MX2007007093A - Proteinas variantes de osteoprotegerina. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a nuevas proteinas variantes de osteoprotegerina (OVP), que demuestran afinidad de enlace reducido para su ligando TRAIL, cuando se comparan con la osteoprotegerina de tipo silvestre. Tambien se proporcionan acidos nucleicos los cuales codifican estas OVP. Los vectores recombinantes y celulas hospederas que expresan estos OVP, tambien estan abarcadas como son metodos para producir OVP recombinantes. La presente invencion tambien se refiere a composiciones que comprenden estas OVP, y a metodos para tratar enfermedades oseas caracterizadas por perdida y/o cambio oseo incrementado. Las OVP de la invencion, son empleadas para prevenir la resorcion osea y pueden ser usadas para tratar cualquier condicion que resulta en perdida osea o cambio oseo anormal, tal como osteoporosis, hipercalcemia, enfermedad de hueso de Paget, mieloma multiple, cancer de hueso y perdida osea debido a la artritis reumatoide u osteomielitis, y similares.

Description

PROTEÍNAS VARIANTES DE OSTEOPROTEGERINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a proteínas envueltas que son empleadas en la regulación de efectos biológicos mediados a través de la interacción de RANK y RANKL. Más particularmente, la invención se refiere a nuevas proteínas variantes de osteoprotegerina (OVP) que tienen especificidades de enlace alteradas cuando se comparan con osteoprotegerina de tipo silvestre. También se proporcionan ácidos nucleicos los cuales codifican estas OVP. Los vectores recombinantes y células hospederas que expresan estos OVP, también están abarcadas como son métodos para producir OVP recombinantes . La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden estas OVP, y a métodos para tratar enfermedades asociadas con el efecto biológico mediado a travéb de la interacción de R?NK y RANKL.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El eje bioquímico (RANKL) /OPG/RANK de ligando Rank, ha sido exitosamente dirigido para tratar osteoporosis, artritis reumatoide, destrucción ósea inducida por cáncer, metástasis, hipercalcemia, y dolor (Hofbauer et al . , Cáncer 92(3): p. 60-470 (2001). Terapias que utilizan OPG (Honore et al , Nature Medicine 6(5):521-528 (2000) ) , un anticuerpo dirigido a RANK, o la proteína RANK-Fc soluble (Oyajobi et al , Cáncer Res 61(6): p. 2572-8 (2001)), también están en desarrollo. Los constructos de proteína RANK-Fc soluble y OPG se enlazan a RANKL, con ello, disminuyendo la cantidad de RANKL que es disponible para la activación del receptor RANK. Además de ser importante en biología ósea, el RANKL juega un papel en el sistema inmune regulando respuestas de las células T específicas del antígeno (Anderson et al , Nature 390 ( 6656) : 175-9 (1997)). El RANKL es altamente expresado en células T activadas, mientras el receptor RANK es expresado a niveles elevados en células dendríticas maduras (DC) . La interacción entre RANKL y RANK, actúa como una señal coestimuladora, la cual mejora la supervivencia de DC y proliferación de células T induciendo diferenciación de DC, producción de citocina y apoptosis reducida en ambos tipos de células. La inmunoterapia para producir tolerancia a tejidos transplantados y/o órganos, se puede lograr bloqueando la señal coestimulatoria usando antagonistas RANK. El bloqueo de coestimulación, previene la activación de células T por DC, y ocasiona que células T aloreactivas lleguen a ser anérgicas y/o someterse a apoptosis (Adler et al , Current Opinión in Immunology 14:660-665 (2002)). Por un mecanismo de acción similar, antagonizar la señalización RANK podría ser un tratamiento para trastornos inflamatorios mediados inmunes y autoiiuuunes, tales como, lupus eritematoso sistémico, enfermedad del intestino inflamatorio, diabetes, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, y espondilitis anquilosante . La osteoprotegerina (OPG) , es una proteína de la familia del receptor del Factor Necrosis del Tumor (TNF) , y fue primero descrito por Simonet et al. (Cell, 89, 309-319 (1997) ) . La OPG parece ser un elemento crucial en la regulación de los procesos naturales de la producción y cambio óseo. Los cambios en el balance entre OPG y su receptor objetivo RANKL, han sido notados en un número de condiciones asociadas con metabolismos óseos anormales. La OPG se ha sometido a pruebas clínicas y preclínicas con potencial para aplicación en varias condiciones asociadas con el cambio óseo incrementado y pérdida ósea, que incluye, osteoporosis, artritis reumatoide, enfermedad Paget, enfermedad periodontal, enfermedad vascular y cánceres que están localizados en o han metastatizado al hueso (para revisión, véase, Lorenz et al . , J. Amer Med Assoc 292: 490-5(2004) y referencias en esta) . Las pruebas animales extensivas de OPG se reportan en la literatura, indicando desempeño igual o superior comparado con otras terapias actualmente usadas para reducir la pérdida ósea (Simonet et al . , Cell, 89, 309-319 (1997); Bolón et al . , Cell Mol Life Sci 59, 1569-76 (2002) ) . La OPG también ha sido mostrada por reducir el dolor asociado con cánceres óseos (Luger et al . , Cáncer Research 61, 4038-4047 (2001)). La OPG se describe en detalle en los documentos, US 6,015,938, US 6,284,740, US 6,284,728, US 6,613,544, US 6,316,408, US 6,288,032 y US 6,369,027. Ratones transgénicos que carecen de expresión de OPG, se describen en el documento US 6,087,555. La OPG se ha sometido a ensayos Fase I en tanto pacientes con mieloma múltiple como en pacientes con osteoporosis, para reducción del cambio óseo. En estudios preliminares Fase I/II en mujeres post- enopáusicas que sufren de osteoporosis, se encontró que una inyección única de OPG suprime marcadores del cambio óseo por 30-80% por varios días (J. Bone Miner Res 16, 348-360 (2001) ) . Pacientes con mieloma múltiple se trataron con un intervalo de dosis de OPG, y mostraron hasta 50% de decremento en la resorción ósea sobre 30 ó más días (Body et al , Cáncer 97, 887-892 (2003) ) . Así, existe evidencia muy fuerte, tanto de estudios preclínicos como estudios clínicos, de que la OPG es probablemente un tratamiento altamente efectivo en una variedad de condiciones caracterizadas por metabolismo óseo anormal . La familia del factor necrosis del tumor (TNF) por citocinas y sus receptores correspondientes, contiene un número considerable de elementos y su reactividad cruzada sustancial entre elementos en las interacciones de ligando-receptor (para una revisión, véase Igney, F.H. and Kra mer, P.H Nature Reviews Cáncer 2, 277-288 (2002)). Los receptores del TNF en general, activan uno de dos tipos de respuesta, ya sea una respuesta apoptótica (muerte celular programada) o un efecto en las trayectorias metabólicas celulares vía activación del factor de transcripción NFkB. La familia del receptor también contiene elementos los cuales actúan como simuladores, para reducir la efectividad de interacción entre otras familias de pares del receptor del ligando. La OPG parece caer en esta clase de receptor. Comparado con muchos elementos de la familia del receptor de TNF, la OPG es relativamente restringida en su especificidad objetivo. De conformidad con conocimiento actual, la OPG se enlaza a solamente dos ligandos similares a TNF: 1. RANKL (activador del receptor del ligando NFkB) , una molécula de la superficie de células similares a TNF, interactúa normalmente con un elemento de la familia del receptor de TNF, RANK, el cual es expresado en precursores de osteoclasto, células T de células dendríticas y precursores he atopoyéticos (Kong et al , Nature 397:315-323 (1999) . El RANKL interactúa con RANK en las superficies celulares para estimular la producción y actividad de osteoclastos, las células principales se involucran en el cambio óseo (Hsu, H et al , Proc Nati Acad Sci USA 96, 3540-3545 (1999)). El RANKL es expresado en células estromales/osteoblastos (Kong et al , Nature 397:315-323 (1999). La interacción de OPG con RANKL inhibe la capacidad de RANKL para unirse a RANK y estimular osteoclastos y su actividad de OPG que confiere su capacidad para reducir la pérdida ósea (Lacey et al . , Amer J Pathol 157, 435- 448 (2000); Simonet et al , Cell, 89, 309-319 (1997)). La constante de enlace de OPG dimérico que se enlaza a RANKL, ha sido reportada como 6.7 nM (Willard et al , Protein Expr. Purif 20, 48-57 (2000)) con otros reportes que colocan la constante de enlace entre 2 y 10 nM. 2. TRAIL (ligando que induce apoptosis relacionado con TNF) , una molécula de la superficie celular similar a TNF está involucrada en la inducción de apoptosis en células de cáncer. La OPG es vista como una de un número pequeño de receptores simulares para TRAIL, actuando para modular su capacidad para dirigir células cancerígenas (Revisado en Igney and Krammer (2002) como se referencia anteriormente) . La OPG podría de este modo, esperar que mejore la supervivencia de las células cancerígenas si se presentan en un sitio relevante en cantidades suficientes, y se ha documentado su capacidad para incrementar la supervivencia de células tumorales (por ejemplo, Neville- ebbe et al . , Breast Cáncer Res Treat. 86, 271- 82 (2004); Holen I et al . , Cáncer Res 62, 1619-1623 (2002)). La afinidad de OPG para TRAIL, ha sido reportada como 3nM (Emery et al , J. Biol Chem. 273, 14363-7 (1998)), aunque esta puede variar con la temperatura (Truneh et al , J. Biol Chem. 275, 23319-25 (2000) ) . La capacidad de la OPG para inhibir la actividad TRAIL, que resulta en un posible incremento en el riesgo para desarrollar cáncer, ha sido notada en la literatura médica como un probable factor disuasivo al uso de este agente como un terapéutico. Entre las áreas de aplicación para agentes que inhiben la pérdida ósea, están condiciones tales como oste?por?sis y enfermedad de Paget, las cuales no están las mismas amenazando la vida, sino requieren terapia de largo término. Además, uno de los usos potenciales más importantes de la OPG es un tratamiento adjunto de pacientes con cáncer con metástasis ósea. En todas estas áreas de aplicación potencial, cualquier indicación de crecimiento incrementado y supervivencia de células cancerígenas asociado con el tratamiento, podría ser un factor disuasivo de uso. Por lo tanto, existe una necesidad para generar una nueva variante de OPG que sustancialmente carece de capacidades de enlace TRAIL. Tal variante podría carecer de la capacidad para interferir significantemente con mecanismos anti-cancerígenos naturales, mientras retiene su capacidad para interferir con la interacción RANK/RANKL que estimula la formación y actividad de osteoclastos, y consecuente pérdida ósea.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Los presentes inventores han generado ahora, nuevas Proteínas Variantes de OPG (OVP) , las cuales demuestran afinidad de enlace reducida para TRAIL y capacidad reducida para inhibir los efectos biológicos normales que resultan de la interacción de TRAIL con su receptor. El análisis de la OVP de la presente invención, ha revelado un enfoque de mutaciones de punto en regiones específicas de la secuencia de proteína OPG de tipo silvestre. En particular, las mutaciones son agrupadas en la región abarcada por residuos de OPG 102-130. Estudios de modelación conducidos en las OVP de la presente invención, soportan la idea de que esta región de OPG/OVP forma una interfaz con proteínas tanto TRAIL como RANKL durante el enlace. La identificación de mutaciones dentro de esta región la cual puede sustancialmente alterar la familia de enlace para TRAIL sin afectar la unión a RANKL, es por lo tanto, {sorprendente. De manera importante la OVP de la presente invención, retiene la capacidad para enlazarse a RANKL, y reducir o inhibir la interacción RANK-RANKL y consecuentes efectos biológicos de esta interacción. Se contempla que las OVP preferidas de la presente invención, retendrán la capacidad de la OPG de tipo silvestre para modular el metabolismo óseo, sin tener el efecto indeseado de mejorar la supervivencia de células cancerígenas a través de la inhibición de la acción de TRAIL. Por consiguiente, la presente invención proporciona una proteína variante de OPG que comprende al menos, una modificación cuando se compara con la OPG de tipo silvestre, en donde la proteína variante de OPG retiene su afinidad de enlace para RANKL, pero exhibe afinidad de enlace reducida para TRAIL cuando se compara con OPG de tipo silvestre. Una variante de OPG de la presente invención, incluye cualquier proteína variante de OPG, sea truncada o de longitud completa, en la forma de monómero o dímero, la cual ha reducido significantemente la unión a TRAIL como un resultado de una modificación a la proteína, mientras retiene sustancialmente su unión a RANKL. En donde se hacen comparaciones entre la actividad de una OVP y aquella de OPG de tipo silvestre, se apreciará que la comparación se hace en base a las proteínas en una forma similar con respecto a tamaño y estado de dimerización. En una modalidad preferida, la proteína variante de OPG comprende al menos, una modificación en la región abarcada por residuos de aminoácido 102-130. Por ejemplo, la proteína variante de OPG puede comprender al menos, una sustitución de aminoácido en la posición 102, 111, 115, 122, 128 ó 130. La presente invención también proporciona una proteína de OVP la cual ha sido modificada para inducir dimerización, o mantener o mejorar su estabilidad, expresión o vida media biológica. Tales modificaciones pueden incluir adición de una porción de albúmina, una región Fe o sustitución con polietilenglicol, o adición de extensiones las cuales sirven para mantener la OVP en una forma dimérica. La presente invención también proporciona un polinucleótido aislado que codifica una proteína variante de OPG de la presente invención. Preferiblemente, el polinucleótido es una variante de la SEC ID NO:l, en donde la variante comprende cambios de ácidos nucleicos de manera que codifican la proteína variante de OPG deseada de la invención. Los métodos para producir tales cambios de ácidos nucleicos se conocen en la técnica y también se describen en este documento. También se proporcionan variaciones en esta secuencia en donde la proteína codificada mantiene el mismo espectro de actividades biológicas. La secuencia de nucleótido puede ser alterada para mejorar la expresión de la proteína codificada en uno o más sistemas de expresión, para incrementar la estabilidad de ARN, o casualmente, que contienen cambios los cuales no disminuyen la función biológica del ácido nucleico o su proteína codificada. La presente invención también proporciona un vector el cual comprende un polinucleótido de conformidad con la invención. Preferiblemente, el vector es adecuado para la replicación y/o expresión de un polinucleótido. Los vectores pueden ser, por ejemplo, un plásmido, virus o vector de fago proporcionado con un origen de replicación, y preferiblemente, un promotor para la expresión del polinucleótido y opcionalmente, un regulador del promotor. El vector puede contener uno o más marcadores seleccionables, por ejemplo, un gen de resistencia a ampicilina en el caso de un plásmido bacteriano o un gen de resistencia a la neomicina para un vector de expresión de mamífero. El vector puede ser usado in vi tro, por ejemplo, para la producción de ARN o usado para transfectar o transformar una célula hospedera. La presente invención también proporciona una célula hospedera la cual comprende un vector de conformidad con la invención, o contiene el gen que codifica una de las proteínas de la invención bajo condiciones que permiten la expresión y producción de la proteína sujeto. La presente invención también proporciona un proceso para preparar una proteína variante de OPG de la invención, el proceso comprende cultivar una célula hospedera de la invención bajo condiciones las cuales permiten la producción de la proteína variante de OPG, y recuperar la proteína variante de OPG. Tales células pueden ser usadas para la producción de cantidades comercialmente empleadas de la proteína variante de OPG codificada. La presente invención también proporciona un método para reducir la afinidad de enlace de OPG por TRAIL, el método comprende modificar al menos, un aminoácido dentro de una proteína OPG o fragmento de la misma para producir una variante de proteína OPG, y probar la proteina variante de OPG para afinidad de enlace para TRAIL. En una modalidad preferida, el método comprende modificar al menos, un aminoácido dentro de la región abarcada por los residuos 102-130 de la OPG de tipo silvestre para producir una proteína variante de OPG, y probar la proteína variante de OPG para afinidad de enlace para TRAIL. Se apreciará que una OVP de la presente invención, puede ser usada para reducir o inhibir el enlace de RANK a RANKL in vi vo, y reducir o inhibir la interacción entre RANK y RANKL y los efectos biológicos mediados a través de esta interacción. Por consiguiente, la presente invención también proporciona una composición para inhibir o reducir el enlace de RANK a RANKL, la composición comprende una proteína variante de OPG de conformidad con la invención, y uno o más portadores aceptables. La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína variante de OPG de conformidad con la invención, y uno o más portadores, solubilizadores, estabilizadores y anti-oxidantes farmacéuticamente aceptables. La presente invención también proporciona un método para inhibir o reducir un efecto biológico mediado a través de la interacción de RANK y RANKL, el método comprende exponer una molécula RANKL a una proteína variante de OPG de conformidad con la presente invención. La presente invención también proporciona un método para inhibir o reducir un efecto biológico mediado a través de la interacción de RANK y RANKL en un sujeto, el método comprende administrar a un sujeto, una proteína variante de OPG de conformidad con la invención. Por "sujeto", en este documento, significa tanto humanos como otros animales, particularmente mamíferos como se resume en este documento, con humanos siendo preferido. La presente invención también proporciona un método para inhibir o reducir la diferenciación, activación y/o supervivencia de osteoclastos por RANKL, el método comprende exponer tejido que contiene osteoclastos o células precursoras de osteoclastos a una proteína variante de OPG de conformidad con la invención. La presente invención también proporciona un método para inhibir o reducir la diferenciación, activación y/o supervivencia de osteoclastos por RANKL en un sujeto, el método comprende, administrar a un sujeto, una proteína variante de OPG de conformidad con la invención. La presente invención también proporciona un método para prevenir o tratar un trastorno óseo que comprende, administrar a un paciente, la composición farmacéutica de la presente invención. A través de esta especificación, la palabra "comprende", o variaciones tales como "comprenden" o "que comprende", serán entendidas por implicar la inclusión de un elemento, integrante o etapa declarada, o grupos de elementos, integrantes o etapas, pero sin la exclusión de cualquier otro elemento, integrante o etapa, o grupo de elementos, integrantes o etapas. Las varias características y modalidades de la presente invención, referidas en secciones individuales en este documento, también aplican como sean apropiadas, a otras secciones. Consecuentemente, características especificadas en relación a una modalidad de la invención, pueden ser combinadas con características especificadas en relación a otras modalidades como sean apropiadas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: A. Estructura de gen OPG. CRD-dominio rico en cisteína; dominio de muerte-DD; HBD: dominio de enlace a heparina. B. mutagénesis y cásete de exhibición de PEGX254. Figura 2: Enlace de comparación ELISA de OVP purificado y OPG a RANKL y TRAIL. Las curvas de enlace son etiquetadas de conformidad con el número variante a ser probado. WT se refiere a OPG no mutado. Las etiquetas de curva que terminan en R, se refieren a enlace RANKL; las etiquetas de curvas que terminan en T, se refieren a enlace TRAIL. Estos estudios se llevaron a cabo usando OPG 22-194 monomérica expresada en E. coli .

