CN114774374B - 一种耐高温类胡萝卜素降解酶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种耐高温类胡萝卜素降解酶及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114774374B
CN114774374B CN202210426939.9A CN202210426939A CN114774374B CN 114774374 B CN114774374 B CN 114774374B CN 202210426939 A CN202210426939 A CN 202210426939A CN 114774374 B CN114774374 B CN 114774374B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacillus subtilis
carotenoid
temperature
degrading enzyme
crude enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210426939.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114774374A (zh
Inventor
郝捷
张善林
李剑梅
云晶
柴林山
于涛
朱万芹
费玥
张疏雨
李力群
谢存一
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Inner Mongolia Kunming Cigarettes Co ltd
Original Assignee
Inner Mongolia Kunming Cigarettes Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inner Mongolia Kunming Cigarettes Co ltd filed Critical Inner Mongolia Kunming Cigarettes Co ltd
Priority to CN202210426939.9A priority Critical patent/CN114774374B/zh
Publication of CN114774374A publication Critical patent/CN114774374A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114774374B publication Critical patent/CN114774374B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A24—TOBACCO; CIGARS; CIGARETTES; SIMULATED SMOKING DEVICES; SMOKERS' REQUISITES
    • A24B—MANUFACTURE OR PREPARATION OF TOBACCO FOR SMOKING OR CHEWING; TOBACCO; SNUFF
    • A24B15/00—Chemical features or treatment of tobacco; Tobacco substitutes, e.g. in liquid form
    • A24B15/18—Treatment of tobacco products or tobacco substitutes
    • A24B15/20—Biochemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
    • Y02W30/00—Technologies for solid waste management
    • Y02W30/50—Reuse, recycling or recovery technologies
    • Y02W30/62—Plastics recycling; Rubber recycling

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了枯草芽孢杆菌在制备耐高温的类胡萝卜素降解酶，和/或，在烟草发酵中的应用，枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.Subtilis)CICC24406，其保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心。本申请公开了枯草芽胞杆菌CICC24406能够产生高酶活性的类胡萝卜素降解酶，为类胡萝卜素降解酶的生产来源提供了一个新的途径。该类胡萝卜素降解酶粗酶液降解效率可达到70％以上，且在80℃高温环境下能有效加速类胡萝卜素的降解，打破了高温对普通类胡萝卜素降解酶的限制，为高温工艺提供了一种新的类胡萝卜素降解酶。该酶可降解类胡萝卜素生成致香物质应用于烟草产品中。

Description

一种耐高温类胡萝卜素降解酶及其制备方法和应用
技术领域
本申请涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种耐高温类胡萝卜素降解酶及其方法和应用。
背景技术
类胡萝卜素(Carotenoids)普遍存在于动物、高等植物、真菌、藻类中的黄色、橙红色或红色的色素之中，主要包括β-胡萝卜素和γ-胡萝卜素，是一类重要的香味前体物质；类胡萝卜素通过酶催化、光氧化可形成β-紫罗兰酮、巨豆三烯酮、二氢猕猴桃内酯等降异戊二烯类化合物(norisoprenoids)，该类物质不仅均具有良好的风味，而且具有较低的嗅觉阈值，是食品、烟草化妆品等加工行业的重要香料物质，可有效提升食品、化妆品、烟叶制品香气品质；由于从植物中直接提取上述香气物质，存在着其工序繁琐、成本高且含量极低的缺点，故，利用类胡萝卜素降解生成香气物质已经成为近年来食品、烟草等学科的研究热点之一。目前，类胡萝卜素的降解方式主要有物理热降解、化学降解和生物酶催化降解方法，其中物理热降解需高温处理，不利于实际生产应用；化学降解过程中的化学试剂难去除，且有的对人体有害；另外，上述两种降解方法都存在降解产物难以控制、产生的目标产物含量低等缺点；而生物酶催化降解具有降解效率高、专一性强、催化条件温和、产物中目标化合物含量高、不使用有害的化学试剂的特点，近年来越来越受到关注，筛选类胡萝卜素降解菌株，制备类胡萝卜素的降解酶，是实现类胡萝卜素高效降解，获得致香物质等香气物质的前提。且目前类胡萝卜素降解酶存在无法在高温条件中使用的问题，限制了其应用的场景。
枯草芽胞杆菌是芽胞杆菌属的一种，广泛分布在自然界中，是一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种，被广泛应用于农业、工业、食品、畜牧、水产等行业，具有良好的应用前景。目前，有关枯草芽孢杆菌生产α-淀粉酶、中性蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶应用研究方面报道较多，但在枯草芽孢杆菌生产类胡萝卜素降解酶方面未见报道。
烟叶发酵是在一定的温度和湿度条件下，促使烟叶理化特性发生深刻变化，将不利于烟叶品质的大分子物质组分(包括蛋白质、淀粉、果胶等)降解转化成有利于提升烟叶品质的小分子组分(还原糖、氨基酸等)，进而达到克服新烟不良品质，改良和提高烟叶内在质量与外观质量的一种初加工方法，是卷烟加工中极为重要的一个环节。目前，烟叶发酵主要采用自然发酵与人工发酵；其中，自然发酵主要是借助自然气候的变化进行发酵的，利用春季季节性温度上升，促进烟叶内酶的活动，使烟叶经过缓慢的发酵过程，以达到改善烟叶品质的目的，人工发酵是利用人为的适合烟叶内在品质变化的条件(即适宜的温度和湿度)，促使烟叶加快变化的方法；但两种方法均存在发酵进展缓慢的缺陷。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐高温类胡萝卜素降解酶及其方法和应用，该降解酶采用枯草芽孢杆菌制备获得，其降解效率可以达到70％以上，其发酵温度可达到90℃。
一方面，本申请提供了枯草芽孢杆菌在制备耐高温的类胡萝卜素降解酶，和/或，在烟草发酵中的应用，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilissubsp.Subtilis)CICC24406，其保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
另一方面，本申请还提供了一种利用上述的枯草芽孢杆菌制备类胡萝卜素降解酶的方法，所述方法包括：向发酵培养基中接种所述枯草芽孢杆菌进行发酵，离心获得上清液，即获得所述类胡萝卜素降解酶的粗酶液。
进一步的，所述发酵温度为25℃～30℃，转速为100～200r/min，培养时间为60～96h；优选的，发酵温度为28℃，转速为160r/min，培养时间为72h。
进一步的，所述发酵培养基的组成包括：糖、亚硝酸钠、酵母粉；
优选的，所述糖选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、淀粉中的一种或多种；更优选的，所述糖为甘露醇；
更优选的，按质量百分比计，所述发酵培养基组成包括：1％～5％糖、0.1％～0.5％亚硝酸钠和0.2％～0.6％酵母粉；优选的，所述发酵培养基组成为2％糖、0.2％亚硝酸钠和0.4％酵母粉。
在一种优选的实施方式中，枯草芽孢杆菌CICC24406菌株发酵产类胡萝卜素降解酶最适培养基配方为：K2HPO4 1.0g，MgSO4 0.5g，NaNO2 2.0g，FeSO4·7H2O 0.01g，KCl0.5g，甘露醇20.0g，酵母粉4.0g，水1000mL。
在一种优选的实施方式中，上述降解酶的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、将枯草芽胞杆菌CICC24406接种于LB斜面培养基，30℃活化培养48h；
步骤二、将枯草芽胞杆菌CICC24406新鲜斜面培养物接种于优化后的改良察氏β-胡萝卜素液体培养基中，在28℃，160r/min条件下，培养72h，获得发酵液；
步骤三、将上述发酵液在4℃，10000r/min离心20min，取上清液过0.22μm微孔滤膜即得粗酶液。
优化后的改良察氏β-胡萝卜素液体培养基等同于上述发酵培养基。
另一方面，本申请还提供了采用枯草芽孢杆菌发酵获得的类胡萝卜素降解酶，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.Subtilis)CICC24406，其保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心；优选的，所述类胡萝卜素降解酶的酶促作用温度为20℃～90℃，pH为4～6；更优选的，温度为80℃，pH为5。
另一方面，本申请还提供了上述的类胡萝卜素降解酶在制备类胡萝卜素致香物质中的应用；优选的，所述类胡萝卜素致香物质包括1-甲基-2,3-环己二酮、氧化异佛尔酮、β-紫罗兰酮、巨豆三烯酮、二氢猕猴桃内酯。
本申请粗酶液对β-胡萝卜素降解产物12种，均为类胡萝卜素C9-C10/C9’-C10’和C7-C8/C7’-C8’双键位置降解而生成的C13衍生物等香气物质。其中主要降解产物为1-甲基-2,3-环己二酮、氧化异佛尔酮、β-紫罗兰酮、巨豆三烯酮、二氢猕猴桃内酯，该类物质具有清凉和优雅的果香、水果的香气、花香、蜜甜的木香和干果香等香气，是食品、烟叶制品、化妆品等行业中常用单体香料，在食品、化妆品、烟叶制品香韵调和时广泛使用。
另一方面，本申请还提供了一种利用上述的枯草芽孢杆菌发酵烟草的方法，所述方法包括：将所述枯草芽孢杆菌接种于烟草中，混合发酵。
进一步的，所述枯草芽孢杆菌的菌悬液OD600值为0.4～0.5，所述菌悬液与烟草的质量比为2：(3～4)；优选的，所述菌悬液与烟草的质量比为2:3。
另一方面，本申请还提供了采用枯草芽孢杆菌发酵获得的烟草发酵物，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.Subtilis)CICC24406，其保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
另一方面，本申请还提供了含有上述的烟草发酵物的烟草产品。
本发明具有如下有益效果：
1、本申请首次公开了枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis subsp.Subtilis)CICC24406能够产生高酶活性的耐高温类胡萝卜素降解酶，为类胡萝卜素降解酶的生产来源提供了一个新的途径。
2、本申请所获得的类胡萝卜素降解酶粗酶液降解效率可达到70％以上，具有生产周期短、成本低、培养方法简单等优势。
3、本申请中的类胡萝卜素降解酶粗酶液在80℃高温环境下能有效加速类胡萝卜素的降解，打破了高温对普通类胡萝卜素降解酶的限制，为高温工艺提供了一种新的类胡萝卜素降解酶。
4、本申请中利用耐高温类胡萝卜素降解酶将β-胡萝卜素降解，制备获得1-甲基-2,3-环己二酮、氧化异佛尔酮、β-紫罗兰酮、巨豆三烯酮、二氢猕猴桃内酯等致香物质，可广泛应用于食品、保健品、化妆品、烟叶制品。
5、本申请将具有产高酶活力的类胡萝卜素降解酶的枯草芽胞杆菌应用到烟叶发酵中，以较低成本和较高效率，缩短烟叶发酵时间，加速烟叶中类胡萝卜素的降解，明显提高烟叶类胡萝卜素类香气物质的含量，在烟叶发酵方面表现出较好的应用价值和应用前景。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1是菌株CICC24406产酶培养基蔗糖浓度优化结果图；
图2是菌株CICC24406产酶培养基NaNO2浓度优化结果图；
图3是菌株CICC24406产酶培养基酵母粉浓度优化结果图
图4是菌株CICC24406产酶培养基碳源优化结果图；
图5是菌株CICC24406产酶培养温度优化结果图；
图6是菌株CICC24406产酶培养时间优化结果图；
图7是不同酶促反应温度对类胡萝卜素降解酶降解率的影响图；
图8是不同pH对类胡萝卜素降解酶降解率的影响图；
图9是类胡萝卜素降解酶粗酵液对β-胡萝卜素降解率图；
图10是类胡萝卜素降解酶降解β-胡萝卜素产物质谱检测TIC图谱图。
具体实施方式
为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面结合说明书附图以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
如未特殊说明，在以下实施方式中，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
其中：洁净工作台HCB-1300V由上海一恒科学仪器有限公司；恒温振荡器THZ-98C由上海一恒科学仪器有限公司提供；全自动高压灭菌锅SX-500由上海新普仪器设备有限公司提供；电热恒温鼓风干燥箱DHG-9053A由上海一恒科学仪器有限公司提供；Sigma高速离心机3-18KS由上海成贯仪器有限公司提供；8890-5977B型气质联用系统(GC/MS)、DB-5MS毛细管柱(60m×0.25mm×0.25μm)、萃取头120μm DVD/CAR/PDMS均由安捷伦科技(中国)有限公司提供；SPME Allow Cond固相萃取装置(CTCAnalytics AG)、Fiber ConditioningStation老化装置(CTCAnalytics AG)、Agitator样品加热箱(CTCAnalytics AG)由瑞士思特斯分析仪器有限公司提供。
本申请使用的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis subsp.Subtilis)购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为：CICC24406。
LB培养基：牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、蒸馏水1000mL、pH 7.0。
改良察氏培养基：酵母粉3.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4 0.5g，NaNO2 3.0g，FeSO4·7H2O0.01g，KCl 0.5g，蔗糖30.0g，pH 7.0，水1000mL。
气质联用系统(GC/MS)测定类胡萝卜素降解产物含量时的测试条件：载气为高纯氦气(纯度不小于99.999％)，恒流流速1.2mL/min，进样口温度250℃，不分流进样，溶剂延迟3.5min。程序升温：40℃保持3.5min，以10℃/min升至100℃，再以7℃/min升至180℃，最后以25℃/min升至280℃，保持5min，DB-5MS毛细管柱(60m×0.25mm×0.25μm，Agilent J&WScientific，Folsom，CA，USA)。
质谱条件：电子轰击离子源(EI)，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，质谱接口温度280℃，电子能量70eV，扫描方式为全扫描模式(SCAN)，质量扫描范围m/z 50-500。
实施例1不同培养基配方对菌株CICC24406产类胡萝卜素降解酶能力的影响
本申请使用的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis subsp.Subtilis)购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为：CICC24406。
本申请首次使用枯草芽孢杆菌作为工程菌株生产类胡萝卜素降解酶，具体包括如下步骤：
将枯草芽胞杆菌CICC24406接种于LB斜面培养基，30℃活化培养48h；将枯草芽胞杆菌CICC24406新鲜斜面培养物接种于改良察氏β-胡萝卜素液体培养基中培养，获得发酵液；将上述发酵液在4℃，10000r/min离心20min，取上清液过0.22μm微孔滤膜即得粗酶液。
以改良察氏培养基为发酵基础培养基，分别考察蔗糖不同添加量(0％、1％、2％、3％、4％、5％)、亚硝酸钠不同添加量(0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％)、酵母粉不同添加量(0％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％)、不同碳源(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇)对粗酶液酶活力的影响；其实验步骤为：以改良察氏液体培养基为种子培养基，无菌操作，取菌株CICC24406试管斜面新鲜培养物按照1环，接种于液体培养基中(100mL/瓶)，于28℃、160r/min下培养72h，即得种子液，然后按照1％的接种量分别接种于不同供试培养基中，于28℃、160r/min下培养96h，测定不同配方发酵培养获得粗酶液对β-胡萝卜素降解降解率(％)，
β-胡萝卜素标准曲线方程为Y＝0.1650x-0.0127(R2＝0.9988)；粗酶液对β-胡萝卜素降解率(％)按照下式计算，试验结果如图1和图2所示。
其中，C0为反应体系中β-胡萝卜素原始浓度(μg/mL)，C1为反应体系在40℃水浴中保温30min时β-胡萝卜素浓度(μg/mL)，V1为反应体系总体积(mL)，V2为反应体系中加入β-胡萝卜素的体积(mL)，t为酶促反应时间(min)。
由图1～3可得，当培养基中添加不同浓度的蔗糖、亚硝酸钠、酵母粉时，菌株CICC24406粗酶液对β-胡萝卜素降解效率存在明显的影响，且随着添加浓度的增高，粗酶液对β-胡萝卜素降解效率呈先升高后降低的趋势，其中蔗糖最适添加浓度为2％、亚硝酸钠最适添加量为0.2％、酵母粉最适添加量为0.4％。
由图4可得，在上述优化条件下，以不同的糖源为碳源的培养基对菌株CICC24406进行液体发酵培养，所获得的粗酶液均具有β-胡萝卜素降解能力，其中以甘露醇为碳源时粗酶液酶活最高，其对β-胡萝卜素降解率达到了63.523％。
本实施例说明：枯草芽孢杆菌CICC24406菌株发酵产类胡萝卜素降解酶最适培养基配方为：K2HPO4 1.0g，MgSO4 0.5g，NaNO2 2.0g，FeSO4·7H2O 0.01g，KCl 0.5g，甘露醇20.0g，酵母粉4.0g，水1000mL。
实施例2不同培养条件对菌株CICC24406产类胡萝卜素降解酶能力的影响
以实施例1中获得的优化后的改良察氏培养基为培养基，分别考察不同摇床温度(20℃、24℃、28℃、32℃、36℃)、不同培养时间(24h、48h、72h、96h、120h)对粗酶液酶活力的影响。试验结果如图5、图6所示。
粗酶液的获得方法、β-胡萝卜素标准曲线方程和β-胡萝卜素降解率计算方法同实施例1。
由图5可得，试验范围内，菌株CICC24406粗酶液对β-胡萝卜素降解效率随着培养温度升高呈先增加后减小的趋势。其中，在24～28℃培养温度范围内，降解效果最好，降解率可达62.027％、64.760％，以28℃降解率最高，然后随着温度的升高，降解率下降。可见，菌株CICC24406发酵生产类胡萝卜素降解酶最佳摇床培养温度为28℃。
由图6可得，优化培养温度条件下，菌株CICC24406粗酶液对β-胡萝卜素降解效率随着培养时间的延长呈先增加后减小的趋势。培养时间达到72h时降解率达到最大值(71.81％)，然后随着时间延长至120h，降解率略有降低，但幅度较小，说明发酵液中β-胡萝卜素降解酶仍然保持了很好的酶活力。可见，菌株CICC24406发酵生产类胡萝卜素降解酶最佳培养时间为72h。
本实施例说明：在优化的培养基中，枯草芽孢杆菌CICC24406菌株发酵产类胡萝卜素降解酶最适培养条件为：最佳摇床培养温度为28℃，最佳培养时间为72h。优化后将粗酶液对β-胡萝卜素降解率提高到了71.81％以上。
实施例3枯草芽胞杆菌CICC24406发酵制备类胡萝卜素降解酶粗酶液
步骤一、将枯草芽胞杆菌CICC24406接种于LB斜面培养基，30℃活化培养48h；
步骤二、将枯草芽胞杆菌CICC24406新鲜斜面培养物接种于优化后的改良察氏β-胡萝卜素液体培养基中，在28℃，160r/min条件下，培养72h，获得发酵液；
步骤三、将上述发酵液在4℃，10000r/min离心20min，取上清液过0.22μm微孔滤膜即得粗酶液。
优化后的改良察氏β-胡萝卜素液体培养基配方为：K2HPO4 1.0g，MgSO4 0.5g，NaNO2 2.0g，FeSO4·7H2O 0.01g，KCl 0.5g，甘露醇20.0g，酵母粉4.0g，水1000mL。
实施例4类胡萝卜素降解酶粗酶液最佳酶促反应温度
按照实施例3的方法制备类胡萝卜素降解酶粗酶液，利用分光光度法，在光程为lcm的比色皿中加入3.0mL的粗酶液，并加入0.2mLβ-胡萝卜素储备液(0.1μg/μL)，分别设置温度为37、45、50、60、70、80、90、100℃条件下保温30min，以未加β-胡萝卜素母液的粗酶液为对照，在吸收光波长460nm处测定其酶活力吸光度值，计算粗酶液对β-胡萝卜素降解率，结果如图7所示。
β-胡萝卜素标准曲线方程和β-胡萝卜素降解率计算方法同实施例1。
由图7可知，试验条件下，粗酶液对β-胡萝卜素降解的降解率随着酶促反应温度的升高呈先增加后降低的趋势，当酶促反应温度为80℃时，粗酶液对β-胡萝卜素降解效率最高。因此，类胡萝卜素降解酶粗酶液佳酶促反应温度为80℃，为耐高温类胡萝卜素降解酶。
实施例5不同pH对类胡萝卜素降解酶酶活的影响
按照实施例3的方法制备类胡萝卜素降解酶粗酶液，取适量的粗酶液，利用0.01N的盐酸溶液和氢氧化钠溶液调整粗酶液的pH，将其pH分别调整为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，在优化的温度条件下，按照实施例1中的方法，测定不同pH粗酶液对β-胡萝卜素降解效率，确定粗酶液酶促反应的最佳pH。
如图8所示，不同pH的粗酶液对β-胡萝卜素的降解率随着pH的升高呈先增加后降低的趋势，但该粗酶液在pH＝4～6范围能维持较好的酶活性，对β-胡萝卜素降解效率达到了50％以上，其中以pH为5的粗酶液对β-胡萝卜素降解效率最高，说明此酶在弱酸性环境下催化能力较强，其酶促反应的最适pH为5。
实施例6粗酶液类胡萝卜素降解酶能力测试
按照实施例3的方法制备类胡萝卜素降解酶粗酶液，利用分光光度法，在光程为lcm的比色皿中，分别加入3.0mL的粗酶液(提前在80℃的水浴中保温)，并加入0.2mLβ-胡萝卜素储备液(0.1μg/μL)，在460nm处测定吸光度值，前20min每隔4min测定一次吸光度值，随后每隔5min测定一次吸光度值；以降解时间为横坐标，降解率为纵坐标，绘制曲线，考察吸光度值变化趋势，具体结果如图9所示。
由图9可得，试验条件下，以未加β-胡萝卜素母液的粗酶液为对照，在吸收光波长460nm处，随着反应时间的延长，枯草芽胞杆菌CICC24406菌株粗酶液对β-胡萝卜素降解率逐渐升高，酶促反应时间在30min时，β-胡萝卜素降解率达到了峰值(53.78％)，然后随着时间的延长，降解效率维持一个相对稳定的水平，说明按照实施例3的方法制备的类胡萝卜素降解酶粗酶液具有良好的β-胡萝卜素降解能力。
实施例7粗酶液对β-胡萝卜素降解产物能力测试
按照实施例3的方法制备类胡萝卜素降解酶粗酶液，准确称取1％的β-胡萝卜素40.00mg，溶解于50mL的粗酶液中(底物β-胡萝卜素浓度为8μg/mL)，在80℃水浴环境中转化30min，冷却至室温后，用等体积二氯甲烷等体积萃取两次，收集萃取体系下层二氯甲烷层，用平衡蒸发浓缩仪，在转速180r/min.、真空度200mbar、18℃条件下氮吹浓缩至1mL，上机分析，分析结果见图10和表1所示。
表1菌株24406粗酶液降解类胡萝卜素GC/MS成分检测结果
结合图10和表1可得，粗酶液对β-胡萝卜素降解产物12种，均为类胡萝卜素C9-C10/C9’-C10’和C7-C8/C7’-C8’双键位置降解而生成的C13衍生物等香气物质。其中1-甲基-2,3-环己二酮、氧化异佛尔酮、β-紫罗兰酮、巨豆三烯酮、二氢猕猴桃内酯含量较高，浓度达到了0.127～0.614μg/mL范围内，以氧化异佛尔酮(3,5,5-三甲基-2-环已烯-1-酮)含量最高，达到了0.614μg/mL；β-大马酮、香叶基丙酮、二氢大马酮含量在0.011～0.019μg/mL范围内，其它致香物质含量均低于0.001μg/mL；可见，类胡萝卜素降解酶粗酶液对类胡萝卜素主要降解产物为1-甲基-2,3-环己二酮、氧化异佛尔酮、β-紫罗兰酮、巨豆三烯酮、二氢猕猴桃内酯，该类物质具有清凉和优雅的果香、水果的香气、花香、蜜甜的木香和干果香等香气，是食品、烟叶制品、化妆品等行业中常用单体香料，在食品、化妆品、烟叶制品香韵调和时广泛使用。
实施例8枯草芽胞杆菌CICC24406在烟叶发酵中的应用
本发明以2019年的云南曲靖CF3原烟作为对照组，将加入枯草芽胞杆菌CICC24406的烟叶作为处理组。将OD600在0.4～0.5之间的菌株CICC24406菌悬液，按照料液比为3:2的比例接种于烟叶中混合均匀，在温度为28℃条件下，发酵培养72h，发酵后烟叶中类胡萝卜素类特征香气物质含量的变化如表2所示。
表2菌株CICC24406发酵烟叶类胡萝卜素降解产物含量GC/MS检测结果
由表2可知，烟叶经枯草芽胞杆菌CICC24406发酵处理后，烟叶中类胡萝卜素类特征香气物质6-甲基-5庚烯-2酮、β-大马酮、香叶基丙酮、β-紫罗兰酮、巨豆三烯酮、二氢猕猴桃内酯等11种特征香气物质的含量均匀不同程度提升，特征香气物质的总量从33.5887μg/g提高到了38.6257μg/g，提高幅度达到了15％，该类物质具有清凉和优雅的果香、水果的香气、花香、蜜甜的木香和干果香等香气，是形成烟叶香气物质的重要化学成分，能掩盖木质杂气、消除烟气刺激性，丰富烟草香气。
以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

Claims (7)

1.一种枯草芽孢杆菌在制备降解类胡萝卜素的粗酶液中的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis subsp. Subtilis）CICC24406，其保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心；
所述制备降解类胡萝卜素的粗酶液的方法包括：向发酵培养基中接种所述枯草芽孢杆菌进行发酵，离心获得上清液，即获得所述降解类胡萝卜素的粗酶液；
所述粗酶液的酶促反应温度为37℃~100℃，所述粗酶液的酶促反应的pH值为2~8；
所述发酵培养基为：K2HPO41.0g、MgSO40.5g、NaNO22.0g、FeSO4·7H2O0.01g、KCl0.5g、蔗糖或甘露醇20.0g、酵母粉4.0g、水1000mL。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为25℃~30℃，转速为100~200 r/min，培养时间为60~96 h。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为28℃，转速为160 r/min，培养时间为72 h。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述粗酶液的酶促反应温度为80℃，所述粗酶液的酶促反应的pH值为5。
5.枯草芽孢杆菌在提高烟叶中类胡萝卜素类特征香气物质中的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis subsp. Subtilis）CICC24406，其保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，所述类胡萝卜素类特征香气物质包括1-甲基-2,3-环己二酮、氧化异佛尔酮、β-紫罗兰酮、巨豆三烯酮、二氢猕猴桃内酯。
6.一种提高烟叶中类胡萝卜素类特征香气物质的方法，其特征在于，所述方法包括：将枯草芽孢杆菌的菌悬液接种于烟草中，混合发酵；所述枯草芽孢杆菌的菌悬液OD600值为0.4~0.5，所述菌悬液与烟草的质量比为2：（3~4）；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis subsp. Subtilis）CICC24406，其保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心；所述类胡萝卜素类特征香气物质包括1-甲基-2,3-环己二酮、氧化异佛尔酮、β-紫罗兰酮、巨豆三烯酮、二氢猕猴桃内酯。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述菌悬液与烟草的质量比为2:3。
CN202210426939.9A 2022-04-22 2022-04-22 一种耐高温类胡萝卜素降解酶及其制备方法和应用 Active CN114774374B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210426939.9A CN114774374B (zh) 2022-04-22 2022-04-22 一种耐高温类胡萝卜素降解酶及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210426939.9A CN114774374B (zh) 2022-04-22 2022-04-22 一种耐高温类胡萝卜素降解酶及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114774374A CN114774374A (zh) 2022-07-22
CN114774374B true CN114774374B (zh) 2023-08-22

Family

ID=82430129

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210426939.9A Active CN114774374B (zh) 2022-04-22 2022-04-22 一种耐高温类胡萝卜素降解酶及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114774374B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108467875A (zh) * 2018-04-28 2018-08-31 郑州轻工业学院 一种微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法
CN109055326A (zh) * 2018-09-04 2018-12-21 宁夏大学 一种类胡萝卜素降解酶
CN109266624A (zh) * 2018-09-04 2019-01-25 百瑞源枸杞股份有限公司 一种类胡萝卜素降解酶的制备方法
CN110786534A (zh) * 2019-11-26 2020-02-14 上海龙殷生物科技有限公司 一种利用产类胡萝卜素微生物改善烟草提取物香气的方法
CN111657536A (zh) * 2020-06-23 2020-09-15 四川中烟工业有限责任公司 一种提高烟叶品质的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108467875A (zh) * 2018-04-28 2018-08-31 郑州轻工业学院 一种微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法
CN109055326A (zh) * 2018-09-04 2018-12-21 宁夏大学 一种类胡萝卜素降解酶
CN109266624A (zh) * 2018-09-04 2019-01-25 百瑞源枸杞股份有限公司 一种类胡萝卜素降解酶的制备方法
CN110786534A (zh) * 2019-11-26 2020-02-14 上海龙殷生物科技有限公司 一种利用产类胡萝卜素微生物改善烟草提取物香气的方法
CN111657536A (zh) * 2020-06-23 2020-09-15 四川中烟工业有限责任公司 一种提高烟叶品质的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
魏涛等.β-胡萝卜素降解菌HC-3发酵条件优化及其对再造烟叶浓缩液增香效果研究.《轻工学报》.2020,(第02期),第24-32页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114774374A (zh) 2022-07-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Owens et al. Formation of volatile compounds during Bacillus subtilis fermentation of soya beans
CN102505002B (zh) 一种用于烤烟快速增香的微生物菌株及烟叶发酵的应用
CN112342168B (zh) 一株地衣芽孢杆菌及其促进酱油发酵增香的应用
CN112322551B (zh) 一株对烟叶不良成分具有多重降解效果的细菌及应用
CN109722393B (zh) 一种烟草黄色土源菌
CN111248409A (zh) 一种低盐豆瓣酱发酵方法
CN111616403A (zh) 一种加速烟叶醇化及提升烟叶品质的生物制剂及其应用
CN113957016A9 (zh) 一种枯草芽孢杆菌及利用枯草芽孢杆菌制备奶香型冬虫夏草发酵液的方法
Huang et al. Effects of Bacillus subtilis subsp. on the microbial community and aroma components of flue-cured tobacco leaves based on metagenome analysis
CN104877942B (zh) 类芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用
CN111733093B (zh) 根际假河杆菌、其培养分离方法和在烟草加香中的用途
CN106399399B (zh) 一种生物降解叶黄素生成8-甲基-α-紫罗兰酮的方法
CN114774374B (zh) 一种耐高温类胡萝卜素降解酶及其制备方法和应用
CN109749963B (zh) 建立在菌种互作基础上的优良土著复合乳酸菌直投式发酵剂及其强化山西老陈醋生产的方法
CN113957019B (zh) 一种类诺卡氏菌、其分离方法和应用
CN114634890B (zh) 一种固氮螺菌、其分离方法和应用
CN113215022B (zh) 一种根际奇顿杆菌及其分离方法和应用
CN113817650A (zh) 一株产吡嗪高温放线菌、分离筛选及应用
CN107619807B (zh) 一种食源性植物乳杆菌及其制备方法和应用
Campos et al. Biosynthesis of γ-polyglutamic acid by bacillus licheniformis through submerged fermentation (SmF) and solid-state fermentation (SSF)
CN114854625B (zh) 一种伤口埃希氏菌及其制备类胡萝卜素降解酶的方法
KR20210002277A (ko) 신규한 초산발효균주 및 이를 이용한 콤부차 음료의 제조방법
CN114045244B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌及利用解淀粉芽孢杆菌制备酱甜香烟草的方法
CN113999800B (zh) 芽孢杆菌属新菌株及其用途
CN113355256B (zh) 北工商生孢八叠球菌菌种及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Hao Jie

Inventor after: Li Liqun

Inventor after: Xie Cunyi

Inventor after: Zhang Shanlin

Inventor after: Li Jianmei

Inventor after: Yun Jing

Inventor after: Chai Linshan

Inventor after: Yu Tao

Inventor after: Zhu Wanqin

Inventor after: Fei Yue

Inventor after: Zhang Shuyu

Inventor before: Hao Jie

Inventor before: Zhang Shuyu

Inventor before: Xie Cunyi

Inventor before: Zhang Shanlin

Inventor before: Yun Jing

Inventor before: Yu Tao

Inventor before: Fei Yue

Inventor before: Li Liqun

Inventor before: Li Jianmei

Inventor before: Chai Linshan

Inventor before: Zhu Wanqin

CB03 Change of inventor or designer information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant