JP2003277294A - 造血幹細胞の末梢化 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、造血幹細胞を含む、ＣＤ３４＋細
胞を末梢化するための方法を提供する。第一の局面で
は、その方法は、ＣＤ３４＋細胞表面のＶＬＡ−４抗原
の阻止因子を投与する工程を包含する。第二の局面で
は、その方法は、ＣＤ３４＋細胞表面のＶＬＡ−４抗原
の阻止因子を投与すること、および、インビボにおいて
ＣＤ３４＋細胞増殖の刺激因子を投与することを包含す
る。本発明の方法は、癌治療あるいはＡＩＤＳ治療、お
よび遺伝子療法に有用である。 【解決手段】 ＣＤ３４＋細胞を末梢化するための組成
物であって、ＶＣＡＭ−１またはフィブロネクチンに対
するＣＤ３４＋細胞表面のＶＬＡ−４抗原の結合を阻止
する因子を含む、組成物。
胞を末梢化するための方法を提供する。第一の局面で
は、その方法は、ＣＤ３４＋細胞表面のＶＬＡ−４抗原
の阻止因子を投与する工程を包含する。第二の局面で
は、その方法は、ＣＤ３４＋細胞表面のＶＬＡ−４抗原
の阻止因子を投与すること、および、インビボにおいて
ＣＤ３４＋細胞増殖の刺激因子を投与することを包含す
る。本発明の方法は、癌治療あるいはＡＩＤＳ治療、お
よび遺伝子療法に有用である。 【解決手段】 ＣＤ３４＋細胞を末梢化するための組成
物であって、ＶＣＡＭ−１またはフィブロネクチンに対
するＣＤ３４＋細胞表面のＶＬＡ−４抗原の結合を阻止
する因子を含む、組成物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】発明の分野
本発明は、造血幹細胞の操作に関する。より詳細には、
本発明は、末梢血中の造血幹細胞数を増加させるための
方法に関する。
本発明は、末梢血中の造血幹細胞数を増加させるための
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】発明の背景
造血幹細胞は、血液中で細胞のリンパ球系、骨髄系、お
よび赤血球系の系統を生じる原始的な方向づけられてい
ない前駆細胞(primitive, uncommitted progenitor cel
ls)である。幹細胞群は、骨髄中の全細胞のごくわずか
の割合を構成し、末梢血ではさらに少量の割合で存在す
る。
よび赤血球系の系統を生じる原始的な方向づけられてい
ない前駆細胞(primitive, uncommitted progenitor cel
ls)である。幹細胞群は、骨髄中の全細胞のごくわずか
の割合を構成し、末梢血ではさらに少量の割合で存在す
る。
【０００３】幹細胞は一般的に、その表面抗原決定基に
より特徴づけられる。Tsukamotoらの米国特許第5,061,6
20号(1991)には、幹細胞高濃縮細胞組成は、CD34+、CD1
0-、CD19-、およびCD33-であることが教示されている。
Leonら、Blood77:1218-1227(1991)には、CD34+細胞の約
1%、あるいは全骨髄細胞群の約0.01%は、CD33（骨髄系
統）、CD71（赤血球系統）、あるいはCD10およびCD5（B
およびTリンパ球系統）のような分化抗原を発現しない
こと、ならびに、成熟中のCD34発現の発現減少は、分化
抗原の発現増大に関連することが、教示されている。
より特徴づけられる。Tsukamotoらの米国特許第5,061,6
20号(1991)には、幹細胞高濃縮細胞組成は、CD34+、CD1
0-、CD19-、およびCD33-であることが教示されている。
Leonら、Blood77:1218-1227(1991)には、CD34+細胞の約
1%、あるいは全骨髄細胞群の約0.01%は、CD33（骨髄系
統）、CD71（赤血球系統）、あるいはCD10およびCD5（B
およびTリンパ球系統）のような分化抗原を発現しない
こと、ならびに、成熟中のCD34発現の発現減少は、分化
抗原の発現増大に関連することが、教示されている。
【０００４】抗原特性と機能特性との組合せもまた、幹
細胞を特徴づけるために使用された。Sutherlandら、Pr
oc.Natl. Acad. Sci. USA 87:3584-3588 (1990)には、
原始幹細胞は、ダイズアグルチニンに結合せず、高レベ
ルのCD34を発現し、高平板効率で芽細胞コロニーを形成
し、長期培養初期細胞（LTC-IC）に富むことが、教示さ
れている。Craigら、BloodReviews 6:59-67 (1992)に
は、CFU-GMアッセイは、骨髄あるいは末梢血の幹細胞採
取物の造血前駆細胞生存性について最も広く使用される
測定法であり、CD34+パーセントによく相関することが
教示されている。Spangrude、ImmunologyToday 10:344-
350 (1989)には、幹細胞が、その他の骨髄細胞型に比較
して、ローダミン123を低レベルに蓄積することが教示
されている。Chaudhauryら、Cell66:85-94 (1991)に
は、幹細胞が、その他の骨髄細胞型に比較して、高レベ
ルのP-糖タンパク質を発現することが教示されている。
細胞を特徴づけるために使用された。Sutherlandら、Pr
oc.Natl. Acad. Sci. USA 87:3584-3588 (1990)には、
原始幹細胞は、ダイズアグルチニンに結合せず、高レベ
ルのCD34を発現し、高平板効率で芽細胞コロニーを形成
し、長期培養初期細胞（LTC-IC）に富むことが、教示さ
れている。Craigら、BloodReviews 6:59-67 (1992)に
は、CFU-GMアッセイは、骨髄あるいは末梢血の幹細胞採
取物の造血前駆細胞生存性について最も広く使用される
測定法であり、CD34+パーセントによく相関することが
教示されている。Spangrude、ImmunologyToday 10:344-
350 (1989)には、幹細胞が、その他の骨髄細胞型に比較
して、ローダミン123を低レベルに蓄積することが教示
されている。Chaudhauryら、Cell66:85-94 (1991)に
は、幹細胞が、その他の骨髄細胞型に比較して、高レベ
ルのP-糖タンパク質を発現することが教示されている。
【０００５】造血幹細胞操作の能力は、癌治療のための
有効な化学療法アプローチおよび放射線療法アプローチ
にますます重要になってきた。化学療法および放射線療
法に対する最近のアプローチは、骨髄移植（BMT）を利
用する。BMTは、幹細胞、前駆細胞、およびより成熟し
た血液細胞を含有する生骨盤骨髄を１〜２リットル取り
出すこと、癌細胞を殺すために化学療法あるいは放射線
療法により患者を治療すること、および、骨髄細胞を静
脈に再導入することを包含する。しかし、BTMには多く
の不利益がある。BMTのためのBM採取には全身麻酔法が
必要であり、このため危険性および経費の両方が増大す
る。さらに、癌細胞が骨髄中に存在し、厳密に取り除か
れない場合には、疾患の再発は明瞭な危険性である。ま
た、癌細胞による骨髄の広範囲におよぶ侵入（骨髄腫、
ワルデンストレームマクログロブリン血症）が存在する
場合には、末梢血細胞が、自家移植（ABMT）での使用の
ために、唯一選択できるものである。結局、骨盤照射を
受けた患者は、ABMTの候補者ではない。
有効な化学療法アプローチおよび放射線療法アプローチ
にますます重要になってきた。化学療法および放射線療
法に対する最近のアプローチは、骨髄移植（BMT）を利
用する。BMTは、幹細胞、前駆細胞、およびより成熟し
た血液細胞を含有する生骨盤骨髄を１〜２リットル取り
出すこと、癌細胞を殺すために化学療法あるいは放射線
療法により患者を治療すること、および、骨髄細胞を静
脈に再導入することを包含する。しかし、BTMには多く
の不利益がある。BMTのためのBM採取には全身麻酔法が
必要であり、このため危険性および経費の両方が増大す
る。さらに、癌細胞が骨髄中に存在し、厳密に取り除か
れない場合には、疾患の再発は明瞭な危険性である。ま
た、癌細胞による骨髄の広範囲におよぶ侵入（骨髄腫、
ワルデンストレームマクログロブリン血症）が存在する
場合には、末梢血細胞が、自家移植（ABMT）での使用の
ために、唯一選択できるものである。結局、骨盤照射を
受けた患者は、ABMTの候補者ではない。
【０００６】これらの困難の結果として、化学療法を受
けている患者に幹細胞を自家供給するための、末梢血か
ら幹細胞を得る方法を提供するのに多大の興味が引き出
された。末梢血由来の幹細胞の自家供給は、化学療法あ
るいは放射線療法の多量投与使用をなすが、BMTより危
険性が少ない。さらに、末梢血由来の幹細胞の使用は、
幹細胞を得るための麻酔を必要としない。また、Lowr
y、Exp. Hematol.20:937-942 (1992)は、骨髄中の癌細
胞は末梢化しない傾向があることを教示している。しか
し、このような方法の重大な限界は、幹細胞は末梢血中
に通常はごく少量にしか存在しないことである。Lobo
ら、BoneMarrow Trasplantation 8:389-392(1991)は、
いかなる末梢化方法も行わずに集められた末梢血幹細胞
を加えても、骨髄除去（myeloablative)治療後の骨髄回
復を早めないことを教示している。これとは逆に、Haas
ら、Exp.Hematol. 18:94-98 (1990)では、組換えヒト顆
粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）で動員
された末梢血幹細胞の自家移植の成功が実証されてい
る。従って、末梢化法によって末梢血中の幹細胞数を増
加させることは、自家幹細胞移植源として末梢血を利用
する方法の成功にとって重要である。その他のサイトカ
インが、これに関して有用であり得る。RoweおよびRapo
port,J. Clin. Pharmacol. 32:486-501 (1992)には、GM
-CSFに加えて、マクロファージコロニー刺激因子（M-CS
F）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、エリトロポエ
チン、インターロイキン-1、-2、-3、-4および-6、なら
びに、種々のインターフェロンおよび腫瘍壊死因子を含
む、その他のサイトカインは、多大の可能性を有するこ
とが示唆されている。
けている患者に幹細胞を自家供給するための、末梢血か
ら幹細胞を得る方法を提供するのに多大の興味が引き出
された。末梢血由来の幹細胞の自家供給は、化学療法あ
るいは放射線療法の多量投与使用をなすが、BMTより危
険性が少ない。さらに、末梢血由来の幹細胞の使用は、
幹細胞を得るための麻酔を必要としない。また、Lowr
y、Exp. Hematol.20:937-942 (1992)は、骨髄中の癌細
胞は末梢化しない傾向があることを教示している。しか
し、このような方法の重大な限界は、幹細胞は末梢血中
に通常はごく少量にしか存在しないことである。Lobo
ら、BoneMarrow Trasplantation 8:389-392(1991)は、
いかなる末梢化方法も行わずに集められた末梢血幹細胞
を加えても、骨髄除去（myeloablative)治療後の骨髄回
復を早めないことを教示している。これとは逆に、Haas
ら、Exp.Hematol. 18:94-98 (1990)では、組換えヒト顆
粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）で動員
された末梢血幹細胞の自家移植の成功が実証されてい
る。従って、末梢化法によって末梢血中の幹細胞数を増
加させることは、自家幹細胞移植源として末梢血を利用
する方法の成功にとって重要である。その他のサイトカ
インが、これに関して有用であり得る。RoweおよびRapo
port,J. Clin. Pharmacol. 32:486-501 (1992)には、GM
-CSFに加えて、マクロファージコロニー刺激因子（M-CS
F）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、エリトロポエ
チン、インターロイキン-1、-2、-3、-4および-6、なら
びに、種々のインターフェロンおよび腫瘍壊死因子を含
む、その他のサイトカインは、多大の可能性を有するこ
とが示唆されている。
【０００７】自家移植のためのその他のアプローチは、
免疫アフィニティー法による末梢血からの幹細胞の精製
である。これらの方法は、化学療法を組み合わせた自家
幹細胞移植のみならず、遺伝子治療にもまた有望であ
り、ここでは、精製幹細胞は、欠陥遺伝子機能を修正す
るための遺伝子操作に必要であり、次に、失われた機能
を供給するために患者に再導入される。しかし、Edging
ton、Biotechnology 10:1099-1106 (1992)には、最近の
方法には、末梢化を行わずに、十分な細胞を処置するた
めに３回別々の４時間の期間が必要とされることが教示
されている。DePalma、GeneticEngineering News、Vol.
12、1992年５月１日には、これが、末梢化のためのG-CS
Fでの処置によって改良され得ることが教示されてい
る。
免疫アフィニティー法による末梢血からの幹細胞の精製
である。これらの方法は、化学療法を組み合わせた自家
幹細胞移植のみならず、遺伝子治療にもまた有望であ
り、ここでは、精製幹細胞は、欠陥遺伝子機能を修正す
るための遺伝子操作に必要であり、次に、失われた機能
を供給するために患者に再導入される。しかし、Edging
ton、Biotechnology 10:1099-1106 (1992)には、最近の
方法には、末梢化を行わずに、十分な細胞を処置するた
めに３回別々の４時間の期間が必要とされることが教示
されている。DePalma、GeneticEngineering News、Vol.
12、1992年５月１日には、これが、末梢化のためのG-CS
Fでの処置によって改良され得ることが教示されてい
る。
【０００８】これらの研究は、造血幹細胞の末梢化を達
成するための新規な方法を開発することの重要性を明白
にする。１つの可能性は、骨髄環境から末梢に幹細胞を
放出する新規な方法を究明することである。残念なこと
に、インビボでの骨髄環境中の造血幹細胞を維持する分
子相互作用型については知られていない。最近、いくつ
かのインビトロ研究は、幹細胞と骨髄間質細胞との間の
結合におけるインテグリン、フィブロネクチン、および
その他の表面抗原の重要な役割に注目し始めた。
成するための新規な方法を開発することの重要性を明白
にする。１つの可能性は、骨髄環境から末梢に幹細胞を
放出する新規な方法を究明することである。残念なこと
に、インビボでの骨髄環境中の造血幹細胞を維持する分
子相互作用型については知られていない。最近、いくつ
かのインビトロ研究は、幹細胞と骨髄間質細胞との間の
結合におけるインテグリン、フィブロネクチン、および
その他の表面抗原の重要な役割に注目し始めた。
【０００９】インテグリンは、細胞間の相互作用、細胞
と細胞外マトリックスと間の相互作用、および、胚発育
およびT-細胞応答の制御に関連する相互作用を仲介す
る、16を超えるヘテロダイマーメンバーを有する膜内在
性糖タンパク質の大きなファミリーである。インテグリ
ン中、VLA-5（α5β1）複合体は広く分布し、フィブロ
ネクチンに対するレセプターとして機能する。VLA-4
（α4β1）複合体は、正常末梢血B細胞およびT細胞、胸
腺細胞、単球、および、ある種の黒色腫細胞、ならび
に、骨髄芽細胞および赤芽球上で相当なレベルで発現さ
れる。VLA-4のリガンドは、血管細胞付着分子-1（VCAM-
1）およびCS-1、フィブロネクチンのHepII領域内で代替
的にスプライシングされたドメインである。インテグリ
ンの別のグループ（CDIIa/CD18、CDIIb/CD18、およびCD
IIc/CD18）は、共通β2鎖を共有し、末梢T細胞、単球、
および成熟顆粒球上で可変的に発現される。β2-インテ
グリンのリガンドは、活性化内皮細胞に認められるIgス
ーパーファミリーのメンバー（ICAM-1およびICAM-2）を
含む。
と細胞外マトリックスと間の相互作用、および、胚発育
およびT-細胞応答の制御に関連する相互作用を仲介す
る、16を超えるヘテロダイマーメンバーを有する膜内在
性糖タンパク質の大きなファミリーである。インテグリ
ン中、VLA-5（α5β1）複合体は広く分布し、フィブロ
ネクチンに対するレセプターとして機能する。VLA-4
（α4β1）複合体は、正常末梢血B細胞およびT細胞、胸
腺細胞、単球、および、ある種の黒色腫細胞、ならび
に、骨髄芽細胞および赤芽球上で相当なレベルで発現さ
れる。VLA-4のリガンドは、血管細胞付着分子-1（VCAM-
1）およびCS-1、フィブロネクチンのHepII領域内で代替
的にスプライシングされたドメインである。インテグリ
ンの別のグループ（CDIIa/CD18、CDIIb/CD18、およびCD
IIc/CD18）は、共通β2鎖を共有し、末梢T細胞、単球、
および成熟顆粒球上で可変的に発現される。β2-インテ
グリンのリガンドは、活性化内皮細胞に認められるIgス
ーパーファミリーのメンバー（ICAM-1およびICAM-2）を
含む。
【００１０】Teixidoら、J. Clin. Invest. 90:358-367
(1992)では、インビトロモデルにおいて、VLA-4/VCAM-
1、VLA-5/フィブロネクチン、およびβ2-インテグリン/
ICAM-1間の相互作用が全て、骨髄間質細胞と、CD34を高
レベルで発現する細胞との付着に重要であることが教示
されている。Simmonsら、Blood80:388-395 (1992)に
は、インビトロモデルにおいて、間質細胞とCD34+細胞
との付着は、主にVLA-4/VCAM-1相互作用に依存し、VLA-
4あるいはVCAM-1のいずれかに対するモノクローナル抗
体でかなり制御されるが、フィブロネクチンは結合にあ
まり役割をなさないことが教示されている。Williams
ら、Nature352:438-441 (1991)には、インビボにおける
マウス研究によって、ネズミ造血幹細胞の間質細胞細胞
外マトリックス（ECM）への付着が、IIICSドメインの代
替スプライス領域を含むフィブロネクチンのタンパク質
分解フラグメントにより、ある程度は促進されることが
教示され、その相互作用がVLA-4によって仲介されるよ
うであることを示唆している。これらの全ての研究は、
幹細胞とそれらの微小環境との付着を阻むために抗体を
利用した。しかし、付着が起こった後に、このような相
互作用が可逆的か、あるいは混乱されるかは分析されて
いない。これらの結果は、骨髄環境と造血幹細胞との間
のどのような相互作用がインビボ環境内に幹細胞を維持
する原因となるのか、そして、このような相互作用が幹
細胞の末梢化の達成を混乱させるかどうかを決定するた
めにさらなる研究の必要性を示す。
(1992)では、インビトロモデルにおいて、VLA-4/VCAM-
1、VLA-5/フィブロネクチン、およびβ2-インテグリン/
ICAM-1間の相互作用が全て、骨髄間質細胞と、CD34を高
レベルで発現する細胞との付着に重要であることが教示
されている。Simmonsら、Blood80:388-395 (1992)に
は、インビトロモデルにおいて、間質細胞とCD34+細胞
との付着は、主にVLA-4/VCAM-1相互作用に依存し、VLA-
4あるいはVCAM-1のいずれかに対するモノクローナル抗
体でかなり制御されるが、フィブロネクチンは結合にあ
まり役割をなさないことが教示されている。Williams
ら、Nature352:438-441 (1991)には、インビボにおける
マウス研究によって、ネズミ造血幹細胞の間質細胞細胞
外マトリックス（ECM）への付着が、IIICSドメインの代
替スプライス領域を含むフィブロネクチンのタンパク質
分解フラグメントにより、ある程度は促進されることが
教示され、その相互作用がVLA-4によって仲介されるよ
うであることを示唆している。これらの全ての研究は、
幹細胞とそれらの微小環境との付着を阻むために抗体を
利用した。しかし、付着が起こった後に、このような相
互作用が可逆的か、あるいは混乱されるかは分析されて
いない。これらの結果は、骨髄環境と造血幹細胞との間
のどのような相互作用がインビボ環境内に幹細胞を維持
する原因となるのか、そして、このような相互作用が幹
細胞の末梢化の達成を混乱させるかどうかを決定するた
めにさらなる研究の必要性を示す。
【００１１】従って、末梢化および帰巣(homing)のプロ
セスを理解するための科学研究目的と、癌治療あるいは
遺伝子治療行程における自家幹細胞移植のための末梢化
のより良い方法の開発との両方のために、幹細胞末梢化
の新規な方法の必要性が存在する。おそらく、このよう
な方法は、現存する方法よりも、末梢血においてさらに
高レベルの幹細胞を産生する。
セスを理解するための科学研究目的と、癌治療あるいは
遺伝子治療行程における自家幹細胞移植のための末梢化
のより良い方法の開発との両方のために、幹細胞末梢化
の新規な方法の必要性が存在する。おそらく、このよう
な方法は、現存する方法よりも、末梢血においてさらに
高レベルの幹細胞を産生する。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】発明の要旨
第一の局面では、本発明は、末梢血中の造血幹細胞およ
びCD34+細胞数を増加させる新規な方法を提供し、これ
はまた造血幹細胞およびCD34+の「末梢化（peripherali
zation）」あるいは「動員（mobilization）」として公
知である。この方法は、造血幹細胞およびCD34+細胞表
面上のVLA-4抗原の阻止因子を投与する工程を包含す
る。抗VLA-4あるいは抗VCAM-1抗体を含む種々の因子
が、このような阻止を仲介するために使用され得、それ
は、必要に応じて、１本鎖、ヒト化あるいはキメラ、そ
れらのFab、Fab'、F(ab')2あるいはF(v)フラグメント、
それらの重鎖あるいは軽鎖モノマーあるいはダイマー、
あるいはそれらの混合物、可溶性フィブロネクチン、CS
-1ペプチドあるいはアミノ酸配列EILDVあるいは同類置
換アミノ酸配列を含むフィブロネクチンペプチド、ある
いは可溶性VCAM-1、二官能性VCAM-1/Ig融合タンパク質
あるいはVCAM-1ペプチドであり得る。
びCD34+細胞数を増加させる新規な方法を提供し、これ
はまた造血幹細胞およびCD34+の「末梢化（peripherali
zation）」あるいは「動員（mobilization）」として公
知である。この方法は、造血幹細胞およびCD34+細胞表
面上のVLA-4抗原の阻止因子を投与する工程を包含す
る。抗VLA-4あるいは抗VCAM-1抗体を含む種々の因子
が、このような阻止を仲介するために使用され得、それ
は、必要に応じて、１本鎖、ヒト化あるいはキメラ、そ
れらのFab、Fab'、F(ab')2あるいはF(v)フラグメント、
それらの重鎖あるいは軽鎖モノマーあるいはダイマー、
あるいはそれらの混合物、可溶性フィブロネクチン、CS
-1ペプチドあるいはアミノ酸配列EILDVあるいは同類置
換アミノ酸配列を含むフィブロネクチンペプチド、ある
いは可溶性VCAM-1、二官能性VCAM-1/Ig融合タンパク質
あるいはVCAM-1ペプチドであり得る。
【００１３】別の局面では、本発明は、サイトカイン治
療のみによるよりも、予測されるより多大の効果を有す
る、造血幹細胞およびCD34+細胞を末梢化するための新
規な方法を提供する。本発明のこの局面に従って、この
方法は、本発明の第一の局面のように、造血幹細胞およ
びCD34+細胞の表面のVLA-4抗原の阻止因子を、造形幹細
胞増殖刺激因子と組み合わせて投与することを包含す
る。造血幹細胞増殖刺激因子を投与する工程は、サイト
カイン、好ましくはG-CSF、幹細胞因子、全能性幹細胞
因子、幹細胞増殖因子、あるいはGM-CSF、しかし代替的
にM-CSF、エリトロポエチン、インターロイキン-1、-
2、-3、-4、-6、あるいは11を使用して、実施され得
る。
療のみによるよりも、予測されるより多大の効果を有す
る、造血幹細胞およびCD34+細胞を末梢化するための新
規な方法を提供する。本発明のこの局面に従って、この
方法は、本発明の第一の局面のように、造血幹細胞およ
びCD34+細胞の表面のVLA-4抗原の阻止因子を、造形幹細
胞増殖刺激因子と組み合わせて投与することを包含す
る。造血幹細胞増殖刺激因子を投与する工程は、サイト
カイン、好ましくはG-CSF、幹細胞因子、全能性幹細胞
因子、幹細胞増殖因子、あるいはGM-CSF、しかし代替的
にM-CSF、エリトロポエチン、インターロイキン-1、-
2、-3、-4、-6、あるいは11を使用して、実施され得
る。
【００１４】その他の局面では、本発明は、癌のための
化学療法あるいは放射線療法を受けている患者に、末梢
血幹細胞を移植する改良方法を提供する。この方法で
は、骨髄除去化学療法あるいは放射線療法の実施前に、
造血幹細胞およびCD34+細胞の表面のVLA-4抗原の阻止を
仲介する因子の投与によって、患者の骨髄から幹細胞が
末梢化される。この因子はこれのみで投与され得るか、
あるいは、好ましくは幹細胞増殖を刺激する因子と組み
合わせて投与され得る。末梢化された幹細胞は、次に白
血球搬出(leukapheresis)により末梢血から回収され
る。次に、幹細胞は、抗CD34抗体による免疫吸着によっ
て回収された末梢化血液から濃縮される。必要に応じ
て、濃縮幹細胞は次に、幹細胞増殖を刺激する因子の存
在下での培養によって、エキソビボで増量される。骨髄
除去化学療法あるいは放射線療法の実施後に、濃縮およ
び必要に応じて増量された幹細胞が患者の循環血液に戻
され、骨髄中にそれ自身を植え付ける(engraft)。
化学療法あるいは放射線療法を受けている患者に、末梢
血幹細胞を移植する改良方法を提供する。この方法で
は、骨髄除去化学療法あるいは放射線療法の実施前に、
造血幹細胞およびCD34+細胞の表面のVLA-4抗原の阻止を
仲介する因子の投与によって、患者の骨髄から幹細胞が
末梢化される。この因子はこれのみで投与され得るか、
あるいは、好ましくは幹細胞増殖を刺激する因子と組み
合わせて投与され得る。末梢化された幹細胞は、次に白
血球搬出(leukapheresis)により末梢血から回収され
る。次に、幹細胞は、抗CD34抗体による免疫吸着によっ
て回収された末梢化血液から濃縮される。必要に応じ
て、濃縮幹細胞は次に、幹細胞増殖を刺激する因子の存
在下での培養によって、エキソビボで増量される。骨髄
除去化学療法あるいは放射線療法の実施後に、濃縮およ
び必要に応じて増量された幹細胞が患者の循環血液に戻
され、骨髄中にそれ自身を植え付ける(engraft)。
【００１５】別の局面では、本発明は、AIDSのために骨
髄除去化学療法あるいは放射線療法を受けている患者
に、末梢血幹細胞を移植する改良方法を提供する。この
方法は、癌のために化学療法あるいは放射線療法を受け
ている患者に、末梢化幹細胞を移植することに関して記
載されているのと同じ工程を包含する。さらに、この方
法はまた、必要に応じて、AZT、可溶性CD4、およびAIDS
ウイルスあるいはアンチセンスあるいは抗原オリゴヌク
レオチドのCD4特異的阻止因子のような、抗ウイルス剤
のような抗HIV剤を、濃縮および必要に応じて増量され
た幹細胞を患者の循環血液に戻す前後に、患者に投与す
ることを包含する。この工程は、新たに戻された幹細胞
の子孫に残余ウイルスが感染することを阻む「掃討(mop
pingup)」機能をなす。
髄除去化学療法あるいは放射線療法を受けている患者
に、末梢血幹細胞を移植する改良方法を提供する。この
方法は、癌のために化学療法あるいは放射線療法を受け
ている患者に、末梢化幹細胞を移植することに関して記
載されているのと同じ工程を包含する。さらに、この方
法はまた、必要に応じて、AZT、可溶性CD4、およびAIDS
ウイルスあるいはアンチセンスあるいは抗原オリゴヌク
レオチドのCD4特異的阻止因子のような、抗ウイルス剤
のような抗HIV剤を、濃縮および必要に応じて増量され
た幹細胞を患者の循環血液に戻す前後に、患者に投与す
ることを包含する。この工程は、新たに戻された幹細胞
の子孫に残余ウイルスが感染することを阻む「掃討(mop
pingup)」機能をなす。
【００１６】別の局面では、本発明は、種々の遺伝子疾
患および後天性疾患を有する患者に、遺伝子治療を実施
するための改良方法を提供する。この方法では、幹細胞
は、造血幹細胞およびCD34+細胞の表面のVLA-4抗原の阻
止を仲介する因子を投与することにより、患者の骨髄か
ら末梢化される。本明細書に前述した方法におけるよう
に、この因子は単独で、あるいは幹細胞の増殖を刺激す
る因子と組み合わせて投与され得る。次に、末梢血は白
血球搬出で集められる。そして、幹細胞は、抗CD34抗原
を用いた免疫吸着によって、回収末梢血から濃縮され
る。必要に応じて次に、濃縮幹細胞は、幹細胞の増殖を
刺激する因子の存在下での培養によって、エキソビボで
増量される。濃縮および必要に応じて増量された幹細胞
は次に、両栄養性(amphotrophic)レトロウイルスベクタ
ーあるいはその他の適切なベクターで形質導入され、そ
れは遺伝子疾患あるいは後天性疾患を改善する遺伝子を
発現する。必要に応じて、ベクターはまた、発現される
選択性マーカーを有し得、その場合、うまく形質導入さ
れた細胞は、選択性マーカーの存在について選択され得
る。形質導入されそして必要に応じて選択された幹細胞
は次に、患者の循環血液に戻され、骨髄にそれ自身が植
え付けられる。
患および後天性疾患を有する患者に、遺伝子治療を実施
するための改良方法を提供する。この方法では、幹細胞
は、造血幹細胞およびCD34+細胞の表面のVLA-4抗原の阻
止を仲介する因子を投与することにより、患者の骨髄か
ら末梢化される。本明細書に前述した方法におけるよう
に、この因子は単独で、あるいは幹細胞の増殖を刺激す
る因子と組み合わせて投与され得る。次に、末梢血は白
血球搬出で集められる。そして、幹細胞は、抗CD34抗原
を用いた免疫吸着によって、回収末梢血から濃縮され
る。必要に応じて次に、濃縮幹細胞は、幹細胞の増殖を
刺激する因子の存在下での培養によって、エキソビボで
増量される。濃縮および必要に応じて増量された幹細胞
は次に、両栄養性(amphotrophic)レトロウイルスベクタ
ーあるいはその他の適切なベクターで形質導入され、そ
れは遺伝子疾患あるいは後天性疾患を改善する遺伝子を
発現する。必要に応じて、ベクターはまた、発現される
選択性マーカーを有し得、その場合、うまく形質導入さ
れた細胞は、選択性マーカーの存在について選択され得
る。形質導入されそして必要に応じて選択された幹細胞
は次に、患者の循環血液に戻され、骨髄にそれ自身が植
え付けられる。
【００１７】本発明の目的は、造血、幹細胞の骨髄への
帰巣、および幹細胞のサイトカイン誘導末梢化を研究す
るための実験モデルとして、造血幹細胞およびCD34+細
胞を末梢化する方法を提供することである。本発明のさ
らなる目的は、化学療法あるいは放射線療法後の自家移
植用の幹細胞富化末梢血を提供するための、造血幹細胞
およびCD34+細胞の末梢化を最適化する方法を提供す
る。本発明のさらなる目的は、化学療法あるいは放射線
療法後の幹細胞の自家移植、あるいは遺伝子治療での使
用のため、末梢血からの精製造血幹細胞および前駆細胞
の収量を最大にするためのCD34+細胞の末梢化方法を提
供することである。本発明のさらなる目的は、正常幹細
胞のサイトカイン誘導細胞分化あるいは夾雑白血病細胞
の増殖を起こす危険をともなわない、幹細胞およびCD34
+細胞を末梢化する方法の提供である。本発明のさらな
る目的は、白血球搬出を計画するための、末梢血中の前
駆細胞含量ピークに対する予測タイミングを有する末梢
化方法の提供である。
帰巣、および幹細胞のサイトカイン誘導末梢化を研究す
るための実験モデルとして、造血幹細胞およびCD34+細
胞を末梢化する方法を提供することである。本発明のさ
らなる目的は、化学療法あるいは放射線療法後の自家移
植用の幹細胞富化末梢血を提供するための、造血幹細胞
およびCD34+細胞の末梢化を最適化する方法を提供す
る。本発明のさらなる目的は、化学療法あるいは放射線
療法後の幹細胞の自家移植、あるいは遺伝子治療での使
用のため、末梢血からの精製造血幹細胞および前駆細胞
の収量を最大にするためのCD34+細胞の末梢化方法を提
供することである。本発明のさらなる目的は、正常幹細
胞のサイトカイン誘導細胞分化あるいは夾雑白血病細胞
の増殖を起こす危険をともなわない、幹細胞およびCD34
+細胞を末梢化する方法の提供である。本発明のさらな
る目的は、白血球搬出を計画するための、末梢血中の前
駆細胞含量ピークに対する予測タイミングを有する末梢
化方法の提供である。
【００１８】本発明は、造血幹細胞表面のVLA-4抗原の
阻止因子を投与することにより、幹細胞およびCD34+細
胞を末梢化する方法を提供することによって、これらの
各目的を満たす。この効果は、このような阻止因子の使
用により増大され得、幹細胞を増幅するアプローチと結
び付いて相乗効果がもたらされる。
阻止因子を投与することにより、幹細胞およびCD34+細
胞を末梢化する方法を提供することによって、これらの
各目的を満たす。この効果は、このような阻止因子の使
用により増大され得、幹細胞を増幅するアプローチと結
び付いて相乗効果がもたらされる。
【００１９】
【課題を解決するための手段】好ましい実施態様の詳細
な説明 本発明は、造血幹細胞の操作に関する。より詳細には、
本発明は、造血幹細胞およびその他のCD34+細胞の末梢
化に関する。
な説明 本発明は、造血幹細胞の操作に関する。より詳細には、
本発明は、造血幹細胞およびその他のCD34+細胞の末梢
化に関する。
【００２０】第一の局面では、本発明は、造血幹細胞お
よびCD34+細胞を末梢化する方法を提供し、この方法
は、造血幹細胞およびCD34+細胞表面のVLA-4抗原の阻止
因子を投与する工程を包含する。本発明の目的のため
に、用語「VLA-4抗原の阻止因子」は、間質細胞表面上
または細胞外マトリックス（ECM）中でVLA-4抗原とVCAM
-1あるいはフィブロネクチンとの相互作用を妨害し得る
因子を意味することを意図する。本明細書に実証されて
いるように、このようなVLA-4抗原の阻止は、幹細胞お
よびCD34+細胞の末梢化を引き起こす。この実証では、
阻止因子としてVLA-4に対するモノクローナル抗体が利
用された。当業者は、この実証を得て、VLA-4抗原を阻
止し得る任意の因子が、本発明の方法にうまく使用され
得ることを認識する。従って、本発明の目的のために、
造血幹細胞表面上のVLA-4抗原を阻止し得る任意の因子
は、本明細書の実施例に使用されているモノクローナル
抗体の等価物であると考えられる。例えば、本発明は、
少なくともペプチド、ペプチド疑似体、炭水化物、およ
びCD34+細胞あるいは造血幹細胞の表面のVAL-4抗原を阻
止し得る小さな分子を、等価物として意図する。
よびCD34+細胞を末梢化する方法を提供し、この方法
は、造血幹細胞およびCD34+細胞表面のVLA-4抗原の阻止
因子を投与する工程を包含する。本発明の目的のため
に、用語「VLA-4抗原の阻止因子」は、間質細胞表面上
または細胞外マトリックス（ECM）中でVLA-4抗原とVCAM
-1あるいはフィブロネクチンとの相互作用を妨害し得る
因子を意味することを意図する。本明細書に実証されて
いるように、このようなVLA-4抗原の阻止は、幹細胞お
よびCD34+細胞の末梢化を引き起こす。この実証では、
阻止因子としてVLA-4に対するモノクローナル抗体が利
用された。当業者は、この実証を得て、VLA-4抗原を阻
止し得る任意の因子が、本発明の方法にうまく使用され
得ることを認識する。従って、本発明の目的のために、
造血幹細胞表面上のVLA-4抗原を阻止し得る任意の因子
は、本明細書の実施例に使用されているモノクローナル
抗体の等価物であると考えられる。例えば、本発明は、
少なくともペプチド、ペプチド疑似体、炭水化物、およ
びCD34+細胞あるいは造血幹細胞の表面のVAL-4抗原を阻
止し得る小さな分子を、等価物として意図する。
【００２１】好ましい実施態様では、造血幹細胞および
CD34+細胞表面のVLA-4抗原を阻止するために、本発明の
方法に使用される阻止因子は、モノクローナル抗体ある
いは抗体誘導体である。好ましい抗体誘導体には、ヒト
化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab、Fab'、F(ab')2
およびF(v)抗体フラグメント、および抗体重鎖あるいは
軽鎖のモノマーあるいはダイマー、あるいはそれらの混
合物が、包含される。同種移植拒絶を制御するためのモ
ノクローナル抗体OKT3の成功した使用は、ヒト化抗体が
好ましいが、ネズミモノクローナル抗体が治療適用に有
効であり得る。VLA-4に対するモノクローナル抗体は、
本発明に従う方法での好ましい阻止因子である。VLA-4
に対するヒトモノクローナル抗体は、本発明に従う方法
での別の好ましい阻止因子である。これらは、Boerner
ら、J.Immunol. 147:86-95 (1991)に記載のように、イ
ンビトロ感作ヒト脾細胞を用いて調製され得る。あるい
は、それらは、Perssonら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA
88:2432-2436 (1991)に記載のような、あるいは、Huan
gおよびStollar, J. of Immunol.Methods 141:227-236
(1991)に記載のような、レパートリークローニングによ
り調製され得る。本発明の方法における別の好ましい阻
止因子は、抗VLA-4特異性を有するキメラ抗体、および
ヒト抗体定常領域である。これらの好ましい阻止因子
は、米国特許第4,816,397号、およびMorrisonら、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)に例証され
ているような、人工認識法によって調製され得る。本発
明の方法でのさらに別の好ましい阻止因子は、抗VLA-4
特異性を有するヒト化抗体である。ヒト化抗体は、Jone
sら、Nature321:522 (1986); Riechmann, Nature 332:3
23 (1988); Queenら、Proc. Natl. Acad. Sci.USA 86:1
0029 (1989);およびOrlandiら、Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 86:3833 (1989)に記載のような、人工認識法に
従って調製され得る。当業者は、図５に示されているよ
うな、HP1/2の重鎖および軽鎖可変領域（配列番号1およ
び2）をコードするヌクレオチド配列に基づき、単に、
クローニング、変異誘発、および発現（抗体の発現につ
いては、例えば、Bossらの米国特許第4,923,805号を参
照のこと）の周知の方法によって、これらの好ましい阻
止因子を産生し得る。その他２つの好ましい阻止因子
は、本明細書に参考として援用されている米国特許第4,
946,778号に記載されているように調製され得る一本鎖
抗体；および、その教示が本明細書に参考として援用さ
れている米国特許第5,091,513号に記載されているよう
に調製され得る生合成抗体結合部位である。当業者は、
任意の上記の抗体あるいは抗体誘導体阻止因子が、本発
明の目的のためのこの用語の意味の中で、VLA-4のレセ
プターに結合し、そして造血幹細胞表面のVLA-4抗原を
阻止するための因子として作用することにより、本発明
の方法において作用し得ることを認識する。従って、本
発明の抗体および抗体誘導体阻止因子は、上記のよう
に、VCAM-1あるいはフィブロネクチンに対して結合特異
性を有する実施態様を包含する。なぜなら、これらの分
子は、幹細胞と間質細胞あるいは細胞外マトリックスと
間の付着に重要であるか、あるいはその他の組織および
血液を介する幹細胞の輸送を妨害すると思われるからで
ある。
CD34+細胞表面のVLA-4抗原を阻止するために、本発明の
方法に使用される阻止因子は、モノクローナル抗体ある
いは抗体誘導体である。好ましい抗体誘導体には、ヒト
化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab、Fab'、F(ab')2
およびF(v)抗体フラグメント、および抗体重鎖あるいは
軽鎖のモノマーあるいはダイマー、あるいはそれらの混
合物が、包含される。同種移植拒絶を制御するためのモ
ノクローナル抗体OKT3の成功した使用は、ヒト化抗体が
好ましいが、ネズミモノクローナル抗体が治療適用に有
効であり得る。VLA-4に対するモノクローナル抗体は、
本発明に従う方法での好ましい阻止因子である。VLA-4
に対するヒトモノクローナル抗体は、本発明に従う方法
での別の好ましい阻止因子である。これらは、Boerner
ら、J.Immunol. 147:86-95 (1991)に記載のように、イ
ンビトロ感作ヒト脾細胞を用いて調製され得る。あるい
は、それらは、Perssonら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA
88:2432-2436 (1991)に記載のような、あるいは、Huan
gおよびStollar, J. of Immunol.Methods 141:227-236
(1991)に記載のような、レパートリークローニングによ
り調製され得る。本発明の方法における別の好ましい阻
止因子は、抗VLA-4特異性を有するキメラ抗体、および
ヒト抗体定常領域である。これらの好ましい阻止因子
は、米国特許第4,816,397号、およびMorrisonら、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)に例証され
ているような、人工認識法によって調製され得る。本発
明の方法でのさらに別の好ましい阻止因子は、抗VLA-4
特異性を有するヒト化抗体である。ヒト化抗体は、Jone
sら、Nature321:522 (1986); Riechmann, Nature 332:3
23 (1988); Queenら、Proc. Natl. Acad. Sci.USA 86:1
0029 (1989);およびOrlandiら、Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 86:3833 (1989)に記載のような、人工認識法に
従って調製され得る。当業者は、図５に示されているよ
うな、HP1/2の重鎖および軽鎖可変領域（配列番号1およ
び2）をコードするヌクレオチド配列に基づき、単に、
クローニング、変異誘発、および発現（抗体の発現につ
いては、例えば、Bossらの米国特許第4,923,805号を参
照のこと）の周知の方法によって、これらの好ましい阻
止因子を産生し得る。その他２つの好ましい阻止因子
は、本明細書に参考として援用されている米国特許第4,
946,778号に記載されているように調製され得る一本鎖
抗体；および、その教示が本明細書に参考として援用さ
れている米国特許第5,091,513号に記載されているよう
に調製され得る生合成抗体結合部位である。当業者は、
任意の上記の抗体あるいは抗体誘導体阻止因子が、本発
明の目的のためのこの用語の意味の中で、VLA-4のレセ
プターに結合し、そして造血幹細胞表面のVLA-4抗原を
阻止するための因子として作用することにより、本発明
の方法において作用し得ることを認識する。従って、本
発明の抗体および抗体誘導体阻止因子は、上記のよう
に、VCAM-1あるいはフィブロネクチンに対して結合特異
性を有する実施態様を包含する。なぜなら、これらの分
子は、幹細胞と間質細胞あるいは細胞外マトリックスと
間の付着に重要であるか、あるいはその他の組織および
血液を介する幹細胞の輸送を妨害すると思われるからで
ある。
【００２２】別の好ましい実施態様では、本発明に従う
方法に使用される阻止因子は、抗体あるいは抗体誘導体
ではなく、VLA-4に対する可溶性型の天然結合タンパク
質である。これらの阻止因子には、可溶性VCAM-1、二官
能性VCAM-1/Ig融合タンパク質、あるいはVCAM-1ペプチ
ド、ならびにフィブロネクチン、代替スプライス非III
型接続セグメントを有するフィブロネクチン、およびア
ミノ酸配列EILDVあるいは同様の同類置換アミノ酸配列
を含むフィブロネクチンペプチドが包含される。これら
の阻止因子は、幹細胞表面上のVLA-4に対する、間質細
胞あるいはECM結合の結合タンパク質との競合により作
用する。
方法に使用される阻止因子は、抗体あるいは抗体誘導体
ではなく、VLA-4に対する可溶性型の天然結合タンパク
質である。これらの阻止因子には、可溶性VCAM-1、二官
能性VCAM-1/Ig融合タンパク質、あるいはVCAM-1ペプチ
ド、ならびにフィブロネクチン、代替スプライス非III
型接続セグメントを有するフィブロネクチン、およびア
ミノ酸配列EILDVあるいは同様の同類置換アミノ酸配列
を含むフィブロネクチンペプチドが包含される。これら
の阻止因子は、幹細胞表面上のVLA-4に対する、間質細
胞あるいはECM結合の結合タンパク質との競合により作
用する。
【００２３】本発明の第一の局面に従うこの方法では、
阻止因子は、好ましくは非経口的に投与される。阻止因
子は、好ましくは薬学的に受容可能なキャリアを含有す
る滅菌薬学的組成物として投与され、このキャリアは、
水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロー
ス、グリセロール、エタノールなど、あるいはそれらの
組合せのような、多くの周知のキャリアであり得る。好
ましくは、阻止因子は、抗体あるいは抗体誘導体のとき
には、約0.1 mg/kg体重／日と約10 mg/kg体重／日との
間の用量で投与される。抗体あるいは抗体誘導阻止因子
でないときには、用量範囲は、好ましくは、これらの抗
体量に対するモル当量の間であるべきである。投与量の
最適化は、阻止因子の投与後の末梢血のCFU-GMアッセイ
あるいは末梢血中のCD34+細胞アッセイによって決定さ
れ得る。好ましい投与量は、末梢血中のCFU-GM含有量を
少なくとも10倍増加させる。
阻止因子は、好ましくは非経口的に投与される。阻止因
子は、好ましくは薬学的に受容可能なキャリアを含有す
る滅菌薬学的組成物として投与され、このキャリアは、
水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロー
ス、グリセロール、エタノールなど、あるいはそれらの
組合せのような、多くの周知のキャリアであり得る。好
ましくは、阻止因子は、抗体あるいは抗体誘導体のとき
には、約0.1 mg/kg体重／日と約10 mg/kg体重／日との
間の用量で投与される。抗体あるいは抗体誘導阻止因子
でないときには、用量範囲は、好ましくは、これらの抗
体量に対するモル当量の間であるべきである。投与量の
最適化は、阻止因子の投与後の末梢血のCFU-GMアッセイ
あるいは末梢血中のCD34+細胞アッセイによって決定さ
れ得る。好ましい投与量は、末梢血中のCFU-GM含有量を
少なくとも10倍増加させる。
【００２４】第二の局面では、本発明は、サイトカイン
のみでの治療よりかなり有効である、造血幹細胞の末梢
化方法を提供する。本発明のこの局面に従って、この方
法は、インビボにおける造血幹細胞の増殖刺激因子を投
与する工程と組み合わせて、造血幹細胞表面のVLA-4抗
原の阻止因子を投与する工程を包含する。造血幹細胞表
面のVLA-4抗原の阻止因子を投与する工程は、本発明の
第一局面について記載されている様式と厳密に同じ様式
で実施される。インビボにおける造血幹細胞増殖の刺激
因子の投与工程は、好ましくは、サイトカイン投与を介
して実施される。
のみでの治療よりかなり有効である、造血幹細胞の末梢
化方法を提供する。本発明のこの局面に従って、この方
法は、インビボにおける造血幹細胞の増殖刺激因子を投
与する工程と組み合わせて、造血幹細胞表面のVLA-4抗
原の阻止因子を投与する工程を包含する。造血幹細胞表
面のVLA-4抗原の阻止因子を投与する工程は、本発明の
第一局面について記載されている様式と厳密に同じ様式
で実施される。インビボにおける造血幹細胞増殖の刺激
因子の投与工程は、好ましくは、サイトカイン投与を介
して実施される。
【００２５】造血幹細胞の増殖を刺激するための好まし
いサイトカインには、顆粒球コロニー刺激因子（G-CS
F）、幹細胞因子、全能性幹細胞因子（TSCF）、幹細胞
増殖因子（SCPF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激
因子（GM-CSF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-
CSF）、エリトロポエチン、インターロイキン-1、-2、-
3、-4、-6、および-11が包含される。最も好ましいの
は、G-CSF、幹細胞因子、およびGM-CSFであり、なぜな
ら、これら３つは全て、幹細胞増殖を引き起こすことが
公知であるからである。G-CSFおよびGM-CSFが前駆細胞
の増殖を刺激する能力は、それらが造血幹細胞の末梢化
を引き起こす能力（例えば、Haasら、Exp.Hematol. 18:
94-98 (1990)およびBlood 72:2074 (1988)を参照のこ
と）としてよく立証されている（例えば、Metcalf,Natu
re 339:27-30 (1989)を参照のこと）。この能力はま
た、幹細胞因子についても立証されている（Andrews
ら、Blood80:920-927 (1992)）。さらに、本明細書に示
されているこれらのその他のサイトカインの多大の可能
性が認識されている（RoweおよびRapoport,J. Clin. Ph
armacol. 32:486-501 (1992)）。本発明の目的のため
に、造血幹細胞の増殖刺激は、インビボにおけるこのよ
うな増殖を仲介し得る任意のサイトカインによって実施
され得る。従って、本発明の目的のために、造血幹細胞
のインビボにおける増殖を刺激し得る任意のサイトカイ
ンは、G-CSF、幹細胞因子、およびGM-CSFと等価である
と考えられ、これらもまた互いに等価であると考えられ
る。さらに、化学療法剤のみの使用で、前駆細胞の増殖
が導かれ得る。このような薬剤もまた、本発明に従った
方法に、VLA-4阻止因子と組合せられ得る。
いサイトカインには、顆粒球コロニー刺激因子（G-CS
F）、幹細胞因子、全能性幹細胞因子（TSCF）、幹細胞
増殖因子（SCPF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激
因子（GM-CSF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-
CSF）、エリトロポエチン、インターロイキン-1、-2、-
3、-4、-6、および-11が包含される。最も好ましいの
は、G-CSF、幹細胞因子、およびGM-CSFであり、なぜな
ら、これら３つは全て、幹細胞増殖を引き起こすことが
公知であるからである。G-CSFおよびGM-CSFが前駆細胞
の増殖を刺激する能力は、それらが造血幹細胞の末梢化
を引き起こす能力（例えば、Haasら、Exp.Hematol. 18:
94-98 (1990)およびBlood 72:2074 (1988)を参照のこ
と）としてよく立証されている（例えば、Metcalf,Natu
re 339:27-30 (1989)を参照のこと）。この能力はま
た、幹細胞因子についても立証されている（Andrews
ら、Blood80:920-927 (1992)）。さらに、本明細書に示
されているこれらのその他のサイトカインの多大の可能
性が認識されている（RoweおよびRapoport,J. Clin. Ph
armacol. 32:486-501 (1992)）。本発明の目的のため
に、造血幹細胞の増殖刺激は、インビボにおけるこのよ
うな増殖を仲介し得る任意のサイトカインによって実施
され得る。従って、本発明の目的のために、造血幹細胞
のインビボにおける増殖を刺激し得る任意のサイトカイ
ンは、G-CSF、幹細胞因子、およびGM-CSFと等価である
と考えられ、これらもまた互いに等価であると考えられ
る。さらに、化学療法剤のみの使用で、前駆細胞の増殖
が導かれ得る。このような薬剤もまた、本発明に従った
方法に、VLA-4阻止因子と組合せられ得る。
【００２６】本発明の第二の局面に従うこの方法では、
サイトカインは、好ましくは、非経口投与される。サイ
トカインは、好ましくは薬学的に受容可能なキャリアを
含有する滅菌薬学的組成物として投与され、このキャリ
アは、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキス
トロース、グリセロール、エタノールなど、あるいはそ
れらの組合せのような、多くの周知のキャリアであり得
る。好ましくは、サイトカインは、G-CSFのときには、
約1μg/kg体重／日と約50μg/kg体重／日との間の用量
で投与され、最も好ましくは、約10-15μg/kg体重／日
で投与される。最も好ましくは、サイトカインは、約4
日から約10日にわたる行程で投与される。投与量の最適
化あるいはサイトカインの組合せ（例えば、G-CSFおよ
びキットリガンド）は、サイトカインの投与および阻止
因子の投与後の末梢血のCFU-GMアッセイによって決定さ
れ得る。好ましい投与量は、サイトカインのみと比較し
て、末梢血１ミリリットル当りのCFU-GM数を少なくとも
５倍増加させるべきである。
サイトカインは、好ましくは、非経口投与される。サイ
トカインは、好ましくは薬学的に受容可能なキャリアを
含有する滅菌薬学的組成物として投与され、このキャリ
アは、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキス
トロース、グリセロール、エタノールなど、あるいはそ
れらの組合せのような、多くの周知のキャリアであり得
る。好ましくは、サイトカインは、G-CSFのときには、
約1μg/kg体重／日と約50μg/kg体重／日との間の用量
で投与され、最も好ましくは、約10-15μg/kg体重／日
で投与される。最も好ましくは、サイトカインは、約4
日から約10日にわたる行程で投与される。投与量の最適
化あるいはサイトカインの組合せ（例えば、G-CSFおよ
びキットリガンド）は、サイトカインの投与および阻止
因子の投与後の末梢血のCFU-GMアッセイによって決定さ
れ得る。好ましい投与量は、サイトカインのみと比較し
て、末梢血１ミリリットル当りのCFU-GM数を少なくとも
５倍増加させるべきである。
【００２７】本発明のこの局面に従って、造血幹細胞あ
るいはCD34+細胞表面のVLA-4抗原の阻止因子を投与する
工程およびこれらの細胞の増殖に対する刺激因子を投与
する工程は、共存的あるいは連続的に実施され得る。好
ましい実施態様では、この工程は、連続的に、好ましく
は、第一工程で、CD34+あるいは造血幹細胞増殖の刺激
因子の投与が実施される。
るいはCD34+細胞表面のVLA-4抗原の阻止因子を投与する
工程およびこれらの細胞の増殖に対する刺激因子を投与
する工程は、共存的あるいは連続的に実施され得る。好
ましい実施態様では、この工程は、連続的に、好ましく
は、第一工程で、CD34+あるいは造血幹細胞増殖の刺激
因子の投与が実施される。
【００２８】第三の局面では、本発明は、癌に対する化
学療法あるいは放射線療法を受けている患者に、末梢血
幹細胞を移植する改良方法を提供する。この方法では、
化学療法あるいは放射線療法の実施の前に、幹細胞は、
造血幹細胞およびCD34+細胞の表面のVLA-4抗原の阻止を
仲介する因子を投与することにより、患者の骨髄から末
梢化される。この方法に使用される阻止因子は、好まし
くは、本発明の第一の局面の考察に記載されたこれらの
阻止因子から選択される。この因子は、単独あるいは幹
細胞の増殖を刺激する因子と組み合わせて投与され得
る。必要に応じてこの方法に使用される増殖刺激因子
は、好ましくは、本発明の第二の局面の考察に記載され
たそれらの増殖刺激因子から選択される。次に、末梢化
された幹細胞は、白血球搬出により末梢血から集められ
る。次に、幹細胞は、抗CD34抗体を用いる免疫吸着のよ
うなCD34アフィニティークロマトグラフィーにより、集
められた末梢化血液から濃縮される。このような幹細胞
濃縮は、当該分野に周知であり、例えば、Berenson,Tra
nsplantation Proceedings 24:3032-3034 (1992)により
記載され、これは本明細書に参考として援用されてい
る。次に、必要に応じて、濃縮幹細胞は、幹細胞増殖を
刺激する因子の存在下でそれらを培養して、エキソビボ
において増量される。このエキソビボ増量は、本発明の
第二の局面の考察に記載されている任意の増殖刺激因子
を単独あるいは組合せで用いて、実施され得る。末梢血
由来のCD34+細胞のこのようなエキソビボ増量は、当該
分野で周知であり、例えば、Bruggarら、Blood81:2579-
2584 (1993)に記載されている。化学療法あるいは放射
線療法の実施後に、濃縮および必要に応じて増量された
幹細胞は、次に患者の循環血液に戻され、骨髄中にそれ
自身が植え付けられる。
学療法あるいは放射線療法を受けている患者に、末梢血
幹細胞を移植する改良方法を提供する。この方法では、
化学療法あるいは放射線療法の実施の前に、幹細胞は、
造血幹細胞およびCD34+細胞の表面のVLA-4抗原の阻止を
仲介する因子を投与することにより、患者の骨髄から末
梢化される。この方法に使用される阻止因子は、好まし
くは、本発明の第一の局面の考察に記載されたこれらの
阻止因子から選択される。この因子は、単独あるいは幹
細胞の増殖を刺激する因子と組み合わせて投与され得
る。必要に応じてこの方法に使用される増殖刺激因子
は、好ましくは、本発明の第二の局面の考察に記載され
たそれらの増殖刺激因子から選択される。次に、末梢化
された幹細胞は、白血球搬出により末梢血から集められ
る。次に、幹細胞は、抗CD34抗体を用いる免疫吸着のよ
うなCD34アフィニティークロマトグラフィーにより、集
められた末梢化血液から濃縮される。このような幹細胞
濃縮は、当該分野に周知であり、例えば、Berenson,Tra
nsplantation Proceedings 24:3032-3034 (1992)により
記載され、これは本明細書に参考として援用されてい
る。次に、必要に応じて、濃縮幹細胞は、幹細胞増殖を
刺激する因子の存在下でそれらを培養して、エキソビボ
において増量される。このエキソビボ増量は、本発明の
第二の局面の考察に記載されている任意の増殖刺激因子
を単独あるいは組合せで用いて、実施され得る。末梢血
由来のCD34+細胞のこのようなエキソビボ増量は、当該
分野で周知であり、例えば、Bruggarら、Blood81:2579-
2584 (1993)に記載されている。化学療法あるいは放射
線療法の実施後に、濃縮および必要に応じて増量された
幹細胞は、次に患者の循環血液に戻され、骨髄中にそれ
自身が植え付けられる。
【００２９】癌に対する化学療法あるいは放射線療法後
の、移植用の末梢化幹細胞の使用の価値は、当該分野で
認められ、Bensingerら、Blood 81:3158-3163 (1993);
Chaoら、81:2031-2035 (1993); KessingerおよびArmita
ge,Blood 77:211-213 (1991); Galeら、Bone Marrow Tr
ansplantation 9:151-155 (1992);およびSienaら、Bloo
d74:1904-1914 (1989)を含む、多くの参考文献に記載さ
れている。本発明に従うこの方法は、末梢血中にこのよ
うな幹細胞の濃度を増加させることにより、移植の成功
の可能性を大いに改良し、末梢血由来の幹細胞の移植に
改良を提供する。
の、移植用の末梢化幹細胞の使用の価値は、当該分野で
認められ、Bensingerら、Blood 81:3158-3163 (1993);
Chaoら、81:2031-2035 (1993); KessingerおよびArmita
ge,Blood 77:211-213 (1991); Galeら、Bone Marrow Tr
ansplantation 9:151-155 (1992);およびSienaら、Bloo
d74:1904-1914 (1989)を含む、多くの参考文献に記載さ
れている。本発明に従うこの方法は、末梢血中にこのよ
うな幹細胞の濃度を増加させることにより、移植の成功
の可能性を大いに改良し、末梢血由来の幹細胞の移植に
改良を提供する。
【００３０】第四の局面では、本発明は、精製末梢血幹
細胞を、AIDSのために骨髄除去化学療法あるいは放射線
療法を受けた患者に移植する改良方法を提供する。この
方法は、癌のために化学療法あるいは放射線療法を受け
た患者に末梢化幹細胞を移植することについての記載と
同じ工程を包含する。さらに、この方法はさらに、必要
に応じて、AZT、可溶性CD4、および、AIDSウイルスある
いはアンチセンスあるいは抗原オリゴヌクレオチドのCD
4特異的阻止因子のような、抗ウイルス剤のような抗HIV
剤を、濃縮および必要に応じて増量された幹細胞を患者
の循環血液に戻す前後に、患者に投与することを包含す
る。この工程は、新たに戻された幹細胞の子孫に残余ウ
イルスが感染することを阻む「掃討」機能をなす。
細胞を、AIDSのために骨髄除去化学療法あるいは放射線
療法を受けた患者に移植する改良方法を提供する。この
方法は、癌のために化学療法あるいは放射線療法を受け
た患者に末梢化幹細胞を移植することについての記載と
同じ工程を包含する。さらに、この方法はさらに、必要
に応じて、AZT、可溶性CD4、および、AIDSウイルスある
いはアンチセンスあるいは抗原オリゴヌクレオチドのCD
4特異的阻止因子のような、抗ウイルス剤のような抗HIV
剤を、濃縮および必要に応じて増量された幹細胞を患者
の循環血液に戻す前後に、患者に投与することを包含す
る。この工程は、新たに戻された幹細胞の子孫に残余ウ
イルスが感染することを阻む「掃討」機能をなす。
【００３１】骨髄除去化学療法あるいは放射線療法は、
HIVにより感染された血液中の任意の細胞を破壊するこ
とが一般的に予測される。従って、「掃討」工程は、こ
のような治療後の患者に移植された幹細胞の子孫に他の
場合では感染し得る任意の残余ウイルスを除去する作用
をなす。数種の因子が、このような「掃討」工程での使
用に有用であり得る。例えば、CD4特異的抗HIV因子およ
びアナログが、非感染CD34+細胞のHIVによる感染を予防
的に阻むことが示された。同様に、抗HIVオリゴヌクレ
オチドが、非感染細胞のHIV感染を阻むことが、例え
ば、米国特許第4,806,463号（その教示は本明細書に参
考として援用されている）に示されている。このような
オリヌクレオチドは、テスト期間100日までウイルス逸
脱を阻むことが示された。Lisziewiczら、Proc.Natl. A
cad. Sci. USA 90:3860-3864 (1993)を参照のこと。従
って、本発明に従うこの方法は、AIDSに対する新たな治
療アプローチを提供する。
HIVにより感染された血液中の任意の細胞を破壊するこ
とが一般的に予測される。従って、「掃討」工程は、こ
のような治療後の患者に移植された幹細胞の子孫に他の
場合では感染し得る任意の残余ウイルスを除去する作用
をなす。数種の因子が、このような「掃討」工程での使
用に有用であり得る。例えば、CD4特異的抗HIV因子およ
びアナログが、非感染CD34+細胞のHIVによる感染を予防
的に阻むことが示された。同様に、抗HIVオリゴヌクレ
オチドが、非感染細胞のHIV感染を阻むことが、例え
ば、米国特許第4,806,463号（その教示は本明細書に参
考として援用されている）に示されている。このような
オリヌクレオチドは、テスト期間100日までウイルス逸
脱を阻むことが示された。Lisziewiczら、Proc.Natl. A
cad. Sci. USA 90:3860-3864 (1993)を参照のこと。従
って、本発明に従うこの方法は、AIDSに対する新たな治
療アプローチを提供する。
【００３２】第五の局面では、本発明は、種々の任意の
遺伝子疾患および後天性疾患を有する患者に、遺伝子治
療を実施するための改良方法を提供する。この方法で
は、幹細胞は、造血幹細胞およびCD34+細胞表面のVLA-4
抗原の阻止を仲介する因子の投与により、患者の骨髄か
ら末梢化される。この方法に使用される阻止因子は、好
ましくは、本発明の第一の局面の考察に記載されている
阻止因子から選択される。本明細書に前述した方法にお
けるように、この因子は、単独あるいは幹細胞増殖を刺
激する因子と組み合わせて投与され得る。必要に応じて
この方法に使用される増殖刺激因子は、好ましくは、本
発明の第二の局面の考察に記載されている増殖刺激因子
から選択される。次に、末梢血は、白血球搬出により集
められる。幹細胞は次に、抗CD34抗体を用いる免疫吸着
により、集められた末梢血から濃縮される。このような
幹細胞濃縮は、当該分野で周知であり、例えば、Berens
on,Transplantation Proceedings 24:3032-3034 (1992)
に記載されており、この参考文献は本明細書に掲載され
ている。必要に応じて、濃縮幹細胞は次に、幹細胞の増
殖を刺激する因子の存在下で、エキソビボにて増量され
る。このエキソビボ増量は、本発明の第二の局面の考察
に記載されている任意の増殖刺激因子を単独あるいは組
み合わせて用いて、実施され得る。末梢血からのCD34+
細胞のこのようなエキソビボ増量は当該分野で周知であ
り、例えば、Bruggarら、Blood81:2579-2584 (1993)に
記載されている。濃縮および必要に応じて増量された幹
細胞は、次に両栄養性レトロウイルスベクター、あるい
はその他の適切なベクターで感染させられ、遺伝子疾患
あるいは後天性疾患を改善する遺伝子を発現する。必要
に応じて、ベクターはまた、発現される選択性マーカー
を有し得、うまく形質導入された細胞は、選択性マーカ
ーの存在について選択され得る。形質導入および必要に
応じて選択された幹細胞は、次に患者の循環血液に戻さ
れ、骨髄中にそれ自身が植え付けられる。レトロウイル
ス仲介遺伝子転移および次の患者への移植のための末梢
血由来の幹細胞の使用に対するアプローチの有用性は、
当該分野で認識され、例えば、Bragniら、Blood80:1418
-1422 (1992)に記載されている。本発明に従うこの方法
は、このような末梢血中の幹細胞濃度を増加させること
による、末梢血由来の幹細胞の移植に改良を提供し、こ
れによりレトロウイルストランスフェクションおよび次
の移植の成功の可能性を大いに改良し、そして部分的に
除去レジメ(ablativeregimens)を受けている患者への遺
伝子工学的に処理した細胞の繰り返し投与および形質導
入細胞の増殖促進因子の受容を可能にする。このような
幹細胞濃縮は、当該分野で周知であり、例えば、Berens
on,Transplantation Proceedings 24:3032-3034 (1992)
に記載されており、この参考文献は本明細書に掲載され
ている。
遺伝子疾患および後天性疾患を有する患者に、遺伝子治
療を実施するための改良方法を提供する。この方法で
は、幹細胞は、造血幹細胞およびCD34+細胞表面のVLA-4
抗原の阻止を仲介する因子の投与により、患者の骨髄か
ら末梢化される。この方法に使用される阻止因子は、好
ましくは、本発明の第一の局面の考察に記載されている
阻止因子から選択される。本明細書に前述した方法にお
けるように、この因子は、単独あるいは幹細胞増殖を刺
激する因子と組み合わせて投与され得る。必要に応じて
この方法に使用される増殖刺激因子は、好ましくは、本
発明の第二の局面の考察に記載されている増殖刺激因子
から選択される。次に、末梢血は、白血球搬出により集
められる。幹細胞は次に、抗CD34抗体を用いる免疫吸着
により、集められた末梢血から濃縮される。このような
幹細胞濃縮は、当該分野で周知であり、例えば、Berens
on,Transplantation Proceedings 24:3032-3034 (1992)
に記載されており、この参考文献は本明細書に掲載され
ている。必要に応じて、濃縮幹細胞は次に、幹細胞の増
殖を刺激する因子の存在下で、エキソビボにて増量され
る。このエキソビボ増量は、本発明の第二の局面の考察
に記載されている任意の増殖刺激因子を単独あるいは組
み合わせて用いて、実施され得る。末梢血からのCD34+
細胞のこのようなエキソビボ増量は当該分野で周知であ
り、例えば、Bruggarら、Blood81:2579-2584 (1993)に
記載されている。濃縮および必要に応じて増量された幹
細胞は、次に両栄養性レトロウイルスベクター、あるい
はその他の適切なベクターで感染させられ、遺伝子疾患
あるいは後天性疾患を改善する遺伝子を発現する。必要
に応じて、ベクターはまた、発現される選択性マーカー
を有し得、うまく形質導入された細胞は、選択性マーカ
ーの存在について選択され得る。形質導入および必要に
応じて選択された幹細胞は、次に患者の循環血液に戻さ
れ、骨髄中にそれ自身が植え付けられる。レトロウイル
ス仲介遺伝子転移および次の患者への移植のための末梢
血由来の幹細胞の使用に対するアプローチの有用性は、
当該分野で認識され、例えば、Bragniら、Blood80:1418
-1422 (1992)に記載されている。本発明に従うこの方法
は、このような末梢血中の幹細胞濃度を増加させること
による、末梢血由来の幹細胞の移植に改良を提供し、こ
れによりレトロウイルストランスフェクションおよび次
の移植の成功の可能性を大いに改良し、そして部分的に
除去レジメ(ablativeregimens)を受けている患者への遺
伝子工学的に処理した細胞の繰り返し投与および形質導
入細胞の増殖促進因子の受容を可能にする。このような
幹細胞濃縮は、当該分野で周知であり、例えば、Berens
on,Transplantation Proceedings 24:3032-3034 (1992)
に記載されており、この参考文献は本明細書に掲載され
ている。
【００３３】本発明は、多くの目的に有用である。造血
幹細胞あるいはCD34+細胞の末梢化方法は、これらの細
胞の骨髄への帰巣、およびそれらのある種の感染症およ
び外傷での往来に関連する、分子相互作用および分子シ
グナルの理解のために向けられた科学研究において価値
がある。本発明はまた、CD34+および造血幹細胞に富む
末梢血源を提供し、従って、本発明の方法を、化学療法
または放射線療法後の、あるいは遺伝子治療の行程にお
ける、これらの細胞型の自家移植を含む治療適用に有用
にする。本発明は、もっぱら現在のサイトカインに基づ
く方法に多くの利点を提供する。例えば、末梢化は、正
常細胞のサイトカイン誘導細胞分化あるいは夾雑白血病
細胞の増殖の危険性を伴わずに得られ得、細胞障害性因
子と組み合わされ得る。さらに、本発明の方法では、末
梢血中の前駆細胞のピークのタイミングは、一貫して最
初の抗体注入から約24時間と約72時間との間にあり、従
って、白血球搬出のための最も有益なタイミングをさら
に予測し得るようにする。
幹細胞あるいはCD34+細胞の末梢化方法は、これらの細
胞の骨髄への帰巣、およびそれらのある種の感染症およ
び外傷での往来に関連する、分子相互作用および分子シ
グナルの理解のために向けられた科学研究において価値
がある。本発明はまた、CD34+および造血幹細胞に富む
末梢血源を提供し、従って、本発明の方法を、化学療法
または放射線療法後の、あるいは遺伝子治療の行程にお
ける、これらの細胞型の自家移植を含む治療適用に有用
にする。本発明は、もっぱら現在のサイトカインに基づ
く方法に多くの利点を提供する。例えば、末梢化は、正
常細胞のサイトカイン誘導細胞分化あるいは夾雑白血病
細胞の増殖の危険性を伴わずに得られ得、細胞障害性因
子と組み合わされ得る。さらに、本発明の方法では、末
梢血中の前駆細胞のピークのタイミングは、一貫して最
初の抗体注入から約24時間と約72時間との間にあり、従
って、白血球搬出のための最も有益なタイミングをさら
に予測し得るようにする。
【００３４】本発明の両局面に従う方法の特定の実施態
様の有効性は、実施例において実証されている。本発明
の第一の局面に従って、VLA-4に対するモノクローナル
抗体は、赤毛ザルおよびヒヒに投与された。マウスモノ
クローナルHP1/2であるこれらの抗体は、以前にPulido
ら、J.Biol. Chem. 266:10241 (1991)に記載され、そし
て、種々の細胞表面のVLA-4抗原を阻止することが知ら
れている。この場合に、これらの抗体の投与は、末梢血
中に存在するCFU-GMの80倍もの（平均40倍）増加をもた
らした。公知のCFU-GMアッセイは、PBSC採取物の造血前
駆細胞の生存性についてもっとも広く使用されている測
定法であり、末梢血中に存在するCD34+細胞のパーセン
トとよく相関する（Craigら、BloodReviews 6:59-67 (1
992)を参照のこと）。従って、これらの結果は、造血幹
細胞およびCD34+細胞表面のVLA-4抗原の阻止因子の投与
により、造血幹細胞およびCD34+細胞の末梢化が生じる
ことを実証する。その上、この結果はヒトにも適用され
る。
様の有効性は、実施例において実証されている。本発明
の第一の局面に従って、VLA-4に対するモノクローナル
抗体は、赤毛ザルおよびヒヒに投与された。マウスモノ
クローナルHP1/2であるこれらの抗体は、以前にPulido
ら、J.Biol. Chem. 266:10241 (1991)に記載され、そし
て、種々の細胞表面のVLA-4抗原を阻止することが知ら
れている。この場合に、これらの抗体の投与は、末梢血
中に存在するCFU-GMの80倍もの（平均40倍）増加をもた
らした。公知のCFU-GMアッセイは、PBSC採取物の造血前
駆細胞の生存性についてもっとも広く使用されている測
定法であり、末梢血中に存在するCD34+細胞のパーセン
トとよく相関する（Craigら、BloodReviews 6:59-67 (1
992)を参照のこと）。従って、これらの結果は、造血幹
細胞およびCD34+細胞表面のVLA-4抗原の阻止因子の投与
により、造血幹細胞およびCD34+細胞の末梢化が生じる
ことを実証する。その上、この結果はヒトにも適用され
る。
【００３５】本発明の第二の局面に従って、VLA-4に対
するモノクローナル抗体が、G-CSFでの処置の５日後に
赤毛ザルに投与された。G-CSFがインビボにおいて造血
幹細胞およびCD34+細胞を刺激し得ることは、公知であ
る（Metcalf,Nature 339:27-30(1989)を参照のこと）。
G-CSF単独で、4および5日の処置によって、末梢血中に
存在するCFU-GMの増加をもたらした。G-CSF処置の停止
および抗VLA-4抗体での処置の開始後に、末梢血中のCFU
-GM数は、さらに劇的に増加した。G-CSF単独によるコン
トロール実験で確証されたように、G-CSF単独では、こ
の場合に認められた型のCFU-GMの処置後増加を引き起こ
さないことが、当業者により認識される。従って、これ
らの結果は、霊長類動物において、造血幹細胞およびCD
34+細胞表面のVLA-4抗原の阻止因子の投与は、これらの
細胞の増殖の刺激因子の投与と組み合わせて、相乗効果
を有する。これらの結果がヒトに対して等しく適用しな
いことを考える理由は存在しない。
するモノクローナル抗体が、G-CSFでの処置の５日後に
赤毛ザルに投与された。G-CSFがインビボにおいて造血
幹細胞およびCD34+細胞を刺激し得ることは、公知であ
る（Metcalf,Nature 339:27-30(1989)を参照のこと）。
G-CSF単独で、4および5日の処置によって、末梢血中に
存在するCFU-GMの増加をもたらした。G-CSF処置の停止
および抗VLA-4抗体での処置の開始後に、末梢血中のCFU
-GM数は、さらに劇的に増加した。G-CSF単独によるコン
トロール実験で確証されたように、G-CSF単独では、こ
の場合に認められた型のCFU-GMの処置後増加を引き起こ
さないことが、当業者により認識される。従って、これ
らの結果は、霊長類動物において、造血幹細胞およびCD
34+細胞表面のVLA-4抗原の阻止因子の投与は、これらの
細胞の増殖の刺激因子の投与と組み合わせて、相乗効果
を有する。これらの結果がヒトに対して等しく適用しな
いことを考える理由は存在しない。
【００３６】理論に捕らわれることは望まないが、出願
人は、造血幹細胞およびCD34+細胞の表面のVLA-4抗原阻
止因子の投与が、間質細胞上あるいはECM中で、VLA-4
と、フィブロネクチンおよび／またはVCAM-1のようなそ
の微細環境リガンドとの間の相互作用の途絶を介して、
骨髄環境からの細胞放出を仲介することにより、これら
の細胞の末梢化を引き起こすと考える。造血幹細胞およ
びCD34+細胞の増殖刺激因子の投与は、少なくともある
程度の、これらの細胞数の絶対的な増加により末梢化を
引き起こすと考えられる。従って、幹細胞増殖刺激因子
との組合せで、VLA-4抗原の阻止因子投与は、相補的な
機構によって末梢化を達成すると考えられる。抗VLA-4
抗体とG-CSFと間の観察された相乗効果は、この解釈を
支持する。さらに、抗VLA-4抗体と5-フルオロウラシル
と間の観察された相乗効果は、さらにこの解釈を確証す
る。これらの機構は相補的であると思われるので、VLA-
4抗原の阻止因子の投与および増殖刺激が共存的あるい
は引き続いて実施されるにもかかわらず、観察された相
乗効果は注目されるべきである。
人は、造血幹細胞およびCD34+細胞の表面のVLA-4抗原阻
止因子の投与が、間質細胞上あるいはECM中で、VLA-4
と、フィブロネクチンおよび／またはVCAM-1のようなそ
の微細環境リガンドとの間の相互作用の途絶を介して、
骨髄環境からの細胞放出を仲介することにより、これら
の細胞の末梢化を引き起こすと考える。造血幹細胞およ
びCD34+細胞の増殖刺激因子の投与は、少なくともある
程度の、これらの細胞数の絶対的な増加により末梢化を
引き起こすと考えられる。従って、幹細胞増殖刺激因子
との組合せで、VLA-4抗原の阻止因子投与は、相補的な
機構によって末梢化を達成すると考えられる。抗VLA-4
抗体とG-CSFと間の観察された相乗効果は、この解釈を
支持する。さらに、抗VLA-4抗体と5-フルオロウラシル
と間の観察された相乗効果は、さらにこの解釈を確証す
る。これらの機構は相補的であると思われるので、VLA-
4抗原の阻止因子の投与および増殖刺激が共存的あるい
は引き続いて実施されるにもかかわらず、観察された相
乗効果は注目されるべきである。
【００３７】本発明は、以下を提供する：
項１．CD34+細胞表面のVLA-4抗原の阻止因子を投与する
工程を包含する、CD34+細胞を末梢化する方法。 項２．前記阻止因子が、必要に応じて、ヒト、キメラ、
１本鎖、あるいはヒト化され得る抗VLA-4あるいは抗VCA
M-1抗体、あるいは、それらのFab、Fab'、F(ab')2、あ
るいはF(v)フラグメント、フィブロネクチン、代替スプ
ライス非III型接続セグメント、アミノ酸配列EILDVある
いはVLA-4仲介付着を阻止する同様の同数置換アミノ酸
配列を有するフィブロネクチンペプチド、可溶性VCAM-
1、二官能性VCAM-1/Ig融合タンパク質、およびVCAM-1ペ
プチドからなる群より選択される、項１に記載の方法。 項３．前記CD34+細胞の少なくとも一部が、造血幹細胞
である、項１に記載の方法。 項４．インビボにおいてCD34+細胞増殖の刺激因子を投
与する工程をさらに包含する、項１に記載の方法。 項５．インビボにおいてCD34+細胞増殖の刺激因子を投
与する工程をさらに包含する、項２に記載の方法。 項６．インビボにおいて造血幹細胞増殖の刺激因子を投
与する工程をさらに包含する、項３に記載の方法。 項７．前記刺激が、5-フルオロウラシル、あるいは、G-
CSF、幹細胞因子、GM-CSF、M-CSF、T-SCF、SCPF、IL-
1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、およびIL-11からなる群よ
り選択されるサイトカインに仲介される、項４に記載の
方法。 項８．前記刺激が、5-フルオロウラシル、あるいは、G-
CSF、幹細胞因子、GM-CSF、M-CSF、T-SCF、SCPF、IL-
1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、およびIL-11からなる群よ
り選択されるサイトカインに仲介される、項５に記載の
方法。 項９．前記刺激が、5-フルオロウラシル、あるいは、G-
CSF、幹細胞因子、GM-CSF、M-CSF、T-SCF、SCPF、IL-
1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、またはIL-11からなる群よ
り選択されるサイトカインに仲介される、項６に記載の
方法。 項１０．前記サイトカインがG-CSFである、項７に記載
の方法。 項１１．前記サイトカインがG-CSFである、項８に記載
の方法。 項１２．前記サイトカインがG-CSFである、項９に記載
の方法。 項１３．前記CD34+細胞表面のVLA-4抗原の阻止因子を投
与する前に、前記サイトカインが投与される、項１０に
記載の方法。 項１４．前記サイトカインが、阻止因子の前に投与され
る、項１１に記載の方法。 項１５．以下の（a）、（b）、（c）、（d）、および
（e）の工程を包含する、患者において癌を治療する方
法： （a）CD34+細胞を、このような細胞の表面のVLA-4抗原
の阻止因子を投与することにより末梢化する、工程； （b）白血球搬出により、該CD34+細胞を含有する末梢血
を集める、工程； （c）抗CD34抗体を用いる免疫吸着により該CD34+細胞を
濃縮する、工程； （d）該患者に化学療法および／または放射線療法を実
施する、工程；および、 （e）該濃縮CD34+細胞を、該患者の循環血液に戻す、工
程。 項１６．白血球搬出の前に、インビボにおいてCD34+細
胞増殖の刺激因子を投与する工程をさらに包含する、項
１５に記載の方法。 項１７．前記患者の循環血液に戻す前に、エキソビボに
おいて濃縮CD34+細胞を増量する工程をさらに包含す
る、項１５に記載の方法。 項１８．前記患者の循環血液に戻す前に、エキソビボに
おいて濃縮CD34+細胞を増量する工程をさらに包含す
る、項１６に記載の方法。 項１９．以下の（a）、（b）、（c）、（d）、および
（e）の工程を包含する、患者においてAIDSを治療する
方法： （a）CD34+細胞を、このような細胞表面のVLA-4抗原の
阻止因子を投与することにより末梢化する、工程； （b）白血球搬出により、該CD34+細胞を含有する末梢血
を集める、工程； （c）抗CD34抗体を用いた免疫吸着により該CD34+細胞を
濃縮する、工程； （d）該患者に化学療法および／または放射線療法を実
施する、工程；および、 （e）濃縮CD34+細胞を、該患者の循環血液に戻す、工
程。 項２０．前記患者の循環血液に濃縮CD34+細胞を戻す前
に、抗HIV因子を該患者に投与することをさらに包含す
る、項１９に記載の方法。 項２１．白血球搬出の前に、インビボにおいてCD34+細
胞増殖の刺激因子を投与する工程をさらに包含する、項
１９に記載の方法。 項２２．前記患者の循環血液に細胞を戻す前に、エキソ
ビボにおいて濃縮CD34+細胞を増量する工程をさらに包
含する、項１９に記載の方法。 項２３．白血球搬出の前に、インビボにおいてCD34+細
胞増殖の刺激因子を投与する工程をさらに包含する、項
２０に記載の方法。 項２４．前記患者の循環血液に細胞を戻す前に、エキソ
ビボにおいて濃縮CD34+細胞を増量する工程をさらに包
含する、項２０に記載の方法。 項２５．遺伝子疾患あるいは後天性疾患を有する患者に
遺伝子療法を実施するための方法であって、該方法が、 （a）CD34+細胞を、このような細胞表面のVLA-4抗原の
阻止因子を投与することにより末梢化する、工程； （b）白血球搬出により、該CD34+細胞を含有する末梢血
を集める、工程； （c）抗CD34抗体を用いる免疫吸着により該CD34+細胞を
濃縮する、工程； （d）該濃縮CD34+細胞を、レトロウイルスベクター、あ
るいは該遺伝子疾患または該後天性疾患を改善する遺伝
子を発現させるその他の適切なベクターでトランスフェ
クトする、工程；および (e)該感染細胞を該患者の循環血液に戻す、工程；を包
含する、方法。 項２６．白血球搬出の前に、インビボにおいてCD34+細
胞増殖の刺激因子を投与する工程をさらに包含する、項
２５に記載の方法。 項２７．細胞感染の前に、エキソビボにおいてCD34+細
胞増殖の刺激因子を投与する工程をさらに包含する、項
２５に記載の方法。 項２８．細胞感染の前に、エキソビボにおいてCD34+細
胞増殖の刺激因子を投与する工程をさらに包含する、項
２６に記載の方法。
工程を包含する、CD34+細胞を末梢化する方法。 項２．前記阻止因子が、必要に応じて、ヒト、キメラ、
１本鎖、あるいはヒト化され得る抗VLA-4あるいは抗VCA
M-1抗体、あるいは、それらのFab、Fab'、F(ab')2、あ
るいはF(v)フラグメント、フィブロネクチン、代替スプ
ライス非III型接続セグメント、アミノ酸配列EILDVある
いはVLA-4仲介付着を阻止する同様の同数置換アミノ酸
配列を有するフィブロネクチンペプチド、可溶性VCAM-
1、二官能性VCAM-1/Ig融合タンパク質、およびVCAM-1ペ
プチドからなる群より選択される、項１に記載の方法。 項３．前記CD34+細胞の少なくとも一部が、造血幹細胞
である、項１に記載の方法。 項４．インビボにおいてCD34+細胞増殖の刺激因子を投
与する工程をさらに包含する、項１に記載の方法。 項５．インビボにおいてCD34+細胞増殖の刺激因子を投
与する工程をさらに包含する、項２に記載の方法。 項６．インビボにおいて造血幹細胞増殖の刺激因子を投
与する工程をさらに包含する、項３に記載の方法。 項７．前記刺激が、5-フルオロウラシル、あるいは、G-
CSF、幹細胞因子、GM-CSF、M-CSF、T-SCF、SCPF、IL-
1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、およびIL-11からなる群よ
り選択されるサイトカインに仲介される、項４に記載の
方法。 項８．前記刺激が、5-フルオロウラシル、あるいは、G-
CSF、幹細胞因子、GM-CSF、M-CSF、T-SCF、SCPF、IL-
1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、およびIL-11からなる群よ
り選択されるサイトカインに仲介される、項５に記載の
方法。 項９．前記刺激が、5-フルオロウラシル、あるいは、G-
CSF、幹細胞因子、GM-CSF、M-CSF、T-SCF、SCPF、IL-
1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、またはIL-11からなる群よ
り選択されるサイトカインに仲介される、項６に記載の
方法。 項１０．前記サイトカインがG-CSFである、項７に記載
の方法。 項１１．前記サイトカインがG-CSFである、項８に記載
の方法。 項１２．前記サイトカインがG-CSFである、項９に記載
の方法。 項１３．前記CD34+細胞表面のVLA-4抗原の阻止因子を投
与する前に、前記サイトカインが投与される、項１０に
記載の方法。 項１４．前記サイトカインが、阻止因子の前に投与され
る、項１１に記載の方法。 項１５．以下の（a）、（b）、（c）、（d）、および
（e）の工程を包含する、患者において癌を治療する方
法： （a）CD34+細胞を、このような細胞の表面のVLA-4抗原
の阻止因子を投与することにより末梢化する、工程； （b）白血球搬出により、該CD34+細胞を含有する末梢血
を集める、工程； （c）抗CD34抗体を用いる免疫吸着により該CD34+細胞を
濃縮する、工程； （d）該患者に化学療法および／または放射線療法を実
施する、工程；および、 （e）該濃縮CD34+細胞を、該患者の循環血液に戻す、工
程。 項１６．白血球搬出の前に、インビボにおいてCD34+細
胞増殖の刺激因子を投与する工程をさらに包含する、項
１５に記載の方法。 項１７．前記患者の循環血液に戻す前に、エキソビボに
おいて濃縮CD34+細胞を増量する工程をさらに包含す
る、項１５に記載の方法。 項１８．前記患者の循環血液に戻す前に、エキソビボに
おいて濃縮CD34+細胞を増量する工程をさらに包含す
る、項１６に記載の方法。 項１９．以下の（a）、（b）、（c）、（d）、および
（e）の工程を包含する、患者においてAIDSを治療する
方法： （a）CD34+細胞を、このような細胞表面のVLA-4抗原の
阻止因子を投与することにより末梢化する、工程； （b）白血球搬出により、該CD34+細胞を含有する末梢血
を集める、工程； （c）抗CD34抗体を用いた免疫吸着により該CD34+細胞を
濃縮する、工程； （d）該患者に化学療法および／または放射線療法を実
施する、工程；および、 （e）濃縮CD34+細胞を、該患者の循環血液に戻す、工
程。 項２０．前記患者の循環血液に濃縮CD34+細胞を戻す前
に、抗HIV因子を該患者に投与することをさらに包含す
る、項１９に記載の方法。 項２１．白血球搬出の前に、インビボにおいてCD34+細
胞増殖の刺激因子を投与する工程をさらに包含する、項
１９に記載の方法。 項２２．前記患者の循環血液に細胞を戻す前に、エキソ
ビボにおいて濃縮CD34+細胞を増量する工程をさらに包
含する、項１９に記載の方法。 項２３．白血球搬出の前に、インビボにおいてCD34+細
胞増殖の刺激因子を投与する工程をさらに包含する、項
２０に記載の方法。 項２４．前記患者の循環血液に細胞を戻す前に、エキソ
ビボにおいて濃縮CD34+細胞を増量する工程をさらに包
含する、項２０に記載の方法。 項２５．遺伝子疾患あるいは後天性疾患を有する患者に
遺伝子療法を実施するための方法であって、該方法が、 （a）CD34+細胞を、このような細胞表面のVLA-4抗原の
阻止因子を投与することにより末梢化する、工程； （b）白血球搬出により、該CD34+細胞を含有する末梢血
を集める、工程； （c）抗CD34抗体を用いる免疫吸着により該CD34+細胞を
濃縮する、工程； （d）該濃縮CD34+細胞を、レトロウイルスベクター、あ
るいは該遺伝子疾患または該後天性疾患を改善する遺伝
子を発現させるその他の適切なベクターでトランスフェ
クトする、工程；および (e)該感染細胞を該患者の循環血液に戻す、工程；を包
含する、方法。 項２６．白血球搬出の前に、インビボにおいてCD34+細
胞増殖の刺激因子を投与する工程をさらに包含する、項
２５に記載の方法。 項２７．細胞感染の前に、エキソビボにおいてCD34+細
胞増殖の刺激因子を投与する工程をさらに包含する、項
２５に記載の方法。 項２８．細胞感染の前に、エキソビボにおいてCD34+細
胞増殖の刺激因子を投与する工程をさらに包含する、項
２６に記載の方法。
【００３８】
【発明の実施の形態】以下の実施例は、本発明の特定の
好ましい実施態様をさらに例証し、全くどこにも限定す
ることを意図していない。
好ましい実施態様をさらに例証し、全くどこにも限定す
ることを意図していない。
【００３９】
【実施例】実施例１
抗VLA-4抗体を用いる幹細胞の末梢化
３匹の赤毛ザルおよび１匹のヒヒに、抗VLA-4マウスモ
ノクローナル抗体HP1/2（1mg/kg体重／日）を、４日間
連続して静脈内に注射した。処置の間の種々の時点およ
び終了後に、末梢血を集めて、従来のフィコール-ハイ
パック（Ficoll-Hypaque）分離法によって、単球を集め
た。全白血球を、血液１ミリリットルあたり回収された
単球数から算出した。CFU-GMおよびBFUeを、従来のアッ
セイにより決定した（例えば、Papayannopoulouら、Sci
ence224:617 (1984)を参照のこと）。これらの研究の結
果を、２匹の赤毛ザル（パネルＡおよびC）および１匹
のヒヒ（パネルＢ）について図１に示す。これらの結果
は、抗VLA-4モノクローナル抗体によるこれらの霊長類
動物の処置により、処置開始後の約２〜４日をピーク
に、全白血球数に少量の増加（２倍まで）が生じたこと
を実証する。さらに重要なことに、血液１ミリリットル
あたりの全CFU-GMは、処置開始後の約２〜４日をピーク
に、さらに劇的に増加した（約40倍）。もう１匹の赤毛
ザルでは、１回の抗体注射後、約８倍のCFU-GM増加が認
められた（データは示していない）。造血前駆細胞の潜
在的な再滞在、およびCFU-GMとCD34+の割合との間の相
関性を測定するための十分に確立されたCFU-GMアッセイ
を使用すると、これらの結果は、抗VLA-4抗体が幹細胞
の末梢化を引き起こすことを確証する。
ノクローナル抗体HP1/2（1mg/kg体重／日）を、４日間
連続して静脈内に注射した。処置の間の種々の時点およ
び終了後に、末梢血を集めて、従来のフィコール-ハイ
パック（Ficoll-Hypaque）分離法によって、単球を集め
た。全白血球を、血液１ミリリットルあたり回収された
単球数から算出した。CFU-GMおよびBFUeを、従来のアッ
セイにより決定した（例えば、Papayannopoulouら、Sci
ence224:617 (1984)を参照のこと）。これらの研究の結
果を、２匹の赤毛ザル（パネルＡおよびC）および１匹
のヒヒ（パネルＢ）について図１に示す。これらの結果
は、抗VLA-4モノクローナル抗体によるこれらの霊長類
動物の処置により、処置開始後の約２〜４日をピーク
に、全白血球数に少量の増加（２倍まで）が生じたこと
を実証する。さらに重要なことに、血液１ミリリットル
あたりの全CFU-GMは、処置開始後の約２〜４日をピーク
に、さらに劇的に増加した（約40倍）。もう１匹の赤毛
ザルでは、１回の抗体注射後、約８倍のCFU-GM増加が認
められた（データは示していない）。造血前駆細胞の潜
在的な再滞在、およびCFU-GMとCD34+の割合との間の相
関性を測定するための十分に確立されたCFU-GMアッセイ
を使用すると、これらの結果は、抗VLA-4抗体が幹細胞
の末梢化を引き起こすことを確証する。
【００４０】実施例２
幹細胞の末梢化を生じるためのCD18阻止因子の機能不全
抗原CD18は幹細胞上に存在し、幹細胞に関連する相互作
用に重要であると広く考えられている。CD18に対する阻
止因子が幹細胞の末梢化を引き起こし得るかどうかを試
験するために、もう１匹の赤毛ザルを、CD18に対するモ
ノクローナル抗体で処置した。抗体を、2mg/kg体重／日
の投与量で３日間、静脈内注射して投与した。このコン
トロール実験の結果を図２に示す。全白血球数は、この
処置で増加し、これはウサギを用いた以前の実験と一致
する。しかし、全GFU-GMは、抗CD18モノクローナル抗体
での処置後に増加を示さなかった。従って、CD18が、幹
細胞に関連する相互作用に重要であると広く考えられて
いるが、CD18阻止因子は、幹細胞あるいは前駆細胞の末
梢化を導かない。これらの結果は、抗VLA-4モノクロー
ナル抗体での処置で観察される幹細胞の末梢化が、実際
にVLA-4の特異的阻止によるものであることを確証す
る。
用に重要であると広く考えられている。CD18に対する阻
止因子が幹細胞の末梢化を引き起こし得るかどうかを試
験するために、もう１匹の赤毛ザルを、CD18に対するモ
ノクローナル抗体で処置した。抗体を、2mg/kg体重／日
の投与量で３日間、静脈内注射して投与した。このコン
トロール実験の結果を図２に示す。全白血球数は、この
処置で増加し、これはウサギを用いた以前の実験と一致
する。しかし、全GFU-GMは、抗CD18モノクローナル抗体
での処置後に増加を示さなかった。従って、CD18が、幹
細胞に関連する相互作用に重要であると広く考えられて
いるが、CD18阻止因子は、幹細胞あるいは前駆細胞の末
梢化を導かない。これらの結果は、抗VLA-4モノクロー
ナル抗体での処置で観察される幹細胞の末梢化が、実際
にVLA-4の特異的阻止によるものであることを確証す
る。
【００４１】実施例３
G-CSFと組合せた両方の抗VLA-4抗体での処置から得られ
た幹細胞の相乗的末梢化 ヒヒを、組換えヒトG-CSFで、１日に２回、５日間連続
で処置した。各G-CSF処置は、体重１キログラムあたり1
5μgのG-CSFの静脈内注射からなった。G-CSF投与の５日
後に、ヒヒに、隔日に２回、抗VLA-4モノクローナル抗
体（HP1/2）を注射した。各注射は、体重１キログラム
あたり１ミリグラムの抗体を含有した。全白血球および
CFU-GMを、実施例１に記載されているように決定した。
結果を図３に示す。図のパネルＡに示すように、G-CSF
は、４および５日処置により、全白血球の著しい増加と
ともに、CFU-GMの予測された増加をもたらした。驚くべ
きことに、５日間のG-CSF処置の最終日の後の、抗VLA-4
抗体投与開始後に、さらにCFU-GMの著しい増加が認めら
れ、この場合は、全白血球は全く増加しなかった。この
第二の増加により、G-CSF単独に比較して、CFU-GM数で
約６倍の向上が得られた。同じプロトコールに従ってG-
CSFのみで処置されたコントロール動物は、処置の停止
後に、末梢血CFUの連続的な減少を示した（図３、パネ
ルＢを参照のこと）。これらの結果は、抗VLA-4抗体で
の処置がCFU-GMのこの第二の増加に起因したことを示
す。従って、抗VLA-4抗体とG-CSFとの組み合せ処置は相
乗効果をもたらし、G-CSFあるいは抗VLA-4抗体のみのい
ずれかでの処置よりも、はるかにCFU-GMの増加をもたら
した。
た幹細胞の相乗的末梢化 ヒヒを、組換えヒトG-CSFで、１日に２回、５日間連続
で処置した。各G-CSF処置は、体重１キログラムあたり1
5μgのG-CSFの静脈内注射からなった。G-CSF投与の５日
後に、ヒヒに、隔日に２回、抗VLA-4モノクローナル抗
体（HP1/2）を注射した。各注射は、体重１キログラム
あたり１ミリグラムの抗体を含有した。全白血球および
CFU-GMを、実施例１に記載されているように決定した。
結果を図３に示す。図のパネルＡに示すように、G-CSF
は、４および５日処置により、全白血球の著しい増加と
ともに、CFU-GMの予測された増加をもたらした。驚くべ
きことに、５日間のG-CSF処置の最終日の後の、抗VLA-4
抗体投与開始後に、さらにCFU-GMの著しい増加が認めら
れ、この場合は、全白血球は全く増加しなかった。この
第二の増加により、G-CSF単独に比較して、CFU-GM数で
約６倍の向上が得られた。同じプロトコールに従ってG-
CSFのみで処置されたコントロール動物は、処置の停止
後に、末梢血CFUの連続的な減少を示した（図３、パネ
ルＢを参照のこと）。これらの結果は、抗VLA-4抗体で
の処置がCFU-GMのこの第二の増加に起因したことを示
す。従って、抗VLA-4抗体とG-CSFとの組み合せ処置は相
乗効果をもたらし、G-CSFあるいは抗VLA-4抗体のみのい
ずれかでの処置よりも、はるかにCFU-GMの増加をもたら
した。
【００４２】実施例４
G-CSFと抗VLA-4抗体との組合せ処置後の、末梢血中の高
増殖可能細胞の分析 実施例３に記載の実験では、高増殖可能（HPP）細胞も
また計数した。HPP細胞は、分析格子上に濃い密集増殖
の、直径0.5mmを超える、肉眼で見えるコロニーを生じ
る細胞である。これらの細胞の存在は、より多い再滞在
容量に関連し、このような細胞は初期前駆細胞と考えら
れる。結果を図４に示す。G-CSF処置のみと、抗VLA-4抗
体との組合せたG-CSF処置との間の末梢血HPP細胞で観察
された不均衡は、CFU-GMについて観察された不均衡より
もさらに大きい。これらの結果は、組合せ処置が、さら
に前駆細胞を産生するばかりか、潜在的により大きな再
滞在容量を有する初期前駆細胞もまた産生することを、
示唆している。
増殖可能細胞の分析 実施例３に記載の実験では、高増殖可能（HPP）細胞も
また計数した。HPP細胞は、分析格子上に濃い密集増殖
の、直径0.5mmを超える、肉眼で見えるコロニーを生じ
る細胞である。これらの細胞の存在は、より多い再滞在
容量に関連し、このような細胞は初期前駆細胞と考えら
れる。結果を図４に示す。G-CSF処置のみと、抗VLA-4抗
体との組合せたG-CSF処置との間の末梢血HPP細胞で観察
された不均衡は、CFU-GMについて観察された不均衡より
もさらに大きい。これらの結果は、組合せ処置が、さら
に前駆細胞を産生するばかりか、潜在的により大きな再
滞在容量を有する初期前駆細胞もまた産生することを、
示唆している。
【００４３】実施例５
5-フルオロウラシルとの組合せによる、抗VLA-4抗体で
の処置から得られる幹細胞の相乗的末梢化 ヒヒを、体重１キログラムあたり100 mgの投与量の、化
学療法剤5-フルオロウラシルで処置した。開始の５日後
に、ヒヒに、抗VLA-4モノクローナル抗体（HP1/2）を隔
日に４回注射した。各注射は、体重１キログラムあたり
１ミリグラムの抗体を含有した。全白血球およびCFU-GM
を、実施例１に記載のように決定した。結果を図６に示
す。図のパネルＢに示すように、5-フルオロウラシルの
みで、11日および12日に、CFU-GMのおだやかな増加が生
じた。しかし、5-フルオロウラシル後の抗VLA-4抗体の
投与は、CFU-GMのさらに劇的な増加を生じ、この増加は
5-フルオロウラシルのみで産生される10倍よりも大きか
った。これらの結果は、抗VLA-4抗体と5-フルオロウラ
シルとの組合せ処置が相乗効果を生じ、どちらかの因子
のみでの処置によるよりも、CFU-GMの多大の増加を引き
起こした。さらに、G-CSF／抗VLA-4抗体でともになされ
たときには、結果は、観察された相乗性が、１つの因子
による前駆細胞増殖の刺激、およびその他の因子による
骨髄からの前駆細胞の放出に起因するという理論を、強
く支持する。従って、これらの結果は、このような相乗
効果が、骨髄からの放出をもたらし得る任意の因子と共
に、増殖を刺激し得る任意の因子によって産生され得る
ことを、強く支持する。
の処置から得られる幹細胞の相乗的末梢化 ヒヒを、体重１キログラムあたり100 mgの投与量の、化
学療法剤5-フルオロウラシルで処置した。開始の５日後
に、ヒヒに、抗VLA-4モノクローナル抗体（HP1/2）を隔
日に４回注射した。各注射は、体重１キログラムあたり
１ミリグラムの抗体を含有した。全白血球およびCFU-GM
を、実施例１に記載のように決定した。結果を図６に示
す。図のパネルＢに示すように、5-フルオロウラシルの
みで、11日および12日に、CFU-GMのおだやかな増加が生
じた。しかし、5-フルオロウラシル後の抗VLA-4抗体の
投与は、CFU-GMのさらに劇的な増加を生じ、この増加は
5-フルオロウラシルのみで産生される10倍よりも大きか
った。これらの結果は、抗VLA-4抗体と5-フルオロウラ
シルとの組合せ処置が相乗効果を生じ、どちらかの因子
のみでの処置によるよりも、CFU-GMの多大の増加を引き
起こした。さらに、G-CSF／抗VLA-4抗体でともになされ
たときには、結果は、観察された相乗性が、１つの因子
による前駆細胞増殖の刺激、およびその他の因子による
骨髄からの前駆細胞の放出に起因するという理論を、強
く支持する。従って、これらの結果は、このような相乗
効果が、骨髄からの放出をもたらし得る任意の因子と共
に、増殖を刺激し得る任意の因子によって産生され得る
ことを、強く支持する。
【００４４】実施例６
ヒト化抗VLA-4抗体の調製
抗VLA-4モノクローナル抗体HP1/2の軽鎖および重鎖の相
補性決定領域（CDR）を、Kabatら、1991,第5版、第4
巻、Sequences of Proteins of Immunological Interes
t, U.S. Department ofHealth and Human Services, NI
H, USAの配列研究に従って、決定した。ネズミHP1/2 VH
のCDRは、アミノ酸31-35（CDR1）、50-66（CDR2）およ
び99-110（CDR3）（それぞれ、Kabat配列のアミノ酸31-
35、50-65および95-102に対応する）として本明細書で
開示されているヒト化VH配列中に示されている残基に対
応する。ネズミHP1/2VKのCDRは、アミノ酸24-34（CDR
1）、50-56（CDR2）および89-97（CDR3）として本明細
書で開示されているヒト化VK配列中に示されている残
基、およびKabat配列中の同じ残基に対応する。KabatNE
WMフレームワークを、重鎖CDRを受け入れるように選択
し、Kabat REIフレームワークを、κ鎖CDRを受け入れる
ように選択した。CDRのヒトフレームワーク中への移植
を、M13変異誘発ベクター、およびフレームワーク由来
の短い配列に隣接したHP1/2CDRコーディング配列を有す
る合成オリゴヌクレオチドを用いて、完了した。VH変異
誘発ベクター M13VHPCR1は、NEWMフレームワークを有
し、そしてOrlandiら、Proc.Natl. Acad. Sci USA 86:
3833-3837 (1989)に記載されている。VK変異誘発ベクタ
ーM13VKPCR2は、本質的にREIフレームワークを含有し、
フレームワーク４で、ValからGluへの１つのアミノ酸の
変化がある以外は、Orlandiらに記載されたM13VKPCR1と
同じである。移植された産物を、PCRで回収し、配列決
定のためにM13mp19にクローニングした。移植されたVH
配列[配列番号3]を図７のパネルＡに示す。CDR移植に加
えて、この産物は、ネズミアミノ酸の27-30位、および9
4位のArgからAspへの変化をコードする。移植したVK配
列[配列番号4]を、図７のパネルＢに示す。
補性決定領域（CDR）を、Kabatら、1991,第5版、第4
巻、Sequences of Proteins of Immunological Interes
t, U.S. Department ofHealth and Human Services, NI
H, USAの配列研究に従って、決定した。ネズミHP1/2 VH
のCDRは、アミノ酸31-35（CDR1）、50-66（CDR2）およ
び99-110（CDR3）（それぞれ、Kabat配列のアミノ酸31-
35、50-65および95-102に対応する）として本明細書で
開示されているヒト化VH配列中に示されている残基に対
応する。ネズミHP1/2VKのCDRは、アミノ酸24-34（CDR
1）、50-56（CDR2）および89-97（CDR3）として本明細
書で開示されているヒト化VK配列中に示されている残
基、およびKabat配列中の同じ残基に対応する。KabatNE
WMフレームワークを、重鎖CDRを受け入れるように選択
し、Kabat REIフレームワークを、κ鎖CDRを受け入れる
ように選択した。CDRのヒトフレームワーク中への移植
を、M13変異誘発ベクター、およびフレームワーク由来
の短い配列に隣接したHP1/2CDRコーディング配列を有す
る合成オリゴヌクレオチドを用いて、完了した。VH変異
誘発ベクター M13VHPCR1は、NEWMフレームワークを有
し、そしてOrlandiら、Proc.Natl. Acad. Sci USA 86:
3833-3837 (1989)に記載されている。VK変異誘発ベクタ
ーM13VKPCR2は、本質的にREIフレームワークを含有し、
フレームワーク４で、ValからGluへの１つのアミノ酸の
変化がある以外は、Orlandiらに記載されたM13VKPCR1と
同じである。移植された産物を、PCRで回収し、配列決
定のためにM13mp19にクローニングした。移植されたVH
配列[配列番号3]を図７のパネルＡに示す。CDR移植に加
えて、この産物は、ネズミアミノ酸の27-30位、および9
4位のArgからAspへの変化をコードする。移植したVK配
列[配列番号4]を、図７のパネルＢに示す。
【００４５】さらなる改変を、Hoら、Gene 77:51-59 (1
989)の２工程PCR特異変異誘発法により導入した。VH配
列については、24位（Kabat番号）をValからAlaに、75
位（Kabat番号）をLysからSerに変化し、次に、アミノ
酸27-30位および94位を、NEWM配列に変異により戻し
た。最終のヒト化VH配列[配列番号5]を図８のパネルＡ
に示す。VK配列については、同じ２工程のPCR特異変異
誘発法を使用してさらなる改変を導入した。最終のヒト
化VK配列[配列番号6]を図８のパネルＢに示す。
989)の２工程PCR特異変異誘発法により導入した。VH配
列については、24位（Kabat番号）をValからAlaに、75
位（Kabat番号）をLysからSerに変化し、次に、アミノ
酸27-30位および94位を、NEWM配列に変異により戻し
た。最終のヒト化VH配列[配列番号5]を図８のパネルＡ
に示す。VK配列については、同じ２工程のPCR特異変異
誘発法を使用してさらなる改変を導入した。最終のヒト
化VK配列[配列番号6]を図８のパネルＢに示す。
【００４６】ヒト化HP1/2の完全なVHおよびVK領域を、
適切な発現ベクターにクローニングした。次に、適切な
ヒトIgG1、IgG4あるいはκ定常領域を、ネズミ可変領域
に関して適切なリーディングフレーム中でベクターに加
えた。次に、ベクターをYB2/0ray骨髄腫細胞（ATCCから
入手可能）に共形質導入し、次に両ベクターの存在につ
いて選択した。細胞上清のELISA分析は、これらの細胞
で産生されたヒト化抗体が、少なくともネズミHP1/2と
等しい効力であることを証明した。このヒト化抗体を発
現する細胞株を、1992年11月3日にATCCに寄託し、受託
番号CRL11175が与えられた。
適切な発現ベクターにクローニングした。次に、適切な
ヒトIgG1、IgG4あるいはκ定常領域を、ネズミ可変領域
に関して適切なリーディングフレーム中でベクターに加
えた。次に、ベクターをYB2/0ray骨髄腫細胞（ATCCから
入手可能）に共形質導入し、次に両ベクターの存在につ
いて選択した。細胞上清のELISA分析は、これらの細胞
で産生されたヒト化抗体が、少なくともネズミHP1/2と
等しい効力であることを証明した。このヒト化抗体を発
現する細胞株を、1992年11月3日にATCCに寄託し、受託
番号CRL11175が与えられた。
【００４７】実施例７
ヒト化抗VLA-4抗体による処置から得られた幹細胞の末
梢化 実施例６に従って調製したヒト化抗VLA-4抗体を、幹細
胞の末梢化について試験した。ヒヒモデルを、３日毎日
の抗体注射に、再度使用した。この結果を図９に示す。
ネズミ抗体について以前に示したように、ヒト化抗VLA-
4抗体は、末梢化CFUの多大の増加を生じた。従って、ヒ
ト化VLA-4抗体は、ネズミモノクローナル抗体HP1/2と同
じ様式で、幹細胞および前駆細胞の末梢化を起こし得
る。この結果は、ヒト化抗体もまた、モノクローナル抗
体のように、幹細胞の末梢化に対して、G-CSFとの組合
せによって相乗的に作用し得ることを示唆する。
梢化 実施例６に従って調製したヒト化抗VLA-4抗体を、幹細
胞の末梢化について試験した。ヒヒモデルを、３日毎日
の抗体注射に、再度使用した。この結果を図９に示す。
ネズミ抗体について以前に示したように、ヒト化抗VLA-
4抗体は、末梢化CFUの多大の増加を生じた。従って、ヒ
ト化VLA-4抗体は、ネズミモノクローナル抗体HP1/2と同
じ様式で、幹細胞および前駆細胞の末梢化を起こし得
る。この結果は、ヒト化抗体もまた、モノクローナル抗
体のように、幹細胞の末梢化に対して、G-CSFとの組合
せによって相乗的に作用し得ることを示唆する。
【００４８】実施例８
抗VLA-4ネズミFabフラグメントによる処置から得た幹細
胞の末梢化 ネズミ抗体HP1/2由来のFabフラグメントを、幹細胞およ
び前駆細胞を末梢化する能力について試験した。実験
を、1mg/kgのFabフラグメントを、３日間、１日２回投
与して実施した。この場合には、程度の低い効果（ヒト
化抗体あるいはモノクローナル抗体に比較して）が認め
られ、これはFabフラグメントの迅速なクリアランスに
起因する。程度は低いが、観察された特徴的なBFU-eの
増加により、この結果を確認する。この結果は、抗VLA-
4抗体フラグメントが、幹細胞および前駆細胞の末梢化
を引き起こし得ることを実証する。このことは、抗VLA-
4Fabフラグメントが、幹細胞の末梢化に対してG-CSFと
の組合せによって相乗的に作用し得ることを示唆する。
さらに、Fabフラグメントが、抗原結合以外になんらか
のエフェクター機能を有することは知られていないの
で、この結果は、VLA-4に結合し、そのことによりVCAM-
1との相互作用を阻止し得る任意の阻止因子が、幹細胞
を末梢化し、そして、そうすることにおいて幹細胞増殖
を促進する因子と相乗的に作用し得ることを示唆する。
胞の末梢化 ネズミ抗体HP1/2由来のFabフラグメントを、幹細胞およ
び前駆細胞を末梢化する能力について試験した。実験
を、1mg/kgのFabフラグメントを、３日間、１日２回投
与して実施した。この場合には、程度の低い効果（ヒト
化抗体あるいはモノクローナル抗体に比較して）が認め
られ、これはFabフラグメントの迅速なクリアランスに
起因する。程度は低いが、観察された特徴的なBFU-eの
増加により、この結果を確認する。この結果は、抗VLA-
4抗体フラグメントが、幹細胞および前駆細胞の末梢化
を引き起こし得ることを実証する。このことは、抗VLA-
4Fabフラグメントが、幹細胞の末梢化に対してG-CSFと
の組合せによって相乗的に作用し得ることを示唆する。
さらに、Fabフラグメントが、抗原結合以外になんらか
のエフェクター機能を有することは知られていないの
で、この結果は、VLA-4に結合し、そのことによりVCAM-
1との相互作用を阻止し得る任意の阻止因子が、幹細胞
を末梢化し、そして、そうすることにおいて幹細胞増殖
を促進する因子と相乗的に作用し得ることを示唆する。
【００４９】本発明は、造血幹細胞を含む、CD34+細胞
を末梢化するための方法を提供する。第一の局面では、
その方法は、CD34+細胞表面のVLA-4抗原の阻止因子を投
与する工程を包含する。第二の局面では、その方法は、
CD34+細胞表面のVLA-4抗原の阻止因子を投与すること、
および、インビボにおいてCD34+細胞増殖の刺激因子を
投与することを包含する。本発明の方法は、癌治療ある
いはAIDS治療、および遺伝子療法に有用である。
を末梢化するための方法を提供する。第一の局面では、
その方法は、CD34+細胞表面のVLA-4抗原の阻止因子を投
与する工程を包含する。第二の局面では、その方法は、
CD34+細胞表面のVLA-4抗原の阻止因子を投与すること、
および、インビボにおいてCD34+細胞増殖の刺激因子を
投与することを包含する。本発明の方法は、癌治療ある
いはAIDS治療、および遺伝子療法に有用である。
【００５０】
【発明の効果】本発明は、末梢血中の造血幹細胞および
CD34+細胞数を増加させる新規な方法を提供する。
CD34+細胞数を増加させる新規な方法を提供する。
【００５１】
【００５２】
【表１】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｃは、赤毛ザル（パネルＡおよび
Ｃ）あるいはヒヒ（パネルＢ）の抗VLA-4抗体（ネズミ
モノクローナル抗体HP1/2）による処置前後の、末梢血
中の全白血球およびCFUのプロフィールを示す。破線
は、右側の縦軸に表示されているように、全白血球数を
示す。斜線の四角は、左側の縦軸に記録されているよう
に、CFU-GMを示す。黒白角は、左側の縦軸に表示されて
いるように、BFUeを示す。下向きの矢印は、抗体の投与
点を示す。横軸は、抗VLA-4抗体の最初の投与前後の日
数を示す。
Ｃ）あるいはヒヒ（パネルＢ）の抗VLA-4抗体（ネズミ
モノクローナル抗体HP1/2）による処置前後の、末梢血
中の全白血球およびCFUのプロフィールを示す。破線
は、右側の縦軸に表示されているように、全白血球数を
示す。斜線の四角は、左側の縦軸に記録されているよう
に、CFU-GMを示す。黒白角は、左側の縦軸に表示されて
いるように、BFUeを示す。下向きの矢印は、抗体の投与
点を示す。横軸は、抗VLA-4抗体の最初の投与前後の日
数を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｃは、赤毛ザル（パネルＡおよび
Ｃ）あるいはヒヒ（パネルＢ）の抗VLA-4抗体（ネズミ
モノクローナル抗体HP1/2）による処置前後の、末梢血
中の全白血球およびCFUのプロフィールを示す。破線
は、右側の縦軸に表示されているように、全白血球数を
示す。斜線の四角は、左側の縦軸に記録されているよう
に、CFU-GMを示す。黒白角は、左側の縦軸に表示されて
いるように、BFUeを示す。下向きの矢印は、抗体の投与
点を示す。横軸は、抗VLA-4抗体の最初の投与前後の日
数を示す。
Ｃ）あるいはヒヒ（パネルＢ）の抗VLA-4抗体（ネズミ
モノクローナル抗体HP1/2）による処置前後の、末梢血
中の全白血球およびCFUのプロフィールを示す。破線
は、右側の縦軸に表示されているように、全白血球数を
示す。斜線の四角は、左側の縦軸に記録されているよう
に、CFU-GMを示す。黒白角は、左側の縦軸に表示されて
いるように、BFUeを示す。下向きの矢印は、抗体の投与
点を示す。横軸は、抗VLA-4抗体の最初の投与前後の日
数を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜Ｃは、赤毛ザル（パネルＡおよび
Ｃ）あるいはヒヒ（パネルＢ）の抗VLA-4抗体（ネズミ
モノクローナル抗体HP1/2）による処置前後の、末梢血
中の全白血球およびCFUのプロフィールを示す。破線
は、右側の縦軸に表示されているように、全白血球数を
示す。斜線の四角は、左側の縦軸に記録されているよう
に、CFU-GMを示す。黒白角は、左側の縦軸に表示されて
いるように、BFUeを示す。下向きの矢印は、抗体の投与
点を示す。横軸は、抗VLA-4抗体の最初の投与前後の日
数を示す。
Ｃ）あるいはヒヒ（パネルＢ）の抗VLA-4抗体（ネズミ
モノクローナル抗体HP1/2）による処置前後の、末梢血
中の全白血球およびCFUのプロフィールを示す。破線
は、右側の縦軸に表示されているように、全白血球数を
示す。斜線の四角は、左側の縦軸に記録されているよう
に、CFU-GMを示す。黒白角は、左側の縦軸に表示されて
いるように、BFUeを示す。下向きの矢印は、抗体の投与
点を示す。横軸は、抗VLA-4抗体の最初の投与前後の日
数を示す。
【図２】図２は、抗CD18モノクローナル抗体60.3での動
物処置前後の、末梢血中の全白血球およびCFUのプロフ
ィールを示す。全ての記号は、図１の通りである。
物処置前後の、末梢血中の全白血球およびCFUのプロフ
ィールを示す。全ての記号は、図１の通りである。
【図３】図３は、G-CSFおよび抗VLA-4モノクローナル抗
体HP1/2による組合せ処置の結果を示す。パネルＡで
は、細い下向きの矢印がG-CSF投与点を示し、太い下向
きの矢印が抗体投与点を示し、（三角を伴った）点線が
全リンパ球数を示す以外は、全ての記号は、図１の通り
である。パネルＢでは、同じ記号が、GCSFのみで処置さ
れたコントロール動物の結果を示す。
体HP1/2による組合せ処置の結果を示す。パネルＡで
は、細い下向きの矢印がG-CSF投与点を示し、太い下向
きの矢印が抗体投与点を示し、（三角を伴った）点線が
全リンパ球数を示す以外は、全ての記号は、図１の通り
である。パネルＢでは、同じ記号が、GCSFのみで処置さ
れたコントロール動物の結果を示す。
【図４】図４は、GCSFおよびHP1/2抗体での組合せ処置
（パネルＡ）、あるいはGCSFのみでの処置（パネルＢ）
の結果である、高増殖可能（HPP）前駆細胞（密集増殖
の直径が0.5mmを超えるコロニー）を示す。記号は図３
の通りである。
（パネルＡ）、あるいはGCSFのみでの処置（パネルＢ）
の結果である、高増殖可能（HPP）前駆細胞（密集増殖
の直径が0.5mmを超えるコロニー）を示す。記号は図３
の通りである。
【図５Ａ】図５Ａおよび図５Ｂは、抗VLA-4ネズミモノ
クローナル抗体HP1/2の重鎖および軽鎖の可変領域をコ
ードするヌクレオチド配列を示す。パネルＡは、最初の
コドンの開始を示す最初のヌクレオチドを伴った、重鎖
可変領域をコードするヌクレオチド配列である。パネル
Ｂは、最初のコドンの開始を示す最初のヌクレオチドを
伴った、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列で
ある。
クローナル抗体HP1/2の重鎖および軽鎖の可変領域をコ
ードするヌクレオチド配列を示す。パネルＡは、最初の
コドンの開始を示す最初のヌクレオチドを伴った、重鎖
可変領域をコードするヌクレオチド配列である。パネル
Ｂは、最初のコドンの開始を示す最初のヌクレオチドを
伴った、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列で
ある。
【図５Ｂ】図５Ａおよび図５Ｂは、抗VLA-4ネズミモノ
クローナル抗体HP1/2の重鎖および軽鎖の可変領域をコ
ードするヌクレオチド配列を示す。パネルＡは、最初の
コドンの開始を示す最初のヌクレオチドを伴った、重鎖
可変領域をコードするヌクレオチド配列である。パネル
Ｂは、最初のコドンの開始を示す最初のヌクレオチドを
伴った、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列で
ある。
クローナル抗体HP1/2の重鎖および軽鎖の可変領域をコ
ードするヌクレオチド配列を示す。パネルＡは、最初の
コドンの開始を示す最初のヌクレオチドを伴った、重鎖
可変領域をコードするヌクレオチド配列である。パネル
Ｂは、最初のコドンの開始を示す最初のヌクレオチドを
伴った、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列で
ある。
【図６】図６は、5-フルオロウラシルおよび抗VLA-4ネ
ズミモノクローナル抗体HP1/2による組合せ処置の結果
を示す。記号は、図３に記載の通りである。パネルA
は、組合せの結果を示し、対してパネルＢは、5-フルオ
ロウラシル処置のみの結果を示す。
ズミモノクローナル抗体HP1/2による組合せ処置の結果
を示す。記号は、図３に記載の通りである。パネルA
は、組合せの結果を示し、対してパネルＢは、5-フルオ
ロウラシル処置のみの結果を示す。
【図７Ａ】図７Ａおよび図７Ｂは、そこに移植されたネ
ズミHP1/2からのCDR-コーディング配列を有する、VH-コ
ーディング領域およびVK-コーディング領域のヌクレオ
チド配列を示す。パネルＡは、移植VH配列を示す。パネ
ルＢは、移植VK配列を示す。
ズミHP1/2からのCDR-コーディング配列を有する、VH-コ
ーディング領域およびVK-コーディング領域のヌクレオ
チド配列を示す。パネルＡは、移植VH配列を示す。パネ
ルＢは、移植VK配列を示す。
【図７Ｂ】図７Ａおよび図７Ｂは、そこに移植されたネ
ズミHP1/2からのCDR-コーディング配列を有する、VH-コ
ーディング領域およびVK-コーディング領域のヌクレオ
チド配列を示す。パネルＡは、移植VH配列を示す。パネ
ルＢは、移植VK配列を示す。
ズミHP1/2からのCDR-コーディング配列を有する、VH-コ
ーディング領域およびVK-コーディング領域のヌクレオ
チド配列を示す。パネルＡは、移植VH配列を示す。パネ
ルＢは、移植VK配列を示す。
【図８Ａ】図８Ａおよび図８Ｂは、ヒト化抗VLA-4抗体h
HP1/2の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするヌクレ
オチド配列を示す。パネルＡは、VH領域をコードするヌ
クレオチド配列である。パネルＢは、VK領域をコードす
るヌクレオチド配列である。
HP1/2の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするヌクレ
オチド配列を示す。パネルＡは、VH領域をコードするヌ
クレオチド配列である。パネルＢは、VK領域をコードす
るヌクレオチド配列である。
【図８Ｂ】図８Ａおよび図８Ｂは、ヒト化抗VLA-4抗体h
HP1/2の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするヌクレ
オチド配列を示す。パネルＡは、VH領域をコードするヌ
クレオチド配列である。パネルＢは、VK領域をコードす
るヌクレオチド配列である。
HP1/2の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするヌクレ
オチド配列を示す。パネルＡは、VH領域をコードするヌ
クレオチド配列である。パネルＢは、VK領域をコードす
るヌクレオチド配列である。
【図９】図９は、ヒト化抗VLA-4抗体hHP1/2による処置
結果を示す。記号は、図３に記載の通りである。
結果を示す。記号は、図３に記載の通りである。
【図１０】図１０は、抗VLA-4抗体HP1/2のネズミFabフ
ラグメントによる処置結果を示す。記号は、図３に記載
の通りである。
ラグメントによる処置結果を示す。記号は、図３に記載
の通りである。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 37/04
37/04 43/00
43/00 １０５
１０５ Ｃ０７Ｋ 16/18 ＺＮＡ
// Ｃ０７Ｋ 16/18 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02
(72)発明者 タリア パパイアンノポウロウ
アメリカ合衆国 ワシントン 98144，シ
アトル，カスケディア アベニュー サウ
ス 3336
Ｆターム(参考） 4C084 AA01 AA02 AA13 AA18 BA01
BA08 BA22 BA23 CA18 CA34
CA36 DA01 DA12 DC50 MA02
NA14 ZB091 ZB222 ZB261
ZC551
4C086 AA01 AA02 BC43 MA02 MA04
NA14 ZB09 ZB22 ZB27 ZC55
4H045 AA11 DA76 EA24 FA74
Claims (31)
- 【請求項１】 ＣＤ３４＋細胞を末梢化するための組成
物であって、ＶＣＡＭ−１またはフィブロネクチンに対
するＣＤ３４＋細胞表面のＶＬＡ−４抗原の結合を阻止
する因子を含む、組成物。 - 【請求項２】 前記因子が、必要に応じて、ヒト、キメ
ラ、単鎖、あるいはヒト化され得る抗ＶＬＡ−４あるい
は抗ＶＣＡＭ−１抗体、あるいは、それらのＦａｂ、Ｆ
ａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、あるいはＦ（ｖ）フラグメン
ト、フィブロネクチン、代替スプライス非ＩＩＩ型接続
セグメントを有するフィブロネクチン、アミノ酸配列Ｅ
ＩＬＤＶあるいはＶＬＡ−４仲介付着を阻止する同様の
同類置換アミノ酸配列を含むフィブロネクチンペプチ
ド、可溶性ＶＣＡＭ−１、二官能性ＶＣＡＭ−１／Ｉｇ
融合タンパク質、およびＶＣＡＭ−１ペプチドからなる
群より選択される、請求項１に記載の組成物。 - 【請求項３】 前記ＣＤ３４＋細胞の少なくとも一部
が、造血幹細胞である、請求項１に記載の組成物。 - 【請求項４】 前記組成物が、ＣＤ３４＋細胞増殖の刺
激因子とともに投与される、請求項１に記載の組成物。 - 【請求項５】 前記組成物が、ＣＤ３４＋細胞増殖の刺
激因子とともに投与される、請求項２に記載の組成物。 - 【請求項６】 前記組成物が、造血幹細胞増殖の刺激因
子とともに投与される、請求項３に記載の組成物。 - 【請求項７】 前記刺激が、５−フルオロウラシル、あ
るいは、Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−
ＣＳＦ、Ｔ−ＳＣＦ、ＳＣＰＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、
ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＩＬ−１１から
なる群より選択されるサイトカインに仲介される、請求
項４に記載の組成物。 - 【請求項８】 前記刺激が、５−フルオロウラシル、あ
るいは、Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−
ＣＳＦ、Ｔ−ＳＣＦ、ＳＣＰＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、
ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＩＬ−１１から
なる群より選択されるサイトカインに仲介される、請求
項５に記載の組成物。 - 【請求項９】 前記刺激が、５−フルオロウラシル、あ
るいは、Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−
ＣＳＦ、Ｔ−ＳＣＦ、ＳＣＰＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、
ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、またはＩＬ−１１から
なる群より選択されるサイトカインに仲介される、請求
項６に記載の組成物。 - 【請求項１０】 前記サイトカインがＧ−ＣＳＦであ
る、請求項７に記載の組成物。 - 【請求項１１】 前記サイトカインがＧ−ＣＳＦであ
る、請求項８に記載の組成物。 - 【請求項１２】 前記サイトカインがＧ−ＣＳＦであ
る、請求項９に記載の組成物。 - 【請求項１３】 前記組成物が、前記サイトカインの投
与後に投与される、請求項１０に記載の組成物。 - 【請求項１４】 前記組成物が、前記サイトカインの投
与後に投与される、請求項１１に記載の組成物。 - 【請求項１５】 癌を治療するための化学療法および／
または放射線療法を受ける前の患者から、ＣＤ３４＋細
胞を含有する末梢血を得るための組成物であって、該組
成物は、ＶＣＡＭ−１またはフィブロネクチンに対する
ＣＤ３４＋細胞表面のＶＬＡ−４抗原の結合を阻止する
因子を含み、ＣＤ３４＋細胞を含有する該得られた末梢
血は、該療法を受けた患者に戻すための濃縮ＣＤ３４＋
細胞を得るために使用される、組成物。 - 【請求項１６】 癌を治療するための化学療法および／
または放射線療法を受ける前の患者から、白血球搬出に
よってＣＤ３４＋細胞を含有する末梢血を得るための組
成物であって、該組成物は、ＶＣＡＭ−１またはフィブ
ロネクチンに対するＣＤ３４＋細胞表面のＶＬＡ−４抗
原の結合を阻止する因子を含み、ＣＤ３４＋細胞を含有
する該得られた末梢血は、該療法を受けた患者に戻すた
めの濃縮ＣＤ３４＋細胞を得るために使用される、組成
物。 - 【請求項１７】 癌を治療するための化学療法および／
または放射線療法を受ける前の患者から、エキソビボに
おいて増量されるためのＣＤ３４＋細胞を含有する末梢
血を得るための組成物であって、該組成物は、ＶＣＡＭ
−１またはフィブロネクチンに対するＣＤ３４＋細胞表
面のＶＬＡ−４抗原の結合を阻止する因子を含み、ＣＤ
３４＋細胞を含有する該得られた末梢血は、該療法を受
けた患者に戻すための濃縮ＣＤ３４＋細胞を得るために
使用される、組成物。 - 【請求項１８】 ＣＤ３４＋細胞増殖の刺激因子をさら
に含有する、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の
組成物。 - 【請求項１９】 癌を治療するための化学療法および／
または放射線療法を受ける前の患者から、ＣＤ３４＋細
胞を含有する末梢血を得るためのキットであって、該キ
ットは、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の組成
物およびＣＤ３４＋細胞増殖の刺激因子を備える、キッ
ト。 - 【請求項２０】 ＡＩＤＳを治療するための化学療法お
よび／または放射線療法を受ける前の患者から、ＣＤ３
４＋細胞を含有する末梢血を得るための組成物であっ
て、該組成物は、ＶＣＡＭ−１またはフィブロネクチン
に対するＣＤ３４＋細胞表面のＶＬＡ−４抗原の結合を
阻止する因子を含み、ＣＤ３４＋細胞を含有する該得ら
れた末梢血は、該療法を受けた患者に戻すための濃縮Ｃ
Ｄ３４＋細胞を得るために使用される、組成物。 - 【請求項２１】 ＡＩＤＳを治療するための化学療法お
よび／または放射線療法を受ける前の患者から、白血球
搬出によってＣＤ３４＋細胞を含有する末梢血を得るた
めの組成物であって、該組成物は、ＶＣＡＭ−１または
フィブロネクチンに対するＣＤ３４＋細胞表面のＶＬＡ
−４抗原の結合を阻止する因子を含み、ＣＤ３４＋細胞
を含有する該得られた末梢血は、該療法を受けた患者に
戻すための濃縮ＣＤ３４＋細胞を得るために使用され
る、組成物。 - 【請求項２２】 ＡＩＤＳを治療するための化学療法お
よび／または放射線療法を受ける前の患者から、エキソ
ビボにおいて増量されるためのＣＤ３４＋細胞を含有す
る末梢血を得るための組成物であって、該組成物は、Ｖ
ＣＡＭ−１またはフィブロネクチンに対するＣＤ３４＋
細胞表面のＶＬＡ−４抗原の結合を阻止する因子を含
み、ＣＤ３４＋細胞を含有する該得られた末梢血は、該
療法を受けた患者に戻すための濃縮ＣＤ３４＋細胞を得
るために使用される、組成物。 - 【請求項２３】 抗ＨＩＶ因子をさらに含有する、請求
項２０〜２２のいずれか１項に記載の組成物。 - 【請求項２４】 ＣＤ３４＋細胞増殖の刺激因子をさら
に含有する、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の
組成物。 - 【請求項２５】 ＡＩＤＳを治療するための化学療法お
よび／または放射線療法を受ける前の患者から、ＣＤ３
４＋細胞を含有する末梢血を得るためのキットであっ
て、該キットは、請求項２０〜２２のいずれか１項に記
載の組成物、ならびに抗ＨＩＶ因子およびＣＤ３４＋細
胞増殖の刺激因子から選択される少なくとも１つの因子
を備える、キット。 - 【請求項２６】 遺伝子疾患または後天性疾患を治療す
るための遺伝子療法を受ける前の患者から、ＣＤ３４＋
細胞を含有する末梢血を得るための組成物であって、該
組成物は、ＶＣＡＭ−１またはフィブロネクチンに対す
るＣＤ３４＋細胞表面のＶＬＡ−４抗原の結合を阻止す
る因子を含み、ＣＤ３４＋細胞を含有する該得られた末
梢血は、濃縮ＣＤ３４＋細胞を得るために使用され、該
濃縮ＣＤ３４＋細胞は、該遺伝子疾患または後天性疾患
を改善する遺伝子でトランスフェクトされ、そして該療
法を受けた該患者に戻される、組成物。 - 【請求項２７】 遺伝子疾患または後天性疾患を治療す
るための遺伝子療法を受ける前の患者から、白血球搬出
によってＣＤ３４＋細胞を含有する末梢血を得るための
組成物であって、該組成物は、ＶＣＡＭ−１またはフィ
ブロネクチンに対するＣＤ３４＋細胞表面のＶＬＡ−４
抗原の結合を阻止する因子を含み、ＣＤ３４＋細胞を含
有する該得られた末梢血は、濃縮ＣＤ３４＋細胞を得る
ために使用され、該濃縮ＣＤ３４＋細胞は、該遺伝子疾
患または後天性疾患を改善する遺伝子でトランスフェク
トされ、そして該療法を受けた該患者に戻される、組成
物。 - 【請求項２８】 遺伝子疾患または後天性疾患を治療す
るための遺伝子療法を受ける前の患者から、エキソビボ
において増量されるためのＣＤ３４＋細胞を含有する末
梢血を得るための組成物であって、該組成物は、ＶＣＡ
Ｍ−１またはフィブロネクチンに対するＣＤ３４＋細胞
表面のＶＬＡ−４抗原の結合を阻止する因子を含み、Ｃ
Ｄ３４＋細胞を含有する該得られた末梢血は、濃縮ＣＤ
３４＋細胞を得るために使用され、該濃縮ＣＤ３４＋細
胞は、該遺伝子疾患または後天性疾患を改善する遺伝子
でトランスフェクトされ、そして該療法を受けた該患者
に戻される、組成物。 - 【請求項２９】 ＣＤ３４＋細胞増殖の刺激因子をさら
に含有する、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の
組成物。 - 【請求項３０】 遺伝子疾患または後天性疾患を治療す
るための遺伝子療法を受ける前の患者から、ＣＤ３４＋
細胞を含有する末梢血を得るためのキットであって、該
キットは、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の組
成物およびＣＤ３４＋細胞増殖の刺激因子を備える、キ
ット。 - 【請求項３１】 請求項１に記載の組成物およびＣＤ３
４＋細胞増殖の刺激因子を備える、キット。
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