CN104593416A

CN104593416A - pHAb-FAST人源抗体表达载体系统及其使用方法

Info

Publication number: CN104593416A
Application number: CN201510053657.9A
Authority: CN
Inventors: 李大伟; 郭昊; 朱奇; 武正华; 陈昊; 荣荣; 俞晓燕; 邓江山
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2015-02-02
Filing date: 2015-02-02
Publication date: 2015-05-06

Abstract

本发明提供了一种pHAb-FAST人源抗体表达载体系统，包括pHAb-FAST 1载体和pHAb-FAST 2载体，所述pHAb-FAST 1载体包含依次排列的EF1α启动子，人抗体轻链信号肽序列和人抗体重链恒定区序列；所述pHAb-FAST 2载体包含依次排列的人抗体轻链恒定区序列、IRES序列和人抗体重链信号肽序列。运用本发明的所述表达载体系统，借助重叠PCR扩增技术，无需酶切连接过程，即可高效快速地获得具有表达功能的人源抗体表达载体；通过所获得的人源抗体表达载体可在哺乳动物细胞内高效表达全长抗体。

Description

pHAb-FAST人源抗体表达载体系统及其使用方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及pHAb-FAST人源抗体表达载体系统及其使用方法。

背景技术

随着基因重组技术，杂交瘤技术以及PCR技术的成熟，单克隆抗体药物的产生成为可能。自1986年第一种单克隆抗体药物Orthoclone Okt3上市至今的短短25年间，已有35种单克隆抗体药物相继批准上市，其治疗领域涵盖了20多种疑难重症，在有效缓解和治疗疾病的同时也为各制药公司赚取了巨额利润。据医药领域权威预测公司IMS health公司的预测，到2016年，全球销售排行前50的药物中单克隆抗体类药物将占11个，而在前10名中，单抗药物将占据6个席位，分别是排名第一位的Humira(adalimumab)，排名第二位的Avastin(bevacizumab)，排名第4位的Rituxan(rituximab)，排名第6位的Herceptin(trastuzumab)，排名第7位的Remicade(infliximab)以及排名第10位的Prolia(denosumab)。在肿瘤治疗领域，销售额排名前5的药物中单抗类药物将占据4个席位，分别是Avastin(bevacizumab)，Rituxan(rituximab)，Herceptin(trastuzumab)和Erbitux(cetuximab)。在抗风湿病领域的前5名药物中，单抗药物亦将占有4个席位：Humira(adalimumab)，Remicade(infliximab)，Simponi(golimumab)，和Actemra(tocilizumab)。由此可见，单克隆抗体药物已经成为生物技术药物领域中的新秀，随着新靶点的不断引入，单克隆抗体药物的治疗领域也将进一步扩大，单克隆抗体的开发越来越受到各国科学家和各大知名药厂的关注和青睐。

另外，从25年的上市单抗药物的类型来看，单克隆抗体药物经历了由鼠源抗体到嵌合抗体到人源化抗体到全人抗体的演变，随着这种演变的发生，其治疗效果有了明显的提高，副作用有了显著降低。所以，含有人抗体恒定区的抗体类型(嵌合抗体/人源化抗体/全人抗体)将成为今后单克隆抗体药物的主流。

单克隆抗体药物的产生的过程中均需要构建特定抗体的表达载体或是抗体库。无论是经过噬菌体展示技术产生的优化抗体片段(Fab、scFv)，还是通过哺乳动物细胞展示技术筛选全长抗体，均需要将抗体的轻链可变区和重链可变区与人抗体的恒定区相连并确保正确表达和顺利分泌。到目前为止，虽然有多种商业化的表达载体，但是针对人源抗体分子构建的可用载体很少，而且现有的表达载体均为单质粒系统且需要通过多次酶切连接才能够在同一表达载体上同时表达两种成分(如抗体重链和抗体轻链)，构建步骤繁琐，时间耗费长，至今无商业化的高效人源抗体表达载体系统可供选用。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高效的人源抗体表达载体系统。运用本发明的所述表达载体系统，借助重叠PCR扩增技术，无需酶切连接过程，即可高效快速地获得具有表达功能的人源抗体表达载体；通过所获得的人源抗体表达载体可在哺乳动物细胞内高效表达全长抗体。

本发明第一方面公开了一种pHAb-FAST人源抗体表达载体系统，包括pHAb-FAST 1载体和pHAb-FAST 2载体，所述pHAb-FAST 1载体包含依次排列的EF1α启动子，人抗体轻链信号肽序列和人抗体重链恒定区序列；所述pHAb-FAST 2载体包含依次排列的人抗体轻链恒定区序列、IRES序列和人抗体重链信号肽序列。

