CN108467875B - 一种微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法 - Google Patents

一种微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108467875B
CN108467875B CN201810399552.2A CN201810399552A CN108467875B CN 108467875 B CN108467875 B CN 108467875B CN 201810399552 A CN201810399552 A CN 201810399552A CN 108467875 B CN108467875 B CN 108467875B
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
fermentation
dihydroactinidiolide
carotenoid
preparing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201810399552.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108467875A (zh
Inventor
郑坚强
司俊玲
周晓微
吴晓宗
田数
张俊杰
贾学伟
李天笑
许春平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhengzhou University of Light Industry
Original Assignee
Zhengzhou University of Light Industry
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhengzhou University of Light Industry filed Critical Zhengzhou University of Light Industry
Priority to CN201810399552.2A priority Critical patent/CN108467875B/zh
Publication of CN108467875A publication Critical patent/CN108467875A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108467875B publication Critical patent/CN108467875B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

本发明公开了一种微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法。本菌株来源于宁夏枸杞。该方法经过菌种活化，制备种子液，然后对富含类胡萝卜素的植物材料进行发酵，或者采用粗酶催化富含类胡萝卜素的植物原料材料，经过滤，萃取得到纯度高、阈值低的二氢猕猴桃内酯香精。本技术发明技术操作简单，技术参数稳定，设备投入少，工业化可行。该方法的发明，开创了生物技术制备食用香精香料的新型方法，有利于对富含类胡萝卜素的农副产品，比如枸杞、番茄皮，胡萝卜等，提高附加值，对这类产品的深加工具有很好的指导意义。

Description

一种微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法
技术领域
本发明涉及食品生物技术领域，特别是指一种微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法。
背景技术
类胡萝卜素在自然间广泛地分布，尤其是枸杞、番茄以及胡萝卜等黄色植物原料，它是很多化合物的前体物质，可以降解C13-类胡萝卜素（非萜类化合物），降解产物包括二氢猕猴桃内酯，二氢大马酮等，这些是构成茶叶，玫瑰，烟草和葡萄酒等必需的香味物质。由于它们往往是低味阈值，而且其中很多是强有效的香气化合物，因而引起了香料和香水行业的极大关注。直接从植物资源中获得类胡萝卜素的降解风味物质工作量大，产品得率低，导致这类技术成本高。而利用生物技术制备的风味物质纯度高、产品得率高，得到的香气化合物目标明确，能够工业化生产，产品产量大。本技术发明从天然枸杞中筛选可以降解的类胡萝卜素生成香气物质的菌株，发酵降解类胡萝卜素得到的二氢猕猴桃内酯香气化合物，优化菌株发酵类胡萝卜素生成香气化合物的关键技术参数，为生物技术从富含类胡萝卜素的天然植物中制备香气物质提供科学依据，促进发酵技术在食用香精香料行业的应用。
目前，国内外制备食用香精香料主要是化工合成方法，化工合成主要不足是对环境危害大，产品中含有重金属等，长时间使用，对人体有害，人工合成的产品中还有化工副产品，使用受到限制。目前在市场上，将近有80%的香精香料质是化学合成的。然而，德国在21世纪初，在食品中应用的7%的香精香料添加剂是天然的。这种趋势的发展，有利于消费者健康和营养的模式消费结构的改善。利用生物技术生产香精香料近年来得到了快速的发展，根据市场稳定的发展趋势，需要生产新的香精香料或者香料资源。化学合成方法和在植物中提取方法，仍旧有生命力，但是生物转化产生香精香料越来越受到人们的重视。利用微生物技术产生香精香料在欧盟和美国的立法机构认为是安全的，天然的。利用生物工程技术，可以产生无穷无尽的质量均匀的产品。微生物技术转化的香精香料具有天然型，有利于产品利润的提高。天然产品和化学合成的芳香物质产品价格差别大，大幅增加产品附加值。通过生物技术制备高品质的香精香料，是香精香料行业未来的发展主要趋势。
发明内容
本发明提出一种微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法，解决了现有技术中二氢猕猴桃内酯制备条件严格，技术要求高的技术问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法，通过如下生产步骤制备获得：
（1）菌种活化，从保藏培养基上挑取发酵菌株，接种到活化培养基中活化培养48h-72h；
所述发酵菌株具体为中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号：M2017593；名称：Bacillus altitudinis SH161；保藏日期：2017年10月19日；地址：中国.武汉.武汉大学；邮编：430072；。
（2）制备种子液，将步骤（1）中活化后的菌种接种到种子培养基中，28-30℃、160r/min摇床培养36h-48h左右，制备种子液；
所述种子培养基配方：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，麦芽提取物3 g/L，酵母粉3.0g/L，K2HPO4 1.5 g/L，KCl 0.5 g/L，121 ℃，灭菌20 min。制备种子液时，具体装液量具体例如为：100/300mL锥形瓶；
（3）发酵培养，将步骤（2）中所制备的种子液接种到发酵培养基中，28-30℃、160r/min摇床培养48h-72h发酵培养；
所述发酵培养基配方：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，麦芽提取物3 g/L，酵母粉3.0g/L，MgSO4 0.5 g/L，NaNO3 3.0 g/L，FeSO4 0.01 g/L，β-胡萝卜素110 mg/L，121 ℃，灭菌20 min；
（4）制备粗酶，首先，菌种发酵液经过硫酸沉淀，过滤，得到上清液；然后透析，第三步进行DEAE-Sepharose离子交换纯化，得到馏分，再次通过phadax G-100凝胶过滤，得到纯度较高的酶，进行应用。
具体使用时，以上述步骤（4）具体操作如下：发酵液采用常压过滤，过滤后的发酵液通过离心方法到澄清的粗酶液。离心后的粗酶液，加硫酸铵至饱和度的70%，4℃下静置过夜后，离心（10000pm，4℃，20 min），取上清液，测定酶活。第二步，进行透析，将盐析所得的粗酶加入预先处理好的透析袋中，粗酶液占透析袋的2/3，空气排净，两端封闭，放入磷酸缓冲溶液（pH7.4）中在4℃下透析，每隔6 h更换缓冲溶液一次，透析24-48 h，同时检测脱盐情况，直至外界溶液的pH，电导率和平衡缓冲液一致为止。第三步，透析液进行 DEAE-Sepharose离子交换，首先DEAE-Sepharose-F.F.离子交换柱（1.0 cm×20 cm）用含有NaCl缓冲溶液平衡，以3.0 mL/min的速度洗脱3个柱体积，直至流出液的pH值与缓冲液相同。
然后将经过透析、浓缩后的酶液上样于预装好的DEAE-Sepharose-F.F.离子交换柱，然后在4℃温度下，用0.1-0.5 mol/L的NaCl盐溶液以2.0 mL/min流速进行阶段洗脱。自动分部收集仪每3 mL收集一管洗脱液，同时检测每管洗脱液的蛋白含量及酶活力，并收集具有酶活的组分。将收集的酶液透析、浓缩后4℃保存备用。第四步，降上一步得的从粗酶液，进行Sephadax G-100凝胶过滤，经离子交换层析、透析、浓缩后的酶液，上样于预装好的Sephadax G-100葡聚糖凝胶柱。用Na2HPO4-KH2PO4缓冲液（10 mmol/L，pH6.5）以0.3 mL/min的流速进行洗脱，自动分布收集仪每3 mL收集一管洗脱液。同时检测每管洗脱液的蛋白含量及酶活力，并收集具有酶活的组分，于4℃保存，得到需要的粗酶。
（5）粗酶催化，添加0.5%-2.0%粗酶（v/w，酶浓度1.0 mg/mL），在30-35℃温度，催化反应10h-20h。
（6）萃取
经过对菌株或者粗酶液进行液体培养类胡萝卜素后，将菌液进行过滤，采用二氯甲烷进行萃取，萃取分3-5次完成，第一次萃取时轻微振荡，每隔3 min振荡一次，共振荡三次；第二次到第五次萃取时剧烈振荡，振荡至有泡沫出现，每隔3 min振荡一次，共振荡三次。萃取后用饱和的碳酸氢钠洗涤，然后再用无水硫酸钠进行干燥，至于密闭容器，得到二氢猕猴桃内酯香精，冷冻贮藏。产品收率为1.0mg/L-2.0 mg/L，纯度9%-11%。
本技术方案能产生的有益效果：
1、本发明利用上述生产制备方法，工艺简单，技术参数容易控制，便于大规模工业化生产，对促进生物技术制备二氢猕猴桃内酯香精的产业化发展，具有重要的意义。尤其是对富含类胡萝卜素的农副产品，比如枸杞、番茄皮，胡萝卜等，对这类产品的深加工具有很好的指导意义。
2、本发明技术条件温和，技术参数稳定，能够连续化制备天然的二氢猕猴桃内酯。该香气化合物香味纯正，气味自然，作为食品香料添加剂，适合用于食品、高档化妆品等。本发明制备的二氢猕猴桃内酯的产率为1.0mg/L-2.0 mg/L，获得产品纯度10%左右。
附图说明
图1为β-胡萝卜素溶液浓度与吸光度的线性关系图，其中y=β-胡萝卜素浓度（μmol/L）；x=吸光度。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中β-胡萝卜素含量测定、β-胡萝卜素降解率及酶活的计算方法简要介绍如下。
β-胡萝卜素标准曲线的测定：
分别取β-胡萝卜素储备液0、20、40、60、120、180、240、480 μL于棕色容量瓶中加蒸馏水定容至5 mL，以蒸馏水做空白对照，于450 nm处测定其吸光度，所得数据见图1，得到β-胡萝卜素溶液浓度与吸光度的线性关系。
β-胡萝卜素浓度与吸光度之间的线性方程：y=107.04x-0.4326，决定系数r2=0.992。
β-胡萝卜素的降解率及酶活性的计算：
取5 mL酶液（37 ℃水浴中保温）并加入500 μL β-胡萝卜素储备液，加入光程1 cm的玻璃比色皿中，以未加β-胡萝卜素储备液的粗酶液作对照，立刻在450 nm处测其吸光度，测完后立即在37 ℃下避光水浴，每隔1 min测定1次吸光度。酶活性单位定义：在37 ℃，pH值为6.5，1 min降解1 μmol β-胡萝卜素所须的酶量为1个单位。
β-胡萝卜素降解率及酶活性的计算公式：
Figure 550427DEST_PATH_IMAGE002
酶活力=（C0-Ct）×（5.0+0.5）/ 5.0× t；
C0=初始β-胡萝卜素含量（μmol/L）；
Ct=t min后β-胡萝卜素含量（μmol/L）；
t =时间（min）。
实施例1
一种微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法，通过如下生产步骤制备获得。
（1）菌种活化：从保藏培养基上挑取发酵菌株，接种到活化培养基中活化培养48h；
所述发酵菌株具体为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏的保藏号为：2017593，菌株：高低芽孢杆菌SH161，该菌株为可公开获得菌株；
所述活化培养基为葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，麦芽提取物3 g/L，酵母粉3.0 g/L，琼脂粉20 g/L，β-胡萝卜素80 mg/L，121 ℃，灭菌20 min。
（2）制备种子液：将步骤（1）中活化后的菌种接种到种子培养基中，30℃、160 r/min摇床培养48h，制备种子液；
所述种子培养基配方：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，麦芽提取物3 g/L，酵母粉3.0g/L，K2HPO4 1.5 g/L，KCl 0.5 g/L，121 ℃，灭菌20 min；制备种子液时，具体装液量为：100/ 250mL锥形瓶。
（3）发酵培养：将步骤（2）中所制备的种子液接种到发酵培养基中，30℃、160 r/min摇床培养48h发酵培养；将种子液接种发酵培养基时，接种量具体按4%体积分数比例进行接种，得发酵液；
所述发酵培养基配方：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，麦芽提取物3 g/L，酵母粉3.0g/L，MgSO4 0.5 g/L，NaNO3 3.0 g/L，FeSO4 0.01 g/L，β-胡萝卜素110 mg/L，121 ℃，灭菌20 min；
（4）制备粗酶：发酵液采用常压过滤，过滤后的发酵液通过离心方法到澄清的粗酶液。离心后的粗酶液，加硫酸铵至硫酸铵饱和度为70%，4℃下静置过夜后，离心（10000pm，4℃，20 min），取上清液，测定酶活。第二步，进行透析，将盐析所得的粗酶加入预先处理好的透析袋中，粗酶液占透析袋的2/3，空气排净，两端封闭，放入磷酸缓冲溶液（pH7.4）中在4℃下透析，每隔6 h更换缓冲溶液一次，透析24 h，同时检测脱盐情况，直至外界溶液的pH，电导率和平衡缓冲液一致为止。第三步，透析液进行 DEAE-Sepharose离子交换，首先DEAE-Sepharose-F.F.离子交换柱（1.0 cm×20 cm）用含有NaCl缓冲溶液平衡，以3.0 mL/min的速度洗脱3个柱体积，直至流出液的pH值与缓冲液相同。
然后将经过透析、浓缩后的酶液上样于预装好的DEAE-Sepharose-F.F.离子交换柱，然后在4℃温度下，用0.1 mol/L的NaCl盐溶液以2.0 mL/min流速进行阶段洗脱。自动分部收集仪每3 mL收集一管洗脱液，同时检测每管洗脱液的蛋白含量及酶活力，并收集具有酶活的组分。将收集的酶液透析、浓缩后4℃保存备用。第四步，降上一步得的从粗酶液，进行Sephadax G-100凝胶过滤，经离子交换层析、透析、浓缩后的酶液，上样于预装好的Sephadax G-100葡聚糖凝胶柱。用Na2HPO4-KH2PO4缓冲液（10 mmol/L，pH6.5）以0.3 mL/min的流速进行洗脱，自动分布收集仪每3 mL收集一管洗脱液。同时检测每管洗脱液的蛋白含量及酶活力，并收集具有酶活的组分，于4℃保存，得到需要的粗酶液。
（5）粗酶催化：向类胡萝卜素中添加0.5%粗酶（v/w，酶浓度1.0 mg/mL），在30℃温度，催化反应10h。
（6）萃取：经过对菌株或者粗酶液进行液体培养类胡萝卜素后，将菌液进行过滤，采用二氯甲烷进行萃取，萃取分3次完成，第一次萃取时轻微振荡，每隔3 min振荡一次，共振荡三次；第二次到第五次萃取时剧烈振荡，振荡至有泡沫出现，每隔3 min振荡一次，共振荡三次。萃取后用饱和的碳酸氢钠洗涤，然后再用无水硫酸钠进行干燥，至于密闭容器，得到二氢猕猴桃内酯香精，冷冻贮藏。产品收率为1.2mg/L，纯度9.3%。
实施例2
一种微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法，通过如下生产步骤制备获得。
（1）菌种活化：从保藏培养基上挑取发酵菌株，接种到活化培养基中活化培养72h；
所述发酵菌株具体为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏的保藏号为：2017593，菌株：高低芽孢杆菌SH161，该菌株为可公开获得菌株；
所述活化培养基为葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，麦芽提取物3 g/L，酵母粉3.0 g/L，琼脂粉20 g/L，β-胡萝卜素80 mg/L，121 ℃，灭菌20 min。
（2）制备种子液：将步骤（1）中活化后的菌种接种到种子培养基中，28℃、160 r/min摇床培养36h，制备种子液；
所述种子培养基配方：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，麦芽提取物3 g/L，酵母粉3.0g/L，K2HPO4 1.5 g/L，KCl 0.5 g/L，121 ℃，灭菌20 min；制备种子液时，具体装液量为：100/ 250mL锥形瓶。
（3）发酵培养：将步骤（2）中所制备的种子液接种到发酵培养基中，28℃、160 r/min摇床培养36h发酵培养；将种子液接种发酵培养基时，接种量具体按4%体积分数比例进行接种，得发酵液；
所述发酵培养基配方：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，麦芽提取物3 g/L，酵母粉3.0g/L，MgSO4 0.5 g/L，NaNO3 3.0 g/L，FeSO4 0.01 g/L，β-胡萝卜素110 mg/L，121 ℃，灭菌20 min；
（4）制备粗酶：发酵液采用常压过滤，过滤后的发酵液通过离心方法到澄清的粗酶液。离心后的粗酶液，加硫酸铵至硫酸铵饱和度为70%，4℃下静置过夜后，离心（10000pm，4℃，20 min），取上清液，测定酶活。第二步，进行透析，将盐析所得的粗酶加入预先处理好的透析袋中，粗酶液占透析袋的2/3，空气排净，两端封闭，放入磷酸缓冲溶液（pH7.4）中在4℃下透析，每隔6 h更换缓冲溶液一次，透析48 h，同时检测脱盐情况，直至外界溶液的pH，电导率和平衡缓冲液一致为止。第三步，透析液进行 DEAE-Sepharose离子交换，首先DEAE-Sepharose-F.F.离子交换柱（1.0 cm×20 cm）用含有NaCl缓冲溶液平衡，以3.0 mL/min的速度洗脱3个柱体积，直至流出液的pH值与缓冲液相同。
然后将经过透析、浓缩后的酶液上样于预装好的DEAE-Sepharose-F.F.离子交换柱，然后在4℃温度下，用0.5 mol/L的NaCl盐溶液以2.0 mL/min流速进行阶段洗脱。自动分部收集仪每3 mL收集一管洗脱液，同时检测每管洗脱液的蛋白含量及酶活力，并收集具有酶活的组分。将收集的酶液透析、浓缩后4℃保存备用。第四步，降上一步得的从粗酶液，进行Sephadax G-100凝胶过滤，经离子交换层析、透析、浓缩后的酶液，上样于预装好的Sephadax G-100葡聚糖凝胶柱。用Na2HPO4-KH2PO4缓冲液（10 mmol/L，pH6.5）以0.3 mL/min的流速进行洗脱，自动分布收集仪每3 mL收集一管洗脱液。同时检测每管洗脱液的蛋白含量及酶活力，并收集具有酶活的组分，于4℃保存，得到需要的粗酶液。
（5）粗酶催化：向类胡萝卜素中添加2.0%粗酶（v/w，酶浓度1.0 mg/mL），在35℃温度，催化反应20h。
（6）萃取：经过对菌株或者粗酶液进行液体培养类胡萝卜素后，将菌液进行过滤，采用二氯甲烷进行萃取，萃取分5次完成，第一次萃取时轻微振荡，每隔3 min振荡一次，共振荡三次；第二次到第五次萃取时剧烈振荡，振荡至有泡沫出现，每隔3 min振荡一次，共振荡三次。萃取后用饱和的碳酸氢钠洗涤，然后再用无水硫酸钠进行干燥，至于密闭容器，得到二氢猕猴桃内酯香精，冷冻贮藏。产品收率为2.0 mg/L，纯度10 %。
实施例3
一种微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法，通过如下生产步骤制备获得。
（1）菌种活化：从保藏培养基上挑取发酵菌株，接种到活化培养基中活化培养48h；
所述发酵菌株具体为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏的保藏号为：2017593，菌株：高低芽孢杆菌SH161，该菌株为可公开获得菌株；
所述活化培养基为葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，麦芽提取物3 g/L，酵母粉3.0 g/L，琼脂粉20 g/L，β-胡萝卜素80 mg/L，121 ℃，灭菌20 min。
（2）制备种子液：将步骤（1）中活化后的菌种接种到种子培养基中，30℃、160 r/min摇床培养48h，制备种子液；
所述种子培养基配方：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，麦芽提取物3 g/L，酵母粉3.0g/L，K2HPO4 1.5 g/L，KCl 0.5 g/L，121 ℃，灭菌20 min；制备种子液时，具体装液量为：100/ 250mL锥形瓶。
（3）发酵培养：将步骤（2）中所制备的种子液接种到发酵培养基中，29℃、160 r/min摇床培养40h发酵培养；将种子液接种发酵培养基时，接种量具体按4%体积分数比例进行接种，得发酵液；
所述发酵培养基配方：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，麦芽提取物3 g/L，酵母粉3.0g/L，MgSO4 0.5 g/L，NaNO3 3.0 g/L，FeSO4 0.01 g/L，β-胡萝卜素110 mg/L，121 ℃，灭菌20 min；
（4）制备粗酶：发酵液采用常压过滤，过滤后的发酵液通过离心方法到澄清的粗酶液。离心后的粗酶液，加硫酸铵至硫酸铵饱和度为70%，4℃下静置过夜后，离心（10000pm，4℃，20 min），取上清液，测定酶活。第二步，进行透析，将盐析所得的粗酶加入预先处理好的透析袋中，粗酶液占透析袋的2/3，空气排净，两端封闭，放入磷酸缓冲溶液（pH7.4）中在4℃下透析，每隔6 h更换缓冲溶液一次，透析24-48 h，同时检测脱盐情况，直至外界溶液的pH，电导率和平衡缓冲液一致为止。第三步，透析液进行 DEAE-Sepharose离子交换，首先DEAE-Sepharose-F.F.离子交换柱（1.0 cm×20 cm）用含有NaCl缓冲溶液平衡，以3.0 mL/min的速度洗脱3个柱体积，直至流出液的pH值与缓冲液相同。
然后将经过透析、浓缩后的酶液上样于预装好的DEAE-Sepharose-F.F.离子交换柱，然后在4℃温度下，用0.3 mol/L的NaCl盐溶液以2.0 mL/min流速进行阶段洗脱。自动分部收集仪每3 mL收集一管洗脱液，同时检测每管洗脱液的蛋白含量及酶活力，并收集具有酶活的组分。将收集的酶液透析、浓缩后4℃保存备用。第四步，降上一步得的从粗酶液，进行Sephadax G-100凝胶过滤，经离子交换层析、透析、浓缩后的酶液，上样于预装好的Sephadax G-100葡聚糖凝胶柱。用Na2HPO4-KH2PO4缓冲液（10 mmol/L，pH6.5）以0.3 mL/min的流速进行洗脱，自动分布收集仪每3 mL收集一管洗脱液。同时检测每管洗脱液的蛋白含量及酶活力，并收集具有酶活的组分，于4℃保存，得到需要的粗酶液。
（5）粗酶催化：向类胡萝卜素中添加1.5%粗酶（v/w，酶浓度1.0 mg/mL），在33℃温度，催化反应15h。
（6）萃取：经过对菌株或者粗酶液进行液体培养类胡萝卜素后，将菌液进行过滤，采用二氯甲烷进行萃取，萃取分3次完成，第一次萃取时轻微振荡，每隔3 min振荡一次，共振荡三次；第二次到第三次萃取时剧烈振荡，振荡至有泡沫出现，每隔3 min振荡一次，共振荡三次。萃取后用饱和的碳酸氢钠洗涤，然后再用无水硫酸钠进行干燥，至于密闭容器，得到二氢猕猴桃内酯香精，冷冻贮藏。产品收率为1.3 mg/L，纯度9.1%。
实施例4
一种微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法，通过如下生产步骤制备获得。
（1）菌种活化：从保藏培养基上挑取发酵菌株，接种到活化培养基中活化培养48h；
所述发酵菌株具体为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏的保藏号为：2017593，菌株：高低芽孢杆菌SH161，该菌株为可公开获得菌株；
所述活化培养基为葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，麦芽提取物3 g/L，酵母粉3.0 g/L，琼脂粉20 g/L，β-胡萝卜素80 mg/L，121 ℃，灭菌20 min。
（2）制备种子液：将步骤（1）中活化后的菌种接种到种子培养基中，28℃、160 r/min摇床培养72h，制备种子液；
所述种子培养基配方：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，麦芽提取物3 g/L，酵母粉3.0g/L，K2HPO4 1.5 g/L，KCl 0.5 g/L，121 ℃，灭菌20 min；制备种子液时，具体装液量为：100/ 250mL锥形瓶。
（3）发酵培养：将步骤（2）中所制备的种子液接种到发酵培养基中，30℃、160 r/min摇床培养48h发酵培养；将种子液接种发酵培养基时，接种量具体按4%体积分数比例进行接种，得发酵液；
所述发酵培养基配方：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，麦芽提取物3 g/L，酵母粉3.0g/L，MgSO4 0.5 g/L，NaNO3 3.0 g/L，FeSO4 0.01 g/L，β-胡萝卜素110 mg/L，121 ℃，灭菌20 min；
（4）制备粗酶：发酵液采用常压过滤，过滤后的发酵液通过离心方法到澄清的粗酶液。离心后的粗酶液，加硫酸铵至饱和度的70%，4℃下静置过夜后，离心（10000pm，4℃，20min），取上清液，测定酶活。第二步，进行透析，将盐析所得的粗酶加入预先处理好的透析袋中，粗酶液占透析袋的2/3，空气排净，两端封闭，放入磷酸缓冲溶液（pH7.4）中在4℃下透析，每隔6 h更换缓冲溶液一次，透析30 h，同时检测脱盐情况，直至外界溶液的pH，电导率和平衡缓冲液一致为止。第三步，透析液进行 DEAE-Sepharose离子交换，首先DEAE-Sepharose-F.F.离子交换柱（1.0 cm×20 cm）用含有NaCl缓冲溶液平衡，以3.0 mL/min的速度洗脱3个柱体积，直至流出液的pH值与缓冲液相同。
