CN109498817A - 一种多细胞靶向脂质体 - Google Patents

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Abstract

本发明属于脂质体制剂在肿瘤药物制备中的应用领域，具体涉及一种多细胞靶向脂质体的构建和应用，因为单个脂质体中包含了多个针对不同细胞的抗体，并通过分子自组装构成具有稳定结构和体内长循环特性的脂质体，通过抗体的作用可以序贯或者同时结合多个不同的细胞，促进不同细胞间的识别、通讯、细胞毒性、促凋亡或清除等作用。

Description

一种多细胞靶向脂质体
技术领域
本发明属于药物制剂、脂质体药物载体和抗体靶向技术领域，具体涉及一种与免疫效 应细胞和靶细胞同时作用的多细胞靶向脂质体药物制剂。
背景技术
脂质体是一种基于磷脂和/或胆固醇构成的具有双分子层囊泡状结构的药物载体。脂质 体是人工制备的由脂质分子形成的双分子层囊泡。由于脂质分子具有亲水头部和疏水尾部，
其可以在内部水相中(内水相)包载亲水性药物，在脂质双层膜中则可以嵌入疏水性药 物。此外，由于脂质体具有良好的组织相容性，毒性低、生物安全，使其在药物输送体系 领域得到了广泛的关注与应用。尤其是脂质体靶向技术的发展，赋予了脂质药物载体独特 的体内行为，使其具有向靶点部位富集，进而与靶细胞特异性相互作用的能力。人们希望， 通过优化靶点的选择，以及通过改进靶向配体的结构及性能，能够转化成脂质体药物临床 疗效的改善，包括降低药物系统毒性、提高治疗指数等。
靶向脂质体药物输送系统的研发思路是，针对以肿瘤细胞表面高表达或特异性表达的 受体为靶标，设计各种类型的主动靶向配体和药物载体。根据这一设计思路开发而来的主 动靶向药物具有相比于无靶向载体输送的游离药物更优化的病灶部位靶向能力，例如靶部 位药物浓度的提高、药效学的改善等。然而，由于这一类靶向给药系统的只作用于某一特 定种类的肿瘤细胞，因此不但不足以有效清除肿瘤，反而可能诱发微小残留病变、肿瘤多 药耐药等问题的产生。
近年来，得益于人们对肿瘤异质性的认识的提升，单细胞靶向局限性背后的机理得以 阐明。比如，不同患者间肿瘤分子标记的差异，同一患者同一肿瘤内的不同肿瘤细胞间分 子标记的差异，同一肿瘤内存在不同的细胞种类及其相互作用等。针对肿瘤异质性的特点， 研究人员将靶向输送的设计思路进行了扩展。比如，双靶点脂质体能够增强载体和细胞间 的结合能力，促进细胞对药物的摄取；靶向肿瘤相关细胞的药物载体可通过其它机制抑制 肿瘤生长，如作用于肿瘤新生血管、成纤维细胞、肿瘤干细胞等。
虽然这类靶向输送技术带来一定程度的治疗改善，其设计思路仍然没有跳出单细胞靶 向的既定框架。肿瘤内部不同细胞间存在着广泛的动态相互作用，例如淋巴细胞浸润、巨 噬细胞吞噬、抗原递呈、基于细胞因子和外泌体的细胞间通讯等，这些相互作用既包括抑 制肿瘤生长的免疫监视和清除，也包括促进肿瘤生长的微环境。并且，阻断或促进这些细 胞间相互作用已在临床实践中证明是可行且有效的，例如基于抗原特异性T细胞的疫苗疗 法、依赖于NK细胞细胞毒性作用的抗体疗法、阻断肿瘤免疫逃逸作用的免疫哨卡抑制剂 疗法等。相比之下，单一细胞靶向的药物输送系统只能通过针对特定靶细胞调节生理过程， 却无法利用肿瘤组织内细胞间的相互作用而实现有效治疗。
由此，将针对不同细胞的抗体修饰在单个脂质体上，通过分子自组装构成具有稳定结 构和体内长循环特性的脂质体，通过抗体的作用序贯或者同时结合多个不同的细胞，从而 实现促进或阻断细胞间相互作用，以调节不同细胞间的识别、通讯、细胞毒性、促凋亡或 清除等作用。并且，利用脂质药物载体，实现针对多细胞的靶向药物输送，改善药理作用的同时，避免组合疗法中可能出现的药物相互作用等问题。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种能够序贯或者同时 结合多种不同细胞的多细胞靶向脂质体药物制剂及其制备与应用。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种多细胞靶向脂质体，其结构中包括脂质体、修饰于脂质体 表面的主要抗体和辅助抗体，所述主要抗体特异性结合靶细胞表面的靶分子，所述辅助抗体 特异性结合于免疫效应细胞。
进一步地，所述多细胞靶向脂质体能够同时或序贯结合免疫效应细胞和靶细胞，从而实 现免疫效应细胞对靶细胞识别和免疫效应的激活。
进一步地，每个脂质体上主要抗体和辅助抗体的摩尔比例在100/1到1/1之间。
进一步地，每个脂质体表面有1-1000个主要抗体和1-1000个辅助抗体。
进一步地，所述主要抗体和辅助抗体分别通过共价连接或者疏水亲水相互作用而展示在 脂质体表面。
如本发明一些实施方式中所例举的，所述主要抗体和辅助抗体分别与所述脂质体中的脂 质分子连接。所述脂质分子带有马来酰亚胺基团。所述主要抗体和辅助抗体分别与脂质分子 的马来酰亚胺基团连接。所述主要抗体和辅助抗体分别与脂质分子通过硫醚键连接。
进一步地，所述靶细胞选自肿瘤细胞、微生物或微生物感染的细胞。因此，所述主要抗 体针对的抗原选自微生物抗原、肿瘤相关抗原、肿瘤细胞表面特异性抗原、肿瘤细胞表面高 表达的抗原、肿瘤组织或肿瘤血管中高表达的抗原。也就是所述靶分子选自微生物抗原、肿 瘤相关抗原、肿瘤细胞表面特异性抗原、肿瘤细胞表面高表达的抗原、肿瘤组织或肿瘤血管 中高表达的抗原。
进一步地，所述主要抗体的特异性靶分子选自CD19，CD20，PSMA，Her2/neu，EGFR，LGR5或PDL1。
本发明一些实施方式中，列举了所述主要抗体的特异性靶分子为CD19。所述CD19为 人B淋巴细胞白血病或人B细胞淋巴瘤的人CD19抗原。
进一步地，所述免疫效应细胞为能够对靶细胞产生细胞毒性、促凋亡或清除作用的效应 细胞。所述免疫效应细胞选自T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞或中性粒细胞。 因此，所述辅助抗体针对的抗原选自肿瘤细胞、淋巴细胞或髓系细胞所表达的抗原。所以， 所述多细胞靶向脂质体可以同时或序贯结合肿瘤细胞、淋巴细胞、或髓系细胞。即同一个脂 质体先结合肿瘤细胞再结合淋巴细胞，或反之。
本发明一些实施方式中，列举了所述所述免疫效应细胞为T淋巴细胞。
本发明的一些实施方式列举了所述免疫效应细胞的效应抗原为CD3，所述辅助抗体为 CD3抗体。
进一步地，所述辅助抗体选自CD3抗体及片段，PD1抗体及片段，CTLA4抗体及片段，CD40L抗体及片段。
所述T淋巴细胞可以是未经激活的T细胞，也可以是经体外活化或扩增的T细胞，例如，抗原特异性T淋巴细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、细胞毒T细胞、辅助性T细胞、淋巴因 子激活的杀伤细胞(LAK细胞)、γδT细胞、嵌合抗原受体T细胞、T细胞受体嵌合型T细 胞。
所述T淋巴细胞是未经激活的T细胞，或是经体外活化或扩增的T细胞。
所述活化或扩增可以是经抗原、抗体、多肽、多肽-主要组织相容复合物、小分子、细 胞因子、免疫检查点抑制剂、基因编辑而活化或扩增。
进一步地，所述主要抗体和辅助抗体的形式选自IgG，Fab’片段、F(ab’)2片段、Fab片 段、单链Fv片段、微抗体(minibody)、纳抗体(nanobody)、单域抗体(unibody)、或双域抗体(diabody)。
本发明的一些实施方式中例举了：所述抗体为抗体的Fab’片段，为抗体去除Fc片段并 还原后获得。包括轻链可变区和重链可变区。
本发明的一些实施方式中例举了所述主要抗体为CD19抗体的Fab‘片段，其轻链可变 区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLEIK。
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWG QGTTLTVFS。
此外，主要抗体可以是Her2抗体，所述Her2抗体的LC序列如SEQ ID NO.3所示， 具体为：
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
所述Her2抗体的HC序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：
MEFGLSWVFLVAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK V。
所述主要抗体还可以是EGFR抗体的scFv片段，所述EGFR抗体scFv的VH序列如 SEQID NO.5所示，具体为：
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVT VSA。
所述EGFR抗体的VL序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELK。
所述主要抗体还可以是PSMA抗体，所述PSMA抗体的VH序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：
QVQLVESGGGLVKPGESLRLSCAASGFTFSDYYMYWVRQAPGKGLEWVAIISDGGYYTYYSDIIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARGFPLLRHGAMDYWGQGT LVTVSS。
所述PSMA抗体的VL序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGQAPKSLIYSASYRYSDVPSRFSGSASGTDFTLTISSVQSEDFATYYCQQYDSYPYTFGGGTKLEIK。
所述主要抗体还可以是PDL1抗体，所述PDL1抗体的重链序列如SEQ ID NO.9所示，具体为：
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYIMMWVRQA PGKGLEWVSS 50
IYPSGGITFY ADTVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARIK 100
LGTVTTVDYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK 150
DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 200
YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP 250
KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN 300
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ 350
VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 400
LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 450。
所述PDL1抗体的轻链序列如SEQ ID NO.10所示，具体为：
QSALTQPASV SGSPGQSITI SCTGTSSDVG GYNYVSWYQQ HPGKAPKLMI 50
YDVSNRPSGV SNRFSGSKSG NTASLTISGL QAEDEADYYC SSYTSSSTRV 100
FGTGTKVTVL GQPKANPTVT LFPPSSEELQ ANKATLVCLI SDFYPGAVTV 150
AWKADGSPVK AGVETTKPSK QSNNKYAASS YLSLTPEQWK SHRSYSCQVT 200
HEGSTVEKTV APTECS。
本发明的一些实施方式中例举了所述辅助抗体为CD3抗体的Fab‘片段，所述CD3抗体 的VH序列如SEQ ID NO.11所示，具体为：
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTL TVSS。
所述CD3抗体的VL序列如SEQ ID NO.12所示，具体为：
DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK。
或者，所述CD3抗体的VH序列如SEQ ID NO.13所示，具体为：
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFG NSYISYWAYWGQGTLVTVSS。
所述CD3抗体的VL序列如SEQ ID NO.14所示，具体为：
QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLT VLA。
所述辅助抗体还可以是PD-1抗体，所述PD-1抗体的VH序列如SEQ ID NO.15所示，具体为：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS。
所述PD-1抗体的VL序列如SEQ ID NO.16所示，具体为：
LEMAEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK。
本发明对于脂质体的成分没有特殊的限制，只要是脂质体即可。所述脂质体的组成成 分可选自蛋磷脂、氢化大豆磷脂酰胆碱、氢化蛋磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉 豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈 酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-亚油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、氢化二棕榈 酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰 磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰 乙醇胺、脑磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、蛋磷脂酰 甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷 脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、脑鞘磷脂、二棕榈酰鞘磷脂或二硬脂酰鞘磷脂、胆固醇、 二油氧基丙基三甲基氯化铵(DOTAP)、二油酰氯丙基氯化三甲铵(DOTMA)、双十八烷基二 甲基溴化铵(DDAB)、二甲基胺乙基胺基丙酰基-胆固醇(DC-Chol)、精胺-5-羧基氨基乙 酸二十八烷基酰胺(DOGS)、二油酰琥珀酰甘油胆碱酯(DOSC)、二油酰氯精胺羧基酰胺乙 基二甲基丙基三氟乙酸铵(DOSPA)、中的任一种或它们的两种或两种以上的组合。
如本发明的一些实施方式中所列举的，所述脂质体的组成成分包括磷脂酰胆碱，胆固 醇、连接主要抗体的脂质和连接辅助抗体的脂质分子。
进一步地，所述脂质体可以是空白脂质体，也可以是载药脂质体。
本发明的第二方面，提供前述多细胞靶向性脂质体的制备方法，为采用后插入法制备， 包括如下步骤：
(1)分别将主要抗体和辅助抗体与脂质分子连接，获得主要抗体-脂质分子和辅助抗体 -脂质分子；
(2)将获得的主要抗体-脂质分子和辅助抗体-脂质分子与已构建好的脂质体混合、孵 育，获得混合溶液；
(3)将所得混合溶液经透析或超滤去除未载入的抗体和抗体脂质复合物，得多细胞靶 向脂质体。
优选地，所述主要抗体与脂质分子的摩尔比范围是：(0.1-5):1000。
优选地，所述辅助抗体与脂质分子的摩尔比范围是：(0.1-5):1000。
本发明的第三方面，提供前述多细胞靶向脂质体在制备免疫治疗药物、抗肿瘤药物 中的应用。
本发明的第四方面，公开了一种治疗肿瘤的方法，包括步骤：将前述多细胞靶向脂质体施用于肿瘤患者。所述方法可以是体外的。所述方法可以是非治疗目的的。所述肿 瘤可以为细胞表面为CD19阳性的肿瘤。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的多细胞靶向脂质体具备与多靶向抗体类似的作用机制，但进一步地提出了通过 主要抗体和辅助抗体的密度和相对比例的调整，优化针对不同靶细胞和靶分子的效应细胞激 活效应；更进一步地，通过脂质体中装载的药物对靶细胞和效应细胞的作用进一步加强；最 后，多细胞脂质体的生产、制备和质量控制也较多靶向抗体而言更为可行。
附图说明
图1A：CD3全长抗体、纯化抗CD3抗体F(ab’)2片段、抗CD3抗体Fab’片段-高分子-DSPE 连接产物的还原型和非还原型SDS-PAGE图，考马斯亮蓝染色。
图1B：CD19全抗体、纯化抗CD19抗体F(ab’)2片段、抗CD19抗体Fab’片段-高分子-DSPE 连接物的SDS-PAGE图，考马斯亮蓝染色。
图1C：抗CD3单链抗体(scFv)片段、抗CD3单链抗体(scFv)片段-高分子-DSPE连接物的SDS-PAGE图，考马斯亮蓝染色。
图2：为多细胞靶向、单靶向、无靶向脂质体的粒径分布。
图3A：CD3及CD19多细胞靶向和单靶向脂质体的靶细胞Jurkat特异性结合。
图3B：CD3及CD19多细胞靶向和单靶向脂质体的靶细胞Raji特异性结合。
图4：为多细胞靶向、单靶向、无靶向脂质体介导CD3+和CD19+靶细胞的细胞间结合。
图5A：多细胞靶向脂质体介导预先激活的效应细胞对靶细胞Raji的细胞杀伤作用， 以LDH法检测加药24小时后的细胞毒性，效应细胞为经过CD3和CD28抗体激活扩增3 天后的T细胞。
图5B：多细胞靶向脂质体介导预先激活的效应细胞对靶细胞Raji的细胞杀伤作用， 以LDH法检测加药24小时后的细胞毒性，效应细胞为经过人IL-2激活扩增的LAK细胞。
图6A：为多细胞靶向脂质体介导预先激活的效应细胞对靶细胞Raji的细胞杀伤作用， 效应细胞为经过唑来膦酸扩增的人γδT细胞，以LDH法检测加药24小时后的细胞毒性，不同效应细胞/靶细胞比例的细胞杀伤情况。
图6B：为多细胞靶向脂质体介导预先激活的效应细胞对靶细胞Raji的细胞杀伤作用， 效应细胞为经过唑来膦酸扩增的人γδT细胞，以LDH法检测加药24小时后的细胞毒性，为不同剂量、靶向的脂质体介导细胞杀伤的情况。
图6C：为多细胞靶向脂质体介导预先激活的效应细胞对靶细胞Raji的细胞杀伤作用， 效应细胞为经过唑来膦酸扩增的人γδT细胞，以LDH法检测加药24小时后的细胞毒性，为不同剂量、靶向的脂质体介导细胞杀伤的情况。
图7A：为多细胞靶向脂质体介导未刺激的效应细胞对靶细胞Raji的细胞杀伤作用，效 应细胞为未激活的人淋巴细胞；以PI染色法检测加药5小时后的细胞毒性，亦即，加药5 小时后的靶细胞杀伤情况。
图7B：为多细胞靶向脂质体介导未刺激的效应细胞对靶细胞Raji的细胞杀伤作用， 效应细胞为未激活的人淋巴细胞；以PI染色法检测加药24小时后的细胞毒性，亦即，加药24小时后的靶细胞杀伤情况。
图8A：为多细胞靶向脂质体介导未刺激淋巴细胞对靶细胞Raji细胞的杀伤作用，效应 细胞为未激活的人淋巴细胞；不同效应细胞/靶细胞比例的细胞杀伤情况(PI染色法)。
图8B：为多细胞靶向脂质体介导未刺激淋巴细胞对靶细胞Raji细胞的杀伤作用，效应 细胞为未激活的人淋巴细胞；为不同剂量、靶向的脂质体介导细胞杀伤的情况(LDH法)。
图8C：为多细胞靶向脂质体介导未刺激淋巴细胞对靶细胞Raji细胞的杀伤作用，效应 细胞为未激活的人淋巴细胞；为不同剂量、靶向的脂质体介导细胞杀伤的情况(LDH法)。
图9A：为多细胞靶向脂质体介导未刺激淋巴细胞的靶细胞杀伤作用，效应细胞为未 激活的淋巴细胞，靶细胞为靶细胞Raji细胞细胞；以LDH法检测加药5小时后的细胞毒性。 其中，多细胞靶向脂质体的主要抗体不再是抗CD3抗体UCHT1克隆的Fab’2片段，而更换为不同克隆的抗CD3IgG单克隆抗体(2C11)。
图9B：为多细胞靶向脂质体介导未刺激淋巴细胞的靶细胞杀伤作用，效应细胞为未 激活的人淋巴细胞，靶细胞为CD19+人B淋巴细胞白血病SUP-B15细胞；以LDH法检测 加药24小时后的细胞毒性。
图9C：为多细胞靶向脂质体介导未刺激淋巴细胞的靶细胞杀伤作用，效应细胞为未 激活的CD4+T淋巴细胞，靶细胞为LGR5+人非小细胞肺癌A549细胞；以LDH法检测加 药5小时后的细胞毒性。其中，多细胞靶向脂质体的辅助抗体为LGR5抗体。
图10：为多细胞靶向脂质体介导未刺激淋巴细胞对靶细胞Raji细胞杀伤作用下的IFN-γ分泌情况，效应细胞为未激活的人淋巴细胞，其中，PxP是指不靶向脂质体组，HxP 是指CD19单靶向脂质体组，UxP是指CD3单靶向脂质体组，UxH是指CD19及CD3多细 胞靶向脂质体组。
图11：为多细胞靶向脂质体介导未刺激淋巴细胞对靶细胞Raji细胞杀伤作用下，不 同浓度EGTA的影响，效应细胞为未激活的人淋巴细胞。
图12：为多细胞靶向脂质体介导未刺激淋巴细胞的靶细胞杀伤作用，效应细胞为未激 活的人淋巴细胞，靶细胞为CD19+Raji细胞；以LDH法检测加药24小时后的细胞毒性，UxH-lipo是指多细胞靶向空白脂质体组，UxH-DAS-lipo是指多细胞靶向达沙替尼脂质体组。
具体实施方式
脂质体(liposomes)是人工制备的由脂质分子形成的双分子层囊泡。脂质分子的结构通 常由亲水头部、疏水尾部及连接部分三个部分组成。在水的介质中，由于疏水相互作用，脂 质分子的疏水尾部相互靠近，亲水头部面向水相定向排列，形成双分子层。基于这样的结构， 既可以在脂质体内部水相中(内水相)包载亲水性药物，也可以在脂质双层膜中嵌入疏水性 药物。
靶向脂质体的靶向作用则是通过在表面修饰配体而实现的。配体可以是抗体、多肽、 小分子等，通过配体与靶细胞特异性受体的相互作用。其中将抗体及其片段修饰在脂质体表 面，相对于小分子和多肽配体具有更好的结合活性和特异性。应用脂质分子自组装原理，在 一个脂质体表面修饰两个以上不同的配体，也具有较好的可行性。
本发明在抗体修饰脂质体技术的基础上，一方面通过针对靶细胞的主要抗体和针对效 应细胞的辅助抗体的巧妙组合，获得了新颖和独特的脂质体针对肿瘤细胞的杀伤机理和效 果。目前已知的多靶向脂质体制剂技术都是应用不同配体组合，通过同时结合不同的抗原以 提高对特定细胞的靶向输送效率和选择性。本发明提出的多细胞靶向脂质体，通过促进或阻 断多种细胞间的相互作用，从而调节不同细胞间的识别、结合和激活等生理功能。因此，为 配体靶向脂质体技术提出了一个全新的方向。
另一方面，在脂质药物载体表面构建多细胞靶向性，不仅比在同一抗体结构上构建两 种不同靶向性的抗体序列简便的多，还可以通过调节脂质体表面主要抗体和辅助抗体的密度 及其比例，优化了抗肿瘤效果。此外，这种多细胞靶向脂质体的构建和制备方法也会避免抗 体错配等问题，克服在生产和疗效上的缺陷。特别是脂质体在体内还有独特的药代动力学 和组织分布特性，能够大大改善目前多靶向抗体的体内作用半衰期短暂的缺陷。
进一步地，本发明所得到的多细胞靶向脂质体，还可以与脂质体载药技术结合，相比 较临床上已有的多靶向抗体与其他药物的联合治疗方案，将更加便捷、多样和可控。通过将 药物包载在脂质体中，可以实现药物的靶向输送和释放，即提高药物的选择性，改变药物的 释放部位和时间。比如，肿瘤免疫疗法的不良反应包括使患者产生细胞因子风暴，因此临床 上会要求患者预先服用地塞米松以抑制该不良反应。再比如，部分免疫药物需要同时系统给 予IL-2等细胞因子药物才能达到理想的免疫激活作用。脂质体作为药物输送载体，可以通 过包载药物，利用主要抗体和辅助抗体实现药物的靶向输送。
由此，本发明通过制备包含针对靶细胞的主要抗体和针对效应细胞的辅助抗体的多细 胞靶向脂质体，可以实现促使免疫细胞结合并识别肿瘤细胞，并进而激活免疫细胞的效应功 能。这种多细胞靶向脂质体具备独特的体内作用机制，而且相对于临床上应用的多靶向抗体 具有生产制备和体内作用多方面的实质性进步。此外，可以利用载药脂质体制备多细胞靶向 制剂，实现更好的治疗效果。
如本发明一些实施方式所列举的，本发明的技术方案具有如下优势：
(1)、本发明从多细胞靶向脂质体的制备出发，在同一个脂质体上修饰两种不同特异 性的靶向抗体或抗体片段。脂质体制备和表面靶向修饰技术成熟，设计简单，易于大规模生 产制备及分离纯化，靶向基团可以根据临床需要作出调整，有利于根据疾病开发设计出各种 不同特异性的多细胞靶向组合；
(2)、本发明的与CD19和CD3抗原特异性结合的两种抗体片段-脂质连接物，与荧光标记脂质体制备的多细胞靶向和单靶向脂质体，与CD19阳性和CD3阳性的细胞分别孵育，都表现出很强的结合活性，并且这种结合是特异性的；
(3)、本发明的CD19和CD3抗原特异性结合的多细胞靶向脂质体与不同荧光标记的CD19阳性和CD3阳性的细胞共孵育，经流式细胞仪检测出现两种荧光双阳性的信号，表现出多细胞靶向脂质体能够有效介导细胞间结合，即促使免疫效应细胞识别靶细胞的能力；
(4)、本发明的CD19和CD3抗原特异性结合的多细胞靶向脂质体与免疫效应细胞和肿瘤细胞共孵育，表现出免疫效应细胞对肿瘤细胞很强的杀伤能力，并且这种杀伤是穿孔素 -颗粒酶途径介导的；
(5)、本发明的CD19和CD3抗原特异性结合的多细胞靶向脂质体与免疫效应细胞和肿瘤细胞共孵育，经ELISA检测，表现出多细胞靶向脂质体能有效刺激免疫效应细胞IFN-γ细胞因子的分泌；
(6)、本发明的CD19和CD3抗原特异性结合的多细胞靶向脂质体，通过调节表面抗体的密度，经LDH检测，表现出多细胞靶向脂质体具有可控的细胞相互作用的调节能力；
(7)、本发明的CD19和CD3抗原特异性结合的多细胞靶向脂质体，不但具有多靶向抗体的优点，而且可以利用载药脂质体制备多细胞靶向药物输送系统。以CD19和CD3抗 原特异性结合的两种抗体片段-脂质连接物和载有免疫调节药物达沙替尼的载药脂质体为原料，制备成的载药多细胞靶向脂质体，在高载药量下，表现出对于免疫效应细胞介导的细胞杀伤的有效抑制能力。载药多细胞靶向脂质体可以作为靶向药物载体，发展为针对疾病的靶向药物输送系统，实现更好的治疗效果。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特 定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施 方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通 常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以 及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术 语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外， 根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例 中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域 常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实验试剂和细胞
卵磷脂(EPC)、氢化大豆磷脂(HSPC)、二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚 胺(DSPE-PEG2000-mal)购自日本NOF公司(Tokyo,Japan)；胆固醇(Chol)、二硬脂酸磷脂酰 乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)、购自美国Avanti Polar Lipids公司(AL,US)。
DiI购自Sigma公司、CFSE购自Invitrogen公司。
RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗试剂(100×)购于Gibico公司。
Raji人淋巴瘤细胞、Jurkat人淋巴瘤细胞购自中国科学院细胞所。
实施例1、多细胞靶向脂质体的制备
1、抗CD19及抗CD3抗体F(ab’)2片段的制备
通过固定化酶胃蛋白酶(pepsin)或无花果蛋白酶(ficin)作酶切反应，将IgG的Fc段切除制备F(ab’)2片段；其中人源、鼠源IgG采用酶胃蛋白酶(pepsin)作酶切反应，鼠 源IgG1采用无花果蛋白酶(ficin)。具体步骤为：将500ul抗体离心通过脱盐柱；将流穿液 加入至固定化酶中，37℃恒温混匀；胃蛋白酶(pepsin)孵育4h或无花果蛋白酶(ficin) 孵育24h后，以5,000g、1min离心收集流穿液，以Protein A Binding Buffer洗涤固定化酶、 收集流穿液，合并流穿液即得到酶切产物。
将酶切产物在protein A column中恒温混匀10min，然后以离心收集流穿液，并以Protein A Binding Buffer洗涤Protein A柱并收集流穿液，合并流穿液即获得经ProteinA柱纯化、除 去IgG和Fc大片段的酶切产物。将上述酶切产物经过50KD透析袋透析，透析介质pH＝7.0 PBS溶液，以2h,2h,16h顺序进行透析，获得除去Fc片段的纯化抗体F(ab’)2片段。
采用现有技术进行确认，所获得的抗CD19抗体F(ab’)2片段为全长抗CD19抗体去除 Fc片段获得。
采用现有技术进行确认，所获得的抗CD3抗体F(ab’)2片段，为全长抗CD3抗体去除Fc片段后获得。包括轻链可变区和重链可变区。轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLEIK。
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWG QGTTLTVFS。
2、抗CD19及抗CD3抗体的Fab’片段-高分子-脂质连接物的制备
通过β-巯基乙胺作还原剂，将抗体F(ab’)2片段还原为Fab’、并化学连接到 DSPE-PEG2000-Mal的马来酰亚胺基团上，具体步骤为：将抗体F(ab’)2片段(1-10mg/ml)与 50mM含EDTAβ-巯基乙胺混合，N2保护下37℃恒温震荡反应90min；之后离心通过脱盐柱， 收集流穿液。得到去除β-巯基乙胺的抗体F(ab’)2片段的还原产物Fab’。之后加入600uM DSPE-PEG2000-Mal胶束的30mM HEPES溶液，使Fab’与DSPE-PEG2000-Mal的摩尔比为 1:1，N2保护下10℃恒温震荡反应16h。得到抗体的Fab’片段-高分子-脂质连接物 DSPE-PEG2000-Mal-Fab’胶束。获得的连接产物通过SDS-PAGE考察连接情况。结果，如 图1A和图1B所示。
3、抗CD3抗体的Fab’片段-高分子-脂质连接物的制备
通过三羧乙基膦(TCEP)作还原剂，将抗体scFv片段及其多聚体还原为含有游离巯基的 scFv、并化学连接到DSPE-PEG2000-Mal的马来酰亚胺基团上，具体步骤为：将800ul抗体 scFv片段(1-10mg/ml)与含1.2Mm的TCEP的HEPES溶液混合，使scFv与TCEP的摩尔比 为1:5，之后立即加入600uM DSPE-PEG2000-Mal胶束的30mM HEPES溶液，N2保护下10℃ 恒温震荡反应16h。得到抗体的scFv片段-高分子-脂质连接物DSPE-PEG2000-Mal-scFv胶 束。获得的连接产物通过SDS-PAGE考察连接情况。结果，如图1C所示。
4、抗CD19及抗CD3单靶向和多细胞靶向脂质体的制备
通过后插法制备单靶向和多细胞靶向脂质体；对于多细胞靶向脂质体，将制备的抗 CD19及抗CD3Fab’片段-高分子-脂质连接物DSPE-PEG2000-Mal-Fab’或scFv片段-高分子- 脂质连接物与脂质体按照摩尔比(0.1-5):(0.1-5):1000混合，N2保护下37℃恒温震荡反 应24h，然后通过300KD超滤洗涤脂质体5次除去未结合抗体Fab’片段，得到抗CD19及 抗CD3多细胞靶向脂质体。对于抗CD3单靶向脂质体，将抗CD19Fab’片段-高分子-脂质 连接物DSPE-PEG2000-Mal-Fab’等摩尔替换成DSPE-mPEG2000；对于抗CD19单靶向脂质 体，将抗CD3Fab’片段-高分子-脂质连接物DSPE-PEG2000-Mal-Fab’等摩尔替换成 DSPE-mPEG2000。结果如图2和表1所示：制备的靶向脂质体的粒径在80-90nm左右，PDI 约为0.1。
表1
Z-AVE(nm) PDI
blank 80.3±1.5 0.06±0.01
aCD3xaCD19 89.0±2.3 0.08±0.01
aCD3xmPEG 84.1±3.2 0.11±0.04
aCD19xmPEG 83.2±0.8 0.08±0.02
mPEGxmPEG 82.8±3.6 0.10±0.01
实施例2、多细胞靶向脂质体体外特异性结合作用评价
以CD19阳性Raji细胞和CD3阳性Jurkat细胞为代表，考察多细胞靶向脂质体体外特 异性结合作用。
Jurkat,Clone E6-1人T淋巴细胞白血病细胞系及Raji人B细胞淋巴瘤细胞系购自中国 科学院细胞库。细胞株通过完全培养基含1％pls双抗+10％FBS的RPMI-1640(GIBCO)。
通过流式细胞仪分析CD3阳性细胞株Jurkat细胞、CD19阳性细胞株Raji细胞和人外 周血淋巴细胞考察多细胞靶向脂质体体外特异性结合能力。1×106个Raji或Jurkat细胞以 400ul完全培养基重悬，加入48孔板中，每孔加入1ug单靶向或多细胞靶向DiI标记脂质体。 37℃细胞培养箱中孵育2h。然后将细胞取出置于流式管中，500×g，5min离心，弃去上清， 然后以PBS洗涤细胞两次。之后以400ul PBS重悬细胞，并以流式细胞仪BectonDickinson FACS LSRII上样检测。结果如图3A和图3B所示。
实施例3、多细胞靶向脂质体介导靶细胞间结合作用评价
以CD19阳性Raji细胞和CD3阳性Jurkat细胞为代表，证明多细胞靶向脂质体可以介 导不同靶细胞之间的细胞-细胞结合。
通过CFSE染色Jurkat细胞，DiI染色Raji细胞。1.25×105个Raji-DiI和1.25×105个 Jurkat-CFSE细胞以400ul无酚红完全培养基重悬并混合，加入48孔板中，每孔加入1ug单 靶向或多细胞靶向脂质体。37℃细胞培养箱中孵育30min。通过流式细胞仪分析CFSE阳性 Jurkat细胞、DiI阳性Raji细胞及CFSE/DiI双阳性细胞簇，考察多细胞靶向脂质体介导靶 细胞间结合作用。结果如图4所示。
实施例4、多细胞靶向脂质体介导效应细胞对肿瘤细胞杀伤作用评价
细胞培养基配方为在无酚红RPMI-1640培养基中加入5％FBS、1％双抗、100IU/mlhIL-2。
1、LDH法评价肿瘤细胞杀伤作用
通过Promega公司CytoTox非放射性细胞毒性检测试剂盒检测多细胞靶向脂质体 介导效应细胞对肿瘤细胞杀伤作用。
将效应细胞(未刺激的人淋巴细胞、CD3/CD28抗体扩增活化的人T细胞、γδT细胞、LAK细胞)和靶细胞(Raji细胞、SUP-B15细胞、A549细胞)以无酚红完全培养基重悬，细 胞浓度分别为1*10^6个/ml和，1.11*10^5个/ml。以100ul效应细胞和90ul靶细胞加至96 孔板中并吹打混匀进行细胞铺板，此时靶细胞与效应细胞比例为1:10。每孔中加入不同浓 度、靶向的脂质体10ul，吹打混匀。将96孔板放于细胞培养箱中24小时孵育。孵育结束 前45分钟向体积校正对照孔和靶细胞最大裂解孔中加入10ul裂解液。孵育结束后，以250g， 4min离心96孔板，离心后吸取50ul上清液至新96孔板，再向新孔板中加入50ul LDH底 物，22℃孵育15分钟。孵育结束后在酶标仪中以490nm波长下检测吸光度。
结果如图5A、图5B、图6A、图6B、图6C、图8B、图8C、图9所示。
通过这些实验数据充分说明：本发明的多细胞靶向脂质体可以有效介导效应细胞对靶 细胞的有效杀伤，其中的效应细胞可以包括未刺激淋巴细胞、体外扩增的淋巴细胞、体外 激活的淋巴细胞、体外诱导分化的淋巴细胞，并且这种细胞杀伤作用依赖于细胞裂解作用， 且具有剂量依赖关系。
2、PI染色法评价肿瘤细胞杀伤作用
将效应细胞(未刺激的人淋巴细胞、CD3/CD28抗体扩增活化的人T细胞、γδT细胞、LAK细胞)和CFSE标记的靶细胞(Raji细胞)以无酚红完全培养基重悬，细胞浓度分别为 1*10^6个/ml和，1.11*10^5个/ml。以100ul效应细胞和90ul靶细胞加至96孔板中并吹打 混匀进行细胞铺板，此时靶细胞与效应细胞比例为1:1、1:5、1:10。每孔中加入不同浓度、 靶向的脂质体10ul，吹打混匀。将96孔板放于细胞培养箱中24小时孵育。孵育结束后， 收集细胞液于流式管，加入5ul 1mg/ml PI后孵育15分钟，再加入流式缓冲液200ul并上样。
结果如图7A、图7B、图8A、图9B所示。
通过这些实验数据充分说明：本发明的多细胞靶向脂质体可以有效介导效应细胞对靶 细胞的有效杀伤，其中的效应细胞可以包括未刺激淋巴细胞、体外扩增的淋巴细胞、体外 激活的淋巴细胞、体外诱导分化的淋巴细胞，并且这种细胞杀伤作用依赖于细胞裂解的膜 裂解作用，且具有剂量依赖关系。此外，多靶向抗体对于表达相同抗原的不同靶细胞，都 可有效介导效应细胞的杀伤(图9A CD19+SUP-B15细胞)。
更换不同抗体分子或靶细胞的结果如图9A、图9B、图9C所示。其中，图9A的主要 抗体更换为抗CD3抗体的不同克隆(2C11)和不同抗体形式(IgG)；图9B为相同主要抗体和 辅助抗体的多细胞靶向脂质体，但是靶细胞更换为CD19+人白血病SUP-B15细胞；图9C 的辅助抗体更换为靶向不同抗原(LGR)的不同靶向分子(RSPO-1蛋白)，靶细胞更换为非小 细胞肺癌A549细胞(实体瘤模型)。
通过这些实验数据充分说明：本发明的多细胞靶向脂质体的第一和辅助抗体可以是靶 向任何抗原的任何形式和结构的靶向分子，靶细胞和效应细胞可以为任何能被主要抗体和 辅助抗体结合的细胞。由于多细胞靶向脂质体基于靶向性而介导免疫效应细胞和靶细胞相 互作用这一独特的机制，我们可以根据不同的疾病类型，通过更换任何靶向分子(主要抗 体和辅助抗体)，都可以起到有效介导效应细胞对靶细胞的作用。
实施例5、多细胞靶向脂质体刺激效应细胞激活作用评价
将效应细胞(未刺激的人淋巴细胞)和靶细胞(Raji细胞)以无酚红完全培养基重悬，细 胞浓度分别为1*10^6个/ml和，1.11*10^5个/ml。以100ul效应细胞和90ul靶细胞加至96 孔板中并吹打混匀进行细胞铺板，此时靶细胞与效应细胞比例为10:1。每孔中加入不同浓 度、靶向的脂质体10ul，吹打混匀。将96孔板放于细胞培养箱中24小时孵育。孵育结束后，以250g，4min离心96孔板，离心后吸取50ul上清液至新96孔板。以ELISA法检测 上清液中的IFN-γ。结果如图10所示，充分说明：本发明的多细胞靶向脂质体在有效介导 未刺激淋巴细胞、体外扩增的淋巴细胞、体外激活的淋巴细胞、体外诱导分化的淋巴细胞 对靶细胞的有效杀伤的同时，促进效应细胞的活化，促进细胞因子的产生和释放，并且产 生的细胞因子具有抗肿瘤活性，且具有剂量依赖关系。
实施例6、多细胞靶向脂质体作用机制研究
将效应细胞(未刺激的人淋巴细胞)和靶细胞(Raji细胞)以无酚红完全培养基重悬，细 胞浓度分别为1.11*10^6个/ml和，1.11*10^5个/ml。以90ul效应细胞和90ul靶细胞加至96 孔板中并吹打混匀进行细胞铺板，此时靶细胞与效应细胞比例为10:1。每孔中加入多细胞 靶向脂质体10ul，吹打混匀。每孔加入10ul EGTA/MgCl2，终浓度为0、0.1、1、10mM，吹打混匀。将96孔板放于细胞培养箱中24小时孵育。孵育结束前45分钟向体积校正对照 孔和靶细胞最大裂解孔中加入10ul裂解液。孵育结束后，以250g，4min离心96孔板，离 心后吸取50ul上清液至新96孔板，再向新孔板中加入50ul LDH底物，22℃孵育15分钟。 孵育结束后在酶标仪中以490nm波长下检测吸光度。
结果如图11所示，充分说明：本发明的多细胞靶向脂质体介导的效应细胞对靶细胞的杀伤 作用，是基于效应细胞的钙离子依赖的颗粒酶/穿孔素途径。
实施例7、多细胞靶向脂质体靶向药物输送作用评价
通过后插法制备载药的多细胞靶向脂质体；对于多细胞靶向载药脂质体，将制备的抗 CD19及抗CD3Fab’片段-高分子-脂质连接物DSPE-PEG2000-Mal-Fab’与达沙替尼载药脂质 体按照摩尔比0.1-5:0.1-5:1000混合，N2保护下37℃恒温震荡反应24h，然后通过300KD 超滤洗涤脂质体5次除去未结合抗体Fab’片段，得到多细胞靶向达沙替尼脂质体。
将效应细胞(未刺激淋巴细胞)和靶细胞(Raji细胞)以无酚红完全培养基重悬，细胞浓 度分别为1*10^6个/ml和，1.11*10^5个/ml。以100ul效应细胞和90ul靶细胞加至96孔板 中并吹打混匀进行细胞铺板，此时靶细胞与效应细胞比例为1:10。每孔中加入不同达沙替 尼浓度、相同脂质浓度的多细胞靶向载药脂质体10ul，吹打混匀。将96孔板放于细胞培养 箱中24小时孵育。孵育结束前45分钟向体积校正对照孔和靶细胞最大裂解孔中加入10ul 裂解液。孵育结束后，以250g，4min离心96孔板，离心后吸取50ul上清液至新96孔板，再向新孔板中加入50ul LDH底物，22℃孵育15分钟。孵育结束后在酶标仪中以490nm波 长下检测吸光度。
结果如图12所示，充分说明：通过将主要抗体和辅助抗体连接在载药脂质体上，可以 在多细胞靶向作用机制的基础上，充分发挥荷载药物的作用。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当 指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干 改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不 脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修 饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实 施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种多细胞靶向脂质体
<130> 171715
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 2
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Phe Ser
115 120
<210> 3
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 4
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile
35 40 45
Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
225 230 235
<210> 5
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 7
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Ser Asp Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Ile Ile
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Phe Pro Leu Leu Arg His Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Ala Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 10
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 11
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 13
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 14
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
20 25 30
Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala
100 105 110
<210> 15
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 16
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Leu Glu Met Ala Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
1 5 10 15
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
20 25 30
Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser
85 90 95
Asn Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (18)

1.一种多细胞靶向脂质体，其特征在于，其结构中包括脂质体、修饰于脂质体表面的主要抗体和辅助抗体，所述主要抗体特异性结合靶细胞表面的靶分子，所述辅助抗体特异性结合于免疫效应细胞。
2.根据权利要求1所述的多细胞靶向脂质体，其特征在于，所述多细胞靶向脂质体能够同时或序贯结合免疫效应细胞和靶细胞，从而实现免疫效应细胞对靶细胞识别和免疫效应的激活。
3.根据权利要求1所述的多细胞靶向脂质体，其特征在于，每个脂质体上主要抗体和辅助抗体的摩尔比例在100/1到1/1之间。
4.根据权利要求1所述的多细胞靶向脂质体，其特征在于，每个脂质体表面有1-1000个主要抗体和1-1000个辅助抗体。
5.根据权利要求1所述的多细胞靶向脂质体，其特征在于，所述主要抗体和辅助抗体分别通过共价连接或者疏水亲水相互作用而展示在脂质体表面。
6.根据权利要求1所述的多细胞靶向脂质体，其特征在于，所述主要抗体针对的抗原选自微生物抗原、肿瘤相关抗原、肿瘤细胞表面特异性抗原、肿瘤细胞表面高表达的抗原、肿瘤组织或肿瘤血管中高表达的抗原；所述辅助抗体针对的抗原选自肿瘤细胞、淋巴细胞或髓系细胞所表达的抗原。
7.根据权利要求1所述的多细胞靶向脂质体，其特征在于，可以同时或序贯结合肿瘤细胞、淋巴细胞、或髓系细胞。
8.根据权利要求1所述的多细胞靶向脂质体，其特征在于，所述多细胞靶向脂质体可以靶向结合T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、或中性粒细胞。
9.根据权利要求1所述的多细胞靶向脂质体，其特征在于，所述多细胞靶向脂质体可以靶向结合未经激活的T细胞、或经体外活化、扩增的T细胞。
10.根据权利要求9所述的多细胞靶向脂质体，其特征在于，所述T淋巴细胞选自抗原特异性T淋巴细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、细胞毒T细胞、辅助性T细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞、γδT细胞、嵌合抗原受体T细胞、T细胞受体嵌合型T细胞。
11.根据权利要求1所述的多细胞靶向脂质体，其特征在于，所述主要抗体和辅助抗体的形式选自IgG，Fab’片段、F(ab’)2片段、Fab片段、单链Fv片段、和微抗体(minibody)，纳抗体(nanobody)、单域抗体(unibody)、双域抗体(diabody)。
12.根据权利要求1所述的多细胞靶向脂质体，其特征在于，所述主要抗体针对的抗原选自CD19，CD20，PSMA，Her2/neu,EGFR或LGR5。
13.根据权利要求1所述的多细胞靶向脂质体，其特征在于，所述辅助抗体选自CD3抗体及片段，PD1抗体及片段，CTLA4抗体及片段，CD40L抗体及片段中的一个或多个。
14.根据权利要求1所述的多细胞靶向脂质体，其特征在于，所述脂质体的组成成分包括磷脂酰胆碱、胆固醇、连接主要抗体的脂质和连接辅助抗体的脂质分子。
15.根据权利要求1所述的多细胞靶向脂质体，其特征在于，所述脂质体可以是空白脂质体或载药脂质体。
16.如权利要求1～15任一项所述多细胞靶向脂质体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)分别将主要抗体和辅助抗体与脂质分子连接，获得主要抗体-脂质分子和辅助抗体-脂质分子；(2)将获得的主要抗体-脂质分子和辅助抗体-脂质分子与已构建好的脂质体混合、孵育，获得混合溶液；(3)将所得混合溶液经透析或超滤去除未载入的抗体和抗体脂质复合物，得多细胞靶向脂质体。
17.如权利要求1～15任一项所述多细胞靶向脂质体在制备免疫治疗药物、抗肿瘤药物中的应用。
18.一种治疗肿瘤的方法，包括步骤：将如权利要求1～15任一项所述多细胞靶向脂质体施用于肿瘤患者。
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Application publication date: 20190322

Assignee: HIGHFIELD BIOPHARMACEUTICAL Corp.

Assignor: SHANGHAI JIAO TONG University

Contract record no.: X2020980005214

Denomination of invention: A multicellular targeting liposome

License type: Exclusive License

Record date: 20200820