PL204277B1 - Białko fuzyjne, jego bi-lub oligomer, ich zastosowania, sekwencja DNA, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza oraz środek farmaceutyczny - Google Patents

Białko fuzyjne, jego bi-lub oligomer, ich zastosowania, sekwencja DNA, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza oraz środek farmaceutyczny

Info

Publication number
PL204277B1
PL204277B1 PL358456A PL35845600A PL204277B1 PL 204277 B1 PL204277 B1 PL 204277B1 PL 358456 A PL358456 A PL 358456A PL 35845600 A PL35845600 A PL 35845600A PL 204277 B1 PL204277 B1 PL 204277B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
component
fusion protein
protein
gly
leu
Prior art date
Application number
PL358456A
Other languages
English (en)
Other versions
PL358456A1 (pl
Inventor
Jürg Tschopp
Pascal Schneider
Nils Holler
Original Assignee
Apoxis Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=7935052&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL204277(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Apoxis Sa filed Critical Apoxis Sa
Publication of PL358456A1 publication Critical patent/PL358456A1/pl
Publication of PL204277B1 publication Critical patent/PL204277B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/472—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/41—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a Myc-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/43—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a FLAG-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153 or CD154

Description

Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy bimerów lub oligomerów złożonych z bimerów, trimerów, kwadromerów lub pentamerów rekombinowanych białek fuzyjnych, przy czym rekombinowane białka fuzyjne posiadają przynajmniej jeden składnik A i przynajmniej jeden składnik B. Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania dimerów lub oligomerów tego rodzaju do otrzymywania leku i/lub ich zastosowania w diagnostyce in vitro. Ponadto wynalazek dotyczy takż e białek fuzyjnych posiadających jeden składnik A i jeden składnik B, przy czym składnik B zawiera segment multimeryzujący i oligomeryzujący, lub funkcjonalną pochodną segmentu tego typu białka, wybraną z grupy składającej się rodziny białek C1q lub kolektyn. Sekwencje DNA kodujące białko fuzyjne tego typu i wektory ekspresyjne i komórki gospodarza zawierające zawierających tą sekwencję DNA i/lub wektor ekspresyjny są także przedmiotem tego wynalazku.
Białka występujące fizjologicznie jako dimery, trimery, kwadromery lub pentamery, występują w naturze w duż ej iloś ci. Ze względu na oddział ywania na powierzchniach tych bia ł ek, które dimeryzują lub multimeryzują w roztworze, może dojść do spontanicznej agregacji białek, lub nawet, przykładowo, do opóźnionej kinetycznie agregacji, co jest uzależnione od stężenia lub otoczenia. Odpowiedzialne za to są oddziaływania hydrofobowe, mostki wodorowe i/lub siły Coloumb'a.
Jednakże, obok tego, w pewnych białkach obecne są motywy strukturalne, które prowadzą do tworzenia specyficznych struktur czwartorzędowych i dzięki temu dimerów lub multimerów białka. Tworzenie struktury czwartorzędowej jest warunkowane określonymi sekwencjami aminokwasowymi białek, które tworzą te dimery lub multimery. Jako strukturę czwartorzędową można wymienić przykładowo helisy superskręcone, które powstają w wyniku dimeryzacji lub multimeryzacji białek poprzez oddziaływania specyficznych helis α, które występują dla każdego białka tworzącego strukturę superskręconą. Helisa superskręcona będąca międzycząsteczkową „domeną dimeryzującą lub multimeryzującą białek jest strukturą superhelisy złożoną z dwóch lub więcej wzajemnie splecionych helis. Tego rodzaju motywy superskręcone są wykrywane zwłaszcza w zewnątrzkomórkowych dimerach lub multimerach białkowych, a w szczególności w przypadku białek lub kompleksów białkowych tkanek łącznych.
Beck i wsp. (J.Mol.Biol. (1996) 256, 909-23) opisuje przykładowo białko tkanki łącznej, tak zwane białko Cartilage Matrix Protein (CMP), które ulega agregacji do postaci homotrimeru potrójnej helisy, która jest wynikiem agregacji trzech komplementarnych helis (każda jest składnikiem polipeptydu), przyjmuje konformację superhelisy. Charakterystyką sekwencji aminokwasowej helisy tego typu tworzącej potrójną helisę jest układ heptanowy (abcdefg)h. Aminokwasy znajdujące się w pozycji a i d zwykle posiadają niepolarne łańcuchy boczne i dzięki temu zapewnia się tworzenie opisanej powyżej struktury superhelikalnej, w tym przypadku potrójnej helisy tworzonej przez trzy helisy.
Ponadto, w literaturze uznaje się, że inne białko macierzy zewnątrzkomórkowej (chrząstkowe oligomeryczne białko macierzy, ang. cartilage oligomeric matrix protein) (COMP) jest w rzeczywistości pięcioma helisami tworzącymi pięciokrotną superskręconą helisę, która oddziaływuje z innymi dzięki czemu jest zdolna do tworzenia pentamerów (Kajava, PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 24:218-226 (1996); Malashkevich i wsp., Science, Vol. 274, 761-765, 1996).
Obok białek macierzy COMP i CMP, które nie należą do białek z rodziny kolagenu, występowanie specyficznych strukturalnych zdolności do multimeryzacji poprzez tworzenie struktur czwartorzędowych stwierdzono również wśród białek należących do rodziny kolagenu. Struktura włókien kolagenu charakteryzuje się występowaniem tropokolagenu, który składa się z trzech helikalnie skręconych polipeptydów. Protofibrylla włosów powstaje również z potrójnej helisy α-keratyny o konformacji superskręconej helisy, tym razem lewoskrętnej.
Dla zwiększenia powinowactwa ligandów, Terskikh i wsp. (PNAS, Vol. 94, 1663-1668, 1997) sugeruje zastosowanie białek fuzyjnych z krótkimi peptydami w roli ligandów i superskręconą domeną białka macierzy COMP. Zwiększone powinowactwo mogło być zweryfikowane dla tych pentamerów, przy czym tą drogą nie można uzyskać agregatów wyższego rzędu.
Ponadto, ze względu na homologie sekwencji w odpowiednich odcinkach sekwencji multimeryzujących, białka C1q, kolageny α 1 (X) , α2 (VII), białko hibernacyjne, ACRP30, białko strukturalne ucha środkowego, cerebellina i multimeryna zostały włączone do jednej rodziny białkowej określanej jako rodzina C1q (Kischore i Reid, Immunopharmacol., 42 (1999) 15-21), której członkowie tworzą struktury dimerowe lub multimerowe. Wśród białek multimeryzujących należących do tej rodziny, przykładowo struktury białka C1q, które jest spokrewnione z układem dopełniacza, cechą charakterystyczPL 204 277 B1 ną jest występowanie monomerów posiadających globularną, tak zwaną domenę główki, i „podobną do kolagenu sekcję sekwencji helikalnej. Monomery tworzą trimery za pomocą tych odcinków sekwencji helikalnych, które tworzą potrójną helisę superskręconą. Sześć takich trimerów C1q tworzy oligomer, przy czym oligomeryzacja tych białkowych trimerów opiera się na oddziaływaniach pomiędzy poszczególnymi superskręconymi potrójnymi helisami. Wynikiem tego jest uzyskanie konformacji strukturalnej białka lub multimeryzującego (oligomeryzującego) kompleksu białkowego C1q określanej jako „bukiet, przy czym stwierdzono, że 18 globularnych, C-końcowych domen główkowych jest połączonych w heksamerze trimerów.
Podobna struktura, jaką zaobserwowano dla białka C1q, może być także obserwowana w przypadku białka ACRP30, które jest również białkiem z rodziny C1q (Hu i wsp., J. Biol. Chem., Vol. 271, nr 18, 10697-10703, 1996). To białko surowicy, które jest wydzielane przez komórki tłuszczowe, jest również prawdopodobnie kwadromerem trimerów, przy czym, podobnie jak w przypadku białka C1q, globularne C-końcowe domeny są połączone poprzez potrójne helisy podobne do kolagenu. Prawdopodobnie cztery z tych potrójnych helis ostatecznie tworzy oligomer poprzez odpowiednie oddziaływania. W publikacji Shapiro i Scherer (Current Biology 1998, 8:335-338) struktura homotrimerów ACRP30 została wykazana za pomocą analizy rentgenowskiej.
Ponadto, białka należące do klasy kolektyn są znane w literaturze jako charakteryzujące się posiadaniem domeny kolageno-podobnej, regionu szyjki i dodatkowo C-końcowej domeny globularnej wiążącej lektynę. Kolektyny występują także fizjologicznie jako oligomery trimerów. Przykładowo, płucny surfaktant białko A (SP-A) i białko wiążące mannozę (MBP), obydwa należące do rodziny kolektyn, tworzą trimery poprzez oddziaływania ich domen kolageno-podobnych i są wykrywane w postaci heksamerów trimerów (Epstein i wsp., Current Oinion in Immunology, vol. 8, nr 1, 1996, 29-35). Zgodnie z powyższym, białka znane jako kolektyny tworzą oligomery (np. hesamery) multimerów (np. trimerów).
Wykazano również, że liczne białka działające jako cząsteczki sygnałowe mogą przenosić sygnał biologiczny tylko pod pewnymi warunkami. Przykładowo, związany z błoną FasL jest aktywny biologicznie tj. wywołuje apoptozę, natomiast po odtrawieniu zewnątrzkomórkowego segmentu białka (tak zwany FasL) ta frakcja nie związana z błoną sFasL nie może już wywierać działania apoptotycznego na komórki docelowe. Publikacja Schneider i wsp. (J. Exp. Med., vol. 187, nr 8, 1998, 1205-1213) stwierdza, że biologiczny efekt uzyskany wobec trimerów sFasL, który jak opisano powyżej jest uzyskiwany po odtrawieniu fragmentów białka związanych z błoną, może być w rzeczywistości reaktywowany z powrotem do ich funkcji fizjologicznych poprzez zastosowanie przeciwciał sieciujących. W tym celu skonstruowano białko fuzyjne składające się z tworzącej trimery domeny FasL, krótkiego łącznika i sekwencji znacznikowej (z sekwencją znacznikową (jednoliterowy kod aminokwasów) DYKDDDDK), poddawano ekspresji, a następnie tego rodzaju białko fuzyjne, które nie jest zdolne do tworzenia trimerów (tj. nie wykazuje specyficznych oddziaływań struktury czwartorzędowej dających tworzenie struktury czwartorzędowej) było sieciowane za pomocą przeciwciał skierowanych wobec sekwencji znacznikowej.
Tego rodzaju cząsteczki sFasL sieciowane przez przeciwciała wykazują znaczny wzrost specyficznej aktywności apoptotycznej w porównaniu z nie sieciowanymi trimerami sFasL. Tego rodzaju podejście ma jednak pewne wady, co sugerują już Schneider i wsp., mianowicie konieczność stosowania obok rekombinowanych, nie wiążących się z błoną białek FasL z domeną tworzącą trimery, specyficznych przeciwciał, czyli innymi słowy, zwiększenie aktywności biologicznej może być uzyskane jedynie poprzez dostarczenie dodatkowej frakcji cząsteczek. Ponadto, zgodnie z teorią sugerowaną przez Schneider i wsp. nie jest możliwe zapewnienie dokładnie zaplanowanego lub ustalonego stopnia oligomeryzacji multimerów. Przeciwciała mogą bowiem powodować, że trimery FasL zwiążą się w dimery lub nawet doprowadzić do powstania szerokiego spektrum kompleksów oligomerowych w wyniku następującej agregacji SFasL/przeciwciało. Ze względu na to, ż e pożądane jest otrzymywanie dokładnie zdefiniowanego produktu z możliwie największą wydajnością przykładowo przeznaczonego do zastosowań medycznych, droga zaproponowana przez Schneider i wsp. reaktywacji i/lub zwiększania aktywności sFasL nie nadaje się do stosowania. Zatem, głównym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie związków, które będą pozbawione wad znanych ze stanu techniki, w szczególności będą posiadały zwiększoną aktywność biologiczną lub prowadziły do reaktywacji aktywności biologicznej.
Przedmiotem wynalazku jest białko fuzyjne, charakteryzujące się tym, że rekombinowane białko fuzyjne posiada składnik A i składnik B, przy czym składnik A jest zewnątrzkomórkową częścią cytoki4
PL 204 277 B1 ny TNF a składnik B posiada multimeryzujący lub oligomeryzujący segment białka ACRP30, który multimeryzuje lub oligomeryzuje białko fuzyjne bez udziału innych cząsteczek. Korzystnie białko fuzyjne według wynalazku charakteryzuje się tym że, składnik B zawiera przedstawioną na Fig. 6A sekwencję aminokwasów od 18 do 111 z mACRP30 lub przedstawioną na Fig. 6B sekwencję aminokwasów od 18 do 108 z hACRP30. Równie korzystnie białko fuzyjne według wynalazku charakteryzuje się tym, że składnik A jest segmentem cytokiny TNF wybranej z grupy zawierającej: CD40L, FasL, TRAIL, TNF, CD30L, OX40L, RANKL, TWEAK, Lta, Ltab2, LIGHT, CD27L, 41-BB, GITRL, APRIL, EDA, VEGI i BAFF.
W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku biał ko fuzyjne charakteryzuje się tym, ż e skł adnik A jest segmentem cytokiny TNF wybranej z grupy zawierającej: hFasL (aminokwasy od 139 do 261), hTRAIL (aminokwasy od 95 do 281), hCD40L (aminokwasy od 116 do 261) oraz m lub hTNF (aminokwasy od 77 do 235). W równie korzystnej realizacji wynalazku białko fuzyjne charakteryzuje się tym, że rekombinowane białka fuzyjne posiadają sekwencję łącznikową pomiędzy składnikiem A i składnikiem B.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest bi - lub oligomer rekombinowanych białek fuzyjnych przedstawionych powyżej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sekwencja DNA kodująca białko fuzyjne zdefiniowane wcześniej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor ekspresyjny charakteryzujący się tym, że zawiera sekwencję DNA zdefiniowaną wcześniej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarz charakteryzująca się tym, że jest transfekowana wektorem ekspresyjnym jak zdefiniowano wcześniej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie bi- lub oligomerów zdefiniowanych wcześniej do wytwarzania środków farmaceutycznych.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie bi- lub oligomerów jak zdefiniowano wcześniej do wytwarzania środków farmaceutycznych do leczenia zaburzeń zapalnych, chorób autoimmunologicznych, chorób opartych na reakcjach hiperapoptotycznych lub hipoapoptotycznych, chorób zakaźnych, zwłaszcza wirusowych chorób zakaźnych, nowotworów, zwłaszcza nowotworów układu limfatycznego i/lub zaburzeń endokrynologicznych.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie bi- lub oligomerów jak zdefiniowano wcześniej do wytwarzania środków farmaceutycznych do podawania doustnego i pozajelitowego.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie bi- lub oligomerów jak zdefiniowano wcześniej do diagnostyki in vitro.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest środek farmaceutyczny charakteryzujący się tym, że zawiera bi- lub oligomer zrekombinowanych białek fuzyjnych jak zdefiniowano wcześniej. Rozwiązanie wspomnianego na wstępie problemu ujawnione w niniejszym wynalazku dostarczają bimery lub oligomery dimerów, trimerów, kwadoromerów lub pentamerów rekombinowanych białek fuzyjnych, w których rekombinowane białka fuzyjne posiadają przynajmniej jeden składnik A i przynajmniej jeden składnik B, przy czym składnik A obejmuje białko lub segment białkowy spełniający funkcję biologiczną w szczególności funkcję wiążącą a składnik B obejmuje białko lub segment białkowy odpowiedzialny za tworzenie bimerów lub oligomerów dimerów, trimerów, kwadromerów lub pentamerów rekombinowanego białka fuzyjnego posiadających funkcję biologiczną bez działania innych cząsteczek, lub łączenie białek fuzyjnych w dimery lub multimery i jednocześnie wzajemne łączenie tych dimerów lub multimerów w bimery lub oligomery bez działania innych cząsteczek.
W opisie tego wynalazku okreś lenie dimer, trimer, kwadromer lub pentamer są uogólniane pojęciem multimer i oznacza to kompleksy białkowe złożone z dwóch, trzech, czterech lub pięciu złączonych polipeptydów (białek). W odróżnieniu od tego, agregaty wyższego stopnia, to znaczy połączenia dwóch lub więcej dimerów, trimerów, kwadromerów lub pentamerów określonych powyżej zostały nazwane bimerami lub oligomerami. Białka lub segmenty białkowe posiadające funkcję biologiczną (składnik A w białku fuzyjnym) są rozumiane w szczególności jako białka posiadające funkcję liganda, zwłaszcza dla przeciwciał lub receptorów (tj. może oddziaływać jako partner wiążący się z jedną lub więcej cząsteczkami), modyfikowane sekwencje aminokwasowe, np. sekwencje aminokwasowe ze związanymi kowalencyjnie lub niekowalencyjnie czynnikami aktywnymi (korzystnie o naturze związków organicznych), przeciwciała lub segmenty przeciwciał z paratopami lub nawet hormony, przykładowo hormony peptydowe. W szczególności, niniejszy wynalazek obejmuje sekwencje aminokwasowe białek sygnałowych jako składnik A w białku fuzyjnym, które są już aktywne jako monomery i któPL 204 277 B1 rych działanie jest zwiększone w postaci składników kompleksów według wynalazku, lub które uzyskują aktywność jedynie poprzez multimeryzację lub oligomeryzację zainicjowaną zgodnie z wynalazkiem lub poprzez oligomeryzację zainicjowaną wyłącznie zgodnie z wynalazkiem (gdy składnik A białka fuzyjnego jest już wykrywany jako trimer). Gdy chodzi o białka sygnałowe fizjologicznie związane z błoną np. cytokiny TNF, preferowane są produkty trawienia, które zawierają zewnątrzbłonowe segmenty białkowe, w szczególności zewnątrzkomórkowe segmenty białkowe. Lecz również sekwencje aminokwasowe działające jako antygeny mogą być również wykorzystane jako składnik A w rekombinowanym białku fuzyjnym. W końcu, receptory, np.: receptory z rodziny receptorów TNF, np.: należące do rodziny białek błonowych typu I (np. FasR) lub segmenty lub pochodne takich receptorów, mogą być również wykorzystane jako składnik A, posiadający również funkcję wiążącą (tj. oddziaływujący jako partner wiążący z innymi cząsteczkami) i dlatego jest objęty pojęciem „ligand rozumianym zgodnie z tym wynalazkiem. Te rodzaje zdolnych do wiązania fragmentów receptorów biologicznych są przydatne zwłaszcza jako leki, jeśli komplementarny ligand biologiczny jest wykrywany u pacjenta w niefizjologicznie wysokim stężeniu.
Ujawnione składniki A mogą posiadać multimetry wykrywane w oligomerach według wynalazku, tj. dimery, trimery, kwadromery lub pentamery, identycznych składników A (oligomery homodimerów lub homomultimerów) lub różnych składników A (oligomery heterodimerów lub heteromultimerów). W ten sposób, białka z różnymi składnikami A, korzystnie także spełniającymi różne funkcje biologiczne, mogą być łączone razem w dimery lub multimery oligomerów według wynalazku. Poszczególne heterodimery lub heteromultimery połączone w bimery lub oligomery mogą również być takie same lub różne, tj. bimer lub oligomer według wynalazku może być również złożony z różnych heterodimerów lub heterooligomerów.
Jednakże jest także możliwe, że białka fuzyjne w danym dimerze lub multimetrze jako podjednostka bimbru są identyczne, lecz z drugiej strony, poszczególne podjednostki bimeru lub oligomeru tworzące dimer lub multimer są różne (heterobimer lub heterooligomer homodimerów, homotrimerów, homokwadoromerów lub homopentamarów). Dzięki temu, przykładowo, do sześciu homotrimerów różniących się pod względem składnika A może być związane w postaci heksameru trimerów według wynalazku. W ten sposób, typowo precyzyjne aktywności biologicznie modulujące mogą być zmieniane poprzez selekcję, ułożenie, specyficzne połączenie i/lub poprzez liczbę składników A w bimerze lub oligomerze. Wiadomo, że pewne właściwości biologiczne przynoszą pożądany efekt biologiczny, np. aktywację komórki, jedynie poprzez oddziaływanie przynajmniej dwóch ligandów (w sensie biologicznym, nie w rozumieniu według wynalazku). Jest to pożądane, np. w połączeniu z pewnymi interleukinami w odniesieniu do działania jako aktywatory komórek T lub komórek B. Zgodnie z ujawnieniem, efektory tego rodzaju, które są skuteczne jedynie w połączeniu mogą być łączone w kompleksy według wynalazku. Jednakże, rozważa się także skład, przykładowo w odniesieniu do określonego składnika A, zawierający różne oligomery.
Ujawniony składnik A w rekombinowanym białku fuzyjnym jest hormonem peptydowym, czynnikiem wzrostu, cytokiną interleukiną lub jej segmentem, korzystnie segmentem zdolnym do wiązania. Jednakże, pochodne funkcjonalne powyżej wspomnianych peptydów i/lub białek mogą być także zastosowane jako składnik A w rekombinowanym białku fuzyjnym, który jest składnikiem oligomeru według wynalazku.