然后将经过透析、浓缩后的酶液上样于预装好的DEAE-Sepharose-F.F.离子交换柱，然后在4℃温度下，用0.2 mol/L的NaCl盐溶液以2.0 mL/min流速进行阶段洗脱。自动分部收集仪每3 mL收集一管洗脱液，同时检测每管洗脱液的蛋白含量及酶活力，并收集具有酶活的组分。将收集的酶液透析、浓缩后4℃保存备用。第四步，降上一步得的从粗酶液，进行Sephadax G-100凝胶过滤，经离子交换层析、透析、浓缩后的酶液，上样于预装好的Sephadax G-100葡聚糖凝胶柱。用Na2HPO4-KH2PO4缓冲液（10 mmol/L，pH6.5）以0.3 mL/min的流速进行洗脱，自动分布收集仪每3 mL收集一管洗脱液。同时检测每管洗脱液的蛋白含量及酶活力，并收集具有酶活的组分，于4℃保存，得到需要的粗酶液。
（5）粗酶催化：向类胡萝卜素中添加1.8 %粗酶（v/w，酶浓度1.0 mg/mL），在34 ℃温度，催化反应18 h。
（6）萃取：经过对菌株或者粗酶液进行液体培养类胡萝卜素后，将菌液进行过滤，采用二氯甲烷进行萃取，萃取分4次完成，第一次萃取时轻微振荡，每隔3 min振荡一次，共振荡三次；第二次到第四次萃取时剧烈振荡，振荡至有泡沫出现，每隔3 min振荡一次，共振荡三次。萃取后用饱和的碳酸氢钠洗涤，然后再用无水硫酸钠进行干燥，至于密闭容器，得到二氢猕猴桃内酯香精，冷冻贮藏。产品收率为1.6 mg/L，纯度9.6%。
实施例5
一种微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法，通过如下生产步骤制备获得。
（1）菌种活化：从保藏培养基上挑取发酵菌株，接种到活化培养基中活化培养48h；
所述发酵菌株具体为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏的保藏号为：2017593，菌株：高低芽孢杆菌SH161，该菌株为可公开获得菌株；
所述活化培养基为葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，麦芽提取物3 g/L，酵母粉3.0 g/L，琼脂粉20 g/L，β-胡萝卜素80 mg/L，121 ℃，灭菌20 min。
（2）制备种子液：将步骤（1）中活化后的菌种接种到种子培养基中，30℃、160 r/min摇床培养48h，制备种子液；
所述种子培养基配方：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，麦芽提取物3 g/L，酵母粉3.0g/L，K2HPO4 1.5 g/L，KCl 0.5 g/L，121 ℃，灭菌20 min；制备种子液时，具体装液量为：100/ 250mL锥形瓶。
（3）发酵培养：将步骤（2）中所制备的种子液接种到发酵培养基中，30℃、160 r/min摇床培养48h发酵培养；将种子液接种发酵培养基时，接种量具体按4%体积分数比例进行接种，得发酵液；
所述发酵培养基配方：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，麦芽提取物3 g/L，酵母粉3.0g/L，MgSO4 0.5 g/L，NaNO3 3.0 g/L，FeSO4 0.01 g/L，β-胡萝卜素110 mg/L，121 ℃，灭菌20 min；
（4）制备粗酶：发酵液采用常压过滤，过滤后的发酵液通过离心方法到澄清的粗酶液。离心后的粗酶液，加硫酸铵至饱和度的70%，4℃下静置过夜后，离心（10000pm，4℃，20min），取上清液，测定酶活。第二步，进行透析，将盐析所得的粗酶加入预先处理好的透析袋中，粗酶液占透析袋的2/3，空气排净，两端封闭，放入磷酸缓冲溶液（pH7.4）中在4℃下透析，每隔6 h更换缓冲溶液一次，透析24-48 h，同时检测脱盐情况，直至外界溶液的pH，电导率和平衡缓冲液一致为止。第三步，透析液进行 DEAE-Sepharose离子交换，首先DEAE-Sepharose-F.F.离子交换柱（1.0 cm×20 cm）用含有NaCl缓冲溶液平衡，以3.0 mL/min的速度洗脱3个柱体积，直至流出液的pH值与缓冲液相同。
然后将经过透析、浓缩后的酶液上样于预装好的DEAE-Sepharose-F.F.离子交换柱，然后在4℃温度下，用0.4 mol/L的NaCl盐溶液以2.0 mL/min流速进行阶段洗脱。自动分部收集仪每3 mL收集一管洗脱液，同时检测每管洗脱液的蛋白含量及酶活力，并收集具有酶活的组分。将收集的酶液透析、浓缩后4℃保存备用。第四步，降上一步得的从粗酶液，进行Sephadax G-100凝胶过滤，经离子交换层析、透析、浓缩后的酶液，上样于预装好的Sephadax G-100葡聚糖凝胶柱。用Na2HPO4-KH2PO4缓冲液（10 mmol/L，pH6.5）以0.3 mL/min的流速进行洗脱，自动分布收集仪每3 mL收集一管洗脱液。同时检测每管洗脱液的蛋白含量及酶活力，并收集具有酶活的组分，于4℃保存，得到需要的粗酶液。
（5）粗酶催化：向类胡萝卜素中添加1.6 %粗酶（v/w，酶浓度1.0 mg/mL），在31℃温度，催化反应18 h。
（6）萃取：经过对菌株或者粗酶液进行液体培养类胡萝卜素后，将菌液进行过滤，采用二氯甲烷进行萃取，萃取分5次完成，第一次萃取时轻微振荡，每隔3 min振荡一次，共振荡三次；第二次到第五次萃取时剧烈振荡，振荡至有泡沫出现，每隔3 min振荡一次，共振荡三次。萃取后用饱和的碳酸氢钠洗涤，然后再用无水硫酸钠进行干燥，至于密闭容器，得到二氢猕猴桃内酯香精，冷冻贮藏。产品收率为1.7mg/L，纯度10.2%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）制备保藏号为M2017593菌株的菌种发酵液：其中所述菌种具体为中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号：M2017593；名称：Bacillus altitudinis SH161；保藏日期：2017年10月19日；地址：中国.武汉.武汉大学；邮编：430072；
（2）取步骤（1）制备的菌种发酵液经过滤、离心后加硫酸铵，静置后透析，然后进行纯化得到馏分，经洗脱过滤得粗酶液；
（3）向类胡萝卜素中添加0.5%wt-2.0%wt粗酶液，在30-35℃下，催化反应10-20h，得初级产物菌液；
（4）初级产物菌液经过滤、3-5次萃取后用饱和的碳酸氢钠洗涤，再经无水硫酸钠干燥后得二氢猕猴桃内酯。
2.如权利要求1所述的微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法，其特征在于，所述步骤（1）的具体操作为：
a. 菌种活化从保藏培养基上挑取发酵菌株，接种到活化培养基中活化培养48h-72h；
b. 将步骤a中活化后的菌种接种到种子培养基中，28-30℃、160 r/min摇床培养36h-48h左右，制备种子液；
c. 将步骤b中所制备的种子液接种到发酵培养基中，28-30℃、160 r/min摇床培养48h-72h发酵培养。
3.如权利要求1所述的微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法，其特征在于，所述步骤（2）的具体操作为：
a. 将菌种发酵液采用常压过滤，过滤后的发酵液经离心得澄清的初级粗酶液，向初级粗酶液中加入硫酸铵至硫酸铵的饱和度为70%，于4℃下静置过夜后，10000pm，4℃条件下离心20 min，取上清酶液；
b. 将步骤a中得到的上清酶液进行盐析透析，将透析所得的透析粗酶液加入预先处理好的透析袋中，使透析粗酶液占透析袋的2/3，然后排净透析袋的空气，两端封闭，放入pH7.4的磷酸缓冲溶液中在4℃下透析，每隔6 h更换缓冲溶液一次，透析24-48 h，得透析液；
c. 将透析液进行DEAE-Sepharose离子交换洗脱得洗脱酶液Ⅰ，将洗脱酶液Ⅰ在4℃下，用0.1-0.5 mol/L的NaCl盐溶液以2.0 mL/min流速于预装好的DEAE-Sepharose-F.F.离子交换柱上进行阶段性洗脱，每3mL收集一管洗脱酶液Ⅱ，于4℃保存备用；
d. 将步骤c得到的洗脱酶液Ⅱ进行Sephadax G-100凝胶过滤，将10 mmol/L、pH为6.5的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液以0.3 mL/min的流速进行洗脱，每3mL收集一管洗脱酶液Ⅲ，于4℃保存备用，即得目的粗酶液。
4.如权利要求3所述的微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法，其特征在于：所述步骤b中的透析液与外界溶液的pH、电导率和平衡缓冲液一致。
5.如权利要求1所述的微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法，其特征在于，所述步骤（4）中萃取的具体操作为：采用二氯甲烷进行萃取，萃取分3-5次完成，第一次萃取时轻微振荡，每隔3 min振荡一次，共振荡三次；第二次到第五次萃取时剧烈振荡，振荡至有泡沫出现，每隔3 min振荡一次，共振荡三次。
6.如权利要求1所述的微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法，其特征在于，所述步骤（4）中制得的二氢猕猴桃内酯的产品收率为1.0mg/L-2.0 mg/L，纯度9%-11%。
CN201810399552.2A 2018-04-28 2018-04-28 一种微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法 Expired - Fee Related CN108467875B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810399552.2A CN108467875B (zh) 2018-04-28 2018-04-28 一种微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810399552.2A CN108467875B (zh) 2018-04-28 2018-04-28 一种微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108467875A CN108467875A (zh) 2018-08-31
CN108467875B true CN108467875B (zh) 2021-02-05

Family

ID=63263887

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810399552.2A Expired - Fee Related CN108467875B (zh) 2018-04-28 2018-04-28 一种微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108467875B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111657536B (zh) * 2020-06-23 2022-10-11 四川中烟工业有限责任公司 一种提高烟叶品质的方法
CN114774374B (zh) * 2022-04-22 2023-08-22 内蒙古昆明卷烟有限责任公司 一种耐高温类胡萝卜素降解酶及其制备方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1182084A (zh) * 1997-11-13 1998-05-20 陈永宽 二氢猕猴桃内酯的合成方法及其应用
CN102732049A (zh) * 2012-06-04 2012-10-17 华中科技大学 一种从微生物菌体中提取制备类胡萝卜素的方法
CN103074383A (zh) * 2012-12-21 2013-05-01 湖南中烟工业有限责任公司 一种脂肪氧化酶制备类胡萝卜素降解产物的方法及应用
CN103122275A (zh) * 2012-12-21 2013-05-29 湖南中烟工业有限责任公司 一种亚油酸催化氧化制备类胡萝卜素降解产物的方法及应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1182084A (zh) * 1997-11-13 1998-05-20 陈永宽 二氢猕猴桃内酯的合成方法及其应用
CN102732049A (zh) * 2012-06-04 2012-10-17 华中科技大学 一种从微生物菌体中提取制备类胡萝卜素的方法
CN103074383A (zh) * 2012-12-21 2013-05-01 湖南中烟工业有限责任公司 一种脂肪氧化酶制备类胡萝卜素降解产物的方法及应用
CN103122275A (zh) * 2012-12-21 2013-05-29 湖南中烟工业有限责任公司 一种亚油酸催化氧化制备类胡萝卜素降解产物的方法及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cleavage of b,b-carotene to flavor compounds by fungi;H. Zorn等;《Appl Microbiol Biotechnol》;20030426;第2003卷(第62期);第331-336页 *
类胡萝卜素降解方式的研究综述;许春平等;《郑州轻工业学院学报》;20120815;第27卷(第4期);第133-138页 *
降解烟叶β－胡萝卜素生成香气物质的微生物分离与鉴定;郑坚强等;《贵州农业科学》;20170115;第45卷(第1期);第56-74页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108467875A (zh) 2018-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102210449B (zh) 干巴菌的液体深层发酵培养及其调味品和富硒产品的制备方法
CN108467875B (zh) 一种微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法
CN102242072B (zh) 利用风味定向技术筛选中国白酒酿造中的β-大马酮产生菌株及其应用
CN103966053A (zh) 一种降低黄酒高级醇含量的黄酒酿造方法
KR101697504B1 (ko) 홍삼증류주 제조방법
CN103525871B (zh) 一种发酵法生产番茄红素的方法
CN102796716A (zh) 一种制备单宁酶的方法
CN107557407A (zh) 一种调控裂褶菌发酵产物裂褶多糖分子量的方法
CN109593630B (zh) 一种发酵型无核黄皮果醋及其制备方法与应用
KR20130077501A (ko) 고산도 식초의 제조방법 및 이에 의한 식초
CN108265096B (zh) 一种微生物发酵制备纽莫康定b0的方法
CN112745998A (zh) 一种蜂蜜发酵酒及其混菌发酵酿造工艺
JP2012510809A (ja) 原形質融合によるエタノール耐性サッカロマイセス・セレビジエｇｐ−０１、その製造方法、サッカロマイセス・セレビジエｇｐ−０１及びゲルマニウムとしての高水溶性メタゲルマニウム酸ナトリウムを利用した高含量有機バイオゲルマニウムを含有する酵母の製造方法
CN105062769B (zh) 一种提高浓香型基酒中3‑羟基‑2‑丁酮和2,3‑丁二醇的工艺方法
CN106636252A (zh) 干巴菌胞外多糖及其制备方法和应用
CN108795892B (zh) 一种制备、分离和纯化葡萄糖氧化酶的方法
CN112522120B (zh) 一株非酿酒酵母hsmt-1及其应用
CN115261358A (zh) 一种茶饮料加工专用单宁酶的制备方法
CN102488321A (zh) 烟用生物香料及其制备方法与它的用途
CN110791436B (zh) 一株高产果胶酶的黑曲霉菌株及其应用
KR0185018B1 (ko) 신규 고향기 청주효모균주 사카로마이세스 세레비제 씨티비14와 이를 이용한 청주의 제조방법
CN105820902A (zh) 一种蜂蜜酒及其制备方法
CN103549608A (zh) 蜂蜜发酵饮料的生产方法
CN107619732B (zh) 一种淡啤酒味保健酒的发酵方法
CN106883978B (zh) 一种白酒用发酵麻吸附剂及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20210205

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee