CN111657536B - 一种提高烟叶品质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高烟叶品质的方法，通过筛选的具有类胡萝卜素降解能力的菌种；将所筛选的菌种制备为生物制剂；以及生物制剂应用于烟叶醇化获得具有类胡萝卜素降解产物的烟叶。改善了烟叶品质，有助于烟叶中类胡萝卜素降解级相关的物质组分含量增加，能增加烟叶甜味，丰富香气，增加烟气饱满感，降低烟叶刺激感。

Description

一种提高烟叶品质的方法

技术领域

本发明涉及烤烟醇化和微生物技术领域，尤其涉及一种提高烟叶品质的方法。

背景技术

卷烟制造企业每年新收的烤烟在品质上会存在一定程度的缺陷，如刺激性大、青杂气重、烟气粗糙不柔和，甚至有些烟叶还存在一定的涩、苦、辣等不良感受。为了改善烤烟品质，提高卷烟制造原料的可用性和适用性，必须对烟叶进行醇化处理。烟叶醇化即是在贮存过程中使烟叶在微生物、酶及化学成分的共同作用下发生一系列生化反应，利于烟叶致香物质的积累，促进品质的提升。在烟草中致香物质的主要来源有类胡萝卜素、叶绿素、苯丙氨酸类、西柏烷类、赖百当类化合物降解产物及美拉德反应产物等。类胡萝卜素是烟叶中的重要大分子色素，主要包括β-胡萝卜素、新黄质、叶黄素、紫黄质四种。烟草在调制和醇化过程中被微生物、酶及化学氧化作用降解为大量的小分子香气物质，如β-二氢大马酮、二氢猕猴桃内酯、香叶基丙酮、β-紫罗兰醇、异佛尔酮、氧化异佛尔酮、巨豆三烯酮及其异构体、金合欢基丙酮、β-环柠檬醛、藏红花醛、法尼基丙酮等。他们在烟草致香物质构成中具有重要地位，这些物质的香味阈值相对较低，刺激性小，香气质较好。普遍具有的香气特征为花香、果香、穿透性清甜香和木香等，并能消除刺激性，对烟叶香气贡献率大。例如，β-紫罗兰酮、醇及其衍生物是烟草中非常重要和含量较高的果香味物质；巨豆三烯酮能改善烟香和吃味、掩盖杂气，使香气更柔和丰满；二氢、四氢猕猴桃内酯是烟草中重要的烟香化合物，并具有优雅的果香感。异佛尔酮及大马酮等也能使烟草和顺，具备甘甜香气。所以，促进烤烟中的类胡萝卜素物质降解，有助于相关香味物质的形成及积累，增加和丰富烟叶香气，提高烟叶品质。

关于类胡萝卜素降解促进产香方面，CN101144074A公开的一种新型发酵酶制剂中是一种含有类胡萝卜素氧化酶的粗酶液，提供了能改善烟叶品质的方法。CN103122275A公开了一种亚油酸催化氧化制备类胡萝卜素降解产物的方法，并将产物直接用于卷烟的加香加料过程中，该香料添加能使卷烟中具有提高卷烟烟气的香气质和香气量、增加回甜感和改善余味等功效。CN103074383A公开了一种脂肪氧化酶制备类胡萝卜素降解产物的方法，将产物用于卷烟生产也可以提高烟叶品质。CN109055326A公开了利用库特氏杆产生能产生类胡萝卜素降解酶，用发酵液处理枸杞渣或枸杞浆，能够增加枸杞酒的挥发香气成分，改善枸杞酒的品质。另外，CN11078653A中公开了一种利用产类胡萝卜素微生物对烟梗、烟末及低次烟草等香气前体不足的原料或原料的提取物进行发酵处理，补充原料本身类胡萝卜素类香气前体物质含量不足的缺陷，改善烟叶香气的方法。综上所述，促进烟叶中类胡萝卜素降解产物的积累，的确能有效地改善提升烟叶品质。但目前利用微生物菌株对类胡萝卜素进行生物降解，应用于烟叶提质的专利较少。

烟叶的醇化过程根据是否进行人为干预，分为自然醇化和人工醇化两种方式。人工醇化(发酵)是根据烟叶本身的品质特点，有针对性地在适当的温度、湿度条件下，发挥强化微生物菌株功能对烟叶增香提质的方法。和自然醇化相比，能加速醇化过程，缩短醇化时间，有针对性地改善烟叶品质。烟草研究者已在使用生物制剂的人工醇化方面做了大量的工作，从烟叶生态系统中分离筛选具有一定功能的微生物，扩大培养后制备成菌剂，喷洒烟叶表面发挥功能。希望通过所筛选的微生物菌株制备生物制剂对烟叶进行人工醇化，利用强化菌剂功能有针对地改变烟叶原有品质缺陷，提高原料适用性和利用率。目前，利用微生物菌剂对烤烟进行人工醇化，促进烟叶中类胡萝卜素降解获得致香物质或其前体的积累的研究较少。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种提高烟叶品质的方法，本发明从醇化烟叶上筛选获得了一株微生物，采用适当条件作用于处于醇化初期的烟叶及经醇化两年仍不能达到使用要求的劣质烟叶，均能促进烟叶中类胡萝卜素降解产物的积累，丰富烟叶香味提高烟叶品质。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

一种提高烟叶品质的方法，包括：筛选的具有类胡萝卜素降解能力的菌种；

将所筛选的菌种制备为生物制剂；以及

生物制剂应用于烟叶醇化获得具有类胡萝卜素降解产物的烟叶。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的菌株源于烤烟表面微生物，制备成的生物制剂作用于烟叶不会引入外源微生物；

该生物制剂为高地芽孢杆菌(Bacillus kochii strain)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号GDMCC 61029。该菌株具有生长速度快、不易感染杂菌、耐受苛刻条件的能力强、易培养等优势；

该菌株均能分泌较高活性的中性、酸性蛋白酶，在促进类胡萝卜素类物质降解的同时，能实现烟叶中高分子含氮物质的降解，促成丰富的小分子致香物质的生成；

该生物制剂的主体成分为一种微生物菌株，菌株制备过程简单、易操作，降低了生产成本；该菌株作用时间为12h～48h，相对已报道用于人工醇化的单菌株制剂作用时间短；

该生物制剂对烟叶进行人工发酵，通过感官品吸及HS-SPME-GC/MS技术分析醇化烟叶中挥发性组分进行评价，得知均能改善烟叶品质，有助于烟叶中类胡萝卜素降解级相关的物质组分含量增加，能增加烟叶甜味，丰富香气，增加烟气饱满感，能降低烟叶刺激感。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要实用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本实施例的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明涉及到的烟叶样品中类胡萝卜素降解产物的形成途径；

图2为处理后的烟叶样本与对照样中类胡萝卜素降解产物积累可视化热图；

CN1，CN2分别为实例1，2中处理的对照样，S1，S2分别为本发明生物制剂处理后的烟叶样本。

高地芽孢杆菌(Bacillus kochii strain)的保藏说明：

保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC；地址：广州市先烈中路一百号省微生物所实验楼五楼；

保藏编号：GDMCC 61029；

保藏时间：2020年5月21日。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

在任一实施例中，本发明的一种提高烟叶品质的方法，包括：筛选的具有类胡萝卜素降解能力的菌种；

将所筛选的菌种制备为生物制剂；以及

生物制剂应用于烟叶醇化获得具有类胡萝卜素降解产物的烟叶。

实施例1：

烟叶微生物的筛选包括：

(1)烟叶表面微生物收集：

从醇化箱中不同的位置，采用五点取样法选择无霉变、无虫蛀、无损烟叶样品10g浸入装有200毫升0.1M，0.85％生理盐水的250mL锥形瓶中，在220rpm和30℃下振荡3小时。用两层无菌纱布过滤，收集含烟叶表面微生物的滤出液。

(2)微生物分离：取上述菌液200μL均匀涂布于含有烟叶提取液的LB固态培养基上，37℃恒温培养2无待长出的菌落数量种类不变。采用微生物挑选系统QPix^TM400(Molecular Devices)将平板上的菌落无菌转接于含有初筛培养基的96孔板上，在30℃恒温避光培养中3天。并以未接入菌落的培养物作为对照，利用酶标仪在540nm波长下，考察各菌落对培养基中类胡萝卜素物质叶黄素降解能力。选择OD540值发生变化明显的菌株，利用微生物挑选系统QPix^TM400转接到96深孔板中(装有2ml已灭菌的初筛培养基)，30℃、400rpm恒温振荡避光培养3天后，用孔板离心机在3500g，4℃条件下对培养液离心，分离菌体及发酵上清液。对上清液中叶黄素含量变化进行测定比较，复筛对叶黄素降解能力较大的菌体，洗涤菌体沉淀加无菌水制成菌悬液，通过平板分离纯化菌株，培养获得菌悬液后与50％甘油按1∶1比例混合，保藏于-80℃的超低温冰箱中备用。

(3)筛选培养基：蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、酵母提取物5g/L，叶黄素40mg/L、pH7.2。其中叶黄素预先溶于含有少量吐温-80的70％的乙醇溶液中，用0.45μm微滤膜无菌过滤后备用。培养基中其他成分经121℃、20min灭菌后冷却，在接种前，在培养基中迅速添加叶黄素溶液。

菌株鉴定包括：

将所筛选具有较高类胡萝卜素降解能力的菌种，接种于LB液态培养基中，30℃振荡培养24h，发酵液在10000g，4℃条件下离心10min，弃上清收集菌泥，用无菌0.85％的生理盐水洗涤菌泥2～3遍。采用细菌基因组提取试剂盒提取菌体DNA，用作PCR扩增模板。采用16s rDNA通用引物27F(5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3′)，1492R(5’TACGGCTACCTTGTTACGACTT3′)，预变性94℃5min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃90s，30个循环，退火72℃10min条件下扩增，获得的产物进行凝胶电泳检验合格后，送至上海生工生物工程公司进行测序，再在NCBI(National Center for BiotechnologyInformation，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中进行比对，得知该菌种为高地芽孢杆菌(Bacilluskochiistrain)，与NC_014551.1相似百分比(Per.Ident)为99.52％。保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号GDMCC 61029。

菌株产酶性能测试

测定菌株对淀粉降解酶、蛋白酶、果胶降解酶、纤维素降解等酶的分泌情况。发现菌株只对蛋白有降解能力，并能分泌较高酶活的中性、酸性蛋白酶。优选菌株产酶情况如表1。

采用福林酚法测定中性蛋白酶酶活，酶活力定义为每克干烟叶的水提酶液，在40℃、p H7.2条件下，每小时水解酪蛋白生成1μg酪氨酸定义为1个酶活单位。计为：U/g·h。

酸性蛋白酶酶活测定方法同中性蛋白酶，酶作用使用pH为3乳酸-乳酸钠缓冲溶液。

表1优选菌株产酶情况

酶种类	中性蛋白酶(U/g·h)	酸性蛋白酶(U/g·h)
			酶活	90.48±2.01	71.34±4.01

生物制剂制备包括：

将筛选菌种接种于含烟叶提取液的LB液态培养基中，37℃振荡培养24h，发酵液在10000g，4℃条件下离心10min，弃上清收集菌泥，用无菌0.85％的生理盐水洗涤菌泥2～3遍。再加入适量海藻糖、蔗糖溶液保护剂，进行真空冷冻浓缩，制备菌剂干粉，低温保藏待用。

人工醇化未经醇化的烟叶包括：

将生物制剂加无菌水稀释至菌体浓度为1×10¹⁰cfu/mL后按20％的添加量均匀地喷洒至烟叶表面，并混合均匀，37℃，湿度70％条件下在控温控湿培养箱中培养24h后，取出烟叶放置烘箱中将烟叶在90℃温度下烘干水分至13～14％，终止菌株继续代谢。在烟叶上喷洒等量无菌水，在相同培养条件下发酵，获得实验对照样。

烟叶品吸质量评价：

水分平衡：将醇化烟叶放置温度为22℃，湿度为65％的条件下平衡水分48h。

品吸评价参照标准《YC/T138-1998烟草及烟草制品感官评价方法》、《YC/T496-2014卷烟感官舒适性评价方法》、及相关企业单料烟及评价标准，组织专业品吸人员7人对烟叶的感官质量进行评定。由品吸结果可知，原有烟叶品吸的整体特征为有明显的刺激性和杂气，香气显得昏杂，但清甜感尚有，整体有一定甜度，经生物制剂处理后烟气刺激性、杂气有所下降，增加香气浓度、饱满感提升，能较好地促进烟叶品质提升，能缩短烟叶醇化时间。

烟叶香味成分检测分析：

采用HS-SPME-GC/MS技术平台测定醇化烟叶中挥发性、半挥发性致香组分。

(1)样品处理：将醇化烟叶用研磨仪70Hz处理90s，过60目筛。准确称取烟叶粉末2.000g，装入20mL顶空瓶中，加入1μL氚代萘-二氯乙烷内标溶液，充分混合均匀后盖上磁性顶空瓶盖待测。将待测醇化烟叶样品及对照样分组，每组6个平行样。

(2)顶空固相微萃取：采用膜厚为50/30μm，二乙烯基苯/活性炭/聚二甲基硅氧烷DVB/CAR/PDMS固相微萃取纤维头；孵化温度：60℃，萃取时间：30min。

(3)GC/MS色谱条件：采用配有自动进样器的ThermoTrace1310-ISQGC/MS气相色谱/质谱联用仪。采用高惰性交联弱极性HP-5毛细管柱(60m×0.25mm×0.25μm)；

(4)数据处理：对烟叶中各挥发性成分进行化合物鉴定，对化合物相对含量进行中心化数据处理，用R语言进行可视化热图绘制。分析菌株处理烟叶和对照样致香成分，根据类胡萝卜素降解途径(图1)分析类胡萝卜素降解产物积累情况，从图2可知菌株对烟叶进行人工醇化，能提高类胡萝卜素降解产物的含量，促进其积累，有助于提高烟叶品质(表2)。

表2类胡萝卜素降解产物风味特征

名称	风味特征
		二氢猕猴桃内酯	消除刺激性
β-环柠檬醛	甜，增加浓度和刺激
		4-氧化二氢异氟尔酮	和顺，甜
(E)-大马士酮	增加浓度、白肋烟味
		β-紫罗兰酮	甜、木香、花香、顺口
3-羟基-a-紫罗兰酮	甜，增加烤烟味
		巨豆三烯酮A	烟草甘甜香气，柔和丰满，掩盖杂味
巨豆三烯酮B
		6-甲基-5-庚烷-2-酮
香叶基丙酮	甜、坚果香
		异戊酸香叶酯	果香

实施例2：

取实施例1中制得的生物制剂，然后对次等烟叶(自然醇化2年品质仍未达到最低使用要求的浓香型烟叶)进行人工醇化。醇化条件为将生物制剂加无菌水稀释至菌体浓度为1×10^8～10cfu/mL后按20％的添加量均匀地喷洒至烟叶表面，并混合均匀，37℃，湿度70％条件下在控温控湿培养箱中培养48h后，取出烟叶放置烘箱中将烟叶在80～90℃温度下烘干水分至13～14％，终止菌株继续代谢。在烟叶上喷洒等量无菌水，在相同培养条件下发酵，获得实验对照样。并对烟叶品质进行评定。原有烟叶品吸整体特征为喉部刺激明显，杂气明显，甜感弱。经生物制剂处理后能明显增加甜度，增加了香气饱满度，烟叶刺激性下降。

图2中CN1，CN2分别为实例1，2中处理的对照样，S1，S2分别为本发明生物制剂处理的烟叶样本。热图中各样本各类物质成分总量的颜色越深表示相对含量越高。由图可知，处理后的样本物质总量普遍比对照高，说明生物制剂对不同烟叶的人工醇化处理均有利于烟叶中各挥发性物质含量的增加，烟叶品质的提升。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (5)

1.一种提高烟叶品质的方法，其特征在于，包括：

筛选的具有类胡萝卜素降解能力的菌种；

将所筛选的菌种制备为生物制剂；以及

生物制剂应用于烟叶醇化获得具有类胡萝卜素降解产物的烟叶；所述菌种为从烤烟中分离出的高地芽孢杆菌，所述高地芽孢杆菌的保藏编号为GDMCC:61029；

所述菌种或生物制剂有助于提高烟叶品质的代谢产物包括二氢猕猴桃内酯、β-环柠檬醛、4-氧化二氢异氟尔酮、（E）-大马士酮、β-紫罗兰酮、3-羟基-a-紫罗兰酮、巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、6-甲基-5-庚烷-2-酮、香叶基丙酮、异戊酸香叶酯；

所述菌种能分泌较高活性的中性、酸性蛋白酶，能实现烟叶中高分子含氮物质的降解。

2.如权利要求1所述的一种提高烟叶品质的方法，其特征在于，所述生物制剂应用于烟叶醇化具体步骤如下：

将生物制剂与无菌水混合，制备成1×10^8~10 cfu/mL的菌悬液，按10%~20 %的添加量均匀地喷洒至烟叶表面，在30~40 ℃，湿度70~80 %条件下培养12~48 h，取出烟叶放置烘箱中将烟叶在80~90 ℃温度下烘干水分至13~14 %，终止菌株继续代谢。

3.如权利要求1所述的一种提高烟叶品质的方法，其特征在于，所述生物制剂制备步骤如下：

将筛选菌种接种于含烟叶提取液的LB液态培养基中，37 ℃振荡培养24 h，发酵液在10000 g，4℃条件下离心10 min，弃上清收集菌泥，用无菌0.85 %的生理盐水洗涤菌泥2~3遍，再加入适量海藻糖、蔗糖溶液保护剂，进行真空冷冻浓缩，制备菌剂干粉，低温保藏待用。

4.如权利要求1所述的一种提高烟叶品质的方法，其特征在于，所述菌种筛选具体步骤如下：

烟叶表面微生物收集：

从醇化箱中不同的位置，采用五点取样法选择无霉变、无虫蛀、无损烟叶样品10 g浸入装有200毫升0.1 M，0.85 %生理盐水的250 mL锥形瓶中，在220 rpm和30℃下振荡3小时，用两层无菌纱布过滤，收集含烟叶表面微生物的滤出液；

微生物分离：

取含烟叶表面微生物的所述滤出液200 μL，均匀涂布于含有烟叶提取液的LB固态培养基上，37℃恒温培养2天，待长出的菌落数量种类不变；采用微生物挑选系统 QPix™400将平板上的菌落无菌转接于含有初筛培养基的96孔板上，在30℃恒温避光培养中3天；并以未接入菌落的培养物作为对照，利用酶标仪在540 nm波长下，考察各菌落对培养基中类胡萝卜素物质叶黄素降解能力；选择OD540值发生变化明显的菌株，利用微生物挑选系统 QPix™400转接到96深孔板中，30℃、400 rpm恒温振荡避光培养3天后，用孔板离心机在3500 g,4℃条件下对培养液离心，分离菌体及发酵上清液；对上清液中叶黄素含量变化进行测定比较，复筛对叶黄素降解能力较大的菌体，洗涤菌体沉淀加无菌水制成菌悬液，通过平板分离纯化菌株，培养获得菌悬液后与50 %甘油按1:1比例混合，保藏于-80℃的超低温冰箱中备用；

筛选培养基：

蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、酵母提取物5 g/L，叶黄素40 mg/L、pH 7.2；其中叶黄素预先溶于含有少量吐温-80的70 %的乙醇溶液中，用0.45μm微滤膜无菌过滤后备用；培养基中其他成分经121 ℃、20 min灭菌后冷却，在接种前，在培养基中迅速添加叶黄素溶液。

5.一种高地芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述应用包括将如权利要求1-4任一项所述的方法所得的高地芽孢杆菌用于烟叶发酵中，所述高地芽孢杆菌的保藏编号为GDMCC:61029。

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