Figura 3: Enlace de comparación ELISA de OVP y OPG purificadas a RANKL y TRAIL. Etiquetado de curva y condiciones como para la Figura 3. Figura 4: Elisa de OVP expresada en mamíferos purificados que se enlazan a RANKL (A) y TRAIL (B) . Estos estudios se llevaron a cabo usando OPG u OVP 22-194 ligadas a Fe diméricas. Figura 5: (A) Inhibición de apoptosis inducida por TRAIL en células HCT116 por proteínas tipo silvestre de OPG. (B) Inhibición de apoptosis inducida por TRAIL en células HCT116 por OVP. Figura 6: (A) Inhibición de tipo nativa de OPG de Activación osteoclástica mediada por RANKL de células RAW264.7. (B) Inhibición de OVP de activación osteoclástica mediada por RANKL de células RAW264.7. Figura 7: Inhibición de OVP de resorción mediada por osteoclastos inducida por RANKL. Todas las OVP usadas a 1 nM. UT-no tratado con OVP. Figura 8: Alineaciones de la OPG humana de tipo nativa y secuencias de aminoácido de OVP preferidas. Figura 9: Modelo estructural de OPG unido a RANKL de ratón (pdb archivo 1JTZ) . El trímero RANKL es visualizado como el diagrama de cinta ligeramente gris superior, OPG co o diagrama de cinta gris oscuro. Los residuos de OPG con al menos un átomo dentro de 5 Angstrom de RANKL, están resaltados como esferas de espacios llenos. Las esferas ligeras representan residuos de contacto potencial de OPG a RANKL en el dominio del receptor N-terminal (residuos 42 a 91 de la OPG, con residuos de contacto específicos registrados como 42, 43, 49, 50, 52, 53, 69, 71-82, 85-91), esferas oscuras muestran el dominio receptor C-terminal (residuos de OPG 105 a 130 con residuos de contacto específicos registrados como 105, 106, 107, 108, 110-130) . Figura 10: Vista parcial de OPG modelada en contacto con TRAL que se enfocan en el segundo dominio del receptor del TNF. En la mitad superior, el TRAIL se muestra como un diagrama de cintas . La OPG se representa como un rastro de alfa-carbono en gris ligero. En negritas, una variante OPG es alineada con OPG, caracterizando la mutación de lie 115 a Glu. Las cadenas laterales para los residuos 115 y 122 se muestran como figuras en bastón. El modelado de la OVP sugiere la mutación de residuos 115 que resulta en una conformación alterada del bucle 107-118, con contactos realineados en la interfaz. El cambio conformacional puede alterar contactos adicionales, como se resaltan por el cambio de la cadena lateral del residuo 133, potencialmente aboliendo los contactos en la región de residuos 120-130. Estos contactos parecen más cruciales para TRAIL que para el enlace RANKL. Esto podría ser consistente con la abolición casi completa de enlace TRAIL visto para esta mutación en estos ensayos. Figura 11: Modelo que predice la asociación entre OPG (inferior) y TRAIL (superior como diagrama de cintas) . Los residuos 102-130, se muestran en la forma de espacios llenos. De conformidad con este modelo, el bucle que contiene los residuos 115 de OPG (flecha larga), y residuos C-terminal a este (a la derecha del bucle 115) , hacen contactos múltiples con TRAIL (flecha corta) . El bucle saliente 195-202 de TRAIL (flecha corta), parece permitir contactos adicionales o más extensivos con OPG que son posibles para RANKL en particular, con residuos OPG 120-130 (comparar con Figura 12) . Esto confirma la región como un área en donde las mutaciones están probablemente, alterando el enlace TRAIL con el potencial para enlace RANKL no alterado. Figura 12: Modelo que predice la asociación entre OPG (inferior) y TRAIL (superior como diagrama de cintas) , usando la estructura RANKL de ratón, alineada al complejo OPG-TRAIL modelado. Los residuos 102-130 de OPG, se muestran en la forma de espacios llenos. El bucle que contiene los residuos 115 (flecha larga), indica hacia y contacta el RANKL, pero los residuos C-terminales a esta área (a la derecha de este bucle) , parecen tener algún contacto con RANKL (flecha corta-residuos RANK 225-233, los cuales corresponden al bucle saliente 195-202 en TRAIL de la Figura 11) . Esto distingue el contacto de OPG con RANKL de aquel de TRAIL mostrado en el diagrama previo.

Clave al Listado de Secuencias SEC ID NO:l - Gen de osteoprotegerina de tipo silvestre humano; SEC ID NO: 2 - Osteoprotegerina de tipo silvestre humano; SEC ID NO: 3 - Osteoprotegerina de tipo silvestre de rata; SEC ID NO: 4 - Osteoprotegerina de tipo silvestre de ratón; y SEC ID NO: 5 a 47 - Proteínas variantes de osteoprotegerina humana (OVP) ; y SEC ID NOs: 48 y 49 - Cebadores usados para aislar el gen de OPG.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Técnicas Generales A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento, tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por uno de habilidad ordinaria en la técnica (por ejemplo, en cultivo celular, genética molecular, química de ácido nucleico, técnicas de hibridización, química y bioquímica) . A menos que se indique de otro modo, las técnicas de ADN recombinantes utilizadas en la presente invención, son procedimientos estándares, bien conocidos por aquellos de habilidad en la técnica. Tales técnicas se describen y explican a través de la literatura en fuentes tales como, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T. A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors) , DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel et al . (Editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, incluyendo todas las actualizaciones hasta la fecha) .

Osteoprotegerina (OPG) La OPG es un miembro de la subfamilia del receptor de TNF, que tiene una actividad asociada con el metabolismo óseo y en particular, que tiene la actividad de inhibir la resorción ósea con ello, incrementando la densidad ósea. En particular, la interacción de OPG con RANKL, inhibe la capacidad de RANKL para estimular la formación y actividad de osteoclastos vía su interacción con RANK, y es esta actividad de OPG la que confiere su capacidad para reducir la pérdida ósea. Las actividades biológicas de OPG también incluyen actividad asociada con enlace a TRAIL. El TRAIL (ligando que induce apoptosis relacionada con TNF), es una molécula de la superficie celular similar a TNF involucrada en la inducción de apoptosis en células cancerígenas. La OPG es vista como una de un número pequeño de receptores simulados para TRAIL, que actúan para modular su capacidad para dirigir células cancerígenas. La OPG se espera de este modo, que tenga el efecto indeseable para mejorar la supervivencia de células cancerígenas si se presenta en un sitio relevante en cantidades suficientes. Se han descrito varios fragmentos activos de OPG. Yamaguchi et al. (J. Biol. Chem. 273, 5117-5123 (1998)), demuestra que las variantes truncadas y suprimidas de OPG, retienen actividad similar a OPG, mientras la OPG en tanto forma de monómero o dímero retiene la actividad biológica (To oyasu, A et al , Biochem Biophys Res Commun 245, 382-387 1998)). Schneeweis et al , (J. Biol. Chem. Oct 7 2005 (epub) , examina el montaje, estado y afinidad de OPG para RANKL. Reporta que la dimerización de OPG ya sea en forma de longitud completa en donde la dimerización es mediada por interacciones no covalentes dentro de las regiones del dominio de muerte, o en la forma truncada en donde la dimerización puede ser mediada por unión a Fe, se requiere para unión de alta afinidad de OPG a RANKL. Las secuencias de aminoácido de osteoprotegerina de humano, rata y ratón de tipo silvestre, se muestran en las SEC ID NOs . 2 a 4, respectivamente. Las secuencias de OPG de tipo silvestre, también abarcan aquellas que tienen la secuencia líder amino terminal de 21 aminoácidos removidos y/o en donde los aminoácidos son removidos del C-término hasta y que incluye 185 aminoácidos.

Proteínas Variantes de OPG Por "proteína" en este documento, significa que al menos, dos aminoácidos covalentemente unidos, los cuales incluyen proteínas, polipéptidos, oligopéptidos y péptidos. La proteína puede ser elaborada de aminoácidos que se originan naturalmente y enlaces peptídicos, o estructuras peptidomiméticas sintéticas, es decir, "análogos", tales como peptoides (véase, et al., Proc. Nati. Acd. Sci. U.S.A. 89(20:9367-71 (1992)), en general, dependiendo del método de síntesis. Por ejemplo, la homo-fenilalanina, citrilina y norleucina, son considerados aminoácidos para propósitos de la invención. "Aminoácido", también incluye residuos de imino ácido tal como prolina e hidroxiprolina. Pueden ser utilizados tanto aminoácidos D como L. Los presentes inventores han generado ahora, nuevas proteínas variantes de OPG (OVP) , las cuales demuestran afinidad de enlace reducido para TRAIL. De manera importante, las OVP de la presente invención, retienen la capacidad para enlazarse a RANKL. Por consiguiente, se contempla que las OVP de la presente invención, retendrán la capacidad de la OPG de tipo silvestre, para modular el metabolismo óseo, sin tener la característica asociada a TRAIL indeseada de mejoramiento de supervivencia de células cancerígenas. Por consiguiente, la presente invención proporciona una proteína variante de OPG que comprende, al menos, una modificación cuando se compara con una OPG de tipo silvestre, en donde la proteína variante de OPG retiene la afinidad de enlace para RANKL, pero exhibe afinidad de enlace reducida para TRAIL cuando se compara con la OPG de tipo silvestre. Por "retiene afinidad de enlace para RANKL", significa que la proteína variante de OPG, exhibe al menos, 20% de afinidad de enlace para RANKL, cuando se compara con OPG de tipo silvestre. La OPG de tipo silvestre, puede ser derivada de cualquier especie, preferiblemente, especies de mamíferos.