Białka zachowujące biologiczną funkcję, lecz jednocześnie posiadające różnice sekwencyjne z odpowiadając ą im sekwencją natywną są opisane jako pochodne funkcjonalne biologicznie aktywnych białek, segmentów białkowych lub peptydów. Rozbieżność sekwencyjna może być jedną lub kilkoma insercjami, delecjami lub substytucjami, przy czym preferowana jest homologia sekwencji przynajmniej 70%, a korzystniej preferowana jest homologia wynosząca przynajmniej 85% pomiędzy wykorzystywaną pochodną i sekwencją natywną. Takie sekwencje aminokwasowe są obejmowane pojęciem „pochodne funkcjonalne wykazujące substytucje konserwatywne w sekwencji fizjologicznej. Za substytucje konserwatywne uznaje się takie substytucje, w których aminokwasy są zastępowane przez aminokwasy należące do tej samej klasy. Są to w szczególności aminokwasy z alifatycznym łańcuchem bocznym, dodatnio lub ujemnie naładowanym łańcuchem bocznym, zawierające grupę aromatyczną w łańcuchu bocznym, lub aminokwasy, których łańcuch boczny może uczestniczyć w wiązaniach wodorowych, przykładowo łańcuch boczny zawierający grupę hydroksylową. Oznacza to, że przykładowo, aminokwas z polarnym łańcuchem bocznym jest zastępowany przez inny aminokwas również z polarnym łańcuchem bocznym, lub przykładowo, aminokwas cechujący się hydrofobowym łańcuchem bocznym jest zastępowany innym aminokwasem również posiadającym hydrofo6
PL 204 277 B1 bowy łańcuch boczny (np. seryna (treonina) przez treoninę (serynę), lub leucyna (izoleucyna) przez izoleucynę (leucynę).
Ujawnionym ligandem jest każda cząsteczka, która może brać udział w reakcjach wiązania. Ligandem może być zatem białko opisywane zwykle jako receptor. Receptorem tego typu może być także „ligand w sensie tego wynalazku jeśli wiąże cząsteczkę sygnałową.
Preferowane są oligomery trimerów białek fuzyjnych, w szczególności trimery lub kwadromery trimerów (3 x 3 lub 4 x 3) lub heksamery trimerów (6 x 3).
Szczególnie korzystny jest bimer lub oligomer dimeru, trimeru, kwadromeru lub pentameru rekombinowanych białek fuzyjnych, w którym składnik A w rekombinowanym białku fuzyjnym jest cytokinąz rodziny cytokin TNF, segmentem tego typu cytokiny TNF lub funkcjonalną pochodną cytokiny TNF lub odpowiedniego segmentu cytokiny TNF. Stosowane tutaj cytokiny TNF mogą prowadzić do, przykładowo, działania apoptotycznego, proliferacyjnego lub aktywującego w komórce docelowej poprzez wiązanie odpowiednich receptorów. Jako niewyłączną listę stosowanych cytokin TNF można podać białka CD40L, FasL, TRAIL, TNF, CD30L, OX40L, RANKL, TWEAK, Lta, Ltab2, LIGHT, CD27L, 41-BB, GITRL, APRIL, EDA, VEGI i BAFF. Zewnątrzkomórkowe segmenty wymienionych powyżej związanych z błoną cytokin TNF lub inne pochodne funkcjonalne są preferowane w stosowaniu jako składnik A rekombinowanych białek fuzyjnych. Te produkty trawienia są szczególnie preferowane, gdy zachowują swoją funkcjonalność biologiczną w szczególności zdolność do wiązania się z odpowiednim receptorem. Funkcjonalne pochodne w powyższym rozumieniu powyżej wspomnianych cytokin TNF lub segmentów z cytokin TNF mogą być również wykorzystane jako składnik A białka fuzyjnego. W szczególnie korzystnej realizacji, składnik A rekombinowanego białka fuzyjnego został wybrany z grupy składają cej się z hFasL (aminokwasy (AA) 139-261), hTRAIL (AA 95-281), hCD40L (AA 116-261) i m lub hTNFa (AA 77-235).
Ponadto, receptory (związane z błoną lub zewnątrzkomórkowe), w szczególności receptory białek rodziny cytokin TNF, w szczególności fizjologiczne receptory powyżej wspomnianych cytokin TNF lub segmenty lub pochodne takich receptorów są wykorzystywane w korzystnej realizacji jako składnik A rekombinowanego białka fuzyjnego. W przypadku, gdy segmenty receptorów są stosowane jako składnik A są one korzystnie segmentami fizjologicznej sekwencji białka tego typu receptorów, które są fizjologicznie umieszczane zewnątrzkomórkowo. Chodzi tu w szczególności o segmenty zewnątrzkomórkowe tego typu receptorów. Przykładowo, zgodnie z wynalazkiem domena(domeny) wiążąca receptor, w szczególności receptor wiążący cytokinę z rodziny cytokin TNF (np. FasR, CD30, CD40, GITR, TNF-R1 i/lub TNF-R2) może być dostarczany wraz z dimeryzującą immunoglobuliną (dimeryzujący fragment Fc) i takie dimery mogą dzięki temu być bimeryzowane lub oligomeryzowane do bimerów lub oligomerów według wynalazku przez składnik B, segment kolageno-podobny posiadający zdolność do bimeryzacji lub oligomeryzacji dimerów lub multimerów. W tym kontekście może być rozważany, przykładowo, tetramer dimerów lub multimerów (np. poprzez tetrameryzację segmentów ACPR30), lub pentamer dimerów lub multimerów (np. poprzez odpowiednie sekcje sekwencji monomeru z kompleksu COMP stosowanego jako składnik B) lub nawet heksamer dimerów lub multimerów (np. poprzez heksameryzację segmentów monomerów kompleksu C1q).
Dostarcza się następujące możliwości: składnik A wybrany dla rekombinowanego białka fuzyjnego, który stanie się składnikiem oligomeru według wynalazku, jest już w roztworze w postaci dimeru lub multimeru. Składnik B w takim przypadku wzmaga jedynie dimeryzację lub multimeryzację składnika A i prowadzi zasadniczo do bimeryzacji lub oligomeryzacji rekombinowanego białka fuzyjnego. Taka sytuacja ma miejsce, przykładowo, gdy jako składnik A, przynajmniej jeden ligand TNF lub jego segment lub pochodna, który jest już zwykle trimerem w roztworze, jest poddawany oligomeryzacji jako składnik(i) białka fuzyjnego. Jednakże, w przypadku, gdy składnik A nie wykazuje w roztworze skłonności do dimeryzacji lub multimeryzacji za sprawą oddziaływań powierzchniowych, zgodnie z wynalazkiem składnik B powinien zapewnić nie tylko dimeryzację lub multimeryzację składnika A lecz także bimeryzację lub oligomeryzację zdimeryzowanych lub multimeryzowanych rekombinowanych białek fuzyjnych. Jest to zwykle konieczne, przykładowo, w przypadku gdy receptory lub ich segmenty stanowią składnik A rekombinowanego białka fuzyjnego.
W korzystnej realizacji bimery lub oligomery dimerów, trimerów, kwadoromerów lub pentamerów rekombinowanych białek fuzyjnych są ujawnione takie, w których składnik A jest korzystnie antygenem lub segmentem antygenu. Pożądane jest stosowanie tutaj antygenów z patogenów wirusowych, bakteryjnych lub pierwotniaków. Mogą to być dowolne z typowych antygenów takich patogenów, przykładowo, segmenty białkowe i/lub specyficzne struktury węglowodanowe, lecz zwykle są one
PL 204 277 B1 antygenami powierzchniowymi odpowiednich patogenów lub segmentami białek powierzchniowych patogenów, które także wykazują właściwości antygenowe. Przykładowo, można rozważać następujące, niewyłączne przykłady: hemaglutynina, neuroamidaza, PreS1, PreS2, antygen HBs, gp120, gp41 lub nawet typowe antygeny nowotworowe.
Ujawniony składnik A rekombinowanego białka fuzyjnego może być także sekwencją aminokwasową która jest odpowiednia do działania jako nośnik agonisty receptora lub antagonisty receptora. Przykładowo, mała cząsteczka organiczna działająca jako czynnik farmakologiczny może być standardowo sprzęgnięta kowalencyjnie z tego typu sekwencją aminokwasową przykładowo poprzez wiązanie eterowe do treoniny lub seryny, wiązanie amido-podobne lub wiązanie estrowe. Niniejszy wynalazek dostarcza dużych kompleksów oligomerowych przykładowo 18 białek fuzyjnych (np. 3 x 6 białek fuzyjnych) wraz z połączonymi agonistami lub antagonistami receptora. W ten sposób, możliwe jest osiągnięcie widocznej poprawy skuteczności lub powinowactwa tego rodzaju cząsteczek organicznych wobec odpowiadających im receptorów, umieszczonych na bimerycznym lub oligomerycznym nośniku białkowym, przykładowo stosowanych jako lek w leczeniu ludzi lub zwierząt.
Składnik B rekombinowanych białek fuzyjnych, który dimeryzuje lub multimeryzuje do bimerów lub oligomerów, jest zwykle białkiem z rodziny białek C1q lub kolektyn. Szczególnie korzystne jako składnik rekombinowanych białek fuzyjnych są białka z rodziny białek C1q lub kolektyn, mianowicie jako składnik B jeśli tylko ich sekwencja dimeryzująca/multimeryzująca lub sekwencja dimeryzująca/oligomeryzująca ulega transkrypcji lub translacji w rekombinowanym białku fuzyjnym. Główne globularne domeny główki (Fig. 14), które są zawarte w sekwencji natywnych monomerów, nie będą dlatego występować, jako produkt translacji, w rekombinowanym białku fuzyjnym według wynalazku i nie są też z tych powodów składnikiem składnika B tego białka. Powyżej wspomniany składnik B rekombinowanego białka fuzyjnego według wynalazku nie posiada sekwencji, która zwykle głównie obejmuje funkcjonalność i dimeryzację/multimeryzację lub bimeryzację/oligomeryzację, odpowiednio, ponieważ segmenty kolageno-podobne białek z powyżej wymienionych rodzin stosowanych jako składnik B uczestniczą zwykle w tworzeniu, przykładowo, potrójnej helisy, która tym samym posiada zdolność do tworzenia struktury bimeru lub oligomeru (przykładowo tetrameru lub heksameru złożonego z przykładowo potrójnych helis) z innymi potrójnymi helisami.
Dlatego zwykle multimeryzujące i oligomeryzujące białko fuzyjne posiada jako składnik B domeny białek z rodzin białek C1q lub kolektyn, które są odpowiedzialne za dimeryzację i multimeryzację i/lub bimeryzację i oligomeryzację, ponieważ ich odpowiednie domeny główki są zastąpione jako składnik A przez inne białka lub segmenty białkowe, które również przenoszą funkcję biologiczną. Określenie „rekombinowane białko fuzyjne jest tym samym rozumiane w ramach tego wynalazku jako przynajmniej jeden składnik A i przynajmniej jeden składnik B będące sztucznie połączone, tj. białko fuzyjne w rozumieniu wynalazku nie posiada odpowiednika w naturze.
Funkcjonalne, tj. bimeryzujące lub oligomeryzujące pochodne białek z rodziny C1q lub rodziny kolektyn, lub pochodne segmentów powyżej wspomnianych białek mogą być także wykorzystane jako składnik B dla agregacji rekombinowanego białka fuzyjnego w bimery lub oligomery. W tym przypadku, przykładowo, składnik B będzie zawierał sekwencję białka C1q, MBP, SP-A (białko A surfaktantu płucnego), SP-D (białko B surfaktantu płucnego), BC (konglutyna surowicy wołowej), CL43 (wołowa kolektyna 43) i/lub ACRP30, lub sekwencja/sekwencje bimeryzujących lub oligomeryzujących segmentów przynajmniej jednego z powyższych białek lub pochodnych funkcjonalnych tych białek lub segmenty pochodzące z tych pochodnych funkcjonalnych. Bimery lub oligomery rekombinowanych białek fuzyjnych są szczególnie korzystne gdy komponent B rekombinowanego białka fuzyjnego jest segmentem białkowym białka C1q lub białka ACRP30, w szczególności ludzkiego wariantu lub ssaczego wariantu, korzystniej wariantu mysiego, przy czym odpowiedni segment białka tego typu zwykle nie posiada główkowej domeny globularnej natywnego białka C1q lub białka ACRP30.
Ujawniono bimery lub oligomery dimerów, trimerów, kwadromerów lub pentamerów rekombinowanych białek fuzyjnych, których składnik B zawiera sekwencję aminokwasową według Fig. 6A (sekwencja w ramce) lub Fig. 6a lub funkcjonalną pochodną tej/tych sekwencji aminokwasowej i/lub segment pochodzący z tej/tych sekwencji. Zwykle, sekwencja ta jest segmentem białka mACRP30 (m: mysie), np. z aminokwasami 18 do 111, lub segmentem z ludzkiego wariantu (hACRP30), np. z aminokwasami 18 do 108. W szczególności, może być dostarczane białko fuzyjne, którego składniki A i B są pochodzenia ludzkiego, dzięki czemu moż na wykluczyć wystąpienie w trakcie podawania terapeutycznego wszelkich możliwych w reakcji immunologicznych u człowieka.
PL 204 277 B1
Szczególnie korzystne są bimery oligomerów dimerów lub multimerów takich białek fuzyjnych, które posiadają sekwencje z organizmów różnych gospodarzy. Ujawnione kompleksy są szczególnie korzystne, gdy pochodzą z chimerycznych białek fuzyjnych, przy czym składnik A pochodzi od różnego niż składnik B rodzaju zwierzęcia. Może być korzystne jeśli składnik A odpowiada sekwencji aminokwasowej myszy, szczura, świni lub innego kręgowca, w szczególności ssaka, lub jej funkcjonalnej pochodnej, a składnik B pochodzi od człowieka, lub na odwrót. Np. kompleksy według wynalazku tych białek, których składnik A odpowiada sekwencji wirusa, bakterii lub pierwotniaka, połączony ze składnikiem B pochodzącym od człowieka, są również korzystne. Oczywiście, sekwencje składnika A i składnika B w biał ku fuzyjnym wedł ug wynalazku mogą również pochodzić z tego samego typu zwierzęcia.
Ujawniona multimeryzacja i/lub oligomeryzacja białka fuzyjnego zachodzi dzięki krótkiej sekwencji aminokwasowej złożonej z więcej niż 6 aminokwasów, korzystnie pomiędzy 8 a 20 amionokwasów, która występuje w rekombinowanym białku fuzyjnym jako składnik B. Bimeryzacja lub oligomeryzacja białek fuzyjnych, które okazały się już być dimerami lub multimerami w roztworze nie za sprawą struktury trzeciorzędowej lecz za sprawą oddziaływań powierzchniowych, co zwykle ma miejsce dla takich krótkich sekwencji aminokwasowych, opiera się korzystnie na tworzeniu mostków siarczkowych, co jest możliwe za sprawą specyficznych sekwencji aminokwasowych w rekombinowanym białku fuzyjnym. Oznacza to, że składnik B korzystnie posiada przynajmniej jedną cysteinę, która w warunkach utleniających moż e tworzyć wiązanie kowalencyjne z przynajmniej jedną cysteiną białka fuzyjnego z przynajmniej jednego innego dimeru lub multimeru. Sekwencja aminokwasową (jednoliterowy kod) VDLEGSTSNGRQCAGIRL jest korzystnym przykładem składnika B zawierającego krótką bimeryzującą lub oligomeryzującą sekwencję aminokwasową od 8 do 20 aminokwasów. Ta sekwencja 18 aminokwasów posiada resztę cysteiny w pozycji 11, która tworzy mostek dwusiarczkowy pomiędzy dimerami lub multimerami.
Funkcjonalne pochodne lub segmenty tej 18 aminokwasowej sekwencji zawierają sekwencje, które mogą być stosowane jako składnik B. Sekwencja VDLEGSTSNGRQSAGIRL może być tutaj wymieniona w szczególności, jako sekwencja, w której reszta cysteiny w pozycji 11 została zastąpiona przez resztę seryny, co nadal pozwala na bimeryzację lub oligomeryzację multimerów białka fuzyjnego.
Białka fuzyjne mogą tworzyć agregaty w korzystnej realizacji w taki sposób, że agregaty wyższego rzędu mogą być tworzone po bimeryzacji lub oligomeryzacji dimeryzowanych lub multimeryzowanych białek fuzyjnych. Takie agregaty wyższego rzędu, które same w sobie zawierają dwa lub więcej bimerów lub oligomerów, mogą być uzyskiwane, przykładowo poprzez sieciowanie przeciwciałami. Przeciwciała skierowane są przeciwko epitopom białka(białek) fuzyjnego kompleksu według wynalazku, korzystnie przeciwko epitopowi składnika B. Jednak, wraz ze składnikiem A składnik B białka fuzyjnego może także posiadać dodatkowe sekcje sekwencji, prezentujące antygeny dla przeciwciał sieciujących. W tym kontekście, tak zwane sekwencje tag są preferowane w ramach tego wynalazku, przykładowo tag flag, innymi słowy sekwencja aminokwasowa DYKDDDDK, lub także, przykładowo, tag His (zawierający kilka kolejnych histydyn).
Szczególnie korzystne są agregaty wyższego rzędu cechujące się tym, że zawierają więcej niż jeden składnik B zawarty w rekombinowanym białku fuzyjnym. Korzystnie białko fuzyjne zawiera w celu tworzenia agregatów wyższego rzędu składnik B1 dla tworzenia bimerów oligomerów w dodatku do przynajmniej jeden inny składnik B (korzystnie składnik B2), który zwykle różni się od składnika B1. Składnik B2, który powinien znajdować się przynajmniej w jednym białku fuzyjnym bimeru lub oligomeru według ujawnienia, zapewnia tworzenie agregatów wyższego rzędu przez bimery lub oligomery. Przykładowo, składnik B1 może być bimeryzującym lub oligomeryzującym segmentem białka z rodziny białek C1q lub kolektyn, natomiast składnik B2 jest sekwencją z 8 do, przykładowo, 28 aminokwasów, która tworzy przynajmniej jeden mostek dwusiarczkowy. W przypadku, gdy przynajmniej jeden mostek dwusiarczkowy jest tworzony pomiędzy dwoma różnymi oligomerami, umożliwione jest powstanie agregatu wyższego rzędu według wynalazku, przykładowo bimeru oligomerów.
Ponadto, korzystne jest wprowadzenie tak zwanych sekwencji łącznikowych pomiędzy składnik A i składnik(i) B, lub w przypadku kilku składników B w białku fuzyjnym, pomiędzy przynajmniej dwoma jego składnikami. Takie sekwencje łącznikowe pozwalają na oddzielenie strukturalnie różnych składników funkcjonalnych w rekombinowanym białku fuzyjnym i może korzystnie spełniać funkcję „zawiasową, tj. stanowić sekwencję aminokwasową o ruchomej strukturze.
Ujawniono ogólnie zgodne z wynalazkiem bimery lub oligomery lub agregaty wyższego rzędu, które charakteryzują się tym, że posiadają zwiększoną biologiczną skuteczność i/lub zwiększone poPL 204 277 B1 winowactwo do komplementarnych białek. W ten sposób, kolejnym przedmiotem wynalazku, są ujawnione sposoby pozwalające uzyskać wzrost biologicznej skuteczności i/lub wzrost powinowactwa cząsteczek biologicznych lub leków spełniających funkcję ligandów w rozumieniu tego wynalazku. Takie sposoby charakteryzują się tym, że rekombinuje się przynajmniej jeden składnik A, odpowiadający białku lub segmentowi białkowemu spełniającemu funkcję biologiczną, z przynajmniej jednym dimeryzującym lub multimeryzującym i bimeryzującym lub oligomeryzującym składnikiem B, przy czym wzrost aktywności biologicznej i/lub wzrost powinowactwa składnika A jest uzyskiwany przez rekombinowane białka fuzyjne ostatecznie ulegające dimeryzacji lub oligomeryzacji dzięki multimeryzacji i oligomeryzacji do bimerów lub oligomerów dimerów i multimerów. Sposób jest szczególnie korzystny, gdy składnik A jest cytokiną TNF, segmentem cytokiny TNF lub pochodną funkcjonalną takiego białka lub takiego segmentu białkowego. Ponadto w korzystnym sposobie rekombinuje się przynajmniej jeden składnik A z przynajmniej jednym składnikiem B w rekombinowanym białku fuzyjnym, przy czym przynajmniej jeden składnik A jest receptorem lub segmentem receptora, korzystnie receptora TNF. W odniesieniu do korzystnych realizacji sposobu tego rodzaju według wynalazku, korzystne realizacje dla bimerów lub oligomerów opisanych powyżej stosują się analogicznie.
Ujawnione bimery i oligomery mogą być stosowane do otrzymywania leku lub do leczenia chorób lub zaburzeń medycznych, tj. w leczeniu ludzi i weterynarii. Agregaty wyższego rzędu tworzone zgodnie z wynalazkiem z bimerów lub oligomerów są także przydatne w stosowaniu jako leki lub do otrzymywania leku. Szeroki zakres chorób i zaburzeń może być leczony za pomocą bimerów lub oligomerów lub wyższego rzędu agregatów według wynalazku. Ten rodzaj bimerów lub oligomerów lub wyższego rzędu agregatów może być zastosowany do otrzymywania leku do leczenia następującej listy chorób i zaburzeń, która nie jest wyłączna: zaburzenia zapalne, choroby autoimmunologiczne, choroby oparte na reakcjach hiperapoptotycznych lub hipoapoptotycznych, zaburzenia neurodegeneracyjne, lecz także do leczenia chorób zakaźnych, nowotworów i/lub zaburzeń endokrynologicznych. W przypadku chorób zakaźnych zastosowanie bimerów lub oligomerów odnosi się to chorób bakteryjnych lub pierwotniakowych, ale także korzystnie zakażeń wirusowych, przy czym przeciwciała lub segmenty przeciwciał przenoszące paratopy są szczególnie korzystne jako składnik A w rekombinowanym białku fuzyjnym. Bimery lub oligomery lub ich agregaty wyższego rzędu są szczególnie użyteczne, gdy choroba wymaga leczenia biologicznie aktywnymi cytokinami, przykładowo obejmując leczenie i/lub otrzymywanie leku do leczenia nowotworów, w szczególności nowotworów układu limfatycznego.
Ponadto, bimery lub oligomery według wynalazku sąstosowane jako szczepionki lub do otrzymywania szczepionki do czynnej lub biernej immunizacji przeciwko chorobom zakaźnym. W przypadku czynnej immunizacji antygen przydatny w immunizacji jest stosowany jako składnik A rekombinowanego białka fuzyjnego. W szczególności, powierzchniowe antygeny lub segmenty antygenów powierzchniowych z bakterii, wirusów lub pierwotniaków, np. rodzajów plasmodia lub trypanosomes mogą być wykorzystywane. Zgodnie z niewyłączną listą, szczepionka zawiera bimery lub oligomery lub ich agregaty, przy czym rekombinowane białka fuzyjne powinny posiadać przynajmniej jeden składnik A, innymi słowy jeden lub więcej identycznych lub różnych antygenów patogenu, może być zastosowany do szczepienia przeciwko odrze, różyczce, zapaleniu istoty szarej rdzenia, wściekliźnie, tężcowi, błonicy, BCG, gruźlicy, malarii, żółtej febrze, HIV, wirusom grypy, przykładowo rhinowirusom. Połączenie różnych antygenów w bimerze lub oligomerze lub agregacie wyższego rzędu tworzonym przez bimery lub oligomery jest także możliwe według tego wynalazku, przy czym różne antygeny tego samego patogenu mogą być łączone w bimer lub oligomer, lub antygeny z dwóch lub więcej patogenów mogą być łączone w bimerze lub oligomerze lub agregacie wyższego rzędu. Zwykle, dwa lub więcej składników A1, A2 lub AX może być zawarte w białku fuzyjnym, które jest następnie składnikiem bimeru lub oligomeru lub agregatu wyższego rzędu według wynalazku, lub dwa lub więcej białek fuzyjnych, które różnią się pod względem przynajmniej jednego składnika A może być łączone w bimer lub oligomer lub wyższego rzędu agregat przez przynajmniej jeden składnik B.
Ujawnia się przynajmniej dwa różne typy bimerów lub oligomerów, które mogą byż zawarte w kompozycji do stosowania jako lek lub jako szczepionka, lub do ich produkcji.
Ujawniony składnik A w białku fuzyjnym jest immunomodulatorem, przykładowo interleukiną (IL), korzystnie IL-2.
Ponadto ujawniono zastosowanie bimerów lub oligomerów jako czynniki immunizacyjne i/lub adiuwanty. Wiadomo, że wiele antygenów stosowanych do immunizacji prowadzi zaledwie do niedostatecznej reakcji odpornościowej danej osoby. Celem adiuwantów jest zwiększanie efektu immuno10
PL 204 277 B1 gennego. Tego rodzaju adiuwanty mogą być stosowane jako składnik A w białku fuzyjnym według wynalazku, a zatem także jako składnik bimeru lub oligomeru według wynalazku. Przykładowo, składnik A może zawierać sekwencję aminokwasową liganda CD40 (CD40L) lub sekwencję lub fragment sekwencji interleukiny, przykładowo jednej z interleukin 1 do 12. Fizjologicznym celem CD40L jest kontrolowanie transformacji nieaktywnych komórek B w cyklu komórkowym. Interleukiny, przykładowo IL-4, IL-5, IL-6 i/lub CD40L, mogą być łączone w bimeryzowane lub oligomeryzowane kompleksy zgodnie z niniejszym wynalazkiem (różne rekombinowane białka fuzyjne w bimerze lub oligomerze), lub mogą występować jako składniki kompozycji (przynajmniej dwa różne rodzaje bimeru lub oligomeru, które mogą być uzyskane z identycznych lub różnych białek fuzyjnych) zwykle zawierają przynajmniej jeden, korzystnie dwa lub więcej różnych typów bimerów lub oligomerów według wynalazku, wraz z immunogenem/immunogenami.
Bimery oligomerów, lub agregaty wyższego rzędu, z których może być otrzymywana kompozycja tego rodzaju, mogą składać się z białek fuzyjnych, które są identyczne lub różne pod względem składnika/składników A. Dzięki temu, każda sekwencja fizjologiczna z charakterystyką współstymulującą i/lub charakterystyką aktywującą układ immunologiczny (komórkowej lub humoralnej odpowiedzi immunologicznej) może być rozważana jako składnik A. Mogą to być składniki fizjologiczne lub składniki syntetyczne. Zatem, ujawniono kompozycje, które zawierają jeden lub więcej bimerów lub oligomerów według wynalazku wraz z jednym lub więcej immunogenem/immunogenów, przy czym ujawniony bimer lub oligomer może być korzystnie przygotowany w taki sposób, że więcej niż jeden immunomodulator/adiuwant jest zawarty w takim bimeryzowanym lub oligomeryzowanym kompleksie, innymi słowy jest to heterobimer lub heterooligomer. W razie potrzeby ujawniony, heterobimer lub heterooligomer może przenosić łącznie nie tylko jeden lub więcej białek fuzyjnych z immunogenem jako składnik A, lecz także przynajmniej jedno białko fuzyjne z adiuwantem jako składnik A, przykładowo CD40L. Dwa lub więcej różnych białek fuzyjnych, każde z innym adiuwantem lub składnikiem imunomodulatorowym, są także uznawane za ujawniony heterooligomer. Oznacza to, że ujawnia się także zastosowanie jako leku lub jako szczepionki w leczeniu ludzi lub weterynarii tego rodzaju homooligomeru lub heterooligomeru lub składników zawierających przynajmniej jeden rodzaj heterooligomeru lub homooligomeru według wynalazku.
W ramach tego wynalazku bimery lub oligomery są stosowane korzystnie do produkcji leku lub do leczenia powyżej wspomnianych chorób lub zaburzeń, tak aby nadawały się one do podawania drogą pozajelitową, tj. przykładowo, podskórnie, domięśniowo lub donaczyniowo, lub nawet doustnie lub donosowo. Podawanie bimerów lub oligomerów lub ich agregatów jako szczepionki lub podstawy do produkcji szczepionki, jest także korzystnie oparte na podawaniu pozajelitowym lub doustnym, a w razie potrzeby takż e donosowym.
Bimery lub oligomery według wynalazku, i/lub agregaty wyższego rzędu, mogą być stosowane samodzielnie jako lek lub mogą być zaangażowane w produkcji leku. Jednak, mogą być one także stosowane wraz z innymi czynnikami aktywnymi jako lek. Bimery lub oligomery według wynalazku, i/lub agregaty wyższego rzędu, mogą także być łączone farmaceutycznie z dopuszczalnymi nośnikami, czynnikami zaróbkowymi lub dodatkami. Odpowiednie metody produkcji opisano w Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack.Pub.Co., Easton, PA, 1980), która jest częścią ujawnienia tego wynalazku. Przykładami substancji nośnikowych, które mogą być rozważane dla podawania pozajelitowego są woda sterylizowana, sterylne roztwory NaCl, glikole polialkilenowe, wodorowane naftaleny i w szczególno ś ci biologicznie dopuszczalne polimery mleczanowe, kopolimery mleczanowo/glikolowe lub kopolimery polioksyetylenowo/polioksypropylenowe.
Bimery lub oligomery według wynalazku, lub odpowiednie agregaty wyższego rzędu, są także stosowane korzystnie w branży diagnostyki in vitro lub, przykładowo, w biochemicznych metodach oczyszczania. Zastosowanie bimerów lub oligomerów i/lub ich oligomerów wyższego rzędu na kolumnach oczyszczających, które mogą być wypełniane tego typu kompleksami, jest również rozważane. Oznacza to, że w ramach tego wynalazku, ujawniane jest zastosowanie tego typu kompleksów do celów detekcyjnych.
Ponadto, w ramach tego wynalazku ujawniono sposoby produkowania specyficznie związanych białek, które oddziaływują z powierzchnią białka, i ze względu na ich oddziaływanie oraz w wyniku tego są wykrywane w roztworze zdimeryzowane lub zmultimeryzowane. Zwłaszcza z cytokinami TNF, lub korzystnie rozpuszczalnymi segmentami tego typu cytokin, które trimeryzują w roztworze, korzystne jest udostępnianie ich w określonej stechiometrii w czystej frakcji. W przypadku prostej koekspresji różnych białek, które są zdolne do wzajemnego łączenia się, przykładowo trzech różnych cytokin TNF
PL 204 277 B1 lub różnych segmentów takich cytokin TNF, wszystkie statystycznie możliwe układy wspólnie ekspresjonowanych białek są wykrywane wśród trimerów łączących się po ekspresji, innymi słowy, przykładowo, pożądane trimery z białek P1, P2 i P3, ale także trimery z dwóch białek P1 i białka P3 itp.
Oligomery według wynalazku mogą być wykorzystane zgodnie z tym sposobem w celu uzyskania określonych pożądanych heteromultimerów, przykładowo, heterotrimerów cytokin TNF lub segmentów tego typu cytokin TNF. Do tych celów różne białka fuzyjne są przygotowywane i korzystnie poddawane ekspresji w komórkach gospodarza. Białka fuzyjne poddawane ekspresji posiadają sekcje sekwencji składnika B białek, które tworzą homooligomery lub heteromultimery, przykładowo, tworzą trimer z trzech różnych łańcuchów, przy czym identyczne trimery bimeryzują lub oligomeryzują. Korzystnie, takie składniki B w białkach fuzyjnych odpowiadają sekcjom sekwencji białek z rodziny dopełniacza lub kolektyny, przykładowo C1q, które tworzą homoheksamery z heterotrimerów. Dlatego w białku fuzyjnym, sekcja sekwencji, która jest dostarczana przez natywne białko dla multimeryzowania łańcucha w heteromultimer, jest łączona jako składnik B ze składnikiem A, przykładowo cytokiną TNF, przy czym jako inne białka fuzyjne (które występują w heterotrimerze) każde posiada połączenia innych składników A, przykładowo różnych cytokin TNF lub ich segmentu, i inną sekcją sekwencji natywnego białka, przykładowo białka C1q, dla heteromultimeryzacji.
Różne białka fuzyjne, które mogą tworzyć heteromultimer są poddawane ekspresji, korzystnie w komórce gospodarza. Heteromultimery łączą się w homooligomery, ponieważ składnik B może oligomeryzować jedynie z identycznymi heteromultimerami. Zgodnie z wynalazkiem, przykładowo, trzy różne białka fuzyjne mogą być poddawane ekspresji, każde z innym składnikiem A, innymi słowy korzystnie różnymi cytokinami TNF, z których każda łączy się z multimeryzującym i oligomeryzującym łańcuchem α, β, albo γ C1q. Jedynie heteromultimery z wszystkich trzech rodzajów cytokin TNF mogą być następnie wykrywane w asocjujących oligomerach. W przeciwieństwie do tego, heteromultimery o innej stechiometrii nie są wykrywane. Oznacza to, że według wynalazku można uzyskać prostą selekcję białek fuzyjnych, która jest specyficzna pod względem stechiometrii i nie podlega rozkładowi statystycznemu.
Ponadto, korzystne jest zastosowanie takich białek fuzyjnych lub sposobów ekstrakcji heteromultimerów o danej stechiometrii, które posiadają łącznik pomiędzy składnikiem A i składnikiem B. Korzystne są zwłaszcza takie łączniki, które zawierają przynajmniej jedno miejsce cięcia proteolitycznego, które pozwala na oddzielenie składników A z kompleksu homooligomeru (z heteromultimerów) od składników B. W ten sposób otrzymywana jest frakcja składająca się wyłącznie z pożądanego heteromultimeru, przykładowo, heterotrimeru z różnych cytokin TNF. Miejsce trawienia proteolitycznego w łączniku jest korzystnie konsensusową sekwencją trombiny.
Ujawnia się białka fuzyjne nadające się do bimeryzacji lub oligomeryzacji dimerów lub multimerów, w którym rekombinowane białko fuzyjne zawiera przynajmniej jeden składnik A i przynajmniej jeden składnik B, przy czym składnik A zawiera białko lub segment białka o funkcji biologicznej, w szczególności funkcji liganda dla przeciwciał lub receptorów lub przeciwciała lub segmentu przeciwciała, a składnik B zawiera segment dimeryzujący lub multimeryzujący i bimeryzujacy lub oligomeryzujący lub funkcjonalną pochodną takiego segmentu białka, wybraną z grupy składającej się z rodziny białek C1q lub kolektyn. Szczególnie korzystnie, w przypadku tego rodzaju białek składnik B rekombinowanego białka fuzyjnego zawiera segment multimeryzujący i/lub oligomeryzujący z białek C1q, SP-A, SP-D, BC, CL43 i ACRP30. Funkcjonalne pochodne takiego segmentu powyżej wspomnianych białek mogą być również wykorzystane w ramach tego wynalazku. W tym przypadku, wraz ze składnikiem A posiadającym aktywność biologiczną białko fuzyjne zawiera zwykle składnik B, który posiada wyłącznie segment z powyżej wspomnianych białek, który jest odpowiedzialny za agregację, lecz korzystnie nie zawiera jego domeny globularnej „główki.
Sekwencja zawierająca sekwencję aminokwasową oligomeryzującej domeny kolagenu z liganda EDA, w szczególności wariant ssaczy, bardziej korzystnie wariant ludzki, lub oligomeryzujący fragment lub funkcjonalna pochodna takiej domeny jest także rozważana jako składnik B białka fuzyjnego według wynalazku. Nawet bardziej korzystnie jako składnik B, może być stosowany fragment sekwencji zawierający sekwencję aminokwasów 160 do 242 ludzkiego białka EDA lub pochodną funkcjonalną np. fragmenty korzystnie odnosi się to do heksameru.
Ujawnia się sekwencje DNA kodujące białka fuzyjne opisane powyżej. Ten typ sekwencji DNA ulega ekspresji w wektorach ekspresyjnych, przy czym odpowiednie wektory ekspresyjne, które zawierają sekwencję DNA białek fuzyjnych według wynalazku, są również przedmiotem wynalazku.
PL 204 277 B1
Ponadto, komórki gospodarza transfekowane sekwencjami DNA kodującymi białka fuzyjne według wynalazku są również objęte niniejszym wynalazkiem. Szczególnie korzystne są komórki gospodarza transfekowane wektorami ekspresyjnymi, przy czym wektory ekspresyjne zawierają sekwencje DNA kodujące białka fuzyjne według wynalazku.
Ujawnia się receptory, zwłaszcza receptory wiążące cząsteczki sygnałowe ligandów z rodziny cytokin TNF, które dimeryzują lub multimeryzują. Przykładowo, tego rodzaju receptorem, jego pochodną lub segmentem receptora lub pochodnej, w szczególności segmentem zawierającym zewnątrzkomórkowy region receptora, przy czym po raz kolejny korzystne są domeny/domena wiążące, może być wykrywany jako składnik A białka fuzyjnego, które jest składnikiem dimeru lub multimeru. Dimeryzacja może być osiągnięta przez rekombinację z segmentami immunoglobulin, zwłaszcza fragmentami Fc, przy czym multimeryzacja może być osiągnięta, przykładowo po rekombinacji z odpowiednimi multimeryzującymi domenami białek. Do tego celu są przydatne wszystkie segmenty sekwencji białek, przykładowo, tworzące dimery lub multimery poprzez tworzenie struktur wyższego rzędu, np. superskręcone helisy, lub zwykle potrójne helisy kolagenopodobne (np. CMP, COMP, kolagen, lamina). Segmenty białek z rodziny C1q lub kolektyn są także zwykle przydatne w dimeryzacji lub multimeryzacji receptorów lub segmentów receptorowych. Przykładowo, zewnątrzkomórkowy segment białka będącego członkiem rodziny receptorowej TNF, przykładowo receptor Fas (FasR) jako składnik A w postaci pentameru, moż e ulegać ekspresji jako skł adnik B poprzez rekombinację z odpowiednimi domenami pentameryzującymi z COMP. Zgodnie z tym można założyć istnienie homodimerów, heterodimerów lub heteromultimerów białek fuzyjnych, które posiadają receptor lub segment receptorowy.
Takie dimery lub multimetry rekombinowanego białka ze składnikiem A zawierającym receptor lub segment receptorowy mogą być także rozważane jako lek lub służyć do produkcji leku. Znajdują one zastosowanie zwłaszcza w przypadkach, gdy towarzyszą im zwiększone stężenia zewnątrzkomórkowe odpowiednich ligandów receptorowych występujące w obrazie klinicznym. Może to dotyczyć także zwiększonych stężeń związanych z błoną cząsteczek sygnałowych, przykładowo cytokin TNF, na komórkach je prezentujących, lub rozpuszczalnych cząsteczkach sygnałowych. Jednak zastosowanie multimetrów tego typu jest w szczególności pożądane także zawsze wtedy, gdy aktywacja przenoszenia sygnału, który jest wzbudzany przez odpowiedni zwykle błonowy receptor, jest zabezpieczana lub obniżana poprzez zastosowanie egzogennych rozpuszczalnych dimerów lub multimerów według wynalazku, który wychwytuje cząsteczki sygnałowe, i który składa się z białek fuzyjnych zawierających receptor lub segment receptorowy jako składnik A. Niniejszy wynalazek został przedstawiony szczegółowo za pomocą następujących figur:
Na Fig. 1 przedstawiono sekwencję aminokwasową wyrażoną w kodzie jednoliterowym rekombinowanego białka fuzyjnego według wynalazku (2) występującego w postaci oligomeru (heksamer FasL) według wynalazku, czyli bimeru lub trimeru. Sekwencja segmentu hFasL (AA 103 lub 139 do 281) została określona jako składnik A, przy czym specyficzny linker (bimeryzujący) o sekwencji VDLEGSTNGRQCAGIRL jest składnikiem B. Fig. 1 zawiera także sekwencję aminokwasową rekombinowanego białka fuzyjnego (1) według stanu techniki będącego zaledwie trimerem FasL, czyli nieposiadającego składnika B bimeryzującego lub oligomeryzującego istniejący multimer, w tym przypadku trimer. Segmenty rekombinowane obydwu białek fuzyjnych (1) i (2) oznaczono na Fig. 1 powyżej sekwencji podając szczegółowy opis elementów funkcjonalnych.
Fig. 2 zawiera Fig. 2A na której przedstawiono wyniki elektroforezy żelowej (SDS-PAGE) białek fuzyjnych według wynalazku (2), wraz ze specyficzną sekwencją łącznikową (składnik B), w warunkach redukujących (r) i nieredukujących (nr). W warunkach nieredukujących w roztworze oligomer jest poddawany elucji jako kompleks natywny z sześciu polieptydów według wynalazku (białko fuzyjne (2)), ponieważ zgodnie z wynalazkiem mostek dwusiarczkowy jest tworzony pomiędzy składnikami B obydwu białek fuzyjnych (2) według wynalazku, które są składnikami różnych trimerów. Wynikiem jest oligomer według wynalazku występujący jako heksamer Fas z masą cząsteczkową odpowiadającą około sześciokrotnej masie cząsteczkowej białka fuzyjnego (2) według wynalazku w postaci monomerycznej. W warunkach denaturujących (np. SDS-PAGE), białko fuzyjne według wynalazku migruje przy braku czynników redukujących jako dimer, co jest wynikiem utworzonych mostków disiarczkowych pomiędzy monomerami. W przeciwieństwie do tego, w warunkach denaturujących i redukujących na żelu SDS migrują monomery białka fuzyjnego (2) według wynalazku. Oligomer według wynalazku, tutaj jako bimer lub trimer, białka fuzyjnego (2) według wynalazku pokazanego na Fig. 1, jest przedstawiony schematycznie na Fig. 2B.
PL 204 277 B1
Na Fig. 3 przedstawiono wyniki testu cytotoksyczności w zależności od stężeń trimerów FasL (trimery trzech białek fuzyjnych według stanu techniki, przykładowo białka fuzyjnego (1) według Fig. 1, które nie zawiera składnika B), lub bimer FasL (heksamer jako bimer trimerów) według wynalazku przedstawione schematycznie na Fig 2B w obecności (, ▲) lub bez obecności (□, Δ) przeciwciał anty-flag M2 specyficznych wobec komórek Jurkat. Gęstość optyczna przy 490 nm jest miarą żywotności komórek (wysoka gęstość optyczna odpowiada niskiemu efektowi apoptotycznemu dodanej substancji i przez to wyższej żywotności komórek). Efekt apoptotyczny dla komórek A20 (Fig. 3A i 3B) i komórek Jurkat (Fig. 3C i 3D) wywierany przez bimery FasL z trimerów (heksamerów) według wynalazku (Fig. 3B i 3D, w każdym przypadku Δ) wzrasta 3 do 10-krotnie w porównaniu z efektem wywieranym przez trimery FasL białek fuzyjnych bez składnika B bimeryzującego lub oligomeryzującego (stan techniki, Fig. 3A i 3C, w każdym przypadku □). Wraz z dodatkowymi przeciwciałami anty-flag, które są specyficzne wobec sekwencji białek fuzyjnych (1) i (2) pokazanych na Fig. 1 i poprzez wzrost, przykładowo, stopnia oligomeryzacji białek fuzyjnych według wynalazku nadal poprzez dodatkowe wzajemne połączenia, efekt apoptotyczny ulega zwiększeniu dla wszystkich preparatów (Fig. 3A do 3D, lub ▲, odpowiednio).
Na Fig. 4 przedstawiono sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego (3) według wynalazku z uwzględnieniem substytucji (C >S) w specyficznej sekwencji łącznikowej (składnik B białka fuzyjnego (3) („super FasL). Patrz opis Fig. 1. W eksperymentach filtracji żelowej pokazano, że „super FasL w roztworze znajduje się w postaci bimeryzowanej według wynalazku jako heksamer. W warunkach denaturujących SDS-PAGE, białko fuzyjne (3) według wynalazku migruje, nawet bez obecności czynnika redukującego, jako monomer, ponieważ mostki dwusiarczkowe nie mogą być tworzone w sekcji łącznika ze względu na wprowadzoną substytucję aminokwasową C>S.
Analogicznie do Fig. 3, na Fig. 5 przedstawiono żywotność komórek A20 (Fig 5B) lub komórek Jurkat (Fig. 5D) po dodaniu agregatów według wynalazku białka fuzyjnego (3) według wynalazku jak pokazano na Fig. 4 („super FasL) w obecności (•) lub braku (o) przeciwciał anty-flag M2. Białka fuzyjne (3) według wynalazku wywołują efekt apoptotyczny, który jest około przynajmniej 1000-krotnie większy niż efekt trimerów FasL (stosowanych do kontrolowania właściwości) według stanu techniki nie posiadających bimeryzującego lub oligomeryzującego składnika B (Fig. 3A (komórki A20) i Fig. 3C (komórki jurkat)), które zastosowano dla porównania. Dodanie przeciwciał anty-flag M2 (•) jest zdolne do słabego zwiększenia aktywności apoptotycznej zarówno komórek A20 jak i komórek Jurkat, około dwukrotnego, w wyniku dalszej oligomeryzacji „super FasL, prowadzącej do powstawania wyższorzędowych agregatów według wynalazku (Fig. 5B i 5D) przynajmniej 1,5 raza, względem preparatu nie zawierającego przeciwciał swoistych wobec sekwencji znacznikowej. W rezultacie, odkryto, że poziom oligomeryzacji; (w tym przypadku bimer trimerów), odpowiedni do wywołania apoptozy, dla której niezbędna jest oligomeryzacja na powierzchni komórki, uzyskana dzięki specyficznemu łącznikowi białka fuzyjnego (3) według wynalazku, zastosowanego jako składnik B; jest już, praktycznie optymalny i może być nieznacznie zwiększony poprzez utworzenie wyższorzędowych agregatów według wynalazku.
Na Fig. 6A przedstawiono sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego (4), FacL-ACRP30, według niniejszego wynalazku, które to białko fuzyjne (4) (sekwencja od N do C końca) posiada sekwencję znacznikową, sekwencję łącznikową, jako składnik B, aminokwasy 18 do 111 białka mACRP30 (m: mysie), łącznik LQ a następnie aminokwasy 139 do 281 hFasL składnika A.
Na Fig. 6B przedstawiono kolejne białko fuzyjne. Zawiera ono domenę kolagenową liganda ludzkiego ACRP30 (hACRP30, aminokwasy 18 do 111), przy czym jego N-koniec jest połączony z końcową sekwencją znacznikową (flag tag) DYKDDDDK a jego C-koniec z zewnątrzkomórkową domeną ludzkiego FasL (AA 139 do 281). Pomiędzy C-końcem hACRP30 a hFasL, jak również między końcową sekwencją znacznikową a N-końcem hACRP30 (GPGQVQLQ), wstawiono sekwecję łącznikową (MHVD). Wszystkie wyżej wspomniane dane odnoszą się do jednoliterowego kodu aminokwasowego.
Na Fig. 6C przedstawiono krzywe otrzymane na podstawie miareczkowania komórek T Jurkat z użyciem FasL, z jednej strony, i z użyciem białka fuzyjnego hACRP30/FasL, z drugiej strony, przy zastosowaniu przeciwciała M2 (+) swoistego wobec Flag i bez dodatku przeciwciała M2 (-) swoistego wobec Flag. Następnie, do komórek T Jurkat dodano supernatanty (OPTIMEM), uzyskane z komórek 293, przejściowo transfekowanych z użyciem FasL lub hACRP30/FasL i ekspresjonujących te białka. W kolejnych eksperymentach stosowano malejące stężenia, przedstawione na osi X, na Fig. 6C i określano odpowiadającą im żywotność komórek T Jurkat, stosując standardowy, niżej opisany test
PL 204 277 B1 cytotoksyczności. Z wykresu jasno wynika, że FasL jest nieaktywne bez poprzecznie łączącego przeciwciała M2 (♦) i jedynie efekt wiązania poprzecznego przeciwciała M2 wywołuje cytotoksyczność. Przeciwnie, odpowiadający temu efekt białka fuzyjnego według niniejszego wynalazku, zwanego hACRP30/FasL, widoczny był bez dodania przeciwciała M2 (▲). Dodatek przeciwciał M2 nieznacznie zwiększał efekt białka fuzyjnego według niniejszego wynalazku.
Analogicznie do treści zawartej na Fig. 3, na Fig. 7 przedstawiono żywotność komórek BJAB po dodaniu trimerów FasL, niezdolnych do bimeryzacji lub oligomeryzacji (eksperyment porównawczy na bazie białka fuzyjnego (1), według Fig. 1; Figura 7A) i dodaniu oligomerów według niniejszego wynalazku, w postaci tetramerów trimerów, innymi słowy dodekamerów, białka fuzyjnego (4) według niniejszego wynalazku i Fig. 6, w obecności (▲) lub braku (Δ) przeciwciał M2 swoistych wobec flag. Trimery FasL, nie będące w zgodzie z niniejszym wynalazkiem, nie wywierają działania apoptotycznego na komórki BJAB przy braku przeciwciał ulegających oligomeryzacji poprzez wiązanie z sekwencją znacznikową (flag) (Fig. 7A, (Δ)), natomiast dodekamer według niniejszego wynalazku (tetramer trimerów) białka fuzyjnego (4), indukuje śmierć komórki już w stężeniu w przybliż eniu 10 ng/ml (K50 = 8 ng/ml) (Fig. 7B). Można to wyraźnie zaobserwować na podstawie redukcji OD przy 490 nm. Aktywność apoptyczna może być nieco zwiększona poprzez dodanie przeciwciał M2 specyficznych wobec flag, do preparatu dodekamerów według wynalazku, zawierającego białka fuzyjne FasL-ACRP30 według niniejszego wynalazku, tj., dodekamer według wynalazku odpowiada praktycznie optymalnemu sposobowi agregacji w aspekcie aktywności apoptotycznej. Przeciwnie, dalsza agregacja do struktur wyższorzędowych według niniejszego wynalazku, wywołana przez odpowiednie przeciwciała, nie powoduje jakichkolwiek znaczących skutków biologicznych.
Na Fig. 8 (TRAIL-ACRP30) przedstawiono sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego (5) według niniejszego wynalazku, obejmującą aminokwasy 95 do 281 hTRAIL, jako składnik A w połączeniu z domeną ulegają c ą oligomeryzacji ACRP30 (AA 18-111), jako skł adnik B. Zatem, w zgodzie z niniejszym wynalazkiem, biał ko fuzyjne (5) występuje w roztworze jako oligomer, zwany jako tetramer trimerów.
Na Fig. 9 przedstawiono żywotność komórek Jurkat po dodaniu trimerów TRAIL (białko fuzyjne z sekwencją znacznikową na końcu N i aminokwasy 95 do 281 ludzkiego TRAIL) według stanu techniki, nie wykazujących zdolności do bimeryzacji lub oligomeryzacji (eksperyment porównawczy, Fig. 9A) i dodekamerów według niniejszego wynalazku, białka fuzyjnego (5) według wynalazku, TRA-IL-ACRP30, w obecności (▲) lub przy braku (Δ) przeciwciał M2, swoistych wobec flag. Obserwacje dokonane w eksperymencie przedstawionym na Fig. 9 odpowiadają wynikom zamieszczonym na Fig. 7. Trimery TRAIL nie powodują działania apoptotycznego wobec komórek Jurakt przy braku przeciwciał ulegających wiązaniu poprzez sekwencję flag (Fig. 9A, (Δ)), natomiast dodekamer według niniejszego wynalazku białka fuzyjnego (5) indukuje śmierć komórki w tym eksperymencie, w stężeniu w przybliżeniu 100 ng/ml (~K50) (Fig. 9B (Δ)). W wyniku dalej wzrastającego stopnia oligomeryzacji, łączne dodawanie dodekamerów TRAIL i przeciwciał anty-flag może ponadto powodować powstawanie wyższorzędowych agregatów według wynalazku, które, w tym wypadku, zwiększyły (przynajmniej dziesięciokrotnie) aktywność indukującą apoptozę (Fig. 9B, (▲)), oligomerów według wynalazku.
Na Fig. 10 (TNFa-ACRP30) przedstawiono sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego (6) według niniejszego wynalazku, zawierającego aminokwasy 77 do 235 mTNFa (m:mysie) jako składnik A w połączeniu z domeną ulegającą oligomeryzacji, mACRP30 (AA 18-111) jako składnik B oraz sekwencję znacznikową z łącznikiem na końcu N. Oznacza to, że białko fuzyjne (6) występuje w roztworze jako dodekamer, zwany oligomerem (tetramer) multimerów (trimerów).
Na Fig. 11 przedstawiono wyniki eksperymentu proliferacji komórek. Miarą proliferacji komórek CT6 było wbudowywanie 3[H] do komórek CT6 myszy w funkcji stężenia trimerów białek fuzyjnych według stanu techniki (sekwencja znacznikowa lub łącznikowa na N-końcu kolejnych aminokwasów 77 do 235 mysiego TNFa) bez składnika B, innymi słowy trimeru TNFa (Fig. 11A) lub dodekamerów (4 x 3) według wynalazku białek fuzyjnych według wynalazku (6) wg Fig. 6, mTNFa-ACRP30 (Fig. 11B). Włączenie 3[H]-tymidyny określano w zliczeniach na minutę (cpm). Eksperymenty przeprowadzano w obecności (▲) lub braku (Δ) przeciwciał M2 swoistych wobec flag. Trimer mTNFa wg stanu techniki wywołał jedynie nieznaczny efekt proliferacyjny wobec komórek CT6 po wiązaniu z receptorem 2 TNF (TNF-R2) (Fig. 11A). Wyraźny efekt zwiększenia
PL 204 277 B1 proliferacji obserwowano jedynie po dodaniu przeciwciał anty-flag (▲), ze względu na ich poprzeczne wiązanie i efekt oligomeryzacji.
Przeciwnie do powyższego, na Fig. 11B przedstawiono silny efekt proliferacyjny (obserwowany już przy stężeniu 5 ng/ml) (D) oligomerów według wynalazku trimerów, tutaj dodekameru białka fuzyjnego (6) według wynalazku. Łączny wpływ wiązania poprzecznego przeciwciał anty-flag i dodekamerów (▲) według wynalazku wywołuje jedynie niewielki efekt proliferacyjny, w porównaniu z dodatkiem jedynie dodekameru według wynalazku. Z badań wynika, że oligomer według wynalazku, tutaj w postaci dodekameru, posiada już, praktycznie optymalną, aktywność proliferacyjną.
Na Fig. 12 (CD40L-ACRP30) przedstawiono sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego (7) według niniejszego wynalazku, zawierającego aminokwasy 116 do 261 hCD40L (h:ludzkie) jako składnik A w połączeniu z domeną ulegającą oligomeryzacji, mACRP30 (AA 18-111) jako składnik B.
Na Fig. 13 przedstawiono w dokładnie taki sam sposób, jak na Fig. 11, wyniki eksperymentu proliferacji komórkowej. Jednakże, w tym przypadku, przeciwnie do Fig. 11, zastosowano ludzkie PBL (limfocyty krwi obwodowej). Na figurze zademonstrowano wpływ tradycyjnego CD40L, obecnego w roztworze w postaci trimeru (sekwencja znacznikowa i sekwencja łącznikowa, jak na Fig. 12, kolejna sekwencja od AA 16 do 261 hCD40L bez składnika oligomeryzacji B; Fig. 13A) na proliferację komórek, w porównaniu z efektem wywołanym obecnością dodekamerów według wynalazku białek fuzyjnych (7) według wynalazku, jak przedstawiono na Fig.12, CD40L-ACRP30 (Fig. 13B). Eksperymenty wykonane przy braku (D) przeciwciał M2 anty-flag wskazują, że trimer CD40L nie wywiera praktycznie żadnego efektu proliferacjnego, natomiast na Fig. 13B można zaobserwować odpowiadający efekt proliferacji już przy dużo niższych stężeniach hCD40L. Na Fig. 13B, oś X odpowiada zmiennej „1/rozcieńczenie, innymi słowy, nie dotyczy całkowitego stężenia, ze względu na to, że dodawano stężony supernatant o nieznanym stężeniu całkowitym. Łączne działanie wiązania poprzecznego przeciwciał skierowanych wobec flag i dodekamerów białka fuzyjnego (7) według wynalazku (▲) może powodować dalsze (w kierunku niższych stężeń) przesunięcie odpowiadającego efektu proliferacji, poprzez powstawanie wyższorzędowych agregatów.
Na Fig. 14 przedstawiono schematyczną strukturę multimerów oligomerycznych. Na Fig. 14A i 14B zademonstrowano pojawienie się natywnych „biał ek pakietowych już w ich natywnej oligomerycznej strukturze (Fig. 14A: heksamer z trimerem domeny główkowej, który tworzy białko dopełniacza C1q; Fig. 14B: tetramer trimerów domeny główkowej, tworzący ACRP30, białko surowicy produkowane przez adipocyty). W ten sposób, domeny główkowe natywnych monomerów kompleksu C1q lub ACRP30 ulegają multimeryzacji i oligomeryzacji. Kompleks oligomeryzacyjny C1q powstaje z trzech różnych produktów genu, natomiast kompleks oligomeryzacyjny ACRP30 jest homododekamerem, innymi słowy, tworzony jest z identycznych, multimeryzowanych i oligomeryzowanych produktów genu. Każdy z odpowiednich, poszczególnych łańcuchów polipeptydowych, stanowiących podstawę wspomnianych kompleksów, posiada domenę główkową, fragment sekwencji tworzący potrójną helisę kolagenu i fragment sekwencji ulegający oligomeryzacji 6 (kompleks C1q) lub 4 (kompleks ACRP30) potrójnych helis kolagenowych do pęczku helis, odpowiednio 18 lub 12 monomerów.
Na Fig. 14C schematycznie przedstawiono oligomeryczny multimer według niniejszego wynalazku białka fuzyjnego według niniejszego wynalazku (np., przedstawionego na Fig. 6 białka fuzyjnego (4), FasL-ACRP30). Obejmuje on cztery trimeryczne ligandy TNF (np., TNF ligand FasL) lub segmenty ligandów TNF jako składnik A, ulegający oligomeryzacji do homododekameru według wynalazku, poprzez fragmenty sekwencji kolagenopodobne białka ACRP30 jako składnik B, występujący, np., w białku fuzyjnym według wynalazku.
Na Fig. 15A przedstawiono otrzymywanie kolejnego białka fuzyjnego według wynalazku, zwanego hEDA/FasL. Domena kolagenowa ludzkiego EDA (aminokwasy 160 do 242) pełni rolę składnika B, z którym związany jest epitop Flag na N-końcu poprzez łącznik, i do którego, C-końcowo, również poprzez łącznik, przyłączony jest składnik A, FasL (AA139-281, tj., domena zewnątrzkomórkowa FasL lub jej fragment). Białko fuzyjne hEDA/FasL według wynalazku występuje jako heksamer, 2x3-mer. Białko EDA jest dalszym członkiem rodziny TNF, posiadającym również domenę kolagenową (jak wyżej, Fig. 15A), obok domeny przezmembranowej i domeny TNF, obejmującym u człowieka 391 AA.
Na Fig. 15B zilustrowano wyniki badań nad białkiem fuzyjnym hEDA/FasL według wynalazku. W celu otrzymania biał ka fuzyjnego, w pierwszym etapie, amplifikowano, przy uż yciu odpowiednich
PL 204 277 B1 primerów, domenę kolagenową ludzkiego EDA (AA 160 do 242), a następnie łączono z odpowiednimi sekwencjami, na N- i C-końcu, odpowiednio z Flag i zewnątrzkomórkową domeną ludzkiego FasL (AA 139 do 281). Na Fig. 15B przedstawiono krzywe uzyskane na podstawie wyników miareczkowania komórek T Jurkat z użyciem FasL, z jednej strony, i białka fuzyjnego hEDA/FasL z drugiej, z dodanym przeciwciałem M2 anty-Flag lub bez tego przeciwciała. Następnie, do komórek Jurkat dodawano supernatanty (OPTIMEM) 239 komórek, przejściowo transfekowanych FasL lub hEDA/FasL i ekspresjonujących te białka. W kolejnych eksperymentach, zastosowano malejące stężenie, zaznaczone na osi X na Fig. 15B, i określano odpowiadający mu poziom żywotności komórek T Jurkat, stosując standardowy, poniżej opisany tekst cytotoksyczności. Z wykresu jasno wynika, że FasL jest nieaktywne bez wiążącego poprzecznie przeciwciała M2 (□). W tym przypadku, jedynie efekt wiązania poprzecznego przez przeciwciało M2 wywołuje efekt cytotoksyczny (). Przeciwnie do wspomnianych wyników, odpowiedni efekt białka fuzyjnego według wynalazku, zwanego hEDA/FasL, osiągnięto bez dodania przeciwciała M2 (o). W tym przypadku, dodanie przeciwciał M2 może zwiększyć jeszcze efekt działania białka fuzyjnego według wynalazku (•).
Niniejszy wynalazek wyjaśniono szczegółowo za pomocą następujących realizacji:
Następujące eksperymenty (a) do (f) stanowią odniesienie do sześciu poniższych realizacji, pod warunkiem, że nie dotyczą odpowiednich, ujawnionych w cytowaniach, modyfikacji:
(a) otrzymywanie wektora dla białek fuzyjnych FasL, TRAIL, TNFa i CD40L
Fragment DNA, kodujący peptyd sygnałowy hemaglutyniny, włączając 6 zasad nie ulegającej translacji sekwencji regionu 5' (CAA AAC ATG GCT ATC ATC TAC CTC ATC CTC CTG TTC ACC GCT GTG CGG GGC) i epitop flag (GAT TAC AAA GAC GAT GAC GAT AAA), łącznik (GGA CCC GGA CAG GTG CAG), miejsca restrykcyjne Pstl, SalI, XhoI i BamHI, klonowano między miejscem restrykcyjnym Hindll a BamHI zmodyfikowanego wektora PCRIII (InVitrogen, NV Leek, Netherlands), w którym wycięto zasady 720-769 (PS 038). W celu uzyskania wektora ekspresji trimerycznego FasL, amplifikowano stosując PCR aminokwasy 139 do 281 sekwencji kodującej ludzkie białko FasL, znajdujące się między miejscami restrykcyjnymi Pstl i EcoRI i klonowano w zmodyfikowanym wektorze PCRIII.
W celu uzyskania heksamerycznego FasL, sekwencję kodującą aminokwasy 103 do 281, sąsiadującą po obu stronach z miejscami restrykcyjnymi EcoRI, a ponadto, z sekwencją łącznikową GGCTT na 5' końcu i na końcu 3' z kodonem stop (TAA) i naturalną, nie ulegającą translacji sekwencją (GAG AAG CAC TTT GGG ATT CTT TCC ATT ATG ATT CTT TGT TAC AGG CAC CGA GAT GTT GAA GCC), klonowano w miejscu restrykcyjnym EcoRI wektora PS 038. „Super FasL (Fig. 4, białko fuzyjne (3)) otrzymano poprzez wprowadzenie mutacji punktowej w sekwencji łącznikowej wektora PS 038, w której sekwencja CAGTGTGCTG z 5' strony miejsca reastrykcyjnego EcoRI została zastąpiona przez CAGTCTGCAG, przy użyciu metod mutacji PCR. Następnie, FasL (aminokwasy 103 do 281) klonowano do zmodyfikowanego w ten sposób PS 038.
W celu uzyskania ludzkiego TRAIL, mysiego TNFa i ludzkiego CD40L, fragmenty zewnątrzkomórkowych domen (TRAIL: aminokwasy 95 do 281), TNFa: aminokwasy 77 do 235, CD40L: aminokwasy 116 do 261) z miejscami restrykcyjnymi Pstl na końcu 5' i kodonem stop oraz miejscami restrykcyjnymi Spel i EcoRI, amplifikowano PCR i klonowano w wektorze PCRIII (Invitrogen). W celu uzyskania ekspresji ligandów jako trimerów, w pierwszym etapie, wstawiano sekwencję GAT TAC AAA GAC GAT GAC GAT GAT AAA, kodującą odcinek znakujący flag tag i sekwencję łącznikową GGA CCC GGA CAG GTG CAG pomiędzy miejscem restrykcyjnym BamHI a Pstl wektora pQE-16 (Qiagen) (PS 330). W kolejnym etapie, ligandy subklonowano jako fragmenty Pstl/Spel w PS 330.
Wektor ekspresji dla FasL-ACRP30 otrzymano w następujący sposób. Przy użyciu EST klonu AA673154, klonowano metodą PCR sekwencję kodującą aminokwasy 18 do 111 mysiego ACRP30, ograniczoną miejscami restrykcyjnymi Nsil i Pstl, do wektora kodującego trimeryczne FasL (tak, by połączone miejsce restrykcyjne Nsil/Pstl położone było po 5' stronie sekwencji kodującej). Wektory ekspresji białek fuzyjnych innych cytokin TNF z ACRP30 otrzymywano poprzez podstawienie w miejscu restrykcyjnym Pstl i EcoRI odpowiedniej sekwencji FasL w wektorze ekspresji FasL-ACRP30 odpowiednią sekwencją liganda.
b) Ekspresja i oczyszczanie rekombinowanych białek fuzyjnych:
Otrzymywano stabilne klony w bakteriach (szczepu M15 z plazmidu pRep4, Qiagen) dla trimerycznego TRAIL, TNFa i CD40L. Odpowiednie klony hodowano wstępnie przez noc w 37°C w bulionie LP z ampicyliną (100 mg/ml) i kanamycyną (50 mg/ml) i stosowano do zaszczepienia hodowli głównej
PL 204 277 B1 (rozcieńczenie 1:50, wzrost w 37°C) kultury o ekspresji indukowanej po godzinie 0.5 mM IPTG (Sigma) przez 6 godzin. Bakterie zbierano wirując, przemywano dwukrotnie PBS, poddawano lizie w prasie francuskiej i oddzielano lizat od nierozpuszczalnych pozostałości drogą wirowania. Otrzymano stabilne klony dla wszystkich białek FasL w komórkach HEK293, stosując selekcję w 800 mg/ml G418 (patrz, cyt., jak również Schneider i wsp., J.Exp.Med., 1998).
Trimeryczne i heksameryczne ligandy oraz super FasL oczyszczano z supernatantów stabilnych klonów lub bakteryjnych lizatów stosując chromatografię powinowactwa na agarozie M2 (Sigma, Switzerland), wymywanej 50 mM cytrynianem NaOH (pH = 2.5) i natychmiast neutralizowanej 0.2 obj . Tris-HCl (pH =8). Do zatężania, bufor zastąpiono PBS (Centrikon-30, Amicon Corp., Easton, TX, USA).
Produkty fuzji FasL i mysiego ACRP30 oczyszczano w podobny sposób. Supernatanty mieszano z 50 mM NaCl i 1 mM CaCl2 i doprowadzano pH do wartości 7.0 stosując kwas chlorowodorowy/NaOH. Rekombinowane białko wiązano następnie na agarozie M1 (Sigma, Switzerland) i wymywano TBS-EDTA (10 mM). Do zatężania, bufor zastąpiono PBS. Koncentrat oczyszczonych białek charakteryzowano stosując proces kwasu bicynchonindynowego (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA) i albuminę surowicy wołowej jako standard, a następnie określano czystość prób przy użyciu SDS-PAGE i barwienie Coomassie-Blue.
Białka fuzyjne TRAIL, TNFa i CD40L z ACRP30 dodawano w odpowiednich analizach w postaci wzbogaconych supernatantów, otrzymanych w następujący sposób: Komórki 293T transfekowano odpowiednimi plazmidami ekspresyjnymi przy użyciu metody fosforanu wapnia. Po inkubacji komórek z odczynnikiem wywołującym precypitację przez 16 godzin, komórki przemywano PBS i inkubowano przez 4 dni w nie zawierającym surowicy podłożu (Optimen, Gibco BRL). Supernatanty redukowano do jednej dwudziestej początkowej objętości poprzez zatężenie, a następnie kontrolowano obecność białka techniką Western blotting. W przypadku TRAIL-ACRP30 i TNFa-ACRP30, w celu określenia odpowiedniego stężenia rekombinowanych białek fuzyjnych, wynik miareczkowania tych białek porównywano z wynikiem dla oczyszczonych TRAL lub TNFa.
(c) Określenie masy cząsteczkowej multimerów przy użyciu sączenia molekularnego:
Wielkość różnych białek fuzyjnych określano stosując filtrację żelową przez Superdex 200 HR10/30 (Pharmacia). Rekombinowane białko wraz z wewnętrznymi standardami, katalazą i owalbuminą, w przypadku trimerycznych i heksamerycznych ligandów oraz ferrytyną i owalalbuminą dla białek fuzyjnych ACRP30, nakładano na kolumnę w objętości 200 ml, wymywano PBS (0.5 ml/min) i zbierano w frakcjach 0.25 ml. Obecność białek w różnych frakcjach po wtrąceniu kwasem trichloroetanowym określano stosując Western blotting. Wielkość białek określano przy użyciu tyroglobuliny (669 kDa), ferrytyny (440 kDa), katalazy (262 kDa), aldolazy (158 kDa), albuminy surowicy wołowej (67 kDa), owalbuminy (43 kDa), chymotrypsynogenu A (25 kDa) i rybonukleazy A (13.7 kDa).
(d) Komórki:
Mysie komórki A20 chłoniaka B przechowywano w DMEM, zawierającym 5% inaktywowanej cieplnie FCS. Ludzkie komórki Jurkat chłoniaka T, komórki BJAB chłoniaka Burkitta hodowano w RPMI wraz z 10% FCS. Ludzkie komórki embrionalne nerki 293 hodowano w DMEM wieloskładnikowej mieszaninie F12 (1:1), wzbogaconej 2% FCS. Wszystkie podłoża zawierały antybiotyki (odpowiednio, penicylinę i streptomycynę w 5 mg/ml i neomycynę w stężeniu 10 mg/ml). Zależną od IL-2, mysią, linię CT6 cytotoksycznych komórek T, hodowano w RPMI, uzupełnionym o 10% FCS, 1 mM pirogronian sodu, 50 mm 2-merkaptoetanol, 10 mM Hepes i 10% kondycjonowany supernatant komórek EL-4.
(e) Analiza cytotoksyczności:
Analizę cytotoksyczności przeprowadzono dokładnie według wcześniejszego opisu Schneider i wsp. (J.Biol.Chem. ,
272:18827-18833, 1997). Pięćdziesiąt tysięcy komórek inkubowano przez 16 godzin w 100 ml podłoża, przez co podłoże zawierało możliwe do wykazania stężenie liganda, w obecności lub przy braku 1 ml/ml przeciwciała M2 (2 ml/ml dla TRAIL). Żywotność (poziomy przeżywalności komórek) określano stosując PMS/MTS (fenanzymetosiarczan 3-[4,5-dimetylotiazol-2-ylo]-5-[3-karboksymetoksyfenylo]-2-[4-sulfofenylo]-2H-tetrazolium, sól] (Promega Corp., Madison, WI). W wymaganym czasie dokonywano wybarwienia (zazwyczaj 1-3 godziny). Absorbancję mierzono przy 490 nm.
(f) Analiza proliferacji komórek B
Komórki CD-19 pozytywne wybrano stosując sortowanie FACS z ludzkich PBL (limfocytów krwi obwodowej) i magnetyczne „kuleczki, natomiast komórki CD-19 negatywne napromieniowywano
PL 204 277 B1
3000 radami. Sto tysięcy oczyszczonych CD-19 pozytywnych komórek inkubowano przez 72 godz. na 96-studzienkowych płytkach z 100,000 autologicznych CD-19-negatywnych, naświetlanych PBL w 120 ml podłoża (RPMI 10% FCS, antybiotyki), wraz z miareczkowanymi, rozpuszczalnymi białkami fuzyjnymi CD40L, z lub bez, przeciwciał M2 (10 mg/ml). Następnie, komórki napromieniowywano przez 6 godzin [3H]-tymidyna i mierzono poziom jej włączenia licznikiem scyntylacyjnym dla cieczy.
Odnośnie opisu metod zastosowanych do realizacji wynalazku, publikacją odnośnikową jest praca Schneider i wsp. (J.Exp.Med., vol. 187, nr 8, 1998, 1205-1213) i publikacje załączone tytułem referencji.
realizacja
Ekspresjonowane rekombinowane białko fuzyjne (2) posiadało aminokwasy 103 do 281 z hFasL (h:ludzkie) jako składnik A a na końcu N aminokwasu 103 sekwencji 18 AA (VDLEGSTSNGRQCAGIRL, tzw. specyficzny łącznik) jako składnik B. Ponadto, w dalszej kolejności, na N-końcu fuzyjnego białka następowała sekwencja znacznikowa aminokwasów DYKDDDDK i sekwencja łącznikowa GPGQVQLQ (N-końcowy składnik B) (Fig. 1).
W eksperymentach porównawczych zastosowano ekspresjonowane biał ko fuzyjne (1), posiadające również wymienioną wyżej sekwencję znacznikową na N-końcu z tą samą sekwencją łącznikową na C-końcu i połączoną z nią na C-końcu, sekwencją aminokwasów 139 do 281 z hFasL. Zgodnie z powyższym, białko fuzyjne (1) różniło się od białka fuzyjnego (2) delecją obejmującą specyficzny łącznik i sekwencję aminokwasową 103 do 138 z hFasL (Fig. 1).
Wektor białek fuzyjnych (1) i (2) otrzymano według procedury opisanej w (a). Ekspresję i oczyszczanie wykonano zgodnie z procedurą opisaną w (b).
Oczyszczone białka fuzyjne (1) poddawano działaniu redukujących i nieredukujących warunków, a następnie rozdzielano efektroforetycznie na żelu (Fig. 2), oceniając w przybliżeniu masę cząsteczkową odpowiednich prążków.
W ostatnim etapie, komórki A20 i Jurkat, hodowane wedł ug (d), usuwano i poddawano analizie cytotoksyczności według (e). Analizę wykonano (Fig. 3) dla obu linii komórkowych, stosując wzrastające stężenia trimerycznego białka fuzyjnego (1) lub bimerycznych trimerów (czyli heksamerów) białka fuzyjnego (2), w obecności lub przy braku, przeciwciał M2 anty-flag (Sigma, Buchs, Switzerland), i odczytują c absorbancję dla OD 490 nm.
realizacja
Ekspresjonowane rekombinowane białko fuzyjne (3) posiadało aminokwasy 103 do 281 z hFasL jako skł adnik A a na koń cu N aminokwasu 103 sekwencji 18 AA (VDLEGSTSNGRQSAGIRL, tzw. specyficzny łącznik) jako składnik B. Ponadto, w dalszej kolejności, na N-końcu fuzyjnego białka (N-końcowo wobec składnika B) następowała sekwencja znacznikowa aminokwasów DYKDDDDK i sekwencja łącznikowa GPGQVQLQ (Fig. 4).
W eksperymentach porównawczych zastosowano ekspresjonowane w ten sam sposób, jak w 1 realizacji, biał ko fuzyjne (1) (Fig. 4).
Wektor białek fuzyjnych (3) i (1) otrzymano według procedury opisanej dla 1 realizacji. Ekspresję i oczyszczanie fuzyjnych białek wykonano zgodnie z procedurą opisaną w (b).
W ostatnim etapie, komórki A20 i Jurkat, hodowane wedł ug (d), usuwano i poddawano analizie cytotoksyczności według (e). Analizę wykonano (Fig. 5) dla obu linii komórkowych, stosując wzrastające stężenia trimerycznego białka fuzyjnego (3), w obecności lub braku, przeciwciał M2 anty-flag (Sigma, Buchs, Switzerland), i odczytując absorbancję dla OD 490 nm.
realizacja
Ekspresjonowane rekombinowane białko fuzyjne (4) posiadało aminokwasy 139 do 281 z hFasL jako składnik A a na końcu N aminokwasu 139 składnika A, pierwszy dimer łącznikowy o sekwencji LQ, a następnie, wciąż na N-końcu, sekwencję 94 AA z białka mACRP30 (AA 18 do 111), domenę ulegającą oligomeryzacji, jako składnik B. Ponadto, w dalszej kolejności, na N-końcu fuzyjnego białka (4) (N-końcowo od składnika B) następowała sekwencja znacznikowa aminokwasów DYKDDDDK i sekwencja łącznikowa GPGQVQLH (Fig. 6).
Białko fuzyjne (1) zastosowano w eksperymentach analizy porównawczej.
Ekspresję i oczyszczanie wykonano zgodnie z procedurą opisaną w (b).
W ostatnim etapie, komórki chł oniaka BJAB Burkitta i komórki Jurkat, hodowane wedł ug (d), usuwano i poddawano analizie cytotoksyczności według (e). Analizę wykonano (Fig.7) dla obu linii komórkowych, stosując wzrastające stężenia trimerycznego białka fuzyjnego (1) lub oligomerycznych trimerów (dodekamerów) białka fuzyjnego (4), tzn., rekombinowanego FasL-ACRP30 (4x3),
PL 204 277 B1 w obecności lub braku przeciwciał M2 anty-flag (Sigma, jak wyżej), i odczytując absorbancję dla
OD 490 nm.
realizacja
Ekspresjonowane rekombinowane białko fuzyjne (5) posiadało aminokwasy 95 do 281 z hTRAIL (h:ludzkie) jako składnik A a na końcu N aminokwasu 95 składnika A, w pierwszej kolejności dimer łącznikowy o sekwencji LQ, a następnie bliżej N-końca, sekwencję 94 AA z białka mACRP30 (AA 18 do 111), domenę ulegającą oligomeryzacji, jako składnik B. Ponadto, w dalszej kolejności, na N-końcu fuzyjnego białka (N-końcowo od składnika B) następowała sekwencja znacznikowa aminokwasów DYKDDDDK i sekwencja łącznikowa GPGQVQLH (Fig. 8).
W eksperymentach porównawczych zastosowano ekspresjonowane białko fuzyjne (nie przedstawione na Fig. 8), występujące w roztworze jako trimer (trimer TRAIL). Użyte w eksperymencie porównawczym białko posiadało (od N-końca do C-końca) sekwencję znacznikową, łącznik o sekwencji GPGQVQLH i na końcu, hTRAIL (AA 95 do 281). Przeciwnie, niż w przypadku białka fuzyjnego (5), składnik B (mACRP30: AA 18 do 111) i łącznik o sekwencji LQ były nieobecne.
Ekspresję i oczyszczanie wykonano zgodnie z procedurą opisaną w (b).
W ostatnim etapie, komórki Jurkat chłoniaka złośliwego, hodowane według (d), usuwano i poddawano analizie cytotoksyczności według (e). Analizę wykonano (Fig. 9) stosując wzrastające stężenia trimerów białka fuzyjnego bez sekwencji ACRP30 (dla porównania) lub oligomeryczne trimery białka fuzyjnego (5), czyli dodekameru rekombinowanego TRAIL-ACRP30 (4x3), w obecności lub braku przeciwciał M2 anty-flag (Sigma, jak wyżej), i odczytując absorbancję dla OD 490 nm.
realizacja
Ekspresjonowane rekombinowane białko fuzyjne (6) posiadało aminokwasy 77 do 235 z mTNFa (m:mysie) jako składnik A a na końcu N aminokwasu 85, w pierwszej kolejności dimer łącznikowy o sekwencji LQ, a następnie N-końcowo, sekwencję 94 AA z białka mACRP30 (AA 18 do 111), domenę ulegającą oligomeryzacji, jako składnik B. Ponadto, na N-końcu fuzyjnego białka (N-końcowo od składnika B) następowała sekwencja znacznikowa aminokwasów DYKDDDDK i sekwencja łącznikowa GPGQVQLH (Fig. 10).
W eksperymentach porównawczych zastosowano ekspresjonowane białko fuzyjne (nie przedstawione na Fig.10), występujące w roztworze jako trimer (trimer TNFa). Użyte w eksperymencie porównawczym białko posiadało (od N-końca do C-końca) sekwencję znacznikową, łącznik o sekwencji GPGQVQLH i na końcu, mTNFa (AA 77 do 235). Przeciwnie, niż w przypadku białka fuzyjnego (6), składnik B (mACRP30: AA 18 do 111) i łącznik o sekwencji LQ były nieobecne.
Ekspresję i oczyszczanie wykonano zgodnie z procedurą opisaną w (b).
Stosując analizę proliferacji według (f), określono wpływ na komórki CT6 dodatku wzrastających stężeń trimerów TNFa lub oligomerów TNFa-ACRP30 (homododekamerów TNFa), w obecności lub braku przeciwciał M2 anty-flag (Sigma, jak wyżej).
W tym celu, komórki CT6 otrzymywano przez 4 dni przed rozpoczęciem eksperymentu proliferacji, w obecności zredukowanych stężeń supernatantów EL-4 (2.5%). Komórki inkubowano na 96-studzienkowej płytce (40,000 komórek na studzienkę), przez 16 godzin w obecności wskazanych stężeń oligomerów TNFa-ACRP30 lub mTNFa, w obecności lub braku 2 mg/ml monoklonalnych przeciwciał M2 i z dodatkiem supernatantu EL-4. Komórki dodatkowo napromieniowywano, przez 6 godzin [3H]-tymidyną (0.5 mCi/studzienkę), poddawano trzem cyklom zamrażania i roztapiania, po czym zbierano. Stopień wbudowania [3H]-tymidyny mierzono licznikiem scyntylacyjnym dla cieczy (Fig. 11).
realizacja
Ekspresjonowane rekombinowane białko fuzyjne (7) posiadało aminokwasy 116 do 261 z hCD40L (h:ludzkie) jako składnik A a na końcu N aminokwasu 95 składnika A, w pierwszej kolejności dimer łącznikowy o sekwencji LQ, a następnie, N-końcowo, sekwencję 94 AA z białka mACRP30 (AA 18 do 111), domenę ulegającą oligomeryzacji, jako składnik B. Ponadto, w dalszej kolejności, na N-końcu fuzyjnego białka (N-końcowo od składnika B) następowała sekwencja znacznikowa aminokwasów DYKDDDDK i sekwencja łącznikowa GPGQVQLH (Fig. 12).
W eksperymentach porównawczych zastosowano ekspresjonowane białko fuzyjne (nie przedstawione na Fig. 12), występujące w roztworze jako trimer (trimer CD40L). Użyte w eksperymencie porównawczym białko posiadało (od N-końca do C-końca) sekwencję znacznikową, łącznik o sekwencji GPGQVQLH i na końcu, hCD40L (AA 116 do 261). Przeciwnie, niż w przypadku białka fuzyjnego (7), składnik B (mACRP30: AA 18 do 111) i łącznik o sekwencji LQ były nieobecne.
PL 204 277 B1
Ekspresję i oczyszczanie wykonano zgodnie z procedurą opisaną w (b).
W ostatnim etapie, przeprowadzono analizę proliferacji komórek według (f), analogicznie, na PBL, przy czym dodawano CD40L trimer oligomerów CD40L-ACRP30 (homododekamery) w obecności i przy braku przeciwciał M3 specyficznych wobec sekwencji znacznikowej (flag) (Sigma, jak wyżej) (Fig. 13).
realizacja
7.1 Procedury eksperymentalne realizacja dotyczy białek fuzyjnych, zawierających poddany multimeryzacji lub oligomeryzacji składnik A oraz receptor jako składnik B.
(A) Otrzymywanie wektora
Białka fuzyjne otrzymywano ze zmodyfikowanego wektora PCR-3 (z Invitrogen), w wyniku wymiany wewnętrznych modułów w następujący sposób (5' do 3'):
(a) moduł Hindlll/Sall, zawierający zewnątrzkomórkową domenę receptora, z poprzedzającą sekwencją Kozak GCCACC (w przypadku hTNF-R1 (aminokwasy 1-211); h-TRAIL-R1 (aminokwasy 1-239); h-TRAIL-R2 (aminokwasy 1-212); h-TRAIL-R3 (aminokwasy 1-240) i hCD40 (aminokwasy 1-193) lub w przypadku hFasR (aminokwasy 1-170), na skutek umieszczenia z przodu 24 nukleotydów 5'nie ulegającego translacji regionu); (b) 14-aminokwasowy łącznik (PQPQPKPQPKPEPE) w kasecie SalI/XhoI (zgodnie z opisem wg Terskikh i wsp. (1997), Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94, 1663); (c) domena oligomeryzacyjna w module XhoI/NotI w przypadku OPG (aminokwasy 187-401, tu, oznaczone jako dN-OPG), CMP (aminokwasy 451-493), GenBank 115555); COMP (aminokwasy 32-75, GenBank 1705995); (d) kaseta NotI/XbaI, zawierająca połączenie His6-myc-tag i kodon stop. Domena oligomeryzacyjna była otoczona przez sekwencje aminokwasowe GGCC i ARTPGGGS, odpowiednio, na N- i C-końcu. Dla wszystkich konstruktów zastosowano łączniki. W przypadku konstruktów Fc, region „zawiasowy, domeny CH2 i CH3 oraz kodon stop z hlgG1, klonowano jako kasetę Sall/Notl, zgodnie z wcześniejszym opisem (Schneider i wsp. (1997) J.Biol.Chem. 272, 18827; Schneider i wsp. (1998) J.Exp.Med. 187, 1205). Stabilne, pochodne HEK-293, linie komórkowe do otrzymywania rekombinowanych białek uzyskiwano w wyniku selekcji w 800 mg/ml G418, zgodnie z uprzednio opisaną metodą (Schneider i wsp. (1997), ref.).
(B) Transfekcja przejściowa
Komórki 293T transfekowano stosując metodę CaCl2, zgodnie wcześniejszym opisem (Schneider i wsp. 1997, ref.) i przemywano PBS przed 3-dniową inkubacją w pozbawionym surowicy podłożu Optimem. Supernatanty zatężano 30-krotnie i przechowywano do chwili użycia w stanie zamrożonym. Stężenie białek fuzyjnych Fas/dN-OPG i Fas/CMP w zatężonym podłożu Optimem określano poprzez miareczkowanie z użyciem „Western blot, stosując jako standard oczyszczone Fas/COMP.
(C) Oczyszczanie rekombinowanych białek
Supernatanty stabilnie transfekowanych komórek 293 nakładano na agarozę M2 (jako ligand) lub sefarozę Białka A (białka fuzyjne Fc), przemywano PBS i wymywano 50 mM cytrynianem-NaOH (pH 2,5). Eluat zobojętniano Tris-HCl (pH 8) i zatężano w centrikon30 zmieniając bufor na PBS (z Amicon, Easton, Texas). Białka fuzyjne COMP i CMP oczyszczano na kolumnach chelatów HiTrap. W tym celu, supernatanty stabilnie transfekowanych komórek 293 uzupełniano 500 mM NaCl i 10 mM imidazolem i nakładano na kolumny, pokryte 0,5 M ZnSO4 (pH 2,5) i zrównoważone PBS. Kolumnę przemywano PBS i wymywano białka PBS zawierającym 50 mM EDTA. Bufor zmieniano na PBS, zgodnie z wcześniejszym opisem.
Flag-FasL i Flag-TRAIL otrzymywano według wcześniejszego opisu (Schneider i wsp. 1997,
J.Biol.Chem. 272, 18827 i Thome i wsp. 1997, Nature 386, 517). Obie pozycje włączono w opis stanu techniki niniejszego zgłoszenia tytułem referencji. Flag-CD40L (AA 116 do 261) ekspresjonowano w bakteriach i oczyszczano na agarozie M2, zgodnie z opisem dla Flag-TRAIL. Stężenie białka określano metodą kwasu bicynchonindynowego. Stopień oczyszczenia badano stosując SDS-PAGE i barwienie Coomassie-Blue.
(D) Sączenie molekularne
W celu wykonania sączenia molekularnego, odpowiednią ilość białka fuzyjnego, w objętości 200 ml nakładano na Superdex 200 kolumny HR 10/30 (z Pharmacia) i wymywano PBS 0,5 ml/min., jednocześnie dokonując pomiaru absorbancji przy 280 nm. Zgodnie z poniższym opisem, poszczególne frakcje (0,25 ml) analizowano w teście cytotoksyczności. W celu określenia masy cząsteczkowej, kolumnę kalibrowano standardowymi białkami, tyroglobuliną (669 kD), ferrytyną (440 kD), katalazą (262 kD),
PL 204 277 B1 aldolazą (158 kD), albuminą surowicy wołowej (67 kD), owalbuminą kurczaka (43 kD), chymotrypsynogenem A (25 kD) i rybonukleazą A (13,7 kD).
(E) Test kompetycyjny ELISA
Test kompetycyjny ELISA wykonano w następujący sposób.
96-studzienkową płytkę ELISA pokryto mieszaniną receptor/białko fuzyjne Fc (0,2 mg/ml w PBS, 100 ml, 10 godzin, 25°C). Studzienki wysycano przez 1 godz. w 37°C w PBS, PBS zawierał 5% wołową surowicę płodową (jako bufor blokujący). Dla sCD40L zastosowano jako bufor blokujący PBS, zawierający 4% mleko beztłuszczowe i 0,05% Tween 20. Kompetycyjne Fc lub białka fuzyjne COPM rozcieńczano seryjnie w 100 ml buforu blokującego w obecności lub przy braku białka A. Ligandy dodawano w stałych stężeniach (sFasL: 2 mg/ml, 36 nM, sTNFa: 0,02 mg/ml, 0,36 nM; sTRAIL: 0,1 mg/ml, 1,4 nM; SCD40L: 0,5 mg/ml, 9,2 nM wszystkie w buforze blokującym) i pozostawiano do związania przez godz. w 37°C. Związane ligandy identyfikowano stosując przeciwciało M2 anty-flag (1 mg/ml w buforze blokującym, 100 ml, 45 minut, 37°C), sprzężone z peroksydazą mysie przeciwciało specyficzne wobec koziego przeciwciała, 1:2000 w buforze blokującym, 100 ml, 30 minut, 37°C) i chlorowodorek fenylenodiaminy (0,3 mg/ml w 50 mM kwasie cytrynowym, 100 mM Na2HPO4, 0,01% H2O2). Absorbancję mierzono przy 490 nm.
(F) Test cytotoksyczności.
Testy cytotoksyczności przeprowadzono stosując 96-studzienkowe płytki, w objętości 100 ml, według opisu Schneider i wsp. (1997), ref. Chimeryczne receptory rozcieńczano seryjnie w podłożu zawierającym odpowiednią ilość cytotoksycznych ligandów, indukującą w ponad 95% śmierć komórki. Białko A użyto w stężeniu 1 mg/ml. sFasL zastosowano w obecności 1 mg/ml M2 a sTRAIL w obecności 2 mg/ml M2. W serii testów z sTNFa nie użyto żadnego przeciwciała M2. Komórki inkubowano przez 16 godzin i mierzono ich poziom żywotności stosując układ testowy PMS/MTS (fenanzynometosiarczan/3-[4,5-dimetylotiazolo-2-ylo]-5-[3-karboksymetoksyfenylo]-2-[4-sulfofenylo]-2H-tetrazolium, w postaci soli)(Promega, Madison, Wisconsin). Absorbancję mierzono przy 490 nm. W celu określenia stężenia molarnego różnych białek fuzyjnych, dokonywano szacunkowej oceny masy cząsteczkowej w nastę pują cy sposób: [teoretyczna Mr+3 kDa dla stwierdzonego N-połączonego glianu) x wielokrotność]. Fas:Fc, :COMP, :CMP, :dN-OPG: odpowiednio, 98, 172, 100 i 105 kDa. TRAILR2: Fc, :COMP:, :CMP, : dN-OPG: 86, 142, 82 i 93 kDa. TNFR1: Fc, :COMP: 104 i 187 kDa. CD40:Fc, :COMP: 101 i 180 kDa. TRAILR2:Fc: 86 kDa, TRAILR3:Fc: 127 kDa. Flag-TRAIL, Flag-FasL, Flag-TNFa, FlagCD40L: odpowiednio, 71, 55, 56 i 54 kDa.
(G) Pomiar BIAcore
Pomiaru dokonywano stosując CM5-karboksymetylodekstranowy, modyfikowany układ czujników (z BIAcore AB, Uppsala, Sweden), przy prędkości przepływu 5 mg/ml. Czujniki CM5 aktywowano 50 ml dawką mieszaniny 1:1 N-etylo-N'-(3-dimetyloaminopropylo)-karbodiimid:N-hydroksyburszty-noimidu. Następnie, nakładano na aktywowane powierzchnie 6 ml ze 100 mg/ml roztworu przeciwciała monoklonalnego M2-anty-Flag w 10 mM NaHCO3 (pH 5,5). Dawką 50 ml 1M etanoloaminy-HCl dezaktywowano pozostały N-hydroksybursztynoimidoester. Ilość immobilizowanego przeciwciała M2, niezbędna w procedurze, wynosiła 4600 jednostek. W celu analizy oddziaływań FasL-Fas:białko fuzyjne i TRAIL-TRAIL-R2:białko fuzyjne, immobilizowano stałą ilość znakowanego liganda na modyfikowanej M2 powierzchni. Na powierzchnię nanoszono dawkę 7 ml 2,5 mg/ml Flag-FasL lub Flag-TRAIL. Pozwolił o to na zwią zanie okoł o 100 do 150 jednostek. Ponadto, zastosowane warunki zapewniły minimalną dysocjację ligandów z powierzchni M2, czemu towarzyszyło następnie wiązanie receptora na poziomie wystarczającym do przeprowadzenia analizy. Wiązanie receptor:białko fuzyjne analizowano poprzez wstrzyknięcie 15 ml oczyszczonego receptora:białka fuzyjnego w stężeniu między 1 a 100 mg/ml, odpowiadającym 100 do 150 jednostek. Kinetykę asocjacji mierzono przez okres 3 minut a kinetykę dysocjacji przez 3 do 5 minut. Nastę pnie, regenerowano powierzchnię (podstawowa powierzchnia M2) stosują c 5 ml dawkę 50 mM cytrynianu-HCl (pH 2,5). 30 kolejnych powtórzeń wiązania i regeneracji przeprowadzono bez znaczącej zmiany w charakterystyce immobilizowanego przeciwciała M2. Kinetykę dysocjacji i asocjacji analizowano stosując program analizy kinetyki producenta, wykorzystujący modele AB=A+B i A+B=AB.
(H) Hodowla podstawowych hepatocytów myszy
W celu hodowli podstawowych hepatocytów myszy, uś miercano myszy C57BL/6 i natychmiast usuwano obszar wątroby powyżej woreczka żółciowego, który umieszczano w podłożu „wiążącym hepatocyty (HAM). W pierwszym etapie, w celu usunięcia erytrocytów, obszar wątroby
PL 204 277 B1 poddano perfuzji stosując 16 ml 10 mM Hepes (pH 7,6), następnie 12 ml 0,5 mg/ml kolagenazy H (z Boehringer Mannheim) w Hepes (4 mM CaCl2), po czym homogenizowano w Hepes na płytkach Petri. Komórki przemywano w Hepes, następnie wirowano (100xg, 30 sekund) i zawieszano ponownie w 60% izotonicznym roztworze Percoll (z Pharmacia) w HAM, po czym wirowano (700xg, 2 min.). Wszystkie bufory i podłoża stosowano w 37°C. Osad komórkowy zawieszano w HAM, mierzono, zaszczepiano na płaskich pł ytkach do mikromiareczkowania (10000 na studzienkę, 200 ml) i pozostawiano do przyłączenia. Dodawano mieszaninę doświadczalną (seryjne rozcieńczenia inhibitorów, sFasL (końcowe stężenie: 400 mg/ml, 7 nM) i przeciwciało M2 (końcowe stężenie: 1 mg/ml)) i inkubowano komórki przez kolejne 16 godzin. Usuwano supernatant, dodawano świeże podłoże HAM (100 ml) i wykonywano, zgodnie z powyższym opisem, test żywotności PMS/MTS.
(I) Aktywacja indukowanej śmierci komórki
Płaskie płytki mikromiareczkowania pokrywano przeciwciałem anty-ludzkim CD TR66 (10 mg/ml) w PBS przez 3 godziny w 37°C. Pł ytki przemywano dwukrotnie PBS i jednokrotnie podł o ż em RPMI 1640. Komórki Jurkat (5x105 kom. na ml, 100 ml) mieszano z inhibitorami i nakładano do każdej studzienki. Następnie wirowano (200xg, 3 min) i inkubowano przez 24 godziny w 37 °C. Żywotność komórek (OD 490 nm) mierzono zgodnie z powyższym opisem. Specyficzną ochronę komórek (w %) obliczano następująco: [(anty-CD3 + inhibitor) - anty-CD3)]/[(kontrola)-(anty-CD3)]x100.
W celu uzyskania kultury mieszanych leukocytów, prowadzono hodowlę splenocytów z myszy z niedoborem perforyny lub myszy gld C57BL/6 (H-2b) wraz z napromieniowanymi gamma (36 Gy) splenocytami z myszy Balb/c (H-2d) przez 5 dni. Przed użyciem, usuwano z prób nie zdolne do życia komórki, prowadząc wirowanie w gradiencie z użyciem Fikolu (z Pharmacia Biotech.). Znakowanie wykonano zgodnie z opisanymi sposobami (Kataoka i wsp.). W skrócie, komórki docelowe (komórki A20) znakowano [51Cr]sodu (z Dupont, Boston, MA) przez 1 godz., następnie trzykrotnie przemywano RPMI 1640. Komórki MLC mieszano z komórkami docelowymi (104 kom. na studzienkę) na płytkach do mikromiareczkowania w kształcie U, w obecności lub przy braku Fas:Fc i Fas:COMP, w 40 mg/ml w końcowej objętości 200 ml i wirowano płytki (200xg, 3 min.). Po 4 godzinnej inkubacji, supernatanty usuwano i mierzono ich radioaktywność. Specyficzne uwalnianie [51Cr] (w %) określano stosując następujący wzór: [(eksperymentalne uwolnienie - samoistne uwolnienie)/(maksymalne uwolnienie - samoistne uwolnienie)] x 100.
(K) Znakowanie FACS
W celu znakowania FACS, klon komórek Jurkat D1.1 CD40L+ (5x105 komórek) inkubowano z 2 mg CD40:COMP w buforze FACS (PBS, 10% płodowa surowica cielęca i 0,02% NaN3).
Jako kontrolę negatywną zastosowano Fas:COMP. Receptor:COMP wykrywano dodając 1 mg przeciwciała 9E10 swoistego wobec myc, a następnie poprzez działanie przeciwciałem znakowanym FITC kozim-anty-mysim (1:100). Inkubację prowadzono przez 20 min, w 4°C, w 50 mg buforu FACS.
(L) Analiza proliferacji komórek B
W celu przeprowadzenia analizy proliferacji komórek B, komórki CD19+ z limfocytów ludzkiej krwi obwodowej (PBL) oczyszczano stosując magnetyczne kuleczki i pozostałe komórki CD19- napromieniowywano (3000 radów). 105 autologicznych CD19-, napromieniowanych PBL w 120 mg podłoża, zawierającego sCD40 L w stężeniu 100 ng/ml (1,8 nM), przeciwciało M2 o stężeniu 10 mg/ml plus lub minus białko A w stężeniu 1 mg/ml, i określano stężenie CD40:Fc lub CD40:COMP. Następnie, komórki hodowano przez 72 godz. na 96 studzienkowych płytkach, napromieniowywano tymidyną [3H] (1 mCi/studzienkę) przez 6 godzin i zbierano. Wynik inkubacji w obecności tymidyny [3H] sprawdzano stosując licznik scyntylacyjny.
7.2 Wyniki 7 realizacji
Białka fuzyjne, składające się z zewnątrzkomórkowych domen receptora związanego z częścią Fc białka IgG (receptor:Fc) znane są w dziedzinie jako czynniki inhibitorowe w oddziaływaniach między receptorem a ligandem. W 7 realizacji, badano wielkość oczyszczonego białka fuzyjnego Fas:Fc przy użyciu sączenia molekularnego. Odkryto, pojedynczy pik wymyty w określonym czasie retencji. Frakcje zawierające Fas:Fc chroniły komórki A20, poddane działaniu śmiertelnej dawki rozpuszczalnego FasL (sFasL)przeciwko śmierci komórki, mimo że poziom ochrony (aż do 50%) był niezwykle niski, biorąc pod uwagę, że szacunkowy stosunek Fas:Fc w eksperymencie wynosił około 100.
Dla kilku wczesnych frakcji eluatu odnotowano słabą aktywność ochronną, prawdopodobnie zawierały one mniejsze, nie wykrywalne ilości wysokocząsteczkowego kompleksu Fas:Fc. Zgodnie
PL 204 277 B1 z wynalazkiem, odkryto, że tego typu duże agregaty białka fuzyjnego mogą działać jak silne inhibitory indukowanej przez FasL śmierci komórki. Zatem, ta frakcja o wysokiej wadze cząsteczkowej agregatu Fas:Fc była początkowo otrzymywana w wyniku dodania immunoglobuliny wiążącej poprzecznie czynnik Białka A.
Dzięki prowadzonej w odpowiednich warunkach analizie, odnotowano, że jedynie około 10% wstrzykniętych Fas:Fc przeszło do wcześnie wymywanych frakcji, i, że w sposób oczywisty, wysokocząsteczkowy kompleks Fas:Fc jest skutecznym antagonistom cytotoksyczności indukowanej przez FasL. Porównując, odnotowano, że pozostające frakcje Fas:Fc, wymywane były zawsze jako dimer i pomimo zastosowania dziesięciokrotnie wyższego stężenia, zapewniono komórkom tylko częściową ochronę. Według wynalazku, wyniki uzyskane w 7 realizacji wskazują, ze tworzenie dużych agregatów Fas:Fc istotnie zwiększa specyficzną aktywność ochronną.
Zatem, zgodnie z wynalazkiem, w oparciu o posiadane wyniki, otrzymywano kompleksy białek fuzyjnych. Kompleksy te wykazywały lepsze powinowactwo wobec FasL i zwiększony poziom inhibicji, wywołane wyższym stopniem oligomeryzacji. Białka fuzyjne według wynalazku są, np., takimi białkami, w których zewnątrzkomórkowe domeny receptorów rodziny TNF, np., Fas, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TNF-R1 lub CD40, połączone są w wyniku fuzji z domenami oligomeryzacji, tzw. chrząstkowego białka oligomerycznego ((COMP); białka fuzyjne oznaczono: receptor:COMP) lub tzw. chrząstkowego białka macierzy ((CMP); białko fuzyjne: receptor:CMP) poprzez 14 aminokwasowy łącznik. Takie białka macierzy i ich domeny, wykazują właściwość formowania super skręconych struktur, odpowiednio, pentamerycznych i trimerycznych. Wyżej wspomniane białka fuzyjne (jak również Receptor:białka fuzyjne Fc, jako kontrola) ekspresjonowano w komórkach ssaczych i oczyszczano chromatografią powinowactwa na chelatujących metale kolumnach lub na Białku A. W 7 realizacji, receptory Fas i TRAIL-R2 związane były również z C-końcową domeną dimeryzacji białka osteoprotegryny rodziny TNF (Receptor:dN-OPG).
Receptory połączone z COMP lub CMP ulegały oligomeryzacji, na co wskazywała ich wolna migracja w żelu poliakrylamidowym w warunkach nie redukujących. W wyniku zastosowania sączenia molekularnego, określono masę cząsteczkową Fas:COMP i TRAIL-R2:CMP wymytych i zdefiniowanych jako piki odpowiednio, o 400 i 170 kDa. Masa cząsteczkowa odpowiadała, odpowiednio, strukturze pentamerycznej i trimerycznej białek fuzyjnych. Zatem, na podstawie eksperymentu 7 realizacji stwierdzono, że właściwość agregacji super skręconych domen polimeryzacji wyżej wymienionych białek macierzy nie ulega zakłóceniu w wyniku fuzji białek (lub domen białkowych) rodziny receptora TNF.
Białko fuzyjne Fas:COMP wykazywało niższą Kd, niż Fas:Fc, w sytuacji, gdy białka fuzyjne współzawodniczyły z Fas:Fc o wiązanie sFasL. Zgodnie z uzyskanym wynikiem, stała dysocjacji 0,77 nM, mierzona dla oddziaływań FasL-Fas:COMP, była około 8- do 9-krotnie niższa, niż porównywane wartości dla Fas:Fc. W przypadku większości testowanych linii komórkowych wykazano, że aktywność inhibitorowa Fas:COMP jest około 10- do 20-krotnie wyższa, niż odnotowana dla dimerycznego białka fuzyjnego Fas:Fc, natomiast wyniki dla agregatów Fas:Fc, otrzymanych w wyniku wią zania poprzecznego biał ka A (Fas:Fc/PA), odpowiadał y wartoś ciom mię dzy Fas:COMP a Fas:Fc. Aktywność ochronna dimerycznego białka fuzyjnego Fas:dN-OPG była porównywalna z aktywnością dimerycznego kompleksu Fas:Fc. Trimeryczne Fas:CMP inhibitowało mediowaną przez sFasL lizę w przybliżeniu tak skutecznie, jak Fas:Fc/PA, zatem, 5-krotnie mniej skutecznie, niż Fas:COMP. Aktywność inhibitorowa była dobra lub lepsza, niż odnotowana dla FasL-blokujących przeciwciał monoklonalnych Nok-1, 4H9 i 4A5. W porównaniu z kompleksem Fas:Fc, również wyraźna była wyższa aktywność inhibitorowa Fas:COMP, odnotowana na podstawie wyników eksperymentów z podstawowymi hepatocytami myszy lub układem modelowym aktywacji indukowanej śmierci komórki z aktywowanymi-anty-CD3 komórkami Jurkat. We wszystkich tych eksperymentach poziom ochronny podłoża odnotowano dla Fas:Fc-PA. Ponadto, zbadano, czy Fas:COMP może wpływać inhibitująco na FasL ekspresjonowane na CTL. Śmierć komórek A20 w 4-godzinnym układzie testowym jest całkowicie zależna od perforyny i zależnej od FasL ścieżki przekazywania sygnału. Ze względu na to, że CTL nie posiadały perforyny, jak również FasL, nie odnotowano żadnego wpływu na te komórki. W odpowiednim eksperymencie, komórki A20 uśmiercano nie posiadającymi perforyny CTL, jak i nie posiadającymi FasL CTL. Fas:Fc i Fas:COPM specyficznie powodowały pewien stopień ochrony dla komórek wystawionych na działanie nie posiadających perforyny CTL.
PL 204 277 B1
W porównaniu z powinowactwem SCD40L do CD40:Fc, CD40:Fc/PA lub CD40:COMP wedł ug wynalazku, w doświadczeniu kompetycyjnego testu ELISA, obserwowano istotny wzrost powinowactwa (30-krotny) dla pentameru receptora, natomiast wpływ podłoża odnotowano dla CD40:Fc/PA (8-krotny). Odnośnie zagadnienia, czy CD40: COMP również posiada zdolność rozpoznania związanego z błoną CD40L, zastosowano pochodną Jurkat linię komórkową D1.1, ekspresjonującą konstytutywnie białko powierzchniowe CD40L, w reakcji oligomeryzacji analizy znakowania FACS, przy użyciu jako próby białek fuzyjnych CD40. Odnotowano istotny poziom znakowania dla CD40:COMP, według wynalazku, wskazujący, że CD40-COMP jest w istocie zdolne do wiązania natywnego, nie poddanego obróbce CD40L. W celu zbadania aktywności specyficznej białka fuzyjnego CD40 w układzie biologicznym, analizowano inhibicję zależnej od CD40L proliferacji ludzkich komórek B, ko-stymulowanych receptorem skierowanym wobec komórek B. Ani CD40:Fc, ani CD40:Fc/PA nie powodowały znaczącego zakłócenia proliferacji, nawet, w przypadku, gdy były podawane w wysokich dawkach. Przeciwnie, CD40:COMP według wynalazku, był zdolny do blokowania proliferacji już przy względnie niskich dawkach.
Podsumowując, na podstawie obserwacji dokonanych w ramach niniejszej realizacji można wnioskować, że inhibicja indukowanej FasL apoptozy przez kompetycyjne inhibitory wzrasta zależąc od stopnia oligomeryzacji, i że względna aktywność różnych inhibitorów (wyrażona w proporcji ich odpowiednich wartości IC50) pozostaje względnie stała dla różnych linii komórkowych. Zwiększona aktywność inhibitorowa Fas:COMP według niniejszego wynalazku, w porównaniu z Fas:Fc, wynika prawdopodobnie z jego wyższego powinowactwa. Podobne wyniki uzyskano również dla aktywności białka fuzyjnego CD40 według wynalazku. CD40:COMP według wynalazku jest wyraźnie lepsze niż CD40:Fc in vitro pod względem inhibicji indukowanej CD40L proliferacji podstawowych komórek B. Zgodnie z tym, wyniki 7 realizacji wskazują, że możliwe jest uzyskanie stałych dysocjacji w zakresie niskiej nanomolarności dla takich receptorów, jak, Fas i CD40, charakteryzujących się w stanie natywnym średnim poziomem powinowactwa wobec ich ligandów, jeżeli, zgodnie z wynalazkiem, są składnikiem białek fuzyjnych wykazujących wyższy stopień oligomeryzacji.
PL 204 277 B1
Wykaz sekwencji <110> Apotech Research and Development Ltd.
<120> Bimer lub oligomer dimerów, trimerów, kwadoromerów lub pentamerów rekombinowanych białek fuzyjnych <130> AP01P004WO <140 PCT/EP00/13032 <141> 2000-12-20 <160 7 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 159 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Opis sekwencji sztucznej: FasL-Trimer <220 <221> DOMENA <222> (1) . . (8) <223> Flag <220 <221> DOMENA <222> (9)..(16) <223> Łącznik <220 <221> DOMENA <222> (17)..(159) <223> ludzkiFasL aa 139-281 <400 1
Asp 1 Tyr Lys Asp Asp 5 Asp Asp Lys Gly Pro 10 Gly Gin Val Gin Leu 15 Gin
Glu Lys Lys Glu 20 Leu Arg Lys Val Ala 25 His Leu Thr Gly Lys 30 Ser Asn
Ser Arg Ser 35 Met Pro Leu Glu Trp 40 Glu Asp Thr Tyr Gly 45 Ile Val Leu
Leu Ser 50 Gly Val Lys Tyr Lys 55 Lys Gly Gly Leu Val 60 Ile Asn Glu Thr
Gly 65 Leu Tyr Phe Val Tyr 70 Ser Lys Val Tyr Phe 75 Arg Gly Gin Ser Cys 80
Asn Asn Leu Pro Leu 85 Ser His Lys Val Tyr 90 Met Arg Asn Ser Lys 95 Tyr
Pro Gin Asp Leu Val Met Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr
100 105 110
PL 204 277 B1
Thr Gly Gin 115 Met Trp Ala Arg Ser 120 Ser Tyr Leu Gly Ala 125 Val Phe Asn
Leu Thr 130 Ser Ala Asp His Leu 135 Tyr Val Asn Val Ser 140 Glu Leu Ser Leu
Val Asn Phe Glu Glu Ser Gin Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu
145 150 155
<210> 2
<211> 213
<212> PRT
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: FasL-Hexaraer
<220>
<221> DOMENA
<222> (1) - - (8)
<223> Flag
<220>
<221> DOMENA
<222> [9) . . [16]
<223> Łącznik
<220>
<221> DOMENA
<222> (17)..(34)
<223> Specific łącznik
<220>
<221> DOMENA
<222> (35)..(70)
<223> ludzkiFasL aa 103-138
<220>
<221> DOMENA
<222> (71)..(213)
<223> ludzkiFasL aa 139-281
<400> 2
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro Gly Gin Val Gin Leu Gin
10 15
Val Asp Leu Glu Gly Ser Thr Ser Asn Gly Arg Gin Cys Ala Gly Ile 20 25 30
Arg Leu Gin Leu Phe His Leu Gin Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu 35 40 45
Ser Thr Ser Gin Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu Lys Gin Ile Gly 50 55 60
His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His 65 70 75 80
Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp 85 90 95
PL 204 277 B1
Thr Tyr Gly Ile 100 Val Leu Leu Ser Gly 105 Val Lys Tyr Lys Lys 110 Gly Gly
Leu Val Ile 115 Asn Glu Thr Gly Leu 120 Tyr Phe Val Tyr Ser 125 Lys Val Tyr
Phe Arg 130 Gly Gin Ser Cys Asn 135 Asn Leu Pro Leu Ser 140 His Lys Val Tyr
Met 145 Arg Asn Ser Lys Tyr 150 Pro Gin Asp Leu Val 155 Met Met Glu Gly Lys 160
Met Met Ser Tyr Cys 165 Thr Thr Gly Gin Met 170 Trp Ala Arg Ser Ser 175 Tyr
Leu Gly Ala Val 180 Phe Asn Leu Thr Ser 185 Ala Asp His Leu Tyr 190 Val Asn
Val Ser Glu 195 Leu Ser Leu Val Asn 200 Phe Glu Glu Ser Gin 205 Thr Phe Phe
Gly Leu Tyr Lys Leu 210
<210> 3 <211> 213 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: Super-FasL
<220>
<221> DOMENA
<222> (1) . . (8)
<223> Flag
<220>
<221> DOMENA
<222> (9) .. (16)
<223> Łącznik
<220>
<221> DOMENA
<222> (17) . .(34)
<223> Specific łącznik
<220>
<221> DOMENA
<222> (35)..(70)
<223> ludzkiFasL aa 103-138
<220>
<221> DOMENA
<222> (71)..(213)
<223> ludzkiFasL aa 139-281
<400> 3
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro Gly Gin Val Gin Leu Gin
5 10 15
PL 204 277 B1
Val Asp Leu Glu Gly Ser Thr Ser Asn Gly Arg Gin Ser Ala Gly 20 25 30
Arg Leu Gin Leu Phe His Leu Gin Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg 35 40 45
Ser Thr Ser Gin Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu Lys Gin Ile 50 55 60
His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala 65 70 75
Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu 85 90 95
Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly 100 105 110
Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val 115 120 125
Phe Arg Gly Gin Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys Val 130 135 140
Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gin Asp Leu Val Met Met Glu Gly 145 150 155
Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gin Met Trp Ala Arg Ser Ser 165 170 175
Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val 180 185 190
Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser Gin Thr Phe 195 200 205
Gly Leu Tyr Lys Leu ' 210
Ile
Glu
Gly
His
Asp
Gly
Tyr
Tyr
Lys
160
Tyr
Asn
Phe <210> 4 <211> 252 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: FasL-ACRP30 <220>
<221> DOMENA <222> (1)..(8) <223> Flag <220>
<221> DOMENA <222> (9)..(16) <223> Łącznik <220>
<221> DOMENA <222> (17) .. (108) <223> mysiACRP30 aa 18-111
PL 204 277 B1 <220>
<221> DOMENA <222> (109) . . (HO) <223> Łącznik <220>
<221> DOMENA <222> (111) . . (252)
<22 3> 1 udzk iFas L aa 139 -281
<40 0> 4
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro Gly Gin Val Gin Leu His
1 5 10 15
Glu Asp Asp Val Thr Thr Thr Glu Glu Leu Ala Pro Ala Leu Val Pro
20 25 30
Pro Pro Lys 35 Gly Thr Cys Ala Gly 40 Trp Met Ala Gly Ile 45 Pro Gly His
Pro Gly His Asn Gly Thr Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Thr Pro
50 55 60
Gly 65 Glu Lys Gly Glu Lys 70 Gly Asp Ala Gly Leu 75 Leu Gly Pro Lys Gly 80
Glu Thr Gly Asp Val Gly Met Thr Gly Ala Glu Gly Pro Arg Gly Phe
85 90 95
Pro Gly Thr Pro Gly Arg Lys Gly Glu Pro Gly Glu Leu Gin Glu Lys
100 105 110
Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg
115 120 125
Ser Met 130 Pro Leu Glu Trp Glu 135 Asp Thr Tyr Gly Ile 140 Leu Leu Ser Gly
Val 145 Lys Tyr Lys Lys Gly 150 Gly Leu Val Ile Asn 155 Glu Thr Gly Leu Tyr 160
Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gin Ser Cys Asn Asn Leu
170 175
Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gin Asn ISO 185 igg
Leu Val Met Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gin 195 200 205
Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser 210 215 220
Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe 225 230 235 240
Glu Glu Ser Gin Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 245 250 <210> 5 <211> 296
PL 204 277 B1 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <22D>
<223> Opis sekwencji sztucznej: TRAIL-ACRP30 <220>
<221> DOMENA <222> (1)..(8) <223> Flag <220>
<221> DOMENA <222> (9)..(16) <223> Łącznik <220>
<221> DOMENA <222> (17).. (108) <223> mysiACRP30 aa 18-111 <220 <221> DOMENA <222> (109)..(110) <223> Łącznik <220>
<221> DOMENA <222> (111)..(296) <223> ludzkiTRAIL aa 95-281 <400> 5
Asp 1 Tyr Lys Asp Asp 5 Asp Asp Lys Gly Pro 10 Gly Gin Val Gin Leu 15 His
Glu Asp Asp Val 20 Thr Thr Thr Glu Glu 25 Leu Ala Pro Ala Leu 30 Val Pro
Pro Pro Lys 35 Gly Thr Cys Ala Gly 40 Trp Met Ala Gly Ile 45 Pro Gly His
Pro Gly 50 His Asn Gly Thr Pro 55 Gly Arg Asp Gly Arg 60 Asp Gly Thr Pro
Gly 65 Glu Lys Gly Glu Lys 70 Gly Asp Ala Gly Leu 75 Leu Gly Pro Lys Gly 00
Glu Thr Gly Asp Val 85 Gly Met Thr Gly Ala 90 Glu Gly Pro Arg Gly 95 Phe
Pro Gly Thr Pro 100 Gly Arg Lys Gly Glu 105 Pro Gly Glu Leu Gin 110 Thr Ser
Glu Glu Thr 115 Ile Ser Thr Val Gin 120 Glu Lys Gin Gin Asn 125 Ile Ser Pro
Leu Val 130 Arg Glu Arg Gly Pro 135 Gin Arg Val Ala Ala 140 Ile Thr Gly Thr
Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys
150 155 160
PL 204 277 B1
Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser 170 Ser Arg Ser Gly 175 His
165
Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His
180 185 190
Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gin Thr Tyr Phe Arg Phe Gin
195 200 205
Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gin Met Val Gin Tyr
210 215 220
Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser
225 230 235 240
Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser
245 250 255
Ile Tyr Gin. Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe
260 265 270
Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser
275 280 285
Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
290 295
<210> 6
<211> 268
<212> PR.T
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: TNFa-ACRP30
<220>
<221> DOMENA
<222> <223> (1) .. Flag (8)
<220>
<221> DOMENA
<222> (9) . . (16
<223> Łącznik <22O>
<221> DOMENA <222> (17) . . (108) <223> mysiACRP30 aa 18-111 <220>
<221> DOMENA <222> (109)..(110) <223> Łącznik <220>
<221> DOMENA <222> (111)..(268) <223> mysiTNFa aa 77-235 <400> 6
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro Gly Gin Val Gin Leu His
PL 204 277 B1
1 5 10 15
Glu Asp Asp Val Thr Thr Thr Glu Glu Leu Ala Pro Ala Leu Val Pro
20 25 30
Pro Pro Lys Gly Thr Cys Ala Gly Trp Met Ala Gly Ile Pro Gly His
35 40 45
Pro Gly His Asn Gly Thr Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Thr Pro
50 55 60
Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Asp Ala Gly Leu Leu Gly Pro Lys Gly
65 70 75 80
Glu Thr Gly Asp Val Gly Met Thr Gly Ala Glu Gly Pro Arg Gly Phe
85 90 95
Pro Gly Thr Pro Gly Arg Lys Gly Glu Pro Gly Glu Leu Gin Thr Leu
100 105 110
Thr Leu Arg Ser Ser Ser Gin Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His
115 120 125
Val Val Ala Asn His Gin Val Glu Glu Gin Leu Glu Leu Ser Gin Arg
130 135 140
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Met Asp Leu Lys Asp Asn Gin Leu
145 150 155 160
Val Val Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Leu Val Tyr Ser Gin Val Leu Phe
165 170 175
Lys Gly Gin Gly Cys Pro Asp Tyr Val Leu Leu Thr His Thr Val Ser
180 185 190
Arg Phe Ala Ile Ser Tyr Gin Glu Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Val
195 200 205
Lys Ser Pro Cys Pro Lys Asp Thr Pro Glu Gly Ala Glu Leu Lys Pro
210 215 220
Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu Glu Lys Gly
225 230 235 240
Asp Gin Leu Ser Ala Glu Val Asn Leu Pro Lys Tyr Leu Asp Phe Ala
245 250 255
Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly Val Ile Ala Leu
260 265 <210 7 <211> 255 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Opis sekwencji sztucznej: CD4OL-ACRP3O <220>
<221> DOMENA <222> (1)..(8) <223> Flag
PL 204 277 B1 <220>
<221> DOMENA <222> (9)..(16) <223> Łącznik <220>
<221> DOMENA <222> (17)..(108) <223> mysiACRP30 aa 18-111 <220>
<221> DOMENA <222> (109) .. (110) <223> Łącznik <220>
<221> DOMENA <222> (111) .. (255) <223> ludzkiCD40L aa 116-261 <400> 7
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro Gly Gin Val Gin Leu His 1 5 10 15
Glu Asp Asp Val Thr Thr Thr Glu Glu Leu Ala Pro Ala Leu Val Pro
25 30
Pro Pro Lys Gly Thr Cys Ala Gly Trp Met Ala Gly Ile Pro Gly His 35 40 45
Pro Gly His Asn Gly Thr Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Thr Pro 50 55 60
Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Asp Ala Gly Leu Leu Gly Pro Lys Gly 55 70 75 80
Glu Thr Gly Asp Val Gly Met Thr Gly Ala Glu Gly Pro Arg Gly Phe
90 95
Pro Gly Thr Pro Gly Arg Lys Gly Glu Pro Gly Glu Leu Gin Gly Asp 100 105 110
Gin Asn Pro Gin Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys 115 120 125
Thr Thr Ser Val Leu. Gin Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Thr Met Ser Asn 130 135 140
Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gin Leu Thr Val Lys Arg Gin
I45 150 155 160
Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gin Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu
165 170 175
Alą Ser Ser Gin Alą Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro 180 185 190
Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser 195 200 205
Ala Lys Pro Cys Gly Gin Gin Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu 210 215 220
PL 204 277 B1
Leu 225 Gin Pro Gly Ala Ser 230 Val Phe Val Asn Val 235 Thr Asp Pro Ser Gin 240
Val Ser His Gly Thr 245 Gly Phe Thr Ser Phe 250 Gly Leu Leu Lys Leu 255
Zastrzeżenia patentowe

Claims (14)

1. Biał ko fuzyjne, znamienne tym, ż e rekombinowane biał ko fuzyjne posiada skł adnik A i składnik B, przy czym składnik A jest zewnątrzkomórkową częścią cytokiny TNF a składnik B posiada multimeryzujący lub oligomeryzujący segment białka ACRP30, który multimeryzuje lub oligomeryzuje białko fuzyjne bez udziału innych cząsteczek.
2. Biał ko fuzyjne wedł ug zastrz. 1, znamienne tym, ż e skł adnik B zawiera przedstawioną na Fig. 6A sekwencję aminokwasów od 18 do 111 z mACRP30 lub przedstawioną na Fig. 6B sekwencję aminokwasów od 18 do 108 z hACRP30.
3. Białko fuzyjne według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że składnik A jest segmentem cytokiny TNF wybranej z grupy zawierającej: CD40L, FasL, TRAIL, TNF, CD30L, OX40L, RANKL, TWEAK, Lta, Ltab2, LIGHT, CD27L, 41-BB, GITRL, APRIL, EDA, VEGI i BAFF.
4. Białko fuzyjne według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, ze składnik A jest segmentem cytokiny TNF wybranej z grupy zawierającej: hFasL (aminokwasy od 139 do 261), hTRAIL (aminokwasy od 95 do 281), hCD40L (aminokwasy od 116 do 261) oraz m lub hTNF (aminokwasy od 77 do 235).
5. Białko fuzyjne według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że rekombinowane białka fuzyjne posiadają sekwencję łącznikową pomiędzy składnikiem A i składnikiem B.
6. Bi - lub oligomer rekombinowanych białek fuzyjnych jak zdefiniowano w którymkolwiek spośród zastrz. od 1 do 5.
7. Sekwencja DNA kodują ca biał ko fuzyjne zdefiniowane w którymkolwiek spoś ród zastrz. od 1 do 5.
8. Wektor ekspresyjny, znamienny tym, że zawiera sekwencję DNA zdefiniowaną w zastrz. 7.
9. Komórka gospodarza, znamienna tym, ż e jest transferowana wektorem ekspresyjnym jak zdefiniowano w zastrz. 8.
10. Zastosowanie bi- lub oligomerów jak zdefiniowano w zastrz. 6 do wytwarzania środków farmaceutycznych.
11. Zastosowanie bi- lub oligomerów jak zdefiniowano w zastrz. 6 do wytwarzania środków farmaceutycznych do leczenia zaburzeń zapalnych, chorób autoimmunologicznych, chorób opartych na reakcjach hiperapoptotycznych lub hipoapoptotycznych, chorób zakaźnych, zwłaszcza wirusowych chorób zakaźnych, nowotworów, zwłaszcza nowotworów układu limfatycznego i/lub zaburzeń endokrynologicznych.
12. Zastosowanie bi- lub oligomerów jak zdefiniowano w zastrz. 6 do wytwarzania środków farmaceutycznych do podawania doustnego i pozajelitowego.
13. Zastosowanie bi- lub oligomerów jak zdefiniowano w zastrz. 6 do diagnostyki in vitro.
14. Środek farmaceutyczny, znamienny tym, że zawiera bi- lub oligomer zrekombinowanych białek fuzyjnych jak zdefiniowano w zastrz. 6.
PL358456A 1999-12-30 2000-12-20 Białko fuzyjne, jego bi-lub oligomer, ich zastosowania, sekwencja DNA, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza oraz środek farmaceutyczny PL204277B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19963859A DE19963859A1 (de) 1999-12-30 1999-12-30 Bi- oder Oligomer eines Di-, Tri-, Quattro- oder Pentamers von rekombinanten Fusionsproteinen
PCT/EP2000/013032 WO2001049866A1 (de) 1999-12-30 2000-12-20 Bi- oder oligomer eines di-, tri-, quattro- oder pentamers von rekombinanten fusionsproteinen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL358456A1 PL358456A1 (pl) 2004-08-09
PL204277B1 true PL204277B1 (pl) 2009-12-31

Family

ID=7935052

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL358456A PL204277B1 (pl) 1999-12-30 2000-12-20 Białko fuzyjne, jego bi-lub oligomer, ich zastosowania, sekwencja DNA, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza oraz środek farmaceutyczny

Country Status (19)

Country Link
US (6) US7385032B2 (pl)
EP (2) EP1246925B1 (pl)
JP (1) JP5031165B2 (pl)
KR (1) KR100767980B1 (pl)
CN (1) CN100385002C (pl)
AT (1) ATE397076T1 (pl)
AU (1) AU783833B2 (pl)
BR (1) BRPI0017054B1 (pl)
CA (1) CA2395632C (pl)
CY (1) CY1108195T1 (pl)
DE (2) DE19963859A1 (pl)
DK (1) DK1246925T3 (pl)
ES (1) ES2307550T3 (pl)
HU (1) HU229204B1 (pl)
IL (2) IL150215A0 (pl)
PL (1) PL204277B1 (pl)
PT (1) PT1246925E (pl)
WO (1) WO2001049866A1 (pl)
ZA (1) ZA200205069B (pl)

Families Citing this family (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7300774B1 (en) * 1999-12-09 2007-11-27 The Regents Of The University Of California Multimeric fusion proteins of the TNF superfamily ligands
US20030095967A1 (en) * 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
US20050100548A1 (en) * 2001-07-24 2005-05-12 Biogen Idec Ma Inc. BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response
SK782002A3 (en) * 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
DE19963859A1 (de) * 1999-12-30 2001-07-12 Apotech Res & Dev Ltd Bi- oder Oligomer eines Di-, Tri-, Quattro- oder Pentamers von rekombinanten Fusionsproteinen
EP1365027A4 (en) * 2000-05-26 2005-06-22 Mochida Pharm Co Ltd FUSION PROTEINS AS FAS-LIGAND
GB0015426D0 (en) * 2000-06-24 2000-08-16 Univ Southampton Method for generating soluble highly multimeric proteins
DE60232577D1 (de) * 2001-01-18 2009-07-23 Vlaams Interuniv Inst Biotech Oligomerische komplexe von chimären proteinen mit verbessertem immunogenen potential
DE10122140A1 (de) * 2001-05-08 2002-11-28 Apotech Res & Dev Ltd Rekombinante Fusionsproteine und deren Trimere
DK1456651T3 (da) 2001-11-30 2008-09-01 Ca Nat Research Council Selvsamlende molekyler
US7736657B2 (en) 2002-02-10 2010-06-15 Apoxis S.A. Fusion constructs containing active sections on TNF ligands
US20080267965A1 (en) * 2002-02-21 2008-10-30 Kalled Susan L Use of Bcma as an Immunoregulatory Agent
AU2002351811A1 (en) * 2002-05-08 2003-11-11 Apoxis S.A. Hexamers of receptors, members of the tnf receptor family, their use in therapy and pharmaceutical compositions comprising the same
FR2840307B1 (fr) * 2002-05-30 2006-07-07 Centre Nat Rech Scient Nouvelles molecules multimeriques, leur procede de preparation, et leur utilisation pour la preparation de medicaments
DE10247755B4 (de) * 2002-10-14 2006-01-19 Pfizenmaier, Klaus, Prof. Dr. Selektive, lokale Aktivierung von Mitgliedern der TNF-Rezeptorfamilie durch systemisch inaktive nicht-Antikörper-TNF-Liganden-Fusionsproteine
CA2503697A1 (en) * 2002-10-29 2004-05-13 Borean Pharma A/S Trimeric binding proteins for trimeric cytokines
CA2520254A1 (en) * 2003-03-26 2004-10-07 Apogenix Gmbh Treatment of viral infections
WO2004101740A2 (en) 2003-05-06 2004-11-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Clotting factor-fc chimeric proteins to treat hemophilia
TWI353991B (en) * 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US20050143297A1 (en) * 2003-05-26 2005-06-30 Jean-Pierre Rosat Method for the administration of ligands, agonists of ligands of the TNF family with reduced toxicity
EP1481686A1 (en) * 2003-05-26 2004-12-01 Apoxis SA Use of multimeric ligands of the TNF family with reduced toxicity for treating cell proliferative diseases
US20050287118A1 (en) * 2003-11-26 2005-12-29 Epitomics, Inc. Bacterial plasmid with immunological adjuvant function and uses thereof
DE102004014983A1 (de) 2004-03-26 2005-10-20 Univ Stuttgart Rekombinante Polypeptide der Mitglieder der TNF Ligandenfamilie und deren Verwendung
BRPI0516723A (pt) * 2004-10-01 2008-09-16 Apoxis Sa métodos para a purga ex-vivo de células em transplante autólogo, para preparação de células coletadas substancialmente isentas de células malignas, células coletadas, e, método para o transplante autólogo de células
FR2879202B1 (fr) * 2004-12-15 2007-02-23 Centre Nat Rech Scient Cnrse Nouveaux ligands multimeriques de cd40, leur procede de preparation et leur utilisation pour la preparation de medicaments
WO2006077232A2 (en) * 2005-01-20 2006-07-27 Apoxis Sa Multimeric soluble fas ligand for eliminating alloreactive t lymphocyte in allogenic harmatopoietic stem-cell transplantation transplantation
BRPI0617057A2 (pt) 2005-08-30 2011-07-12 Univ Miami anticorpo isolado, toxina especìfica para receptor de fator de necrose tumoral 25 (tnfr25), método para ativar o receptor de fator de necrose tumoral 25 (tnfr25), método para inibir a sinalização do receptor de fator de necrose tumoral 25 (tnfr25) numa célula, vacina antitumoral, método para imunizar um paciente contra tumor, método para tratar cáncer num paciente, método para tratar e/ou prevenir inflamação intestinal, composição terapêutica para a facilitação de um transplante de órgão, método para transplantar um tecido de um doador para um hospedeiro, método para inibir a expressão clonal de uma população de células t cd8 cognatas, método para tratar e/ou prevenir inflamação pulmonar, antagonista de tnfr25 isolado, composição e vetor de expressão
CA2636424A1 (en) * 2006-01-09 2007-10-25 The Regents Of The University Of California Immunostimulatory combinations of tnfrsf, tlr, nlr, rhr, purinergic receptor, and cytokine receptor agonists for vaccines and tumor immunotherapy
WO2007117339A2 (en) * 2006-01-11 2007-10-18 The United States Of America As Respresented By The Secretary Of The Navy Adhesin-enterotoxin chimera based immunogenic composition against entertoxigenic escherichia coli
JP6002903B2 (ja) 2007-07-10 2016-10-05 アポゲニクス アーゲー Ｔｎｆスーパーファミリーコレクチン融合タンパク質
PL2604693T3 (pl) * 2008-07-21 2016-09-30 Jednołańcuchowe cząsteczki TNFSF
AU2009308707A1 (en) * 2008-10-31 2010-05-06 Biogen Idec Ma Inc. LIGHT targeting molecules and uses thereof
EP2382236B1 (en) 2009-01-09 2016-08-17 Apogenix AG Fusion proteins forming trimers
WO2010102518A1 (zh) * 2009-03-13 2010-09-16 北京表源生物技术有限公司 一种融合蛋白多聚体
CN102612525A (zh) 2009-06-09 2012-07-25 儿童医院医疗中心 抗原-诺罗病毒p-结构域单体和二聚体，抗原-诺罗病毒p-粒子分子，及其制备和应用方法
SG178125A1 (en) 2009-08-03 2012-03-29 Univ Miami Method for in vivo expansion of t regulatory cells
EP2518078B1 (en) * 2009-12-15 2020-05-20 Choe, Muhyeon Method for manufacturing dimers and multimers by increasing the production of bond bridges in a complex of multiple monomers and repeating chains of an affinity domain of a type specifically binding to protein monomers
US10822396B2 (en) 2009-12-15 2020-11-03 MuHyeon CHOE Repeat-chain for the production of dimer, multimer, multimer complex and super-complex
WO2012040101A1 (en) 2010-09-21 2012-03-29 University Of Miami Compositions and methods for inducing migration by dendritic cells and an immune response
WO2012040266A2 (en) * 2010-09-24 2012-03-29 University Of Miami Gene-based adjuvants and compositions thereof to increase antibody production in response to gene-based vaccines
EP2681245B1 (en) * 2011-03-03 2018-05-09 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
WO2013121368A2 (en) * 2012-02-15 2013-08-22 Biocon Limited A process for detection and optional quantification of an analyte
US9562077B2 (en) * 2012-07-11 2017-02-07 Children's Hospital Medical Center Protein complex system for increased immunogenicity and functionality, and methods making and use
CA2878640C (en) 2012-07-13 2023-10-24 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
KR20150136047A (ko) 2013-01-09 2015-12-04 유니버시티 오브 마이애미 TL1A-Ig 융합 단백질을 사용한 T 조절 세포의 조절을 위한 조성물 및 방법
SG11201505926VA (en) 2013-03-15 2015-09-29 Biogen Ma Inc Factor ix polypeptide formulations
WO2014145355A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Stone Geoffrey W Composition comprised of antigen linked to a tnf superfamily ligand
WO2014179494A1 (en) 2013-04-30 2014-11-06 Colorado State University Research Foundation Sensors and assays for ubiquitin or ubiquitin-like proteins
CA2917721C (en) * 2013-05-30 2023-03-14 Muhyeon Choe Super-complex formed by cross-binding between complexes of repeating chain and monomer and use thereof
US9321803B2 (en) 2013-07-12 2016-04-26 Children's Hospital Medical Center Compositions and methods for inhibiting norovirus infection
CN104299540A (zh) * 2013-07-15 2015-01-21 驰众信息技术（上海）有限公司 广告互动播放系统及其广告机终端
NO2776305T3 (pl) 2014-04-23 2018-01-27
JP2014218510A (ja) * 2014-08-11 2014-11-20 アポゲニクスゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテルハフツングＡｐｏｇｅｎｉｘ ＧｍｂＨ 三量体形成融合タンパク質
CN104356233B (zh) * 2014-10-11 2017-09-29 中国科学院微生物研究所 一种人热休克蛋白gp96的scFv抗体及其制备方法与应用
WO2016112983A1 (en) 2015-01-15 2016-07-21 Biontech Ag Cytokine fusion proteins
IL284430B2 (en) 2015-01-20 2024-04-01 Igm Biosciences Inc Tumor necrosis factor-α receptor binding molecules and their uses
MA41460A (fr) 2015-02-03 2017-12-12 Oncomed Pharm Inc Agents de liaison à la tnfrsf et leurs utilisations
ES2754432T3 (es) 2015-05-04 2020-04-17 Apogenix Ag Proteínas agonistas de receptor CD40 de cadena sencilla
TW201718632A (zh) * 2015-08-12 2017-06-01 梅迪繆思有限公司 Ｇｉｔｒｌ融合蛋白及其用途
WO2017068180A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Apogenix Ag Single-chain light receptor agonist proteins
EP3364995B1 (en) 2015-10-23 2021-08-04 Apogenix AG Single-chain cd27-receptor agonist proteins
CN108473549A (zh) 2015-10-23 2018-08-31 阿珀吉科吉尼科斯股份公司 单链gitr受体激动剂蛋白
EP3368558A1 (en) 2015-10-28 2018-09-05 Apogenix AG Single-chain tl1a receptor agonist proteins
EP3231813A1 (en) 2016-03-29 2017-10-18 F. Hoffmann-La Roche AG Trimeric costimulatory tnf family ligand-containing antigen binding molecules
AU2017245143B2 (en) 2016-03-30 2024-01-11 Ab Biosciences, Inc. Recombinant intravenous immunoglobulin (rIVIG) compositions and methods for their production and use
CN109843931A (zh) 2016-08-11 2019-06-04 昆士兰医学研究所理事会 免疫调节化合物
EP3559239A1 (en) * 2016-12-22 2019-10-30 Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK) Oligomeric vaccines from plants by s-tag-s-protein fusions
JP2020515531A (ja) 2017-03-28 2020-05-28 チルドレンズ ホスピタル メディカル センター ノロウイルスｓ粒子ベースのワクチンならびにその作製および使用方法
WO2018178074A1 (en) 2017-03-29 2018-10-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Trimeric antigen binding molecules specific for a costimulatory tnf receptor
WO2019048936A1 (en) 2017-09-07 2019-03-14 University Of Oslo VACCINE MOLECULES
CN112552415B (zh) * 2021-02-22 2021-06-22 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 B淋巴细胞刺激因子十二聚体及其制备方法与应用
EP4347665A1 (en) * 2021-05-27 2024-04-10 Beijing Anxinhuaide Biotech. Co., Ltd. A super-trail molecule comprising two trail trimers
WO2024003353A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Transgene Fusion protein comprising a surfactant-protein-d and a member of the tnfsf

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5859330A (en) * 1989-12-12 1999-01-12 Epitope, Inc. Regulated expression of heterologous genes in plants and transgenic fruit with a modified ripening phenotype
US5763733A (en) * 1994-10-13 1998-06-09 Enzon, Inc. Antigen-binding fusion proteins
US5869330A (en) * 1995-06-05 1999-02-09 Whitehead Institute For Biomedical Research DNA encoding a novel serum protein produced exclusively in adipocytes
WO1997033617A1 (en) * 1996-03-13 1997-09-18 Protein Design Labs, Inc. Fas ligand fusion proteins and their uses
US6165476A (en) * 1997-07-10 2000-12-26 Beth Israel Deaconess Medical Center Fusion proteins with an immunoglobulin hinge region linker
JP3762220B2 (ja) * 1997-07-18 2006-04-05 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド 脂肪細胞特異的タンパク質分子
JP4057127B2 (ja) * 1998-02-19 2008-03-05 セイコーエプソン株式会社 アクティブマトリックス基板及びアクティブマトリックス基板の製造方法並びに液晶装置
IL137706A0 (en) * 1998-02-19 2001-10-31 Harvard College Mhc fusion proteins and conjugates
US7300774B1 (en) * 1999-12-09 2007-11-27 The Regents Of The University Of California Multimeric fusion proteins of the TNF superfamily ligands
MXPA01012092A (es) * 1999-05-27 2002-07-22 Zymogenetics Inc Proteina homologa zacrp5 relacionada al complemento de adipocitos.
ATE316982T1 (de) * 1999-08-09 2006-02-15 Lexigen Pharm Corp Mehrere zytokin-antikörper komplexen
DE19963859A1 (de) * 1999-12-30 2001-07-12 Apotech Res & Dev Ltd Bi- oder Oligomer eines Di-, Tri-, Quattro- oder Pentamers von rekombinanten Fusionsproteinen

Also Published As

Publication number Publication date
CN100385002C (zh) 2008-04-30
EP1985706A3 (de) 2009-05-13
CN1526020A (zh) 2004-09-01
BRPI0017054B1 (pt) 2017-04-04
ATE397076T1 (de) 2008-06-15
EP1985706A2 (de) 2008-10-29
DE19963859A1 (de) 2001-07-12
WO2001049866A1 (de) 2001-07-12
EP1246925B1 (de) 2008-05-28
IL150215A (en) 2008-11-26
CY1108195T1 (el) 2014-02-12
ZA200205069B (en) 2004-03-24
DK1246925T3 (da) 2008-09-01
US20030053984A1 (en) 2003-03-20
CA2395632C (en) 2012-08-28
IL150215A0 (en) 2002-12-01
BR0017054A (pt) 2003-01-07
AU2367301A (en) 2001-07-16
US20040235117A1 (en) 2004-11-25
PL358456A1 (pl) 2004-08-09
EP1246925A1 (de) 2002-10-09
JP5031165B2 (ja) 2012-09-19
AU783833B2 (en) 2005-12-08
HU229204B1 (hu) 2013-09-30
KR100767980B1 (ko) 2007-10-18
US20120009211A1 (en) 2012-01-12
ES2307550T3 (es) 2008-12-01
US20150004129A1 (en) 2015-01-01
US20090053252A1 (en) 2009-02-26
US7385032B2 (en) 2008-06-10
US20130202552A1 (en) 2013-08-08
KR20020089319A (ko) 2002-11-29
PT1246925E (pt) 2008-08-11
DE50015185D1 (de) 2008-07-10
HUP0203628A2 (en) 2003-02-28
CA2395632A1 (en) 2001-07-12
JP2003518949A (ja) 2003-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL204277B1 (pl) Białko fuzyjne, jego bi-lub oligomer, ich zastosowania, sekwencja DNA, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza oraz środek farmaceutyczny
JP6694409B2 (ja) Ｔｎｆｓｆ一本鎖分子
JP6152156B2 (ja) 融合分子及びｉｌ−１５変異体
JP5844158B2 (ja) 三量体形成融合タンパク質
KR100283541B1 (ko) 신규 사이토킨
ES2609429T3 (es) Composiciones y métodos para modular respuestas inmunitarias
US20040197876A1 (en) Recombinant fusion proteins and the trimers thereof
JP2007530021A (ja) Ｔｎｆリガンドファミリーメンバーの組換えポリペプチドおよびその使用
JPH07145068A (ja) 溶解型ｔｎｆ受容体のマルチマー、その製造方法、およびそれを含有する医薬組成物
JP2002509430A (ja) Ｔｎｆスーパーファミリーのメンバーであるｎｆ−ｋａｐｐａ ｂの受容体アクティベーターに対するリガンド
Holler et al. Development of improved soluble inhibitors of FasL and CD40L based on oligomerized receptors
MX2007007093A (es) Proteinas variantes de osteoprotegerina.
WO1995026985A1 (en) Modified receptors that continuously signal
JPWO2001090382A1 (ja) Ｆａｓリガンド融合蛋白質
KR20230020443A (ko) 4-1bb 표적화 다량체 면역조절제
JP2014218510A (ja) 三量体形成融合タンパク質
AU2007200199A1 (en) DNA19355 polypeptide, a tumor necrosis factor homolog
JP2016210791A (ja) 三量体形成融合タンパク質