优选的，所述pHAb-FAST 1载体中，EF1α启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

优选的，所述pHAb-FAST 1载体中，人抗体轻链信号肽序列的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示。

优选的，所述pHAb-FAST 1载体中，人抗体重链恒定区序列的核苷酸序列为如SEQ IDNO：5所示。

进一步的，所述pHAb-FAST 1载体中，还包括基本真核表达载体所需的转录终止信号(polyA尾)、抗氨苄青霉素抗性基因及大肠杆菌DNA复制基本元件。

优选的，所述pHAb-FAST 2载体以T载体形式存在。

优选的，所述pHAb-FAST 2载体中，人抗体轻链恒定区序列的核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示。

优选的，所述pHAb-FAST 2载体中，IRES序列的核苷酸序列为如SEQ ID NO：7所示。

优选的，所述pHAb-FAST 2载体中，人抗体重链信号肽序列的核苷酸序列如SEQ IDNO：8所示。

优选的，所述pHAb-FAST 1载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述pHAb-FAST2载体核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选的，所述pHAb-FAST 1载体和pHAb-FAST 2载体共同构成pHAb-FAST人源抗体表达载体系统。

本发明第二方面公开了前述pHAb-FAST人源抗体表达载体系统的制备方法，可采用本领域技术人员公知的常规方法来制备。

本发明第三方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括前述前述pHAb-FAST人源抗体表达载体系统。

进一步优选的，所述试剂盒还包括引物对1。

优选的，引物对1是反向PCR引物，用于将pHAb-FAST 1载体的人抗体轻链信号肽序列和人抗体重链恒定区序列之间打开。

更优选的，引物对1包括引物对1正向引物和引物对1反向引物，所述引物对1正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，具体为：

5'-GCCTCCACCAAGGGCCCATC-3'。

所述引物对1反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，具体为：

5'-ACATCTGGCACCTGGGAGCCAG-3'。

进一步优选的，所述试剂盒还包括引物对2。

引物对2用于从pHAb-FAST 2载体中获取包含人抗体轻链恒定区序列、IRES序列和人抗体重链信号肽序列的特定片段。

优选的，引物对2包括引物对2正向引物和引物对2反向引物，所述引物对2正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，具体为：5'-CGAACTGTGGCTGCACCATC-3'。

所述引物对2反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示，具体为：5'-GGAGTGGGCACCTGTTGCTG-3'。

进一步优选的，所述试剂盒还包括用于制备引物对3的核苷酸序列。

优选的，引物对3包括引物对3正向引物和引物对3反向引物。

优选的，引物对3具有扩增待用抗体轻链可变区序列的功能。另外，引物对3的正向引物还具有在待用抗体轻链可变区序列5’端添加与人抗体轻链信号肽序列3’端相重叠的序列的功能，引物对3的反向引物还具有在待用抗体轻链可变区序列3’端添加与人抗体轻链恒定区序列5’端相重叠的序列的功能。

所述引物对3正向引物的设计方法为：在用于扩增待用抗体轻链可变区的正向引物的5'端添加如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列(5'-CTGGCTCCCAGGTGCCAGATGT-3')，形成长度为42bp～52bp的引物对3正向引物。

所述引物对3反向引物的设计方法为：在用于扩增待用抗体轻链可变区的反向引物的5'端添加如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列(5'-GATGGTGCAGCCACAGTTCG-3')，形成长度为40bp～50bp的引物对3反向引物。

进一步优选的，所述试剂盒还包括用于制备引物对4的核苷酸序列。

优选的，引物对4包括引物对4正向引物和引物对4反向引物。引物对4具有扩增待用抗体重链可变区序列的功能。另外，引物对4的正向引物还具有在待用抗体重链可变区序列5’端添加与人抗体重链信号肽序列3’端相重叠的序列的功能，引物对4的反向引物还具有在待用抗体重链可变区序列3’端添加与人抗体重链恒定区序列5’端相重叠的序列的功能。

所述引物对4正向引物的设计方法为：在用于扩增待用抗体重链可变区的正向引物的5'端添加如SEQ ID NO：15所示的核苷核酸序列(5'-CAGCAACAGGTGCCCACTCC-3')，形成长度为40bp～50bp的引物对4正向引物。

所述引物对4反向引物的设计方法为：在用于扩增待用抗体重链可变区的反向引物的5'端添加如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列(5'-GATGGGCCCTTGGTGGAGGC-3')，形成长度为40bp～50bp的引物对4反向引物。

进一步优选的，所述试剂盒还包括末端引物对。

优选的，末端引物包括末端引物正向引物和末端引物反向引物。

优选的，所述末端引物正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示，具体为：5'-CTGGCTCCCAGGTGCCAGATGT-3'。所述末端引物反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：18所示，具体为：5'-GATGGGCCCTTGGTGGAGGC-3'。

进一步的，所述试剂盒还可以包括使用该人源抗体表达系统时可能需要使用的任何试剂和细胞(如感受态细胞DH5α，CHO细胞，293T细胞等)，也可包含做真核细胞转染时作为阴性对照的pHAb-FAST空质粒(不含任何抗体组件，其余部分与pHAb-FAST完整质粒一致)。试剂盒所供给的组分可以合适的小瓶或容器(如塑料小瓶或玻璃小瓶)形式提供。试剂盒可包括用于合适的贮存标签指示或合适的使用说明书。

本发明第四方面还可以提供另外一种试剂盒，所述试剂盒包括大片段1和小片段2。

优选的，所述大片段1是以前述pHAb-FAST 1载体为模板，用前述引物对1进行PCR反应获得的。

优选的，所述大片段1的5’端依次(5’→3’)有与待用抗体重链链可变区序列3’端相重叠的序列和人抗体重链恒定区序列，大片段1的3’端依次(5’→3’)有EF1α启动子，人抗体轻链信号肽序列以及与待用抗体轻链可变区序列5’端相重叠的序列的功能。

优选的，所述大片段1的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。

优选的，所述小片段2是以前述pHAb-FAST 2载体为模板，用引物对2进行PCR反应，获得的。

优选的，所述小片段2从5’端到3’端依次为与待用抗体轻链链可变区序列3’端相重叠的序列、人抗体轻链恒定区序列、IRES序列、人抗体重链信号肽序列和与待用抗体重链链可变区序列5’端相重叠的序列。

优选的，所述小片段2的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。

进一步优选的，所述试剂盒还包括前述用于制备引物对3的核苷酸序列。

进一步优选的，所述试剂盒还包括前述用于制备引物对4的核苷酸序列。

进一步优选的，所述试剂盒还包括前述末端引物对。

本发明第五方面提供了一种制备人源抗体的方法，包括如下步骤：

(1)制备待用片段

(a)以pHAb-FAST 1载体为模板，用引物对1进行PCR反应，获得大片段1。

5'-GCCTCCACCAAGGGCCCATC-3'。

5'-ACATCTGGCACCTGGGAGCCAG-3'。

优选的，所述大片段1的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。

(b)以pHAb-FAST 2载体为模板，用引物对2进行PCR反应，获得小片段2。

优选的，引物对2用于从pHAb-FAST 2载体中获取包含人抗体轻链恒定区序列、IRES序列和人抗体重链信号肽序列的特定片段。

所述引物对2反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示，具体为：

5'-GGAGTGGGCACCTGTTGCTG-3'。

优选的，所述小片段2的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。

(c)以待用抗体轻链可变区为模板，用引物对3进行PCR反应，获得片段3。

优选的，引物对3包括引物对3正向引物和引物对3反向引物。

优选的，所述片段3从5’端到3’端依次为与人抗体轻链信号肽序列3’端相重叠的序列、待用抗体轻链可变区和与人抗体轻链恒定区序列5’端相重叠的序列。

(d)以待用抗体重链链可变区为模板，用引物对4进行PCR反应，获得片段4。

优选的，所述片段4从5’端到3’端依次为与人抗体重链信号肽序列3’端相重叠的序列、待用抗体重链可变区和与人抗体重链恒定区序列5’端相重叠的序列。

(3)进行第一次重叠PCR：将片段3，小片段2和片段4，按特定比例混合进行重叠PCR反应，将重叠PCR反应结束后获得的重叠PCR反应液作为模板，用末端引物进行常规PCR，获得片段5。

末端引物用于扩增获得特定片段5。

优选的，末端引物包括末端引物正向引物和末端引物反向引物。优选的，所述末端引物正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示。所述末端引物反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。

优选的，所述片段5从5’端到3’端依次为与人抗体轻链信号肽序列3’端相重叠的序列、待用抗体轻链可变区、人抗体轻链恒定区序列、IRES序列、人抗体重链信号肽序列和与待用抗体重链链可变区序列5’端相重叠的序列。

(4)进行第二次重叠PCR：将片段5与大片段1按比例混合进行重叠PCR反应。

(5)转化大肠杆菌：取步骤(4)获得的重叠PCR反应液转化大肠杆菌感受态细胞中，筛选重组真核表达载体的阳性克隆，摇菌，抽质粒。

优选的，所述大肠杆菌感受态细胞为DH5α感受态细胞。

(6)取步骤(5)获得的质粒做酶切鉴定，初步证实得到的序列是真核表达质粒。

优选的，用XbaI和BamHI做酶切鉴定。

(7)将鉴定正确的质粒送测序：对人源抗体表达质粒的各连接部位进行测序，进一步确认其正确性。

优选的，所述表达质粒中轻链由EF1α启动子启动，重链由IRES启动。

(8)将人源抗体表达质粒转染宿主细胞，表达和分泌待用抗体。

优选的，所述宿主细胞为293T细胞。

进一步的，当已经有制备好的大片段1和小片段2时，那么制备人源抗体时，步骤(1)中的(a)和(b)可以省略。此方法，也在本专利的保护范围之内。

本发明第六方面公开了前述pHAb-FAST人源抗体表达载体系统或试剂盒或方法在人源抗体表达中的应用。

优选的，所述人源抗体选自嵌合抗体，人源化抗体或全人抗体。

本发明的有益效果为：

1.本发明的pHAb-FAST人源抗体表达载体系统是一种全分子抗体表达体系，是将含有可变区和全部人抗体恒定区序列的全长轻链及重链抗体重组到同一个载体中进行表达的表达载体系统，这种表达载体系统既优于缺乏相应恒定区的小分子抗体表达系统，也不需要以分别含有轻链和重链抗体的表达载体同时转染细胞。

2.本发明所涉及的pHAb-FAST人源抗体表达载体系统中轻链由EF1α启动子启动，重链由IRES启动，保证了轻链表达量略高于重链表达量的表达比例，更符合自然状态下B淋巴细胞的抗体轻重链组件的表达模式，有利于已组装好的完整抗体的分泌并减少了由于单重链分子在细胞内积累对细胞产生的负面影响。

3.本发明所涉及的pHAb-FAST人源抗体表达载体系统中抗体重链序列和抗体轻链序列的5’端分别加有来自于人B淋巴细胞的天然重链轻链抗体信号肽，保证了轻重链抗体的高效合成和分泌。

4.本发明所涉及的pHAb-FAST人源抗体表达载体系统及其使用方法的特点在于，其无需进行多次酶切连接反应，可在1天内完成人源抗体表达质粒的构建，从构建质粒到获得测序结果仅需4天(构建1天，转化1天，摇菌抽质粒1天，测序1天)。该载体系统除具有快速构建的能力以外，还具有极高的准确性，由转化所获得的质粒，接近100％为所要获得的具有正确序列的人源抗体质粒。

5.本发明所涉及的pHAb-FAST人源抗体表达载体系统及其使用方法的用途在于无论是全合成的或是来自于噬菌体抗体库筛选的或是分泌抗体的杂交瘤细胞株扩增的针对任何一种抗原的人源的或是鼠源的或是人源化的抗体轻链和重链可变区(VH,VL)均可通过重叠PCR的方法快速准确的形成具有人抗体恒定区的全长抗体表达质粒，从而可以在哺乳动物细胞如CHO细胞，BHK细胞，HEK-293细胞，PER-C6细胞，NS0细胞，Sp2/0细胞等细胞中获得全人抗体(IgG1-kappa型)，嵌合抗体或人源化抗体的表达。

6.本发明所涉及的pHAb-FAST人源抗体表达载体系统及其使用方法的用途还在于：运用此载体系统，可以轻松快捷的建立高效表达IgG全长人抗体的永久性表达细胞系从而用于大规模生产全长人IgG抗体。

附图说明

图1是人源抗体表达载体系统中组分pHAb-FAST 1的结构模式图

图2是人源抗体表达载体系统中组分pHAb-FAST 2的结构模式图

图3是人源抗体表达载体系统使用方法的简易图示

图4是人源抗体表达载体系统使用过程中各片段(大片段1、小片段2、片段3和片段4)的电泳图谱

图5是人源抗体表达载体系统使用方法中步骤5所获得的重叠PCR反应液的电泳图谱及片段5电泳图谱

图6是B4完整抗体表达载体的酶切鉴定结果

图7是构建好的人源抗体表达载体经转染293T细胞后细胞裂解液和上清液的Westernblot结果

图8是完整人源化抗体质粒的构建流程

图9是pHAb-FAST载体系统构建并表达的人源化抗体大小与原鼠抗体大小western blot比较图

图10是pHAb-FAST载体系统构建并表达的人源化抗体的种属检测结果

图11是pHAb-FAST载体系统构建并表达的人源化抗体的抗原纯蛋白结合活性检测图

图12是pHAb-FAST载体系统构建并表达的人源化抗体的抗原结合活性检测图

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

以下实施例中载体及基因来源说明：特异引物由上海生工合成；载体鉴定中使用的限制性内切酶BamHI、XbaI酶均为Fermentas公司产品(生工生物工程(上海)有限公司，021-37772180)；载体构建中使用的DNA纯化试剂盒为索莱宝公司(上海索宝生物科技有限公司，上海市徐汇区钦江路)产品，按说明书进行；载体转染(PEI为sigma公司产品)及分泌表达检测试剂均为市售试剂。KOD DNA聚合酶购自TOYOTO(东洋纺)公司。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1用pHAb-FAST载体系统构建B4嵌合抗体表达载体

A、设计引物：

根据使用方法步骤1中的引物设计原则，引物序列设计如下：

引物对1正向引物

5'-GCCTCCACCAAGGGCCCATC-3'SEQ ID NO：9

引物对1反向引物

5'-ACATCTGGCACCTGGGAGCCAG-3'SEQ ID NO：10

引物对2正向引物

5'-CGAACTGTGGCTGCACCATC-3'SEQ ID NO：11

引物对2反向引物

5'-GGAGTGGGCACCTGTTGCTG-3'SEQ ID NO：12

引物对3正向引物

5'-CTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGACATCGTGATGACCCAGTCTC-3'SEQ IDNO：21

引物对3反向引物

5'-GATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGATCTCTACCTTGGTCCCTCC-3'SEQ ID NO：22

引物对4正向引物

5'-CAGCAACAGGTGCCCACTCC GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3'SEQ IDNO：23

引物对4反向引物

5'-GATGGGCCCTTGGTGGAGGCGGCGGAGACGGTGACCAGG-3'SEQ ID NO：24

末端正向引物

5'-CTGGCTCCCAGGTGCCAGATGT-3'SEQ ID NO：17

末端反向引物

5'-GATGGGCCCTTGGTGGAGGC-3'SEQ ID NO：18

B、待用片段的准备：

B-1以pHAb-FAST 1为模板，用引物对1进行PCR反应，获得大片段1(7107bp，如图4)。反应体系为50μl体系，做两管。

PCR反应体系为：

dNTPs 5μl；KOD-PLUS-NEO 10*buffer 5μl；MgSO43μl；KOD-PLUS-NEO1μl；模板pHAb-FAST 11μl；引物对1正向引物1.5μl；引物对1反向引物1.5μl；双蒸水32μl；总共50μl。

PCR反应循环反应为：

94℃预变性2min；98℃变性10s；63℃退火30s；68℃延伸3min 45s；循环数20。

B-2以pHAb-FAST 2为模板，用引物对2进行PCR反应，获得小片段2(1035bp如图4)。反应体系为50μl体系，做两管。

PCR反应体系为：

dNTPs 5μl；KOD-PLUS-NEO 10*buffer 5μl；MgSO43μl；KOD-PLUS-NEO1μl；模板pHAb-FAST 21μl；引物对2正向引物1.5μl；引物对2反向引物1.5μl；双蒸水32μl；总共50μl。

PCR反应循环反应为：

94℃预变性2min；98℃变性10s；60℃退火30s；68℃延伸30s；循环数20。

B-3以含有待用抗体轻链可变区的质粒为模板，用引物对3进行PCR反应，获得片段3(324bp如图4)。反应体系为50μl体系，做两管。

PCR反应体系为：

dNTPs 5μl；KOD-PLUS-NEO 10*buffer 5μl；MgSO43μl；KOD-PLUS-NEO1μl；轻链可变区质粒1μl；引物对3正向引物1.5μl；引物对3反向引物1.5μl；双蒸水32μl；总共50μl。

PCR反应循环反应为：

94℃预变性2min；98℃变性10s；61℃退火30s；68℃延伸15s；

循环数20。

B-4以待用抗体重链链可变区质粒为模板，用引物对4进行PCR反应，获得片段4(366bp如图4)。反应体系为50μl体系，做两管。

PCR反应体系为：

dNTPs 5μl；KOD-PLUS-NEO 10*buffer 5μl；MgSO43μl；KOD-PLUS-NEO1μl；重链可变区质粒1μl；引物对4正向引物1.5μl；引物对4反向引物1.5μl；双蒸水32μl；总共50μl。

PCR反应循环反应为：

94℃预变性2min；98℃变性10s；65℃退火30s；68℃延伸15s；

循环数20。

B-5

PCR产物经1％琼脂糖电泳分离后，可分别见7107bp、1035bp、324bp和366bp的扩增条带(图4)，将目的条带分别切下，用公司琼脂糖凝胶纯化试剂盒进行纯化，方法是：

1、从琼脂糖凝胶中将PCR产物DNA条带切下，转入离心管中，加入2倍体积的结合缓冲液，55℃下温浴7分钟使得凝胶溶解；

2、将离心管中溶解的凝胶溶液转移到试剂盒自带的DNA吸附柱中，13000转/分钟离心2分钟；

3、向DNA吸附柱中加入700μl漂洗液，13000转/分钟离心2分钟；弃去漂洗液，再加入500μl漂洗液，13000转/分钟离心2分钟；弃去漂洗液后，13000转/分钟离心2分钟，室温放置5分钟；

4、将DNA吸附柱加入一个新的离心管中，加入65℃预热的洗脱缓冲液70μl，13000转/分钟离心2分钟，离心管底的溶液即为回收的PCR产物DNA片段。

C、进行第一次重叠PCR(获得片段5，长度为1665bp，如图片5)：将各反应片段(小片段2、片段3、片段4)按1:1～1:5的比例[(片段大小*片段浓度)之比；大片段：小片段]加入到25ul PCR反应体系中，确保个片段的加入量在100ng～300ng之间。经计算，在试验中各片段的加入量分别为：小片段2：5.3μl，片段3：1.1μl，片段4：1.1μl。

PCR反应体系为：

dNTPs 2.5μl；KOD-PLUS-NEO 10*buffer 2.5μl；MgSO41.5μl；KOD-PLUS-NEO 0.5μl；小片段25.3μl；片段31.1μl；片段41.1μl；双蒸水10.5μl；总共25μl。

PCR反应循环反应为：

94℃预变性2min；98℃变性10s；60℃退火30s 68℃延伸60s；循环数6。

取1μl上述重叠PCR反应液作为模板，进行片段5的进一步扩增。

PCR反应体系为：

dNTPs 5μl；KOD-PLUS-NEO 10*buffer 5μl；MgSO43μl；KOD-PLUS-NEO1μl；重叠PCR反应液1μl；末端正向引物1.5μl；末端反向引物1.5μl；双蒸水32μl；总共50μl。

PCR反应循环反应为：

94℃预变性2min；98℃变性10s；63℃退火30s；68℃延伸60s；循环数16。

PCR产物经1％琼脂糖电泳分离后，可见1665bp的扩增条带，将目的条带切下，用公司琼脂糖凝胶纯化试剂盒进行纯化，方法是：

D、进行第二次重叠PCR(获得完整的人源抗体表达质粒大小为8772bp，如图片5)：将各反应片段(大片段1和片段5)按1:1～1:5的比例[(片段大小*片段浓度)之比,大片段：小片段]加入25ul PCR反应体系中，确保各片段的加入量在100ng～300ng之间。经计算，大片段1的加入量选择3.8μl，片段五的加入量选择4.2μl。

PCR反应体系为：

dNTPs 2.5μl；KOD-PLUS-NEO 10*buffer 2.5μl；MgSO41.5μl；KOD-PLUS-NEO 0.5μl；大片段13.8μl；片段54.2μl；双蒸水10μl；总共25μl。

PCR反应循环反应为：

94℃预变性2min；98℃变性10s；63℃退火30s；68℃延伸5min；循环数16。

E-1、转化大肠杆菌：将步骤D获得的重叠PCR产物转化入大肠杆菌感受态细胞中，在含有氨苄青霉素100μl/ml的LB培养基上37℃培养12-16小时，方法是：

a、取步骤D获得的重叠PCR产物5ul加到50ul的感受态细胞中，轻轻摇匀，冰浴30min.

b、42℃热激90s,快速转到冰浴2-3min,注意不要摇动管。

c、向管中加入500ul的LB培养基，150rmp,37℃，45min。

d、将菌液全部涂到LB平板上，含100ug/ml Amp。

e、将平板正置直至液体全部吸收。

f、倒置平板，于37℃培养12－16h。

E-2、筛选重组真核表达载体的阳性克隆：将菌落放大培养，纯化提取质粒，方法是：

a.挑取转化后的单菌落，接种到2ml含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中，37℃，150rpm，摇床培养12～16hr。

b.取1-1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，4℃，13000rpm离心30s，弃上清，然后再短暂离心，用枪头将离心管底部少量残液吸出弃掉。剩余菌液4℃保存。

c.将细胞沉淀漩涡震荡打散后，重悬于100μl冰预冷的碱裂解液Ⅰ中，漩涡震荡，使细菌悬浮均匀。

d.细菌重悬液中加入200μl碱裂解液Ⅱ，上下翻转离心管5次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，置于冰上(<5min)。

e.加入150μl冰预冷的碱裂解液Ⅲ,上下翻转离心管8次,使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，并将离心管置于冰上1～3min,4℃，13000rpm离心5min，将～400μl的上清转移至另一个离心管中。

f.加400μl酚:氯仿(V:V＝1:1)，震荡充分混合有机相和水相，13000rpm离心2min，取上清于新离心管中。

g.用2～2.5体积的乙醇(850μl)室温沉淀核酸，混合均匀，室温静置2min。13000rpm离心5min。小心的把上清倒掉；然后再短暂离心，用枪头把离心管底部少量残液小心的吸出弃掉。

h.加1ml左右70％乙醇于沉淀中，颠倒离心管数次，洗涤管壁与沉淀，如沉淀偏离管底需13000rpm离心1min。小心的把上清倒掉，然后再短暂离心，用枪头把离心管底部少量残液小心的吸出(若沉淀漂浮，用枪头将其置于离心管底部)。

i.打开离心管，室温静置3～5min，使乙醇充分挥发，直至离心管内没有可见的液体存在。

j.加50μl TE缓冲液(含20μg/ml RNase A)于离心管中，静置5min，温和震荡混匀。贮存于-20℃。

F、用XbaI酶和BamHI酶进行酶切鉴定，初步证实得到的序列是真核表达质粒。

酶切体系是：

10*Green buffer 2μl；XbaI 0.5μl；BamHI 0.5μl；质粒3μl；双蒸水14μl；

总共20μl。

37℃酶切1小时，跑电泳。如若正确(及形成完整的人源抗体表达质粒)，则应出现3个酶切条带，大小分别为5283bp，2745bp(含有抗体重链)和744bp(含有抗体轻链)。从图6可以看出，构建的质粒的酶切条带大小正确。

G对人源抗体表达质粒的各连接部位进行测序，进一步确认其正确性。

实施例2B4嵌合抗体表达质粒在真核细胞293T中的表达和分泌

A转染：将B4嵌合抗体表达质粒和绿荧光质粒共转染293T细胞(绿荧光质粒的作用仅为观测转染效率)。具体步骤为：

A-1将状态良好的293T细胞铺板于6孔板中，每孔2mlDMEM完全培养基，培养12～16个小时。(本实验中仅用2个孔)

A-2取300μl无血清DMEM培养基，加入0.6μg绿荧光质粒，混匀。

A-3向两个EP管中分别加入2μg的B4质粒和空质粒(不含任何抗体组件，其余部分与pHAb-FAST完整质粒一致)。

A-4取100μl A-2加入A-3的两个EP管中，混匀。

A-5取300μl无血清DMEM培养基，加入18μgPEI，混匀。

A-6取100μl A-5加入A-4的两个EP管中，混匀，孵育10分钟。

A-7向每个EP管中加入800μl无血清DMEM培养基，混匀，从而形成转染液。

A-8吸去6孔板中的培养基，更换为1ml转染液。

A-9培养箱中培养4至6小时后吸去转染液，更换为2mlDMEM完全培养基，在培养箱中培养2天。观察绿荧光情况，判断转染效率。

B收取细胞裂解液和上清液中的蛋白，用浓度为10％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，通过免疫印迹(Western blot)检测细胞裂解液中是否有B4嵌合抗体的表达以及上清中是否有B4嵌合抗体的分泌(以是否可以和抗人重链恒定区二抗结合为标准，重链大小约50KD)。图7显示，细胞中有嵌合抗体的表达且能够分泌到上清液中。

实施例3：鼠源抗AGR2抗体A的人源化改造(运用pHAb-FAST载体系统)

具体实施技术细节与实施例1和2基本类似，完整抗AGR2人源化质粒的构建流程如图8，简要来说，即以鼠源AGR2抗体A的氨基酸序列为基础，通过与人胚系抗体氨基酸序列进行同源性比对和T细胞抗原性分析后产生抗体重链和轻链可变区的人源化抗体理论序列(即SDR移植技术)，根据理论序列合成多个短的核酸片段，通过重叠PCR方法将各短片段连接成完整的人源化重链可变区和轻链可变区。随后通过一次重叠PCR将人源化重链可变区片段，pHAb-FAST2片段，人源化轻链可变区片段和pHAb-FAST1连成一个完整的载体，转化产生的质粒经测序正确后通过转染CHO细胞并收集上清液，用proteinG柱子纯化获得抗AGR2的人源化抗体，对获得的抗体的理化活性进行检测，检测结果如图9。结果显示通过运用pHAb-FAST载体系统构建并表达的人源化抗体大小与原鼠抗体大小一致(图9)，图10显示通过该质粒产生的抗体确实无法被抗鼠二抗检测到却可以被抗人二抗检测到，说明原鼠抗体确实实现了人源化。图11结果说明通过该质粒产生的抗体仍然具有原鼠抗体所具有的抗纯AGR2蛋白的活性。图12结果说明通过该质粒产生的抗体也能够在复杂环境中准确检测到抗原AGR2的存在。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims

1.一种pHAb-FAST人源抗体表达载体系统，包括pHAb-FAST 1载体和pHAb-FAST 2载体，所述pHAb-FAST 1载体包含依次排列的EF1α启动子，人抗体轻链信号肽序列和人抗体重链恒定区序列；所述pHAb-FAST 2载体包含依次排列的人抗体轻链恒定区序列、IRES序列和人抗体重链信号肽序列。

2.根据权利要求1所述的表达载体系统，其特征在于，所述pHAb-FAST 1载体中，EF1α启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；人抗体轻链信号肽序列的核苷酸序列如SEQID NO：4所示；人抗体重链恒定区序列的核苷酸序列为如SEQ ID NO：5所示。

3.根据权利要求1所述的表达载体系统，其特征在于，所述pHAb-FAST 2载体中，人抗体轻链恒定区序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；IRES序列的核苷酸序列为如SEQ ID NO：7所示；人抗体重链信号肽序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

4.根据权利要求1所述的表达载体系统，其特征在于，所述pHAb-FAST 1载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述pHAb-FAST 2载体核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

5.一种试剂盒，包括如权利要求1-4任一权利要求所述的pHAb-FAST人源抗体表达载体系统。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括以下特征中任一项或多项：

(1)所述试剂盒还包括引物对1，引物对1是反向PCR引物，用于将pHAb-FAST 1载体的人抗体轻链信号肽序列和人抗体重链恒定区序列之间打开。

(2)所述试剂盒还包括引物对2，引物对2用于从pHAb-FAST 2载体中获取包含人抗体轻链恒定区序列、IRES序列和人抗体重链信号肽序列的特定片段。

(3)所述试剂盒还包括用于制备引物对3的核苷酸序列，引物对3包括引物对3正向引物和引物对3反向引物，引物对3具有扩增待用抗体轻链可变区序列的功能；引物对3的正向引物具有在待用抗体轻链可变区序列5’端添加与人抗体轻链信号肽序列3’端相重叠的序列的功能，引物对3的反向引物具有在待用抗体轻链可变区序列3’端添加与人抗体轻链恒定区序列5’端相重叠的序列的功能。

(4)所述试剂盒还包括用于制备引物对4的核苷酸序列，引物对4包括引物对4正向引物和引物对4反向引物，引物对4具有扩增待用抗体重链可变区序列的功能，引物对4的正向引物具有在待用抗体重链可变区序列5’端添加与人抗体重链信号肽序列3’端相重叠的序列的功能，引物对4的反向引物具有在待用抗体重链可变区序列3’端添加与人抗体重链恒定区序列5’端相重叠的序列的功能。

(5)所述试剂盒还包括末端引物对，末端引物包括末端引物正向引物和末端引物反向引物。

7.一种试剂盒，包括大片段1和小片段2，所述大片段1是以前述pHAb-FAST 1载体为模板，用前述引物对1进行PCR反应获得的，所述小片段2是以前述pHAb-FAST 2载体为模板，用引物对2进行PCR反应，获得的。

8.一种制备人源抗体的方法，包括如下步骤：

(1)制备待用片段：

(d)以待用抗体重链可变区为模板，用引物对4进行PCR反应，获得片段4。

(3)进行第一次重叠PCR：将片段3，小片段2和片段4，按特定比例混合进行重叠PCR反应，重叠PCR反应结束后取重叠PCR反应液作为模板，用末端引物进行常规PCR，获得片段5。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，省略(a)和(b)，采用已经制备好的大片段1和小片段2。

10.如权利要求1-4任一权利要求所述的表达载体系统在人源抗体表达中的应用。