｌｙｓ２８〜Ｔｈｒ４９、具体的にはＫＰＦＮＰＧＳＤ
ＬＱＮＡＧＴＱＬＫＲＬＶＤＴ）に対応する合成ペプチド（ペプチドテクノロジ
ーズ社（Peptide Technologies, Inc.））を使用して、ｍＵＧに対するウサギ抗
体（サイトイムン（CytImmune））を作成した。ｍＦｎに対するウサギ抗体（ギ
ブコビーアールエル（GIBCO BRL））を１：１０００希釈で使用し、ｍＵＧに対
する抗体は１：５００で使用した。
【０１１７】 これらの３セットの結果は、ホモ接合体のウテログロビンノックアウトマウス
（ＵＧ-/- ）は、ｍＵＧタンパク質またはタンパク質の任意の検出可能な断片も
欠如していることを確認している。
【０１１８】 例５：ウテログロビンノックアウトマウスの表現型 ＵＧ+/- マウスの交配種に生まれた１７９匹のマウスのうち、４６匹（２６％
）は＋／＋であり、９０匹（５０％）は＋／−であり、４３匹（２４％）はＵＧ -/- 遺伝子型であり、破壊されたｍＵＧ遺伝子座がメンデル則で遺伝し、ＵＧ+/ + マウス、ＵＧ+/- マウス、およびＵＧ-/- マウスが等しく出産時に生存してい
ることを示している。しかしＵＧ-/- マウスは新規表現型を示し、ここでは、顕
著な体重減少に関連する悪疫質、重いタンパク尿、および低カルシウム血症を特
徴とする進行性の病気を示した。タンパク尿は、異常に高レベルのアルブミンや
他の血清タンパク質が尿中に排泄される症状である。これは、糸球体機能不全と
腎不全を意味する。影響を受けた動物（肺について上記したように）の腎臓の組
織病理学的観察では、図３に示すように激症の腎糸球体疾患を明らかになった。
ＵＧ+/+ マウスの糸球体と比較して、ＵＧ-/- マウスのそれは少細胞性であり、
大きな好酸球性タンパク質性沈着物があった。ＵＧ-/- マウスにおける致死的腎
疾患の経時変化は、早期発症型（４〜５週間）かまたは後期発症型（１０ヶ月間
）であった。最初４週令では健康に見えたＵＧ-/- マウスは、２ヶ月令では巣状
の糸球体沈着物があった。約１０ヶ月ではこれらのマウスは、早期発症で死んで
いくマウスと似た極端な悪疫質があった。ヘテロ接合体は、ＵＧ-/- マウスで観
察された弱い型の腎疾患があった。後期発症のマウスの腎臓の組織病理は、早期
発症型のような重症の糸球体症のみでなく、腎実質の顕著な繊維化と尿細管肥厚
があった（図３を参照）。ＵＧ-/- マウスの主な病理は腎臓中にあったが、組織
病理学的研究はまた、血管優先と見えた膵臓の壊死の病巣がところどころ明らか
にした。さらにアポトーシス体を示唆する胸腺や脾臓構造中の病巣が見つかった
。興味深いことに膵臓はｍＵＧ遺伝子を発現し、この臓器はまた、Ｉ群細胞外Ｐ
ＬＡ2 の豊富な供給源である。これは、主に消化酵素であるため、その活性化は
組織傷害を引き起こすかも知れない。
【０１１９】 ウテログロビンタンパク質は免疫調節性および抗炎症性を有することが報告さ
れているため、炎症に応答してかつ反応性アミロイド症が起きることがわかって
いるため、ｍＵＧ−ヌルマウスの糸球体沈着物はアミロイドタンパク質である可
能性が高かった。反応性アミロイド症は、アミロイドタンパク質と免疫複合体の
沈着が特徴である。ＵＧ-/- マウス中の腎沈着物の本体は、腎臓切片の免疫組織
染色により確立された。ＵＧ-/- マウスとＵＧ+/+ マウスの腎臓切片をコンゴー
レッドで染色し、偏光ライト下で観察した。アミロイドタンパク質は、この試験
で陽性の複屈折を示すが、ＵＧ-/- マウスの糸球体は明らかに陰性であった。Ｕ
Ｇ-/- マウスの糸球体中のＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＭ免疫複合体の有無につ
いての免疫蛍光試験および主要アミロイドタンパク質の有無についての分析も陰
性であった。すなわちＵＧ-/- マウスの糸球体沈着物は、アミロイドタンパク質
も免疫複合体も含有せず、従って炎症応答の結果ではないようである。
【０１２０】 例６：ＵＧ-/- 腎臓中のＦｎとコラーゲンの検出 ＵＧ-/- マウスの腎沈着物を走査電子顕微鏡により観察して、その構造と形態
を明らかにした。糸球体病変を有するＵＧ-/- マウスの腎臓をホルマリンで固定
し、エポキシ樹脂に包埋した。薄い切片を酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色し、
電子顕微鏡で観察した。６０００×または６０，０００×で顕微鏡写真を撮った
。沈着物は主に２つのタイプの小繊維構造を示した：１つのタイプは長く横縞の
入った小繊維で比較的まれであり、他の１つは短く拡散しておりより豊富であっ
た（図３Ｅと３Ｆ）。コラーゲンやフィブロネクチンのようなＥＣＭタンパク質
は、同様の小繊維構造を生成するため、ＵＧ-/- 中の糸球体沈着物はこれらのタ
ンパク質を含有するかも知れない。
【０１２１】 糸球体沈着を次に、抗ｍＦｎ抗体を使用して免疫蛍光で分析した。ホルマリン
固定組織切片を、ウサギ抗ｍＦｎとＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧを使用して
、免疫蛍光のために使用した。同様にｍＦｎ、コラーゲンＩおよびIII、ビトロ
ネクチン、ラミニンおよびオステオポンチンについて特異的な抗体を使用して、
免疫蛍光試験を行った。ツァイスアキシオフォト（Zeiss Axiophot）顕微鏡を使
用して、表面蛍光写真を撮った。野生型マウスの腎糸球体中のＦｎ特異的免疫蛍
光は実質的に検出されず（図３Ｇ）、これはＵＧ-/- マウス同腹子の糸球体では
強かった（図３Ｈ）。マッソン３色染色を使用すると、ＵＧ+/+ マウスの糸球体
は陰性（図３Ｉ）であり、ＵＧ-/- マウス（図３Ｊ）は陽性であり、糸球体沈着
体中のコラーゲンの存在を示唆している。コラーゲンＩおよびコラーゲンIII特
異的抗体を使用した免疫蛍光は、これらの結果を確認した。Ｆｎは他の細胞外マ
トリックス（ＥＣＭ）タンパク質と相互作用することが知られているため、我々
は、ＵＧ+/+ マウスとＵＧ-/- マウスの糸球体中のラミニン、ビトロネクチンお
よびオステオポンチンの存在について免疫組織染色により試験したが、その結果
は陰性であった。
【０１２２】 例７：ＵＧ-/- の腎臓はＦｎを過剰産生しない Ｆｎの過剰産生が腎糸球体でのその沈着を説明できるかどうかを調べるために
、我々は、ＵＧ-/- マウスとＵＧ+/+ マウスの腎臓、肺、および肝臓中のＦｎ−
ｍＲＮＡの相対量を、ＲＴ−ＰＣＲとデンシトメトリーにより評価した。すなわ
ちＦｎ−ｍＲＮＡの過剰産生は、ＵＧ-/- マウスの糸球体中のＦｎ−沈着の可能
性のある原因ではなかった。次に我々は、ＵＧ-/- マウスとＵＧ+/+ マウスの血
漿、腎臓および肝臓中のＦｎ−タンパク質を、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥと
ウェスタンブロッティングにより比較した。野生型マウスの血漿、腎臓、および
肝臓中では、２２０kDのＦｎ分子のみが検出されたが、ＵＧ-/- マウスの血漿と
肝臓溶解物は、２２０kDのＦｎバンドを有し、腎臓溶解物は、他の明確な、共有
結合したマルチマー型のＦｎバンドを含有した（図４Ａ）。
【０１２３】 例８：ＵＧ-/- マウス中の血清ＰＬＡ2 活性の上昇 現在の概念に基づくと、Ｆｎマトリックスアセンブリーと原線維発生の決定的
に重要な最初の工程は、少なくとも細胞表面では、インテグリン活性化とＦｎ自
己凝集であると考えられている。ＵＧは可溶性ホスホリパーゼＡ2 （ｓＰＬＡ2
）（炎症経路の重要な酵素）の強力なインヒビターであるため、ＵＧ-/- マウス
中のｍＵＧの欠如は、糸球体腎炎（炎症性腎疾患）の発症に寄与しているかも知
れない。すなわち我々は、年令、性および体重の一致したＵＧ+/+ マウス（ｎ＝
３）とＵＧ-/- マウス（ｎ＝３）の血清中のＰＬＡ2 活性を測定した。動物を屠
殺し、各試料の血清ＰＬＡ2 活性を、製造業者の説明書に従ってＰＬＡ2 活性キ
ット（ケイメンケミカル（Caymen Chemical））を使用して三重測定で測定した
。血清中のタンパク質濃度は、ブラッドフォード測定法（バイオラッド（BioRad
））で測定し、ＰＬＡ2 の比活性を算出した。ＵＧ-/- マウスの血清ＰＬＡ2 の
比活性（μmol／分／mgタンパク質）［３６＋３．３（ＳＥＭ）］は、ＵＧ+/+
マウス［１８＋２．８（ＳＥＭ）］より有意に高かった（ｐ＜０．０５）。これ
らの結果は、より高いＰＬＡ2 活性により、リソホスファチド酸（ＬＰＡ）産生
の上昇と、従ってＵＧ-/- マウス中でのインテグリン活性化とＦｎ自己凝集の促
進を引き起こすかも知れない可能性を示した。
【０１２４】 例９：インビトロでのウテログロビンとフィブロネクチンの相互作用 ウテログロビンがＦｎ自己アセンブリーを防止する方法をさらに理解するため
に、インビトロでｍＦｎ−Ｆｎ相互作用を破壊するｒｈＵＧの能力を測定した。
等モルのｒｈＵＧとｍＦｎをインキュベートして、任意のタンパク質結合または
他の相互作用をさせ、次に抗Ｆｎ抗体で免疫沈降させ、免疫沈降物を還元条件下
のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ｍＦｎまたはｍＵＧ抗体を用いて、前述のウェ
スタンブロッティング法によりそれぞれ各タンパク質が検出された。結果は、フ
ィブロネクチンがｒｈＵＧと一緒に免疫沈降したことを示している（図４Ｂ）。
これらの結果を確認するために、 125Ｉ−ｒｈＵＧをｍＦｎとインキュベートし
、６％ポリアクリルアミドゲルを非変性条件下と非還元条件下で使用して、複合
体を電気泳動により分離した（図４Ｃ）。オートラジオグラム中のＦｎ−ＵＧヘ
テロマーの検出（レーン２）は、可溶性ＦｎがインビトロでＵＧと相互作用する
ことを示した。Ｆｎ−ＵＧヘテロマー化がインビボで起きるかどうか確認するた
めに、ＵＧ+/+ マウスとＵＧ-/- マウスの血漿を、ｒｈＵＧと交差反応しない抗
ｍＦｎ抗体と免疫沈降させた（図４Ｄ）。抗ｍＦｎ抗体は、ＵＧ+/+ マウスの血
漿からのｍＦｎとｒｈＵＧを同時沈降させたが、ＵＧ-/- マウスのものは沈降さ
せず、ＵＧ+/+ マウスの血漿中にはＦｎ−ＵＧヘテロマーが存在することを示唆
していた。従ってＦｎ−ＵＧ複合体は、インビトロで生成される単なるアーチフ
ァクトではなく、血清中に天然に存在している。
【０１２５】 ＦｎへのＵＧ結合の特異性と親和性を測定するために、我々は 125Ｉ−Ｆｎを
非標識Ｆｎと、ＵＧの存在下および非存在下でインキュベートした。任意の複合
体をスベリン酸ジスクシニミジル（ＤＳＳ）で親和性架橋した。ヒトＦｎ（ｈＦ
ｎ）でコーティングした２４ウェルプレート（コラボラティブバイオメディカル
プロダクツ（Collaborative Biomedical Products））を使用して、３μlの 125 Ｉ−Ｆｎ（比活性６mCi/mg：ＩＣＮバイオメディカルズ（ICN Biomedicals））
を、５００μlのＨＢＳＳ中のＵＧまたはＦｎ（１０-12 〜１０-6Ｍ）の非存在
下および存在下で、室温で２時間インキュベートした。ＵＧ抗体を用いてすべて
のＦｎをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングを行っても、ＵＧ汚
染は検出されなかった。放射能標識複合体をＰＢＳで２回洗浄し、１Ｎ ＮａＯ
Ｈで可溶化し、１Ｎ ＨＣｌで中和し、ガンマカウンターで放射活性を測定した
。別の実験で、 125Ｉ−Ｆｎ（３μl）を２０μl（１mg/ml）のマウスＦｎと４
０μlのＨＢＳＳ（ｐＨ７．６）中で、増加する濃度の還元型ｒｈＵＧ（５〜５
００μg）の非存在下または存在下で、室温で２時間インキュベートした。試料
を０．２０mM ＤＳＳで室温で２０分架橋させ、ＳＤＳ試料緩衝液中で５分間沸
騰させ、４〜２０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、オートラジオグラフ
ィーを行った。ＵＧの非存在下では、 125Ｉ−Ｆｎは、非標識Ｆｎと高分子量の
放射能活性複合体を生成したが、ＵＧの存在下では、Ｆｎ−Ｆｎ凝集物は、ＵＧ
濃度に依存して阻害された（図４Ｅ）。
【０１２６】 ＵＧに対するＦｎの結合親和性とそれ自身に対するＦｎの結合親和性の間に差
があるかどうかを調べるために、結合実験を行い、ここで 125Ｉ−Ｆｎは非標識
Ｆｎとインキュベートし、異なる濃度のＵＧとともにマルチウェルプレートに固
定した。別の実験で、 125Ｉ−Ｆｎと非標識の固定化Ｆｎとの結合試験を、非標
識可溶性Ｆｎの種々の濃度を使用して行った。両方の実験からのデータのスキャ
チャード解析は、直線を与え、ＦｎへのＵＧ結合の解離定数（kds ）は１３nMで
、自身へのＦｎ結合の解離定数は１７６nMであった。これらの結果は、ＵＧのＦ
ｎに対する比較的高い結合親和性のために、ＵＧはＦｎの自己凝集を有効に防ぐ
ことを示唆している。放射ヨード化（ 125Ｉ）コラーゲンＩを非標識物ＦｎとＵ
Ｇの非存在下または存在下でインキュベートした親和性架橋実験も、Ｆｎについ
て記載したように行った。変性または非変性 125Ｉ−コラーゲンＩ（比活性６５
．４mCi/mg）を還元型ＵＧ（２５０μｇ）の存在下または非存在下でＦｎとイン
キュベートし、親和性架橋し、電気泳動し、そしてオートラジオグラフィーを行
った。結果は、ＵＧが高分子量の 125Ｉ−コラーゲン−Ｆｎ凝集体の形成を妨害
することを示している（図４Ｆ）。
【０１２７】 例１０：ｒｈＵＧによる糸球体ｈＦｎのインビボ阻害 ｒｈＵＧがＦｎ蓄積から腎糸球体を防御するかどうかを試験するために、可溶
性ヒトＦｎ（ｈＦｎ）単独または等モルのｒｈＵＧと混合したｈＦｎを、ＵＧ+/ + マウスと見かけ上健常のＵＧ-/- マウス同腹子に静脈内投与した。
【０１２８】 ヒトＦｎ（１５０μlのＰＢＳ中５００μg）を、２ヶ月令の約２２ｇのＵＧ+/ + マウスと見かけ上健常のＵＧ-/- マウスの尾静脈に投与した。同様に、対照マ
ウスに、１５０μlのＰＢＳ中の５００μｇのｈＦｎと等モルのｒｈＵＧまたは
アルブミンとの混合物を注射した。最後の注射の２４時間後にマウスを屠殺し、
種々の臓器を緩衝化ホルマリンで固定した。腎臓と他の臓器の組織切片を、単一
特異的抗ｈＦｎ抗体（ギブコビーアールエル（GIBCO BRL）；クローン１）およ
びＦＩＴＣ結合したウサギ抗マウスＩｇＧ（カペル（Cappel））を用いる免疫蛍
光により観察した。別の実験でＵＧ+/+ マウスに、１５０μlのＰＢＳ中１mgの
ｈＦｎ単独を３日間連続で注射した。
【０１２９】 ヒトＦｎを注入する理由は、内因性マウスＦｎと投与したｈＦｎとを区別でき
るからである。種々の組織中のｈＦｎの静脈内投与と免疫組織学的検出法はすで
に説明されている。
【０１３０】 ｈＦｎとｒｈＵＧ（１：１モル比）の混合物またはｈＦｎ単独を注射した野生
型ＵＧ+/+ マウスの糸球体中のヒトＦｎ免疫蛍光は、同様であった（図５Ａと５
Ｂ）。しかし、ｈＦｎとＵＧの混合物を注射したＵＧ-/- マウスは、糸球体中で
ｈＦｎ特異的免疫蛍光をほとんど示さず（図５Ｃ）、Ｆｎ単独を投与されたマウ
スは、高強度の免疫蛍光を示した（図５Ｄ）。ｈＦｎとＢＳＡの混合物を対照と
して投与すると、防御作用は得られなかった。ＵＧ+/+ マウスで多量のＦｎを注
入することによりこのＵＧ防御作用が克服されるかどうかを調べるために、我々
は、動物１匹につき１mgのｈＦｎを３日間連続して注射した。低用量（５００μ
ｇ／マウス）ｈＦｎのＵＧ+/+ マウスへの静脈内投与は、顕著な糸球体沈着を引
き起こすのに有効ではなかった（図５Ａ）が、高用量（３mg／動物）の投与では
有意な蓄積があった。すなわち、ＵＧは糸球体Ｆｎ−沈着を防止し、ＵＧ-/- マ
ウスに対してＵＧ+/+ マウスは、内因性ＵＧが存在するため、可溶性Ｆｎの蓄積
に対する閾値が高い。
【０１３１】 例１１：組織培養細胞でのｒｈＵＧによる原線維発生とＦｎマトリックスアセン
ブリーの阻害 典型的なインビトロ組織培養測定法でＵＧがＦｎ−原線維発生とマトリックス
アセンブリーを防止するかどうかを調べるために、マウス胚繊維芽細胞を、可溶
性ｈＦｎ単独または等モルのｈＦｎとｒｈＵＧとの混合物を含有する培地中で培
養した。培養細胞（ＣＲＬ６３３６、ＡＴＣＣ）中のＦｎマトリックスアセンブ
リーと原線維発生は、前述のように測定した。ｈＦｎ単独で処理した培養物の細
胞中で見られた原線維発生のレベルは、ｈＦｎとｒｈＵＧとの混合物を投与され
たもの（図５Ｆ）と比較して、はるかに高かった（図５Ｅ）。
【０１３２】 例１２：臨床試料中のＵＧ−Ｆｎ複合体の検出 体液（例えば、血清、ＢＡＬ、および喀痰）の臨床試料中のＵＧ−Ｆｎ複合体
の検出は、ヒトの疾患におけるこの複合体の役割を決定するのに重要である。Ｕ
Ｇ−Ｆｎ複合体の検出のために溶液相診断測定法が開発され、その測定フォーマ
ットを図６に示す。固層支持体に共有結合した捕捉抗体は、ヒトタンパク質に対
する単一特異的ウサギポリクローナル抗体である。固層支持体は、ビーズ（例え
ば、磁性ビーズ）、チューブ、またはＥＬＩＳＡプレートでもよい。固層支持体
は、多様なタイプの試料でより一貫した結果を得るために、各結合反応後に洗浄
工程を行う柔軟性を与える。検出抗体はＦｎに特異的であり、多くの市販品が利
用できる。次に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のような酵素に結合した
抗ＩｇＧ抗体を使用して、標準的酵素反応（酵素基質が発色性または蛍光性化合
物に変換され、これが分光光度計または蛍光計（アマシャム（Amersham））で定
量される）で分子鎖の末端の抗Ｆｎ−ＩｇＧを検出する。この測定法の検出限界
は、試料液１ml当たりＵＧ−Ｆｎ複合体５００μｇである。
【０１３３】 例１３：ウテログロビン欠乏症 ｈＵＧの一過性であるが急性の欠乏は、臨床的透析（血液透析、腹膜透析、お
よび連続的透析（ＣＲＲＴ））として知られている血液洗浄方法により作成され
る。すべての型の臨床的透析は、血液から毒性の体内廃産物（尿素のような化学
的代謝物、およびベータ２−ミクログロブリンのような小タンパク質を含む）を
ろ過するのに半透膜を使用する。
【０１３４】 ＵＧは、極端にコンパクトなタンパク質であり、真の分子量が１５．７kDa で
あるにもかかわらず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは分子量約１０〜１３kDa に対応して
異常な泳動をすることが知られている。従ってＵＧダイマーは、透析実験で１０
〜１３kDa タンパク質として挙動することが予測される。驚くべきことに、この
ダイマーは、８．０kDa ＭＷＣＯ透析膜を通過するほどコンパクトであることが
わかった。ＵＧはまた、１４．０kDa ＭＷＣＯ透析膜を通過した。
【０１３５】 これらの実験で使用した透析膜の組成は、臨床的透析のために製造し使用され
る大多数の膜の組成と、全く同一ではないがよく似ている。これらは、再生セル
ロースまたは酢酸セルロースからなる。
【０１３６】 この実験のために、２つの部分的に精製した（１つは＞９０％の純度であり、
１つは約７０％の純度である）ｒｈＵＧ細胞溶解物の１．０mlのアリコートを、
緩衝液添加無しに、１０００mlの非緩衝化５０mM酢酸アンモニウムに対して、３
つの大きさの透析チューブ（３．５kDa 、８．０kDa 、１４．０kDa ）（スペク
トラ／ポア（Spectra/Por）；トーマスサネンティフック（Thomas Scientific）
）を使用して透析した。各試料について４８時間の間に緩衝液を４回交換し、す
べて室温（約２５〜２７℃）で行った。各透析試料の外観は、透明な黄色から透
明で無色の液体に変化した。操作の初めと最後にチューブに直接短時間、圧力（
絞る）を加えて漏れを観察することにより、透析チューブの漏れを調べたが、漏
れはなかった。チューブの両端を締めて、さらに漏れの無いようにした。
【０１３７】 図７は、これらの結果のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１、２，および
３の透析後の３つの試料の隣のレーン７と８に、９０％の純度の透析前試料を示
す。８．０kDa ＭＷＣＯ膜で透析した試料であるレーンには、ＵＧダイマーはも
う存在しない。これらの結果は後に、異なるバッチの部分精製したＵＧ調製物を
用いて確認された。
【０１３８】 例１４．腫瘍細胞へのｈＵＧ結合タンパク質の親和性架橋 以前の研究により、ホモダイマー型の完全に酸化されたｒｈＵＧは、あるタイ
プの腫瘍細胞に存在する１９０kDa 結合タンパク質に結合することが証明されて
いる（レイトン（Leyton）ら、１９９４；クンヅー（Kundu）ら、１９９６）。
本例は、還元型ｒｈＵＧ（後にモノマーであることが証明された）は、４９kDa
型および〜３２kDa 型とともに、１９０kDa ＵＧ結合タンパク質にも結合するこ
とを証明する。これはまた、これらのＵＧ結合タンパク質の存在が、これらの腫
瘍細胞（ＮＩＨ３Ｔ３、マウス肥満細胞腫、肉腫、およびリンパ腫）中における
非浸潤性表現型を仲介する外因性ｒｈＵＧの能力と、相関することも証明する。
これらのＵＧ結合タンパク質が存在しないことは、外因性ｒｈＵＧ（繊維肉腫）
の存在下で浸潤性表現型が続くことと相関する。以下の表は、既に記載されてい
るように（クンヅー（Kundu）ら、１９９６）ＥＣＭ浸潤測定法において、この
表現型を証明する新しいデータを与える。この作用がｒｈＵＧに特異的であるこ
とを示すために、無関係のタンパク質対照（ミオグロビン）を使用した。
【０１３９】
【０１４０】 簡単に説明すると、トリプシンとＥＤＴＡでコンフルエントな細胞（ＮＩＨ３
Ｔ３、マウス肥満細胞腫、肉腫、リンパ腫および繊維肉腫）を採取し、次に遠心
分離した。細胞をＤＭＥＭ／ＢＳＡ中に再懸濁した。浸潤チャンバーの下部区画
に、化学誘因物質として使用する繊維芽細胞調整培地（ＦＣＭ）を満たした。下
部区画に、マトリゲル（Matrigel）基底膜マトリックスをあらかじめコーティン
グしたＰＥＴ膜を重層した。還元型ｒｈＵＧの非存在下または存在下であらかじ
め加水したマトリゲル（Matrigel）コーティング浸潤チャンバーの上部区画に、
細胞（１．６×１０5 ／ウェル）を接種し、加湿インキュベーター中で３７℃で
２４時間インキュベートした。マトリゲル（Matrigel）に浸潤しフィルターの下
の表面に付着した細胞を、ギムザ染色した。フィルターの上部表面を、湿った綿
棒で掻き取ってマトリゲル（Matrigel）と非泳動細胞を除去した。チャンバーを
水で洗浄し、泳動した細胞を、倒立顕微鏡下で計測し、ツァイス（Zeiss）光学
顕微鏡アキシオベルト（Axiovert）４０５Ｍを使用して顕微鏡写真（１２０×）
を撮った。
【０１４１】 要約すると、還元型ｒｈＵＧは、一部の型の腫瘍細胞の応答を仲介し、ここで
浸潤性表現型は非浸潤性表現型に変換される。
【０１４２】 結合試験 ウテログロビンが非浸潤性表現型を仲介する機構を解明するために、これらの
細胞への放射能標識ｒｈＵＧの特異的結合を調べた。ｒｈＵＧ（２０μｇ）を［
125Ｉ］ヨウ化ナトリウムを使用して放射ヨード化した（２mCi；担体の無いＩ
ＯＤＯ−ＢＥＡＤＳ）。反応は、１５０μlのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で２５℃
で１０分行い、セファデックスＧ−２５スパンカラムクロマトグラフィー（１２
００×ｇで４分）により 125Ｉ−ｒｈＵＧを精製した。精製した担体の無い125
Ｉ−ｒｈＵＧの比活性は２５μCi/μgであった。１２ウェルプレート中のコンフ
ルエントな細胞（ＮＩＨ３Ｔ３、マウス肥満細胞腫、肉腫、リンパ腫および繊維
肉腫）を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１回洗浄し、０．５％ＢＳＡを含有する１ml
のハンクス液（ＨＢＳＳ）（ｐＨ７．６）中の異なる濃度の還元型 125Ｉ−ＵＧ
で、過剰の非標識還元型ｈＵＧの非存在下または存在下で、室温で２時間インキ
ュベートした。ＵＧは、１０mMのＤＴＴの存在下で３７℃で１５分還元した。非
結合 125Ｉ−ｈＵＧを迅速に除去して反応を停止させ、細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．
４）で３回洗浄し、１Ｎ ＮａＯＨを加え次に等量の１Ｎ ＨＣｌを加えて可溶
化した。放射能活性は、係数効率が約８０％のガンマカウンター（アイシーエヌ
バイオメディカルズ（ICN Biomedicals）、モデル１０／６００プラス）で測定
した。総結合から非特異結合を差し引いて、特異的結合を算出した。結合データ
