CN1594361A - 人源性抗破伤风外毒素抗体、其制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人源性抗破伤风外毒素抗体(HTAT－Fab)，通过下述方法制备：构建人免疫噬菌体抗体库，筛选HTAT－Fab的噬菌体阳性克隆，进而获得具有特异中和活性、高亲和力的HTAT－Fab基因，该基因可在原核细胞如大肠杆菌等、真核细胞如酵母菌等或哺乳动物细胞如CHO等中表达，纯化获得高纯度的HTAT－Fab；本发明首次利用免疫噬菌体抗体库技术研制的HTAT－Fab，具有组织穿透能力强、中和性高、亲和力高的特点，更适合用于破伤风的防治。本发明的HTAT－Fab产品，不仅可消除马血清抗破伤风抗毒素(TAT)(异种蛋白)易引起的过敏反应，又可克服人破伤风免疫球蛋白(HTIG)生产的血源不足及潜在病毒污染的问题，具有良好的应用前景。

Description

人源性抗破伤风外毒素抗体、其制备方法及其用途

发明领域

本发明涉及人源性抗破伤风外毒素抗体(HTAT-Fab)、其制备方法及其用途，属于生物制品领域。

背景技术

破伤风(tetanus)疾病是由破伤风杆菌侵入人体伤口后，在厌氧环境下繁殖，产生嗜神经外毒素而引起全身肌肉强直性痉挛为特点的急性传染病。重型患者可因喉痉挛或继发严重肺部感染而死亡；新生儿及重型患者，病死率可高达20-50％；全世界每年约有5万人死于破伤风。破伤风有效防治方案中往往需要及时注射破伤风抗毒素(Tetanus antitoxin，TAT)或人破伤风免疫球蛋白(Human Tetanusimmunoglulin，HTIG)。据不完全统计，国内需要TAT和HTIG累计达1000万人份/年以上，国际需要为1.2亿人份/年以上，市场空间广阔。

破伤风杆菌(clostridium tetani)属专性厌氧菌，大量存在于人、畜的肠道及土壤中，可形成芽胞而长期存在。破伤风杆菌无侵袭力，不侵入血循环及其他组织器官，其致病完全由细菌产生的外毒素引起。破伤风杆菌能产生强烈的外毒素，包括破伤风痉挛毒素和破伤风溶血毒素。破伤风痉挛毒素是一种神经毒素，能选择性地抑制正常存在的抑制性介质及抑制性神经元的协调作用，以致伸肌、屈肌同时强烈收缩，肌肉强直痉挛，造成破伤风特有的角弓反张，牙关紧闭等症状。抗痉挛毒素抗体可与游离毒素结合而阻断毒素入侵易感细胞；但对已与神经细胞受体结合的毒素分子则无中和作用。血清中抗毒素含量需达0.01-0.1IU/ml方有保护作用。破伤风痉挛毒素毒性很强，极少量的毒素即可致病，而如此少量毒素还不足以引起免疫应答。毒素与神经细胞牢固结合后，也不能有效地刺激免疫系统产生抗毒素。因此有效地获得抗毒素途径是通过破伤风类毒素的预防注射或通过注入大剂量抗毒素的被动免疫。

绝大多数破伤风病人均有外伤史，伤口多有合并化脓性感染。一般伤口较深，常有异物及坏死组织残留。部分患者伤口较小而隐蔽，常被患者忽视而致延误诊断和治疗，甚至因病情发展而造成严重后果。破伤风的潜伏期为1-2周，最长可达数月。具有明确外伤史及典型临床表现的破伤风患者，一般均能及时诊断。因而，治疗是否适当为直接影响破伤风预后的关键，在破伤风的治疗中，彻底的伤口清创处理，恰当地控制肌肉痉挛而防止喉痉挛，以及有效地控制肺部感染最为重要。

破伤风的治疗包括：伤口清创处理、被动免疫(TAT应用)、抗生素治疗及对症治疗。

破伤风的预防包括：伤口清创处理、主动免疫(破伤风类毒素应用)及被动免疫(TAT应用)。

对伤口的及时彻底清创和处理，可控制需氧化脓菌的感染，进而避免造成厌氧环境，达到防止破伤风杆菌生长繁殖的目的。抗生素应用的目的仅限于杀灭伤口内的破伤风杆菌繁殖体和同时侵入的需氧化脓菌。

破伤风抗毒素(tetanus antitoxin，TAT)的主要作用为中和游离的破伤风毒素，对伤口感染较重及症状明显的患者，应争取早期使用，并根据伤口情况及病情进展决定是否需要重复应用或加局部应用，以中和新产生的毒素。至于抗毒素的用量，以前多主张大剂量，10-20万IU，现多主张不必过大，一般用2万-3万IU，静滴或肌注。用前应先作皮试，如皮试阳性，则进行脱敏注射法。或用人抗破伤风免疫球蛋白(human tetanus immunoglobulin.HTIG)。被动免疫时，主要用于未进行破伤风主动免疫的受伤者。采用TAT 1000-2000IU，1次注射，可维持保护期约10天。亦可用HTIG500-1000IU肌注，可维持保护期3-4周。为加强保护效果，最好同时开始建立主动免疫，凡无破伤风类毒素预防接种史者，应在注射抗毒素之后立即接受破伤风类毒素计划免疫。

进行被动免疫后，仍可能有部分人发病，但通常潜伏期长，病情亦较轻。

我国早已将百日咳菌苗、白喉类毒素和破伤风类毒素混合为3联疫苗列入儿童计划免疫。对未进行过破伤风主动免疫的军人及易受伤的职业工作者，可采用精制破伤风类毒素进行人群免疫。在受伤时还可追加注射1次。在破伤风发病较高的地区，提倡孕妇在妊娠后期进行破伤风主动免疫。这不仅可保持产妇在分娩时有较高抗体水平，而且有足够的抗体传递给婴儿，达到有效的保护预防作用。

TAT系用破伤风类毒素免疫马的血清经胃酶消化后，提纯制得的液体或冻干抗毒素球蛋白制剂。该制剂属异源性蛋白，使用时容易引起过敏反应，TAT的过敏反应按其发生与症状，临床上分为过敏性休克、血清病(狭义)及局部过敏性反应等几种。过敏反应的发生与抗毒素的质量有关，也与人的个体因素有关。

根据文献报道，临床使用TAT引起的过敏反应高达5％-30％，其中0.001％的人发生致死性过敏反应。有关技术人员统计了某医院自2000年1月--2002年8月120例TAT使用者的过敏皮试情况，结果皮试阳性者54例，皮试阳性率为45％。

据对北京地区几家医院的TAT应用情况的调查表明，一般每家医院每天平均大约有十几至几十人接受TAT的预防注射，几乎所有医院均不采用破伤风类毒素的主动免疫预防，而且不管患者是否经过破伤风类毒素的主动免疫，均一律给予TAT注射。其注射范围也很广，几乎所有外伤，甚至有些新鲜清洁伤口均一律注射TAT。对同一患者的反复应用也较普遍。由此增加了过敏反应的发生率，因此TAT的使用应加以控制。

从药理学角度讲，预防注射1500-3000IU的TAT，2-3天内血清抗体能保持在0.3-0.6IU/ml的水平。但十几天后其抗体水平几乎测不到；由于TAT是异种蛋白，很快就被机体排泄掉；通常注射(皮下、肌肉、静脉)的TAT很少能进入创口周围组织内同毒素相遇；破伤风毒素一但与神经细胞受体结合后会不可逆转地发生毒性作用，任何抗毒素都无法中和其毒力，只能等新的神经细胞出芽生长以后才可恢复神经的正常传导作用；破伤风的潜伏期较长，且捉摸不定，届时体内几乎没有中和抗体，故对破伤风预防注射TAT的效果则不很理想，往往增加了过敏反应的发生率。欧美发达国家已停止使用马血清TAT，而采用HTIG。据报道在停止使用TAT以前每年接受TAT注射的人数超过300万，其中过敏休克死亡数超过20人。又例如，据报道注射马血清TAT的过敏反应病死率为1/5万-1/20万，与受伤后不用TAT预防而患破伤风的死亡率无几差别。据我国有关学者对几十家医院的初步调查来看，情况也颇类似。

第三届国际破伤风会议(1970年)推荐了一个伤后预防破伤风的方案，见表1。此方案为清洁消毒伤口、抗生素及破伤风类毒素使用，只有在基础免疫超过10年或基础免疫不完全且超过一年或未免疫的患者才使用TAT。因此异种动物血清来源的TAT应慎重使用。

     表1第三届国际破伤风学术会议(1970)推荐伤后预防破伤风的方案

伤员的免疫状态	创口状况	处理
			基础免疫或加强免疫未超过一年	AB	清洁消毒，不用类毒素或抗毒素清洁消毒，外科清创术，类毒素
基础免疫未超过10年或加强免疫超过1年	AB	清洁消毒，类毒素清洁消毒，外科清创术，类毒素，抗生素
			基础免疫超过10年或基础免疫不完全且超过1年或未免疫	AB	清洁消毒，抗生素，类毒素，抗毒素清洁消毒，外科清创术，类毒素，抗毒素，抗生素

创口状况：A表浅、清洁、无异物或坏死组织

B创口大或深、不洁、有异物或坏死组织

20世纪60年代，欧美发达国家相继研制出人破伤风免疫球蛋白(HTIG)。我国自80年代初期开始了HTIG的生产，目前HTIG尚不能满足市场需求，主要还是由马血清TAT占领着市场。

HTIG较TAT优点是1、在安全性方面，HTIG系采集经破伤风类毒素免疫的健康献血者抗体滴度较高的破抗血浆制备而成，属人源性同种蛋白，故使用后几乎不会发生过敏反应。2、在有效性方面，HTIG预防用量为250IU，TAT为1500-3000IU；HTIG治疗用量为3000-6000IU，TAT为50000-200000IU。可见，HTIG的功效是TAT的6倍以上。并且HTIG在人体内的半衰期长达21-27天，而TAT仅为2-14天。3、在操作性方面，由于使用TAT常发生过敏反应，所以使用前必须先做过敏试验，过敏反应阳性者，须采取脱敏注射法。注射期间需严密观察，这对医患双方都很不方便。而HTIG则无需皮试，使用起来简单方便。

人源的HTIG克服了马血清TAT临床使用的过敏反应等不良反应，大大提升了破伤风的防治水平。但由于人血源来源因难、价格昂贵，存在HIV、HBV、HCV等外源病毒污染的危险，使其工业化生产和临床应用受到了很大限制。

目前，国外已有对鼠源性单克隆抗体进行改造以制备人源化基因工程破伤风抗毒素的研究报道，但仍处于实验室研究阶段。

近年来，由于基因工程技术的发展，使利用基因工程的方法制备人源化/人源性抗体成为可能。利用基因工程制备的人源化/人源性抗体可降低或消除异种血清蛋白引起的过敏反应，又可克服人源免疫球蛋白生产的血源不足及潜在病毒污染的可能等问题，市场前景良好，是其主要发展方向。

因此，利用先进的生物技术，寻找更加高效、安全的破伤风治疗药物是非常有意义的。

发明内容

本发明的目的在于提供人源性抗破伤风外毒素抗体(HTAT-Fab)，该抗体能用于防治破伤风，几乎无过敏反应及其他副作用，使用简便，可以直接使用，避免了TAT皮试的烦琐，该抗体组织穿透力强，无外源病毒污染，可广泛适用于各种人群。

本发明的另一目的在于提供人源性抗破伤风外毒素抗体的制备方法，该方法首先建立人免疫噬菌体抗体库，然后筛选特异性抗体，并运用噬菌体表面表达技术直接获得基因工程单克隆抗体，耗时短，费用低，可获得任意目的抗体和高亲和力特异性抗体。用此方法制备的人抗破伤风毒素抗体可避免异种血清蛋白引起的过敏反应，又可克服人源免疫球蛋白生产的血源不足及存在病原体污染等问题。

本发明的再一目的在于提供上述人源性抗破伤风外毒素抗体(HTAT-Fab)在制备治疗和预防破伤风疾病药物上的用途。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种人源性抗破伤风外毒素抗体(HTAT-Fab)，包括重链和/或轻链，其中重链--Gamma链Fd段共666bp基因序列为(序列1)：

5′gagtctg ggggagactt ggtacagcct ggggggtccc tgagactctc ctgtacagcc

tctggattct cctttggcaa ctatggcctg agctgggtcc gccaggctcc agggaagggg

ctggagtggg tctcagttat cagtggtagc gctggtgcca catactacgc agactccgtg

aagggccggt tcaccatctc cagagacaat tccaagaata ccctgtttct ccaaatgaac

aacttgagag ccgacgacac ggccatttat tactgtgcga aagggggaaa gcagtggctg

ataccctggt tcgacccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc

aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg

gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca

ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac

tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc

aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt

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    轻链--Kappa链，共6 33bp基因序列为(序列2)：

5′   accc agtctccgtc ctccgtgtct gcatctccag gagacagagc caccctctct

tgtcgggcga gtcaggatat tagcaactac tacgcctggt atcagcagaa accagggcag

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aaggtggaga tgaaacgaac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat

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gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt

gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc

aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagt

tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgttag。

本发明的人源性抗破伤风外毒素抗体轻链为κ型，重链Fd为γ3，分子量分别为25KD。

本发明还涉及上述人源性抗破伤风外毒素抗体在制备治疗和预防破伤风药物中的应用。

本发明的人源性抗破伤风外毒素抗体的制备方法包括如下步骤：

1)构建人破伤风类毒素免疫噬菌体抗体库；

2)筛选、富集人源性抗破伤风外毒素抗体(HTAT-Fab)的噬菌体抗体；

3)在原核细胞、真核细胞或哺乳动物细胞中表达HTAT-Fab；

4)纯化获得高纯度的HTAT-Fab。

其中所述构建人破伤风类毒素免疫噬菌体抗体库包括人IgG Fab段基因的PCR扩增，和利用基因工程DNA体外重组技术建立破伤风类毒素免疫噬菌体抗体库；所述筛选、富集人源性抗破伤风外毒素抗体(HTAT-Fab)的噬菌体抗体包括通过固相化抗原免疫吸附筛选法，筛选出人抗破伤风类毒素的噬菌体抗体；所述在原核细胞、真核细胞或哺乳动物细胞中表达可溶性HTAT-Fab，也就是可溶性人抗破伤风类毒素IgG Fab抗体(TAT-Fab)表达产物的制备，包括切去噬菌体外壳蛋白基因III(gIII)，经连接反应后转入原核细胞、真核细胞或哺乳动物细胞中表达可溶性人抗破伤风类毒素的Fab段；所述纯化包括收集细菌沉淀，反复冻融后离心得上清，上清液中即含有HTAT-Fab。

其中的原核细胞、真核细胞或哺乳动物细胞包括但不限于大肠杆菌、酵母菌等或CHO等。

具体地说，本发明人源性抗破伤风外毒素抗体的制备方法中，人IgG Fab段基因的PCR扩增包括：用淋巴细胞分离液从经破伤风类毒素免疫数天的自愿者的抗凝血中分离淋巴细胞，提取细胞总RNA，用Oligo-dT引物将提取的RNA通过逆转录酶试剂盒逆转录成cDNA，用一组人特异性IgG Kampa链、Lamda链及重链Gramma链引物对人轻链(VC+HC)和重链Fd(VH+CH1)基因进行PCR扩增，得到PCR产物。

其中用Trizol试剂提取细胞总RNA，人特异性IgG Kampa链、Lamda链及重链Gramma链引物如下：

(1)人免疫球蛋白重链(Gamma链)Fd段可变区5’端引物：

VH1a  5’-CAG GTG CAG  CTC GAG CAG TCT GGG-3’

VH3a  5’-GAG GTG CAG  CTC GAG GAG TCT GGG-3’

VH1f  5’-CAG GTG CAG CTG  CTC GAG TCT GGG-3’

VH3f  5’-GAG GTG CAG CTG  CTC GAG TCT GGG-3’

VH2f  5’-CAG GTG CAG CTA  CTC GAG TCG GG-3’

VH4f  5’-CAG GTG CAG CTG  CTC GAG TCG GG-3’

人免疫球蛋白重链(Gamma链)CH1区3’端引物：

CG1z  5’-GCA TGT  ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GGG-3’

(2)人免疫球蛋白Kappa链可变区5’端引物：

VK1a  5’-GAC ATC  GAG CTC ACC CAG TCT CCA-3’

VK2a  5’-GAA ATT  GAG CTC ACG CAG TCT CCA-3’

VK3a  5’-GAT ATT  GAG CTC ACT CAG TCT CCA-3’

人免疫球蛋白Kappa链恒定区3’端引物：

CK1z  5’-GCG CCG TCT AGA ACT AAC ACT  CTC CCC TGT TGA AGC

          TCT TTG TGA CGG GCG ATC TCA G-3’

(3)人免疫球蛋白Lambda链可变区5’端引物：

VL3  5’-TCT GTG GAG CTC CAG CCG CCC TCA GTG-3’

VL4  5’-TCT GAA GAG CTC CAG GAC CCT GTT GTG TCT GTG-3’

VL6  5’-CAG ACT GAG CTC ACT CAG GAG CCC-3’

人免疫球蛋白Lambda链恒定区5’端引物：

CLz  5’-CGC CGT CTA GAA CTA TGA ACA TTC TGT AGG-3’

PCR条件为85-99℃下0.5-2分钟，40-65℃(55℃、56℃、58℃、60℃)下0.5-2分钟，65--80℃ 1-4分钟，20-60个循环，65--80℃延伸51-20分钟。

利用基因工程DNA体外重组技术建立破伤风类毒素免疫噬菌体抗体库包括：将上述PCR产物分别经回收纯化后，将不同引物扩增的Kampa链及Lamda链PCR产物混合，经酶切并与同样酶切回收的噬菌粒pComb3经连接酶进行连接反应，连接产物通过转移的方法导入细菌，建立轻链基因库。将不同引物扩增的重链Fd PCR产物混合、酶切，并与含有轻链基因的噬粒进行连接反应，连接产物通过电转移的方法导入细菌，电转后加入培养基培养，再加入辅助噬菌体培养，收集上清，经后处理，得到噬菌体抗体库。

所述转移的方法优选采用电转移的方法。

其中：PCR产物分别经琼脂糖凝胶回收纯化，PCR扩增后，其DNA琼脂糖凝胶电泳分别在640bp和690bp处出现特异性条带。将不同引物扩增的产物混合后，用Xba I/Sac I酶切与同样酶切回收的噬菌粒pComb3经T4 DNA连接酶进行连接反应，连接产物通过电转移的方法导入XL1-Blue细菌，电转条件为：Bio-Red电转仪，0.2cm电转杯，2.5kv，建立轻链基因库。将不同引物扩增的重链Fd PCR产物混合用SpeI/Xho I酶切与含有轻链基因的噬粒进行连接反应，以同样方法电转入XL1-Blue细菌，电转后加入培养基培养一定时间后，加入带有氨苄青霉素和四环素抗性的培养液培养一定时间，加入辅助噬菌体VCSM13 37℃ 1小时，加卡那霉素37℃摇床过夜，收集上清，用PEG-8000和Nacl沉淀噬菌体上清，离心后用PBS重悬沉淀，再次离心得上清即为噬菌体抗体库。

噬菌体抗体库的特异性富积与筛包括：以固相化的破伤风外毒素为抗原对噬菌体抗体库进行3-8轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选，优选5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选。

所述吸附包括：将破伤风外毒素与噬菌体抗体库混合、孵育，使破伤风外毒素与噬菌体抗体库结合；所述洗脱为用洗涤液洗去与破伤风外毒素非特异性结合或结合力弱的噬菌体抗体、用洗脱液洗脱下与破伤风外毒素特异性结合的噬菌体抗体；所述扩增是将上述洗脱下来的破伤风外毒素特异性结合的噬菌体抗体，与辅助噬菌体VCSM13共同感染大肠杆菌进行扩增，并进行下一轮筛选。

吸附过程中，首先将破伤风外毒素稀释，并在孔板中包被，然后用牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(BSA-PBS)封闭，再加入上述噬菌体抗体库孵育。洗脱采用TBS-Tween20洗孔，洗涤强度逐轮增加。扩增过程中，采用甘氨酸-盐酸洗脱缓冲液洗脱下与外毒素结合的噬菌体抗体，并用Tris液中和，加入新鲜扩增的大肠杆菌株。如此“吸附-洗脱-扩增”反复3-8次，优选5次。

可溶性人抗破伤风类毒素IgG Fab抗体(TAT-Fab)表达产物的制备包括：经2-8轮筛选后扩增阳性克隆，提取噬菌粒用Spe I/Nhe I切除噬菌体外壳蛋白基因III(gIII)基因，经连接反应后电转入原核细胞如大肠杆菌、真核细胞如酵母菌等或哺乳动物细胞如CHO等中，挑取阳性克隆在培养液中生长，进一步用诱导剂IPTG诱导表达，离心后收集细菌沉淀，用PBS悬起沉淀，冻融后离心得上清液，即含有可溶性人抗破伤风类毒素IgG Fab(HTAT-Fab)抗体，该上清可以采用现有技术中公开的方法进一步纯化。

本发明的人抗破伤风类毒素IgG Fab抗体可以制备为适于预防或治疗疾病用途的各种剂型的药物。

本发明首次利用免疫噬菌体抗体库技术研制人源性HTAT-Fab，该产品不仅可克服马血清TAT作为异源蛋白应用于人体易引起的过敏反应，而且解决了人源HTIG血液来源困难、价格昂贵、存在外源病毒感染的危险。本发明研制的HTAT-Fab片段，具有组织穿透能力强、中和性高、亲和力高的特点，有利于中和毒素，这些特点是现有TAT和HTIG无法比拟的。另外与国外正在研究开发的，利用对鼠源性单克隆抗体的改造而制备的人源化TAT-Fab相比，彻底解决了鼠源性抗体对人体易引起过敏反应的问题，更适合用于破伤风的防治。

本发明的HTAT-Fab产品，不仅可消除马血清抗破伤风抗毒素(TAT)(异种蛋白)易引起的过敏反应，又可克服人破伤风免疫球蛋白(HTIG)生产的血源不足及潜在病毒，如爱滋病毒HIV、乙肝病毒HBV、丙肝病毒HCV、SARA病毒等污染的问题，市场前景看好。

本发明的制备方法中，首先采用提高人体抗破伤风类毒素抗体滴度的方法来获得高亲合力的HTAT-Fab，再利用免疫噬菌体抗体库技术得到人源性HTAT-Fab，本发明的制备方法简单、表达高。

下面结合附图和具体实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明，本发明而不是限制本发明。

附图说明

图1PCR扩增人IgG轻链基因的琼脂糖凝胶电泳图

图2PCR扩增人IgG Fab重链基因的琼脂糖凝胶电泳图

图3轻链基因库和噬菌体抗体库内切酶电泳鉴定图

图4Western Blot图

详细描述

本发明的人源性抗破伤风外毒素抗体(HTAT-Fab)，包括重链和/或轻链，其中重链见序列1，轻链见序列2。其制备方法为：首先根据1989年Orlandi等设计的人免疫球蛋白(Ig)通用引物及简并引物序列合成引物，以曾接种过破伤风疫苗的志愿者，用破伤风类毒素加强免疫，免疫后第6天，取志愿者的血液分离淋巴细胞，从淋巴细胞提取总的RNA，以总RNA为模板反转录成建库所需要的Ig全套可变区基因的cDNA，用人Ig特异性引物扩增所有免疫球蛋白轻链和重链Fd段基因；常规制备感受态的细菌(XL1-blue)，将经过纯化的轻链PCR产物用Xba I和Sac I限制性内切酶消化后进行电泳分离纯化，将载体(pComb3)用同样的酶消化后电泳分离纯化，将载体的轻链进行连接反应，连接完成后采用电穿孔的方法转入感受态细胞，构建轻链库；从轻链库抽提纯化后的轻链库质粒DNA和重链Fd段PCR产物用Xho I和Spe I酶消化后，按上述“轻链库的构建”程序中的方法进行连接和电穿孔，建立人IgFab抗体库，抽提含有IgFab的重组载体，与辅助病毒(VCSM13)共转染受体菌，建立噬菌体抗体库；HTAT-Fab在噬菌体膜表面表达之后，可用固相化的破伤风抗原对噬菌体抗体库进行吸附，洗去游离的噬菌体，将结合的噬菌体洗脱下来，再感染宿主菌进行扩增；经数轮“吸附-洗脱-扩增”之后可使特异性的噬菌体抗体得到富集，采用ELISA的方法进行测定，最后获得表达HTAT-Fab的噬菌体，提取质粒DNA，用Spe I和Nhe I消化后再进行连接，转化大肠杆菌，筛选噬菌体基因III片段切除的克隆，扩增阳性克隆，表达可溶性Fab片段；经过纯化得到可溶性HTAT-Fab。

用固相化抗原特异性吸附噬菌体；反复洗涤去除非特异性吸附的噬菌体，洗脱并收集与抗原结合的噬菌体，再次感染大肠杆菌，使特异性噬菌体得到扩增；经过3-8轮“吸附-洗脱-扩增”使表达HTAT-Fab的特异性的噬菌体富集；用ELISA鉴定洗脱噬菌体的特异亲和性，当大多数的克隆均呈阳性反应，结束筛选。

取表达HTAT-Fab的噬菌体，提取DNA，用Spe I和NheI消化后再进行连接；转化大肠杆菌，筛选噬菌体基因III片段切除的克隆；扩增阳性克隆，HTAT-Fab在大肠杆菌中进行表达，用SDS-PAGE和蛋白免疫印记法测定抗体的表达量、特异性和分子量；筛选高效表达菌株作为生产用菌株或称工程菌，HTAT-Fab片段在大肠杆菌的大量表达、纯化和鉴定。

本发明中，人免疫噬菌体抗体库(phage antibody library)技术是通过PCR将全套人抗体重链和轻链V区基因克隆出来，并在噬菌体表面表达、分泌，经筛选后获得特异性抗体。这一技术将表型(与抗原特异结合)和基因型(含有片段抗体基因)联系起来，使识别抗原的能力与进行再扩增的能力结合在一起，可以模拟生物体内B细胞的有关特性--识别与扩增的统一，因而是一种极为高效的表达、筛选抗体的体系。而且，该技术可制备全人源性抗体，避免了鼠源性抗体在人体应用时诱发的人抗鼠抗体的不良反应。

利用噬菌体抗体库技术制备人源性抗破伤风外毒素的基因工程抗体如HTAT-Fab，一方面解决了破伤风抗毒素的完全人源化(或称人源性)问题，可消除现用马血清TAT易引起过敏性休克和血清病等副作用及人源HTIG可能存在的肝炎和AIDS等病毒的污染问题，另一方面所生产的小分子抗体具有很强的中和性和组织穿透能力，易穿透血管或组织到达靶部位，有利于中和毒素。

具体实施方式

噬菌粒pComb3(4000bp)由美国Scripps研究所产品；XL1-Blue及辅助噬菌体VCSM13购于美国Stratagene公司；Trizol购于Gibco-BRL公司；PCR试剂盒、限制性内切酶、T4 DNA连接酶购于Promega公司；破伤风外毒素、标准人破伤风免疫球蛋白(TIG)购于中国药品生物制品检定所。羊抗人IgG Fab、诱导剂IPTG(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)、显色剂OPD(邻苯二胺)、3-吗啉丙磺酸(MOPS)均为Sigma公司产品。酵母菌及CHO购于Promega。

1.人IgG Fab段基因的PCR扩增：

用淋巴细胞分离液从经破伤风类毒素免疫6天的自愿者的抗凝血中分离淋巴细胞，用Trizol提取细胞总RNA，用PCR试剂盒内的Oligo-dT引物将提取的RNA通过逆转录酶试剂盒逆转录成cDNA，参照文献Kang AS，Burton DR，Jones TM，et al.Combinatorial immunoglobulin libraries in phageλ.Methods：Comp MethodsEnzymol，1991；2(2)：111-118和Marks JD，Hoogenboom HK，Bonnert TP，et al.By-passing immunization.Human antibodies from V-gene libraries displayedon phage.J Mol Biol，1991；222(3)：581-597用前述的一组人特异性IgG Kampa链、Lamda链及重链Gramma链引物对人轻链(VC+HC)和重链Fd(VH+CH1)基因进行PCR扩增，PCR条件为94℃ 1分钟，54℃(55℃、56℃、58℃、60℃)1分钟，72℃ 2分钟，35个循环，72℃延伸10分钟。

2.菌体抗体库的建立：

上述PCR产物分别经琼脂糖凝胶回收纯化(650-700bp)后，将不同引物扩增的Kampa链及Lamda链PCR产物混合，用Xba I/Sac I酶切与同样酶切回收的噬菌粒pComb3经T4 DNA连接酶进行连接反应，连接产物10μl通过电转移的方法导入200μl XL1-Blue细菌，电转条件为：Bio-Red电转仪，0.2cm电转杯，2.5kv，建立了轻链基因库。将不同引物扩增的重链Fd PCR产物混合用Spe I/Xho I酶切与含有轻链基因的噬粒进行连接反应，以同样方法电转入XL1-Blue细菌，电转后加入10mlSOC培养基，37℃ 1小时，加入10ml带有氨苄青霉素和四环素抗性的SB培养液，37℃ 1小时，加入80ml前述SB培养液，37℃ 2小时，加入辅助噬菌体VCSM13(1×10¹²pfu/ml)37℃ 1小时，加卡那霉素3.7℃摇床过夜，收集上清，用4％PEG-8000(聚乙二醇-8000)和3％Nacl沉淀噬菌体上清，离心后用0.02mol/L pH7.4PBS缓冲溶液重悬沉淀，再次离心得上清即为噬菌体抗体库。

其中的SOC培养基为：

蛋白胨                           20g

酵母提取物                       5g

氯化钠                           0.5g

1mol/L氯化钾                     2.5ml

制备方法：用水补足体积到1L。分成100ml的小份，高压灭菌。培养基冷却到室温后，再在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁，再加2ml灭菌的1mol/L葡萄糖(18g葡萄糖溶于足够水中，再用水补足到100ml，用0.22um的滤膜过滤除菌)。

SB培养液配方：每升培养液含细菌培养用胰化蛋白胨(Bactotryp-tone)30g、细菌培养用酵母提取物(Bacto-yeast extract)20g和MOPS(3-吗啉丙磺酸)10g，pH7.0。

上述两步中，取经破伤风类毒素免疫6天后的自愿者外周血，用ELISA检测其外周血清中抗破伤风毒素的抗体滴度，抗体滴度为0.5IU/ml，分别以TIG和PBS为阳性和空白对照。从外周血中分离淋巴细胞，提取细胞总RNA逆转录为cDNA，用6对轻链引物和6对重链Fd段引物进行PCR扩增，分别在640bp和690bp处出现特异性条带(图1，2)。轻链经酶切电转入XL1-Blue细菌，建立了轻链基因库(4700bp)。用Xho I/Xba I酶切将转入的轻链(640bp)和gIII基因(700bp)酶切下来，电泳在3000bp和1700bp处得到两条特异性带(图3)。重链Fd酶切电转入轻链基因库中，建立了噬菌体抗体基因库(5700bp)，库容为1×10⁶。用Xho I/Xba I酶切将转入的轻链(640bp)、重链Fd(690bp)和gIII基因(700bp)酶切下来，电泳在3000bp和2400bp处得到两条特异性带(图3)。

3.噬菌体抗体库的特异性富积与筛选：参照下述文献操作：Griffiths AD，Duncan AR.Strategies for selection of antibodies by phage display[J].CurrOpin Biotechnol，1998；9(1)：102-108，和Barbas C III，Kang AS，Lenner RA，etal.Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces：the geneIII site.Proc Natl Acad Sci USA，1991；89：10164-10168，以及Barbas C III，Lenner RA，Combinatorial immunogolobulin libraries on the surface ofphage(phabs)：rapid selection of antigen specific Fabs.Methods：CompMethods Enzymol，1991；2(2)：119-124。用碳酸氢盐缓冲液(pH8.6)稀释纯化的破伤风外毒素至4μg/ml，取25μl加入到96孔板(0.1μg/孔)4℃包被过夜，用3％BSA-PBS(牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(PBS))封闭1小时，加入上述噬菌体抗体库(100μg/孔)，37℃孵育2小时，用TBS-Tween20(吐温)洗孔洗去非特异性结合或结合力弱的噬菌体抗体(第一轮筛选洗1遍，第二轮筛选洗5遍，第三轮以上筛选洗10遍)，每孔用50μl pH2.2的甘氨酸-盐酸洗脱缓冲液洗脱下与外毒素结合的噬菌体抗体，并用3μl pH9.6的2M Tris缓冲液中和，加入2ml新鲜扩增的OD600为1.0左右的XL1-Blue菌，经辅助噬菌体VCSM13感染后进行下一轮筛，如此“吸附-洗脱-扩增”反复3-8次，优选5次。

其中TBS组成及配制方法为：

Tris-HCI缓冲液(0.5M pH7.6)  100ml

NaCI                        8.5-9g(0.15mol/L)

双蒸水                       加至1000ml

TBS配制方法：先以少量双蒸水溶解NaCl，再加入Tris-HCl缓冲液，最后加双蒸水至1000ml，充分摇匀。

其中的0.5 M pH7.6的Tris缓冲液组成及配制方法为：

Tris(三羟甲基氨基甲烷)      60.57g

1N HCl                    约420ml

双蒸水                      加至1000ml

Tris缓冲液配制方法：先以少量双蒸水(300-500ml)溶解Tris，加入HCl后，用HCl(1N)或NaOH(1N)将pH调至7.6，最后双蒸水加至1000ml。此液为储备液，4℃冰箱中保存。

以固相化的破伤风外毒素为抗原对噬菌体抗体库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选，计算每一轮产率(yield％)见表1，虽然洗涤强度逐轮增加的，但洗脱下的特异性噬菌体抗体滴度明显增加，产率也增加，特异性噬菌体抗体得到了富积，经5轮筛选后富积的滴度为1.3×10⁷pfu/ml。

              表1亲和吸附筛选对噬菌体抗体的富集效应

筛选轮数    筛选前的噬菌体量    筛选后的噬菌体量        产率(％)

            (PFU)               (PFU)

1           1.69×10¹¹         1.0×10³               5.0×10^-7

2           1.0×10¹²          7.0×10⁶               7.0×10^-4

3           3.7×10¹²          4.0×10⁶               1.1×10^-5

4           3.0×10¹²          1.0×10⁶               3.3×10^-5

5           4.0×10¹²          1.3×10⁶               3.25×10^-5

产率(％)＝筛选后的噬菌体量/筛选前的噬菌体量×100％

4.可溶性人抗破伤风类毒素IgG Fab抗体(TAT-Fab)表达产物的制备：

(1)在大肠杆菌中表达：经3-8轮筛选，优选5轮筛选后扩增阳性克隆，提取噬菌粒用Spe I/Nhe I切除噬菌体外壳蛋白基因III(gIII)基因，经连接反应后电转入XL1-Blue细菌，挑取阳性克隆在含有2mM Mgcl₂和氨苄青霉素抗性的SB培养液中生长，当其OD600为0.2-0.3加入1mmol/诱导剂IPTG诱导表达10-12小时，离心后收集细菌沉淀，用0.02mol/L pH7.4 PBS悬起沉淀反复冻融4-5次离心得上清，即含有可溶性人抗破伤风类毒素IgG Fab抗体。或者；

(2)在酵母菌中表达：参考现有技术中公开的方法，将经3-8轮筛选，优选5轮筛选后扩增阳性克隆也在酵母菌如毕赤酵母菌株、甲醇营养型酵母GS115中表达。或者；

(3)在CHO中表达：经3-8轮筛选，优选5轮筛选后扩增阳性克隆也可以在哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中进行表达。

5.用ELISA法检测抗体的特异性和水平：

用纯化的破伤风毒素4℃过夜包被96孔板(0.1μg/孔)，3％BSA-PBS封闭非特异性位点1小时，加入不同稀释浓度的上述制备的人HTAT-Fab抗体，以TIG为阳性对照，空载体XL1-Blue裂解液为阴性对照和PBS为空白对照。37℃孵育2小时，加入HRP标记的羊抗人IgG Fab抗体，37℃孵育1小时，加显色剂OPD，避光孵育30分钟，加入2M硫酸终止反应，在490nm处检测吸光值。

6.SDS-PAGE和Western Blot：

将制备的含有人IgG Fab抗体的上清在还原条件下进行SDS-PAGE电泳，之后通过电转法转移到硝酸纤维素膜上，用3％BSA封闭非特异性位点，洗膜后加入HRP标记的羊抗人IgG Fab抗体，以DAB进行显色反应。

随机挑选经5轮筛选之后的菌落(空斑)20个，用ELISA测定其与破伤风外毒素结合的活性，以TIG、空菌裂解液和PBS分别作阳性、阴性和空白对照。在490nm处的吸光值最高的为1.68，对其轻链和重链Fd进行DNA测序，通过GenBank检索验证，轻链为κ型，重链Fd为γ3。

可溶性Fab的表达与鉴定：将上述阳性克隆扩增提取质粒，Spe I/Nhe I酶切连接反应后电转入XL1-Blue变Fd-gIII融合表达蛋白为独立表达蛋白。ELISA鉴定该阳性克隆的特异性。分别用0.1μg/孔、0.25μg/孔0.5μg/孔0.75μg/孔1.0μg/孔破伤风外毒素包被ELISA板，加不同稀释度的TIG，确定最佳包板的破伤风毒素的浓度为0.1μg/孔。破伤风外毒素用该浓度包板后加入阳性克隆扩增裂解液，分别以TIG、空菌裂解液和PBS作阳性、阴性和空白对照，测定其OD490的值，相当于0.03-0.07IU/ml，见表2。证明该阳性克隆所表达的可溶性Fab可与破伤风外毒素特异性结合。该阳性克隆扩增后收集菌体裂解液在还原条件下作SDS-PAGE和Western Blot，见图4，其中1为轻链基因库酶切鉴定；2为噬菌体抗体基因库酶切鉴定，图中25KD处显示有特异性条带。

             表2TAT-Fab的表达水平(ELISA检测结果)

                                     OD490值

TIG             1.88       1.74       1.24      0.72      0.60       0.22        0.02

(μg/ml)        (0.60)     (0.30)     (0.15)    (0.07)    (0.03)     (0.01)      (0.005)

TAT-Fab         0.87       0.85       0.70      0.70      0.62       0.61        0.57

(稀释度)        (原液)     (原液)     (1∶5)    (1∶5)    (1∶10)    (1∶10)     (1∶15)

空菌裂解液对照  0.01

PBS空白对照     0.00

根据用于构建抗体库的抗体基因的不同来源和不同的构建目的，噬菌体抗体库可分为免疫，天然(非免疫)，合成抗体库或初级，次级抗体库。免疫抗体库由从被抗原免疫过的或有免疫史的动物的脾脏B细胞中扩增得到的V区基因构建而成。与杂交瘤技术相比，免疫抗体库的优点在于能更快速地筛选抗原特异性的抗体，甚至所得的抗体的亲和力比单克隆抗体还高。

本发明所建立的是免疫噬菌体抗体库。自愿者于7天前注射破伤风类毒素，测定其抗体滴度，分离含高滴度破伤风抗毒素的人IgG抗体基因库的淋巴细胞，为建立可筛选出特异性抗体的抗体基因库奠定了基础。经免疫后体内目的抗体基因mRNA丰度较高，有利于采用RT-PCR法扩增出多对轻链和重链Fd基因，筛选出高特异性与破伤风外毒素结合的抗体。

特异性抗体的筛选方法的合理应用影响着是否能得到所要求的噬菌体抗体。本发明采用固相化抗原免疫吸附筛选法。将抗原包被到96孔板上达到固相化用来吸附噬菌体抗体库中的特异性抗体。筛选操作简便易行，以3-8轮的富集后可获得较高的特异性阳性克隆比例。在筛选过程中，噬菌体抗体的产率逐渐升高是特异性抗体富集的表现，可作为判断筛选效果的指标；在筛选过程中，洗涤次数也影响着是否可获得高特异性抗体。第1、2轮筛选分别洗涤1次和5次，可将非特异性噬菌体和辅助噬菌体洗去，第3轮以上洗涤10次，可将一些结合力低的噬菌体抗体洗涤下来，得到高结合力的噬菌体抗体。

经5轮“吸附-洗脱-扩增”的淘筛，带有特异性抗体的噬菌体得到富集，采用间接ELISA法，选OD490值较高的阳性克隆经Spe I/Nhe I酶切，去除载体上的噬菌体外壳gIII基因，使重链Fd的表达为独立蛋白的表达。轻链和重链Fd基因表达产物在pelB产物的引导下，进入细菌质周腔中，在此装配成Fab抗体，即为特异性的抗破伤风毒素Fab抗体。同时采用间接ELISA法检测该可溶性人Fab抗体具有较高的与抗原结合活性和特异性。并对其基因序列进行测序，得到序列1、2，与GenBank检索证实，该克隆与已发表的抗破伤风类毒素抗体序列有高度的同源性。

本发明通过先给小鼠注射HTAT-Fab，再注射破伤风外毒素检测了HTAT-Fab对破伤风外毒素的中和作用，表明本发明的HTAT-Fab具有很强的中和破伤风外毒素的作用。

运用噬菌体表面表达技术直接获得基因工程单克隆抗体，耗时短，费用低，可获得任意目的抗体和高亲和力特异性抗体。用此方法制备的人抗破伤风毒素抗体可避免异种血清蛋白引起的过敏反应，又可克服人源免疫球蛋白生产的血源不足及存在病原体污染等问题，在临床上的应用奠定了基础。

Claims (10)

1.一种人源性抗破伤风外毒素抗体(HTAT-Fab)，包括重链Fd段和/或轻链，其中重链Fd段的基因序列为(序列1)：

5′gagtctg ggggagactt ggtacagcct ggggggtccc tgagactctc ctgtacagcc

tctggattct cctttggcaa ctatggcctg agctgggtcc gccaggctcc agggaagggg

ctggagtggg tctcagttat cagtggtagc gctggtgcca catactacgc agactccgtg

aagggccggt tcaccatctc cagagacaat tccaagaata ccctgtttct ccaaatgaac

aacttgagag ccgacgacac ggccatttat tactgtgcga aagggggaaa gcagtggctg

ataccctggt tcgacccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc

aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg

gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca

ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac

tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc

aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt

gacaaaact

轻链的基因序列为(序列2)：

5′   accc agtctccgtc ctccgtgtct gcatctccag gagacagagc caccctctct

tgtcgggcga gtcaggatat tagcaactac tacgcctggt atcagcagaa accagggcag

gctcccaagg tcctgatcta tggtgcatcc agtttgcaaa gtggggtccc atcaaggttc

agcgggagtg gatctgggac atatttcact ctgactatca acagcctgca gcctgatgat

tttgcaactt actattgtca acagacttac agtttcccgc tcactttcgg cggagggacc

aaggtggaga tgaaacgaac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat

gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga

gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt

gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc

aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagt

tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgttag。

2.权利要求1所述的人源性抗破伤风外毒素抗体的制备方法，包括如下步骤：

1)构建人破伤风类毒素免疫噬菌体抗体库；

2)筛选、富集人源性抗破伤风外毒素抗体(HTAT-Fab)的噬菌体抗体；

3)在原核细胞、真核细胞或哺乳动物细胞中表达可溶性HTAT-Fab；

4)纯化获得高纯度的HTAT-Fab。

3.根据权利要求2所述的人源性抗破伤风外毒素抗体的制备方法，其中所述构建人破伤风类毒素免疫噬菌体抗体库包括人IgG Fab段基因的PCR扩增，和利用基因工程DNA体外重组技术建立破伤风类毒素免疫噬菌体抗体库；所述筛选、富集人源性抗破伤风外毒素抗体(HTAT-Fab)的噬菌体抗体包括通过固相化抗原免疫吸附筛选法，筛选出人抗破伤风外毒素的噬菌体抗体；所述在原核细胞、真核细胞等或哺乳动物细胞等中表达HTAT-Fab，包括切去噬菌体外壳蛋白基因III(gIII)，经连接反应后转入原核细胞、真核细胞或哺乳动物细胞等中表达人抗破伤风类毒素的Fab段；所述纯化包括收集细菌沉淀，反复冻融后离心得上清，上清液中即含有HTAT-Fab。

4.根据权利要求1或2所述的人源性抗破伤风外毒素抗体的制备方法，其中人IgG Fab段基因的PCR扩增包括：用淋巴细胞分离液从经破伤风类毒素免疫数天的自愿者的抗凝血中分离淋巴细胞，提取细胞总RNA，用引物将提取的RNA通过逆转录酶试剂盒逆转录成cDNA，用一组人特异性IgG Kampa链、Lamda链及重链Gramma链引物对人轻链(VC+HC)和重链Fd(VH+CH1)基因进行PCR扩增，得到PCR产物。

5.根据权利要求3所述的人源性抗破伤风外毒素抗体的制备方法，其中利用基因工程DNA体外重组技术建立破伤风类毒素免疫噬菌体抗体库包括：将PCR产物分别经回收纯化后，将不同引物扩增的Kampa链及Lamda链PCR产物混合，经酶切并与同样酶切回收的噬菌粒pComb3经连接酶进行连接反应，连接产物通过转移导入细菌，建立轻链基因库；将不同引物扩增的重链Fd PCR产物混合、酶切，并与含有轻链基因的噬粒进行连接反应，连接产物通过电转移的方法导入细菌，电转后加入培养基培养，再加入辅助噬菌体培养，收集上清，经后处理，得到噬菌体抗体库。

6.根据权利要求3所述的人源性抗破伤风外毒素抗体的制备方法，其中以固相化的破伤风外毒素为抗原对噬菌体抗体库进行3-8轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选，优选5轮筛选。

7.根据权利要求6所述的人源性抗破伤风外毒素抗体的制备方法，其中所述吸附包括：将破伤风外毒素与噬菌体抗体库混合、孵育，使破伤风外毒素与噬菌体抗体库结合；所述洗脱为用洗涤液洗去与破伤风外毒素非特异性结合或结合力弱的噬菌体抗体、并用洗脱液洗脱下与破伤风外毒素特异性结合的噬菌体抗体；所述扩增是将上述洗脱下来的与破伤风外毒素特异性结合的噬菌体抗体，与辅助噬菌体VCSM13共同感染大肠杆菌进行扩增，并进行下一轮筛选。

8.根据权利要求1或2所述的人源性抗破伤风外毒素抗体的制备方法，其中可溶性人抗破伤风类毒素IgG Fab抗体表达产物的制备包括：经3-8轮筛选后扩增阳性克隆，提取噬菌粒用SpeI/NheI切除噬菌体外壳蛋白基因III(gIII)基因，经连接反应后电转入原核细胞、真核细胞或哺乳动物细胞等，挑取阳性克隆在培养液中生长，进一步用诱导剂IPTG诱导表达，离心后收集细菌沉淀，用PBS悬起沉淀，冻融后离心得上清液，即含有可溶性人抗破伤风类毒素抗体。

9.根据权利要求5所述的人源性抗破伤风外毒素抗体的制备方法，其中PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳分别在640bp和690bp处出现特异性条带。

10.权利要求1所述的人源性抗破伤风外毒素抗体在制备治疗和预防破伤风疾病药物上的用途。

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