KR101549181B1

KR101549181B1 - 솜털곰팡이병균에 대해 항균 활성을 갖는 바실러스 알티투디니스 hc7 및 이의 배양방법

Info

Publication number: KR101549181B1
Application number: KR1020130139943A
Authority: KR
Inventors: 이찬중; 전창성; 정종천; 문지원; 서장선
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2013-11-18
Filing date: 2013-11-18
Publication date: 2015-09-01
Also published as: KR20150057081A

Abstract

본 발명은 솜털곰팡이병균에 대해 항균 활성을 갖는 바실러스 알티투디니스 미생물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 버섯에 대해 높은 친화성을 가지며 생육적온이 버섯균과 유사하여 버섯균과 함께 살포하여 솜털곰팡이병원균의 생장을 억제할 수 있어 친환경방제제로 효과적인 바실러스 알티투디니스 HC7에 관한 것이다.

Description

솜털곰팡이병균에 대해 항균 활성을 갖는 바실러스 알티투디니스 HC7 및 이의 배양방법{Antimicrobial bacillus altitudinis HC7 for cladobotryum mycophilum, and process for culturing thereof}

본 발명은 솜털곰팡이병균에 대해 항균 활성을 갖는 바실러스 알티투디니스 미생물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 버섯에 대해 높은 친화성을 가질 뿐만 아니라, 생육적온이 버섯균과 유사하여 버섯균과 함께 살포하여 솜털곰팡이병원균의 생장을 억제할 수 있어 친환경방제제로 효과적인 바실러스 알티투디니스 HC7에 관한 것이다.

버섯 재배도 다른 농작물의 재배와 마찬가지로 여러 가지 병충해와 잡균으로 인하여 버섯 생산량의 감소뿐만 아니라 품질저하 등으로 인하여 농가소득을 크게 저하시켜 심한 경우는 폐농에 이르게 한다. 이와 같은 병충해와 잡균으로 인한 버섯의 피해는 버섯의 생장, 발육，운송 및 저장 등의 시기에 발생하고 있으며, 특히 버섯재배 시에 나타나는 병해는 발병의 원인에 따라 비 병원성 병해와 병원성병해로 크게 나눌 수 있다. 비 병원성 병해는 비 생물적 병해(abiotic diseases) 또는 비 전염성 병해(non-infectious diseases)라 불라고 있으며 버섯재배의 부적절한 환경조건과 열악한 재배시설에 의해서 주로 발생하고 있다.

병원성 병해는 유해생물의 기생에 의해서 발병하는 것으로 대개 전염성을 가지고 있기 때문에 병 발생면적 및 피해 정도가 현저하게 다르게 나타나는 경우도 있다. 이와 같은 병원성 병해를 전염성 병해(infectious diseases) 또는 생물적 병해 (biotic diseases)로 부르고 있으며, 버섯에 병을 유발하는 병원체는 곰팡이, 방선균, 세균, 바이러스 및 선충 등으로 알려져 있다. 이 중에서 곰팡이 및 세균이 발병시키는 버섯의 질병은 세균성 갈색무늬병, 푸른 곰팡이병, 솜털곰팡이병 등이 있다.

상기 세균성 갈색무늬병은 버섯의 갓 부분을 갈색으로 변화시켜 버섯의 양적·질적인 저하를 초래하는 질병으로 주로 슈도모나스 톨라시(Pseudomonas tolaassi)가 분비하는 톨라시(tolaasin)라고 하는 독소(toxin)에 의해서 발병한다. 등록특허 10-0267752에는 버섯 세균성 갈반 병원균을 유발하는 슈도모나스 톨라시 세균 검출 및 정량 분석하는 기술이 기재되어 있으나, 버섯재배 농가에 큰 피해를 유발하고 있는 솜털곰팡이병에 관한 연구 및 이를 효과적으로 방제할 수 있는 생물학적 방제제에 대한 연구는 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명은 버섯에 대해 높은 친화성 및 솜털곰팡이병원균의 생장을 억제할 수 있어 친환경방제제로 사용할 수 있는 바실러스 알티투디니스 HC7를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 생육적온이 버섯균과 유사하여 버섯균과 함께 살포하여 솜털공팡이병 예방을 위한, 미생물농약, 종자코팅제, 버섯의 솜털곰팡이병 방제용 미생물농약, 버섯재배용 무살균 배지제조를 위한 첨가제, 바이오상토, 미생물영양제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 및 관주살포제에 첨가될 수 있는 바실러스 알티투디니스 HC7를 제공하고자 한다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하고, 기탁번호 KACC91890P인 바실러스 알티투디니스 HC7(Bacillus altitudinis HC7)에 관한 것이다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 바실러스 알티투디니스 HC7은 버섯에서 발생하는 솜털곰팡이병에 대해 항균 활성을 가지는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 버섯은 양송이버섯, 느타리버섯 및 큰느타리버섯으로 이루어진 군 중 1종 이상의 버섯일 수 있다.

또한, 본 발명은 가용성 전분(Soluble starch), 텍스트린(Dextrine) 및 갈락토오스(Galactose)로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 탄소원; 소이톤(Soytone), 효모 추출물(Yeast extract) 및 맥아 추출물(Malt extract)로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 유기 질소원; NH₄Cl, NH₄H₂PO₄, (NH₄)₂HPO₄, NH₄NO₃ 및 NaNO₃로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 무기 질소원; 아스파라긴(Asparagine), 아스파라긴산(Aspartic acid) 및 글루탐산(Glutamic acid)으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 아미노산; 및 KCl, BaCl₂, CaCl₂, Li₂SO₄, MgSO₄, FeSO₄, Na₂MoO₄ 및 KH₂PO₄로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 무기 염류; 를 포함하는 바실러스 알티투디니스 HC7 배양용 배지을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 탄소원은 가용성 전분(Soluble starch) 및 텍스트린(Dextrine)로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하고, 상기 유기 질소원은 소이톤(Soytone)을 포함하고, 상기 무기 질소원은 NH₄H₂PO₄ 및 (NH₄)₂HPO₄로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하고, 상기 아미노산은 아스파라긴(Asparagine)을 포함하고, 상기 무기 염류는 KCl, MgSO₄ 및 FeSO₄로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 배지는 탄소원 100 중량부에 대하여 250 ~ 400 중량부의 유기 질소원, 10 ~ 100 중량부의 무기 질소원, 1 ~ 30 중량부의 아미노산 및 0.01 ~ 1 중량부의 무기 염류를 포함할 수 있다.

나아가, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하고, 기탁번호 KACC91890P인 바실러스 알티투디니스 HC7을 배양온도 25 ~ 35 ℃에서 20 ~ 30시간 동안 상술한 바와 같은 배지에 배양하는 바실러스 알티투디니스 HC7 배양 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 배양은 pH 5.5 ~ 7.0에서 배양할 수 있다.

더불어, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하고, 기탁번호 KACC91890P인 바실러스 알티투디니스 HC7을 포함하는 솜털곰팡이균 방제용 방제제를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 방제제는 미생물농약, 종자코팅제, 버섯의 솜털곰팡이병 방제용 미생물농약, 버섯재배용 무살균 배지제조를 위한 첨가제, 바이오상토, 미생물영양제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제로 이루어진 군 중 1종 이상일 수 있다.

본 발명은 버섯에 대해 높은 친화성을 가지며 솜털곰팡이병원균의 생장을 효과적으로 억제할 수 있는 바실러스 알티투디니스 HC7 및 이의 배양방법을 제공하는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 생육적온이 버섯균과 유사하여 버섯균과 함께 살포할 수 있어 친환경방제제로 효과적인 바실러스 알티투디니스 HC7를 제공하는 효과가 있다.

도 1은 실시예 2에서 선발한 HC7과 솜털곰팡이균을 대치배양한 결과이다.
도 2는 실험예 1에서 분석한 HC7의 유전적 유연관계도이다.
도 3은 실험예 2에서 측정한 방제효과 결과이다.
도 4는 실험예 3에서 배양 온도 변화에 따른 생육 활성을 측정한 결과이다.
도 5는 실험예 3에서 배양 pH 변화에 따른 생육 활성을 측정한 결과이다.
도 6은 실험예 3에서 탄소원 종류에 따른 생육 활성을 측정한 결과이다. (1: 프록토스, 2: 갈락토오스, 3: 사카로스, 4: 가용성 전분, 5: 이노시톨, 6: 글리세롤, 7: 자일로스, 8: 덱스트로스, 9: 락토오스, 10: 덱스트린, 11: Na-CMC, 12: 아도니톨, 13: 만니톨, 14: 만노스, 15: 말토오스, 16: 라피노스, 17: 셀로비스, 18: 에탄올, 19: 솔리신)
도 7은 실험예 3에서 가용성 전분의 농도에 따른 생육 활성을 측정한 결과이다.
도 8은 실험예 3에서 유기 질소원 종류에 따른 생육 활성을 측정한 결과이다. (1: 펩톤, 2: 소이톤, 3: 우레아, 4: 카사미노 산, 5: 트립톤, 6: 효모추출물, 7: 맥아 추출물)
도 9는 실험예 3에서 소이톤의 농도에 따른 생육 활성을 측정한 결과이다.
도 10은 실험예 3에서 무기 질소원 종류에 따른 생육 활성을 측정한 결과이다. (1: NH₄Cl, 2: (COONH₄)₂, 3: NH₄H₂PO₄, 4: (NH₄)₂HPO₄, 5: NH₄NO₃, 6: NaNO₃, 7: (NH₄)₂SO₄)
도 11은 실험예 3에서 (NH₄)₂HPO₄의 농도에 따른 생육 활성을 측정한 결과이다.
도 12는 실험예 3에서 아미노산 종류에 따른 생육 활성을 측정한 결과이다. (1: 아스파라긴, 2: 메사이오닌, 3: 프롤린, 4: 류신, 5: 글루타민, 6: 발린, 7: 아스파라긴산, 8: 글루타믹 산, 9: 아르기닌, 10: 히스티딘, 11: 시스테인, 12: 트레오닌)
도 13은 실험예 3에서 아스파라긴의 농도에 따른 생육 활성을 측정한 결과이다.
도 14는 실험예 3에서 무기 염류 종류에 따른 생육 활성을 측정한 결과이다. (1: KCl, 2: BaCl₂, 3: CaCl₂, 4: CoCl₂, 5: Li₂SO₄, 6: MnSO₄, 7: MgSO₄, 8: ZnSO₄, 9: FeSO₄, 10: AgNO₃, 11: Na₂MoO₄, 12: KH₂PO₄, 13: FeCl₃)
도 15는 실험예 3에서 KCl의 농도에 따른 생육 활성을 측정한 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 버섯에 병을 유발하는 병원체 중 곰팡이 및 세균, 특히 세균성갈색무늬병 및 푸른곰팡이병에 관한 연구는 활발하나, 버섯재배 농가에 큰 피해를 유발하고 있는 솜털곰팡이병에 관한 연구 및 이를 효과적으로 방제할 수 있는 생물학적 방제제에 대한 연구는 미비한 실정이다.

본 발명은 기탁번호 KACC91890P인 바실러스 알티투디니스 HC7를 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해, 버섯에 대해 높은 친화성을 가지며 솜털곰팡이병원균의 생장을 효과적으로 억제할 수 있으며, 생육적온이 버섯균과 유사하여 버섯균과 함께 살포할 수 있어 친환경방제제로 효과적인 바실러스 알티투디니스 HC7를 제공하는 효과가 있다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하고, 기탁번호 KACC91890P인 바실러스 알티투디니스 HC7을 제공한다.

상기 바실러스 알티투디니스 HC7은 버섯에서 발생하는 솜털곰팡이병에 대해 항균 활성을 가져 솜털곰팡이병원균의 생장을 효과적으로 억제할 수 있다.

상기 버섯은 통상적으로 농가에서 재배되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 양송이버섯, 느타리버섯 및 큰느타리버섯으로 이루어진 군 중 1종 이상의 버섯일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 양송이버섯일 수 있다.

또한, 본 발명은 가용성 전분(Soluble starch), 텍스트린(Dextrine) 및 갈락토오스(Galactose)로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 탄소원; 소이톤(Soytone), 효모 추출물(Yeast extract) 및 맥아 추출물(Malt extract)로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 유기 질소원; NH₄Cl, NH₄H₂PO₄, (NH₄)₂HPO₄, NH₄NO₃ 및 NaNO₃로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 무기 질소원; 아스파라긴(Asparagine), 아스파라긴산(Aspartic acid) 및 글루탐산(Glutamic acid)으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 아미노산; 및 KCl, BaCl₂, CaCl₂, Li₂SO₄, MgSO₄, FeSO₄, Na₂MoO₄ 및 KH₂PO₄로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 무기 염류; 를 포함하는 바실러스 알티투디니스 HC7 배양용 배지를 제공한다.

상기 바실러스 알티투디니스 HC7 배양용 배지는 통상적인 배지에 사용되는 탄소원, 유기 질소원, 무기 질소원, 아미노산 및 무기 염류 혼합비라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 탄소원 100 중량부에 대하여 250 ~ 400 중량부의 유기 질소원, 10 ~ 100 중량부의 무기 질소원, 1 ~ 30 중량부의 아미노산 및 0.01 ~ 1 중량부의 무기 염류를 포함할 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 탄소원은 가용성 전분(Soluble starch) 및 텍스트린(Dextrine)로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하고, 상기 유기 질소원은 소이톤(Soytone)을 포함하고, 상기 무기 질소원은 NH₄H₂PO₄ 및 (NH₄)₂HPO₄로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하고, 상기 아미노산은 아스파라긴(Asparagine)을 포함하고, 상기 무기 염류는 KCl, MgSO₄ 및 FeSO₄로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.

만약, 가용성 전분 또는 텍스트린을 탄소원으로 사용하여 배양할 경우, 도면 6에서 확인되는 바와 같이 높은 생육을 확인할 수 있었다.

만약, 소이톤을 유기 질소원으로 사용하여 배양할 경우, 도면 8에서 확인되는 바와 같이 높은 생육을 확인할 수 있었다.

만약, NH₄H₂PO₄ 및/또는 (NH₄)₂HPO₄을 무기 질소원으로 사용하여 배양할 경우, 도면 10에서 확인되는 바와 같이 높은 생육을 확인할 수 있었다.

만약, 아스파라긴을 무기 질소원으로 사용하여 배양할 경우, 도면 12에서 확인되는 바와 같이 높은 생육을 확인할 수 있었다.

만약, KCl, MgSO₄ 및/또는 FeSO₄를 무기 염류로 사용하여 배양할 경우, 도면 14에서 확인되는 바와 같이 높은 생육을 확인할 수 있었다.

나아가, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하고, 기탁번호 KACC91890P인 바실러스 알티투디니스 HC7을 배양하는 방법을 제공한다.

상기 배양의 조건은 배양온도 25 ~ 35 ℃에서 20 ~ 30시간 동안 배양하는 것으로서, 보다 바람직하게는 28 ~ 33 ℃에서 22 ~ 27시간 동안 배양하는 것일 수 있다(도 4 참조).

만약, 25 ℃ 미만의 온도에서 배양할 경우, 균사생육이 아주 느려 장시간 배양해야 할 문제가 발생할 수 있으며, 35 ℃를 초과하는 온도에서 배양할 경우, 급격한 균사생육 억제와 장기간 배양시 균주 사멸의 문제가 발생할 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 배양은 pH 5.5 ~ 7.0에서 배양할 수 있으며, 보다 바람직하게는 pH 5.8 ~ 6.8에서 배양할 수 있다.(도 5 참조).

게다가, 만약, pH 5.5 미만의 pH에서 배양할 경우, 생육이 저조하여 배양시간이 길어지는 문제가 발생할 수 있으며, pH 7.0을 초과하는 pH에서 배양할 경우, 생육이 급격하게 느려져 장시간 배양의 문제가 발생할 수 있다.

상기 바실러스 알티투디니스 HC7을 포함하는 방제제는 솜털곰팡이병 예방 및 치료를 위해 사용되는 통상의 방제제라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 미생물농약, 종자코팅제, 버섯의 솜털곰팡이병 방제용 미생물농약, 버섯재배용 무살균 배지제조를 위한 첨가제, 바이오상토, 미생물영양제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제로 이루어진 군 중 1종 이상일 수 있다.

특히, 양송이버섯 배양시 문제가 되는 솜털곰팡이병균(Cladobotryum mycophilum)의 성장억제에 탁월한 효과가 있어, 버섯의 솜털곰팡이병 방제용 미생물 농약, 버섯재배용 무살균 배지제조를 위한 첨가제, 바이오상토의 제조에도 활용될 수 있다.

상기 미생물농약은 바실러스 알티투디니스 HC7를 포함하여 통상의 방법으로 제조된 것이라면 특별히 제한하지 않는다.

예를 들면, 바실러스 알티투디니스 HC7 및 미생물 담체인 바이오 매트릭스를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 바이오 매트릭스는 식물자원 고분자 재료, 미생물 기원 생체 고분자 재료, 영양제, 보조 재료 및 첨가제를 포함할 수 있다.

또한, 상기 식물자원 고분자 재료는 감자가루, 콩가루, 전분가루 등을 포함할 수 있으며, 상기 미생물기원 생체 고분자는 뮤코폴리사카라이드, 폴리-베타하이드록시-알카노에이트 및 응집제를 포함할 수 있다. 나아가, 상기 영양제는 포도당, 펩톤 및 무기염류를 포함할 수 있으며, 상기 보조 재료는 질석, 왕겨 태운가루 등을 포함할 수 있고, 상기 첨가제는 증량제, UV 차단제, 계면활성제를 포함할 수 있다.

상기 미생물농약은 항진균 미생물농약, 종자 코팅제, 미생물영양제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제 등으로 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

준비예 . 솜털곰팡이균 분리 동정

양송이버섯 재배농가에서 솜털곰팡이병 증상을 보이는 자실체의 이병 부위를 표면살균한 후 1㎝ 크기로 절단하여 감자 덱스트로스 한천(PDA; potato dextrose agar) 배지에 치상하여 25 ℃의 항온기에서 3~4일 배양하면서 자라나온 균사 선단부위를 화염 멸균한 칼을 사용하여 5㎜ 크기로 잘라서 PDA에 다시 배양하여 병원균을 순수 분리하였다. 이후 순수 분리한 병원균병원균의 유전자를 추출하여 범용 프라이머 ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3')과 ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')에 위해 증폭된 rDNA의 ITS(internal transcribed spacers)영역의 유전자 분석, 생리ㆍ생화학 및 형태 등 균학적특성, 생물검정을 통한 병원성검정을 통하여 Cladobotryum mycophilum 균(C. mycophilum 균)으로 동정하였다.

이후 동정한 C. mycophilum 균의 병원성 유무를 조사하기 위하여 멸균수에 병원균의 포자밀도가 5×10⁵/㎖가 되도록 희석하여 접종원으로 사용하여 양송이버섯의 갓 표면에 희석한 병원균 포자를 분무하여 25℃, 95%의 항온기에 넣어 2일 후 병원성 유·무를 확인하였다.

확인 결과 균주에 따라 약간의 차이는 있었지만 양송이 버섯균주와 자실체에 전형적인 솜털곰팡이병 증상의 병원성을 보여, 병원성이 있는 C. mycophilum 균임을 확인할 수 있었다.

실시예 1. 유용한 미생물의 분리 및

유용한 미생물을 분리하기 위해, 현재 양송이버섯을 재배중인 농가에서 양송이버섯을 재배중인 양송이버섯 배지를 농가별로 3점씩 채취하여 실험에 사용하였다. 상기 배지를 상기 배지를 멸균수를 이용하여 연속희석법으로 단계별로 희석하여 R2A 고체배지에 도말하여 28℃ 배양기에서 24 시간 동안 배양하여 50 ~ 60개의 콜로니(colony)를 형성한 플레이트(plate)로 부터 단일콜로니를 분리하여 미생물로 사용하였다.

상기 미생물은 1,500 균주였고, 상기 균주를 R2A배지에서 2일 동안 배양한 후 균체를 모아서 20%(v/v) 글리세롤 용액에 넣어 -70℃에 보존하면서 사용하였다.

실시예 2. 항균 미생물 선발

실시예 1에서 분리한 균주 중 항균 미생물을 선발하기 위하여 대치배양법으로 실험하였다.

구체적으로, 대량의 분리 균주를 효과적으로 검정하기 위하여 1개의 페트리접시(petridish)에 상기 실시예 1에서 분리한 균주 중 4균주를 동일한 간격으로 접종하여 실험하였다. 대치배양에 이용할 솜털곰팡이균은 준비예에서 병원성을 확인한 것으로, PDA 배지에 5일간 배양 후 콕 보러(cork borer)를 이용하여 가장자리를 채취하여 검정용 PDA 배지의 정 가운데에 치상하여 생육저지환의 정도에 따라 각 균주에 대한 항균능력을 평가하였다.

상기 항균 능력 평가 결과, 실시예 1에서 분리한 1,500 균주 중 가장 강한 항균활성을 나타내는 항균미생물 HC7, HC15 및 HC94 3종을 선발하였으며, 이들 중 HC7이 가장 높은 항균활성을 보여 HC7을 항균 미생물로 선발하였다. HC7의 대치배양 결과는 도면 1에 나타내었다.

실험예 1. 선발한 항균 미생물의 동정

실시예 2에서 선발한 항균 미생물 HC7의 분리학적 동정을 위하여 유전적 유연관계를 분석하였다.

유전적 유연관계는 DNA는 Quiagen Genomic DNA Isolation Kit(Quiagen, USA)을 사용하여 분리하였고, PCR 증폭은 Techne thermocycler(Techne LTD, Duxford, Cambridge, U.K.)로 수행하였다. PCR 반응혼합액은 1 x buffer (10 mM Tris-HCl pH 9.0, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl₂, 0.01% gelatin and 0.1% Triton X-100), 최종농도 200 ㎛의 deoxyribonucleotide triphosphates(dATP, dCTP, dTTP), 0.6 U Taq DNA polymerase(Molecular Biochemicals, Mt Wellington, Auckland, New Zealand), 최종농도 2 ㎛의 정, 역방향의 프라이머[정방향 프리아머: fD1(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 역방향 프라이머: rP2(5'-ACGGCTACCTTGTT ACGACTT-3')] 그리고 10 ng template DNA로 이루어졌다. PCR은 94℃에서 1분, 56℃에서 1분 그리고 72℃에서 2분간 30회 반복으로 수행하였고, 반응 후 프아리머와 dNTP는 High Pure PCR Product Purification Kit(Bioneer Co., Chungbuk, Korea)을 사용하여 PCR 산물로부터 제거하여 정제하였다.

정제한 PCR 산물은 pT7 blue Vector(Novagen Co., Madison, WI, USA)에 클로닝하여 Big Dye Terminator Kit와 ABI Prism 310 Genetic Analyzer(Perkin Elmer, New Jersey, USA)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. 종 유사성 결정을 위해 ClustralW 분석프로그램을 사용하여 GenBank에 있는 다른 염기서열들과 비교하였다. MEGA 4의 Neighbor-joining 방법을 이용하여 계통수를 작성하였으며, tree의 안정성은 1000 반복의 bootstrap 분석으로 조사하였다.

이후 16S rDNA을 분석하고 각종 생화학적 성상검사와 미생물학적 분류 방법(Bergey's manual of systematic bacteriology 색인 이용)으로 최종 동정하였다. 동정 결과는 하기 도면 2에 나타냈으며, 본 발명의 HC7의 16S rDNA의 염기서열은 서열번호 1과 같다.

도 2에서 확인되는 바와 같이, HC7은 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) 종인 것을 확인할 수 있었다.

이후 HC7의 생물학적 특성을 파악하기 위하여 하기 표 1에 기재되어 있는 여러 조건에서의 생장을 확인하였다. 생장 결과는 하기 표 1에 하였다.

실험예 2. 항균 미생물의 방제효과 검정

HC7의 솜털곰팡이병해의 방제효과를 검정하기 위해, 상자(30 ㎝ × 20 ㎝)에 재배된 양송이버섯을 실험에 사용하였다. 양송이버섯 자실체에 준비예에서 병원성을 확인한 병원균 포자현탁액을 분무살포하고 30분 후 실시예 1에서 제조한 20%(v/v) 글리세롤 용액에 넣어 -70℃에 보존한 현탁액 중 실시예 2에서 선발한 HC7의 현탁액을 분무살포하고 온도 17℃, 습도 87%의 생육실에서 재배하면서 병 발생율을 조사하였다. 방제효과 결과는 하기 표 2 및 도면 3에 나타냈다.

표 2 및 도 3에서 확인되는 바와 같이, 무처리구에서는 88.7%의 이병율을 보였지만 항균 미생물인 HC7를 처리한 군에서는 19.3%의 이병율을 보여 78.2%의 높은 방제효과를 확인할 수 있었다.

실험예 3. 배양조건 조사

HC7의 최적 배양조건을 조사하기 위해, 기초 배지(M9 Minimal medium, MBcell)를 사용하여 pH 3 ~10, 배양온도 10 ~ 45 ℃, 탄소원, 질소원 및 무기염류의 적정 첨가량에 따른 생육 및 항균활성을 조사하였다.

구체적으로 생육은 R2A 액체배지에 1×10⁷ cfu/ml 농도로 접종하여 30 ℃에서 24시간 동안 180rpm으로 진탕배양 후 분광광도계(US/Spectramax Plus 38, USA)로 흡광도를 측정하여 조사하였고, 항균활성은 PDA배지에 솜털곰팡이병원균을 접종하고 항균미생을 접종하여 3~5일 정도 대치배양 후 항균활성을 측정하였다. 배양 조건에 따른 생육 및 항균 활성 결과는 도면 4 내지 15에 나타냈다.

도 4에서 확인되는 바와 같이, 배양 온도가 25 ℃에서부터 급격히 생육이 증가하기 시작하여 35℃까지 유지되었으며 그 이상에서는 급격히 생육이 낮아졌다. 또한 이러한 온도 범위 안에서도 30 ℃에서 최적의 생육을 보이는 것으로 확인할 수 있었다.

또한, 도 5에서 확인되는 바와 같이, 배양 pH가 5에서부터 급격히 활성이 증가하여 7까지 그 활성이 유지되었으며, pH 6에서 가장 생육이 좋았다.

이로 인해, 배양 온도 25 ~ 35 ℃ 및 pH 5.5 ~ 7.0에서 병원균인 솜털곰팡이병균에 대해 강한 억제력을 나타내었다.

나아가, 도 6에서 확인되는 바와 같이, 탄소원의 종류는 프록토스, 갈락토오스, 사카로스, 가용성 전분, 이노시톨, 글리세롤, 자일로스, 덱스트로스, 락토오스, 덱스트린, Na-CMC, 아도니톨, 만니톨, 만노스, 말토오스, 라피노스, 셀로비스, 에탄올, 솔리신을 대상으로 생육을 조사한 결과, 가용성 전분(Soluble starch), 텍스트린(Dextrine) 및 갈락토오스(Galactose)에서 활성이 있는 것을 확인할 수 있었다. 더불어, 이 중 최적의 탄소원은 가용성 전분(Soluble starch)이고, 도 7에서 확인되는 바와 같이 최적 농도는 3% 가용성 전분에서 HC7의 배양시 활성이 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 8에서 확인되는 바와 같이, 유기질소원의 종류는 펩톤, 소이톤, 우레아, 카사미노 산, 트립톤, 효모추출물, 맥아 추출물을 그 대상으로 하였으며, 이중 소이톤(Soytone), 효모 추출물(Yeast extract) 및 맥아 추출물(Malt extract)에서 높은 활성을 확인할 수 있었다. 나아가, 이 중 최적의 유기 질소원은 소이톤(Soytone)이고, 도 9에서 확인되는 바와 같이 최적 농도는 10% 소이톤에서 HC7의 배양시 활성이 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다.

더불어, 도 10에서 확인되는 바와 같이, 무기질소원의 종류는 NH₄Cl, (COONH₄)₂, NH₄H₂PO₄, (NH₄)₂HPO₄, NH₄NO₃, NaNO₃, (NH₄)₂SO₄를 그 대상으로 하였으며, 이 중 NH₄Cl, NH₄H₂PO₄, (NH₄)₂HPO₄, NH₄NO₃ 및 NaNO₃에서 활성이 확인되었고, 이 중 최적의 무기 질소원은 (NH₄)₂HPO₄이고, 도 11에서 확인되는 바와 같이, 최적 농도는 1% (NH₄)₂HPO₄에서 HC7의 배양시 활성이 가장 우수하였다.

게다가, 도 12에서 확인되는 바와 같이, 아미노산의 종류는 아스파라긴, 메사이오닌, 프롤린, 류신, 글루타민, 발린, 아스파라긴산, 글루타믹 산, 아르기닌, 히스티딘, 시스테인, 트레오닌을 그 대상으로 하였으며, 이 중 아스파라긴(Asparagine), 아스파라긴산(Aspartic acid) 및 글루탐산(Glutamic acid)에서 활성이 확인할 수 있었다. 또한, 도 13에서 확인되는 바와 같이, 이 중 최적의 아미노산은 아스파라긴(Asparagine)으로서 0.5%의 농도에서 HC7의 배양시 활성이 가장 우수하였다.

나아가, 도 14에서 확인되는 바와 같이, 무기물의 종류는 KCl, BaCl₂, CaCl₂, MgSO₄, ZnSO₄, FeSO₄, AgNO₃, Na₂MoO₄, KH₂PO₄, FeCl₃, CoCl₂, Li₂SO₄, MnSO₄를 대상으로 하였으며, 이 중 KCl, BaCl₂, CaCl₂, Li₂SO₄, MgSO₄, FeSO₄, Na₂MoO₄, KH₂PO₄에서 활성이 확인할 수 있었다. 더불어, 이 중 최적의 무기물은 KCl이였고, 도 15에서 확인되는 바와 같이 1 mM의 KCl에서 HC7의 배양시 활성이 가장 우수하였다.

하기 표 3에는 상기 최적 배양 결과를 나타내었다.

상기 실시예 및 실험예를 통해 확인할 수 있듯이, 본원 발명의 항균 미생물인 HC7은 버섯에 대해 높은 친화성을 가지며 생육적온이 버섯균과 유사하여 버섯균과 함께 살포하여 솜털곰팡이병원균의 생장을 억제할 수 있어 친환경방제제로 적합한 것을 확인할 수 있었다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT:RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Antimicrobial bacillus altitudinis HC7 for cladobotryum mycophilum, and process for culturing thereof <130> 1040144 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1363 <212> DNA <213> Agaricus bisporus <400> 1 ttgctcccgg atgttagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac 60 tgggataact ccgggaaacc ggagctaata ccggatagtt ccttgaaccg catggttcaa 120 ggatgaaaga cggtttcggc tgtcacttac agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg 180 tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca 240 ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat 300 ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct 360 ctgttgttag ggaagaacaa gtgcaagagt aactgcttgc accttgacgg tacctaacca 420 gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc 480 cggaattatt gggcgtaaag ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc 540 ggctcaaccg gggagggtca ttggaaactg ggaaacttga gtgcagaaga ggagagtgga 600 attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac 660 tctctggtct gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac 720 cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt 780 gctgcagcta acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa 840 aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga 900 agaaccttac caggtcttga catcctctga caaccctaga gatagggctt tcccttcggg 960 gacagagtga caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag 1020 tcccgcaacg agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt 1080 gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg 1140 acctgggcta cacacgtgct acaatggaca gaacaaaggg ctgcgagacc gcaaggttta 1200 gccaatccca caaatctgtt ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc 1260 tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1320 acaccgcccg tcacaccacg agagtttgca acacccgaag tcg 1363

Claims

서열번호 1의 염기서열을 포함하고, 기탁번호 KACC91890P인 바실러스 알티투디니스 HC7(Bacillus altitudinis HC7).
제1항에 있어서, 상기 바실러스 알티투디니스 HC7은 버섯에서 발생하는 솜털곰팡이병균(Cladobotryum mycophilum)에 대해 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 바실러스 알티투디니스 HC7.
제2항에 있어서, 상기 버섯은 양송이버섯, 느타리버섯 및 큰느타리버섯으로 이루어진 군 중 1종 이상의 버섯인 것을 특징으로 하는 바실러스 알티투디니스 HC7.
가용성 전분(Soluble starch), 텍스트린(Dextrine) 및 갈락토오스(Galactose)로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 탄소원;
소이톤(Soytone), 효모 추출물(Yeast extract) 및 맥아 추출물(Malt extract)로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 유기 질소원;
NH₄Cl, NH₄H₂PO₄, (NH₄)₂HPO₄, NH₄NO₃ 및 NaNO₃로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 무기 질소원;
아스파라긴(Asparagine), 아스파라긴산(Aspartic acid) 및 글루탐산(Glutamic acid)으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 아미노산; 및
KCl, BaCl₂, CaCl₂, Li₂SO₄, MgSO₄, FeSO₄, Na₂MoO₄ 및 KH₂PO₄로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 무기 염류;를 포함하며,
서열번호 1의 염기서열을 포함하고, 기탁번호 KACC91890P인 바실러스 알티투디니스 HC7 배양용 배지.
제4항에 있어서, 상기 탄소원은 가용성 전분(Soluble starch) 및 텍스트린(Dextrine)로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하고, 상기 유기 질소원은 소이톤(Soytone)을 포함하고, 상기 무기 질소원은 NH₄H₂PO₄ 및 (NH₄)₂HPO₄로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하고, 상기 아미노산은 아스파라긴(Asparagine)을 포함하고, 상기 무기 염류는 KCl, MgSO₄ 및 FeSO₄로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 바실러스 알티투디니스 HC7 배양용 배지.
제4항에 있어서, 상기 배지는 탄소원 100 중량부에 대하여 250 ~ 400 중량부의 유기 질소원, 10 ~ 100 중량부의 무기 질소원, 1 ~ 30 중량부의 아미노산 및 0.01 ~ 1 중량부의 무기 염류를 포함하는 것을 특징으로 하는 바실러스 알티투디니스 HC7 배양용 배지.
서열번호 1의 염기서열을 포함하고, 기탁번호 KACC91890P인 바실러스 알티투디니스 HC7을 배양온도 25 ~ 35 ℃에서 20 ~ 30시간 동안 제5항의 배지에 배양하는 것을 특징으로 하는 바실러스 알티투디니스 HC7 배양 방법.
제7항에 있어서, 상기 배양은 pH 5.5 ~ 7.0에서 배양하는 것을 특징으로 하는 바실러스 알티투디니스 HC7 배양 방법.
서열번호 1의 염기서열을 포함하고, 기탁번호 KACC91890P인 바실러스 알티투디니스 HC7을 포함하는 솜털곰팡이균 방제용 방제제.
제9항에 있어서, 상기 방제제는 미생물농약, 종자코팅제, 버섯재배용 무살균 배지제조를 위한 첨가제, 엽면살포제 및 관주살포제로 이루어진 군 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 솜털곰팡이균 방제용 방제제.