BG113393A - Метод за получаване на глутатион - Google Patents

Метод за получаване на глутатион Download PDF

Info

Publication number
BG113393A
BG113393A BG113393A BG11339321A BG113393A BG 113393 A BG113393 A BG 113393A BG 113393 A BG113393 A BG 113393A BG 11339321 A BG11339321 A BG 11339321A BG 113393 A BG113393 A BG 113393A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
glutathione
concentration
biomass
separation
kluyveromyces marxianus
Prior art date
Application number
BG113393A
Other languages
English (en)
Other versions
BG67591B1 (bg
Inventor
Траяна Недева
Вангелова Куюмджиева Анна
Анна КУЮМДЖИЕВА
Спасова Недева Траяна
Марина Бадалова
Стефанова Бадалова Марина
Александър Савов
Валентинов Савов Александър
Original Assignee
"Ромб" Оод
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by "Ромб" Оод filed Critical "Ромб" Оод
Priority to BG113393A priority Critical patent/BG67591B1/bg
Publication of BG113393A publication Critical patent/BG113393A/bg
Publication of BG67591B1 publication Critical patent/BG67591B1/bg

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до метод за получаване на глутатион, по-специално до метод за получаване на натурален глутатион с участието на специално селекциониран щам аскомицетни дрожди Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus НБПМКК 1984, чиято специфична технологична характеристика позволява в условията на конкретно подбрани параметри на култивационния процес да биосинтезира глутатион при съотношение на окислена (GSSG) и редуцирана (GSH) форма на метаболита от 3.0-3.8:7.0-7.2. Методът предвижда последователност от операции, включваща култивиране на щама-продуцент на глутатион Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus НБПМКК 1984 върху модифицирана хранителна среда на Reeder в полунепрекъсната система в условия на двуфазов процес, сепариране на получената биомаса от културалната течност, дезинтегриране на активната биомаса, съдържаща целевият продукт глутатион, разделяне и концентриране на глутатиона с последващо изолиране и охарактеризиране на крайния продукт.

Description

Метод за получаване на глутатион
Област
Изобретението се отнася до метод за получаване на глутатион, по-специално до метод за получаване на глутатион с участието на специално селекциониран щам аскомицетни дрожди Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus НБПМКК 1984, за нуждите на хранителната промишленост, козметиката, парфюмерията и медицината.
Предшестващо състояние на техниката
Трипептидът глутатион (GSH) се синтезира естествено във всяка клетка от човешкото тяло от три аминокиселини- цистеин, глутаминова киселина и глицин. Глутатионът има основна роля при цялостното функциониране на организма, тъй като участва в растежа, регулацията на клетъчния метаболизъм и имунните реакции (1). В най-висока концентрация това съединение се открива в сърцето, черния дроб и мускулната тъкан. Благодарение на антиоксидантните си свойства глутатионът неутрализира и директно обезврежда активни кислородни форми с помощта на ензима глутатион пероксидаза. Той блокира въздействието на свободните радикали и така предпазва клетките и клетъчните мембрани от увреждане като подържа цялостното здравословно състояние на организма, поради което глутатионът се използва широко в хранителната промишленост, козметиката, парфюмерията, медицината (2, 3). Всичко това обуславя интересът към получаване на глутатион в промишлено значими количества.
Известно е получаването на глутатион чрез химична синтеза, но процесът е свързан с опасност както за консуматора (наличие на токсични странични продукти), така и за околната среда, поради което съгласно Европейското и американско законодателства, такива продукти не могат да бъдат използват при храни, напитки и козметика (4, 5). Това налага използването на натурални технологии за получаване на глутатитион, като особено предимство има микробиологичният подход (6, 7).
Предпочитаните микроорганизми за получаване на GSH са дрожди, особено от видовете Candida utilis и Saccharomyces cerevisiae поради факта, че в диви щамове на тези видове, концентрацията на GSH е значителна и варира между 0,1 и 1 % от сухата маса (8, 9). Допълнително предимство е факта, че тези дрожди притежават способност да нарастват бързо до висока клетъчна плътност на евтини хранителни среди и в крайния продукт няма риск от ендотоксини. Получените добиви в лабораторни условия обаче, са почти наполовина от добива, получен при използване на ензимен метод. Аналогични резултати са показани и в патент US2018135142 с участието на щам Saccharomyces cerevisiae CGMCC 12789, съгласно който добивът на глутатион достига 263,2 mg/L.
Priyanka Saini at al. (11) установяват, че клетките на дрожди от вида Kluyveromyces marxianus са по-устойчиви на оксидативен и осмотичен стрес спрямо тези на щамове Saccharomyces cerevisiae, както и високо ниво на глутатионова продуктивност. Последното дава основание на колектива да предположи потенциалната приложимост на Kluyveromyces marxianus във ферментационната промишленост.
Задача на изобретението е да предложи високоефективен метод за получаване на натурален продукт глутатион с участието на аскомицетни дрожди Kluyveromyces marxianus, водещ до получаване на краен продукт с изключително добри биологични и пазарни характеристики.
Същност на изобретението
Изобретението се отнася до метод за получаване на глутатион, по-специално до метод за получаване на натурален глутатион с участието на специално селекциониран щам аскомицетни дрожди Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus НБПМКК 1984. Методът включва последователност от операции при съответните параметри на провеждането им, а именно:
Кутивиране на щамът-продуцент на глутатион Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus НБПМКК 1984 върху модифицирана хранителна среда на Reeder в полунепрекъсната система в условия на двуфазов процес, сепариране на получената биомаса от културалната течност с помощта на проточна центрофуга, дезинтегриране на активната биомаса, съдържаща целевият продукт глутатион чрез термична автолиза, разделяне и концентриране на глутатиона чрез ултрафилтрация, изолиране на концентриран продукт глутатион от безклетъчен екстракт чрез мембранна филтрация и охарактеризиране на крайния продукт.
Селекционираният дрождеви щам- продуцент, който притежава GRAS (Generally Recognized As Safe) статус, расте при по-високи температури и показва висок антиоксидантен потенциал и устойчивост на индустриален стрес, поради което е подходящ за създаването на метод за получаване на натурален продукт глутатион, на основата на микробиологичен процес. Специфична технологична характеристика на щама е способността му да биосинтезира глутатион при съотношение на окислена (GSSG) и редуцирана (GSH) форма на метаболита от 3.03.8 : 7.0- 7.2 при подбраните параметри на култивационния процес. Този висок относителен дял на GSH е индикатор, че в културата се поддържа добър оксиредукционен баланс и тя е компетентна да се справи с потенциално излагане на оксидативен и други видове стрес, породени в хода на ферментацията.