は、リガンド（ＬＩＧＡＮＤ）コンピュータープログラムを使用してスキャチャ
ードプロットで解析し、その結果を図８に示す。
【０１４３】 125Ｉ−ｒｈＵＧ（還元型）の定常状態結合のスキャチャード解析は、ＮＩＨ
３Ｔ３細胞を使用して、解離定数（Ｋｄ）２０nMで特異的結合する単一のクラス
の存在を示す。肥満細胞腫、肉腫、およびリンパ腫への 125Ｉ−ｒｈＵＧ（還元
型）結合の解離定数は、２０〜２５nMの値に匹敵した。非還元型ホモダイマー 1 25 Ｉ−ｒｈＵＧを、これらの細胞への結合についても試験し、肥満細胞腫、肉腫
、およびリンパ腫タイプの細胞について３０〜３５nMのＫｄが得られた。還元型
または非還元型 125Ｉ−ｒｈＵＧのいずれの結合も、繊維肉腫細胞を使用して検
出されなかった。
【０１４４】 親和性架橋実験 これらの細胞上のＵＧ結合部位をさらに解析するために、非標識の還元型ｒｈ
ＵＧの非存在下および存在下で 125Ｉ−ｒｈＵＧ（還元型）を使用して、スベリ
ン酸ジスクシニミジル（ＤＳＳ）を用いて親和性架橋試験を行った。ＤＳＳ架橋
剤は、互いに近接しているタンパク質分子を共有結合させる。この非標識タンパ
ク質を加えると、これは結合部位について標識タンパク質と競合し、ウテログロ
ビンのみに対する結合特異性を証明している。
【０１４５】 ６ウェルプレートで増殖させたコンフルエントな細胞（ＮＩＨ３Ｔ３、マウス
肥満細胞腫、肉腫、リンパ腫および繊維肉腫）を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄
し、０．１％ＢＳＡを含有する２．０mlのＨＢＳＳ（ｐＨ７．６）中の還元型 1 25 Ｉ−ＵＧ（３．０nM）で、非標識還元型ＵＧ（１μM）の非存在下または存在
下で、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、細胞をさらに、２．
０mlのＨＢＳＳ（ｐＨ７．６）中の０．２０mM ＤＳＳと２０分インキュベート
させた。５０mMのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加えて反応を停止させ、
細胞を掻き取り、１０，０００×ｇで１５分遠心分離して採取し、６０μlの１
％トリトンＸ−１００溶液（１mM ＰＭＳＦ、２０μg/mlロイペプチンおよび２
０mM ＥＤＴＡを含有する）に溶解した。１０，０００×ｇで１５分遠心分離し
て得られた上清（３０μl）を、５％β−メルカプトエタノールの存在下で試料
緩衝液に懸濁し、５分沸騰させ、４〜２０％勾配のドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル（バイオラッド（Bio-Rad））で電気泳動した
。ゲルをクマシーブルーで短時間染色し、バイオラッド（Bio-Rad）ゲルドラー
ヤーで乾燥し、コダックＸ−ＯｍａｒｔＡｒＸ線フィルムを使用してオートラジ
オグラフィーを行った。
【０１４６】 ＮＩＨ３Ｔ３細胞（レーン１〜３）、マウス肥満細胞腫細胞（レーン４〜５）
、肉腫細胞（レーン６〜７）、およびリンパ腫細胞（レーン８〜９）へのｈＵＧ
結合タンパク質の親和性架橋の結果を図９に示す（レーン１：（−）ＤＳＳ；レ
ーン２：（＋）ＤＳＳ；レーン３：（＋）非標識ｈＵＧ、（＋）ＤＳＳ；レーン
４：（＋）ＤＳＳ；レーン５：（＋）非標識ｈＵＧ、（＋）ＤＳＳ；レーン６：
（＋）ＤＳＳ；レーン７：（＋）非標識還元型ｈＵＧ、（＋）ＤＳＳ；レーン８
：（＋）ＤＳＳおよびレーン９：（＋）非標識還元型ｈＵＧ、（＋）ＤＳＳ）。
非放射性であるが還元型ｈＵＧを、競合のために反応混合物に加えると、１９０
kDa バンド以外に４９kDa タンパク質バンドが存在し、両方のバンドの強度が低
下することに注目されたい。
【０１４７】 要約すると、ｒｈＵＧ（還元型）は、いくつかの腫瘍細胞株の浸潤性表現型の
喪失を仲介する。このｒｈＵＧ介在挙動変化に感受性の腫瘍細胞は、解離定数が
約２０〜３０nMと低い単一のクラスの特異的ｒｈＵＧ結合活性を有する。このｒ
ｈＵＧ結合活性は、１９０kDa と４９kDa に近い分子量を有する特異的タンパク
質に関連している。ｒｈＵＧ結合活性が欠如した繊維肉腫細胞の浸潤性は、ｒｈ
ＵＧの存在に影響されない。まとめるとこれらのデータは、外因性ｒｈＵＧ（還
元型または非還元型）は、ウテログロビン受容体を有する腫瘍細胞における浸潤
性の喪失を仲介することを示している。
【０１４８】 例１５．ウテログロビン親和性クロマトグラフィーによるウテログロビン受容体
の精製 ウテログロビン受容体を精製するために、いくつかのウシ組織で 125Ｉ−ｒｈ
ＵＧ結合測定法を使用して、受容体の組織分布を分析した。この操作の間、ＵＧ
結合活性は、主に組織と細胞の膜画分中にあり、ウテログロビン受容体が細胞膜
に局在化していることを示していた。
【０１４９】 ウシの心臓、脾臓、気管、肺、肝臓および大動脈から膜を調製した。ウシの脾
臓は、ＵＧが濃縮されていることがわかり、以後の精製のために選択した。ウシ
の脾臓を、１０mM重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）でホモジナイズした。
ホモジネートを６００×ｇで４℃で１０分遠心分離した。上清を２４，０００×
ｇで６０分遠心分離した。ペレットを、５０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４
）（１％トリトンＸ−１００、１０μg/mlロイペプチン、２mM ＥＤＴＡ、およ
び０．４mM ＰＭＳＦを含有）中で４℃で６時間攪拌して可溶化した。２４，０
００×ｇで９０分遠心分離して上清を採取し、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ
結合ＵＧ親和性カラムに適用した。セファロース４Ｂ結合ＵＧ親和性カラムは、
製造業者（ファルマシア（Pharmacia））の説明書に従って調製した。ＵＧ受容
体タンパク質を、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）（０．１％トリトン
Ｘ−１００、１０μg/mlロイペプチン、２mM ＥＤＴＡ、および０．４mM ＰＭ
ＳＦを含有）を使用してカラムから溶出し、直ちに２Ｍトリス−塩酸（ｐＨ８．
０）で中和した。ＵＧ結合タンパク質を含有する画分を、 125Ｉ−ＵＧ結合と親
和性架橋測定法により検出した。精製した受容体の均一性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で次に銀染色（バイオラッド（Bio-Rad））でチェックした。
【０１５０】 結果を図１０に示す。見かけの分子量が１８０と４０kDa の２つのタンパク質
バンドが明瞭に見えることに注目されたい。さらに見かけの分子量が３２kDa の
第３のバンドも検出される。すなわちインビトロで腫瘍細胞浸潤性の抑制を仲介
するウテログロビン受容体が、ウテログロビン親和性クロマトグラフィーにより
精製された。
【０１５１】 例１６．サイトカインによるウテログロビン受容体の発現の調節 炎症と免疫調節におけるウテログロビン受容体の可能な役割をより理解するた
めに、いくつかの炎症メディエーターに応答したウテログロビン受容体の発現を
ＮＩＨ３Ｔ３細胞で調べた。以前の報告は、ヒトウテログロビンが、いくつかの
サイトカインに対するヒトマクロファージとリンパ球の応答を仲介する（デイリ
ンク（Deirynck）ら、１９９５；１９９６）ことを示しており、免疫抑制物質と
してのウテログロビンの役割を示唆している。ｈＵＧの作用は、ＩＬ−２介在転
写活性化とＩＦＮ−γとＴＮＦ−αの新規合成とを抑制することであった。細胞
内制御プロセスにおけるそのような変化は、細胞外ｈＵＧとその受容体が参加し
なければならないシグナル伝達経路から生じる。従って、免疫および炎症応答の
間に、ＵＧ受容体シグナル伝達経路を操作することにより、サイトカインネット
ワーク中の有益な変化を起こす可能性がある。
【０１５２】 ＮＩＨ３Ｔ３細胞を既に記載されているように培養し、ｒｈＵＧ有りおよび無
しで免疫メディエーターを加えた。ＵＧ受容体のレベルを、 125Ｉ−ｒｈＵＧの
