CN1721531A - 重组人抗体表达载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及重组单克隆抗体,特别是涉及携带人抗体重链和轻链恒定区的用于表达人抗体的通用载体,其制备方法及其在真核表达系统中表达完整人抗体中的应用。
Description
发明领域
本发明涉及重组单克隆抗体,特别是涉及携带人抗体重链和轻链恒定区的用于表达人抗体的通用载体,其制备方法及其在真核表达系统中表达肝炎病毒抗体基因中的应用。
发明背景
抗体分子的突出特点是其功能和分子结构的双重性:识别不同抗原需要数量巨大的结构上的多样性;与体内效应系统相互作用需要结构的恒定性。这一特点使抗体分子成为体内最复杂的分子,长期以来一直是人们研究的热点。
自19世纪末,以抗原免疫动物获得抗血清的途径一直是获得抗体的经典方法。但由于抗血清含有为数众多的各种不同的抗体,其中某些抗体会针对正常组织细胞产生交叉反应而导致严重后果.因此,长期以来抗血清仅用于中和外源性毒素如蛇毒等,而未能应用于其他疾病的治疗。
1975年,Khler及Milstein建立了制备单克隆抗体的B淋巴细胞杂交瘤技术(Nature(London),256:495,1975)。通过细胞工程可以在体外定向地制备各种单克隆抗体(McAb,以下有时也简称“单抗”),这在抗体生产中是一个具有划时代意义的进展。特别重要的是,单克隆抗体对相应抗原具有的高度特异性以及抗体分子的均质性可大大降低它在体内与正常组织的交叉反应,为利用抗体治疗疾病带来了新的希望。近20年来,单克隆抗体在疾病诊断方面得到广泛应用,在疾病治疗方面也取得了突破性进展。然而,由于McAb多为鼠源性的,这也大大限制了它作为治疗制剂在人体内的应用。
进入20世纪80年代后,随着分子生物学技术的发展和抗体基因结构的阐明,DNA重组技术开始应用于抗体的改造,出现了各种各样的基因工程抗体。这些基因工程抗体或消除了天然抗体的一些不利于应用的特性,或增加了新的生物学功能,从而拓展了抗体的应用范围,改善了抗体的应用性能。与鼠源性单克隆抗体相比,基因工程抗体具有许多优点:1)通过基因工程技术的改造,可以最大程度地降低抗体的鼠源性,减少甚至消除人体对抗体的排斥反应;2)基因工程小分子抗体的分子量较小,穿透力强,更易到达病灶的核心部位;3)可以根据治疗的需要,制备多种用途的新型抗体;4)可以采用原核细胞、真核细胞或植物等多种表达体系大量生产抗体分子,大大降低了生产成本。总之,这些基因工程抗体的产生大大增强了单克隆抗体的临床效力,引发了FDA批准治疗性免疫球蛋白和Fab分子上市的浪潮。据统计,目前正处于临床试验中的基因工程抗体约占生物制剂的30%。
尽管这些基因工程抗体在很大程度上改善了抗体性能,使其更适于临床应用,但这种改造多是选择性针对抗体的某一个不利于应用的特性进行的。因此,仍然存在许多不尽人意的地方,基因工程抗体并不能完全替代天然抗体发挥作用。例如,人源化鼠单抗,包括人-鼠嵌合抗体和改型抗体都不能完全消除鼠单抗的异源性,仍可产生不同程度的人抗鼠抗体(HAMA)。HAMA不但会阻碍抗体功能的有效发挥,而且会干扰单抗在体内的合理分布(例如减少在肿瘤细胞靶位上分布),使临床疗效减弱甚至消失,且其亲和力也明显低于亲本鼠单抗。另一方面,小分子抗体由于其缺乏Fc段,在体内的半衰期缩短,同时也难以发挥Fc段介导的靶细胞杀伤,和促进细胞吞噬以及诱发生物活性物质释放等生物学效应。所以,尽管存在免疫排斥反应,完整的鼠单抗还是成为第一批批准上市的治疗性抗体。因此,目前有必要进一步探索和完善完整的重组人抗体的制备技术,努力建立一套能表达完整人抗体的表达体系。
发明目的
本发明的一个目的是提供用于表达完整人抗体的重组表达载体,特征在于所说的载体同时携带有人轻链和重链抗体恒定区序列以及供插入可变区序列的适当的限制性内切酶位点。
根据本发明载体的一个优选实施方案,其中所说的完整人抗体表达载体是重组质粒pPICZαIgG。
根据本发明载体的一个优选实施方案,其中所说的载体还携带有功能性分泌信号序列。
根据本发明载体的一个优选实施方案,其中所说的完整人抗体是完整的人单克隆抗体或人源化小鼠单克隆抗体。
根据本发明载体的一个优选实施方案,其中所说的完整人抗体是完整的人单克隆抗体。
本发明的另一个目的是提供被上述重组载体转化的能够在适当的培养条件下表达人抗体分子的宿主细胞。