Щам Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus НБПМКК 1984 е вариетет на типовата култура Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042, чийто геном е секвениран и анотиран. Той притежава специфични морфологични, културални и физиологобиохимични характеристики за биосинтеза на глутатион, систематизирани на Таблица 1 по- долу:
ТАБЛИЦА 1
А: Морфлогични и културални характеристики
Клетъчна морфология Кръгли клетки, размножаващи се чрез монополярно пъпкуване; образува 1-4 сферични аскоспори под формата на тетрада или верига; не образува псевдомицел и хламидоспори; не произвежда пигменти. Размер - (0.05-0.1)х(0.1-0.2) pm
Културални характеристики В бульонна култура образува утайка. На твърда хранителна среда образува гладки, меки, оцветени в бяло колонии; лъскави с повдигнат център, гладък ръб и конкавна форма.
Б: Физиологични характеристики
Усвояване на нитрати Не
Растеж на безвитаминна среда Не, ауксотроф по никотинова киселина
Образуване на киселини Не
Температура на растеж Минимална Т°С - 5-6; Оптимална Т°С - 37-40; Максимална Т°С 47-48
Растеж 50% глюкоза Не
Разцепване на арбутин Да
Растеж в среда с повишена осмотичност Да, 7% NaCI
В: Ферментационен и асимилационен профил
Ферментация на:
D-глкжоза Да Малтоза Не
D-галактоза Да Лактоза Не
Захароза Да Мелибиоза Да
Асимилация на:
D-Глюкоза Да Рибитол Не
D-Галактоза Да Г алактитол Не
Захароза Да D-Маноза Не
Малтоза Не D-Глюцитол Не
Целубиоза Не а -СНз-β -D-зГлюкозид Не
α,а -Трехалоза Не Салицин Не
Лактоза Да D, L-Лактат Да
Мелибиоза Не Скорбяла Не
Рафиноза Да D-Ксилоза Да
L-сорбоза Не L-Арабиноза Да
Мелицитоза Не Сукцинат Да/Не
Инулин Да D-Арабиноза Не
L-рамноза Не D-Рибоза Не
Етанол Да Цитрат Не
Глицерол Не туо-Инозитол Не
Еритритол Не Метанол Не
Контрола Не
С цел повишаване продукцията на целевия метаболит, култивирането на щам Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus НБПМКК 1984 върху модифицирана хранителна среда на Reeder се осъществява в полу-непрекъсната система в условия на двуфазов процес както следва:
Първа фаза с продължителност 12 часа - периодично култивиране в биореактор „Galencamp“ при температура 35 - 37°С, pH 5.8 - 6.0, обороти на разбъркване 300 rpm и аерация 1 l/l/min върху модифицирана хранителна среда на Reeder в състав (g/l):
суроватъчен пермеат (при концентрация на лактоза 20.0 д/!)- 22.0 до 26.0; (NH4)2SO4 - 3.0 до 3.1; К2НРО4- 0.8 до 1.0; NaCI- 0.3 до 0.5; MgSO4-7H2O - 0.6 до 0.7; CaCI21.8 до 0.2; КН2РО4 - 0.8 до 1.0 и дрождев екстракт - 0.8 до 1.0.
Втора фаза - подхранване на културата чрез двукратно доливане с хранителна среда, представляваща стерилен разтвор на лактоза с обем 1 I и концентрация такава, че при добавянето на този обем към периодичната култура в съотношение 3:1, крайната концентрация на лактозата в биореактора да бъде 20.0 g/l. След подхранването се поддържат постоянни параметрите температура 35 - 37°С, обороти на разбъркване 300 rpm, аерация 1 l/l/min и pH 6.0. Продължителността на втората фаза е до 24 часа, като на всеки 3 часа се провежда мониторинг на културата по отношение остатъчната концентрация на биогенните елементи, количеството синтезирани биомаса и глутатион. Резултатите са илюстрирани на Таблица 2 по- долу.
ТАБЛИЦА 2
Час Сухо тегло (g/l) Остатъчна концентрация (g/l) Глутатион (mg/g АСВ*)
С N Р
0 0.09 ±0 02 20.1 ±0.94 2.98 ±0.12 1.08 ± 0.05
3 0.96 ± 0.04 17.9 + 0.89 2.53 ±0.13 1.00 ± 0.01
6 4.58 ±0.22 6.95 ± 0.29 2.19 ± 0.11 0.89 ±0 04
9 7.20 ± 0.31 1.43 ±0.07 1.89 ±0.09 0.76 ±0.02
12 7.17 ±0.32 0.28 ±0.01 1.87 ±0.08 0.76 ± 0.04 0.964 + 0.39
Доливане до крайна концентрация на лактозата 20 g/l
След доливка 5.35 + 0.21 19.98 ±0.91 1 66 ±0.07 0.64 ± 0.03 -
15 9.87 ± 0.42 13.32 ±0.64 1.58 ±0.06 0.60 ±0.04
18 14.22 ±0.73 6.19 ±0.25 1.24 ±0.04 0.56 ± 0.04 0.973 + 0.43
Доливане до крайна концентрация на лактозата 20 g/l
След доливка 10.58 + 0.45 20.2 ± 0.93 1.06 ±0.03 0.50 ±0.03
21 16.47 ±0.78 12.75 ±0.53 0.99 ± 0.03 0.48 ± 0.03
24 22.54 ±1.05 4.31 ±0 02 0.92 ± 0.03 0.42 ± 0.02 0.979 + 0.52
*АСВ- абсолютно сухо вещество
След приключване на култивирането, биомасата и културална течност се подлагат на постферментационна обработка, която включва: сепариране на биомасата от културната течност чрез центрофугиране на проточна центрофуга при условия, при които се постига оптимален добив на биомаса, а именно: скорост на подаване на културата- 1.5 l/min, обороти на въртене- 4 000 rpm и температура 4°С; дезинтегриране на активната биомаса, съдържаща целевият продукт глутатион чрез термична автолиза, осигуряваща едновременното нарушаване на клетъчния интегритет и екстрахиране/концентриране на целевия продукт при 78 °C за 10 min; сепариране на клетъчните стени чрез центрофугиране при 13000 rpm за 10 min при 4°С; разделяне и концентриране на глутатиона чрез ултрафилтрация (MWCO = 10 kDa) и нанофилтрация (MWC0 = 200 Da); изолиране на концентриран продукт от безклетъчен екстракт чрез мембранна филтрация и неговото охарактеризиране за съдържание на пепелни вещества, тежки метали и микроорганизми, както и стабилност при температура 60°С и pH 5.0 - 6.0 в продължение на 10 часа. Този режим на обработка осигурява концентрация на екстрахирания глутатион, възлизаща на 2.343 mg/ml. Принципната схема на разделяне и концентриране на фракциите с различно съдържание на глутатион и съпътстващи продукти е представена на приложената Фиг. 1.
Полученият краен продукт се тества за наличие на странични вещества, които биха компрометирали неговите биологични и пазарни характеристики. Проведеният анализ по отношение наличието на пепелни вещества, тежки метали и странична микрофлора в получения, съгласно метода от изобретението, глутатион красноречиво показват, че по тези показатели крайният продукт отговаря на характеристиките и нормите, определени от Наредба № 5/09.02.15 на M3 относно Максимално допустимите количества на някои замърсители в храните.
Крайният продукт се подлага и на изследване за стабилност по отношение на температура и на pH. Получените резултати доказват, че глутатионът, получен по метода, съгласно изобретението, е стабилнен при температура 60°С и pH 5.0 - 6.0 в продължение на 10 часа, което показва, че продуктът е подходящ за приложение в хранителната промишленост, козметиката, парфюмерията и медицината.
Предимствата на метода за получаване на глутатион, съгласно настоящото изобретение, се дължат на специфичната технологична характеристика на щам Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus НБПМКК 1984, позволяваща да биосинтезира глутатион при съотношение на окислена (GSSG) и редуцирана (GSH) форма на метаболита от 3.0-3.8: 7.0-7.2 при конкретно подбраните параметри на култивационния процес; този висок относителен дял на GSH е индикатор, че в културата се поддържа добър оксиредукционен баланс и тя е компетентна да се справи с потенциално излагане на оксидативен и други видове стрес, породени в хода на ферментацията. Ефективността на метода за получаване на глутатион, съгласно настоящото изобретение, достига 99.72%.
Кратко описание на приложените фигури:
Фиг. 1 - представя принципна схема на разделяне и концентриране на фракциите с различно съдържание на глутатион и съпътстващи продукти.
Изобретението се илюстрира със следните примерни изпълнения, без да ограничават неговия обхват.
Пример 1: Получаване на глутатион
Съгласно един предпочитан вариант на изпълнение, основният процес за получаване на глутатион се осъществява в биореактор “Gallencamp” с работен обем 4 I, при температура 37°C, pH 6.0, обороти на разбъркване 300 об/мин, аерация 1 l/l/min.
Щам Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus НБПМКК 1984 се култивира върху модифицирана хранителна среда на Reeder със състав (д/1): суроватъчен пермеат (при 20 д/l концентрация на лактоза) в количество 22.0, (NH^SCU - 3.0, К2НРО4 1.0, NaCI - 0.5, МдЗОд УНгО - 0.7, CaCI2 - 0.2, КН2РО4, - 1.0 и дрождев екстракт (Bacto™ Yeast Extract) - 1.0. Инокулирането се осъществява с 12-часова вегетативна култура на щам Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus НБПМКК 1984, получена върху течна хранителна среда със състав (д/1): лактоза - 20.0, пептон 10.0 и дрождев екстракт (Bacto™ Yeast Extract) - 5.0, при pH 6.0.
При подбраните условия на култивиране щамът-продуцент расте с висока специфична скорост на растеж (μ [h1]). Тази стойност е индикатор за интензивен растеж, водещ до натрупване на значително количество биомаса. Икономическият коефициент (Yx/c) също показва висока стойност, която насочва към ефективно протичащи биосинтетични процеси, трансформиращи въглеродния субстрат в първични метаболити, в т.ч. и добив от глутатион. Кинетичните параметри на процеса на култивиране и биосинтеза на глутатион са показани на Таблица 3 подолу.
ТАБЛИЦА 3
Кинетични параметри на процеса на култивиране
μ Ф -ψ Td(h)“ Y x/c* Общ глутатион (mg/g ACB****)
0.300 - 0.330 2.08-2.10 0.402 - 0.406 0.872-0.958
*μ (h ·’) - специфична скорост на растеж •*Td (h) - време на удвояване *Y х/с - икономически коефициент •***АСВ - абсолютно сухо вещество
С цел повишаване продукцията на целевият метаболит, щам Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus НБПМКК 1984 се култивира в полу-непрекъсната система в условия на двуфазов процес, където:
Първа фаза - периодично култивиране до достигането края на логаритмичната фаза в биореактор „Galencamp“ с работен обем 4 I, при температура 37°С, pH 6.0, обороти на разбъркване 300 об/мин, аерация 1 l/l/min на модифицирана хранителна среда Reeder със състав (g/l): суроватъчен пермеат (при 20 д/l концентрация на лактоза) 22.0; (NH4)2SO4 - 3.0; К2НРО4- 1.0; NaCI - 0.5; MgSO4 7Н2О - 0.7; CaCI2- 0.2; КН2РО41.0 и дрождев екстракт (Bacto™ Yeast Extract) - 1.0. Продължителността на първата фаза е 12 часа.
Втора фаза - подхранване на културата чрез двукратно доливане със свежа хранителна среда, съобразена с работния обем на биореактора. Свежата хранителна среда за доливките е стерилен разтвор на лактоза с обем 1 I и концентрация такава, че при добавянето на този обем към периодичната култура в съотношение 3:1, крайната концентрация на лактозата в биореактора да бъде 20.0 g/l. По време на процеса след подхранване се поддържат постоянни параметрите температура 37°С, обороти на разбъркване 300 rpm, аерация 1 l/l/min и pH 6.0. Продължителността на втората фаза е до 24 часа, като на всеки 3 часа се провежда мониторинг на културата по отношение остатъчната концентрация на биогенните елементи, количеството синтезирани биомаса и глутатион. Динамиката на растеж на щам Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus НБПМКК 1984 в системата на полунепрекъснато култивиране - подхранване с лактоза е илюстрирана на Таблица 2 по-горе.
След приключване на култивирането, биомасата и културална течност се подлагат на постферментационна обработка, която включва: сепариране на биомасата от културалната течност чрез центрофугиране; дезинтегриране на активната биомаса, съдържаща целевия продукт глутатион; разделяне и концентриране на целевия продукт; изолиране на концентриран препарат глутатион от безклетъчен екстракт чрез мембранна филтрация и охарактеризиране на крайния продукт, където:
- Сепарирането на културалната течност от дрождевата биомаса се извършва на проточна центрофуга при условия, при които се постига оптимален добив на биомаса, а именно: скорост на подаване на културата-1.5 l/min, обороти на въртене4 000 rpm и температура 4°С.
- Дезинтегрирането на дрождевата биомаса се осъществява чрез термична автолиза, осигуряваща едновременното нарушаване на клетъчния интегритет и екстрахиране/концентриране на целевия продукт. Процесът се провежда при режим както следва: 10 g суха биомаса се смесват със 100 ml загрята до 78°С вода и миксират за 10 min. на стайна температура; сепарирането на клетъчните стени се осъществява чрез центрофугиране при 13000 rpm, 10 min, 4°С. Този режим осигурява концентрация на екстрахирания глутатион възлизаща на 2.343 mg/ml.
- Разделянето и концентрирането на целевия продукт се осъществява с помощта на 10 kDa- онови полиетерсулфонови (PES) ултрафилтрационни (УФ) мембрани и полисулфон- полипропиленови (PSU-PP) нанофилтрационни (НФ) мембрани с размер на порите 200 Da.
- Изолирането на концентриран продукт от безклетъчен екстракт се осъществява чрез мембранна филтрация.
- Тестването за наличие на странични вещества, които могат да компрометират биологичните и пазарни характеристики на продукта се осъществява чрез определяне на количеството пепелни вещества, наличието на тежки метали и странична микрофлора.
- Изследвано е и влиянието на температурата и pH върху стабилността на глутатион като предпоставка за успешно влагане в храни и приложение като хранителна добавка.
Принципнатата схема на разделяне и концентриране на фракциите с различно съдържание на глутатион и съпътстващи продукти е показана на приложената Фиг.1.
Операционните условия на мембранното разделяне и концентриране на целевия продукт са представени на Таблица 4 по- долу
ТАБЛИЦА 4
Процес Операционни условия
Термична Екстракция (ТЕ) Т = 78°С; t = 10 min
Ултрафилтрация (УФ) Захранващ разтвор = ТЕ супернатанта Р = 0.2 MPa; Т = 23°С; t = 4 h GSH концентрация в захранващия разтвор = 2.343 mg/ml
Нанофилтрация (НФ) Захранващ разтвор = УФ пермеат Р = 0.8 MPa; Т = 23°С; t = 78 h GSH концентрация в захранващия разтвор = 1.900 mg/ml
Следвайки работната схема за разделяне на целевия продукт, посочена на Фиг. 1, на термична екстракция се подлагат 10 g дрождева биомаса в 100 g вода, от които се събират и анализират 3 фракции: ТЕ супернатанта, УФ пермеат и УФ ретентат.
Резултатите по отношение на концентрацията на получения продукт и ефективността на съответното стъпало от процеса на мембранно разделяне са представени в Таблица 5 по- долу.
На процедурата по разделяне и концентриране се подлага суспензия, изготвена от суха дрождева маса със съдържание на глутатион - 2.59%. Ефективността на изолиране на глутатиона при екстракция с гореща вода е 72.4%; скоростта на потока на проникване намалява с времето поради концентрацията на ретентата и феномена концентрационна поляризация. Концентрацията на глутатион в УФ пермеата се увеличава с течение на времето, тъй като той взаимодейства със задържаните макромолекули в супернатантата. Отхвърлянето на глутатион от УФ мембраната е 18.9%.
ТАБЛИЦА 5
Фракция Началн а проба (течна, д) Начална проба (АСВ, д) Проба (д) /ТАА (ml) А«2 GSH GSH тд/д АСВ Добие (%)
тМ д % mg/ml
Биомаса 0.4 д в 10 ml 0.870 3.374 0.01036 2.59 25.90 72.4
ТЕ супернатанта 80 3.05 10 д в 100 ml 0.079 0.3043 0.00094 0.2343 2.343 61.46
УФ пермеат 75 2.55 0.4 д в 10 ml 0.064 0.2460 0.0030 0.1900 1.900 55.88
УФ ретентат 5 0.23 0.4 д в 10 ml 0.089 0.3431 0.0010 0.2577 2.577 56.02
Фракцията УФ ретентат се подлага на концентрация чрез НФ, съгласно описаната работна процедура. Като резултат се събират и анализират 2 фракции: НФ пермеат и НФ ретентат по отношение на концентрацията на получения продукт и ефективността на НФ фаза. Концентрацията на полученият продукт и ефективността на нанофилтрационното мембранно разделяне е илюстрирано на
Таблица 6 по- долу.
ТАБЛИЦА 6
Фракция Начална проба (течна, д) Начална проба (ACB, д) Проба (д)/ ТАА (ml) A412 GSH GSH тд/д АСВ Добив (%)
mM д % mg/ml
УФ пермеат 75 2.55 0.4 д в 10 ml 0.064 0.2460 0.0030 0.1900 1.900 55.88 99.72
НФ пермеат 46 0.386 0.4 д в 10 ml 0.00099 0.0008 0.000002 0.0005 0.005 0.600
НФ ретентат 29 1.822 0.4 д в 10 ml 0.163 0.6394 0.0195 0.49 4.90 85.78
От Таблица 6 е видно, че ефективността на изолиране на глутатиона при концентрирането му чрез НФ е 99.72%. Скоростта на потока на проникване намалява с времето поради концентрацията на ретентата, концентрационната поляризация и замърсяване на мембраната. Концентрацията на глутатион в НФ пермеат постепенно намалява почти до 0 mg/ml. Отхвърлянето на глутатион от НФ мембрана е 99.9%.
Пример 2: Изследване за съдържание на пепелни вещества, тежки метали, и микробиологични показатели на полученият съгласно изобретението глутатион.
Тестването за наличие на странични вещества, които могат да компрометират биологичните и пазарни характеристики на продукта се осъществява чрез определяне на количеството пепелни вещества, наличието на тежки метали и странична микрофлора. Данните, изложени на Таблица 7 по- долу показват, че по показателите съдъранието на пепелни вещества, тежки метали и микроорганизми, полученият по метода, съгласно изобретението, глутатион отговаря на характеристиките и нормите, определени в Наредба № 5/09.02.15 г на M3 за Максимално допустимите количества на някои замърсители в храните.
ТАБЛИЦА 7
Съдържание на пепелни вещества (%) < 10
Съдържание на тежки метали (mg/kg)
Олово < 0.3
Арсен <0.2
Мед <5.0
Микробиологични показатели
Остатъчни живи клетки от щама-продуцент Не се установяват
Патогенни микроорганизми Не се установяват
Salmonellalmg продукт Не се установява
Staphylococcus aureuslmg продукт Не се установява
Pseudomonas aeruginosalmg продукт Не се установява
Бактериално замърсяване (общ брой аеробни и факултативно анаеробни мезофилни микроорганизми / g продукт) < 103
Пример 3: Изследване влияние на температурата и pH върху стабилността на глутатион, получен съгласно метода по изобретението
Данните от изследването на глутатиона, получен с участието на щам Kluyveromyces marxianus var. Bulgaricus НБПМКК 1984 по отношение на стабилност спрямо температурни изменения, показани на Таблица 8 по-долу и по отношение на стабилност спрямо изменения на pH, показани на Таблица 9 по-долу, са свидетелство за това, че продуктът е подходящ за влагане в хранителни продукти и може да бъде използван като хранителна добавка.
ТАБЛИЦА 8
Т(°С) Общ глутатион (mg/g АСВ) (време, h)
1 2 3 4 5 10
0 0.912 + 0.09 0.907 + 0.1 0.907 + 0.10 0.915 + 0.12 0.912 + 0.09 0.917 + 0.08
30 0.914 + 0.10 0.906 + 0.08 0.890 + 0.09 0.865 + 0.06 0.841 +0.11 0.820 + 0.12
40 0.894 + 0.03 0.878 + 0.08 0.862 + 0.06 0.831 +0.07 0.802 + 0.08 0.784 + 0.09
50 0.853 + 0.06 0.839 + 0.07 0.825 + 0.06 0.808 + 0.05 0.792 + 0.04 0.783 + 0.07
60 0.853 + 0.06 0.839 + 0.07 0.825 + 0.06 0.808 + 0.05 0.792 + 0.04 0.783 + 0.07
100 0.336 + 0.06 0.305 + 0.07 0.217 + 0.04 0.102 + 0.02 0.094 + 0.01 0.062 + 0.08
ТАБЛИЦА 9
pH Общ глутатион (mg/g ACB) (време, h)
1 3 10
4.5 0.782 + 0.29 0.764 + 0.33 0.632 + 0.30
5.0 0.811 + 0.38 0.781 +0.32 0.736 + 0.34
5.5 0.864 + 0.37 0.833 + 0.38 0.801 +0.438
6.0 0.963 + 0.40 0.942 + 0.42 0.924 + 0.43
6.5 0.811 +0.34 0.784 + 0.33 0.720 + 0.33
7.0 0.643 + 0.29 0.636 + 0.28 0.602 + 0.29
7.5 0.627 + 0.25 0.598 + 0.27 0.573 + 0.26
8.0 0.603 + 0.26 0.577 + 0.23 0.524 + 0.24
ЛИТЕРАТУРА
1. Berhane, К, Widersten, М., Engstrom, A., Kozarich, J.W., and Mannervik, B. (1994). Detoxication of base propenals and other unsaturated aldehyde products of radical reactions and lipid peroxidation by human glutathione transferase. Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 91, pp. 1480-1484.
2. Erkekoglu P. (2018). Introductory Chapter: A General Overview of Glutathione, Glutathione Transport, and Glutathione Applications, Glutathione in Health and Disease, Pinar Erkekoglu and Belma Kocer-Gumusel, IntechOpen, DOI: 10.5772/intechopen. 81594.
3. Weschawalit S., Thongthip S., Phutrakool P., Asawanonda P. (2017) Glutathione and its antiaging and antimelanogenic effects. Clin Cosmet Investig Dermatol. 10:147-153. doi: 10.2147/CCID.S128339
4. FDA Food Code, available at: https://www.fda.goV/media/110822/download
5. EFSA Strategy 2020 Trusted science for safe food, available at: http://www. efsa. europa. eu/en/corporate/pub/strateov2020
6. Li W, Li Z, Ye Q (2010) Enzymatic synthesis of glutathione using yeast cells in two-stage reaction. Bioprocess Biosyst Eng 33:675-682. doi: 10.1007/s00449-009-0361-6
7. Nisamedtinov, I., Orumets, K., Kewai, K., Viiard, E., Sarand, I., and Paalme, T. 2010. Multilevel Control of GSH Accumulation in Mutant and Wild-type Strains of S. cerevisiae Under Conditions of Smooth Cysteine Addition. 2010. Retrieved from http://www.aidic.it/ibic2010/webDaDers/82Nisamedtinov.Ddf
8. Патент US2018135142
9. Priyanka Saini at al., Physiological response of Kluyveromyces marxianus during oxidative and osmotic stress, Process Biochemistry, Volume 56, May 2017, Pages 21-29

Claims (5)

  1. ПРЕТЕНЦИИ
    1. Метод за получаване на глутатион с участието на аскомицетни дрожди от вида Kluyveromyces marxianus, характеризиращ се с това, че щам аскомицетни дрожди Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus НБПМКК 1984 се култивира върху модифицирана хранителна среда на Reeder в полунепрекъсната система в условия на двуфазов процес, получената биомаса се сепарира от културалната течност на проточна центрофуга, активната биомаса се дезинтегрира чрез термична автолиза, а полученият глутатион се подлага на разделяне и концентриране чрез ултрафилтрация и нанофилтрация с последващо изолиране и охарактеризиране на продукта.
  2. 2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че модифицираната хранителна среда на Reeder е в състав (g/l): суроватъчен пермеат (при концентрация на лактоза 20.0 g/l)- от 22.0 до 26.0; (NH4)2SO4- от 3.0 до 3.1; К2НРО4- от 0.8 до 1.0; NaCI- от 0.3 до 0.5; MgSO4 7Н2О- от 0.6 до 0.7; СаС12от 1.8 до 0.2; КН2РО4- от 0.8 до 1.0 и дрождев екстракт- от 0.8 до 1.0.
  3. 3. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че сепарирането на биомасата от културалната течност на проточна центрофуга се осъществява при скорост на подаване на културата 1.5 l/min, обороти на въртене 4 000 грт и температура 4°С.
  4. 4. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че дезинтегрирането на активната биомаса чрез термична автолиза се осъществява, като суха биомаса се смесва със загрята до 78°С вода, миксира се за 10 min. на стайна температура и клетъчните стени се сепарират чрез центрофугиране при 13000 грт за 10 min при температура 4°С.
  5. 5. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че разделянето и концентрирането на полученият глутатион се осъществява с помощта на ултрафилтрационни мембрани с размер на порите 10 KDa и нанофилтрационни мембрани с размер на порите 200 Da.
BG113393A 2021-07-07 2021-07-07 Метод за получаване на глутатион BG67591B1 (bg)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BG113393A BG67591B1 (bg) 2021-07-07 2021-07-07 Метод за получаване на глутатион

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BG113393A BG67591B1 (bg) 2021-07-07 2021-07-07 Метод за получаване на глутатион

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG113393A true BG113393A (bg) 2023-01-16
BG67591B1 BG67591B1 (bg) 2023-11-30

Family

ID=89033660

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG113393A BG67591B1 (bg) 2021-07-07 2021-07-07 Метод за получаване на глутатион

Country Status (1)

Country Link
BG (1) BG67591B1 (bg)

Also Published As

Publication number Publication date
BG67591B1 (bg) 2023-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6329940B2 (ja) ユーグレナ属微細藻類、多糖類の製造方法、及び有機化合物の製造方法
JPWO2017150304A1 (ja) エルゴチオネインの発酵生産
JP5883780B2 (ja) 酵母の培養方法
JP7225086B2 (ja) 新規微生物、およびそれを用いたウロリチン類の製造方法
CN114058522B (zh) 一种高产角鲨烯的酿酒酵母菌、应用及其选育方法
Yee et al. The production of functional γ-aminobutyric acid Malaysian soy sauce koji and moromi using the trio of Aspergillus oryzae NSK, Bacillus cereus KBC, and the newly identified Tetragenococcus halophilus KBC in liquid-state fermentation
CN107429282A (zh) 谷胱甘肽的制造方法
Kallel-Mhiri et al. Mechanism of ethyl acetate synthesis by Kluyveromyces fragilis
EP3339443A1 (en) Use of streptomyces psammoticus and method for producing vanillin
JP5518891B2 (ja) 原形質融合によるエタノール耐性サッカロマイセス・セレビジエｇｐ−０１、その製造方法、サッカロマイセス・セレビジエｇｐ−０１及びゲルマニウムとしての高水溶性メタゲルマニウム酸ナトリウムを利用した高含量有機バイオゲルマニウムを含有する酵母の製造方法
CN107849514A (zh) 增强木糖的微藻代谢
WO2006013736A1 (ja) 酵母変異株、グルタチオン高含有酵母の製造方法、その培養物、その分画物、酵母エキスおよびグルタチオン含有飲食品
DK3140416T3 (en) COLLECTION OF PROPIONI BACTERIUM AND Yeast
BG113393A (bg) Метод за получаване на глутатион
JP4620405B2 (ja) 酵母変異株、グルタチオン高含有酵母の製造方法、その培養物、その分画物、酵母エキスおよびグルタチオン含有飲食品
JP4620404B2 (ja) 酵母変異株、グルタチオン高含有酵母の製造方法、その培養物、その分画物、酵母エキスおよびグルタチオン含有飲食品
WO2012067106A1 (ja) 酵母エキスの製造方法
JP2006141251A (ja) γ−アミノ酪酸含有食品の製造方法、及びγ−アミノ酪酸高生成能を有する酵母
JP5667365B2 (ja) サッカロマイセス・セレビシエ変異株、及び該変異株を用いた含硫化合物高含有酵母の製造方法。
Sunish et al. Microbial Biomass
Dwivedi Fundamentals Of Fermentation Technology
Ibrahim et al. Isolation, Identification, and Optimization of γ-Aminobutyric Acid (GABA)-Producing Bacillus cereus Strain KBC from a Commercial Soy Sauce moromi in Submerged-Liquid Fermentation
JP2022049288A (ja) ビフィズス菌増殖促進効果のある食品素材
CN114958617A (zh) 一株高产麦角硫因的糙皮侧耳及其应用
CN115125181A (zh) 枯草芽孢杆菌中甲基萘醌-7储存空间的构建方法