CN115053983B - 一种利用高地芽孢杆菌J54降解烟叶中TSNAs的液态发酵方法 - Google Patents

一种利用高地芽孢杆菌J54降解烟叶中TSNAs的液态发酵方法 Download PDF

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Abstract

一种利用高地芽孢杆菌J54菌株降低烟叶TSNAs的方法，包括以下步骤：A、烟叶粉碎：将烤干后的硃砂烟烟叶研磨成粉末，过筛；B、菌液制备：将甘油管保存的高地芽孢杆菌J54菌种于LB固体培养基上划线，然后置于28‑30℃恒温培养箱中培养，挑选一颗单菌落转接至LB液体培养基中，置于恒温振荡培养箱中培养20‑50h得到发酵菌剂，然后用无菌去离子水将菌剂的OD值调至OD600＝1.8‑2.0，得到菌液；C、发酵：将烟叶粉末加入到无机盐基础培养基中作为菌株的营养源，经高压蒸汽灭菌后再加入菌液，所述菌液的使用量为发酵体系总体积的0.8‑1.2％，置于28‑30℃恒温振荡培养箱中以150‑160rpm/min的转速培养6‑8天或置于35‑37℃恒温振荡培养箱中以150‑160rpm/min的转速培养7‑21天。本发明开拓性的通过接种菌种降低烟叶TSNAs。

Description

一种利用高地芽孢杆菌J54降解烟叶中TSNAs的液态发酵方法
技术领域
本发明属于烟草工业技术领域，具体涉及一种利用高地芽孢杆菌J54菌株降低烟叶 TSNAs的方法。
背景技术
烟草特有亚硝胺(TSNAs)是一类烟碱的总称，这类烟碱仅存在于烟草及烟气中，属于 N-亚硝胺类化合物，目前已经分离鉴定出的TSNAs共有8种，研究较为深入的主要包括4种含量最高的物质：N-亚硝基降烟碱(NNN)、4-(N-甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)和N-亚硝基假木贼碱(NAB)，这些物质具有较强的致癌性，对吸烟者的健康危害极大。
早在1962年，国际上就首次报道了关于TSNAs的潜在致癌作用，会导致人类口腔、食道、胃、肺部、胰脏、肝脏等部位形成肿瘤，其中，NNN和NNK是致癌性最强的两种物质，尤其对啮齿动物具有强致癌性，NNK被国际癌症研究机构(IARC)确定为Ⅰ类致癌物(IARC GroupⅠ)，可使动物和人体组织中的DNA出现甲基化，引发肿瘤的可能性增大。因此，降低烟草特有亚硝胺含量对提高烟草品质和安全性至关重要，已成为近年的研究热点。
研究表明，烟草特有亚硝胺(TSNAs)在成熟采收的鲜烟叶中含量极低，主要在烟叶的调制过程中产生和积累。前人已在多方面探索了降低烟叶中亚硝胺(TSNAs)的方法，其中多涉及烤烟和卷烟的工艺环节等，包括使用装置、烟叶调制、改进工艺等，但对烟叶中TSNAs含量降低的整体效果并不十分明显。
发明内容
为了解决现有技术对烟叶中TSNAs含量降低的不足，本发明提供一种操作简便，能高效定向降解烟叶TSNAs含量且抗逆性好的利用高地芽孢杆菌J54降低烟叶TSNAs的方法。
本发明的技术方案如下：
一种利用高地芽孢杆菌J54菌株降低烟叶TSNAs的方法，其特征在于包括以下步骤：
A、烟叶粉碎：将烤干后的硃砂烟烟叶研磨成粉末，然后过筛，得到发酵原材料；
B、菌液制备：将甘油管保存的高地芽孢杆菌J54菌种于LB固体培养基上划线，然后置于28-30℃恒温培养箱中过夜培养至长出单菌落，挑选一颗单菌落转接至LB液体培养基中，置于28-30℃、150-160rpm/min恒温振荡培养箱中培养20-50h得到发酵菌剂，然后用无菌去离子水将菌剂的OD值调至OD600＝1.8-2.0，得到菌液；
C、发酵：将烟叶粉末加入到无机盐基础培养基中作为菌株的营养源，经高压蒸汽灭菌后再加入菌液，所述菌液的使用量为发酵体系总体积的0.8-1.2％，置于28-30℃恒温振荡培养箱中以150-160rpm/min的转速培养6-8天或置于35-37℃恒温振荡培养箱中以150-160 rpm/min的转速培养7-21天。
优选的，在步骤A中过50目筛。
优选的，步骤B中所述恒温培养箱和恒温振荡培养箱的温度为28℃，所述恒温振荡培养箱为150rpm/min，培养48h，OD值调至OD600＝2.0。
优选的，步骤C中所述恒温振荡培养箱为160rpm/min。
优选的，于所述高地芽孢杆菌J54菌株的保藏编号为CCTCC No.M2019667。
优选的，步骤C中无机盐基础培养基的配方如下，以g/L计：
K2HPO4：0.2；
KH2PO4：0.8；
MgSO4：0.2；
CaSO4·H2O：0.1；
Na2MoO4：0.0033；
FeSO4·7H2O：0.005，
按5.00g烟叶粉末对应45ml的无机盐的比例添加。
优选的，步骤C所述菌液的每次使用量为烟草培养基总体积的1％。
优选的，所述C步骤中烟叶采用液态发酵，温度设置为28℃，发酵时间7天。
本发明的有益技术效果如下：
1、本发明首次将高地芽孢杆菌J54用于烟叶的液态发酵过程以降低TSNAs含量，烟叶的TSNAs含量降低幅度可达35％以上。
2、本发明使用特别筛选的J54(保藏编号为CCTCC NO：M2019665)菌株，菌株使用成本低，菌液应用于烟叶的操作便捷，在发酵过程中即可以达到降低TSNAs的目的。
3、本发明基于J54菌株的自身繁衍特性，通过在发酵过程中调控温度和时间，给菌株提供了适于生存的环境，从而提高接种菌株的存活率及活跃度，提高了TSNAs的降解率。
综上，本发明开拓性的通过接种菌种降低烟叶TSNAs，具有成本低、生态相容性好、无二次污染、操作简便、高效定向、抗逆性好等优点，因此应用微生物来降低烟叶中的TSNAs含量是非常理想的途径。烟叶TSNAs含量降低的实现，对提高烟草品质，减轻TSNAs对人体健康及生活环境带来的危害均具有重要意义。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例包括采收、烘烤、发酵步骤，具体步骤如下：
A、烟叶粉碎：将烤干后将硃砂烟烟叶研磨成粉末，然后过50目筛，得到发酵原材料。
B、菌液制备：将甘油管保存的高地芽孢杆菌J54菌种(保藏编号为CCTCC NO：M2019665。)于LB固体培养基上划线，然后置于28℃恒温培养箱中过夜培养至长出单菌落。挑选一颗单菌落转接至5ml LB液体培养基中，置于28℃、150rpm/min恒温振荡培养箱中培养48h得到发酵菌剂，然后用无菌去离子水将菌剂的OD值调至OD600＝2.0，得到菌液。
C、发酵：称取5.00g烟叶粉末加入到45ml的无机盐基础培养基中定容至50ml制成烟叶培养基，将培养基置于120℃高温灭菌锅中灭菌15min，得到无菌的烟叶培养基；在超净工作台中取500μl制好的J54菌液加入烟草培养基中，用封口膜封住，置于28℃恒温振荡培养箱中以160rpm/min的转速培养7天，即可得到低TSNAs的烟叶。所述菌液的每次使用量为烟草培养基总体积的1％。
对比例1
在实施例1的基础上，在超净工作台中向灭菌后的烟叶培养基中加入500μl的无菌去离子水，封口后置于28℃恒温振荡培养箱中，以160rpm/min的转速振荡培养7天。
实施例2
在实施例1的基础上，在超净工作台中向灭菌后的烟叶培养基中加入500μl制好的菌液，封口后置于35℃恒温振荡培养箱中，以160rpm/min的转速振荡培养7天。
对比例2
在实施例1的基础上，在超净工作台中向灭菌后的烟叶培养基中加入500μl的无菌去离子水，封口后置于35℃恒温振荡培养箱中，以160rpm/min的转速振荡培养7天。
实施例3
在实施例1的基础上，在超净工作台中向灭菌后的烟叶培养基中加入500μl制好的菌液，封口后置于35℃恒温振荡培养箱中，以160rpm/min的转速振荡培养14天。
对比例3
在实施例1的基础上，在超净工作台中向灭菌后的烟叶培养基中加入500μl的无菌去离子水，封口后置于35℃恒温振荡培养箱中，以160rpm/min的转速振荡培养14天。
实施例4
在实施例1的基础上，在超净工作台中向灭菌后的烟叶培养基中加入500μl制好的菌液，封口后置于35℃恒温振荡培养箱中，以160rpm/min的转速振荡培养21天。
对比例4
在实施例1的基础上，在超净工作台中向灭菌后的烟叶培养基中加入500μl的无菌去离子水，封口后置于35℃恒温振荡培养箱中，以160rpm/min的转速振荡培养21天。
对比例5
在实施例1的基础上，将接种了500μl高地芽孢杆菌J54的烟叶培养基置于28℃恒温振荡培养箱中，以160rpm/min的转速振荡培养14天，测定其在烟叶TSNAs降解中的作用。
对比例5’
在实施例1的基础上，在超净工作台中向灭菌后的烟叶培养基中加入500μl的无菌去离子水，封口后置于28℃恒温振荡培养箱中，以160rpm/min的转速振荡培养14天。
对比例6
在实施例1的基础上，将接种了高地芽孢杆菌J54的烟叶培养基置于28℃恒温振荡培养箱中，以160rpm/min的转速振荡培养21天，测定其在烟叶TSNAs降解中的作用。
对比例6’
在实施例1的基础上，在超净工作台中向灭菌后的烟叶培养基中加入500μl的无菌去离子水，封口后置于28℃恒温振荡培养箱中，以160rpm/min的转速振荡培养21天。
以上各实验结束进行对比，将发酵液转至无菌的50ml离心管中，在室温下以4500rpm/min的转速离心10min，弃上清，收集沉淀，再用无菌去离子水洗涤沉淀一次。将获得的烟叶碎末沉淀和菌体混合物置于55℃烘箱，彻底蒸发水分。
测定发酵完成烟叶中TSNAs的含量如表1(每组对比例分别对比)。
表1接种菌种后28℃发酵烟叶TSNAs含量
Figure BDA0003742775350000051
实验结果：
在烟叶的发酵过程中，按照发酵体系体积的1％接种量接入OD600＝2.0的高地芽孢杆菌 J54菌液并在将发酵体系分别置于28℃和35℃条件下发酵，结果表明：
由表1可知，实施例1在28℃条件下发酵7天，其TSNAs含量下降了35.86％，降解效果具有显著性；对比例5在28℃条件下发酵14天对烟叶中TSNAs含量的降解效果不显著，其TSNAs含量仅下降2.77％；对比例6在28℃条件下发酵21天烟叶中TSNAs含量没有降低，反而呈现升高的趋势，升高了10.93％；实施例2在35℃条件下发酵7天烟叶中TSNAs含量下降10.86％，具有统计学意义；实施例3在35℃条件下发酵14天烟叶中TSNAs含量下降15.93％，具有统计学意义；实施例4在35℃条件下发酵21天烟叶中TSNAs含量下降11.22％，具有统计学意义。因此，高地芽孢杆菌J54在烟叶液态发酵过程中，在35℃条件下发酵7-21 天均可得到低TSNAs的烟叶；在28℃条件下发酵则需对发酵时间进行控制才能得到低TSNAs 的烟叶。综上，降解TSNAs的最佳发酵条件是28℃发酵7天。

Claims (7)

1.一种利用高地芽孢杆菌J54菌株降低烟叶TSNAs的方法，其特征在于包括以下步骤：
A、烟叶粉碎：将烤干后的硃砂烟烟叶研磨成粉末，然后过筛，得到发酵原材料；
B、菌液制备：将甘油管保存的高地芽孢杆菌J54菌种于LB固体培养基上划线，所述高地芽孢杆菌J54菌株的保藏编号为CCTCC No.M2019667，然后置于28-30℃恒温培养箱中过夜培养至长出单菌落，挑选一颗单菌落转接至LB液体培养基中，置于28-30℃、150-160rpm/min恒温振荡培养箱中培养20-50h得到发酵菌剂，然后用无菌去离子水将菌剂的OD值调至OD600＝1.8-2.0，得到菌液；
C、发酵：将烟叶粉末加入到无机盐基础培养基中作为菌株的营养源，经高压蒸汽灭菌后再加入菌液，所述菌液的使用量为发酵体系总体积的0.8-1.2％，置于28-30℃恒温振荡培养箱中以150-160rpm/min的转速培养6-8天或置于35-37℃恒温振荡培养箱中以150-160rpm/min的转速培养7-21天。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤A中过50目筛。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤B中所述恒温培养箱和恒温振荡培养箱的温度为28℃，所述恒温振荡培养箱为150rpm/min，培养48h，OD值调至OD600＝2.0。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤C中所述恒温振荡培养箱为160rpm/min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤C中无机盐基础培养基的配方如下，以g/L计：
K2HPO4：0.2；
KH2PO4：0.8；
MgSO4：0.2；
CaSO4·H2O：0.1；
Na2MoO4：0.0033；
FeSO4·7H2O：0.005，
按5.00g烟叶粉末对应45ml的无机盐的比例添加。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤C所述菌液的每次使用量为烟草培养基总体积的1％。
7.根据权利要求1所述利用高地芽孢杆菌J54菌株降低烟叶TSNAs的方法，其特征在于所述C步骤中烟叶采用液态发酵，温度设置为28℃，发酵时间7天。
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