CN114634890B - 一种固氮螺菌、其分离方法和应用 - Google Patents

一种固氮螺菌、其分离方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种固氮螺菌，其特征在于，其微生物学分类命名为固氮螺菌W712，拉丁文学名为Azospirillum sp.；其16S rDNA部分序列如序列表所示；其保藏编号为CGMCC No.1.18567。本发明还公开了所述固氮螺菌培养分离方法和其含氨基酸发酵提取物的制备方法和用途。本发明的固氮螺菌为新的菌株，用其制备得到的含氨基酸发酵提取物用于卷烟加香中，能增加烟气清甜感，丰富协调烟香的同时保持较好舒适性。

Description

一种固氮螺菌、其分离方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种固氮螺菌、其分离方法和其含氨基酸发酵提取物在烟草加香中的应用。
背景技术
微生物发酵是在适宜的条件下，利用微生物将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程。微生物发酵技术已在医药工业、食品工业、能源工业、化学工业、生态保护、农业等各个领域得到广泛应用。
卷烟加香是烟草行业一种常规的、必需的增补香气的技术手段，同时烟用香精香料的应用更是与卷烟品牌的树立及卷烟风格特征的彰显休戚相关。烟用香精香料来源广泛；其中利用微生物发酵技术制备烟用香料，由于其成本相对较低，不受气候、土地资源的限制，在缩短生产周期的同时，还可提高香料的产量和品质，属于对环境友好、资源节约型的产品技术研发，符合企业绿色、环保、安全、节约减排的发展要求，是烟用香料开发的一个重要方向。但目前能用于制备烟用香料的微生物优势菌株仍然较少，所开发香料的香型和功效作用较为单调；所以对微生物开展持续筛选及开发利用、拓展微生物在香精香料领域的功能应用，以满足烟用香精香料研发和生产需求，具有现实的必要性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的固氮螺菌、其培养分离和鉴别方法；本发明的目的还在于提供所述固氮螺菌含氨基酸发酵提取物，作为生物香料在卷烟加香中的应用。
本发明通过以下技术方案实现上述目的。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
本发明第一方面公开了一种具有固氮功能的微生物固氮螺菌W712，其是从云南昆明烟草种植基地烟草根际土壤样品中分离得到的，对其进行了形态学、生理生化性质和16SrDNA分析，鉴定结果表明其属于固氮螺菌，其微生物学分类命名为固氮螺菌W712，拉丁文学名为Azospirillum sp.，已于2021年10月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC No.1.18567，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。
本发明分离得到的固氮螺菌W712菌株的主要形态特征和生理生化性质特征为：在大多数培养基上生长良好，在R2A琼脂培养基上，菌落边缘整齐，中间凸起，呈淡粉红色。氧化酶、柠檬酸利用、硝酸盐还原、脲酶呈阳性，精氨酸双水解酶、明胶液化、色氨酸脱氨酶呈阴性。能利用果糖、半乳糖醛酸、甘油、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸。细胞膜的极性脂成分主要包括双磷脂酰甘油、磷脂酰甘油、磷脂酰甲基乙醇胺，磷脂酰胆碱及一个未知的含氨基的极性脂细胞的呼吸醌为泛醌-10(Q-10)。
本发明所分离得到的烟草固氮螺菌W712的16S rDNA基因核苷酸序列如序列表所示，该序列已递交国际核苷酸序列数据库(GenBank)，序列检索号：MT559271。
本发明第二方面公开了一种分离、培养和鉴别所述的固氮螺菌W712的方法，包括以下步骤：
a、从自然环境中取土壤样品，加无菌水，摇床振荡，制备成母液；
b、加无菌水将步骤a的母液进行梯度稀释，并分别接种于Ashby无氮固体培养基上进行筛选培养，挑选生长较好的菌落进行纯化，得到分离的微生物单菌落；
c、将步骤b得到的微生物单菌落接种到斜面培养基，保存备用，并对菌株进行形态学分析、生理生化测定，完成系统发育树构建，进行分子鉴别，得到所述的固氮螺菌。
优选地，步骤a中的土壤样品取自云南昆明烟草种植基地的烟草根际土壤。
优选地，步骤a中的摇床振荡温度为28℃，振荡速度为180rpm，振荡时间为30min。
优选地，步骤b中的Ashby无氮固体培养基组成如下：甘露醇、10g，琼脂、15g，NaCl、0.2g，CaCO3、5g，KH2PO4、0.2g，MgSO4·7H2O、0.2g，CaSO4·2H2O、0.1g，蒸馏水定容至1000ml，调节pH值为7.0～7.2。
优选地，步骤b的具体步骤为：将母液用无菌水稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，分别取0.2mL均匀涂布于Ashby无氮固体平板培养中，置于恒温恒湿培养箱中，28℃培养4d，观察菌落形态，挑选生长较好的菌落进行划线纯化数次，至有规则单菌落出现，得到分离的微生物菌液。
优选地，步骤c将微生物单菌落接种到R2A斜面培养基，28℃培养2d，置于4℃冰箱保存备用。
本发明第三方面公开了所述固氮螺菌用于制备发酵生物香料的用途。
优选地，所述固氮螺菌制备发酵生物香料的步骤为：将固氮螺菌扩大培养后接种于发酵培养基中，28℃下摇瓶培养7天后，发酵悬浮液利用离心设备进行离心分离，上层滤液在50～60℃条件下浓缩得到固形物含量50％～80％的浓缩发酵液；浓缩发酵液用浓度30％～50％乙醇溶剂回溶，其中浓缩发酵液与溶剂体积比为V:V＝1:20～1:40；冷藏静置沉淀12～24h后进行过滤，滤液在50～60℃条件下浓缩得到固形物含量60％～80％的的黄棕色液体，为含氨基酸发酵提取物，即为所述发酵生物香料；该发酵提取物经分析含有多种氨基酸成分。
本发明第四方面公开了所述发酵生物香料用于烟草加香的用途。优选将得到的含氨基酸发酵提取物加入到卷烟烟丝中。能增加烟气清甜感，丰富协调烟香的同时保持较好舒适性。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明首次从云南昆明烟草根际土壤样品中分离得到了新的菌种W712，经形态学、生理生化性质和16S rDNA分析，鉴定结果表明，该菌株是一种新的细菌，属于固氮螺菌，微生物学分类命名为固氮螺菌W712，拉丁文学名为Azospirillum sp.；保藏编号为CGMCCNo.1.18567。
2、固氮菌是细菌中的一科，能直接利用大气中的分子态氮在固氨酶的作用下还原转化为氨，并进一步合成氨基酸，组成自身蛋白质，或为共生的农作物提供氮素养分，促进植物生长。利用无氮培养基对本发明得到的固氮螺菌W712进行筛选培养，验证了该菌具有良好的生物固氮能力，作为能提供氮素养分的优势菌种，可应用于农业生产与研究中。
3、本发明得到的固氮螺菌W712，其发酵提取物加入到卷烟烟丝中，能增加烟气清甜感，丰富协调烟香的同时能保持较好舒适性。固氮螺菌W712发酵产物提取物适合卷烟加香，具有提升卷烟抽吸品质的效果。
附图说明
图1为本发明的固氮螺菌W712在R2A培养基上的电镜照片；
图2为本发明固氮螺菌W712及部分相关菌株依据16S rDNA基因序列构建的系统发育树。
具体实施方式
以下通过实施例来详细说明本发明的技术方案，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方案的限制。在本申请的各实施例中，没有注明具体技术或条件者，按照本领域内现有技术或条件进行，所使用的材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1
1.固氮螺菌W712(Azospirillum sp.W712)的分离、培养与鉴定
1.1固氮螺菌W712的分离
取云南昆明烟草种植基地烟草根际土壤样品，塑料袋密封带回，4℃保存待用。准确称取10g土样，加入90mL无菌水，28℃、180rpm摇床震荡30min，制备成母液；用无菌水将母液浓度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，将5个浓度的菌液分别取0.2mL均匀涂布于Ashby无氮固体平板培养基中，每个浓度的菌液设置3个平行试验，置于恒温恒湿培养箱中，28℃下培养4d，观察菌落形态，挑选生长较好的菌落进行划线纯化数次，至有规则单菌落出现；将规则的微生物单菌落接种到R2A斜面培养基，28℃培养2d，置于4℃冰箱保存备用，并编号W712。
1.2固氮螺菌W712的鉴定
对分离纯化的菌株W712进行形态学、生理生化性质和16S rDNA分析，鉴定结果表明属于固氮螺菌，其微生物学分类命名为固氮螺菌W712，拉丁文学名：Azospirillumsp.W712。
固氮螺菌W712在R2A培养基上的电镜照片如附图1所示。
固氮螺菌W712在大多数培养基上生长良好，在R2A琼脂培养基上，菌落边缘整齐，中间凸起，呈淡粉红色。氧化酶、柠檬酸利用、硝酸盐还原、脲酶呈阳性，精氨酸双水解酶、明胶液化、色氨酸脱氨酶呈阴性。能利用果糖、半乳糖醛酸、甘油、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸。细胞膜的极性脂成分主要包括双磷脂酰甘油、磷脂酰甘油、磷脂酰甲基乙醇胺，磷脂酰胆碱及一个未知的含氨基的极性脂细胞的呼吸醌为泛醌-10(Q-10)。
固氮螺菌W712的生理生化特征如表1所示：
表1固氮螺菌W712的生理生化特征
实验 生长反应 实验 生长反应
过氧化氢酶 -- 精氨酸双水解酶 --
氧化酶 ++ 明胶液化 --
柠檬酸利用 ++ 色氨酸脱氨酶 --
脲酶 ++ 酸性磷酸酶 ++
注：“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性
固氮螺菌W712的碳氮利用情况如表2所示：
表2固氮螺菌W712的碳氮源利用情况
碳源利用 结果 碳源或氮源利用 结果
醋酸 + 果糖 +
乙酰乙酸 + D-半乳糖醛酸 +
丙氨酸 + 甘油 +
精氨酸 + 葡糖醛酰胺 +
天冬氨酸 + D-苹果酸 +
α-酮基丁酸 + L-苹果酸 +
γ-氨基丁酸 + 丙酸 +
注：“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性
固氮螺菌W712的16S rDNA部分序列如序列表所示，该序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较分析，并从数据库获得相关种属的16S rDNA基因序列，构建系统发育树，见附图2。经比较分析发现，本发明的固氮螺菌W712与菌株Azospirillumbaldaniorum Sp245的亲缘关系最近，在系统进化树上形成独立的分枝，综合形态、生理生化、细胞化学和系统进化分析等特征，两者又有明显差距，表明本发明的固氮螺菌W712是一个新物种，拉丁文学名为Azospirillum sp.W712。
固氮螺菌W712在GenBank数据库的16S rDNA基因核苷酸序列登录号为MT559271，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.1.18567。固氮螺菌W712及相关种属的16S rDNA基因序列构建的系统发育树如附图2所示。
实施例2
1.固氮螺菌W712发酵提取物的制备
1.1固氮螺菌W712(Azospirillum sp.W712)的培养
(1)试管斜面培养
采用斜面保藏培养基，培养基为R2A琼脂培养基，培养基的配方为：葡萄糖0.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，可溶性淀粉0.5g，丙酮酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，琼脂15g，蒸馏水定容到1000mL，pH值7.2。将培养基在121℃下灭菌25分钟，摆成斜面，接种固氮螺菌W712菌株，28℃下培养1周，获得试管菌种；
(2)种子培养
采用种子培养基，种子培养基的配方为：糊精120g，大豆粉40g，酵母膏2g，色氨酸0.5g，β-丙氨酸5g，硫酸镁0.5g，磷酸铵0.2g，蒸馏水定容到1000mL，pH值7.2。将培养基在121℃下灭菌25分钟，从步骤(1)的试管斜面上挑取部分菌丝体接入种子液中，28℃摇瓶培养36h，获得液体菌种；
(3)发酵培养
取5L发酵培养基，培养基的配方为：大豆粉10g；葡萄糖10g；蛋白胨3g；氯化钠2.5g；碳酸钙2g；蒸馏水1000mL，pH值7.2。将培养基在121℃下灭菌30min，将步骤(2)中的液体菌种按10％的接种量接到发酵培养基中，摇瓶培养6天，培养温度为28℃，得到发酵悬浮液。
2.固氮螺菌W712发酵提取物制备和评价
2.1发酵提取物的制备
将固氮螺菌发酵悬浮液利用离心机进行离心分离，取上层滤清液，滤清液在60℃条件下浓缩得到固形物含量50％的浓缩发酵液；浓缩发酵液用浓度40％乙醇溶剂回溶(发酵液与溶剂体积比V:V＝1:20)，于4℃下冷藏静置沉淀24h后进行过滤，滤液在60℃条件下浓缩得到固形物含量为70％的黄棕色液体，即为固氮螺菌含氨基酸发酵产物提取物，作为生物香料在卷烟加香中的应用。
2.2发酵产物提取物的评价与分析
将得到的固氮螺菌含氨基酸发酵提取物用微量喷雾器按烟丝0.25‰的量均匀地喷加在烟丝上，对照组加入等量蒸馏水，将加香烟丝和对照烟丝卷制成卷烟，放入恒温恒湿箱内，在湿度60％±2，温度22℃±2条件下平衡24h后，由评吸专家组成的评吸小组进行感官评吸，评吸结果如表3所示。由评吸结果可知，与对照卷烟相比，添加发酵提取物的样品卷烟具有特殊的清甜香，烟香丰富性增加，烟气量和香气浓度明显提升，且舒适性良好，说明该发酵提取物具有使卷烟增香，提升卷烟抽吸品质的功效，适宜在烟草加香中进行应用。
表3固氮螺菌W712发酵提取物的感官评吸比较
Figure GDA0004181550020000071
对固氮螺菌发酵提取物利用全自动氨基酸分析仪测定氨基酸含量，具体测定方法参照国标GB/T 5009.124-2016，结果如表4所示。由表4可知，发酵产物提取物中氨基酸总量为11.14g/100g，其中提供甜味感受的氨基酸包括苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸，甜味氨基酸总含量为4.25g/100g，占比38.15％，是该发酵提取物能使卷烟主流烟气具有明显清甜感的主要原因。
表4发酵产物提取物氨基酸含量分析
Figure GDA0004181550020000072
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 云南中烟工业有限责任公司
<120> 一种固氮螺菌、其分离方法和应用
<130> RIB220224
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1474
<212> DNA
<213> 固氮螺菌W712(Azospirillum sp.)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag aacgaacgct ggcggcatgc ctaacacatg caagtcgaac 60
gagggcttcg gccctagtgg cgcacgggtg agtaacacgt gggaacctgc ctttcggttc 120
gggataacgt ctggaaacgg acgctaacac cggatacgtc cttcgggaga aagtttacgc 180
cgagagaggg gcccgcgtcc gattaggtag ttggtggggt aatggcccac caagccgacg 240
atcggtagct ggtctgagag gatgatcagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300
ctacgggagg cagcagtggg gaatattgga caatgggggc aaccctgatc cagcaatgcc 360
gcgtgagtga tgaaggcctt agggttgtaa agctctttcg cacgcgacga tgatgacggt 420
agcgtgagaa gaagccccgg ctaacttcgt gccagcagcc gcggtaatac gaagggggcg 480
agcgttgttc ggaattactg ggcgtaaagg gcgcgtaggc ggcgcattaa gtcaggagtg 540
aaagccccgg gctcaacctg ggaacggctc ttgatactgg tgcgcttgag ttccggagag 600
gatggtggaa ttcccagtgt agaggtgaaa ttcgtagata ttggaagaac accggtggcg 660
aaggcggcca tctggacgga cactgacgct gaggcgcgaa agcgtgggga gcaaacagga 720
ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgaatgct agacgctggg gtgcatgcac 780
ttcggtgtcg ccgctaacgc attaagcatt ccgcctgggg agtacggccg caaggttaaa 840
actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca 900
acgcgcagaa ccttaccaac ccttgacatg tccactaccg gctcgagaga tcgggctttc 960
agttcggctg ggtggaacac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 1020
tgggttaagt cccgcaacga gcgcaacccc taccgccagt tgccatcatt cagttgggca 1080
ctctggtgga actgccggtg acaagccgga ggaaggcggg gatgacgtca agtcctcatg 1140
gcccttatgg gttgggctac acacgtgcta caatggcggt gacagtggga cgcgaagtcg 1200
caagatggag ccaatcccca aaagccgtct cagttcggat tgcactctgc aactcgggtg 1260
catgaagttg gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg 1320
ccttgtacac accgcccgtc acaccacgag agtttgcaac acccgaagtc ggtgaggtaa 1380
cctttatgga gccagccgcc gaaggtgggg cagatgattg gggtgaagtc gtaacaaggt 1440
agccgtatcg gaaggtgcgg ctggatcacc tcct 1474

Claims (2)

1.一种固氮螺菌用于制备发酵生物香料的用途，其特征在于，其微生物学分类命名为固氮螺菌W712，拉丁文学名为Azospirillum sp.；其16S rDNA部分序列如序列表所示；其保藏编号为CGMCC No.1.18567；所述固氮螺菌制备发酵生物香料的步骤为：将固氮螺菌扩大培养后接种于发酵培养基中，28℃下摇瓶培养7天后，发酵悬浮液利用离心设备进行离心分离，上层滤液在50～60℃条件下浓缩得到固形物含量50％～80％的浓缩发酵液；浓缩发酵液用浓度30％～50％乙醇溶剂回溶，其中浓缩发酵液与溶剂体积比为V:V＝1:20～1:40；冷藏静置沉淀12～24h后进行过滤，滤液在50～60℃条件下浓缩得到固形物含量60％～80％的黄棕色液体，即为所述发酵生物香料。
2.根据权利要求1所述用途，其特征在于，将制得的发酵生物香料用于卷烟加香中的用途。
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