JP2012510809A - 原形質融合によるエタノール耐性サッカロマイセス・セレビジエｇｐ−０１、その製造方法、サッカロマイセス・セレビジエｇｐ−０１及びゲルマニウムとしての高水溶性メタゲルマニウム酸ナトリウムを利用した高含量有機バイオゲルマニウムを含有する酵母の製造方法 - Google Patents
原形質融合によるエタノール耐性サッカロマイセス・セレビジエｇｐ−０１、その製造方法、サッカロマイセス・セレビジエｇｐ−０１及びゲルマニウムとしての高水溶性メタゲルマニウム酸ナトリウムを利用した高含量有機バイオゲルマニウムを含有する酵母の製造方法 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は細胞融合によるエタノール耐性菌株及びメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）を利用した高含量バイオゲルマニウムを含有する酵母の製造方法に関するものである。本発明は酵母の成長に影響を及ぼすエタノール耐性を改善するために、サッカロマイセス・セレビジエ（ＫＣＴＣ ７９０４）とＣａｎｄｉｄａ ｅｔｈａｎｏｌｉｃａ（ＫＣＴＣ ７１８１）から得た原形質体を融合させてエタノール耐性サッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１（ＫＣＴＣ １１３９９ＢＰ）変異菌株を製造する方法を含む。また、このように製造されたサッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１（ＫＣＴＣ １１３９９ＢＰ）変異菌株とメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）溶液を１：０．５−２体積比で混合し、混合液に対して界面活性剤０．１−０．４重量部を添加して培養することにより、二酸化ゲルマニウム（ＧｅＯ２）を利用する既存方法より高含量の有機バイオゲルマニウムを含有する酵母を製造する方法を含み、こうした製造方法から生産された高含量有機バイオゲルマニウムを含有する酵母を提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
Description
本発明はエタノール耐性で高含量のゲルマニウムを含有する酵母、及びその製造方法に関するものである。より具体的には、本方法は、サッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＫＣＴＣ ７９０４）とＣａｎｄｉｄａ ｅｔｈａｎｏｌｉｃａ（ＫＣＴＣ ７１８１）の原形質融合により高濃度エタノール耐性の変異サッカロマイセス・セレビジエ、酵母ＧＰ−０１を得て、これをメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）の存在下で培養し、酵母細胞内でゲルマニウムを生物転換させることにより、最後にアルコール耐性でかつ高含量の有機バイオゲルマニウムを含有する変異酵母（以下、「酵母Ｇｅ−３２Ｋ」という）を得ることを含む。
自然界においてゲルマニウムは無機ゲルマニウム（ＧｅＯ２）と有機ゲルマニウムの形態に分類され、無機ゲルマニウムは人体を通じて長期間摂取される場合、臓器内蓄積による強い毒性が誘発される。
有機ゲルマニウムは微生物、鉱泉水、薬用植物体内に天然的に存在する。これは、菌体内で生合成したもの及び化学的に合成させたもの等がある。有機ゲルマニウムは細胞内タンパク質、ペプチド等と有機的に結合されており、免疫機能増進、癌細胞発生及び転移の抑制、多くの難病及び疾患予防に対する薬理効能が多数の論文及び科学雑誌を通じて知られている（Ｋｏｒ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００７．３５（２）：１１８−１２７；Ｊ．Ｋｏｒ．Ｓｏｃ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．Ｎｕｔｒ．２００６．３５（６）：６８３−６８９；Ｊ．Ｋｏｒ．Ｓｏｃ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００５．４８（３）：２４６−２５１；Ｉｍｍｕｎｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ．２００６．６（２）：８６−９２）。それだけでなく有機ゲルマニウムは細胞内酸素供給（Ｊ．Ｏｒｔｈｏｍｏｌ．Ｍｅｄｉｃｉｎ．，１９８６．１：１４５−１４８）、血液の浄化機能（Ｍｅｄｉｃｉｎ．Ｈｙｐｈｏｔｈｅｓｉｓ．，１９８８．２６：２０７−２１５）、ＮＫ細胞と大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）の活性化（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８５．２９：６５−７４；Ｋｏｒ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００７．３５（２）：１１８−１２７）による免疫機能増進を通じた抗腫瘍効果とインターフェロン分泌誘導（Ｇａｎｔｏｋａｇａｋｕｔｙｏｈｏ，９：１９７６−１９８０）、癌細胞発生及び転移の抑制（Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｈｙ．１９８５．１２（１２）：２３４５−２３５１）、関節炎抑制効果（Ａｕｔｏｎｏｍｉｃ ＆ Ａｕｔａｃｏｉｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００５．２５：１２９−１３４）、神経痛（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８６．８：３７９−３８６）、骨粗鬆症（Ｇｅｒｍａｎｉｕｍ；Ｔｈｅ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｌｉｆｅ ｅｎｈａｎｃｅｒ．１９８８）、高血圧とコレステロール低下（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９０．４１：２８６−２９１）、肝臓毒性軽減（Ｊ．Ｋｏｒ．Ｓｏｃ．Ｆｏｏｄ．Ｎｕｔｒ．，１９９４．２３（４）：５８１−５８６）等の疾病予防及び治療に効果があることが知られており、アメリカ、日本等の先進国では有機ゲルマニウムを癌、心臓疾患等の難病を治療するために活用する研究が活発に進行されている（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９８５．５（５）：４７９−４８３）。
このような有機ゲルマニウムを得る方法としては、薬用植物である山参、天然霊芝等から抽出する方法及び触媒により有機酸と二酸化ゲルマニウム（ＧｅＯ２）の反応を誘導して化学的に合成する方法が広く知られている。しかし薬用植物から有機ゲルマニウムを抽出する方法は費用が過多に消耗し、低いゲルマニウム収率のため商業化が容易ではなく、化学的合成方法は反応産物から無機ゲルマニウムが検出され、まだその安全性が確立されていないため食品または医薬品としての使用が制限されている（アメリカ ＦＤＡ 輸入禁止規定、１９８８）。
一方、酵母は昔から製パン、酒精生産等に利用されてきた重要な微生物として長い間人類の食生活に利用されている。このような酵母はそれ自体も立派な栄養供給源であり、タンパク質、ビタミン、ミネラルなどが理想的に等しく含有された低脂肪高タンパク質を特徴とする次世代タンパク質供給源である単一細胞タンパク質（ＳＣＰ，ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）として脚光を浴びている。
また酵母は単一細胞では最高のビタミンＢ群の供給源であり、生体内の代謝活動に重要な役割を担当する酵素を多量に含み、健康補助食品として愛用されている。そのため最近は酵母を利用して、より優れた生理及び薬理効果が現れるようにする健康機能食品の開発に関する研究が進行しており、このためには高含量の有機バイオゲルマニウムが含有された酵母の開発が必須である。
従来は、酵母を無機ゲルマニウム（ＧｅＯ２）が添加された培地で培養し、有機バイオゲルマニウムを含有する酵母を製造する方法が開示されていた。しかし酵母が高濃度の無機ゲルマニウムが添加された条件では成長が阻害されるという点を考慮した場合、こうした方法では菌体の収率増大に制約が多いため、満足できるほどの有機バイオゲルマニウムを含有する酵母を生産することができない。
そのため、最近は菌体を生産する工程と無機ゲルマニウム（二酸化ゲルマニウム，ＧｅＯ２）を菌体内に流入させる工程とを分離した方法が試されている。しかし、この方法も菌株が成長する時に発生するエタノールにより菌体の収率が低く、菌体内に流入される無機ゲルマニウム（ＧｅＯ２）の含量が極めて微量である。
また上記方法に使用された二酸化ゲルマニウム（ＧｅＯ２）の溶解度は２５℃で５．２ｇ／Ｌと低く、菌株の成長に阻害因子として作用（Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９８９．４（４）：２９９−３０６）することが知られている。
従って、エタノールに抵抗性の強い菌株及び二酸化ゲルマニウム（ＧｅＯ２）より高い溶解性と低い毒性を持つ無機ゲルマニウム化合物を利用して高含量の有機バイオゲルマニウムが含有された酵母を多量に得る方法が要求されている。
よって、本発明の目的は菌体収率を高めるためにエタノール耐性サッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１及びこのような菌株を製造する方法を提供することにある。
また本発明の他の目的はエタノール耐性菌株（変異サッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１）とメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）を利用して高含量のバイオゲルマニウムを含有する酵母Ｇｅ−３２Ｋの製造方法を提供することにある。
さらに本発明の他の目的はエタノール耐性菌株とメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）を利用した高含量バイオゲルマニウムを含有する酵母の製造方法によって生産された酵母Ｇｅ−３２Ｋを提供することにある。
本発明は、高濃度のエタノール耐性有機ゲルマニウム生産能を持つへんサッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１（ＫＣＴＣ １１３９９ＢＰ）変異菌株に関し、さらにサッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１とメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）とを培養する工程を含む、高含量のバイオゲルマニウムを含有する酵母Ｇｅ−３２Ｋの製造方法に関するものである。
本発明は、サッカロマイセス・セレビジエ（ＫＣＴＣ−７９０４）及びＣａｎｄｉｄａ ｅｔｈａｎｏｌｉｃａ（ＫＣＴＣ ７１８１）から原形質体融合菌株を得ることにより高濃度のエタノール環境でも成長が優秀なエタノール耐性菌株を多量生産することができる。従来は菌株が成長する時に生成されるエタノールによって菌体の生育が抑制されて菌体収率が減少したが、本発明のエタノール耐性菌株はこのような問題点を克服することができる。
また本発明の菌株は原菌株に比べ収率が３倍以上増加されることから、本発明の菌株を利用して製造する高含量のバイオゲルマニウムを含む酵母を大量に生産することができる。
また本発明の菌株から得た菌体にバイオゲルマニウムを流入させる時、従来の二酸化ゲルマニウム（ＧｅＯ２）の代わりに同一条件で溶解度が５００ｇ／Ｌであるメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）を利用して、高いゲルマニウム溶解性、イオン透過力及び低い細胞成長毒性の影響により細胞内生物転換率を増加させることで、二酸化ゲルマニウム（ＧｅＯ２）使用時より２〜３倍さらに高い高含量のバイオゲルマニウムを含む酵母を得ることができる。
また本発明の菌体とメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）溶液を培養させる時、界面活性剤を添加することで、界面活性剤を使用しない場合より酵母内に有機ゲルマニウムを効率的に多量含有させることができる。
本発明は高濃度の有機ゲルマニウム生産能を持つサッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１（ＫＣＴＣ １１３９９ＢＰ）変異菌株に関するものである。
上記サッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１変異菌株は生命工学研究所ジーンバンクに寄託番号ＫＣＴＣ １１３９９ＢＰで寄託された。
具体的に本発明はサッカロマイセス・セレビジエ（ＫＣＴＣ ７９０４）とエタノール利用性が高いＣａｎｄｉｄａ ｅｔｈａｎｏｌｉｃａ（ＫＣＴＣ ７１８１）菌株の原形質体を融合する工程を含み、エタノール耐性サッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１（ＫＣＴＣ １１３９９ＢＰ）変異菌株を製造する。
またこうして製造されたサッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１（ＫＣＴＣ １１３９９ＢＰ）変異菌株にメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）溶液を混合することで、細胞内生物転換反応による高含量有機バイオゲルマニウム含有酵母を製造することができる。
上記原形質体は、サッカロマイセス・セレビジエ（ＫＣＴＣ ７９０４）とＣａｎｄｉｄａ ｅｔｈａｎｏｌｉｃａ（ＫＣＴＣ ７１８１）の菌体に浸透安定剤の１Ｍソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）と還元剤の０．５Ｍメルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）が混合した液を加えて得られる。
さらに細胞壁分解酵素が添加されたソルビトール溶液に上記菌体を懸濁して細胞壁を分解することで原形質体を製造することができる。ここで、１Ｍソルビトールと２−メルカプトエタノールの体積比は１：２−４が望ましく、より望ましくは１：２−３である。
また原形質体の融合は、二つの菌株の原形質体に１Ｍソルビトール、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、マンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）からなる群から選択されたいずれか一つ、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ，ＭＷ ４０００）、１０ｍＭ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を添加してなるものである。
ここで、１Ｍソルビトール、ポリエチレングリコール及び塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の体積比は１：２−４：２−５が望ましく、より望ましくは１：２−３：２−４である。
また本発明による高含量有機バイオゲルマニウム酵母の製造方法はサッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１（ＫＣＴＣ １１３９９ＢＰ）変異菌株にメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）溶液を混合して製造することができる。
ここで、サッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１（ＫＣＴＣ １１３９９ＢＰ）変異菌株とメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）は１：０．５−２の体積比が望ましく、より望ましくは１：１が適当である。
さらに高濃度有機ゲルマニウムの細胞内転換のためには、サッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１（ＫＣＴＣ １１３９９ＢＰ）変異菌株にメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）反応混合液をｐＨ９−１０、温度３０−４０℃下で１９−２１時間培養するのが望ましい。上記培養工程は当業者が酵母を製造するのに適合する通常の方法を含む。
このような過程を通じて高含量有機バイオゲルマニウムを含有する酵母を得ることができる。
以下、本発明のエタノール耐性菌株の製造方法及びこれを利用した高含量有機バイオゲルマニウムを含む酵母の製造方法を工程別に分けて詳細に説明する。
第１工程：エタノール耐性融合菌株の製造
生命工学研究所遺伝子銀行（ＫＣＴＣ）から分譲を受けたサッカロマイセス・セレビジエ（ＫＣＴＣ ７９０４）とＣａｎｄｉｄａ ｅｔｈａｎｏｌｉｃａ（ＫＣＴＣ ７１８１）の二つの原形質体を融合し培養して、原形質体融合菌株を得る。
このような融合菌株を得るために、まず、分譲を受けたサッカロマイセス・セレビジエ（ＫＣＴＣ ７９０４）とＣａｎｄｉｄａ ｅｔｈａｎｏｌｉｃａ（ＫＣＴＣ ７１８１）を培養し、生成された培養液を遠心分離して菌体を得る。
この場合、培養液の吸光度（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ，Ｏ．Ｄ．）が０．４５−０．５（対数期初期）である時に培養液を遠心分離して菌体を得ることが望ましく、上記二つの菌株をそれぞれ又は混合して利用することによって菌体を得ることができる。
こうして得られた上記二つの菌体に１Ｍソルビトールと０．５Ｍメルカプトエタノールで混合された液を菌体と等しい体積比で添加して、菌体を２回洗浄し、一定時間定置させた後、分解酵素が含有された溶液を上記混合液（菌体と１Ｍソルビトールとメルカプトエタノールの混合液）と同一の体積で添加して、菌体を懸濁培養することで原形質体を製造する。
製造された原形質体を混合した混合体に１Ｍソルビトール、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ， ＭＷ ４０００）及び１０ｍＭ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を加えて上記混合体を融合させ、これを遠心分離して融合菌株を得る。
原形質体融合菌株の分離は、栄養源が添加された寒天培地で融合菌株を６−８日間培養した後、染色液で染色して原形質体融合が確認された単一菌集落を分離する。
この時、寒天培地は３−５重量％の酵母抽出物、７−９重量％のペプトン、７−９重量％のグルコース、０．１−０．６重量％の塩化カルシウム、７２−７５重量％のソルビトール及び５−８重量％の寒天を含有するのが望ましいが、当業界で使用される通常の方法を含む。
第２工程：エタノール耐性の菌株製造とメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）溶液製造
第１工程によって分離した融合菌株をメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）が含まれた培地で培養してサッカロマイセス・セレビジエ ＧＰ−０１（ＫＣＴＣ １１３９９ＢＰ）変異菌株を得る。
サッカロマイセス・セレビジエ ＧＰ−０１（ＫＣＴＣ １１３９９ＢＰ）変異菌株を得るために、まず、メタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）をゲルマニウム原料として利用し、液体培地組成物に対してゲルマニウムの濃度が３，０００−２０，０００ ｐｐｍである液体培地で、第１工程によって分離した融合菌株を１０−１３時間培養する。
液体培地組成物はエタノール６−１０重量％、ペプトン０．１−０．５重量％、酵母抽出物０．１−０．４重量％、グルコース２−５重量％、麦芽抽出物０．１−０．４重量％及び水８４−９０重量％を含むことが望ましいが、培養に適合する組成比はこれに限定されない。
上記液体培地のエタノール濃度は８−１０重量％、メタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）中のゲルマニウムの含量が３，０００−１０，０００ｐｐｍであることが望ましい。
この時、エタノールの濃度が６重量％未満又は、１０重量％超過である場合には、適正選別菌株数の確保が困難であるか、効果的なエタノール耐性菌株の分離が困難であることがあり、メタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）が３，０００ｐｐｍ未満である場合には、高濃度ゲルマニウム含有酵母を効率的に分離することができず、２０，０００ｐｐｍを超過する場合には、原料供給価に比べ生産収率を確保するのが困難である。
液体培地で培養された菌株の中、菌体成長が旺盛で培養上澄液内にゲルマニウム含量が少ない菌株を選別し、平板培地で継代して分離することによりサッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１（ＫＣＴＣ １１３９９ＢＰ）変異菌株を製造する。
こうして製造された菌株ＧＰ−０１はエタノールに抵抗性が高いので、菌株の生産収率を高めることができる。
この時に使用された平板培地は３−５重量％の寒天、１０−１２重量％の酵母抽出物、２０−２３重量％のペプトン、２０−２３重量％のグルコースを含有する培地組成とし、培地を固める前に３９−４２重量％のエタノールを加えて平板培地を製造することが望ましいが、継代するのに適合する組成比はこれに限定されない。
このように製造された平板培地は菌株を接種し、常温でエタノールが蒸発しないよう２重封印して培養することで菌株を分離及び製造する。
本発明者は上記菌株をサッカロマイセス・セレビジエ変異ＧＰ−０１と命名し、微生物寄託機関である韓国生命工学研究院生物支援センター（ＫＣＴＣ）に寄託し、２００８年１０月１４日付けで寄託番号ＫＣＴＣ１１３９９ＢＰを受けた。
本発明を完成するために利用された無機ゲルマニウム塩のメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）の合成は、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）、石灰石（ＣａＣＯ３）、炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）及び炭酸水素カリウム（ＫＨＣＯ３）からなる群から選択されたいずれか一つと、これと同一当量の二酸化ゲルマニウムを加え、かつ滅菌させることにより溶解度の高いゲルマニウム溶液であるメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）を得ることができ、生物転換工程の進行直前に製造した反応液を利用する。
本発明の第２工程では、融合菌株をメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）が含有された培地で培養させる前に２．０−２．５キログレイ（ＫＧｙ，Ｄ１０ ｖａｌｕｅ）ガンマ線（Ｃｏ６０）を２−４時間照射して菌株を変異させる工程をさらに含むことができる。
この時、ガンマ線が２ＫＧｙ未満である場合には変異菌株が多く形成されて選別しにくいため所望の変異菌株を得にくいことがあり、ガンマ線が２．５ＫＧｙ超過の場合には菌株の死滅率が高いため所望の菌株を得にくいことがある。
このようにガンマ線で照射された突然変異菌株をＹＭブロス（ＹＭ ｂｒｏｔｈ）で１時間培養し安定化させて利用することができる。
第３工程：菌体内に無機ゲルマニウムイオン流入
第２工程から得た菌株にメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）溶液を混合して高含量の有機ゲルマニウムを含有する酵母を製造する。
高含量の有機ゲルマニウムを含有する酵母を製造するために、まず、第２工程から得た菌株培養液を遠心分離して菌体のみ回収し、ここにゲルマニウム含量が３，０００−１０，０００ｐｐｍのメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）溶液を混合してゲルマニウムが含有された培養液を製造する。
上記菌体とメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）溶液の混合体積比は１：０．５−２である。
こうして製造されたゲルマニウムが含有された培養液に対して界面活性剤を０．１−０．４重量部を追加し、ｐＨ９−１０、温度３０−４０℃の条件で１９−２１時間培養すれば高含量の有機ゲルマニウム酵母を製造することができる。
この時、ゲルマニウムが含有された培養液に対して界面活性剤を追加すると、細胞膜の透過性増大による細胞内ゲルマニウムの含量増大が誘導されてサッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１（ＫＣＴＣ １１３９９ＢＰ）変異菌株内に無機ゲルマニウムイオンを多量流入させることができる。
本発明に使用された界面活性剤はツイン−８０が望ましいが、これに限定されない。
また菌体とメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）溶液の混合比率が１：０．５（体積比）未満の場合と１：２（体積比）超過の場合には、高い菌体懸濁液の粘度及びゲルマニウムと酵母細胞壁との間の低い拡散速度によって酵母内のバイオゲルマニウムの含量が低くなることがある。
またｐＨが９未満の場合とｐＨ１０超過の場合にも酵母内のバイオゲルマニウムの含量は低くなり、温度が３０℃未満又は４０℃超過の場合にも酵母内のバイオゲルマニウム含量は低くなる。
また界面活性剤がゲルマニウムが含有された培養液に対して０．１重量部未満の場合は細胞壁の透過性が不良であり、０．４重量部超過の場合は酵母細胞壁の構造破壊によって膜透過性が阻害されることで酵母細胞内のバイオゲルマニウムの含量が界面活性剤を使用しない場合と類似した含量を示すことがある。
サッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１（ＫＣＴＣ １１３９９ＢＰ）変異菌株を利用して高含量バイオゲルマニウム酵母を製造した後、ゲルマニウムが含有された培養液は０．２ｕｍのメンブレインフィルターで濾過させて再使用することができる。
以下、本発明の理解を助けるため望ましい実施例を提示する。下記の実施例は本発明の例示であるだけで、本発明の範疇及び技術思想範囲内で多様な変更及び修正が可能であることは当業者にとって明白なことであり、このような変形及び修正が本発明で請求した請求範囲に属することは当然である。
製造例１．メタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）溶液の製造
炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３，Ｋａｎｔｏ，Ｊａｐａｎ）を水にとかした後、炭酸ナトリウムと１：１当量で二酸化ゲルマニウム（ＧｅＯ２，ＰＰＭ，ドイツ）を加え、かつ滅菌させ、メタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）を得た。こうして製造されたメタゲルマニウム酸ナトリウムの溶解度は５００ｇ／Ｌ（２５℃）で、溶解度が高い。
実施例１．融合菌株の製造及びこれよりのエタノール耐性菌株の製造
分譲を受けたサッカロマイセス・セレビジエ（ＫＣＴＣ ７９０４）とＣａｎｄｉｄａ ｅｔｈａｎｏｌｉｃａ（ＫＣＴＣ ７１８１）を１００ｍｌのＹＰＤ培地が加えられた三角フラスコで３０℃で１０時間培養し、菌体吸光度が０．５である対数期の初期に、上記培養液を３０００ｒｐｍで遠心分離して菌体を得、滅菌生理食塩水で菌体を２回洗浄した。遠心分離して得た菌体に１Ｍソルビトールと０．５Ｍメルカプトエタノールが１：２の体積比で混合された混合液を菌体１ｍｌ当り１ｍｌを加え、３０℃で３０分間定置させた後、遠心分離洗浄をした。その後、細胞膜分解酵素のザイモラーゼＬ４０２５（ｚｙｍｏｌａｓｅ，ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）２００ｕｎｉｔが添加された１Ｍソルビトール溶液を上記遠心分離洗浄された液（菌体と１Ｍソルビトールとメルカプトエタノールとの混合液）１ｍｌ当り１ｍｌを加え、３０℃で６０分間菌体を懸濁培養して各菌株の原形質体を製造した。製造された原形質体を混合した混合体に、１Ｍソルビトールと、ポリエチレングリコール（ＭＷ ４０００）と１０ｍＭ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）が１：３：２の体積比で混合された液を同一体積で加えた後、３０℃で３０分間融合させ、遠心分離して融合菌株を得た。
上記融合菌株の分離は融合菌株を４．１重量％の酵母抽出物、８．１重量％のペプトン、８．１重量％のグルコース、０．４重量％の塩化カルシウム、７３．２重量％のソルビトール及び６．１重量％の寒天からなるＳＯＳ固体培地で一週間培養した後、カルボール・フクシン（ｃａｒｂｏｌ ｆｕｃｈｉｎ）で染色して分離する。
上記の分離された融合菌株はエタノール１０重量％、ペプトン０．４重量％、酵母抽出物０．２重量％、グルコース４重量％、麦芽抽出物０．２重量％、及び水８５．２重量％と、これに対してゲルマニウム濃度が１０，０００ｐｐｍのメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）溶液を３０重量部添加したＹＭ液体培地で１０時間培養する。上記液体培地で培養された菌株の中、菌体成長が旺盛で培養上澄液内にゲルマニウム含量が少ない菌株を選別し、４．１重量％の寒天（Ｄｉｆｃｏ）、１１．１重量％の酵母抽出物（Ｇｅｎｉｃｏ，韓国）、２２．０重量％のペプトン（Ｄｉｆｃｏ）、２２．０重量％のグルコース（Ｄａｅｓａｎｇ，韓国）、４０．８重量％のエタノールが含有された平板培地で継代して分離することにより、サッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１（ＫＣＴＣ １１３９９ＢＰ）変異菌株を製造した。
その後、菌体の成長阻害物質であるエタノールに対する影響を調査するために、製造された菌株にエタノールを濃度別に添加して菌株の成長性を調査した。
下記表１は実施例１で製造した菌株のエタノール濃度別菌体成長性を示したもので、各エタノール濃度別に３回ずつ調査したものである。
エタノールは、菌株が成長する時に発生するが、このようなエタノールによって菌株の成長が抑制される。しかし表１の結果をみると、エタノールが菌体の成長阻害物質であるにもかかわらず、サッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１（ＫＣＴＣ １１３９９ＢＰ）変異菌株はエタノールを使用しない場合よりもエタノールを使用した場合にむしろ成長性が良くなっている。ここで、添加されたエタノール濃度が６−１０％である場合、成長性が最も良かった。
従って、サッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１（ＫＣＴＣ１１３９９ＢＰ）変異菌株は、高濃度のエタノール条件でも成長性が良いエタノール耐性菌株であることが分かる。
さらに、原菌株（サッカロマイセス・セレビジエ（ＫＣＴＣ ７９０４））と菌株収率を比べてみるとサッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１（ＫＣＴＣ １１３９９ＢＰ）変異菌株が原菌株より３倍以上菌株収率が増加されたことを確認した。
実施例２．無機ゲルマニウム溶液濃度による酵母内のバイオゲルマニウムの含量変化
実施例１で製造したエタノール耐性のサッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１（ＫＣＴＣ １１３９９ＢＰ）変異菌株培養液を遠心分離して菌体を回収し、菌体量に対して１：１の割合（体積比）でメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）溶液を混合するが、メタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）溶液中のゲルマニウムを濃度別に製造し、ｐＨ１０、温度４０℃の条件で２０時間培養した。その後、酵母内のバイオゲルマニウムの含量を測定するために、培養後乾燥した酵母１ｇに硝酸３０ｍｌを入れて加熱分解させ、ｐＨ６に補正した後、試料１ｍｌ、フェニルフッ素（ｐｈｅｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｎｅ）１ｍｌ、シクロヘキサン１ｍｌを混合して３０℃で３０時間放置後、５２５ｎｍで吸光度を測定してバイオゲルマニウム含量を測定した。
また二酸化無機ゲルマニウム（ＧｅＯ２）溶液を利用して実施例２と同様の方法で製造して比較対象とした。
下記表２は比較対象である二酸化無機ゲルマニウム（ＧｅＯ２）溶液とメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）溶液に含有されたゲルマニウムの含量によって酵母内に投入されるバイオゲルマニウム含量の比較を示したものである。
表２をみると同量のゲルマニウムが投入されても、メタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）溶液が二酸化ゲルマニウム（ＧｅＯ２）溶液に比べて酵母内にバイオゲルマニウムをさらに流入させる。また原菌株のサッカロマイセス・セレビジエ（ＫＣＴＣ ７９０４）に比べてサッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１（ＫＣＴＣ １１３９９ＢＰ）変異菌株が酵母内にバイオゲルマニウムをさらに流入させる。
メタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）溶液において、投入されるゲルマニウム含量が３，０００−１０，０００ｐｐｍである場合、菌体内に無機ゲルマニウムイオンが多く流入されるが、特に投入されるゲルマニウム含量が５，０００ｐｐｍの場合、菌体内への流入されるゲルマニウムの収率が最も高い。ここで収率とは、投入ゲルマニウム含量による菌株内のゲルマニウム含量の比率である。
実施例３．菌体と無機ゲルマニウム溶液（ＧｅＯ２，Ｎａ２ＧｅＯ３）の混合割合による酵母内のバイオゲルマニウム含量の比較
実施例１で製造したエタノール耐性菌株培養液を遠心分離して菌体を回収し、ここにゲルマニウムの含量が５，０００ｐｐｍのメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）溶液を割合別に混合した。この時、ｐＨは１０、温度は４０℃の条件で２０時間培養した。
また二酸化無機ゲルマニウム（ＧｅＯ２）溶液を利用して実施例３と同様の方法で製造して比較対象とした。
酵母内のゲルマニウム含量の測定は実施例２と同様の方法で行った。
下記表３は比較対象である二酸化無機ゲルマニウム（ＧｅＯ２）溶液とメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）溶液と菌体の割合による酵母内のバイオゲルマニウム含量の比較を示したものである。
表３をみると菌体と無機ゲルマニウム溶液の混合比率が１：０．５−２（体積比）の場合に酵母内のバイオゲルマニウム含量が最も高く、二酸化ゲルマニウム（ＧｅＯ２）を利用した場合よりメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）溶液を反応に添加した場合、ゲルマニウム含量が２−４倍程度増大された。
実施例４．菌体内に無機ゲルマニウムイオンを最大に流入させることができる最適条件
実施例１で製造したエタノール耐性菌株培養液を遠心分離して回収した菌体と、ゲルマニウムの含量が５，０００ｐｐｍのメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）溶液を１：０．５の割合（体積比）で混合してゲルマニウムが含有された培養液を製造し、ｐＨ、温度、ゲルマニウムが含有された培養液に対して界面活性剤（ツイン−８０）を濃度別に２０時間培養した。この時、ｐＨは１ＮＮａＯＨを使用して調節し、温度と界面活性剤は数回繰り返して実験をした。
ゲルマニウム測定時、対照群は界面活性剤を使用しないで培養したものを使用した。
また酵母内のバイオゲルマニウムの含量の測定は実施例２と同様の方法で行った。
下記表４は酵母内にゲルマニウムイオン流入時のｐＨ、温度、界面活性剤の影響を示したものである。
また酵母内のバイオゲルマニウムの含量の測定は実施例２と同様の方法で行った。
下記表４は酵母内にゲルマニウムイオン流入時のｐＨ、温度、界面活性剤の影響を示したものである。
表４に示すように酵母内に無機ゲルマニウムイオンが最大に流入される条件はｐＨ８−１０、温度３０−４０℃、ゲルマニウムが含有された培養液に対して界面活性剤０．１−０．４重量部であり、望ましくはｐＨ１０、温度４０℃、界面活性剤０．２重量部である。
ここで、ｐＨ、温度、無機ゲルマニウムの濃度による酵母内のバイオゲルマニウム含量を図２、図３、図４のグラフで示した。
このような有機ゲルマニウムを得る方法としては、薬用植物である山参、天然霊芝等から抽出する方法及び有機酸と二酸化ゲルマニウム（ＧｅＯ２）の反応による化学的に合成する方法が広く知られている。しかし薬用植物から有機ゲルマニウムを抽出する方法は費用が過多に消耗し、低いゲルマニウム収率のため商業化が容易ではなく、化学的合成方法は反応産物から無機ゲルマニウムが検出され、まだその安全性が確立されていないため食品または医薬品としての使用が制限されている（アメリカ ＦＤＡ 輸入禁止規定、１９８８）。
上記サッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１変異菌株は生命工学研究所韓国タイプ・カルチャー・コレクション（ＫＲＩＢＢ、Ｇｗａｈａｋ−ｌｏ−１１１，Ｙｕｓｅｏｎｇ−ｇｕ−Ｄａｅｊｅｏｎ ３０５−８０８、大韓民国）に寄託番号ＫＣＴＣ １１３９９ＢＰで２００８年１０月７日に寄託された。
また界面活性剤がゲルマニウムが含有された培養液に対して０．１重量部未満の場合は細胞壁の透過性が不良であり、０．４重量部超過の場合は酵母細胞壁の構造破壊によって膜透過性が阻害されることで酵母細胞内のバイオゲルマニウムの含量が界面活性剤を使用しない場合と類似した含量までバイオゲルマニウムの含有量が減少されることがある。
実施例１で製造したエタノール耐性のサッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１（ＫＣＴＣ １１３９９ＢＰ）変異菌株培養液を遠心分離して菌体を回収し、回収した菌体量に対して１：１の割合（体積比）で異なる濃度のメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）溶液を混合し、ｐＨ１０、温度４０℃の条件で２０時間培養した。その後、酵母内のバイオゲルマニウムの含量を測定するために、培養後乾燥した酵母１ｇに硝酸３０ｍｌを入れて加熱分解させ、ｐＨ６に補正した後、試料１ｍｌ、フェニルフッ素（ｐｈｅｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｎｅ）１ｍｌ、シクロヘキサン１ｍｌを混合して３０℃で３０時間放置後、５２５ｎｍで吸光度を測定してバイオゲルマニウム含量を測定した。
ここで、ｐＨ、温度、無機ゲルマニウムの濃度による酵母内のバイオゲルマニウム含量を図１、図２、図３のグラフで示した。
Claims (9)
- 有機ゲルマニウム生産能を持つ変異サッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１（ＫＣＴＣ １１３９９ＢＰ）。
- サッカロマイセス・セレビジエＫＣＴＣ ７９０４とＣａｎｄｉｄａ ｅｔｈａｎｏｌｉｃａＫＣＴＣ ７１８１とを原形質融合する工程を含むエタノール耐性サッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１の製造方法。
- 前記融合原形質体は、ペレット化した前記サッカロマイセス・セレビジエ（ＫＣＴＣ ７９０４）及び前記Ｃａｎｄｉｄａ ｅｔｈａｎｏｌｉｃａ （ＫＣＴＣ ７１８１）に、１Ｍソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）及び０．５Ｍメルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を添加することによって得られる、請求項２に記載の製造方法。
- 前記原形質融合は、１Ｍソルビトール、及びポリエチレングリコール（ＭＷ ４０００）の存在下で原形質体を融合することによって行われる、請求項２に記載の製造方法。
- サッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１（ＫＣＴＣ １１３９９ＢＰ）をメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）に使用直前に添加する工程を含む、高含量有機バイオゲルマニウム酵母Ｇｅ−３２Ｋの製造方法。
- 前記メタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）は、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）、石灰石（ＣａＣＯ３）、炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）及び炭酸水素カリウム（ＫＨＣＯ３）からなる群から選択されたいずれか一つを水に溶解する工程及び、前記溶解された物質と１：１の体積比の二酸化ゲルマニウム（ＧｅＯ２）を添加する工程を含んでなる方法によって製造される、請求項５に記載の方法。
- 前記サッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１（ＫＣＴＣ １１３９９ＢＰ）とメタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）の混合比は１：０．５−２（体積比）である、請求項５に記載の方法。
- 前記サッカロマイセス・セレビジエＧＰ−０１（ＫＣＴＣ １１３９９ＢＰ）と前記メタゲルマニウム酸ナトリウム（Ｎａ２ＧｅＯ３）とを含む培養液をｐＨ９−１０、温度３０−４０℃下で１９−２１時間培養する工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
- 請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法によって生産された、高含量有機バイオゲルマニウムを含有する酵母（酵母Ｇｅ−３２Ｋ）。
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