En una modalidad preferida, la OPG de tipo silvestre, es una proteína OPG humana prevalente. Más preferiblemente, la OPG de tipo silvestre, es una proteína que tiene una secuencia de aminoácido como se muestra en la SEC ID NO.2. Las proteínas variantes de OPG de la presente invención, preferiblemente exhiben al menos, una actividad biológica de la OPG de tipo silvestre. En un ejemplo, la actividad biológica de la OPG de tipo silvestre, se refiere al metabolismo óseo, y en particular, a la capacidad para inhibir la estimulación reducida y/o actividad de osteoclastos por RANKL. Preferiblemente, las proteínas variantes de OPG de la presente invención, retienen la capacidad para prevenir las enfermedades relacionadas disminuidas en la densidad ósea o cambio óseo anormal. En otro ejemplo, la actividad biológica de la OPG de tipo silvestre, se refiere a la actividad de células T, y en particular, a la capacidad para reducir o inhibir la activación de células T. Preferiblemente, las proteínas variantes de OPG de la presente invención, son tratamientos empleados para trastornos autoinmunes, tales como, lupus eritematoso sistémico, enfermedad del intestino inflamatorio, diabetes, esclerosis múltiple, artritis reumatoide y espondilitis anquilosante. En ejemplos adicionales, las proteínas variantes de OPG de la presente invención, son empleadas para tratar enfermedades cardiovasculares, prevenir o reducir la calcificación de bazos y válvulas sanguíneas, o mejorar el crecimiento de los bazos sanguíneos. En una modalidad, la proteína variante OPG es una versión modificada de una secuencia de OPG de tipo silvestre de longitud completa. En otra modalidad, la proteína variante de OPG contiene una o más inserciones adicionales o supresiones en el N-término, C-término o internamente. Por ejemplo, la proteína variante de OPG puede consistir de cualquier fragmento activo modificado de OPG. El fragmento activo puede consistir de, por ejemplo, 22-294 aminoácidos, 22-201 aminoácidos, 22-194 aminoácidos o 1-197 aminoácidos. En una modalidad preferida, las proteínas variantes de OPG tienen al menos, 1 residuo de aminoácido que difiere de una secuencia de OPG de tipo nativa, con al menos, 2, 3, 4, ó 5 diferentes residuos siendo más preferidos. Las modificaciones son preferiblemente, sustituciones de aminoácidos y pueden incluir aquellas en la superficie o áreas expuestas de OPG. Las proteínas variantes de OPG pueden comprender un dominio o dominios múltiples conectados por secuencias enlazadoras. Las proteínas variantes de OPG pueden contener modificaciones adicionales, por ejemplo, modificaciones que alteran la estabilidad o inmunogenicidad o las cuales permiten las modificaciones p?st-traduccionales tales como PEGilación o glicosilación. En una modalidad preferida, la proteína variante de OPG comprende al menos, una modificación en la región abarcada por los residuos de aminoácido 102-130. Por ejemplo, la proteína variante de OPG puede comprender al menos, una sustitución de aminoácido en la posición 102, 111, 115, 122, 128 ó 130. En una modalidad preferida, las proteínas variantes de OPG comprenden al menos, una modificación dentro de la estructura de bucle que comprende los residuos 107-118. En una modalidad particularmente preferida, la modificación en esta región, involucra la sustitución de lie en la posición 115. lie en la posición 115, puede ser sustituido por aminoácidos que son más polares o tienen cadenas laterales más cortas. Preferiblemente, lie en la posición 115, es sustituido con Thr, Met, Val, Asp, Gly, Ser o Arg. De este modo, las modificaciones preferidas incluyen, I115T, I115M, I115V, I115D, I115G, I115S y I115R. En una modalidad preferida, la proteína variante de OPG comprende al menos, una modificación en la región abarcada por los residuos de aminoácidos 120-130. En otra modalidad, la modificación involucra la sustitución de Arg en la posición 122. Preferiblemente, Arg en la posición 122, es sustituido con Gly, Gln, Ser, Asn o Glu. De este modo, las modificaciones preferidas incluyen R122G, R122Q, R122S, R122N y R122E. En aún una modalidad particularmente preferida adicional, la modificación involucra sustitución de Phe en la posición 128. Preferiblemente, Phe en la posición 128 es sustituido con Val, Ala, Leu, lie o Ser. De este modo, las modificaciones preferidas incluyen, F128V, F128A, F128L, F128I y F128S. En todavía una modalidad preferida adicional, la modificación involucra sustitución de Val en la posición 130. Preferiblemente, Val en la posición 130 es sustituida con Glu o Ala. En una modalidad preferida adicional, la proteína variante de OPG comprende al menos, dos modificaciones. Al menos, las dos modificaciones pueden ambas ocurrir en la región abarcada por los residuos 102-130. Por ejemplo, al menos las dos modificaciones pueden involucrar sustituciones en las posiciones 115 y 122. Ejemplos de modificaciones de enlaces dobles dentro de esta región son, R122N y I115M; R122N y I115M; F128S y I115M; F128I y I115M; y F128L y I115M. Alternativamente, al menos dos modificaciones pueden involucrar una o más modificaciones dentro de la región abarcada por aminoácidos 102-130, y una o más modificaciones fuera de esta región. La modificación fuera de esta región puede ocurrir en, por ejemplo, cualquiera o más de los residuos 31, 40, 51, 100, 155, 167 ó 168. En una modalidad preferida, la modificación ocurre en el residuo 40. Preferiblemente, la modificación involucra sustitución de Leu en la posición 40 con Ser. En otra modalidad, la proteína variante de OPG de la presente invención, comprende una o más modificaciones dentro de la región abarcada por los aminoácidos 102-130 y una modificación en cualquiera o más de los siguientes residuos de aminoácidos: Gln21, Glu22, Thr23, Phe24, Pro25, Pro26, Lys27, Tyr28, Leu29, His30, Tyr31, Asp32, Glu33, Glu34, Thr35, Ser36, His37, Gln38, Asp42, Lys43, Pro45, Pro46, Thr48, Lys51, Gln52, His53, Cys54, Thr55, Ala56, Lys57, Trp58, Lys59, Thr60, Val61, Ala63, Pro64, Pro66, Asp67, His68, Tyr69, Asp72, Ser73, Trp74, Thr76, Ser77, Asp78, Glu79, Leudl, Tyr82, Ser84, Pro85, Val86, Lys88, Glu89, Leu90, Tyr92, Val93, Lys94, Gln95, Glu96, Asn98, Arg99, ThrlOO, HislOl, Vall31, Glnl32, Alal33, Glyl34, Thrl35, Prol36, Glul37, Argl38, Vall41, Lysl43, Argl44, Cysl45, Prol46, Aspl47, Glyl48, Phel49, Phel50, Serl51, Asnl52, Glul53, Thrl54, Serl55, Serl56, Lysl57, Alal58, Prol59, Cysl60, Argldl, Lysl62, Hisl63, Thrl64, Asnl65, Cysl66, Serl67, Vall68, Phel69, Glyl70, Leul71, Leul72, Leul73, Thrl74, Glnl75, Lysl76, Glyl77, Asnl78, Alal79, Thrl80, Hisl81, Aspl82, Asnl83, Ilel84, Cysl85, Serl86, Glyl87, Asnl88, Serl89, Glul90, Serl91, Thrl92, Glnl93, Lysl94, Cysl95, Glyl96, Ilel97, Aspl98, Vall99, Thr200 y Leu201. En otra modalidad, la proteína variante de OPG de la presente invención, comprende una o más modificaciones dentro de la región abarcada por los aminoácidos 102-130 y una modificación en cualquiera o más de los siguientes residuos de aminoácido: Tyr28, His30, Tyr31, Glu34, Thr35, Ser36, His37, Lys43, Tyr49, Gln52, His53, Pro66, Asp67, His68, Tyr69, Tyr70, Thr71, Asp72, Ser73, Trp74, His75, Thr76, Ser77, Asp78, Glu79, Cys80, Leudl, Tyr82, Cys83, Ser84, Pro85, Val86, Cys87, Lys88, Glu89, Leu90, Gln91, Asnl39 y Glul53. La presente invención también proporciona una proteína variante de OPG que comprende una modificación en el residuo 40, en donde la proteína variante de OPG retiene la afinidad de enlace para RANKL, pero exhibe afinidad de enlace reducida para TRAIL cuando se compara con la OPG de tipo silvestre. Preferiblemente, la modificación involucra sustitución de Leu en la posición 40 con Ser. Una proteína variante de OPG de la presente invención, puede involucrar una o más de las siguientes modificaciones mostradas en la Tabla 1. En una modalidad preferida adicional, la proteína variante de OPG comprende una secuencia como se muestra en cualquiera de las SEC ID NOs . : 5 a 47. En una modalidad preferida adicional de la presente invención, la OVP exhibe una afinidad de enlace para RANKL que es al menos 50%, más preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 80%; más preferiblemente al menos 90%, y más preferiblemente, al menos 95% de aquella de la OPG de tipo silvestre. En una modalidad, la OVP exhibe afinidad de enlace incrementada para RANKL cuando se compara con la OPG de tipo silvestre. En una modalidad preferida adicional, la OVP tiene un EC50 (nM) para unión a RANKL de menos de 5nM, más preferiblemente, menos de 1 nM bajo condiciones de ensayo como se describe en el Ejemplo 8. En una modalidad preferida adicional de la presente invención, la OVP exhibe una afinidad de enlace para TRAIL que es menos de 50%, más preferiblemente, menos de 40%, más preferiblemente, menos de 30%, más preferiblemente, menos de 20%, más preferiblemente, menos de 10% y más preferiblemente menos de 5% que aquella de la OPG de tipo silvestre. En una modalidad preferida adicional, la OVP tiene un EC50 (nM) para unión a TRAIL de menos de 5nM, más preferiblemente, mayor de 1 nM, más preferiblemente mayor de 25 nM, más preferiblemente mayor de 50 nM, bajo condiciones de ensayo como se describe en el Ejemplo 8. También están abarcadas proteínas variantes de OPG que tienen supresiones o truncaciones carboxi-terminal de parte o todos los residuos de aminoácidos 195-401 ó 198-401 de OPG; uno o más cambios de aminoácidos en los residuos 195-401 ó 198-401; supresión de parte o todos los dominios ricos en cisteína de OPG, en particular supresión del dominio rico en cisteína distal (carboxi-terminal) ; y uno o más cambios de aminoácido en un dominio rico en cisteína, en particular en el dominio rico en cisteína distal (carboxi-terminal) . Las supresiones de secuencia de aminoácido preferido, en general, varían desde aproximadamente 1 hasta 30 residuos, más preferiblemente aproximadamente 1 hasta 10 residuos y típicamente aproximadamente 1 hasta 5 residuos contiguos . Se entenderá que la numeración de aminoácido usada en este documento, se refiere a sitios para mutagénesis relacionada con la numeración de la secuencia OPG humana mostrada en las SEC ID NOs.: 1 y 2. Los sitios correspondientes en homólogos, derivados y variantes alélicas también están abarcados por la presente invención. El término "correspondiente a", es usado en el contexto de la presente invención para referirse a residuos de aminoácidos de polipéptidos OPG relacionados con las SEC ID NOs: 1 y 2 (por ejemplo, mayor de 70% idéntica, mayor de 80% idéntica, mayor de 90% idéntica o mayor de 9% idéntica a las SEC ID NOs. 1 y 2) , sin embargo, la numeración de residuos relativos del polipéptido relacionado, puede ser diferente que aquella de las SEC ID NOs. 1 y 2. También están abarcadas proteínas de variantes de OPG descritas en este documento, que comprende sustituciones conservativas adicionales a través de la secuencia. Tales sustituciones conservativas son como sigue: Además, si se desea, aminoácidos que no se originan naturalmente o análogos de aminoácido químicos, pueden ser introducidos como una sustitución o adición en el polipéptido de la presente invención. Tales aminoácidos incluyen, pero no se limitan a, los isómeros D de los aminoácidos comunes, ácido 2, 4-diaminobutírico, ácido -amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 2-aminobutírico, ácido 6-aminohexanoico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminopropiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cistéico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciciohexilalanina, ß-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos diseñadores tales como ß-metilaminoácidos, C -metilaminoácidos, Na-metilaminoácidos, y análogos de aminoácido en general. También proporcionado por la invención, están derivados químicamente modificados de proteínas variantes de OPG las cuales pueden proporcionar ventajas adicionales, tales como estabilidad incrementada y tiempo de circulación del polipéptido, o disminución de inmunogenicidad (véase, Patente Estadounidense No. 4,179,337). Las porciones químicas para derivatización pueden ser seleccionadas a partir de polímeros solubles tales como polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico y similares. También están incluidas OVP de la presente invención, las cuales son diferentemente modificadas durante o después de la síntesis, por ejemplo, por biotinilación, bencilación, glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/de bloqueo conocidos, desdoblamiento proteolítico, etc. Los polipéptidos pueden ser modificados en posiciones aleatorias dentro de la molécula, o en posiciones predeterminadas dentro de la molécula y pueden incluir una, dos, tres o más porciones químicas unidas. Estas modificaciones pueden servir para incrementar la estabilidad y/o bioactividad del polipéptido de la invención. Modificaciones adicionales de las proteínas variantes de OPG abarcadas por la invención incluyen, modificaciones post-traduccionales (por ejemplo, cadenas de carbohidratos N-ligadas u O-ligadas, procesamiento de extremos N-terminales o C-terminales) , modificaciones químicas de cadenas de carbohidratos N-ligadas u O-ligadas, y adición de un residuo de metionina N-terminal como un resultado de la expresión de células hospederas procarióticas. Las OVP pueden también, ser modificadas con una etiqueta detectable, tal como una etiqueta enzimática, fluorescente, isotópica o de afinidad, para permitir la detección y asilamiento de la proteína.

Modificaciones adicionales de las proteínas variantes de OPG incluyen, proteínas quiméricas en donde la proteína variante de OPG es fusionada a una secuencia de aminoácido heterólogo. La secuencia heteróloga puede ser cualquier secuencia la cual permite a la proteína de fusión resultante para retener al menos, la actividad de la proteína variante de OPG. Las secuencias heterólogas incluyen por ejemplo, fusiones de inmunoglobulinas tales como, fusiones Fe o fusiones a otros ligandos celulares los cuales pueden incrementar la estabilidad o auxiliar en la purificación de la proteína. En una modalidad las proteínas variantes de OPG de la invención, pueden ser producidas como diméricas o aún, como moléculas de cadenas únicas oligoméricas, con dos, tres o posiblemente, más monómeros. Los monómeros pueden ser unidos por un enlace peptídico o un enlazador peptídico, o por ejemplo, por medio de una molécula PEG. La dimerización también se puede lograr produciendo el compuesto como una proteína de fusión con la porción Fe de Ig gama (Acceso GenPept No. M87789.1). Las moléculas pueden ser expresadas como proteínas de fusión con una parte Fe C-terminal o con una parte Fe N-terminal. La dimerización también se pude lograr enfocando el producto candidato a un cierre leucina GCN4, el cual ha sido reportado por inducir la dimerización de proteínas de fusión (Dónate, et al , Biochemistry, 39 11467-76 (2000)). Alternativamente, las moléculas diméricas pueden ser producidas por mutagenización de uno de al menos, cinco, o alternativamente, uno de los primeros cinco residuos de aminoácido a un residuo de cisteína. Un residuo de cisteína no apareado del compuesto purificado, puede entonces ser unido a un grupo PEG "di-activo", usando grupos de unión reactivos de tiol existentes. Alternativamente, las moléculas diméricas pueden ser producidas insertando dos moléculas candidatas (idénticas o aún diferentes) en estructura, con un enlazador de polipéptido flexible adecuado en un vector de expresión apropiado. Todavía, modificaciones adicionales de las proteínas variantes de OPG incluyen formas diméricas o multiméricas en donde las unidades monoméricas de la proteína variante de OPG pueden ser ligadas en conjunto químicamente o genéticamente por moléculas enlazadoras apropiadas, las cuales pueden incluir enlazadores péptidos o químicos, o puentes de disulfuro entre los residuos de cisteína. Adicionalmente, las formas diméricas o multiméricas de las proteínas sujeto, se pueden lograr por enlaces entre proteínas en las cuales la proteína de OPG está fusionada, tal como regiones Fe.

Las proteínas variantes de OPG de la invención, son preferiblemente aisladas y purificadas a partir de otros polipéptidos presentes en los tejidos, líneas celulares y células hospederas transformadas que expresan la OVP, o purificadas a partir de componentes en los cultivos celulares que contienen la proteína secretada. En una modalidad, la OVP está libre de asociación con otras proteínas, tales como el producto de expresión de una célula hospedera bacteriana. Las proteínas variantes de OPG de la presente invención, pueden ser preparadas usando cualquier técnica conocida en el arte. Por ejemplo, el polinucleótido proporcionado como SEC ID N0.1, puede ser sometido a mutagénesis in vi tro. Tales técnicas de mutagénesis in vi tro incluyen, sub-clonación del polinucleótido en un vector adecuado, transformación del vector en una cepa "imitadora", tal como la XL-1 roja de E. coli (Stratagene) , y propagación de la bacteria transformada por un número adecuado de generaciones. En otro ejemplo, los polinucleótidos de la invención son sometidos a técnicas de intercambio como se describe ampliamente por Harayama (1998) . Los productos de proteínas derivados de ADN mutado/alterado, pueden ser fácilmente seleccionados usando técnicas descritas en este documento, para determinar si tienen especificidad de sustrato mejorada y/o alterada.

Los mutantes de secuencia de aminoácido de los polipéptidos de la presente invención, pueden también ser preparados introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en una secuencia de ácido nucleico, o por síntesis in vi tro del polipéptido deseado. Tales mutantes incluyen por ejemplo, supresiones, inserciones o sustituciones de residuos dentro de la secuencia de aminoácido. Una combinación de supresión, inserción y sustitución, se puede hacer para llegar al constructo final, siempre que el producto de proteína final posee las características deseadas. Los mutantes de sustitución tienen al menos, un residuo de aminoácido en la secuencia de OPG de tipo silvestre removida y un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para mutagénesis substitucional, incluyen aquellos sitios ejemplificados en este documento. Los sitios para mutación pueden ser modificados individualmente o en serie, por ejemplo, (1) sustituyendo primero con elecciones de aminoácido conservativo y después con más selecciones de radical dependiendo de los resultados logrados, (2) suprimir el residuo objetivo, o (3) insertar otros residuos adyacentes al sitio localizado. Alternativamente, las proteínas variantes de OPG pueden ser generadas usando el sistema de mutagénesis de evolución in vi tro libres de células. En un ejemplo de evolución in vi tro libre de células, se utiliza un sistema similar a aquel descrito en el documento WO 99/58661 ó WO 2004/039995. Un método de evolución in vi tro libre de célula, comprende exponer moléculas de ARN de OPG mutante, producidas directamente o indirectamente por la acción de una polimerasa en la presencia de un mutágeno (tal como replicasa QB o ribavirina, o un derivado/análogo del mismo) , a un sistema de traducción bajo condiciones las cuales resultan en la producción de una población de proteínas mutantes. Estas proteínas de OPG mutantes, están ligadas al ARN a partir del cual son traducidas formando una población de complejos de ARN/proteína mutante. Esta población de complejos de ARN/proteína OPG mutante, es seleccionada para una actividad biológica deseada tal como enlace a RANKL sin enlace a TRAIL. Un complejo de ARN/proteína mutante con la actividad deseada, puede ser aislado y la secuencia de la proteína codificada por el ARN caracterizada por técnicas estándares. La presente invención también proporciona un proceso para preparar una proteína variante de OPG de la invención, el proceso comprende cultivar una célula hospedera de la invención, bajo condiciones las cuales permiten la producción de la proteína variante de OPG, y recuperar la proteína variante de OPG. Tales células pueden ser usadas para la producción de cantidades comercialmente empleadas para la pr?teína variante de OPG codificada. Las proteínas variantes de OPG de la presente invención, pueden ser producidas en una variedad de formas, que incluyen, producción y recuperación de proteínas naturales, producción y recuperación de proteínas recombinantes y síntesis química de las proteínas. En una modalidad, una proteína variante de OPG de la presente invención, es producida cultivando una célula capaz de expresar la proteína variante de OPG bajo condiciones efectivas para producir la proteína variante de OPG y recuperar la proteína variante de OPG. Las condiciones de cultivo efectivas incluyen, pero no se limitan a, medio efectivo, bioreactor, temperatura, pH y condiciones de oxígeno, que permiten la producción de proteína. Un medio efectivo se refiere a cualquier medio en el cual, una célula es cultivada para producir un polipéptido de la presente invención. Tal medio comprende típicamente, un medio acuoso que tiene fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato asimilables y sales apropiadas, minerales, metales y otros nutrientes, tales como vitaminas. Las células de la presente invención pueden ser cultivadas en bio-reactores de fermentación convencionales, matraces sacudidores, tubos de prueba, discos microtituladores y cajas de petri. La cultivación se puede llevar a cabo a una temperatura, pH y contenido de oxígeno apropiado para una célula recombinante. Tales condiciones de cultivo están dentro de la pericia de uno de habilidad ordinaria en la técnica. Un método para la purificación de proteínas variantes de OPG a partir de células hospederas transfectadas, también está incluido. Los procesos de purificación pueden emplear una o más etapas de purificación de proteína estándares, tales como, cromatografía, en un orden apropiado, para obtener proteína purificada. Las etapas de cromatografía pueden incluir, intercambio iónico, filtración en gel, interacción hidrofóbica, fase inversa, cromatoenfoque, cromatografía de afinidad, que emplean un anticuerpo anti-OPG o complejo de afinidad de biotina-estreptavidina y similares. La presente invención también proporciona un método para reducir la afinidad de enlace de OPG para TRAIL, el método comprende modificar al menos, un aminoácido dentro de una proteína de OPG o fragmento de la misma, para producir una proteína variante de OPG, y probar la proteina variante de OPG para afinidad de enlace para TRAIL. En una modalidad preferida, el método comprende modificar al menos, un aminoácido dentro de la región abarcada por los residuos 102-130 de la OPG de tipo silvestre, para producir una proteína variante de OPG, y probar la proteína variante de OPG para afinidad de enlace para TRAIL. Los métodos para probar la proteína variante de OPG para afinidad de enlace para TRAIL, serán conocidos por aquellos de habilidad en la técnica. Los ensayos adecuados incluyen, pero no se limitan a, comparaciones cuantitativas que comparan las constantes de enlace y equilibrio cinético. La relación de asociación cinética (Kon) y relación de disociación (Koff) , y las constantes de enlace de equilibrio (Kd) , pueden ser determinadas usando resonancia de plasmón de superficie en un instrumento BIAcore, siguiendo el procedimiento estándar en la literatura (Pearce et al , Biochemistry 38:81-89 (1999)). También se pueden usar varios métodos alternativos para determinar la afinidad de enlace y cinética, ejemplos de los cuales se describen en la sección de ejemplos de este documento. Ácidos Nucleicos, Vectores y Células Hospederas La presente invención también proporciona un polinucleótido aislado que codifica una proteína variante de OPG de la presente invención. Ejemplos de polinucleótidos de la presente invención incluyen, ADNc, ADN genómico, ADN y ARN sintético.

Preferiblemente, el polinucleótido es una variante de la SEC ID N0:1, en donde la variante comprende cambios de ácido nucleico de manera tal que codifica la proteína variante de OPG deseada de la invención. Los métodos para producir tales cambios de ácido nucleico se conocen en la técnica y también se describen en este documento. La presente invención también proporciona un vector el cual comprende un polinucleótido de conformidad con la invención. Preferiblemente, el vector es adecuado para la replicación y/o expresión de un polinucleótido. Los vectores pueden ser, por ejemplo, un plásmido, virus o vector de fago proporcionado dentro de un origen de replicación, y preferiblemente, un promotor para la expresión del polinucleótido y opcionalmente, un regulador del promotor. El vector puede contener uno o más marcadores seleccionables, por ejemplo, un gen de resistencia a la ampicilina en el caso de un plásmido bacteriano o un gen de resistencia a neomicina para un vector de expresión de mamífero. El vector puede ser usado in vi tro, por ejemplo, para la producción de ARN o usado para transfectar o transformar una célula hospedera. La presente invención también proporciona una célula hospedera la cual comprende un vector de conformidad con la invención, o contiene el gen que codifica una de las proteínas de la invención, bajo condiciones que permiten la expresión y producción de la proteína sujeto. Los ácidos nucleicos de la invención, pueden ser construidos usando técnicas de mutagénesis dirigida al sitio o evolucionarías, disponibles para el trabajador experto. El material de partida puede ser, por ejemplo, ADNc o ADN genómico que codifica la OPG de tipo silvestre. El ADNc se obtiene a partir de bibliotecas preparadas de ARNm aislado de varios tejidos que expresan osteoprotegerina. En humanos, las fuentes de tejido para osteoprotegerina incluyen, riñon, hígado, placenta y corazón. El ADN genómico que codifica la osteoprotegerina, se obtiene a partir de bibliotecas genómicas, las cuales son comercialmente disponibles de una variedad de especies. Alternativamente, los ácidos nucleicos de la invención pueden ser ácidos nucleicos sintéticos. El ADN sintético por ejemplo, se obtiene por síntesis química de fragmentos de oligonucleótido traslapantes, seguidos por montaje de los fragmentos para reconstituir parte o toda la región codificante y secuencias de flanqueo (véase Patente Estadounidense No. 4,695,623, que describen la síntesis química de genes interferón) . El ARN se obtiene más fácilmente por vectores de expresión procariótica o por constructos in vi tro, los cuales dirigen la sintesis de alto nivel de ARNm, tal como vectores que usan promotores T7 y polimerasa de 7?RN. Los vectores de expresión que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican a OVP, células hospederas transformadas con dichos vectores y métodos para la producción de OVP, también se proporcionan por la invenció. Una revisión de la expresión de proteínas recombinantes se encuentra en Methods of Enzymology Vol. 185 (Goeddel, D. V. ed.) Academic Press (1990). Las células hospederas par ala producción de OVP incluyen, células hospederas procarióticas tales como, células hospederas de E. coli , levadura, planta, fúngica, insecto y de mamífero. Las cepas de E. coli tales como HB101 ó JM101, son adecuadas para expresión. Las células hospederas de mamífero preferidas incluyen, células COS, CHOd-, 292, CV-1, 3T3, de riñon de hámster bebé (BHK) y otras. Las células hospederas de mamífero son preferidas cuando las modificaciones post-traduccionales, tales como piocesamíento de glic?silación y polipéptido, son importantes para la actividad OVP. La expresión de mamífero permite la producción de polipéptidos secretados, los cuales pueden ber recuperados a partir del medio de crecimiento. Los vectores para la expresión de OVP, preferiblemente contienen a un mínimo, secuencias requeridas para la propagación del vector y para la expresión del inserto clonado. Estas secuencias incluyen un origen de replicación, marcador de selección, promotor, sitio de enlace al ribosoma, secuencias mejoradoras, sitios de empalme de ARN y sitio de terminación de la transcripción. Vectores adecuados para la expresión en las células hospederas mencionadas anteriormente, son fácilmente disponibles y los ácidos nucleicos de la invención, son insertados en los vectores usando técnicas de ADN recombinante estándar. Los vectores para la expresión específica de tejidos de osteoprotegerina, también están incluidos. Tales vectores incluyen promotores los cuales funcionan específicamente en el hígado, riñon y otros órganos para la producción en ratones, y vectores virales para la expresión de osteoprotegerina en células humanas objetivo. Usando un sistema vector hospedero apropiado, se puede producir una OVP recombinantemente cultivando una célula hospedera transformada con un vector de expresión que contiene secuencias de ácido nucleico que codifican la OVP bajo condiciones de manera tal que el OVP se produce, y aislar el producto de expresión. La OVP puede ser producida en el sobrenadante de las células de mamífero transfectadas o en los cuerpos de inclusión de las células hospederas bacterianas transformadas. Las OVP así producidas, pueden ser purificadas por procedimientos conocidos por uno de habilidad en la técnica, como se describe posteriormente. La expresión de OVP en E. coli , se describe en el Ejemplo 2. Los plásmidos específicos y las células hospederas descritos en este Ejemplos, son par apropósitos ilustrativos solamente, sin embargo, y se apreciará que otros plásmidos disponibles y células hospederas, podrían también, ser usados para expresar las OVP de la invención.

Composiciones Farmacéuticas La presente invención proporciona una composición para inhibir o reducir el enlace de RANK o RANKL, la composición comprende una proteína variante de OPG de conformidad con la invención, y uno o más portadores aceptables. La presente invención también proporciona una composición para inhibir o reducir un efecto biológico mediado a través de la interacción de RANK o RANKL, la composición comprende una proteína variante de OPG de conformidad con la invención, y uno o más portadores aceptables. La presente invención también proporciona una composición para inhibir o reducir la estimulación de osteoclastos por RANKL, la composición comprende una proteína variante de OPG de conformidad con la invención, y uno o más portadores aceptables.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende, una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína variante de OPG de conformidad con la invención, y uno o más portadores, solubilizadores, estabilizadores y anti-oxidantes farmacéuticamente aceptables . El término "cantidad terapéuticamente efectiva", significa una cantidad la cual proporciona un efecto terapéutico por una condición especificada y la ruta de administración. La composición puede estar en una forma líquida o liofilizada y comprender un diluyente (Tris, acetato, o amortiguadores de fosfato) , que tienen varios valores de pH e intensidad iónica, solubilizadores tales como Tween o Polisorbato, portadores tales como albúmina de suero humano o gelatina, preservativos tales como trimerosal o alcohol bencílico, y antioxidantes tales como ácido ascórbico o etabisulfito de sodio. También está abarcada una composición que comprende una OVP modificada con polímeros solubles en agua para incrementar la solubilidad o estabilidad. Las composiciones pueden también comprender incorporación de OVP en liposomas, microemulsiones, micelos o vesículas para el suministro controlado sobre un periodo de tiempo prolongado. La selección de una composición particular, dependerá de un número de factores, que incluyen, la condición a ser tratada, la ruta de administración y los parámetros farmacocinéticos deseados. Una examinación más extensiva de los componentes adecuados para la composición farmacéutica se encuentra en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. A. R. Gennaro, ed. Mack, Easton, Pa. (1980) . Las composiciones de la invención pueden ser administradas por inyección, ya sea subcutánea, intravenosa o intramuscular, o por administración oral, nasal, pulmonar o rectal. La ruta de administración eventualmente elegida, dependerá de un número de factores y puede ser valorada por uno de habilidad en la técnica. La invención también se proporciona para composiciones farmacéuticas que comprenden, una cantidad terapéuticamente efectiva de los ácidos nucleicos de la invención, junto con un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Las composiciones de ácido nucleico, serán adecuadas para el suministro de una parte o todas las OVP a las células y tejidos, como parte de un régimen de terapia de gen . Por "terapia de gen" en este documento, significa la administración en una vez o repetida del ADN o ARNm terapéuticamente efectiva, u otro ácido nucleico. En una modalidad, los genes son introducidos en las células para lograr la síntesis in vi vo de un producto de gen terapéuticamente efectivo.

Métodos de Tratamiento La OPG se ha sometido a pruebas clínicas y pre-clínicas con potencial para aplicación en varias condiciones asociadas con la pérdida ósea y cambio óseo incrementado, que incluye, osteoporosis, artritis reumat?ide, enfermedad de Paget, enfermedad periodontal, enfermedad vascular y cánceres, que están localizados en o han metastatizado al hueso (para revisión, véase Lorenz et al . , J. Amer Med Assoc 292: 490-5(2004) y referencias en este documento) . También se sabe que antagonizar la señalización de RANK podría ser un tratamiento para trastornos autoinmunes, tales como lupus eritematosos sistémico, enfermedad del intestino inflamatorio, diabetes, esclerosis múltiple, artritis reumatoide y espondilitis anquilosante. Reportes recientes han indicado que la OPG puede también ser usadas en el tratamiento o prevención de enfermedades cardiovasculares, para prevenir o reducir la calcificación de los bazos y válvulas sanguíneas (Kaden et al . , J. Mol. Cardiol. 36: 17-19 (2004) y para intensificar el crecimiento de los bazos sanguíneos (Cross et al ; Int J Cáncer Nov 14, 2005 (epub) ) . Los polimorfismos en el gen OPG, han sido asociados con la incidencia de enfermedad Juvenil de Paget (Daroszewska et al . , J. Bone Miner. Res 19: 1506-11 (2004)) y con hombres Caucásicos con alto riesgo a desarrollar enfermedad de la arteria coronaria (Soufi et al . , J. Clin. Endocrinol Metab. 89: 3764-8 (2004) ) . Es claro por lo tanto, que las proteínas variantes de OPG de la presente invención, tendrán un intervalo de usos terapéuticos. Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para inhibir o reducir el enlace de RANK a RANKL, el método comprende exponer una molécula RANKL a una proteína variante de OPG de conformidad con la presente invención. La presente invención también proporciona un método para inhibir o reducir un efecto biológico mediado a través de la interacción de RANK y RANKL en una célula, el método comprende, exponer la célula a una proteína variante de OPG de conformidad con la presente invención. La presente invención también proporciona un método para inhibir o reducir un efecto biológico mediado a través de la interacción de RANK y RANKL en un sujeto, el método comprende, administrar a un sujeto, una proteína variante de OPG de conformidad con la invención. La presente invención también proporciona un método para tratamiento o prevención de una enfermedad inflamatoria mediada inmune o autoinmune en un sujeto, el método comprende administrar a un sujeto, una proteína variante de OPG de conformidad con la invención. La presente invención también proporciona un método para el tratamiento o prevención de enfermedad cardiovascular en un sujeto, el método comprende administrar a un sujeto, una proteína variante de OPG de conformidad con la invención. La presente invención también proporciona un método para inhibir o reducir la diferenciación, activación y/o supervivencia de osteoclastos por RANKL, el método comprende, exponer el tejido que contiene osteoclastos o precursores de osteoclastos a una proteína variante de OPG de conformidad con la invención. La presente invención también proporciona un método para inhibir o reducir la diferenciación, activación y/o supervivencia de osteoclastos por RANKL en un sujeto, el método comprende, administrar a un sujeto, una proteína variante de OPG de conformidad con la invención. Por "sujeto", en este documento, significa tanto humanos como otros animales, particularmente mamíferos como se resume en este documento, con humanos siendo preferido. La presente invención también proporciona un método para prevenir o tratar un trastorno óseo que comprende, administrar a un paciente la composición farmacéutica de la presente invención. Los términos "tratar" y "tratamiento", en este documento, significan incluir tratamiento terapéutico, así como también profiláctico, o medidas supresivas para la enfermedad o trastorno. De este modo, por ejemplo, la administración exitosa de una proteína variante de OPG antes del comienzo de la enfermedad, puede resultar en el tratamiento de la enfermedad. Como otro ejemplo, la administración exitosa de una proteína variante de OPG después de la manifestación clínica de la enfermedad para combatir los síntomas de la enfermedad comprende, "tratamiento" de la enfermedad. "Tratamiento", también abarca la administración de una proteína variante de OPG después de la aparición de la enfermedad para erradicar la enfermedad. La administración exitosa de un agente después del comienzo y después que se han desarrollado los síntomas clínicos, con posible abatimiento de los síntomas clínicos y quizás alivio de la enfermedad, además comprende "tratamiento" de la enfermedad. Las condiciones las cuales pueden ser tratables con OVP de la presente invención incluyen las siguientes: • Osteoporosis, tal como osteoporosis primaria, osteoporosis endocrina (hipertiroidismo, hiperparatiroidismo, síndrome Cushing y acromegalia) , formas hereditarias y congénitas de osteoporosis (osteogénesis imperfecta, homocistinuria, síndrome Menkes y síndrome de Riley-Day) , y osteoporosis debido a la inmovilización de extremidades. • Enfermedad ósea de Paget (osteítis deformans) en adultos y jóvenes) . • Osteomielitis, o una lesión infecciosa en hueso, que conduce a pérdida ósea. • Hipercalcemia que resulta de tumores sólidos (cáncer, pulmón y riñon) y malignidades hematológicas (mieloma múltiple, linfoma y leucemia) ; hipercalcemia idiopática e hipercalcemia asociada con hipertiroidismo y trastornos de la función renal. • Osteopenia después de la cirugía, inducida por administración de esteroides, y con trastornos asociados del intestino delgado y grueso y con enfermedad renal y hepática crónica. • Osteonecrosis, o muerte de células óseas, asociadas con lesión traumática o necrosis no traumática asociada con la enfermedad Gauchers, anemia de células falciformes, lupus eritematosis sistémico y otras condiciones . • Pérdida ósea debido a artritis reumatoide, espondilitis anquilosante y otros trastornos inflamatorios mediados inmunes . • Calcificación del sistema vascular. • Pérdida ósea periodontal. • Cánceres que afectan el hueso que incluyen, mieloma múltiple, cáncer primario del hueso y metástasis osteolítica tal como de cáncer de próstata y mama metastatizado. • Enfermedad cardiovascular. • Enfermedad de la arteria coronaria. • Trastornos autoinmunes tales como, lupus eritematoso sistémico, enfermedad del intestino inflamatorio, diabetes, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, y espondilitis anquilosante. Se apreciará que una OVP de la invención, puede ser usada sola o en conjunto con otros agentes terapéuticos. Por ejemplo, una OVP de la presente invención, puede ser usada en conjunto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo activador TRAIL o un anticuerpo anti-TNF. En una modalidad preferida, la proteína variante de OPG de la presente invención, se usa para tratar un trastorno óseo que está asociado con cambios o pérdidas óseas excesivas. El trastorno óseo puede incluir, pero no se limita a, osteoporosis, enfermedad de Paget del hueso, hipercalcemia, hiperparatiroidismo, osteopenia inducida por esteroides, artritis reumatoide, osteomielitis, mieloma múltiple, cáncer de huelo, calcificación vascular, metástasis osetolitica y pérdida ósea periodontal. Se entiende que la OVP de la invención, puede ser usada sola o en conjunto con otros factores para el tratamiento de trastornos óseos. En una modalidad, la OVP se usa en conjunto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un factor el cual estimula la formación ósea. Tales factores incluyen pero no se limitan a, factores morfogénicos óseos designados MBP-1 hasta BMP-12, factor-ß de crecimiento de transformación, (TGF-ß) y los elementos de la familia TGF-ß, inhibidores de interleucina-1, inhibidores de TNFa, hormona paratiroides y análogos de los mismos, proteína relacionada con la paratiroides y análogos de los mismos, Vitamina E, series de prostaglandinas, bifosfonatos (tales como alendronato y otros) , y minerales que mejoran el hueso tales como fluoruro y calcio. La invención será ahora descrita en más detalle con referencia a los siguientes Ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1: Clonación del gen de OPG humana El gen para OPG se aisló a partir de una biblioteca de ADNc de riñon fetal humano (Spring Bioscience, Fremont, CA) . Se diseñaron lo cebadores a los extremos 5' y 3' de la secuencia de OPG, y se usó RCP estándar para amplificar el gen. Los cebadores usados para aislar el gen de OPG fueron: Delantero: 5' TATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGAACAAGTTGCTGTGCTGCG CGCTCG 3' (SEC ID NO:48). Inverso : 5' CATCTTTATAATCTGCGGCCGCTAAGCAGCTTATTTTTACTGATTG GACC 3' (SEC ID NO: 49) . Sobresalen en los cebadores sitios de restricción incorporados que permiten clonación en vectores adecuados para propagación en E. coli , tal como pGC (pGC (Coia et al , (1996), J Immunol. Meth 192:13-23), con clonación exitosa confirmada por secuenciamiento de ADN. Además de los 1203 nucleótidos que codifican la proteína OPG 401aa de longitud completa, se amplificó la secuencia de OPG que excluye su señal peptídica (aa 1-21) . También se amplificó la mitad N-terminal de la proteína a aa 194, que comprende los 4 dominios ricos en cisteína, y sin su señal peptídica. Una representación esquemática de la estructura del gen de OPG se muestra en la Figura 1A. El fragmento 22-194 de OPG, el cual abarca la parte de la proteína responsable para enlazarse a RANKL y TRAIL (Simonet et al , (1997), Yamaguchi et al , (1998) como se referencia anteriormente) , se expresó en 2L de 2 x YT/100 µg/ml de ampicilina con inducción de IPTG del vector pGC. Esto produce la proteína con una fusión de extremo de péptido FLAG doble C-terminal, para detección y purificación de afinidad de extractos periplásmicos de E. coli . La inducción se llevó a cabo 3-4 horas a 20-22°C. El material purificado de afinidad, es además purificado en pico por cromatografía en filtración de gel en una columna Superdex 200. Se colectaron los picos que corresponden en tamaño a un monómero OPG. También se purificó un pico más pequeño que corresponde en tamaño a un dímero de OPG. Los picos purificados podrían ser detectados por manchado Western usando un anticuerpo anti-FLAG que migra a aproximadamente el tamaño esperado. La proteína monomérica purificada se detectó por anticuerpos específicos suministrados con un kit de detección de OPG (sistemas R&D, Minneápolis, MN) . La identidad de esta proteína se confirmó por secuenciamiento de aminoácido N-terminal de sus primeros 19 residuos que se correlacionan con la secuencia publicada.

Ejemplo 2: Generación de Proteínas Variantes de OPG (OVP) Para crear una biblioteca de variantes de OPG, la secuencia de ADN de OPG (22-194), se clonó en la mutagénesis pEGX y el vector de exhibición (Figura IB) , con confirmación por secuenciamiento de ADN. El plásmido que contiene OPG (~0.5-1.0 µg) , se linearizó por digestión Smal y se usaron 100-200 g de este directamente como plantilla para transcripción de polimerasa de ARN T7 a 37°C por 16-24 horas. El éxito de la transcripción se verificó por electrofóresis en gel de agarosa cargando 1 µl de los 20 µl de la reacción. En donde es posible, todas las manipulaciones que involucran ARN, que incluyen exhibición de ribosoma, usan amortiguadores tratados con DEPC, reactivos y tubos para minimizar la degradación de ARN. El transcripto de ARN es usado directamente como plantilla para una reacción de replicación por Qßreplicasa a 37°C por 16-24 horas: Volumen (µl) Transcripto de ARN T7 0.5 rNTP 25 mM 1 amortiguador de polimerasa 5 x 17 4 DTT 100 mM 2 MgS04 0-1.6 Qßreplicasa 1 H20 10.5-8.9 El éxito de la replicación se valoró por electrofóresis en gel de agarosa cargando 1 µl de la reacción. Este proceso genera una biblioteca de ARN de doble hebra que codifica variantes de OPG. Las condiciones de mutación se ajustaron para obtener 1-3 mutaciones aleatorias por copia de gen. En esta etapa, 1 µg de la biblioteca de ARN de OPG, preparada por exhibición, es equivalente a aproximadamente 7 x 1011 moléculas. La concentración de la muestra es entonces estimada espectrofotométricamente . La biblioteca de ARN de OPG, entonces se usó para exhibición de ribosoma. La biblioteca fue primero traducida por 30 minutos a 30 °C usando un sistema de traducción de lisado de reticulocito de conejo (Promega) : Volumen (µl) Lisado de reticulocito 33 Mezcla de aminoácido menos Leu 0.5 Mezcla de aminoácido menos Met 0.5 MgCl2 25 mM 0.5 RNasin 0.5 KCl 1.5 ARN de OPG 1-2 µg H20 a 50 µl La ausencia de un codón de detención al final del dominio espaciador CL, evita el ribosoma al final de la traducción conduciendo a un complejo de ARN/ribosoma/proteína. Una terminación de traducción de estos complejos se estabilizó manteniendo la adición en frío (en hielo) de acetato de magnesio (MgOAc) . La traducción se diluyó a 300 µl con adición de 60 µl de PBS/MgOAc 50 mM/leche desnatada al 10% (libre de biotina) enfriada en hielo y 190 µl de PBS/MgOAc 50 mM/Tween al 0.05%/2.5 mg/ml de heparina. La mezcla se dividió entonces en alícuotas 3 x 100 µl .

Ejemplo 3: OVP de Panorámica Los complejos generados en el Ejemplo 2 fueron paneados contra RANKL (Roche) y TRAIL (Peprotech) en solución. Las versiones biotiniladas de RANKL y TRAIL, se prepararon usando biotina Sulfo-NHS-LC (Pierce) para permitir la captura de complejos seleccionados en solución usando perillas magnéticas revestidas con estreptavidina (Dynal) . Se llevó a cabo una reacción de paneo en cada una de las tres alícuotas de mezcla de traducción. Se emplearon dos estrategias diferentes para crear una presión de selección que favorece el aislamiento de secuencias OVP que tienen cambios de aminoácido en los residuos que reducen la afinidad de enlace a TRAIL, mientras retiene la afinidad de enlace a RANKL. Una estrategia usada es primero panear contra el RANKL soluble, y después, los aglutinantes TRAIL son desafiados con un exceso de proteína TRAIL libre. En una alícuota de traducción, se agregó biotinil-RANKL a una concentración que es aproximadamente equimolar a la cantidad de ARN de entrada. Esta mezcla entonces se rotó por 40-60 minutos a 4°C. Perlillas magnéticas revestidas con estreptavidina (Dynal) , se lavaron y resuspendieron en PBS/MgOAc 50 mM/Tween al 0.05%. Después del paneo RANKL, se agregaron 10 µl de estas perlillas a la mezcla por 10 minutos a 4°C. Las perlillas que se capturaron con biotinil-RANKL en complejo con OPG que exhiben ribosoma, son entonces lavadas usando un magneto, dos veces con PBS/MgOAc 50 mM/Tween al 0.05%, dos veces con PBS/MgOAc 50 mM, después se suspendieron nuevamente en 100 µl de este amortiguador. Se agregó un exceso de TRAIL soluble a esta mezcla a 2 o más veces la concentración molar del RANKL agregado para competir los aglutinantes TRAIL y estos se rotaron a 4°C por 30 minutos. Cualquier complejo que eluye de las perlillas durante este procedimiento entonces se lavó siempre como anteriormente y las perlillas con complejos de enlace RANKL unido, se resuspendieron en 20 µl de H20. Esta estrategia de paneo se denotó como "RANKL-1ro" La otra estrategia se usó para panear primero contra el TRAIL soluble para remover los aglutinantes TRAIL más fuertes, y después se paneó la mezcla contra RANKL para aislar los aglutinantes RANKL restantes. A una segunda alícuota de traducción, se agregó biotinil-TRAIL a aproximadamente 1/2 hasta 1/4 de la cantidad molar de ARN de entrada. Esta mezcla se rotó por 40-60 minutos a 4°C, después 10 µl de perlillas de estreptavidina se agregaron por 10 minutos. Las perlillas que capturan biotinil-TRAIL en el complejo con OVP que exhibe ribosoma, se removieron usando un magneto, con ello, se lleva la mezcla de los mejores aglutinantes TRAIL. El biotinil-RANKL se agregó entonces a la mezcla a aproximadamente 1/2 de la cantidad molar de entrada de ARN y esta se rotó a 4°C por 30-40 minutos para selección de variantes de OPG que retienen la afinidad de enlace RANKL. Las perlillas entonces se lavaron como anteriormente y se resuspendieron en H20. Esta estrategia de paneo se denotó "TRAIL-lro-" . Se llevó a cabo un paneo de control en una tercera alícuota de traducción como se realiza para el paneo RANKL-lro pero se usó biotinil-IGF-1 (Gropep) en lugar de biotinil-RANKL. También se realizó una variación de las estrategias de selección RANKL-lro y TRAIL-l1"0 descritas anteriormente, en donde los antígenos usados se acoplaron a perlillas magnéticas epoxi (Dynal) , en lugar de usar los antígenos en forma biotinilada soluble.

Ejemplo 4: Clonación de OVP seleccionado El ARN seleccionado con los complejos, se convirtió a ADNc usando TI-RCP por métodos estándares usando 5 µl de la suspensión de perlillas como plantilla. Los productos de TI-RCP se aislaron por electrofóresis de agarosa. Como también bandas para los paneos TRAIL-lro y RANKL-l170, se puede observar una banda débil generada a partir del paneo IGF-1, sugiriendo que existe alguna selección no específica inherente dentro de este procedimiento de selección. La combinación de ADNc seleccionado entonces se purificó a partir del gel y se digirió la restricción y ligó en el vector de expresión pGC, de manera que la selección para las propiedades de enlace deseadas, podrían proceder. Las ligaciones fueron electroporadas en una cepa de E. coli apropiada, para producir colonias transformantes.

Ejemplo 5: Selección de clones de OVP Se seleccionaron aproximadamente 100 clones de cada experimento de selección y exhibición. Los clones que llevan los genes para OVP se hicieron crecer como cultivos iniciadores en 200 µl de 2 x YT suplementado con ampicilina y glucosa en cavidades de placas microtituladoras y se incubaron durante la noche a 37°C. Estos cultivos se usaron como inóculos para los cultivos de expresión en 200 µl de 2 x YT suplementado con ampicilina. Cuando las densidades ópticas a 600 nm de los cultivos alcanzaron aproximadamente 1.0, la expresión de variantes de PCG se induce con la adición de IPTG A 0.5-1 mM e incubación por 16 horas a 20-22°C. Los sobrenandantes de cultivo entonces se cosecharon por enlace de ELISA a RANKL y TRAIL revestidos durante la noche en las superficies de las cavidades de las placas microtituladoras. Las superficies son bloqueadas con caseína al 0.5% por 2 horas. Los sobrenadantes se filtraron usando placas microti tuladoras ajustadas con membranas de valor límite de peso molecular 100 kD (MWCO) , para remover las especies de peso molecular elevado y agregados, los cuales ayudan a reducir la señal antecedente en el ELISA. Estos sobrenadantes filtrados son aplicados a cavidades bloqueadas y revestidas con antígenos. La detección de OVP unido se logra usando anticuerpo anti-FLAG de ratón, después, conjugado de peroxidasa anti-ratón de cabra (BioRad) . La TMB (KPL) se usó como sustrato de peroxidasa con la señal de enlace medida por lectura de absorbancia a 450 nm. Los lavados entre las etapas se hicieron 3 veces con PBS/Tween al 0.05%, después 3 veces con PBS y las diluciones se hicieron en caseína al 0.25%. Esta primera selección cruda se valoró, con la mayoría de clones prometedores (basados en la señal de enlace RANKL siendo retenida en o cercana al nivel de OPG tipo silvestre y la señal de enlace TRAIL siendo sustancialmente reducida) , seleccionados para una selección secundaria. La selección secundaria involucra expresar colones seleccionados en cultivos de 10 ml con un periodo de inducción de 3 horas a 20-22°C. Los extractos periplásmicos de estas células, son cultivados, filtrados como anteriormente y después probados a un intervalo de diluciones (en general, desde 1:2 a 1:32) por ELISA como anteriormente. Las mejores de estas proteínas son elegidas para expresión y purificación a gran escala (0.5-2 1) como se describe anteriormente, para la OPG de tipo nativa. Las proteínas purificadas son cuantificadas por determinación de coeficientes de extinción debido a los residuos Trp y Tyr a A28onm. Las OVP fueron entonces probadas a concentraciones equivalentes en comparación con la proteína de tipo nativa OPG por ELISA como se describe anteriormente. Las proteínas se probaron para enlazarse en una serie de dilución doble en general, a partir de una concentración de 0.5 µM hasta 0.031 µM. La mayoría de las proteínas las cuales están en formato de monómero, muestran retención de enlace RANKL a o cercano a aquel de la OPG de tipo nativa, y reducción sustancial en la señal de enlace TRAIL. Un ejemplo de resultados a partir de tal ELISA, se muestra en la Figura 2. Las variantes con el perfil requerido de propiedades de enlace, se producen de todas las estrategias de selección.

Ejemplo 6: Procesos de exhibición y selección de ribosoma repetidos Se emprendieron subsecuentes rondas de exhibición y selección de ribosoma para mejorar además, algunas de las OVP mejores candidatas. Para lograr esto, genes para estas OVP fueron clonados en el vector pEGX y mutagénesis y exhibición, llevados a cabo como se describe anteriormente, con las cantidades molares de los antígenos solubles usados en la selección alterad para forzar la presión de selección hacia reducción adicional de enlace de TRAIL y mantenimiento del enlace RANKL. La selección para las mejores variantes se emprendió como se describe anteriormente, con mutantes adicionales aislados con mejoramientos aparentes en las propiedades deseadas. Las secuencias de las mejores OVP seleccionadas de exhibición de ribosoma de todas las rondas de selección, se muestran en la Figura 3. Las mutaciones en aa 115 dentro del bucle Cysl07-Cysll8, se observaron en muchas de las variantes seleccionadas, como fueron varias mutaciones en los aminoácidos cercanos en el área que abarca aas 102-130. Esto sugiere que esta región, y aa 115 en particular, son importantes para enlace TRAIL y que algunos cambios se pueden tolerar en este documento, sin pérdida de enlace RANKL.

Ejemplo 7: Mutagénesis dirigida al sitio Las ubicaciones de mutaciones indicadas por selección de exhibición de ribosoma, mostradas por ser benéficas para alterar la especificidad de OPG, se investigaron además empleando mutagénesis dirigida al sitio en estas posiciones. Los cambios de aminoácido adicionales son muestreados en los residuos 115, 122 y 138, y la mutación L40S se combinó con algunas de las combinaciones en estas posiciones. Se diseñaron cebadores delanteros e inversos que codifican el residuo mutante particular, permitiendo la amplificación de RCP de fragmentos frontales y posteriores del gen OVP mutante con regiones sobresalientes complementarias. La RCP fue usada para unir los dos segmentos de ADN en conjunto, cebando cada uno por unos 10 ciclos iniciales sin cebadores, y después, 30 ciclos con cebadores de flanqueo 5' y 3' para amplificación del gen mutante completo con sitios de restricción para clonación. Se empleó un sistema de expresión de mamífero para permitir la producción de niveles superiores de la forma dimérica estable más biológicamente relevante de las proteínas para ensayos a base de célula y ELISA adicionales. Los mutantes dirigidos al sitio y los mejores genes de OVP (1-194) candidatos seleccionados que exhiben ribosoma (residuos 1-21 constituyen el péptido señal), se clonaron en el vector de expresión de mamífero pAPEX-3.Fc. Esto permite la expresión de OVP contra fusiones con un dominio Fe humano para formar dímeros estables. Un extremo FLAG C-terminal también se agrega. Se usaron células EBNA de HEK 293 para expresión. Estas células adherentes se pasaron en medio DMEM suplementado con Glutamax 2 mM (Invitrogen), suero de ternera de bovino al 10%, y 200 µg/ml de geneticina y se incubó a 37 °C en C02 al 5%. Para transfección temporal usando lipofectamina (Invitrogen) , se cosecharon células casi confluentes y se usaron 5 x 106 células para sembrar un disco de cultivo de tejido de 10 cm a un volumen de 10 ml . Las células se dejaron adherir y crecer por 24 horas. Se mezclaron 24 mg de ADN de plásmido pAPEX-3.Fc que alberga la OVP de interés, con 1.5 ml de DMEM. Se diluyeron 60ul de lip?fectamina en 1.5 ml de DMEM y se incubó por 5 minutos a temperatura ambiente. El ADN diluido y la lipofectamina, son mezclados, incubados por 20 minutos a temperatura ambiente, y después agregados por goteo al disco de cultivo. Después del crecimiento durante la noche, las células totales de un disco se cosecharon y usaron para sembrar un disco T175 en 25-30 ml . Una vez que las células han alcanzado casi confluencia (1-2 días), se reemplazaron DMEM que contiene suero con 25-30 ml de medio libre de suero 293T Ex-cell (JRH Biosciences) suplementado con Glutamax 4 mM. Después de 3-4 días, el medio es colectado, centrifugado y filtrado a través de un filtro de jeringa de 0.22 µm. Para purificación de proteínas secretadas en el medio, se aplicó sobrenadante a 1 ml de resina de proteína A (Sigma) equilibrada con PBS. Las proteínas unidas a la proteína A vía su porción Fe, son eluidas con 0.1M de Gly, pH 3 y esta se monitoreó a A28onm- El eluado es neutralizado por diálisis inmediata contra PBS. La proteína dializada es concentrada a 0.5 ml y sometida a cromatografía de filtración en gel, usando una columna Superdex 200. El pico dominante que corresponde al dímero OVP-Fc, es colectado y confirmada la identidad por manchado Western, usando anticuerpo anti-FLAG y secuenciamiento N-terminal el cual revela OPG con péptido señal que ha sido procesado. La cromatografía de intercambio iónico de OVP purificado por filtración en gel, eluye un pico de proteína, sugiriendo homogeneidad.

Ejemplo 8: Selección de mutantes de OVP dirigidos al sitio Las proteínas de OVP que expresan mamífero purificado, son probadas para enlazarse a RANKL y TRAIL por ELISA. Las cavidades son revestidas con RANKL a 5 µg/ml o TRAIL a 10 µg/ml en PBS O/N a 4°C, enjuagadas con PBS, bloqueadas con caseína al 0.5% en PBS a temperatura ambiente por 2 horas, después enjuagadas nuevamente con PBS. Las concentraciones de OVP a ser probadas, son normalizadas a aproximadamente 10 nM y después, se aplican 50 µl a las cavidades revestidas con antígeno en diluciones dobles seriales sobre 6-7 cavidades por 1 hora. Todas las diluciones se hicieron en caseína al 0.25%. Todos los lavados entre incubaciones de enlace son 3 veces en PBS/Tween al 0.05%, después, 3 veces con PBS. La detección de OVP unida se logra con incubación de 50 µl de anti-FLAG a 1.2 mg/ml por 20 minutos, después, 50 µl de conjugado de peroxidasa anti-ratón de cabra (BioRad) a 1:1500 por 20 minutos. Se usó TMB como sustrato de enzima y después se midió la señal de enlace a A450nm. Todas las OVP ó OPG de tipo silvestre, son probadas en el formato ligado a Fe C-terminal. Un ejemplo de resultados a partir de tal ELISA que compara el enlace de varias OVP a la OPG (22-194) de tipo silvestre, se muestra en las Figuras 4A y 4B. Los datos muestran que la OPG (22-194) de tipo silvestre, se enlaza a tanto RANKL y TRAIL y que la mayoría de OVP mantienen RANKL que se enlaza en o cerca del nivel de la proteína de tipo silvestre. Todas las OVP probadas en este documento, mostraron al menos alguna reducción de enlace a TRAIL comparada con el tipo silvestre, con la exhibición de ribosoma seleccionada 1R17 (I115M) , y los mutantes dirigidos al sitio en la posición 115-115D, 115G y 115R, mostraron niveles muy bajos de enlace TRAIL. Para permitir las comparaciones aproximadas de enlace relativo de OVP en ELISA, los valores EC50 de los datos, son resumidos en la Tabla 1. Los valores EC5o fueron estimados trazando respuestas de enlace contra dosis de OVP en una escala logarítmica, con extrapolaciones elaboradas cuando los datos no alcanzan el intervalo EC50. Algunas OVP mostraron ligero incremento en enlace a RANKL, mientras en algunos RANKL, el enlace se redujo por hasta 3 veces.

Ejemplo 9: Pruebas biológicas de OVP en un ensayo de apoptosis inducida por TRAIL de células HCT116 La reducción de la actividad de enlace de TRAIL de OVP observada en ELISA, es además probada en un ensayo de apoptosis inducida por TRAIL, de células HCT116 en la presencia de estas OVP. Estas células son cultivadas en DMEM que contiene suero de bovino fetal al 10% (FCS) y penicilina-estreptomicina al 1% a 37°C en C02 al 5%. Las células HCT116 son colocadas en placas de 12 cavidades a 7.5 x 104 células/cavidad en 1 ml de DMEM + FCS y se dejan unir y crecer por 24 horas. El medio de crecimiento es entonces removido y reemplazado con 500 µl de medio fresco por 1 hora a 37°C. Las OVP u OPG. Fe humana recombinante (sistemas R&D), son agregadas a 0.56, 1.69, 5.6 y 11.2 nM y las células son incubadas unos 15 minutos adicionales a 37 °C antes de la adición de TRAIL humano recombinante (sistemas R&D), a 10 ng/ml (0.53 nM) . Las células son entonces incubadas por 16 horas a 37°C, antes de ser cosechadas para registrar el porcentaje de células apoptóticas en cada cavidad. La dosis máxima de OVP entonces se probó en la ausencia de TRAIL para determinar la toxicidad en las células. Todas las células (unidas y flotantes) , son cosechadas y resuspendidas en 20 µl de 1 mg/ml de yoduro de propidio (Pl), Tritón X-100 al 0.1%, acetato de sodio al 0.1% en PBS. La apoptosis es registrada valorando la morfología nuclear por microscopio de fluorescencia siguiendo el teñido Pl con una célula registrada como apoptótica si exhibe uno o más de los siguientes: marginación nuclear, condensación de cromatina, o formación de cuerpos apoptóticos. Para evitar desvío, las muestras son registradas sin conocer el tratamiento dado a la muestra. Ejemplos de tales ensayos se muestran en las Figuras 5A y 5B. El efecto de las proteínas de OPG de tipo silvestre, se muestra en la Figura 5A en donde la proporción de celdas que exhiben apoptosis inducida por TRAIL, se reduce más de aproximadamente 70% hasta por debajo de 10% a una dosis de OPG de 5.6 nM. La OPG (22-194). Fe parece ser similarmente efectiva a la molécula OPG. Fe de longitud completa (sistemas R&D), mientras una versión Fe ligada N-terminalmente de la proteina de tipo silvestre, es un poco menos efectiva. Todas las OVP mostradas en la Figura 5B, tienen poca o ninguna capacidad para inhibir la ap?pt?sis inducida por TRAIL. Aún una dosis superior cuatro veces que la mostrada en este documento, parece ser insignificante bloqueando la actividad TRAIL con estas OVP seleccionadas.

Ejemplo 10: Pruebas biológicas de OVP en un ensayo de diferenciación mediada por RANKL de células RAW264.7 La línea de células de monocito de tumor inducido por el virus de leucemia murino RAW264.7, diferencia en osteoclastos bajo estimulación RANKL. Para probar además la capacidad de OVP para enlazarse a RANKL y bloquear sus efectos biológicos mediados a través del enlace a RANKL, se valoró la diferenciación mediada por RANKL de células RAW264.7 en la presencia de OVP. Las células RAW264.7 se cultivaron en medio DMEM que contiene FCS al 5% y penicilina-estreptomicina al 1% a 37°C en COS al 5%. Las células RAW264.7 (3xl0 células/cavidad), se sembraron en placas de 96 cavidades, en 100 µl de DMEM y FCS al 5%, y se dejaron crecer por 24 horas. Se agregó un adicional de 100 µl de medio que contiene 15 ng/ml (0.75 mM) de RANKL humano (Roche) y OVP de 0 a 0.5 mN a cada cavidad, y las células se incubaron unos 3 días adicionales. La formación de osteoclasto es evaluada midiendo la actividad de fosfatasa de ácido resistente a tartrato (TRAP) . Las células son fijadas, secadas y se agregan 100 µl de amortiguador de citrato 50 mM a pH 4.6, 10 mM de tartrato, 1 mg/ml de p-nitrofenilfosfato, para medir la actividad TRAP. Después de la incubación por 30 minutos, las reacciones se detienen y se mide la absorbancia a 405 nm. Tal ensayo se muestra en la Figura 6A. A una dosis de 0.4 mM, todas las OVP mostradas, son capaces de bloquear totalmente la diferenciación osteoclástica de células RAW264.7 inducidas por 0.75 nM de RANKL. La Figura 6B muestra también, tal ensayo que involucra la OVP generada por mutagénesis dirigida al sitio a aall5. Sobre este intervalo estrecho de baja dosis, se puede ver una discriminación de actividades de enlace a RANKL debido a que estas proteínas todas muestran pérdida sustancial de la capacidad para inhibir la apoptosis inducida por TRAIL (Figura 5B) . Se debe notar que algunas variantes mostraron actividad en este ensayo equivalente a o mejor que aquella de OPG. Por otro lado, algunas variantes que mostraron una reducción relativamente modesta en el enlace a RANKL (Tabla 1) , mostraron capacidad significantemente reducida para bloquear la activación de osteoclastos mediada por RANKL.

Ejemplo 11: Pruebas biológicas de OVP en un ensayo de resorción de osteoclasto de tumor de células gigantes Se usó también un ensayo de resorción de osteoclasto de tumor de células gigantes como un medio para medir el efecto biológico de OVP que se enlace a RANKL. Este es un ensayo (Atkins et al , Bone 28:370-37 (2001) ) para osteoclastogénesis mediada por RANKL, midiendo el nivel de formación de hueco de resorción en empalmes de dentina. El ensayo puede ser usado para mostrar la inhibición mediada por OPG de este efecto. Tanto el número de huecos de resorción como área de resorción, pueden ser cuantificados . Un ejemplo de estas OVP de varias pruebas de ensayo, se muestra en la Figura 7. Todos los constructos mostraron inhibición con la OPG de tipo nativa a aproximadamente 55% de inhibición y la mejor OVP, R23 (I115M, L40S), mostró 75% de inhibición.

Ejemplo 12: Conclusiones a partir de pruebas biológicas de OVP Las secuencias de OVP seleccionadas aisladas por selección de exhibición y ribosoma, se muestran en la Figura 8. Los resultados de estudios de enlace conducidos en estas OVP y OVP adicionales generadas por mutagénesis dirigida al sitio, se muestran en la Tabla 1. Es claro a partir de los datos mostrados en la Tabla 1, que las sustituciones en la posición de residuos 115, tienen un impacto principal en la capacidad de OVP para enlazarse a TRAIL. En particular, la sustitución de residuos tales como Met, Gly, Asn, Asp y Glu en esta posición, conduce a una reducción sustancial en el enlace a TRAIL sin afectar significantemente el enlace a RANKL. Además, ninguno de las OVP generadas con estas sustituciones, mostró alguna actividad en un ensayo para apoptosis inducida por TRAIL de células tumorales. Las mutaciones en el residuo 122 también tienen un impacto en la capacidad de OVP para enlazarse a TRAIL. Por ejemplo, mutantes dobles 1I115M, R122N y I115M, R122E mostró afinidad de enlace sustancialmente reducida para TRAIL. Las mutaciones en el residuo 128 también tienen un impacto en la capacidad de OVP para enlazarse a TRAIL. Por ejemplo, mutantes dobles 1I115M, F128L y I115M, F128I mostraron afinidad de enlace sustancialmente reducida para TRAIL. El mutante doble I115M, L40S, resultó en una inhibición de 75% de osteoclastogénesis mediada por RANKL, la cual resalta la importancia de mutaciones en el residuo 40. Se proporciona un sumario de la actividad biológica de OVP seleccionada en un ensayo a base de célula, en la Tabla 2.

Ejemplo 13: Modelación de Estructura Tri-dimensional de OPG/OVP La OPG es clasificada como un elemento de la superfamilia de proteínas del receptor TNF. Los elementos más notablemente caracterizan repeticiones múltiples de aproximadamente 40 aminoácidos, dominios ricos en cisteína, que están involucrados en el enlace al ligando. Los ligandos conocidos incluyen las proteínas TRAIL y RANKL estructuralmente homologas. No se han publicado estructuras tri-dimensionales para OPG solo o en combinación con cualquiera de sus ligandos RANKL o TRAIL. Un modelo estructura fue por lo tanto, establecido de los dos dominios ricos en cisteína en el fragmento amino terminal de OPG, en un intento por examinar el efecto probable de mutaciones contenidas en OVP preferido. De una búsqueda BLAST de la base de datos de la estructura de proteína Brookhaven (PDB) , se seleccionaron tres homólogos cercanos de las proteínas relacionadas con el receptor del TNF, para el cual, han sido determinadas tres estructuras tridimensionales, es decir, polipéptidos en archivos pdp 1SG1 (Complejo de Ligando-Receptor entre el Factor de Crecimiento del Nervio y el Receptor de Neurotrofina Común p75) , y estructuras del Receptor de Muerte 5 a partir de los archivos 1D4V y IDU3. Además, se agregó una estructura del archivo 1D0G. El elemento de la superfamilia del receptor de TNF DR5 (una proteína del receptor TRAIL) , es representado en esta estructura de complejos a un trímero de TRAIL que se explotó para el diseño de modelos para el complejo de ligando de OPG. La modelación se realizó usando el Modelador de módulo dentro del paquete de software InsightlI (Molecular Simulations Inc.). La estructura de la cadena 1SG1 X además se dividió en un dominio N-terminal y C-terminal y los dos dominios fueron separadamente alineados con las plantillas restantes, como ambos dominios han mostrado homología a OPG. Comparados con otras tres plantillas, parecen ser una región articulada en la proteína que permite al dominio C-terminal ser desplazado. Se generaron cincuenta modelos para el fragmento de OPG de tipo silvestre como el punto de partida para experimentos de selección, así como también para un número de las secuencias de OVP seleccionadas. Los modelos se valoraron de conformidad con registros del Modelador, y los 10 modelos valorados superiores, se alinearon a DR5 en la estructura 1D0G. Las regiones de contacto del receptor del componente TRAIL de esta estructura, fue en cambio, usada para modelar una estructura de contacto posible de receptores en RANKL, usando la estructura determinada de RANKL de ratón (pdb de archivo 1JTZ) . Este proceso permite una comparación de la OPG modelada cuando se enlazan las estructuras TRAIL y RANKL. Los modelos resultantes del complejo de OPG, en su estructura modelada, con TRAIL o RANKL respectivamente, fueron examinados por choques estéricos e interacciones de enlace potencial. Los modelos de la pr?teína de OPG sugieren que el enlace de tanto RANKL como TRAIL, podrían ocurrir con la interfaz extensiva encontrada en las interacciones de ligando receptor de TNF similares (Hymowitz et al, Mol. Cell 4:563-571 (1999); He et al , Science 304: 870-875 (2004) . Como se predice de la modelación, dos dominios similares al receptor de TNF de OPG, parecen estar involucrados en el enlace de tanto RANKL como TRAIL (véase Figuras 9 a 12), el dominio N-terminal que tiene contactos dentro de la región de los residuos 42 a 92 y el dominio C-terminal dentro de la región de residuos 107 a 154. Se detectaron dos subregiones las cuales parecen particularmente significantes - 107-118 y 120-142. El dominio N-terminal que contacta con OPG parece similar entre RANKL y TRAIL, por lo tanto, mutaciones en esta región, podrían probablemente, resultar en efectos en ambas interacciones de enlace. Esto es consistente con los resultados de los experimentos de selección reportados en este documento, como esta región no es una en donde se encuentra la mutación frecuente en OVP seleccionada para enlace reducido a TRAIL pero no a RANKL. Parece haber una articulación alrededor del enlace disulfuro entre los residuos 124 a 142, permitiendo al dominio C-terminal ya sea doblarse separado del ligando, con ello, limitando las interacciones o doblarse hacia el ligando para formar más interacciones. Existen diferencias adicionales en la conformación entre los dos ligandos examinados, TRAIL y RANKL. Los residuos Glul95 a Asn202 en TRAIL, en particular, Asnl99, Thr200 y Lys201, sobresalen como una región de bucle hacia el sitio de enlace de OPG, potencialmente contactando OPG con la región de los residuos Lysl20, Hisl21, Argl22, Cysl24, Prol25, Prol26, Glyl27, Phel28, Cysl41, Lysl42. Sin embargo, el posicionamiento preciso de esta región, parece estar guiado adicionalmente, por contactos dentro del bucle saliente N-terminal a la región de articulación, la cual es adjuntada entre Cysl07 y Cyslld. Dentro de este bucle, Glull6 y Phell7, parecen capaces de formar series de interacciones favorables en al menos, dos orientaciones. Las mutaciones en el residuo cercano Ilell5, por ejemplo, I115G ó I115E, parecen desviarse de una orientación, la cual podría traducirse a una o más posiciones abiertas y con ello, debilitar la interacción de C-terminal que contacta al bucle 195-202 de TRAIL, mientras se mantiene la interacción RANKL. Algunos cambios en el residuo 115, sin embargo, se encontraron en estos estudios, para romper el enlace a RANKL, así como también a TRAIL. Estos cambios fueron en donde el aminoácido sustituido tiene una cadena lateral más grande en combinación con una carga positiva o negativa. Esto sugiere que el residuo 115 está también involucrado en contactar RANKL o que cambios no favorables a este residuo, rompe el contacto importante hecho por residuos cercanos tales como 116. Modelación de cambios dentro de la región 120-142 sugiere que las alteraciones en cualquiera de un número de residuos en esta región, podrían influenciar el enlace a TRAIL específicamente, y un número de tales cambios han sido detectados entre las OVP examinadas. Dentro de la región de enlace N-terminal, los residuos 42-92 de OPG forman una región de amplio contacto con tanto RANKL como TRAIL. Ambas estructuras de ligando parecen similares en esta interfaz. Puesto que esta no es una región en donde las mutaciones que conducen a pérdida de enlace TRAIL se observan en el trabajo descrito en este documento, se concluye que los residuos en esta región pueden en realidad, contribuir más débilmente a enlace TRAIL, o que las mutaciones en esta región afectan el enlace a TRAIL y RANKL en paralelo, de manera que cambios en esta área no se seleccionan durante esta estrategia de selección. Sin embargo, cambios conformacionales sutiles debido a mutaciones en esta o en una área cercana, pueden posiblemente, alterar las propiedades de la molécula favorablemente para sus efectos mediados por RANKL, y se ha sugerido anteriormente, para un cambio conformacional debido a la mutación del residuo 115. De interés particular, es un cambio en un residuo 40 identificado entre OVP examinadas. Puesto que este residuo cae adyacente a esta región de contacto, es probable que los cambios en los residuos cercanos, pueden influenciar sutilmente la forma de este blucle, con ello, desviando preferencialmente hacia RANKL al costo de la unión de TRAIL. Es probable que tales cambios sutiles en la forma se puedan lograr por mutación en otros residuos de OPG que pueden afectar el pliegue de este dominio. Todas las referencias citadas anteriormente, están incorporadas en este documento en su totalidad por referencia. Cualquier discusión de documento, actos, materiales, dispositivos, artículos o similares los cuales han sido incluidos en la presente especificación, son solamente para los propósitos de proporcionar un contexto para la presente invención. No se deben tomar como una admisión de que cualquiera o todas estas materias forman parte de la base de la técnica anterior o son del conocimiento general común en el campo relevante a la presente invención, conforme existe además de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta solicitud. Se apreciará por las personas expertas en la técnica, que se pueden hacer numerosas variaciones y/o modificaciones a la invención como se muestra en las modalidades específicas, sin apartarse del espíritu o alcance de la invención como se describe ampliamente. Las presentes modalidades en este documento por lo tanto, están consideradas en todos los sentidos como ilustrativas y no restrictivas.

Tabla 1: Estudios de enlace de OVP # por extrapolación Incremento en enlace = EC50 inferior; () reducción en enlace -EC50 superior Tabla 2 : Sumario de actividad biológica en ensayos a base de células *-capacidad inferior para bloquear apoptosis inducida por TRAIL +++++ capacidad mayor para bloquear apoptosis inducida por TRAIL

Claims (37)

NOVEDAD DE IA INVENCIÓN Habiéndose descrito la presente se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Una proteína variante de OPG, caracterizada porque comprende al menos, una modificación cuando se compara con la OPG de tipo silvestre, en donde la proteína variante de OPG retiene afinidad de enlace para RANKL, pero exhibe afinidad de enlace reducida para TRAIL, cuando se compara con la OPG de tipo silvestre.

2. Una proteína variante de OPG, como se reivindica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende al menos, una modificación en la región abarcada por residuos de aminoácidos 102-130.

3. Una proteína variante de OPG, como se reivindica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende al menos, una sustitución de aminoácido en la posición de residuos 102, 111, 115, 122, 128 ó 130.

4. Una proteína variante de OPG, como se reivindica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende al menos, una modificación dentro de la estructura de bucle que comprende residuos 107-118.

5. Una proteína variante de OPG, como se reivindica de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque comprende una modificación en el residuo 115.

6. Una proteina variante de OPG, como se reivindica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque lie en la posición 115 es sustituida con Thr, Met, Val, Asp, Gly, Ser o Arg.

7. Una proteína variante de OPG, como se reivindica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende una modificación en el residuo 122.

8. Una proteína variante de OPG, como se reivindica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque Arg en la posición 122 es sustituida con Gly, Gln, Ser, Asn o Glu.

9. Una proteina variante de OPG, como se reivindica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende una modificación en el residuo 128.

10. Una proteina variante de OPG, como se reivindica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque Phe en la posición 128 es sustituida con Val, Ala, Leu, lie o Ser.

11. Una proteina variante de OPG, como se reivindica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende una modificación en el residuo 130.

12. Una proteína variante de OPG, como se reivindica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque Val en la posición 130 es sustituida con Glu o Ala.

13. Una proteína variante de OPG, como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque comprende al menos, dos modificaciones.

14. Una proteína variante de OPG, como se reivindica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende al menos, dos modificaciones en la región abarcada por los residuos 122-130.

15. Una proteína variante de OPG, como se reivindica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque comprende al menos, dos modificaciones seleccionadas del grupo que consiste de: (i) R122N e I115M; (ii) R122N e I115M; iii) F128S e I115M; (iv) F128I e I115M; y (v) F128L e I115M.

16. Una proteína variante de OPG, como se reivindica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende al menos, una modificación en la región abarcada por los residuos 122-130 y al menos, una modificación adicional fuera de esta región.

17. Una proteína variante de OPG, como se reivindica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la modificación adicional ocurre en cualquiera o más de los residuos 31, 40, 51, 100, 155, 167 ó 168.

18. Una proteína variante de OPG, como se reivindica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la modificación ocurre en cualquiera o más de los residuos Gln21, Glu22, Thr23, Phe24, Pro25, Pro26, Lys27, Tyr28, Leu29, His30, Tyr31, Asp32, Glu33, Glu34, Thr35, Ser36, His37, Gln38, Asp42, Lys43, Pro45, Pro46, Thr48, Lys51, Gln52, His53, Cys54, Thr55, Ala56, Lys57, Trp58, Lys59, Thr60, Val61, Ala63, Pro64, Pro66, Asp67, His68, Tyr69, Asp72, Ser73, Trp74, Thr76, Ser77, Asp78, Glu79, Leudl, Tyr82, Ser84, Pro85, Val86, Lys88, Glu89, Leu90, Tyr92, Val93, Lys94, Gln95, Glu96, Asn98, Arg99, ThrlOO, HislOl, Vall31, Glnl32, Alal33, Glyl34, Thrl35, Prol36, Glul37, Argl38, Vall41, Lysl43, Argl44, Cysl45, Prol46, Aspl47, Glyl48, Phel49, Phel50, Serl51, Asnl52, Glul53, Thrl54, Serl55, Serl56, Lysl57, Alal58, Prol59, Cysl60, Argldl, Lysl62, Hisl63, Thrl64, Asnl65, Cysl66, Serl67, Vall68, Phel69, Glyl70, Leul71, Leul72, Leul73, Thrl74, Glnl75, Lysl76, Glyl77, Asnl78, Alal79, Thrl80, Hisldl, Aspl82, Asnld3, Ileld4, Cysld5, Serl86, Glyl87, Asnl88, Serl89, Glul90, Serl91, Thrl92, Glnl93, Lysl94, Cysl95, Glyl96, Ilel97, Aspl98, Vall99, Thr200 o Leu201.

19. Una proteína variante de OPG, como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizada porque comprende cualquiera o más de las siguientes modificaciones mostradas en la Tabla 1.

20. Una proteína variante de OPG, como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizada porque exhibe una afinidad de enlace para RANKL que es al menos, 80% que aquella de la OPG de tipo silvestre.

21. Una proteina variante de OPG, como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizada porque tiene un EC50 (nM) para RANKL de menos de 1 mm bajo condiciones de ensayo descritas en el Ejemplo 8.

22. Una proteína variante de OPG, como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizada porque exhibe una afinidad de enlace para TRAIL que es menos de 20% que aquella de la OPG de tipo silvestre.

23. Una proteina variante de OPG, como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizada porque tiene un EC50 (nM) para TRAIL mayor de 10 mM bajo condiciones de ensayo descritas en el Ejemplo 8.

24. Una proteina variante de OPG, como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizada porque la proteina variante de OPG está conjugada a un polipéptido.

25. Una proteina variante de OPG, como se reivindica de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el polipéptido es un dominio constante de inmunoglobulina.

26. Un dimero o multímero caracterizado porque comprende al menos, dos proteínas variantes de OPG como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25.

27. Un polinucleótido aislado caracterizado porque codifica una proteína variante de OPG como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25.

28. Un método para reducir la afinidad de enlace de OPG para TRAIL, caracterizado porque el método comprende modificar al menos, un aminoácido dentro de una proteína OPG o fragmento de la misma, para producir una proteína variante de OPG, y probar la proteína variante de OPG para afinidad de enlace para TRAIL.

29. Un método como se reivindica de conformidad con la reivindicación 2d, caracterizado porque comprende modificar al menos, un aminoácido dentro de la región abarcada por los residuos 102-130 de la OPG de tipo silvestre para producir una proteína variante de OPG, y probar la proteína variante de OPG para afinidad de enlace para TRAIL.

30. Una composición para inhibir o reducir el enlace de RANK o RANKL, caracterizada porque la composición comprende una proteina variante de OPG como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, y uno o más portadores aceptables.

31. Un método para inhibir o reducir el enlace de RANK a RANKL, caracterizado porque el método comprende, exponer una molécula RANKL a una proteína variante de OPG como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.

32. Un método para inhibir o reducir un efecto biológico mediado a través de la interacción de RANK y RANKL en una célula, caracterizado porque el método comprende, exponer la célula a una proteína variante de OPG como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.

33. Un método para inhibir o reducir un efecto biológico mediado a través de la interacción de RANK y RANKL en un sujeto, caracterizado porque el método comprende, administrar a un sujeto, una proteína variante de OPG como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.

34. Un método para tratamiento o prevención de una enfermedad mediada inmune o auto-inmune en un sujeto, caracterizado porque el método comprende, administrar a un sujeto, una proteína variante de OPG como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.

35. Un método para tratamiento o prevención de una enfermedad cardiovascular en un sujeto, caracterizado porque el método comprende, administrar a un sujeto, una pr? eina variante de OPG como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.

36. Un método para inhibir o reducir la diferenciación, activación y/o supervivencia de osteoclastos por RANKL, caracterizado porque el método comprende, exponer los tejidos que contienen osteoclastos o precursores de oste?clastos, a una proteina variante de OPG como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.

37. Un método para inhibir o reducir la diferenciación, activación y/o supervivencia de osteoclastos por RANKL en un sujeto, caracterizado porque el método comprende administrar a un sujeto, una proteína variante de OPG como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.