CN105400721A - 一种快速筛选具有抗菌活性芽孢杆菌的方法 - Google Patents
一种快速筛选具有抗菌活性芽孢杆菌的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及微生物筛选领域，具体公开了一种快速筛选具有抗菌活性芽孢杆菌的方法。利用高温处理快速除去杂菌，并利用指示菌进行琼脂覆盖，通过观察抑菌圈筛选具有抗菌活性芽孢杆菌。可在35～42℃的培养条件下，在琼脂覆盖后培养6～12h内观察到抑菌圈，实现具有抗菌活性芽孢杆菌的高效筛选，整个筛选过程在48h内即可完成，大大简化了筛选的程序，降低了劳动强度。且本方法所述方法只利用了几种较为简单的培养基，无需滤纸片、牛津杯等试验材料，筛选成本低。
Description
技术领域
本发明涉及微生物筛选领域，具体地说，涉及一种快速筛选具有抗菌活性芽孢杆菌的方法。
背景技术
芽孢杆菌是一种产芽孢的革兰氏阳性细菌，在环境中分布较广，由于在其生长过程中可产生枯草菌素、多粘菌素、短杆菌肽等抗菌肽，对肠道或植物致病菌具有明显的抑制作用，通过降低肠道环境中游离氧、促进乳酸菌等益生微生物的生长、肠道免疫调节等发挥益生作用。基于芽孢杆菌所产抗菌肽抑菌谱广、稳定性高，芽孢杆菌所产抗菌肽被广泛应用于饲料添加剂和微生态制剂的生产中，并取得了较好的应用效果。目前筛选具有抗菌活性芽孢杆菌的研究报道较多，采用的筛选方法多是首先从样品中分离纯化出芽孢杆菌菌株，经培养得到无细胞培养液以后，再采用滤纸片法、打孔法、杯碟法来测试每株菌是否具有抗菌活性。虽有一些方法未经过分离纯化、制备无细胞培养液来进行具有抗菌活性细菌的筛选，如《一种快速筛选抗菌活性细菌和放线菌的方法》(申请号：201410212912.5)，但筛选的方法过于复杂，需将移液器吸头进行截取，筛选劳动强度较大。公开号为CN105002114A的中国专利申请公开了一种分离解油脂芽孢杆菌的方法，其运用高温结合指示剂显色的方法来筛选解油脂芽孢杆菌，但该技术方案中，样品需经过两到三天的间歇增氧富集培养，筛选的培养基必须在制备好LB培养基的基础上，加入混入油脂的BTB油脂培养基，再培养两天，再通过透明圈的大小来判断解油脂的能力，但此方法较为繁琐，筛选时间较长。
利用芽孢杆菌产生强耐热性的芽孢这一主要原理，通过将样品进行稀释以后进行高温处理，来杀死大量的营养细胞，只剩下芽孢能在培养基上进行生长，最终通过含有指示菌的琼脂覆盖的方法，直接进行抑菌活性的观察。为缩短筛选的时间，本方法不经过富集培养，而采用高温处理直接选择性地将样品中的芽孢进行筛选。此外，为选择特异性强的拮抗细菌，可任意选择革兰氏阳性菌或阴性菌作为指示菌。其次，针对同一环境样品，可在多个稀释度的平板中，进行抗多种指示菌的芽孢杆菌筛选，而且指示菌的活化以及琼脂覆盖的方法更为简单，芽孢杆菌抑菌圈的直径大小直接反映了其抑菌能力的强弱。这样的筛选过程极大地简化了筛选的工序，避免了先将样品进行富集培养或将细菌进行分离培养的繁琐过程，减轻了筛选的劳动强度，同时也使筛选分离到目标菌株的概率提高。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种快速筛选具有抗菌活性芽孢杆菌的方法。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种快速筛选具有抗菌活性芽孢杆菌的方法，所述筛选方法包括如下步骤：
1)样品的稀释：稀释样品，得到样品稀释液；
2)样品稀释液的高温处理：将装有样品稀释液的三角瓶置于80～90℃的水浴锅中，水浴处理30min，期间振荡三角瓶3～5次；
3)芽孢杆菌的分离培养；
4)指示菌的琼脂覆盖；
5)抑菌圈的观察、目标菌的挑取分离和目标菌的纯化。
进一步地，所述步骤4)具体为：将活化后的指示菌按照1％～5％的加入量(优选1％)，加入到温度为40～65℃未凝固的LB琼脂培养基或BHI琼脂培养基中，充分混匀后，慢慢倒入到长有芽孢杆菌单菌落的琼脂培养基表面，使其刚好覆盖芽孢杆菌的菌落，然后进行培养，培养温度为35～42℃，培养时间为6～12h；
所述指示菌为细菌，可根据需要选择革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。所述指示菌为细菌，优选单增李斯特菌CMCC54002、金黄色葡萄球菌ATCC6538、猪霍乱沙门氏菌CGMCC1.1859、大肠杆菌O157:H7ATCC43889。其在35～42℃的培养条件下，可在琼脂覆盖后培养6～12h内观察到抑菌圈，将更为高效的对具抗菌活性的芽孢杆菌进行筛选。
作为优选，指示菌的活化步骤为：将斜面中保存的指示菌接种于LB液体培养基或BHI液体培养基，培养温度为35～42℃，培养时间为12h。
进一步地，所述步骤1)具体为：称取样品加入到含8～10倍(优选9倍)体积无菌生理盐水的三角瓶中，35～38℃(优选37℃)充分振荡摇匀。
进一步地，所述步骤3)具体为：将高温处理后的样品稀释液用无菌生理盐水进行梯度稀释，将稀释102～106倍的菌悬液涂布于营养琼脂培养基的表面进行分离培养；所述营养琼脂培养基的组成为：蛋白胨10.0g，牛肉浸膏3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH7.4±0.2。
更进一步地，为了更好的实现芽孢杆菌的分离，本发明提供一个较佳的分离培养条件，具体为：培养温度为35～42℃，培养时间为12～24h。
进一步地，所述步骤5)中：将培养后的指示菌琼脂覆盖的平板置于光线明亮处，观察芽孢杆菌菌落周围是否存在抑菌圈，将有抑菌圈的芽孢杆菌单菌落进行挑取。
所述挑取方法为将有抑菌圈的芽孢杆菌单菌落进行挑取的步骤包括：用接种针或无菌牙签或无菌枪头穿破目标单菌落上层的指示菌琼脂，小心挑取下层琼脂中的芽孢杆菌菌落，然后在营养琼脂培养基上进行划线纯化、保存。
进一步地，所述样品为土壤、发酵食品、动物肠道内容物或粪便。
前文所述的培养基配方如下：
所述LB琼脂培养基的配方为：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0±0.2；所述BHI琼脂培养基的配方为：胰蛋白胨10.0g，牛心浸粉17.0g，氯化钠5.0g，葡萄糖2.0g，磷酸氢二钠2.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH7.4±0.2；所述LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0±0.2；所述BHI液体培养基的配方为：胰蛋白胨10.0g，牛心浸粉17.0g，氯化钠5.0g，葡萄糖2.0g，磷酸氢二钠2.0g，蒸馏水1000mL，pH7.4±0.2。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种快速筛选具有抗菌活性芽孢杆菌的方法。利用高温处理快速除去杂菌，并利用指示菌进行琼脂覆盖，通过观察抑菌圈筛选具有抗菌活性芽孢杆菌。本发明通过实验提供了格外适宜作为指示菌的微生物，其在35～42℃的培养条件下，可在琼脂覆盖后培养6～12h内观察到抑菌圈，实现具有抗菌活性芽孢杆菌的高效筛选，使整个筛选在48h内即可完成，大大简化了筛选的程序，降低了劳动强度。且本方法所述方法只利用了几种较为简单的培养基，无需滤纸片、牛津杯等试验材料，筛选成本低。
附图说明
图1为本发明实施例2中筛选抗单增李斯特菌的芽孢杆菌时观察到的抑菌圈。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1抗大肠杆菌的芽孢杆菌的筛选
(1)称取25.0g猪的肠道内容物，加入到含有225mL无菌生理盐水的三角瓶中，37℃充分振荡摇匀20min；然后将装有样品的三角瓶置于80～90℃的水浴锅中，水浴处理30min，水浴期间振荡三角瓶5次，再将高温处理后的样品用无菌生理盐水进行梯度稀释，将稀释104～106倍的菌悬液涂布于营养琼脂培养基表面；
(2)营养琼脂培养基的组成为：蛋白胨10.0g，牛肉浸膏3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH7.4±0.2；
(3)芽孢杆菌的培养条件为：培养温度为37℃，培养时间为12h；
(4)将斜面中保存的指示菌大肠杆菌O157:H7ATCC43889接种至LB液体培养基中，培养温度为37℃，培养时间为12h；
(5)LB液体培养基的组成为：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0±0.2；
(6)将活化后的指示菌大肠杆菌按照1％加入量，加入到温度为40～65℃(还未凝固)的LB琼脂培养基中，充分混匀后，慢慢倒入到长有芽孢杆菌单菌落的琼脂培养基表面，轻轻覆盖一薄层，然后进行培养；
(7)覆盖有指示菌的芽孢杆菌培养平皿，其培养温度为37℃，培养时间为12h；
(8)取出芽孢杆菌培养平皿，置于光线明亮处，观察平皿表面分离的芽孢杆菌菌落周围是否出现抑菌圈，将有抑菌圈的芽孢杆菌单菌落进行挑取；
(9)将有抑菌圈的芽孢杆菌单菌落进行挑取的方法为：用接种针或无菌牙签(或无菌枪头)穿破目标单菌落上层的指示菌琼脂，小心挑取下层的芽孢杆菌单菌落，然后进行划线纯化、保存。
实施例2抗单增李斯特菌的芽孢杆菌的筛选
(1)称取25.0g土壤样品，加入到含有225mL无菌生理盐水的三角瓶中，37℃充分振荡摇匀20min；然后将装有样品的三角瓶置于80～90℃的水浴锅中，水浴处理30min，水浴期间振荡三角瓶5次，再将高温处理后的样品用无菌生理盐水进行梯度稀释，将稀释104～106倍的菌悬液涂布于营养琼脂培养基表面。
(2)营养琼脂培养基的组成为：蛋白胨10.0g，牛肉浸膏3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH7.4±0.2；
(3)芽孢杆菌的培养条件为：培养温度为37℃，培养时间为12h；
(4)将斜面中保存的指示菌单增李斯特菌CMCC54002接种至BHI液体培养基中，培养温度为37℃，培养时间为12h；
(5)BHI液体培养基的组成为：胰蛋白胨10.0g，牛心浸粉17.5g，氯化钠5.0g，葡萄糖2.0g，磷酸氢二钠2.5g，蒸馏水1000mL，pH7.4±0.2；
(6)将活化后的指示菌单增李斯特菌按照1％加入量，加入到温度为40～65℃(还未凝固)的BHI琼脂培养基中，充分混匀后，慢慢倒入到长有芽孢杆菌单菌落的琼脂培养基表面，轻轻覆盖一薄层，然后进行培养；
(7)覆盖有指示菌的芽孢杆菌培养平皿，其培养温度为37℃，培养时间为12h；
(8)取出芽孢杆菌培养平皿，置于光线明亮处，观察平皿表面分离的芽孢杆菌菌落周围是否出现抑菌圈，将有抑菌圈的芽孢杆菌单菌落进行挑取，如图1所示；
(9)将有抑菌圈的芽孢杆菌单菌落进行挑取的方法为：用接种针或无菌牙签(或无菌枪头)穿破目标单菌落上层的指示菌琼脂，小心挑取下层的芽孢杆菌单菌落，然后进行划线纯化、保存。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种快速筛选具有抗菌活性芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述筛选方法包括如下步骤：
1)样品的稀释：稀释样品，得到样品稀释液；
2)样品稀释液的高温处理：将装有样品稀释液的三角瓶置于80～90℃的水浴锅中，水浴处理30min，期间振荡三角瓶3～5次；
3)芽孢杆菌的分离培养；
4)指示菌的琼脂覆盖；
5)抑菌圈的观察、目标菌的挑取分离和目标菌的纯化。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)具体为：将活化后的指示菌按照1％～5％的加入量，加入到温度为40～65℃未凝固的LB琼脂培养基或BHI琼脂培养基中，充分混匀后，慢慢倒入到长有芽孢杆菌单菌落的琼脂培养基表面，使其刚好覆盖芽孢杆菌的菌落，然后进行培养，培养温度为35～42℃，培养时间为6～12h；
所述指示菌为细菌，优选单增李斯特菌CMCC54002、金黄色葡萄球菌ATCC6538、猪霍乱沙门氏菌CGMCC1.1859、大肠杆菌O157:H7ATCC43889。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，指示菌的活化步骤为：将斜面中保存的指示菌接种于LB液体培养基或BHI液体培养基，培养温度为35～42℃，培养时间为12h。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤1)具体为：称取样品加入到含8～10倍(优选9倍)体积无菌生理盐水的三角瓶中，35～38℃(优选37℃)充分振荡摇匀。
5.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤3)具体为：将高温处理后的样品稀释液用无菌生理盐水进行梯度稀释，将稀释102～106倍的菌悬液涂布于营养琼脂培养基的表面进行分离培养；所述营养琼脂培养基的组成为：蛋白胨10.0g，牛肉浸膏3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH7.4±0.2。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述分离培养的培养条件为：培养温度为35～42℃，培养时间为12～24h。
7.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中：将培养后的指示菌琼脂覆盖的平板置于光线明亮处，观察芽孢杆菌菌落周围是否存在抑菌圈，将有抑菌圈的芽孢杆菌单菌落进行挑取。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述挑取方法为将有抑菌圈的芽孢杆菌单菌落进行挑取的步骤包括：用接种针或无菌牙签或无菌枪头穿破目标单菌落上层的指示菌琼脂，小心挑取下层琼脂中的芽孢杆菌菌落，然后在营养琼脂培养基上进行划线纯化、保存。
9.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述样品为土壤、发酵食品、动物肠道内容物或粪便。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述LB琼脂培养基的配方为：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0±0.2；所述BHI琼脂培养基的配方为：胰蛋白胨10.0g，牛心浸粉17.0g，氯化钠5.0g，葡萄糖2.0g，磷酸氢二钠2.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH7.4±0.2；所述LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0±0.2；所述BHI液体培养基的配方为：胰蛋白胨10.0g，牛心浸粉17.0g，氯化钠5.0g，葡萄糖2.0g，磷酸氢二钠2.0g，蒸馏水1000mL，pH7.4±0.2。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160316 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |