CN110468075B - 一株高山芽孢杆菌及其在防治荔枝霜疫病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物病害生防技术领域，公开了一株高山芽孢杆菌XJGS‑4及其在防治荔枝霜疫病中的应用。将该高山芽孢杆菌命名为高山芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)XJGS‑4，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏号为GDMCC No:60698，保藏时间为2019年6月17日。本发明得到的高山芽孢杆菌来源于健康荔枝果树根际土壤，长期与荔枝互惠共生，避免了其破坏植物表面微生态环境稳定性的可能；本发明的高山芽孢杆菌及基于其得到的生物制剂对荔枝霜疫霉均具有强烈的抑制作用，具有很好的开发应用前景。

Description

一株高山芽孢杆菌及其在防治荔枝霜疫病中的应用

技术领域

本发明属于植物病害生防技术领域，具体涉及一株高山芽孢杆菌XJGS-4 及其在防治荔枝霜疫病中的应用。

背景技术

荔枝(Litchi chinensis Sonn.)是种植在我国南方地区重要的热带及亚热带水果，其果实色香味俱佳，营养丰富，适量食用还具有药用价值，享负“中华之珍果”的盛名，是我国最具竞争力的出口水果之一。但由于荔枝成熟的季节是盛夏，采摘、运输和贮藏过程中，容易因变褐腐烂造成巨大的经济损失，而采后病害是引起腐烂的主要原因。荔枝霜疫病是采后环节中引起荔枝鲜果腐烂的主要病害。然而目前，在生产上对荔枝霜疫病的控制主要以化学防治为主。这不仅为荔枝果实的食用安全留下潜在的风险，还会促使病原微生物产生抗药性。为此，许多研究致力于开发安全高效的生物防治方法。从荔枝根际土壤中筛选拮抗微生物，能有效维持植物根际土壤的微生态环境稳定性，具有重要的现实意义。

芽孢杆菌属(Bacillus)是一种广谱性的拮抗细菌，有多个芽孢杆菌亚群在植物病害生物防治中具有重要地位。杨少波等报道了多粘芽孢杆菌 (Paenibacillus polymyxa)产生的生物活性物质能对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、黑曲霉(Aspergillusniger)等病原菌具有显著的拮抗作用，陈海英等筛选到一株多粘类芽孢杆菌对瓜类炭疽病菌、水稻纹枯病菌等真菌具有较好的抑菌作用。周佳暖等报道了一株高山芽孢杆菌对香蕉细菌病害及真菌病害具有强烈的抑制作用。因此芽孢杆菌作为一类重要的自然资源，已引起国内外研究者的广泛关注，具有开发生物农药的潜力。

发明内容

为了克服上述现有技术在防治荔枝霜疫病中的缺点与不足，开发高山芽孢杆菌的应用，本发明的首要目的在于提供一株以荔枝果树根际微生物为筛选对象，分离得到的对荔枝霜疫霉具有较好抑制作用的高山芽孢杆菌，命名为高山芽孢杆菌(Bacillusaltitudinis)XJGS-4，为生物防治代替化学防治提供新的资源与方向，未来可作为生物农药进行开发利用。

本发明另一目的在于提供一种基于上述高山芽孢杆菌制备得到的生物制剂。

本发明再一目的在于提供上述高山芽孢杆菌在防治荔枝霜疫病中的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一株高山芽孢杆菌，将其命名为高山芽孢杆菌(Bacillus altitudinis) XJGS-4，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，地址：中国广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏号为GDMCC No:60698，保藏时间为2019年6月17日。

