CN101289512A - 高水平表达活性淋巴毒素-β受体免疫球蛋白嵌合蛋白的方法以及它们的纯化方法 - Google Patents

高水平表达活性淋巴毒素-β受体免疫球蛋白嵌合蛋白的方法以及它们的纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及通过在低温下在培养系统中培养编码期望融合体的DNA转化的宿主，从而使错折叠或错桥接蛋白质形式最小化的对于其配体具有高亲和性的蛋白质－免疫球蛋白融合体形式的高产率表达的方法。所述宿主细胞可以是转化的哺乳动物，昆虫，酵母或细菌细胞。所述蛋白质－免疫球蛋白融合体可以包括TNF或TNF－受体家族的一员，例如淋巴毒素－β或淋巴毒素－β受体。本发明还涉及含有所述蛋白质－免疫球蛋白融合体的药物组合物。

Description

高水平表达活性淋巴毒素-β受体免疫球蛋白嵌合蛋白的方法以及它们的纯化方法
本申请是申请日为1999年12月16日、申请号为99815695.7、发明名称为“高水平表达活性淋巴毒素-β受体免疫球蛋白嵌合蛋白的方法以及它们的纯化方法”的发明专利申请的分案申请。
背景
TNF家族由称之为TNF家族配体和TNF家族受体的配体和它们的特异受体对组成(Bazzoni和Beutler，1996；Aggarwal和Natarajan，1996)。象TNF这样的配体一般发现是细胞表面上的膜结合形式，或者在某些情况下它们从细胞表面选择性裂解并分泌出来。配体与特异受体结合并且这种结合作用使得两个或多个受体聚集。这些受体的胞内区域可以以某种方式感觉这种变化并且将该信息通过信号转导机制发送给细胞内。免疫系统以及可能其它非免疫系统的调节中涉及该家族。所述调节经常以“主开关”水平，使得TNF家族信号可以导致大量的继发TNF最佳代表的作用。TNF可以引发生物体对外来侵袭的一般保护性炎症反应，其涉及细胞运输中涉及的附着分子的改变的表现，驱动特异细胞进入特异区室的趋化因子产生和各种效应细胞的引导。因此，这些途径的调节具有临床潜力。
TNF受体家族是一般由胞外结构域，跨膜结构域和胞内信号结构域组成的相关蛋白质的集合。胞外结构域由紧密二硫键结构域的2-6个拷贝构成，并且在半胱氨酸的独特排列的基础上被识别(Banner等，1993)。各个受体结合相应的配体，但是一个配体可以结合几个受体。在某些情况下，天然存在没有跨膜结构域和/或胞内结构域的可溶形式的受体这一点是清楚的。自然中，这些受体的平截本可以具有直接的生物调节作用。osteoprotegerin系统提供该方法的实施例。Osteoprotegerin是一种分泌的TNF家族受体，其阻断引发破骨细胞活化的由RANK-L(也称之为TRANCE)和/或TRAIL至受体的信号。通过阻断这些受体，大多数可能的RANK受体，骨吸收受到阻碍并且骨质增加(Bucay等，1998)。很清楚，病毒利用了该方法来在它们的宿主生物体中抑制TNF活性(Smith等，1994)。这些受体可以对很多作用发出信号，包括细胞分化，细胞死亡或细胞成活信号。细胞死亡信号在Fas和TNF受体的情况下经常通过与caspase蛋白水解酶的级联相对直接连接而引发。
TNF受体是解释生物学途径的有力工具，因为它们容易转化为具有长血清半寿期的免疫球蛋白融合蛋白。二聚体可溶受体形式可以是天然分泌的或表面结合的配体介导作用的抑制剂。通过与这些配体结合，这些融合蛋白阻止该配体与细胞相关的受体相互作用并且抑制相关的信号。这些受体-Ig融合蛋白在实验意义上是有用的，并且也成功地在临床上使用，例如TNF-R-Ig已经被用来治疗肠炎，类风湿性关节炎和伴随OKT3给药的急性临床综合症(Eason等，1996；Feldmann等，1997；van Dullemen等，1995)。由TNF家族受体传递信号的很多作用的操作可以在治疗以免疫为基础的疾病以及宽范围的具有由于涉及免疫系统的病理后遗症的人疾病中应用。例如最近描述的一种可溶形式的受体，osteoprotegerin，已经证明阻断骨质的损失(Simmonet等，1997)。因此，TNF家族受体传递信号控制的作用比必要限制免疫系统调节。针对受体的抗体可以阻断配体结合并且因此也具有临床用途。这样的抗体寿命经常非常长，并且具有超过可溶性受体-Ig融合蛋白的优点，可溶性受体-Ig融合蛋白在血液中具有更短的半寿期。
抑制受体介导的途径代表这些受体的最辉煌的治疗应用，最初是TNF受体的激活表现出有临床前景(Aggarwal和Natarajan，1996)。TNF受体的激活可以引发靶细胞中细胞死亡，并且因此对肿瘤的应用还是具有吸引力的(Eggermont等，1996)。通过给与受体，即自然途径，或者通过给与可以与所述受体交联的抗体，都可以激活该受体。抗体对于治疗例如癌症，可能是有利的，因为抗体与配体相反可以在血液中保持长时间，而配体在血液中具有短的寿命。拮抗抗体是治疗癌症的有力武器，因为在肿瘤中受体可以更具有选择性地被表达，或者它们在肿瘤中只对细胞死亡或分化发出信号，同样，通过TNF家族受体介导很多正免疫学作用，例如宿主炎症反应，抗体产生等，因此拮抗剂抗体在其它非癌症应用中具有有益效果。
反常规地，一个途径的抑制在治疗肿瘤中也可以具有临床利益。例如，一些肿瘤表达Fas配体，并且该表达可以导致Fas阳性淋巴细胞的死亡，这样有利于肿瘤避开免疫系统的能力。在这种情况下，Fas系统的抑制然后使得免疫系统以现在有可能评价的其它途径与肿瘤反应(Green和Ware，1997)。
该受体家族中的一员，淋巴毒素-β受体(LTβR)结合表面淋巴毒素(LT)，而表面淋巴毒素由淋巴毒素-α和β链的三聚体复合物构成(Crowe等，1994)。在外周免疫系统的发育和成熟免疫系统中淋巴结和脾中作用的调节中涉及这种受体-配体对(Ware等，1995；Mackay等，1997；Rennert等，1996；Rennert等，1997；Chaplin和Fu，1998)。LTβR和IgG之间可以形成淋巴毒素-β受体-免疫球蛋白融合蛋白(LTβR-Ig)，其阻断表面LT配体和受体之间传递信号，并且对小结树突细胞的功能状态有影响(Mackay和Browning1998)。这种阻断在啮齿类动物模型中还能导致减少的自身免疫疾病(Mackay等，1998，1995年7月21日申请的U.S.S.N.08/505606和1996年10月26日申请的U.S.S.N.60/029060)。该受体家族的第二个成员称之为疱疹病毒进入介体的HVEM，其结合称之为Light的配体(Mauri等，1998)以及herteromeric LT配体。目前不知道该受体的功能，但是HVEM-Ig融合蛋白可以用于免疫疾病的治疗，并且已经证明该构建体体外影响免疫功能测定(Harrop，J.A.，等，1998)。
尽管如上所述TNF家族成员具有临床上的进步，但是仍然有对于获得期望产率的适合在临床条件下使用的受体Ig融合体的方法的需要。例如，当在猴COS细胞或者在中国仓鼠卵巢细胞中表达时，LTβR-Ig蛋白可以变成两种形式。一种形式以高亲和性结合配体而另一种则不是这样。因此，有对于产生更高产率的以高亲和性结合的形式同时使较低亲和性形式的存在最小化的方法的需要。
发明概述
本发明涉及通过在低温下在培养系统中培养编码期望的融合体的DNA转化的宿主从而使错折叠或错桥接蛋白形式的量最小化的具有结合其配体的高亲和性的蛋白质-Ig融合体形式，本文称为“活性”形式的高产率表达方法。在各种实施方案中，本发明涉及通过在大约27℃至大约35℃的温度下培养转化宿主而在哺乳动物表达系统中表达高产率的方法。优选地，在大约27℃至大约32℃的温度下培养哺乳动物宿主。
在其它实施方案中，本发明涉及在低温下在酵母表达系统中通过培养转化宿主表达高产率活性融合蛋白的方法。当在酵母中表达期望的蛋白质时，优选的温度是大约10℃至大约25℃，更优选大约15℃至大约20℃。
在权利要求保护的本发明一些方法中，蛋白质-Ig融合体包括TNF受体家族的一员，例如淋巴毒素-β受体或者其片段。或者，权利要求保护的方法可以包括在低温度下在任何表达系统例如昆虫或细菌系统中表达期望的融合蛋白。
在其它实施方案中，权利要求保护的本发明包括通过权利要求保护的方法获得的活性蛋白质-Ig融合体，含有它们的药物组合物。在另外的实施方案中，本发明涉及制备药物制剂的方法，包括在大约27℃至大约35℃，优选大约27℃至大约32℃的低温下在培养系统中培养编码期望的蛋白质-Ig融合体的DNA转化的宿主，高产率表达活性融合蛋白，从培养系统回收活性蛋白质融合体，并且将回收的活性融合蛋白与药学可接受载体组合。在优选的实施方案中，所述蛋白质-Ig融合体包括淋巴毒素-β或者其片段，或HVEM，或者其片段。
在其它实施方案中，权利要求保护的本发明涉及应用描述的方法获得的药物组合物。
权利要求保护的本发明在不同的实施方案中涉及哺乳动物表达系统，以及其它表达系统，例如酵母，细菌系统，或昆虫系统。
在一些实施方案中，本发明涉及通过在大约10℃至大约25℃，更优选大约15℃至大约20℃的低温下培养而在酵母中高水平表达活性融合蛋白的方法。也涉及通过在酵母中该表达方法获得的活性融合体，和含有这些活性融合体的药物组合物。本发明中涉及的制备含有活性蛋白质-Ig融合体的药物制剂的方法包括在低温下，优选大约10℃至大约25℃，更优选大约15℃至大约20℃下，培养编码期望的融合体的DNA转化的酵母细胞。在本发明所有的组合物和方法的最优选的实施方案中，蛋白质-Ig融合体包括淋巴毒素-β受体，HVEM或者其片段。
附图的简要描述
图1：受体-免疫球蛋白嵌合蛋白的图示。左图表示典型的IgG分子的图，Fc结构域以黑色表示，重链可变区为灰色，轻链是白色。中图是包括胞内(深灰色)和胞外(浅灰色)结构域的LTβR分子的示意图。右图是LTβR-Ig融合蛋白的示意图。
图2：概念性图示表示死亡的LTβR-Ig形式中可能的缺陷，尽管没有鉴定实际错折叠或错桥接的氨基酸。
图3：用PNGase F处理之前和之后人LTβR-Ig的SDS-PAGE分析。第1和2泳道含有使用蛋白质A亲和性色谱从37℃下生长的CHO细胞培养上清液中纯化的人LTβR-Ig。第3泳道表示用PNGase F处理去除所有的N-交联寡糖之后的相同的制剂。第1泳道是在非还原条件下展开的，第2和3泳道是在还原条件下展开的。通过用考马斯亮蓝将凝胶染色使蛋白质泳带可以目测。
图4：是通过AGH1亲和柱泳道流出的蛋白质和用pH3.5磷酸缓冲液洗脱的蛋白质的非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶分析。该凝胶右侧的泳道表示亲和纯化之前的该蛋白质。通过用考马斯亮蓝将凝胶染色使蛋白质泳带可以目测。
图5：来自AGH1亲和柱的流过(下)和洗脱(上)级分结合表面淋巴毒素的能力。从所述FACS分析得到平均荧光强度。右侧表示FACS曲线的实施例，其中LTβR-Ig与对照LFA-3-Ig蛋白质的结合相比较。
图6：使用POROS醚柱和递减的硫酸铵梯度的人LTβR-Ig的分析HIC色谱。第1峰代表人LTβR-Ig的下面的失活形式，第2峰代表人LTβR-Ig的较大的活性形式。分别集中相应于第1和2峰的级分并且在4-20％SDS-PAGE凝胶上分析(插入的一组)。标记“1”的泳道含有来自HIC层析谱第1峰的“失活”材料，第2泳道是来自HIC层析谱第2峰的“活性”材料。起始材料在泳道“L”中给出。标记“M”的泳道含有分子量标记物。图7：使用Pharmacia Source15PHE柱的人LTβR-Ig的制备HIC(疏水相互作用层析)。用5M NaCl将含有人LTβR-Ig的蛋白质A洗脱液调节至1.5MNaCl，20mM磷酸钠，pH7.0的终浓度，并且加载到柱子上。用5体积的1.5MNaCl，20mM磷酸钠，pH7.0冲洗柱子并且用20mM磷酸钠，pH7.0洗脱。X-轴代表以分钟表示的时间，Y-轴代表280nm的吸光度。插入的图中所示是用流过(FT)和洗脱(E)集合液的考马斯亮蓝将非还原4-10％SDS-PAGE凝胶染色显影。箭头指示“活的”和“死的”形式的迁移位置。
图8：从不同温度下培养的CHO细胞分泌的人LTβR-Ig的SDS-PAGE/蛋白质印迹分析。通过4-20％梯度凝胶通过非还原SDS-PAGE电泳之后使用蛋白质印迹，重复一次分析在指定培养温度下培养的含有人LTβR-Ig的CHO细胞上清液。
图9：培养温度对从哺乳动物细胞分泌的人LTβR-Ig的总量中死的物质的百分比的影响。在指定温度下培养双份含有分泌重组人LTβR-Ig的CHO细胞的烧瓶，并且通过蛋白质A(Protein A)亲和层析纯化分泌的人LTβR-Ig。利用分析HIC层析双份评价人LTβR-Ig的“失活”形式的百分比。X-轴代表培养温度，Y-轴表示以细胞分泌的人LTβR-Ig的总量的百分比表示的“失活”物质的量。
图10：28，32和37℃下制备的HVEM-Ig的非还原SDS-PAGE分析。从28，32和37℃下培养的细胞衍生的HVEM-Ig的蛋白质A纯化制剂与非还原SDS-PAGE样品缓冲液混合并且在预制4-10％SDS-PAGE凝胶上电泳。用考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。箭头标记的泳带代表未聚集的HVEM-Ig。凝胶上可见的较高分子量的泳带相应于聚集形式。
图11：37℃对32℃产生的HVEM-Ig与表面Light和/或LTα/β结合的FACS分析。A).作为浓度的函数的HVEM-Ig与用人LIGHT转染的293细胞的结合证明32℃下产生的物质结合比37℃下产生的物质更好。B).2μg/ml浓度下HVEM-Ig与LIGHT转染的293细胞结合观察到的FACS曲线的实例。C).32℃下产生的HVEM-Ig与表现LIGHT和表面淋巴毒素-α/β(LTα/β)复合物两者的II-23T细胞杂交瘤系的表面的改进结合的另一个实例。
图12：LIGHT或淋巴毒素-α(LTα)配体与BIA核芯片固定的三个不同温度下产生的HVEM-Ig结合的BIAcore分析。每一条曲线表现出一个配体浓度下的结合作用，使用了下面的浓度：30，15，7.5，3.75，1.87，0.93，0.47，0.23，0.11和0.0μg/ml。每一个芯片加载到相同RU水平，表明结合了相同量的受体-Ig。
详细描述
现在对于权利要求保护的本发明详细地给出参考。本发明涉及产生高水平的TNF家族中受体的免疫球蛋白融合蛋白的功能或活性形式的能力。利用受体-Ig融合蛋白成功予以临床干涉要求长期存在和长期治疗的能力或在疾病期间新病突发最小化。理想的是，用于人用的这些融合蛋白的制剂没有任何聚集，失活或错折叠形式，因为它们的存在将降低药效，并且改变的结构将激发抗体反应，而这有利于清除药物从而降低其药效。此外，抗受体抗体可以与细胞表面上的天然受体直接交联从而激活它们，即Browning等1996，JEM中描述的那些对抗抗体(agonistic antibody)。对抗抗体激活该系统，因此进一步的受体-Ig治疗可能效果更小甚至不利的。所谓“免疫球蛋白融合蛋白”指携带免疫球蛋白恒定区的任何部分例如CH1，CH2或CH3结构域或者它们的组合的多肽的胞外结构域的任何功能部分的任何融合体。优选地，所述多肽是TNF家族受体的一员。Ig分子的部分可以从各种免疫球蛋白同种型衍生，包括，例如IgG1，IgG2，IgM，IgA等。所谓“TNF家族受体”指无论天然膜结合的或分泌的(osteoprotegerin情况下)具有规范的TNF家族半胱氨酸桥接模式的任何受体，或者与TNF家族配体的确定成员结合的任何受体(例如Banner等，1993)。在其它实施方案中，权利要求保护的本发明涉及通过这里讨论的方法获得的TNF家族受体-Ig融合体，以及涉及含有它们的药物制剂。
LTβR-Ig蛋白质在猴COS细胞或中国仓鼠卵巢细胞中以两种方式表达。一种形式，“活性”形式，以高亲和性结合配体，而另一种“失活”形式则不是如此。对于任何TNF受体-Ig融合蛋白以前没有描述过活的和死的形式的混合物，然而，失活形式的本质还不清楚。通过SDS-PAGE分析中存在两条泳带发现这两种形式。表达出的物质包含相当量的糖基化异质性；但是，该异质性最可能不导致这里描述的功能问题。例如，当受体表达为没有跨膜结构域和免疫球蛋白Fc结构域的可溶性单体形式时，发现非-，单-和二-N-连接的糖基化形式。BDA8可以将单和双糖基化形式两者免疫沉淀，BDA8是只识别功能形式的抗体。此外，亲和性纯化形式具有类似的糖基化异质性。更可能地，我们推测非膜固定形式的表达导致一些导致受体-Ig二聚体的两个臂之间不适当交联的异常二硫键连接。
TNF家族受体一般在胞外配体结合部分3-4重复区，每个区有大约3个二硫桥。可以想得到不适当的折叠将导致不正确模式的二硫键或者缺少二硫键的一些形成(图2图示说明)。在受体-Ig融合蛋白的情况下，看来Fc结构域的早期折叠使得其接着进行带来两个LTBR链，即两个受体臂紧密邻近的二聚合。如果受体区还没有完成它们的折叠，则存在两个臂之间自由巯基配对的可能性，即臂之间桥接。这样的不正确的折叠可能会发生，或者在导致折叠错误的两种情况下与已经形成的二硫键紧邻的自由巯基之间可能产生二硫键混乱。也可能在一个臂内发生不正确折叠，即臂内折叠错误，尽管这样的错误可能不导致最后分子的根本不同的形状。在这种情况下，利用常规区分大小方法不容易拆分活性和失活形式。
最终证实，当受体被表达为一种Ig融合蛋白时，在TNFR55受体中，第四区，即与跨膜区最近的区对于配体结合是关键的(Marsters等，1992)。该区对于很多TNF受体可能是关键的。对TNFR55的另一项研究表明其只是对于Ig融合蛋白的角度是关键的，并且没有第四区的膜形式在结合TNF配体中是完全活性的(Corcoran等，1994)，但是，最近，结晶学分析指出与第四区相关的可能的关键功能(Naismith等，1996)。该第四区在还缺少与配体直接接触的两个物种之间是相对保守的(Banner等，1993)。紧邻铰合区和CH2+CH3FC区的两个第四区之间的该区中臂间桥接可能不会明显地改变该分子的球形，并且因此在以大小为基础的分离方法中可能是不显的。不管怎么说，该分子将表现出损伤的配体结合。只具有三个区的受体以相似方式表现。
在细胞培养中降低温度导致分泌的错折叠的较小形式(即失活形式)的明显减少。该改进大概是由于在将受体-Ig融合蛋白组装为期望的二聚体形式之前使得更多的时间折叠LTβR部分的各个区的降低的多肽的折叠速度。将折叠过程减慢需要的绝对温度是宿主依赖性的。对于哺乳动物细胞(即CHO)，权利要求保护的方法优选在大约27℃至大约35℃的温度下发生，更优选地，该温度是大约27℃至大约32℃。酵母培养系统需要在大约10℃至大约25℃，优选大约15℃至大约20℃的温度下生长来实现显著的效益。
权利要求保护的本发明的利用使活性蛋白Ig融合体正确折叠。在某些情况下可能需要使细胞在例如大约37℃至大约43℃较高温度下生长，在这期间只发生非常低水平的克隆基因的表达。期望的生长期之后，融合体可以在低温下表达，产生提高的活性融合体的产率。如上面所讨论的，在哺乳动物系统中的低温度优选是大约27℃至大约35℃，更优选大约27℃至大约32℃下。
因此，通过降低蛋白质-Ig融合体表达的温度的权利要求保护的方法使本领域技术人员调节蛋白质和期望的蛋白质的Ig部分两者的折叠。
另外，利用包括亲和性和/或常规层析技术的权利要求保护的方法，现在人们可以纯化活性级分足以使用该嵌合蛋白来阻断各种临床环境中的免疫功能。另外，利用低温度(即对于CHO小于等于32℃；对于酵母小于等于25℃)细胞培养条件的权利要求保护的方法，现在有可能制备培养上清液，其高度富集较大的活性形式的人LTβR-Ig。此外，该家族受体的其它成员有着相似问题是有可能的。例如，对于TNFR55-Ig(也称之为p55或p60TNFR)我们在非还原SDS PAGE上观察到两条类似的泳带。类似地，通过在低温下分泌改进了称之为HVEM的另一个TNF家族受体的性质。因为不同温度下生成的物质没有明显的大小差别，所以该受体可以构成一个臂内折叠错误的实例。无论怎样，不考虑机理，权利要求保护的方法导致降低的分泌温度下TNF家族的这些成员和其它成员的制剂中更具活性融合蛋白的更高百分比。
实施例
实施例1.特异性识别人LTβR-Ig的活性形式的mAb
使用标准蛋白质A基亲和性层析方法可以纯化用质粒转染的COS或CHO细胞分泌的LTβR-Ig蛋白质(图1)。这种纯化的蛋白质由非还原SDS丙烯酰胺凝胶上大约100kDa处两条小间距的泳带组成(图3)。两条泳带表观大小大约5kDa差异。当蛋白质被还原时，基本上在大约50kDa处拆分从异源糖基化得到的两个泳带(图3)。但是，从给出这对还原泳带的糖基化区别并不能直接得出在非还原条件下观察到的这两条泳带。使用一组对人LTβR的单克隆抗体，我们证明来自第I组的抗体即AGH1和BDA8只识别该受体的大的MW形式(表I；除了上泳带和下泳带选择性的所有的数据均从Browning等处得到，1996)。来自该组的抗体直接与配体结合区结合，这一点由BDA8的Fab片段仍然被封闭的发现所证实。第II组mAbs也可以阻断配体结合，但是，在生物学测试中，这些mAbs表现出混合的激动剂和拮抗剂行为。当人们从这些mAbs(这些实验中使用的AGH1)制备亲和柱并且应用LTβR-Ig的大形式和小形式的混合物时，较小形式的受体流过而较大形式粘着柱基质。低pH洗脱得到纯的大形式制剂(图4)。对这两个级分分析它们结合表面佛波醇酯激活的II-23T细胞杂交瘤细胞即表达淋巴毒素复合体的细胞的能力(如Browning等，1995所述)，只有结合nAb的级分能结合表面淋巴毒素。流过(flow through)的级分，即较低分子量泳带完全是失活的(图5)。具体地说，来自LTβR-Ig构建体稳定转染的CHO细胞的上清液通过蛋白质A柱分离该蛋白质。用pH2.8的25mM磷酸钠缓冲液洗脱纯蛋白质，并且用1/10体积pH8.6的0.5M磷酸钠中和含有这些级分的蛋白质。在0.25毫升体积中用3μg的LTβR-Ig和4μg的抗-LTβR mAb进行免疫沉淀，接着用只识别小鼠mAb上的κ链而不识别人Fc区的KappaLock琼脂糖小球捕获mAb。离心去除小球并且用蛋白质A琼脂糖从上清液去除残留的免疫球蛋白。用SDS PAGE样品缓冲液(没有还原剂)处理小球并且将该缓冲液加载到SDS-PAGE凝胶上。展开凝胶并且转移到Hybond上，并且用与辣根过氧化物酶偶联的抗-人IgG Fc片段进行蛋白质印迹(LTβR mAb，接着用抗-小鼠IgG-HRP并且对HRP进行化学荧光检测(Amersham)。
为了利用AGH1专识别LTβR：Ig的活性形式的能力，根据制备商的说明用CNBr-激活的琼脂糖(Pharmacia，Piscataway，NJ)制备AGH1亲和柱。用PBS充分冲洗该柱子，并且应用蛋白质A纯化的LTβR-Ig，并且收集流出液。用PBS冲洗该柱子，然后用pH2的25mM磷酸钠洗脱。如上所述立即中和含有洗脱液的级分。设定10D溶液等于1毫克/毫升，在280nm处通过吸光度测定蛋白质浓度。通过所述FACS分析对含有LTβR-Ig的流出和洗脱合并液测试结合(Browning等，1995)。流过的级分表现出对表达表面LT的细胞没有FACS染色，而洗脱的合并液保留了完全的结合活性。
实施例2.人LTβR-Ig的活性和失活成分的常规色谱分离
在使用常规色谱步骤的分离方法设计中利用了上面鉴定的大和小MW成分之间潜在的结构差异。作为一个实例，通过在PBS中凝胶过滤可以以大小分离该蛋白质来获得较大和较小形式的部分分离。然后可以将这些制剂再次施用给相同的柱子来获得90％以上富集各成分的人LTβR-Ig的较大和较小形式的制剂。或者，可以利用疏水作用层析(HIC)来实现相同的结果。用硫酸铵稀释蛋白质混合物，加载到HIC柱上，并且用递减的盐梯度差异洗脱大的和小的成分。在这些条件下，获得这两种人LTβR-Ig成分的基线分离(图6)。这些方法以及上述免疫亲和方法对制备毫克量的人LTβR-Ig的大和小制剂是有用的，但是对于制备大量的用于医药应用的这些成分还存在很多期望。发明人发明了一种新的方法，将树脂用于HIC方法，该树脂可以大量获得并且已鉴定允许小形式的人LTβR-Ig物质流过柱子而大成分保留的色谱条件，并且可以选择性洗脱(图6)。使洗脱出的物质进行最后步骤，例如大小排阻层析或离子交换层析，来去除聚集的物质和其它杂志，并且其在配制成合适的生理缓冲液之后可以用于体内工作。下面第一个实施例(A)描述了用来分析评价LTβR-Ig制剂中失活物质的量的具体条件。第二个实施例(B)描述了产生高度富集活性成分的LTβR-Ig的制剂的制备纯化过程。
A).分析性疏水作用层析(HIC)可以用作评价失活LTβR-Ig的量的定量分析
在用1.5M硫酸铵平衡并且接着以递减梯度的硫酸铵洗脱的Perseptive Biosystems Poros ether/m柱(4.6×100mm，编号No.P091M526)上实现重组人LTβR-Ig的较小的失活成分和较大的活性成分的基线拆分。将该LTβR-Ig制剂稀释到0.1毫克/毫升的浓度，并且制备成1.5M硫酸铵，20mM磷酸钠，pH9(缓冲液A)的最终缓冲液组合物。将一部分(含有100微克蛋白质的1毫升)加载到Poros ether/m柱上。用8.3毫升缓冲液A冲洗该柱子。用线性梯度(总梯度体积16.6毫升)从100％缓冲液A至100％缓冲液B(20mM磷酸钠，pH9)。差别洗脱活性和失活成分，接着用缓冲液B16.6毫升洗脱。以214nm吸光度监测柱子洗出液。全部过程在室温下进行，使用1毫升/分钟的柱流速。图5给出了代表性分析HIC层析的洗脱曲线。1峰含有LTβR-Ig的失活级分，2峰是LTβR-Ig的活性成分。为了定量确定两种形式的相对分布，利用Perseptive instrumentsVison积分软件将峰面积积分。
B).人重组LTβR-Ig的制备性纯化
条件培养基的澄清和浓缩：利用死端式过滤通过5μ聚丙烯5sqft.Calyx过滤胶囊(Microseparations Inc，Westborogh，MA)，接着通过0.2μOpticap4英寸过滤柱(Millipore Corp.，Bedford，MA)从自分泌重组LTβR-Ig的CHO细胞收获的10升条件培养基去除细胞碎屑。使用串联连接的三个S1Y30 Spiral Ultrafiltration柱(Amicon，Beverly，MA)通过超滤将澄清的培养基浓缩至大约1升。
蛋白质A亲和层析：4℃下浓缩的条件培养基以重力通过10毫升蛋白质A琼脂糖快速流过(Pharmacia)柱。用50毫升PBS，50毫升含有0.5M氯化钠的PBS和50毫升PBS冲洗柱子。为了去除杂质牛IgG，用50毫升pH5.5的2mM磷酸钠冲洗柱子。以3毫升级分，用25mM磷酸钠，100mM氯化钠，pH2.8，通过重力洗脱结合的LTβR-Ig，并且立即用0.3毫升pH8.6的0.5M磷酸钠中和。通过吸收光谱法鉴定含有蛋白质的级分，合并并且在-70℃下保存。
疏水作用层析：用40毫升3M氯化钠，40mM磷酸钠pH7和20毫升1.5M氯化钠，20mM磷酸钠pH7(所有的溶液均在室温下)稀释蛋白质A洗脱集合液(40毫升，2.5毫克/毫升的浓度)。将稀释的合并液加载到10×100毫米(7.8毫升)SourcePH15(Pharmacia，PiacatawayNJ)，以2毫升/分钟的流速洗脱。以20毫升/分钟的流速，用79毫升1.5M氯化钠，20mM磷酸钠pH7冲洗该柱子。以2毫升/分钟的流速，用20mM磷酸钠pH7冲洗结合的蛋白质。在280nm下监测流出液的吸光度并且收集9毫升级分。用UV吸收光谱鉴定含有蛋白质的洗脱级分，合并并且在-70℃下保存。图7代表典型的HIC洗脱曲线。在这些条件下，失活的材料流过该柱而活性材料结合到该树脂。图7中的插入分别含有流过和洗脱汇集液的考马斯亮蓝染色的NR SDS-PAGE分析的扫描。
大小排阻层析：使用centriprep30浓缩器通过超滤将含有LTβR-Ig的活性成分的HIC洗脱合并液大约100毫升(1.3毫克/毫升)浓缩至9毫升(Amicon，Beverly，MA)。将该浓缩液加载到在PBS中平衡的1.6×100cmSuperose-6 prep分级(Pharmacia，Uppsala，Sweden)柱上，以1毫升/分钟的流速洗脱。以3毫升级分收集流出液。通过UV吸收光谱鉴定含有蛋白质的级分。使用NR SDS-PAGE凝胶电泳以3微克/泳道的载量对选择的级分分析聚集物含量。合并最小可见聚集物的级分并且在-70℃下保存。
在该方式中，可以制备LTβR-Ig，其含有最小量的粗培养基中存在的失活LTβR-Ig成分。
实施例3.在细胞培养阶段富集人LTβR-Ig的大的活性成分的低温发酵条件
在常规哺乳动物细胞培养条件下，以大约50％小和50％大成分的混合物分泌人LTβR-Ig。使用表达相同蛋白质的杆状病毒感染的细胞导致大大降低水平的小的形式。在28℃培养昆虫细胞时，我们研究了从低温下培养的哺乳动物细胞分泌的人LTβR-Ig是否会具有改变的大的和小的形式的比例。图8所示的是蛋白质印迹分析的28℃，30℃，33℃，35℃和37℃下T形瓶中培养的分泌人LTβR-Ig的CHO细胞的上清液。在33℃，35℃和37℃下的培养物中存在大的和小的形式(箭头所示)。含有在30℃和28℃下生长的细胞的培养上清液的泳道中几乎看不到小形式的证据。因此，在细胞培养过程中降低温度大大减少小的失活形式的人LTβR-Ig的量。为了定量确定细胞培养温度和富集的较大的活性形式的人LTβR-Ig的程度之间的关系，以1℃的间隔在28℃-37℃范围的温度下设立两套培养瓶并培养。通过分析HIC层析对蛋白质A亲和纯化的人LTβR-Ig样品进行分析来定量测定从不同温度下生长的细胞衍生的制剂中存在的人LTβR-Ig的小的和大的成分的比例。如图9所示，当培养温度从37℃降低至32℃时，下面泳带的量快速减少大约5倍。将培养温度降低至28℃减少下面形式的量但是以小得多的显著方式。这些结果表明只是从37℃降低几度降低培养温度就大大减少较小分子量成分的量，因此提高了人LTβR-Ig的较大活性成分的产率。以这些数据为基础，对选择的32℃和28℃的培养温度测试这些发现是否在适合制备使用适合在悬浮液中培养的CHO细胞分泌重组人LTβR-Ig的条件下以大规模重复。对于这些实施方案，在37℃下将细胞培养到大约2×106细胞/毫升的密度，用大约4体积的生长培养基将培养物稀释，并且在32℃下培养直到细胞成活率降低到低于80％。在生产期间将温度降低至28℃也导致最终收获中明显降低水平的失活成分。令人感兴趣地注意到在28℃或32℃下生产期间细胞数目不增加得非常快时，在收获的条件培养基中获得超过37℃下专门生长的培养基几倍的增加的生产滴度。下面描述32℃和28℃过程中使用的具体条件。
原始数据提示在其它宿主系统例如酵母中降低培养温度导致类似的好处。令人感兴趣的是，在酵母中，在比哺乳动物细胞中低得多的温度下发现低温度生产的有益效果。在30℃下培养酵母占优势产生失活形式，在25℃下培养的培养基含有大约相等失活和活性形式的混合物，而在16℃下发酵的培养物占优势产生活性形式的人LTβR-Ig。这些发现提示低温发酵将导致在任何分泌宿主系统中明显更高产率的人LTβR-Ig的活性成分。本领域技术人员容易确定每一种系统的最佳生产温度。
这里我们提供了该方法如何应用于LTβR-Ig的生产的详细实施例。开发了两种细胞培养方法，它们吸收了降低细胞培养温度明显减少从宿主细胞分泌的LTβR-Ig中存在的失活成分的量这一事实的好处。另外，当与36-37℃下进行的传统发酵循环相比较时，低温发酵的出人意料的好处是滴度的几倍的改进。表II总结了用两种不同的用糖基化程度不同的不同LTβR-Ig构建体转染的细胞系获得的失活LTβR-Ig成分的对比产率和相对量(插入该实施例不适切)。
32℃细胞培养方法：在补充有10％FBS，140毫克/升的链霉素和50毫克/升的庆大霉素的DME/HAM’sF-12培养基中培养用来在悬浮液中生长的分泌人LTβR-Ig的CHO细胞(见下面的表III)。对于扩大比例，以大约2×105细胞/毫升在培养基中接种两个750毫升-旋转瓶。在5％CO2气氛下在37℃下将培养物培养到大约3×106细胞/毫升的密度。合并两个旋转培养的细胞悬浮液来接种扩大规模的含有大约10升培养基的生物反应器。以11％O2氧化培养物并且在37℃下培养三天至大约2×106细胞/毫升的密度。使用该培养物来接种含有6.4×105细胞/毫升密度的33升培养基的生产生物反应器。然后在32℃有利温度下氧通入速度设置在11％O2下将该生产生物反应器培养8天。在收获那天(第8天)细胞密度大约是2×106细胞/毫升，成活率大约60％。在这些条件下，实现了12毫克/升LTβR-Ig的滴度，这比传统的37℃温度下培养的相同细胞高两倍。LTβR-Ig制剂中失活成分的相对量是17％，这代表当与37℃培养获得的产物相比时多于60％的减少。
28℃细胞培养方法：在补充有10％FBS，140毫克/升的链霉素和50毫克/升的庆大霉素的DME/HAM’sF-12培养基中培养用来在悬浮液中生长的分泌人LTβR-Ig的CHO细胞(见下面的表III)。对于扩大比例，以大约2×105细胞/毫升在培养基中接种两个800毫升-旋转瓶。在5％CO2气氛下在37℃下将培养物培养到大约3.5×106细胞/毫升的密度。合并两个旋转培养的细胞悬浮液来接种扩大规模的含有大约10升培养基的生物反应器。以11％O2氧化培养物并且在37℃下培养2天至大约1.7×106细胞/毫升的密度。使用该培养物来接种起始细胞密度2.5-3×105细胞/毫升的两个40升和一个10升的生产生物反应器，分裂比例是1∶9。然后在37℃下培养该生产生物反应器并且以11％O2氧化，直到达到大约是2×106细胞/毫升的细胞密度(两天)。在第二天结束后，将生物反应器温度降低至28℃，并且再将该生物反应器培养5天。在第7天，细胞密度大约是3×106细胞/毫升并且细胞成活率大于75％，收获生物反应器，并且如上所述处理条件培养基。在这些条件下，实现了大约20毫克/升LTβR-Ig的最后滴度，这比37℃培养的相同细胞获得的滴度高3.3倍。失活成分的相对比例是10％，这代表比37℃制备的物质减少了80％。
实施例4：在生产期间使死的形式最小化的Fc区中的改变
以我们对为什么死的分子产生这些制剂的假设解释为基础，人们会预见缩短Fc区二聚合之前的时间将增加正确折叠的受体区的级分。我们开发几种方法来实现该结果。不同IgFc区以不同的速率折叠是可能的，但是IgG1区改变为IgG4区不改变活性失活比。第二，通过诱变从IgG1Fc区去除交联两个肽链的铰链区中的两个半胱氨酸残基。在不存在铰合二硫键形成下Fc区可以很好地二聚合，但是在其不存在下其速度可能会减缓。丙氨酸置换两个半胱氨酸导致减少量的死的形式，这一点通过SDS-PAGE和HIC层析定量测定，使得其中野生型LTβR-Ig在37和28℃下含有50和5％失活形式，IgG1铰合部中缺失半胱氨酸导致当在各温度下生产时20和5％失活形式。因此，通过置换两个半胱氨酸的铰合部修饰可以提高制剂的质量，此外，只置换一个半胱氨酸会具有有益效果也是可能的。这样的基因修饰会降低依赖于低温生产方法的死的形式的百分比。
实施例5：胱氨酸桥的缺失解决折叠问题
一般情况下，确定蛋白质采取的以达到最终正确形式的折叠途径是非常困难的。不管怎样，TNF家族受体中一些二硫桥是不通常的并且对于最后的折叠状态可能是不需要的。这些桥是诱变的好的候选者。通过常规的将101和108位半胱氨酸定点诱变为丙氨酸来去除LT βR-Ig的第三区中一个这样的桥(使用Ware等，1995中定义的序列编号)导致改进的失活/活性物质的比例，这一点由SDS-PAGE证实。野生型LTβR-Ig一般证明，当分别在37和28℃下生产时存在50和5％失活形式。缺失一个半胱氨酸二硫桥的突变形式当在这些温度下生产时具有20和5％的失活形式。
实施例6：较低温度的使用改进HVEM-Ig制剂的质量
疱疹病毒进入介体(HVEM)是与LTβR相关的TNF家族受体，并且与LIGHT配体紧密结合，与淋巴毒素-a受体(LTa)弱结合(Mauri等，1998)。通过将胞外结构域进行PCR扩增并且与人IgG1CH2和CH3区融合，以Ig融合蛋白形式制备人HVEM，如对于LTβR-Ig所述(Crowe等，1994)。将该构建体插入到称之为CH269的载体中(Chicheportiche等，1997)，用于在人胚胎肾细胞系293中瞬时表达，使用EBNA系统(293-E细胞)高拷贝载体表达。收集上清液，并且使用蛋白质A亲和层析和低pH洗脱纯化HVEM-Ig。如所述(Browning等，1996a)从昆虫细胞系制备重组LTα。通过使用来自激活的II23的RNA对全cDNA进行PCR扩增来制备重组可溶性人LIGHT，得到Mauri等，1998描述的序列的编码区。LIGHT的受体结合区通过PCR扩增并且融合到α配对因子前导序列上并且和对于其它相关蛋白质所述一样(Browning等，1996)基本被表达。在前导序列和受体结合区之间插入FLAG标记物和(G4S)3间隔臂氨基酸序列，使得分泌的LIGHT会具有一个N-末端FLAG序列。该构建体编码下面的分子：
″MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKR..EADYKDDDDNGGGSGGGSGGGSKELNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMV ″
其中两个点表示成熟蛋白质预期的N-末端，其可以通过去除下面接着的两个氨基酸(EA)而进一步被处理。通过对抗-FLAGmAb柱的亲和层析并且用低pH或钙螯合作用洗脱从上清液纯化该蛋白质。如所述(Chicheportiche等，1997)，也将全长LIGHT插入到载体CH269中用于在193-E细胞表面上的表达。曾描述过用于受体-Ig与细胞表面检测的FACS结合方法和用于测定可溶性配体与固定化受体-Ig的结合的BIAcore方法(Mackay等，1997)。BIAcore技术获得蛋白质与芯片(即受体)结合的真实时间测定。
使用补充有10％FBS的培养基在旋转瓶中在37℃下使表达HVEM-Ig的CHO细胞生长至汇合。当细胞达到汇合时，用新鲜培养基置换用过的培养基，并且在37，32和28℃下温育培养物。一个星期收获一次28和32℃的培养物，每4天收获37℃的培养物.如所述利用蛋白质A亲和层析纯化分泌出的HVEM-Ig。分析之前将纯化过的制剂在-70℃下保存。当在28，32和37℃下生产并纯化HVEM-Ig时，所有的制剂在SDS-PAGE分析上行为类似(图10)，提示蛋白质中没有发生大的改变。因此，如果发生异常折叠/二硫桥接，则其要么在臂内要么接近Fc区的铰链区发生，即臂间桥接，因此不会有利地影响分子SDS-PAGE中总的形状。在FACS结合测试中评价受体-Ig与293-E细胞上表达的LIGHT或激活的II23细胞上的LIGHT结合的能力(图11)。在两个细胞类型中，HVEM-Ig结合细胞表面配体的能力比32℃下表达提高了大约2-3倍。应用BIAcore技术，发现当用HVEM-Ig以类似水平加载BIAcore芯片时(RU值反映芯片上蛋白质的量)，较低温下产生的HVEM-Ig比较高温度下产生的蛋白质结合更多的配体(图12)。不管LIGHT或LTα是配体都获得该结果。BIAcore结合曲线表明结合作用开始和结束的真实时间，并且可以看到不管生产温度，结合作用是类似的。因此，一部分制剂被有效失活，并且较低生产温度使该比例最小化。我们得出结论较低温度纠正了异常折叠问题并且提高了活性分子的百分比，尽管我们不能直接观察失活分子的级分。上述亲和层析技术可以用来在通过降低生产温度和/或在铰合部或受体本身中诱变各种半胱氨酸优化制剂防止不正确折叠之后拆分活性/失活形式。
实施例7：使其它TNF-家族受体-Ig融合蛋白失活形式最小化的基因方案
将大多数TNF家族受体制备成具有免疫球蛋白-Fc区的融合蛋白构建体：
参考
p55TNF-R (Loestcher等，1991，Marsters等，1992；Ashkenazi等，1991)
p75TNF-R (Mohler等，1993)
LTβ-R   (Crowe等，1994)
Fas      (Suda等，1993)
CD27     (Goodwin等，1993)
CD30     (Smith等，1993)
CD40     (Fanslow等，1992)
Ox40     (Baum等，1994)
4-1BB    (Alderson等，1994)
HVEM(Mauri等，1998)
在一些情况下，最特别地，Fas-Ig和CD40-Ig，例如Fanslow等，1992，嵌合体相对于两个TNF受体的可溶性Fc形式来说活性不好。这些制剂中的一些是各种比例的活性和失活形式的混合物是可能的。失活形式只是指以大大低于(10-1000倍)活性形式的亲和性结合的分子，即其可能不是完全没有结合活性，而是相对于天然细胞上发现的高亲和形式来说对于配体具有降低的亲和性。异常的受体臂间或受体臂内二硫键可能会发生，导致较小活性的蛋白质。
使用这些受体或者其它还没有鉴定的受体，通过常规技术可以制备一组抗-受体mAbs。这些抗体能阻断配体与受体的结合，这一点优选使用与细胞表面天然受体的配体结合测试来评价(但是也可以使用重组受体形式的其它方法)，使用这些抗体来构成亲和柱。活性和失活-Fc形式的混合物的制剂将通过柱子并且收集流出液。用低pH缓冲液(一般pH2.5至4.0)洗脱与柱子结合的物质，并立即中和。两个级分会与FACS结合测试(或者任何其它标准结合版本)中的细胞结合或者与不同蛋白质浓度下的配体结合。这些mAbs中的一些将选择性结合活性形式，并且可以看到流出液对洗出液的50％结合需要的浓度之间的差异。该结果标记着mAb是分界mAb。洗出液与流过液中蛋白质的比例表示制剂中活性形式百分比。
因此这些鉴定的mAbs可以用来亲和纯化活性形式。此外，它们在各种免疫测试版本中的应用可以用来优化期望的受体-Fc形式的正确形式的表达。该测试可以另外在与其它常规纯化方法的结合中使用来发现纯化受体的活性形式而不用亲和技术分离的方法。使用这些Abs画出活性和失活形式，培养温度可以优化并且采用层析方法来富集活性形式。或者，可以利用HIC柱方法来分开活性和失活形式，并且使用该方法，可以优化培养条件。类似地，这些测定可以形成受体部分半胱氨酸诱变的基础，来确定有问题的二硫键，去除有问题的二硫键后得到功能活性物质。因为这些受体中很多具有作为人疾病的治疗药物的用途，并且人们希望只将正确折叠形式对患者施用，所以确定制剂和去除不好的结合形式的这些方法具有实用性.
不超出本发明的精神或范围在本发明方法中进行各种修饰和改变对于本领域技术人员是显而易见的。因此，本发明覆盖本发明的修饰和改变，前提是它们在后面的权利要求书及其等价物的范围内。
表I：抗-LT-b-R mAbs的总结
a评价抗体是否阻断可溶性受体与激活的II-23的结合的测试。Nd＝没有做.
b山羊抗-小鼠Fc包被平板，捕获的抗-受体mAb，HT29s加IFNg。
c阻断
d加强
e可变的，在一些测定中一些部分抑制，在其它中则没有.
f使用mAb加KappalLock系统沉淀的受体形式。
g在该表中的数据和使用BIAcore技术所做的表位图的基础上确定的组。
表II：在不同培养温度下培养的CHO细胞中LTβR-Ig构建体的表达
  构建体   发酵温度℃   表达mg/La   失活成分百分比b
LTβR05 373228 61220 501710
LTβR09   373228   10-76   50-6
a使用蛋白质A亲和层析评价表达水平.b蛋白质A亲和纯化后使用分析HIC方法评价LTβR-Ig制剂中存在的失活成分的量.
表III：DME/HAM’sF-12培养基补充物
  成分   1升生长培养基中的量a
  胎牛血清   100ml
  葡萄糖   1.85g
  碳酸氢铵   2.2g
  链霉素   140mg
  庆大霉素   50mg
  乙醇胺(1M贮备液)   0.1ml
  硫辛酸   91.2mg
  亚油酸   38.4mg
  三碘-L-甲腺原氨酸   0.2mg
  Ex-Cyte VLE(Bayer)   1ml
  牛胰岛素   10mg
  牛运铁蛋白   10mg
  牛血清白蛋白   50mg
  Pluronic F-68   1g
  半胱氨酸   82mg
  蛋氨酸   34mg
  丝氨酸   52mg
  缬氨酸   105.6mg
  甘氨酸   50mg
  天冬氨酸   24.4mg
  脯氨酸   52.2mg
a成分与基础培养基粉末混合，然后将体积调至1升。用50％的盐酸将培养基的pH调节到7.20至7.25。
参考文献
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<212>PRT
<213>人
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Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1                5                  10                  15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln
            20                  25                  30
Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe
        35                  40                  45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
    50                  55                  60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Asn Gly
                85                  90                  95
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Lys Glu Leu Asn Pro
            100                 105                 110
Ala Ala His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly
        115                 120                 125
Pro Leu Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu
    130                 135                 140
Ser Tyr His Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr
145                 150                 155                 160
Ile Tyr Ser Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu
                165                 170                 175
Ala Ser Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro
            180                 185                 190
Glu Glu Leu Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys Gly Arg Ala
        195                 200                 205
Thr Ser Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val
    210                 215                 220
Val His Leu Glu Ala Gly Glu Glu Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu
225                 230                 235                 240
Arg Leu Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe
                245                 250                 255
Met Val Ala Thr Thr Tyr Arg Glu Phe Asn Ala Pro Cys Thr
            260                 265                 270

Claims (36)

1.一种表达高产率活性蛋白质-Ig融合体的方法，包括在一个具有大约27℃至大约35℃的低温的培养系统中培养用编码期望的蛋白质-Ig融合体的DNA转化的宿主。
2.权利要求1的方法，其中温度是大约27℃至大约32℃。
3.权利要求1的方法，其中所述转化的宿主首先在高于大约33℃的温度下培养足以使所述宿主生长的一段时间。
4.权利要求1的方法，其中所述蛋白质-Ig融合体包括TNF受体家族的一个成员。
5.权利要求3的方法，其中所述TNF受体家族成员是淋巴毒素-β受体，TNFR-55，HVEM或者其片段。
6.权利要求1的方法，进一步包括通过疏水作用层析从所述培养系统中回收活性蛋白质-Ig融合体的步骤。
7.权利要求1的方法，其中所述培养系统包括昆虫或细菌细胞。
8.一种通过在一个具有大约27℃至大约35℃的低温的培养系统中培养用编码该融合体的DNA转化的宿主获得的活性蛋白质-Ig融合体。
9.权利要求8的融合体，包括TNF家族的一个成员。
10.权利要求9的融合体，包括LT-β受体或者其片段。
11.权利要求9的融合体，包括HVEM或者其片段。
12.一种制备包含活性蛋白质-Ig融合体的药物制剂的方法，所述方法包括：
(a)在一个具有大约27℃至大约32℃的低温的培养系统中培养用编码该蛋白质-Ig融合体的DNA转化的宿主，从而表达活性蛋白质-Ig融合体；
(b)从所述培养系统中回收活性蛋白质-Ig融合体；和
(c)组合步骤(b)的活性蛋白质-Ig融合体和药学可接受载体。
13.权利要求12的方法，其中蛋白质-Ig融合体包括TNF家族的一个成员或者其片段。
14.权利要求13的方法，其中蛋白质-Ig融合体包括淋巴毒素-β受体或者其片段。
15.权利要求13的方法，其中蛋白质-Ig融合体包括HVEM或者其片段。
16.通过下面步骤获得的药物制剂：
(a)在一个具有大约27℃至大约32℃的低温的培养系统中培养用编码蛋白质-Ig融合体的DNA转化的宿主，从而表达活性蛋白质-Ig融合体；
(b)从所述培养系统中回收活性蛋白质-Ig融合体；和
(c)组合步骤(b)的活性蛋白质-Ig融合体和药学可接受载体。
17.权利要求16的药物制剂，其中蛋白质-Ig融合体包括TNF家族的一个成员。
18.权利要求17的药物制剂，其中蛋白质-Ig融合体包括淋巴毒素-β受体或者其片段。
19.权利要求17的药物制剂，其中蛋白质-Ig融合体包括HVEM或者其片段。
20.一种表达高产率活性蛋白质-Ig融合体的方法，包括在一个具有大约10℃至大约25℃的低温的培养系统中培养用编码期望的蛋白质-Ig融合体的DNA转化的酵母。
21.权利要求20的方法，其中温度是大约15℃至大约20℃。
22.权利要求20的方法，其中所述转化的宿主首先在高于大约30℃的温度下培养足以使所述宿主生长的一段时间。
23.权利要求20的方法，其中所述蛋白质-Ig融合体包括TNF受体家族的一员。
24.权利要求23的方法，其中所述TNF受体家族成员是淋巴毒素-β受体或者其片段。
25.权利要求20的方法，进一步包括通过疏水作用层析从所述培养系统中回收活性蛋白质-Ig融合体的步骤。
26.一种通过在一个具有大约10℃至大约25℃的低温的培养系统中培养用编码该融合体的DNA转化的酵母获得的活性蛋白质-Ig融合体。
27.权利要求26的融合体，包括TNF家族的一员。
28.权利要求27的融合体，包括LT-β受体或者其片段。
29.权利要求26的融合体，包括HVEM或者其片段。
30.一种含有具有一个Ig Fc区和肽链的活性蛋白质-Ig融合体的药物制剂，其中改变Ig Fc区从而改变所述蛋白质-Ig融合体的铰链区中二硫化物形成的速率。
31.权利要求30的制剂，其中所述IgFc区通过用丙氨酸置换至少一个半胱氨酸残基而改变。
32.一种蛋白质-Ig融合体，包括一个与从TNF家族衍生的肽交联的Ig-Fc区，其中Ig-Fc区上至少一个半胱氨酸残基被丙氨酸置换。
33.权利要求32的蛋白质-Ig融合体，其中所述肽衍生自淋巴毒素-β受体。
34.一种通过将至少一个半胱氨酸残基诱变为一个丙氨酸，从而提高表达的融合体的活性形式的产率的制备包括一个与从TNF受体家族衍生的肽交联的Ig Fc区的蛋白质-Ig融合体的方法。
35.权利要求34的方法，其中所述肽是LTBR，且101和108位的半胱氨酸诱变为丙氨酸。
36.LTBR肽的101和108位包括丙氨酸的LTBR-Ig融合蛋白。
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