結合に続いて親和性架橋とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定した。結果を図１１
に示す。対照と比較して、それぞれＬＰＳとＩＬ−６で細胞を処理すると、ＵＧ
結合タンパク質である放射性バンドの強度が大きく上昇した。しかし、細胞をＰ
ＭＡ、ＰＤＧＦ、ＴＮＦαおよびＩＦＮγで処理すると、この差は明らかではな
かった。これらの結果は、ＵＧ受容体が、サイトカイン（ＩＬ−６）と前炎症メ
ディエーター（ＬＰＳ）の存在に応答することの予備的証拠を提供する。
【０１５３】 例１７．ＵＧ抑制性腫瘍細胞株での自己分泌および傍分泌ループの証明 癌細胞による細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の浸潤を抑制するＵＧの役割の可
能性を調べるために、４つのヒト細胞株（各々、子宮と前立腺の腺癌由来である
）を試験した。これらの臓器中の正常上皮は、ＵＧ遺伝子を比較的高レベルで構
成性に発現するため、これらの細胞株を選択した。まず、ＲＴ−ＰＣＲと免疫沈
降次にウェスタンブロッティングにより、腺癌由来の細胞株がＵＧ−ｍＲＮＡと
ＵＧタンパク質を発現するかどうかを調べることが必要であった。
【０１５４】 ヒトＵＧ真核生物発現ベクター作製体、細胞培養、トランスフェクションおよび
Ｇ４１８耐性クローン選択： ｐＧＥＭ ４Ｚ（ジー・マンティル（G. Mantile）、エル・ミーレ（L. Miele
）、イー・コルデラ−ミーレ（E. Cordella-Miele）、エイ・ビー・ムクヘルジ
ー（A.B. Mukherjee）、J. Biol. Chem. 268, 20343 (1993)）でクローン化した
ｈＵＧ ｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで消化した。完全長ｈＵＧ−ｃＤＮＡ断片を切
り出して、ＴＡベクター（インビトロジェン（Invitrogen））中にＥｃｏＲＩ部
位でサブクローン化した。ｈＵＧ−ｃＤＮＡ断片の向きは、ＤＮＡ配列決定によ
り証明した。この断片をＴＡベクターからＨｉｎｄIIIとＸｂａ１で消化して切
り出し、次に前もってＨｉｎｄIIIとＸｂａ１で消化してアガロースゲル電気泳
動により精製しておいたｐＲＣ／ＲＳＶ発現ベクター（インビトロジェン）中に
連結した。
【０１５５】 ヒト肺腺癌細胞株（ＨＴＢ−１７４）を、５％熱不活化ウシ胎仔血清を補足し
たＲＰＭＩ培地中で、３７℃で５％ ＣＯ2で培養し、一方残りの子宮（ＨＥＣ
−１Ａ）および前立腺（ＨＴＢ−８１）の腺癌に由来するヒト腫瘍細胞株を、１
０％ ＦＢＳを補足したマッコイ（McCoy's）５Ａ培地中で３７℃で５％ ＣＯ2 で維持した。腫瘍細胞株は、ｐＲＣ／ＲＳＶ−ｈＵＧ作製体またはｐＲＣ／ＲＳ
Ｖプラスミド（対照として）で電気穿孔法によりトランスフェクトした。２４時
間後、Ｇ４１８を、４００μg/mlの最終濃度で培地に加えた。個々のＧ４１８耐
性クローンを単離して、２００μg/mlのＧ４１８を含む培地中でさらに他の試験
のために維持した。
【０１５６】 ＲＴ−ＰＣＲによるＵＧ−ｍＲＮＡの検出： ＲＮＡゾル法（RNAzol method）（テル−テスト社（TEL-TEST, Inc.））を用
いて種々の細胞株から、総ＲＮＡを単離した。本試験に使用したプライマーは、
ペリ（Peri）ら、１９９３年に報告された。簡単に述べると、ｈＵＧ−ｃＤＮＡ
特異的プライマーのｈＵＧｒ（５’ＴＡＣＡＣＡＧＴＧＡＧＣＴＴＴＧＧＧＣ−
３’）を使用して逆転写を行った。次にＲＴ−ＰＣＲ産物を、プライマーｈＵＧ
Ｉ（５’ＡＴＧＡＡＡＣＴＣＧＣＴＧＴＣＡＣＣＣ−３’）およびプライマーｈ
ＵＧｒを用いるさらなる増幅のために使用した。次にＰＣＲ産物をブロットして
、ｈＵＧ特異的オリゴヌクレオチドプローブｈＵＧｐ（５’−ＴＧＡＡＧＡＡＧ
ＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＣＣ−３’）とのハイブリダイゼーションにより検出した
。ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ検出のために使用されるプライマーおよびプローブは、
以下のとおりである：
【０１５７】 ｈＧＡＰＤＨ−ｒ：（５’−ＣＡＡＡＧＴＴＧＴＣＡＴＧＧＡＴＧＡＣＣ−３’
）、 ｈＧＡＰＤＨ−Ｉ：（５’ＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＧＧＧＧ−３’）およ
び ｈＧＡＰＤＨ−ｐ：（５’−ＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴ−３’
）。
【０１５８】 免疫沈降およびウェスタンブロット分析： ＵＧ ｃＤＮＡトランスフェクションヒト子宮内膜腺癌（ＨＥＣ−１Ａ）およ
び前立腺癌（ＨＴＢ−８１）細胞溶解物を、ジー・マンティル（G. Mantile）ら
、J. Biol. Chem. 268, 20343 (1993)に報告された方法により免疫沈降させた。
簡単に述べると、細胞を洗浄し、溶解緩衝液中で溶解して遠心分離した。上清を
ウサギｈＵＧ抗体と共に１時間インキュベートし、次にプロテインＡ−アガロー
スと共に４℃で一晩インキュベートした。結合複合体を、遠心分離により回収し
、洗浄し、ＳＤＳ−試料緩衝液中で沸騰させることにより溶出した。試料を、Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、次にニトロセルロース膜に電気ブ
ロットした。ウェスタンブロット分析のために、ＵＧを含む膜をブロッキング液
中でブロックし、洗浄し、ヤギ抗ＵＧ抗体（１：２５０希釈）とインキュベート
した。膜を洗浄し、さらにウサギ抗ヤギＨＲＰ結合ＩｇＧ（１：２０００希釈）
と共にインキュベートして、製造業者（アマーシャム（Amersham））の説明書に
従って、増強化学発光（ＥＣＬ）法により検出した。
【０１５９】 子宮（ＨＥＣ−１Ａ）および前立腺（ＨＴＢ−８１）の、ｐＲＣ／ＲＳＶ−ｈ
ＵＧトランスフェクション腺癌および野生型腺癌から抽出された総ＲＮＡのＲＴ
−ＰＣＲ分析。ＰＣＲ産物をブロットして、ｈＵＧ特異的オリゴヌクレオチドプ
ローブとのハイブリダイゼーションにより検出した。ヒトＧＡＤＰＨ遺伝子は、
ＲＮＡ品質の内部対照として、およびピペット誤差を除外するために使用した。
【０１６０】 結果は、これらの細胞が、検出可能なレベルのＵＧ−ｍＲＮＡもＵＧ−タンパ
ク質も発現しないことを明らかにした（図１２ａと１２ｂ）。次にこれらの細胞
を、ヒトＵＧ（ｈＵＧ）−ｃＤＮＡ作製体であるｐＲＣ−ＲＳＶ−ｈＵＧで安定
にトランスフェクトした。非トランスフェクション細胞および偽（ベクターのみ
）トランスフェクション細胞を対照とした。結果は、ＵＧ−ｍＲＮＡおよびＵＧ
−タンパク質は対照細胞において検出不能であるが、ＵＧ−ｃＤＮＡトランスフ
ェクション細胞は、高レベルでＵＧ−ｍＲＮＡとＵＧ−タンパク質の両方を発現
することを示しており、本システムの妥当性を示している。
【０１６１】 例１８．腫瘍細胞表現型 これらの腺癌細胞株における強制ＵＧ−発現が、足場非依存性増殖およびＥＣ
Ｍを浸潤するこれらの能力（癌細胞の２つの最も重要な特徴）に何らかの影響を
及ぼすかどうかを決定するために、それぞれ軟寒天上の増殖およびマトリゲル（
Matrigel）（ＥＣＭ）浸潤について試験した。図１３に示すように、ＵＧの強制
発現は、ｐＲＣ−ＲＳＶ−ｈＵＧでトランスフェクトしたＨＥＣ−１Ａ細胞によ
る軟寒天上の足場非依存性増殖（図１３ａ）およびＥＣＭ浸潤（図１３ｂ）の劇
的な阻害を引き起こしたが、対照細胞または偽トランスフェクション細胞では引
き起こさなかった。ＨＥＣ−１Ａ腫瘍細胞のｐＲＣ／ＲＳＶ／ｈＵＧ−トランス
フェクションによるＥＣＭ浸潤の抑制は、非トランスフェクション対照のものに
比較して約７９％であった。肺、乳腺および前立腺の腺癌に由来する他の細胞株
は、軟寒天上の足場非依存性増殖またはＥＣＭ浸潤の抑制を示さなかった（デー
タは示していない）。
【０１６２】 精製ｈＵＧで腺癌細胞株を処理すると軟寒天上の足場非依存性増殖およびＥＣ
Ｍ浸潤を抑制できるかどうかを試験するために、非トランスフェクションか、ま
たは偽トランスフェクションの、上述の４つ全部の細胞株を使用して同じ測定法
を実施した。結果は、精製組換えｈＵＧでこれらの細胞を前処理すると、非トラ
ンスフェクションＨＥＣ−１Ａ細胞による軟寒天上の足場非依存性増殖、さらに
はＥＣＭ浸潤が劇的に抑制されることを示している。ＥＣＭ浸潤の阻害のこの百
分率は、ｐＲＣ−ＲＳＶ−ｈＵＧ−トランスフェクションＨＥＣ−１Ａ細胞を試
験して得られるものと非常に類似している（図１４）。上記結果は、ｐＲＣ−Ｒ
ＳＶ−ｈＵＧ−トランスフェクションＨＥＣ−１Ａ細胞による足場非依存性増殖
およびＥＣＭ浸潤の、ｈＵＧ介在性抑制の機作のさらなる研究を招いた。 非トランスフェクションかつｐＲＣ／ＲＳＶ−ＵＧ作製体、またはｐＲＣ／Ｒ
ＳＶプラスミドでトランスフェクトした子宮（ＨＥＣ−１Ａ）、前立腺（ＨＴＢ
−８１）および肺（ＨＴＢ１７４）腫瘍細胞株の両方について、軟寒天測定法を
実施した。細胞をトリプシン処理して、接種層として同じ培地を含む０．５％寒
天の５ml基底層の上に、同じ培地を含む２mlの０．３％ノーブル寒天中で６０mm
シャーレに接種した。ｐＲＣ／ＲＳＶ−ＵＧ作製体またはｐＲＣ／ＲＳＶプラス
ミドでトランスフェクトした細胞には、２００μg/ml Ｇ４１８を含む上部寒天
／培地を使用した。プレートを、３７℃および５％ ＣＯ2で１２〜１４日間イ
ンキュベートした。コロニーを、メディウム赤色（medium Red）染色液で染色し
て、用手法でカウントした。
【０１６３】 インビトロマトリゲル（Matrigel）浸潤測定法を、クンデュー（Kundu）ら、
１９９６年に報告されたように行った。簡単に述べると、細胞が約８０％コンフ
ルエンスに達したら、トリプシン処理して、０．１％ ＢＳＡを含むＰＢＳで２
回洗浄した。細胞を、０．１％ ＢＳＡを含むＤＭＥＭに再懸濁して、マトリゲ
ル（Matrigel）浸潤チャンバーの上部区画に入れた。チャンバーの下部区画に、
ＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞の増殖性培養液の上清から２４時間のインキュベーシ
ョン後に調製した細胞浸潤の化学誘引物質である、繊維芽細胞調整培地（ＦＣＭ
）を充填した。３７℃で３６時間インキュベート後、細胞をギムザ液で３分間染
色して、直ちに無水エタノールで２回（それぞれ５分間）洗浄した。非浸潤細胞
およびマトリゲル（Matrigel）は、フィルターの上部表面から湿った綿棒でこす
り取り、チャンバーを水で３回洗浄した。フィルター上に残った浸潤細胞は、倒
立顕微鏡下で計測して、トランスフェクション細胞からの浸潤細胞と対照細胞か
らのものとを比較して、細胞浸潤の百分率を計算した。
【０１６４】 軟寒天上の対照細胞（ｐＲＣ／ＲＳＶベクター単独でトランスフェクトした子
宮腺癌）の形態を、図１４（ａ）ＨＥＣ−１Ａに示し、一方軟寒天上のｈＵＧ発
現作製体でトランスフェクトした細胞の形態を、図１４（ｂ）ＨＥＣ−１Ａ／Ｕ
Ｇに示した。ｒｈＵＧの存在下の小さいサイズのコロニーは、ウテログロビンが
、ヒト腫瘍細胞の浸潤性だけでなく腫瘍細胞増殖も抑制していることを示してい
る。
【０１６５】 例１９．ＵＧ−受容体結合の証明 ｈＵＧが、受容体介在性経路を介してこの効果を発揮するかどうかを決定する
ために、 125Ｉ−ｈＵＧ結合および親和性架橋測定法を実施した。
【０１６６】125 Ｉ−ｈＵＧ結合測定法： ＵＧの放射ヨード化および結合実験を、クンデュー（Kundu）ら、１９９６年
に報告されたように実施した。簡単に述べると、ＵＧ（２０μg）を、 125Ｉ−
ヨウ化ナトリウム（２mCi；無担体）およびヨードビーズ（IODOBEADS）を使用し
て放射ヨード化した。 125Ｉ−ＵＧを、セファデックスＧ−２５スパンカラムク
ロマトグラフィー（１２００×ｇで４分間）により精製した。精製 125Ｉ−ＵＧ
の比活性は、２０μCi/μgであった。１２ウェルプレート中の非トランスフェク
ションコンフルエントＨＥＣ−１Ａ細胞およびヒトｐＲＳＶ／ｈＵＧトランスフ
ェクション細胞の両方ともＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄して、０．１％ ＢＳＡ
を含む１mlのハンクス液（Hanks Balanced Salt Solution）（ＨＢＳＳ）（ｐＨ
７．６）中の還元型 125Ｉ−ＵＧ（１．５nM）と共に、増大する濃度（１pM〜１
μM）の非標識還元型組換えｈＵＧの非存在下または存在下で室温で２時間イン
キュベートした。細胞を、ＰＢＳ（ｐＨ７．６）で洗浄して、１Ｎ ＮａＯＨ中
に可溶化し、次に等量の１Ｎ ＨＣｌを加えた。放射活性をガンマカウンターに
より測定した。特異的結合は、総結合から非特異的結合を差し引いて算出した。
リガンド（LIGAND）コンピュータプログラムを使用して、データのスキャッチャ
ード解析を実施した。これらの結果は、図８に示すものと同一であり、このこと
は、これが前に性状解析されたものと同じＵＧ受容体であることを示している。
【０１６７】 親和性架橋実験： 非トランスフェクション腺癌細胞およびｐＲＣ／ＲＳＶ／ｈＵＧトランスフェ
クション腺癌細胞を、６ウェルプレート中でコンフルエンスまで増殖させた。こ
れらをＰＢＳ（ｐＨ７．６）で洗浄して、還元型組換えヒト 125Ｉ−ＵＧ（３nM
）と共に、０．１％ ＢＳＡを含む２．０ml ＨＢＳＳ（ｐＨ７．６）中で、非
標識還元型ｈＵＧ（２５０nM）の非存在下および存在下で、室温で２時間インキ
ュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄して、０．２mMスベリン酸ジ
スクシミジル（ＤＳＳ）と共に２ml ＨＢＳＳ（ｐＨ７．６）中でさらに２０分
間インキュベートした。細胞をこすり取り、１５分間の遠心分離（１０，０００
×ｇ）により回収して、４０：１比の溶解緩衝液（１mM ＰＭＳＦ、ロイペプチ
ン（２０μg/ml）および２mM ＥＤＴＡを含む１％トリトンＸ−１００）中で溶
解した。上清を、５％β−メルカプトエタノールを含有する試料緩衝液中に再懸
濁した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離してオートラジオグラフィーを行っ
た。
【０１６８】 本実験の結果は、 125Ｉ−ｈＵＧが、ＨＥＣ−１Ａだけに高親和性（Ｋｄ＝２
５nM）と特異性（図１５ａと１５ｂ）で結合したが、他の全ての腺癌細胞株は、
この結合を欠いていた（データは示していない）ことを示している。ＵＧ受容体
は、ＨＥＣ−１Ａ（レスポンダー）細胞で同定されたが、ＨＴＢ−８１（非レス
ポンダー）細胞では同定されなかった。それぞれ、非トランスフェクション（ａ
）およびｐＲＳＶ／ｈＵＧトランスフェクションＨＥＣ−１ＡおよびＨＴＢ−８
１細胞上のその結合タンパク質との、 125Ｉ−ｈＵＧの親和性架橋。細胞を、結
合のために還元型 125Ｉ−ｈＵＧと共に非標識還元型ｈＵＧの非存在下および存
在下でインキュベートし、次にＤＳＳ（レーン１：（−）ＤＳＳ；レーン２：（
＋）ＤＳＳおよびレーン３：（＋）ｈＵＧ＋ＤＳＳ）と架橋させた。 125Ｉ−ｈ
ＵＧを使用する親和性架橋実験の結果は、ＨＥＣ−１Ａ細胞における１９０kDa
および４９kDa両方のＵＧ結合タンパク質が存在する（図１５ｂ）が、試験した
他の３つの腺癌細胞株では存在しない（示していない）ことを証明している。す
なわち、強制ＵＧ発現または精製ｈＵＧによる細胞の処理は、ｈＵＧ結合タンパ
ク質を発現する細胞のみのＥＣＭ浸潤を抑制する。
【０１６９】 例２０：ＵＧ欠乏マウスにおける腫瘍発生 これまでに、誕生から１年以上生存している全部で１６匹のＵＧ−／−マウス
（後期発症型）は、腎障害を示すだけでなく腫瘍も発症している。すなわち、加
齢ＵＧ欠乏マウスの全１６匹のマウス（１００％）が、現在までのところ腫瘍を
発症している。これらの腫瘍は種々の組織に生じ、なお性状解析が行われている
種々の腫瘍型である。それにもかかわらず、結果は、癌の発生におけるＵＧ欠乏
の重要性を証明しており、癌の治療および／または予防におけるｒｈＵＧの有用
な可能性を示している。
【０１７０】 例２１：ＨＣＧ関連因子（ＨＡＦ）としてのＵＧの同定 最近の報告は、妊娠初期に女性の尿に見い出されたＨＡＦと呼ばれるＨＣＧ（
ヒト絨毛性ゴナドトロピン）関連因子を記述しているが、これは、（１）カポジ
肉腫の腫瘍発生および転移をブロックし；（２）ＨＩＶ感染をブロックし；そし
て（３）造血を刺激する（ルナルディ−イスカンダル（Lunardi-Iskandar）ら、
１９９５；１９９８）。ＨＡＦは、ヒト尿からＨＣＧと同時精製され、ＨＣＧと
複合体を形成しうる。ヒトＵＧは、妊娠初期の女性の尿で増加している。ＵＧと
ＨＡＦは両方とも低分子量タンパク質（１５〜３０kDa ）であり、両方とも腫瘍
細胞の浸潤を抑制する。インビトロの予備試験では、 125Ｉ−ｒｈＵＧとＨＣＧ
（エアストラブズ社（Ayerst Labs, Inc.）から入手）が、実際に堅く結合した
複合体を形成することを示しており、このことは、ウテログロビンとＨＡＦが同
じタンパク質であることを示唆している。
【０１７１】 本発明を、現在最も実際的で好ましい実施態様と考えられる例に関連して説明
したが、本発明は開示された実施態様に限定されるものではなく、添付の請求の
範囲の精神と範囲に含まれる種々の変更や同等法を含むものと理解されたい。
【０１７２】 参考文献
【図面の簡単な説明】
添付の図面を参照して本発明をさらに詳細に説明する。
【図１】 図１は、ＵＧ様タンパク質の整列を示す。
【図２】 図２Ａは、トランスジェニックＵＧノックアウトマウスの目的のターゲティン
グ作製体を示す；制限部位は、Ｂ−ＢａｍIII、Ｅ＝ＥｃｏＲＩ、Ｈ＝ＨｉｎｄI
IIである；図２Ｂ〜２Ｄは、ＰＣＲとサザンブロット解析によるトランスジェニ
ック胚の子孫中の遺伝的作製体の証明を示す；（Ｂ）ターゲティングＥＳ Ｒ１
細胞クローンのサザンブロット解析、Ｗｔ＝野生型；（Ｃ）子孫の尾の生検から
のゲノムＤＮＡの代表的ＰＣＲ分析；遺伝子型とその対応するＰＣＲ産物は以下
の通りである：ＵＧ+/+ 、３０４塩基対；ＵＧ+/- 、３０４塩基対と６６７塩基
対；ＵＧ-/- 、６６７塩基対；（Ｄ）マウスの尾のゲノムＤＮＡのサザンブロッ
ト；図２Ｅは、ＲＴ−ＰＣＲ分析によるＵＧ-/- マウスの肺組織中にＵＧ−ｍＲ
ＮＡが存在しないことの確認を示す；同腹子の肺組織から抽出した総ＲＮＡの、
ＵＧ+/+ ＵＧ+/- およびＵＧ-/- 遺伝子型を用いるＲＴ−ＰＣＲ分析；２７３塩
基対のＲＴ−ＰＣＲ産物が、ＵＧ+/+ とＵＧ+/- マウスの肺中で検出されたが、
ＵＧ-/- マウスでは欠如していた；図２Ｆは、ウェスタン解析によるＵＧ-/- マ
ウスの肺中にＵＧタンパク質が欠如していることの確認を示す；肺溶解物からの
タンパク質（各３０μｇ）を、４〜２０％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥで非還元条件
下で電気泳動して分離し、ウサギ抗マウスＵＧを使用して免疫ブロットした；図
２Ｇは、細気管支上皮細胞中で、免疫組織学的方法を使用して、ＵＧ-/- マウス
の肺組織切片中にＵＧが欠如していることの確認を示す；ＵＧ+/+ マウス（上の
パネル）の細気管支上皮細胞の上の黒い染色は、ＵＧの免疫反応性を示す；ＵＧ -/- マウスの肺（下のパネル）中では免疫反応性が無いことに注意されたい。
【図３】 図３Ａ〜３Ｊは、正常マウス対ＵＧ+/+ マウスからの腎臓切片の組織学的分析
を比較したものであり、ノックアウトマウスでのみ異常な実質繊維化と糸球体Ｆ
ｎ沈着を示している；ＵＧ+/+ （Ａ）とそのＵＧ-/- （Ｂ）同腹子からの腎臓切
片のＨ＆Ｅ染色；（Ｃ）重症の実質繊維化を有する１０ヶ月令のマウスの腎臓切
片；（Ｄ）腎細管肥厚（倍率４０×、ｇ＝糸球体；ｆ＝繊維化；ｔ＝腎細管）を
示す（Ｃ）中の同じマウス腎臓の領域；（Ｅ）重症の腎疾患を有するＵＧ-/- マ
ウスの糸球体沈着物の透過電子顕微鏡（倍率６０００×）；（Ｆ）（Ｅ）内の挿
入図は倍率６０，０００×であり、コラーゲン（ｃｏｌ）を示す長い縞のある小
繊維構造とＦｎ小繊維に一致する短い拡散構造を示す；（Ｇ）マウスＦｎ抗体を
使用したＵＧ+/+ マウスからの腎臓切片のＦｎ免疫蛍光；（Ｈ）重症の腎疾患を
有するＵＧ-/- マウスからの腎臓切片のＦｎ免疫蛍光；ＵＧ+/+ （Ｉ）マウスと
ＵＧ-/- （Ｊ）マウスを用いる腎臓切片のメーソン（Mason）の三色染色；ＵＧ- /- マウス腎臓切片の糸球体の上の青い染色はコラーゲンである（倍率約４０×
）。
【図４】 図４Ａは、ＵＧ-/- マウスの腎臓中でのみＦｎ凝集物が存在することを示す；
ＵＧ+/+ マウスとＵＧ-/- マウスの血漿、腎臓、および肝臓からのＦｎの免疫沈
降とウェスタンブロッティング；ＵＧ-/- マウスの腎臓溶解物中でのみマルチマ
ー性のＦＮバンド（太い矢印）が検出された。 図４Ｂと４Ｃは、インビトロでのＵＧ−Ｆｎ複合体の形成を示す；（Ｂ）等モ
ルのＵＧとＦｎをインキュベートし、ＦｎまたはＵＧ抗体を用いて免疫沈降し、
ウェスタンブロッティングにより検出した；免疫沈降物は、Ｆｎ（レーン２、上
のパネル）とＵＧ（レーン２、下のパネル）の両方を含有する；両方のパネルの
レーン１は、ＦｎとＵＧ標準物質を示す；（Ｃ）等モルの 125Ｉ−ＵＧとＦｎを
４℃で１時間インキュベートし、得られた複合体を、６％非還元非変性ポリアク
リルアミドゲルで電気泳動して分離した；レーン１、クマシーブルー染色したＦ
ｎ−ＵＧヘテロマー；レーン２、そのオートラジオグラム。 図４Ｄは、正常であるがＵＧ-/- ではないマウスの血漿中のＵＧ−Ｆｎ複合体
の存在を示す；Ｆｎ抗体を用いてＵＧ+/+ とＵＧ*/- マウスの血漿の免疫沈降と
、ＦｎとＵＧ抗体を用いるウェスタンブロッティング；Ｆｎ（上のパネル）；Ｕ
Ｇ（下のパネル）；ｓｔｄ＝ＵＧとＦｎの標準物質。 図４Ｅは、インビトロでのＵＧによるＦｎ自己凝集の用量依存性阻害を示す；
異なる量のＵＧの非存在下（レーン２）および存在下（レーン３〜５）での、非
標識Ｆｎによる 125Ｉ−Ｆｎの親和性架橋；ＵＧの非存在下で形成された非常に
高分子量の放射能Ｆｎバンド（レーン２）の強度は、用量依存性に低下している
；レーン１、ＵＧとＤＳＳの非存在下での非標識Ｆｎを有する 125Ｉ−Ｆｎ；白
矢頭−マルチマーＦｎ；下の細い矢印＝２２０kDa のＦｎ。 図４Ｆは、ＵＧによるＦｎ−コラーゲン複合体形成の阻害を示す；ＵＧの非存
在下（レーン３）および存在下（レーン４）での、非標識Ｆｎによる 125Ｉ−コ
ラーゲンの親和性架橋；レーン１、クマシーブルー染色コラーゲンＩ；コラーゲ
ンＩのアルファ1 アルファ1 鎖とコラーゲンＩのアルファ2 −アルファ2 鎖；レ
ーン２、ＵＧとＤＳＳの非存在下での 125Ｉ−コラーゲンと非標識Ｆｎ。
【図５】 図５Ａ〜５Ｆは、ＵＧの非存在下のみの、正常マウスとＵＧ-/- マウスの腎臓
中のＦｎ沈着の免疫組織学的分析を示す；（Ａ）等モルのＦｎとＵＧの混合物を
静脈内投与した野生型マウスの腎臓切片；（Ｂ）（Ａ）と同じ投与量のＦｎを投
与したがＵＧを投与していないＵＧ+/+ マウス；（Ｃ）ＦｎとＵＧの混合物を投
与した見かけが健常なＵＧ-/- マウス；（Ｄ）Ｆｎのみ（（Ｃ）と同じ投与量）
を投与しＵＧを投与していないＵＧ-/- マウス；（Ｅ）可溶性ｈＦｎのみを補足
した培地中で増殖した培養細胞によるＦｎ原線維発生；（Ｆ）等モルの可溶性ｈ
ＦｎとＵＧの混合物を含有する培地を与えた（Ｅ）と同じ細胞培養物（倍率４０
×、ｇ＝糸球体）。
【図６】 図６Ａ〜６Ｂは、臨床試料中のＵＧ−Ｆｎ複合体を検出するための診断測定法
のフォーマットを示す。
【図７】 図７は、ＵＧダイマーが８．０kDa ＭＷＣＯ透析膜を通過するが、３．４kDa
ＭＷＣＯ透析膜を通過しないことを示す。
【図８】 図８は、 125Ｉ−ｈＵＧ（還元型）のＮＩＨ３Ｔ３細胞への特異的結合のスキ
ャチャードプロットを示す。３つの実験のデータであり、各データ点は、３回測
定の平均である。
【図９】 図９は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（レーン１〜３）、肥満細胞種細胞（レーン４〜５
）、肉腫細胞（レーン６〜７）、およびリンパ腫細胞（レーン８〜９）に対する
、ｈＵＧ結合タンパク質の親和性架橋のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のオートラジオグ
ラフである。還元型 125Ｉ−ｈＵＧをこれらの各細胞と、結合のために非標識還
元型ｈＵＧの非存在下または存在下でインキュベートし、次にスベリン酸ジスク
シニミジル（ＤＳＳ）で架橋させた（レーン１：（−）ＤＳＳ；レーン２：（＋
）ＤＳＳ；レーン３：（＋）非標識ｈＵＧ、（＋）ＤＳＳ；レーン４：（＋）Ｄ
ＳＳ；レーン５：（＋）非標識ｈＵＧ、（＋）ＤＳＳ；レーン６：（＋）ＤＳＳ
；レーン７：（＋）非標識還元型ｈＵＧ、（＋）ＤＳＳ；レーン８：（＋）ＤＳ
Ｓ；およびレーン９：（＋）非標識還元型ｈＵＧ、（＋）ＤＳＳ）。
【図１０】 図１０は、親和性精製したＵＧ結合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のオー
トラジオグラフを示す。
【図１１】 図１１は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞によるＵＧ結合タンパク質の発現に及ぼす異なる
サイトカインおよび他の物質の作用の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のオートラジオグ
ラフを示す。
【図１２】 図１２Ａは、子宮と前立腺のｐＲＣ／ＲＳＶ−ｈＵＧトランスフェクトしたお
よび野生型（ＷＴ）腺癌から抽出した総ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。レー
ン１と２は、異なるクローン単離体である。図１２Ｂは、トランスフェクトして
いない細胞株とトランスフェクトした細胞株により産生された、ウテログロビン
タンパク質のウェスタンブロット解析を示す。
【図１３】 図１３Ａと１３Ｂは、ＨＥＣ−１Ａ細胞によるＥＣＭ浸潤に及ぼすｈＵＧの誘
導発現の作用を示す。
【図１４】 図１４は、軟寒天上の対照細胞（ｐＲＣ／ＲＳＶベクター単独でトランスフェ
クトした子宮腺癌）の形態を（ａ）ＨＥＣ−１Ａに示し、軟寒天上のｈＵＧ発現
作製体でトランスフェクトした細胞の形態を（ｂ）ＨＥＣ−１Ａ／ＵＧに示す。
【図１５】 図１５は、ＵＧ受容体がＨＥＣ−１Ａ（レスポンダー）細胞には存在するが、
ＨＴＢ−８１（ノンレスポンダー）細胞には存在しないことを示す（レーン１：
（−）ＤＳＳ；レーン２：（＋）ＤＳＳ；およびレーン３：（＋）ｈＵＧ、（＋
）ＤＳＳ）。トランスフェクトしていない細胞（ａ）とｐＲＳＶ／ｈＵＧトラン
スフェクトしたＨＥＣ−１ＡとＨＴＢ−８１細胞上の、 125Ｉ−ｈＵＧとその結
合タンパク質との親和性架橋を示す。細胞を、非標識還元型ｈＵＧの非存在下お
よび存在下で結合についてインキュベートし、次にＤＳＳで架橋する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/00 Ａ６１Ｐ 35/00 35/00 37/02 37/02 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 14/46 Ｃ０７Ｋ 14/46 16/18 16/18 17/00 17/00 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/53 33/53 33/566 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 ピロン、アプリル アメリカ合衆国 メリーランド、ガイザー スバーグ、 ランブリング ロード 11333 (72)発明者 ムクヘルジー、アニル、ビー アメリカ合衆国 メリーランド、ブルック ビル、 ピー、オー、ボックス 136 (72)発明者 ズアン、ゾンジヤン アメリカ合衆国 メリーランド、ロックビ ル、 チャンティリイ ロード 10

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 原発性癌細胞増殖の予防または治療方法であって、そのよう
    な予防または治療の必要な患者に、腫瘍抑制有効量の組換えヒトウテログロビン
    （ｒｈＵＧ）またはその断片もしくは誘導体を投与することを含んでなる上記方
    法。
  2. 【請求項２】 腫瘍抑制有効量のｒｈＵＧを投与することによりウテログロ
    ビン受容体をターゲティングすることをさらに含んでなる、請求項１に記載の方
    法。
  3. 【請求項３】 腫瘍抑制有効量のｒｈＵＧと薬剤学的に許容される担体また
    は希釈剤とを含んでなる医薬組成物。
  4. 【請求項４】 ｒｈＵＧは、約７５％〜約１００％の純度を有する、請求項
    ３に記載の医薬組成物。
  5. 【請求項５】 ｒｈＵＧは、約９０％〜約１００％の純度を有する、請求項
    ３に記載の医薬組成物。
  6. 【請求項６】 ｒｈＵＧは、少なくとも約９５％の純度を有する、請求項３
    に記載の医薬組成物。
  7. 【請求項７】 ｒｈＵＧは、還元型でありかつモノマー型である、請求項３
    に記載の医薬組成物。
  8. 【請求項８】 フィブロネクチン凝集および／または沈着を阻害することに
    よる腫瘍転移の予防または治療方法であって、そのような予防または治療の必要
    な患者に、フィブロネクチン阻害有効量のｒｈＵＧまたはその断片もしくは誘導
    体を投与することを含んでなる上記方法。
  9. 【請求項９】 フィブロネクチン阻害有効量のｒｈＵＧを投与することによ
    りウテログロビン受容体をターゲティングすることをさらに含んでなる、請求項
    ８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 造血刺激方法であって、そのような刺激の必要な患者に、
    造血刺激有効量のｒｈＵＧまたはその断片もしくは誘導体を投与することを含ん
    でなる上記方法。
  11. 【請求項１１】 造血刺激有効量のｒｈＵＧを投与することによりウテログ
    ロビン受容体をターゲティングすることをさらに含んでなる、請求項１０に記載
    の方法。
  12. 【請求項１２】 造血刺激有効量のｒｈＵＧまたはその断片もしくは誘導体
    と、薬剤学的に許容される担体または希釈剤とを含んでなる医薬組成物。
  13. 【請求項１３】 ｒｈＵＧは、約７５％〜約１００％の純度を有する、請求
    項１２に記載の医薬組成物。
  14. 【請求項１４】 ｒｈＵＧは、約９０％〜約１００％の純度を有する、請求
    項１２に記載の医薬組成物。
  15. 【請求項１５】 ｒｈＵＧは、少なくとも９５％の純度を有する、請求項１
    ２に記載の医薬組成物。
  16. 【請求項１６】 ウテログロビン構造類似体および／またはＵＧ受容体リガ
    ンドの１つまたはそれ以上の化合物、ペプチドおよび／またはタンパク質を含む
    試料のスクリーニング方法であって、 （ａ）試料に精製ウテログロビン受容体を接触させ； （ｂ）受容体と試料との結合作用（この結合は、試料中にウテログロビン構造
    類似体および／またはＵＧ受容体リガンドが存在することを意味する）を検出す
    る、ことを含んでなる上記方法。
  17. 【請求項１７】 精製ウテログロビン受容体を含むウテログロビン構造類似
    体および／またはＵＧ受容体リガンドのスクリーニングのためのキット。
  18. 【請求項１８】 試料からウテログロビン受容体を精製する方法であって、 （ａ）試料に、固層支持体に結合したｒｈＵＧを接触させ； （ｂ）固層支持体からウテログロビン受容体の精製試料を溶出する、ことを含
    んでなる上記方法。
  19. 【請求項１９】 酸化ｒｈＵＧに還元剤を、ｒｈＵＧを還元するのに充分な
    時間と温度で接触させることを含んでなる、還元型ｒｈＵＧの調製方法。
  20. 【請求項２０】 還元型ｒｈＵＧはモノマー型である、請求項１９に記載の
    方法
  21. 【請求項２１】 精製ウテログロビン受容体で動物を免疫し、該受容体に対
    する抗体を単離することを含んでなる、ウテログロビン受容体に対する抗体の作
    成方法。
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