所述的高山芽孢杆菌在LB培养基上30℃培养24h，单菌落圆形乳白色，表面褶皱。

一种生物制剂，基于上述的高山芽孢杆菌制备得到。

所述的生物制剂由所述的高山芽孢杆菌经液体发酵制备得到，优选包括以下步骤：将高山芽孢杆菌接种至LB液体培养基中培养，即可获得生物试剂。

所述LB液体培养基的pH值为7.0。

所述的培养指在28-30℃，摇床震荡速率为180-220rpm条件下培养24h。

本发明还提供上述生物制剂在防治荔枝霜疫病中的应用。

本发明还提供上述高山芽孢杆菌在防治荔枝霜疫病中的应用。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

1、本发明得到的高山芽孢杆菌来源于健康荔枝果树根际土壤，长期与荔枝互惠共生，避免了其破坏植物表面微生态环境稳定性的可能；

2、本发明的生物制剂对荔枝霜疫霉具有强烈的抑制作用，而且该生物制剂来源环保无毒性，对生态环境影响小；

3、本发明得到的高山芽孢杆菌，培养条件要求低，具有很好的开发应用前景。

附图说明

图1为高山芽孢杆菌XJGS-4在LB培养基上的单菌落图。

图2为荔枝霜疫霉的正常生长菌落形态。

图3为高山芽孢杆菌XJGS-4对荔枝霜疫霉的抑制效果图。

图4为高山芽孢杆菌XJGS-4的生物制剂对荔枝霜疫霉的抑制效果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中涉及的试剂均可从商业渠道获得。

实施例1：高山芽孢杆菌的分离、纯化和保藏

(1)LB培养基的配制：称取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加水1000mL搅拌混匀，再加琼脂15g，充分加热溶解后分装至250mL三角瓶中，121℃湿热灭菌20min，保存备用。

(2)高山芽孢杆菌的分离与纯化：用于分离拮抗菌的土壤样品采集于华南农业大学荔枝果园健康果树根际土壤。称取10g土壤样品，在无菌条件下将土样加入到盛有90mL无菌生理盐水(0.9％)的三角瓶中，置于28℃的180rpm 摇床上振荡30min，制备得到稀释倍数为10^-1的土壤稀释液，在室温下静置 10min以分离沙、石、土等固体杂质。取1mL稀释倍数为10^-1的土壤稀释液加入到9mL生理盐水的试管中，充分混匀，制备得到稀释倍数为10^-2的土壤稀释液。以此类推，将土壤液逐级稀释至10^-5。取100μL稀释液(稀释倍数分别为：10^-3、10^-4和10^-5)涂布于步骤(1)制备得到的LB固体平板上，每个稀释倍数设置3个重复，30℃培养3d，以分离土壤中的各种细菌。挑取大小、形状、颜色、质地、表面结构等特征差异明显的细菌，用平板划线法纯化获得单菌落，待用。

将纯化得到的菌株进行16S序列分析，其中一株细菌序列(如下所示)与GenBank中登录号为MN148770.1的Bacillus altitudinis strain J54同源性达 99.71％，证实其分类命名为高山芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，命名为高山芽孢杆菌(Bacillusaltitudinis)XJGS-4。序列片段如下：

AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATA CATGCAAGTCGAGCGGACAGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGC GGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACT CCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCA AGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCA TTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACT CCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGA CGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTG TTGTTAGGGAAGAACAAGTGCAAGAGTAACTGCTTGCACCTTGACGGTA CCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATAC GTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGG CGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTC ATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCAC GTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAG GCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAG CGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTA AGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCAC TCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACG GGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGA AGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTT TCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGT GTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTT AGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGTCAAAC CGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCGTCATGCCCCTTATGACCTGG GCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCGAGACCGCAA GGTTTAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAA CTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCGTGCCG CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCG

高山芽孢杆菌XJGS-4在LB培养基上30℃培养，培养48h，菌落圆形乳白色，表面褶皱(见图1)。

(3)高山芽孢杆菌XJGS-4的保藏：将该菌株于2019年6月17日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的中国广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号为GDMCC No:60698。

实施例2：对峙培养法测定高山芽孢杆菌的活性

(1)LB培养基的配制同实施例1。

(2)胡萝卜培养基的配制：称取200g胡萝卜，用榨汁机充分榨汁后用 16层纱布过滤，滤液补足水分至1000mL，再加15g琼脂，充分加热溶解后分装于锥形瓶，封口后121℃湿热灭菌20min，保存备用。

(3)高山芽孢杆菌单菌落的制备：将芽孢杆菌划线接种至LB培养基平板上活化培养24h后，挑取单菌落进行划线保存。

(4)荔枝霜疫霉的培养：接种荔枝霜疫霉至胡萝卜平板上，培养7d后，用直径为7mm的打孔器打取菌落边缘的菌饼。

(5)活性测定：将步骤(3)制得的高山芽孢杆菌划线接种到胡萝卜培养基平板边缘，在距该划线区域3cm处接种步骤(4)制得的荔枝霜疫霉菌饼，实验中以不接种高山芽孢杆菌为对照，3个重复，置于25℃下恒温培养5d，观察抑菌带边缘和对照的荔枝霜疫霉的菌丝形态，结果如图2、图3所示。与图2对比可知，本发明的高山芽孢杆菌XJGS-4对荔枝霜疫霉的生长具有明显的抑制作用，且造成了菌丝的畸形。

实施例3：牛津杯法测定高山芽孢杆菌生物制剂的活性

(1)LB培养基的配制同实施例1；LB液体培养基的制备除不加琼脂，其他与LB固体培养基的配方相同，将称得的药剂充分溶解后分装于锥形瓶(每瓶100mL培养液)，加塞、包扎，121℃灭菌20min，冷却后贮存备用。

(2)胡萝卜培养基的配制同实施例2。

(3)高山芽孢杆菌生物制剂的制备：取实例2步骤(3)制备得到的高山芽孢杆菌单菌落接入步骤(1)制备得到的LB培养液锥形瓶中，置于30℃，摇床速率为200rpm下培养24h，即可得到高山芽孢杆菌的生防制剂。

(4)荔枝霜疫霉的培养同实施例2。

(5)活性测定：将一个牛津杯置于胡萝卜培养基平板边缘，吸取200μL 步骤(3)制得的高山芽孢杆菌生物制剂至牛津杯中，在距牛津杯3cm处接种步骤(4)制得的荔枝霜疫霉菌饼，实验中以不接种高山芽孢杆菌为对照，3 个重复，置于25℃下恒温培养5d，观察抑菌带边缘和对照的荔枝霜疫霉的菌丝形态，结果如图4所示。与图2对比可知，本发明高山芽孢杆菌XJGS-4的生物制剂对荔枝霜疫霉的生长具有明显的抑制作用，且造成了菌丝的畸形。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一株高山芽孢杆菌及其在防治荔枝霜疫病中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1400

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 高山芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）XJGS-4的16S序列

<400> 1

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60

ggacagaagg gagcttgctc ccggatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120

cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggagct aataccggat agttccttga 180

accgcatggt tcaaggatga aagacggttt cggctgtcac ttacagatgg acccgcggcg 240

cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 300

ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360

gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420

cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgcaa gagtaactgc ttgcaccttg 480

acggtaccta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 540

tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagggctcg caggcggttt cttaagtctg 600

atgtgaaagc ccccggctca accggggagg gtcattggaa actgggaaac ttgagtgcag 660

aaggggagag tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca 720

gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga 780

acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt 840

ttccgcccct tagtgctgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggtcgca 900

agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 960

tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaaccc tagagatagg 1020

gctttccctt cggggacaga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga 1080

gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt 1140

gggcactcta aggtgactgc cggtgtcaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatcg 1200

tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gacagaacaa agggctgcga 1260

gaccgcaagg tttagccaat cccacaaatc tgttctcagt tcggatcgca gtctgcaact 1320

cgactgcgtg aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag cgtgccgcgg tgaatacgtt 1380

cccgggcctt gtacacaccg 1400

Claims (7)

1.一株荔枝内生短小芽孢杆菌，其特征在于将其命名为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）FRO26，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏号为GDMCC No:60725，保藏时间为2019年7月11日。

2.一种生物制剂，其特征在于利用权利要求1所述的荔枝内生短小芽孢杆菌制备得到。

3.根据权利要求2所述的生物制剂，其特征在于由包括以下步骤的方法制备得到：将所述的荔枝内生短小芽孢杆菌接种至LB液体培养基中培养，获得生物试剂。

4.根据权利要求3所述的生物制剂，其特征在于：所述LB液体培养基的pH值为6.8-7.0。

5.根据权利要求3所述的生物制剂，其特征在于：所述的培养指在28-30℃，摇床震荡速率为180-200rpm条件下培养24h。

6.权利要求2-5任一项所述的生物制剂在防治荔枝霜疫霉病中的应用。

7.权利要求1所述的荔枝内生短小芽孢杆菌在防治荔枝霜疫霉病中的应用。

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