根据本发明的一个优选实施方案,其中所说的宿主细胞毕赤酵母细胞。
本发明再一个目的是提供如上限定的重组表达载体在分泌表达完整的人免疫球蛋白中的应用。
本发明再一个目的是提供如上限定的重组表达载体在分泌表达完整的人抗乙型肝炎表面抗原单克隆抗体中的应用。
附图简要说明
图1显示重链和轻链抗体表达载体的构建示意图。
图2显示重链和轻链抗体表达质粒的酶切鉴定图谱。其中(a)是XhoI/XbaI酶切产物的电泳图谱:泳道1为轻链表达载体的XhoI/XbaI双酶切产物;泳道2为重链表达载体的XhoI/XbaI双酶切产物;M为DNA分子量标准。(b)是SalI和SpeI酶切产物的电泳图谱:泳道1为重链表达载体的SalI单酶切产物;泳道2为重链表达载体pPICZαIgH;泳道3为轻链表达载体的SpeI单酶切产物;泳道4为轻链表达载体pPICZαIgκ。
图3显示完整人IgG抗体表达载体的构建示意图。
图4显示完整人抗体表达载体的酶切鉴定图谱。其中泳道1为完整抗体表达载体pPICZαIgG;泳道2为表达载体的PmeI单酶切产物;泳道3为DNA分子量标准;泳道4为表达载体的XbaI单酶切产物。
图5显示重组的重链和轻链抗体在毕赤酵母菌中经甲醇诱导表达后,培养物上清中表达产物的免疫印迹分析结果。其中:泳道1为天然人IgG标准品;泳道2为轻链抗体转化菌的培养物上清;泳道3为重链抗体转化菌的培养物上清。
图6显示重组的完整抗体在毕赤酵母菌中经甲醇诱导表达后,培养物上清的免疫印迹分析结果。其中泳道1为天然人IgG标准品;泳道2为完整抗体转化菌的培养物上清。
图7显示完整人抗-HBs抗体重组质粒的酶切鉴定图谱。泳道1为完整抗体重组表达质粒;泳道2为重组质粒的PmeI单酶切产物;泳道3为重组质粒的XhoI单酶切产物;泳道4为DNA分子量标准;泳道5为重组质粒的XbaI单酶切产物。
图8显示重组人抗乙型肝炎表面抗原抗体(抗-HBs抗体)的抗原结合活性。
图9显示全分子抗-HBs抗体的免疫印迹分析结果。泳道1、2为全分子抗体的纯化产物;泳道3为人IgG标准品。
发明的具体内容
本发明涉及单克隆抗体,特别是涉及完全人源的全分子抗体表达体系的建立,以及所说体系在具有抗原结合活性的全分子抗体的筛选及重组表达中的应用。本发明进一步涉及具有乙肝表面抗原结合活性的完整人抗乙肝表面抗体序列的获得及其在所述体系中的重组制备。
各种基因工程抗体的出现在很大程度上改善了抗体性能,增强了单克隆抗体的临床效力,使其更适于临床应用。然而,所有这些改造都是在已有单抗基因基础上针对抗体的某一附属特性的改良,即改变或增加其生物学效应、降低其异源性、改变其药学动力学效应等。已有的人源化鼠单抗(包括对鼠单抗恒定区进行人源化改造得到的人-鼠嵌和抗体和只保留了抗原决定区(CDR区)鼠源性的改型抗体等)均未能完全消除鼠单抗的异源性,而仍可产生不同程度的HAMA,使抗体的效应减弱,且其亲和力也远远低于亲本鼠单抗。另外,小分子抗体由于缺乏Fc段介导,不但在体内的半衰期缩短,而且难以通过靶细胞杀伤、细胞吞噬及生物活性物质释放等效应功能来灭活或清除外来抗原以保护机体。因此,各种基因工程抗体都不能完全替代天然抗体发挥作用。所以,我们希望能够基于已有的知识建立一套可克隆并重组制备完整人抗体的表达体系。
大肠杆菌表达系统是应用最为广泛的原核表达体系,但受其自身加工能力的限制,该表达体系并不完全适于表达有活性的完整抗体分子。而最早用来表达抗体分子,也是目前应用最多的哺乳动物细胞表达体系虽然能够正确折叠、装配并分泌表达具有良好生物活性的完整抗体,但也存在操作烦琐、表达产物纯化困难、表达产量相对较低以及生产成本高等缺点,不利于人抗体的大规模生产和应用。因此,我们特别选择应用适合大规模工业化生产的毕赤-巴斯德酵母来建立完整人抗体表达体系。酵母表达体系既具备易于操作,遗传背景清楚,生产成本低等原核生物的特点,又具有真核生物的折叠、分泌机制,可以完成真核生物特异的蛋白酶解、折叠、糖基化等翻译后修饰过程,且生长速度快,培养成分简单,能适应大规模工业化生产的需要。尤其毕赤酵母,它的乙醇氧化酶基因(AOXI)是一个甲醇诱导表达的严格调控基因,启动活性高,渗漏低,在加入甲醇后可以迅速启动转录,更适合高密度培养,这对于提高重组蛋白的产量是至关重要的。而且,毕赤酵母的N-糖基化方式也更接近高等真核生物,因此有可能将其作为表达天然人抗体分子的另一个重要的异源表达体系。
我们利用基因重组技术对毕赤-巴斯德酵母质粒进行重组,并在此基础上提供一套适于克隆和表达各种全分子抗体的通用工具质粒,建立了可克隆、筛选并表达制备全分子人源抗体的表达体系。基于本发明的这一表达系统,我们成功地克隆并在毕赤酵母宿主细胞内分泌表达了完整的人抗乙肝表面抗原(HBs)抗体,从而完成了本发明。
为实现上述发明目的,可以按照本领域技术人员已知的技术(如参见分子克隆试验指南,科学出版社,第二版,1999年出版)进行基因的分离或合成、核苷酸片段的消化与连接、克隆和表达载体的构建及扩增、核苷酸序列的分析与鉴定、细胞的转化与培养,以及表达产物的分离与纯化等操作。
作为构建本发明的通用工具载体的起始质粒,可使用任何一种能在细菌细胞中稳定保留并复制,并在酵母菌中表达的质粒载体。这样的起始质粒包括但不只限于pPIC3.5,pPIC9,pHIL等。但本发明中优选的是高效表达质粒pPICZα。我们利用基因重组技术,分别将人抗体重链和轻链恒定区基因重组至起始质粒相应的多克隆位点,并利用人工合成的寡核苷酸接头,在载体α信号肽下游分别引入相应的限制性内切酶位点,构建成全长重链抗体表达载体pPICZαIgH和轻链抗体表达载体pPICZαIgκ(参见实施例1)。为表达全分子人源抗体,可以将携带有轻链和重链恒定区cDNA及相应可变区克隆位点的两个AOXI表达盒串联连接到同一个载体中,以构建抗体的多拷贝重组酵母质粒载体,即可分泌表达全长人抗体的工具载体pPICZαIgG(参见实施例2)。
本发明的工具载体pPICZαIgG不仅是只表达轻链或重链单链抗体的所谓完整抗体表达载体,它同时携带有人抗体轻链和重链恒定区cDNA,又包括有可供其它基因插入的限制性内切酶位点,因此能够适合各种全分子抗体的克隆和重组表达(图3)。这里所说的各种抗体包括完全人源抗体、人源化鼠单抗和抗体融合蛋白等。
本发明的工具载体pPICZαIgG是在对重链和轻链抗体表达载体pPICZαIgH和pPICZαIgκ进行适当修饰的基础上构建的。它解决了毕赤酵母表达载体的AOXI表达盒在串联重组时存在的连接方向性问题。我们通过聚合酶链反应(PCR)介导的定位突变技术在轻链和重链表达载体的AOXI表达盒3’末端分别引入新的位点,保证了多个表达盒按同一方向连接和重组。因此,该工具载体除用于表达全分子抗体外,也适用于其它蛋白质的多拷贝表达,以提高重组蛋白质的产量。即使是全分子抗体本身也可通过多拷贝表达来提高产量。
在酵母表达体系中,外源DNA是经过同源重组整合至酵母基因组DNA上进行表达的。表达载体须在线性化条件下进行转化,以提高整合效率。但由于多拷贝表达载体同时含有多个线性化内切酶位点,不适于通过单或双酶切线性化,而只能以环状形式进行宿主细胞的转化,因此致使整合效率下降约100倍。本发明在不改变重链载体线性化位点的前提下,借助PCR介导的定位突变技术选择性地突变了轻链表达载体的线性化位点PmeI。因此,进一步重组得到的载体中只保留有一个PmeI位点,从而保证了重组表达载体对宿主的线性化转化。利用本发明的表达载体转化酵母感受态细胞X33,随机挑取5个Zeocin抗性克隆并提取酵母基因组DNA进行PCR反应,结果由这些克隆均扩增得到了轻链和重链抗体cDNA,从而证明了我们的线性化的多拷贝表达载体的高整合效率。
PCR扩增人抗体重链和轻链可变区cDNA后,将其克隆至预先构建的完整人抗体表达载体中。线性化后用所得到的DNA转化酵母感受态细胞X33,即成功地建立了相应的全分子抗体的毕赤酵母表达体系(参见实施例3)。
值得进一步指出的是,本发明的全分子抗体表达体系不仅是单纯的克隆或表达体系,而是一个可对全分子抗体进行克隆、筛选、分泌表达及大规模发酵生产的多功能表达体系。
与传统的克隆载体相比,本发明的全分子抗体表达体系同时含有可供轻链和重链抗体可变区克隆的酶切位点,而且在抗体可变区的5’和3’末端也分别含有相应序列。因此,可根据胚系V基因段序列,设计两组高度简并性的引物,5’-CAG
GT CGACCTGSWGSAGTCWGGG-3’;5’-GAT
GGGCCCTTGGTGGAGGCTGAC-3’(重链);5’-GCCAG
ACTAGTGMTGACMCAGTCTCC-3’;5’-CCA
CGGTCCGTTGGATATCCAGCCTGGT-3’(轻链)。可通过RT-PCR扩增得到全套人VH和Vκ基因,并方便、快捷地将这些基因克隆到本发明的表达体系中进行进一步的重组表达。
本发明全分子抗体表达体系的筛选功能不仅限于传统的PCR、RT-PCR及分子杂交等基因水平上的操作,而且可利用其强大的分泌功能构建抗体表达文库,根据抗体的抗原特异结合活性来筛选各种已知或未知的抗体,因此使抗体产物的筛选具有了较大的灵活性。虽然本发明重组载体的克隆能力远低于目前广泛用于抗体筛选的噬菌体文库,而且库容相对较小,但它可以对完整的轻链(或重链)抗体及全分子抗体进行分泌表达,故更有利于筛选那些特异性强的高亲和力抗体,而这是噬菌体文库所不能比拟的。
本发明的全分子抗体表达体系是将含有可变区和全部恒定区序列的全长度轻链及重链抗体重组到同一个载体进行表达的,因此,优于原核表达体系特别是大肠杆菌表达体系所能表达的人源小分子抗体如Fab,ScFv等。虽然这些小分子抗体也同时具有轻链和重链抗体结构,但却缺乏相应的恒定区。
本发明的全分子抗体表达体系已将全长轻链和重链抗体序列按1∶1的比例固定于同一载体上,因此所表达的重组抗体不是须在体外进行重新组装的单独的轻链或重链,而且也不需要以分别含有轻链和重链抗体的表达载体同时转化酵母感受态细胞,以使其在酵母菌体内重组到同一载体或酵母基因组上。因此,与已有的酵母表达体系以及目前应用最多的哺乳动物细胞表达体系相比,本发明的全分子抗体表达体系更易于操作,且更适合大规模工业化生产。
本发明的另一个目的是应用本发明的表达体系克隆、筛选和表达有用的功能性抗体分子例如抗乙肝表面抗原抗体(参见实施例4-6)。
为了使用我们的完整人抗体表达系统表达抗乙肝表面抗原的全分子人抗体,首先使用两组简并引物由B淋巴细胞基因组中扩增得到全套的人VH和Vκ基因,构建了链和重链抗体表达文库。经甲醇诱导表达后,获得了具有乙肝表面抗原结合活性抗体分子。
本发明制得的抗乙肝表面抗原的抗体具有完全人源的可变区序列。与已发表的抗体序列的同源性比较分析显示,其轻链可变区基因与已发表的Clone305-51LVκ序列(Genbank AB027444)具有93%的同源性,但氨基酸序列则只有88%同源性,其中尤其以两者的CDR3区(由23个氨基酸构成)的变异为最大。而重链可变区序列仅与已发表的Clonel4可变区序列(Genbank AF455923)部分同源。其中,CDR3区无论基因序列还是基因长度均不同与已知的同类序列。因此,可以认为该抗体序列是具有HBsAg结合活性的新的人源抗体序列。
将筛选获得的抗-HBs抗体cDNA重组到本发明的全分子抗体表达体系中,经甲醇诱导表达并纯化后,通过免疫印迹技术鉴定重组抗体分子的完整性并以酶联免疫吸附方法(ELISA)检测表达产物的乙肝表面抗原结合活性。结果表明,如上得到的表达产物不仅具有乙肝表面抗原特异结合活性,而且给灵长类动物猕猴注射后能够有效的保护动物免受乙型肝炎病毒的攻击(参见实施例6-(3))。
另外,按本发明上述方法制得的抗乙肝表面抗原抗体是一种完全的人源全分子抗体,它不同于现有的Fab,ScFv等抗乙肝小分子抗体。本发明的抗体既能够特异识别并结合乙肝表面抗原,又能够通过其Fc段发挥抗体的效应功能,中和并清除外界侵入的抗原物质,而且不会产生人源化抗体常常引发的HAMA。因此,本发明制备的人源抗体除可用于预防乙型肝炎病毒感染外,也可作为乙型肝炎的治疗性药物用于临床。
实施例
实施例1:重链和轻链抗体表达载体pPICZαIgH和pPICZαIgκ的构建
(1)完整重链和轻链抗体表达载体的构建
(a)人抗体恒定区序列的克隆重组:使用Trizol试剂盒(Gibco/BRL),从人外周血淋巴细胞中提取总RNA,以RT-PCR方法分别扩增得到人CH和CκcDNA。在所设计的引物上分别引入ApaI(重链)和CpoI(轻链)酶切位点,以利于与可变区序列的连接。将扩增片段经EcoRI/XbaI双酶消化后,连接到载体酵母pPICZα(Invitrogene)相应的内切酶位点。常规转化感受态大肠杆菌JMl09细胞,以酶切法鉴定阳性重组子(图2a)。
(b)寡核苷酸链的插入:人工合成两组寡核苷酸链,其中分别含有SalI(H链)和SpeI(L链)酶切位点。向两组互补的寡核苷酸各1μg中加入TE至终体积40μl,100℃煮沸15分钟,然后缓慢冷却至室温。互补链退火后分别形成带有XhoI和EcoRI粘性末端的重链和轻链接头。各取0.03pmol,与XhoI/EcoRI消化后的上述重组有相应恒定区cDNA的载体常规连接,常规转化、筛选,以酶切法鉴定阳性重组子(图2),即得到命名为pPICZαIgH和pPICZαIgκ的完整重链及轻链抗体表达载体。如图1所示,该载体内含有人抗体重链(轻链)恒定区序列,又在表达载体α信号肽3’末端引入了SalI(SpeI)位点。因此可将PCR扩增出的全套人抗体可变区cDNA(含酶切位点SalI/ApaI或SpeI/CpoI)克隆到酵母天然α信号肽的3’末端,与恒定区相接。
(2)对表达载体的修饰
毕赤酵母表达载体的AOXI表达盒位于限制性内切酶BglII和BamHI之间,可被它们完整地切割下来。由于每个表达盒都具有外源蛋白表达所需全部元件,因此可将消化后的多个表达盒重组至同一个载体中,对外源蛋白进行多拷贝表达。但该多拷贝载体在制备及表达时存在以下问题:(a)由于BglII和BamHI是一对同尾酶,因此在2个或多个表达盒串联重组时,会存在头-头,尾-尾,头-尾几种连接方式,影响外源蛋白质的表达。(b)酵母表达载体须在线性化条件下转化宿主细胞,以提高整合效率。但多拷贝表达载体可能同时含有多个线性化酶切位点而给载体的线性化带来困难(如果以环状形式转化宿主细胞则导致整合效率大大降低)。为了克服这些缺陷,本研究利用PCR介导的定位突变技术对上述完整重链和轻链抗体表达载体进行适当的修饰,以使之更适于酵母宿主的转化和外源蛋白质的多拷贝表达。所说的修饰包括以下几个方面。
(a)在轻链和重链表达载体中引入ClaI位点:为解决载体多拷贝串联时正确连接的问题,我们应用PCR介导的定位突变技术,在AOXI表达盒3’末端引入新的ClaI酶切位点。设计合成含有ClaI位点的引物,PCR扩增出相应的DNA片段,然后将其分别与相应的用同样酶切的重链和轻链表达载体连接并转化酵母宿主。对阳性重组转化体的酶切法鉴定结果表明:在AOXI表达盒3’末端成功地引入新的酶切位点ClaI后,即可使用内切酶BglII、BamHI和ClaI对载体和目的基因进行消化和连接,从而保证多个表达盒能够按同一方向重组到载体中(图3)。
(b)对轻链表达载体PmeI位点的修饰:合成其中PmeI线性化位点已发生突变的引物,PCR扩增得到相应的DNA片段并经限制性内切酶消化后与轻链表达载体pPICZαCκ进行重组,然后用所得到的重组质粒转化宿主细胞。对重组体的酶切鉴定结果表明,如此处理后,消除了轻链抗体表达盒中的PmeI位点,并使串联重组后得到的全分子抗体表达载体只保留有一个用于进一步线性化切割的PmeI位点(图3)。
实施例2:全分子抗体表达载体pPICZαIgG的构建
用BamHI/ClaI双酶消化如上修饰的重链表达载体pPICZαIgH,同时用BglII/ClaI消化竟修饰的轻链表达载体pPICZαIgκ。回收所需的片段并在连接酶作用下将分别克隆有轻链和重链恒定区序列的两个AOXI表达盒重组到同一个载体中,以构成用于表达完整抗体的重组载体。用所得到的重组载体常规转化酵母宿主细胞后对其进行酶切鉴定。结果表明,该载体同时含有人抗体重链和轻链恒定区基因以及供可变区基因克隆的限制性内切酶位点。并且该载体只包含一个PmeI线性化酶切位点(图4)。
实施例3:全分子抗体表达体系的建立
(1)全分子人源抗体重组质粒的构建:使用Trizol试剂盒(Gibco/BRL)从人外周血淋巴细胞中提取总RNA。以该RNA为模板,使用下列轻/重链简并引物进行RT-PCR扩增:5’-CAG
GTCGACCTGSWGSAGTCWGGG-3’(重链上游);5’-GATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAC-3’(重链下游);5-GCCAG
ACTAGTGMTGACMCAGTCTCC-3’(轻链上游);5-CCA
CGGTCCGTTGGATATCCAGCCTGGT-3’(轻链下游)。分别扩增得到所需的人抗体VH和VκcDNA。回收并纯化后,分别用SalI/ApaI和SpeI/CpoI双酶消化之,然后将它们依次重组到已构建好的人重链、轻链及全分子抗体表达载体中。常规转化宿主细胞后,酶切鉴定所得到的阳性重组子。
(2)完整人源抗体在酵母菌中的诱导表达:按照常规方法制备酵母感受态细胞。用相应的内切酶将如上获得的重组质粒切成线性后,与感受态细胞混合并移入电转化杯中。选择酵母参数fungi-pulse,进行电转化。之后立即加入1ml冰浴的山梨醇终止反应并将混合物转到1.5ml EP管中。30℃静置孵育1~2小时(h)。然后取约80μl转化后的菌液涂布于含Zeocin(100μg/ml)的YPD(酵母提取物-蛋白胨-D-葡萄糖培养基)平板上,30℃倒置培养2~3天,并定时观察转化子的生长状态。培养后,从YPD培养板上分别挑取10个Zeocin抗性克隆接种于10ml BMGY培养基中,30℃震荡培养24h,至OD600达到2.0~6.0时收集细胞。用等体积(10ml)BMMY重悬细胞沉淀,30℃震荡培养并诱导表达。诱导表达过程中,每24h补充一次甲醇至终浓度0.5%,同时补充灭菌重蒸水,使发酵液总体积保持不变。于培养的第0,1,2,3,4和5天等时间点各取1ml发酵液,离心分离上清并进行蛋白质理化性质和生物学活性分析。
(3)表达产物的鉴定:分别取轻链、重链及全分子抗体的第5天培养物上清进行Western印迹分析。于还原条件下对单链抗体进行电泳分离(分离胶12%),并于非还原条件下对全分子抗体进行电泳分离(分离胶8%)。之后通过电转移将蛋白转至硝酸纤维素膜上,2%BSA封闭后,以辣根过氧化物酶标记的山羊抗人抗体为第二抗体,以DAB为显色剂进行免疫印迹分析。结果分别在相应重链(55KD)、轻链(23KD)和完整抗体(140KD)的位置出现染色区带(图6和7),表明本发明建立的表达体系成功地表达了我们所预期的目的蛋白质。
实施例4:人抗乙肝表面抗体序列的筛选
(1)构建天然抗体表达文库:
筛选并分离抗-HBs抗体强阳性血液,经淋巴细胞分离液梯度密度离心后获取淋巴细胞并提取总RNA。以之为模板,利用如前所述的两组简并性可变区扩增引物进行RT-PCR,扩增得到全套人VH和Vκ基因。分别用SalI/ApaI和SpeI/CpoI消化上述抗-HBs抗体的VH和Vκ基因,收集适当的酶切片段并于相应的内切酶部位重组到重链和轻链抗体表达载体pPICZαIgH和pPICZαIgκ中,得到携带抗HBs抗体重链和轻链可变区基因序列的重组质粒。线性化后将该重组质粒转化到酵母感受态细胞内。将所得到的被转化细胞30℃静置孵育1~2h后,取50~100μl菌液涂布于含Zeocin(100μg/ml)的YPD平板上。由于用于转化的重组质粒并不是来自单一克隆,而是全套轻链(重链)抗体混合物,为保证筛选到所需的目的蛋白质(抗-HBs抗体),须将全部转化菌涂于多块含Zeocin的YPD培养板上,以构成重链或轻链抗体的表达文库。随机挑取10个克隆进行DNA序列测定,结果显示它们的序列均各不相同,因此表明这些文库具有良好的多样性。
(2)抗乙肝表面抗体的筛选:
从重链(轻链)抗体转化菌的YPD培养板上各随机挑取100个Zeocin抗性克隆接种于BMGY培养基中,30℃震荡培养24小时(h),至OD600达到约2.0~6.0时收集细胞。用等体积BMMY溶液重新悬浮转化体细菌细胞后,30℃震荡培养并向细胞悬液中加入0.5%(W/V)甲醇以诱导表达。在培养的第0~5天各取1ml发酵液,并离心分离上清。取第5天的培养物上清用抗-HBs抗体(检测试纸)进行粗筛。在试纸加样处滴加80μl上清液,以20分钟内呈现颜色反应者为抗-HBs抗体阳性。粗筛后,再使用ELISA方法对阳性克隆作进一步的生物活性鉴定。结果显示,本发明的重组表达系统分别成功地分泌表达了抗-HBs抗体的轻链及重链克隆。
取抗-HBs抗体表达阳性酵母菌,接种于YPD培养基中30℃培养过夜,然后离心收集菌体。将细胞沉淀物重新悬浮的STBE中并洗涤(5000rpm离心5分钟),然后使用反复冻融法(加入TE 100μl/ml酵母菌液,100℃煮沸10分钟,然后于-80℃冰冻30分钟,再100℃煮沸10分钟后离心取上清)提取酵母基因组DNA。以提取的酵母基因组DNA为模板,用前述轻链和重链可变区扩增引物进行PCR扩增(反应条件为:94℃预变性2min,94℃30s,55℃30s,72℃1min,共30个循环,最后72℃延伸10min)。琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物,回收并纯化后进行测序分析。
将所获得的抗-HBs抗体的序列与已发表序列进行同源性比较,结果显示本发明方法得到的抗-HBs抗体的轻链可变区基因与已发表的Clone305-51L Vκ序列(Genbank AB027444)具有93%的同源性,但氨基酸序列则只有88%同源性。其中尤其以两者的CDR3区(由23个氨基酸构成)的变异为最大。而重链可变区序列仅与已发表的Clonel4可变区序列(Genbank AF455923)部分同源。其中,CDR3区无论基因序列还是基因长度均不同与已知的同类序列。因此,可以认为该抗体序列是具有HBsAg结合活性的新的人源抗体序列。
实施例5:全分子人抗乙肝表面抗体的诱导表达
(1)全分子人抗乙肝表面抗原抗体表达质粒的构建:
分别用SalI/ApaI和SpeI/CpoI消化上述抗-HBs抗体的VH和Vκ基因,收集适当的酶切片段并于相应的内切酶部位重组到重链和轻链抗体表达载体pPICZαIgH和pPICZαIgκ中,得到携带抗HBs抗体重链和轻链可变区基因序列的重组质粒。用所得到的重组质粒转化酵母宿主细胞后,常规培养转化体细胞并筛选阳性菌落,然后从中提取DNA并对其进行酶切鉴定。
(2)全分子人抗乙肝表面抗体在酵母中的诱导表达:
按照常规方法制备酵母感受态细胞。用相应的内切酶将如上获得的重组质粒切成线性后,与感受态细胞混合并移入电转化杯中。选择酵母参数fungi-pulse,进行电转化。之后立即加入1ml冰浴的山梨醇终止反应并将混合物转到1.5ml EP管中。30℃静置孵育1~2h。然后取约80μl转化后的菌液涂布于含Zeocin(100μg/ml)的YPD平板上,30℃倒置培养2~3天,并定时观察转化子的生长状态。培养后,从YPD培养板上分别挑取8个Zeocin抗性克隆接种于10ml BMGY培养基中,30℃震荡培养24h,至OD600达到2.0~6.0时收集细胞。用等体积(10ml)BMMY重悬细胞沉淀,30℃震荡培养并诱导表达。诱导过程中,每24h补充一次甲醇至终浓度0.5%,同时补充灭菌的重蒸水,使发酵液总体积保持不变。在培养0-7天各取1ml发酵液,离心菌体,收集上清用于蛋白分析。
(3)活性蛋白的鉴定:
离心收集各克隆的第5天培养物上清,以重组人HBsAg疫苗作为抗原,以辣根过氧化物酶标记的山羊抗人抗体为第二抗体,以OPD为显色剂,应用ELISA方法检测阳性克隆,结果以A490值表示。同时,以BSA-PBS为阴性对照。结果如下列表1所示。
表1不同克隆表达的重组抗体的HBsAg结合活性比较(
x±s)
克隆 | 对照 | G1 | G2 | G3 | G4 | G5 | G6 | G7 | G8 |
A490吸光率 | 0.06±0.02 | 0.09±0.02 | 0.22±0.03 | 0.12±0.01 | 0.20±0.03 | 0.12±0.03 | 0.14±0.02 | 0.14±0.02 | 0.14±0.01 |
从表1所示的结果可以看出,8个克隆中有2个克隆G2和G4表达了具有HBsAg结合活性的重组抗体蛋白质。
实施例6:全分子人抗乙肝表面抗体的活性鉴定
本实施例描述分别以酶联免疫吸附法(ELISA)检测本发明人源抗体的抗原结合活性,以Western印迹法检测抗体的结构完整性,并使用活体动物猕猴检测所得抗体对乙型肝炎表面抗原攻击的保护作用。
(1)重组抗体的乙肝表面抗原结合活性:
以重组人HBsAg疫苗(购自上海生物制品所)作为抗原(1μg/孔),4℃过夜包被24孔微量滴定板。用1%牛血清白蛋白(BSA)封闭后向各孔内分别加入阳性克隆G2的不同时间的培养物上清(100μl/孔),37℃孵育1.5小时。然后以山羊抗人IgG-HRP作为第二抗体进行常规ELISA检测,结果以A490值表示。其中,以该克隆的第0天培养物上清作为阴性对照。结果如下列表2所示。
表2G2阳性克隆重组抗体与乙肝表面抗原结合反应的经时变化(
x±s)
天数 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
A490吸光率 | 0.06±0.02 | 0.10±0.01 | 0.12±0.02 | 0.15±0.02 | 0.17±0.02 | 0.21±0.02 | 0.22±0.03 | 0.22±0.02 |
从表2所示的结果可以看出,按上述本发明方法制备的重组抗乙肝人抗体具有良好的乙肝表面抗原结合活性。而且,该重组抗体的表达随时间延长而增加,具有累积效应。表达第5天达到高峰,但5~7天无明显差别。
(2)Weatern印迹分析:
将抗-HBs抗体阳性菌株G2接种于400ml BMGY培养基中,30℃震荡培养24h,至OD600达到2.0~6.0时收集细胞。用等体积BMMY重悬细胞,30℃培养并加入甲醇诱导表达。在诱导过程中,每24h补充一次甲醇至终浓度0.5%。培养第5天离心收集上清,采用Protein A Sepharose CL-4B亲和层析柱进行纯化。于非还原条件下电泳(分离胶8%)纯化产物。之后以电转移法将蛋白转至硝酸纤维素膜上。用2%BSA封闭后,以辣根过氧化物酶标记的山羊抗人抗体为第二抗体,以DAB为显色剂进行免疫印迹分析。结果相应全分子抗体(140KD)的位置出现染色区带(图9),表明诱导表达的蛋白即为我们所预期的目的蛋白质。
(3)重组抗体的生物学活性:
选择抗-HBV抗体阴性、SGPT指标正常的健康猕猴9只(平均体重2.5-4.5Kg),每组3只。3个实验组的每只动物通过静脉途径注射本发明抗-HBs抗体100IU,分别于抗体注射前1天(1组)、抗体注射后1天(2组)和1周(3组)用乙肝病毒攻击,然后观察动物症状和体征变化。观察期间动物正常进食,未见明显的异常行为,并且各组动物体重亦无明显改变。
于病毒接种后第0、2、4、8和12周采集实验动物的静脉血,分离血清并分别以常规生化检测法检测动物的血清谷丙转氨酶(SGPT)水平。同时,通过肝穿刺采集被试动物的活体肝组织并进行肝组织病理学检查。结果如下列表3所示。
表3抗-HBs抗体接种猴体安全性试验
实验动物组 | 血清SGPT异常(周) | 肝组织病理异常(周) |
0 2 4 8 12 | 0 4 8 12 | |
123 | 0/2 0/3 0/3 0/3 0/30/3 0/3 0/3 0/3 0/30/3 0/3 0/3 0/3 0/3 | 0/3 0/3 0/3 0/30/3 0/3 0/3 0/30/3 0/3 0/3 0/3 |
从表3所示结果可以看出,于乙肝病毒感染前、后注射抗体均可有效预防病毒感染,动物均未发生血清肝酶的异常升高。肝活体组织病理学检查也表明,所有试验动物均未见肝组织的异常病理学改变。表明本发明的抗体具有良好的生物学效应。
序列表
<110>吉林圣元科技有限公司
<120>重组人抗体表达载体及其应用
<140>
<141>
<160>4
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作PCR扩增的引物。
<400>1
CAG
GTCGACC TGSWGSAGTC WGGG
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作PCR扩增的引物。
<400>2
GAT
GGGCCCT TGGTGGAGGC TGAC
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作PCR扩增的引物。
<400>3
GCC
AGACTAG TGMTGACMCA GTCTCC
<210>4
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作PCR扩增的引物。
<400>4
CCA
CGGTCCG TTGGATATCC AGCCTGGT
Claims (9)
1、用于表达完整人抗体的重组表达载体,特征在于所说的载体同时携带有人轻链和重链抗体恒定区序列以及供插入可变区序列的适当的限制性内切酶位点。
2、根据权利要求1的重组表达载体,其中所说的完整人抗体表达载体是重组质粒pPICZαIgG。
3、根据权利要求1的重组表达载体,其中所说的载体还携带有功能性分泌信号序列。
4、根据权利要求1的重组表达载体,其中所说的完整人抗体是完整的人单克隆抗体或人源化小鼠单克隆抗体。
5、根据权利要求1的重组表达载体,其中所说的完整人抗体是完整的人单克隆抗体。
6、被根据权利要求1的重组表达载体转化的并能够在适当的培养条件下表达人抗体分子的宿主细胞。
7、据权利要求6的宿主细胞是毕赤酵母细胞。
8、根据权利要求1的重组表达载体在分泌表达完整的人免疫球蛋白中的应用。
9、根据权利要求1的重组表达载体在分泌表达完整的抗乙型肝炎表面抗原的人单克隆抗体中的应用。
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-
2004
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |