CN102977205A - 骨保护素变异蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的骨保护素变异蛋白(OVP),与野生型骨保护素相比,其显示出减小的与其配体TRAIL的结合亲和力。还提供了编码这些OVP的核酸。还涵盖了表达这些OVP的重组载体和宿主细胞以及生产重组OVP的方法。本发明还涉及包含这些OVP的组合物,以及涉及治疗以增加骨转换和/或骨丢失为特征的骨疾病的方法。本发明的OVP对于防止骨再吸收很有用,并且可以用于治疗任何导致不正常骨转换或骨丢失的病症,例如骨质疏松症、高钙血症、骨佩吉特病、多发性骨髓瘤、骨癌和由类风湿性关节炎或骨髓炎所致的骨丢失等。

Description

骨保护素变异蛋白
本申请是申请日为2005年12月13日的题为“骨保护素变异蛋白”的中国专利申请No.200580040780.1的分案申请。
技术领域
本发明涉及在调节通过RANK和RANKL的相互作用介导的生物学作用中很有用的进化蛋白。更具体地,本发明涉及新的骨保护素变异蛋白,其与野生型骨保护素相比,具有改变的结合特异性。还提供了编码这些OVP的核酸。还涵盖表达这些OVP的重组载体和宿主细胞以及生产重组OVP的方法。本发明还涉及包含这些OVP的组合物,并且涉及治疗与通过RANK和RANKL的相互作用介导的生物学作用相关的疾病的方法。
背景技术
Rank配体(RANKL)/OPG/RANK生物化学轴已被成功地用于治疗骨质疏松症、类风湿性关节炎、癌诱导的骨组织破坏、转移、高钙血症和疼痛(Hofbauer et al.,Cancer 92(3):p.460-470(2001))。利用OPG(Honore et al.,Nature Medicine 6(5):521-528(2000))(针对RANKL的一种抗体)或者可溶性RANK-Fc蛋白(Oyajobi et al.,Cancer Res 61(6):p.2572-8(2001))的治疗方法也正在开发中。OPG和可溶性RANK-Fc蛋白构建体与RANKL结合,由此减少了可以用于RANK受体活化的RANKL的量。
除了在骨生物学中很重要之外,RANKL在免疫系统中通过调节抗原特异性T细胞应答起到重要的作用(Anderson et al.,Nature390(6656):175-9(1997))。RANKL在活化的T细胞上被高度表达,而RANK受体在成熟树状突细胞(DC)上以高水平进行表达。RANKL和RANK之间的相互作用充当共刺激信号,其通过诱导DC分化、细胞因子产生和减少两种细胞型(DC细胞和T细胞)中的细胞凋亡来增强DC存活和T细胞增生。可通过利用RANK拮抗剂来阻断共刺激信号而获得用来产生对移植组织和/或器官的耐受性的免疫疗法。阻断共刺激阻止了T细胞通过DC细胞的活化,而且使得同种异体反应性T细胞变得无细胞免疫反应性和/或发生凋亡(Adler et al.,Current Opinion in Immunology 14:660-665(2002))。通过类似的作用机制,拮抗性RANK信号转导可以是用于自身免疫和免疫介导的炎性失调如系统性红斑狼疮、发炎性肠道疾病、糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎。
骨保护素(OPG)是肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的一种蛋白,并且由Simonet等人首次描述(Cell,89,309-319(1997))。
在调节骨生成和转换的自然过程中,OPG似乎是一个关键的元件。已注意到在多种与异常骨代谢有关的疾病中的OPG和它的靶受体RANKL之间的平衡的变化。
OPG已进行了临床前和临床试验,其具体在各种与增加的骨转换和骨丢失相关的疾病(包括骨质疏松症、风湿性关节炎、佩吉特病(Paget’s disease)、牙周病、血管疾病和位于骨组织中或转移至骨组织的癌症)中应用的效力(对于评论,参见Lorenz et al.,J.Amer Med Assoc 292:490-5(2004)以及其中的参考文献)。大量的OPG的动物试验在文献中已经报道过,与当前使用的用于减少骨丢失的其它疗法相比,表现出相同或者更优异的效果(Simonet et al.,Cell,89,309-319(1997);Bolon et al.,Cell Mol Life Sci 59,1569-76(2002))。也已证实OPG能减轻与骨癌相关的疼痛(Luger et al.,Cancer Research 61,4038-4047(2001))。
在US 6,015,938,US 6,284,740,US 6,284,728,US 6,613,544,US6,316,408,US 6,288,032和US 6,369,027中详细地描述了OPG。在US 6,087,555中描述了缺少OPG表达的转基因小鼠。
OPG在多发性骨髓瘤病人和骨质疏松症病人中对于减少骨转换已经进行了I期试验。在患有骨质疏松症的绝经后女性的开始I/II期试验中,发现单次注射OPG就可以抑制30-80%的骨转换的标记物数天(Bekker et al.,J.Bone Miner Res 16,348-360(2001))。用一定范围的OPG剂量来治疗多发性骨髓瘤病人,并且显示高达50%的病人在30或者更多天内减少骨吸收(Body et al.,Cancer 97,887-892(2003))。因此,临床前研究和临床研究都有非常强大的证据表明,OPG在各种以异常骨代谢为特征的病症中可能是一种高度有效的疗法。
细胞因子的肿瘤坏死因子(TNF)家族和它们的相应受体包括相当多的成员,并且在配体-受体相互作用中在这些成员之间存在实质上的交叉反应性(对于评论,参见Igney,F.H.and Krammer,P.HNature Reviews Cancer 2,277-288(2002))。TNF受体通常引发两种应答中的一种,或者是凋亡(程序性细胞死亡)应答或者是通过活化转录因子NFκB的对细胞代谢途径的作用。该受体家族还包括充当假目标(decoy)的成员,以减弱在其它家族配体-受体对之间的相互作用的有效性。OPG看起来属于这一类的受体。
与许多TNF受体家族成员相比,OPG在其目标特异性方面是相对受限制的。根据现有的知识,OPG只结合两种TNF类配体。
1.RANKL(NFκB配体的受体活化剂),一种TNF类细胞表面分子,通常与TNF受体家族成员RANK相互作用,而RANK在破骨细胞前体、树突状细胞、T细胞和造血细胞前体上表达(Kong etal.,Nature 397:315-323(1999))。RANKL与RANK在细胞表面上相互作用以刺激破骨细胞的生成和活性,而破骨细胞是骨转换中涉及的主要细胞(Hsu,H et al.,Proc Natl Acad Sci USA 96,3540-3545(1999))。RANK在基质细胞/成骨细胞上表达(Kong et al.,Nature397:315-323(1999))。OPG和RANKL的相互作用抑制RANKL结合RANK和刺激破骨细胞的能力,并且正是OPG的这种活性赋予其减少骨丢失的能力(Lacey et al.,Amer J Pathol 157,435-448(2000);Simonet et al.,Cell,89,309-319(1997))。结合于RANKL的二聚OPG的结合常数已被报道为6.7nM(Willard et al.,Protein Expr.Purif 20,48-57(2000)),而其它的报道将结合常数置于2nM和10nM之间。
2.TRAIL(TNF相关的凋亡诱导配体),一种TNF类细胞表面分子,涉及诱导癌细胞中的细胞凋亡。OPG被认为是少数用于TRAIL的假目标受体中的一种,用来调节其靶向癌细胞的能力(在上面参考的Igney and Krammer(2002)中进行了评论)。因此,如果在相关部位有足够的量,则将可以预期OPG会增强癌细胞的存活,而且其增强肿瘤细胞存活的能力已经被记载了(例如,Neville-Webbe et al.,Breast Cancer Res Treat.86,271-82(2004);Holen I et al.,Cancer Res 62,1619-1623(2002))。OPG对于TRAIL的亲和力已被报道是3nM(Emery et al.,J.Biol Chem.273,14363-7(1998)),尽管会随温度而发生变化(Truneh et al.,J.Biol Chem.275,23319-25(2000))。
OPG抑制TRAIL活性的能力(可能会导致癌形成的危险增加)已在医学文献中记载为对这种试剂用作治疗方法的一种可能的威胁(deterrent)。对于抑制骨丢失的药剂的应用领域中,诸如骨质疏松症和佩吉特病的病症,它们本身是没有生命威胁的,但是需要长期的治疗。此外,OPG的最重要的可能应用之一是在有骨转移的癌症病人的辅助治疗。在所有这些可能的应用领域中,任何与治疗相关的增加癌细胞生长和存活的迹象都会成为应用的威胁。因此,需要产生一种实质上缺乏结合TRAIL能力的新的OPG变异体。这样的变异体缺少严重干扰自然抗癌机制的能力,而同时保留其干扰RANK/RANKL相互作用(刺激破骨细胞形成和活性,以及随之而来的骨丢失)的能力。
发明内容
现在本发明已形成新的OPG变异蛋白(OVP),其显示出减小的对于TRAIL的结合亲和力和减小的抑制由TRAIL与其受体相互作用所致的正常生物学作用的能力。
对本发明的OVP的分析表明,在野生型OPG蛋白序列的特异性区域中的集中的点突变。尤其是,该突变都聚集在由OPG残基102-130包围的区域内。在本发明的OVP上构建的模型研究支持这样的观点:OPG/OVP的这个区域在结合过程中与TRAIL和RANKL蛋白形成一个界面。因此,在该区域内鉴定的实质性给把对于TRAIL的结合亲和力的突变同时不影响结合至RANKL是令人惊讶的。
重要的是,本发明的OVP保留了它与RANKL结合的能力,以及减小或抑制RANK-RANKL相互作用和该相互作用引起的随之而来的生物学作用的能力。可以设想,本发明优选的OVP将保留野生型OPG调节骨代谢的能力,而同时没有通过抑制TRAIL的作用而增强癌细胞存活的不希望作用的能力。
因此,本发明提供一种OPG变异蛋白,与野生型OPG相比,其包含至少一种修饰,其中与野生型OPG相比,该OPG变异蛋白保留了对于RANKL的结合亲和力,但表现出减小的对于TRAIL的结合亲和力。
本发明的OPG变异体包括OPG的任何变异蛋白,无论是截短的还是全长的、单体形式或二聚体形式,其由于对该蛋白的修饰而具有显著减小的与TRAIL的结合,同时基本上保留其对RANKL的结合。其中在OVP的活性和野生型OPG的活性之间进行比较,应当理解,该比较是基于相对于大小和二聚化状态而处于类似形式的蛋白质进行的。
在一个优选具体实施方式中,该OPG变异蛋白包含在由氨基酸残基102-130包围的区域内的至少一个修饰。例如,该OPG变异蛋白可以包含在位置102、111、115、122、128或130的至少一个氨基酸替代。
本发明还提供一种已被修饰以诱导二聚体化、或者保持或提高其稳定性、表达或生物半衰期的OVP蛋白。这样的修饰可以包括插入白蛋白部分、Fc区或者用聚乙二醇替代,或者是插入用于保持二聚形式的OVP的伸展蛋白。
本发明还提供了一种分离的编码本发明的OPG变异蛋白的多核苷酸。优选地,该多核苷酸是SEQ ID NO:1的变异体,其中该变异体包括核酸改变以使其编码本发明需要的OPG变异蛋白。产生这样的核酸改变的方法在本领域是已知的并且在本文中也做了描述。
还提供了在这个序列上的变异,其中所编码蛋白保持相同的生物学活性谱。可以改变核苷酸序列以提高所编码蛋白在一个或更多个表达系统中的表达、增加RNA稳定性或者偶然发现地包含消除核酸或其编码蛋白的生物功能的改变。
本发明还提供了一种载体,其包含根据本发明的多核苷酸。优选地,该载体适用于复制和/或表达多核苷酸。该载体可以例如是提供有复制源的质粒、病毒或噬菌体,并且优选提供有用于表达该多核苷酸的启动子并且可选地为该启动子的调节子。该载体可以包括一个或者更多个可选标记物,例如在细菌质粒情况下的氨苄青霉素抗性基因或对于哺乳动物表达载体的新霉素抗性基因。该载体可以用于体外,例如生产RNA或者用于转染或转化宿主细胞。
本发明还提供了一种宿主细胞,其包含根据本发明的载体,或者含有在允许目标蛋白表达和生产的条件下编码本发明蛋白质之一的基因。
本发明还提供了一种用于制备本发明的OPG变异蛋白的方法,该方法包括:在允许生产OPG变异蛋白的条件下培养本发明的宿主细胞,以及该回收OPG变异蛋白。这样的细胞可以用于生产商业上有用的大量的编码OPG变异蛋白。
本发明还提供了一种用于减小OPG对于TRAIL的结合亲和力的方法,该方法包括:修饰在OPG蛋白或其片段内的至少一个氨基酸以产生一个OPG变异蛋白,以及检测该OPG变异蛋白对于TRAIL的结合亲和力。
在一个优选具体实施方式中,该方法包括:修饰在由野生型OPG的残基102-130包围的区域内的至少一个氨基酸以产生一个OPG变异蛋白,以及检测该OPG变异蛋白对于TRAIL的结合亲和力。
应当理解,本发明的OVP可以用于在体内减少或者抑制RANK与RANKL的结合,以及减少或抑制RANK和RANKL之间的相互作用和通过该相互作用介导的生物学作用。
因此,本发明还提供了一种用于抑制或减少RANK与RANKL结合的组合物,该组合物包含根据本发明的OPG变异蛋白和一种或者多种可接受的载体。
本发明还提供了一种药物组合物,其包含治疗有效量的根据本发明的OPG变异蛋白和药学上可接受的(药用)载体、增溶剂、稳定剂和抗氧化剂中的一种或者多种。
本发明还提供了一种用于抑制或减少通过RANK和RANKL的相互作用介导的生物学作用的方法,该方法包括将RANKL分子暴露于根据本发明的OPG变异蛋白。
本发明还提供了一种用于抑制或减少受治者中通过RANK和RANKL的相互作用介导的生物学作用的方法,该方法包括将根据本发明的OPG变异蛋白给予受治者。
本文中的“受治者(subject)”是指人类也指其它动物,本文中尤其是指哺乳动物,并且人是优选的。
本发明还提供了一种用于抑制或减少通过RANKL的破骨细胞的分化、活化和/或存活的方法,该方法包括将包含破骨细胞或破骨细胞前体细胞的组织暴露于根据本发明的OPG变异蛋白。
本发明还提供了一种用于抑制或减少受治者中通过RANKL的破骨细胞的分化、活化和/或存活的方法,该方法包括将根据本发明的OPG变异蛋白给予受治者。
本发明还提供了一种用于预防或治疗骨疾病的方法,包括将本发明的药物组合物给予受治者。
本说明书通篇中,词语“包含”或其变形如“包括”应被理解为表示包括所陈述的元件、整体或步骤,或者多个元件、整体或步骤的组,但不排除任何其它元件、整体或步骤,或者多个元件、整体或步骤的组。
在本文单个部分提及的本发明的各种特性和具体实施方式也适当地适用于其它部分。因此,相对于本发明的一个具体实施方式进行描述的特性可以与相对于本发明其它实施方式进行描述的特性加以组合。
附图说明
图1:A.OPG基因结构。CRD-富半胱氨酸结构域;DD-死亡结构域;HBD:肝素结合结构域。B.pEGX254突变和显示盒。
图2:比较纯化的OVP和OPG与RANKL和TRAIL的结合的ELISA。结合曲线根据被检测的变异体数量进行标记。WT是指没有突变的OPG。以R结尾的曲线标记是指与RANKL结合;以T结尾的曲线标记是指与TRAIL结合。这些研究是利用在大肠杆菌中表达的单体OPG 22-194来实施的。
图3:比较纯化的OVP和OPG与RANKL和TRAIL的结合的ELISA。曲线标记和条件如图3。
图4:结合于RANKL(A)和TRAIL(B)的纯化的哺乳动物表达的OVP的ELISA。这些研究是利用二聚的Fc-连接的OPG或OVP 22-194来实施的。
图5:(A)通过OPG野生型蛋白在HCT116细胞中抑制TRAIL诱导的凋亡。(B)通过OVP在HCT116细胞中抑制TRAIL诱导的凋亡。
图6:(A)RAW264.7细胞的RANKL介导的破骨细胞活化的OPG野生型抑制。(B)RAW264.7细胞的RANKL介导的破骨细胞活化的OVP抑制。
图7:RANKL诱导的破骨细胞介导的再吸收的OVP抑制。使用的所有OVP的浓度为1nM。UT-未用OVP处理。
图8:人类OPG野生型和优选的OVP氨基酸序列的对比。
图9:结合至小鼠RANKL的OPG的结构模型(pdb file 1JTZ)。RANKL三聚体被显示成上部浅灰色带状图,OPG被显示为深灰色带状图。具有在5埃的RANKL中的至少一个原子的OPG残基被突出显示为空间填充的球体。浅色球表示在N末端受体结构域中与RANKL可能接触的OPG残基(OPG的残基42到91,其中具体的接触标号为42、43、49、50、52、53、69、71-82、85-91),深色球表示C-末端受体结构域(OPG的残基105到130,其中具体的接触残基标号为105、106、107、108、110-130)。
图10:集中在第二TNF受体结构域上的接触TRAIL的模型化OPG的部分视图。上半部分将TRAIL显示为带状图。OPG被显示为浅灰色的α碳踪迹。在黑色中,一个OPG变异体与OPG对准,特征在于Ile115至Glu的突变。残基115和122的侧链被显示为线条图。OVP的模型化表明,残基115的突变导致产生107-118环的构象改变,其中在界面处重排接触。构象的改变可能改变其它的接触部分,如通过残基122的侧链的转移所突出显示的,可能破坏残基120-130区域的接触部分。这些接触部分似乎对于TRAIL结合比对于RANKL结合显得更关键。这就与在我们的试验中对于这种突变所观察到的几乎完全消除了与TRAIL的结合是一致的。
图11:预测在OPG(底部)和TRAIL(顶部的带状图)之间的结合的模型。残基102-130以空间填充的形式示出。根据此模型,包含OPG的残基115的环(长箭头),以及C-末端至其的残基(115环的右边)与TRAIL形成多个接触部分(短箭头)。TRAIL的突出环195-202(短箭头)似乎允许与OPG的接触比与RANKL可能的接触(尤其是OPG残基120-130)有另外的接触或更广泛的接触(与图12相比)。这证实该区域为这样的区域,其中突变可能改变与可能的未改变RANKL进行结合的TRAIL结合。
图12:预测在OPG(底部)和RANKL(顶部的带状图)之间的结合的模型,其中利用小鼠RANKL结构,与模型化的OPG-TRAIL复合体对准。OPG的残基102-130以空间填充的形式示出。包含残基115的环(长箭头)指向并接触RANKL,但是C-末端至该区域的残基(该环的右边)似乎与RANKL具有很少的接触(短箭头-RANKL残基225-233,与图11的TRAIL中的突出环195-202相对应)。这将OPG与RANKL的接触与前图中示出的OPG与RANKL的接触区分开。
序列表的检索表
SEQ ID NO:1-人类野生型骨保护素基因;
SEQ ID NO:2-人类野生型骨保护素;
SEQ ID NO:3-大鼠野生型骨保护素;
SEQ ID NO:4-小鼠野生型骨保护素;和
SEQ ID NO:5至47-人类骨保护素变异蛋白(OVP);以及
SEQ ID NO:48和49-用于分离OPG基因的引物。
具体实施方式
通用技术
除非另外定义,本文中所用的技术和科学术语具有与本领域(例如,在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术、化学和生物化学中)的普通技术人员通常理解相同的意思。
除非另外指出,本发明中利用的重组DNA技术是本领域的技术人员所熟知的标准步骤。这样的技术在各种来源的文献中通篇被描述和解释,如J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,JohnWiley and Sons(1984),J.Sambrook et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989),T.A.Brown(editor),Essential Molecular Biology:A Practical Approach,Volumes 1and 2,IRL Press(1991),D.M.Glover and B.D.Hames(editors),DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes 1-4,IRL Press(1995and 1996),and F.M.Ausubel et al.(Editors),Current Protocols inMolecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988,包括到目前的所有更新)。
骨保护素(OPG)
OPG是TNF受体超家族中的一员,具有与骨代谢有关的活性,并且尤其是具有抑制骨再吸收从而增加骨密度的活性。更具体地,OPG与RANKL的相互作用抑制了RANKL通过其与RANK的相互作用刺激破骨细胞的形成和活性的能力,并且正是OPG的这种活性赋予其减少骨丢失的能力。
OPG的生物学活性还包括与TRAIL结合有关的活性。TRAIL(TNF相关的凋亡诱导配体)是一种涉及诱导癌细胞凋亡的TNF类细胞表面分子。OPG被认为是用于TRAIL的少数假目标受体中的一种,用来调节其靶向癌细胞的能力。因此,如果在相关部位有足够的量,则预计OPG具有不希望的增强癌细胞存活的作用。
OPG的各种活性片段已经被描述。Yamaguchi等人(J.BiolChem.273,5117-5123(1998))证实,OPG的截短或缺失变异体保留OPG类的活性,而以单体或二聚体形式的OPG保留生物学活性(Tomoyasu,A et al.,Biochem Biophys Res Commun 245,382-387(1998))。Schneeweis等人(J.Biol.Chem.Oct 72005(epub))研究了OPG对于RANKL的结合、状态以及亲和力。他们报道了全长形式或截短形式的OPG的二聚化要求OPG对RANKL有高亲和力结合,其中全长形式的OPG的二聚化是通过在死亡结构域区域内的非共价相互作用来介导的,而截短形式的OPG的二聚化可以通过Fc结合来介导。
野生型人类、大鼠和小鼠骨保护素的氨基酸序列分别示于SEQID NO 2至4。
野生型的OPG序列还包括去除了21个氨基酸的氨基末端前导序列那些序列和/或去除了从C-末端直至并且包括氨基酸185的氨基酸的那些序列。
OPG变异蛋白
本文中的“蛋白(蛋白质)”是指至少两个共价结合的氨基酸,其包括蛋白质、多肽、寡核苷酸和肽。蛋白可以由天然存在的氨基酸和肽键,或者是通常取决于合成方法的合成的拟肽结构,即“类似物”如类肽所组成(见Simon et al.,Proc.Natl.Acd.Sci.U.S.A.89(20:9367-71(1992))。例如,智人(homo-)-苯丙氨酸、瓜氨酸和noreleucine被认为是用于本发明目的的氨基酸。“氨基酸”还包括亚氨基酸残基如脯氨酸和羟脯氨酸。D-和L-氨基酸都可被利用。
现在,本发明人已经形成了新的OVP变异蛋白(OVP),其表现出减小的对于TRAIL的结合亲和力。重要地,本发明的OVP保留了结合RANKL的能力。因此,可以设想,本发明的OVP保留了野生型OPG调节骨代谢的能力,而同时没有不期望的增强癌细胞存活的与TRAIL相关的特性。
因此,本发明提供了一种与野生型OPG相比包含至少一个修饰的OPG变异蛋白,其中,与野生型OPG相比,该OPG变异蛋白保留了对RANKL的结合亲和力,但表现出减小的对于TRAIL的结合亲和力。
用“保留对于RANKL的结合亲和力”是指与野生型OPG相比,该OPG变异蛋白表现出至少20%的对于RANKL的结合亲和力。
野生型的OPG可能来源于任何物种,优选是哺乳类物种。在一个优选的具体实施方式中,野生型的OPG是普遍的人类OPG蛋白。更优选地,该野生型OPG是具有在SEQ ID NO:2示出的氨基酸序列的蛋白质。
本发明的OPG变异蛋白优选表现出野生型OPG的至少一种生物学活性。
在一个实施例中,野生型OPG的生物学活性涉及骨代谢,并且尤其是抑制或减小通过RANKL的破骨细胞的刺激和/或活性的能力。优选地,本发明的OPG变异蛋白保留预防与骨密度降低或异常骨转换相关的疾病的能力。
在另一个实施例中,野生型OPG的生物学活性涉及T细胞活性,并且尤其是减小或抑制T细胞活化的能力。优选地,本发明的OPG变异蛋白对于自身免疫失调(如系统性红斑狼疮、发炎性肠道疾病、糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎)的治疗是很有用的。
在又一个实施例中,本发明的OPG变异蛋白对于治疗心血管疾病、预防或减弱血管和瓣膜的钙化,或增强血管生长是很有用的。
在一个具体实施方式中,OPG变异蛋白是全长野生型OPG序列的修饰形式。在另一个具体实施方式中,OPG变异蛋白包含一个或多个在N-末端、C-末端或中间部分的另外的插入或缺失。例如,该OPG变异蛋白可以包括OPG的任何经修饰的活性片段。该活性片段可以包括例如氨基酸22-294、氨基酸22-201、22-194或氨基酸1-197。
在一个优选的具体实施方式中,OPG变异蛋白具有至少1个不同于野生型OPG序列的氨基酸残基,其中更优选具有至少2、3、4或5个不相同的残基。该修饰优选是氨基酸替代,并且可以包括对OPG的表面或暴露区域的那些氨基酸替代。OPG变异蛋白可以包括一个结构域或由接头序列连接的多个结构域。OPG变异蛋白可以包含其它修饰,例如改变稳定性或免疫原性的修饰,或能够进行翻译后修饰的如聚乙二醇化(PEG化)或糖基化。
在一个优选具体实施方式中,OPG变异蛋白包含在由氨基酸残基102-130包围的区域内的至少一个修饰。例如,该OPG变异蛋白可以包含在位置102、111、115、122、128或130处的至少一个氨基酸替代。
在一个优选具体实施方式中,该OPG变异蛋白包含在包括残基107-118的环结构内的至少一个修饰。在一个特别优选具体实施方式中,这个区域中的修饰包括在位置115处的Ile的替代,位置115处的Ile可以被具有更强极性或更短侧链的氨基酸所替代。优选地,位置115处的Ile用Thr、Met、Val、Asp、Gly、Ser或Arg进行替代。因此,优选的修饰包括I115T、I115M、I115V、I115D、I115G、I115S和I115R。
在一个优选具体实施方式中,该OPG变异蛋白包含在由氨基酸残基120-130包围的区域内的至少一个修饰。在另一个优选具体实施方式中,该修饰包括在位置122处的Arg的替代。优选地,位置122处的Arg被Gly、Gln、Ser、Asn或Glu所替代。因此,优选的修饰包括R122G、R122Q、R122S、R122N和R122E。
在又一个特别优选具体实施方式中,该修饰包括位置128处的Phe的替代。优选地,位置128处的Phe被Val、Ala、Leu、Ile或Ser所替代。因此,优选的修饰包括F128V、F128A、F128L、F128I和F128S。
在又一个优选具体实施方式中,该修饰包括位置130处的Val的替代。优选地,位置130处的Val被Glu或Ala所替代。
在一个进一步优选具体实施方式中,该OPG变异蛋白包含至少两个修饰。
该至少两个修饰可以都发生在由残基120-130包围的区域中。例如,该至少两个修饰可以涉及在位置115和122处的替代。在这个区域内的合适双修饰的实例是R122N和I115M;R122N和I115M;F128S和I115M;F128I和I115M;以及F128L和I115M。
可替换地,该至少两个修饰可以涉及在由氨基酸102-130包围的区域中的一个或多个修饰以及该区域外部的一个或多个修饰。
该区域外部的修饰可以发生在例如残基31、40、51、100、155、167或168中的任何一个或多个处。在一个优选具体实施方式中,该修饰发生在残基40处。优选地,该修饰涉及位置40上的Leu用Ser替代。
在另一个具体实施方式中,本发明的OPG变异蛋白包含在由氨基酸102-130包围的区域中的一个或多个修饰和对以下氨基酸残基中的任何一个或多个的修饰:G1n21、Glu22、Thr23、Phe24、Pro25、Pro26、Lys27、Tyr28、Leu29、His30、Tyr31、Asp32、Glu33、Glu34、Thr35、Ser36、His37、Gln38、Asp42、Lys43、Pro45、Pro46、Thr48、Lys51、Gln52、His53、Cys54、Thr55、Ala56、Lys57、Trp58、Lys59、Thr60、Va161、Ala63、Pro64、Pro66、Asp67、His68、Tyr69、Asp72、Ser73、Trp74、Thr76、Ser77、Asp78、Glu79、Leu81、Tyr82、Ser84、Pro85、Val86、Lys88、Glu89、Leu90、Tyr92、Val93、Lys94、Gln95、Glu96、Asn98、Arg99、Thr100、His101、Va1131、Gln132、Ala133、Gly134、Thr135、Pro136、Glu137、Arg138、Va1141、Lys143、Arg144、Cys 145、Pro 146、Asp147、Gly148、Phe149、Phe150、Ser151、Asn152、Glu153、Thr154、Ser155、Ser156、Lys157、Ala158、Pro159、Cys160、Arg161、Lys162、His163、Thr164、Asn165、Cys166、Ser167、Va1168、Phe169、Gly170、Leu171、Leu172、Leu173、Thr174、Gln175、Lys176、Gly177、Asn178、Ala179、Thr180、His181、Asp182、Asn183、Ile184、Cys185、Ser186、Gly187、Asn188、Ser189、G1u190、Ser191、Thr192、Gln193、Lys194、Cys195、Gly196、Ile197、Asp198、Val199、Thr200和Leu201。
在另一个具体实施方式中,本发明的OPG变异蛋白包含在由氨基酸残基120-130包围的区域中的一个或多个修饰和对以下氨基酸残基中的一个或多个的修饰:Tyr28、His30、Tyr31、Glu34、Thr35、Ser36、His37、Lys43、Tyr49、Gln52、His53、Pro66、Asp67、His68、Tyr69、Tyr70、Thr71、Asp72、Ser73、Trp74、His75、Thr76、Ser77、Asp78、Glu79、Cys80、Leu81、Tyr82、Cys83、Ser84、Pro85、Val86、Cys87、Lys88、Glu89、Leu90、Gln91、Asn139和Glu153。
本发明还提供一种包含在残基40处的修饰的OPG变异蛋白,其中与野生型的OPG相比,该OPG变异蛋白保留对于RANKL的结合亲和力但表现出减小的对于TRAIL的结合亲和力。优选地,所述修饰涉及在位置40处的Leu用Ser所替代。
本发明的OPG变异蛋白可以包含表1所示修饰中的一个或多个。
在一个进一步优选的具体实施方式中,该OPG变异蛋白包含在SEQ ID No:5至47中任何一个所示的序列。
在本发明一个进一步优选的具体实施方式中,该OVP表现出的对于RANKL的结合亲和力为野生型OPG对于RANKL的结合亲和力的至少50%,更优选至少60%,更优选至少70%,更优选至少80%,更优选至少90%,以及更优选至少95%。
在一个具体实施方式中,与野生型OPG相比,该OVP表现出增加的对于RANKL的结合亲和力。
在一个进一步优选的具体实施方式中,在实施例8中描述的试验条件下该OVP对于RANKL的结合具有小于5nM的EC50(nM),更优选小于1nM。
在本发明一个进一步优选的实施例中,该OVP表现出对于TRAIL的亲和力为小于50%,更优选小于40%,更优选小于30%,更优选小于20%,更优选小于10%,以及更优选小于5%的野生型OPG对于TRAIL的亲和力。
在一个进一步优选的实施例中,在实施例8中描述的试验条件下该OVP对于TRAIL的结合具有大于5nM的EC50(nM),更优选大于10nM,更优选大于25nM,更优选大于50nM。
还包括OPG变异蛋白,其具有在OPG的氨基酸残基195-401或198-401上的部分或全部的缺失或羧基端截短;在氨基酸残基195-401或198-401上的一个或多个氨基酸的改变;OPG的富半胱氨酸结构域的部分或全部缺失,尤其是远端(羧基末端)的富半胱氨酸结构域的缺失;以及在富半胱氨酸结构域中,尤其是在远端(羧基末端)的富半胱氨酸结构域中的一个或多个氨基酸的改变。
优选的氨基酸序列的缺失通常在约1-30个残基,更优选在约1-10个残基并且通常在约1-5个相邻残基的范围内。
应当理解,本文中用的指突变位置的氨基酸编号是指与在SEQID NO:1和2示出的人类OPG序列编号相关的突变位点。在同源物、衍生物和等位基因变异体中的相应位点也包括在本发明的范围内。
在本发明的上下文中使用的术语“对应于”是指与SEQ ID NO1和2相关的OPG多肽的氨基酸残基(例如与SEQ ID NO 1和2有大于70%的相同、大于80%的相同、大于90%的相同或大于95%的相同),然而,相关多肽的相对氨基酸残基编号可能与SEQ ID NO1和2的编号不同。
还包括本文中描述的OPG变异蛋白,包括在整个序列中的其它保守替代。这些保守替代如下:
  原始残基  示例性的替代
  Ala(A)  val;leu;ile;gly
  Arg(R)  lys
  Asn(N)  gln;his;
  Asp(D)  glu
  Cys(C)  ser
  Gln(Q)  asn;his
  Glu(E)  asp
  Gly(G)  pro,ala
  His(H)  asn;gln
  Ile(I)  leu;val;ala
  Leu(L)  ile;val;met;ala;phe
  Lys(K)  arg
  Met(M)  leu;phe;
  Phe(F)  leu;val;ala
  Pro(P)  gly
  Ser(S)  thr
  Thr(T)  ser
  Trp(W)  tyr
  Tyr(Y)  trp;phe
  Val(V)  ile;leu;met;phe,ala
此外,如果希望,则可以将非天然的氨基酸或化学的氨基酸类似物作为替代或插入物引入本发明。这样的氨基酸包括但不限于普通氨基酸的D-异构体,2,4-二氨基丁酸,α-氨基异丁酸,4-氨基丁酸,2-氨基丁酸,6-氨基己酸,2-氨基异丁酸,3-氨基丙酸,鸟氨酸,正亮氨酸,正缬氨酸,羟脯氨酸,肌氨酸,瓜氨酸,高瓜氨酸,磺基丙氨酸(半胱氨酸),叔丁基甘氨酸,叔丁基丙氨酸,苯丙氨酸,环己基丙氨酸,β-丙氨酸,氟氨基酸,标记氨基酸例如β-甲基氨基酸,Cα-甲基氨基酸,Nα-甲基氨基酸和通常的氨基酸类似物。
本发明还提供的是经化学修饰的OPG变异蛋白衍生物,其可以提供其它的优点,如增加该多肽的稳定性和循环时间,或者降低免疫原性(见美国第4,179,337号专利)。用于衍生化的化学部分可以选自水溶性多聚物如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇等。还包括的是,本发明的OVP在合成过程中或合成以后被差别修饰,例如,通过生物素化、苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化,通过熟知的保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割等等。多肽可以在分子内的任何位置或在分子内的预定位置被修饰,而且可以包括一个、二个、三个或更多个连接的化学部分。这些修饰可以用来增加本发明多肽的稳定性和/或生物学活性。
本发明涵盖的OPG变异蛋白的其它修饰包括翻译后修饰(例如,N-连接或O-连接糖链,N-末端或C-末端的加工)、N-连接或O-连接糖链的化学修饰,以及作为原核宿主细胞表达的结果在N末端蛋氨酸残基的插入。OVP也可以用可检测标记物,如酶、荧光、同位素或亲合性标记物加以修饰,以可以进行蛋白质的检测和分离。
OPG变异蛋白的其它修饰包括嵌合蛋白,其中OPG变异蛋白被融合到异源氨基酸序列。该异源氨基酸序列可以是使生成的融合蛋白保持至少OPG变异蛋白的活性的任何序列。该异源序列包括例如,免疫球蛋白融合体如Fc融合体或融合至其它的可以增加该蛋白的稳定性或有助于纯化的细胞配体的融合体。
在一个具体实施方式中,本发明的OPG变异蛋白可以利用两个、三个或可能更多个单体生成为二聚或者甚至寡聚单链分子。
单体可以通过肽键或肽连接物,或例如通过PEG分子进行结合。
二聚化还可以通过将该化合物制成具有Ig γ1的Fc-部分的融合蛋白来实现(GenPept accession No.M87789.1)。该分子可以被表达为具有C-末端Fc-部分或N-末端Fc-部分的融合蛋白。
二聚化也可以通过将备选产品融合至GCN4亮氨酸拉链(结构)来实现,该亮氨酸拉链已被报道可以诱导融合蛋白的二聚化(Donate,et al.,Biochemistry,3911467-76(2000))。
可替换地,可以通过将最后五个氨基酸残基中的一个,或可替换地最前五个氨基酸残基中的一个突变为半胱氨酸残基来生成二聚分子。然后纯化化合物的未配对半胱氨酸残基可以通过利用存在的硫醇活性连接基团连接至一个“双活性(diactive)”的PEG基团。可替换地,可以通过利用在适当表达载体中的合适柔性肽符合读框地插入两个备选分子(相同或甚至不同的)来生成二聚分子。
OPG变异蛋白的更进一步修饰包括二聚体或多聚体形式,其中OPG变异蛋白的单体单元可以通过合适的连接分子(可以包括肽或化学连接物,或在半胱氨酸残基之间的二硫化物桥)化学地或遗传地连在一起。另外,可以通过OPG蛋白融合的蛋白之间的键接(如Fc区)获得主题蛋白的二聚体或多聚体形式。
本发明的OPG变异蛋白优选地分离和纯化自存在于表达OVP的组织、细胞系和转化的宿主细胞中的其它多肽,或者纯化自包含分泌蛋白的细胞培养物中的组分。在一个具体实施方式中,OVP不与其它蛋白如细菌宿主细胞的表达产物结合。
本发明的OPG变异蛋白可以用本领域已知的任何技术来制备。例如,作为SEQ ID NO:1提供的多核苷酸可以进行体外突变。这样的体外突变技术包括将该多核苷酸亚克隆入一个合适的载体,将该载体转化入“增变基因(mutator)”菌株,如大肠杆菌(E.coli)XL-1red(Stratagene)并将转化的细菌繁殖合适的传代次数。在另一个实施例中,本发明的多核苷酸经过如由Harayama(1998)广泛描述的DNA改组技术。来源于突变/改变的DNA的蛋白质产物用本文中描述的技术可以容易地加以筛选,以确定它们是否具有增强和/或改变的底物特异性。
本发明的多肽的氨基酸序列突变体也可以通过在一个核酸序列中引入合适的核苷酸变化,或通过在体外合成希望的多肽来制备。这样的突变包括,例如,在该氨基酸序列中残基的缺失、插入或取代。可以使用缺失、插入和取代的组合来得到最终的构建体,只要该最终蛋白质产物具有期望的特性。
取代突变在野生型OPG序列上有至少一个氨基酸残基被去除并且在它的位置上插入了一个不同的残基。最感兴趣的用于取代突变的位点包括在本文中举例说明的那些位点。用于突变的位点可以单个或系列地加以修饰,例如,通过(1)首先是用保守氨基酸选择然后是根据获得的结果用更多自由基选择进行取代(2)缺失目标残基,或(3)在邻接定位位点插入其它残基。
可替换地,OPG变异蛋白可用体外非细胞进化突变系统产生。在一个体外非细胞进化的实施例中,利用了类似于WO 99/58661或WO 2004/039995中所描述的系统。
体外非细胞进化办法包括在导致产生突变蛋白种群的条件下,将在诱变剂(如QB复制酶或病毒唑,或其衍生物/类似物)存在的情况下通过聚合酶的作用直接或间接产生的突变OPG RNA分子暴露给翻译系统。这些突变OPG蛋白与它们从其翻译的RNA相连,从而形成突变蛋白/RNA复合体的种群。对该突变OPG蛋白/RNA复合体的种群筛选出具有期望生物活性如与RANKL结合而不与TRAIL结合的突变OPG蛋白/RNA复合体种群。具有期望活性的突变蛋白/RNA复合体可以被分离出来并且由RNA编码的蛋白质序列用标准技术进行表征。
本发明还提供一种用于制备本发明的OPG变异蛋白的方法,该方法包括在允许生产OPG变异蛋白的条件下培养本发明的宿主细胞,以及回收该OPG变异蛋白。这样的细胞可以用于生产商业上有用量的编码的OPG变异蛋白。
本发明的OPG变异蛋白可以用多种方法进行生产,包括天然蛋白的生产和回收,重组蛋白的生产和回收,蛋白质的化学合成。在一个具体实施方式中,本发明的OPG变异蛋白在有效生产OPG变异蛋白的条件下通过培养能够表达OPG变异蛋白的细胞、以及回收该OPG变异蛋白来生产。有效的培养条件包括但不限于允许蛋白生产的有效培养基、生物反应器、温度、pH和氧条件。有效培养基是指在其中培养细胞以产生本发明的多肽的任何培养基。这样的培养基通常包括含水培养基,其具有可同化的碳、氮和磷酸盐源,以及适当的盐、矿物质金属和其它营养物质如维生素。本发明的细胞可以在传统的发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定皿和培养板中进行培养。在适合重组细胞的温度、pH和氧含量的条件下进行培养。这样的培养条件属于本领域普通技术人员的能力范围。
本发明还包括一种用于从转染宿主细胞纯化OPG变异蛋白的方法。纯化过程可以采用以适当顺序的一个或多个标准的蛋白纯化步骤,如层析。层析步骤可以包括离子交换、凝胶过滤、疏水相互作用、反相、色谱聚焦、采用抗-OPG抗体或生物素-抗生蛋白链菌素亲合性复合体等的亲合性色谱。
本发明还提供一种用于减小OPG对TRAIL的结合亲和力的方法,该方法包括修饰在OPG蛋白或其片段内的至少一个氨基酸以产生OPG变异蛋白,以及检测该OPG变异蛋白对TRAIL的结合亲和力。
在一个优选的具体实施方式中,该方法包括修饰由野生型OPG的残基102-130包围的区域内的至少一个氨基酸以产生OPG变异蛋白,以及检测该OPG变异蛋白对TRAIL的结合亲和力。
对于本领域的技术人员来说,用于检测OPG变异蛋白对于TRAIL的结合亲和力的方法是已知的。适合的试验包括,但不限于,比较动力学和平衡结合常数的数量比较。动力学结合速率(Kon)和解离速率(Koff)、以及平衡结合常数(Kd)可以依据文献(Pearceet al.,Biochemistry 38:81-89(1999))中的标准程序在BIAcore仪器上利用表面等离子共振的方法来确定。多种可选替换方法也可以用来确定结合亲和力和动力学,其实例在本文的技术实施例部分进行了描述。
核酸、载体和宿主细胞
本发明还提供了一种分离的编码本发明的OPG变异蛋白的多核苷酸。本发明的多核苷酸的例子包括cDNA、基因组DNA、合成的DNA和RNA。
优选地,该多核苷酸是SEQ ID NO:1的变异体,其中该变异体包括核酸变化使其编码本发明期望的OPG变异蛋白。产生这样的核酸变化的方法在本领域是已知的,并且在本文中也描述了。
本发明还提供了一种包含根据本发明的多核苷酸的载体。优选地,该载体是适于复制和/或表达多核苷酸。载体可以是例如质粒、病毒或噬菌体载体,只要具有复制源,并且优选用于多核苷酸表达的启动子和可选的启动子调节子。载体可以包含一个或多个可选标记物,例如在细菌质粒情况下的氨苄青霉素抗性基因或用于哺乳动物表达系统的新霉素抗性基因。载体可以在体外使用,例如用于产生RNA或者用于转染或转化宿主细胞。
本发明还提供了一种包含根据本发明的载体的宿主细胞,或者包含在允许目标蛋白表达和生产的条件下编码本发明蛋白之一的基因的宿主细胞。
本发明的核酸可以利用技术人员可以得到的进化或定点突变技术加以构建。起始物质可以是例如编码野生型OPG的cDNA或基因组DNA。cDNA是从表达骨保护素的各种组织中分离的mRNA制备的文库中得到的。在人类,用于骨保护素的组织来源包括肾、肝、胎盘和心脏。编码骨保护素的基因组DNA是获自可商购从各种物种获得的基因组文库。
可选替换地,本发明的核酸可以是合成的核酸。例如,合成的DNA是通过搭接寡核苷酸片段的化学合成,然后组装这些片段已重建该编码区和侧接序列的部分或全部而获得(参见美国专利第4,695,623号,其描述了干扰素基因的化学合成)。RNA最容易通过引导高水平的mRNA合成的原核表达载体或通过体外构建体,如利用T7启动子和RNA聚合酶来获得。
本发明还提供了包含编码OVP的核酸序列的表达载体、用所述载体转化的宿主细胞和用于生产OVP的方法。表达重组蛋白的综述在Methods of Enzymology Vol.185(Goeddel,D.V.ed.)Academic Press(1990)中可以找到。
用于生产OVP的宿主细胞包括原核宿主细胞如大肠杆菌、酵母、植物细胞、真菌、昆虫和哺乳动物宿主细胞。大肠杆菌株如HB 101或JM101适用于表达。优选的哺乳动物宿主细胞包括COS、CHOd-、293、CV-1、3T3、幼年仓鼠肾(BHK)细胞以及其它细胞。当翻译后修饰(如糖基化和多肽加工)对于OVP的活性重要时,哺乳动物宿主细胞是优选的。哺乳动物表达允许产生分泌多肽,其可以从生长培养基中回收。
用于表达OVP的载体优选地包含对于载体繁殖和克隆插入物表达所需的最小序列。这些序列包括复制源、选择性标记物、启动子、核糖体结合位点、增强子序列、RNA剪接位点和转录终止位点。适用于在前述宿主细胞中表达的载体很容易获得,并且将本发明的核酸利用标准重组DNA技术插入该载体中。还包括了用于骨保护素的组织特异性表达的载体。这样的载体包含在小鼠体内的肝、肾或其它用于生产的器官特异性起作用的启动子,以及用于在靶向的人类细胞中表达骨保护素的病毒载体。
利用适当的宿主-载体系统,OVP可在该OVP可以产生的条件下,通过培养用包含编码OVP的核酸序列的表达载体转化的宿主细胞,并分离该表达产物来重组地产生OVP。OVP可以在转染的哺乳动物细胞的上清液中或在所包含的转化细菌宿主细胞个体中产生。这样产生的OVP可以用本领域技术人员所熟知的步骤进行纯化,如下文所述。在实施例2中描述了在大肠杆菌中的OVP表达。然而,在该实施例2中描述的特异性质粒和宿主细胞是仅用于说明的目的,应当理解其它可利用的质粒和宿主细胞也可以用于表达本发明的OVP.
药物组合物
本发明提供了一种用于抑制或减少RANK与RANKL的结合的组合物,该组合物包含根据本发明的OPG变异蛋白以及一种或多种可接受的载体。
本发明还提供了一种用于抑制或减少通过RANK和RANKL相互作用介导的生物学作用的组合物,该组合物包含根据本发明的OPG变异蛋白以及一种或多种可接受的载体。
本发明还提供了一种用于抑制或减少由RANKL对破骨细胞的刺激的组合物,该组合物包含根据本发明的OPG变异蛋白以及一种或多种可接受的载体。
本发明还提供了一种药物组合物,包含治疗有效量的根据本发明的OPG变异蛋白,以及药用载体、助溶剂、稳定剂和抗氧化剂中的一种或多种。
术语“治疗有效量”意思是指对于特定病症和给药路径提供治疗作用的量。该组合物可以是液体或冻干形式,并包含具有不同pH值和离子强度的稀释剂(Tris、醋酸盐或磷酸盐缓冲液)、助溶剂如吐温(Tween)或聚山梨醇酯(Polysorbate)、载体如人类血清白蛋白或明胶、防腐剂如噻汞撒(thimerosal)或苯甲醇、以及抗氧化剂如抗坏血酸或偏亚硫酸钠。还包括的是一种组合物,其包含用水溶性聚合物修饰的OVP以增加水溶性或稳定性。组合物还可以包括将OVP并入脂质体、微乳液、胶束或囊泡中以在延长的时间期内实现控释。特定组合物的选择取决于很多因素,包括治疗的病症、给药的路径和希望的药物动力学参数。更广泛的适用于药物组合物的成分的调查可在Remington′s Pharmaceutical Sciences,18th ed.A.R.Gennaro,ed.Mack,Easton,Pa.(1980)中找到。
本发明的组合物可以通过注射(皮下、静脉或肌肉),或者口服、鼻道、肺或直肠给药。最终采用的给药途径取决于很多因素并可以由本领域的技术人员确定。
本发明还提供了包含治疗有效量的本发明的核酸以及药用佐剂的药物组合物。作为基因治疗方案的一部分,核酸组合物适用于将部分或全部所述OVP递送至细胞或组织。
本文中的“基因治疗”是指一次或重复给予治疗有效的DNA、mRNA或其它核酸。在一个具体实施方式中,将基因引入细胞以便实现治疗有效遗传产物的体内合成。
治疗方法
对OPG在各种与骨转换和骨丢失增多相关的病症(包括骨质疏松症、风湿性关节炎、佩吉特病、牙周病、血管疾病和位于骨组织或转移至骨组织的癌症)中应用的效果已经经过了临床前和临床试验(对于评论,参见Lorenz et al.,J.Amer Med Assoc 292:490-5(2004)和其中的参考文献)。
也已经知道,拮抗RANK信号转导可以是治疗自身免疫性障碍如系统性红斑狼疮、发炎性肠道疾病、糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎的治疗方法。
最近的报道也表明,OPG也可以用于治疗或预防心血管疾病,以预防或减少血管和瓣膜的钙化(Kaden et al.,J.Mol.Cardiol.36:17-19(2004),以及用于促进血管生长(Cross et al;Int J Cancer Nov14,2005(epub))。OPG基因的多态性已经和幼年佩吉特病的发生(Daroszewska et al.,J.Bone Miner.Res 19:1506-11(2004))和处于高危形成冠脉疾病的高加索人(Soufi et al.,J.Clin.Endocrinol.Metab.89:3764-8(2004))相关。
因此,很清楚,本发明的OPG变异蛋白将具有广泛的治疗应用。
因此,本发明提供了一种用于抑制或减少RANK与RANKL结合的方法,该方法包括将RANKL分子暴露给根据本发明的OPG变异蛋白。
本发明还提供了一种用于抑制或减少细胞内通过RANK和RANKL相互作用介导的生物学作用的方法,该方法包括将该细胞暴露给根据本发明的OPG变异蛋白。
本发明还提供了一种用于抑制或减少受治者的通过RANK和RANKL相互作用介导的生物学作用的方法,该方法包括给予受治者根据本发明的OPG变异蛋白。
本发明还提供了一种用于治疗或预防受治者的自身免疫性或免疫介导的炎性疾病的方法,该方法包括给予受治者根据本发明的OPG变异蛋白。
本发明还提供了一种用于治疗或预防受治者的心血管疾病的方法,该方法包括给予受治者根据本发明的OPG变异蛋白。
本发明还提供了一种用于抑制或减小通过RANKL的破骨细胞的分化、活化和/或存活的方法,该方法包括将包含破骨细胞或破骨细胞前体的组织暴露于根据本发明的OPG变异蛋白。
本发明还提供了一种用于抑制或减小受治者的通过RANKL的破骨细胞的分化、活化和/或存活的方法,该方法包括给予受治者根据本发明的OPG变异蛋白。
本文中的“受治者”是指人和其它动物,尤其是本文中强调的哺乳动物,优选人。
本发明还提供了用于预防或者治疗骨疾病的方法,该方法包括给予病人本发明的药物组合物。
本文中的术语“治疗”和“治疗方法”是指包括治疗性治疗以及对于疾病或障碍的预防性或抑制性措施。因此,例如,在疾病发作之前成功地给予OPG变异蛋白会达到治疗疾病。作为另一个实例,疾病出现临床症状以后成功地给予OPG变异蛋白去与疾病的症状斗争,包含疾病的“治疗”。“治疗”还包括为了消除疾病而在疾病出现以后给予OPG变异蛋白。在发作后和在临床症状以后成功地给予某种药剂可能减轻临床症状并且可能减轻疾病,也包括疾病的“治疗”。
可以用本发明的OVP治疗的病症包括以下:
●骨质疏松症,如原发性骨质疏松、内分泌性骨质疏松(甲状腺机能亢进、甲状旁腺功能亢进、库欣综合征(Cushing’ssyndrome)和肢端肥大症)、遗传和先天性形式的骨质疏松(成骨不全症、高胱氨酸尿、门克斯(氏)综合征(Menkes′syndrome)和赖利-戴综合征(Riley-Day syndrome))和由于肢体的不运动导致的骨质疏松症。
●成人和青少年的骨佩吉特病(畸形性骨炎)。
●骨髓炎或骨的感染性损害,导致骨丢失。
●由实体瘤(乳腺、肺和肾)和恶性血液恶性肿瘤(多发性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病);先天性高钙血症和与甲亢和肾功能紊乱相关的高钙血症。
●手术后的骨质减少,由类固醇给予所诱导的,并且与小肠和大肠的障碍以及与慢性肝脏和肾脏疾病相关。
●与创伤性损伤相关的骨质疏松或骨细胞死亡,或与高歇氏病(Gaucher′s disease)、镰状细胞贫血、系统性红斑狼疮和其它疾病相关的非创伤性坏死。
●由类风湿性关节炎、强直性脊柱炎和其它免疫介导的炎性疾病导致的骨丢失。
●血管系统的钙化。
●牙周骨丢失。
●影响骨组织的癌症,包括多发性骨髓瘤,骨的原发性癌和溶骨转移如来自转移的乳腺和前列腺癌。
●心血管疾病。
●冠心病。
●自身免疫失调如系统性红斑狼疮、发炎性肠道疾病、糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎。
应当理解,本发明的OVP可以单独使用也可以与其它治疗药物联合使用。例如,本发明的OVP可以与治疗有效量的TRAIL激活剂抗体或抗TNF抗体联合使用。
在一个优选的具体实施方式中,本发明的OPG变异蛋白用来治疗与过量骨转换或丢失相关的骨疾病。骨疾病可以包括,但不限于,骨质疏松、骨佩吉特病、高钙血症、甲状旁腺功能亢进、类固醇诱导的骨质减少、类风湿性关节炎、骨髓炎、多发性骨髓瘤、骨癌、血管钙化、骨转移和牙周骨丢失。
应理解,本发明的OVP可以单独使用或与其它的治疗骨疾病的因素联合使用。
在一个具体实施方式中,OVP与治疗有效量的刺激骨生成的因素联合使用。这样的因素包括但不限于称为BMP-1至BMP-12的骨形态发生因子,转化生长因子-β(TGF-β)和TGF-β家族成员,白细胞介素-1抑制因子,TNFα抑制因子,甲状旁腺素及其类似物,甲状旁腺相关蛋白及其类似物,维生素E系列前列腺素,二膦酸盐(例如阿伦膦酸盐和其它),以及强骨矿物质如氟化物和钙。
本发明现在将参照下面的非限制性实施例做更详细的描述。
实施例1:克隆人类OPG基因
用于OPG的基因是从人类胎儿肾cDNA文库中分离出来的(Spring Bioscience,Fremont,CA)。对用于OPG序列5’和3’末端的引物加以设计,并且用标准的PCR来扩增基因。用于分离OPG基因的引物是:
正向:5′TATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGAACAAGTTGCTGTGCTGCGCGCTCG 3′(SEQ ID NO:48)。
反向:5′CATCTTTATAATCTGCGGCCGCTAAGCAGCTTATTTTTACTGATTGGACC 3′(SEQ ID NO:49)。
引物中的突出端并入了限制性位点,其允许克隆入适当载体以在大肠杆菌中扩增,如pGC(Coia et al.,(1996),J.Immunol.Meth.192:13-23),其中通过DNA测序来确定克隆成功。除了编码全长401aa的OPG蛋白的1203个核苷酸外,不包括其信号肽(aa 1-21)的OPG序列被扩增(OPG 22-401)。蛋白的N-末端部分到aa 194(包括4个富半胱氨酸结构域,带或不带有其信号肽序列)也被扩增。OPG基因结构的示意图在图1A中示出。
包含负责与RANKL和TRAIL结合的蛋白质部分的片段OPG22-194(Simonet et al.,(1997),Yamaguchi et al.,(1998),如上文中参考的)在pGC载体外在IPTG的诱导下表达在2L的2×YT/100μg/mL的氨苄青霉素中。这产生了具有用于检测的C-端双FLAG肽标签融合的蛋白,并从大肠杆菌周围介质提取物中进行亲合纯化。诱导在20-22℃进行3-4小时。亲合纯化的物质进一步在Superdex 200柱上通过凝胶过滤层析进行峰纯化。收集大小上与OPG单体对应的峰。还纯化大小上与OPG二聚体对应的较小峰。纯化的峰可以利用以大致预期大小移动的抗-FLAG抗体通过蛋白质印迹方法进行检测。纯化的单体蛋白可用OPG检测试剂盒(R&Dsystems,Minneapolis,MN)提供的特异性抗体进行检测。这种蛋白的鉴定是通过其与公布的序列相关的前19个残基的N-端氨基酸测序来确认的。
实施例2:OPG变异蛋白(OVP)的生成
为了形成OPG变异体文库,将OPG(22-194)DNA序列克隆入pEGX突变体和显示载体(图1B),其中通过DNA测序进行确认。包含OPG的质粒(~0.5-1.0μg)通过SmaI消化来线性化,并将其的100-200ng在37℃下直接用作用于T7RNA聚合酶转录的模板达16-24h。用在加载20μL反应物的1μL的琼脂糖凝胶电泳来验证转录成功。可能的话,所有涉及RNA的操作(包括核糖体显示)使用DEPC-处理的缓冲液、试剂和试管以使RNA降解最小化。
在37℃,将RNA转录体直接用作用于通过Qβ复制酶的复制反应的模板达16-24h。
Figure BDA00002131465500351
复制的成功通过加载1μL反应物的琼脂糖凝胶电泳来评定。这个过程产生编码OPG变异体的双链RNA文库。对突变条件加以调节以在每个基因拷贝获得1-3个任意的突变。在这个阶段,制备用于显示的1μg的OPG RNA文库相当于大约7×1011个分子。然后样品的浓度通过分光光度法来测定。
然后将OPG RNA文库用于核糖体显示。该文库首先用兔网织红细胞裂解物翻译系统(Promega)在30℃翻译30分钟:
Figure BDA00002131465500352
在CL间隔结构域末端处缺少终止密码子就使核糖体在翻译结束时停止,而形成RNA/核糖体/蛋白质复合物。一旦翻译完成,这些复合物通过保持低温(在冰上)和加入醋酸镁(MgOAc)加以稳定。翻译产物中加入60μL冰冷PBS/50mM MgOAc/10%脱脂牛奶(不含生物素)和190μL PBS/50mM MgOAc/0.05%吐温/2.5mg/mL肝素而稀释至300μL。然后将该混合物分为3×100μL等分试样。
实施例3:淘选OVP
对实施例2中产生的复合物在溶液中针对RANKL(Roche)和TRAIL(Peprotech)进行淘选。利用Sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce)来制备生物素化的RANKL和TRAIL以利用抗生蛋白链菌素涂覆的磁珠(Dynal)能够捕获溶液中所选的复合物。
在三个翻译混合物等分试样中的每一个均进行了panning试验。采用两种不同的方案以形成有利于分离在残基中具有氨基酸变化(其减小对TRAIL的结合亲和力,同时保留RANKL结合亲和力)的OVP序列的选择压力。一种使用的方案是首先针对可溶性RANKL进行淘选,然后用过量的游离TRAIL蛋白竞争掉TRAIL结合物。在一个翻译产物等分试样中,以大约与加入的RNA等摩尔的量的浓度加入生物素-RANKL。然后将该混合物在4℃摇动40-60min。洗涤抗生蛋白链菌素涂覆的磁珠(Dynal)并再悬浮在PBS/50mM MgOAc/0.05%吐温中。在RANKL淘选之后,将这些磁珠的10μL加入到混合物中,在4℃保持10分钟。然后将在带有核糖体-显示的OPG的复合物中捕获生物素-RANKL的磁珠利用磁铁去除,用PBS/50mM MgOAc/0.05%吐温洗涤两次,用PBS/50mM MgOAc洗涤两次,然后再悬浮在100μL的这种缓冲液中。将过量的可溶性TRAIL以加入的RANKL摩尔浓度的2倍或更多倍的浓度加入到该混合物中,以竞争掉TRAIL结合物并将其在4℃摇动30分钟。然后将在这个过程中从磁珠上被洗脱的任何复合物如上所述进行洗脱,并且将带有结合的RANKL-结合复合物的小珠重悬在20μL的H2O中。这种淘选方案以“RANKL-1st”表示。
使用的另一方案是首先针对可溶性TRAIL进行淘选以去除较强的TRAIL结合物,然后针对RANKL淘选该混合物以分离剩余的RANKL结合物。对于第二个翻译产物等分试样,以加入的RNA的大约1/2到1/4的摩尔量加入生物素-TRAIL。将该混合物在4℃摇动40-60min,然后加入10μL的抗生蛋白链菌素小珠达10分钟。在带有核糖体显示的OVP的复合物中捕获生物素基-TRAIL的磁珠用磁铁去除,由此去除混合物中的较好TRAIL结合的复合物。然后将生物素基-RANKL以大约加入的RNA的1/2的摩尔量加入该混合物中,并且将其在4℃摇动30-40min,以选出保持与RANKL结合亲和力的OPG变异体。然后将小珠以以上所述的方法洗涤并且重悬在H2O中。这种淘选方案以“TRAIL-1st”表示。在第三个翻译产物等分试样中进行实施对照淘选试验,其实施与“RANKL-1st”相同,只是使用生物素基-IGF-I(Gropep)代替生物素基-RANKL。还实施上述RANKL-1st和TRAIL-1st选择方案的变形方案,其中使用的抗原连接于环氧磁珠(Dynal)而不是使用可溶生物素化形式的抗原。
实施例4:所选OVP的克隆
以5μL的珠子悬浮物为模板,利用RT-PCR通过标准方法将带有复合物的所选RNA转化为cDNA。RT-PCR产物通过琼脂糖电泳进行分离。象用于RANKL-1st和TRAIL-1st淘选的带一样,可观察到从IGF-I淘选产生较弱带,表明在这个选择过程中本身存在一些非特异的选择。然后将所选DNA库从凝胶中进行纯化,并限制性消化并且连接入表达载体pGC中,以便可以对希望结合特性进行筛选。连接物被电穿孔插入合适的大肠杆菌菌株以产生转化的克隆体。
实施例5:筛选OVP克隆体
对来自每一个显示和选择试验的大约100个克隆体进行筛选。携带有用于OVP的基因的克隆体作为起始培养物在微滴定板的孔中在200μL的添加了氨苄青霉素和葡萄糖的2×YT中生长,并在37℃孵育过夜。将这些培养物用作在200μL的添加了氨苄青霉素的2×YT中用于表达培养物的接种种。当培养物在600nm处的光密度值达到大约1.0时,通过添加IPTG至0.5-1mM并在20-22℃孵育16h而诱导pGC外部的变异体的表达。然后收集培养物上清液,用于在微的定板的孔表面上对涂覆过夜的RANKL和TRAIL的ELISA结合。表面用0.5%的酪蛋白封闭2小时。上清液利用装有100kD分子量截止(MWCO)膜的微量滴定板过滤,以除去更高分子量的物种和聚集体,这有助于减少ELISA中的背景信号。这些滤过的上清液应用于抗原包被和封闭的孔。结合的OVP的检测利用小鼠抗-FLAG抗体和山羊抗小鼠过氧化酶结合(BioRad)而实现。TMB(KPL)用作过氧化酶底物,其中结合信号通过读取在450nm处的吸光度进行检测。在各步骤之间的洗涤用PBS/0.05%吐温进行3次,然后用PBS洗涤3次,并且在0.25%的酪蛋白中制成稀释液。对该第一次粗选进行评价,利用所选的最有希望的克隆体(基于RANKL-结合信号保持在或接近野生型OPG的水平以及TRAIL-结合信号被大幅度减小)进行第二次的筛选。
第二次筛选包括在20-22℃、诱导期为3h下在10ml的培养基中表达选择的克隆体。收获来自这些细胞的胞质提取物,如上所述进行过滤,然后如上所述通过ELISA在一定的稀释范围(通常从1∶2到1∶32)进行检测。选择这些蛋白中最好的用来进行大规模的如上所述对OPG野生型的表达和纯化(0.5-2L)。纯化的蛋白是通过确定由于Trp和Tyr残基在A280nm的消光系数进行定量。然后与OPG野生型蛋白相比,通过如上所述的ELISA的方法在等当量浓度检测OVP。在通常从0.5μM到0.031μM浓度范围的成对稀释系列对该蛋白质的结合进行检测。大多数单体形式的该蛋白表现出与RANKL的结合的保持在或接近于野生型的OPG,而在TRAIL结合信号方面大幅度减少。图2中示出了来自这样的ELISA的实例。具有需要的结合特性谱的变异体是从所有的选择方案中产生的。
实施例6:重复核糖体展示和选择过程
接下来进行多轮核糖体显示和选择以进一步改进部分所述最好的候选OVP。为了达到这个目的,将用于这些OVP的基因克隆入pEGX载体中,如上所述进行突变和展示,其中改变在选择中使用的可溶性抗原的摩尔量以迫使选择压力朝向进一步减少TRAIL结合和保持RANKL结合。如上所述实施筛选最好的变异体,其中进一步分离的突变体具有改进的希望性质。图3示出了来自各轮选择的最好核糖体显示-选择的OVP的序列。在许多所选变异体中观察到在Cys107-Cys118环中的在aa115处的突变,如在aa102-130包围的区域附近的氨基酸中的多个突变。这表明,这个区域并且尤其是在aa 115对于TRAIL结合很重要,并且这里可容忍一些变化同时不丧失RANKL结合。
实施例7:定点突变
证实对改变改变OPG特异性有益的通过核糖体显示选择精确定位的突变位置进一步通过在这些位点的定点突变进行研究。另外的氨基酸变化在残基115、122和128处进行取样,并且将L40S突变与这些位点处的一些突变加以联合。设计编码特定突变残基的正向和反向引物,允许带有互补悬突区域的突变OVP基因的前后片段进行PCR扩增。在起始的10个循环,在没有引物的情况下,利用PCR以通过相互启动将两个DNA片段连接起来,接着的30个循环用侧悬5’和3’引物来扩增带有用于克隆的限制性位点的全长突变基因。
采用哺乳动物表达系统以允许产生更高水平的更加生物学相关地稳定的二聚体形式的蛋白,用于进一步的ELISA和基于细胞的分析测定。将定点突变和最好的核糖体显示-选择的候选OVP(1-94)基因(残基1-21构成信号肽)克隆入哺乳动物表达载体pAPEX-3.Fc中。这就使作为具有人类Fc结构域的融合体的OVP可以形成稳定的二聚体。还增加了一个C-端FLAG标签。用HEK 293EBNA细胞进行表达。这些粘附细胞在补充了2mM的Glutamax(Invitrogen)、10%小牛血清、和200μg/mL的遗传霉素的DMEM培养基中培养传代并在5%CO2、37℃下孵育。为了利用lipofectamin(Invitrogen)的临时转染,收集接近-铺满的细胞并且利用5×106个细胞接种到10cm组织培养皿至10mL的体积。允许细胞粘附和生长24h。将24mg包含感兴趣的OVP的pAPEX-3.Fc质粒DNA与1.5mL的DMEM混合。将60μl的lipofectamine在1.5mL的DMEM中稀释并且在室温下孵育5分钟。稀释的DNA和lipofectamine混合,并在室温下孵育20分钟,然后逐滴加入到培养皿中。在过夜生长后,收集来自一个培养皿总细胞并且用来接种到25-30mL的T175培养皿中。一旦细胞已达到接近铺满(1-2天),则将含血清的DMEM培养基用25-30mL的补加了4mM Glutamax的Ex-cell 293T无血清培养基(JRH Biosciences)替代。3-4天以后,收集该培养基,离心,并通过0.22μm注射过滤器进行过滤。
为了纯化分泌到培养基中的蛋白,将上清液施加到用PBS平衡的1mL的蛋白A(Sigma)树脂。通过它们的Fc部分结合至蛋白A的蛋白质,用0.1MGly在pH 3情况下进行洗脱并且这A280nm处进行监测。洗脱物通过针对PBS的即时透析进行中和。将透析的蛋白浓缩到0.5mL并且用Superdex 200柱进行凝胶过滤层析。收集对应于OVP-Fc二聚体的主峰并且利用抗-FLAG抗体通过蛋白质印迹和揭示带有信号肽的OPG已经被处理的N-末端测序进行确认。凝胶过滤纯化的OVP的离子交换层析洗脱了一个蛋白峰,其表明同种性。
实施例8:筛选定点突变的OVP突变体
纯化的哺乳动物表达的OVP蛋白通过ELISA检测它们与RANKL和TRAIL的结合。孔在4℃用在PBS O/N中的5g/mL的RANKL和10g/mL的TRAIL进行包被,用PBS漂洗,在室温下用在PBS溶液中的0.5%的酪蛋白封闭2小时,然后再用PBS漂洗。将待检测的OVP的浓度标准化为约10nM,然后将50μL以系列成对稀释液施加到超过6-7个孔的抗原包被的孔中达1小时。所有稀释液都在0.25%的酪蛋白中制备。在结合孵育之间的所有洗涤都是3次用PBS/0.05%吐温,然后3次用PBS。结合的OVP的检测通过用50μL的1.2mg/mL抗-FLAG孵育20min,然后用50μL的1∶1500的羊抗-小鼠-过氧化酶轭合物(BioRad)孵育20分钟而实现。TMB被用作酶底物,然后在A450nm处检测结合的信号。所有的OVP和OPG wt都以C-末端Fc-连接形式加以检测。图4A和4B中示出了来自这样的ELISA(比较了多种OVP与OPG(22-194)野生型的结合)的结果的示例。该数据显示,OPG(22-194)wt与RANKL和TRAIL都结合,而大多数OVP保持与野生型蛋白相同或接近的RANKL结合水平。与wt(野生型)相比,所有这里检测的OVP显示出至少一部分减少的与TRAIL结合,其中核糖体显示选择1R17(I115M),以及在115-115D、115G和115R的定点突变,表现出非常低水平的TRAIL结合。为了能够进行在ELISA中的OVP的相对结合的近似比较,在表1中总结了来自该数据的EC50值。EC50值是在通过OVP剂量对对数刻度上的结合反应进行绘图来估计的,其中当数据达不到EC50范围时,应用外推法。部分OVP表现出与RANKL结合的轻微增加,然而在一些RANKL结合中减少达到3倍。
实施例9:在TRAIL-诱导的HCT116细胞凋亡的试验分析中的OVP的生物学检测
在ELISA中观察到的OVP的TRAIL-结合活性的减小进一步在这些OVP存在的情况下,在TRAIL-诱导的HCT116细胞凋亡试验分析中进行检测。细胞在37℃、5%CO2下,在含10%胎牛血清(FCS)和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中进行培养。将HCT116细胞以在1ml DMEM+FCS中的7.5×104个细胞/孔铺放在12孔板中并且允许附着和生长24h。然后去除生长介质并用500μL的新鲜介质在37℃替代1小时。OVP或重组人OPGFc(R&D Systems)以0.56、1.69、5.6和11.2nM添加并且在37℃将这些细胞继续孵育15分钟,然后将重组人类TRAIL(R&D Systems)添加至10ng/ml(0.53nM)。然后在收集以计算每孔中凋亡细胞的百分比之前,将这些细胞在37℃孵育16小时。在TRAIL不存在的情况下检测OVP的最大剂量,用于对细胞的毒性。收集所有细胞(附着和漂浮的)并且重悬在20μL的1mg/ml碘化丙啶(PI)、0.1%Triton X-100、0.1%醋酸钠的PBS溶液中。在PI染色以后,利用荧光显微镜通过评价核的形态来评定凋亡,其中如果显示有以下中的一种或多种:核边缘化、染色质凝聚或形成凋亡体,则将细胞评定为凋亡。为避免偏差,样品是在不知道给予它什么处理的情况下进行评价的。图5A和5B中示出了这样的试验的例子。图5A示出了野生型OPG蛋白的作用,其中在OPG剂量为5.6nM下,表现出TRAIL-诱导凋亡的细胞的比例从高于约70%减少到10%以下。OPG(22-194).Fc与全长的OPGFc(R&D systems)分子看起来一样有效,而N-端连接-Fc形式的野生型蛋白是较低有效的。图5B示出的所有OVP具有很少或没有抑制TRAIL诱导凋亡的能力。即使在比这里示出的高4倍的剂量,利用这些选择的OVP看起来具有可忽略的TRAIL抑制活性。
实施例10:在RANKL-介导的RAW264.7细胞分化的试验分析中的OVP的生物学检测
鼠类白血病病毒-诱导的肿瘤单核细胞系RAW264.7在RANKL刺激下分化为破骨细胞。为了进一步检测OVP结合RANKL和抑制其通过与RANK结合介导的生物学作用的能力,在OVP存在的情况下进行RANKL-介导的RAW264.7细胞的分化的试验分析。在37℃、5%CO2下,将RAW264.7细胞在含5%FCS和1%青霉素-链霉素的DMEM中进行培养。将RAW264.7细胞(3×103个细胞/孔)接种在100μL DMEM和5%FCS中的96孔板中,并且允许生长24小时。在每个孔中加入另外的100μL的含15ng/mL(0.75nM)人类RANKL(Roche)和从0到0.5nM的OVP的介质,并将细胞再培养3天。破骨细胞的形成是通过测量抗酒石酸盐酸性磷酸酶活性来评价的。将细胞固定,干燥并且加入100μL 50mM的柠檬酸盐缓冲液pH4.6、10mM酒石酸盐、1mg/mL对硝基苯基磷酸盐以检测TRAP活性。孵育30分钟以后,停止反应并在405nm测量吸光度。图6A示出了这样的测定分析。在0.4nM的剂量下,示出的所有OVP都能够抑制由0.75nM RANKL诱导的RAW264.7细胞的破骨细胞分化。图6B也示出了涉及通过在aa 115处的定点突变产生的OVP的这样的测定分析。在这个低剂量的窄范围内,尽管这些蛋白都显示基本上丧失抑制TRAIL-诱导的凋亡的能力,但我们可观察到RANKL-结合活性的差别(图5B)。应该注意,一些变异体在这个测定分析中表现出的活性等同于或更好于OPG。另一方面,表现出在结合RANKL方面相对适度减弱的一些变异体(表1)表现出显著降低的抑制RANKL介导的破骨细胞激活的能力。
实施例11:在巨细胞瘤破骨细胞再吸收测定分析中的OVP的生物学检测
巨细胞瘤破骨细胞再吸收测定分析也被用作一种检测结合RANKL的OVP的生物学作用的手段。这是一个通过测量在牙质薄片中的再吸收点形成水平的用于RANKL-介导的破骨细胞形成的测定分析(Atkins et al.,Bone 28:370-37(2001))。这个试验可以用于显示OPG-介导的这种作用的抑制。再吸收点的数量和再吸收面积都可以进行定量。图7中示出了检测多个OVP的这种测定分析的示例。所有的构建体都显示出抑制,其中OPG wt为约55%的抑制,并且最好的OVP(R23(I115M,L40S))表现出75%的抑制。
实施例12:OVP生物学检测的结论
图8示出了通过核糖体显示选择分离的所选OVP的序列。表1中示出了在这些OVP和通过定点突变产生的其它OVP上进行的结合研究的结果。
在表1中示出的数据很明显,在残基位置115处的替代对于OVP结合TRAIL的能力有重要影响。尤其是,在这个位置的诸如Met、Gly、Asn、Asp和Glu的残基的替代导致与TRAIL结合的大幅度减少,而没有显著影响与RANKL的结合。而且,利用这些取代产生的OVP中没有任何一个在TRAIL-诱导的肿瘤细胞凋亡的试验中表现出任何活性。
在残基122处的突变也对OVP与TRAIL结合有影响。例如,双重突变株1I115M,R122N和I115M,R122E表现出对于TRAIL的结合亲和力的大幅度减小。
在残基128处的突变也对OVP与TRAIL结合有影响。例如,双重突变株1I115M,F128L和I115M,F128I表现出对于TRAIL的结合亲和力的大幅度减小。
双重突变株I115M,L40S导致了RANKL-介导的破骨细胞形成的75%的抑制,其突出了在残基40处的突变的重要性。
表2中提供了在基于细胞的试验中的所选OVP的生物活性的总结。
实施例13:OPG/OPV的三维结构模型化
OPG被归类为蛋白质的TNF-受体超家族的成员。其成员最显著的特征是大约40个氨基酸(富半胱氨酸结构域)的多个重复,其参与配体结合。已知的配体包括结构同源的TRAIL和RANKL蛋白。
没有公开单独的OPG或者与其配体RANKL或TRAIL的组合的三维结构。因此,建立了在OPG的氨基末端片段中的两个富半胱氨酸结构域的结构模型,用于研究在优选OVP中包含的突变的可能作用。
根据Brookhaven蛋白结构数据库(PDB)的BLAST检索,选择了TNF-受体相关蛋白的三个相近同源物,其三维结构已被确定,即在pdb file 1SG1(在神经生长因子和公共神经营养受体p75之间的受体-配体复合物)中的多肽和来自file 1D4V和1DU3的死亡受体5结构。另外,增加一个来自音锉1D0G的结构。TNF-受体超家族成员DR5(一个TRAIL受体蛋白)以络合于TRAIL三聚体的这种结构表示,其可用于OPG配体复合物的模型的设计。利用InsightII软件包(Molecular Simulations Inc.)中的模组Modeller来实施模型化。1SG1X链的结构被进一步分为N-端和C-端结构域,并且该两个结构域分别与剩余模板对齐,两个结构域均表现出与OPG的同原性。与其它三个模板相比较,蛋白中似乎存在一个铰链区,其允许C-端结构域被替代。对用作选择试验起点的野生型OPG片段以及大量所选OVP序列产生50个模型。根据来自Modeller的分数对模型进行了排序,并且排在前10的模型与1D0G结构中的DR5对比。这个结构中的TRAIL组分的受体接触区域又用于模拟在RANKL上的受体的可能的接触结构,其中利用小鼠RANKL(pdbfile IJTZ)的确定结构。这个过程允许在结合TRAIL和RANKL结构时进行模拟的OPG的比较。对分别利用TRAIL或RANKL的OPG的复合物(以其模拟结构)的所得模型的分别与空间接触和可能的结合相互作用进行研究。
我们的OPG蛋白模型表明,与RANKL和TRAIL的结合可利用在类似TNF-受体-配体相互作用(Hymowitz et al.,Mol.Cell4:563-571(1999);He et al.,Science 304:870-875(2004)中发现的广泛界面来进行。如根据我们的模型所预测的,OPG的两个TNF-受体类结构域似乎参与了与RANKL和TRAIL的结合(见图9到图12),N-端结构域具有在残基42到92的区域内的接触,并且C-端结构域具有在残基107到154的区域内的接触。检测到了两个看起来尤其重要的子区域一107-118和120-142。与OPG接触的N-端结构域在RANKL和TRAIL之间看起来类似,因此在这个区域中的突变将更有可能导致产生对两个结合相互作用的作用。这与本文中报道的选择实验结果是一致的,因为这个区域不是一个在选择用于减少对TRAIL结合而不是对RANKL结合的OVP中发现经常突变的区域。
在残基124到142之间的二硫键附近好像有一个铰链,允许C-端结构域可以弯曲远离配体从而限制相互作用,或者可以朝向该配体弯曲以形成更多的相互作用。在研究的两个配体TRAIL和RANKL之间的构象中存在进一步的差别。TRAIL中的残基Glu195到Asn202,尤其是Asn199、Thr200和Lys201突出形成一个朝向OPG结合位点的环区,有可能在OPG中的残基Leu119到Arg143的区域内接触OPG,其中最有可能接触残基Lys120、His121、Arg122、Cys124、Pro125、Pro126、Gly127、Phe128、Cys141和Lys142。
然而,这个区域的准确定位似乎由在突出环N-端到铰链区内的接触(其被包围在Cys107到Cys118之间)另外指导。在这个环内,Glu116和Phe117看起来能够形成多组在至少两个取向上的有利相互作用。在相邻残基Ile115(例如I115G或I115E)上的突变似乎偏向于一个取向,其可以移动至一个更加开放的位置,从而减弱C-端接触对TRAIL的195-202环的相互作用同时保持对RANKL的相互作用。然而,在这些研究中发现,在残基115处的一些变化破坏与RANKL的结合以及与TRAIL的结合。这些变化是其中取代的氨基酸具有带有正电荷或负电荷的更大侧链。这表明,残基115也参与与RANKL的接触或者对这个残基破坏重要的接触的不利变化,其由相邻残基如116形成。
在区域120-142内的变化的模型化表明,在这个区域中的多个残基的任何一个的变化可能特定地影响其与TRAIL的结合,并且在研究的OVP中已经检测到多种这样的变化。
在N-端结合区域中,OPG的残基42-92形成一个用于RANKL和TRAIL的较宽接触区。在这个界面中两个配体结构似乎类似。由于这个区域不是其中的突变导致在本文描述的研究工作中观察到的与TRAIL结合的丧失的区域,所以我们推断,在这个区域中的残基实际上对与TRAIL的结合的贡献更弱,或者在这个区域中的突变平行地影响与TRAIL和RANKL的结合,以致在我们的筛选方法过程中没有选择这个区域的变化。但是,由在这个或附近区域的突变所致的微小构象变化可能改变有利于其RANKL-介导的作用的分子的性质,与上文中由残基115的突变所致的构象转变所表明的一样。尤其感兴趣的是在研究的OVP中确定的在残基40上的变化。因为这个残基位于这个接触区域的附近,邻近残基中的变化可能会微小影响这个环的形状,从而在TRAIL连接的基础上优先偏向于与TRAIL结合。形状上的这种微小转变可通过在可以影响这个结构域的折叠的其它OPG残基中的突变而实现。
以上引用的所有参考文献均将其全部内容通过引用方式并入本文中。
已被包括在本发明的说明书中的文献、条例、材料、装置、制品等的任何论述仅用于为本发明提供上下文内容的目的。其不应看作是承认任何或所有这些内容形成如同其已在本申请每一权利要求的优先权日之前存在的本发明相关领域的现有技术基础或公共常识。
本领域的普通技术人员应该理解,在不背离如较宽描述的本发明的精神和范围的前提下,可以对如具体的实施方式所示出的本发明进行多种变化和/或更改。因此,本发明的具体实施方式应被认为是说明性的而不是限制性的。
表1:OVP结合研究
#通过外推法结合增加=较低的EC50;()结合减少=更高EC50
  变异体 RANKL倍数变化cf wt   TRAIL倍数变化cf wt
  I115V   1.5   (4)
  I115L   1.75   (4.3)
  I115M   1.2   (25)
  I115W   (1.4)   (5)
  I115A   2.25   (2.5)
  I115G   21   (>125#)
  I115N   (1.1)   (390#)
  I115S   (1.4)   (3.1)
  I115R   (2.3)   (50#)
  I115K   (60)   没有结合
  I115Y   1.1   (3)
  I115D   1.5   (>125)
  I115E   (2.25)   (>250)
  N102D   1.1   (1)
  I115M,L40S   1.1   (>250)
  I115M,N139D   (1.75)   (60)
  I115T,K51R   (1.75)   (0.8)
  I115M+:
  R122G   1   (12.5)
  R122N   (1.1)   (>250)
  R122Q   2.5   (3)
  R122S   1.5   (3.5)
  R122D   (6)   (23)
  R122E   (1.2)   (>250)
  I115M+:
  F128L   1.2   (250#)
  F128A   1.2   (2)
  F128S   1   (50)
  F128T   (3.3)   (7)
  F128I   (21)   (250#)
  I115T,K51R,R111H   1.5   (7.5)
  I115T,K51R,S167G   1.5   (15)
表2:在基于细胞的测定分析中的生物学活性的总结
*-抑制TRAIL-诱导的凋亡的最小能力
+++++抑制TRAIL-诱导的凋亡的最大能力
序列表
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600011
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600021
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600031
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600041
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600051
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600071
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600081
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600091
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600121
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600131
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600141
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600151
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600161
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600171
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600181
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600191
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600201
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600211
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600221
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600231
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600251
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600261
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600271
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600301
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600311
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600321
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600341
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Figure DEST_PATH_IDA00002482531600361
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600371
Figure DEST_PATH_IDA00002482531600381

Claims (37)

1.一种与野生型OPG相比包括至少一个修饰的OPG变异蛋白,其中,与野生型OPG相比,所述OPG变异蛋白保持对于RANKL的结合亲和力,但是表现出减小的对于TRAIL的结合亲和力。
2.根据权利要求1所述的OPG变异蛋白,其包括在由氨基酸残基102-130包围的区域中的至少一个修饰。
3.根据权利要求2所述的OPG变异蛋白,其包括在残基位置102、111、115、122、128或130处的至少一个氨基酸替代。
4.根据权利要求2所述的OPG变异蛋白,其包括在包含残基107-118的环结构中的至少一个修饰。
5.根据权利要求4所述的OPG变异蛋白,其包括在位置115处的修饰。
6.根据权利要求5所述的OPG变异蛋白,其中,在位置115处的Ile被Thr、Met、Val、Asp、Gly、Ser或Arg替代。
7.根据权利要求2所述的OPG变异蛋白,其包括在残基122处的修饰。
8.根据权利要求7所述的OPG变异蛋白,其中,在位置122处的Arg被Gly、Gln、Ser、Asn或Glu替代。
9.根据权利要求2所述的OPG变异蛋白,其包括在位置128处的修饰。
10.根据权利要求9所述的OPG变异蛋白,其中,在位置128处的Phe被Val、Ala、Leu、Ile或Ser替代。
11.根据权利要求2所述的OPG变异蛋白,其包括在残基130处的修饰。
12.根据权利要求11所述的OPG变异蛋白,其中,在位置130处的Val被Glu或Ala替代。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的OPG变异蛋白,其包括至少两个修饰。
14.根据权利要求13所述的OPG变异蛋白,其包括在由残基122-130包围的区域中的至少两个修饰。
15.根据权利要求14所述的OPG变异蛋白,其包括选自由以下构成的组中的至少两个修饰:
(i)R122N和I115M;
(ii)R122N和I115M;
(iii)F128S和I115M;
(iv)F128I和I115M;和
(v)F128L和I115M。
16.根据权利要求13所述的OPG变异蛋白,其包括在由残基122-130包围的区域中的至少一个修饰和在这个区域外的至少一个另外的修饰。
17.根据权利要求16所述的OPG变异蛋白,其中,所述另外的修饰发生在残基31、40、51、100、155、167或168中的任何一个或多个上。
18.根据权利要求16所述的OPG变异蛋白,其中,所述另外的修饰发生在残基Gln21、Glu22、Thr23、Phe24、Pro25、Pro26、Lys27、Tyr28、Leu29、His30、Tyr31、Asp32、Glu33、Glu34、Thr35、Ser36、His37、Gln38、Asp42、Lys43、Pro45、Pro46、Thr48、Lys51、Gln52、His53、Cys54、Thr55、Ala56、Lys57、Trp58、Lys59、Thr60、Val61、Ala63、Pro64、Pro66、Asp67、His68、Tyr69、Asp72、Ser73、Trp74、Thr76、Ser77、Asp78、Glu79、Leu81、Tyr82、Ser84、Pro85、Val86、Lys88、Glu89、Leu90、Tyr92、Val93、Lys94、Gln95、Glu96、Asn98、Arg99、Thr100、His101、Val131、Gln132、Ala133、Gly134、Thr135、Pro136、Glu137、Arg138、Val141、Lys143、Arg144、Cys145、Pro146、Asp147、Gly148、Phe149、Phe150、Ser151、Asn152、Glu153、Thr154、Ser155、Ser156、Lys157、Ala158、Pro159、Cys160、Arg161、Lys162、His163、Thr164、Asn165、Cys166、Ser167、Val168、Phe169、Gly170、Leu171、Leu172、Leu173、Thr174、Gln175、Lys176、Gly177、Asn178、Ala179、Thr180、His181、Asp182、Asn183、Ile184、Cys185、Ser186、Gly187、Asn188、Ser189、Glu190、Ser191、Thr192、Gln193、Lys194、Cys195、Gly196、Ile197、Asp198、Val199、Thr200或Leu201中的任何一个或多个上。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的OPG变异蛋白,其包括在表1中示出的修饰中的任何一个或多个。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的OPG变异蛋白,其表现出的对于RANKL的结合亲和力至少为野生型OPG的80%。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的OPG变异蛋白,其在实施例8中描述的试验条件下对于RANKL具有小于1nM的EC50(nM)。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的OPG变异蛋白,其对于TRAIL表现出的结合亲和力为低于野生型OPG的20%。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的OPG变异蛋白,其在实施例8中描述的试验条件下对于TRAIL具有大于10nM的EC50(nM)。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的OPG变异蛋白,其中,所述OPG变异蛋白结合于多肽。
25.根据权利要求24所述的OPG变异蛋白,其中,所述多肽是免疫球蛋白恒定区。
26.一种包括根据权利要求1至25中任一项所述的至少两个OPG变异蛋白的二聚体或多聚体。
27.一种分离的编码根据权利要求1至25中任一项所述的OPG变异蛋白的多核苷酸。
28.一种用于减小OPG对于TRAIL的结合亲和力的方法,所述方法包括修饰OPG蛋白或其片段中的至少一个氨基酸以产生OPG变异蛋白,以及检测所述OPG变异蛋白对于TRAIL的结合亲和力。
29.根据权利要求28所述的方法,包括修饰在由野生型OPG的残基102-130包围的区域中的至少一个氨基酸以产生OPG变异蛋白,以及检测所述OPG变异蛋白对于TRAIL的结合亲和力。
30.一种用于抑制或减少RANK与RANKL结合的组合物,所述组合物包含根据权利要求1至26中任一项所述的OPG变异蛋白,以及一种或多种可接受的载体。
31.一种用于抑制或减少RANK与RANKL结合的方法,所述方法包括使RANKL分子暴露于根据权利要求1至26中任一项所述的OPG变异蛋白。
32.一种用于抑制或减少细胞中通过RANK与RANKL的相互作用所介导的生物学作用的方法,所述方法包括使所述细胞暴露于根据权利要求1至26中任一项所述的OPG变异蛋白。
33.一种用于抑制或减少受治者通过RANK和RANKL的相互作用所介导的生物学作用的方法,所述方法包括给予受治者根据权利要求1至26中任一项所述的OPG变异蛋白。
34.一种用于治疗或预防受治者的自身免疫或免疫介导的炎性疾病的方法,所述方法包括给予受治者根据权利要求1至26中任一项所述的OPG变异蛋白。
35.一种用于治疗或预防受治者的心血管疾病的方法,所述方法包括给予受治者根据权利要求1至26中任一项所述的OPG变异蛋白。
36.一种用于通过RANKL来抑制或减少破骨细胞的分化、活化和/或存活的方法,所述方法包括使含有破骨细胞或破骨细胞前体的组织暴露于根据权利要求1至26中任一项所述的OPG变异蛋白。
37.一种用于通过RANKL来抑制或减少受治者的破骨细胞的分化、活化和/或存活的方法,所述方法包括给予受治者根据权利要求1至26中任一项所述的OPG变异蛋白。
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